CN113512105A - 一种依降钙素的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种依降钙素的制备方法，包括以树脂为固相合成载体按照依降钙素氨基酸序列中的Arg23‑Pro31、Lys10‑Pro22和Ser1‑Leu8序列片段分别缩合制备依降钙素肽树脂I、II和III、分别裂解得依降钙素片段I、II和III；依降钙素片段III与H‑Gly‑OtBu缩合得依降钙素肽片段IV、环化得片段V，裂解得片段VI；将依降钙素肽片段I、II和VI按照依降钙素的氨基酸序列顺序缩合得依降钙素肽片段IX、裂解、纯化即得依降钙素。本发明降低了纯化难度，缩短合成周期，降低了投料量，大大降低了物料成本，提高了产品收率，利于大规模生产。

Description

一种依降钙素的制备方法
技术领域
本发明涉及药物制备技术领域，具体涉及一种依降钙素的制备方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
依降钙素的分子式为C148H244N42O47，分子量为3363.77，其结构为：
Figure BDA0003011449080000011
依降钙素可用于治疗骨质疏松症引起的骨痛，能够抑制破骨细胞活性，减少骨的吸收，防止骨钙丢失具有改善骨强度、骨皮质厚度、骨钙质含量、骨密度等作用。依降钙素是鲑鱼降钙素的衍生物，二者的主要差别为鲑鱼降钙素是由N端Cys1的巯基与Cys6的巯基形成二硫键的长链环肽，而依降钙素由31个氨基酸残基组成、N端Ser1的氨基与Asu6侧链羧基形成酰胺环的长链环肽，相对而言依降钙素的结构更为复杂。
目前依降钙素通过化学合成法进行制备，专利US 5739272公开了两种合成方式：一种是将依降钙素的序列分为两个片段，片段1(Ser1～Gly9)和片段2(Lys10～Pro31)，片段1(Ser1～Gly9)通过固相合成的方式获取，裂解后再缩合至Lys10～Pro31-树脂，由于固相合成方法的假稀释效应，在片段缩合时羧基组分是大大过量的(通常为2至5倍摩尔当量)，因此通过片段合成的方法需要更大的投料量，Asu价格十分昂贵，增加Asu的消耗量，增加生产成本；另一种是采用逐个氨基酸单独偶联的方式在树脂上进行合成。专利EP0452514B1采用Boc策略进行依降钙素的合成，将依降钙素的序列分为两个片段：Ser1～Gly9和Lys10～Pro31，片段Ser1～Gly9是通过全液相合成的方式进行制备，与固相合成方法相比液相合成操作后处理步骤繁琐，需要反复的浓缩、中和、洗涤、萃取、沉淀、重复沉淀等步骤，反应收率低、反应周期长，且许多反应步骤须在低温条件下进行。将片段Ser1～Gly9缩合至Lys10～Pro31-MBHA树脂，需要使用酸性、腐蚀性更强的HF裂解肽树脂。并且采用Boc合成策略时每个氨基酸偶联完毕脱Boc的过程中均需使用TFA脱除每个氨基酸N端的Boc保护基，然后使用碱对TFA中和，再用溶剂对其洗涤；而采用Fmoc合成策略只需要使用20％的哌啶/DMF脱除每个氨基酸N端的Boc保护基，只通过溶剂洗涤一种方式即可。此外，由于采用Boc合成策略，因此所需的氨基酸为Boc保护氨基酸，随着固相多肽合成技术的不断发展进步现如今Boc合成策略基本被淘汰，当下的固相多肽合成基本完全采用Fmoc合成策略，保护氨基酸的生产厂家基本以生产Fmoc保护氨基酸为主，很少生产Boc保护氨基酸，因此Boc保护氨基酸均不是常规的保护氨基酸，需要定制、延长货期。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种依降钙素的制备方法，解决了现有技术的生产周期长、生产效率低、保护氨基酸消耗量大的问题。本发明采用片段合成法通过固相合成的方式同时进行3个片段的合成，采用液相片段缩合的方式得到全长的依降钙素，降低了纯化难度，缩短合成周期，在液相合成体系进行片段缩合降低了投料量，大大降低了物料成本，提高了产品收率，利于大规模生产。
具体地，本发明的技术方案如下所述：
本发明提供了一种依降钙素的制备方法，其包括：以树脂为固相合成载体按照依降钙素氨基酸序列中的Arg23-Pro31、Lys10-Pro22和Ser1-Leu8序列片段分别缩合制备得到依降钙素肽树脂I、II和III，然后分别裂解得到依降钙素片段I、II和III；其中，依降钙素片段III继续与H-Gly-OtBu缩合得到依降钙素肽片段IV，该片段环化得到依降钙素肽片段V，然后裂解得到依降钙素肽片段VI；将依降钙素肽片段I、II和VI按照依降钙素的氨基酸序列顺序进行缩合得到依降钙素肽片段IX，然后裂解得到依降钙素粗肽，纯化该粗肽即得依降钙素。
