CN110204611A - 一种固相片段法合成比伐卢定 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固相片段法合成比伐卢定，该方法以三苯甲基氯类型树脂作为起始树脂，采用固相合成1‑9全保护肽树脂，将全保护九肽从树脂上切割下来后在固相中接入10‑20肽树脂，经裂解得到比伐卢定粗品。该方法的亮点以及优势是使用了固相片段法合成替代逐步法合成比伐卢定减少脱保护次数，避免10Gly‑9Asn肽序结构在碱性条件下发生五元环重排副反应，有效降低杂质Asp9和β‑Asp9的含量。本发明工艺操作简单，粗品纯度高，制备后产品纯度达到99.8％，单杂小于0.1％，具备良好的工业化生产前景。
Description
发明领域
本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及比伐卢定的固相片段合成方法。
背景技术
比伐卢定于2000年和2004年先后经过美国食品药品监督管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMEA)批准上市，在临床上用于经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronaryintervention PCI)围术期的抗凝治疗。其有效抗凝成分为水蛭素衍生物片段，通过直接并特异性抑制凝血酶活性而发挥抗凝作用，无论凝血酶处于血循环中还是与血栓结合，本品均可与其催化位点和阴离子结合位点(又称底物识别位点)发生特异性结合，从而直接抑制凝血酶的活性。其作用与肝素不同，它不依赖于抗凝血酶、肝素辅因子等。凝血酶是凝血反应中起核心作用的丝氨酸蛋白酶：它水解纤维蛋白原生成纤维蛋白单体；激活凝血因子；促进纤维蛋白交联形成稳定血栓的共价结构。同时，凝血酶激活凝血因子；激活血小板，促进血小板聚集和颗粒释放。因凝血酶可水解本品多肽顺序3#Arg和4#Pro之间的肽键，使本品失活，所以本品对凝血酶的抑制作用是可逆而短暂的。
比伐卢定为人工合成的二十肽，20位氨基酸残基组成的线性肽，其中1位为D型Phe，其肽序结构为：H-D-Phe1-Pro2-Arg3-Pro4-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn9-Gly10-Asp11-Phe12-Glu13-Glu14-Ile15-Pro16-Glu17-Glu18-Tyr19-Leu20-OH
化学结构式如下：
现有专利情况
美国US5196404，该专利采用标准Boc化学固相多肽合成法，需要用剧毒的HF作为裂解试剂，裂解时需要特殊的反应装置及操作人员防护设备，不适合规模化生产。中国专利CN101094867、CN101033249和CN101555274采用标准Fmoc多肽固相合成法，避免了强酸切割的风险，但粗品副产物较多，纯品收率仅为14％左右(CN101033249)，不利于工业化生产。
中国专利CN101475631、CN103864895、CN102816208和CN105273062采用多肽片段液相拼接的方法来合成比伐卢定，将比伐卢定分成三个、四个或五个多肽片段，在液相中完成片段的拼接。该方法片段与片段间缩合效率不高，多肽片段原料及每步拼接产物都需要纯化，废液量大，生产成本较高。
比伐卢定肽序中10位Gly与9位Asn之间的酰胺键与侧链的氨基由于空间位阻的影响，在偶联以及裂解过程中，酸性以及碱性条件下中间体五元环发生重排反应，生成杂质Asp9和β-Asp9等杂质，由于这些杂质性质与比伐卢定类似，极性相近，从而大大增加了比伐卢定粗品纯化的难度，由于Asp9和β-Asp9等杂质均为降解杂质，需要在合成工艺中有效控制杂质的含量。副产物反应机理如下：
现有的比伐卢定合成方法存在如下共有技术难点为：(1)液相合成比伐卢定工艺采用剧毒试剂，生产过程危险性较高，不适合规模化生产；(2)现有固相合成法，通过逐一偶联方式或采用片段合成法得到比伐卢定，由于多个困难点(如Arg3、Gly5～Gly9、Asn9-Gly10)的存在导致粗肽纯度较低，容易产生于比伐卢定化学性质相近的杂质而造成液相纯化难度增加，产品总收率不高。
发明内容
本发明的目的是提供一种比伐卢定的固相片段法合成方法。本发明需要解决的技术问题是：选择一条合适的可工业化生产的合成路线，解决如下技术问题：(1)液相合成比伐卢定工艺采用剧毒试剂，生产过程危险性较高，不适合规模化生产；(2)现有固相合成法得到的粗肽纯度低，制备纯化难度较高，产品总收率不高。
本发明主要通过如下方式解决固相合成法得到比伐卢定粗肽纯度低，产品总收率不高的技术问题：(1)通过采用固相片段法合成，减少脱除Fmoc的碱性条件避免碱性条件下产生重排产物的杂质，有效降低水解杂质Asp9和β-Asp9的含量。(2)选用Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH替代片段二中的连续4个Fmoc-Gly-OH的逐个偶联，有效降低加Gly、加2Gly和缺失Gly、缺失2Gly杂质的含量。(3)片段二中Fmoc-Arg(Pbf)-OH的偶联选用活性更高的Hopfp/DIC体系作为活化试剂参与缩合反应，有效降低缺失Arg杂质的含量。
本发明的技术解决方案是：一种固相片段法合成比伐卢定的方法，包括以下步骤：
1)将Fmoc-Leu-OH在催化剂中与Wang Resin相连，得到Fmoc-Leu-Wang Resin；
2)采用固相合成法Fmoc/tBu策略依次连接比伐卢定肽序中第20位到第10位氨基酸,脱保护后得到11肽树脂H-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Resin，即片段一；
3)Fmoc-Asn(Trt)-OH与CTC树脂偶联得到Fmoc-Asn(Trt)-CTC Resin；
