CN104177490A

CN104177490A - 片段缩合制备醋酸鲑鱼降钙素的方法

Info

Publication number: CN104177490A
Application number: CN201410420967.5A
Authority: CN
Inventors: 常民; 王锐; 彭雅丽; 薛宏祥
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Hainan Biomaike Medical Technology Co ltd
Priority date: 2014-08-25
Filing date: 2014-08-25
Publication date: 2014-12-03
Anticipated expiration: 2034-08-25
Also published as: CN104177490B

Abstract

本发明公开了一种片段缩合制备醋酸鲑鱼降钙素的方法，所述方法包括以下步骤：1)采用固相合成法，在固相载体上合成鲑鱼降钙素的片段序列，第1-10位、第11-23位、第24-32位或第24-31位氨基酸；2)在液相依次偶联片段形成全保护鲑鱼降钙素；3)裂解全保护鲑鱼降钙素得到鲑鱼降钙素粗肽，高效液相纯化换盐得到醋酸鲑鱼降钙素纯肽。本发明利用固液相结合片段缩合的方法制备醋酸鲑鱼降钙素，提高了产率和纯度，成本低，利于大规模生产。

Description

片段缩合制备醋酸鲑鱼降钙素的方法

技术领域

本发明涉及制药领域，具体地说，涉及片段缩合制备醋酸鲑鱼降钙素的方法。

背景技术

鲑鱼降钙素为一条由32个氨基酸组成的单链，其N-末端7个氨基酸环化为二硫键。由于鲑鱼降钙素与人降钙素受体结合部位有很高的亲和力，所以比合成的哺乳类降钙素的效果更好、作用时间更长。鲑鱼降钙素通过其特异性受体，抑制破骨细胞活性。在骨吸收率增加的情况下，如骨质疏松症时，它能明显降低骨转换，甚至可使骨转换正常化。已证明鲑鱼降钙素对动物模型和人类有止痛作用，可能是直接作用于中枢神经系统的结果。因此，临床上主要用于治疗早期和晚期绝经后骨质疏松症以及老年性骨质疏松症、继发于乳腺癌、肺癌或肾癌、骨髓瘤和其他恶性肿瘤骨转移所致的高钙血症以及变形性骨炎。

目前鲑鱼降钙素的合成方法如专利CN1865283B(中国专利申请号200510025880.9)与CN103254305A(中国专利申请号201310213820.4)是利用Fmoc策略固相法合成鲑鱼降钙素，主要包括以下步骤：Fmoc-Rink Amide MBHA树脂或Rink Amide AM树脂脱Fmoc-保护后按照固相合成的方法依次连接各种保护氨基酸得到保护三十二肽树脂；其间依次脱去Fmoc保护基团；脱侧链保护基团及裂解肽同步进行，得还原型粗品；粗品经弱碱空气氧化反应，并经反相HPLC分离纯化，制得醋酸鲑鱼降钙素精品。但是由于鲑鱼降钙素由32个氨基酸组成，固相逐步合成方法产品收率低(15-20％)，而且产品纯化困难，不易得到高纯度的鲑鱼降钙素。

其他如专利CN1100789C(中国专利申请号00111438.7)公开了基因重组生产鲑鱼降钙素，然而基因表达有着工作量大、三废严重、无法大规模生产等缺点。

所以本领域技术人员仍然期待以高产品收率获得具有良好品质产品的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有合成方法收率低、产品纯化困难、不易得到高纯度的鲑鱼降钙素的缺点，提供一种利用固液相结合片段缩合的方法制备醋酸鲑鱼降钙素，提高了产率和纯度，成本低，利于大规模生产。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

方案一：

一种片段缩合制备醋酸鲑鱼降钙素的方法，固相合成3个侧链保护的肽片段序列，将各肽片段在溶液体系中逐步偶联得到全保护的鲑鱼降钙素，然后裂解脱除保护基得到鲑鱼降钙素粗品，纯化换盐得到醋酸鲑鱼降钙素纯品；

