CN104844693B

CN104844693B - 一种合成利那洛肽的方法

Info

Publication number: CN104844693B
Application number: CN201510314459.3A
Authority: CN
Inventors: 郭德文; 曾德志; 马中刚; 文永均
Original assignee: CHENGDU SHENGNUO BIOTEC Co Ltd
Current assignee: CHENGDU SHENGNUO BIOTEC Co Ltd
Priority date: 2015-06-10
Filing date: 2015-06-10
Publication date: 2018-08-03
Anticipated expiration: 2035-06-10
Also published as: CN104844693A

Abstract

本发明涉及医药合成领域，公开了一种合成利那洛肽的方法。本发明所述方法合成在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列Thr侧链上、Cys侧链上、Asn侧链上、Tyr侧链上、Glu侧链上偶联有保护基以及在C端偶联有树脂载体的利那洛肽树脂，然后酸解脱除保护基和树脂载体得到利那洛肽线性粗肽，采用半胱氨酸盐酸盐/DMSO缓冲溶液对线性粗肽进行环化，得到利那洛肽粗品，粗品纯化转醋酸盐后即得成品。本发明所述方法从环化体系等方面着手，改进了利那洛肽合成方法，以简便、快捷的工艺步骤将利那洛肽的总收率提高了一个阶段，且能够保证纯度在较高的水平，同时极大地缩短了后期环化时间，相比现有技术更加具有实用价值和应用前景。

Description

一种合成利那洛肽的方法

技术领域

本发明涉及医药合成领域，具体涉及一种合成利那洛肽的方法。

背景技术

利那洛肽(linaclotide)为阿斯利康开发的新产品，是首个鸟苷酸环化酶激动剂(GCCA)类药物，于2012年年8月获得美国食品与药物监督管理局的批准，它与位于肠道中的鸟苷酸环化酶C结合，利那洛肽在血浆中的浓度基本无法测出，却能使细胞内和细胞外环磷酸鸟苷(cGMP)浓度增高。一般认为细胞内cGMP浓度的增加可以刺激肠液的分泌并促进胃肠活动，从而导致排便次数增多，用于便秘型肠易激综合征(IBS-C)与慢性特发型便秘(CIC)的治疗。利那洛肽结构序列如下：

H-Cys¹-Cys²-Glu³-Tyr⁴-Cys⁵-Cys⁶-Asn⁷-Pro⁸-Ala⁹-Cys¹⁰-Thr¹¹-Gly¹²-Cys¹³-Tyr¹⁴-OH(3对二硫键为1-6、2-10、5-13)。

中国专利CN103626849A公开卡了一种利那洛肽的制备方法，以Hqm保护1位和6位Cys，以Trt保护2位和10位Cys，以Acm保护5位和13位Cys，采用逐一偶联方法合成利那洛肽线性肽，最后依次以氧气、水合肼、碘和醋酸进行三步环化获得利那洛肽，其总收率依据记载最高可达69.60％。然而，该方法在后期环化形成二硫键时需要分三步进行，操作较复杂，同时花费的时间长达14.2-28.5h，生产效率仍然受限；

中国专利CN104163853A公开了一种制备利那洛肽的方法，其首先合成一个5肽片段和9肽片段，然后缩合两个片段并采用GSH/GSSH氧化体系一步环化得到利那洛肽，其总收率依据记载最高可达36％，后期环化时间为12h；

中国专利CN104231051A公开了一种利那洛肽的制备方法，以特殊的Cys保护基进行逐一合成，环化时采用的是EDTA和DMSO，环化时间为8-15h，其总收率依据记载最高可达32.15％；

中国专利CN102875655A公开了一种合成利那洛肽的方法，其以Mmt作为Cys保护基进行合成，后期采用GSH/GSSH氧化体系一步环化得到利那洛肽，其总收率依据记载最高可达27％，后期环化时间为12h；

