CN101838355A

CN101838355A - 一种2-氯三苯甲基氯树脂的制备方法

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Publication number: CN101838355A
Application number: CN200910080537A
Authority: CN
Inventors: 苏志国; 马光辉; 李鹏; 张竞
Original assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Current assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Priority date: 2009-03-20
Filing date: 2009-03-20
Publication date: 2010-09-22

Abstract

本发明公开了一种涉及在医药、生物化工、化学工程领域中2-氯三苯甲基氯树脂的制备方法，以2-氯二苯甲酮为原料合成1-氯-2-二氯苯甲基苯，再与低交联的聚苯乙烯(PS)白球进行化学偶联得到2-氯三苯甲基氯(2-CTC)树脂。本发明方法克服了现有2-氯三苯甲基氯树脂制备方法的步骤繁琐及必须使用有机金属试剂的弊端，简便易行且无需使用有机金属试剂，制备得到的2-CTC树脂首位氨基酸上载水平、溶胀性质及多肽固相合成效率均优于同类商品2-CTC树脂，且批次质量稳定，重复性好，易于工业化生产。

Description

一种2-氯三苯甲基氯树脂的制备方法

技术领域

本发明涉及在医药、生物化工、化学工程领域中的2-氯三苯甲基氯树脂的制备方法，更具体的说，是涉及首位氨基酸上载量高、溶胀性好、多肽固相有机合成效率高的2-氯三苯甲基氯树脂的制备方法。

背景技术

固相合成法在肽合成领域中具有操作简便，副产物少，纯化效率高等优点，被越来越多的应用于生物活性肽类的研究开发，特别是被广泛用于药用短肽的实际生产中。在多肽固相合成(Solid-phase Peptide Synthesis，SPPS)中，固相载体的选择是至关重要的一步，它直接影响到最终目标肽的产率和纯度，继而影响整个合成的经济效率。2-氯三苯甲基氯(2-chlorotrityl chloride，2-CTC)树脂是SPPS中普遍应用的载体树脂，由于其反应条件较其他树脂更温和、能够有效地抑制外消旋作用和二酮哌嗪生成等副反应的发生、产物纯度高等优点，被越来越多的应用于生物活性肽类的研究开发，特别是被广泛用于药用短肽的实际生产中。

Terracciano S等人在Bioorganic&Medicinal Chemistry 2005年13卷5225-5239页中报道了使用2-CTC-PS树脂成功合成了海绵抗癌活性环状六肽；Chen L等人在United States Patent Application 2008年39卷530-560页中报道了使用2-CTC-PS树脂采用环肽耦合策略合成了MC-4受体拮抗肽；Kang M C等人在Nat.Rev.Drug Discov.2003年2卷587-593页，Schneider S E等人在J.Peptide Sci.2005年11卷744-753页中分别报道了使用2-CTC-PS树脂合成HIV融合抑制剂T20、T1249。

李佩华等人在化学世界2007年48卷469-470页中报道了使用2-CTC-PS树脂合成了C-末端N烷基化肽酰胺；孙立枢等人在中国生物工程杂志2007年27卷80-84页中报道了使用2-CTC-PS树脂获得更高的丙肝疫苗多肽合成效率；徐婉如等人在现代生物医学进展2008年8卷1673-1676页中报道了使用2-CTC-PS树脂较Wang树脂获得更高的机体保护肽合成效率。中国专利(公开号CN1520827)公开了一种制备没有氯三苯甲基氯接头-树脂的生物活性物质或治疗剂的方法，该发明特别用于产生T-20和T-1249治疗剂。此外2-CTC树脂还可用于羧酸、醇和硫醇的固相合成，其广泛的用途和优良的性能决定了2-CTC树脂不再只是实验室常用的合成载体，而将逐渐成为大批量使用的生产用载体树脂。

