CN105085634A

CN105085634A - 一种地加瑞克的制备方法

Info

Publication number: CN105085634A
Application number: CN201510538780.XA
Authority: CN
Inventors: 李湘; 徐琪; 魏忠勇
Original assignee: Chinese Peptide Co
Current assignee: Chinese Peptide Co
Priority date: 2015-08-29
Filing date: 2015-08-29
Publication date: 2015-11-25

Abstract

本发明公开了一种安全高效的地加瑞克合成方法。本发明方法以氨基树脂为起始树脂载体，通过固相合成法依次连接地加瑞克序列中相对应的Fmoc-氨基酸，其中最末位氨基酸采用Ac-D-2Nal-OH，经缩合反应及脱保护反应，得到全保护地加瑞克肽树脂；再进行酸解切割和乙醚沉降，得到地加瑞克粗肽；经色谱纯化、醋酸转盐以及冷冻干燥得到醋酸地加瑞克。本发明选用Oxyma作为安全高效的偶联试剂，以提高工艺安全性减少工艺副产物。本发明工艺既可以采用固相合成也可以采用液相合成，工艺副产物少，易于分离纯化。所得最终的醋酸地加瑞克产物纯度高达99％，收率高达61％，具有可观的经济适用价值和广泛的应用前景。

Description

一种地加瑞克的制备方法

技术领域

本发明属于制药技术领域，特别涉及一种地加瑞克及地加瑞克醋酸盐的工业化制备新工艺。

背景技术

地加瑞克（Degarelix）由FerringPharmaceuticals公司开发（TradeName:Firmagon），经美国FDA批准，于2008年12月24日在美国上市，用于治疗晚期前列腺癌。地加瑞克是一种促性腺激素释放激素（GnRH）受体抑制剂类药物，可逆性地抑制垂体GnRH受体来减少促性腺激素释放继而抑制睾酮的释放。地加瑞克通过抑制对前列腺癌持续生长至关重要的睾酮来延缓前列腺癌的生长和恶化。以激素方法治疗前列腺癌来降低睾酮浓度在初期时却造成睾酮浓度激增，此初始刺激该激素受体可暂时性地促进而非抑制肿瘤生长，而地加瑞克则不会有这种现象。Ⅲ期临床研究显示，地加瑞克降低睾酮浓度的效果至少可与亮丙瑞林储库型控释注射剂（LupronDepot）相媲美，而且降低睾酮浓度显效快。在治疗的第3日，地加瑞克组96％达到去生殖腺的睾酮浓度，亮丙瑞林组效果为0％。第14日，地加瑞克组99％达到去生殖腺的睾酮浓度，亮丙瑞林组为18％。在临床研究中，前列腺特异抗原（PSA）浓度可作为监测的第2个疗效判断终点。使用地加瑞克2周后降低PSA64％，1月后85％，3月后95％，在治疗的整个1年中始终抑制PSA。地加瑞克在临床研究中报道的最常见的不良反应是：注射部位反应（疼痛，红肿和肿胀），热潮红，体重增加，乏力和某些肝酶浓度升高。

地加瑞克是一种含有7个非天然氨基酸的线性十肽，肽序列为：

Ac-D2Nal¹-DPhe(4-Cl)²-D-3Pal³-Ser⁴-4Aph(L-Hor)⁵-D-4Aph(Cbm)⁶-Leu⁷-Ilys⁸-Pro⁹-DAla¹⁰-NH₂

化学结构为（结构1）：

目前与地加瑞克合成相关的报道如下。

专利CN102329373A的地加瑞克固相合成工艺包括如下步骤：以Fmoc保护的氨基树脂为起始原料，按照固相合成的方法，用DIC/HOBt或DIC/HOAt为偶联剂进行接肽反应，按照氨基酸序列依次连接保护氨基酸，其中5位苯丙胺酸残基侧链氨基先以Trt或Alloc保护，去保护后偶联上氢化乳清酸，裂解得到粗肽，纯化后得到精肽（收率：40%，纯度：99.8%）。该方法由于在树脂上使用了TFA除去三苯甲基，会影响酸敏感的Boc等基团，而使用四（三苯基膦）钯脱去Alloc，金属残留会影响重金属含量超标，会导致产品质量不合格。

专利CN103992392A的合成方法以Fmoc保护的氨基树脂为固相载体，HBTU/HOBt/DIEA作为氨基酸偶联剂，用ivDde代替5位苯丙氨酸苯环4位氨基相连的乳清酸片段，从C端到N端依次缩合反应连接10个保护的氨基酸，得到全保护肽树脂，然后脱掉N端D-Nal的Fmoc保护基，用乙酸酐和吡啶乙酸化，脱掉ivDde替换上Hor。该方法采用Fmoc-Aph(ivDde)-OH作为原料，此原料合成困难，工艺复杂，不适于工业化规模生产。

