CN102532267A

CN102532267A - 一种艾替班特的制备方法

Info

Publication number: CN102532267A
Application number: CN2012100283779A
Authority: CN
Inventors: 陈大来; 潘俊锋; 马亚平; 袁建成
Original assignee: Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2012-02-09
Filing date: 2012-02-09
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2032-02-09
Also published as: CN102532267B

Abstract

本发明属于药物化学技术领域，公开了一种艾替班特的制备方法。本发明所述艾替班特的制备方法包括以下步骤：1)由Fmoc-Arg(Pbf)-OH和替代度为0.5～1.0mmol/g的2-氯三苯甲基氯树脂出发，得到Fmoc-Arg(Pbf)-CTC树脂；2)将Fmoc-Arg(Pbf)-CTC树脂采用逐一偶联的方式合成得到艾替班特-CTC树脂；3)对艾替班特-CTC树脂进行裂解得到艾替班特粗肽，纯化得到艾替班特。与现有技术相比，本发明所述制备方法操作简单、原料投入少、成本低艾替班特收率高，适合于大规模产业化生产，并且制得的艾替班特纯度高、杂质含量低，具有可观的经济实用价值和广泛的应用前景。

Description

一种艾替班特的制备方法

技术领域

本发明属于药物化学技术领域，尤其涉及一种艾替班特的制备方法。

背景技术

遗传性血管水肿(hereditary angioedema，HAE)又称C1抑制物缺乏症，是罕见的由遗传缺陷引起的常染色体显性遗传病，是由于一种称为C1抑制剂的蛋白水平低或功能障碍引起的，发病率为1/10000-1/50000。HAE其特征是不可预知的手、脚、脸、喉头和腹部的发作性水肿和肿胀，导致毁容、失能或死亡。如喉部肿胀能导致窒息，消化道水肿可引起腹痛、恶心和呕吐，肠道肿胀患者经常会出现胃部严重疼痛，恶心和呕吐。病人通常有该病的家族史。HAE病人可出现手、足、四肢、面部、肠道、喉头或气管的快速水肿，这可能而呼吸道水肿则使病人有窒息的危险。

艾替班特，英文名Firazyr，是由Shire公司研发的HAE专治药物，于2011年8月25日获FDA批准用于18岁及以上成年人的遗传性血管水肿急性发作治疗，也是FDA批准的第3个用于治疗HAE发作的药物。艾替班特有相似于缓激肽的结构d合成十肽，但是，其中有5个非蛋白源的氨基酸。艾替班特的所有手性氨基酸是L-构型除了精氨酸(位1)和1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸(位8)，其分子式为C₅₉H₈₉N₁₉O₁₃S，分子量为1304.5，十个氨基酸顺序组成如下：

H-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH。

艾替班特是一种强力的选择性的缓激肽2型(B2)受体的选择性竞争性拮抗剂，通过抑制与HAE的栓塞局部肿胀、炎症、疼痛症状有关的缓激肽的影响而治疗急性HAE的栓塞局部肿胀。HAE只是艾替班特可能治疗的几种适应症的第一个，其他潜在适应症还有哮喘、肝硬化和其他类型的血管性水肿。所以说艾替班特具有很高的药用价值和广阔的市场前景。然而现有的艾替班特的制备方法仍旧主要沿用1990年左右，由德国赫切斯特股份公司发明的固相合成方法，该方法制得的艾替班特产品纯度低、杂质含量高、收率低，不适合产业化生产，应用价值低。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种艾替班特的制备方法，所述制备方法艾替班特的收率高，制得的艾替班特的杂质含量低、纯度高，适合于产业化生产。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种艾替班特的制备方法，包括以下步骤：

1)由Fmoc-Arg(Pbf)-OH和替代度为0.5～1.0mmol/g的2-氯三苯甲基氯树脂出发，得到Fmoc-Arg(Pbf)-CTC树脂；

2)将Fmoc-Arg(Pbf)-CTC树脂采用逐一偶联的方式合成得到艾替班特-CTC树脂；

3)最后对艾替班特-CTC树脂进行裂解得到艾替班特粗肽，纯化得到艾替班特。

优选的，所述艾替班特的制备方法步骤1)所述Fmoc-Arg(Pbf)-CTC树脂是Fmoc-Arg(Pbf)-OH与2-氯三苯甲基氯树脂在碱性条件的作用下生成的。具体的是2-氯三苯甲基氯树脂经过DMF或DCM浸泡溶胀，然后加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH，在碱性条件的作用下反应制得Fmoc-Arg(Pbf)-CTC树脂。其中，所述碱性条件的作用优选为二异丙基乙胺的作用。