其中，所述的3个肽片段序列为：

第一肽片段序列为鲑鱼降钙素序列(从肽序列氨基至羧基的方向，以下相同)中的第1-10位氨基酸，且第1位和第7位半胱氨酸形成二硫键，

第二肽片段序列为鲑鱼降钙素序列中的第11-23位氨基酸，

第三肽片段序列为鲑鱼降钙素序列中的第24-32位氨基酸。

上述方案一，具体包括以下步骤：

(1)分别固相合成侧链保护的第一至第三肽片段序列；

(2)脱去侧链保护的第三肽片段序列的氨基保护基；

(3)将脱去氨基保护基的侧链保护的第三肽片段序列和侧链保护的第二肽片段序列偶联得到侧链保护的第四肽片段序列；

(4)脱去侧链保护的第四肽片段序列的氨基保护基；

(5)将脱去氨基保护基的侧链保护的第四肽片段序列和侧链保护的第一肽片段序列偶联得到全保护的鲑鱼降钙素；

(6)将全保护的鲑鱼降钙素裂解脱除保护基得到鲑鱼降钙素粗品；

(7)鲑鱼降钙素粗品经纯化换盐得到醋酸鲑鱼降钙素。

步骤(1)中，侧链保护的第一至第三肽片段序列分别由氨基酸依次偶联在固相载体上获得各片段序列的肽树脂，然后再经裂解去除树脂得到；

其中，侧链保护肽的第一和第二肽片段序列所用的固相载体为2-氯-三苯甲基氯树脂；侧链保护肽的第三肽片段序列所用的固相载体为Sieber树脂；

侧链保护的第一至第三肽片段序列固相合成中，

所使用的氨基脱保护试剂为20％哌啶的DMF溶液(V/V)、或者1％DBU的DMF溶液(V/V)；优选20％哌啶的DMF溶液(V/V)；

所使用的偶联剂为DIC与HOBt按摩尔比1:1的组合、或者HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合；优选HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合；待偶联的氨基酸与HOBt的摩尔比是1:1；

所使用的裂解剂为0.5～1％TFA的DCM溶液(V/V)、20％TFE的DCM溶液(V/V)、或者TFE与AcOH与DCM按照体积比1:2:7的混合物；优选1％TFA的DCM溶液(V/V)；

其中，侧链保护的第一肽片段序列固相合成完成之后，固相I₂环化第1位和第7位的半胱氨酸形成二硫键。

步骤(1)中，具体的固相合成方法，为本领域技术人员的常规技术手段。

步骤(2)或(4)中，所使用的氨基脱保护试剂为16％哌啶的DMF溶液(V/V)，或者1v/v％DBU的DMF溶液。优选16％哌啶的DMF溶液(V/V)。

步骤(3)和(5)中，所使用的偶联剂为HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者DIC与HOBt按摩尔比1:1的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合。优选HBTU与HOAt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合。步骤(3)中，脱去氨基保护基的侧链保护的第三肽片段序列与侧链保护的第二肽片段序列的摩尔比为0.85～1:1，侧链保护的第二肽片段序列与HOBt或者HOAt的摩尔比为1:1。步骤(5)中，脱去氨基保护基的侧链保护的第四肽片段序列与侧链保护的第一肽片段序列的摩尔比为0.9～1:1，侧链保护的第一肽片段序列与HOBt或者HOAt的摩尔比为1:1。

步骤(3)和(5)中，偶联反应的溶剂为DMF、DCM、NMP和DMSO中的任意一种或几种的组合。优选DMF。

步骤(6)中，使用的裂解液为TFA与H₂O按体积比95:5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与PhOH与H₂O按体积比80:5:5:5:5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与H₂O按体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合溶液。优选TFA与EDT与TIS与H₂O按体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合溶液。

步骤(7)中，所述的纯化换盐为反相高效液相色谱纯化换盐。即色谱柱为C18柱；流动相之一为0.25％醋酸的水溶液(V/V)。

方案二：

一种片段缩合制备醋酸鲑鱼降钙素的方法，固相合成3个侧链保护的肽片段序列，将第五肽片段序列的C末端与H-Pro-NH₂在溶液体系中偶联，再依次逐步偶联其余片段得到全保护的鲑鱼降钙素，然后裂解脱除保护基得到鲑鱼降钙素粗品，纯化换盐得到醋酸鲑鱼降钙素纯品；

其中，所述的3个肽片段序列为：

第二肽片段序列为鲑鱼降钙素序列中的第11-23位氨基酸，

第五肽片段序列为鲑鱼降钙素序列中的第24-31位氨基酸。

方案二具体包括以下步骤：

(1)分别固相合成侧链保护的第一、第二和第五肽片段序列；

(2)将侧链保护的第五肽片段序列与H-Pro-NH₂偶联得到侧链保护的第三肽片段序列；

(3)脱去侧链保护的第三肽片段序列的氨基保护基；

(4)将脱去氨基保护基的侧链保护的第三肽片段序列和侧链保护的第二肽片段序列偶联得到侧链保护的第四肽片段序列；

(5)脱去侧链保护的第四肽片段序列的氨基保护基；

(6)将脱去氨基保护基的侧链保护的第四肽片段序列和侧链保护的第一肽片段序列偶联得到全保护的鲑鱼降钙素；

(7)将全保护的鲑鱼降钙素裂解脱除保护基得到鲑鱼降钙素粗品；

(8)鲑鱼降钙素粗品经纯化换盐得到醋酸鲑鱼降钙素。

步骤(1)中，侧链保护的第一、第二和第五肽片段序列分别由氨基酸依次偶联在固相载体上获得各片段序列的肽树脂，然后经裂解去除树脂得到；

其中，侧链保护肽的第一、第二和第五肽片段序列所用的固相载体为2-氯-三苯甲基氯树脂；

侧链保护的第一、第二和第五肽片段序列的固相合成中，

所使用的偶联剂为DIC与HOBt按摩尔比1:1的组合、或者HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合；优选HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合；优选HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合；待偶联的氨基酸与HOBt的摩尔比是1:1；