专利CN102952174A的合成方法以Fmoc保护的氨基树脂为起始原料，按照固相合成的方法，用DIC/HOBt为偶联剂进行接肽反应，5位苯丙氨酸残基侧链氨基相连的氢化乳清酸片段先以三苯甲基保护，使用TFA去保护后偶联上氢化乳清酸。该方法由于在树脂上使用TFA除去三苯甲基，会影响酸敏感的Boc等基团，导致产品质量和收率不高，而且用的生产原料较贵直接导致生产成本偏高。

专利CN102428097B的地加瑞克合成方法以Fmoc保护的氨基树脂为起始原料，按照固相合成的方法，用DIC/HOBt为偶联剂进行接肽反应，去保护选用哌啶和烷基取代哌啶，可以防止Aph(L-Hor)的二氢尿嘧啶部分转化为乙内酰脲。该方法为传统的固相多肽合成方法，缺乏足够的新颖性且生产成本高。

专利CN103992378A发明公开了一种制备醋酸地加瑞克的技术，具体步骤为：首先，在RinkAmideMBHA树脂上依次偶联10个氨基酸，DIC/6-Cl-HOBt作为氨基酸偶联剂，其顺序为：Fmoc-D-Ala-OH,Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Ilys(Boc)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-D-4Aph(Dde)-OH,Fmoc-4Aph(Teoc)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-D-3Pal-OH,Fmoc-D-Phe(4Cl)-OH,Fmoc-D-2Nal-OH；然后，脱去保护基Fmoc，醋酐封端后用2%水合肼的DMF混合溶液脱去6位D-苯丙氨酸侧链氨基上的Dde，再通过三甲基硅基异氰酸酯DMF溶液引入Cbm；使用四丁基氟化铵DMF混合溶液脱去5位苯丙氨酸侧链氨基上的Teoc，通过偶联反应在该氨基上引入L-Hor。该方法需要在树脂载体上进行多肽合成修饰,操作工艺复杂，不适于工业化规模生产。

在专利CN102329373A,CN103992392A,CN10295217A,CN102428097B发明公开的地加瑞克合成方法中，6位氨基酸残基D-4-Aph(Cbm)在合成中采用侧链Cbm基团不保护的Fmoc-D-4-Aph(Cbm)-OH或者侧链Cbm用t-Bu保护的Fmoc-D-4-Aph(t-Bu-Cbm)-OH.固相合成中采用侧链不保护的Fmoc-D-4-Aph(Cbm)-OH，如果反应温度控制不当，在最后的乙酰化封端过程中容易产生在侧链Cbm基因上的乙酰化副产物，该副产物难以分离纯化，将影响工艺的效率和产品的质量。采用侧链用叔丁基保护的Fmoc-D-4-Aph(t-Bu-Cbm),在完成连结后需要去除保护基，而Aph(t-Bu-Cbm)侧链上叔丁基的脱除比较困难，需要在强酸水溶液中加热条件下才能完全脱除，加大了产生消旋等杂质的可能性，影响产品质量。

在专利CN103992378A发明公开的地加瑞克合成方法中，6位氨基酸残基D-4-Aph(Cbm)在合成中采用Fmoc-D-4-Aph(Dde)-OH,最后醋酐封端后用2%水合肼的DMF混合溶液脱去6位D-苯丙氨酸侧链氨基上的Dde，再通过三甲基硅基异氰酸酯DMF溶液引入Cbm，以此来避免在醋酐封端过程中Cbm基团的乙酰化副产物。此工艺操作复杂，不适于工业化规模生产。

文献也报道了地加瑞克的Boc固相合成法（2001:880SYNTHLINE）和Boc液相合成法（US6214798B1）。Boc固相合成法需要用HF进行裂解，对人体和环境都会造成很大危害。Boc液相合成法所得地加瑞克纯度较低,只有96%-98%（J.Med.Chem.,2005,48,4851）。

目前报道的地加瑞克Fmoc固相合成法均采用了HOBt或类似物作为氨基酸偶联剂,HOBt已经被归类为UN05081.3C类易爆化学品(J.Hazard.Mater.,2005,126,1-7)，在运输和生产过程中有安全隐患。因此需要开发一种反应条件温和，安全有效的地加瑞克固相合成方法。

发明内容

针对现有技术的上述缺陷完成了本发明。本发明的目的是提供一种反应条件温和，生产安全，操作简单，环境污染小，收率高，杂质少，适合规模化生产的地加瑞克固相合成方法。

在地加瑞克的合成工艺研究中我们发现，把Fmoc-D-4Aph(Cbm)-OH用于固相合成中时，未保护的Cbm基团的弱亲核活性仍然可以构成杂质形成的威胁，如Cbm的乙酰化副产物（结构2）及与活化氨基酸反应形成酰胺副产物（结构3）等。这些工艺杂质难以从产物中除去，导致合成工艺杂质多，产品收率低：

