CN104072585A - 一种合成艾替班特的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药合成领域，公开了一种合成艾替班特的方法。本发明所述方法将在精氨酸N端以及侧链上偶联由保护基的保护精氨酸，在偶联试剂和活化试剂作用下和树脂载体进行酯化反应，得到肽树脂1，所述树脂载体为Wang树脂或对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂；然后按照艾替班特氨基酸序列C端到N端的顺序，从肽树脂1出发，在缩合试剂和活化试剂存在下，将保护氨基酸进行逐一延伸偶联，最终获得艾替班特树脂，然后酸解获得艾替班特粗品，艾替班特粗品纯化得到艾替班特纯品。本发明选择合适的Wang(王)树脂或对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂(HMP)，并优化了整个合成工艺，显著地提高了艾替班特的总收率，相比于现有技术提高了20％以上。

Description

一种合成艾替班特的方法
技术领域
本发明涉及医药合成领域，具体涉及一种合成艾替班特的方法。
背景技术
艾替班特，英文名为Icatibant，是由德国Jerini公司(美国为Shire plc公司)研发的一种对缓B2受体选择性的竞争拮抗剂。2011年8月艾替班特获美国FDA批准上市，商品名为Firazyr，该药为注射剂，用于18岁以上人群治疗遗传性血管水肿(HAE)的急性发作。
HAE又称C1抑制物缺乏症，是罕见的由遗传缺陷引起的常染色体显性遗传病，是由于一种称为C1抑制剂的蛋白水平低或功能障碍引起的，发病率为1/10000-1/50000。HAE其特征是不可预知的手、脚、脸、喉头和腹部的发作性水肿和肿胀，导致毁容、失能或死亡。如喉部肿胀能导致窒息，消化道水肿可引起腹痛、恶心和呕吐，肠道肿胀患者经常会出现胃部严重疼痛，恶心和呕吐。病人通常有该病的家族史。HAE病人可出现手、足、四肢、面部、肠道、喉头或气管的快速水肿，这可能而呼吸道水肿则使病人有窒息的危险。
艾替班特有相似于缓激肽的结构d合成十肽，但是，其中有5个非蛋白源的氨基酸。艾替班特的所有手性氨基酸是L-构型除了精氨酸(位1)和1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸(位8)，其分子式为C59H89N19O13S，分子量为1304.5，十个氨基酸顺序组成如下：
H-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH。
艾替班特是一种强力的选择性的缓激肽2型(B2)受体的选择性竞争性拮抗剂，通过抑制与HAE的栓塞局部肿胀、炎症、疼痛症状有关的缓激肽的影响而治疗急性HAE的栓塞局部肿胀。HAE只是艾替班特可能治疗的几种适应症的第一个，其他潜在适应症还有哮喘、肝硬化和其他类型的血管性水肿。所以说艾替班特具有很高的药用价值和广阔的市场前景。然而现有的艾替班特的制备方法仍旧主要沿用1990年左右，由德国赫切斯特股份公司发明的固相合成方法，该方法制得的艾替班特产品纯度低、杂质含量高、收率低，不适合产业化生产，应用价值低。
申请号为201210028377.9报道了直接固相合成艾替班特的方法，采用2-氯三苯基氯树脂为起始载体，但由于该树脂在接肽的过程中容易发生肽链脱落，直接影响艾替班特的总收率。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种合成艾替班特的方法，使得本发明所述方法显著提高艾替班特的总收率。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种合成艾替班特的方法，包括以下步骤：
步骤1、在精氨酸N端以及侧链上偶联有保护基的保护精氨酸，在偶联试剂和活化试剂作用下和树脂载体进行酯化反应，得到肽树脂1，所述树脂载体为Wang(王)树脂或对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂(HMP)；
步骤2、按照艾替班特氨基酸序列C端到N端的顺序，从肽树脂1出发，在缩合试剂和活化试剂存在下，将其余氨基酸进行逐一延伸偶联，每次延伸偶联后均得到对应的肽树脂，最终获得艾替班特树脂，然后酸解获得艾替班特粗品，艾替班特粗品纯化得到艾替班特纯品。
艾替班特主链氨基酸有10个，其中有5个非蛋白源的氨基酸。艾替班特的所有手性氨基酸是L-构型除了精氨酸(位1)和1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸(位8)，其分子式为C59H89N19O13S，分子量为1304.5，十个氨基酸顺序组成如下：
H-D-Arg1-Arg2-Pro3-Hyp4-Gly5-Thi6-Ser7-D-Tic8-Oic9-Arg10-OH。
本发明针对现有技术中采用的树脂载体易造成艾替班特总收率较低的缺陷，选择合适的树脂载体，并优化了整个合成工艺，本发明所述合成工艺既可以采用固相合成，也可以采用液相合成。
本发明所述保护基是在氨基酸合成领域常用的保护氨基酸主链以及侧链上氨基、羧基等干扰合成的基团的保护基团，防止氨基、羧基等在制备目标产物过程中发生反应，生成杂质，对于本发明中需要保护侧链的氨基酸来说，本领域技术人员公知其侧链结构以及知晓采用常用保护基来保护氨基酸侧链上的氨基、羧基等基团，作为优选，本发明通过tBu保护基保护羟脯氨酸、丝氨酸的侧链；通过Pdf保护基保护精氨酸的侧链。此外，在本发明所述方法涉及的氨基酸中，除D-Arg外其余氨基酸N端均优选通过Fmoc保护基进行保护，而D-Arg优选通过Boc保护基进行保护或者不保护。被保护基保护的氨基酸称为保护氨基酸，步骤1所述保护精氨酸属于保护氨基酸，。
作为优选，所述保护精氨酸为Fmoc-Arg(Pbf)-OH，而对应的肽树脂1为Fmoc-Arg(Pbf)-树脂载体。
作为优选，所述保护精氨酸和树脂载体的摩尔比为1-6:1，更优选为2.5-3.5:1。
作为优选，所述肽树脂1的取代值为0.2-1.8mmol/g肽树脂1，更优选为0.5-1.0mmol/g肽树脂1。