目前在聚苯乙烯载体基础上制备2-CTC树脂的制备方法步骤较复杂且均须使用有机金属试剂，Orosz G等人在Tetrahedron Letters 1998年39卷3241-3242页中报道了先由聚苯乙烯树脂和苯甲酰氯通过Friedel-Crafts酰化反应得到苯甲酮衍生聚合物，再通过有机锂试剂将苯甲酮衍生聚合物转化为三苯甲基氯聚合物；Choi MKW等人在Tetrahedron 2004年60卷3903-3907页中报道了通过三苯甲基化单体聚合制备2-CTC树脂的制备方法，该方法需要使用格氏试剂。因此有机金属试剂的反应操作条件、试剂成本及废料的处理都可能会成为2-CTC树脂规模化生产中较难解决的问题。而目前国内尚无2-CTC树脂制备方法的专利及文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的2-氯三苯甲基氯树脂的制备方法。

本发明的目的在于提供一种新的2-氯三苯甲基氯树脂的制备方法，该制备方法步骤简单易于操作，且制备过程中无需使用有机金属试剂，更有利于2-氯三苯甲基氯树脂的大规模生产。

本发明提供的一种2-氯三苯甲基氯树脂的新制备方法，包括以下步骤：

(a)将1-氯-2-二氯苯甲基苯(DCPB)与低交联的聚苯乙烯树脂反应在有机溶剂环境中，一定温度下经催化剂催化，进行化学偶联得到2-氯三苯甲基醇(2-CTA)结构，反应终止后经过洗涤和干燥获得2-CTA树脂；

(b)将步骤a中得到的2-CTA树脂置于有机溶剂环境中，一定温度下与亚硫酰氯进行氯化反应得到PS树脂上的2-CTC结构，经过洗涤和干燥即得到所述的2-CTC树脂。

本发明方法的制备步骤简便，操作易行，无需使用有机金属试剂，对反应设备无特殊要求。制备得到的2-CTC树脂该2-氯三苯甲基氯树脂具有更优良的溶胀性质及氨基酸上载率，更有利于提高多肽固相合成的产物收率和纯度。

本发明还提供了上述制备方法制得的2-氯三苯甲基氯-聚苯乙烯树脂，粒径范围为50～1000目，DVB交联度为0.5％～15％，在N，N，二甲基甲酰胺中的溶胀性质可达到6.0～8.0g/g树脂，二氯甲烷中的溶胀性质可以达到5.0～8.0g/g树脂，首位氨基酸上载率达到1.98mmol/g树脂，使用该树脂合成的困难序列酰基载体蛋白(ACP)65-74收率为72％，纯度达到76.5％；合成的胸腺五肽(TP-5)收率为91％，纯度达到98.2％。

上述制备方法中，步骤a中所使用的低DVB交联聚苯乙烯树脂不限制来源和制备方法，交联度为0.5％～15％；树脂粒径范围为50～1000目；加入DCPB的物质的量为1～100mmolDCPB/g树脂，优选为2～50mmol DCPB/g树脂；使用的催化剂为氯化铁、氯化锌、氯化铝、氯化锑、磷酸、硼酸中的一种；催化体系的浓度为：1～50mmol/g树脂，优选为3～30mmol/g树脂；步骤(a)中所使用的有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、二氯乙烷中的一种；使用的有机溶剂用量为2～50mL/g树脂，优选为3～30mL/g树脂；反应温度为0～80℃，；反应时间为1～30h；反应终止溶液和反应后的洗涤溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、N，N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、丙醇、四氢呋喃、丙酮、稀盐酸中的几种。

上述制备方法中，使用的亚硫酰氯用量为1～30mmol/g树脂，优选为2～20mmol/g树脂；步骤(b)中所使用的有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、二氯乙烷中的一种；有机溶剂用量为2～50mL/g树脂，优选为3～30mL/g树脂；氯化反应温度为0～80℃；反应时间为0.5～20h；反应后的洗涤溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、N，N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、丙醇、四氢呋喃、丙酮、稀盐酸中的几种。

本发明公开的制备方法与现有技术相比，具有如下优点：

1.本发明提供了一种制备2-氯三苯甲基氯树脂的新方法，并得到了多肽合成效率优良的2-氯三苯甲基氯树脂。

2.本发明提供了一种简便制备2-氯三苯甲基氯树脂的方法，且制备过程无需使用有机金属试剂。

3.本发明克服了现有2-氯三苯甲基氯树脂制备方法的步骤繁琐及必须使用有机金属试剂的弊端，成功地在无需有机金属试剂的条件下以简便的操作方法制备得到了合成效率优良的2-氯三苯甲基氯树脂，并将其成功应用于多肽的固相合成中。使用该树脂合成的困难序列ACP65-74收率为72％，纯度达到76.5％；合成的TP-5收率为91％，纯度达到98.5％。