。

本发明的目的在于提供一种地加瑞克的制备方法，主要解决现有固相合成法中有毒且难分离的地加瑞克杂质问题以及提高生产工艺的安全性。通过在合成中采用Ac-D-2Nal-OH氨基酸和高效安全的偶联试剂很好地解决了这一问题。

本发明的制备地加瑞克的固相合成方法包括以下步骤：a)以氨基树脂为固相载体，通过固相合成法依次偶联地加瑞克序列中相对应的Fmoc保护氨基酸或Fmoc保护的地加瑞克的肽片段，最后一个氨基酸采用Ac-D-2Nal-OH，制备得到侧链部分保护或全保护的地加瑞克肽树脂；b)使用酸解切肽试剂对所述肽树脂进行切割及侧链去保护。

在a)步骤中可以使用偶联剂，所述偶联剂选自下列中的一种及其任意组合：HOBt，HOAt，DIC,EDC,BMC,BEC,PIC,PEC，PyBOP,PyAOP,HATU,HBTU,TBTU，TDBTU,HOOBt,Oxyma。在b)步骤中可以使用含有TFA的酸解切肽试剂对肽树脂进行切割及侧链去保护。

另一方面，通过进一步的工艺研究，我们惊奇地发现，当使用Oxyma+X(X=DIC,DCC,EDC,BMC,BEC,PIC,PEC中的一种)作为偶联剂进行地加瑞克Fmoc固相合成，其工艺杂质显著减少，产品纯度和收率明显提高。地加瑞克的合成中使用偶联剂Oxyma+X有两个显著优点：a）Oxyma作为偶联剂用来替代富氮的HOBt，这使得用于大规模的工业生产工艺更安全;HOBt已经被归类为UN05081.3C类易爆化学品(J.Hazard.Mater.,2005,126,1-7),在运输和生产过程中有安全隐患。在地加瑞克的合成中尚未有报道使用Oxyma作为氨基酸的偶联剂。b）使用Oxyma+X作为偶联剂，在地加瑞克的合成过程中偶联反应可以在较低的温度下进行，因此，工艺杂质明显较少，产品纯度显著更高。

本发明中一些常用的缩写及术语具有以下含义：

Fmoc:芴甲氧羰基

tBu:叔丁基

Oxyma:2-肟氰乙酸乙酯

HOBt：1-羟基苯骈三唑

HOOBt:3,4-二氢-3-羟基-4-OXO-1,2,3-苯并三嗪

DIC：N，N'-二异丙基碳二亚胺

DCC:二环己基碳二亚胺

EDC:1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺

BMC:N，N'-甲基叔丁基碳二亚胺

BEC:N，N'-乙基叔丁基碳二亚胺

PIC:N，N'-异丙基苯基碳二亚胺

PEC:N，N'-乙基苯基碳二亚胺

D-Ala:D-丙氨酸

Pro:脯氨酸

Leu:亮氨酸

Ser:丝氨酸

D-3Pal：D-3-吡啶丙氨酸

D-Phe(4Cl):D-4-氯-苯丙氨酸

ILys(Boc):N-叔丁氧羰基-N-异丙基-L-赖氨酸

D-4Aph(Cbm):N⑷-(氨基甲酰基）-D-4-氨基苯丙氨酸

Aph(L-Hor):N(4)-(L-氢化乳清酸）-4-氨基苯丙氨酸

D-2Nal:D-2-萘丙氨酸

DMF:N，N'-二甲基甲酰胺

Piperidine:六氢吡啶

TFA:三氟醋酸

MeOH:甲醇

DCM:二氯甲烷

PyBop:六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基

PyAOP:(3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸盐

TDBTU:N,N,N',N'-四甲基-O-(3,4-二氢-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪-3-基)脲四氟硼酸盐

HATU:2-(7-偶氮苯并三氮唑）-N,N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯

DIEA:N,N-二异丙基乙胺

NMP:N-甲基吡咯烷酮

肽树脂1：Fmoc-DPhe(4-Cl)-D3Pal-Ser(tBu)-4-Aph(L-Hor)-D4Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-DAla-RinkAmideMBHAResin

肽树脂2：Ac-D2Nal-DPhe(4-Cl)-D3Pal-Ser(tBu)-4-Aph(L-Hor)-D4Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-DAla-RinkAmideMBHAResin。

本发明的地加瑞克合成流程见附图1，本方法包括以下步骤。

1)氨基树脂与Fmoc-D-Ala-0H偶联得到Fmoc-D-Ala-氨基树脂。

2)采用Fmoc固相合成法按地加瑞克的氨基酸排列顺序依次连接如下氨基酸：Fmoc-Pro-OH，Fmoc-ILys(Boc)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-D4Aph(Cbm)-OH，Fmoc-Aph(Hor)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-D3Pal-OH，Fmoc-DPhe(4C1)-OH以及Ac-D-2Nal-OH。

