CN103992378A - 一种制备醋酸地加瑞克的方法 - Google Patents

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杨东晖
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周亮
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Abstract

本发明涉及一种制备醋酸地加瑞克的技术，具体步骤为：首先，在RinkAmideMBHA树脂上依次偶联10个氨基酸，其顺序为：Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ilys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-4Aph(Dde)-OH、Fmoc-4Aph(Teoc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-3Pal-OH、Fmoc-D-Phe(4Cl)-OH、Fmoc-D-2Nal-OH；然后，脱去保护基Fmoc，醋酐封端后用2%水合肼的DMF混合溶液脱去6位D-苯丙氨酸侧链氨基上的Dde，再通过三甲基硅基异氰酸酯DMF溶液引入Cbm；使用四丁基氟化铵DMF混合溶液脱去5位苯丙氨酸侧链氨基上的Teoc，通过偶联反应在该氨基上引入L-Hor。裂解、纯化、冻干后得到醋酸地加瑞克。本发明选择了一条分步、正交、特异性强的保护基合成策略制备地加瑞克，直接在载体上合成修饰有效的构件，能有效提高收率、降低生产成本。

Description

一种制备醋酸地加瑞克的方法
技术领域
本发明涉及一种多肽类药物的制备方法，是一种合成促性腺激素释放激素（GnRH）受体拮抗剂，通过与脑下垂体的GnRH受体可逆的结合，减少促性腺激素及睾酮的释放，从而发挥抗前列腺癌作用的特效药-醋酸地加瑞克的制备方法。
背景技术
地加瑞克，英名为： Degarelix，为一种含有7个非天然氨基酸的线性十肽，结构式如下： 
肽序列为：
AC-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Ilys-Pro-D-Ala-NH2
醋酸地加瑞克是一种合成的促性腺激素释放激素（GnRH）受体拮抗剂，通过与脑下垂体的GnRH受体可逆的结合，减少促性腺激素及睾酮的释放，从而发挥抗前列腺癌作用。以往激素疗法治疗前列腺癌时初期会造成睾酮浓度激增,由此可能暂时促进肿瘤生长而不是抑制它,但醋酸地加瑞克无此现象。来自比利时法语区鲁汶大学的Bertrand Tombal和来自德国柏林本杰明·富兰克林医疗中心的Kurt Miller对来源于2328例不同国家的前列腺癌患者的荟萃分析研究发现，与接受促黄体生成素释放激素激动剂相比，接受醋酸地加瑞克治疗的患者，总体生存率明显上升，前列腺癌的症状控制得到改善，骨折概率降低，肾脏以及泌尿系统的不良反应减少，还可显著降低心血管事件的风险。
国外相关的专利报道如下：
    WO2011066386和US5925730A采用Boc固相合成策略，临时保护基的脱除都是在酸性条件下进行。虽然有效的避免了二氢乳清酸在碱的条件下重排成海因结构的副产物，但是Boc策略最终要用到HF进行裂解，对人和环境有较大的危害。
    WO2010121835采用Fmoc固相合成策略，以Rnik Amide AM或Rnik Amide MBHA为固相载体，5位和6位分别以Fmoc-Aph(L-Hor)-OH和Fmoc-Aph(Cbm-tBu)-OH进行偶联。该方法操作复杂，且L-Hor在之后的反复脱保护过程中容易发生重排成海因结构的副产物，同时Aph(Cbm-tBu)侧链上保护基的脱除是在水溶液中进行，进一步加大了发生重排的可能性。
目前国内与合成相关的只有3篇报道：
