CN112940078A - 一种普卡那肽的制备方法 - Google Patents

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CN112940078A CN201911263163.8A CN201911263163A CN112940078A CN 112940078 A CN112940078 A CN 112940078A CN 201911263163 A CN201911263163 A CN 201911263163A CN 112940078 A CN112940078 A CN 112940078A
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戚建英
康艳萍
刘磊
张才荣
杨燕苹
王晶翼
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Sichuan Kelun Pharmaceutical Research Institute Co Ltd
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Abstract

本发明公开了一种适合工业化制备普卡那肽的方法，该方法只需要制备2条肽片段，且采用固相合成将2条片段缩合成线性普卡那肽，相对于液相合成法的溶液成分更简单，分离纯化难度更小，并且不需要价格昂贵的酶，成本低，操作方便，具有较强的实际应用价值，适合工业生产。

Description

一种普卡那肽的制备方法
技术领域
本发明涉及多肽制药领域，尤其涉及一种多肽化合物普卡那肽的制备方法。
背景技术
慢性特发性便秘(CIC)和肠易激综合征伴便秘(IBS-C)是影响胃肠道的两种最常见的疾病，这些疾病的特点是大便次数减少、紧张、腹痛或不适。我国成人慢性便秘，包括CIC、功能性排便障碍及IBS-C等，患病率4％-6％，就诊0.1亿-0.15亿。慢性便秘可继发精神心理障碍，对患者生活质量损害程度与糖尿病、心衰等慢性疾病相当。
普卡那肽(plecanatide)由美国Synergy制药公司研发，为含有16个氨基酸的环状多肽，能调节胃肠道中的酸碱离子，诱导液体转运进入胃肠道，增加胃肠道的蠕动，适用于治疗成人慢性特发性便秘。美国食品药品管理局(FDA)于2017年1月19日批准上市，商品名为Trulance。其结构式如下：
Figure BDA0002312132240000011
目前，普卡那肽主链的合成方法主要分为片段法和固相合成法。CN201280021221.6采用片段法，通过片段之间液相缩合形成主链，该方法需要提前制备2个以上的片段，且片段之间液相缩合后处理繁琐，不适用于工业生产。而固相合成主链的方法，需要高倍数物料投入，产生大量原材料的浪费，原料利用率低，反应时间长，且由于普卡那肽的特殊性，N端氨基酸直接偶联效果较差。
因此，需要一种更为简单、高效、低成本及适合工业生产的普卡那肽制备方法。
发明内容
本发明提供了一种制备普卡那肽的方法。普卡那肽序列是16个氨基酸单元长度，普卡那肽序列N-末端到C-末端的顺序为H-Asn1-Asp2-Glu3-Cys4-Glu5-Leu6-Cys7-Val8-Asn9-VaL10-Ala11-Cys12-Thr13-Gly14-Cys15-Leu16-OH；二硫键(4-12)和(7-15)。
本发明的方法包括合适的两条肽片段的合成，其中至少一条肽片段采用固相合成，随后采用固相合成将两条肽片段缩合以形成线性粗肽后，线性粗肽的半胱氨酸氨基酸残基的氧化环化以形成环化的最终产物。具体而言，该方法包括以下步骤：
(1)制备第一肽片段和第二肽片段，所述第一肽片段具有普卡那肽序列的从位置K到位置16的氨基酸单元的第一序列；
所述第二肽片段具有普卡那肽序列的从位置1到位置K-1的氨基酸单元的第二序列；其中第一肽片段和第二肽片段中至少一个采用固相合成；
然后采用固相合成，在偶联剂系统的存在下，将所述第一肽片段和第二肽片段偶联，得到线性普卡那肽的肽树脂；
且所述氨基酸单元的侧链受保护基团的保护；
(2)采用切割试剂将线性普卡那肽从树脂上切割下来，得到线性普卡那肽固体；
(3)溶解线性普卡那肽固体，脱除Cys的侧链保护基团，再经氧化形成两对二硫键，得粗肽，经过分离纯化获得普卡那肽纯品；
其中，普卡那肽序列是16个氨基酸单元长度，普卡那肽序列N-末端到C-末端的顺序为
H-Asn1-Asp2-Glu3-Cys4-Glu5-Leu6-Cys7-Val8-Asn9-VaL10-Ala11-Cys12-Thr13-Gly14-Cys15-Leu16-OH；二硫键(4-12)和(7-15)。
其中，所述K是大于2，小于16的整数。
在一些实施方案中，步骤(1)所述的K选自5、7和9中的任意一个数值；优选地，所述K选自5或7。
在一些实施方案中，所述的固相合成方法为Fmoc固相合成，固相合成在Wang树脂或2-氯三苯甲基树脂上进行；优选地，所述Wang树脂取代度为0.4～0.8mmol/g；所述2-氯三苯甲基树脂取代度为0.8-1.1mmol/g，更优选地，所述Wang树脂取代度为0.78mmol/g，所述2-氯三苯甲基树脂取代度为1.1mmol/g。