3)用裂解试剂切割肽树脂及脱除侧链保护基，无水乙醚沉淀，离心后得到粗肽。

4)经分离纯化，盐交换和冻干得到地加瑞克。

上述地加瑞克固相合成方法中，步骤1)所用树脂所述氨基树脂为RinkAmide树脂，RinkAmideAM树脂，RinkAmideMBHA树脂或Sieber树脂。

上述地加瑞克固相合成方法中，所用的偶联剂选自下列中的一种及其任意组合：HOBt，HOAt，DIC,EDC,BMC,BEC,PIC,PEC，PyBOP,PyAOP,HATU,HBTU,TBTU，TDBTU,HOOBt,Oxyma。优选偶联剂为Oxyma+X(X=DIC,DCC,EDC,BMC,BEC,PIC,PEC中的一种)；反应溶剂为DMF或NMP,反应温度为0-20^oC。

上述地加瑞克固相合成方法中，氨基酸N端Fmoc保护基的脱除选用体积比为20%的哌啶/DMF溶液或者哌啶/NMP溶液，脱保护时间为10-40分钟，用量为树脂体积的2-4倍。

上述地加瑞克固相合成方法中，氨基酸投料量为所投树脂摩尔数的14倍。

上述地加瑞克固相合成方法中，肽树脂裂解及侧链去保护试剂为体积比95:5的三氟醋酸:水溶液；裂解条件为0–30^oC搅拌1.5–3h，沉淀粗肽时无水乙醚体积为8-12倍，干燥，获得地加瑞克粗品。

实验结果表明，当采用DIC/Oxyma作为偶联剂完成地加瑞克所有氨基酸的连接，地加瑞克粗肽的高效液相色谱纯度高达91.3％。经纯化，盐交换和冻干，最终产品的纯度高达99％，工艺总收率高达61.1%（实施例1）。明显高于用其它偶联剂所得到的收率（21%-48%）。

附图说明

图1是一种地加瑞克的制备方法。

具体实施方式

地加瑞克的合成采用从Fmoc氨基树脂和氨基酸以逐步偶联的固相多肽合成法进行.

实施例1。

步骤1.FmocRinkAmide树脂（800mmol,2222g,取代度0.36mmol/g）置于一反应器中，用N,N-二甲基甲酰胺（30L）溶胀30分钟。悬浮液过滤，将20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺（30L）加入到树脂中并搅拌30分钟以除去Fmoc保护基。Fmoc去保护后，将树脂用N,N-二甲基甲酰胺彻底洗涤，准备用于步骤2偶联。

步骤2.将497.6gFmoc-DAla-OH,227.4g2-肟氰乙酸乙酯（Oxyma）和248mLN,N-二异丙基碳二亚胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0-10摄氏度活化20分钟。活化后，将溶液加入到含有肽树脂的反应器中，偶联反应在0-20摄氏度进行1-4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬浮液过滤并用N,N-二甲基甲酰胺洗涤肽树脂。然后肽树脂在20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液中搅拌30分钟以除去Fmoc保护基。Fmoc去保护后，将树脂用N,N-二甲基甲酰胺彻底洗涤，并准备用于步骤3偶联。

步骤3.将539.2gFmoc-Pro-OH,227.4g2-肟氰乙酸乙酯（Oxyma）和248mLN,N-二异丙基碳二亚胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0-10摄氏度活化20分钟。活化后，将溶液加入到含有肽树脂的反应器中，偶联反应在0-20摄氏度进行1-4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬浮液过滤并用N,N-二甲基甲酰胺洗涤肽树脂。然后肽树脂在20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液中搅拌30分钟以除去Fmoc保护基。Fmoc去保护后，将树脂用N,N-二甲基甲酰胺彻底洗涤，并准备用于步骤4偶联。

步骤4.将817gFmoc-ILys(Boc)-OH,227.4g2-肟氰乙酸乙酯（Oxyma）和248mLN,N-二异丙基碳二亚胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0-10摄氏度活化20分钟。活化后，将溶液加入到含有肽树脂的反应器中，偶联反应在0-20摄氏度进行1-4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬浮液过滤并用N,N-二甲基甲酰胺洗涤肽树脂。然后肽树脂在20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液中搅拌30分钟以除去Fmoc保护基。Fmoc去保护后，将树脂用N,N-二甲基甲酰胺彻底洗涤，并准备用于步骤5偶联。

