CN112062835A - 一种比伐芦定的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种比伐芦定的制备方法，属于多肽药物制备方法技术领域。该方法以2‑CTC树脂为载体，采用固相法合成三肽片段Boc‑D‑Phe‑Pro‑Arg(Pbf)‑OH和六肽片段Fmoc‑Pro‑Gly‑Gly‑Gly‑Gly‑Asn(Dod)‑OH；再以Wang树脂或2‑CTC树脂为载体，通过逐步法偶联Fmoc保护氨基酸，获得中间体(10‑20)‑肽树脂，脱除Fmoc保护基后，依次逐个偶联以上的六肽片段和三肽片段，经裂解获得比伐芦定粗品，最后经纯化获得比伐芦定精品。此方法极大地提高了产品收率和纯度，精品纯度达99.89％，单杂均控制在0.1％以下，也降低了成本，利于大规模、产业化生产。

Description

一种比伐芦定的制备方法
技术领域
本发明属于多肽药物制备方法技术领域，具体涉及一种比伐芦定的制备方法。
背景技术
比伐芦定，英文通用名称为Bivalirudin，商品名为Angiomax，氨基酸序列如下：
H-D-Phe1-Pro2-Arg3-Pro4-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn9-Gly10-Asp11-Phe12-Glu13-Glu14-Ile15-Pro16-Glu17-Glu18-Tyr19-Leu20-OH(SEQ ID NO.1)
分子式：C98H138N24O33，分子量：2180.32，CAS：128270-60-0。
比伐芦定是一种人工合成的抗凝血药物，为凝血酶(thrombin)直接的、特异的、可逆性抑制剂，是水蛭素的20肽类似物(线性肽)。比伐芦定能与凝血酶催化位点和阴离子外结合位点发生特异性结合，直接抑制凝血酶的活性，从而抑制凝血酶所催化和诱导的反应；比伐芦定与凝血酶的结合过程是可逆的，凝血酶通过缓慢的酶解比伐芦定Arg3-Pro4之间的肽键可使凝血酶恢复原来的生物活性。1990年Maraganore,Feton和Kline在美国专利US5196404中，据此设计了凝血酶二价抑制剂比伐芦定。C-端12肽为水蛭素片段，能够结合阴离子结合位点；N-端四肽D-Phe1-Pro2-Arg3-Pro4(SEQ ID NO.2)与活性位点结合；中间用四个连续的甘氨酸Gly5-Gly6-Gly7-Gly8(SEQ ID NO.3)连接。因其Arg3-Pro4会被凝血酶缓慢水解而游离出活性位点，故为可逆性二价凝血酶直接抑制剂。比伐芦定于2000年获准在美国上市，其注射剂为白色疏松状物或无定形固体比伐芦定主要作为抗凝剂，用于成人择期经皮冠状动脉介入治疗(PCI)。
基于比伐芦定的结构特征，在其制备过程中涉及的主要技术难点及其现有的解决方案情况如下：
(1)多苷和缺苷杂质(Bivalirudin±1Gly和Bivalirudin±2Gly)：一直以来这类杂质都是比伐芦定的最大技术难点，因其结构中含有Gly-Gly-Gly-Gly片段，由于Gly自身特性，极易产生Bivalirudin±1Gly和Bivalirudin±2Gly的杂质，这类杂质与比伐芦定的极性很接近，分离度小，在后续纯化中很难去除。为此，杭州诺泰制药技术有限公司专利CN102260323A通过液相合成Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH四肽片段，然后将其接到肽树脂上，但由于该四肽片段在各类溶剂中的溶解性较差，常规的柱层析、调酸碱和重结晶等纯化手段都难以获得较好纯度的四肽片段，多苷和缺苷杂质会一直保留到比伐芦定产品中。济南康和医药科技有限公司专利CN109134615A使用液相法合成三肽片段Fmoc-Pro-Gly-Gly-OH和二肽片段Fmoc-Gly-Gly-OH，再逐个接入比伐芦定肽序列中，虽然降低了Bivalirudin±1Gly和Bivalirudin±2Gly杂质，但是三肽片段和二肽片段在接入肽链时溶解度差，反应活性低，导致该三肽和二肽缺失肽杂质增多。济南康和医药科技有限公司专利CN104031127A(CN104031127B)和兰州大学专利CN102532274A(CN102532274B)都报道了通过液相合成Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH(SEQ ID NO.4)六肽片段，降低了Bivalirudin±1Gly和Bivalirudin±2Gly杂质，但是该六肽无法通过重结晶或萃取等方式提纯，而且末端的Arg在接入肽链脱Fmoc保护基时，容易消旋，产生消旋杂质D-Arg-Bivalirudin。齐鲁制药有限公司专利CN103242431A采取液相中合成Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH(SEQ IDNO.5)五肽片段，有效避免Bivalirudin±1Gly和Bivalirudin±2Gly的杂质产生。虽然该五肽片段的溶解性比Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH有所改善，但是五肽片段的提纯难度较大，无法通过萃取而只能从水中获得，可操作性差，不易工业生产；同时，需用DMF重结晶，但其中的多苷和缺苷杂质无法除去，纯度较低，质量可控性较差。哈尔滨吉象隆生物技术有限公司专利201510005428.X中使用Fmoc-Gly-Gly-OH为原料直接偶联到比伐芦定序列中，但是研究发现原料Fmoc-Gly-Gly-OH中存在游离的H-Gly-OH及H-Gly-Gly-OH氨基酸，将增加产生Bivalirudin±1Gly、Bivalirudin±2Gly杂质产生的风险。成都圣诺生物制药有限公司专利CN102286076A和CN102532274A使用了Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R)-Gly-Asp(OtBu)-OH(SEQ ID NO.6)作为片段，减少了Bivalirudin±1Gly和Bivalirudin±2Gly杂质，但是，该片段合成工艺复杂，收率低，片段在接入肽链时溶解度差，反应活性低，质量可控性差，不易工业生产。
(2)Asn9引起的降解杂质：Fmoc-Asn(Trt)9-Gly10-肽树脂在脱Fmoc保护基接后续氨基酸时，Asn易与Gly在碱性条件下发生五元重排副反应，并加速Asn降解为Asp和β-Asp。专利通过先合成九肽片段Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-OH(SEQ ID NO.7)，再接到主链(10-20)-肽树脂上，这样减少了Asn接入肽链后重复经历脱Fmoc保护基的次数，从而达到降低Asn降解杂质。但Fmoc-Asn(Trt)-OH本身由于Trt保护基的空间结构问题，容易发生β折叠而促进Asn降解和消旋，不仅难以控制Asn降解，还能导致消旋杂质D-Asn9-Bivalirudin的增多；此外，该九肽片段的合成中仍无法避免(1)中的多苷和缺苷杂质，同时该片段的溶解性差，反应活性低，反应时该片段的投料量需大大过量，成本较高，不利于工业化生产。
综上所述，需要一种适合工业化生产、质量可控的比伐芦定制备方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种新的比伐芦定的制备方法，它包括以下步骤：
(1)使用2-CTC树脂，采用多肽固相合成法逐一偶联Fmoc保护氨基酸，分别合成三肽片段Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-OH和六肽片段Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Dod)-OH；
(2)使用Wang树脂或2-CTC树脂，采用多肽固相合成法，按比伐芦定序列从C端向N端偶联，逐一偶联Fmoc保护氨基酸，得到中间体(10-20)-肽树脂，所述中间体(10-20)-肽树脂的结构为：
Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-树脂；
