CN103242431A - 一种比伐卢定的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种避免杂质产生的比伐卢定的制备方法。采用固相偶联法，以Fmoc-Leu-Wang树脂或Fmoc-Leu-2-chlorotrityl树脂为原料，脱除Fmoc保护基后逐一偶联Fmoc保护的氨基酸得侧链全保护比伐卢定[9-20]肽-树脂，脱除Fmoc保护后再与Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH五肽片段固相偶联得侧链全保护比伐卢定[4-20]肽-树脂，再逐一偶联其余的保护氨基酸，得到侧链全保护比伐卢定肽-树脂；裂解除去侧链全保护比伐卢定肽-树脂上的树脂和保护基团，沉淀得到比伐卢定。本发明的方法减小了杂质比伐卢定[-Gly]和[+Gly]，提高了产品的收率和纯度。

Description

一种比伐卢定的制备方法
技术领域
本发明涉及一种工业化大规模制备比伐卢定的方法，特别涉及采用固相合成法制备比伐卢定，属于多肽合成技术领域。
背景技术
比伐卢定（Bivalirudin）是一种人工合成的抗凝药物，其抗凝成分为水蛭素衍生物C端的20个氨基酸残基的多肽。最先由瑞士Biogen公司研发，后转让给剑桥医药公司（TheMedicines Company，TMC），剑桥医药公司于1997年12月23日向FDA递交新药申请（NewDrug Application，NDA），直到2000年12月15日才被批准作为抗凝药用于接受经皮冠状动脉腔内血管成形术（PTCA）的不稳定型心绞痛患者，上市剂型为粉针剂，商品名Angiomax，规格250mg。
比伐卢定是一个由20个氨基酸组成的多肽，具有如下结构：
D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH。
目前比伐卢定常用的制备工艺主要有液相合成和固相合成两种。
液相合成比伐卢定的方法参见CN101475631A、CN102164609A、CN102264757A等文献。其中，CN101475631A公开了以下技术方案：首先逐步合成3个全保护的片段：N-端全保护的6肽，中段全保护的6肽，C端全保护的8肽，然后将这三个片段依次缩合得到全保护的比伐卢定，最后脱除所有保护基团得到比伐卢定粗品，再经高效液相色谱纯化，得到比伐卢定纯品。
由于液相法合成比伐卢定步骤复杂，工艺控制点较多，副产物多，工艺不稳定，因此，比伐卢定多采用固相合成法来制备。中国专利文件CN101555274A采用逐步偶联的策略制备比伐卢定，在构筑分子中-Gly-Gly-Gly-Gly-结构时，采用Fmoc-Gly-OH逐步偶联，无法避免比伐卢定[-Gly]、[+Gly]杂质以及比伐卢定[-2Gly]、[+2Gly]的杂质的产生。这些杂质与比伐卢定自身的极性非常相近，在纯化的过程中很难完全去除，产品收率无法得到有效的提高，导致产品纯度降低，影响产品的质量以及用药安全。CN102731624A采用了七肽+13肽的合成方法，不能避免[-Gly]、[+Gly]杂质的产生，且成本较高。WO2010117725A采用二肽法固相合成比伐卢定，该路线采用Fmoc-Gly-Gly-OH，分两次引入比伐卢定分子中的4个甘氨酸残基，可以避免比伐卢定[-Gly]、[+Gly]杂质的产生，但无法避免合成过程中比伐卢定[-2Gly]、[+2Gly]杂质的产生。CN102225966A、CN101906150A、CN102260323A中或采用二肽或采用四肽的合成来制备比伐卢定，虽能抑制杂质产生，但成本仍较高，需要多步合成。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种采用固相合成法制备比伐卢定的方法，既能避免杂质产生，又可降低生产成本，可用于工业上大规模生产比伐卢定。
术语说明：
侧链保护基团：指与氨基酸的侧链（即氨基酸通式H2N-C(R)(H)-COOH中的R基）偶联的化学部分，其有助于防止侧链的一部分与多肽合成、加工等步骤中使用的化学物质反应。
缩合剂：能引起缩合反应的试剂，在多肽合成中，尤指能促进氨基与羧基偶联形成肽键的试剂。
活化助剂：在多肽缩合反应中，能够协助缩合剂更好的促进缩合反应的试剂，如：抑制缩合反应中消旋杂质的产生、催化加快反应速度等。
本发明的技术方案如下：
一种比伐卢定的制备方法，包括步骤如下：
（1）以Fmoc-Leu-Wang树脂或Fmoc-Leu-2-chlorotrityl树脂为原料，加入脱保护剂，脱除所述树脂上的Fmoc保护基；
（2）将步骤（1）脱除Fmoc保护基的树脂采用逐一偶联的方式依次连接Fmoc保护的氨基酸，所述的偶联是在活化助剂和缩合剂存在下进行的固相偶联反应，每一个偶联反应均以茚三酮检测阴性为反应终点，反应完毕用脱保护剂脱除Fmoc保护基，再与下一个Fmoc保护的氨基酸进行偶联反应；重复操作直至合成得到侧链全保护比伐卢定[9-20]肽-树脂：