相比CN103626849A专利，其他三者在总收率方面较低，但是综合考虑工艺时间和繁琐程度，后三个现有技术无疑更优，如何在这三个现有技术基础上提高总收率以及缩短后期环化时间是进一步提高利那洛肽生产效率的主要研究方向。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种合成利那洛肽的方法，使得本发明所述方法能够显著提高利那洛肽合成的总收率，并缩短后期环化的时间。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种合成利那洛肽的方法，包括以下步骤：

步骤1、合成在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列Thr侧链上、Cys侧链上、Asn侧链上、Tyr侧链上、Glu侧链上偶联有保护基以及在C端偶联有树脂载体的利那洛肽树脂；

步骤2、利那洛肽树脂酸解脱除所有保护基和树脂载体得到利那洛肽线性粗肽，然后采用半胱氨酸盐酸盐/DMSO缓冲溶液对利那洛肽线性粗肽进行环化，按照其N端到C端的氨基酸顺序，形成第1位Cys和第6位Cys的二硫键、第2位Cys和第10位Cys的二硫键以及第5位Cys和第13位Cys的二硫键得到利那洛肽粗品，粗品纯化转醋酸盐后即得利那洛肽成品。

利那洛肽线性肽主链14个氨基酸中存在6个Cys，最后的环化阶段对于利那洛肽的收率、纯度等有关键影响，针对目前现有技术方案中存在的方法繁琐、环化时间过长、总收率偏低的缺陷，本发明从环化体系等方面着手，改进了利那洛肽的合成方法，提高了生产效率。

在本发明所述方法中，按照利那洛肽线性肽主链C端至N端的氨基酸顺序(即SEQID NO:1所示氨基酸序列)逐一合成，以利那洛肽线性肽主链N端到C端的氨基酸顺序编号，如下式：

H-Cys¹-Cys²-Glu³-Tyr⁴-Cys⁵-Cys⁶-Asn⁷-Pro⁸-Ala⁹-Cys¹⁰-Thr¹¹-Gly¹²-Cys¹³-Tyr¹⁴-OH

作为优选，所述半胱氨酸盐酸盐/DMSO缓冲溶液pH值用氨水调至7.0-9.5，半胱氨酸盐酸盐浓度为1mmol/L，DMSO体积百分浓度为3-30％。更优选地，所述半胱氨酸盐酸盐/DMSO缓冲溶液pH值用氨水调至7.0-9.5，半胱氨酸盐酸盐浓度为1mmol/L，DMSO浓度为10-20％；更进一步优选地，所述半胱氨酸盐酸盐/DMSO缓冲溶液pH值用氨水调至7.0-9.5，半胱氨酸盐酸盐浓度为1mmol/L，DMSO浓度为15％。

作为优选，步骤1为：

在偶联剂的作用下，将Fmoc-Tyr(tBu)-OH与树脂载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Tyr(tBu)-树脂载体，然后按照利那洛肽线性肽氨基酸序列，即SEQ ID NO:1所示氨基酸序列C端到N端的顺序，在活化试剂和缩合试剂的作用下，依次逐个将剩余保护氨基酸进行延伸偶联，偶联后脱出N端保护基，得到利那洛肽树脂H-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-树脂载体；

所述剩余保护氨基酸N端保护基均为Fmoc保护基。

本发明所述保护基是在氨基酸合成领域常用的保护氨基酸主链以及侧链上氨基、羧基等干扰合成的基团的保护基团，防止氨基、羧基等在制备目标产物过程中发生反应，生成杂质，而被保护基保护的氨基酸称为保护氨基酸如Fmoc-Tyr(tBu)-OH，以及本发明方法中提及的剩余保护氨基酸中的Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH等。对于本发明中需要保护侧链的氨基酸来说，本领域技术人员公知其侧链结构以及知晓采用常用保护基来保护氨基酸侧链上的氨基、羧基等基团，作为优选，本发明优选Fmoc保护氨基酸的N端，并按照表1中的保护基保护对应氨基酸的侧链。

表1

Cys(Mmt)	Glu(OtBu)	Tyr(tBu)
			Asn(Trt)	Thr(tBu)