在本发明的实施方式中，依降钙素肽树脂I的制备方法包括：以氨基树脂为固相合成载体，树脂经溶胀、脱去Fmoc保护基和洗涤后，依次从C端至N端缩合Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH，脱去N端Fmoc保护基得到依降钙素肽树脂I，其结构为H-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-氨基树脂；
裂解依降钙素肽树脂I得到的依降钙素片段I的结构为：H-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-NH2。
在本发明的实施方式中，依降钙素肽树脂II的制备方法包括：以Fmoc-Pro-CTC树脂为固相合成载体，树脂经溶胀、脱去Fmoc保护基和洗涤后，依次从C端至N端缩合Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH，得到依降钙素肽树脂II，其结构为Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-CTC树脂。
裂解依降钙素肽树脂II得到的依降钙素片段II的结构为：Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-OH；
在本发明的实施方式中，依降钙素肽树脂III的制备方法包括：以Fmoc-Leu-CTC树脂为固相合成载体，树脂经溶胀、脱去Fmoc保护基和洗涤后，依次从C端至N端缩合Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asu(OBzl)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH，得到依降钙素肽树脂III，其结构为Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OBzl)-Val-Leu-CTC树脂。
裂解依降钙素肽树脂III得到的依降钙素片段III的结构为：Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OBzl)-Val-Leu-OH。
在本发明的实施方式中，依降钙素肽片段IV的结构为：Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OBzl)-Val-Leu-Gly-OtBu；依降钙素肽片段IV环化后得到的依降钙素肽片段V的结构为：Cyclo(Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu)-Val-Leu-Gly-OtBu；该片段裂解后得到依降钙素肽片段VI，其结构为：Cyclo(Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Asu)-Val-Leu-Gly-OH。
在本发明的一些实施方式中，制备降钙素肽片段V时，涉及保护基OBzl和Fmoc的脱除，可使用Pd/C在H2存在条件下实现对OBzl保护基的脱除，以及使用二乙胺或三乙胺脱除Fmoc保护基。
在本发明的实施方式中，依降钙素肽片段IX的制备包括：依降钙素肽片段I和II缩合制备依降钙素肽片段VII，其结构为Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-NH2；
依降钙素肽片段VII脱除Fmoc保护基得到依降钙素肽片段VIII，其结构为：H-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-NH2；在本发明的一些实施方式中，使用二乙胺或三乙胺脱除肽片段中的Fmoc保护基；
依降钙素肽片段VI与依降钙素肽片段VIII缩合制备得到依降钙素肽片段IX，其结构为Cyclo(Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Asu)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-NH2。
在本发明的实施方式中，Fmoc-Pro-氨基树脂的制备方法包括：将Fmoc-Pro-OH缩合至脱除Fmoc保护基的氨基树脂中，并进行封闭反应得到；所述氨基树脂为替代度为0.5-1.2mmol/g的Sieber树脂。
在本发明的实施方式中，Fmoc-Pro-CTC树脂的替代度为0.5-1.2mmol/g，Fmoc-Leu-CTC树脂的替代度为0.5-1.2mmol/g。
