CN113072506B - 一类含天冬氨酸、谷氨酸的环二肽的合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一类含天冬氨酸、谷氨酸的环二肽的合成方法，该方法是以Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH或Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH为原料，与9‑芴甲醇反应得到全保护氨基酸的芴甲酯，然后脱除侧链叔丁氧基，得到保护氨基酸Fmoc‑Asp‑OFm或Fmoc‑Glu‑OFm；再以2‑CTC Resin树脂为载体与Fmoc‑Asp‑OFm或Fmoc‑Glu‑OFm侧链γ‑羧基键合，固相环化合成全保护环二肽，切割裂解得到碳端为天冬氨酸或谷氨酸的环二肽。该方法通过引入9‑芴甲醇保护羧基，在固相合成二肽的过程中可顺利除去，整个过程操作简单，固相环合效率高，纯度高，可适用于批量化合成碳端为天冬氨酸或谷氨酸的环二肽。

Description

一类含天冬氨酸、谷氨酸的环二肽的合成方法
技术领域
本发明属于多肽合成技术领域，具体涉及一类含天冬氨酸、谷氨酸的环二肽的合成方法。
背景技术
环二肽(cyclic dipeptides)，又名2,5-二酮哌嗪(2,5-diketopiperazines)，是一自然界中最小的环肽，这类化合物在人、脊椎动物、无脊椎动物、植物、真菌和细菌中均有发现。由于环二肽形成了一个稳定的六元环结构，具有一定的构象约束作用。有两个氢键给体和两个氢键受体，氢键是药物与受体相互作用的主要方式之一，因此环二肽在药物化学中是一个重要的药效团。目前发现的一些环二肽具有抗病毒、抗菌、抗肿瘤等生物活性，因此环二肽及其衍生物常被作为候选物，一直受到合成化学家和生物学家及药物学家的追捧。
L-天冬氨酸作为人体非必需的酸性氨基酸，具有广泛的用途。可作为钾、钙等无机离子补充剂、氨解毒剂。临床上可用于治疗慢性肝炎、心肌功能障碍、低钾症、缺血性贫血等。L-谷氨酸作为哺乳动物脑内含量最高的酸性氨基酸，可调节体内的氨水平，作为兴奋型递质，临床上主要用于神经系统疾病的治疗，还可改善儿童智力发育，是一种公认的健脑物质。当前，有很多含有天冬氨酸、谷氨酸环二肽的合成及其生物活性报道。例如从美洲大蠊中分离得到的Cyclo(Tyr-Asp)，具有显著促进HUVEC细胞血管生成的功效，同时具有创面修复的功效。Cyclo(Asp-Pro)是起源于肠抑素的内源性肽，可以抑制脂肪吸收，起到减肥的作用。南京农业大学报道的Cyclo(Leu-Glu)，可促进植物的生长。左旋多巴(L-DOPA)是一种天然存在的稀有氨基酸，与谷氨酸形成的环二肽，即Cyclo(L-DOPA-Glu)，具有良好的抗氧化活性及自由基清除能力。
含有天冬氨酸、谷氨酸的环二肽的合成方法有经典液相合成法和固相合成法，其中液相合成法采取最大保护策略，从N端到C端合成，采取活泼酯法或对称酸酐法，合成得到全保护二肽甲酯片段，氨酯交换环合，液相合成周期长，且二肽甲酯片段需要柱层析；固相合成法包括直接缩合法和分子内氨解法，分子内氨解法多选用Oxime树脂，以肟为Linker的载体，形成羧酸肟酯，亲核活性高，但树脂昂贵，应用较少；直接缩合法：采取Fmoc/tBu/OAL正交策略或Fmoc/tBu/Dmab正交策略，合成线性二肽，脱除N端和C端保护，在固相载体上直接缩合得到目标环肽。采用Fmoc/tBu/OAL正交策略，须使用高毒试剂3-溴丙烯，安全性低，且脱保护须使用过渡金属催化剂钯，对空气敏感且价格昂贵，脱保护反应的试剂残留影响环合反应的发生；采用Fmoc/tBu/Dmab正交策略，羧基保护基需使用2-{1-[4-(羟甲基)苯氨基]-3-甲基亚丁基}-5,5-二甲基-1,3-环己二酮(Dmab-OH)，价格约2400元/g，价格昂贵，脱保护需使用水合肼，增加了合成步骤，故应用较少。
发明内容
本发明的目的是提供一种合成工艺简单、成功率高、适用性广、可批量化合成的含天冬氨酸、谷氨酸的环二肽的方法。
本发明所述含天冬氨酸、谷氨酸的环二肽的结构式为：
Figure BDA0003046584520000021
其中，式Ⅰ为含天冬氨酸的环二肽，其分子通式为Cyclo(AA-Asp)，式Ⅱ为含谷氨酸的环二肽，其分子通式为Cyclo(AA-Glu)，分子通式中AA代表α-氨基酸，式Ⅰ和式Ⅱ中R为α-氨基酸的侧链；其合成路线和合成方法如下：
Figure BDA0003046584520000031