步骤(2)、(4)和(6)中，偶联剂为HATU与DIEA按摩尔比1:2的组合、或者HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者DIC与HOBt按摩尔比1:1的组合。步骤(2)优选HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合。步骤(4)和步骤(6)优选HBTU与HOAt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合。步骤(2)中，侧链保护的第五肽片段序列与H-Pro-NH₂的摩尔比为1:3.9～4，H-Pro-NH₂与HATU或者HOBt或者HOAt的摩尔比为1:1。步骤(4)中，脱去氨基保护基的侧链保护的第三肽片段序列与侧链保护的第二肽片段序列的摩尔比为0.85～1:1，侧链保护的第二肽片段序列与HATU或者HOBt或者HOAt的摩尔比为1:1。步骤(6)中，脱去氨基保护基的侧链保护的第四肽片段序列与侧链保护的第一肽片段序列的摩尔比为0.9～1:1，侧链保护的第一肽片段序列与HATU或者HOBt或者HOAt的摩尔比为1:1。

步骤(2)、(4)和(6)中，偶联反应的溶剂为DMF、DCM、NMP和DMSO中的任意一种或几种的组合。优选DMF。

步骤(3)或(5)中，所使用的氨基脱保护试剂为16％哌啶的DMF溶液(V/V)，或者1％DBU的DMF溶液(V/V)，优选16％哌啶的DMF溶液(V/V)。

步骤(7)中，使用的裂解液为TFA与H₂O按体积比95:5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与PhOH与H₂O按体积比80:5:5:5:5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与H₂O按体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合溶液。优选TFA与EDT与TIS与H₂O按体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合溶液。

步骤(8)中，所述的纯化换盐为反相高效液相色谱纯化换盐。即色谱柱为C18柱；流动相之一为0.25％醋酸的水溶液(V/V)。

本发明合成片段缩合制备醋酸鲑鱼降钙素所涉及的目标肽(鲑鱼降钙素)及中间体的各个肽片段的氨基酸序列见表l。本发明的两种实施方案见表2。本发明所涉及的氨基酸的缩写见表3。本发明中所使用的物料缩写的含义见表4。

表1鲑鱼降钙素相应的编码氨基酸序列

表2两种实施方案

表3氨基酸的缩写

氨基酸	单字母缩写	三字母缩写
			天冬酰胺	N	Asn
精氨酸	R	Arg
			半胱氨酸	C	Cys
谷氨酰胺	Q	Gln
			谷氨酸	E	Glu

甘氨酸	G	Gly
			组氨酸	H	His
亮氨酸	L	Leu
			赖氨酸	K	Lys
脯氨酸	P	Pro
			丝氨酸	S	Ser
苏氨酸	T	Thr
			酪氨酸	Y	Tyr
缬氨酸	V	Val

本发明中，所述的“取代值”指的是单位量的树脂负载的物质的数量，单位为“mmol/g”。

表4本发明所使用的物料缩写含义

英文缩写	全称
		Fmoc-	9-芴甲氧羰基
Sieber Resin	9-Fmoc-amino-xanthen-3-yloxy-Merrifield树脂
		2-CTC Resin	2-氯-三苯甲基氯树脂
RP-HPLC	反相高效液相色谱
		DMF	N,N-二甲基甲酰胺
NMP	N-甲基吡咯烷酮
		DBU	1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯
DCM	二氯甲烷
		DIEA	N,N-二异丙基乙胺
HOBt	1-羟基苯并三氮唑
		HOAt	1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
PyBOP	六氟磷酸苯并三氮唑-1-基-氧基三吡咯烷基
		HATU	2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐
HBTU	苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐

DIC	N,N-二异丙基碳二亚胺
		TFA	三氟乙酸
TFE	三氟乙醇
		EDT	1,2-乙二硫醇
TIS	三异丙基硅烷
		Boc-	叔丁氧羰基
-Pbf	2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基
		-tBu	叔丁基
-Trt	三苯甲基

有益效果：本发明相对现有技术具有以下优点：

1、本发明利用较高荷载量的酸敏感树脂为起始原料，先采用标准的固相肽合成技术合成选定结构的高纯度肽片段，再采用液相偶联技术使肽片段缩合，从而获得高纯度(＞98.5％)、高收率(＞30％)的目标肽。

2、相比较连续固相合成鲑鱼降钙素的工艺，本发明：

a.2-氯-三苯甲基氯树脂重复使用方法简便，相比Rink Amide树脂价格低廉；每个片段可使用高荷载量(≧0.75mmol/g树脂)的固相载体，相比较Rink Amide树脂荷载量限制(0.25-0.4mmol/g树脂)，物料通量增加；

b.氨基酸及试剂投量为1.5-2倍量，远低于固相肽合成常规的3-4倍甚至5倍过量，节约物料成本；

c.固相环化利用固相载体假稀释作用，使得环化产率提高，减少反应时间。

3、采用超酸敏感型树脂合成的10个或10个以上氨基酸的侧链保护肽片段序列纯度非常高，不必用色谱技术纯化，只需要进行沉淀、研磨即可使用；片段液相偶合，其杂质主要为未偶合的片段，而不是缺少一个或数个氨基酸的缺陷肽，在最终高效液相色谱纯化中容易得多，从而减少制备次数，降低了鲑鱼降钙素的制备成本，有利于实现规模化、产业化生产。