    中国专利CN102329373A发明公开了一种地加瑞克的固相合成工艺。该发明的方法包括如下步骤：以Fmoc保护的氨基树脂为起始原料，按照固相合成的方法，用DIC/HOBt或DIC/HOAt为偶联剂进行接肽反应，按照氨基酸序列依次连接保护氨基酸，其中5位苯丙氨酸残基侧链氨基先以Trt或Alloc保护，相应的去保护后偶联上氢化乳清酸，裂解得到粗肽，两次纯化后得到精肽（收率：40%，纯度：99.8%）。该方法由于在树脂上使用10%TFA除去三苯甲基，再会影响酸敏感的Boc等基团，而使用四（三苯基膦）钯脱去Alloc，金属残留再会影响重金属含量超标，会导致产品质量和含量不高。
    中国专利CN10295217A发明公开了一种合成地加瑞克的方法。以Fmoc保护的氨基树脂为起始原料，按照固相合成的方法，用DIC/HOBt为偶联剂进行接肽反应，5位苯丙氨酸残基侧链氨基相连的氢化乳清酸片段先以三苯甲基保护，使用10%TFA去保护后偶联上氢化乳清酸。该方法由于在树脂上使用10%TFA除去三苯甲基，再会影响酸敏感的Boc等基团，导致产品质量和收率不高，而且用的生产原料较贵直接导致生产成本偏高、工业生产困难。
    中国专利CN102428097A发明公开了一种地加瑞克的合成方法。以Fmoc保护的氨基树脂为起始原料，按照固相合成的方法，用DIC/HOBt为偶联剂进行接肽反应，去保护选用哌啶和烷基取代哌啶，可以防止Aph（L-Hor）的二氢尿嘧啶部分转化为乙内酰脲部分。裂解纯化得到单杂小于0.3%，总收率为：37%。该方法为传统的固相多肽合成方法，用的生产原料较贵且总收率只有37%，该方法缺乏足够的新颖性且生产成本高，不适于工业化规模生产。
本发明人用已发表文献的合成方法，制备醋酸地加瑞克，发现现有地加瑞克的固相合成方法中，存在合成不充分、投料比大、成本高的缺陷，且由于纯度和收率不高，原料价格昂贵，不适于工业化规模生产。为此，本发明人对醋酸地加瑞克的制备方法进行了研究，从而得到了本发明的技术方案。
发明内容
本发明的目的是提供一种醋酸地加瑞克的制备方法。本发明选择了一条分步、正交、特异性强的保护基合成策略合成地加瑞克，而后通过裂解、纯化、冻干得到醋酸地加瑞克。在Rink Amide MBHA 树脂的载体上分步、正交、特异性的去保护后偶联上相应的构件得到地加瑞克，该方法直接在载体上合成修饰有效的构件，避免了直接购买或者液相合成昂贵的非天然氨基酸，有效地提高了收率、降低了生产成本，适于工业化规模生产。
本发明的合成路线如图1所示：首先，在Rink Amide MBHA 树脂上依次偶联10个氨基酸，偶联氨基酸顺序为：Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ilys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-4Aph(Dde)-OH、Fmoc-4Aph(Teoc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-3Pal-OH、Fmoc-D-Phe(4Cl)-OH、Fmoc-D-2Nal-OH；然后，脱去保护基Fmoc，醋酐封端，使用V水合肼:VDMF =2:98混合溶液去6位D-苯丙氨酸残基侧链氨基上的Dde，加入三甲基硅基异氰酸酯的DMF溶液，使6位D-苯丙氨酸残基侧链氨基偶联上Cbm；使用四丁基氟化铵的DMF混合溶液去5位苯丙氨酸残基侧链氨基上的Teoc，加入L-Hor-OH、6-Cl-HOBt和DIC，使5位苯丙氨酸残基侧链氨基偶联上L-Hor。裂解、纯化、冻干后得到收率和纯度均相对较高的醋酸地加瑞克。
本发明中一些常用的缩写具有以下含义；
Fmoc ：芴甲氧羰基
Fmoc-AA ：芴甲氧羰基保护的氨基酸
tBu ：叔丁基
Boc：叔丁氧羰基
6-Cl-HOBt ：6-氯-1-羟基苯并三氮唑
HOBt：1-羟基苯并三氮唑
HOAt： N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
DIC ：N，N′-二异丙基碳化二亚胺
