CN104817631B - 一种合成西那普肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药合成领域，公开了一种合成西那普肽的方法。本发明所述方法按照西那普肽主链C端至N端的氨基酸顺序，交替合成Lys和(Leu)4，最终获得西那普肽。本发明所述方法调整西那普肽的合成工艺，以较简便的工艺步骤将西那普肽的总收率提高了一个阶段，且能够保证纯度在较高的水平，同时严格控制了最大单一杂质含量，相比现有技术更加具有实用价值和应用前景。

Description

一种合成西那普肽的方法
技术领域
本发明涉及医药合成领域，具体涉及一种合成西那普肽的方法。
背景技术
西那普肽是一种人工设计的21肽，于2012年3月被美国FDA批准上市，临床用于治疗新生儿呼吸窘迫综合征，其氨基酸肽序如下：
H-Lys1-Leu2-Leu3-Leu4-Leu5-Lys6-Leu7-Leu8-Leu9-Leu10-Lys11-Leu12-Leu13-Leu14-Leu15-Lys16-Leu17-Leu18-Leu19-Leu20-Lys21-OH
新生儿呼吸窘迫综合征，又称新生儿肺透明膜病，指新生儿出生后不久即出现进行性呼吸困难和呼吸衰竭等症状，主要是由于缺乏肺泡表面活性物质所引起，导致肺泡进行性萎陷，患儿于生后4～12小时内出现进行性呼吸困难、呻吟、发绀、吸气三凹征，严重者发生呼吸衰竭。发病率与胎龄有关，胎龄越小，发病率越高，体重越轻病死率越高。
现有关于西那普肽的合成方法国内外均有报道。美国专利US5260273采用基因工程进行制备，该方法工艺成本较高且繁琐。限制了西那普肽的生产效率。为此，我国专利CN102850440A以及CN104098656A均公开了一种西那普肽的合成方法，以此降低成本和工艺繁琐程度。其中CN104098656A公开的是按照西那普肽C端到N端的肽序逐一合成的技术方案，但是这种合成策略一方面周期长，另一方面总收率较低，为47.9％；CN102850440A公开了一种片段合成策略，但是根据其记载的技术方案合成的多肽和最终的西那普肽并不一致，而且其总收率更低，仅为40％。
不同的合成策略对最终产品的纯度、杂质含量和收率有很大影响，如何在保证纯度和收率的前提下，尽可能的降低合成工艺的复杂程度、杂质以及缩短合成周期，是当下技术人员的研究重点。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种合成西那普肽的方法，使得本发明所述方法能够显著提高西那普肽合成的总收率，并保证西那普肽具有较高纯度和较低的单一杂质含量，同时缩短合成周期。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种合成西那普肽的方法，包括以下步骤：
步骤1、将保护的Lys与树脂偶联，获得在Lys的N端及其侧链上偶联有保护基、在其C端偶联有树脂的肽树脂1；
步骤2、将在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端偶联有保护基的多肽片段1的C端与肽树脂1的N端进行偶联，而后将保护的Lys再与片段1的N端偶联，获得在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列N端、Lys侧链上偶联有保护基，在C端偶联有树脂的肽树脂2；
步骤3、将在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端偶联有保护基的多肽片段1的C端与肽树脂2的N端进行偶联，而后将保护的Lys再与片段1的N端偶联，获得在SEQ ID NO:3所示氨基酸序列N端、Lys侧链上偶联有保护基，在C端偶联有树脂的肽树脂3；
步骤4、将在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端偶联有保护基的多肽片段1的C端与肽树脂3的N端进行偶联，而后将保护的Lys再与片段1的N端偶联，获得在SEQ ID NO:4所示氨基酸序列N端、Lys侧链上偶联有保护基，在C端偶联有树脂的肽树脂4；
步骤5、将在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端偶联有保护基的多肽片段1的C端与肽树脂4的N端进行偶联，而后将保护的Lys再与片段1的N端偶联，获得在SEQ ID NO:5所示氨基酸序列N端、Lys侧链上偶联有保护基，在C端偶联有树脂的西那普肽树脂；
步骤6、西那普肽树脂酸解脱除C端树脂和所有保护基得到西那普肽粗品，粗品纯化转醋酸盐，获得西那普肽成品。
西那普肽主链氨基酸有21个，采用片段方法进行合成存在很多种形式，但只有合适的片段方法才能保证较高的西那普肽的总收率以及纯度，同时又能降低杂质的产生。为此，申请人根据长期的试验研究，提出了本发明所述方法来制备西那普肽，在保证纯度的前提下，进一步提高总收率以及降低合成方法的杂质的产生。
在本发明所述方法中，按照西那普肽主链C端至N端的氨基酸顺序交替合成Lys和(Leu)4，以西那普肽主链N端到C端的氨基酸顺序编号，如下式：
H-Lys1-Leu2-Leu3-Leu4-Leu5-Lys6-Leu7-Leu8-Leu9-Leu10-Lys11-Leu12-Leu13-Leu14-Leu15-Lys16-Leu17-Leu18-Leu19-Leu20-Lys21-OH
SEQ ID NO:1所示氨基酸序列即为上式中编号2-5、7-10、12-15、17-20的多肽序列，SEQ ID NO:2所示氨基酸序列即为上式中编号16-21的多肽序列，SEQ ID NO:3所示氨基酸序列即为上式中编号11-21的多肽序列，SEQ ID NO:4所示氨基酸序列即为上式中编号6-21的多肽序列，SEQ ID NO:5所示氨基酸序列即为上式中编号1-21的多肽序列。
