CN103951744B - 一种固相合成胸腺法新的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固相树脂及其制备方法和用途。所述方法涉及的固相树脂结构如式Ⅰ所示;HMPA‑AAn‑AM树脂Ⅰ其中的AA为下述相同或不相同的带侧链保护的氨基酸:Arg、Lys、Asn、Gln、Asp、Glu、Pro、Gly;n为1‑8的整数。所述固相树脂可用于胸腺法新的固相合成。
Description
技术领域
本发明涉及多肽固相合成领域,尤其涉及胸腺法新的固相合成方法。
背景技术
胸腺法新是一种由28个氨基酸组成的多肽,其序列为:Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn。它的分子式为:C129H215N33O55,分子量3108.37。
胸腺法新原名胸腺肽α1,又称胸腺素α1或Tα1。胸腺法新是胸腺肽中的一种。胸腺肽是胸腺组织分泌的具有生理活性的一组多肽,能促进淋巴细胞转化,增强巨噬细胞吞噬活性,可用于治疗多种免疫缺陷病。临床研究表明,胸腺肽α1是胸腺素中最重要、生物活性最强的组分。胸腺法新具有显著的双向免疫调节作用,被认为是一个化学成分明确、刺激作用适中的理想的免疫调节剂。
胸腺法新可以用以治疗慢性乙肝、慢性丙肝、肝炎后肝硬化(包括代偿期和失代偿期)、原发性肝癌、病毒性重型肝炎。中内外的临床研究表明,单用胸腺法新治疗慢性乙肝,持续应答率与单用干扰素相近,但没有干扰素的毒副作用。虽然胸腺法新的治疗效果并不显著,但在停止治疗后,病毒清除率反而有上升的趋势,也就是说胸腺法新在抑制乙肝病毒上有很强的后续效应。
目前胸腺法新的合成方法主要是用多肽固相合成法,虽然多肽固相合成技术已经相当成熟,但是在合成胸腺法新时,其粗品纯度往往不高(低于50%)。这主要是由于胸腺法新形成了β折叠,使得某些氨基酸的偶联及去保护非常困难。另外,合成过程中使用的王树脂或者CTC树脂容易发生DKP副反应,这也是纯度下降的重要的原因。CN201110069876公开了一种合成胸腺法新的方法,该方法使用PEG Wang树脂,能有效的减少胸腺法新的β折叠,使得粗品的纯度大大提高。但是,DKP还是没能控制得很好,而且PEG王树脂的成本非常高,不利于大生产。
因此,本领域迫切需要找到一种有效合成胸腺法新的新方法。
发明内容
本发明旨在提供一种多肽固相合成胸腺法新的制备方法。
在本发明的第一方面,提供了一种结构如式Ⅰ所示的固相合成树脂;
HMPA-AAn-AM树脂 Ⅰ
其中的AA为下述相同或不相同的带侧链保护的氨基酸:Arg、Lys、Asn、Gln、Asp、Glu、Pro、Gly;
n为1-8的整数;例如n为1、2、3、4、5、6、7或8。
在另一优选例中,所述AA为下述相同或不相同的带侧链保护的氨基酸:Arg、Lys、Pro、Gly。
在另一优选例中,所述n为1-4的整数;例如n为1、2、3或4。
在另一优选例中,所述侧链保护基团选自Pbf、Boc、Trt、OtBu。
在另一优选例中,所述AA为下述相同或不相同的带侧链保护的氨基酸:Arg(Pbf)、Lys(Boc)、Asn(Trt)、Gln(Trt)、Asp(OtBu)、Glu(OtBu)、Pro、Gly。
在本发明的第二方面,提供了一种如上所述的本发明提供的固相合成树脂的制备方法,所述方法包括步骤:
(1)将Fmoc-AAn-OH和AM树脂缩合,得到Fmoc-AAn-AM树脂;
(2)将Fmoc-AAn-AM树脂和去保护剂混合、洗涤得到AAn-AM树脂;
(3)将HMPA-Linker和AAn-AM树脂缩合,得到如上所述的本发明提供的固相合成树脂;
其中的AA为下述相同或不相同的带侧链保护的氨基酸:Arg(Pbf)、Lys(Boc)、Asn(Trt)、Gln(Trt)、Asp(OtBu)、Glu(OtBu)、Pro、Gly;
n为1-8的整数;例如n为1、2、3、4、5、6、7或8。
在另一优选例中,所述的去保护剂以其总体积计,其中含有3%-20%哌啶,0.5%-10%二环脒(DBU),和0.1M-0.5M 1-羟基苯并三唑(HOBt)。
在另一优选例中,所述的去保护剂以其总体积计,其中含有1%-10%哌啶和0.1M-0.5M 1-羟基苯并三唑(HOBt)。