1、以Fmoc-Asp(OtBu)-OH或Fmoc-Glu(OtBu)-OH为原料，以二氯甲烷为溶剂，在4-二甲氨基吡啶、N,N′-二环己基碳二亚胺作用下与9-芴甲醇缩合，得到Fmoc-Asp(OtBu)-OFm或Fmoc-Glu(OtBu)-OFm，然后在三氟乙酸作用下脱除侧链OtBu基团，得到Fmoc-Asp-OFm或Fmoc-Glu-OFm。
2、以2-CTC Resin树脂为载体，在N,N′-二异丙基乙胺作用下将Fmoc-Asp-OFm或Fmoc-Glu-OFm的侧链γ-羧基与2-CTC Resin树脂键合，得到Fmoc-Asp(2-CTC Resin)-OFm或Fmoc-Glu(2-CTC Resin)-OFm。
3、用体积浓度为20％的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除Fmoc-Asp(2-CTCResin)-OFm或Fmoc-Glu(2-CTC Resin)-OFm的N端Fmoc基团，得到H-Asp(2-CTC Resin)-OFm或H-Glu(2-CTC Resin)-OFm。
4、以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，在1-羟基苯并三唑和N,N-二异丙基碳二亚胺作用下，在H-Asp(2-CTC Resin)-OFm或H-Glu(2-CTC Resin)-OFm中的树脂上连接Fmoc-AA(X)-OH，得到直链全保护二肽Fmoc-AA(X)-Asp(2-CTC Resin)-OFm或Fmoc-AA(X)-Glu(2-CTCResin)-OFm；所述Fmoc-AA(X)-OH中的X为AA的侧链保护基团，当侧链没有保护基团时X为H原子。
5、用体积浓度为50％的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除Fmoc-AA(X)-Asp(2-CTC Resin)-OFm或Fmoc-AA(X)-Glu(2-CTC Resin)-OFm的N端Fmoc基团和C端OFm基团，得到H-AA(X)-Asp(2-CTC Resin)-OH或H-AA(X)-Glu(2-CTC Resin)-OH。
6、以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，将H-AA(X)-Asp(2-CTC Resin)-OH或H-AA(X)-Glu(2-CTC Resin)-OH与1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐、N-甲基吗啉，在氮气保护下进行固相环合反应，得到全保护环肽树脂Cyclo(AA(X)-Asp(2-CTCResin))或Cyclo(AA(X)-Glu(2-CTC Resin))。
7、将步骤6得到的Cyclo(AA(X)-Asp(2-CTC Resin))或Cyclo(AA(X)-Glu(2-CTCResin))用含三氟乙酸的裂解切割液裂解树脂的同时脱除环肽侧链，得到目标环二肽Cyclo(AA-Asp)或Cyclo(AA-Glu)。
上述步骤1中，优选将Fmoc-Asp(OtBu)-OH或Fmoc-Glu(OtBu)-OH和9-芴甲醇溶于干燥的二氯甲烷，加入4-二甲氨基吡啶，降温至0℃，滴加N,N′-二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液，滴加完毕后保持0℃反应30分钟，过滤除去沉淀，自然升温至室温反应，反应7～8小时，得到Fmoc-Asp(OtBu)-OFm或Fmoc-Glu(OtBu)-OFm。其中，所述Fmoc-Asp(OtBu)-OH或Fmoc-Glu(OtBu)-OH与9-芴甲醇、4-二甲氨基吡啶、N,N′-二环己基碳二亚胺的摩尔比优选为1:1.1～1.5:0.1～0.2:1.2～2.0。
上述步骤2中，优选2-CTC Resin树脂与Fmoc-Asp-OFm或Fmoc-Glu-OFm、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比为1:1.1～1.3:4～5。
上述步骤3中，优选脱除N端Fmoc基团的时间为15～20分钟。在此时间范围内，N端的Fmoc基团可完全脱除。而C端的OFm几乎无法脱除。实验表明：OFm基团在体积浓度为20％的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，20分钟内脱除比例不超过3％，即天冬氨酸或谷氨酸的α-羧基游离的比例不超过3％。游离的α-羧基经活化后，与哌啶形成酰胺，脱保护后与目标环二肽极性差异大，易于除去。故对于固相合成而言，可忽略不计。