(3)采用多肽固相合成法，在中间体(10-20)-肽树脂上依次逐个偶联六肽片段Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Dod)-OH和三肽片段Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-OH，得到侧链全保护的比伐芦定肽树脂；
(4)侧链全保护的比伐芦定肽树脂经TFA体系裂解后，得到比伐芦定粗品；
(5)比伐芦定粗品经粗分、反相HPLC纯化，再经等电点沉淀，得到比伐芦定精品。
进一步地，
所述2-CTC树脂或Wang树脂采用多肽固相合成法逐一偶联Fmoc保护氨基酸时，先偶联一个Fmoc保护氨基酸；
优选地，
所述2-CTC树脂偶联Fmoc保护氨基酸的方法如下：在2-CTC树脂中加入二氯甲烷、Fmoc保护氨基酸和DIEA反应，再加入甲醇继续反应，洗涤，干燥，即得；
更优选地，所述2-CTC树脂、Fmoc保护氨基酸和DIEA的摩尔比为(1～5)：(1～5)：(1～5)；
和/或，所述2-CTC树脂、二氯甲烷、甲醇的质量体积比为1g：(1～10)mL：(1～10)mL；
和/或，所述加入缩合剂DIEA的反应温度为20～25℃，反应时间为1～3h；
和/或，所述加入甲醇后的反应温度为20～25℃，反应时间为30～60min；
和/或，所述2-CTC树脂为2-CTC Resin树脂；
进一步优选地，所述2-CTC树脂、Fmoc保护氨基酸和DIEA的摩尔比为1：(0.8～1.5)：(2～3)；
和/或，所述2-CTC树脂、二氯甲烷、甲醇的质量体积比为1g：10mL：1mL；
和/或，所述2-CTC Resin树脂的替代度为0.1～0.9mmol/g；
和/或，所述洗涤为用二氯甲烷洗涤；
更进一步优选地，
步骤(1)中，合成三肽片段Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-OH时，2-CTC树脂偶联的Fmoc保护氨基酸为Fmoc-Arg(Pbf)-OH；合成六肽片段Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Dod)-OH时，2-CTC树脂偶联的Fmoc保护氨基酸为Fmoc-Asn(Dod)-OH；
步骤(2)中，2-CTC树脂偶联的Fmoc保护氨基酸为Fmoc-Leu-OH；
更进一步优选地，
所述2-CTC树脂偶联Fmoc-Leu-OH得到的Fmoc-Leu-CTC替代度为0.35～0.75mmol/g。
进一步地，
所述Wang树脂偶联Fmoc保护氨基酸的方法如下：在Wang树脂中加入二氯甲烷；将Fmoc保护氨基酸、HOBT、DMF、DIEA和DMAP混合后倒入Wang树脂中反应，加入醋酸酐继续反应，洗涤，干燥，即得；
优选地，所述Wang树脂和二氯甲烷的质量体积比为1g：(1～10)mL；
和/或，所述Wang树脂、Fmoc保护氨基酸、HOBT、DIEA和DMAP的摩尔比为(1～5)：(1～5)：(1～5)：(1～5)：(0.1～1)；
和/或，所述Wang树脂、DMF和醋酸酐的质量体积比为1g：(1～10)mL：(0.1～1)mL；
和/或，所述倒入Wang树脂中反应的反应温度为20～25℃，反应时间为1～5h；
和/或，所述加入醋酸酐后反应温度为20～25℃，反应时间为1～5h；
更优选地，所述Wang树脂和二氯甲烷的质量体积比为1g：10mL；
和/或，所述Wang树脂、Fmoc保护氨基酸、HOBT、DIEA和DMAP的摩尔比为1：2：2：2：(0.25～0.3)；
和/或，所述Wang树脂、DMF和醋酸酐的质量体积比为1g：10mL：0.1mL；
进一步优选地，所述Wang树脂的替代度为0.1～0.7mmol/g；
和/或，所述洗涤为用DMF洗涤；
更进一步优选地，所述Wang树脂偶联的Fmoc保护氨基酸为Fmoc-Leu-OH；
更进一步优选地，
所述Wang树脂偶联Fmoc-Leu-OH得到的Fmoc-Leu-Wang替代度为0.25～0.65mmol/g。
进一步地，
步骤(1)中，所述合成三肽片段Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-OH时，2-CTC树脂先采用多肽固相合成法偶联Fmoc-Pro-OH，再采用多肽固相合成法偶联Boc-D-Phe-OH，最后切割，即得；
优选地，
所述偶联Fmoc-Pro-OH时，使用的缩合剂选择Cl-HOBt/DIC、HOBt/DIC、PyBOP/HOBt/DIEA、BOP-Cl/HOBt/DIEA、HATU/HOBt/DIEA、TBTU/HOBt/DIEA、HBTU/HOBt/DIEA、COMU/DIEA；
和/或，所述偶联Fmoc-Pro-OH时，偶联的溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO中的一种或多种组合；
和/或，所述偶联Boc-D-Phe-OH时，使用的缩合剂选自Cl-HOBt/DIC、HOBt/DIC、COMU/DIEA；
和/或，所述偶联Boc-D-Phe-OH时，偶联的溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO中的一种或多种组合；
更优选地，
所述偶联Fmoc-Pro-OH时，使用的缩合剂选自TBTU/HOBt/DIEA；
和/或，所述偶联Fmoc-Pro-OH时，偶联的溶剂选自DMF和DCM混合溶液；
和/或，所述偶联Boc-D-Phe-OH时，使用的缩合剂选自COMU/DIEA；
和/或，所述偶联Boc-D-Phe-OH时，偶联的溶剂选自DMF和DCM混合溶液；
进一步优选地，
所述偶联Fmoc-Pro-OH时，Fmoc-Pro-OH以及缩合剂中TBTU、HOBt、DIEA的摩尔比为(1～5)：(1～5)：(1～5)：(1～5)；
和/或，所述偶联Fmoc-Pro-OH时，DMF和DCM混合溶液中DMF和DCM的体积比为(1～5)：(1～5)；
和/或，所述偶联Boc-D-Phe-OH时，Boc-D-Phe-OH以及缩合剂中COMU、DIEA的摩尔比为(1～5)：(1～5)：(1～5)；
和/或，所述偶联Boc-D-Phe-OH时，DMF和DCM混合溶液中DMF和DCM的体积比为(1～5)：(1～5)；
更进一步优选地，
所述偶联Fmoc-Pro-OH时，Fmoc-Pro-OH以及缩合剂中TBTU、HOBt、DIEA的摩尔比为1∶1∶1∶1；
和/或，所述偶联Fmoc-Pro-OH时，DMF和DCM混合溶液中DMF和DCM的体积比为3：1；
和/或，所述偶联Boc-D-Phe-OH时，Boc-D-Phe-OH以及缩合剂中COMU、DIEA的摩尔比为1：1：1；
和/或，所述偶联Boc-D-Phe-OH时，DMF和DCM混合溶液中DMF和DCM的体积比为3：1。
进一步地，所述切割为将偶联后的树脂加入溶剂中，反应后，洗涤，浓缩，在浓缩液中加入甲叔醚，析出固体后过滤，洗涤滤渣、干燥，即得；
优选地，所述溶剂为三氟乙醇和DCM的混合溶液；
和/或，所述反应为25～30℃下反应2～5h；
和/或，所述洗涤为用DCM洗涤；
和/或，所述甲叔醚的温度在10℃以下；
更优选地，所述三氟乙醇和DCM的混合溶液中，三氟乙醇和DCM的体积比为1:(3～5)。
进一步地，
步骤(1)中，所述合成六肽片段Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Dod)-OH时，2-CTC树脂采用多肽固相合成法依次偶联Fmoc保护氨基酸，最后切割，即得；所述Fmoc保护氨基酸依次为Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH；
优选地，合成六肽片段Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Dod)-OH时，使用的缩合剂选自Cl-HOBt/DIC、HOBt/DIC、PyBOP/HOBt/DIEA、BOP-Cl/HOBt/DIEA、HATU/HOBt/DIEA、TBTU/HOBt/DIEA、HBTU/HOBt/DIEA、COMU/DIEA；
和/或，偶联的溶剂选自DMF和DCM的混合溶剂与NMP或DMSO中的一种或两种，组合成三相或四相溶剂体系；
和/或，反应溶剂中加入以下表面活性剂：20～40％(v/v)的曲拉通或5-10％(v/v)的硫氢化钾；反应温度采用33-38℃，反应时间采用2-4h；