在另一优选例中,步骤(1)和(3)中所述的氨基酸和树脂的缩合在选自下述的一种或多种缩合剂的存在下进行:N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N,N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、三羟甲基丙烷(TMP)、二异丙基乙胺(DIPEA)、1-羟基苯并三唑(HOBt);更佳地,所述的缩合剂中含有N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N,N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)和三羟甲基丙烷TMP);最佳地,所述的缩合剂中含有N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N,N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)和二异丙基乙胺(DIPEA)。
在另一优选例中,步骤(1)和(3)中所述的Fmoc-氨基酸和树脂的缩合在缩合剂的存在下进行,所述缩合剂由N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-羟基苯并三唑(HOBt)和N,N-二甲基吡啶(DMAP)组成。
在本发明的第三方面,提供了一种如上所述的本发明提供的固相合成树脂的用途,用于结构如式Ⅱ所示的胸腺法新的固相合成;
在本发明的第四方面,提供了一种如式Ⅱ所示的胸腺法新的固相合成制备方法,以如上所述的本发明提供的固相合成树脂为起始原料,按照固相合成的方法依次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸或多肽,获得保护的二十八肽树脂,其间依次脱去Fmoc-保护基团,用缩合剂进行接肽反应,得保护的二十八肽树脂后,同步进行脱侧链保护基团及切肽,获得胸腺法新。
在另一优选例中,所述的制备方法包括步骤:
(i)连接Fmoc-Asn(Trt)-OH,得到Fmoc-Asn(Trt)-HMPA-AAn-AM树脂;
(ii)将Fmoc-Asn(Trt)-HMPA-AAn-AM树脂与去保护试剂混合,脱除Fmoc;
(iii)按照Fmoc固相合成法重复步骤(i)中氨基酸与树脂偶联的操作与步骤(ii)中脱保护操作,将具有侧链保护基团的氨基酸从肽链碳端到氮端依次偶联,获得结构如式Ⅲ所示的Fmoc保护的二十八肽树脂;和
(iv)Fmoc保护的二十八肽树脂经裂解液裂解得到胸腺法新;
FmocSer(tBu)Asp(OtBu)AlaAlaValAsp(OtBu)Thr(tBu)Ser(tBu) Ⅲ
Ser(tBu)Glu(OtBu)IleThr(tBu)Thr(tBu)Lys(Boc)Asp(OtBu)LeuLys(Boc)Glu(OtBu)Lys(Boc)Lys(Boc)Glu(OtBu)ValValGlu(OtBu)Glu(OtBu)AlaGlu(OtBu)Asn(Trt)-HMPA-AAn-AM树脂。
在另一优选例中,所述的去保护剂以其总体积计,其中含有1%-50%哌啶,0.5%-10%二环脒(DBU),1%-10%哌嗪,0.5%-10%1-羟基苯并三唑(HOBt),0.1%-10%1,4-二硫代苏糖醇(DTT),5%-50%乙醇胺,5%-50%叔丁基胺(TBA),1%-10%环己亚胺,和/或3%-30%N-甲基吡咯烷。
在另一优选例中,连接或偶联具有Fmoc保护基团的氨基酸或多肽时的缩合剂为下述的一种或一种以上的混合:DIC、HATU、TBTU、HBTU、PyBop、HOBt、Cl-HOBt、DIEA、NMM。
在另一优选例中,所述裂解液中含有下述一种或一种以上的混合:三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、三异丙基硅烷、水、苯甲硫醚、苯甲醚。
据此,本发明提供了一种有效合成胸腺法新的新方法。
附图说明
图1显示了本发明提供的制备胸腺法新的合成工艺流程图。
图2显示了实施例制备得到的胸腺法新产品的HPLC图。
图3显示了实施例制备得到的胸腺法新产品的LC-MS图。
图4显示了用王树脂(Wang resin)的Fmoc-[20-28]、Fmoc-[20-22]、Fmoc-[20-23]、Fmoc-[20-24]和Fmoc-[20-25]的LCMS图。