4)采用固相合成法Fmoc/tBu策略依次连接比伐卢定肽序中第9位至第1位氨基酸，得到Fmoc保护的9肽树脂Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-CTCResin；
5)采用TFEA/DCM体系裂解切割片段肽9肽树脂得到Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-OH，即片段二；
6)片段一与片段二通过固相法在HBTU/HOBt/DIEA/DMF体系中偶联得Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang Resin；
7)使用20％PIP/DMF脱除Fmoc得到比伐卢定肽树脂
H-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang Resin；
8)使用裂解试剂，室温搅拌2～3h，采用甲基醚沉降得到比伐卢定粗肽。
优选的，本发明所述比伐卢定的制备方法，包括以下步骤：
1)片段一肽树脂的合成
将Wang树脂加入固相反应器，加入DMF，将Fmoc-Leu-OH、DMAP和HOBt溶解于DMF中，在加入DIC，随后加入到固相反应器中，加入PIP/DMF脱Fmoc保护；
将Fmoc-Tyr(tBu)-OH和HOBt溶解于DMF中，加入DIC，加入固相反应器中，加入PIP/DMF脱Fmoc保护；
重复以上步骤，依次连接Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，得到片段一肽树脂
H-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Resin。
2)片段二肽树脂的合成
将CTC-Cl树脂加入固相合成反应釜，加入DCM溶胀，用DMF洗涤，随后加入Fmoc-Asn(Trt)-OH和DIEA，室温搅拌，过滤，采用DMF洗涤，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，DMF洗涤，
将Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH和HOBt溶于DMSO中，加入DIC，预活化，随后加入固相反应器中，搅拌反应，抽干，DMF洗涤，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，DMF洗涤，
重复以上步骤，依次连接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH，经洗涤干燥后得到片段二肽树脂Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-CTC Resin；
3)片段二的合成
将Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-CTC Resin加入圆底烧瓶中，加入TFEA/DCM搅拌反应，过滤收集滤液，将滤液浓缩至油状后，加入甲基叔丁基醚析出粗品固体，离心，干燥得到片段二Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-OH固体；
4)比伐卢定粗品的合成。
将片段二Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-OH、PyBop、HOBt溶解于DMF中，加入DIEA，随后加入装有片段一肽树脂的固相反应器中，在室温搅拌，抽干，洗涤，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，洗涤，干燥后可得到比伐卢定肽树脂，
将比伐卢定肽树脂加入到裂解试剂(TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5)中，室温搅拌反应，过滤，将滤液中加入到甲基醚中沉降析出粗品固体，离心，洗涤干燥后得到比伐卢定粗肽。
其中，1)片段一肽树脂的合成：Wang树脂的替代度为0.5～0.8mmol/g；其保护的氨基酸分别为Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH。
其中，2)片段二肽树脂的合成：CTC-Cl树脂的取代值在0.8-1.2之间，其保护的氨基酸为：Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH。
其中，2)片段二肽树脂的合成：固相合成中使用的偶联剂为DIC/HOBt、DIC/Cl-HOBt、HBTU/HOBt/DIEA、HBTU/Cl-HOBt/DIEA、PyBop/HOBt/DIEA、PyBop/Cl-HOBt/DIEA；反应溶剂为DMF、NMP、DMSO；反应温度为室温，反应时间为搅拌2-4h。
其中，脱除氨基保护基Fmoc的试剂为20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺混合溶液。
其中，2)片段二肽树脂的合成：片段二中的4个甘氨酸选用氨基酸Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH替代Fmoc-Gly-OH；偶联缩合剂DIC/HOBt、DIC/Cl-HOBt、HBTU/HOBt/DIEA、HBTU/Cl-HOBt/DIEA、PyBop/HOBt/DIEA、PyBop/Cl-HOBt/DIEA，优选HBTU/HOBt/DIEA，反应溶剂为DMF、NMP、DMSO或混合溶剂，优选DMSO，室温搅拌2-3h。
其中，片段二中Fmoc-Arg(Pbf)-OH的偶联缩合剂为DIC/HOBt、DIEA/HOBt/Pybop、DIC/HoPfp，优选DIC/HoPfp，反应溶剂为DMF、NMP、DMF/DCM，优选DMF，室温搅拌3-4h。