和/或，所述切割的方法如前述；
更优选地，
合成六肽片段Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Dod)-OH时，使用的缩合剂选自BOP-Cl/HOBt/DIEA；
和/或，偶联的溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO混合溶液；
和/或，反应溶剂中加入以下表面活性剂：20～40％(v/v)的曲拉通；和/或，反应温度采用35℃；和/或，反应时间采用3h；
进一步优选地，
所述Fmoc保护氨基酸以及缩合剂中的BOP-Cl、HOBt、DIEA的摩尔比为(1～5)：(1～5)：(1～5)：(1～5)；
和/或，所述溶剂中DMF、DCM、NMP、DMSO的体积比(1～5)：(1～5)：(1～5)：(1～5)；
和/或，所述表面活性剂为25％(v/v)的曲拉通；
更进一步优选地，
所述Fmoc保护氨基酸以及缩合剂中BOP-Cl、HOBt、DIEA的摩尔比为1：1：1：1；
和/或，所述溶剂中DMF、DCM、NMP、DMSO的体积比4：2：2：2。
进一步地，
步骤(2)中，所述偶联Fmoc保护氨基酸时，使用的缩合剂选自Cl-HOBt/DIC、HOBt/DIC、PyBOP/HOBt/DIEA、BOP-Cl/HOBt/DIEA、HATU/HOBt/DIEA、TBTU/HOBt/DIEA、HBTU/HOBt/DIEA、COMU/DIEA；
和/或，步骤(2)中，所述偶联Fmoc保护氨基酸时，偶联的溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO中的一种或多种组合；
和/或，步骤(3)中，所述偶联六肽片段时，使用的缩合剂选自Cl-HOBt/DIC、HOBt/DIC、PyBOP/HOBt/DIEA、BOP-Cl/HOBt/DIEA、HATU/HOBt/DIEA、TBTU/HOBt/DIEA、HBTU/HOBt/DIEA、COMU/DIEA；
和/或，步骤(3)中，所述偶联六肽片段时，偶联的溶剂选自DMF和DCM的混合溶剂与NMP或DMSO中的一种或两种，组合成三相或四相溶剂体系；
和/或，步骤(3)中，所述偶联六肽片段时，反应溶剂中加入以下表面活性剂：20～40％(v/v)的曲拉通或5-10％(v/v)的硫氢化钾；反应温度采用33-38℃，反应时间采用2-4h；
和/或，步骤(3)中，所述偶联三肽片段时，使用的缩合剂选自Cl-HOBt/DIC、HOBt/DIC、PyBOP/HOBt/DIEA、BOP-Cl/HOBt/DIEA、HATU/HOBt/DIEA、TBTU/HOBt/DIEA、HBTU/HOBt/DIEA、COMU/DIEA；
和/或，步骤(3)中，所述偶联三肽片段时，偶联的溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO中的一种或多种组合；
优选地，
步骤(2)中，所述偶联Fmoc保护氨基酸时，使用的缩合剂选自TBTU/HOBt/DIEA；
和/或，步骤(2)中，所述偶联Fmoc保护氨基酸时，偶联的溶剂选自DMF和DCM的混合溶液；
和/或，步骤(3)中，所述偶联六肽片段时，使用的缩合剂选自Cl-HOBt/DIC；
和/或，步骤(3)中，所述偶联六肽片段时，偶联的溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO混合溶液；
和/或，步骤(3)中，所述偶联六肽片段时，反应溶剂中加入以下表面活性剂：20～40％(v/v)的曲拉通；和/或，反应温度采用35℃；和/或，反应时间采用3h；
和/或，步骤(3)中，所述偶联三肽片段时，使用的缩合剂选自COMU/DIEA；
和/或，步骤(3)中，偶联三肽片段时，偶联的溶剂选自DMF和DCM的混合溶液；
更优选地，
步骤(2)中，所述偶联Fmoc保护氨基酸时，Fmoc保护氨基酸以及缩合剂中的TBTU、HOBt、DIEA的摩尔比为(1～5)：(1～5)：(1～5)：(1～5)；
和/或，步骤(2)中，所述偶联Fmoc保护氨基酸时，偶联的溶剂中DMF和DCM的体积比(1～5)：(1～5)；
和/或，步骤(3)中，所述偶联六肽片段时，六肽片段以及缩合剂中的Cl-HOBt和DIC的摩尔比为(1～5)：(1～5)：(1～5)；
和/或，步骤(3)中，所述偶联六肽片段时，偶联的溶剂中DMF、DCM、NMP、DMSO的体积比为(1～5)：(1～5)：(1～5)：(1～5)；
和/或，步骤(3)中，所述偶联六肽片段时，所述表面活性剂为25％(v/v)的曲拉通；
和/或，步骤(3)中，所述偶联三肽片段时，三肽片段以及缩合剂中的COMU和DIEA的摩尔比为(1～5)：(1～5)：(1～5)；
和/或，步骤(3)中，偶联三肽片段时，偶联的溶剂中DMF和DCM的体积比(1～5)：(1～5)；
进一步优选地，
步骤(2)中，所述偶联Fmoc保护氨基酸时，Fmoc保护氨基酸以及缩合剂中的TBTU、HOBt、DIEA的摩尔比为1：1：1：1；
和/或，步骤(2)中，所述偶联Fmoc保护氨基酸时，偶联的溶剂中DMF和DCM的体积比3：1；
和/或，步骤(3)中，所述偶联六肽片段时，六肽片段以及缩合剂中的Cl-HOBt和DIC的摩尔比为1：1：1；
和/或，步骤(3)中，所述偶联六肽片段时，偶联的溶剂中DMF、DCM、NMP、DMSO的体积比为4：2：2：2；
和/或，步骤(3)中，所述偶联三肽片段时，三肽片段以及缩合剂中的COMU和DIEA的摩尔比为1：1：1；
和/或，步骤(3)中，偶联三肽片段时，偶联的溶剂中DMF和DCM的体积比3：1。
进一步地，
所述多肽固相合成法中，脱保护时使用的脱保护液为哌啶和DMF混合溶液；所述混合溶液中，哌啶浓度为10～30％；所述脱保护液中加入1～3wt％的HOBT；
和/或，所述多肽固相合成法中，脱保护的条件为20～30℃下反应5～10min；
和/或，所述多肽固相合成法中，偶联反应的条件为30～35℃反应2～5h；
优选地，所述混合溶液中，哌啶浓度为20％；所述脱保护液中加入1.35wt％的HOBT；
和/或，所述多肽固相合成法中，脱保护后使用DMF洗涤；
和/或，所述偶联反应结束后使用DMF洗涤，干燥。
进一步地，步骤(4)中，所述TFA体系为裂解液；所述裂解液由TFA、甲硫醚、苯酚、1,2-乙二硫醇、三异丙基硅烷和水中一种或多种组成；
和/或，所述裂解温度为20-30℃；
和/或，所述裂解时间为2-4h；
优选地，裂解液由TFA、甲硫醚、苯酚、1,2-乙二硫醇、三异丙基硅烷和水组成；
和/或，所述裂解温度为25℃；
更优选地，所述TFA、甲硫醚、苯酚、1,2-乙二硫醇、三异丙基硅烷和水的体积比为(50～100)：(1～5)：(1～5)：(1～5)：(1～5)：(1～5)；
进一步优选地，所述TFA、甲硫醚、苯酚、1,2-乙二硫醇、三异丙基硅烷和水的体积比为85：2：2：5：4：2。
进一步地，步骤(5)中，所述粗分为将比伐芦定粗品溶于溶剂后，过滤，用聚合物填料进行粗分；
和/或，所述反相HPLC纯化采用梯度洗脱方法；
和/或，所述等电点沉淀时pH为3～4；
优选地，
所述粗分时，溶剂为20％的乙腈水溶液；其中，所述水为0.1％的TFA水溶液；
和/或，所述粗粉采用等度洗脱的方法；
和/或，所述等电点沉淀时pH为3.7±0.1。
本发明中v/v代表体积与体积的比，m/v代表质量与体积的比。
本发明中“多肽固相合成法”为本领域常用的方法，即为将前一步反应得到的Fmoc保护氨基酸-树脂脱去Fmoc保护基后，再与下一个保护氨基酸偶联反应。
本发明中“-氨基酸(Rx)-”括号里的Rx为氨基酸的侧链保护基团；本发明中“Fmoc-氨基酸(Rx)-OH”为保护氨基酸，Fmoc为氨基酸的氨基保护基团。
与现有技术相比，本发明具有下述有益效果：