D-Ala ：D-丙氨酸
Pro ：脯氨酸
Ilys：N′-异丙基-赖氨酸
Leu ：亮氨酸
D-4Aph：4-氨基-D-苯丙氨酸
4Aph：4-氨基-苯丙氨酸
Ser:丝氨酸
D-3Pal: (3-吡啶基)-D-丙氨酸
D-Phe(4Cl): D-4-氯苯丙氨酸
D-2Nal: 3-(2-萘基)-D-丙氨酸
L-Hor-OH：二氢乳清酸
Dde：2-乙酰基-5,5-二甲基-1,3-环己二酮
Teoc：三甲基硅乙氧羰基
Alloc：（2-丙烯氧基）羰基
DMF ：N，N′-二甲基甲酰胺
TFA ：三氟醋酸
TIS：三异丙基硅烷
MeOH ：甲醇
PhSMe：苯甲硫醚。
为此本发明提供一种醋酸地加瑞克的制备方法，其步骤如下：
步骤1，在Rink Amide MBHA 树脂上依次偶联10个氨基酸，然后脱去保护基Fmoc，醋酐封端；
步骤2，使用V水合肼:VDMF =2:98混合溶液去6位D-苯丙氨酸残基侧链氨基上的Dde，加入三甲基硅基异氰酸酯的DMF溶液，使6位D-苯丙氨酸残基侧链氨基偶联上Cbm；
步骤3，使用四丁基氟化铵的DMF混合溶液去5位苯丙氨酸残基侧链氨基上的Teoc，加入L-Hor-OH、6-Cl-HOBt和DIC，使5位苯丙氨酸残基侧链氨基偶联上L-Hor-OH；
步骤4，裂解、纯化、冻干后得到醋酸地加瑞克。
其中，步骤1所述合成方法，以Rink Amide MBHA 树脂载体为起始原料，依次偶联10个氨基酸，偶联氨基酸顺序为：Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ilys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-4Aph(Dde)-OH、Fmoc-4Aph(Teoc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-3Pal-OH、Fmoc-D-Phe(4Cl)-OH、Fmoc-D-2Nal-OH。然后脱去保护基Fmoc，醋酐封端。
其中，步骤2所述使用V水合肼:VDMF =2:98混合溶液去6位D-苯丙氨酸残基侧链氨基上的Dde，加入三甲基硅基异氰酸酯的DMF溶液，使6位D-苯丙氨酸残基侧链氨基偶联上Cbm；操作过程为：V水合肼:VDMF =2:98混合溶液，在25-35℃下反应5min。搅拌反应后抽滤除去液体，再次加入上述溶液，25-35℃下反应10min，搅拌反应后抽滤除去液体，然后用DMF洗涤6次后，加入三甲基硅基异氰酸酯的DMF溶液，冰浴冷却，缓慢加入载体中，0-15℃下反应2小时，25-35℃下反应24小时，抽除液体，用DMF洗涤3次。
其中，步骤3所述使用四丁基氟化铵的DMF混合溶液去5位苯丙氨酸残基侧链氨基上的Teoc，加入L-Hor-OH、6-Cl-HOBt和DIC，使5位苯丙氨酸残基侧链氨基偶联上L-Hor。偶联条件为：缩合试剂为：6-Cl-HOBt和DIC，反应溶剂为：DMF，反应温度：在25-35℃下反应2小时，抽除液体，DMF洗涤3次。
其中，步骤4所述的地加瑞克的裂解。裂解液为：VTIS : VPhSMe :VTFA=5: 5: 90；裂解时间：2小时，旋蒸后滤液加入到其体积6-10倍的乙醚中，沉降后离心洗涤5次制得地加瑞克粗肽。
本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：
1、    去Dde保护基的Rink Amide MBHA 树脂的地加瑞克10肽片段：三甲基硅基异氰酸酯摩尔比的选择：1:1和1:2；
2、    去Teoc保护基的Rink Amide MBHA 树脂的地加瑞克10肽片段：L-Hor：6-Cl-HOBt：DIC摩尔比的选择：1:3:3:3和1:1.5:1.5:1.5；
3、    使5位苯丙氨酸残基侧链氨基偶联上L-Hor，偶联温度的选择：15-25℃和25-35℃；
4、    使5位苯丙氨酸残基侧链氨基偶联上L-Hor，偶联时间的选择：1小时和2小时。