上述步骤4中，优选将H-Asp(2-CTC Resin)-OFm或H-Glu(2-CTC Resin)-OFm加入N,N-二甲基甲酰胺中，并加入Fmoc-AA(X)-OH、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺，在氮气保护下反应2～3小时，抽滤，依次用异丙醇和N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，得到Fmoc-AA(X)-Asp(2-CTC Resin)-OFm或Fmoc-AA(X)-Glu(2-CTC Resin)-OFm。其中，优选所述Fmoc-AA(X)-OH、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺与步骤2中2-CTC Resin树脂的摩尔比为2～4:2.5～5:2.5～5:1。
上述步骤5中，优选脱除N端Fmoc基团和C端OFm基团的时间为3～4小时。在体积浓度为50％的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，4小时内可将N端Fmoc基团和C端OFm基团完全脱除，游离氨基端，同时游离谷氨酸或天冬氨酸的α-羧基端。
上述步骤6中，优选1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐，N-甲基吗啉与步骤2中2-CTC Resin树脂的摩尔比为2～4:3～6:8～15:1。进一步优选固相环合反应的时间为3～4.5小时。
上述步骤7中，所述含三氟乙酸的裂解切割液选自三氟乙酸与三异丙基硅烷、苯甲硫醚、水体积比为88:5:4:3的混合液或三氟乙酸与三异丙基硅烷、水体积比为92:5:3的混合液或三氟乙酸与水的体积比为95:5的混合液；切割裂解液主要成分为三氟乙酸，是否加入三异丙基硅烷和苯甲硫醚须根据形成的环二肽二酮哌嗪环上的侧链R基团及其保护基团X而定。如：无侧链保护或保护基是Boc时用三氟乙酸和水，保护基是Pbf时加苯甲硫醚和三异丙基硅烷。
本发明先以液相合成Fmoc-Asp-OFm或Fmoc-Glu-OFm，再选用2-CTC Resin树脂为载体将Asp或Glu的γ-羧基键合于树脂上，通过固相合成环二肽得到环肽树脂，裂解树脂脱除保护基，得到目标环二肽。与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、本发明选用9-芴甲醇保护羧基，合成Fmoc-Asp(OtBu)-OFm或Fmoc-Glu(OtBu)-OFm，9-芴甲醇廉价易得，易于除去，形成芴甲酯后，由于OFm基团的多芳香环结构，产物的极性很小，可通过石油醚/乙酸乙酯体系快速柱层析洗脱得到，经过三氟乙酸脱除OtBu基团，得到Fmoc-Asp-OFm或者Fmoc-Glu-OFm。液相合成过程简单，试剂廉价，安全性高。
2、本发明首次提出Fmoc/tBu/OFm正交保护策略合成环二肽，通过控制哌啶浓度和脱除反应时间，可选择性地脱除Fmoc基团和OFm基团，整个过程只须一次20％的哌啶溶液脱Fmoc操作，OFm基团在此浓度下，15min内几乎无法脱除，故此方法是合成天冬氨酸、谷氨酸环二肽量身定做的合成方法，简单实用。
3、本发明选用苯并三氮唑、N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐作缩合剂，克服了1-羟基苯并三唑及N,N′-二异丙基碳二亚胺作为缩合剂，环合不完全，杂质偏多的弊端。环合在树脂上进行，通过抽滤洗涤即可除去杂质，是一种操作简单的合成方式。
4、本发明避免了高毒试剂3-溴丙烯的使用，操作安全性高；避免了价格昂贵的金属钯催化剂及Dmab-OH的使用，经济合理性高。
5、本发明合成的环二肽大多呈白色固体或无色固体，可溶于水，易溶于甲醇，在空气中化学性质稳定。
附图说明
图1是Cyclo(Asp-Asp)的HPLC色谱图。
图2是Cyclo(Asp-Asp)的ESI-MS图谱。
图3是Cyclo(Gln-Asp)的HPLC色谱图。
图4是Cyclo(Gln-Asp)的ESI-MS图谱。
图5是Cyclo(Arg-Asp)的HPLC色谱图。
图6是Cyclo(Arg-Asp)的ESI-MS图谱。
图7是Cyclo(Asp-Glu)的HPLC色谱图。
图8是Cyclo(Asp-Glu)的ESI-MS图谱。
图9是Cyclo(Lys-Glu)的HPLC色谱图。