(1)解决多苷和缺苷杂质(Bivalirudin±1Gly和Bivalirudin±2Gly)的项目技术难点：因比伐芦定结构中含有Gly-Gly-Gly-Gly片段，由于Gly自身特性，极易产生多苷和缺苷杂质，这类杂质与比伐芦定的极性很接近，分离度小，在后续纯化中很难去除。本发明采取固相合成六肽片段，在使用Gly合成该片段时，加入表面活性剂和强溶解性溶剂并控制温度，解决了多个Gly偶联时反应活性差，容易多苷和缺苷的技术难点；同时，该六肽片段的溶解性较好，解决了-Gly-Gly-Gly-Gly-序列引起的溶解性差和反应活性低的技术难点，以及解决了现有专利报道的与-Gly-Gly-Gly-Gly-相关片段溶解性差、难以纯化的问题，此外，在偶联该六肽片段时加入了表面活性剂和强溶解性溶剂，极大地提高了反应活性，有效控制了多苷和缺苷杂质，提高了比伐芦定的纯度和收率，降低合成成本。
(2)解决Asn降解杂质问题：Fmoc-Asn(Trt)9-Gly10-肽树脂在脱Fmoc保护基接后续氨基酸时，Asn易与Gly在碱性条件下发生五元重排副反应，并加速Asn降解为Asp和β-Asp。本发明突破常规的氨基酸，将Asn的Trt保护基换为Dod，Dod保护基为4,4′-二甲氧基二苯甲基，对碱稳定，可以抑制Asn在碱性条件下的重排和降解，可以有效控制水解杂质Asp-Bivalirudin和β-Asp-Bivalirudin。
(3)等电点沉淀法提纯：本发明提出等电点沉淀法除杂以提纯。根据氨基酸和多肽具有两性的特征，等电点也是氨基酸和多肽的固有属性，不同氨基酸或不同的多肽，其等电点均不同。等电点沉淀法对酸碱度敏感，因此，在相同PH下，不同分子量的氨基酸或多肽的溶解度都不同。利用这一特性，可以有效控制多聚体杂质和多苷/缺苷杂质(Bivalirudin±1Gly和Bivalirudin±2Gly)。多聚体杂质作为多肽不可避免的杂质，国家药品评审中心对该杂质也有明确的要求。其它专利对多聚体杂质少有报道。
此外，使用三肽片段和COMU缩合剂可以避免消旋杂质L-Phe-Bivalirudin。
综上，本发明使用了三肽和六肽片段合成工艺，所得比伐芦定精品收率较高(大于78.0％)，纯度较高(大于99.80％)；解决了多苷/缺苷、水解杂质、消旋杂质和多聚体等技术问题，每个杂质占比均低于0.05％，等电点沉淀法将片段中多苷杂质从0.14％降低至0.05％以下；解决了4个Gly偶联时易多苷/缺苷和反应活性差等问题；结合国家药品评审中心对药品申报的要求，关注并解决了多聚体杂质难题。本发明降低了成本，利于大规模、产业化生产。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明合成比伐芦定的工艺路线图。
图2为本发明制备的比伐芦定的HPLC图谱。
图3为本发明制备的比伐芦定的高分辨质谱图。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
本发明中涉及的英文缩写所对应的中文名称见表1所示：
表1.本发明中涉及的英文缩写所对应的中文名称
Figure BDA0002647322840000101
Figure BDA0002647322840000111
比伐芦定肽脂树为：
X-Y-Gly10-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-树脂(SEQ ID NO.8)，其中，X为三肽Boc-D-Phe1-Pro2-Arg(Pbf)3-，Y为六肽-Pro4-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Dod)9-(SEQ ID NO.9)。
本实施例使用的保护氨基酸如表2所示：
表2.使用的保护氨基酸
Figure BDA0002647322840000112
Figure BDA0002647322840000121
图1为本发明合成比伐芦定的工艺路线图。
具体制备方法如下：
实施例一、三肽片段Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-OH的制备
(1)Fmoc-Arg(Pbf)-CTC的制备：将100g(90mmol)替代度为0.9mmol/g的2-CTCResin树脂，加入1000ml二氯甲烷，混合40min后，再加入31.8g(90mmol)的Fmoc-Arg(Pbf)-OH，最后加入23.2g(180mmol)的DIEA，于20-25℃条件下混合反应1h后，加入甲醇100ml，继续混合反应30min后，抽滤，树脂用二氯甲烷洗5次，每次1000ml。即得到Fmoc-Arg(Pbf)-CTC，经紫外检测替代度为0.85mmol/g，共90mmol。
(2)偶联Fmoc-Pro-OH：①去保护，去保护液为20％哌啶/DMF溶液(v/v)，该溶液中含有1.35％的HOBT(m/v)。即在105.88g(90mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-CTC中加入该去保护液1000ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽滤，加入DMF1000ml，混合3min后，抽滤；再加入以上去保护液1000ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽滤，加入DMF1000ml，混合洗涤3min后，抽滤，再重复用DMF洗涤8次。②偶联，即在2L反应瓶中，依次加入60.7g(180mmol)的Fmoc-Pro-OH、57.8g(180mmol)的TBTU和24.3g(180mmol)的HOBT，加入3:1的DMF/DCM(v/v)溶液1000ml，于0-5℃条件下加入23.2g(180mmol)的DIEA，激活5min。将以上激活液缓慢加入到去保护后的树脂中，于30-35℃条件下混合2h。待反应结束后，Kaiser Test检测呈阴性后，抽滤，加入DMF1000ml，混合3min后，抽滤。重复用DMF洗涤6次，即得Fmoc-Pro-Arg(Pbf)-CTC树脂。
(3)偶联Boc-D-Phe-OH：①先对步骤(2)制得的Fmoc-Pro-Arg(Pbf)-CTC树脂去保护，去保护操作方法及用量与(2)相同。②偶联，即在2L反应瓶中，依次加入47.8g(180mmol)的Boc-D-Phe-OH、77.1g(180mmol)的COMU，加入3:1的DMF/DCM(v/v)溶液1000ml，于0-5℃条件下加入23.2g(180mmol)的DIEA，激活5min。将以上激活液缓慢加入到去保护后的树脂中，于30-35℃条件下混合反应2h。待反应结束后，Kaiser Test检测呈阴性后，抽滤，加入DMF1000ml，混合3min后，抽滤，如此重复洗涤6次。再用DCM抽洗3次，每次1000ml。最后用甲醇收缩抽洗2次，每次加入甲醇1000ml。于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h。即得Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-CTC。
(4)切割：将(3)中的Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-CTC肽树脂全部加入到1000ml三氟乙醇/DCM溶液(v/v＝1:3)中，在25℃条件下搅拌反应2h后，过滤，滤饼用DCM溶液抽洗3次，每次300ml，合并滤液，于30℃条件下浓缩至剩余体积约200ml。将该浓缩液缓慢倒入冷冻的甲叔醚(-10℃以下)中，搅拌30min充分析固体后，过滤，滤渣用甲叔醚抽洗3次后，将该固体真空干燥(25℃，4h)，即得到65.6g三肽片段(FW：756.35)，收率为96.41％，HPLC纯度为99.42％，其中，消旋杂质Boc-L-Phe-Pro-Arg(Pbf)-OH低于0.1％。
实施例二、六肽片段Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Dod)-OH的制备
(1)Fmoc-Asn(Dod)-CTC的制备：将100g(90mmol)替代度为0.9mmol/g的2-CTCResin树脂，加入1000ml二氯甲烷，混合40min后，再加入78.5g(135mmol)的Fmoc-Asn(Dod)-OH，最后加入34.8g(270mmol)的DIEA，于20-25℃条件下混合反应1h后，加入甲醇100ml，继续混合反应30min。30min后，抽滤，树脂用二氯甲烷洗5次，每次1000ml。即得到Fmoc-Asn(Dod)-CTC，经紫外检测替代度为0.71mmol/g，共80mmol。