为此提出了6种实验条件：
实验条件1：偶联Cbm：在3.88g（1mmol）去Dde保护基的Rink Amide MBHA 树脂的地加瑞克10肽片段，加入135uL（1mmol）三甲基硅基异氰酸酯的DMF溶液，冰浴冷却，缓慢加入载体中，低温反应2小时，25-35℃下反应24小时，抽除液体，用DMF洗涤3次。去Teoc保护基：加入1.04g（4mmol）四丁基氟化铵的DMF混合溶液，25-35℃下反应2小时，抽除液体，用DMF洗涤3次，每次15mL。偶联L-Hor：将0.73g (3.0mmol) L-Hor-OH和0.51g (3.0mmol) 6-Cl-HOBt用溶剂DMF溶解，冰浴冷却温度为0～10℃，加入465uL  (3.0mmol)DIC，激活5分钟后加入到反应柱中与脱完保护的树脂进行反应，25-35℃下反应2小时，抽除液体，DMF洗涤3次，每次15mL。经裂解、反相HPLC纯化、冻干后得到醋酸地加瑞克精肽；
实验条件2：偶联Cbm：在3.88g（1mmol）去Dde保护基的Rink Amide MBHA 树脂的地加瑞克10肽片段，加入270uL（2mmol）三甲基硅基异氰酸酯的DMF溶液，冰浴冷却，缓慢加入载体中，低温反应2小时，25-35℃下反应24小时，抽除液体，用DMF洗涤3次。去Teoc保护基：加入1.04g（4mmol）四丁基氟化铵的DMF混合溶液，25-35℃下反应2小时，抽除液体，用DMF洗涤3次，每次15mL。偶联L-Hor：将0.73g (3.0mmol) L-Hor-OH和0.51g (3.0mmol) 6-Cl-HOBt用溶剂DMF溶解，冰浴冷却温度为0～10℃，加入465uL  (3.0mmol) DIC，激活5分钟后加入到反应柱中与脱完保护的树脂进行反应，25-35℃下反应2小时，抽除液体，DMF洗涤3次，每次15mL。经裂解、反相HPLC纯化、冻干后得到醋酸地加瑞克精肽；
实验条件3：偶联Cbm：在3.88g（1mmol）去Dde保护基的Rink Amide MBHA 树脂的地加瑞克10肽片段，加入135uL（1mmol）三甲基硅基异氰酸酯的DMF溶液，冰浴冷却，缓慢加入载体中，低温反应2小时，25-35℃下反应24小时，抽除液体，用DMF洗涤3次。去Teoc保护基：加入1.04g（4mmol）四丁基氟化铵的DMF混合溶液，25-35℃下反应2小时，抽除液体，用DMF洗涤3次，每次15mL。偶联L-Hor：将0.37g (1.5mmol) L-Hor-OH和0.26g (1.5mmol) 6-Cl-HOBt用溶剂DMF溶解，冰浴冷却温度为0～10℃，加入233uL  (1.5mmol)DIC，激活5分钟后加入到反应柱中与脱完保护的树脂进行反应，25-35℃下反应2小时，抽除液体，DMF洗涤3次，每次15mL。经裂解、反相HPLC纯化、冻干后得到醋酸地加瑞克精肽；
实验条件4：偶联Cbm：在3.88g（1mmol）去Dde保护基的Rink Amide MBHA 树脂的地加瑞克10肽片段，加入270uL（2mmol）三甲基硅基异氰酸酯的DMF溶液，冰浴冷却，缓慢加入载体中，低温反应2小时，25-35℃下反应24小时，抽除液体，用DMF洗涤3次。去Teoc保护基：加入1.04g（4mmol）四丁基氟化铵的DMF混合溶液，25-35℃下反应2小时，抽除液体，用DMF洗涤3次，每次15mL。偶联L-Hor：将0.37g (1.5mmol) L-Hor-OH和0.26g (1.5mmol) 6-Cl-HOBt用溶剂DMF溶解，冰浴冷却温度为0～10℃，加入233uL  (1.5mmol)DIC，激活5分钟后加入到反应柱中与脱完保护的树脂进行反应，25-35℃下反应2小时，抽除液体，DMF洗涤3次，每次15mL。经裂解、反相HPLC纯化、冻干后得到醋酸地加瑞克精肽；