图10是Cyclo(Lys-Glu)的ESI-MS图谱。
图11是Cyclo(Phe-Glu)的HPLC色谱图。
图12是Cyclo(Phe-Glu)的ESI-MS图谱。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
合成天冬氨酸-天冬氨酸环二肽
1、称取40g(97.3mmol)Fmoc-Asp(OtBu)-OH、21g(107mmol)9-芴甲醇溶于500mL干燥的二氯甲烷中，在搅拌条件下，加入1.19g(9.73mmol)4-二甲氨基吡啶，降温至0℃，滴加50mL含24.1g(116.8mmol)N,N′-二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液，滴加完毕后保持0℃反应30分钟，过滤除去沉淀，自然升温至室温，反应7小时，TLC监测反应完全。减压浓缩反应液，浓缩物用少许二氯甲烷溶解，石油醚-乙酸乙酯体系柱层析(体积比PE:EA＝5:1)，得到48g白色固体Fmoc-Asp(OtBu)-OFm。
向48g(81.4mmol)Fmoc-Asp(OtBu)-OFm中加入400mL三氟乙酸、20mL水，室温搅拌反应3小时，脱除侧链OtBu基团，减压浓缩至无馏分溢出，将浓缩液倒入300mL纯水中，超声分散，有大量固体析出，过滤，滤饼依次用饱和碳酸氢钠水溶液、纯水超声洗涤，过滤，烘干得42g白色固体Fmoc-Asp-OFm。
2、称取10g 2-CTC Resin树脂(取代度1.60mmol/g)在二氯甲烷中溶胀10分钟，然后加入9.38g(17.6mmol)Fmoc-Asp-OFm、10.6mL(64mmol)N,N′-二异丙基乙胺、40mL二氯甲烷，在氮气保护下室温搅拌反应2小时，使Fmoc-Asp-OFm的侧链γ-羧基与2-CTC Resin树脂键合，然后加入无水甲醇封闭30分钟，抽滤，滤饼依次用50mL异丙醇、50mL N,N-二甲基甲酰胺洗涤，得到Fmoc-Asp(2-CTC Resin)-OFm。
3、用60mL体积浓度为20％的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除步骤2所得Fmoc-Asp(2-CTC Resin)-OFm的Fmoc保护基15分钟，抽滤，滤饼依次用异丙醇、N,N-二甲基甲酰胺分别洗涤两次，每次50mL，茚三酮检测树脂为阳性黑色，得到H-Asp(2-CTC Resin)-OFm。
4、将步骤3得到的H-Asp(2-CTC Resin)-OFm加入60mL N,N-二甲基甲酰胺中，并加入13.2g(32mmol)Fmoc-Asp(OtBu)-OH、6.5g(48mmol)1-羟基苯丙三唑、7.4mL(48mmol)N,N′-二异丙基碳二亚胺，在氮气保护下室温搅拌反应2小时，茚三酮检测树脂为阴性无色透明。抽滤，滤饼依次用异丙醇、N,N-二甲基甲酰胺分别洗涤两次，每次50mL，得到直链全保护二肽Fmoc-Asp(OtBu)-Asp(2-CTC Resin)-OFm。
5、向步骤4得到的Fmoc-Asp(OtBu)-Asp(2-CTC Resin)-OFm中加入70mL体积浓度为50％的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液，室温搅拌反应3小时，脱除N端Fmoc基团和C端OFm基团。反应液抽滤，滤饼依次用异丙醇、N,N-二甲基甲酰胺分别洗涤两次，每次50mL，用甲醇洗涤三次，每次50mL，茚三酮检测树脂为阳性黑色，得到H-Asp(OtBu)-Asp(2-CTC Resin)-OH。
6、将8.6g(64mmol)1-羟基苯丙三唑、24.2g(64mmol)苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐、14mL(128mmol)N-甲基吗啉溶于65mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入步骤5所得H-Asp(OtBu)-Asp(2-CTC Resin)-OH中，在氮气保护下室温搅拌3小时，进行固相环合反应。茚三酮检测树脂阴性无色透明，抽滤反应液，滤饼依次用异丙醇、N,N-二甲基甲酰胺分别洗涤两次，每次50mL，无水甲醇洗涤三次，每次40mL，干燥，得全保护环肽树脂Cyclo(Asp(OtBu)-Asp(2-CTC Resin))。
