CN105111301B

CN105111301B - 一种鲑鱼降钙素的制备方法

Info

Publication number: CN105111301B
Application number: CN201510594506.4A
Authority: CN
Inventors: 龙春艳; 胡阳
Original assignee: Sichuan Jisheng Biopharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Sichuan Jisheng Biopharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2015-09-17
Filing date: 2015-09-17
Publication date: 2018-08-28
Anticipated expiration: 2035-09-17
Also published as: CN105111301A

Abstract

本发明公开了一种鲑鱼降钙素的制备方法，包括将Fmoc‑Pro‑OH与树脂偶联，获得Fmoc‑Pro‑树脂；将Fmoc‑Pro‑树脂与保护氨基酸和保护肽片段逐一偶联获得鲑鱼降钙素线性肽树脂；将鲑鱼降钙素线性肽树脂在裂解液中裂解，得到还原性粗品；将还原性粗品使用氧化剂氧化，得到氧化粗品；将氧化粗品纯化，得到鲑鱼降钙素精品。

Description

一种鲑鱼降钙素的制备方法

技术领域

本发明涉及制药技术领域，具体涉及到一种鲑鱼降钙素的制备方法。

背景技术

鲑鱼降钙素，英文名：Calcitonin(Salmon)，化学结构式如式Ⅰ：

天然降钙素是由哺乳动物的甲状旁腺细胞或非哺乳类有脊椎动物的后腮体所分泌的一种生物活性多肽，是生物体内钙调节的主要因子。其中，鲑鱼降钙素具有抑制破骨细胞的活性，从而抑制骨盐溶解，阻止骨内钙释出，改善骨密度，有效缓解疼痛症状，降低骨折的危险性，降低血钙的作用，广泛应用于临床治疗老年骨质疏松症，绝经后骨质疏松症，骨转移癌致高钙血症。

目前，鲑鱼降钙素的合成方法多是利用Fmoc-策略固相法合成鲑鱼降钙素，具体步骤如下：Fmoc-Rink Amide MBHA树脂或Rink Amide AM树脂脱Fmoc-保护后按照固相合成的方法依次连接各种保护氨基酸得到保护三十二肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，脱侧链保护基团及切肽同步进行，得还原型粗品，粗品经弱碱空气氧化反应，并经反相HPLC分离纯化，制得鲑鱼降钙素精品。但由于鲑鱼降钙素由32个氨基酸组成，属于中长肽，空间位阻大，合成收率较低。

例如，在已经公开的中国专利CN104672320A中，其公开了使用逐一偶联的方式将多种氨基酸片段连接在载体树脂上，再经过分离纯化获得鲑鱼降钙素精品。该文献公开的即是采用逐一将氨基酸接入树脂上，此外，另一种方式是将部分氨基酸形成多肽片段再接入树脂上。例如在已经公开的中国专利文献CN104177490A中，公开了将32个氨基酸使用三个多肽片段进行偶联，其中第一肽片段序列为鲑鱼降钙素序列中的第1-10位氨基酸，且第1位和第7位半胱氨酸形成二硫键，第二肽片段序列为鲑鱼降钙素序列中的第11-23位氨基酸，第三肽片段序列为鲑鱼降钙素序列中的第24-32位氨基酸。

在将氨基酸片段与树脂偶联的过程中，往往是通过保护氨基片段与树脂偶联，例如Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc--Ser(tBu)与树脂偶联时先需要进行脱Fmoc保护剂，然后将Cys或者Ser接入树脂上。在实际偶联过程中，偶联方式对成本和总收率有一定影响。例如，在使用逐一方式进行偶联过程中，发明人发现，单个氨基酸逐一偶联过程中，需要使用到含有Gly的氨基酸片段，该氨基酸片段在偶联前为Fmoc-Gly-OH，当接入该保护氨基酸片段后，发明人发现在反应环境中产生了[+1Gly]-鲑鱼降钙素和[-1Gly]-鲑鱼降钙素杂质，该杂质的化学特性与鲑鱼降钙素近似，使得分离时需要通过多次反复的纯化工艺来去除这类杂质，进而导致了生产成本高，总收率较低。