Fmoc-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-树脂；
所述的各Fmoc保护的氨基酸的用量与所述树脂的用量的摩尔比为2～5:1；
（3）将步骤（2）制备的侧链全保护的比伐卢定[9-20]肽-树脂用脱保护剂脱除Fmoc保护后，再与Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH五肽片段在活化助剂和缩合剂存在下进行固相偶联反应，接入[4-8]肽脯氨酸-L-甘氨酸-L-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（Pro-Gly-Gly-Gly-Gly），得到侧链全保护比伐卢定[4-20]肽-树脂，结构如下：
Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-树脂；
所得侧链全保护比伐卢定[4-20]肽-树脂用脱保护剂脱除Fmoc保护基，再进行下一步骤；
（4）上述步骤（3）得到的脱除Fmoc保护基后的侧链全保护比伐卢定[4-20]肽-树脂采用与步骤（2）相同的逐一偶联的方式依次连接Fmoc保护的[1-3]肽，D-苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸（D-Phe-Pro-Arg），合成得到侧链全保护比伐卢定肽-树脂；其中所述苯丙氨酸D-Phe残基的引入也可以采用Boc-D-Phe-OH保护的形式；
（5）经酸解剂裂解除去侧链全保护比伐卢定肽-树脂上的树脂和保护基团，经沉淀，得到比伐卢定粗品。
进一步地，本发明的方法还包括步骤(6)比伐卢定粗品的纯化：将上述步骤（5）得到的比伐卢定粗品经反相高效液相色谱纯化，冻干得到比伐卢定纯品。
本发明中，所用到的脱保护剂均为哌啶，优选应用形式为含20%(v/v)哌啶的DMF溶液。
上述步骤（2）中所述的Fmoc保护的氨基酸，各种氨基酸分别以下列形式应用：
Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH。
上述方法中，步骤（2）所述的逐一偶联的方式是：脱除Fmoc保护基的树脂与一个Fmoc保护氨基酸在活化助剂、缩合剂作用下进行固相偶联反应，反应完毕用脱保护剂脱除Fmoc保护基，所得产物再与下一个Fmoc保护氨基酸进行固相偶联反应，再脱除Fmoc保护基；重复该固相偶联反应-脱除Fmoc保护基的循环操作，按
Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr序列倒序逐一依次连接Fmoc保护的氨基酸。每一步的固相偶联反应都以茚三酮检测阴性为反应终点。
上述方法中，步骤（1）所述的Fmoc-Leu-Wang树脂或Fmoc-Leu-2-chlorotrityl树脂，均可市场购买。也可以采用Wang树脂或2-氯三苯甲基氯树脂参照CN102286076A的实施例1或实施例3制备得到。
根据本发明优选的，步骤（1）所述的Fmoc-Leu-Wang树脂或Fmoc-Leu-2-chlorotrityl树脂的荷载量为0.3～1.5mmol/g，进一步优选的，所述的Fmoc-Leu-Wang树脂或Fmoc-Leu-2-chlorotrityl树脂的荷载量为0.3～0.8mmol/g。
根据本发明优选的，所述的脱保护剂为含20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液（v/v=4:1体积比）；树脂与脱保护剂的摩尔体积比为1:10～50，单位：mol/L；进一步优选树脂与脱保护剂的摩尔体积比=1:20～40mol/L；脱保护反应时间为每次10min，重复脱保护3次。
根据本发明优选的，步骤（2）所述的缩合剂选自N,N-二异丙基碳二亚胺（DIC）、N,N-二环己基碳二亚胺（DCC），六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷（PyBOP）、2-（7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基）-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）或O-苯并三氮唑-N,N,N’,N-四甲基脲四氟硼酸酯（TBTU）；优选为N,N-二异丙基碳二亚胺（DIC）、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）、2-（7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基）-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）；缩合剂的用量与树脂用量的摩尔比为2～6:1。