其中，片段二中20-30％(V/V)TFEA/DCM或1～10％(V/V)TFA/DCM，室温搅拌1～2h，采用甲基叔丁基醚沉降离心后得到片段二。
其中，所述的裂解试剂为：TFA：TIS：H2O＝95:2.5:2.5，室温搅拌2～3h，采用甲基叔丁基醚沉淀比伐卢定粗肽。
进一步优选的，根据实施例之一，
1)片段一肽树脂的合成
称取125.0g Wang树脂加入固相反应器，加入700ml DMF溶胀30min，用DMF洗涤两遍，称量106.0g Fmoc-Leu-OH、3.67g DMAP和54.1g HOBt溶解于500ml DMF中，于0-10℃加入62.0ml DIC，预活化5-10min，加入固相反应器中，搅拌反应5～7h，抽干，DMF洗涤3次，加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次，DMF洗涤6次。
称量137.8g Fmoc-Tyr(tBu)-OH和54.1g HOBt溶解于400ml DMF中，于0-10℃加入62.0ml DIC，预活化5-10min，加入固相反应器中，鼓氮气反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次，DMF洗涤6次。
重复以上步骤，依次连接Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH，加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次，DMF洗涤6次，得到片段一肽树脂
H-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Resin。
2)片段二肽树脂的合成
称量200.0g CTC-Cl树脂加入固相合成反应釜，加入1400ml DCM溶胀30min，用DMF洗涤两遍。加入Fmoc-Asn(Trt)-OH119.34g和DIEA 1020ml，室温搅拌3小时。过滤，采用DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次，DMF洗涤6次。
称量281.2g Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH和108.2g HOBt溶于800ml DMSO中，于0-10℃加入124.0ml DIC，预活化5-10min，加入固相反应器中，搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次，DMF洗涤6次。
重复以上步骤，依次连接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH，经洗涤干燥后得到片段二肽树脂
Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-CTC Resin。
3)片段二的合成
将490g Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-CTC Resin加入圆底烧瓶中，并加入3L20％TFEA/DCM搅拌反应1-2h，过滤收集滤液，将滤液浓缩至油状后，加入甲基叔丁基醚析出粗品固体，离心，干燥得到片段二Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-OH固体。
4)比伐卢定粗品的合成
称量229g片段二Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-OH、104.1g PyBop、27.1g HOBt溶解于500ml DMF中，于0-10℃加入34ml DIEA，预活化5-10min，加入装有片段一肽树脂的固相反应器中，反应在室温搅拌3小时后，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次，DMF洗涤6次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤2次，干燥后可得到比伐卢定肽树脂，
将上述肽树脂加入4L 0-10℃的裂解试剂(TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5)中，室温搅拌反应3h，过滤裂解液，将滤液中加入到30L 0-10℃的甲基醚中沉降析出粗品固体，离心，洗涤干燥后得到比伐卢定粗品。
本发明的制备方法，还可以包括进一步纯化的步骤：
5)比伐卢定的制备
粗品的溶解：将比伐卢定粗品190g，加10L纯化水搅拌溶解，采用氨水调节溶液的pH至4.0～5.0，用0.45um滤膜过滤，即可得到比伐卢定粗品溶液，待纯化。
比伐卢定粗品的纯化：
经转盐后得到比伐卢定三氟乙酸盐纯品溶液，浓缩，冷冻干燥后得到比伐卢定成品。
以下通过实验数据说明本发明的有益成果
1、逐步法与固相片段法的筛选
通过逐一偶联方式合成得到比伐卢定肽序，选用TFA：TIS：H2O＝95:2.5:2.5体系裂解得到比伐卢定粗品，在粗品中检测Asp9和β-Asp9杂质的含量，同时通过上述固相片段法合成比伐卢定肽树脂，裂解得到比伐卢定粗品后，在粗品中对比Asp9和β-Asp9杂质的含量。
使用不同合成方法得到比伐卢定粗品纯度以及Asp9和β-Asp9杂质的含量结果如下：
| 合成方法 | 粗肽纯度/RT＝40.78min | Asp<sup>9</sup>的含量/RRT＝1.10 | β-Asp<sup>9</sup>的含量/RRT＝1.13 |
| 逐步法 | 85.70％ | 2.15％ | 1.24％ |
| 固相片段法 | 90.22％ | 0.56％ | 0.34％ |
2、Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH偶联与4个Fmoc-Gly-OH逐个偶联对比