在合成H-Tyr(tBu)-树脂载体中，其取代值优选为0.2～1.0mmol/g树脂，更优选的取代值为0.3～0.5mmol/g树脂。

本发明偶联时，每个保护氨基酸用量优选为树脂或肽树脂摩尔数的1-6倍，更优选为2.5-3.5倍；所述偶联反应时间优选为60～300分钟，更优选为100～140分钟。

在偶联中，由于每个氨基酸N端都有保护基，因此需要先脱除N端保护基再偶联，这对本领域技术人员来说是公知常识。本发明优选用PIP/DMF(哌啶/N,N-二甲基甲酰胺)混合溶液脱除N端保护基，混合溶液中含哌啶为10～30％(V)，其余为DMF。去N端保护基试剂的用量为每克肽树脂5～15mL，更优选的为每克肽树脂8～12mL；去N端保护基时间为10～60分钟，优选的为15～25分钟。

需要说明的是，本发明所述肽树脂指任意个数保护氨基酸按照利那洛肽氨基酸顺序和树脂载体相连接形成的肽树脂，这其中不仅包括起始的H-Tyr(tBu)-树脂载体、以及最后的利那洛肽树脂，还包括在合成利那洛肽树脂过程中形成的肽树脂。

作为优选，所述树脂为Trityl-Cl(三苯甲基氯)类树脂或羟基类树脂。更优选地，所述Trityl-Cl类树脂为Trityl-Cl树脂、4-Methyltrityl-Cl(4-甲基三苯甲基氯)树脂、4-Methoxytrityl-Cl(4-甲氧基三苯甲基氯)树脂或2-Cl Trity-Cl(2-氯三苯甲基氯)树脂；所述羧基类树脂为Wang(王)树脂或HMP(对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯)树脂。

作为优选，所述偶联试剂为N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、N,N-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑/4-N,N-二甲基吡啶(DIC/HOBt/DMAP)两种之一。其中，进一步优选地，当树脂载体为Trityl-Cl类树脂时，保护氨基酸Fmoc-Tyr(tBu)-OH与树脂载体的偶联方法为：保护氨基酸Fmoc-Tyr(tBu)-OH的羧基与树脂中的Cl-代烷基在DIPEA的作用下发生酯化反应而接入保护氨基酸；当载体树脂为羟基类型树脂时，Fmoc-Tyr(tBu)-OH与载体树脂的偶联方法为：Fmoc-Tyr(tBu)-OH的羧基与树脂中的羟基在DIC/HOBt/DMAP的作用下发生酯化反应而接入保护氨基酸。

作为优选，所述缩合试剂优选为N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷/有机碱(PyBOP/有机碱)、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯/有机碱(HATU/有机碱)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐/有机碱(HBTU/有机碱)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯/有机碱(TBTU/有机碱)中的一种。所述缩合试剂的摩尔用量优选为肽树脂中总摩尔数的1～6倍，更优选为2.5～3.5倍。所述活化试剂为1-羟基苯并三唑(HOBt)或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt)。所述活化试剂的用量优选为肽树脂中总摩尔数的1～6倍，更优选为2.5～3.5倍。

需要说明的是，所述PyBOP/有机碱、HATU/有机碱、HBTU/有机碱、TBTU/有机碱，在本发明中属于四种双体系的缩合试剂，即PyBOP、HATU、HBTU在使用时需要分别和有机碱组合在一起成为一种缩合试剂使用，其中所述有机碱和PyBOP、HATU、HBTU、TBTU的摩尔比优选为为1.3-3.0:1，更优选为1.3-2:1。

作为优选，所述有机碱为N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、三乙胺(TEA)或N-甲基吗啡啉(NMM),更优选为DIPEA。

