CN104530224A - 一种固相合成比伐芦定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固相合成比伐芦定的方法。本发明的方法包括如下步骤:以Wang树脂为起始原料,合成Fmoc-Leu-载体树脂,在Fmoc-Leu-Wang树脂上通过固相偶联合成法依次接入下列序列中相应的Fmoc-保护氨基酸,得到比伐芦定树脂,接入X片段时,用固相偶联合成反应,X片段对应的Fmoc-保护氨基酸为Fmoc-Gly-Gly-OH。本发明的方法避免了工艺杂质比伐芦定[-Gly]、工艺杂质比伐芦定[+Gly]的产生,大大降低了纯化的难度,提高了产品的收率。
Description
技术领域
本发明属于多肽药物制备方法技术领域,尤其涉及固相合成比伐芦定的方法。
背景技术
中文名:比伐芦定
汉语拼音:Bifaluding
英文名称:Bivalirudin
药物别名:比瓦尔丁
英文别名:Angiomax;
氨基酸序列:
D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH
化学文摘(CAS)号:128270-60-0
分子式:C98H138N24O33
分子量:2180.33
CAS名称:
D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginyl-L-prolylglycylglycylglycylglycyl-
L-asparaginylglycyl-L-α-aspartyl-L-phenylalanyl-L-α-glutamyl-L-α-glutamyl-L-isoleucyl-
L-prolyl-L-α-glutamyl-L-α-glutamyl-L-tyrosyl-L-leucine
分子结构式:
制剂通用名:注射用比伐芦定
制剂英文名:Bivalirudin For Injection
商品名:Angiomax、Angiox、泰加宁(美国Medicines公司产品在美国使用商品名Angiomax,在欧洲使用商品名Angiox;国内深圳信立泰公司产品使用商品名泰加宁)
Medicines公司2004年11月10日宣布在欧洲首次进行凝血酶特异性抑制剂Bivalirudin的商品销售,其在美国的商品名为目前已经被欧洲和美国以及其他地区,如加拿大、以色列、新西兰和阿根廷等国家批准,允许其上市。Angiomax是一种直接凝血酶抑制剂,在临床研究中,比伐芦定能过同时降低肝素临时抗凝时带来的出血和缺血并发症几率。这一优势在高危患者中也得到了保持。
中国专利200910028793.7报道了一种比伐芦定的液相合成方法。首先逐步合成三个全保护的片段:N-端全保护的6肽、中段全保护的6肽、C-端全保护的8肽,然后将这三个片段依次缩合得到全保护的比伐芦定,最后脱除所有保护基团得到比伐芦定粗品,再经过高效液相色谱纯化,得到比伐芦定纯品。
中国专利201110162887.0报道了一种比伐芦定的液相合成方法。首先合成四个全保护的片段,然后将这四个片段依次锁个得到全保护的比伐芦定,最后脱除所有保护基团得到比伐芦定粗品,再进过高效液相色谱纯化,得到比伐芦定纯品。
中国专利201110170669.1报道了一种比伐芦定的制备方法,包括固相多肽法制备比伐芦定树脂、比伐芦定树脂酸解得到比伐芦定粗品、比伐芦定粗品纯化得到比伐芦定纯品,其中固相多肽合成法制备比伐芦定树脂的方法为:在Fmoc-Leu-载体树脂上通过固相偶联合成法依次接入下列序列中相对应的Fmoc-保护氨基酸,得到比伐芦定树脂:R1-D-Phe-Pro-
Arg(Pbf)-Pro-X-Asn(R2)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-树脂,,接入X片段时仅用1次固相偶联合成反应,对应的Fmoc-保护氨基酸为Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH。
中国专利201310188441.4报道了一种比伐芦定的制备方法。采用固相偶联法,以Fmoc-Leu-Wang树脂或Fmoc-Leu-2-chlotrityl树脂为原料,脱除Fmoc保护基后逐一偶联Fmoc保护的氨基酸得到侧链全保护比伐芦定[9-20]肽-树脂,脱除Fmoc保护后再与Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH五肽片段固相偶联得侧链全保护比伐芦定[4-20]肽-树脂,再逐一偶联其余的保护氨基酸,得到侧链全保护比伐芦定肽-树脂;裂解除去侧链全保护比伐芦定肽-树脂上的树脂和保护基团,沉淀得到比伐芦定。