片段二肽序中4个连续的氨基酸均为Fmoc-Gly-OH，分别选用Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH替代法、Fmoc-Gly-Gly-OH替代法以及单个Fmoc-Gly-OH分别偶联缩合得到片段二，同时通过上述固相片段法合成比伐卢定肽树脂，选用TFA：TIS：H2O＝95:2.5:2.5体系裂解得到比伐卢定粗品，在粗品中检测对比Plus 2Gly，Plus Gly，Des 2Gly，Des Gly杂质的含量。使用上述条件制备得到的比伐卢定粗品以及相关杂质的纯度如下：
3、Fmoc-Arg(Pbf)-OH偶联活化试剂筛选
比伐卢定肽序空间结构的原因，Fmoc-Arg(Pbf)-OH偶联存在反应不完全的情况，导致大大增加粗品中缺失Arg的含量，粗品纯度下降明显。通过筛选Fmoc-Arg(Pbf)-OH偶联活化试剂，优化偶联反应效率，提高粗品纯度，选用DIC/HOBt、DIC/HOBt/PyBop、DIC/HoPfp这三种活化试剂分别偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH得到片段二，同时通过HPLC中控检测方法测定片段二粗品纯度，同时检测对比Des Arg杂质的含量。使用上述条件制备得到的片段二粗品以及相关杂质的纯度如下：
按照本发明，以Wang或CTC Resin为起始载体，以Fmoc保护的氨基酸为单体，依次连接氨基酸的方法包括以下步骤：
片段一的合成
片段二的合成
比伐卢定的合成
对说明书中符号“/”作解释：
该符号代表和的意思，以TFEA/DCM为例，代表TFFA和DCM，该符号属于多肽合成工艺中常用的表述方式。
附图说明
图1：比伐卢定成品HPLC谱图
具体实施方式
上述描述和实施例中所采用的缩写及其代表如下：
| Fmoc | 9-芴甲氧羰基 |
| HBTU | O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯 |
| DIC | 二异丙基碳二亚胺 |
| HOBt | 1-羟基苯并三唑 |
| HOAt | 1-羟基-7-偶氮苯并三唑 |
| DIEA | 二异丙基乙胺 |
| Trt | 三苯甲基 |
| OtBu | 叔丁氧基 |
| DMSO | 二甲基亚砜 |
| DMF | N,N-二甲基甲酰胺 |
| DCM | 二氯甲烷 |
| PIP | 哌啶 |
| TFA | 三氟乙酸 |
| TIS | 三异丙基硅烷 |
| CTC Resin | 三苯甲基二氯树脂 |
| NMP | N-甲基吡咯烷酮 |
| TFEA | 三氟乙醇 |
通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为限制。
实施例1：逐一偶联法合成比伐卢定
称取16.67g Wang树脂(10mmol，替代度0.6mmol/g)加入固相反应器，加入70ml DMF溶胀30min，用DMF洗涤两遍。称量10.60g Fmoc-Leu-OH(3.0eq.)、0.37g DMAP(0.3eq)和5.40gHOBt(4.0eq.)溶解于50ml DMF中，于0-10℃加入6.2ml DIC(4.0eq.)，预活化5-10min，加入固相反应器中，鼓氮气反应5～7h。抽干，DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次。
称量13.78g Fmoc-Tyr(tBu)-OH(3.0eq)和5.40g HOBt(4.0eq)溶解于40ml DMF中，于0-10℃加入6.20ml DIC(4.0eq)，预活化5-10min，加入固相反应器中，搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次。
重复以上步骤，依次连接Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH，加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤2次，干燥后可得到比伐卢定肽树脂42.6g。
将上述肽树脂加入440ml 0-10℃的裂解试剂(TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5)中，室温搅拌反应3h，过滤裂解液，将滤液中加入到4L 0-10℃的甲基醚中沉降析出粗品固体，离心，洗涤干燥后得到18.32g比伐卢定粗肽，HPLC纯度(面积归一化法)为85.70％，合成收率为56.5％。
实施例2：片段一肽树脂的合成
称取125.0g Wang树脂(100mmol，替代度0.8mmol/g)加入固相反应器，加入700ml DMF溶胀30min，用DMF洗涤两遍。称量106.0g Fmoc-Leu-OH(3.0eq.)、3.67g DMAP(0.3eq)和54.1g HOBt(4.0eq.)溶解于500ml DMF中，于0-10℃加入62.0ml DIC(4.0eq.)，预活化5-10min，加入固相反应器中，搅拌反应5～7h。抽干，DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次。
称量137.8g Fmoc-Tyr(tBu)-OH(3.0eq)和54.1g HOBt(4.0eq)溶解于400ml DMF中，于0-10℃加入62.0ml DIC(4.0eq)，预活化5-10min，加入固相反应器中，鼓氮气反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次。
重复以上步骤，依次连接Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH，加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，得到片段一肽树脂H-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Resin。