进一步的，所述2-氯三苯甲基氯树脂的替代度优选为0.8～1.0mmol/g，更优选为0.9mmol/g。

本发明所述制备方法步骤2)通过多肽固相合成法采用从C端向N端逐一偶联的方式从Fmoc-Arg(Pbf)-CTC树脂N端逐个加入氨基酸合成艾替班特-CTC树脂。其中，所述逐一偶联方式所使用的偶联剂优选为二异丙基碳二亚胺和化合物A混合物或化合物A、化合物B和化合物C的混合物，其中所述化合物A为1-羟基苯并三唑或1-羟基-7-偶氮苯并三唑，所述化合物B为O-苯并三唑-N，N，N，N-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、O-(7-偶氮苯并三氮唑-1-氧)-N，N，N，N-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸盐、O-(苯并三唑-1-氧)-N，N，N，N-四甲基脲鎓六氟硼酸盐或(苯并三唑-1-氧)三吡咯烷子基磷鎓六氟磷酸盐，所述化合物C为二异丙基乙胺或2，4，6-三甲基吡啶。

进一步地，上述二异丙基碳二亚胺和化合物A的混合物中二异丙基碳二亚胺与化合物A的物质的量比优选为1∶1～1.5∶1，更优选为1.3∶1。

进一步地，上述化合物A、化合物B和化合物C的混合物中化合物A与化合物B和化合物C的物质的量优选比为1～1.5∶1∶1，更优选为1.2∶1∶1。

本发明所述逐一偶联的Fmoc保护基团的氨基酸分别为Fmoc-Oic-OH、Fmoc-D-Cit-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thi-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Hyp(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH和Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH。

本发明所述制备方法步骤3)通过裂解剂对艾替班特-CTC树脂进行裂解，得到艾替班特粗肽。其中，所述裂解剂优选为三氟乙酸、三异丙基硅烷和水的混合物。

进一步地，上述裂解剂中三氟乙酸与三异丙基硅烷和水的体积比为90～95∶3～5∶2～5，更优选为95∶3∶2。

本发明所述制备方法步骤3)裂解得到的艾替班特粗肽进一步纯化得到艾替班特，所述纯化优选为反相高效液相色谱纯化。

反相高效液相色谱，英文名reversed phase high performance liquidchromatography，简称，RP-HPLC，是由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系。它正好与由极性固定相和弱极性流动相所组成的液相色谱体系(正相色谱)相反。RP-HPLC是当今液相色谱的最主要的分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物的分离纯化。本发明所述制备方法将步骤3裂解得到的艾替班特粗肽采用反相高效液相色谱法转成醋酸盐溶液。

优选的，所述反相高效液相色谱法具体为：以反相十八烷基硅烷或八烷基硅烷键合硅胶为固定相，裂解得到的艾替班特粗肽溶液上样后，用0.1％醋酸溶液/乙腈流动相转盐，冻干即得。

与现有技术相比，本发明所述制备方法操作简单、原料投入少、成本低艾替班特收率高，适合于大规模产业化生产，并且制得的艾替班特纯度高、杂质含量低，具有可观的经济实用价值和广泛的应用前景。

附图说明

图1示本发明实施例的制备方法的流程图。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种艾替班特的制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义列于下表中：

Fmoc	N-芴甲氧羰基
		HBTU	O-苯并三唑-N，N，N，N-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
HATU	O-(7-偶氮苯并三氮唑-1-氧)-N，N，N，N-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
		TATU	2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸盐
TBTU	O-(苯并三唑-1-氧)-N，N，N，N-四甲基脲鎓六氟硼酸盐
		PyBOP	(苯并三唑-1-氧)三吡咯烷子基磷鎓六氟磷酸盐
DIC	二异丙基碳二亚胺
		HOBt	1-羟基苯并三唑
HOAt	1-羟基-7-偶氮苯并三唑
		DIPEA	二异丙基乙胺
TMP	2，4，6-三甲基吡啶
		DMAP	4-甲氨基吡啶
tBu	叔丁基
		DMF	N，N-二甲基甲酰胺