在一些实施方案中，步骤(2)所述的切割试剂是由TFA、TIS、H2O、EDT、苯甲硫醚、苯酚和对甲酚中的2种或2种以上组成的混合溶液；优选地，所述的切割试剂由体积比为74～96:1～7:1～7:1～7：1～5的TFA、苯酚、苯甲硫醚、H2O和EDT组成的混合溶液；或者所述的切割试剂由体积比为90～95:1～5:1～5:1～5的TFA、TIS、H2O和EDT组成的混合溶液；更优选地，所述的切割试剂由体积比为82.5：5：5：5：2.5的TFA、苯酚、苯甲硫醚、H2O和EDT组成的混合溶液；或者所述的切割试剂由体积比为94：2:2:2的TFA、TIS、H2O和EDT组成的混合溶液。
在一些实施方案中，所述步骤(3)Cys的侧链保护基团选自Trt、Mmt、tBu、StBu、Acm或Npys，其中4和12位的保护基团不同于7和15位；优选地，所述Cys的侧链保护基团选自Trt和Acm保护基。
在一些实施方案中，所述步骤(3)线性普卡那肽的溶剂选自MeOH、ACN、EtOH、i-PrOH或其水溶液中的一种或几种组成的混合溶剂，氧化剂选自空气、O2、H2O2、GSSH、GSH、DMSO和碘中的一种或多种；优选地，所述线性普卡那肽溶剂为10％MeOH、10％ACN或25％EtOH中的一种，氧化剂为DMSO和/或碘。
在一些实施方案中，所述步骤(1)中包括如下步骤：
(1-1)在活化剂系统的存在下，将第一肽片段肽序列C-末端的第一个氨基酸原料Fmoc-Leu-OH与树脂偶联得到Fmoc-Leu-树脂后，脱除Fmoc保护基；得到H-Leu-树脂；在偶联剂系统的存在下，按照第一肽片段肽序列从C-末端到N-末端依次将保护氨基酸的C端偶联到H-Leu-树脂上；偶联反应完全后，脱除Fmoc保护基，得到脱除Fmoc保护基的第一肽片段肽树脂；
(1-2)在活化剂系统的存在下，将第二肽片段肽序列C-末端的第一个氨基酸原料Fmoc-AA-OH与树脂偶联得到Fmoc-AA-树脂后，脱除Fmoc保护基；得到H-AA-树脂；在偶联剂系统的存在下，按照第二肽片段肽序列从C-末端到N-末端依次将保护氨基酸的C端偶联到H-AA-树脂上；得到第二肽片段肽树脂；
(1-3)用裂解试剂将第二肽片段从树脂上裂解下来，采用固相法将第二肽片段偶联到脱除Fmoc保护基的第一肽片段肽树脂上，得到线性普卡那肽的肽树脂。
本发明中“Fmoc-AA-OH”是指N端Fmoc保护的氨基酸原料；AA是氨基酸的英文AminoAcid的缩写。
本发明中“活化剂系统”由DCM和DIEA组成。
在一些实施方案中，其特征在于：所述的偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂选自HBTU/DIEA、HATU/DIEA、HBTU/HOBt/DIEA、HCTU/NMM、HATU/HOAt/DIEA、TBTU/DIEA、HOBt/DIC、HOAt/DIC、Cl-HOBt/DIC、PyBOP/HOBt/DIEA、PyAOP/HOBt/DIEA和Oxyma/DIC中的一种或多种，所述反应溶剂选自DMF、DCM、NMP和DMSO中的一种或多种；优选地，所述缩合剂为HOBt/DIC，反应溶剂为DMF。
在一些实施方案中，所述脱除Fmoc保护基的试剂由体积比为1:1～10的哌啶和DMF组成；优选地，所述脱除Fmoc保护基的试剂由体积比为1:4的哌啶和DMF组成。
在一些实施方案中，所述步骤(2-3)裂解方法为将第二肽片段加入温度为-5℃～5℃的裂解试剂中反应，裂解试剂为TFE/DCM/HAc、TFE/DCM或TFA/DCM；优选地，所述步骤(2-3)裂解方法为将第二肽片段加入温度为0℃由体积比为1～5：90～99的TFA和DCM组成的裂解试剂中反应；或由体积比为15～25：75～85的TFE和DCM组成的裂解试剂中反应；更优选地，所述的TFA与DCM的体积比为2:98；更优选地，所述的TFE与DCM的体积比为20:80。
本发明制备普卡那肽的方法只需要制备2条肽片段，且采用固相合成将2条片段缩合成线性普卡那肽，相对于液相合成法的溶液成分更简单，分离纯化难度更小，并且不需要价格昂贵的酶，成本低，操作方便，具有较强的实际应用价值，适合工业生产。
具体实施方式
本发明采用的试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。
其中，本发明采用试剂的中英文名称对照如表1所示：
表1本发明采用试剂的中英文名称对照
Figure BDA0002312132240000061
Figure BDA0002312132240000071
所使用的原料氨基酸，其中
Fmoc-Glu(R)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链R基保护谷氨酸
Fmoc-Asp(R)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链R基保护天冬氨酸
Boc-Asn(Trt)-OH代表：叔丁氧羰基-侧链三苯甲基保护天冬酰胺
Fmoc-Asn(Trt)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链三苯甲基保护天冬酰胺