其余氨基酸优选为Boc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Hyp(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thi-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-Tic-OH、Fmoc-Oic-OH。
作为优选，所述缩合试剂为N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)中的一种。所述缩合试剂的摩尔用量优选为肽树脂中氨基总摩尔数的1～6倍，更优选为2.5～3.5倍。
作为优选，所述活化试剂为1-羟基苯并三唑(HOBt)或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt)。所述活化试剂的用量优选为肽树脂中氨基总摩尔数的1～6倍，更优选为2.5～3.5倍。
作为优选，所述偶联试剂为N,N-二异丙基碳二亚胺/4-二甲氨基吡啶(DIC/DMAP)双体系偶联试剂。
作为优选，所述酯化反应和延伸偶联的反应溶剂均采用DMF。
本发明所述延伸偶联是指在第一个氨基酸与树脂载体偶联后，剩余氨基酸按照艾替班特氨基酸的C端到N端的顺序逐个和前一个偶联的氨基酸发生缩合反应(主链氨基和羧基的缩合反应)进行偶联。本发明偶联时，每次延伸偶联时所述氨基酸和对应肽树脂的摩尔比优选为1-6:1，更优选为2.5-3.5:1；所述偶联反应时间优选为60～300分钟，更优选为100～140分钟。所述对应的肽树脂是指Arg和树脂载体偶联形成的肽树脂1、Oic和肽树脂1偶联形成的肽树脂2、D-Tic和肽树脂2偶联形成的肽树脂3、Ser和肽树脂3偶联形成的肽树脂4、Thi和肽树脂4偶联形成的肽树脂5、Gly和肽树脂5偶联形成的肽树脂6、Hyp和肽树脂6偶联形成的肽树脂7、Pro和肽树脂7偶联形成的肽树脂8、Arg和肽树脂8偶联形成的肽树脂9、D-Arg和肽树脂9偶联形成的艾替班特树脂。
在延伸偶联中，由于每个氨基酸N端都有保护基，因此需要先脱除N端保护基再偶联，这对本领域技术人员来说是公知常识。本发明优选用PIP/DMF(哌啶/N,N-二甲基甲酰胺)混合溶液脱除N端保护基，混合溶液中含哌啶为10～30％(V)，其余为DMF。去N端保护基试剂的用量优选为每0.05mol多肽树脂1000-1600mL；去N端保护基时间优选为10～60分钟，优选的为15～25分钟。
需要说明的是，本发明所述肽树脂指任意个数氨基酸按照艾替班特氨基酸顺序和树脂载体相连接形成的肽树脂，这其中也包括肽树脂1。
作为优选，所述酸解采用由体积百分比为80-95％的TFA、体积百分比为1-10％的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解。更优选地，用由体积百分比为90％的TFA、体积百分比为5％的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解。所述混合酸解液用量优选为每克艾替班特树脂需要4～15mL，更优选为9～11mL。所述酸解的时间优选为室温条件下1～6小时，更优选为3～4小时。
作为优选，所述纯化具体为：
艾替班特粗品，加水搅拌，用氨水调pH8.5至完全溶解，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用；
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得艾替班特纯化中间体浓缩液；
取艾替班特纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到艾替班特醋酸水溶液，冷冻干燥，得艾替班特纯品。
由本发明所述方法合成的艾替班特经HPLC检测，纯度为99％以上，最大单一杂质仅为0.10％左右，总收率为55％左右，远高于现有技术201210028377.9专利中记载的33％。。
由以上技术方案可知，本发明选择合适的Wang(王)树脂或对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂(HMP)，并优化了整个合成工艺，显著地提高了艾替班特的总收率，相比于现有技术提高了20％以上。
具体实施方式
本发明公开了一种合成艾替班特的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的的化合物和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明具体实施方式中，本发明中的氨基酸购自于成都晖蓉生物科技有限公司，所用树脂购自于上虞普尔树脂有限公司，申请文件中所用英文缩写对应的中文含义见表1。
表1英文缩写释义
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：肽树脂1的合成
将100g替代度为0.80mmol/g的Wang树脂，加入到固相反应柱中，加入DMF溶胀树脂30分钟后抽干。取155.6g Fmoc-Arg(Pbf)-OH和32.5g HOBt,用DMF溶解，加入到上述树脂中，搅拌均匀后再加入33mL DIC和3.0gDMAP，室温搅拌反应6小时，抽掉反应液，DMF洗涤3次后，DCM洗涤3次，甲醇洗涤3次，每次洗涤时间为3min，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Wang树脂，检测替代度为0.51mmol/g。
实施例2：肽树脂1的合成
将100g替代度为0.75mmol/g的HMP树脂，加入到固相反应柱中，加入DMF溶胀树脂30分钟后抽干。取145.8g Fmoc-Arg(Pbf)-OH和30.4g HOBt,用DMF溶解，加入到上述树脂中，搅拌均匀后再加入30.5mL DIC和2.8gDMAP，室温搅拌反应6小时，抽掉反应液，DMF洗涤3次后，DCM洗涤3次，甲醇洗涤3次，每次洗涤时间为3min，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Wang树脂，检测替代度为0.49mmol/g。
实施例3：肽树脂2的合成(Fmoc-Oic-OH的偶联)