在使用若干多肽片段进行偶联时，首先是原料本身的成本较高，在进行化学偶联时原料的投料比较大，使得实际的原料利用率较低。更重要的是，使用多肽片段时由于空间位阻的关系，多肽片段不易与树脂偶联，使得投料比较大；进而增加了成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种鲑鱼降钙素的制备方法，可以提高产品的纯度，降低生产成本。

为达上述目的，本发明的一个实施例中提供了一种鲑鱼降钙素的制备方法，包括以下步骤：

(1)、将Fmoc-Pro-OH与树脂偶联，获得Fmoc-Pro-树脂；

(2)、将所述Fmoc-Pro-树脂与保护氨基酸和保护肽片段逐一偶联获得鲑鱼降钙素线性肽树脂，其中

第3位～第5位三个保护氨基酸是以保护肽片段Z进行偶联；

第20位～第21位和第28位～29位两个保护氨基酸均是以保护肽片段X进行偶联；

第23位～第24位两个保护氨基酸是以保护肽片段Y进行偶联；

其偶联氨基酸片段为：

Fmoc-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-X(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Val-Y-Lys(Boc)-X(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Z(tBu)-Thr(tBu)-Pro-树脂，

其中X为Leu-Ser，Y为Leu-Gly，Z为Gly-Ser-Gly；

(3)、将鲑鱼降钙素线性肽树脂在裂解液中裂解，得到还原性粗品；

(4)、将所述还原性粗品使用氧化剂氧化，得到氧化粗品；

(5)、将所述氧化粗品纯化，得到鲑鱼降钙素精品。

优选的，与Fmoc-Pro-OH偶联的树脂为Fmoc-Rink Amide MBHA树脂或Rink AmideAM树脂。

Fmoc-Pro-载体树脂是Fmoc-Pro-OH与去Fmoc保护基团的Fmoc-RinkAmide MBHA树脂偶联得到；最优选，Fmoc-Pro-树脂是取代值为0.45mmol/g的树脂。

本发明中，是以Fmoc-Pro-树脂中Pro氨基酸为第一位氨基酸，依次类推计算位数序号，并以Cys氨基酸为第32位即最后一位氨基酸。

优选的，步骤(1)和步骤(2)的偶联反应中加入活化剂，所述活化剂为1-羟基苯并三唑或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑。

优选的，步骤(1)和步骤(2)中选用的缩合剂为N,N-二异丙基碳二亚胺、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐或O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯中的一种；或者偶联剂即缩合剂是DIC、三乙胺和N-乙基对甲苯胺混合溶液；该混合溶液中摩尔比DIC：三乙胺：N-乙基对甲苯胺为100:2～5:2～5。缩合剂的摩尔用量为氨基树脂中氨基总摩尔数的1.2倍～6倍，优选为2.5～4.5倍。

优选的，步骤(1)和步骤(2)中选用的去Fmoc保护试剂为哌啶/N,N-二甲基甲酰胺混合溶液，混合溶液中含哌啶为10％～30％(v/v)。活化试剂的用量为氨基树脂中氨基总摩尔数的1.2倍～6倍，优选的为2.5～4.5倍。

优选的，步骤(2)中，接入X对应的保护肽片段为Fmoc-Leu-Ser(tBu)-OH；接入Y对应的保护肽片段为Fmoc-Leu-Gly-OH；接入Z对应的保护肽片段为Fmoc-Gly-Ser(tBu)-Gly–OH。