Fmoc-Leu-OH代表：N-芴甲氧羰基亮氨酸
Fmoc-Cys(R)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链R基保护半胱氨酸
Fmoc-Gly-OH代表：N-芴甲氧羰基甘氨酸
Fmoc-Thr(tBu)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链叔丁基保护苏氨酸
Fmoc-Ala-OH代表：N-芴甲氧羰基丙氨酸
Fmoc-Val-OH：N-芴甲氧羰基缬氨酸
当氨基酸为Asp(天冬氨酸)或Glu(谷氨酸)时，侧链R＝OtBu(叔丁氧基)；当氨基酸为Cys(半胱氨酸)时，侧链R＝Trt、Mmt、tBu、StBu、Acm或Npys。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：一种普卡那肽的制备方法
1、BocAA1-4OH肽片段的制备
(1)BocAA1-4OH肽片段序列
Boc-Asn(trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Cys(Acm)-OH
(2)Fmoc-Cys(Trt)-CTC树脂的合成
称取2.76g取代度为1.1mmol/g的2-氯三苯甲基氯树脂(CTC树脂)加入多肽反应器中，同时加入27ml DCM洗涤并溶胀树脂1小时。称取Fmoc-Cys(Acm)-OH(9mmol，3.80g)，加19ml DCM溶解，将溶解后的反应液加入至树脂中，待树脂与反应液搅拌均匀后，向树脂反应液中DIEA(13.5mmol，3.38ml)，25℃反应2小时。反应完成后，向反应液中继续加入2.21ml甲醇用于封闭未反应的活性位点，反应1小时。反应完成后，排干溶液，使用27mlDMF溶液洗涤树脂4次，洗涤完成后，取少量树脂收缩干燥后，利用紫外分光度法测定哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的取代度为1.07mmol/g。
(3)BocAA1-4OH肽树脂的制备
取Fmoc-Cys(Trt)-CTC树脂，使用27ml 20％哌啶/DMF溶液分别5，15min处理树脂两次，脱除Fmoc保护基，然后使用27ml DMF洗涤树脂5次，去除Fmoc副产物以及残余哌啶，以茚三酮法检测判断反应终点。树脂显红棕色，则表示脱保护完全。
称取Fmoc-Glu(OtBu)-OH(8.75mmol，3.74g)，HoBt(8.75mmol，1.20g)溶解于19mlDMF溶液中，氮气保护条件下将该溶液冰浴至0-5℃，然后加入DIC(9.63mmol，1.49ml)搅拌反应10min。10min后，将反应溶液加入至制备的树脂中，室温反应，反应过程取小样，以茚三酮法检测判断缩合完成情况。1小时反应完全，抽干树脂，使用27ml DMF洗涤树脂3次，以茚三酮法检测判断反应终点，树脂显淡黄色，缩合反应完全。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照普卡那肽主链肽序，依次完成Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Boc-Asn(Trt)-OH的偶联。每种氨基酸、HOBT每次分别投料8.75mmol，DIC每次投料9.63mmol。偶联完毕，将BocAA1-4肽树脂用27ml DCM，27ml甲醇交替洗涤树脂3次，洗涤完成后，将树脂置于真空干燥箱中干燥至恒重，得到BocAA1-4OH肽树脂5.67g。
(4)BocAA1-4OH肽树脂的裂解
称取步骤(3)得到的BocAA1-4OH肽树脂5.67g加入至多肽裂解反应器中，加入57ml预先降温至0℃左右的裂解液2％TFA/DCM溶液，室温条件下搅拌反应1小时。反应完成后，将反应液过滤，滤液旋干。最终获得BocAA1-4OH肽片段的白色固体2.92g，收率为95.33％，纯度为97.13％。
2、AA5-16OH肽树脂的制备
(1)AA5-16OH肽树脂序列
Glu(OtBu)-Leu-Cys(Trt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Acm)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Leu
(2)Fmoc-Leu-Wang树脂的合成
称取1.80g取代度为0.78mmol/g的Wang树脂加入多肽反应器中，同时加入18mlDCM洗涤并溶胀树脂1小时。称取Fmoc-Leu-OH(2.11mmol，0.75g)，DMAP(0.14mmol，0.02g)，加13ml溶剂(DCM:DMF＝2:1)溶解，加入DIC(2.8mmol，0.5ml)活化后将溶解后的反应液加入至树脂中，25℃反应4h。反应完成后，排干溶液，使用18ml DMF、16ml DCM溶液洗涤树脂2次。洗涤完成后，往树脂中加入18ml封闭液(DCM:Ac2O:吡啶＝90:5:5)封闭反应1h，排干溶液，使用18ml DMF溶液洗涤树脂4次。取少量树脂收缩干燥后，利用紫外分光度法测定哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的取代度为0.51mmol/g。