附图说明

图1为本发明制备的醋酸鲑鱼降钙素纯肽色谱图；

图2为本发明制备的醋酸鲑鱼降钙素纯肽质谱图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：三片段制备醋酸鲑鱼降钙素。

1.树脂的合成

1.1合成Fmoc-Gly-2-氯-三苯甲基氯树脂：将2-氯-三苯甲基氯树脂(5g，取代值0.75mmol/g树脂，1eq.)加入150mL多肽合成器，用60mL DCM洗涤溶胀树脂。抽干溶剂，加入Fmoc-Gly-OH(1.5eq.)和DIEA(3eq.)的30mL DCM溶液。氩气保护机械搅拌该混合物1小时。加入色谱甲醇10mL(2ml/g树脂)对树脂上的活性部分进行30分钟封闭。排干树脂床，用3×60mL DMF、3×60mL DCM、3×60mL MeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得Fmoc-Gly-2-氯-三苯甲基氯树脂5.8107g。用紫外分光光度法测量哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的荷载量为0.53mmol/g。

1.2合成Fmoc-Pro-2-氯-三苯甲基氯树脂：将2-氯-三苯甲基氯树脂(5g，取代值0.75mmol/g树脂，1eq.)加入150mL多肽合成器，用60mL DCM洗涤溶胀树脂。排干树脂床，加入Fmoc-Pro-OH(1.3eq.)和DIEA(3eq.)的30mL DCM溶液。氩气保护机械搅拌该混合物1小时。加入色谱甲醇10mL(2ml/g树脂)对树脂上的活性部分进行30分钟封端。排干树脂床，用3×60mL DMF、3×60mL DCM、3×60mL MeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得Fmoc-Pro-2-氯-三苯甲基氯树脂5.906g。利用紫外分光光度法测量哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的荷载量为0.51mmol/g。

2.片段合成

2.1肽片段序列Boc-AA(1-10)-OH的合成：

向150mL肽反应室中加入5g Fmoc-Gly-2-氯-三苯甲基氯树脂。加入60mL DCM搅拌溶胀树脂，抽干。用2×50mL20％哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂，去除Fmoc。用50mL DMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物(二苯并富烯和其哌啶加合物)和残余哌啶，然后茚三酮试验测定。

同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-Leu-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(2eq.)、HOBT(2eq.)和DIEA(4eq.)在室温下溶解于25mL DMF中。氩气保护下把该溶液冰浴冷却至0℃，然后加入HBTU(2eq.)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用5mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×50mL DMF洗涤树脂。

依次用Fmoc-保护的氨基酸Val、Cys(Trt)、Thr(tBu)、Ser(tBu)、Leu、Asn(Trt)、Ser(tBu)和Boc-Cys(Trt)各2eq.，对所述肽序列后续单体重复该操作过程。在最后一个偶合反应后，加入6eq.的I₂/DMF，反应2.5～3小时，抽干，反复使用DMF洗涤，抽干树脂床，用3×60mL DMF、3×60mL DCM、3×60mL MeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得8.92g树脂结合肽。

用100mL1％TFA/DCM处理约1小时，然后用2×50mL0.5％TFA/DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶(与TFA体积比1:1)烧瓶中。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约10mL体积，然后用10mL DMSO重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约10mL。加入100mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约100mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得3.57g纯度93.1％Boc-AA(1-10)-OH，产率90.1％。

上述合成的片段序列Boc-AA(1-10)-OH的结构如下：

分子式：C₇₅H₁₁₃N₁₁O₁₇S₂，分子量：1492.8。

2.2肽片段序列Fmoc-AA(11-23)-OH的合成：

向150mL肽反应室中加入5g Fmoc-Pro-2-氯-三苯甲基氯树脂。在60mL DCM中溶胀树脂，抽干。用2×50mL20％哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂。用50mL DMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物(二苯并富烯和其哌啶加合物)和残余哌啶，茚三酮试验测定。

同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-Tyr(tBu)-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(2eq.)、HOBt(2eq.)和DIEA(4eq.)在室温下溶解于25mL DMF中。氩气保护下把该溶液冰浴冷却至0℃，然后加入HBTU(2eq.)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用5mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×50mLDMF洗涤树脂。

用Fmoc-保护的氨基酸Thr(tBu)、Gln(Trt)、Leu、Lys(Boc)、His(Trt)、Leu、Glu(OtBu)、Gln(Trt)、Ser(tBu)、Leu、Lys(Boc)各2当量，对所述肽序列后续单体重复该操作过程。在最后一个偶合反后，不脱去N末端Fmoc保护，3×60mL DCM、3×60mL MeOH洗涤，真空抽滤干燥至恒重，获得11.1g树脂结合肽。