(2)去保护和偶联氨基酸：①去保护，操作方法及用量完全与实施例一中(2)的去保护相同。②偶联，即在2L反应瓶中，依次加入71.4g的Fmoc-Gly-OH(240mmol)、61.1g的BOP-Cl(240mmol)和32.4g的HOBt(240mmol)，溶于1000ml的DMF/DCM/NMP/DMSO(v:v:v:v＝4:2:2:2)混合溶液中，加入250ml(25％，v/v)的曲拉通，于0-5℃条件下加入30.3g的DIEA(240mmol)，激活5min。将以上激活液缓慢加入到去保护后的树脂中，于35℃条件下混合3h。待反应结束后，Kaiser Test检测呈阴性后，抽滤，加入DMF1000ml，混合3min后，抽滤。重复用DMF洗涤6次。按照比伐芦定序列继续偶联剩余的Fmoc保护氨基酸，重复以上去保护和偶联操作(投料倍数及缩合剂用量一致)，依次逐个偶联的氨基酸为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH。偶联结束后，先用DCM抽洗3次，每次1000ml，再用甲醇收缩两次，每次加入甲醇1000ml，于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h。即得Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Dod)-CTC。
(3)切割：操作方法及用量完全与实施例一中(4)的切割相同，即得到68.55g六肽片段(FW：905.35)，收率为94.69％，HPLC纯度为98.65％，其中，多苷/缺苷杂质Bivalirudin±2Gly未检出，Bivalirudin+1Gly占比0.14％，Bivalirudin-1Gly占比0.03％。
实施例三、Fmoc-Leu-树脂的制备
(1)Fmoc-Leu-CTC的制备：将60g(54mmol)替代度为0.9mmol/g的2-CTC Resin树脂，加入600ml二氯甲烷，混合40min后，再加入15.3g(43.2mmol)的Fmoc-Leu-OH，最后加入21g(162mmol)的DIEA，于20-25℃条件下混合反应1h后，加入甲醇60ml，继续混合反应30min。30min后，抽滤，树脂用二氯甲烷洗5次，每次600ml，再用甲醇收缩两次，每次加入甲醇600ml，于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h。即得到74g的Fmoc-Leu-CTC，经紫外检测替代度为0.60mmol/g，共44.4mmol。
(2)Fmoc-Leu-Wang的制备：将80g(56mmol)替代度为0.7mmol/g的Wang Resin树脂，加入800ml二氯甲烷，混合40min后，抽滤。称取40.1g(112mmol)的Fmoc-Leu-OH和15.1g(112mmol)的HOBT于反应瓶中，加入800ml的DMF，于0-5℃下搅拌溶清，再加入14.5g的DIEA(112mmol)和2g(16mmol)的DMAP，保持0-5℃下搅拌激活5min后，倒入上述Wang树脂中，于20-25℃条件下混合反应2h后，加入醋酸酐8ml，继续混合反应1h后，抽滤，树脂用DMF洗5次，每次800ml，再用甲醇收缩两次，每次加入甲醇800ml，于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h。即得到98.2g的Fmoc-Leu-Wang，经紫外检测替代度为0.51mmol/g，共50.0mmol。
实施例四、侧链全保护比伐芦定-CTC肽树脂的制备
(1)中间体(10-20)的制备
即Fmoc-Gly10-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-CTC的制备。
称取61.6g(37mmol)实施例三中(1)制备的Fmoc-Leu-CTC，加入600ml二氯甲烷，混合40min后，抽滤。①先去保护，去保护液为20％哌啶/DMF溶液(v/v)，该溶液中含有1.35％的HOBT(m/v)。即在61.6g的Fmoc-Leu-CTC中加入该去保护液600ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽滤，加入DMF600ml，混合3min后，抽滤；再加入以上去保护液600ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽滤，加入DMF600ml，混合洗涤3min后，抽滤，重复用DMF洗涤8次。②然后偶联，即在1L反应瓶中，依次加入51g(111mmol)的Fmoc-Tyr(tBu)-OH、35.6g(111mmol)的TBTU和15g(111mmol)的HOBT，加入3:1的DMF/DCM(v/v)溶液600ml，于0-5℃条件下加入14.5g(111mmol)的DIEA，激活5min。将以上激活液缓慢加入到去保护后的树脂中，于30-35℃条件下混合2h。待反应结束后，Kaiser Test检测呈阴性后，抽滤，加入DMF600ml，混合3min后，抽滤，重复用DMF洗涤6次。按照比伐芦定序列继续偶联剩余的Fmoc保护氨基酸，重复以上去保护和偶联操作(投料倍数及缩合剂用量一致)，依次逐个偶联的氨基酸为：Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH，即得到中间体(10-20)的肽树脂。
(2)中间体(4-20)的制备
即Fmoc-Pro4-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Dod)9-Gly10-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-CTC(SEQID NO.10)的制备。
将(1)中的中间体(10-20)肽树脂去保护，去保护操作及用量与(1)相同。然后偶联六肽片段Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Dod)-OH，即在1L反应瓶中，依次加入67g(74mmol)的六肽片段、12.6g(74mmol)的Cl-HOBt，加入DMF/DCM/NMP/DMSO(v:v:v:v＝4:2:2:2)溶液600ml，再加入150ml(25％，v/v)的曲拉通，于0-5℃条件下加入9.3g(74mmol)的DIC，激活5min。将以上激活液缓慢加入到去保护的中间体(10-20)肽树脂中，于35℃条件下混合3h。待反应结束后，Kaiser Test检测呈阴性后，抽滤，加入DMF600ml，混合3min后，抽滤。重复用DMF洗涤6次。即得到中间体(4-20)的肽树脂。
(3)侧链全保护比伐芦定-CTC肽树脂的制备
将(2)中的中间体(4-20)肽树脂去保护，去保护操作及用量与(1)相同。然后偶联三肽片段Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-OH，即在1L反应瓶中，依次加入56g(74mmol)的三肽片段、31.7g(74mmol)的COMU，加入3:1的DMF/DCM(v/v)溶液600ml，于0-5℃条件下加入9.5g(74mmol)的DIEA，激活5min。将以上激活液缓慢加入到去保护的中间体(4-20)肽树脂中，于30-35℃条件下混合反应2h。待反应结束后，Kaiser Test检测呈阴性后，抽滤，加入DMF600ml，混合3min后，抽滤，如此重复洗涤6次。再用DCM抽洗3次，每次600ml。最后用甲醇收缩2次，每次加入甲醇600ml。于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h。即得到160.4g侧链全保护比伐芦定-CTC肽树脂。
实施例五、侧链全保护比伐芦定-Wang肽树脂的制备
称取72.5g(37mmol)实施例三中(2)的Fmoc-Leu-Wang，加入600ml二氯甲烷，混合40min后，抽滤。按照比伐芦定序列继续偶联剩余的Fmoc保护氨基酸，去保护和偶联操作与实施例四完全相同(投料倍数及缩合剂用量一致)，依次逐个偶联的氨基酸或片段为：Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、六肽片段、三肽片段，经干燥得到164.7g侧链全保护比伐芦定-Wang肽树脂。