(3)AA5-16OH肽树脂的制备
取Fmoc-Leu-Wang树脂，使用18ml 20％哌啶/DMF的混合溶液分别5，15min处理树脂2次，脱除Fmoc保护基，然后使用18ml DMF洗涤树脂5次，去除Fmoc副产物以及残余哌啶，以茚三酮法检测判断反应终点。树脂显红棕色，则表示脱保护完全。
称取Fmoc-Cys(Trt)-OH(2.75mmol，1.62g)，HoBt(2.75mmol，0.37g)溶解于13mlDMF溶液中，氮气保护条件下将该溶液冰浴至0-5℃，然后加入DIC(3.03mmol，0.47ml)搅拌反应10min。10min后，将反应溶液加入至制备的树脂中，室温反应，反应过程取小样，以茚三酮法检测判断缩合完成情况。1小时反应完全，抽干树脂，使用18ml DMF洗涤树脂3次，以茚三酮法检测判断反应终点，树脂显淡黄色，缩合反应完全。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照普卡那肽主链肽序，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH的偶联。每种氨基酸、HOBt每次分别投料2.75mmol，DIC每次投料3.03mmol。偶联完毕，将FmocAA5-16OH肽树脂使用18ml 20％哌啶/DMF溶液分别5，15min处理树脂2次，脱除Fmoc保护基，然后使用18ml DMF洗涤树脂5次，去除Fmoc副产物以及残余哌啶，以茚三酮法检测判断反应终点。树脂显红棕色，则表示脱保护完全。
3、线性普卡那肽的制备
(1)线性普卡那肽树脂的制备
称取BocAA1-4OH肽片段(1.84mmol，1.88g)，HoBt(1.84mmol，0.25g)溶解于7mlDMF溶液中，氮气保护条件下将该溶液冰浴至0-5℃，然后加入DIC(2.02mmol，0.31ml)搅拌反应10min。10min后，将反应溶液加入至步骤2制备的AA5-16OH肽树脂中，室温反应，反应过程取小样，使用茚三酮法检测缩合完成情况，1小时反应完全，抽干树脂，使用9ml DMF洗涤树脂3次，以茚三酮法检测判断反应终点，树脂淡黄色，缩合反应完全。
使用9ml DCM及9ml甲醇分别交替洗涤树脂3次，洗涤完成后，将树脂置于真空干燥中干燥至恒重，最终得到3.83g线性普卡那肽的肽树脂。
(2)线性普卡那肽的制备
称取步骤(1)所得得到3.83g线性普卡那肽的肽树脂加入至多肽裂解反应器中，加入57ml预先降温至0℃左右的由体积比为82.5：5：5：5：2.5的TFA、苯酚、苯甲硫醚、水、EDT组成的裂解液，室温条件下搅拌反应2小时。反应完成后，将反应液过滤至570ml预先降温至-10℃左右的甲基叔丁基醚，有白色固体产生，-10℃下搅拌该白色淤浆物30min，随后将白色淤浆物离心，离心机参数设置为3500r/min，离心5min，离心完成后，弃掉上清液，收集白色淤浆物，加入新鲜的甲基叔丁基醚，重复上述离心过程，收集白色淤浆物，真空干燥至恒重，最终获得白色线性普卡那肽固体1.60g，收率为95.14％，纯度为93.87％。
4、线性普卡那肽液相环化为普卡那肽
取步骤3得到的线性普卡那肽固体1.60g，用10％甲醇水溶液288ml溶解，加入DMSO32ml，室温搅拌反应，HPLC中控反应，至线性肽反应完全，完成Cys7-Cys15二硫键的氧化。然后用醋酸调PH至3-4，加入碘(2.76mmol，0.70g)的甲醇溶液10ml，反应0.5h通过HPLC监控反应结束，完成Cys4-Cys12二硫键的氧化。反应液直接经HPLC纯化后冻干，得普卡那肽白色固体0.63g，收率为40.58％，纯度为99.07％。
实施例2：一种普卡那肽的制备方法
1、BocAA1-6OH肽片段的制备
(1)BocAA1-6OH肽片段序列
Boc-Asn(trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OH
(2)Fmoc-Leu-CTC树脂的合成
称取2.73g取代度为1.1mmol/g的CTC树脂加入多肽反应器中，同时加入27ml DCM洗涤并溶胀树脂1小时。称取Fmoc-Leu-OH(9mmol，3.18g)，加19ml DCM溶解，将溶解后的反应液加入至树脂中，待树脂与反应液搅拌均匀后，向树脂反应液中DIEA(13.5mmol，3.38ml)，25℃反应2小时。反应完成后，向反应液中继续加入2.3ml甲醇用于封闭未反应的活性位点，反应1小时。反应完成后，排干溶液，使用27mlDMF溶液洗涤树脂4次，洗涤完成后。取少量树脂收缩干燥后，利用紫外分光度法测定哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的取代度为0.98mmol/g。
(3)BocAA1-6OH肽树脂的制备
取Fmoc-Leu-CTC树脂，使用27ml 20％哌啶/DMF溶液分别5，15min处理树脂两次，脱除Fmoc保护基，然后使用27ml DMF洗涤树脂5次，去除Fmoc副产物以及残余哌啶，以茚三酮法检测判断反应终点。树脂显红棕色，则表示脱保护完全。