本发明合成的肽树脂2是在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列基础上，在其N端、Lys侧链上分别偶联有保护基，在其C端偶联有树脂；合成的肽树脂3是在SEQ ID NO:3所示氨基酸序列基础上，在其N端、Lys侧链上分别偶联有保护基，在其C端偶联有树脂；合成的肽树脂4是在SEQ ID NO:4所示氨基酸序列基础上，在在其N端、Lys侧链上分别偶联有保护基，在其C端偶联有树脂；合成的西那普肽树脂是在SEQ ID NO:5所示氨基酸序列基础上，在其N端、Lys侧链上分别偶联有保护基，在其C端偶联有树脂；
本发明所述保护基是在氨基酸合成领域常用的保护氨基酸主链以及侧链上氨基、羧基等干扰合成的基团的保护基团，防止氨基、羧基等在制备目标产物过程中发生反应，生成杂质，而被保护基保护的氨基酸称为保护氨基酸，如保护的Lys。对于本发明中需要保护侧链的氨基酸来说，本领域技术人员公知其侧链结构以及知晓采用常用保护基来保护氨基酸侧链上的氨基、羧基等基团，作为优选，本发明以Fmoc保护基保护Lys以及(Leu)4的N端，以Boc保护基保护Lys的侧链。
在合成肽树脂1中，保护的Lys与树脂偶联所形成的肽树脂取代值优选为0.2～1.0mmol/g肽树脂，更优选的取代值为0.3～0.5mmol/g肽树脂。
本发明偶联时，每个保护氨基酸或多肽片段用量优选为肽树脂摩尔数的1-6倍，更优选为2.5-3.5倍；所述偶联反应时间优选为60～300分钟，更优选为100～140分钟。
在偶联中，由于每个氨基酸N端都有保护基，因此需要先脱除N端保护基再偶联，这对本领域技术人员来说是公知常识。本发明优选用PIP/DMF(哌啶/N,N-二甲基甲酰胺)混合溶液脱除N端保护基，混合溶液中含哌啶为10～30％(V)，其余为DMF。去N端保护基试剂的用量为每克肽树脂5～15mL，更优选的为每克肽树脂8～12mL；去N端保护基时间为10～60分钟，优选的为15～25分钟。
需要说明的是，本发明所述肽树脂指任意个数保护氨基酸或氨基酸按照西那普肽氨基酸顺序和树脂相连接形成的肽树脂，这其中不仅包括独立权利要求中的肽树脂1-4、西那普肽树脂，还包括在合成肽树脂1-4、西那普肽树脂过程中形成的肽树脂。
作为优选，所述树脂为Trityl-Cl(三苯甲基氯)类树脂或羟基类树脂。更优选地，所述Trityl-Cl类树脂为Trityl-Cl树脂、4-Methyltrityl-Cl(4-甲基三苯甲基氯)树脂、4-Methoxytrityl-Cl(4-甲氧基三苯甲基氯)树脂或2-Cl Trity-Cl(2-氯三苯甲基氯)树脂；所述羧基类树脂为Wang(王)树脂或HMP(对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯)树脂。
作为优选，步骤1所述偶联采用偶联试剂偶联，所述偶联试剂为N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、N,N-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑/4-N,N-二甲基吡啶(DIC/HOBt/DMAP)两种之一。其中，进一步优选地，当树脂载体为Trityl-Cl类树脂时，保护氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH与载体树脂的偶联方法为：保护氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH的羧基与树脂中的Cl-代烷基在DIPEA的作用下发生酯化反应而接入保护氨基酸；当载体树脂为羟基类型树脂时，Fmoc-Lys(Boc)-OH与载体树脂的偶联方法为：Fmoc-Lys(Boc)-OH的羧基与树脂中的羟基在DIC/HOBt/DMAP的作用下发生酯化反应而接入保护氨基酸。
作为优选，步骤2至步骤5所述偶联均采用缩合试剂和活化试剂偶联，所述缩合试剂优选为N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷/有机碱(PyBOP/有机碱)、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯/有机碱(HATU/有机碱)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐/有机碱(HBTU/有机碱)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯/有机碱(TBTU/有机碱)中的一种。所述缩合试剂的摩尔用量优选为肽树脂中总摩尔数的1～6倍，更优选为2.5～3.5倍。所述活化试剂为1-羟基苯并三唑(HOBt)或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt)。所述活化试剂的用量优选为肽树脂中总摩尔数的1～6倍，更优选为2.5～3.5倍。
需要说明的是，所述PyBOP/有机碱、HATU/有机碱、HBTU/有机碱、TBTU/有机碱，在本发明中属于四种双体系的缩合试剂，即PyBOP、HATU、HBTU在使用时需要分别和有机碱组合在一起成为一种缩合试剂使用，其中所述有机碱和PyBOP、HATU、HBTU、TBTU的摩尔比优选为为1.3-3.0:1，更优选为1.3-2:1。
作为优选，所述有机碱为N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、三乙胺(TEA)或N-甲基吗啡啉(NMM),更优选为DIPEA。
在本发明合成过程中，优选采用DMF溶剂来溶解。
除上述列举的合成方法，本发明也可以采用液相合成法按照本发明片段合成策略进行合成。