用100mL1％TFA/DCM处理约1小时，然后用2×50mL0.5％TFA/DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶(与TFA体积比1:1)烧瓶中。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约10mL体积，然后用10mL DMF重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约10mL。加入100mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约100mL水洗涤。真空干燥产物，获得6.63g纯度92％的Fmoc-AA(11-23)-OH，产率88％。

上述合成的肽片段序列Fmoc-AA(11-23)-OH的结构如下：

Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-OH。

分子式：C₁₇₀H₂₁₇N₁₉O₂₇，分子量：2958.66。

2.3肽片段序列H-AA(24-32)-NH₂的合成

向150mL肽反应室中加入5g Sieber树脂(取代值：0.3mmol/g树脂)。在60mL DCM中搅拌溶胀树脂，抽干。用2×50mL20％哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂，去除Fmoc。用50mL DMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物和残余哌啶，茚三酮试验测定。

同时活化氨基酸Fmoc-Pro-OH。将Fmoc-保护的氨基酸(2eq.)、HOBt(2eq.)和DIEA(4eq.)在室温下溶解于25mL DMF中。氩气保护下把该溶液冰浴冷却至0℃，然后加入HBTU(2eq.)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用5mLDCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×50mL DMF洗涤树脂。

依次用Fmoc-保护的氨基酸Thr(tBu)、Gly、Ser(tBu)、Gly、Thr(tBu)、Asn(Trt)、Thr(tBu)、Arg(Pbf)各2当量，对所述肽序列后续单体重复该操作过程。在最后一个偶合反应后，脱去N末端Fmoc保护，用3×60mL DCM、3×60mL MeOH洗涤，真空抽滤干燥至恒重，获得7.1g树脂结合肽。

用100mL1％TFA/DCM处理约1小时，然后用2×50mL0.5％TFA/DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶(与TFA体积比1:1)烧瓶中。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约10mL体积，然后用10mL DMF重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约10mL。加入100mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约100mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得2.22g纯度95％H-AA(24-32)-NH₂，产率92％。

上述合成的片段序列H-AA(24-32)-NH₂的结构如下：

H-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-NH₂。

分子式：C₈₂H₁₂₂N₁₄O₁₇S，分子量：1608.00。

上述2.1～2.3的肽片段的固相合成过程中，所使用的氨基脱保护试剂还可以为1v/v％DBU的DMF溶液；所使用的偶联剂还可以为DIC与HOBt按摩尔比1:1的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合；所使用的裂解剂为0.5～1％v/vTFA的DCM溶液、20v/v％TFE的DCM溶液、或者TFE与AcOH与DCM按照体积比1:2:7的混合物。

3.片段缩合过程

3.1通过液相片段缩合合成Fmoc-AA(11-32)-NH₂

在100mL圆底烧瓶中加入0.542g H-AA(24-32)-NH₂(0.33mmol)、1.140g Fmoc-AA(11-23)-OH(0.385mmol)和0.0524g HOAt(0.385mmol)。将所述固体溶解于10mL DMF，加入含有0.127mL DIEA(0.77mmol)，然后在氩气保护下冷却至0℃，向冷却的溶液中加入0.146g HBTU(0.385mmol)。在0℃搅拌反应混合物1小时，然后升至室温，再搅拌1小时。加入60mL水从所述溶液中沉淀肽。真空过滤收集固体，用2×20mL水洗涤，并干燥获得1.6049g粗品Fmoc-AA(11-32)-NH₂。在室温下用100mL MTBE研磨所述固体3小时，真空过滤收集，并干燥获得1.410g Fmoc-AA(11-32)-NH₂，收率92％。

3.1中偶联反应的溶剂还可以为DCM、NMP或DMSO。偶联剂还可以为HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者DIC与HOBt按摩尔比1:1的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合。

反应过程TLC控制，TLC条件：氯仿/甲醇/TFE＝80:10:10；UV，碘检测；

H-AA(24-32)-NH₂，Rf：0.69；

Fmoc-AA(11-23)-OH，Rf：0.25；

Fmoc-AA(11-32)-NH₂，Rf：0.62。

合成的Fmoc-AA(11-32)-NH₂的结构如下：

Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-NH₂。

分子式：C₂₅₂H₃₃₇N₃₃O₄₃S，分子量：4548.64。

3.2合成H-AA(11-32)-NH₂

在50mL圆底烧瓶中加入合成的1.4g Fmoc-AA(11-32)-NH₂，加入DMF13.8mL溶解，滴加哌啶至终浓度16％，反应2小时，TLC监测，HPLC检定，反应完全后加入冰水沉淀产物，冰水洗涤2遍，真空干燥。加入60mL冷MTBE搅拌2小时去除脱除Fmoc的富烯产物，过滤沉淀，干燥，得到H-AA(11-32)-NH₂1.2601g，收率95％。