实施例六、比伐芦定粗品的制备
于0-5℃条件下，将实施例四中的侧链全保护比伐芦定-CTC肽树脂160.4g全部加入到1.6L裂解试剂中，裂解液的体积比为TFA:甲硫醚:苯酚:1,2-乙二硫醇:三异丙基硅烷:水＝85:2:2:5:4:2，裂解温度为25℃，裂解时间为2h。反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液和洗涤液后进行减压浓缩，浓缩至旋转瓶内浓缩液的重量约为浓缩前总重量的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的5L甲基叔丁基醚中，沉降过夜后离心5次，每次用甲基叔丁基醚800mL，得到白色固体粉末，先用氮气吹干4h后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得比伐芦定粗品80.12g，收率为99.33％，HPLC纯度为95.98％。
实施例七、比伐芦定粗品的制备
于0-5℃条件下，将实施例五中的侧链全保护比伐芦定-Wang肽树脂164.7g全部加入到1.65L裂解试剂中，裂解液的体积比为TFA:甲硫醚:苯酚:1,2-乙二硫醇:三异丙基硅烷:水＝85:2:2:5:4:2，裂解温度为25℃，裂解时间为2h。反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，减压浓缩至滤液体积约为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的5L甲基叔丁基醚中，沉降过夜后离心5次，每次用甲基叔丁基醚800mL，得到白色固体粉末，先用氮气吹干4h后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得比伐芦定粗品80.37g，收率为99.64％，HPLC纯度为96.51％。
实施例八、比伐芦定精品的制备
(1)粗分：将实施例六的80.12g比伐芦定粗品溶于20％的乙腈/水溶液(v/v)，其中，水溶液为0.1％的TFA水溶液(v/v)。用0.45μm滤膜过滤，用聚合物填料进行粗分，粗分条件如下：
色谱柱：UniPs 30-100，30μm，
Figure BDA0002647322840000162
150×250mm；
流动相：A相：20mM甲酸铵水溶液
B相：乙腈
流速：300ml/min
检测波长：220nm。
采用等度洗脱，即45％乙腈，循环进样纯化。取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰，得到粗分样品溶液。
(2)反相HPLC纯化：
色谱柱：Kromasil-C18 10-100，10μm，
Figure BDA0002647322840000161
150×250mm
流动相：A相：0.15％TFA水溶液
B相：乙腈
流速：300ml/min
检测波长：220nm
将(1)中得到的粗分样品溶液在30℃条件下浓缩，浓缩至乙腈的体积占比在5％以下后，直接进样。采用梯度洗脱，循环上样方法，先用10％的乙腈平衡30min，再将B相的体积比在60min之内由10％上升至80％，并保持15min。采集图谱，观测吸收度的变化，收集主峰并合并合格的样品溶液。
(3)等电点沉淀法：
将(2)中得到的样品溶液在25℃条件下浓缩，除去乙腈后，搅拌状态下，使用0.5％的TFA水溶液(v/v)调节PH至3.7±0.1时，析出白色固体。固体用pH3.7的TFA水溶液洗涤三次后，收集固体并真空干燥，得到63.17g比伐芦定精品，收率78.32％，纯度99.82％，其中，水解杂质Asp-Bivalirudin占比0.01％，杂质β-Asp-Bivalirudin未检出，多苷杂质Bivalirudin+1Gly占比0.04％，其余多苷/缺苷杂质未检出，消旋杂质L-Phe-Bivalirudin占比0.02％，多聚体杂质占比0.02％。
实施例九：比伐芦定精品的制备
将实施例七的80.37g比伐芦定粗品按实施例八的方法制备，经粗分、反相HPLC纯化和等电点沉淀法，干燥后，得到63.53g比伐芦定精品，收率78.76％，纯度99.89％，其中，水解杂质Asp-Bivalirudin占比0.01％，杂质β-Asp-Bivalirudin未检出，多苷杂质Bivalirudin+1Gly占比0.03％，其余多苷/缺苷杂质未检出，消旋杂质L-Phe-Bivalirudin占比0.01％，多聚体杂质占比0.02％。
对本发明制备得到的比伐芦定精品高效液相色谱测定，HPLC图谱如图2所示。
对实施例九制备得到比伐芦定精品进行高分辨质谱测定，比伐芦定的理论分子量为2180.29，其高分辨质谱图如图3所示，分子量显示为1091.00400[M+2H]2+，与理论值相符。
综上，本发明使用了三肽和六肽片段合成工艺，所得比伐芦定精品收率较高(大于78.0％)，纯度较高(大于99.80％)；解决了多苷/缺苷、水解杂质、消旋杂质和多聚体等技术问题，每个杂质占比均低于0.05％，等电点沉淀法将片段中多苷杂质从0.14％降低至0.05％以下；解决了4个Gly偶联时易多苷/缺苷和反应活性差等问题；结合国家药品评审中心对药品申报的要求，关注并解决了多聚体杂质难题。本发明降低了成本，利于大规模、产业化生产。
SEQUENCE LISTING
<110> 扬子江药业集团四川海蓉药业有限公司
四川海汇药业有限公司
<120> 一种比伐芦定的制备方法
<130> GY191-2020P0110544CC
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro
1 5 10 15
Glu Glu Tyr Leu
20
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Phe Pro Arg Pro
1
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Gly Gly Gly Gly
1
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Arg Pro Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Pro Gly Gly Gly Gly
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
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1 5
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu
1 5 10
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Pro Gly Gly Gly Gly Asn
1 5
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr
1 5 10 15
Leu

Claims (10)

1.一种比伐芦定的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
(1)使用2-CTC树脂，采用多肽固相合成法逐一偶联Fmoc保护氨基酸，分别合成三肽片段Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-OH和六肽片段Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Dod)-OH；
(2)使用Wang树脂或2-CTC树脂，采用多肽固相合成法，按比伐芦定序列从C端向N端偶联，逐一偶联Fmoc保护氨基酸，得到中间体(10-20)-肽树脂，所述中间体(10-20)-肽树脂的结构为：
Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-树脂；