根据本发明优选的，步骤（2）中所述的活化助剂选自1-羟基苯并三唑（HOBt）、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑（HOAt）；优选为1-羟基苯并三唑（HOBt）；活化助剂与树脂用量的摩尔比为2～6:1。
根据本发明优选的，步骤（2）中所述的固相偶联反应时间为30～150min，优选60～120min。以茚三酮检测阴性为反应终点。
本发明步骤（3）所述的固相偶联反应与步骤（2）的反应条件完全相同，所用的活化助剂和缩合剂与步骤（2）相同，活化助剂和缩合剂的用量也与步骤（2）相同。
根据本发明优选的，步骤（3）中所述的Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH的用量与侧链全保护的比伐卢定[9-20]肽-树脂的用量的摩尔比为2～5:1；进一步优选3:1摩尔比。
根据本发明优选的，步骤（2）中活化助剂和缩合剂以下列形式应用：将活化助剂和缩合剂与Fmoc保护氨基酸一起溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF），加入反应器。
根据本发明优选的，步骤（3）中活化助剂和缩合剂以下列形式应用：将活化助剂和缩合剂与Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH一起溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF），加入反应器。
本发明步骤（4）所述的固相偶联反应与步骤（2）的反应条件完全相同，所用的活化助剂和缩合剂与步骤（2）相同，活化助剂和缩合剂的用量也与步骤（2）相同。
根据本发明优选的，步骤（5）所述的酸解剂为三氟乙酸（TFA）、三异丙基硅烷（TIS）、水组成的混合物，三氟乙酸：三异丙基硅烷：水=90～95：2～5：2～5体积比。
根据本发明优选的，步骤（5）所述的酸解剂的用量与侧链全保护比伐卢定-树脂之比为5～20ml/g，优选8～15ml/g，更优选的，酸解剂：侧链全保护比伐卢定-树脂=10：1ml/g。
根据本发明优选的，步骤（5）所述的裂解反应时间为1～5h，优选为1.5～3.5h。
本发明还提供用于合成比伐卢定的Fmoc保护的肽片段Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH五肽，其结构及制备方法。
本发明中，所述的五肽片段Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH的结构式如下：
可以通过本发明提供的以下优选方法制备。
本发明优选的，所述的五肽片段Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH的制备方法步骤如下：
将起始原料四聚甘氨酸、碳酸钠（摩尔比=1:2）溶于适量水中，加入Fmoc-Pro-OSu的1,4-二氧六环溶液，Fmoc-Pro-OSu与四聚甘氨酸摩尔比1～1.1:1，搅拌反应2～3h，TLC检测反应结束后，浓缩除去1,4-二氧六环，加入2N盐酸调节溶液pH值至2-3，析出大量固体，抽滤收集固体产品，水洗，干燥后柱层析纯化得五肽片段
Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH。
根据本发明优选的，步骤(6)比伐卢定粗品的纯化方法，高效液相色谱柱参数为：色谱填料为10μm的反相C18固定相，色谱柱直径为50毫米、长度为250毫米，纯化方法步骤如下：
称取比伐卢定粗品溶于适量水中，微孔滤膜过滤，将滤液用高效液相色谱柱纯化，流动相为0.1%(v/v)三氟乙酸水溶液—0.1%(v/v)三氟乙酸乙腈溶液，梯度洗脱，循环纯化，合并主峰溶液减压浓缩，蒸除乙腈，得比伐卢定三氟乙酸盐溶液；冷冻干燥得比伐卢定纯品，产品纯度≥99.5%，产品中不含比伐卢定[-2Gly]、[+2Gly]杂质，同时比伐卢定[-Gly]、比伐卢定[+Gly]杂质含量均小于0.1%。
本发明步骤（5）所述的沉淀一般选用冰乙醚或甲基叔丁基醚试剂，按现有技术进行即可。
本发明的方法中，在制备比伐卢定粗品时用酸解剂裂解脱除掉除Fmoc外的tBu、Trt、Boc、Pbf等保护基即可。裂解过程除脱去树脂外，还会同时脱去除氨基酸上的其余保护基团（tBu、Trt、Boc、Pbf等）。