中国专利201210196621.2报道了一种固相片段法合成比伐芦定的方法。首先用固相法逐步合成一个13肽片段I-Wang Resin,一个N端被Fmoc保护的7肽片段II,二者采用固相片段法偶联合成比伐芦定Wang Resin;最后经过脱保护、裂解、纯化,冷冻干燥得到纯比伐芦定。
中国专利200610024611.5报道了一种固相多肽合成比伐芦定的制备方法。该方法包括如下步骤:以三苯氯甲基树脂或4-甲基-三苯氯树脂或4-甲氧基-三苯氯甲基树脂或2-氯-三苯氯甲基树脂或Wang树脂其中的任何一种为起始原料,按固相合成的方法依次连接保护氨基酸,获得保护的二十肽树脂,其间依次脱去Fmoc-保护基,脱侧链保护基团、切肽,获得比伐芦定粗品,再经C18(或C8)高压柱分离纯化,制得比伐芦定精品。
中国专利200980152943.3报道了一种通过汇聚五个片段的合成方法制备具有下式的20-mer肽的比伐芦定的方法,以及涉及一些它的肽中间体。H-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly
-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH。
中国专利201310210329.6报道了一种通过顺序偶联制备比伐芦定的方法,其中Gly的投料比显著高于其他相应氨基酸的投料比,具体地,Gly的投料比为4-8倍。
中国专利201210030956.7报道了一种比伐芦定的制备方法,包括固相多肽合成法制备比伐芦定树脂、比伐芦定树脂酸解得到比伐芦定粗品、比伐芦定粗品纯化得到比伐芦定纯品,其中固相多肽合成法制备比伐芦定树脂的方法为:在Fmoc-Leu-载体树脂上通过固相偶联合成法依次接入下列序列中相对应的保护氨基酸或片段,得到比伐芦定树脂:R1-D-Phe-Pro-
X-Y-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-树脂其中,R1为Fmoc或Boc或H;X为Arg(Pbf)-Pro;Y为Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R2)-Gly-Asp(OtBu),R2为Trt或H。
中国专利201210428012.5报道了一种比伐芦定的制备方法。该方法采用固相合成的多肽片段Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-OH为原料,避免了Bivalirudin±1Gly和Bivalirudin±2Gly的问题;此外,该发明采用特定偶联试剂使该异构体L-Phe的量降低。
中国专利201110144317.9报道了一种固相液相结合合成比伐芦定的方法,该方法包括以下步骤:a、将Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH和式V反应,得式IV;b、将制得的式IV和去保护剂反应,得式III;c、通过固相合成的方法将剩余的氨基酸与式III缩合,再经过去保护基,切除树脂处理后得到比伐芦定精肽。
以上专利可分为2种制备方法,一种为逐一偶联法,另一种为片段偶联法。逐一偶联法工艺简单,但会产生工艺杂质比伐芦定[-Gly]、比伐芦定[+Gly],这两种工艺杂质在纯化时有一定困难,会造成纯化收率降低,成本增加;以上专利中的片段偶联法也无法避免工艺杂质比伐芦定[-Gly]、比伐芦定[+Gly]的产生,其所采用的片段均在4肽以上,片段需要额外进行合成、纯化等工序,增加的工作量及合成的难度。而且片段对接过程中,酯化反应效率会比逐一偶联法低很多,使合成工序收率降低,增加了成本,不适合工业化生产。
发明内容
本发明提供一种固相合成比伐芦定的方法,所述方法,步骤如下:依次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸,获得保护的二十肽树脂,其间依次脱去Fmoc-保护基团,获得侧链保护的二十肽树脂后,同步进行脱侧链保护基团及切肽,获得比伐芦定粗品。
本方法意外的发现,使用保护氨基酸片段为Fmoc-Gly-Gly-OH的氨基酸为起始原料后,避免了工艺杂质比伐芦定[-Gly]的大量产生,大大降低了纯化的难度,提高了产品的收率,避免了自制各种片段进行合成的复杂工艺,降低了成本,适合工业放大生产。
按照本发明,应用固相偶联法,以Fmoc-Leu-树脂为固相载体,按照序列顺序依次连接具有保护基团的Fmoc-氨基酸,获得比伐芦定保护二十肽树脂:
D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-X-X-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-树脂
其中X为Gly-Gly
接入X时用固相偶联法合成反应,接入X时对应的保护氨基酸为Fmoc-Gly-Gly-OH。