实验条件5：偶联Cbm：在3.88g（1mmol）去Dde保护基的Rink Amide MBHA 树脂的地加瑞克10肽片段，加入270uL（2mmol）三甲基硅基异氰酸酯的DMF溶液，冰浴冷却，缓慢加入载体中，低温反应2小时，25-35℃下反应24小时，抽除液体，用DMF洗涤3次。去Teoc保护基：加入1.04g（4mmol）四丁基氟化铵的DMF混合溶液，25-35℃下反应2小时，抽除液体，用DMF洗涤3次，每次15mL。偶联L-Hor：将0.73g (3.0mmol) L-Hor-OH和0.51g (3.0mmol) 6-Cl-HOBt用溶剂DMF溶解，冰浴冷却温度为0～10℃，加入465uL  (3.0mmol)DIC，激活5分钟后加入到反应柱中与脱完保护的树脂进行反应，15-25℃下反应2小时，抽除液体，DMF洗涤3次，每次15mL。经裂解、反相HPLC纯化、冻干后得到醋酸地加瑞克精肽；
实验条件6：偶联Cbm：在3.88g（1mmol）去Dde保护基的Rink Amide MBHA 树脂的地加瑞克10肽片段，加入270uL（2mmol）三甲基硅基异氰酸酯的DMF溶液，冰浴冷却，缓慢加入载体中，低温反应2小时，25-35℃下反应24小时，抽除液体，用DMF洗涤3次。去Teoc保护基：加入1.04g（4mmol）四丁基氟化铵的DMF混合溶液，25-35℃下反应2小时，抽除液体，用DMF洗涤3次，每次15mL。偶联L-Hor：将0.73g (3.0mmol) L-Hor-OH和0.51g (3.0mmol) 6-Cl-HOBt用溶剂DMF溶解，冰浴冷却温度为0～10℃，加入465uL  (3.0mmol)DIC，激活5分钟后加入到反应柱中与脱完保护的树脂进行反应，25-35℃下反应1小时，抽除液体，DMF洗涤3次，每次15mL。经裂解、反相HPLC纯化、冻干后得到醋酸地加瑞克精肽。
实验结果如下：
实验条件 收率 纯度
实验条件1 51.3% 99.82%
实验条件2 53.1% 99.85%
实验条件3 49.8% 99.81%
实验条件4 51.1% 99.85%
实验条件5 47.1% 99.79%
实验条件6 44.1% 99.80%
以上结果表明，实验条件2的纯化效果较优。
本发明的方法和现有技术相比具有明显的优势，有关对比实验如下：
专利 收率 纯度
本发明技术 53.1% 99.85%
CN102329373A 40% 99.8%
CN10295217A 42% 99.8%
CN102428097A 37% N/A
本发明的有益效果是：选择了一条正交、特异性强的保护基合成策略合成地加瑞克。可以在Rink Amide MBHA 树脂的载体上分步、正交、特异性的合成上两个昂贵修饰型氨基酸，不仅降低了成本，有效地提高了收率和含量。
附图说明
图1本发明的合成路线；
图2实施例1醋酸地加瑞克精肽HPLC图谱；
图3实施例2醋酸地加瑞克精肽HPLC图谱；
图4 醋酸地加瑞克的质谱图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。
实施例1：
（1） 取2.0g（1.0mmol）的Rink Amide MBHA (取代度=0.50mmol/g)树脂加入到反应柱中，加入15 mLDCM溶胀30min，去保护：加入15mL的V哌啶:VDMF =20:80混合溶液，搅拌反应5min后抽滤除去液体，再次加入上述混合溶液，搅拌反应10min后抽滤除去液体，如此进行2次脱保护，然后用DMF洗涤6次，每次15mL。 
（2）偶联Fmoc-D-Ala-OH：将0.94g (3.0mmol) Fmoc-D-Ala-OH和0.51g (3.0mmol) 6-Cl-HOBt用溶剂DMF溶解，冰浴冷却温度为0～10℃，加入465uL (3.0mmol) DIC，激活5分钟后加入到反应柱中与脱完保护的载体进行反应，25-35℃下反应2小时，抽除液体，DMF洗涤3次，每次15mL。