步骤5.将565.4gFmoc-Leu-OH,227.4g2-肟氰乙酸乙酯（Oxyma）和248mLN,N-二异丙基碳二亚胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0-10摄氏度活化20分钟。活化后，将溶液加入到含有肽树脂的反应器中，偶联反应在0-20摄氏度进行1-4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬浮液过滤并用N,N-二甲基甲酰胺洗涤肽树脂。然后肽树脂在20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液中搅拌30分钟以除去Fmoc保护基。Fmoc去保护后，将树脂用N,N-二甲基甲酰胺彻底洗涤，并准备用于步骤6偶联。

步骤6.将712.8gFmoc-D-4Aph(Cbm)-OH,227.4g2-肟氰乙酸乙酯（Oxyma）和248mLN,N-二异丙基碳二亚胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0-10摄氏度活化20分钟。活化后，将溶液加入到含有肽树脂的反应器中，偶联反应在0-20摄氏度进行1-4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬浮液过滤并用N,N-二甲基甲酰胺洗涤肽树脂。然后肽树脂在20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液中搅拌30分钟以除去Fmoc保护基。Fmoc去保护后，将树脂用N,N-二甲基甲酰胺彻底洗涤，并准备用于步骤7偶联。

步骤7.将868gFmoc-4Aph(L-Hor)-OH,227.4g2-肟氰乙酸乙酯（Oxyma）和248mLN,N-二异丙基碳二亚胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0-10摄氏度活化20分钟。活化后，将溶液加入到含有肽树脂的反应器中，偶联反应在0-20摄氏度进行1-4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬浮液过滤并用N,N-二甲基甲酰胺洗涤肽树脂。然后肽树脂在20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液中搅拌30分钟以除去Fmoc保护基。Fmoc去保护后，将树脂用N,N-二甲基甲酰胺彻底洗涤，并准备用于步骤8偶联。

步骤8.将613.5gFmoc-Ser(tBu)-OH,227.4g2-肟氰乙酸乙酯（Oxyma）和248mLN,N-二异丙基碳二亚胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0-10摄氏度活化20分钟。活化后，将溶液加入到含有肽树脂的反应器中，偶联反应在0-20摄氏度进行1-4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬浮液过滤并用N,N-二甲基甲酰胺洗涤肽树脂。然后肽树脂在20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液中搅拌30分钟以除去Fmoc保护基。Fmoc去保护后，将树脂用N,N-二甲基甲酰胺彻底洗涤，并准备用于步骤9偶联。

步骤9.将621.4gFmoc-D3Pal-OH,227.4g2-肟氰乙酸乙酯（Oxyma）和248mLN,N-二异丙基碳二亚胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0-10摄氏度活化20分钟。活化后，将溶液加入到含有肽树脂的反应器中，偶联反应在0-20摄氏度进行1-4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬浮液过滤并用N,N-二甲基甲酰胺洗涤肽树脂。然后肽树脂在20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液中搅拌30分钟以除去Fmoc保护基。Fmoc去保护后，将树脂用N,N-二甲基甲酰胺彻底洗涤，并准备用于步骤10偶联。

步骤10.将675gFmoc-DPhe(4-Cl)-OH,227.4g2-肟氰乙酸乙酯（Oxyma）和248mLN,N-二异丙基碳二亚胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0-10摄氏度活化20分钟。活化后，将溶液加入到含有肽树脂的反应器中，偶联反应在0-20摄氏度进行1-4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬浮液过滤并用N,N-二甲基甲酰胺洗涤肽树脂，得到3440gFmoc-DPhe(4-Cl)-D3Pal-Ser(tBu)-4-Aph(L-Hor)-D4Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-DAla-RinkAmideMBHAResin（肽树脂1）。

采用DIC/Oxyma偶联方法连接Ac-D-2Nal-OH。

将步骤10所得的肽树脂1（8.8g）用20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液中搅拌30分钟以除去Fmoc保护基。Fmoc去保护后，将树脂用N,N-二甲基甲酰胺彻底洗涤，并准备用于Ac-D-2Nal-OH的偶联。将1.03gAc-D-2Nal-OH与0.57g2-肟氰乙酸乙酯（Oxyma）加入到肽树脂中，加入适量N,N-二甲基甲酰胺把氨基酸溶解，再加入0.62mLN,N-二异丙基碳二亚胺到反应器中进行偶联反应，偶联反应在0-20摄氏度进行1-4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬浮液过滤并用N,N-二甲基甲酰胺洗涤五次，甲醇洗涤两次。在真空下干燥后，得到8.65g肽树脂2:Ac-D2Nal-DPhe(4-Cl)-D3Pal-Ser(tBu)-4-Aph(L-Hor)-D4Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-DAla-RinkAmideMBHAResin。

肽树脂切割得到地加瑞克粗品：将所得的肽树脂2(5.65g)悬浮在三氟醋酸切割液中，三氟醋酸:水(95:5,10ml/g树脂)，在室温下反应2.5小时。过滤后，收集滤液并在乙醚中沉淀。将粗肽离心收集，用乙醚洗涤，并在真空下干燥。得到地加瑞克粗品2.38g，地加瑞克粗肽的产率为111.7％，高效液相色谱纯度为91.3％。

纯化，盐交换和冻干：将地加瑞克粗肽（1.46g）溶于30%乙腈/水中，并通过使用盐酸缓冲体系C18反相色谱纯化。将产物馏分合并后使用醋酸缓冲系统进行盐交换。盐交换后将合并的产物馏分进行冷冻干燥，得到最终的醋酸地加瑞克成品802mg，最终产品的纯度为99％，纯化收率为54.7％，总收率为61.1%.