(3)采用多肽固相合成法，在中间体(10-20)-肽树脂上依次逐个偶联六肽片段Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Dod)-OH和三肽片段Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-OH，得到侧链全保护的比伐芦定肽树脂；
(4)侧链全保护的比伐芦定肽树脂经TFA体系裂解后，得到比伐芦定粗品；
(5)比伐芦定粗品经粗分、反相HPLC纯化，再经等电点沉淀，得到比伐芦定精品。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
所述2-CTC树脂或Wang树脂采用多肽固相合成法逐一偶联Fmoc保护氨基酸时，先偶联一个Fmoc保护氨基酸；
优选地，
所述2-CTC树脂偶联Fmoc保护氨基酸的方法如下：在2-CTC树脂中加入二氯甲烷、Fmoc保护氨基酸和DIEA反应，再加入甲醇继续反应，洗涤，干燥，即得；
更优选地，所述2-CTC树脂、Fmoc保护氨基酸和DIEA的摩尔比为(1～5)：(1～5)：(1～5)；
和/或，所述2-CTC树脂、二氯甲烷、甲醇的质量体积比为1g：(1～10)mL：(1～10)mL；
和/或，所述加入缩合剂DIEA的反应温度为20～25℃，反应时间为1～3h；
和/或，所述加入甲醇后的反应温度为20～25℃，反应时间为30～60min；
和/或，所述2-CTC树脂为2-CTC Resin树脂；
进一步优选地，所述2-CTC树脂、Fmoc保护氨基酸和DIEA的摩尔比为1：(0.8～1.5)：(2～3)；
和/或，所述2-CTC树脂、二氯甲烷、甲醇的质量体积比为1g：10mL：1mL；
和/或，所述2-CTC Resin树脂的替代度为0.1～0.9mmol/g；
和/或，所述洗涤为用二氯甲烷洗涤；
更进一步优选地，
步骤(1)中，合成三肽片段Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-OH时，2-CTC树脂偶联的Fmoc保护氨基酸为Fmoc-Arg(Pbf)-OH；合成六肽片段Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Dod)-OH时，2-CTC树脂偶联的Fmoc保护氨基酸为Fmoc-Asn(Dod)-OH；
步骤(2)中，2-CTC树脂偶联的Fmoc保护氨基酸为Fmoc-Leu-OH；
更进一步优选地，
所述2-CTC树脂偶联Fmoc-Leu-OH得到的Fmoc-Leu-CTC替代度为0.35～0.75mmol/g。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
所述Wang树脂偶联Fmoc保护氨基酸的方法如下：在Wang树脂中加入二氯甲烷；将Fmoc保护氨基酸、HOBT、DMF、DIEA和DMAP混合后倒入Wang树脂中反应，加入醋酸酐继续反应，洗涤，干燥，即得；
优选地，所述Wang树脂和二氯甲烷的质量体积比为1g：(1～10)mL；
和/或，所述Wang树脂、Fmoc保护氨基酸、HOBT、DIEA和DMAP的摩尔比为(1～5)：(1～5)：(1～5)：(1～5)：(0.1～1)；
和/或，所述Wang树脂、DMF和醋酸酐的质量体积比为1g：(1～10)mL：(0.1～1)mL；
和/或，所述倒入Wang树脂中反应的反应温度为20～25℃，反应时间为1～5h；
和/或，所述加入醋酸酐后反应温度为20～25℃，反应时间为1～5h；
更优选地，所述Wang树脂和二氯甲烷的质量体积比为1g：10mL；
和/或，所述Wang树脂、Fmoc保护氨基酸、HOBT、DIEA和DMAP的摩尔比为1：2：2：2：(0.25～0.3)；
和/或，所述Wang树脂、DMF和醋酸酐的质量体积比为1g：10mL：0.1mL；
进一步优选地，所述Wang树脂的替代度为0.1～0.7mmol/g；
和/或，所述洗涤为用DMF洗涤；
更进一步优选地，所述Wang树脂偶联的Fmoc保护氨基酸为Fmoc-Leu-OH；
更进一步优选地，
所述Wang树脂偶联Fmoc-Leu-OH得到的Fmoc-Leu-Wang替代度为0.25～0.65mmol/g。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中，所述合成三肽片段Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-OH时，2-CTC树脂先采用多肽固相合成法偶联Fmoc-Pro-OH，再采用多肽固相合成法偶联Boc-D-Phe-OH，最后切割，即得；
优选地，
所述偶联Fmoc-Pro-OH时，使用的缩合剂选择Cl-HOBt/DIC、HOBt/DIC、PyBOP/HOBt/DIEA、BOP-Cl/HOBt/DIEA、HATU/HOBt/DIEA、TBTU/HOBt/DIEA、HBTU/HOBt/DIEA、COMU/DIEA；
和/或，所述偶联Fmoc-Pro-OH时，偶联的溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO中的一种或多种组合；
和/或，所述偶联Boc-D-Phe-OH时，使用的缩合剂选自Cl-HOBt/DIC、HOBt/DIC、COMU/DIEA；
和/或，所述偶联Boc-D-Phe-OH时，偶联的溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO中的一种或多种组合；
更优选地，
所述偶联Fmoc-Pro-OH时，使用的缩合剂选自TBTU/HOBt/DIEA；
和/或，所述偶联Fmoc-Pro-OH时，偶联的溶剂选自DMF和DCM混合溶液；
和/或，所述偶联Boc-D-Phe-OH时，使用的缩合剂选自COMU/DIEA；
和/或，所述偶联Boc-D-Phe-OH时，偶联的溶剂选自DMF和DCM混合溶液；
进一步优选地，
所述偶联Fmoc-Pro-OH时，Fmoc-Pro-OH以及缩合剂中TBTU、HOBt、DIEA的摩尔比为(1～5)：(1～5)：(1～5)：(1～5)；
和/或，所述偶联Fmoc-Pro-OH时，DMF和DCM混合溶液中DMF和DCM的体积比为(1～5)：(1～5)；
和/或，所述偶联Boc-D-Phe-OH时，Boc-D-Phe-OH以及缩合剂中COMU、DIEA的摩尔比为(1～5)：(1～5)：(1～5)；
和/或，所述偶联Boc-D-Phe-OH时，DMF和DCM混合溶液中DMF和DCM的体积比为(1～5)：(1～5)；
更进一步优选地，
所述偶联Fmoc-Pro-OH时，Fmoc-Pro-OH以及缩合剂中TBTU、HOBt、DIEA的摩尔比为1：1：1：1；
和/或，所述偶联Fmoc-Pro-OH时，DMF和DCM混合溶液中DMF和DCM的体积比为3：1；
和/或，所述偶联Boc-D-Phe-OH时，Boc-D-Phe-OH以及缩合剂中COMU、DIEA的摩尔比为1：1：1；
和/或，所述偶联Boc-D-Phe-OH时，DMF和DCM混合溶液中DMF和DCM的体积比为3：1。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述切割为将偶联后的树脂加入溶剂中，反应后，洗涤，浓缩，在浓缩液中加入甲叔醚，析出固体后过滤，洗涤滤渣、干燥，即得；
优选地，所述溶剂为三氟乙醇和DCM的混合溶液；
和/或，所述反应为25～30℃下反应2～5h；
和/或，所述洗涤为用DCM洗涤；
和/或，所述甲叔醚的温度在10℃以下；
更优选地，所述三氟乙醇和DCM的混合溶液中，三氟乙醇和DCM的体积比为1:(3～5)。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中，所述合成六肽片段Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Dod)-OH时，2-CTC树脂采用多肽固相合成法依次偶联Fmoc保护氨基酸，最后切割，即得；所述Fmoc保护氨基酸依次为Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH；
优选地，合成六肽片段Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Dod)-OH时，使用的缩合剂选自Cl-HOBt/DIC、HOBt/DIC、PyBOP/HOBt/DIEA、BOP-Cl/HOBt/DIEA、HATU/HOBt/DIEA、TBTU/HOBt/DIEA、HBTU/HOBt/DIEA、COMU/DIEA；