（3）重复偶联：重复去除Fmoc保护基及接肽反应步骤的操作，按照地加瑞克氨基酸序列，依次偶联：Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ilys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-4Aph(Dde)-OH、Fmoc-4Aph(Teoc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-3Pal-OH、Fmoc-D-Phe(4Cl)-OH、Fmoc-D-2Nal-OH。
（4）醋酐封端：先脱去保护基Fmoc，加入15mL的V哌啶:VDMF =20:80混合溶液，搅拌反应5min后抽滤除去液体，再次加入上述混合溶液，搅拌反应10min后抽滤除去液体，如此进行2次脱保护，然后用DMF洗涤6次，每次15mL。取1mL醋酐、1mL吡啶和1mLDMF，冰浴冷却，缓慢加入载体中，25-35℃下反应2小时，抽除液体，用DMF洗涤6次，每次15mL。
（5）去Dde保护基：加入15mL的V水合肼:VDMF =2:98混合溶液，搅拌反应5min后抽滤除去液体，再次加入上述混合溶液，搅拌反应10min后抽滤除去液体，如此进行2次脱保护，然后用DMF洗涤6次，每次15mL。
（6）偶联Cbm：加入270uL（2mmol）三甲基硅基异氰酸酯的DMF溶液，冰浴冷却，缓慢加入载体中，低温反应2小时，25-35℃下反应24小时，抽除液体，用DMF洗涤3次，每次15mL。
（7）去Teoc保护基：加入1.04g（4mmol）四丁基氟化铵的DMF混合溶液，25-35℃下反应2小时，抽除液体，用DMF洗涤3次，每次15mL。
（8）偶联L-Hor：将0.73g (3.0mmol) L-Hor-OH和0.51g (3.0mmol) 6-Cl-HOBt用溶剂DMF溶解，冰浴冷却温度为0～10℃，加入465uL (3.0mmol) DIC，激活5分钟后加入到反应柱中与脱完保护的载体进行反应，25-35℃下反应2小时，抽除液体，DMF洗涤3次，每次15mL。
（9）裂解：将上述肽树脂用15mL VTIS:VPhSMe:VTFA=5:5:90裂解液裂解；裂解时间：2小时；过滤，旋蒸，旋蒸母液加入90mL的乙醚中，沉降后离心洗涤5次，每次45mL。制得地加瑞克粗肽1.72g。
（10）第一次纯化：将色谱柱用50%乙腈冲洗干净后用5%乙腈平衡系统5min，以1-3g/次的上样量进行HPLC纯化，流动相：A为0.1%TFA水溶液; 流动相B为乙腈；梯度程序为:初始状态流动相B为10%，保持5分钟，然后在60分钟内将流动相B比例增至50%;流速为：20 mL／min。于280nm波长处检测，根据色谱峰分段收集馏分，并将收集的馏分用分析液相色谱仪进行检测，纯度≥99.0%且单杂≤0.2%馏分即为第一步合格馏分。其余为不合格馏分，不合格馏分中纯度大于80%部分再进行回收纯化，纯度小于80%舍弃。
（11）第二次纯化：将色谱柱用50%乙腈冲洗干净后用5%乙腈平衡系统5min，以1-3g/次的上样量进行HPLC纯化，流动相：A为0.3%醋酸水溶液; 流动相B为乙腈；梯度程序为:初始状态流动相B为10%，保持5分钟，然后在60分钟内将流动相B比例增至50%;流速为：20 mL／min。于280nm波长处检测，根据色谱峰分段收集馏分，并将收集的馏分用分析液相色谱仪进行检测，纯度≥99.8%且单杂≤0.1%馏分即为第二步合格馏分。其余为不合格馏分，不合格馏分中纯度大于80%部分再进行回收纯化，纯度小于80%舍弃。
（12）转盐、浓缩及冻干：将色谱柱用50%乙腈冲洗干净后用5%乙腈平衡系统5min，以1-3g/次的上样量进行HPLC纯化，样品加入30%醋酸溶解，按照上述梯度要求进行转盐，于280nm波长处检测，根据色谱峰分段收集馏分，浓缩至20mg/mL左右，冻干后得到醋酸地加瑞克精肽：0.90g，纯度：99.85%，收率：53.1%。精肽图谱见图2。
实施例2：
（1）取200.0g（100.0mmol）的Rink Amide MBHA (取代度=0.50mmol/g)树脂加入到反应柱中，加入1500mLDCM溶胀30min，去保护：加入1500mL的V哌啶:VDMF =20:80混合溶液，搅拌反应5min后抽滤除去液体，再次加入上述混合溶液，搅拌反应10min后抽滤除去液体，如此进行2次脱保护，然后用DMF洗涤6次，每次1500mL。 