称取Fmoc-Glu(OtBu)-OH(8.02mmol，3.41g)，HoBt(8.02mmol，1.08g)溶解于19mlDMF溶液中，氮气保护条件下将该溶液冰浴至0-5℃，然后加入DIC(8.82mmol，1.37ml)搅拌反应10min。10min后，将反应溶液加入至制备的树脂中，室温反应，反应过程取小样，以茚三酮法检测判断缩合完成情况。1小时反应完全，抽干树脂，使用27ml DMF洗涤树脂3次，以茚三酮法检测判断反应终点，树脂显淡黄色，缩合反应完全。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照普卡那肽主链肽序，依次完成Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Boc-Asn(Trt)-OH的偶联。每种氨基酸、HOBT每次分别投料8.02mmol，DIC每次投料8.82mmol。偶联完毕，将BoocAA1-6OH肽树脂用27ml DCM，27ml甲醇交替洗涤树脂3次，洗涤完成后，将树脂置于真空干燥中干燥至恒重，得到BocAA1-6OH肽树脂7.06g。
(4)BocAA1-6OH肽树脂的裂解
称取步骤(3)得到的BocAA1-6OH肽树脂7.06g，加入至多肽裂解反应器中，加入71ml预先降温至0℃左右的裂解液20％TFE/80％DCM，室温条件下搅拌反应1小时。反应完成后，将反应液过滤，滤液旋干。用少许DCM溶解后，加入71ml甲基叔丁基醚中沉淀，离心后收集白色淤浆物，真空干燥至恒重，最终获得BocAA1-6OH白色固体3.62g，收率为81.96％，纯度为96.7％。
2、AA7-16OH肽树脂的制备
(1)AA7-16OH肽片段序列
Cys(Acm)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Acm)-Leu
(2)Fmoc-Leu-CTC树脂的合成
称取0.90g取代度为1.1mmol/g的CTC树脂加入多肽反应器中，同时加入9ml DCM洗涤并溶胀树脂1小时。称取Fmoc-Leu-OH(3mmol，1.05g)，加7ml DCM溶解，将溶解后的反应液加入至树脂中，待树脂与反应液搅拌均匀后，向树脂反应液中DIEA(4.5mmol，0.74ml)，25℃反应2小时。反应完成后，向反应液中继续加入0.75ml甲醇用于封闭未反应的活性位点，反应1小时。反应完成后，排干溶液，使用9ml DMF溶液洗涤树脂4次。取少量树脂收缩干燥后，利用紫外分光度法测定哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的取代度为1.06mmol/g。
(3)AA7-16OH肽树脂的制备
取Fmoc-Leu-CTC树脂，使用9ml 20％哌啶/DMF的溶液分别5，15min处理树脂2次，脱除Fmoc保护基，然后使用9ml DMF洗涤树脂5次，去除Fmoc副产物以及残余哌啶，以茚三酮法检测判断反应终点。树脂显红棕色，则表示脱保护完全。
称取Fmoc-Cys(Acm)-OH(2.89mmol，1.21g)，HoBt(2.89mmol，0.39g)溶解于7mlDMF溶液中，氮气保护条件下将该溶液冰浴至0-5℃，然后加入DIC(3.18mmol，0.49ml)搅拌反应10min。10min后，将反应溶液加入至制备的树脂中，室温反应，反应过程取小样，以茚三酮法检测判断缩合完成情况。1小时反应完全，抽干树脂，使用9ml DMF洗涤树脂3次，以茚三酮法检测判断反应终点，树脂显淡黄色，缩合反应完全。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照普卡那肽主链肽序，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH的偶联。每种氨基酸、HOBT每次分别投料2.89mmol，DIC每次投料3.18mmol。偶联完毕，将的FmocAA7-16OH肽树脂使用2×9ml20％哌啶/DMF溶液分别5，15min处理树脂，脱除Fmoc保护基，然后使用9ml DMF洗涤树脂5次，去除Fmoc副产物以及残余哌啶，以茚三酮法检测判断反应终点。树脂显红棕色，则表示脱保护完全。
3、线性普卡那肽的制备
(1)线性普卡那肽树脂的制备
称取BocAA1-6OH肽片段(1.93mmol，2.84g)，HoBt(1.93mmol，0.26g)溶解于7mlDMF溶液中，氮气保护条件下将该溶液冰浴至0-5℃，然后加入DIC(2.12mmol，0.33ml)搅拌反应10min。10min后，将反应溶液加入至步骤2制备的AA7-16OH肽树脂中，室温反应，反应过程取小样，使用茚三酮法检测缩合完成情况，1小时反应完全，抽干树脂，使用9ml DMF洗涤树脂3次，以茚三酮法检测判断反应终点，树脂淡黄色，缩合反应完全。
使用9ml DCM及9ml甲醇分别交替洗涤树脂3次，洗涤完成后，将树脂置于真空干燥中干燥至恒重，最终得到3.92g线性普卡那肽树脂。
(2)线性普卡那肽的制备