在本发明的实施方式中，Fmoc-Pro-氨基树脂、Fmoc-Pro-CTC树脂以及Fmoc-Leu-CTC树脂在使用时，均需进行溶胀以及脱除Fmoc保护的操作，其中，在本发明的一些实施方式中，脱除Fmoc保护基的方法包括：分别向上述溶胀后的树脂中加入PIP/DMF溶液(比如20％PIP/DMF(v/v))，在15-35℃条件下进行至少两次脱Fmoc保护，脱Fmoc保护后，使用DMF洗涤树脂至pH中性。
在本发明的实施方式中，如无特殊说明，参与缩合的氨基酸均需进行活化处理，所述活化方法包括将待缩合的氨基酸加入到缩合体系中。
在本发明的实施方式中，依降钙素肽树脂I、II和III的制备、依降钙素片段III和H-Gly-OtBu的缩合、以及依降钙素片段I、II和III的缩合均在缩合体系中进行，所述缩合体系为A/D或B/C体系，其中，A为HOBT或HOAT，B为HATU、HBTU、TBTU或PyBOP，C为DIEA或TMP，D为DIC或EDC。
在本发明的一些实施方式中，缩合合成依降钙素肽树脂I、II和III时，采用A/D缩合体系，其中以A为HOBT、D为DIC为优，两者的摩尔比为2-5:2-5。
在本发明的一些实施方式中，缩合合成依降钙素肽片段IV时，采用B/C缩合体系，其中以B为HBTU，C为DIEA为优，两者的摩尔比为2-5:2-5。
在本发明的一些实施方式中，依降钙素肽片段I与依降钙素肽片段II缩合制备依降钙素肽片段VII，采用B/C缩合体系，其中以B为HBTU，C为DIEA为优，两者的摩尔比为2-5:2-5。
在本发明的一些实施方式中，依降钙素肽片段VI与依降钙素肽片段VIII缩合，采用B/C缩合体系，其中以B为HBTU，C为DIEA为优，两者的摩尔比为2-5:2-5。
在本发明的实施方式中，裂解时加入裂解液，所述裂解液选自TFA、DCM、TFE、TIS、EDT、苯甲硫醚和H2O中的至少2种；
优选地，所述裂解液选自TFA/DCM、DCM/TFE、TFA/TIS/H2O、TFA/TIS/EDT/H2O和TFA/苯甲硫醚/TIS/EDT/H2O。
在本发明的一些实施方式中，裂解依降钙素肽树脂I时，加入裂解液，在15-35℃条件下反应1.5-3h后进行抽滤，使用旋转蒸发仪将滤液减压蒸馏至无液体，得到依降钙素片段I，所述裂解液为TFA/DCM，优选为1％TFA/DCM(v/v)。
在本发明的一些实施方式中，裂解依降钙素肽树脂II或III时，加入裂解液，在15-35℃条件下反应1.5-3h后进行抽滤，使用旋转蒸发仪将滤液减压蒸馏至无液体，得到依降钙素片段II或III，所述裂解液为DCM/TFE，比如其一种优选配比为DCM:TFE＝80:20(v/v)。
在本发明的一些实施方式中，裂解依降钙素肽片段V时，加入裂解液，在15-35℃条件下反应1.5-3h后进行抽滤，使用旋转蒸发仪将滤液减压蒸馏至无液体，得到依降钙素肽片段VI，所述裂解液为TFA/TIS/H2O，比如其一种优选配比为TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5(v/v/v)。
在本发明的一些实施方式中，裂解依降钙素肽片段IX时，加入裂解液，在15-35℃条件下反应2-5h后，抽滤，将滤液加至预冷的MTBE中进行沉淀、离心，再用MTBE将沉淀洗涤，真空干燥，得依降钙素粗肽；所述裂解液为TFA/苯甲硫醚/TIS/EDT/H2O，比如其一种优选配比为TFA：苯甲硫醚:TIS:EDT:H2O＝90:2.5:2.5:2.5:2.5(v/v/v/v/v)。
在本发明的实施方式中，依降钙素肽片段IV经环化得到依降钙素肽片段V，环化反应在环化体系中进行，环化体系为环化体系为A/D体系或B/C体系，其中，A为HOBT或HOAT，B为HATU、HBTU、TBTU或PyBOP，C为DIEA或TMP，D为DIC或EDC。
在本发明的一些实施方式中，所述环化体系为HOBT/EDC体系，其摩尔比以1-2:1-2为优。
在本发明的一些实施方式中，依降钙素粗肽的纯化方法包括：采用反相高效液相色潽法对依降钙素粗肽进行两步纯化，所述第一步纯化的流动相为：流动相A相为0.1％的TFA/H2O(v/v)溶液，流动相B相为0.1％的TFA/ACN(v/v)溶液，第二步纯化为转盐纯化，流动相为：流动相A相为0.1％的醋酸/H2O(v/v)溶液，流动相B相为0.1％的醋酸/ACN(v/v)溶液。
相较于现有技术，本发明的优势在于：