取0.1mol Fmoc-Oic-OH和0.1mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.1molDIC，搅拌下慢慢加入，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的氨基酸溶液，备用；
取0.05mol实施例1的Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂(即肽树脂1，取代值约0.51mmol/g肽树脂1)，采用1000mL 20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的肽树脂1；
将活化后的氨基酸溶液加入到去Fmoc的肽树脂1中，偶联反应60～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，过滤洗涤，得肽树脂2，Fmoc-Oic-Arg(pbf)-Wang树脂。
实施例4：肽树脂2的合成(Fmoc-Oic-OH的偶联)
取0.1mol Fmoc-Oic-OH和0.1mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.1molDIC，搅拌下慢慢加入，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的氨基酸溶液，备用；
取0.05mol实施例2的Fmoc-Arg(pbf)-HMP树脂(即肽树脂1，取代值约0.6mmol/g肽树脂1)，采用1000mL 20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的肽树脂1；
将活化后的氨基酸溶液加入到去Fmoc的肽树脂1中，偶联反应60～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，过滤洗涤，得肽树脂2，Fmoc-Oic-Arg(pbf)-HMP树脂。
实施例5：肽树脂3的合成(Fmoc-D-Tic-OH的偶联)
取0.1mol Fmoc-D-Tic-OH和0.1mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.1molDIC，搅拌下慢慢加入，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的氨基酸溶液，备用；
取0.05mol实施例3的肽树脂2，采用1100mL 20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的肽树脂2；
将活化后的氨基酸溶液加入到去Fmoc的肽树脂2中，偶联反应60～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，过滤洗涤，得肽树脂3，Fmoc-D-Tic-Oic-Arg(pbf)-Wang树脂。
实施例6：肽树脂3的合成(Fmoc-D-Tic-OH的偶联)
取0.1mol Fmoc-D-Tic-OH和0.1mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.1molDIC，搅拌下慢慢加入，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的氨基酸溶液，备用；
取0.05mol实施例4的肽树脂2，采用1100mL 20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的肽树脂2；
将活化后的氨基酸溶液加入到去Fmoc的肽树脂2中，偶联反应60～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，过滤洗涤，得肽树脂3，Fmoc-D-Tic-Oic-Arg(pbf)-HMP树脂。
实施例7：肽树脂4的合成(Fmoc-Ser(tBu)-OH的偶联)
取0.1mol Fmoc-Ser(tBu)-OH和0.1mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.1mol DIC，搅拌下慢慢加入，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的氨基酸溶液，备用；
取0.05mol实施例5的肽树脂3，采用1200mL 20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的肽树脂3；
将活化后的氨基酸溶液加入到去Fmoc的肽树脂3中，偶联反应60～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，过滤洗涤，得肽树脂4，Fmoc-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(pbf)-Wang树脂。
实施例8：肽树脂4的合成(Fmoc-Ser(tBu)-OH的偶联)
取0.1mol Fmoc-Ser(tBu)-OH和0.1mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.1mol DIC，搅拌下慢慢加入，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的氨基酸溶液，备用；
取0.05mol实施例6的肽树脂3，采用1200mL 20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的肽树脂3；
将活化后的氨基酸溶液加入到去Fmoc的肽树脂3中，偶联反应60～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，过滤洗涤，得肽树脂4，Fmoc-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(pbf)-HMP树脂。
实施例9：肽树脂5的合成(Fmoc-Thi-OH的偶联)
取0.15mol Fmoc-Thi-OH和0.15mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.15mol DIC，搅拌下慢慢加入，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的氨基酸溶液，备用；