实施例3：片段二肽树脂的合成
称量200.0g CTC-Cl树脂(200mmol，替代度1.0mmol/g)加入固相合成反应釜，加入1400ml DCM溶胀30min，用DMF洗涤两遍。加入Fmoc-Asn(Trt)-OH119.34g(1.0eq)和DIEA1020ml(3.0eq)，室温搅拌3小时。过滤，采用DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次。
称量281.2g Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH(3.0eq)和108.2g HOBt(4.0eq)溶于800mlDMSO中，于0-10℃加入124.0ml DIC(4.0eq)，预活化5-10min，加入固相反应器中，搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次。
重复以上步骤，依次连接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH，经洗涤干燥后得到499.2g片段二肽树脂
Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-CTC Resin。
实施例4：片段二肽树脂的合成
称量200.0g CTC-Cl树脂(200mmol，替代度1.0mmol/g)加入固相合成反应釜，加入1400ml DCM溶胀30min，用DMF洗涤两遍。加入Fmoc-Asn(Trt)-OH119.34g(1.0eq)和DIEA1020ml(3.0eq)，室温搅拌3小时。过滤，采用DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次。
称量212.8g Fmoc-Gly-Gly-OH(3.0eq)和108.2g HOBt(4.0eq)溶于400ml DMF中，于0-10℃加入124.0ml DIC(4.0eq)，预活化5-10min，加入固相反应器中，搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次。
重复以上步骤，依次连接Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH，经洗涤干燥后得到493.2g片段二肽树脂
Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-CTC Resin。
实施例5：片段二肽树脂的合成
称量200.0g CTC-Cl树脂(200mmol，替代度1.0mmol/g)加入固相合成反应釜，加入1400ml DCM溶胀30min，用DMF洗涤两遍。加入Fmoc-Asn(Trt)-OH119.34g(1.0eq)和DIEA1020ml(3.0eq)，室温搅拌3小时。过滤，采用DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次。
称量178.4g Fmoc-Gly-OH(3.0eq)和108.2g HOBt(4.0eq)溶于800ml DMF中，于0-10℃加入124.0ml DIC(4.0eq)，预活化5-10min，加入固相反应器中，搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次。
重复以上步骤，依次连接Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH，经洗涤干燥后得到480.6g片段二肽树脂Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-CTC Resin。
实施例6：片段二肽树脂的合成
称量200.0g CTC-Cl树脂(200mmol，替代度1.0mmol/g)加入固相合成反应釜，加入1400ml DCM溶胀30min，用DMF洗涤两遍。加入Fmoc-Asn(Trt)-OH119.34g(1.0eq)和DIEA1020ml(3.0eq)，室温搅拌3小时。过滤，采用DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次。
称量281.2g Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH(3.0eq)和108.2g HOBt(4.0eq)溶于800mlDMSO中，于0-10℃加入124.0ml DIC(4.0eq)，预活化5-10min，加入固相反应器中，搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次。
重复以上步骤，依次连接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH，经洗涤干燥后得到497.2g片段二肽树脂
Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-CTC Resin。
其中Fmoc-Arg(Pbf)-OH的偶联反应条件为：称量389.2g Fmoc-Arg(Pbf)-OH和147.4gHOPfp(4.0eq)溶于800ml DMF中，于0-10℃加入124.0ml DIC(4.0eq)，预活化5-10min，加入固相反应器中，搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次。
实施例7：片段二Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-OH的合成