本发明采用固相合成和液相合成结合的方式合成制备依降钙素，将依降钙素分划分为3个片段，采用固相合成法同时进行3个片段的合成，在液相体系中将片段I、片段II和修饰后的片段III进行缩合得到保护依降钙素肽，大大提高了合成效率，有效缩短了依降钙素的生产周期，降低了纯化难度，提高了产品收率，利于大规模生产，避免了传统的采用逐个氨基酸进行偶联、再进行环化的方法中合成过程中出现困难序列、氨基酸缩合反应不完全、产生缺失肽、纯化困难、收率低的缺陷。在液相体系进行片段缩合有效避免了固相合成中的假稀释效应，降低了投料量，尤其是价格高昂的Asu，降低了生产成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明中所使用的缩写的具体含义列于下表中：
Figure BDA0003011449080000071
Figure BDA0003011449080000081
Figure BDA0003011449080000091
实施例1
依降钙素肽树脂I的制备
(1)Sieber树脂的溶胀：取15.4g替代度为0.78mmol/g的Sieber树脂，加入DCM将树脂溶胀0.5h，抽干溶剂，再用DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂。
(2)Fmoc保护基的脱除：向步骤(1)溶胀后的Sieber树脂中，加入20％PIP/DMF(v/v)溶液，在30℃条件下进行两次脱Fmoc保护：第一次脱Fmoc保护和第二次脱Fmoc保护，再用DMF洗涤树脂pH至7，抽干溶剂；第一次脱Fmoc保护时间为5min，第二次脱Fmoc保护时间10min。
(3)Fmoc-Pro-Sieber树脂的制备：(a)将36mmol Fmoc-Pro-OH与36mmol HOBT用适量的DMF溶解，加入40mmol DIC，在30℃条件下反应5min后，将活化后的氨基酸加至脱除Fmoc保护基的Sieber树脂中，在30℃条件下进行氨基酸的缩合反应2h后，排空反应液，再用DMF洗涤树脂3次；(b)将72mmol DIEA、72mmol乙酸酐和DMF的混合溶液加至树脂中，在30℃条件下反应30min对树脂进行封闭反应，排空反应液，再用DMF洗涤树脂3次。
(4)氨基酸活化：分别将36mmol Fmoc-Thr(tBu)-OH、36mmol Fmoc-Gly-OH、36mmolFmoc-Ala-OH、36mmol Fmoc-Gly-OH、36mmol Fmoc-Val-OH、36mmol Fmoc-Asp(OtBu)-OH、36mmol Fmoc-Thr(tBu)-OH、36mmol Fmoc-Arg(Pbf)-OH与36mmol HOBT用适量的DMF溶解，加入40mmol DIC，在30℃条件下反应5min。
(5)氨基酸缩合反应：将步骤(4)中活化后的Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH依次加至脱除Fmoc保护基的树脂中，在25℃条件下进行氨基酸的缩合反应2h，茚三酮显色反应监控反应进程，得到依降钙素肽树脂I：H-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Sieber树脂。
茚三酮显色方法为：取少量树脂置于试管中，DMF洗涤两次，在试管中分别加入体积分数85％苯酚-乙醇溶液、吡啶和质量分数5％茚三酮-乙醇溶液各两滴，于110℃条件下加热反应3min后，用DMF洗涤两次，观察树脂颜色。
(6)依降钙素肽树脂收缩：用溶剂MeOH洗涤肽树脂5次，时间为5min/次，排空溶剂，将依降钙素肽树脂置于真空干燥箱30℃下干燥，得到干燥后的依降钙素肽树脂。
实施例2
依降钙素肽树脂II的制备
(1)Fmoc-Pro-CTC树脂的溶胀：取14.7g替代度为0.75mmol/g的Fmoc-Pro-CTC树脂，加入DCM将树脂溶胀0.5h，抽干溶剂，再用DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂。
(2)Fmoc保护基的脱除：在25℃条件下加入20％PIP/DMF(v/v)溶液进行两次脱除Fmoc保护：第一次脱除Fmoc保护和第二次脱除Fmoc保护，再用DMF洗涤树脂pH至7，抽干溶剂；第一次脱除Fmoc保护反应时间为5min，第二次脱除Fmoc保护反应时间为10min。
(3)氨基酸活化：分别将33mmol Fmoc-Tyr(tBu)-OH、33mmol Fmoc-Thr(tBu)-OH、33mmol Fmoc-Gln(Trt)-OH、33mmol Fmoc-Leu-OH、33mmol Fmoc-Lys(Boc)-OH、33mmolFmoc-His(Trt)-OH、33mmol Fmoc-Leu-OH、33mmol Fmoc-Glu(OtBu)-OH、33mmol Fmoc-Gln(Trt)-OH与33mmol HOBT用适量的DMF溶解，加入37mmol DIC，在25℃条件下反应5min。