称取步骤(1)所得3.92g线性普卡那肽树脂加入至多肽裂解反应器中，加入59ml预先降温至0℃左右的由体积比为94：2:2:2的TFA、TIS、H2O和EDT组成的裂解液，室温条件下搅拌反应2小时。反应完成后，将反应液过滤至590ml预先降温至-10℃左右的甲基叔丁基醚，有白色固体产生，-10℃下搅拌该白色淤浆物30min，随后将白色淤浆物离心，离心机参数设置为3500r/min，离心5min，离心完成后，弃掉上清液，收集白色淤浆物，加入新鲜的甲基叔丁基醚，重复上述离心过程，收集白色淤浆物，真空干燥至恒重，最终获得白色线性普卡那肽固体1.67g，收率为94.82％，纯度为92.39％。
4、线性普卡那肽液相环化为普卡那肽
取步骤3得到的线性普卡那肽固体1.67g用10％ACN水溶液334ml溶解，加入氨水溶液调PH至7-8，室温搅拌反应，HPLC中控反应，至线性肽反应完全，完成Cys7-Cys15二硫键的氧化。然后用醋酸调PH至3-4，加入碘(2.88mmol，0.73g)的ACN溶液10ml，反应0.5h通过HPLC监控反应结束，完成Cys4-Cys12二硫键的氧化。反应液直接经HPLC纯化后冻干，得普卡那肽白色固体0.62g，收率为38.26％，纯度为99.14％。
实施例3：一种普卡那肽的制备方法
1、BocAA1-8OH肽片段的制备
(1)BocAA1-8OH肽片段序列
Boc-Asn(trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Acm)-Val-OH
(2)Fmoc-Val-CTC树脂的合成
称取2.75g取代度为1.1mmol/g的CTC树脂加入多肽反应器中，同时加入27ml DCM洗涤并溶胀树脂1小时。称取Fmoc-Val-OH(9mmol，3.08g)，加19ml DCM溶解，将溶解后的反应液加入至树脂中，待树脂与反应液搅拌均匀后，向树脂反应液中DIEA(13.5mmol，3.36ml)，25℃反应2小时。反应完成后，向反应液中继续加入2.3ml甲醇用于封闭未反应的活性位点，反应1小时。反应完成后，排干溶液，使用27ml洗涤4次，DMF溶液洗涤树脂。取少量树脂收缩干燥后，利用紫外分光度法测定哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的取代度为1.05mmol/g。
(3)BocAA1-8OH肽树脂的制备
取Fmoc-Val-CTC树脂，使用27ml 20％哌啶/DMF的混合溶液分别5，15min处理树脂2次，脱除Fmoc保护基，然后使用27ml DMF洗涤树脂5次，去除Fmoc副产物以及残余哌啶，以茚三酮法检测判断反应终点。树脂显红棕色，则表示脱保护完全。
称取Fmoc-Cys(Acm)-OH(8.59mmol，3.57g)，HoBt(8.59mmol，1.16g)溶解于19mlDMF溶液中，氮气保护条件下将该溶液冰浴至0-5℃，然后加入DIC(9.45mmol，1.46ml)搅拌反应10min。10min后，将反应溶液加入至制备的树脂中，室温反应，反应过程取小样，以茚三酮法检测判断缩合完成情况。1小时反应完全，抽干树脂，使用27ml DMF洗涤树脂3次，以茚三酮法检测判断反应终点，树脂显淡黄色，缩合反应完全。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照普卡那肽主链肽序，依次完成Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Boc-Asn(Trt)-OH的偶联。每种氨基酸、HOBT每次分别投料8.59mmol，DIC每次投料9.45mmol。偶联完毕，将肽树脂用27ml DCM，27ml甲醇交替洗涤树脂3次，洗涤完成后，将树脂置于真空干燥中干燥至恒重，得到BocAA1-8OH肽树脂7.88g。
(4)BocAA1-8OH肽树脂的裂解
称取步骤(3)得到的BocAA1-8OH肽片段CTC树脂7.88g加入至多肽裂解反应器中，加入79ml预先降温至0℃左右的裂解液20％TFE/80％DCM，室温条件下搅拌反应1小时。反应完成后，将反应液过滤，滤液旋干。用少许DCM溶解后，加入79ml甲基叔丁基醚中沉淀，离心后收集白色淤浆物，真空干燥至恒重，最终获得白色BocAA1-8OH肽片段4.90g，收率为93.55％，纯度为95.21％。
2、AA9-16OH肽树脂的制备
(1)AA9-16OH肽片段序列
Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Acm)-Leu
(2)Fmoc-Leu-CTC树脂的合成
称取0.95g取代度为1.1mmol/g的CTC树脂加入多肽反应器中，同时加入9ml DCM洗涤并溶胀树脂1小时。称取Fmoc-Leu-OH(3mmol，1.1g)，加7ml DCM溶解，将溶解后的反应液加入至树脂中，待树脂与反应液搅拌均匀后，向树脂反应液中DIEA(4.5mmol，0.74ml)，25℃反应2小时。反应完成后，向反应液中继续加入0.75ml甲醇用于封闭未反应的活性位点，反应1小时。反应完成后，排干溶液，使用9ml DMF溶液洗涤树脂洗涤4次。取少量树脂收缩干燥后，利用紫外分光度法测定哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的取代度为1.06mmol/g。