所述的载体类型为:Trityl-Cl类型树脂为Trityl-Cl树脂、4-Methyltrityl-Cl树脂、4-Methoxytrityl-Cl树脂或2-Cl Trity-Cl树脂;羟基类型树脂为Wang树脂或对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂。优选羟基类型Wang树脂。
所述的载体树脂替代度为:0.6-1.4mmol/g,优选为0.8-1.1mmol/g;
树脂反应前溶胀试剂选自N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、N-甲基吗啡啉(NMM)、二甲基亚砜,优选为DCM。
当所述的载体树脂为羟基类型Wang树脂时,Fmoc-Leu-OH与载体树脂的偶联方法为:Fmoc-Leu-OH的羧基与树脂中的羟基在缩合剂的作用下发生偶联反应而接入保护氨基酸。
缩合试剂选自N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基(PyBop)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、N,N-二异丙基乙胺(DIEA),优选为N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)。缩合剂的用量为投料树脂的总摩尔数的1-5倍,优选为3倍。
活化剂为1-羟基苯并三唑(HOBT)或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAT)中的一种,优选HOBT。活化剂的用量为投料树脂的总摩尔数的1-5倍,优选为3倍。
催化剂为4-二甲氨基吡啶(DMAP)。催化剂的用量为投料树脂的总摩尔数的0.05~0.5倍,优选为0.11倍。
偶联时所用于溶剂保护氨基酸、缩合剂、活化剂、催化剂的溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、N-甲基吗啡啉(NMM)、二甲基亚砜(DMSO)中的一种,优选为DMF。
偶联反应时间为4-12小时,优选为7-8小时。
Fmoc-Leu-树脂合成完毕后,用吡啶和乙酸酐封闭载体树脂未连接保护氨基酸的活性位点,吡啶和乙酸酐的体积比为1:2~2:1,优选为17:19。
Fmoc-Leu-树脂的替代度为0.5-1.0mmol/g,优选为0.6-0.8mmol/g。
所述的保护氨基酸分别为Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Phe-OH。
Fmoc为9-芴甲氧羰基,tBu为叔丁基,OtBu为叔丁氧基,Trt为三苯基甲烷,Pbf为2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃。
各保护氨基酸用量为Fmoc-Leu-树脂总摩尔数的1-5倍,优选为3倍。
其中Fmoc-Gly-OH应用于接入第11个的Gly的过程,第13-17个Gly接入时连续接入2个Fmoc-Gly-Gly-OH。
固相偶联合成法具体为:前一步偶联反应得到的保护氨基酸-树脂脱掉Fmoc保护后,再与后一个保护氨基酸进行偶联反应。脱Fmoc保护的试剂为10-50%(体积分数)的哌啶(PIP)/DMF溶液,优选20-25%。脱Fmoc保护时间为10-50分钟,优选25-35分钟。
偶联时需添加缩合试剂和活化试剂,缩合试剂选自N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基(PyBop)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、N,N-二异丙基乙胺(DIEA),优选为N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)。
缩合剂的用量为Fmoc-Leu-树脂总摩尔数的1-5倍,优选为3倍。
活化剂为1-羟基苯并三唑(HOBT)或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAT)中的一种,优选HOBT。
活化剂的用量为Fmoc-Leu-树脂总摩尔数的1-5倍,优选为3倍。
偶联反应的时间为1-5小时,优选2-2.5小时
脱去Fmoc保护基的比伐芦定肽树脂经酸解同时脱掉侧链保护基和树脂,得到比伐芦定粗品:
D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH
酸解试剂为三氟乙酸(TFA)、1,2-乙二硫醇(EDT)的混合溶剂,酸解试剂的混合溶剂的配比为:TFA的体积分数为90-95%,EDT的体积分数为5-10%。优选为95%TFA、5%EDT.