(4)氨基酸缩合反应：将活化后的Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH依次加至脱除Fmoc保护基的树脂中，在25℃条件下进行氨基酸的缩合反应2h，茚三酮显色反应监控反应进程，得到依降钙素肽树脂II：Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-CTC树脂。
(5)依降钙素肽树脂收缩：用溶剂MeOH洗涤肽树脂5次，时间为5min/次，排空溶剂，将依降钙素肽树脂置于真空干燥箱30℃下干燥，得到干燥后的依降钙素肽树脂。
实施例3
依降钙素肽树脂III的制备
(1)Fmoc-Leu-CTC树脂的溶胀：取11.3g替代度为0.89mmol/g的CTC树脂，加入DCM将树脂溶胀0.5h，抽干溶剂，再用DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂。
(2)Fmoc保护基的脱除：在25℃条件下加入20％PIP/DMF(v/v)溶液进行两次脱除Fmoc保护：第一次脱除Fmoc保护和第二次脱除Fmoc保护，再用DMF洗涤树脂pH至7，抽干溶剂；第一次脱除Fmoc保护反应时间为5min，第二次脱除Fmoc保护反应时间为10min。
(3)氨基酸活化：分别将30mmol Fmoc-Val-OH、30mmol Fmoc-Asu(OBzl)-OH、30mmol Fmoc-Thr(tBu)-OH、30mmol Fmoc-Ser(tBu)-OH、30mmol Fmoc-Leu-OH、30mmolFmoc-Asn(Trt)-OH、30mmol Fmoc-Ser(tBu)-OH与30mmol HOBT用适量的DMF溶解，加入33mmol DIC，在25℃条件下反应5min。
(4)氨基酸缩合反应：将活化后的Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asu(OBzl)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH依次加至脱除Fmoc保护基的树脂中，在25℃条件下进行氨基酸的缩合反应2h，茚三酮显色反应监控反应进程，得到依降钙素肽树脂III：Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OBzl)-Val-Leu-CTC树脂。
(5)依降钙素肽树脂收缩：用溶剂MeOH洗涤肽树脂5次，时间为5min/次，排空溶剂，将依降钙素肽树脂置于真空干燥箱30℃下干燥，得到干燥后的依降钙素肽树脂。
实施例4
依降钙素肽片段I的制备
将实施例1制得的依降钙素肽树脂I置于圆底烧瓶中按照裂解液1％TFA/DCM(v/v)的体积与依降钙素肽树脂II的质量比值为10:1的比例加入裂解液，在25℃条件下反应2h后进行抽滤，使用旋转蒸发仪将滤液减压蒸馏至无液体，得到依降钙素片段I：H-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-NH2。
实施例5
依降钙素肽片段II的制备
将实施例2制得的依降钙素肽树脂II置于圆底烧瓶中按照裂解液(DCM:TFE＝80:20(v/v))的体积与依降钙素肽树脂I的质量比值为10:1的比例加入裂解液，在25℃条件下反应2h后进行抽滤，使用旋转蒸发仪将滤液减压蒸馏至无液体，得到依降钙素片段II：Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-OH。
实施例6
依降钙素肽片段III的制备
将实施例3制得的依降钙素肽树脂III置于圆底烧瓶中按照裂解液(DCM:TFE＝80:20(v/v))的体积与依降钙素肽树脂I的质量比值为10:1的比例加入裂解液，在25℃条件下反应2h后进行抽滤，使用旋转蒸发仪将滤液减压蒸馏至无液体，得到依降钙素片段III：Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OBzl)-Val-Leu-OH。
实施例7
依降钙素肽片段IV的制备
(1)将实施例6得到的固体、11mmol H-Gly-OtBu和11mmol HBTU溶于0.3L DMF，在N2保护下将溶液降温至0℃，搅拌条件下加入11mmol DIEA进行反应1h，随后将反应液升温至25℃继续反应3h。
(2)在搅拌条件下将步骤(1)的反应液滴加至10倍反应液体积的预冷(0～10℃)的水中对肽片段进行沉淀，搅拌10min后用布氏漏斗进行抽滤，收集固体。