7、向步骤6所得Cyclo(Asp(OtBu)-Asp(2-CTC Resin))中加入95mL三氟乙酸、5mL水，室温搅拌反应2小时，减压浓缩至无馏分溢出，加入50mL纯水，过滤后采用反相色谱制备纯化：流动相A是质量分数为0.1％的醋酸水溶液，AQ-C18色谱柱：5cm×20cm，检测波长215nm，流速25mL/min。色谱柱先用100％流动相A平衡，平衡后上样，运行程序：100％流动相A洗脱。合格品浓缩后冷冻干燥，得到Cyclo(Asp-Asp)冻干粉2.98g，即天冬氨酸-天冬氨酸环二肽，其HPLC纯度大于95％，色谱图见图1，ESI-MS m/z：253(M+Na+，100)，质谱图见图2，收率81.2％。
实施例2
合成谷氨酰胺-天冬氨酸环二肽
本实施例步骤1、2、3与实施例1相同。
本实施例的步骤4中，将步骤3得到的H-Asp(2-CTC Resin)-OFm加入60mL N,N-二甲基甲酰胺中，并加入19g(32mmol)Fmoc-Asn(Trt)-OH、6.5g(48mmol)1-羟基苯丙三唑、7.4mL(48mmol)N,N′-二异丙基碳二亚胺，其他步骤与实施例1步骤4相同，得到直链全保护二肽Fmoc-Asn(Trt)-Asp(2-CTC Resin)-OFm。
本实施例步骤5、6均与实施例1步骤5、6相同。
本实施例步骤7中，向步骤6所得Cyclo(Asn(Trt)-Asp(2-CTC Resin))中加入92mL三氟乙酸、5mL三异丙基硅烷、3mL水，室温搅拌反应2小时，减压浓缩至无馏分溢出，加入30mL纯水，过滤后采用亲水色谱制备纯化：流动相A为超纯水，流动相B为乙腈，色谱柱5cm×20cm，填料为Click xion6010型亲水填料，检测波长215nm，流速30mL/min。色谱柱先用90％流动相B平衡，平衡后上样，运行程序：90％流动相B10min，90％～80％流动相B 30min，80％～70％流动相B 30min。合格品浓缩后冷冻干燥，得到Cyclo(Asn-Asp)冻干粉2.87g，即天冬酰胺-天冬氨酸环二肽，其HPLC纯度大于92％，色谱图见图3，ESI-MS m/z：265.99(M+Na+，100)，质谱图见图4，收率74.3％。
实施例3
合成精氨酸-天冬氨酸环二肽
本实施例步骤1、2、3与实施例1相同。
本实施例的步骤4中，将步骤3得到的H-Asp(2-CTC Resin)-OFm加入60mL N,N-二甲基甲酰胺中，并加入20.8g(32mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH、6.5g(48mmol)1-羟基苯丙三唑、7.4mL(48mmol)N,N′-二异丙基碳二亚胺，其他步骤与实施例1步骤4相同，得到直链全保护二肽Fmoc-Arg(Pbf)-Asp(2-CTC Resin)-OFm。
本实施例步骤5、6均与实施例1步骤5、6相同。
本实施例步骤7中，向步骤6所得Cyclo(Arg(Pbf)-Asp(2-CTC Resin))中加入88mL三氟乙酸、5mL三异丙基硅烷、4mL苯甲硫醚、3mL水，室温搅拌反应2小时，减压浓缩至无馏分溢出，加入50mL纯水，过滤后采用反相色谱制备纯化：流动相A是质量分数为0.1％的醋酸水溶液，AQ-C18色谱柱：5cm×20cm，检测波长215nm，流速20mL/min。色谱柱先用100％流动相A平衡，平衡后上样，运行程序：100％流动相A洗脱。合格品浓缩后冷冻干燥，得到Cyclo(Arg-Asp)冻干粉3.52g，即精氨酸-天冬氨酸环二肽，其HPLC纯度大于98％，色谱图见图5，ESI-MSm/z：272.09(M+1，100)，质谱图见图6，收率81.4％。
实施例4
合成天冬氨酸-谷氨酸环二肽
1、称取30g(70.5mmol)Fmoc-Glu(OtBu)-OH、15.2g(77.6mmol)9-芴甲醇溶于350mL干燥的二氯甲烷中，在搅拌条件下，加入1.29g(10.58mmol)4-二甲氨基吡啶，降温至0℃，滴加50mL含18.9g(91.7mmol)N,N′-二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液，滴加完毕后保持0℃反应30分钟，过滤除去沉淀，自然升温至室温，反应8小时，TLC监测反应完全。减压浓缩反应液，浓缩物用少许二氯甲烷溶解，石油醚-乙酸乙酯体系柱层析(体积比PE:EA＝5:1)，得到36.2g白色固体Fmoc-Glu(OtBu)-OFm。
向36.2g(60mmol)Fmoc-Glu(OtBu)-OFm中加入300mL三氟乙酸、15mL水,室温搅拌反应3小时，脱除侧链OtBu基团，减压浓缩至无馏分溢出，将浓缩液倒入300mL纯水中，超声分散，有大量固体析出，过滤，滤饼依次用饱和碳酸氢钠溶液、纯水超声洗涤，过滤，烘干得31g白色固体Fmoc-Glu-OFm。