4.本发明方法操作简单、条件温和并且易于工业化放大生产。

具体实施方法

下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明并不仅仅限制于该实施例中。

实施例1

称取2-氯二苯甲酮10.825g(0.05mol)与五氯化磷14.075g(0.05mol)置于100mL反应瓶中，混和物在100～110℃下加热8h，反应完成后待混和物冷却至室温，冰浴条件下缓慢加入10mL丙酮及15mL水，充分振荡后回收有机层，用15mL水洗2次后用无水硫酸镁干燥8h，过滤滤液经减压浓缩得到黄色油状液体1-氯-2-二氯苯甲基苯(DCPB)。反相高效液相色谱分析产物纯度为80.75％；质谱分析产物分子量为270.0，600M核磁共振氢谱分析产物结构正确。

实施例2

称取1.00g DVB-PS(交联度3.0％，粒径400～800目)溶胀于20mL三氯甲烷中，加入氯化铝(2.037g，15.0mmol)/硝基苯(5mL)溶液，再缓慢加入DCPB(10.90g)/三氯甲烷(5mL)溶液，混和溶液在室温下搅拌反应10h。反应完毕后将混和物冷却到0℃，加入5mL甲醇、5mL水、5mL 1M盐酸溶液以终止反应。过滤后收集树脂，用20mL甲醇、20mL二氯甲烷(2次)、20mL四氢呋喃(2次)依次洗涤，真空干燥后得到黄色树脂，红外光谱分析产物结构正确，取样检测2-CTA树脂的溶胀性质为2.24g(DCM)/g(树脂)，3.68g(DMF)/g(树脂)。

称取1.60g 2-CTA树脂悬浮于15mL三氯甲烷中，缓慢加入亚硫酰氯0.74mL(10.0mmol)后室温下搅拌反应5h。过滤后收集树脂，用15mL丙酮(3次)洗涤，真空干燥得到黄色树脂，红外光谱分析产物结构正确，且与2-CTA树脂的分析结果相同，取样检测2-CTC树脂的溶胀性质为3.13g(DCM)/g(树脂)，3.98g(DMF)/g(树脂)。

称取干燥2-CTC树脂溶胀于10mL二氯甲烷中，按照1.5mmol(氨基酸)/g(树脂)加入Fmoc-Ala-OH保护氨基酸，8.5mmol(DIEA)/g(树脂)加入二异丙基乙胺(DIEA)，室温下搅拌反应2小时，通过加入DIEA/甲醇(1∶9)溶液封闭未反应位点。树脂过滤后用15mLDCM(2次)、15mL甲醇(2次)、15mL DCM(2次)、15mL DMF(2次)、依次洗涤并真空干燥，采用Fmoc滴定法(GreenJ et al.Tetrahedron，1993，49：4141-4146.)检测树脂的首位氨基酸载量为1.24mmol/g。

实施例3

称取2.00g DVB-PS(交联度1.0％，粒径200～400目)溶胀于20mL二氯甲烷中，加入氯化铝(3.394g，25.0mmol)/硝基苯(10mL)溶液，再缓慢加入DCPB(12.42g)/二氯甲烷(5mL)溶液，混和溶液在室温下搅拌反应6h。反应完毕后将混和物冷却到0℃，加入5mL丙酮、5mL乙醇、5mL1M盐酸溶液以终止反应。过滤后收集树脂，用20mL甲醇、20mL三氯甲烷(2次)、20mL四氢呋喃(2次)依次洗涤，真空干燥后得到黄色树脂，红外光谱分析产物结构正确。取样检测2-CTA树脂的溶胀性质为7.94g(DCM)/g(树脂)，5.09g(DMF)/g(树脂)。