(3)将步骤(2)得到的固体加至5％DMF/H2O中，搅拌10min后用布氏漏斗进行抽滤，重复此步骤两次，收集固体。
(4)将步骤(3)得到的固体加至H2O中，搅拌10min后用布氏漏斗进行抽滤，收集固体置于真空干燥箱30℃下干燥，得到依降钙素肽片段IV：Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OBzl)-Val-Leu-Gly-OtBu。
实施例8
降钙素肽片段V的制备
(1)脱除OBzl保护基：(a)在圆底烧瓶中将实施例7制得的依降钙素肽片段IV溶于1L DCM/MeOH(50/50，v/v)溶液。(b)向烧瓶内加入1g 5％Pd/C，在H2存在下脱除OBzl保护基，反应12h，TLC(流动相为DCM:MeOH＝50:1)检测无底物存在，反应完全。(c)进行抽滤，收集滤液，使用旋转蒸发仪将滤液减压蒸馏至无液体。
(2)脱除Fmoc保护基：(a)将步骤(1)得到的固体加至圆底烧瓶中加0.5L DMF/DCM(1/1，v/v)溶解，加入100mmol三乙胺，30℃反应6h后，在搅拌条件下将步骤(1)的反应液滴加至10倍反应液体积的预冷(0～10℃)的水中对肽片段进行沉淀，10min后用布氏漏斗进行抽滤，重复此步骤两次。(b)收集固体置于真空干燥箱30℃下干燥。
(3)环化：(a)将依降钙素肽片段IV和11mmol HOBT溶于50％DMF/DCM，在N2保护下将溶液降温至0℃，搅拌条件下加入12mmol EDC进行反应1h，随后将反应液升温至25℃继续反应24h。(b)搅拌条件下将步骤(a)的反应液滴加至10倍反应液体积的预冷(0～10℃)的水中对肽片段进行沉淀，搅拌10min，随后用布氏漏斗进行抽滤，收集固体。(c)将步骤(b)得到的固体加至5％DMF/H2O中，搅拌10min，随后用布氏漏斗进行抽滤，重复此步骤两次，收集固体。(d)将步骤(c)得到的固体加至5％DMF/H2O中，搅拌10min，随后用布氏漏斗进行抽滤，收集固体置于真空干燥箱30℃下干燥，得到依降钙素肽片段V：Cyclo(Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu)-Val-Leu-Gly-OtBu。
实施例9
降钙素肽片段VI的制备
(1)将实施例8制得的依降钙素片段V溶于0.2L预冷(0～10℃)的裂解液(TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5，v/v/v)，25℃水解2h。(2)将反应液滴加至10倍反应液体积预冷(0～10℃)的MTBE中进行沉淀、离心，再用MTBE将沉淀洗涤3次，将沉淀置于真空干燥箱30℃下干燥，得到依降钙素肽片段VI：Cyclo(Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Asu)-Val-Leu-Gly-OH。
实施例10
依降钙素肽片段IX的制备
(1)依降钙素肽片段I与依降钙素肽片段II缩合：(a)将实施例4制得的依降钙素肽片段I溶于0.5L DMF，用DIEA调pH至中性，加入实施例5获得的依降钙素肽片段和11mmolHBTU进行溶解，在N2保护下将溶液降温至0℃，搅拌条件下加入11mmol DIEA进行反应1h，随后将反应液升温至25℃继续反应3h。(b)搅拌条件下将步骤(a)的反应液滴加至10倍反应液体积的预冷(0～10℃)的水中对肽片段进行沉淀，用布氏漏斗进行抽滤，重复此步骤两次。(c)将步骤(b)得到的固体加至5％DMF/H2O中，搅拌10min，随后用布氏漏斗进行抽滤，重复此步骤两次，收集固体。(d)将步骤(c)得到的固体加至H2O中，搅拌10min，随后用布氏漏斗进行抽滤，收集固体置于真空干燥箱30℃下干燥，得到依降钙素肽片段VII：Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-NH2。
(2)脱除Fmoc保护基：将步骤(1)固体用500ml DMF/DCM溶解，加入100mmol三乙胺，30℃反应2h后，在搅拌条件下将步骤(1)的反应液滴加至10倍反应液体积的预冷(0～10℃)的水中对肽片段进行沉淀，10min后用布氏漏斗进行抽滤，重复此步骤两次，收集固体置于真空干燥箱30℃下干燥，得到依降钙素肽片段VIII：H-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-NH2。