取0.05mol实施例7的肽树脂4，采用1300mL 20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的肽树脂4；
将活化后的氨基酸溶液加入到去Fmoc的肽树脂4中，偶联反应60～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，过滤洗涤，得肽树脂5，Fmoc-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(pbf)-Wang树脂。
实施例10：肽树脂5的合成(Fmoc-Thi-OH的偶联)
取0.15mol Fmoc-Ser(tBu)-OH和0.15mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.15mol DIC，搅拌下慢慢加入，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的氨基酸溶液，备用；
取0.05mol实施例8的肽树脂4，采用1300mL 20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的肽树脂4；
将活化后的氨基酸溶液加入到去Fmoc的肽树脂4中，偶联反应60～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，过滤洗涤，得肽树脂5，Fmoc-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(pbf)-HMP树脂。
实施例11：肽树脂6的合成(Fmoc-Gly-OH的偶联)
取0.15mol Fmoc-Gly-OH和0.15mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.15mol DCC，搅拌下慢慢加入，于室温环境中搅拌反应30分钟，过滤得到活化后的氨基酸溶液，备用；
取0.05mol实施例9的肽树脂5，采用1400mL 20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的肽树脂5；
将活化后的氨基酸溶液加入到去Fmoc的肽树脂5中，偶联反应60～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，过滤洗涤，得肽树脂6，Fmoc-Gly-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(pbf)-Wang树脂。
实施例12：肽树脂6的合成(Fmoc-Gly-OH的偶联)
取0.15mol Fmoc-Gly-OH和0.15mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.15mol DCC，搅拌下慢慢加入，于室温环境中搅拌反应30分钟，过滤得到活化后的氨基酸溶液，备用；
取0.05mol实施例10的肽树脂5，采用1400mL 20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的肽树脂5；
将活化后的氨基酸溶液加入到去Fmoc的肽树脂5中，偶联反应60～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，过滤洗涤，得肽树脂6，Fmoc-Gly-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(pbf)-HMP树脂。
实施例13：肽树脂7的合成(Fmoc-Hyp(tBu)-OH的偶联)
取0.15mol Fmoc-Hyp(tBu)-OH和0.15mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.14mol PyBOP，搅拌下慢慢加入，于室温环境中搅拌反应30分钟，再加入0.28mol DIPEA，混合均匀，得到活化后的氨基酸溶液，备用；
取0.05mol实施例11的肽树脂6，采用1500mL 20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的肽树脂6；
将活化后的氨基酸溶液加入到去Fmoc的肽树脂6中，偶联反应60～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，过滤洗涤，得肽树脂7，Fmoc-Hyp(tBu)-Gly-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(pbf)-Wang树脂。
实施例14：肽树脂7的合成(Fmoc-Hyp(tBu)-OH的偶联)
取0.15mol Fmoc-Hyp(tBu)-OH和0.15mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.14mol PyBOP，搅拌下慢慢加入，于室温环境中搅拌反应30分钟，再加入0.28mol DIPEA，混合均匀，得到活化后的氨基酸溶液，备用；
取0.05mol实施例12的肽树脂6，采用1500mL 20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的肽树脂6；
将活化后的氨基酸溶液加入到去Fmoc的肽树脂6中，偶联反应60～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，过滤洗涤，得肽树脂7，Fmoc-Hyp(tBu)-Gly-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(pbf)-HMP树脂。
实施例15：肽树脂8的合成(Fmoc-Pro-OH的偶联)
取0.15mol Fmoc-Pro-OH和0.15mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.14mol HATU，搅拌下慢慢加入，于室温环境中搅拌反应30分钟，再加入0.28mol DIPEA，混合均匀，得到活化后的氨基酸溶液，备用；