优选的，保护氨基酸或保护肽片段的用量为树脂总摩尔量的2倍～6倍；更优选为2～4倍。

优选的，Fmoc-Pro-树脂的取代值为0.2mmol/g～1.0mmol/g；更优选Fmoc-Pro-树脂的取代值为0.3～0.6mmol/g。

优选的，步骤(2)中，Fmoc-Pro-树脂与保护氨基酸和保护肽片段偶联时，先反应得到的保护氨基酸树脂脱去Fmoc保护基后再与下一个保护氨基酸偶联反应；耦联反应结束和脱去Fmoc保护后经过Kaiser Test检测。

优选的，步骤(3)中，裂解液含有三氟醋酸80％～95％(v/v)、1,2-乙二硫醇1％～10％(v/v)、三异丙基硅烷1％～5％(v/v)，溶剂为水；更优选的混合溶剂的体积配比为：TFA为90％、EDT为4％，TIS为2％，余量为水。

优选的，每克鲑鱼降钙素肽树脂使用的裂解剂用量为5～15mL；优选的，每克鲑鱼降钙素肽树脂使用的裂解剂用量为9～11mL；裂解时间为室温，裂解时间为2～6小时，优选的为3～4小时。

优选的，步骤(4)中，将所述还原性粗品溶于乙腈水溶液中，使用氧化剂碘/甲醇溶液进行氧化。

本发明通过将Gly氨基酸片段与相邻氨基酸片段连接后再与载体树脂偶联，使得在偶联环境中无[+1Gly]-鲑鱼降钙素和[-1Gly]-鲑鱼降钙素杂质，降低了原料的有效利用率，进而降低了生产成本。

其次，在还原性粗品进行氧化过程中，现有技术是将粗品加入含有水的氧化剂中进行，通常的氧化剂为双氧水或者氧气。本发明的粗品首先在乙腈水溶液中溶解，并通过碘/甲醇混合溶液进行氧化，可以提高氧化的效率，减少氧化终点的时间。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。

本发明所使用的缩写的含义列于下表中。

本发明使用的氨基酸相对应的保护氨基酸对照表

缩写	保护氨基酸形式
		Thr	Fmoc-Thr(tBu)-OH
Gly-Ser-Gly	Fmoc-Gly-Ser(tBu)-Gly-OH
		Asn	Fmoc-Asn(Trt)-OH
Arg	Fmoc-Arg(pbf)-OH
		Pro	Fmoc-Pro-OH
Tyr	Fmoc-Tyr(tBu)-OH
		Gln	Fmoc-Gln(Trt)-OH
Leu	Fmoc-Leu-OH
		Lys	Fmoc-Lys(Boc)-OH
His	Fmoc-His(Trt)-OH
		Glu	Fmoc-Glu(OtBu)-OH
Leu-Ser	Fmoc-Leu-Ser(tBu)-OH
		Leu-Gly	Fmoc-Leu-Gly-OH
Val	Fmoc-Val-OH
		Cys	Fmoc-Cys(Trt)-OH
Leu-Ser	Fmoc-Leu-Ser(tBu)-OH
		Ser	Fmoc-Ser(tBu)-OH

实施例1

制备鲑鱼降钙素肽树脂：

以Fmoc-Pro-树脂为开始载体，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次偶联保护氨基酸，制得鲑鱼降钙素肽树脂，以Pro作为第一个偶联氨基酸，Cys作为最后一个偶联氨基酸排序，偶联氨基酸片段为：

其中X为Leu-Ser，Y为Leu-Gly，Z为Gly-Ser-Gly。

接入X时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Leu-Ser(tBu)-OH；

接入Y时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Leu-Gly-OH；

接入Z时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Gly-Ser(tBu)-Gly-OH。

本发明的具体步骤如下：

(1)、将Fmoc-Rink Amide MBHA树脂或Rink Amide AM树脂为原料脱Fmoc-保护后，与Fmoc-Pro-OH偶联得到Fmoc-Pro树脂；得到的Fmoc-Pro-树脂可以是取代值为0.2～1.0mmol/g的树脂。