本发明使用了Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH一步引入脯氨酸（Pro）和4个甘氨酸（Gly），从而完全避免了比伐卢定[-2Gly]、[+2Gly]杂质，同时大大减小了杂质比伐卢定[-Gly]、比伐卢定[+Gly]含量，此方法提高了产品的收率和纯度，反应效率高，有利于实现规模化的固相化学合成。
本发明方法首次合成了Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH，并将其应用于比伐卢定的固相合成，使得最终产品的纯度大于99.5%，比伐卢定[-Gly]、比伐卢定[+Gly]两个杂质的含量均小于0.1%。与现有技术相比，本发明工艺具有操作简单、条件温和等特点，适于大规模工业化制备比伐卢定。
附图说明
图1实施例10的比伐卢定粗品纯化的HPLC图谱。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但是，应当理解，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应将其理解为用于以任何形式限制本发明。在本文中，除非另外说明，其中：(i)温度以摄氏度(℃)表示，操作在室温环境下进行。(ii)含量及收率“%”均为质量百分比。(iii)纯度%均为高效液相色谱纯度HPLC。
本发明中所采用的树脂（Fmoc-Leu-wang树脂和Fmoc-Leu-2-chlorotrityl树脂）、Fmoc保护氨基酸、Boc-D-Phe-OH等原料均购自吉尔生化有限公司，实施例1中的Fmoc-Pro–OSu购自天津科创医药中间体技术生产力促进有限公司，四聚甘氨酸购自四川同晟氨基酸有限公司。
以下实施例1涉及五肽片段Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH的制备，实施例2-7涉及侧链全保护比伐卢定肽-树脂的制备，实施例8-9涉及比伐卢定粗品的制备，实施例10涉及比伐卢定粗品的纯化。除非另外说明，所用原料及试剂均为市购产品。
实施例1、Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH的制备
称取四聚甘氨酸（24.6g，100mmol）、碳酸钠（21.2g，200mmol）加入500ml水中，搅拌10分钟溶解后加入Fmoc-Pro–OSu（47.7g，110mmol）的1,4-二氧六环溶液500ml，室温搅拌反应2.5小时，TLC检测反应结束，减压浓缩去除1,4-二氧六环，采用2N盐酸调节水相pH，至pH为2-3时，析出大量固体，抽滤，水洗，干燥，柱层析纯化制得目标产物51.2g，收率为90.0%，纯度为98.7%。MS m/z:566(M+1)。[α]D 20℃=-24.3°(DMF,c=1.0)。
H1NMR（600MHz，CD3SOCD3）：
δ8.34（dd,J=4.8Hz,2H,）,8.24(dd,J=6.0Hz,1H),8.21(dd,J=6.0Hz,1H),8.11-8.16(m,3H),8.06(dd,J=5.4Hz,1H),7.90(q,4H),7.68(t，J=9.0Hz,2H),7.64(d,J=7.8Hz,1H),7.60(d,J=7.2Hz,1H),7.41-7.44(m,4H),7.31-7.37(m,4H),4.39(dd,J1=J2=3.0Hz,1H),4.27-4.33(m,3H),4.19-4.23(m,3H),3.49(t,J=7.2Hz,2H),3.36-3.42(m，2H)，2.21-2.23(m,1H),2.07-2.12(m,1H),1.82-2.00(m,6H);
C13NMR（600MHz,CD3SOCD3）：δ173.0,172.8,171.7,169.7,169.5,154.6,144.3,141.1,128.1,127.6,125.7,120.5,67.5,67.1,60.5,60.3,47.6,47.0,41.3,31.7,30.3,23.4,
实施例2、侧链全保护比伐卢定肽-树脂的制备
称取Fmoc-Leu-Wang树脂25.0g（荷载量0.4mmol/g,10mmol）加入固相反应器中，加入20%的哌啶DMF溶液150ml，25～30℃搅拌反应10min，重复脱保护3次，反应完毕后抽滤，将树脂用200ml DMF洗涤，抽滤，重复洗涤共6次，将Fmoc-Tyr(tBu)-OH（MW：459,30mmol）13.8g、1-羟基苯并三唑（HOBt）（MW：135.1,30mmol）3.9g溶于100ml DMF，加入固相反应器内，再加入N,N-二异丙基碳二亚胺（DIC）(MW:126.2,30mmol)3.6ml，25～35℃反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准，重复以上步骤，按照比伐卢定肽序逐一与相应Fmoc保护氨基酸偶联，保护氨基酸和缩合剂的摩尔当量与前述Fmoc-Tyr(tBu)-OH相同；依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH，脱除Fmoc保护制得侧链全保护比伐卢定肽-树脂，其结构如下：