取0.05mol实施例13的肽树脂7，采用1600mL 20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的肽树脂7；
将活化后的氨基酸溶液加入到去Fmoc的肽树脂7中，偶联反应60～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，过滤洗涤，得肽树脂8，Fmoc-Pro-Hyp(tBu)-Gly-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(pbf)-Wang树脂。
实施例16：肽树脂8的合成(Fmoc-Pro-OH的偶联)
取0.15mol Fmoc-Pro-OH和0.15mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.14mol HATU，搅拌下慢慢加入，于室温环境中搅拌反应30分钟，再加入0.28mol DIPEA，混合均匀，得到活化后的氨基酸溶液，备用；
取0.05mol实施例14的肽树脂7，采用1600mL 20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的肽树脂7；
将活化后的氨基酸溶液加入到去Fmoc的肽树脂7中，偶联反应60～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，过滤洗涤，得肽树脂8，Fmoc-Pro-Hyp(tBu)-Gly-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(pbf)-HMP树脂。
实施例17：肽树脂9的合成(Fmoc-Arg(Pbf)-OH的偶联)
取0.15mol Fmoc-Arg(Pbf)-OH和0.15mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.14mol HBTU，搅拌下慢慢加入，于室温环境中搅拌反应30分钟，再加入0.28mol DIPEA，混合均匀，得到活化后的氨基酸溶液，备用；
取0.05mol实施例15的肽树脂8，采用1600mL 20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的肽树脂8；
将活化后的氨基酸溶液加入到去Fmoc的肽树脂8中，偶联反应60～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，过滤洗涤，得肽树脂9,Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Hyp(tBu)-Gly-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(pbf)-Wang树脂。
实施例18：肽树脂9的合成(Fmoc-Arg(Pbf)-OH的偶联)
取0.15mol Fmoc-Arg(Pbf)-OH和0.15mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.14mol HBTU，搅拌下慢慢加入，于室温环境中搅拌反应30分钟，再加入0.28mol DIPEA，混合均匀，得到活化后的氨基酸溶液，备用；
取0.05mol实施例16的肽树脂8，采用1600mL 20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的肽树脂8；
将活化后的氨基酸溶液加入到去Fmoc的肽树脂8中，偶联反应60～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，过滤洗涤，得肽树脂9，Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Hyp(tBu)-Gly-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(pbf)-HMP树脂。
实施例19：艾替班特树脂的合成(Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH的偶联)
取0.2mol Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH和0.2mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.19mol TBTU，搅拌下慢慢加入，于室温环境中搅拌反应30分钟，再加入0.38mol DIPEA，混合均匀，得到活化后的氨基酸溶液，备用；
取0.05mol实施例17的肽树脂9，采用1600mL 20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的肽树脂9；
将活化后的氨基酸溶液加入到去Fmoc的肽树脂9中，偶联反应60～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，过滤洗涤；
采用1600mL 20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得艾替班特树脂肽树脂，D-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Pro-Hyp(tBu)-Gly-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(pbf)-Wang树脂。
实施例20：艾替班特树脂的合成(Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH的偶联)
取0.2mol Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH和0.2mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.19mol TBTU，搅拌下慢慢加入，于室温环境中搅拌反应30分钟，再加入0.38mol DIPEA，混合均匀，得到活化后的氨基酸溶液，备用；