和/或，偶联的溶剂选自DMF和DCM的混合溶剂与NMP或DMSO中的一种或两种，组合成三相或四相溶剂体系；
和/或，反应溶剂中加入以下表面活性剂：20～40％(v/v)的曲拉通或5-10％(v/v)的硫氢化钾；反应温度采用33-38℃，反应时间采用2-4h；
和/或，所述切割的方法如权利要求5所述；
更优选地，
合成六肽片段Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Dod)-OH时，使用的缩合剂选自BOP-Cl/HOBt/DIEA；
和/或，偶联的溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO混合溶液；
和/或，反应溶剂中加入以下表面活性剂：20～40％(v/v)的曲拉通；和/或，反应温度采用35℃；和/或，反应时间采用3h；
进一步优选地，
所述Fmoc保护氨基酸以及缩合剂中的BOP-Cl、HOBt、DIEA的摩尔比为(1～5)：(1～5)：(1～5)：(1～5)；
和/或，所述溶剂中DMF、DCM、NMP、DMSO的体积比(1～5)：(1～5)：(1～5)：(1～5)；
和/或，所述表面活性剂为25％(v/v)的曲拉通；
更进一步优选地，
所述Fmoc保护氨基酸以及缩合剂中BOP-Cl、HOBt、DIEA的摩尔比为1：1：1：1；
和/或，所述溶剂中DMF、DCM、NMP、DMSO的体积比4：2：2：2。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中，所述偶联Fmoc保护氨基酸时，使用的缩合剂选自Cl-HOBt/DIC、HOBt/DIC、PyBOP/HOBt/DIEA、BOP-Cl/HOBt/DIEA、HATU/HOBt/DIEA、TBTU/HOBt/DIEA、HBTU/HOBt/DIEA、COMU/DIEA；
和/或，步骤(2)中，所述偶联Fmoc保护氨基酸时，偶联的溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO中的一种或多种组合；
和/或，步骤(3)中，所述偶联六肽片段时，使用的缩合剂选自Cl-HOBt/DIC、HOBt/DIC、PyBOP/HOBt/DIEA、BOP-Cl/HOBt/DIEA、HATU/HOBt/DIEA、TBTU/HOBt/DIEA、HBTU/HOBt/DIEA、COMU/DIEA；
和/或，步骤(3)中，所述偶联六肽片段时，偶联的溶剂选自DMF和DCM的混合溶剂与NMP或DMSO中的一种或两种，组合成三相或四相溶剂体系；
和/或，步骤(3)中，所述偶联六肽片段时，反应溶剂中加入以下表面活性剂：20～40％(v/v)的曲拉通或5-10％(v/v)的硫氢化钾；反应温度采用33-38oC，反应时间采用2-4h；
和/或，步骤(3)中，所述偶联三肽片段时，使用的缩合剂选自Cl-HOBt/DIC、HOBt/DIC、PyBOP/HOBt/DIEA、BOP-Cl/HOBt/DIEA、HATU/HOBt/DIEA、TBTU/HOBt/DIEA、HBTU/HOBt/DIEA、COMU/DIEA；
和/或，步骤(3)中，所述偶联三肽片段时，偶联的溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO中的一种或多种组合；
优选地，
步骤(2)中，所述偶联Fmoc保护氨基酸时，使用的缩合剂选自TBTU/HOBt/DIEA；
和/或，步骤(2)中，所述偶联Fmoc保护氨基酸时，偶联的溶剂选自DMF和DCM的混合溶液；
和/或，步骤(3)中，所述偶联六肽片段时，使用的缩合剂选自Cl-HOBt/DIC；
和/或，步骤(3)中，所述偶联六肽片段时，偶联的溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO混合溶液；
和/或，步骤(3)中，所述偶联六肽片段时，反应溶剂中加入以下表面活性剂：20～40％(v/v)的曲拉通；和/或，反应温度采用35℃；和/或，反应时间采用3h；
和/或，步骤(3)中，所述偶联三肽片段时，使用的缩合剂选自COMU/DIEA；
和/或，步骤(3)中，偶联三肽片段时，偶联的溶剂选自DMF和DCM的混合溶液；
更优选地，
步骤(2)中，所述偶联Fmoc保护氨基酸时，Fmoc保护氨基酸以及缩合剂中的TBTU、HOBt、DIEA的摩尔比为(1～5)：(1～5)：(1～5)：(1～5)；
和/或，步骤(2)中，所述偶联Fmoc保护氨基酸时，偶联的溶剂中DMF和DCM的体积比(1～5)：(1～5)；
和/或，步骤(3)中，所述偶联六肽片段时，六肽片段以及缩合剂中的Cl-HOBt和DIC的摩尔比为(1～5)：(1～5)：(1～5)；
和/或，步骤(3)中，所述偶联六肽片段时，偶联的溶剂中DMF、DCM、NMP、DMSO的体积比为(1～5)：(1～5)：(1～5)：(1～5)；
和/或，步骤(3)中，所述偶联六肽片段时，所述表面活性剂为25％(v/v)的曲拉通；
和/或，步骤(3)中，所述偶联三肽片段时，三肽片段以及缩合剂中的COMU和DIEA的摩尔比为(1～5)：(1～5)：(1～5)；
和/或，步骤(3)中，偶联三肽片段时，偶联的溶剂中DMF和DCM的体积比(1～5)：(1～5)；
进一步优选地，
步骤(2)中，所述偶联Fmoc保护氨基酸时，Fmoc保护氨基酸以及缩合剂中的TBTU、HOBt、DIEA的摩尔比为1：1：1：1；
和/或，步骤(2)中，所述偶联Fmoc保护氨基酸时，偶联的溶剂中DMF和DCM的体积比3：1；
和/或，步骤(3)中，所述偶联六肽片段时，六肽片段以及缩合剂中的Cl-HOBt和DIC的摩尔比为1：1：1；
和/或，步骤(3)中，所述偶联六肽片段时，偶联的溶剂中DMF、DCM、NMP、DMSO的体积比为4：2：2：2；
和/或，步骤(3)中，所述偶联三肽片段时，三肽片段以及缩合剂中的COMU和DIEA的摩尔比为1：1：1；
和/或，步骤(3)中，偶联三肽片段时，偶联的溶剂中DMF和DCM的体积比3：1。
8.根据权利要求1～7任一项所述的制备方法，其特征在于：
所述多肽固相合成法中，脱保护时使用的脱保护液为哌啶和DMF混合溶液；所述混合溶液中，哌啶浓度为10～30％；所述脱保护液中加入1～3wt％的HOBT；
和/或，所述多肽固相合成法中，脱保护的条件为20～30℃下反应5～10min；
和/或，所述多肽固相合成法中，偶联反应的条件为30～35℃反应2～5h；
优选地，所述混合溶液中，哌啶浓度为20％；所述脱保护液中加入1.35wt％的HOBT；
和/或，所述多肽固相合成法中，脱保护后使用DMF洗涤；
和/或，所述偶联反应结束后使用DMF洗涤，干燥。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述TFA体系为裂解液；所述裂解液由TFA、甲硫醚、苯酚、1,2-乙二硫醇、三异丙基硅烷和水中一种或多种组成；
和/或，所述裂解温度为20-30℃；
和/或，所述裂解时间为2-4h；
优选地，裂解液由TFA、甲硫醚、苯酚、1,2-乙二硫醇、三异丙基硅烷和水组成；
和/或，所述裂解温度为25℃；
更优选地，所述TFA、甲硫醚、苯酚、1,2-乙二硫醇、三异丙基硅烷和水的体积比为(50～100)：(1～5)：(1～5)：(1～5)：(1～5)：(1～5)；
进一步优选地，所述TFA、甲硫醚、苯酚、1,2-乙二硫醇、三异丙基硅烷和水的体积比为85：2：2：5：4：2。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(5)中，所述粗分为将比伐芦定粗品溶于溶剂后，过滤，用聚合物填料进行粗分；
和/或，所述反相HPLC纯化采用梯度洗脱方法；
和/或，所述等电点沉淀时pH为3～4；
优选地，
所述粗分时，溶剂为20％的乙腈水溶液；其中，所述水为0.1％的TFA水溶液；
和/或，所述粗粉采用等度洗脱的方法；
和/或，所述等电点沉淀时pH为3.7±0.1。
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