(2)、在Fmoc-Pro-树脂上偶联Thr

取0.15mol第2个保护氨基酸Fmoc-Thr(tBu)-OH和0.15mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.15mol DIC，搅拌下慢慢加入含有保护氨基酸的DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用。

取Fmoc-Pro-树脂111g，取代值为0.45mmol/g，用1500mL20％PIP/DMF溶液去保护30分钟，洗涤抽滤得到去Fmoc的树脂。

将活化后的第2个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂中，偶联反应2-5小时，抽滤洗涤，得含2个保护氨基酸的树脂。

(3)、接入第3～9个氨基酸或者多肽片段

使用步骤(2)中的方法，将第3～9个氨基酸片段偶联在树脂上，其中在普联第3～4个氨基酸片段时接入Z片段，接入Z片段后再依次接入第5～9个氨基酸。

(4)、接入第10个保护氨基酸

取0.2mol第10个保护氨基酸和0.2mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.2molDIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液。

将加入活化后的第10个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂，偶联反应3～5小时，过滤洗涤，得含第10个保护氨基酸的树脂。

(5)、接入第11～24个保护氨基酸或片段

采用接入第2个保护氨基酸相同方法，依次接入上述对应的第11～24个保护氨基酸或片段。

(6)、接入第25个保护氨基酸

取0.2mol第25个保护氨基酸和0.2mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.2molDCC二环己基碳二亚胺，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用；本发明中DCC作为活化剂，可以将保护氨基酸活化，使其可以与树脂进行偶联时更容易进行，反应速率快，收率也较高。通过对比试验可以得知，在加入步骤6的活化剂后，保护氨基酸的收率更高，且与未加入实验组相比具有显著性差异。

已接第24个保护氨基酸的0.1mol树脂，采用1500mL20％PIP/DMF溶液去保护两次，第一次去保护时间为15分钟，第二次去保护时间为30分钟，洗涤抽滤得到去Fmoc的树脂。

将活化后的第25个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂中，偶联反应3～5小时，抽滤洗涤，得含25个保护氨基酸的树脂。

(7)、接入第25～32个保护氨基酸或片段

采用接入第25个保护氨基酸相同方法，依次接入上述对应的第25～32个保护氨基酸或片段，得鲑鱼降钙素肽树脂。

制备鲑鱼降钙素肽树脂还原型粗品：

取鲑鱼降钙素肽树脂，加入体积比为TFA︰EDT：TIS︰水＝90︰4︰2：4的裂解液，裂解液用量为10mL/g树脂，搅拌均匀。室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末即为鲑鱼降钙素还原型粗品。

鲑鱼降钙素肽树脂还原型粗品的氧化：

取鲑鱼降钙素还原型粗品溶于乙腈溶液，溶液中鲑鱼降钙素的浓度为0.5～5mg/ml，乙腈水溶液的浓度为40％～80％，本实施例选用鲑鱼降钙素浓度为2mg/ml，溶液中乙腈的质量分数为60％。然后用碘/甲醇溶液氧化2小时，得鲑鱼降钙素粗品。

鲑鱼降钙素粗品的纯化工艺：

鲑鱼降钙素粗品溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用；

采用高效液相色谱法进行纯化，纯化的色谱柱为直径10cm、填料为粒径10um的十八烷基键合硅胶、孔径的C18柱，流动相分别为磷酸-醋酸铵缓冲液和乙腈溶液，流速为120ml/min，上样量为5～10g，色谱仪的检测波长为220nm。

取鲑鱼降钙素纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；

采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，流速为20mL/min；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到鲑鱼降钙素醋酸水溶液，冷冻干燥，得鲑鱼降钙素精品35.6g，总收率为27.7％。