2、称取10g 2-CTC Resin树脂(取代度1.60mmol/g)在二氯甲烷中溶胀10分钟，然后加入9.63g(17.6mmol)Fmoc-Glu-OFm、10.6mL(64mmol)N,N′-二异丙基乙胺，40mL二氯甲烷，在氮气保护下室温搅拌反应2小时，使Fmoc-Glu-OFm的侧链γ-羧基与2-CTC Resin树脂键合，然后加入无水甲醇封闭30分钟，抽滤，滤饼依次用50mL异丙醇、50mL N,N-二甲基甲酰胺洗涤，得到Fmoc-Glu(2-CTC Resin)-OFm。
3、用60mL体积浓度为20％的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除步骤2所得Fmoc-Glu(2-CTC Resin)-OFm的Fmoc保护基15分钟，抽滤，滤饼依次用异丙醇、N,N-二甲基甲酰胺分别洗涤两次，每次50mL，茚三酮检测树脂为阳性黑色，得到H-Glu(2-CTC Resin)-OFm。
4、将步骤3得到的H-Glu(2-CTC Resin)-OFm加入60mL N,N-二甲基甲酰胺中，并加入13.2g(32mmol)Fmoc-Asp(OtBu)-OH、6.5g(48mmol)1-羟基苯丙三唑、7.4mL(48mmol)N,N′-二异丙基碳二亚胺，在氮气保护下室温搅拌反应2小时，茚三酮检测树脂为阴性无色透明。抽滤，滤饼依次用异丙醇、N,N-二甲基甲酰胺分别洗涤两次，每次50mL，得到直链全保护二肽Fmoc-Asp(OtBu)-Glu(2-CTC Resin)-OFm。
5、向步骤4得到的Fmoc-Asp(OtBu)-Glu(2-CTC Resin)-OFm中加入70mL体积浓度为50％的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液，室温搅拌反应3小时，脱除N端Fmoc基团和C端OFm基团。反应液抽滤，滤饼依次用异丙醇、N,N-二甲基甲酰胺分别洗涤两次，每次50mL，用甲醇洗涤三次，每次50mL，茚三酮检测树脂为阳性黑色，得到H-Asp(OtBu)-Glu(2-CTC Resin)-OH。
6、将8.6g(64mmol)1-羟基苯丙三唑、24.2g(64mmol)苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐、14mL(128mmol)N-甲基吗啉溶于60mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入步骤5所得H-Asp(OtBu)-Glu(2-CTC Resin)-OH中，在氮气保护下室温搅拌3.5小时，进行固相环合反应。茚三酮检测树脂阴性无色透明，抽滤反应液，滤饼依次用异丙醇、N,N-二甲基甲酰胺分别洗涤两次，每次50mL，无水甲醇洗涤三次，每次40mL，干燥，得全保护环肽树脂Cyclo(Asp(OtBu)-Glu(2-CTC Resin))。
7、向步骤6所得Cyclo(Asp(OtBu)-Glu(2-CTC Resin))中加入95mL三氟乙酸、5mL水，室温搅拌反应2小时，减压浓缩至无馏分溢出，加入35mL纯水，过滤后采用反相色谱制备纯化：流动相A是质量分数为0.1％的醋酸水溶液，色谱柱5cm×35cm，填料为反相聚合物，检测波长215nm，流速25mL/min。色谱柱先用100％流动相A平衡，平衡后上样，运行程序：100％流动相A洗脱。合格品浓缩后冷冻干燥，得到Cyclo(Asp-Glu)冻干粉3.32g，即天冬氨酸-谷氨酸环二肽，其HPLC纯度大于99％，色谱图见图7，ESI-MS m/z：267.13(M+Na+，100)，质谱图见图8，收率85％。
实施例5
合成赖氨酸-谷氨酸环二肽
本实施例步骤1、2、3与实施例4相同。
本实施例步骤4，将步骤3得到的H-Glu(2-CTC Resin)-OFm加入60mL N,N-二甲基甲酰胺中，并加入14.9g(32mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH、6.5g(48mmol)1-羟基苯丙三唑、7.4mL(48mmol)N,N′-二异丙基碳二亚胺，其他步骤与实施例4步骤4相同，得到Fmoc-Lys(Boc)-Glu(2-CTC Resin)-OFm。
本实施例步骤5、6均与实施例4步骤5、6相同。