H-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂。
实施例3、侧链全保护比伐卢定肽-树脂的制备
称取Fmoc-Leu-Wang树脂20.0g（荷载量0.5mmol/g,10mmol）加入固相反应器中，加入20%的哌啶DMF溶液150ml，25～30℃搅拌反应10min，重复脱保护3次，反应完毕后抽滤，将树脂用200ml DMF洗涤，抽滤，重复洗涤共6次，将Fmoc-Tyr(tBu)-OH（MW:459,30mmol）13.8g、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑（HOAt）（MW:136.1,30mmol）4.1g、2-（7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基）-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）(MW:380.2,30mmol)11.4g溶于DMF，加入固相反应器内，加入N-甲基吗啉（NMM）(MW:101.2,ρ:0.92g/ml,45mmol)5ml，反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准，重复以上步骤，按照比伐卢定肽序逐一与相应的Fmoc保护或Boc保护氨基酸偶联，各Fmoc保护或Boc保护氨基酸的摩尔当量与前述Fmoc-Tyr(tBu)-OH相同，依次连接的保护氨基酸为：
Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Boc-D-Phe-OH，制得侧链全保护比伐卢定肽-树脂，其结构如下：
Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂。
实施例4、侧链全保护比伐卢定肽-树脂的制备
称取Fmoc-Leu-Wang树脂45.5g（荷载量0.33mmol/g,15mmol）加入固相反应器中，加入含20%哌啶的DMF溶液150ml，室温搅拌反应10min，重复脱保护3次，反应完毕后抽滤，树脂用200ml DMF重复洗涤6次，将Fmoc-Tyr(tBu)-OH（MW：459,45mmol）20.6g、1-羟基苯并三唑（HOBt）（MW：135.1,45mmol）6.08g、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）(MW:379.2,45mmol)17.05g溶于DMF，加入固相反应器内，加入N-甲基吗啉（NMM）(MW:101.2,ρ:0.92g/ml,45mmol)5ml，反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准，重复以上步骤，依次与相应的Fmoc保护氨基酸偶联（逐一依次连接的氨基酸同实施例3），制得侧链全保护比伐卢定肽-树脂，其结构如下：
Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂。
实施例5、侧链全保护比伐卢定肽-树脂的制备
称取Fmoc-Leu-2-chlorotrityl树脂25.0g（荷载量0.4mmol/g,10mmol），加入固相反应器中，加入20%的哌啶DMF溶液150ml，室温搅拌反应10min，重复脱保护3次，反应完毕后抽滤，树脂用200ml DMF重复洗涤6次，将Fmoc-Tyr(tBu)-OH（MW：459,30mmol）13.8g、1-羟基苯并三唑（HOBt）（MW：135.1,30mmol）3.9g、N,N-二异丙基碳二亚胺（DIC）(MW:126.2,30mmol)3.6ml溶于DMF，加入固相反应器内，反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准，重复以上步骤，依次与相应的Fmoc保护氨基酸偶联（逐一依次连接的氨基酸同实施例2），之后脱除Fmoc保护制得侧链全保护比伐卢定肽-树脂，其结构如下：
H-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-2-chlorotrityl树脂。
实施例6、侧链全保护比伐卢定肽-树脂的制备