(3)AA9-16OH肽树脂的制备
取Fmoc-Leu-CTC树脂，使用9ml 20％哌啶/DMF的溶液分别5，15min处理树脂2次，脱除Fmoc保护基，然后使用9ml DMF洗涤树脂5次，去除Fmoc副产物以及残余哌啶，以茚三酮法检测判断反应终点。树脂显红棕色，则表示脱保护完全。
称取Fmoc-Cys(Acm)-OH(2.89mmol，1.20g)，HoBt(2.89mmol，0.39g)溶解于7mlDMF溶液中，氮气保护条件下将该溶液冰浴至0-5℃，然后加入DIC(3.18mmol，0.51ml)搅拌反应10min。10min后，将反应溶液加入至制备的树脂中，室温反应，反应过程取小样，以茚三酮法检测判断缩合完成情况。1小时反应完全，抽干树脂，使用9ml DMF洗涤树脂3次，以茚三酮法检测判断反应终点，树脂显淡黄色，缩合反应完全。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照普卡那肽主链肽序，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH的偶联。每种氨基酸、HOBT每次分别投料2.89mmol，DIC每次投料3.18mmol。偶联完毕，将FmocAA9-16OH肽树脂使用2×9ml 20％哌啶/DMF溶液分别5，15min处理树脂，脱除Fmoc保护基，然后使用9ml DMF洗涤树脂5次，去除Fmoc副产物以及残余哌啶，以茚三酮法检测判断反应终点。树脂显红棕色，则表示脱保护完全。
3、线性普卡那肽的制备
(1)线性普卡那肽树脂的制备
称取BocAA1-8OH肽片段(1.93mmol，3.37g)，HoBt(1.93mmol，0.26g)溶解于7mlDMF溶液中，氮气保护条件下将该溶液冰浴至0-5℃，然后加入DIC(2.12mmol，0.34ml)搅拌反应10min。10min后，将反应溶液加入至步骤2制备的AA9-16OH肽树脂中，室温反应，反应过程取小样，使用茚三酮法检测缩合完成情况，1小时反应完全，抽干树脂，使用9ml DMF洗涤树脂3次，以茚三酮法检测判断反应终点，树脂淡黄色，缩合反应完全。
使用9ml DCM及9ml甲醇分别交替洗涤树脂3次，洗涤完成后，将树脂置于真空干燥中干燥至恒重，最终得到3.96g线性普卡那肽树脂。
(2)线性普卡那肽的制备
称取步骤(1)所得3.96g线性普卡那肽树脂加入至多肽裂解反应器中，加入60ml预先降温至0℃左右的由体积比为82.5：5：5：5：2.5的TFA、苯酚、苯甲硫醚、水、EDT组成的裂解液，室温条件下搅拌反应2小时。反应完成后，将反应液过滤至600ml预先降温至-10℃左右的甲基叔丁基醚，有白色固体产生，-10℃下搅拌该白色淤浆物30min，随后将白色淤浆物离心，离心机参数设置为3500r/min，离心5min，离心完成后，弃掉上清液，收集白色淤浆物，加入新鲜的甲基叔丁基醚，重复上述离心过程，收集白色淤浆物，真空干燥至恒重，最终获得白色线性普卡那肽固体1.65g，收率为93.64％，纯度为91.22％。
4、线性普卡那肽液相环化为普卡那肽
取步骤3得到的线性普卡那肽固体1.65g用25％乙醇水溶液330ml溶解，加入氨水溶液调PH至7-8，加入双氧水溶液(0.3eq)室温搅拌反应，HPLC中控反应，至线性肽反应完全，完成Cys7-Cys15二硫键的氧化。然后用醋酸调PH至3-4，加入碘(2.7mmol，0.69g)的乙醇溶液10ml，反应0.5h通过HPLC监控反应结束，完成Cys4-Cys12二硫键的氧化。反应液直接经HPLC纯化后冻干，得普卡那肽白色固体0.61g，收率为40.12％，纯度为99.21％。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以上实施例形式的具体实施方式，是对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以上的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

Claims (10)

1.一种制备普卡那肽的方法，其特征在于：所述的制备方法包括如下步骤：
(1)制备第一肽片段和第二肽片段，所述第一肽片段具有普卡那肽序列的从位置K到位置16的氨基酸单元的第一序列；
所述第二肽片段具有普卡那肽序列的从位置1到位置K-1的氨基酸单元的第二序列；其中第一肽片段和第二肽片段中至少一个采用固相合成；
然后采用固相合成，在偶联剂系统的存在下，将所述第一肽片段和第二肽片段偶联，得到线性普卡那肽的肽树脂；
且所述氨基酸单元的侧链受保护基团的保护；
(2)采用切割试剂将线性普卡那肽从树脂上切割下来，得到线性普卡那肽固体；
(3)溶解线性普卡那肽固体，脱除Cys的侧链保护基团，再经氧化剂氧化形成两对二硫键，得粗肽，经过分离纯化获得普卡那肽纯品；
其中，普卡那肽序列是16个氨基酸单元长度，普卡那肽序列N-末端到C-末端的顺序为