Fmoc-AA(11-32)-NH₂，Rf：0.62；

H-AA(11-32)-NH₂，Rf：0.58。

合成的H-AA(11-32)-NH₂的结构如下：

H-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-NH₂。

分子式：C₂₃₇H₃₂₇N₃₃O₄₁S，分子量：4326.40。

3.3Boc-AA(1-10)-OH(已环化)与H-AA(11-32)-NH₂缩合得到Boc-AA(1-32)-NH₂

将0.435g Boc-AA(1-10)-OH(0.29mmol)、1.2g H-AA(11-32)-NH₂(0.277mmol)、0.04gHOAt(0.29mmol)和0.12mL DIEA(0.58mmol)加入100mL圆底烧瓶中，并加入20mLDMF。将生成的溶液搅拌冷却至0-5℃。向该冷却溶液中加入0.11g HBTU(0.29mmol)。在冰浴下搅拌1小时，去除冰浴，继续搅拌1小时。加入冰水60mL沉淀肽。真空过滤收集固体，用水20ml×2洗涤，干燥，在室温下用100mL MTBE研磨所述固体3h，真空过滤收集，并干燥获得1.46g Boc-AA(1-32)-NH₂，收率90％。

3.3中偶联反应的溶剂还可以为DCM、NMP或DMSO。偶联剂还可以为HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者DIC与HOBt按摩尔比1:1的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合。

反应过程TLC控制。TLC条件：氯仿/甲醇/TFE＝80:7:7；UV，碘检测；

Boc-AA(1-10)-OH，Rf：0.27；

H-AA(11-32)-NH₂，Rf：0.54；

Boc-AA(1-32)-NH₂，Rf：0.45。

合成的Boc-AA(1-32)-NH₂的结构为：

分子式：C₃₁₂H₄₃₈N₄₄O₅₇S₃，分子量：5813.29。

4、鲑鱼降钙素的裂解及纯化

4.1通过去除侧链保护Boc-AA(1-32)-NH₂合成鲑鱼降钙素粗肽

在250mL圆底烧瓶中加入三氟乙酸/1,2-乙二硫醇/三异丙基硅烷/水为92.5:2.5:2.5:2.5溶液50mL并冷却至0℃。向该冷却溶液中加入1.1825gBoc-AA(1-32)-NH₂，在0℃搅拌所述淤浆直到所述固体溶解(约5分钟)，然后升至室温，搅拌3小时。将该溶液加入0℃乙醚70mL沉淀所述肽。以3000rpm离心旋转淤浆5分钟，从所述固体倾析乙醚。将所述固体再悬浮于50mL乙醚中，以3000rpm离心旋转5分钟，倾析乙醚。重复该过程一次，然后将固体溶解于含有1％乙酸的1:l水/乙腈30mL中，在室温下保存24小时。将该溶液冷冻，然后冷冻干燥获得680.7mg鲑鱼降钙素粗肽，产率96％。

4.1中所使用的裂解液还可以是三氟乙酸与水按体积比95:5的混合溶液、或者三氟乙酸与1,2-乙二硫醇与三异丙基硅烷与苯酚与水按体积比80:5:5:5:5的混合溶液。

4.2HPLC纯化鲑鱼降钙素粗肽

45mg鲑鱼降钙素粗肽经制备型HPLC纯化产生全长鲑鱼降钙素纯品20.7mg，纯度98.68％，产率46％。

HPLC纯化条件：色谱柱：Waters C18 250×19,5u,130A；流速：8mL/min；检测：UV，220nm；流动相：A.80％乙腈/水；B.0.25％醋酸/水；方法：20％A，5min；20％-45％A，8min；45-60％A，30min。

醋酸鲑鱼降钙素纯肽色谱图见图1，纯肽质谱图见图2。

醋酸鲑鱼降钙素的结构如下：

分子式：C₁₄₅H₂₄₀N₄₄O₄₈S₂，分子量：3431.86。

实施例2：四片段制备醋酸鲑鱼降钙素。

1.树脂合成

1.1合成Fmoc-Thr(tBu)-2-氯-三苯甲基氯树脂：将2-氯-三苯甲基氯树脂(5g，取代值0.75mmol/g树脂，1eq.)加入150mL多肽合成器，用60mL DCM溶胀树脂。抽干溶剂，加入Fmoc-Thr(tBu)-OH(1.5eq.)和DIEA(3eq.)的30mL DCM溶液。氩气保护机械搅拌该混合物1小时。加入色谱甲醇10mL(2ml/g树脂)对树脂上的活性部分进行30分钟封闭。抽干溶剂，用3×60mL DMF、3×60mL DCM、3×60mL MeOH洗涤，真空抽滤干燥至恒重，获得6.112g Fmoc-Thr(tBu)-2-氯-三苯甲基树脂。利用紫外分光光度法测量哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的荷载量为0.50mmol/g。