称取Fmoc-Leu-2-chlorotrityl树脂25.0g（荷载量0.4mmol/g,10mmol），加入固相反应器中，加入20%的哌啶DMF溶液150ml，25～30℃搅拌反应10min，重复脱保护3次，反应完毕后抽滤，将树脂用200ml DMF洗涤，抽滤，重复洗涤共6次，将Fmoc-Tyr(tBu)-OH（MW:459,30mmol）13.8g、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑（HOAt）（MW:136.1,30mmol）4.1g、2-（7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基）-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）(MW:380.2,30mmol)11.4g溶于DMF，加入固相反应器内，加入N-甲基吗啉（NMM）(MW:101.2,ρ:0.92g/ml,45mmol)5ml，反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准，重复以上步骤，按照比伐卢定肽序逐一与相应的Fmoc保护或Boc保护氨基酸偶联，各Fmoc保护或Boc保护氨基酸的摩尔当量与前述Fmoc-Tyr(tBu)-OH相同，依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Boc-D-Phe-OH，制得侧链全保护比伐卢定肽-树脂，其结构如下：
Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-2-chlorotrityl树脂。
实施例7、侧链全保护比伐卢定肽-树脂的制备
称取Fmoc-Leu-2-chlorotrityl树脂25.0g（荷载量0.4mmol/g,10mmol），加入固相反应器中，加入20%的哌啶DMF溶液150ml，室温搅拌反应5min，反应完毕后抽滤，再加入20%的哌啶DMF溶液150ml，室温搅拌反应12min，反应完毕后抽滤，树脂用200ml DMF重复洗涤6次，将Fmoc-Tyr(tBu)-OH（MW：459,30mmol）13.8g、1-羟基苯并三唑（HOBt）（MW：135.1,45mmol）6.08g、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）(MW:379.2,45mmol)17.05g溶于DMF，加入固相反应器内，加入N-甲基吗啉（NMM）(MW:101.2,ρ:0.92g/ml,45mmol)5ml，反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准，重复以上步骤，依次与相应的Fmoc保护氨基酸偶联（逐一依次连接的氨基酸同实施例2），之后脱除Fmoc保护制得侧链全保护比伐卢定肽-树脂，其结构如下：
H-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-树脂。
实施例8、比伐卢定粗品的制备
配制酸解剂200ml，其中三氟乙酸190ml，三异丙基硅烷5ml，水5ml，预冷至0℃；
将实施例2制备的侧链全保护比伐卢定肽-树脂20g加入到500ml圆底烧瓶中；加入配制的酸解剂进行裂解反应，裂解反应温度在20分钟内升至25℃，并在此温度下反应2小时，过滤树脂，用少量三氟乙酸洗涤树脂，合并滤液。在剧烈搅拌下将滤液缓慢加入1.1L预冷却的乙醚内，出现白色沉淀，静置1小时后，抽滤，并用冰乙醚洗涤滤饼5次，真空干燥得到比伐卢定粗品7.5g（也称粗肽）。粗肽收率93.7%。
实施例9、比伐卢定粗品的制备
配制酸解剂400ml，其中三氟乙酸380ml，三异丙基硅烷10ml，水10ml，预冷至0℃；将实施例3制备的侧链全保护比伐卢定-树脂40g加入到1000ml圆底烧瓶中；加入配制的酸解剂进行裂解反应，裂解反应温度在20分钟内升至25℃，并在此温度下反应2小时，过滤树脂，用少量三氟乙酸洗涤树脂，合并滤液。在剧烈搅拌下将滤液缓慢加入2.2L预冷却的乙醚内，出现白色沉淀，静置1小时后，抽滤，并用冰乙醚洗涤滤饼5次，真空干燥得到比伐卢定粗品（粗肽）16.5g。粗肽收率94.6%。
实施例10、比伐卢定粗品的纯化
称取实施例9制备的比伐卢定粗品粉末8.0g，采用乙腈水溶液溶解，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，备用。