图5显示了用HMPA-AM树脂的Fmoc-[20-28]、Fmoc-[20-22]、Fmoc-[20-23]、Fmoc-[20-24]和Fmoc-[20-25]的LCMS图。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究,发现使用一种特定的树脂可以有效控制胸腺法新固相合成过程中的DKP。在此基础上,完成了本发明。
本文中所使用的化合物、化学基团和试剂等的表示方法均为所属领域公认的表示方法。为了方便查阅,下表将列出本文中所用到的缩略语及其具体名称:
本发明中涉及的结构式如下表所示:
如本文所用,“固相合成”或“多肽固相合成(solid phase peptide synthesis)”是一种本领域熟知的多肽合成技术,包括但不限于下述方法:将一个氨基被保护的氨基酸共价连接(键合)在固相载体上;在去保护剂存在下,脱掉氨基的保护基,使第一个氨基酸接到固相载体上;然后氨基被封闭(保护)的第二个氨基酸的羧基通过活化,羧基被活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应(缩合)形成肽键,这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽;重复上述肽键形成反应,使肽链从C端向N端生长,直至达到所需要的肽链长度;最后脱去氨基的保护基,水解肽链和固相载体之间的酯键(切割),得到合成好的肽。
如本文所用,“去保护剂”或“脱保护剂”可以互换使用,都是指可以将连接在氨基酸上的氨基保护剂去除的化学试剂,所述的氨基保护基团可以使本领域熟知的,例如但不限于,Fmoc,Boc。
如本文所用,“缩合剂”、“活化剂”、或“缩合活化剂”可以互换使用,都是指使一个氨基酸的氨基和另一个氨基酸的羧基缩合形成肽键的化学试剂,可以使本领域熟知的,例如但不限于,碳二亚胺、ByPOB、HATU、TBTU、TMP、DIPEA。
如本文所用,“切割剂”和“裂解液”可以互换使用,都是指将同树脂键合的多肽和树脂分离的化学试剂,可以使本领域熟知的,例如但不限于,含有TFA的弱酸性溶液、HCl溶液。
树脂
本发明提供的特定树脂是在HMPA Linker和AM树脂中连接一个氨基酸或一段小肽,具体地可以如结构式Ⅰ所示:
HMPA-AAn-AM树脂 | Ⅰ |
式中,AA是指带侧链保护的氨基酸,所述氨基酸选自Arg(Pbf)、Lys(Boc)、Asn(Trt)、Gln(Trt)、Asp(OtBu)、Glu(OtBu)、Pro、Gly,优选自Arg(Pbf)、Pro、Lys(Boc)、Gly;当n为大于1的整数时,涉及的氨基酸可以是相同的,也可以是不同的;n为0、1、2、3、4、5、6、7或8,优选为0、1、2、3或4。
树脂的制备方法
本发明提供的上述在HMPA Linker和AM树脂中连接一个氨基酸或一段小肽的特定树脂可以通过多肽固相合成的方式获得。具体地,可以包括下述步骤:
步骤一、通过多肽固相合成方式得到多肽树脂片段:AA1-AA2……AAn-AM树脂;
步骤二、连接HMPA Linker,得到HMPA-AA1-AA2……AAn-AM树脂。
上述步骤二中使用的缩合剂优选DIC/HOBt。
树脂的用途-胸腺法新的制备方法
本发明提供的上述在HMPA Linker和AM树脂中连接一个氨基酸或一段小肽的特定树脂可以用于胸腺法新的多肽固相合成。
本发明提供的胸腺法新多肽固相合成的制备方法包括步骤:
第一步,将Fmoc-Asn(Trt)-OH和结构如式Ⅰ所示的本发明提供的特定树脂偶联,得到Fmoc-Asn(Trt)-HMPA-AA1-AA2……AAn-AM树脂;
第二步,使用脱保护剂脱除Fmoc;
第三步,按照固相合成法重复第二步中氨基酸与树脂偶联的步骤与第三步中脱保护的步骤,将具有侧链保护基团的氨基酸从肽链碳端到氮端依次偶联,获得结构如式Ⅲ所示的肽树脂;所述氨基酸的保护基团为Fmoc;(OtBu/tBu是保护基,最后会被脱除)
第四步,结构如式Ⅲ所示的肽树脂和裂解液混合,得到结构如式Ⅱ所示的胸腺法新。
在本发明的一种实施方式中,测定第一步得到的Fmoc-Asn(Trt)-HMPA-AA1-AA2……AAn-AM树脂的取代值,取代值范围在0.05-0.5mmol/g之间,优选为0.15-0.35mmol/g。