实施例2。

采用DIC/HOOBt偶联方法连接Ac-D-2Nal-OH。

按照实施例1中所述步骤1至10的方法合成肽树脂1。将上述步骤10所得的肽树脂1（17.2g）用20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液中搅拌30分钟以除去Fmoc保护基。Fmoc去保护后，将树脂用N,N-二甲基甲酰胺彻底洗涤，并准备用于Ac-D-2Nal-OH的偶联。将2.06gAc-D-2Nal-OH,1.3gHOOBt加入到含有肽树脂的反应器中，加入适量N,N-二甲基甲酰胺把氨基酸溶解，再加入1.24mLN,N-二异丙基碳二亚胺到反应器中进行偶联反应，偶联反应在0-20摄氏度进行1-4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬浮液过滤并用N,N-二甲基甲酰胺洗涤五次，甲醇洗涤两次。在真空下干燥后，得到19.85g肽树脂2:Ac-D2Nal-DPhe(4-Cl)-D3Pal-Ser(tBu)-4-Aph(L-Hor)-D4Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-DAla-RinkAmideMBHAResin。

肽树脂切割得到地加瑞克粗品：将干燥后的肽树脂2(0.5g)悬浮在三氟醋酸切割液中，三氟醋酸:水(95:5,10ml/g树脂)，在室温下反应2.5小时。过滤后，收集滤液并在乙醚中沉淀。将粗肽离心收集，用乙醚洗涤，并在真空下干燥。得到地加瑞克粗品0.174g，地加瑞克粗肽的产率为103.2％，高效液相色谱纯度为88.6％。

纯化，盐交换和冻干：将地加瑞克粗肽（0.125g）溶于30%乙腈/水中，并通过使用盐酸缓冲体系C18反相色谱纯化。将产物馏分合并后使用醋酸缓冲系统进行盐交换。盐交换后将合并的产物馏分进行冷冻干燥，得到最终的醋酸地加瑞克成品59mg，最终产品的纯度为99％，纯化收率为47.2％，总收率为48.7%.

实施例3。

采用DIC/HOBt偶联方法连接Ac-D-2Nal-OH。

按照实施例1中所述步骤1至10的方法合成肽树脂1。将上述步骤10所得的肽树脂1（0.88g）用20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液中搅拌30分钟以除去Fmoc保护基。Fmoc去保护后，将树脂用N,N-二甲基甲酰胺彻底洗涤，并准备用于Ac-D-2Nal-OH的偶联。将0.106gAc-D-2Nal-OH,0.054gHOBt和0.062mLN,N-二异丙基碳二亚胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0-10摄氏度活化60分钟。活化后，将溶液加入到含有肽树脂的反应器中，偶联反应在0-20摄氏度进行1-4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬浮液过滤并用N,N-二甲基甲酰胺洗涤五次，甲醇洗涤两次。在真空下干燥后，得到1.0g肽树脂2:Ac-D2Nal-DPhe(4-Cl)-D3Pal-Ser(tBu)-4-Aph(L-Hor)-D4Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-DAla-RinkAmideMBHAResin。

肽树脂切割得到地加瑞克粗品：将干燥后的肽树脂2(1.0g)悬浮在三氟醋酸切割液中，三氟醋酸:水(95:5,10ml/g树脂)，在室温下切割2.5小时。过滤后，收集滤液并在乙醚中沉淀。将粗肽离心收集，用乙醚洗涤，并在真空下干燥。得到地加瑞克粗品0.310g，地加瑞克粗肽的产率为95％，高效液相色谱纯度为84.9％。

纯化，盐交换和冻干：将地加瑞克粗肽（0.251g）溶于30%乙腈/水中，并通过使用盐酸缓冲体系C18反相色谱纯化。将产物馏分合并后使用醋酸缓冲系统进行盐交换。盐交换后将合并的产物馏分进行冷冻干燥，得到最终的醋酸地加瑞克成品108mg，最终产品的纯度为99％，纯化收率为43.1％，总收率为41%.