在本发明所述方法步骤6中，作为优选方案，步骤6所述酸解采用由体积百分比为80-95％的TFA、体积百分比为1-10％的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解。更优选地，用由体积百分比为90％的TFA、体积百分比为5％的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解。所述混合酸解液用量优选为每克西那普肽树脂需要4～15mL，更优选为9～11mL。所述酸解的时间优选为室温条件下1～6小时，更优选为3～4小时。
作为优选，所述纯化转醋酸盐具体为：
西那普肽粗品溶解后采用高效液相色谱法进行纯化，获得西那普肽纯化中间体浓缩液，然后以流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，以高效液相色谱法进行转醋酸盐。
更优选地，西那普肽粗品，用水溶解，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用；
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得西那普肽纯化中间体浓缩液；
取西那普肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min(可根据不同规格的色谱柱，调整相应的流速)；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到西那普肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得西那普肽成品。
由本发明所述方法合成的西那普肽经HPLC检测，粗肽纯度在76.1％-83.1％，纯化后成品纯度在99％以上，总收率在52.3％-57.1％，最大单一杂质在0.1％左右。与现有技术CN102850440A以及CN104098656A相比，本发明将西那普肽的总收率提高了一个阶段，且能够保证纯度在较高的水平，同时严格控制了最大单一杂质含量。
由以上技术方案可知，本发明所述方法调整西那普肽的合成工艺，以较简便的工艺步骤将西那普肽的总收率提高了一个阶段，且能够保证纯度在较高的水平，同时严格控制了最大单一杂质含量，相比现有技术更加具有实用价值和应用前景。
具体实施方式
本发明公开了一种合成西那普肽的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的的化合物和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明具体实施方式中，所有偶联由保护基的氨基酸均可通过市售获得，本发明中的保护氨基酸购自于成都晖蓉生物科技有限公司，所用树脂购自于上虞普尔树脂有限公司，其中本发明所述多肽片段1、多肽片段2也可以通过市售获得，申请文件中所用英文缩写对应的中文含义见表1。
表1英文缩写释义
英文缩写 中文名称 英文缩写 中文名称
Fmoc 9-芴甲氧羰基 Boc 叔丁氧羰酰基
Lys 赖氨酸 Leu 亮氨酸
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：Fmoc-Lys(Boc)-2-Cl Trt-树脂(肽树脂1)的合成
取500g取代值为0.6mmol/g的2-Cl Trt-Cl树脂，加入DMF溶胀树脂。取0.6molFmoc-Lys(Boc)-OH，用适量DMF溶解，加入到上述树脂中，搅拌均匀后再加入1.2mol DIPEA，搅拌反应3小时，抽掉反应液，DMF洗涤3次后，DCM洗涤3次，得到Fmoc-Lys(Boc)-2-Cl Trt-树脂，检测取代值为0.45mmol/g。
实施例2：Fmoc-Lys(Boc)-Wang树脂(肽树脂1)的合成
取500g取代值为0.7mmol/g的Wang树脂，加入DMF溶胀树脂。取0.7mol Fmoc-Lys(Boc)-OH，用适量DMF溶解，加入到上述树脂中，搅拌均匀后再加入0.7mol DIC、0.7molHOBt、0.07mol 4-N,N-二甲基吡啶，搅拌反应6小时，抽掉反应液，DMF洗涤3次后，DCM洗涤3次，得到Fmoc-Lys(Boc)-Wang树脂，检测取代值为0.51mmol/g。
实施例3：西那普肽树脂的合成
取0.1mol实施例1的Fmoc-Lys(Boc)-2-Cl Trt-树脂(取代值约0.45mmol/g)，用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得到去Fmoc的H-Lys(Boc)-2-Cl Trt-树脂。
(1)接入保护的(Leu)4-OH(多肽片段1)
取0.25mol Fmoc-(Leu)4-OH和0.25mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.25mol DIC，搅拌下慢慢加入，搅拌反应30分钟，加入到上述H-Lys(Boc)-2-Cl Trt-树脂中，偶联反应120～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，洗涤过滤，再用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得H-(Leu)4-Lys(Boc)-2-Cl Trt-树脂。
(2)接入保护的Lys
取0.25mol Fmoc-Lys(Boc)-OH和0.25mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.25molDIC，搅拌下慢慢加入，搅拌反应30分钟，加入到上述H-(Leu)4-Lys(Boc)-2-Cl Trt-树脂中，偶联反应120～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，洗涤过滤，获得肽树脂2，即Fmoc-Lys(Boc)-(Leu)4-Lys(Boc)-2-Cl-Trt-树脂，再用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得H-Lys(Boc)-(Leu)4-Lys(Boc)-2-Cl-Trt-树脂，准备下一次的偶联。