上述方法的第一和/或第三步肽键形成的偶联反应中,可以使用本领域常规的缩合剂,例如但不限于,选用下述的一种或一种以上的混合:DIC、HATU、TBTU、HBTU、PyBop、HOBt、Cl-HOBt、DIEA、NMM;在本发明的一个优选例中,涉及的缩合剂为DIC/HOBt/DMAP或为HBTU/HOBt/DIEA的组合。在整个反应过程中用茚三酮显色法(Kaiser)测试(Kaiser test)监控。
上述方法的第二和/或第三步脱去氨基酸侧链保护基团的反应中,使用的去保护剂选自下述的一种或一种以上的组合:①1%-50%哌啶的DMF溶液;②0.5%-10%DBU的DMF溶液;③1%-10%哌嗪的DMF溶液;④0.5%-10%HOBt的DMF溶液;⑤0.1%-10%DTT的DMF溶液;⑥5%-50%乙醇胺的DMF溶液;⑦5-50%TBA的DMF溶液;⑧1%-10%环己亚胺的DMF溶液;⑨3%-30%N-甲基吡咯烷的DMF溶液,优选为①或①、②的组合,如20%PIP的DMF溶液,20%PIP+5%DBU的DMF溶液。
上述方法的第四步中涉及的裂解液选自下述:①三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、三异丙基硅烷、水的体积比为90-95:2-5:2-5:1-3;②三氟乙酸、三异丙基硅烷、水的体积比为90-95:2-5:2-5或③三氟乙酸、苯甲硫醚、苯甲醚、1,2-乙二硫醇的体积比为85-90:2-5:2-5:3-5,优选为三氟乙酸/1,2-乙二硫醇/三异丙基硅烷/水=90/2/5/3。
在本发明的一个优选实施例中,上述第四步是将结构如式Ⅲ所示的肽树脂和裂解液混合,甲基叔丁基醚沉降、离心、干燥后得到胸腺法新粗品,再经纯化(例如但不限于,通过反相高效液相色谱柱,在流动相为醋酸的水溶液和/或醋酸的乙腈溶液的情况下,通过梯度洗脱进行纯化)、冻干后得到胸腺法新。
有关茚三酮显色法(Kaiser)测试法,及其监控方法可以参见文献VIRENDERK.SARIN,et al.“Quantitative Monitoring of Solid-Phase Peptide Synthesis bythe Ninhydrin Reaction”ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 117,147-157(1981)、E.KAISER,etal.“Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in the Solid-PhaseSynthesis of Peptides”SHORT COMMUNICATIONS 595-598(Received October 28,1969)、和THORKILD CHRISTENSEN“A Qualitative Test for Monitoring CouplingCompleteness in Solid Phase Peptide Synthesis Using Chloranil”Acta ChemicaScandinavica B 33(1979)763-766。
本发明提到的上述特征,或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用,说明书中所揭示的各个特征,可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明,所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于:
1、本发明首次提供了一种有助于胸腺法新固相合成的树脂。
2、本发明提供的胸腺法新固相合成方法可有效控制DKP。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的,例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例中,胸腺法新粗肽的检测方法为:
粗产品品检测方法:
柱子:Kromas1 100-5C18 5μm 250*4.6mm
流动相A:0.085%磷酸-14%乙腈
流动相B:0.085%磷酸-25%乙腈
检测波长:210nm;
梯度 | A% | B% |
0min | 100 | 0 |
30min | 50 | 50 |
31min | 0 | 100 |
35min | 0 | 100 |
35.1min | 100 | 0 |