在本发明合成过程中，优选采用DMF溶剂来溶解。

除上述列举的合成方法，本发明也可以采用液相合成法合成利那洛肽树脂。

作为优选，所述酸解采用由体积百分比为80-95％的TFA、体积百分比为1-10％的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解。更优选地，用由体积百分比为90％的TFA、体积百分比为5％的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解。所述混合酸解液用量优选为每克利那洛肽树脂需要4～15mL，更优选为9～11mL。所述酸解的时间优选为室温条件下1～6小时，更优选为3～4小时。

作为优选，所述环化时间为1-4h，更优选为2-3h。

作为优选，所述半胱氨酸盐酸盐/DMSO缓冲溶液用量为每0.5-3mg利那洛肽线性肽粗品使用1mL半胱氨酸盐酸盐/DMSO缓冲溶液；更优选地，述半胱氨酸盐酸盐/DMSO缓冲溶液用量为每1-2mg利那洛肽线性肽粗品使用1mL半胱氨酸盐酸盐/DMSO缓冲溶液。

作为优选，所述纯化转醋酸盐具体为：

利那洛肽粗品溶解后采用高效液相色谱法进行纯化，获得利那洛肽纯化中间体浓缩液，然后以流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，以高效液相色谱法进行转醋酸盐。

更优选地，利那洛肽粗品，用水溶解，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用；

采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得利那洛肽纯化中间体浓缩液；

取利那洛肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；

采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min(可根据不同规格的色谱柱，调整相应的流速)；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到利那洛肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得利那洛肽成品。

由本发明所述方法合成的利那洛肽经HPLC检测，其线性粗肽纯度在83.1％-85.8％，纯化后成品纯度在99％以上，总收率在37.1％-43.5％，最大单一杂质小于0.1％。与现有技术CN104163853A、CN104231051A和CN102875655A相比，本发明将利那洛肽的总收率提高了一个阶段，且能够保证纯度在较高的水平，同时缩短后期环化的时间为1-4h。而与CN103626849A相比，本发明大大缩短了环化时间和简化工艺繁琐程度，提高了生产效率。

由以上技术方案可知，本发明所述方法从环化体系等方面着手，改进了利那洛肽的合成方法，以较简便、较快捷的工艺步骤将利那洛肽的总收率提高了一个阶段，且能够保证纯度在较高的水平，同时极大地缩短了后期环化时间，相比现有技术更加具有实用价值和应用前景。

具体实施方式

本发明公开了一种合成利那洛肽的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的的化合物和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明具体实施方式中，所有保护氨基酸均可通过市售获得，本发明中的保护氨基酸购自于成都晖蓉生物科技有限公司，所用树脂购自于上虞普尔树脂有限公司，申请文件中所用英文缩写对应的中文含义见表2。

表2英文缩写释义

英文缩写	中文名称	英文缩写	中文名称
				Fmoc	9-芴甲氧羰基	OtBu	叔丁氧基
tBu	叔丁基	Trt	三苯甲基
				Ala	丙氨酸	Gly	甘氨酸
Asn	门冬酰胺	Pro	脯氨酸
				Cys	半胱氨酸	Thr	苏氨酸
Glu	谷氨酸	Tyr	酪氨酸

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：Fmoc-Tyr(tBu)-2-Cl Trt-树脂的合成

取500g取代值为0.6mmol/g的2-Cl Trt-Cl树脂，加入DMF溶胀树脂。取0.6molFmoc-Tyr(tBu)-OH，用适量DMF溶解，加入到上述树脂中，搅拌均匀后再加入1.2mol DIPEA，搅拌反应3小时，抽掉反应液，DMF洗涤3次后，DCM洗涤3次，得到Fmoc-Tyr(tBu)-2-Cl Trt-树脂，取代值为0.45mmol/g。

实施例2：Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂的合成

取500g取代值为0.5mmol/g的Wang树脂，加入DMF溶胀树脂。取0.5mol Fmoc-Tyr(tBu)-OH，用适量DMF溶解，加入到上述树脂中，搅拌均匀后再加入1.0mol DIC、0.4molHOBt、0.04mol 4-N,N-二甲基吡啶，搅拌反应6小时，抽掉反应液，DMF洗涤3次后，DCM洗涤3次，得到Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂，取代值为0.39mmol/g。