DCM	二氯甲烷
		DBLK	六氢吡啶/DMF溶液

实施例1：Fmoc-Arg(Pbf)-CTC树脂的制备

将11.1g替代度为0.9mmol/g的2-氯三苯甲基氯树脂，加入到固相反应柱中，加入DMF溶胀树脂30分钟。向12.98g Fmoc-Arg(Pbf)-OH中加入3.50mLDIPEA，活化5min，然后加入DMF溶胀的树脂中反应平衡10min，再加入3.50mLDIPEA，室温反应45min后，加入甲醇封闭20min。抽掉反应液，DMF洗涤3次后，DCM洗涤3次，然后用甲醇收缩3次，3次时间分别为3min、5min、8min，得到Fmoc-Arg(Pbf)-CTC树脂，检测替代度为0.5mmol/g。

实施例2：Fmoc-Oic-OH的偶联

称取10mmol Fmoc-Arg(Pbf)-CTC树脂加入固相反应器中，用DMF溶胀0.5h，再用20％DBLK脱除Fmoc保护两次，每次时间分别为10min和5min，洗涤后连接Fmoc-Oic-OH。将11.73g Fmoc-Oic-OH、4.9g HOBt和6.1mL DIC溶于DCM中(可以加入少量DMF助溶)，冰水浴活化7min后，加入固相反应器中，室温反应1～2h，反应终点以茚三酮法检测为准。反应结束后，抽掉反应液，DMF洗涤，再用20％DBLK脱除Fmoc保护两次，每次时间分别为10min和5min，洗涤后准备偶联下一个氨基酸。

实施例3：Fmoc-D-Cit-OH的偶联

将11.91g Fmoc-D-Cit-OH、5.00g HOAt和11.4gHATU溶于DCM中(可以加入少量DMF助溶)，冰水浴下加入3.87gDIPEA活化7min后，加入固相反应器中，室温反应1～2h，反应终点以茚三酮法检测为准。反应结束后，抽掉反应液，DMF洗涤，再用20％DBLK脱除Fmoc保护，洗涤后准备偶联下一个氨基酸。

实施例4：Fmoc-Ser(tBu)-OH的偶联

将11.49g Fmoc-Ser(tBu)-OH、5.00g HOAt和6.1mL DIC溶于DCM中(可以加入少量DMF助溶)，冰水浴下活化7min后，加入固相反应器中，室温反应1～2h，反应终点以茚三酮法检测为准。反应结束后，抽掉反应液，DMF洗涤，再用20％DBLK脱除Fmoc保护，洗涤后准备偶联下一个氨基酸。

实施例5：Fmoc-Thi-OH的偶联

将11.79g Fmoc-Thi-OH、5.00g HOBt和11.37gHBTU溶于DCM中(可以加入少量DMF助溶)，冰水浴下加入3.87gDIPEA活化7min后，加入固相反应器中，室温反应1～2h，反应终点以茚三酮法检测为准。反应结束后，抽掉反应液，DMF洗涤，再用20％DBLK脱除Fmoc保护，洗涤后准备偶联下一个氨基酸。

实施例6：Fmoc-Gly-OH的偶联

将8.91g Fmoc-Gly-OH、5.00g HOBt和9.63gTBTU溶于DCM中(可以加入少量DMF助溶)，冰水浴下加入3.63gTMP活化7min后，加入固相反应器中，室温反应1～2h，反应终点以茚三酮法检测为准。反应结束后，抽掉反应液，DMF洗涤，再用20％DBLK脱除Fmoc保护，洗涤后准备偶联下一个氨基酸。

实施例7：Fmoc-Hyp(tBu)-OH的偶联

将12.27g Fmoc-Hyp(tBu)-OH、5.00g HOAt和9.66gTATU溶于DCM中(可以加入少量DMF助溶)，冰水浴下加入3.63gTMP活化7min后，加入固相反应器中，室温反应1～2h，反应终点以茚三酮法检测为准。反应结束后，抽掉反应液，DMF洗涤，再用20％DBLK脱除Fmoc保护，洗涤后准备偶联下一个氨基酸。

实施例8：Fmoc-Pro-OH的偶联

将10.11g Fmoc-Pro-OH、5.00g HOAt和11.4gHATU溶于DCM中(可以加入少量DMF助溶)，冰水浴下加入3.87gDIPEA活化7min后，加入固相反应器中，室温反应1～2h，反应终点以茚三酮法检测为准。反应结束后，抽掉反应液，DMF洗涤，再用20％DBLK脱除Fmoc保护，洗涤后准备偶联下一个氨基酸。