(3)依降钙素肽片段VI与依降钙素肽片段VIII缩合：(a)将实施例9制得的依降钙素肽片段VI溶于1000ml DMF并加DIEA中和、再将步骤(2)获得的依降钙素肽片段VIII和11mmol HBTU加入溶解，在N2保护下将溶液降温至0℃，搅拌条件下加入12mmol DIEA进行反应1h，随后将反应液升温至25℃继续反应6h。(b)搅拌条件下将步骤(a)的反应液滴加至10倍反应液体积的预冷(0～10℃)的水中对肽片段进行沉淀，搅拌10min，随后用布氏漏斗进行抽滤，收集固体置于真空干燥箱30℃下干燥，得到保护依降钙素肽片段IX：Cyclo(Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Asu)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-NH2。
实施例11
保护依降钙素肽IX的裂解
(1)将实施例10制得的保护依降钙素肽X溶于500ml预冷(0～10℃)的裂解液(TFA:苯甲硫醚:TIS:EDT:H2O＝90:2.5:2.5:2.5:2.5，v/v/v/v/v)，25℃水解2h脱除侧链保护基。(2)将反应液滴加至10倍体积预冷(0～10℃)的MTBE中进行沉淀、离心，再用MTBE将沉淀洗涤3次，收集固体置于真空干燥箱30℃下干燥，得到依降钙素粗肽，HPLC纯度为70％。
实施例12
依降钙素粗肽的纯化
采用反相高效液相色潽法对粗肽进行两步纯化：第一步纯化和第二步纯化，所述第一步纯化：流动相A相为0.1％TFA/H2O(v/v)溶液，流动相B相为0.1％TFA/ACN(v/v)溶液，第二步转盐纯化：流动相A相为0.1％AcOH/H2O(v/v)溶液，流动相B相为0.1％AcOH/ACN(v/v)溶液。
经纯化、冻干得依降钙素产品，经检测产品HPLC纯度为98.9％，总收率42％。
对比例
逐个氨基酸缩合的方法制备依降钙素
按照依降钙素的序列从C端至N端依次逐个偶联相应的Fmoc-保护氨基酸进行线性依降钙素肽树脂的合成。实验过程中发现从Val7之后的N端氨基酸的缩合反应均困难，均需使用HBTU+DIEA的缩合体系进行复投，并且需要进行封闭反应。得到的依降钙素粗肽的HPLC纯度仅为32％。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种依降钙素的制备方法，其包括：以树脂为固相合成载体按照依降钙素氨基酸序列中的Arg23-Pro31、Lys10-Pro22和Ser1-Leu8序列片段分别缩合制备得到依降钙素肽树脂I、II和III，然后分别裂解得到依降钙素片段I、II和III；其中，依降钙素片段III继续与H-Gly-OtBu缩合得到依降钙素肽片段IV，该片段环化得到依降钙素肽片段V，然后裂解得到依降钙素肽片段VI；将依降钙素肽片段I、II和VI按照依降钙素的氨基酸序列顺序进行缩合得到依降钙素肽片段IX，然后裂解得到依降钙素粗肽，纯化该粗肽即得依降钙素。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，依降钙素肽树脂I的制备方法包括：以氨基树脂为固相合成载体，树脂经溶胀、脱去Fmoc保护基和洗涤后，依次从C端至N端缩合Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH，脱去N端Fmoc保护基得到依降钙素肽树脂I，其结构为H-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-氨基树脂；
优选地，裂解依降钙素肽树脂I得到的依降钙素片段I的结构为：H-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-NH2。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，依降钙素肽树脂II的制备方法包括：以Fmoc-Pro-CTC树脂为固相合成载体，树脂经溶胀、脱去Fmoc保护基和洗涤后，依次从C端至N端缩合Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH，得到依降钙素肽树脂II，其结构为Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-CTC树脂；