分子量：3431.58(100％M+H)；纯度：99.2％。

在实施上述实施例时，缩合剂为N,N-二异丙基碳二亚胺、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐或O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯中的一种；选用的去Fmoc保护试剂为哌啶/N,N-二甲基甲酰胺混合溶液，混合溶液中含哌啶为10％～30％(v/v)。

上述实施例表明，本发明提供的方法直接避免了[+1Gly]-鲑鱼降钙素和[-1Gly]-鲑鱼降钙素杂质的产生，使纯化难度大大降低，提高了产品收率，所得产品纯度大于99.0％，具有广泛的实用价值和应用前景。

实施例2

制备鲑鱼降钙素肽树脂：

其中X为Leu-Ser，Y为Leu-Gly，Z为Gly-Ser-Gly。

接入X时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Leu-Ser(tBu)-OH；

接入Y时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Leu-Gly-OH；

接入Z时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Gly-Ser(tBu)-Gly-OH。

本发明的具体步骤如下：

(2)、在Fmoc-Pro-树脂上偶联Thr

取0.15mol第2个保护氨基酸Fmoc-Thr(tBu)-OH和0.15mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.15mol DIC和0.003mol的三乙胺和0.28mol的N-乙基对甲苯胺，搅拌下慢慢加入含有保护氨基酸的DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用。

将活化后的第2个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂中，偶联反应2-3小时，抽滤洗涤，得含2个保护氨基酸的树脂。

(3)、接入第3～9个氨基酸或者多肽片段

使用步骤(2)中的方法，将第3～9个氨基酸片段偶联在树脂上，其中在普联第3～4个氨基酸片段时接入Z片段，接入Z片段后再依次接入第5～9个氨基酸；其中使用的缩合剂为0.15mol DIC和0.003mol的三乙胺和0.28mol的N-乙基对甲苯胺。

(4)、接入第10个保护氨基酸

取0.2mol第10个保护氨基酸和0.2mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.2mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液。

将加入活化后的第10个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂，偶联反应2～3小时，过滤洗涤，得含第10个保护氨基酸的树脂。

(5)、接入第11～24个保护氨基酸或片段

采用接入第2个保护氨基酸相同方法，依次接入上述对应的第11～24个保护氨基酸或片段；所使用的缩合剂为0.15mol DIC和0.003mol的三乙胺和0.28mol的N-乙基对甲苯胺。

(6)、接入第25个保护氨基酸

将活化后的第25个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂中，加入0.15mol DIC和0.003mol的三乙胺和0.28mol的N-乙基对甲苯胺偶联反应，抽滤洗涤，得含25个保护氨基酸的树脂。

(7)、接入第25～32个保护氨基酸或片段

为了验证本实施例缩合剂的效果，实施例2采用与实施例1基本相同的实验参数，优化设计了缩合剂的组分。实施例1中采用的缩合剂大多与现有技术中相同，其缩合反应时间一般为3～5小时。本实施例的缩合剂在原有基础上进行优化，例如在步骤2和步骤4的缩合反应中，在达到相同的实验效果情况下，相比实施例1减少了1～2小时。

另外将三乙胺和N-乙基对甲苯胺作为氨基酸缩合剂进行反应时，这两种物质无法对氨基酸进行缩合，说明实施例2中三乙胺和N-乙基对甲苯胺不能够单独进行缩合反应，其是通过促进DIC的缩合效率来实现减少反应时间。

实施例3：采用逐一方式接入氨基酸

(1)、以Rink Amide MBHA树脂或Rink Amide AM树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以TBTU/HOBt或HBTU/HOBt为缩合剂，逐个接上氨基酸，获得保护三十二肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团；得还原型粗品；