H-Asn1-Asp2-Glu3-Cys4-Glu5-Leu6-Cys7-Val8-Asn9-VaL10-Ala11-Cys12-Thr13-Gly14-Cys15-Leu16-OH；二硫键(4-12)和(7-15)；
其中所述K是大于2，小于16的整数。
2.根据权利要求1所述的制备普卡那肽的方法，其特征在于：步骤(1)所述的K选自5、7和9中的任意一个数值；优选地，所述K选自5或7。
3.根据权利要求1或2所述的制备普卡那肽的方法，其特征在于：所述的固相合成方法为Fmoc固相合成，固相合成在Wang树脂或2-氯三苯甲基树脂上进行；优选地，所述Wang树脂取代度为0.4～0.8mmol/g；所述2-氯三苯甲基树脂取代度为0.8-1.1mmol/g，更优选地，所述Wang树脂取代度为0.78mmol/g，所述2-氯三苯甲基树脂取代度为1.1mmol/g。
4.根据权利要求1至3任意一项所述的制备普卡那肽的方法，其特征在于：步骤(2)所述的切割试剂是由TFA、TIS、H2O、EDT、苯甲硫醚、苯酚和对甲酚中的2种或2种以上组成的混合溶液；优选地，所述的切割试剂由体积比为74～96:1～7:1～7:1～7：1～5的TFA、苯酚、苯甲硫醚、H2O和EDT组成的混合溶液；或者所述的切割试剂由体积比为90～95:1～5:1～5:1～5的TFA、TIS、H2O和EDT组成的混合溶液；更优选地，所述的切割试剂由体积比为82.5：5：5：5：2.5的TFA、苯酚、苯甲硫醚、H2O和EDT组成的混合溶液；或者所述的切割试剂由体积比为94：2:2:2的TFA、TIS、H2O和EDT组成的混合溶液。
5.根据权利要求1至4任意一项所述的制备普卡那肽的方法，其特征在于：所述步骤(3)Cys的侧链保护基团选自Trt、Mmt、tBu、StBu、Acm或Npys，其中4和12位的保护基团不同于7和15位；优选地，所述Cys的侧链保护基团选自Trt和Acm保护基。
6.根据权利要求1至5任意一项所述的制备普卡那肽的方法，其特征在于：所述步骤(3)线性普卡那肽的溶剂选自MeOH、ACN、EtOH、i-PrOH或其水溶液中的一种或几种组成的混合溶剂，氧化剂选自空气、O2、H2O2、GSSH、GSH、DMSO和碘中的一种或多种；优选地，所述线性普卡那肽溶剂为10％MeOH、10％ACN或25％EtOH中的一种，氧化剂为DMSO和/或碘。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的制备普卡那肽的方法，其特征在于：所述步骤(1)包括如下步骤：
(1-1)在活化剂系统的存在下，将第一肽片段肽序列C-末端的第一个氨基酸原料Fmoc-Leu-OH与树脂偶联得到Fmoc-Leu-树脂后，脱除Fmoc保护基；得到H-Leu-树脂；在偶联剂系统的存在下，按照第一肽片段肽序列从C-末端到N-末端依次将保护氨基酸的C端偶联到H-Leu-树脂上；偶联反应完全后，脱除Fmoc保护基，得到脱除Fmoc保护基的第一肽片段肽树脂；
(1-2)在活化剂系统的存在下，将第二肽片段肽序列C-末端的第一个氨基酸原料Fmoc-AA-OH与树脂偶联得到Fmoc-AA-树脂后，脱除Fmoc保护基；得到H-AA-树脂；在偶联剂系统的存在下，按照第二肽片段肽序列从C-末端到N-末端依次将保护氨基酸的C端偶联到H-AA-树脂上；得到第二肽片段肽树脂；
(1-3)用裂解试剂将第二肽片段从树脂上裂解下来，采用固相法将第二肽片段偶联到脱除Fmoc保护基的第一肽肽树脂上，得到线性普卡那肽的肽树脂。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的制备普卡那肽的方法，其特征在于：所述的偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂选自HBTU/DIEA、HATU/DIEA、HBTU/HOBt/DIEA、HCTU/NMM、HATU/HOAt/DIEA、TBTU/DIEA、HOBt/DIC、HOAt/DIC、Cl-HOBt/DIC、PyBOP/HOBt/DIEA、PyAOP/HOBt/DIEA和Oxyma/DIC中的一种或多种，所述反应溶剂选自DMF、DCM、NMP和DMSO中的一种或多种；优选地，所述缩合剂为HOBt/DIC，反应溶剂为DMF。
9.根据权利要求7所述的制备普卡那肽的方法，其特征在于：所述脱除Fmoc保护基的试剂由体积比为1:1～10的哌啶和DMF组成；优选地，所述脱除Fmoc保护基的试剂由体积比为1:4的哌啶和DMF组成。
10.根据权利要求7所述的制备普卡那肽的方法，其特征在于：所述步骤(1-3)裂解方法为将第二肽片段加入温度为-5℃～5℃的裂解试剂中反应，裂解试剂为TFE/DCM/HAc、TFE/DCM体系或TFA/DCM体系；优选地，所述步骤(1-3)裂解方法为将第二肽片段加入温度为0℃由体积比为1～5：90～99的TFA和DCM组成的裂解试剂中反应；或由体积比为15～25：75～85的TFE和DCM组成的裂解试剂中反应；更优选地，所述的TFA与DCM的体积比为2:98；更优选地，所述的TFE与DCM的体积比为20:80。
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