称取3.130g 2-CTA树脂悬浮于30mLN，N-二甲基甲酰胺中，缓慢加入亚硫酰氯1.10mL(15.0mmol)后室温下搅拌反应3h。过滤后收集树脂，用15mL三氯甲烷(3次)洗涤，真空干燥得到黄色树脂，红外光谱分析产物结构正确，且与2-CTA树脂的分析结果相同，取样检测2-CTC树脂的溶胀性质为8.77g(DCM)/g(树脂)，8.57g(DMF)/g(树脂)。

称取干燥2-CTC树脂溶胀于10mL二氯甲烷中，按照1.5mmol(氨基酸)/g(树脂)加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH保护氨基酸，8.5mmol(DIEA)/g(树脂)加入二异丙基乙胺(DIEA)，室温下搅拌反应4小时，通过加人DIEA/甲醇(1∶9)溶液封闭未反应位点。树脂过滤后用15mLDCM(2次)、15mLDMF(2次)、15mL DCM(2次)、15mL甲醇(2次)依次洗涤并真空干燥，采用Fmoc滴定法(GreenJ et al.Tetrahedron，1993，49：4141-4146.)检测树脂的氨基酸载量为0.42mmol/g。

实施例4

称取5.00g DVB-PS(交联度1.5％，粒径600目以下)溶胀于50mL三氯甲烷中，加入氯化铝(4.073g，30.0mmol)/硝基苯(10mL)溶液，再缓慢加入DCPB(26.12g)/三氯甲烷(10mL)溶液，混和溶液在室温下搅拌反应7h。反应完毕后将混和物冷却到0℃，加入15mL四氢呋喃、15mL水、15mL 1M盐酸溶液以终止反应。过滤后收集树脂，用30mL甲醇、30mL1M盐酸溶液、30mL乙醇依次洗涤，真空干燥后得到黄色树脂，红外光谱分析产物结构正确，取样检测2-CTA树脂的溶胀性质为4.72g(DCM)/g(树脂)，4.98g(DMF)/g(树脂)。

称取7.86g 2-CTA树脂悬浮于50mL三氯甲烷中，缓慢加入亚硫酰氯3.70mL(50.0mmol)后室温下搅拌反应3h。过滤后收集树脂，用15mL丙酮(3次)洗涤，真空干燥得到黄色树脂，红外光谱分析产物结构正确，且与2-CTA树脂的分析结果相同，取样检测2-CTC树脂的溶胀性质为5.13g(DCM)/g(树脂)，6.68g(DMF)/g(树脂)。

称取干燥2-CTC树脂溶胀于10mL二氯甲烷中，按照1.5mmol(氨基酸)/g(树脂)加入Fmoc-Gly-OH保护氨基酸，8.5mmol(DIEA)/g(树脂)加入二异丙基乙胺(DIEA)，室温下搅拌反应8小时，通过加入DIEA/甲醇(1∶9)溶液封闭未反应位点。树脂过滤后用15mLDCM(2次)、15mL DMF(2次)、15mL DCM(2次)、15mL甲醇(2次)依次洗涤并真空干燥，采用Fmoc滴定法(Green J et al.Tetrahedron，1993，49：4141-4146.)检测树脂的氨基酸载量为0.72mmol/g。

实施例5

采用DIEA/HBTU/HOBt缩合体系和TFA/TIS/phenol/EDT切割体系，使用实施例3制备的2-CTC树脂和有机金属试剂制备的2-CTC树脂对胸腺五肽(Thymopentin，TP-5)进行固相合成；使用实施例4制备的2-CTC树脂及有机金属试剂制备的2-CTC树脂对困难序列酰基载体蛋白65-74(Acyl Carrier Protein fragment，ACP65-74)进行固相合成。多肽固相合成方法如下：称取C端Fmoc保护氨基酸-树脂复合物加入反应器中，用DCM溶胀后抽干。加入20％PIP/DMF(V∶V)进行脱保护反应0.5～1h，反应结束后用DCM(2次)、EtOH(1次)、DCM(1次)、DMF(1次)依次洗涤、抽干；加入溶于HOBt/DMF溶液的Fmoc保护氨基酸，预平衡30min后加入HBTU/DMF溶液和DIEA/DMF溶液，室温下进行连接反应，反应结束后用EtOH、DCM交替洗涤、抽干。重复脱保护反应和连接反应直至多肽N端氨基酸的连接完成，加入20％PIP/DMF(V∶V)进行脱保护反应0.5～1h，反应结束后用DCM(2次)、EtOH(1次)、MeOH(2次)依次洗涤、抽干后放入干燥塔干燥。称取干燥的肽树脂复合物，与切割试剂(TFA∶TIS∶phenol∶EDT＝87.5∶5∶5∶2.5)均冷却数分钟后，向树脂复合物中缓缓加入切割试剂，室温下反应2～3h。反应完成后收集反应溶液加入装有冷乙醚的离心管中，并将树脂用TFA洗一次，洗液一并加入乙醚中，于-20℃沉淀，8000rpm离心后倾去上清，得白色沉淀。以无水乙醚研磨沉淀，真空干燥得粗肽。