(2)、加入切肽试剂TFA/EDT/H2O/TIS进行切肽，并脱侧链保护基团，然后加入乙醚沉淀粗品，获得还原型鲑鱼降钙素粗品；

(3)、在通过碘/甲醇溶液氧化，过滤，获得氧化型鲑鱼降钙素粗品；

(4)、在C18柱或C8中进行分离纯化，获得目标产物。

具体的实施参数可以参照实施例1或者CN1865283B。实施例2的接肽总收率达93.4％；粗品收率为：86.1％，总收率约为：17.2％，产品纯度为91.4％。

实施例4：通过三个多肽片段偶联

本实施例的具体步骤为：

(1)分别固相合成侧链保护的第一至第三肽片段序列；

(2)脱去侧链保护的第三肽片段序列的氨基保护基；

(3)将脱去氨基保护基的侧链保护的第三肽片段序列和侧链保护的第二肽片段序列偶联得到侧链保护的第四肽片段序列；

(4)脱去侧链保护的第四肽片段序列的氨基保护基；

(5)将脱去氨基保护基的侧链保护的第四肽片段序列和侧链保护的第一肽片段序列偶联得到全保护的鲑鱼降钙素；

(6)将全保护的鲑鱼降钙素裂解脱除保护基得到鲑鱼降钙素粗品；

(7)鲑鱼降钙素粗品经纯化换盐得到醋酸鲑鱼降钙素。

具体的实施参数可以参照实施例1或者CN104177490A，实施例4的接肽总收率为83.4％；粗品收率为：76.1％，总收率约为：14.2％，产品纯度为90.2％。

有上述实施例1～实施例4的实施结果可以得知，本发明的方法相对于现有技术具有明显的优势，在产品纯度和收率上有较大提升，对降低产品的生产成本有较大影响。

Claims

1.一种鲑鱼降钙素的制备方法，包括以下步骤：

(1)、将Fmoc-Pro-OH与树脂偶联，获得Fmoc-Pro-树脂；

(2)、将所述Fmoc-Pro-树脂与保护氨基酸逐一偶联获得鲑鱼降钙素线性肽树脂；其中

第3位～第5位三个保护氨基酸是以保护肽片段Z进行偶联；

第23位～第24位两个保护氨基酸是以保护肽片段Y进行偶联；

其偶联氨基酸片段为：

Fmoc-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-X(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Val-Y-Lys(Boc)-X(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Z(tBu)-Thr(tBu)-Pro-树脂；

X为Leu-Ser，Y为Leu-Gly，Z为Gly-Ser-Gly；

(4)、将所述还原性粗品使用氧化剂氧化，得到氧化粗品；

(5)、将所述氧化粗品纯化，得到鲑鱼降钙素精品。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述与Fmoc-Pro-OH偶联的树脂为Fmoc-RinkAmide MBHA树脂或Rink Amide AM树脂。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)和步骤(2)的偶联反应中加入活化剂，所述活化剂为1-羟基苯并三唑或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)和步骤(2)中选用的缩合剂为N,N-二异丙基碳二亚胺、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐或O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯中的一种；选用的去Fmoc保护试剂为哌啶/N,N-二甲基甲酰胺混合溶液，混合溶液中含哌啶为10％～30％(v/v)。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，接入X对应的保护肽片段为Fmoc-Leu-Ser(tBu)-OH；接入Y对应的保护肽片段为Fmoc-Leu-Gly-OH；接入Z对应的保护肽片段为Fmoc-Gly-Ser(tBu)-Gly–OH。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述保护氨基酸或保护肽片段的用量为树脂总摩尔量的2倍～6倍。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述Fmoc-Pro-树脂的取代值为0.2mmol/g～1.0mmol/g。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，Fmoc-Pro-树脂与保护氨基酸和保护肽片段偶联时，先反应得到的保护氨基酸树脂脱去Fmoc保护基后再与下一个保护氨基酸偶联反应。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，裂解液含有三氟醋酸80％～95％(v/v)、1,2-乙二硫醇1％～10％(v/v)、三异丙基硅烷1％～5％(v/v)，溶剂为水。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，将所述还原性粗品溶于乙腈水溶液中，使用氧化剂碘/甲醇溶液进行氧化。