实施例3：利那洛肽树脂的制备

取0.1mol实施例1的Fmoc-Tyr(tBu)-2-Cl Trt-树脂(取代值0.45mmol/g)，用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得到去Fmoc的H-Tyr(tBu)-2-Cl Trt-树脂。

取0.3mol Fmoc-Cys(Trt)-OH和0.3mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.3mol DIC，搅拌下慢慢加入，继续搅拌反应30分钟，加入到上述H-Tyr(tBu)-2-Cl Trt-树脂中，偶联反应120～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，洗涤过滤，再用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得H-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-2-Cl Trt-树脂。

同上法依次接入表3中剩余保护氨基酸，得到利那洛肽肽树脂：

H-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-2-Cl Trt-树脂

表3

实施例4：利那洛肽肽树脂的制备

取0.3mol Fmoc-Cys(Trt)-OH和0.3mol HOBt，用适量DMF溶解，另取0.28molHBTU，搅拌下慢慢加入，继续搅拌反应30分钟，再加入0.56molDIEA，混匀后加入到上述H-Tyr(tBu)-2-Cl Trt-树脂中，偶联反应120～180分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，洗涤过滤，再用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得H-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-2-Cl Trt-树脂。

同上法依次接入表3剩余保护氨基酸，得到利那洛肽肽树脂：

实施例5：利那洛肽肽树脂的制备

取0.1mol实施例2的Fmoc-Tyr(tBu)-Wang-树脂(取代值0.39mmol/g)，用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得到去Fmoc的H-Tyr(tBu)-Wang-树脂。

取0.3mol Fmoc-Cys(Trt)-OA和0.3mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.3mol DIC，搅拌下慢慢加入，继续搅拌反应30分钟，加入到上述H-Tyr(tBu)-Wang-树脂中，偶联反应120～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，洗涤过滤，再用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得H-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Wang-树脂。

同上法依次接入表3剩余保护氨基酸，得到利那洛肽肽树脂：

H-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Wang-树脂

实施例6：利那洛肽肽树脂的制备

取0.3mol Fmoc-Cys(Trt)-OH和0.3mol HOBt，用适量DMF溶解，另取0.28molHBTU，搅拌下慢慢加入，继续搅拌反应30分钟，再加入0.56molDIEA，混匀后加入到上述H-Tyr(tBu)-Wang-树脂中，偶联反应120～180分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，洗涤过滤，再用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得H-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Wang-树脂。

同上法依次接入表3剩余保护氨基酸，得到利那洛肽肽树脂：

实施例7：利那洛肽线性肽粗品的制备

取实施例3所得利那洛肽树脂，加入体积比为TFA︰水︰EDT＝90︰5︰5的混合酸解液(用量10mL/克利那洛肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重，得利那洛肽线性肽粗品，纯度为83.1％。

实施例8：利那洛肽线性肽粗品的制备

取实施例4所得利那洛肽树脂，加入体积比为TFA︰水︰EDT＝90︰5︰5的混合酸解液(用量10mL/克利那洛肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重，得利那洛肽线性肽粗品，纯度为85.8％。

实施例9：利那洛肽线性肽粗品的制备

取实施例5所得利那洛肽树脂，加入体积比为TFA︰水︰EDT＝90︰5︰5的混合酸解液(用量10mL/克利那洛肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重，得利那洛肽粗品，纯度为83.5％。

实施例10：利那洛肽线性肽粗品的制备

取实施例6所得利那洛肽树脂，加入体积比为TFA︰水︰EDT＝90︰5︰5的混合酸解液(用量10mL/克利那洛肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重，得利那洛肽线性肽粗品，纯度为84.7％。

实施例11：利那洛肽粗品的制备

取实施例7所得利那洛肽线性肽粗品,用1mmol/L半胱氨酸盐酸盐/20％DMSO(V/V)，缓冲溶液溶解并稀释至1.5mg/ml的溶液，用氨水调pH9.0，搅拌反应3小时，得到利那洛肽粗品溶液。