本例中，以实施例3制备得到的2-CTC-PS树脂为固相载体进行多肽固相有机合成得到的TP-5的收率为91％，反相高效液相色谱检测纯度为98.2％，以有机金属试剂制备的2-CTC-PS树脂为固相载体进行多肽固相有机合成得到的TP-5的收率为89％，反相高效液相色谱检测纯度为96.7％；以实施例4制备得到的2-CTC-PS树脂为固相载体合成得到的困难序列ACP 65-74的收率为72％，反相高效液相色谱检测纯度为76.5％，以有机金属试剂制备的2-CTC-PS树脂为固相载体进行多肽固相有机合成得到的困难序列ACP 65-74的收率为70％，反相高效液相色谱检测纯度为56.4％。

Claims

1.一种2-氯三苯甲基氯树脂的制备法，包括如下步骤：

(a)将1-氯-2-二氯苯甲基苯与二乙烯基苯交联度为0.5％～15％、粒径范围为50～1000目的聚苯乙烯树脂在有机溶剂环境中，0～80℃条件下经催化剂催化，反应1～30h后得到2-氯三苯甲基醇结构，反应终止后经过洗涤和干燥获得2-氯三苯甲基醇树脂；

(b)将步骤a中得到的2-氯三苯甲基醇树脂置于有机溶剂环境中，0～80(2条件下与亚硫酰氯进行氯化反应0.5～20h得到二乙烯苯-聚苯乙烯树脂上的2-氯三苯甲基氯结构，经过洗涤和干燥即得到所述的2-氯三苯甲基氯树脂。

2.如权利要求1所述的制备方法，所述步骤(a)中加入1-氯-2-二氯苯甲基苯的物质的量为1～100mmol/g树脂，优选为2～50mmol/g树脂。

3.如权利要求1所述的制备方法，所述步骤(a)中所使用的催化剂为氯化铁、氯化锌、氯化铝、氯化锑、磷酸、硼酸中的一种。

4.如权利要求1所述的制备方法，所述步骤(a)中催化体系的浓度为：1～50mmol/g树脂，优选为3～30mmol/g树脂。

5.如权利要求1所述的制备方法，所述步骤(a)中反应终止试剂选自N，N-二甲基甲酰胺、水、甲醇、乙醇、丙醇、四氢呋喃、丙酮、稀盐酸中的几种。

6.如权利要求1所述的制备方法，所述步骤(b)中所使用的亚硫酰氯用量为1～30mmol/g树脂，优选为2～20mmol/g树脂。

7.如权利要求1所述的制备方法，所述步骤(a)和(b)中所使用的有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、二氯乙烷中的一种。

8.如权利要求1所述的制备方法，所述步骤(a)和(b)中所使用的有机溶剂用量为2～50mL/g树脂，优选为3～30mL/g树脂。

9.如权利要求1所述的制备方法，所述步骤(a)和(b)中反应后的洗涤溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、N，N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、丙醇、四氢呋喃、丙酮、稀盐酸中的几种。

10.如权利要求1所述的制备方法，所制备得到的2-氯三苯甲基氯树脂，首位氨基酸上载量为0.30～1.98mmol/g树脂，多肽固相合成的收率为70％～99％，肽纯度为65％～99％。