将490g Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-CTC Resin加入圆底烧瓶中，并加入3L20％TFEA/DCM搅拌反应1-2h，过滤收集滤液，将滤液浓缩至油状后，加入甲基叔丁基醚析出粗品固体，离心，干燥得到305.2g片段二Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-OH固体。
实施例8：片段二Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-OH的合成
将490g Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-CTC Resin加入圆底烧瓶中，并加入1.5L1％TFA/DCM搅拌反应0.5～1h，过滤收集滤液，采用DIEA调节滤液的pH＝5.0～7.0,，将滤液浓缩至油状后，加入甲基叔丁基醚析出粗品固体，离心，洗涤，干燥得到293.6g片段二Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-OH固体。
实施例9：比伐卢定粗品的合成
称量229g片段二Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-OH(1.5eq)、104.1g PyBop、27.1g HOBt(2.0eq)溶解于500ml DMF中，于0-10℃加入34mlDIEA，预活化5-10min，加入装有实施例2中装有片段一肽树脂的固相反应器中，反应在室温搅拌3小时后，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤2次，干燥后可得到比伐卢定肽树脂446.5g。
将上述肽树脂加入4L 0-10℃的裂解试剂(TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5)中，室温搅拌反应3h，过滤裂解液，将滤液中加入到30L 0-10℃的甲基醚中沉降析出粗品固体，离心，洗涤干燥后得到195.5g比伐卢定粗肽，HPLC纯度(面积归一化法)为90.22％，合成收率为72.4％。
实施例10：比伐卢定的制备
粗品的溶解：实施例9中所得的比伐卢定粗品190g，加10L纯化水搅拌溶解，采用氨水调节溶液的pH至4.0～5.0，用0.45um滤膜过滤，即可得到比伐卢定粗品溶液，待纯化。
比伐卢定粗品的纯化：
经转盐后得到比伐卢定三氟乙酸盐纯品溶液，浓缩至950ml，冷冻干燥后得到120.3g比伐卢定成品，HPLC纯度为99.84％，单杂低于0.10％，总收率为49.7％。
Claims (10)
1.一种比伐卢定的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将Fmoc-Leu-OH在催化剂中与Wang Resin相连，得到Fmoc-Leu-Wang Resin；
2)采用固相合成法Fmoc/tBu策略依次连接比伐卢定肽序中第20位到第10位氨基酸,脱保护后得到11肽树脂H-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Resin，即片段一；
3)Fmoc-Asn(Trt)-OH与CTC树脂偶联得到Fmoc-Asn(Trt)-CTC Resin；
4)采用固相合成法Fmoc/tBu策略依次连接比伐卢定肽序中第9位至第1位氨基酸，得到Fmoc保护的9肽树脂Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-CTCResin；
5)采用TFEA/DCM体系裂解切割片段肽9肽树脂得到Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-OH，即片段二；
6)片段一与片段二通过固相法在HBTU/HOBt/DIEA/DMF体系中偶联得Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang Resin；
7)使用20％PIP/DMF脱除Fmoc得到比伐卢定肽树脂
H-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang Resin；
8)使用裂解试剂，室温搅拌2～3h，采用甲基醚沉降得到比伐卢定粗肽。
2.一种比伐卢定的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)片段一肽树脂的合成
将Wang树脂加入固相反应器，加入DMF，将Fmoc-Leu-OH、DMAP和HOBt溶解于DMF中，在加入DIC，随后加入到固相反应器中，加入PIP/DMF脱Fmoc保护；
将Fmoc-Tyr(tBu)-OH和HOBt溶解于DMF中，加入DIC，加入固相反应器中，加入PIP/DMF脱Fmoc保护；
重复以上步骤，依次连接Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，得到片段一肽树脂H-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Resin。
2)片段二肽树脂的合成
将CTC-Cl树脂加入固相合成反应釜，加入DCM溶胀，用DMF洗涤，随后加入Fmoc-Asn(Trt)-OH和DIEA，室温搅拌，过滤，采用DMF洗涤，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，DMF洗涤，
将Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH和HOBt溶于DMSO中，加入DIC，预活化，随后加入固相反应器中，搅拌反应，抽干，DMF洗涤，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，DMF洗涤，