按照西那普肽主链C端至N端的氨基酸顺序，再进行3次(1)和(2)的循环，交替合成Lys和(Leu)4，期间依次获得肽树脂2、肽树脂3和肽树脂4，最终得到西那普肽树脂：
Fmoc-Lys(Boc)-(Leu)4-Lys(Boc)-(Leu)4-Lys(Boc)-(Leu)4-Lys(Boc)-(Leu)4-Lys(Boc)-2-Cl Trt-树脂。
实施例4：西那普肽树脂的合成
取0.1mol实施例1的Fmoc-Lys(Boc)-2-Cl Trt-树脂(取代值约0.45mmol/g)，用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得到去Fmoc的H-Lys(Boc)-2-Cl Trt-树脂。
(1)接入保护的(Leu)4-OH(多肽片段1)
取0.25mol Fmoc-(Leu)4-OH和0.25mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.24molHTBU，搅拌下慢慢加入，搅拌反应30分钟后加入0.48molDIEA，混匀后加入到上述H-Lys(Boc)-2-Cl Trt-树脂中，偶联反应120～180分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，洗涤过滤，再用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得H-(Leu)4-Lys(Boc)-2-Cl Trt-树脂。
(2)接入保护的Lys
取0.25mol Fmoc-Lys(Boc)-OH和0.25mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.24molHBTU，搅拌下慢慢加入，搅拌反应30分钟后加入0.48molDIPEA，混匀后加入到上述H-(Leu)4-Lys(Boc)-2-Cl Trt-树脂中，偶联反应120～180分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，洗涤过滤，获得肽树脂2，即Fmoc-Lys(Boc)-(Leu)4-Lys(Boc)-2-Cl-Trt-树脂，再用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，H-Lys(Boc)-(Leu)4-Lys(Boc)-2-Cl-Trt-树脂，准备下一次的偶联。
按照西那普肽主链C端至N端的氨基酸顺序，再进行3次(1)和(2)的循环，交替合成Lys和(Leu)4，期间依次获得肽树脂2、肽树脂3和肽树脂4，最终得到西那普肽树脂：
Fmoc-Lys(Boc)-(Leu)4-Lys(Boc)-(Leu)4-Lys(Boc)-(Leu)4-Lys(Boc)-(Leu)4-Lys(Boc)-2-Cl Trt-树脂。
实施例5：西那普肽树脂的合成
取0.1mol实施例2的Fmoc-Lys(Boc)-Wang-树脂(取代值约0.51mmol/g)，用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得到去Fmoc的H-Lys(Boc)-Wang-树脂；
(1)接入保护的(Leu)4-OH(多肽片段1)
取0.25mol Fmoc-(Leu)4-OH和0.25mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.25mol DIC，搅拌下慢慢加入，搅拌反应30分钟，加入到上述H-Lys(Boc)-Wang-树脂中，偶联反应120～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，洗涤过滤，再用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得H-(Leu)4-Lys(Boc)-Wang-树脂。
(2)接入保护的Lys
取0.25mol Fmoc-Lys(Boc)-OH和0.25mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.25molDIC，搅拌下慢慢加入，搅拌反应30分钟，加入到上述H-(Leu)4-Lys(Boc)-Wang-树脂中，偶联反应120～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，洗涤过滤，获得肽树脂2，即Fmoc-Lys(Boc)-(Leu)4-Lys(Boc)-Wang-树脂，再用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得H-Lys(Boc)-(Leu)4-Lys(Boc)-Wang-树脂，准备下一次的偶联。
按照西那普肽主链C端至N端的氨基酸顺序，再进行3次(1)和(2)的循环，交替合成Lys和(Leu)4，期间依次获得肽树脂2、肽树脂3和肽树脂4，最终得到西那普肽树脂：
Fmoc-Lys(Boc)-(Leu)4-Lys(Boc)-(Leu)4-Lys(Boc)-(Leu)4-Lys(Boc)-(Leu)4-Lys(Boc)-Wang-树脂。
实施例6：西那普肽树脂的合成
取0.1mol实施例2的Fmoc-Lys(Boc)-Wang-树脂(取代值约0.45mmol/g)，用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得到去Fmoc的H-Lys(Boc)-Wang-树脂；
(1)接入保护的(Leu)4-OH(多肽片段1)