高效液相色谱法进行纯化时的条件，色谱柱：以10um的十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，柱子直径和长度为：50mm×250mm；流动相：0.1%TFA/水溶液-0.1%TFA/乙腈溶液；洗脱的流速60ml/min；采用梯度洗脱，循环进样方式上样。将上述处理的样品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰并用分析液相检测纯度，合并主峰溶液，在小于40℃水浴条件下减压浓缩，用旋转蒸发仪蒸去大部分乙腈，得比伐卢定三氟乙酸盐溶液。冷冻干燥得产品2.48g，总收率31%，产品纯度为99.6%，比伐卢定[+Gly]杂质、比伐卢定[-Gly]杂质均小于0.1%。得比伐卢定纯品。

Claims (12)

1.一种比伐卢定的制备方法，包括步骤如下：
（1）以Fmoc-Leu-Wang树脂或Fmoc-Leu-2-chlorotrityl树脂为原料，加入脱保护剂，脱除所述树脂上的Fmoc保护基；
（2）将步骤（1）脱除Fmoc保护基的树脂采用逐一偶联的方式依次连接Fmoc保护的氨基酸，所述的偶联是在活化助剂和缩合剂存在下进行的固相偶联反应，每一个偶联反应均以茚三酮检测阴性为反应终点，反应完毕用脱保护剂脱除Fmoc保护基，再与下一个Fmoc保护的氨基酸进行偶联反应；重复操作直至合成得到侧链全保护比伐卢定[9-20]肽-树脂：
Fmoc-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-树脂；
所述的各Fmoc保护的氨基酸的用量与所述树脂的用量的摩尔比为2～5:1；
（3）将步骤（2）制备的侧链全保护的比伐卢定[9-20]肽-树脂用脱保护剂脱除Fmoc保护后，再与Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH五肽片段在活化助剂和缩合剂存在下进行固相偶联反应，接入[4-8]肽脯氨酸-L-甘氨酸-L-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（Pro-Gly-Gly-Gly-Gly），得到侧链全保护比伐卢定[4-20]肽-树脂，结构如下：
Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-树脂；
所得侧链全保护比伐卢定[4-20]肽-树脂用脱保护剂脱除Fmoc保护基，再进行下一步骤；
（4）上述步骤（3）得到的脱除Fmoc保护基后的侧链全保护比伐卢定[4-20]肽-树脂采用与步骤（2）相同的逐一偶联的方式依次连接Fmoc保护的[1-3]肽，D-苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸（D-Phe-Pro-Arg），合成得到侧链全保护比伐卢定肽-树脂；其中所述苯丙氨酸D-Phe残基的引入也可以采用Boc-D-Phe-OH保护的形式；
（5）经酸解剂裂解除去侧链全保护比伐卢定肽-树脂上的树脂和保护基团，经沉淀，得到比伐卢定粗品。
2.如权利要求1所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于步骤（2）中所述的Fmoc保护的氨基酸，各种氨基酸分别以下列形式应用：
Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH。
3.如权利要求1所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于步骤（2）所述的逐一偶联的方式是：脱除Fmoc保护基的树脂与一个Fmoc保护氨基酸在活化助剂、缩合剂作用下进行固相偶联反应，反应完毕用脱保护剂脱除Fmoc保护基，所得产物再与下一个Fmoc保护氨基酸进行固相偶联反应，再脱除Fmoc保护基；重复该固相偶联反应-脱除Fmoc保护基的循环操作，按Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr序列倒序逐一依次连接Fmoc保护的氨基酸。
4.如权利要求1所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于步骤（1）所述的Fmoc-Leu-Wang树脂或Fmoc-Leu-2-chlorotrityl树脂的荷载量为0.3～1.5mmol/g；优选为0.3～0.8mmol/g。
5.如权利要求1所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于所述的脱保护剂为含20%v/v哌啶的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液；树脂与脱保护剂的摩尔体积比为1:10～50，单位：mol/L；优选树脂与脱保护剂的摩尔体积比=1:20～40mol/L；脱保护反应时间为每次10min，重复脱保护3次。