重复以上步骤，依次连接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH，经洗涤干燥后得到片段二肽树脂Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-CTC Resin；
3)片段二的合成
将Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-CTC Resin加入圆底烧瓶中，加入TFEA/DCM搅拌反应，过滤收集滤液，将滤液浓缩至油状后，加入甲基叔丁基醚析出粗品固体，离心，干燥得到片段二Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-OH固体；
4)比伐卢定粗品的合成。
将片段二Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-OH、PyBop、HOBt溶解于DMF中，加入DIEA，随后加入装有片段一肽树脂的固相反应器中，在室温搅拌，抽干，洗涤，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，洗涤，干燥后可得到比伐卢定肽树脂，
将比伐卢定肽树脂加入到裂解试剂(TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5)中，室温搅拌反应，过滤，将滤液中加入到甲基醚中沉降析出粗品固体，离心，洗涤干燥后得到比伐卢定粗肽。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：1)片段一肽树脂的合成：Wang树脂的替代度为0.5～0.8mmol/g；其保护的氨基酸分别为Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：2)片段二肽树脂的合成：CTC-Cl树脂的取代值在0.8-1.2之间，其保护的氨基酸为：Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：2)片段二肽树脂的合成：固相合成中使用的偶联剂为DIC/HOBt、DIC/Cl-HOBt、HBTU/HOBt/DIEA、HBTU/Cl-HOBt/DIEA、PyBop/HOBt/DIEA、PyBop/Cl-HOBt/DIEA；反应溶剂为DMF、NMP、DMSO；反应温度为室温，反应时间为搅拌2-4h。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：脱除氨基保护基Fmoc的试剂为20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺混合溶液。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：2)片段二肽树脂的合成：片段二中的4个甘氨酸选用氨基酸Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH替代Fmoc-Gly-OH；偶联缩合剂DIC/HOBt、DIC/Cl-HOBt、HBTU/HOBt/DIEA、HBTU/Cl-HOBt/DIEA、PyBop/HOBt/DIEA、PyBop/Cl-HOBt/DIEA，优选HBTU/HOBt/DIEA，反应溶剂为DMF、NMP、DMSO或混合溶剂，优选DMSO，室温搅拌2-3h。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：片段二中Fmoc-Arg(Pbf)-OH的偶联缩合剂为DIC/HOBt、DIEA/HOBt/Pybop、DIC/HoPfp，优选DIC/HoPfp，反应溶剂为DMF、NMP、DMF/DCM，优选DMF，室温搅拌3-4h。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：片段二中20-30％(V/V)TFEA/DCM或1～10％(V/V)TFA/DCM，室温搅拌1～2h，采用甲基叔丁基醚沉降离心后得到片段二。
10.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的裂解试剂为：TFA：TIS：H2O＝95:2.5:2.5，室温搅拌2～3h，采用甲基叔丁基醚沉淀比伐卢定粗肽。
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| 虞娉等: "比伐卢定合成策略的选择及合成条件的优化" * |
| 虞娉等: "比伐卢定合成策略的选择及合成条件的优化", 《浙江中西医结合杂志》 * |
| 衣春等: "固相合成比伐卢定的新方法", 《中国社区医师》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112062835A (zh) * | 2020-08-24 | 2020-12-11 | 扬子江药业集团四川海蓉药业有限公司 | 一种比伐芦定的制备方法 |
| CN113929749A (zh) * | 2021-11-18 | 2022-01-14 | 陕西未来多肽生物科技有限公司 | 一种十六肽化合物及其制备方法 |
| CN113845587A (zh) * | 2021-12-01 | 2021-12-28 | 浙江湃肽生物有限公司南京分公司 | 一种比伐卢定的合成方法 |
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| CN110204611B (zh) | 2023-11-07 |
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