1.2合成Fmoc-Pro-2-氯-三苯甲基树脂同实施例1。

1.3合成Fmoc-Gly-2-氯-三苯甲基树脂同实施例1。

2.片段序列合成

2.1肽片段序列Fmoc-AA(24-31)-OH的合成

向150mL肽反应室中加入5g Fmoc-Thr(tBu)-2-氯-三苯甲基氯树脂。在60mL DCM中搅拌溶胀树脂，抽干。用2×50mL20％哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂，去除Fmoc。用50mL DMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物和残余哌啶，茚三酮试验测定。

同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-Gly-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(2eq.)、HOBt(2eq.)和DIEA(4eq.)在室温下溶解于25mL DMF中。氩气保护下把该溶液冰浴冷却至0℃，然后加入HBTU(2eq.)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用5mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×50mL DMF洗涤树脂。

用Fmoc-保护的氨基酸Ser(tBu)、Gly、Thr(tBu)、Asn(Trt)、Thr(tBu)、Arg(Pbf)各2当量，对所述肽序列后续单体重复该操作过程。在最后一个偶合反应后，不脱除最后一个氨基酸的Fmoc保护，用3×60mL DCM、3×60mL MeOH洗涤，真空抽滤干燥至恒重，获得9.01g树脂结合肽。

用100mL1％TFA/DCM处理约1小时，然后用2×50mL0.5％TFA/DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶(与TFA体积比1:1)上。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约10mL体积，然后用10mL DMSO重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约10mL。加入100mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约100mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得3.99g纯度91％Fmoc-AA(24-31)-OH，产率92％。

上述合成的片段序列Fmoc-AA(24-31)-OH的结构如下：

Fmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-OH。

分子式：C₉₂H₁₂₄N₁₂O₁₉S，分子量：1734.10。

2.2肽片段序列Boc-AA(1-10)-OH的合成同实施例1。

2.3肽片段序列Fmoc-AA(11-23)-OH的合成同实施例1。

3.片段缩合过程

3.1Fmoc-AA(24-31)-OH与Pro-NH₂缩合合成片段序列Fmoc-AA(24-32)-NH₂

在50mL圆底烧瓶中加入0.7003g Fmoc-AA(24-31)-OH(0.404mmol)，0.1841gPro-NH₂(1.61mmol)，和0.218g HOBt(1.61mmol)，将所述固体溶解于含有0.8ml DIEA(3.22mmol)的20mL DMF中，然后在氩气保护下冷却至0℃。向冷却的溶液中加入0.6124g HBTU1.61mmol。在0℃搅拌反应混合物1h，然后恢复至室温，再搅拌1h。加入60mL水从所述溶液中沉淀肽。真空过滤收集固体，用2×20ml水洗涤，真空干燥获得0.772g粗品Fmoc-AA(24-32)-NH₂。在室温下用100mL MTBE研磨所述固体3h，真空过滤收集，并干燥获得0.7238g Fmoc-AA(24-32)-NH₂，收率97.94％。

3.1中偶联反应的溶剂还可以为DCM、NMP或DMSO。偶联剂还可以为HATU与DIEA按摩尔比1:2的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者DIC与HOBt按摩尔比1:1的组合。

反应过程TLC控制，TLC条件：氯仿/甲醇/TFE＝80:8:8；UV，碘检测；

Fmoc-AA(24-31)-OH，Rf：0.45；

H-Pro-NH₂，Rf：0.15；

Fmoc-AA(24-32)-NH₂，Rf：0.69。

片段序列Fmoc-AA(24-32)-NH₂的结构：

Fmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-NH₂。

分子式：C₉₇H₁₃₂N₁₄O₁₉S，分子量：1830.23。

3.2H-AA(24-32)-NH₂的合成

在50mL圆底烧瓶中加入上述合成的0.732g Fmoc-AA(24-32)-NH₂，加入8mL DMF溶解，滴加哌啶至终浓度16％，反应2小时，TLC监测，HPLC检定，反应完全后加入40mL冰水沉淀产物，20mL冰水洗涤过滤沉淀2遍，真空干燥。加入冷冻40mL MTBE搅拌2小时去除脱除Fmoc的富烯产物，过滤沉淀，干燥，得到0.611g H-AA(24-32)-NH₂，收率95％。

Fmoc-AA(24-32)-NH₂，Rf：0.69；

H-AA(24-32)-NH₂，Rf：0.58。

合成的片段序列H-AA(24-32)-NH₂的结构如下：

H-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-NH₂。

分子式：C₈₂H₁₂₂N₁₄O₁₇S，分子量：1608.00。

3.3肽片段序列Fmoc-AA(11-32)-NH₂合成同实施案例1。

3.4肽片段序列H-AA(11-32)-NH₂合成同实施案例1。

3.5肽片段序列Boc-AA(1-32)-NH₂合成同实施案例1。

4裂解与纯化同实施例1。

Claims

1.一种片段缩合制备醋酸鲑鱼降钙素的方法，其特征在于，固相合成3个侧链保护的肽片段序列，将各肽片段在溶液体系中逐步偶联得到全保护的鲑鱼降钙素，然后裂解脱除保护基得到鲑鱼降钙素粗品，纯化换盐得到醋酸鲑鱼降钙素纯品；