取0.25mol Fmoc-(Leu)4-OH和0.25mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.24molHTBU，搅拌下慢慢加入，搅拌反应30分钟后加入0.48molDIPEA，混匀后加入到上述H-Lys(Boc)-Wang-树脂中，偶联反应120～180分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，洗涤过滤，再用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得H-(Leu)4-Lys(Boc)-Wang-树脂。
(2)接入保护的Lys
取0.25mol Fmoc-Lys(Boc)-OH和0.25mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.24molHBTU，搅拌下慢慢加入，搅拌反应30分钟后加入0.48molDIPEA，混匀后加入到上述H-(Leu)4-Lys(Boc)-Wang-树脂中，偶联反应120～180分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，洗涤过滤，获得肽树脂2，即Fmoc-Lys(Boc)-(Leu)4-Lys(Boc)-Wang-树脂，再用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得H-Lys(Boc)-(Leu)4-Lys(Boc)-Wang-树脂，准备下一次偶联。
按照西那普肽主链C端至N端的氨基酸顺序，再进行3次(1)和(2)的循环，交替合成Lys和(Leu)4，期间依次获得肽树脂2、肽树脂3和肽树脂4，最终得到西那普肽树脂：
Fmoc-Lys(Boc)-(Leu)4-Lys(Boc)-(Leu)4-Lys(Boc)-(Leu)4-Lys(Boc)-(Leu)4-Lys(Boc)-Wang-树脂。
实施例7：西那普肽粗品的制备
取实施例3所得西那普肽树脂，加入体积比为TFA︰水︰EDT＝90︰5︰5的混合酸解液(用量10mL/克西那普肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重，得西那普肽粗品，粗品纯度为79.3％。
实施例8：西那普肽粗品的制备
取实施例4所得西那普肽树脂，加入体积比为TFA︰水︰EDT＝90︰5︰5的混合酸解液(用量10mL/克西那普肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重，得西那普肽粗品，粗品纯度为76.1％。
实施例9：西那普肽粗品的制备
取实施例5所得西那普肽树脂，加入体积比为TFA︰水︰EDT＝90︰5︰5的混合酸解液(用量10mL/克西那普肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重，得西那普肽粗品，粗品纯度为83.1％。
实施例10：西那普肽粗品的制备
取实施例6所得西那普肽树脂，加入体积比为TFA︰水︰EDT＝90︰5︰5的混合酸解液(用量10mL/克西那普肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重，得西那普肽粗品，粗品纯度为81.5％。
实施例11：西那普肽粗品纯化转醋酸盐
取实施例7所得西那普肽粗品，加水溶解，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用；
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得西那普肽纯化中间体浓缩液；
取西那普肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到西那普肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得西那普肽纯品135.1g，总收率为54.7％，分子量：2470.8(100％M+H)，纯度：99.1％，最大单一杂质0.08％。
实施例12：西那普肽粗品纯化转醋酸盐
取实施例8所得西那普肽粗品，加水溶解，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用；
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得西那普肽纯化中间体浓缩液；
取西那普肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到西那普肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得西那普肽纯品129.2g，总收率为52.3％，分子量：2470.6(100％M+H)，纯度：99.0％，最大单一杂质0.11％。
实施例13：西那普肽粗品纯化转醋酸盐
取实施例9所得西那普肽粗品，加水溶解，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用；
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得西那普肽纯化中间体浓缩液；
取西那普肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到西那普肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得西那普肽纯品141.0g，总收率为57.1％，分子量：2470.6(100％M+H)，纯度：99.3％，最大单一杂质0.10％。
实施例14：西那普肽粗品纯化转醋酸盐
取实施例10所得西那普肽粗品，加水溶解，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用；