实施例4。

采用HATU/DIPEA偶联方法连接Ac-D-2Nal-OH。

按照实施例1中所述步骤1至10的方法合成肽树脂1。将上述步骤10所得的肽树脂1（0.88g）用20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液中搅拌30分钟以除去Fmoc保护基。Fmoc去保护后，将树脂用N,N-二甲基甲酰胺彻底洗涤，并准备用于Ac-D-2Nal-OH的偶联。将0.102gAc-D-2Nal-OH与0.152gHATU加入到肽树脂中，加入适量N,N-二甲基甲酰胺把氨基酸溶解，再加入0.13mLDIPEA到反应器中进行偶联反应，偶联反应在0-20摄氏度进行1-4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬浮液过滤并用N,N-二甲基甲酰胺洗涤五次，甲醇洗涤两次。在真空下干燥后，得到0.86g肽树脂2:Ac-D2Nal-DPhe(4-Cl)-D3Pal-Ser(tBu)-4-Aph(L-Hor)-D4Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-DAla-RinkAmideMBHAResin。

肽树脂切割得到地加瑞克粗品：将干燥后的肽树脂2(0.86g)悬浮在三氟醋酸切割液中，三氟醋酸:水(95:5,10ml/g树脂)，在室温下切割2.5小时。过滤后，收集滤液并在乙醚中沉淀。将粗肽离心收集，用乙醚洗涤，并在真空下干燥。得到地加瑞克粗品0.32g，地加瑞克粗肽的产率为98％，高效液相色谱纯度为78.1％.

实施例5。

采用PyAOP/NMM偶联方法连接Ac-D-2Nal-OH。

按照实施例1中所述步骤1至10的方法合成肽树脂1。将上述步骤10所得的肽树脂1（0.88g）用20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液中搅拌30分钟以除去Fmoc保护基。Fmoc去保护后，将树脂用N,N-二甲基甲酰胺彻底洗涤，并准备用于Ac-D-2Nal-OH的偶联。将0.102gAc-D-2Nal-OH与0.208gPyAOP加入到肽树脂中，加入适量N,N-二甲基甲酰胺把氨基酸溶解，再加入0.088mLNMM到反应器中进行偶联反应，偶联反应在0-20摄氏度进行1-4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬浮液过滤并用N,N-二甲基甲酰胺洗涤五次，甲醇洗涤两次。在真空下干燥后，得到0.867g肽树脂2：Ac-D2Nal-DPhe(4-Cl)-D3Pal-Ser(tBu)-4-Aph(L-Hor)-D4Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-DAla-RinkAmideMBHAResin。

肽树脂切割得到地加瑞克粗品：将干燥后的肽树脂2(0.867g)悬浮在三氟醋酸切割液中，三氟醋酸:水(95:5,10ml/g树脂)，在室温下反应2.5小时。过滤后，收集滤液并在乙醚中沉淀。将粗肽离心收集，用乙醚洗涤，并在真空下干燥。得到地加瑞克粗品0.340g，地加瑞克粗肽的产率为104.2％，高效液相色谱纯度为71.6％.

[实施例6。

采用TDBTU/NMM偶联方法连接Ac-D-2Nal-OH。

按照实施例1中所述步骤1至10的方法合成肽树脂1。将上述步骤10所得的肽树脂1（0.88g）用20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液中搅拌30分钟以除去Fmoc保护基。Fmoc去保护后，将树脂用N,N-二甲基甲酰胺彻底洗涤，并准备用于Ac-D-2Nal-OH的偶联。将0.102gAc-D-2Nal-OH与0.139gTDBTU加入到肽树脂中，加入适量N,N-二甲基甲酰胺把氨基酸溶解，再加入0.088mLNMM到反应器中进行偶联反应，偶联反应在0-20摄氏度进行1-4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬浮液过滤并用N,N-二甲基甲酰胺洗涤五次，甲醇洗涤两次。在真空下干燥后，得到0.861g肽树脂2：Ac-D2Nal-DPhe(4-Cl)-D3Pal-Ser(tBu)-4-Aph(L-Hor)-D4Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-DAla-RinkAmideMBHAResin。

肽树脂切割得到地加瑞克粗品：将干燥后的肽树脂2(0.861g)悬浮在三氟醋酸切割液中，三氟醋酸:水(95:5,10ml/g树脂)，在室温下反应2.5小时。过滤后，收集滤液并在乙醚中沉淀。将粗肽离心收集，用乙醚洗涤，并在真空下干燥。得到地加瑞克粗品0.340g，地加瑞克粗肽的产率为104.2％，高效液相色谱纯度为90％.