优选地，裂解依降钙素肽树脂II得到的依降钙素片段II的结构为：Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-OH。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，依降钙素肽树脂III的制备方法包括：以Fmoc-Leu-CTC树脂为固相合成载体，树脂经溶胀、脱去Fmoc保护基和洗涤后，依次从C端至N端缩合Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asu(OBzl)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH，得到依降钙素肽树脂III，其结构为Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OBzl)-Val-Leu-CTC树脂；
优选地，裂解依降钙素肽树脂III得到的依降钙素片段III的结构为：Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OBzl)-Val-Leu-OH。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，依降钙素肽片段IV的结构为：Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OBzl)-Val-Leu-Gly-OtB u；依降钙素肽片段IV环化后得到的依降钙素肽片段V的结构为：Cyclo(Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu)-Val-Leu-Gly-OtBu；该片段裂解后得到依降钙素肽片段VI，其结构为：Cyclo(Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Asu)-Val-Leu-Gly-OH。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，依降钙素肽片段IX的制备包括：依降钙素肽片段I和II缩合制备依降钙素肽片段VII，其结构为Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-NH2；
依降钙素肽片段VII脱除Fmoc保护基得到依降钙素肽片段VIII，其结构为H-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gl n(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly -Thr(tBu)-Pro-NH2；
依降钙素肽片段VI与依降钙素肽片段VIII缩合制备得到依降钙素肽片段IX，其结构为Cyclo(Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Asu)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Tr t)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-NH2。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，缩合反应在缩合体系中进行，所述缩合体系为A/D或B/C体系，其中，A为HOBT或HOAT，B为HATU、HBTU、TBTU或PyBOP，C为DIEA或TMP，D为DIC或EDC。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，裂解时加入裂解液，所述裂解液选自TFA、DCM、TFE、TIS、EDT、苯甲硫醚和H2O中的至少2种；
优选地，所述裂解液选自下列体系：TFA/DCM、DCM/TFE、TFA/TIS/H2O、TIS/EDT/H2O、TFA/TIS/EDT/H2O和TFA/苯甲硫醚/TIS/EDT/H2O。
9.根据权利要求1中任一项所述的制备方法，其特征在于，环化反应在环化体系中进行，环化体系为A/D体系或B/C体系，其中，A为HOBT或HOAT，B为HATU、HBTU、TBTU或PyBOP，C为DIEA或TMP，D为DIC或EDC。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，依降钙素粗肽的纯化方法包括：采用反相高效液相色潽法对依降钙素粗肽进行两步纯化，所述第一步纯化的流动相为：流动相A相为0.1％的TFA/H2O(v/v)溶液，流动相B相为0.1％的TFA/ACN(v/v)溶液，第二步纯化为转盐纯化，流动相为：流动相A相为0.1％的醋酸/H2O(v/v)溶液，流动相B相为0.1％的醋酸/ACN(v/v)溶液。
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