其中，所述的3个肽片段序列为：

第一肽片段序列为鲑鱼降钙素序列中的第1-10位氨基酸，且第1位和第7位半胱氨酸形成二硫键，

第二肽片段序列为鲑鱼降钙素序列中的第11-23位氨基酸，

第三肽片段序列为鲑鱼降钙素序列中的第24-32位氨基酸。

2.根据权利要求1所述的片段缩合制备醋酸鲑鱼降钙素的方法，其特征在于，它包括以下步骤：

(1)分别固相合成侧链保护的第一至第三肽片段序列；

(2)脱去侧链保护的第三肽片段序列的氨基保护基；

(4)脱去侧链保护的第四肽片段序列的氨基保护基；

(7)鲑鱼降钙素粗品经纯化换盐得到醋酸鲑鱼降钙素。

3.根据权利要求2所述的片段缩合制备醋酸鲑鱼降钙素的方法，其特征在于，步骤(1)中，侧链保护的第一至第三肽片段序列分别由氨基酸依次偶联在固相载体上获得的；

侧链保护的第一至第三肽片段序列固相合成中，所使用的氨基脱保护试剂为体积百分含量为20％的哌啶的DMF溶液、或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液；所使用的偶联剂为DIC与HOBt的组合、或者HBTU与HOBt与DIEA的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA的组合；所使用的裂解剂为体积百分含量为0.5～1％的TFA的DCM溶液、体积百分含量为20％的TFE的DCM溶液、或者TFE与AcOH与DCM按照体积比1:2:7的混合物；

4.根据权利要求2所述的片段缩合制备醋酸鲑鱼降钙素的方法，其特征在于，步骤(2)或(4)中，所使用的氨基脱保护试剂为体积百分含量为16％的哌啶的DMF溶液，或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液。

5.根据权利要求2所述的片段缩合制备醋酸鲑鱼降钙素的方法，其特征在于，步骤(3)中和(5)中，所使用的偶联剂为HBTU与HOBt与DIEA的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA的组合、或者DIC与HOBt的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA的组合；步骤(3)和(5)中，偶联反应的溶剂为DMF、DCM、NMP和DMSO中的任意一种或几种的组合。

6.一种片段缩合制备醋酸鲑鱼降钙素的方法，其特征在于，固相合成3个侧链保护的肽片段序列，将第五肽片段序列C末端与H-Pro-NH₂在溶液体系中偶联，再依次逐步偶联其余片段得到全保护的鲑鱼降钙素，然后裂解脱除保护基得到鲑鱼降钙素粗品，纯化换盐得到醋酸鲑鱼降钙素纯品；

其中，所述的3个肽片段序列为：

第二肽片段序列为鲑鱼降钙素序列中的第11-23位氨基酸，

第五肽片段序列为鲑鱼降钙素序列中的第24-31位氨基酸。

7.根据权利要求6所述的片段缩合制备醋酸鲑鱼降钙素的方法，其特征在于，它包括以下步骤：

(1)分别固相合成侧链保护的第一、第二和第五肽片段序列；

(3)脱去侧链保护的第三肽片段序列的氨基保护基；

(5)脱去侧链保护的第四肽片段序列的氨基保护基；

(8)鲑鱼降钙素粗品经纯化换盐得到醋酸鲑鱼降钙素。

8.根据权利要求7所述的片段缩合制备醋酸鲑鱼降钙素的方法，其特征在于，步骤(1)中，侧链保护的第一、第二和第五肽片段序列分别由氨基酸依次偶联在固相载体上获得的；

侧链保护的第一、第二和第五肽片段序列的固相合成中，所使用的氨基脱保护试剂为体积百分含量为20％的哌啶的DMF溶液、或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液；所使用的偶联剂为DIC与HOBt的组合、或者HBTU与HOBt与DIEA的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA的组合；所使用的裂解剂为体积百分含量为0.5～1％的TFA的DCM溶液、体积百分含量为20％的TFE的DCM溶液、或者TFE与AcOH与DCM按照体积比1:2:7的混合物；

9.根据权利要求7所述的片段缩合制备醋酸鲑鱼降钙素的方法，其特征在于，步骤(2)、(4)和(6)中，所使用的偶联剂为HATU与DIEA的组合、或者HBTU与HOBt与DIEA的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA的组合、或者DIC与HOBt的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA的组合；步骤(2)、(4)和(6)中，偶联反应的溶剂为DMF、DCM、NMP和DMSO中的任意一种或几种的组合。

10.根据权利要求7所述的片段缩合制备醋酸鲑鱼降钙素的方法，其特征在于，步骤(3)或(5)中，所使用的氨基脱保护试剂为体积百分含量为16％的哌啶的DMF溶液，或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液。