（2）偶联Fmoc-D-Ala-OH：将94.2g (300.0mmol) Fmoc-D-Ala-OH和51.2g (300.0mmol) 6-Cl-HOBt用溶剂DMF溶解，冰浴冷却温度为0～10℃，加入47mL (300.0mmol) DIC，激活5分钟后加入到反应柱中与脱完保护的载体进行反应，25-35℃下反应2小时，抽除液体，DMF洗涤3次，每次1500mL。
（3）重复偶联：重复去除Fmoc保护基及接肽反应步骤的操作，按照地加瑞克氨基酸序列，依次偶联：Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ilys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-4Aph(Dde)-OH、Fmoc-4Aph(Teoc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-3Pal-OH、Fmoc-D-Phe(4Cl)-OH、Fmoc-D-2Nal-OH。
（4）醋酐封端：先脱去保护基Fmoc，加入1500mL的V哌啶:VDMF =20:80混合溶液，搅拌反应5min后抽滤除去液体，再次加入上述混合溶液，搅拌反应10min后抽滤除去液体，如此进行2次脱保护，然后用DMF洗涤6次，每次1500mL。取100mL醋酐、100mL吡啶和100mLDMF，冰浴冷却，缓慢加入载体中，25-35℃下反应2小时，抽除液体，用DMF洗涤6次，每次1500mL。
（5）去Dde保护基：加入1500mL的V水合肼:VDMF =2:98混合溶液，搅拌反应5min后抽滤除去液体，再次加入上述混合溶液，搅拌反应10min后抽滤除去液体，如此进行2次脱保护，然后用DMF洗涤6次，每次1500mL。
（6）偶联Cbm：加入27mL（200mmol）三甲基硅基异氰酸酯的DMF溶液，冰浴冷却，缓慢加入载体中，低温反应2小时，25-35℃下反应24小时，抽除液体，用DMF洗涤3次，每次1500mL。
（7）去Teoc保护基：加入104g（400mmol）四丁基氟化铵的DMF混合溶液，25-35℃下反应2小时，抽除液体，用DMF洗涤3次，每次1500mL。
（8）偶联L-Hor：将73.4g (300.0mmol) L-Hor-OH和51.2g (300.0mmol) 6-Cl-HOBt用溶剂DMF溶解，冰浴冷却温度为0～10℃，加入47mL (300.0mmol) DIC，激活5分钟后加入到反应柱中与脱完保护的载体进行反应，25-35℃下反应2小时，抽除液体，DMF洗涤3次，每次1500mL。
（9）裂解：将上述肽树脂用1500mL VTIS:VPhSMe:VTFA=5:5:90裂解液裂解；裂解时间：2小时；过滤，旋蒸，旋蒸母液加入9000mL的乙醚中，沉降后离心洗涤5次，每次4500mL。制得地加瑞克粗肽175g。
（10）第一次纯化：将色谱柱用50%乙腈冲洗干净后用5%乙腈平衡系统5min，以20-35g/次的上样量进行HPLC纯化，流动相：A为0.1%TFA水溶液; 流动相B为乙腈；梯度程序为:初始状态流动相B为10%，保持5分钟，然后在60分钟内将流动相B比例增至50%;流速为：80 mL／min。于280nm波长处检测，根据色谱峰分段收集馏分，并将收集的馏分用分析液相色谱仪进行检测，纯度≥99.0%且单杂≤0.2%馏分即为第一步合格馏分。其余为不合格馏分，不合格馏分中纯度大于80%部分再进行回收纯化，纯度小于80%舍弃。