实施例12：利那洛肽粗品的制备

取实施例8所得利那洛肽线性肽粗品,用1mmol/L半胱氨酸盐酸盐/30％DMSO(V/V)，缓冲溶液溶解并稀释至1.5mg/ml的溶液，用氨水调pH8.5，搅拌反应3小时，得到利那洛肽粗品溶液。

实施例13：利那洛肽粗品的制备

取实施例9所得利那洛肽线性肽粗品,用1mmol/L半胱氨酸盐酸盐/5％DMSO(V/V)，缓冲溶液溶解并稀释至1.5mg/ml的溶液，用氨水调pH8.0，搅拌反应3小时，得到利那洛肽粗品溶液。

实施例14：利那洛肽粗品的制备

取实施例10所得利那洛肽线性肽粗品,用1mmol/L半胱氨酸盐酸盐/15％DMSO(V/V)，缓冲溶液溶解并稀释至1.5mg/ml的溶液，用氨水调pH7.5，搅拌反应3小时，得到利那洛肽粗品溶液。

实施例15：利那洛肽粗品纯化

取实施例11所得利那洛肽粗品用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用。

取利那洛肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；

采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到利那洛肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得利那洛肽纯品58.5g，总收率为38.3％，分子量：1527.8(100％M+H)，纯度：99.4％，最大单一杂质为0.07％。

实施例16：利那洛肽粗品纯化

取实施例12所得利那洛肽粗品用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用。

取利那洛肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；

采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到利那洛肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得利那洛肽纯品56.7g，总收率为37.1％，分子量：1527.8(100％M+H)，纯度：99.6％，最大单一杂质为0.05％。

实施例17：利那洛肽粗品纯化

取实施例13所得利那洛肽粗品用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用。

取利那洛肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；

采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到利那洛肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得利那洛肽纯品63.9g，总收率为41.8％，分子量：1527.6(100％M+H)，纯度：99.1％，最大单一杂质为0.10％。

实施例18：利那洛肽粗品纯化

取实施例14所得利那洛肽粗品用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用。

取利那洛肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；

采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到利那洛肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得利那洛肽纯品66.4g，总收率为43.5％，分子量：1527.8(100％M+H)，纯度：99.3％，最大单一杂质为0.09％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种合成利那洛肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤2、利那洛肽树脂酸解脱除所有保护基和树脂载体得到利那洛肽线性粗肽，然后采用半胱氨酸盐酸盐/DMSO缓冲溶液对利那洛肽线性粗肽进行环化，按照其N端到C端的氨基酸顺序，形成第1位Cys和第6位Cys的二硫键、第2位Cys和第10位Cys的二硫键以及第5位Cys和第13位Cys的二硫键得到利那洛肽粗品，粗品纯化转醋酸盐后即得利那洛肽成品；

所述半胱氨酸盐酸盐/DMSO缓冲溶液pH值用氨水调至7.0-9.5，半胱氨酸盐酸盐浓度为1mmol/L，DMSO体积百分浓度为3-30％。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1为：

所述剩余保护氨基酸N端保护基均为Fmoc保护基。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述偶联试剂为N,N-二异丙基乙胺、N,N-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑/4-N,N-二甲基吡啶两种之一。

4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述缩合试剂为N,N-二异丙基碳二亚胺、N,N-二环己基碳二亚胺，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷/有机碱、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯/有机碱、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐/有机碱、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯/有机碱中的一种。

5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述活化试剂为1-羟基苯并三唑或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述树脂为Trityl-Cl类树脂或羟基类树脂。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述酸解采用由体积百分比为80-95％的TFA、体积百分比为1-10％的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述环化时间为1-4h。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述半胱氨酸盐酸盐/DMSO缓冲溶液用量为每0.5-3mg利那洛肽线性肽粗品使用1mL半胱氨酸盐酸盐/DMSO缓冲溶液。