本实施例步骤7中，向步骤6所得Cyclo(Lys(Boc)-Glu(2-CTC Resin))中加入95mL三氟乙酸、5mL水，室温搅拌反应2小时，减压浓缩至无馏分溢出，加入40mL纯水，过滤后采用反相色谱制备纯化：流动相A是质量分数为0.1％的醋酸水溶液，色谱柱5cm×35cm，填料为反相聚合物，检测波长215nm，流速20mL/min。色谱柱先用100％流动相A平衡，平衡后上样，运行程序：100％流动相A洗脱。合格品浓缩后冷冻干燥，得到Cyclo(Lys-Glu)冻干粉3.23g，即赖氨酸-谷氨酸环二肽，其HPLC纯度大于97％，色谱图见图9，ESI-MS m/z：258.23(M+1，100)，质谱图见图10，收率78.5％。
实施例6
合成苯丙氨酸-谷氨酸环二肽
本实施例步骤1、2、3与实施例4相同。
本实施例步骤4，将步骤3得到的H-Glu(2-CTC Resin)-OFm加入60mL N,N-二甲基甲酰胺中，并加入12.3g(32mmol)Fmoc-Phe-OH、6.5g(48mmol)1-羟基苯丙三唑、7.4mL(48mmol)N,N′-二异丙基碳二亚胺，其他步骤与实施例4步骤4相同，得到Fmoc-Phe-Glu(2-CTC Resin)-OFm。
本实施例步骤5、6均与实施例4步骤5、6相同。
本实施例步骤7中，向步骤6所得Cyclo(Phe-Glu(2-CTC Resin))中加入95mL三氟乙酸、5mL水，室温搅拌反应2小时，减压浓缩至无馏分溢出，加入50mL纯水，过滤后采用反相色谱制备纯化：流动相A是质量分数为0.1％的醋酸水溶液，流动相B为甲醇，色谱柱5cm×35cm，填料为反相聚合物，检测波长215nm，流速30mL/min。色谱柱先用20％流动相B平衡，平衡后上样，运行程序：20％流动相B15min，20％～30％流动相B 40min，35％流动相B恒流。合格品浓缩后冷冻干燥，得到Cyclo(Phe-Glu)冻干粉3.35g，即苯丙氨酸-谷氨酸环二肽，其HPLC纯度大于96％，色谱图见图11，ESI-MS m/z：299.18(M+Na+，100)，质谱图见图12，收率75.9％。

Claims (10)

1.一类含天冬氨酸、谷氨酸的环二肽的合成方法，所述环二肽的结构式为：
Figure FDA0003046584510000011
其中，式Ⅰ为含天冬氨酸的环二肽，其分子通式为Cyclo(AA-Asp)，式Ⅱ为含谷氨酸的环二肽，其分子通式为Cyclo(AA-Glu)，分子通式中AA代表α-氨基酸，式Ⅰ和式Ⅱ中R为α-氨基酸的侧链，其特征在于所述合成方法由下述步骤组成：
(1)以Fmoc-Asp(OtBu)-OH或Fmoc-Glu(OtBu)-OH为原料，以二氯甲烷为溶剂，在4-二甲氨基吡啶、N,N′-二环己基碳二亚胺作用下与9-芴甲醇缩合，得到Fmoc-Asp(OtBu)-OFm或Fmoc-Glu(OtBu)-OFm，然后在三氟乙酸作用下脱除侧链OtBu基团，得到Fmoc-Asp-OFm或Fmoc-Glu-OFm；
(2)以2-CTC Resin树脂为载体，在N,N′-二异丙基乙胺作用下将Fmoc-Asp-OFm或Fmoc-Glu-OFm的侧链γ-羧基与2-CTC Resin树脂键合，得到Fmoc-Asp(2-CTC Resin)-OFm或Fmoc-Glu(2-CTC Resin)-OFm；
(3)用体积浓度为20％的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除Fmoc-Asp(2-CTC Resin)-OFm或Fmoc-Glu(2-CTC Resin)-OFm的N端Fmoc基团，得到H-Asp(2-CTC Resin)-OFm或H-Glu(2-CTC Resin)-OFm；
(4)以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，在1-羟基苯并三唑和N,N-二异丙基碳二亚胺作用下，在H-Asp(2-CTC Resin)-OFm或H-Glu(2-CTC Resin)-OFm的树脂上连接Fmoc-AA(X)-OH，得到Fmoc-AA(X)-Asp(2-CTC Resin)-OFm或Fmoc-AA(X)-Glu(2-CTC Resin)-OFm；所述Fmoc-AA(X)-OH中的X为AA的侧链保护基团，当侧链没有保护基团时X为H原子；