（11）第二次纯化：将色谱柱用50%乙腈冲洗干净后用5%乙腈平衡系统5min，以20-35g/次的上样量进行HPLC纯化，流动相：A为0.1%醋酸水溶液; 流动相B为乙腈；梯度程序为:初始状态流动相B为10%，保持5分钟，然后在60分钟内将流动相B比例增至50%;流速为：80 mL／min。于280nm波长处检测，根据色谱峰分段收集馏分，并将收集的馏分用分析液相色谱仪进行检测，纯度≥99.8%且单杂≤0.1%馏分即为第二步合格馏分。其余为不合格馏分，不合格馏分中纯度大于80%部分再进行回收纯化，纯度小于80%舍弃。
（12）转盐、浓缩及冻干：将色谱柱用50%乙腈冲洗干净后用5%乙腈平衡系统5min，以20-35g/次的上样量进行HPLC纯化，将第二次纯化合格馏分合并、浓缩处理后，按照上述梯度要求进行转盐，于280nm波长处检测，根据色谱峰分段收集馏分，浓缩至20mg/mL左右，冻干后得到醋酸地加瑞克精肽：93.8 g，纯度：99.86%，收率：55.2%。精肽图谱见图3。

Claims (3)

1.一种制备醋酸地加瑞克的方法，所述方法步骤如下：
步骤1，在Rink Amide MBHA 树脂上依次偶联10个氨基酸，然后脱去保护基Fmoc，醋酐封端；
步骤2，使用V水合肼:VDMF =2:98混合溶液去6位D-苯丙氨酸残基侧链氨基上的Dde，加入三甲基硅基异氰酸酯的DMF溶液，使6位D-苯丙氨酸残基侧链氨基偶联上Cbm；
步骤3，使用四丁基氟化铵的DMF混合溶液去5位苯丙氨酸残基侧链氨基上的Teoc，加入L-Hor-OH、6-Cl-HOBt和DIC，使5位苯丙氨酸残基侧链氨基偶联上L-Hor；
步骤4，裂解、纯化、冻干后得到醋酸地加瑞克。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：
其中，步骤1所述合成方法，以Rink Amide MBHA 树脂载体为起始原料，依次偶联10个氨基酸，偶联氨基酸顺序为：Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ilys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-4Aph(Dde)-OH、Fmoc-4Aph(Teoc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-3Pal-OH、Fmoc-D-Phe(4Cl)-OH、Fmoc-D-2Nal-OH，然后脱去保护基Fmoc，醋酐封端；
其中，步骤2所述使用V水合肼:VDMF =2:98混合溶液去6位D-苯丙氨酸残基侧链氨基上的Dde，加入三甲基硅基异氰酸酯的DMF溶液，使6位D-苯丙氨酸残基侧链氨基偶联上Cbm；操作过程为：V水合肼:VDMF =2:98混合溶液，在25-35℃下反应5min，搅拌反应后抽滤除去液体，再次加入上述溶液，25-35℃下反应10min，搅拌反应后抽滤除去液体，然后用DMF洗涤6次后，加入三甲基硅基异氰酸酯的DMF溶液，冰浴冷却，缓慢加入载体中，低温反应2小时，常温下反应24小时，抽除液体，用DMF洗涤3次；
其中，步骤3所述使用四丁基氟化铵的DMF混合溶液去5位苯丙氨酸残基侧链氨基上的Teoc，加入L-Hor-OH、6-Cl-HOBt和DIC，使5位苯丙氨酸残基侧链氨基偶联上L-Hor，偶联条件为：缩合试剂为：Cl-HOBt和DIC，反应溶剂为：DMF，反应温度：在25-35oC反应2小时，常温下反应结束后，抽除液体，DMF洗涤3次；
其中，步骤4所述的地加瑞克的裂解，裂解液为：VTIS : VPhSMe :VTFA=5: 5: 90；裂解时间：2小时，旋蒸后滤液加入到其体积6-10倍的乙醚中，沉降后离心洗涤6次制得地加瑞克粗肽。
3.根据权利要求1 所述的方法，其特征是：选择了一条正交、特异性强的保护基合成策略合成地加瑞克，在Rink Amide MBHA 树脂的载体上分步、正交、特异性的去保护后偶联上相应的构件得到地加瑞克，该方法直接在载体上合成修饰有效的构件，避免了直接购买或者液相合成昂贵的非天然氨基酸，有效地提高了收率、降低生产成本。
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