酸解试剂用量为每克肽树脂对应5-15mL;优选为每克肽树脂对应10mL酸解试剂。
本发明的比伐芦定工艺路线有下列优点:
1、原辅材料来源方便,收率高,质量稳定,生产成本低。冻干后得到成品可将成本控制在700元/g以下,极具市场竞争力。
2、具备规模化生产能力,合成采用主流的固相合成法,工艺稳定、简便易行。无需自行制作多肽片段或其他中间体,免去了中间体制作过程中的繁杂工艺。
3、使用Fmoc-Gly-Gly-OH进行固相合成的方法,减小了杂质比伐芦定[-Gly]、比伐芦定[+Gly],提高了产品的收率和纯度,同时为后续纯化工作降低难度及工作量。
发明内容有以下优点
4、本发明与现有方法比较
具体实施方式
表1
实施例中:
以下通过实施例进一步说明本发明,但是,应当理解,这些实施例仅仅用于更详细具体的说明之用,而不应将其理解为用于以任何形式限制本发明。在本文中,除非另外说明,其中,(1)含量及收率“%”均为质量百分比,(2)纯度“%”均为高效液相色谱纯度HPLC;
实施例1、制备Fmoc-Leu-Wang树脂:
将200gWang树脂(100~200目,1.1mmol/g)用800mLDCM浸泡30分钟,抽干。在上述树脂中,在氮气搅拌的条件下加入DMAP2.96g、Fmoc-Leu-OH233.2g(FW:353.1)、DIC 100mL、HoBt 90g和DMF 800mL,室温反应8小时;反应结束后抽干溶液,DMF洗涤两次,抽干,加入吡啶和乙酸酐溶液900mL打封闭,反应4小时;反应结束后抽干溶液,DMF洗涤六次,抽干,加入甲醇溶液800mL收缩树脂体积6分钟。抽干液体,氮气吹干,获得Fmoc-Leu-Wang树脂258g。
封闭后Fmoc-Leu-Wang树脂的替代度为0.71mmol/g;
实施例2、制备Fmoc-Leu-Wang树脂:
将200gWang树脂(100~200目,1.1mmol/g)用800mLDCM浸泡30分钟,抽干。在上述树脂中,在氮气搅拌的条件下加入DMAP2.96g、Fmoc-Leu-OH233.2g(FW:353.1)、DIC 100mL、HoBt 90g和DMF 800mL,室温反应7小时;反应结束后抽干溶液,DMF洗涤两次,抽干,加入吡啶和乙酸酐溶液900mL打封闭,反应4小时;反应结束后抽干溶液,DMF洗涤六次,抽干,加入甲醇溶液800mL收缩树脂体积6分钟。抽干液体,氮气吹干,获得Fmoc-Leu-Wang树脂247g。
封闭后Fmoc-Leu-Wang树脂的替代度为0.65mmol/g;
实施例3、制备侧链全保护比伐芦定肽树脂:
取实施例1中的Fmoc-Leu-Wang树脂17.46g,加入DMF100mL溶胀30分钟,抽干DMF,加入25%脱保护试剂150mL,脱保护25分钟,用DMF洗涤六次,抽干,加入用DMF100mL溶解的Fmoc-Tyr(tBu)-OH 11.4g(FW:459.6)、DIC 3.88mL、HoBt 3.35g的混合物,接肽反应2小时,反应终点以茚三酮检测阴性为准,抽干,用DMF洗涤两次,抽干,重复以上步骤,按照比伐芦定肽序逐一与相应的Fmoc保护氨基酸偶联,各Fmoc保护氨基酸的摩尔当量与前述Fmoc-Tyr(tBu)-OH相同,依次连接的保护氨基酸为:
Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH,制得侧链全保护比伐芦定肽树脂,其结构如下:
NH2-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂;
实施例4、制备侧链全保护比伐芦定肽树脂:
取实施例2中的Fmoc-Leu-Wang树脂19.08g,加入DMF100mL溶胀30分钟,抽干DMF,加入25%脱保护试剂150mL,脱保护25分钟,用DMF洗涤六次,抽干,加入用DMF100mL溶解的Fmoc-Tyr(tBu)-OH 11.4g(FW:459.6)、DIC 3.88mL、HoBt 3.35g的混合物,接肽反应2小时,反应终点以茚三酮检测阴性为准,抽干,用DMF洗涤两次,抽干,重复以上步骤,按照比伐芦定肽序逐一与相应的Fmoc保护氨基酸偶联,各Fmoc保护氨基酸的摩尔当量与前述Fmoc-Tyr(tBu)-OH相同,依次连接的保护氨基酸为:
Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH,制得侧链全保护比伐芦定肽树脂,其结构如下:
NH2-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂;
实施例5、制备侧链全保护比伐芦定肽树脂:
取实施例1中的Fmoc-Leu-Wang树脂17.46g,加入DMF100mL溶胀30分钟,抽干DMF,加入20%脱保护试剂150mL,脱保护35分钟,用DMF洗涤六次,抽干,加入用DMF100mL溶解的Fmoc-Tyr(tBu)-OH 11.4g(FW:459.6)、DIC 3.88mL、HoBt 3.35g的混合物,接肽反应2小时,反应终点以茚三酮检测阴性为准,抽干,用DMF洗涤两次,抽干,重复以上步骤,按照比伐芦定肽序逐一与相应的Fmoc保护氨基酸偶联,各Fmoc保护氨基酸的摩尔当量与前述Fmoc-Tyr(tBu)-OH相同,依次连接的保护氨基酸为:
Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH,制得侧链全保护比伐芦定肽树脂,其结构如下:
NH2-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂;
实施例6、制备侧链全保护比伐芦定肽树脂:
取实施例2中的Fmoc-Leu-Wang树脂19.08g,加入DMF100mL溶胀30分钟,抽干DMF,加入20%脱保护试剂150mL,脱保护35分钟,用DMF洗涤六次,抽干,加入用DMF100mL溶解的Fmoc-Tyr(tBu)-OH 11.4g(FW:459.6)、DIC 3.88mL、HoBt 3.35g的混合物,接肽反应2小时,反应终点以茚三酮检测阴性为准,抽干,用DMF洗涤两次,抽干,重复以上步骤,按照比伐芦定肽序逐一与相应的Fmoc保护氨基酸偶联,各Fmoc保护氨基酸的摩尔当量与前述Fmoc-Tyr(tBu)-OH相同,依次连接的保护氨基酸为:
Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH,制得侧链全保护比伐芦定肽树脂,其结构如下:
NH2-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂;
实施例7、制备侧链全保护比伐芦定肽树脂:
取实施例1中的Fmoc-Leu-Wang树脂17.46g,加入DMF100mL溶胀30分钟,抽干DMF,加入20%脱保护试剂150mL,脱保护35分钟,用DMF洗涤六次,抽干,加入用DMF100mL溶解的Fmoc-Tyr(tBu)-OH 11.4g(FW:459.6)、DIC 3.88mL、HoBt 3.35g的混合物,接肽反应2.5小时,反应终点以茚三酮检测阴性为准,抽干,用DMF洗涤两次,抽干,重复以上步骤,按照比伐芦定肽序逐一与相应的Fmoc保护氨基酸偶联,各Fmoc保护氨基酸的摩尔当量与前述Fmoc-Tyr(tBu)-OH相同,依次连接的保护氨基酸为:
Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH,制得侧链全保护比伐芦定肽树脂,其结构如下:
NH2-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂;
实施例8、制备侧链全保护比伐芦定肽树脂:
取实施例2中的Fmoc-Leu-Wang树脂19.08g,加入DMF100mL溶胀30分钟,抽干DMF,加入20%脱保护试剂150mL,脱保护35分钟,用DMF洗涤六次,抽干,加入用DMF100mL溶解的Fmoc-Tyr(tBu)-OH 11.4g(FW:459.6)、DIC 3.88mL、HoBt 3.35g的混合物,接肽反应2.5小时,反应终点以茚三酮检测阴性为准,抽干,用DMF洗涤两次,抽干,重复以上步骤,按照比伐芦定肽序逐一与相应的Fmoc保护氨基酸偶联,各Fmoc保护氨基酸的摩尔当量与前述Fmoc-Tyr(tBu)-OH相同,依次连接的保护氨基酸为:
Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH,制得侧链全保护比伐芦定肽树脂,其结构如下:
NH2-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂;
实施例9、制备比伐芦定粗品:
在实施例3中的
NH2-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-
Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂中,加入预冷至-20℃的裂解试剂(TFA/EDT=475mL/25mL,体积比),常温裂解反应2小时,减压过滤,收集滤液,用1500mL乙醚沉淀,减压抽干,获得比伐芦定粗品18.24g,产品纯度为82.46%。
实施例10、制备比伐芦定粗品:
在实施例4中的
NH2-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-
Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂中,加入预冷至-20℃的裂解试剂(TFA/EDT=475mL/25mL,体积比),常温裂解反应2小时,减压过滤,收集滤液,用1500mL乙醚沉淀,减压抽干,获得比伐芦定粗品18.68g,产品纯度为77.46%。
实施例11、制备比伐芦定粗品:
在实施例5中的
NH2-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-
Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂中,加入预冷至-20℃的裂解试剂(TFA/EDT=475mL/25mL,体积比),常温裂解反应2小时,减压过滤,收集滤液,用1500mL乙醚沉淀,减压抽干,获得比伐芦定粗品18.05g,产品纯度为83.54%。
实施例12、制备比伐芦定粗品:
在实施例6中的
NH2-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-
Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂中,加入预冷至-20℃的裂解试剂(TFA/EDT=475mL/25mL,体积比),常温裂解反应2小时,减压过滤,收集滤液,用1500mL乙醚沉淀,减压抽干,获得比伐芦定粗品18.76g,产品纯度为78.59%。
实施例13、制备比伐芦定粗品:
在实施例7中的
NH2-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-
Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂中,加入预冷至-20℃的裂解试剂(TFA/EDT=475mL/25mL,体积比),常温裂解反应2小时,减压过滤,收集滤液,用1500mL乙醚沉淀,减压抽干,获得比伐芦定粗品17.95g,产品纯度为86.12%。