6.如权利要求1所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于步骤（2）所述的缩合剂选自N,N-二异丙基碳二亚胺（DIC）、N,N-二环己基碳二亚胺（DCC），六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷（PyBOP）、2-（7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基）-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）或O-苯并三氮唑-N,N,N’,N-四甲基脲四氟硼酸酯（TBTU）；优选为N,N-二异丙基碳二亚胺（DIC）、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）、2-（7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基）-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）；缩合剂的用量与树脂用量的摩尔比为2～6:1；所述的活化助剂选自1-羟基苯并三唑（HOBt）、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑（HOAt）；优选为1-羟基苯并三唑（HOBt）；活化助剂与树脂用量的摩尔比为2～6:1；步骤（2）中所述的固相偶联反应时间为30～150min，优选60～120min。
7.如权利要求1所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于步骤（3）所述的固相偶联反应与步骤（2）的反应条件完全相同，所用的活化助剂和缩合剂与步骤（2）相同，活化助剂和缩合剂的用量也与步骤（2）相同；步骤（3）中所述的Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH的用量与侧链全保护的比伐卢定[9-20]肽-树脂的用量的摩尔比为2～5:1；进一步优选3:1摩尔比。
8.如权利要求1所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于步骤（5）所述的酸解剂为三氟乙酸（TFA）、三异丙基硅烷（TIS）、水组成的混合物，三氟乙酸：三异丙基硅烷：水=90～95：2～5：2～5体积比；步骤（5）所述的酸解剂的用量与侧链全保护比伐卢定-树脂之比为5～20ml/g；优选酸解剂：侧链全保护比伐卢定-树脂=10：1ml/g；优选的步骤（5）所述的裂解反应时间为1～5h。
9.如权利要求1所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于还包括步骤(6)比伐卢定粗品的纯化：将所述步骤（5）得到的比伐卢定粗品经反相高效液相色谱纯化，冻干得到比伐卢定纯品。
10.如权利要求9所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于步骤(6)比伐卢定粗品的纯化方法，高效液相色谱柱参数为：色谱填料为10μm的反相C18固定相，色谱柱直径为50毫米、长度为250毫米，纯化方法步骤如下：
称取比伐卢定粗品溶于适量水中，微孔滤膜过滤，将滤液用高效液相色谱柱纯化，流动相为0.1%(v/v)三氟乙酸水溶液—0.1%(v/v)三氟乙酸乙腈溶液，梯度洗脱，循环纯化，合并主峰溶液减压浓缩，蒸除乙腈，得比伐卢定三氟乙酸盐溶液；冷冻干燥得比伐卢定纯品，产品纯度≥99.5%，产品中不含比伐卢定[-2Gly]、[+2Gly]杂质，同时比伐卢定[-Gly]、比伐卢定[+Gly]杂质含量均小于0.1%。
11.一种用于合成比伐卢定的五肽Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH，具有式I所示的结构：
Figure FDA00003216049900031
12.五肽Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH的制备方法，步骤如下：
将起始原料四聚甘氨酸、碳酸钠按摩尔比1:2溶于适量水中，加入Fmoc-Pro-OSu的1,4-二氧六环溶液，Fmoc-Pro-OSu与四聚甘氨酸摩尔比1～1.1:1，搅拌反应2～3h，TLC检测反应结束后，浓缩除去1,4-二氧六环，加入2N盐酸调节溶液pH值至2-3，析出固体，抽滤，收集固体产品，水洗，干燥后柱层析纯化得五肽片段Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH。
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