实施例9：Fmoc-Arg(Pbf)-OH的偶联

将19.44g Fmoc-Arg(Pbf)-OH、5.00g HOAt和11.4gHATU溶于DCM中(可以加入少量DMF助溶)，冰水浴下加入3.87gDIPEA活化7min后，加入固相反应器中，室温反应1～2h，反应终点以茚三酮法检测为准。反应结束后，抽掉反应液，DMF洗涤，再用20％DBLK脱除Fmoc保护，洗涤后准备偶联下一个氨基酸。

实施例10：Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH的偶联

将19.44g Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、5.00g HOAt和11.4gHATU溶于DCM中(可以加入少量DMF助溶)，冰水浴下加入3.87gDIPEA活化7min后，加入固相反应器中，室温反应1～2h，反应终点以茚三酮法检测为准。反应结束后，抽掉反应液，DMF洗涤，再用20％DBLK脱除Fmoc保护，DMF洗涤3次，DCM洗3次，用甲醇收缩3次，时间分别为3min、5min、8min，真空干燥，得到艾替班特肽树脂。

实施例11：艾替班特肽树脂裂解

配制裂解试剂200mL，其中三氟乙酸190mL，三异丙基硅烷6mL，水4mL放入冰箱中预冷30min。将20.0g艾替班特肽树脂加入到500mL圆底烧瓶中，然后将配制的200mL裂解试剂倒入树脂中，搅拌的同时冰浴，通入氮气，反应30min后撤走冰浴，室温下继续反应2h，过滤树脂，收集滤液。用少量三氟乙酸洗涤树脂，过滤，合并滤液。将滤液缓慢加入20L冰乙醚中，出现白色沉淀，3000转/分钟离心收集沉淀，冰乙醚洗涤5次后，减压干燥得到粗肽10.3g，HPLC检测纯度＞90％。

实施例12：艾替班特精肽的制备

把艾替班特粗肽(实施例10得到)10.3g用400mL水溶解后，采用Waters 2545 RP-HPLC系统，波长230nm，色谱柱为50×250mm反相C18柱，0.1％TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于98％精肽。将精肽溶液采用Waters 2545 RP-HPLC系统，色谱柱为50×250mm反相C18柱，0.1％醋酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到5.1g醋酸艾替班特精肽。HPLC纯度：99.35％，总收率35％。

实施例13：艾替班特精肽的规模化制备

把艾替班特粗肽100g用4000mL水溶解后，采用北京创新通恒LC6000系统，波长230nm，色谱柱为15×30cm反相C18柱，0.1％TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于98％精肽。将精肽溶液采用北京创新通恒LC6000系统，色谱柱为15×30cm反相C18柱，0.1％醋酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到48.5g醋酸艾替班特精肽。HPLC纯度：99.3％，总收率33％

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种艾替班特的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1)所述Fmoc-Arg(Pbf)-CTC树脂是Fmoc-Arg(Pbf)-OH和2-氯三苯甲基氯树脂在碱性条件的作用下生成的。

3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述碱性条件的作用为二异丙基乙胺的作用。

4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤2)所述逐一偶联方式的偶联剂为二异丙基碳二亚胺和化合物A的混合物或化合物A、化合物B和化合物C的混合物，其中所述化合物A为1-羟基苯并三唑或1-羟基-7-偶氮苯并三唑，所述化合物B为O-苯并三唑-N，N，N，N-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、O-(7-偶氮苯并三氮唑-1-氧)-N，N，N，N-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸盐、O-(苯并三唑-1-氧)-N，N，N，N-四甲基脲鎓六氟硼酸盐或(苯并三唑-1-氧)三吡咯烷子基磷鎓六氟磷酸盐，所述化合物C为二异丙基乙胺或2，4，6-三甲基吡啶。

5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述二异丙基碳二亚胺和化合物A的混合物中二异丙基碳二亚胺与化合物A的物质的量比为1∶1～1.5∶1。

6.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述化合物A、化合物B和化合物C的混合物中化合物A与化合物B和化合物C的物质的量比为1～1.5∶1∶1。

7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤3)所述裂解的裂解剂为三氟乙酸、三异丙基硅烷和水的混合物。

8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述三氟乙酸与三异丙基硅烷和水的体积比为90～95∶3～5∶2～5。

9.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤3)所述纯化为反相高效液相色谱纯化。