实施例14、制备比伐芦定粗品:
在实施例8中的
NH2-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-
Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂中,加入预冷至-20℃的裂解试剂(TFA/EDT=475mL/25mL,体积比),常温裂解反应2小时,减压过滤,收集滤液,用1500mL乙醚沉淀,减压抽干,获得比伐芦定粗品18.91g,产品纯度为80.58%。
Claims (10)
1.一种固相合成法合成比伐芦定的方法,其特征在于,包括如下步骤:
以Fmoc-Leu-载体树脂为起始原料,按照固相偶联合成的方法一次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸,获得保护的二十肽树脂,其间依次脱去Fmoc-保护基团,用缩合剂进行接肽反应,获得保护的二十肽树脂后,进行脱侧链保护及裂解,获得比伐芦定粗品。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所用Fmoc-Leu-载体树脂替代度为:0.6-1.4mmol/g。优选为0.6-0.8mmol/g。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述载体树脂选自:Trityl-Cl树脂、4-Methyltrityl-Cl树脂、4-Methoxytrityl-Cl树脂或2-Cl Trity-Cl树脂;Wang树脂或对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:当载体树脂为Wang树脂时,Fmoc-Leu-OH与载体树脂偶联的方法为:Fmoc-Leu-OH的羧基与树脂中的羟基在缩合剂的作用下发生偶联反应而接入保护氨基酸。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:Wang树脂反应前需要溶胀试剂,溶胀试剂选自N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、N-甲基吗啡啉(NMM)、二甲基亚砜。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于:偶联时需添加缩合试剂和活化试剂,缩合试剂选自:N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基(PyBop)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、N,N-二异丙基乙胺(DIEA),活化剂选自:1-羟基苯并三唑(HOBT)或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAT)中的一种,催化剂为4-二甲氨基吡啶(DMAP)。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:偶联时所用于溶剂选自:N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、N-甲基吗啡啉(NMM)、二甲基亚砜(DMSO)中的一种。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述的具有Fmoc保护基团的氨基酸分别为:Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Phe-OH。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:脱侧链保护及裂解使用的酸解试剂选自:三氟乙酸(TFA)、1,2-乙二硫醇(EDT)的混合溶剂,其用量为每克肽树脂对应5-15mL;酸解试剂的混合溶剂的配比为:TFA的体积分数为90-95%,EDT的体积分数为5-10%。
10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤如下:
制备Fmoc-Leu-Wang树脂:
将200gWang树脂(100~200目,1.1mmol/g)用800mLDCM浸泡30分钟,抽干。在上述树脂中,在氮气搅拌的条件下加入DMAP2.96g、Fmoc-Leu-OH233.2g(FW:353.1)、DIC 100mL、HoBt 90g和DMF 800mL,室温反应8小时;反应结束后抽干溶液,DMF洗涤两次,抽干,加入吡啶和乙酸酐溶液900mL打封闭,反应4小时;反应结束后抽干溶液,DMF洗涤六次,抽干,加入甲醇溶液800mL收缩树脂体积6分钟。抽干液体,氮气吹干,获得Fmoc-Leu-Wang树脂258g。
封闭后Fmoc-Leu-Wang树脂的替代度为0.71mmol/g;
制备侧链全保护比伐芦定肽树脂:
Fmoc-Leu-Wang树脂17.46g,加入DMF100mL溶胀30分钟,抽干DMF,加入25%脱保护试剂150mL,脱保护25分钟,用DMF洗涤六次,抽干,加入用DMF100mL溶解的Fmoc-Tyr(tBu)-OH 11.4g(FW:459.6)、DIC 3.88mL、HoBt 3.35g的混合物,接肽反应2小时,反应终点以茚三酮检测阴性为准,抽干,用DMF洗涤两次,抽干,重复以上步骤,按照比伐芦定肽序逐一与相应的Fmoc保护氨基酸偶联,各Fmoc保护氨基酸的摩尔当量与前述Fmoc-Tyr(tBu)-OH相同,依次连接的保护氨基酸为:
[0066]Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH
制得侧链全保护比伐芦定肽树脂,其结构如下:
NH2-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂;
制备比伐芦定粗品:
在NH2-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂中,加入预冷至-20℃的裂解试剂(TFA/EDT=475mL/25mL,体积比),常温裂解反应2小时,减压过滤,收集滤液,用1500mL乙醚沉淀,减压抽干,获得比伐芦定粗品。
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Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017019174A1 (en) * | 2015-07-30 | 2017-02-02 | Ambiopharm, Inc. | Method of producing bivalirudin |
CN108434459A (zh) * | 2018-03-15 | 2018-08-24 | 国家纳米科学中心 | 一种多肽药物偶联物及其制备方法和应用 |
CN109134615A (zh) * | 2018-09-20 | 2019-01-04 | 济南康和医药科技有限公司 | 一种比伐芦定的制备方法 |
CN112062835A (zh) * | 2020-08-24 | 2020-12-11 | 扬子江药业集团四川海蓉药业有限公司 | 一种比伐芦定的制备方法 |
CN117659119A (zh) * | 2022-10-31 | 2024-03-08 | 珠海市藤栢医药有限公司 | 一种rgd片段、利用其制备多肽的方法及其应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101033249A (zh) * | 2006-03-10 | 2007-09-12 | 周逸明 | 固相多肽合成比筏芦定的制备方法 |
WO2010117725A2 (en) * | 2009-04-06 | 2010-10-14 | Novetide, Ltd. | Production of peptides containing poly-gly sequences using fmoc chemistry |
CN102532274A (zh) * | 2012-02-13 | 2012-07-04 | 成都圣诺生物制药有限公司 | 一种比伐卢定的制备方法 |
CN103242431A (zh) * | 2013-05-20 | 2013-08-14 | 齐鲁制药有限公司 | 一种比伐卢定的制备方法 |
-
2015
- 2015-01-07 CN CN201510005428.XA patent/CN104530224A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101033249A (zh) * | 2006-03-10 | 2007-09-12 | 周逸明 | 固相多肽合成比筏芦定的制备方法 |
WO2010117725A2 (en) * | 2009-04-06 | 2010-10-14 | Novetide, Ltd. | Production of peptides containing poly-gly sequences using fmoc chemistry |
CN102532274A (zh) * | 2012-02-13 | 2012-07-04 | 成都圣诺生物制药有限公司 | 一种比伐卢定的制备方法 |
CN103242431A (zh) * | 2013-05-20 | 2013-08-14 | 齐鲁制药有限公司 | 一种比伐卢定的制备方法 |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017019174A1 (en) * | 2015-07-30 | 2017-02-02 | Ambiopharm, Inc. | Method of producing bivalirudin |
CN108434459A (zh) * | 2018-03-15 | 2018-08-24 | 国家纳米科学中心 | 一种多肽药物偶联物及其制备方法和应用 |
CN108434459B (zh) * | 2018-03-15 | 2020-09-11 | 国家纳米科学中心 | 一种多肽药物偶联物及其制备方法和应用 |
CN109134615A (zh) * | 2018-09-20 | 2019-01-04 | 济南康和医药科技有限公司 | 一种比伐芦定的制备方法 |
CN109134615B (zh) * | 2018-09-20 | 2021-02-19 | 济南康和医药科技有限公司 | 一种比伐芦定的制备方法 |
CN112062835A (zh) * | 2020-08-24 | 2020-12-11 | 扬子江药业集团四川海蓉药业有限公司 | 一种比伐芦定的制备方法 |
CN117659119A (zh) * | 2022-10-31 | 2024-03-08 | 珠海市藤栢医药有限公司 | 一种rgd片段、利用其制备多肽的方法及其应用 |
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