45min | 100 | 0 |
纯化方法:
色谱柱:Kromasil C18,10μm,30mm*250mm
波长:214nm
流动相:A:H2O+0.1%HAc
B:ACN+0.1%HAc
梯度 | A | B |
0min | 90% | 10% |
60min | 60% | 40% |
60.1min | 5% | 95% |
80min | 5% | 95% |
实施例1
H-[Arg(Pbf)]4-AM resin的合成
(1)AM resin(天津南开和成科技有限公司生产,替代度为1.1mmol/g,100g)投入固相反应柱,用DMF洗2次,DMF溶胀30分钟。
(2)将Fmoc-Arg(Pbf)-OH(142.73g)、HOBt(44.58g)用DMF(800mL)溶解,加入DIPCDI(69mL),于冰浴中预反应10分钟。
(3)将上述反应液加入固相反应釜中,机械搅拌,室温下反应3小时,茚三酮检测,树脂无色透明。
(4)抽干溶液,用DMF洗涤3次。用20%的哌啶的DMF溶液,室温下脱除Fmoc两次,时间分别为10min和20min。
(5)抽干溶液,树脂用DMF洗5次,DCM洗涤2次,茚三酮检测呈阳性。
(6)重复步骤(2)至步骤(5),得到H-[Arg(Pbf)]4-AM resin。
实施例2
H-Asn(Trt)-HMPA-[Arg(Pbf)]4-AM resin的合成
(1)将HMPA Linker(40.08g)、HOBt(44.58g),用DMF(800mL)溶解,加入DIPCDI(69ml),于冰浴中预反应10分钟。
(2)上述反应液加入固相反应柱中,机械搅拌,室温下反应3小时,用茚三酮检测,树脂无色透明。抽干溶液,树脂用DMF洗3次。
(3)将Fmoc-Asn(Trt)-OH(131.27g)、HOBt(44.58g)、DMAP(2.69g),用DMF(6L)溶解,加入DIPCDI(69ml),于冰浴中预反应10分钟。
(4)上述反应液加入固相反应柱中,机械搅拌,室温下反应3小时。抽干溶液,树脂用DMF洗3次,甲醇收缩。
(5)树脂封闭2h,封闭液为DMF/醋酸酐/吡啶=1L/80mL/100mL。
(6)抽干溶液,树脂用DMF洗3次,甲醇收缩。树脂干燥,测定取代值为0.32mmol/g。
(7)从步骤(6)干燥后的树脂中取出100g,用DMF溶胀10min。
(8)用20%的哌啶的DMF溶液,室温下脱除Fmoc两次,时间分别为5min和10min。
(9)抽干溶液,树脂用DMF洗5次,DCM洗涤2次,茚三酮检测呈阳性。
实施例3
Fmoc氨基酸缩合及封闭
(1)将Fmoc-Glu(OtBu)-OH(40.85g)、HOBt(19.45g)用DMF(800mL)溶解,加入DIPCDI(30ml),于冰浴中预反应10分钟。
(2)将上述反应液加入固相反应釜中,机械搅拌,室温下反应3小时,茚三酮检测,树脂无色透明。
(3)抽干溶液,用DMF洗涤3次。用20%的哌啶的DMF溶液,室温下脱除Fmoc两次,时间分别为10min和20min。
(4)抽干溶液,树脂用DMF洗五次,DCM洗涤两次,茚三酮检测呈阳性。
(5)重复步骤(1)至步骤(4),得到H-[1-28]-HMPA-[Arg(Pbf)]4-AM resin。
(6)树脂封闭2h,封闭液为DMF/醋酸酐/吡啶=900mL/80mL/100mL。
(7)抽干溶液,用DMF洗涤5次,DCM洗2次,甲醇收缩2次,干燥,称重得到256.47g肽树脂。
实施例4
肽树脂裂解
(1)配制1L的裂解液,裂解液的配比为TFA/EDT/TIS/H2O=90/2/5/3,加到裂解反应器中,控温至0℃。
(2)缓慢加入100g肽树脂,搅拌10min,然后升温至25℃,再反应2h。
(3)过滤树脂,收集滤液。树脂用100mLTFA洗涤,合并滤液。
(4)将滤液加入到10L冰冻的甲基叔丁基醚中,析出沉淀。
(5)离心,并用2L甲基叔丁基醚洗涤沉淀2次。
(6)真空干燥,得到胸腺法新粗肽48.3g粗肽,纯度67.2%。
通过LCMS来分析(杂质的峰面积比产物的峰面积),由于粗肽中杂质比较多,所以我们选取Fmoc-[20-28]来分析,对比用王树脂(Wang resin)和HMPA-AM树脂的LCMS图(参见附图4和5),可以看出主要的DKP杂质:Fmoc-[20-22]、Fmoc-[20-23]、Fmoc-[20-24]、Fmoc-[20-25]的含量变化:
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并非用以限定本发明的实质技术内容范围,本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中,任何他人完成的技术实体或方法,若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同,也或是一种等效的变更,均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
Claims (10)
1.一种结构如式Ⅰ所示的固相合成树脂;
HMPA-AAn-AM树脂 Ⅰ
其中的AA为Arg;n为4。
2.如权利要求1所述的固相合成树脂,其特征在于,所述侧链保护基团选自Pbf、Boc、Trt、OtBu。
3.一种如权利要求1所述的固相合成树脂的制备方法,其特征在于,所述方法包括步骤:
(1)将Fmoc-AAn-OH和AM树脂缩合,得到Fmoc-AAn-AM树脂;
(2)将Fmoc-AAn-AM树脂和去保护剂混合、洗涤得到AAn-AM树脂;
(3)将HMPA-Linker和AAn-AM树脂缩合,得到如权利要求1所述的固相合成树脂;
其中的AA为Arg(Pbf);n为4。
4.如权利要求3所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)和(3)中所述的Fmoc-氨基酸和树脂的缩合在缩合剂的存在下进行,所述缩合剂由N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-羟基苯并三唑(HOBt)和N,N-二甲基吡啶(DMAP)组成。
5.一种如权利要求1或2所述的固相合成树脂的用途,其特征在于,用于结构如式Ⅱ所示的胸腺法新的固相合成;
6.一种如式Ⅱ所示的胸腺法新的固相合成制备方法,以如权利要求1或2所述的固相合成树脂为起始原料,按照固相合成的方法依次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸或多肽,获得保护的二十八肽树脂,其间依次脱去Fmoc-保护基团,用缩合剂进行接肽反应,得保护的二十八肽树脂后,同步进行脱侧链保护基团及切肽,获得胸腺法新;
7.如权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述的制备方法包括步骤:
(i)连接Fmoc-Asn(Trt)-OH,得到Fmoc-Asn(Trt)-HMPA-AAn-AM树脂;
(ii)将Fmoc-Asn(Trt)-HMPA-AAn-AM树脂与去保护试剂混合,脱除Fmoc;
(iii)按照Fmoc固相合成法重复步骤(i)中氨基酸与树脂偶联的操作与步骤(ii)中脱保护操作,将具有侧链保护基团的氨基酸从肽链碳端到氮端依次偶联,获得结构如式Ⅲ所示的Fmoc保护的二十八肽树脂;
(iv)Fmoc保护的二十八肽树脂经裂解液裂解得到胸腺法新;
8.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述的去保护剂以其总体积计,其中含有1%-50%哌啶,0.5%-10%二环脒(DBU),1%-10%哌嗪,0.5%-10%1-羟基苯并三唑(HOBt),0.1%-10%1,4-二硫代苏糖醇(DTT),5%-50%乙醇胺,5%-50%叔丁基胺(TBA),1%-10%环己亚胺,和/或3%-30%N-甲基吡咯烷。
9.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,连接或偶联具有Fmoc保护基团的氨基酸或多肽时的缩合剂为下述的一种或一种以上的混合:DIC、HATU、TBTU、HBTU、PyBop、HOBt、Cl-HOBt、DIEA、NMM。
10.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述裂解液中含有下述一种或一种以上的混合:三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、三异丙基硅烷、水、苯甲硫醚、苯甲醚。
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