取0.05mol实施例18的肽树脂9，采用1600mL 20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的肽树脂9；
将活化后的氨基酸溶液加入到去Fmoc的肽树脂9中，偶联反应60～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，过滤洗涤；
采用1600mL 20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得艾替班特树脂肽树脂，D-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Pro-Hyp(tBu)-Gly-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(pbf)-HMP树脂。
实施例21：艾替班特粗品的制备
取实施例19制得的艾替班特肽树脂，加入体积百分比为90％的TFA、体积百分比为5％的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解(混合酸解液10mL/克艾替班特树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末即为艾替班特粗品，粗品纯度为89.3％。
实施例22：艾替班特粗品的制备
取实施例20制得的艾替班特肽树脂，加入体积百分比为85％的TFA、体积百分比为7.5％的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解(混合酸解液15mL/克艾替班特树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末即为艾替班特粗品，粗品纯度为85.8％。
实施例23：艾替班特粗品纯化
取实施例21所得艾替班特粗品，加水搅拌溶解，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用；
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得艾替班特纯化中间体浓缩液；
取艾替班特纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到艾替班特醋酸水溶液，冷冻干燥，得艾替班特纯品35.9g，总收率为55.2％，分子量：1305.2(100％M+H)，纯度：99.6％，最大单一杂质0.12％。
实施例24：艾替班特粗品纯化
取实施例22所得艾替班特粗品，加水搅拌溶解，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用；
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得艾替班特纯化中间体浓缩液；
取艾替班特纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到艾替班特醋酸水溶液，冷冻干燥，得艾替班特纯品33.1g，总收率为50.9％，分子量：1305.8(100％M+H)，纯度：99.4％，最大单一杂质0.10％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种合成艾替班特的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、在精氨酸N端以及侧链上偶联有保护基的保护精氨酸，在偶联试剂和活化试剂作用下和树脂载体进行酯化反应，得到肽树脂1，所述树脂载体为Wang树脂或对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂；
步骤2、按照艾替班特氨基酸序列C端到N端的顺序，从肽树脂1出发，在缩合试剂和活化试剂存在下，将其余氨基酸进行逐一延伸偶联，每次延伸偶联后均得到对应的肽树脂，最终获得艾替班特树脂，然后酸解获得艾替班特粗品，艾替班特粗品纯化得到艾替班特纯品。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述保护精氨酸为Fmoc-Arg(Pbf)-OH，。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述保护精氨酸和树脂载体的摩尔比为1-6:1。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述肽树脂1的取代值为0.2-1.8mmol/g肽树脂1。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，每次延伸偶联时所述氨基酸和对应肽树脂的摩尔比为1-6:1。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述缩合试剂为N,N-二异丙基碳二亚胺、N,N-二环己基碳二亚胺，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯中的一种。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述活化试剂为1-羟基苯并三唑或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述偶联试剂为N,N-二异丙基碳二亚胺/4-二甲氨基吡啶双体系偶联试剂。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述酯化反应和延伸偶联的反应溶剂均采用DMF。
10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述酸解采用由体积百分比为80-95％的TFA、体积百分比为1-10％的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解。
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