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得西那普肽纯化中间体浓缩液；
取西那普肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到西那普肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得西那普肽纯品135.6g，总收率为54.9％，分子量：2470.8(100％M+H)，纯度：99.1％，最大单一杂质0.10％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种合成西那普肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、将保护的Lys与树脂偶联，获得在Lys的N端及其侧链上偶联有保护基、在其C端偶联有树脂的肽树脂1；
步骤2、将在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端偶联有保护基的多肽片段1的C端与肽树脂1的N端进行偶联，而后将保护的Lys再与片段1的N端偶联，获得在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列N端、Lys侧链上偶联有保护基，在C端偶联有树脂的肽树脂2；
步骤3、将在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端偶联有保护基的多肽片段1的C端与肽树脂2的N端进行偶联，而后将保护的Lys再与片段1的N端偶联，获得在SEQ ID NO:3所示氨基酸序列N端、Lys侧链上偶联有保护基，在C端偶联有树脂的肽树脂3；
步骤4、将在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端偶联有保护基的多肽片段1的C端与肽树脂3的N端进行偶联，而后将保护的Lys再与片段1的N端偶联，获得在SEQ ID NO:4所示氨基酸序列N端、Lys侧链上偶联有保护基，在C端偶联有树脂的肽树脂4；
步骤5、将在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端偶联有保护基的多肽片段1的C端与肽树脂4的N端进行偶联，而后将保护的Lys再与片段1的N端偶联，获得在SEQ ID NO:5所示氨基酸序列N端、Lys侧链上偶联有保护基，在C端偶联有树脂的西那普肽树脂；
步骤6、西那普肽树脂酸解脱除C端树脂和所有保护基得到西那普肽粗品，粗品纯化转醋酸盐，获得西那普肽成品，所述酸解采用由体积百分比为80-95％的TFA、体积百分比为1-10％的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述保护的Lys为在其N端和侧链偶联有保护基的Lys。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述保护的Lys为在其N端偶联有Fmoc保护基、在其侧链偶联有Boc保护基的Lys，即Fmoc-Lys(Boc)-OH。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1所述偶联采用偶联试剂偶联，所述偶联试剂为N,N-二异丙基乙胺、N,N-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑/4-N,N-二甲基吡啶两种之一。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述树脂为Trityl-Cl类树脂或羟基类树脂。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2至步骤5所述偶联均采用缩合试剂和活化试剂偶联，所述缩合试剂为N,N-二异丙基碳二亚胺、N,N-二环己基碳二亚胺，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷/有机碱、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯/有机碱、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐/有机碱、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯/有机碱中的一种；所述活化试剂为1-羟基苯并三唑或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤6所述粗品纯化转醋酸盐具体为：
西那普肽粗品溶解后采用高效液相色谱法进行纯化，获得西那普肽纯化中间体浓缩液，然后以流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，以高效液相色谱法进行转醋酸盐。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，步骤6所述粗品纯化转醋酸盐具体为：
西那普肽粗品，用水溶解，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用；
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得西那普肽纯化中间体浓缩液；
取西那普肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到西那普肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得西那普肽成品。
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