(5)用体积浓度为50％的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除Fmoc-AA(X)-Asp(2-CTCResin)-OFm或Fmoc-AA(X)-Glu(2-CTC Resin)-OFm的N端Fmoc基团和C端OFm基团，得到H-AA(X)-Asp(2-CTC Resin)-OH或H-AA(X)-Glu(2-CTC Resin)-OH；
(6)以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，将H-AA(X)-Asp(2-CTC Resin)-OH或H-AA(X)-Glu(2-CTC Resin)-OH与1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐、N-甲基吗啉，在氮气保护下进行固相环合反应，得到Cyclo(AA(X)-Asp(2-CTC Resin))或Cyclo(AA(X)-Glu(2-CTC Resin))；
(7)将Cyclo(AA(X)-Asp(2-CTC Resin))或Cyclo(AA(X)-Glu(2-CTC Resin))用含三氟乙酸的裂解切割液裂解树脂，同时脱除环肽侧链，得到目标环二肽Cyclo(AA-Asp)或Cyclo(AA-Glu)。
2.根据权利要求1所述的含天冬氨酸、谷氨酸的环二肽的合成方法，其特征在于：步骤(1)中，将Fmoc-Asp(OtBu)-OH或Fmoc-Glu(OtBu)-OH和9-芴甲醇溶于干燥的二氯甲烷，加入4-二甲氨基吡啶，降温至0℃，滴加N,N′-二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液，滴加完毕后保持0℃反应30分钟，过滤除去沉淀，自然升温至室温反应，反应7～8小时，得到Fmoc-Asp(OtBu)-OFm或Fmoc-Glu(OtBu)-OFm。
3.根据权利要求2所述的含天冬氨酸、谷氨酸的环二肽的合成方法，其特征在于：步骤(1)中，所述Fmoc-Asp(OtBu)-OH或Fmoc-Glu(OtBu)-OH与9-芴甲醇、4-二甲氨基吡啶、N,N′-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1.1～1.5:0.1～0.2:1.2～2.0。
4.根据权利要求1所述的含天冬氨酸、谷氨酸的环二肽的合成方法，其特征在于：步骤(2)中，所述2-CTC Resin树脂与Fmoc-Asp-OFm或Fmoc-Glu-OFm、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比为1:1.1～1.3:4～5。
5.根据权利要求1所述的含天冬氨酸、谷氨酸的环二肽的合成方法，其特征在于：步骤(3)中，脱除N端Fmoc基团的时间为15～20分钟。
6.根据权利要求1所述的含天冬氨酸、谷氨酸的环二肽的合成方法，其特征在于：步骤(4)中，将H-Asp(2-CTC Resin)-OFm或H-Glu(2-CTC Resin)-OFm加入N,N-二甲基甲酰胺中，并加入Fmoc-AA(X)-OH、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺，在氮气保护下反应2～3小时，抽滤，依次用异丙醇和N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，得到Fmoc-AA(X)-Asp(2-CTCResin)-OFm或Fmoc-AA(X)-Glu(2-CTC Resin)-OFm。
7.根据权利要求6所述的含天冬氨酸、谷氨酸的环二肽的合成方法，其特征在于：步骤(4)中，所述Fmoc-AA(X)-OH、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺与步骤(2)中2-CTCResin树脂的摩尔比为2～4:2.5～5:2.5～5:1。
8.根据权利要求1所述的含天冬氨酸、谷氨酸的环二肽的合成方法，其特征在于：步骤(5)中，脱除N端Fmoc基团和C端OFm基团的时间为3～4小时。
9.根据权利要求1所述的含天冬氨酸、谷氨酸的环二肽的合成方法，其特征在于：步骤(6)中，所述1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐，N-甲基吗啉与步骤(2)中2-CTC Resin树脂的摩尔比为2～4:3～6:8～15:1。
10.根据权利要求1所述的含天冬氨酸、谷氨酸的环二肽的合成方法，其特征在于：步骤(6)中，固相环合反应的时间为3～4.5小时。
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