实施例7。

采用HBTU/NMM偶联方法连接Ac-D-2Nal-OH。

按照实施例1中所述步骤1至10的方法合成肽树脂1。将上述步骤10所得的肽树脂1（0.88g）用20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液中搅拌30分钟以除去Fmoc保护基。Fmoc去保护后，将树脂用N,N-二甲基甲酰胺彻底洗涤，并准备用于Ac-D-2Nal-OH的偶联。将0.102gAc-D-2Nal-OH与0.152gHBTU加入到肽树脂中，加入适量N,N-二甲基甲酰胺把氨基酸溶解，再加入0.088mLNMM到反应器中进行偶联反应，偶联反应在0-20摄氏度进行1-4个小时，或直至茚三酮检测结果为阴性。将树脂悬浮液过滤并用N,N-二甲基甲酰胺洗涤五次，甲醇洗涤两次。在真空下干燥后，得到0.871g肽树脂2：Ac-D2Nal-DPhe(4-Cl)-D3Pal-Ser(tBu)-4-Aph(L-Hor)-D4Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-DAla-RinkAmideMBHAResin。

肽树脂切割得到地加瑞克粗品：将干燥后的肽树脂2(0.871g)悬浮在三氟醋酸切割液中，三氟醋酸:水(95:5,10ml/g树脂)，在室温下反应2.5小时。过滤后，收集滤液并在乙醚中沉淀。将粗肽离心收集，用乙醚洗涤，并在真空下干燥。得到地加瑞克粗品0.348g，地加瑞克粗肽的产率为106.6％，高效液相色谱纯度为63.9％。

纯化，盐交换和冻干：将地加瑞克粗肽（0.299g）溶于30%乙腈/水中，并通过使用盐酸缓冲体系C18反相色谱纯化。将产物馏分合并后使用醋酸缓冲系统进行盐交换。盐交换后将合并的产物馏分进行冷冻干燥，得到最终的醋酸地加瑞克成品61.2mg，最终产品的纯度为99％，纯化收率为20.5％，总收率为21.8%。

Claims

1.一种制备地加瑞克的固相合成方法，其特征在于包括以下步骤：a)以氨基树脂为固相载体，通过固相合成法依次偶联地加瑞克序列中相对应的Fmoc保护氨基酸或Fmoc保护的地加瑞克的肽片段，最后一个氨基酸采用Ac-D-2Nal-OH，制备得到侧链部分保护或全保护的地加瑞克肽树脂；b)使用酸解切肽试剂对所述肽树脂进行切割及侧链去保护。

2.根据权利要求1所述的制备地加瑞克的方法，其特征在于该方法还包括对产物的纯化步骤。

3.根据权利要求1至2之一所述的制备地加瑞克的方法，其特征在于固相合成法依次偶联的氨基酸为：Fmoc-D-Ala-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-ILys(Boc)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-D-4Aph(Cbm)-OH，Fmoc-4Aph(L-Hor)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-D-3Pal-OH，Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH，Ac-D-2Nal-OH。

4.根据权利要求1至3之一所述的制备地加瑞克的方法，其特征在于在a)步骤中使用偶联剂，所述偶联剂选自下列中的一种及其任意组合：HOBt，HOAt，DIC，EDC，BMC，BEC，PIC，PEC，PyBOP，PyAOP，HATU，HBTU，TBTU，TDBTU，HOOBt，Oxyma。

5.根据权利要求4所述的制备地加瑞克的方法，其特征在于在a)步骤中所用的偶联剂为Oxyma与X的组合，其中X=DIC，DCC，EDC，BMC，BEC，PIC，PEC的一种，X优选为DIC，EDC。

6.根据权利要求1至5之一所述的制备地加瑞克的方法，其特征在于所述偶联反应中氨基酸投料量为所投树脂摩尔数的1-4倍，反应溶剂为DMF或NMP，偶联反应时间为0.5-4小时，偶联反应温度为0-20°C。

7.根据权利要求1至6之一所述的制备地加瑞克的方法，其特征在于脱去Fmoc使用体积比5-30%六氢吡啶的DMF或NMP溶液,洗脱时间为15-30分钟。

8.根据权利要求1至7之一所述的制备地加瑞克的方法，其特征在于步骤b)中所述的酸解切割及侧链去保护试剂为体积比95:5的三氟醋酸:水溶液，0-30oC切肽反应1.5-3小时，过滤，滤液加入乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗涤，干燥，获得地加瑞克粗品。

9.根据权利要求2至8之一所述的制备地加瑞克的方法，其特征在于产物纯化步骤采用C18或C8柱色谱分离纯化，流动相为0.05%-0.5%盐酸或磷酸或三氟醋酸的水溶液和乙腈溶液，用液相色谱仪跟踪收集所需要的产品馏分，检测波长为220nm。

10.一种制备地加瑞克可药用盐的方法，其特征在于按照权利要求1至9之一所述的方法制备地加瑞克，之后将其制成可药用盐。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述的地加瑞克可药用盐为醋酸地加瑞克。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于通过对所述的地加瑞克进行醋酸转盐，冻干，获得醋酸地加瑞克。