CN102329373B - 地加瑞克的固相合成工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及地加瑞克的一种固相合成方法，包括以下步骤：1）树脂与Fmoc-D-Ala-OH得到Fmoc-D-Ala-树脂；树脂是氨基树脂；2）采用Fmoc固相合成策略依次将按地加瑞克的氨基酸排列顺序进行连接；3）去除N端Fmoc，用乙酸酐和吡啶进行乙酰化；4）去除C端第6个氨基酸残基-4Aph（X）上的保护基X；5）将L-4,5-dihydrooroticacid连接到C端第6个氨基酸残基-4Aph的侧链氨基上；6）用裂解试剂切割肽树脂，无水乙醚沉淀，离心后得粗肽；7）经纯化分离得地加瑞克。本发明操作简单，对人体和环境危害小，且该工艺有效的降低了杂质的含量，能够进行规模化生产。

Description

地加瑞克的固相合成工艺
技术领域
本发明涉及一种地加瑞克的制备方法，尤其涉及地加瑞克的固相合成方法。
背景技术
地加瑞克（英文名：DegareIix）是丹麦辉凌制药有限公司研发的前列腺癌治疗药，2008年12月24日获美国食品和药物管理局(FDA)批准上市。它属于“促性腺激素释放激素(GnRH)”受体抑制剂类药物，主要针对晚期前列腺癌患者，通过抑制睾丸激素来延缓前列腺癌的病程发展。
作为一个人工合成的十肽，Degarelix存在以下化学结构：
该化学结构中C端第五个氨基酸Aph（L-Hor）上的六元环L-Hor在碱性条件下容易发生异构化反应，生成乙内酰脲-5-乙酸（详见：Koedjikov,A.H.et.al.,J.Chem.Soc.Perkin,Trans.2,1984,1077-1081;Kaneti,J.et.al.,Org.Biomol.Chem.,2004,1098-1103），反应机理如下式所示：
    该机制导致Aph（L-Hor）发生如下转变（详见WO2010121835）: 
上述反应会导致产品中存在一个和目标产物性质相近的杂质Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser-Aph（Z）-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2，其中Z代表乙内酰脲-5-乙酰基，增大了纯化难度并降低了产品收率。
WO2011066386和US5925730采用Boc固相合成策略，临时保护基的脱除都是在酸性条件下（TFA）进行。虽然有效的避免了Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser-Aph（Z）-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2的产生，但Boc策略最终要用到HF进行裂解，对人和环境有较大的危害。
WO2010121835采用Fmoc固相合成策略，以Rink amide AM或Rink amide MBHA为固相载体，5位和6位分别以Fmoc-Aph（L-hor）-OH和Fmoc-Aph（tBuCbm）-OH进行偶联。该方法操作复杂，且L-Hor在之后的反复脱保护过程中容易发生异构化，同时Aph（tBuCbm）侧链上保护基的脱除是在水溶液中进行，进一步加大了发生异构化的可能性，最终导致产生0.1~0.3%的Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser-Aph（Z）-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2杂质。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术存在的上述问题，提供一种反应条件温和、操作简单、生产安全、环境污染小、高收率、高质量、适合规模化生产的地加瑞克固相合成方法。
本发明的技术解决方案是：一种地加瑞克的固相合成方法，包括以下步骤：
1）树脂与Fmoc-D-Ala-OH得到Fmoc-D-Ala-树脂； 
2）采用Fmoc固相合成策略依次将Fmoc-Pro-OH、Fmoc-ILys（Boc）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-4Aph（Cbm）-OH、Fmoc-4Aph（X）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-D-3Pal-OH、Fmoc-D-Phe（4Cl）-OH以及Fmoc-D-2Nal-OH按地加瑞克的氨基酸排列顺序进行连接；
3）去除N端Fmoc，用乙酸酐和吡啶进行乙酰化；
4）去除C端第6个氨基酸残基-4Aph（X）上的保护基X；
5） 将L-4,5-dihydroorotic acid连接到C端第6个氨基酸残基-4Aph的侧链氨基上；
6）用裂解试剂切割肽树脂，无水乙醚沉淀，离心后得到粗肽；
7）经纯化分离得地加瑞克。
上述地加瑞克固相合成方法中，步骤1）所用树脂优选Sieber树脂或Rink amide BHA以及9-Fmoc-Aminoxanthen-3-yloxy-acetamidomethyl树脂，树脂替代度为0.3~0.8mmol/g。
上述地加瑞克固相合成方法中， C端第5个氨基酸Fmoc-D-4Aph（Cbm）-OH由Fmoc-D-4Aph-OH和三甲基硅基异氰酸酯合成获得，反应溶剂为DMF,反应温度为0~15℃。
上述地加瑞克固相合成方法中，Fmoc-4Aph（X）-OH由Fmoc-D-4Aph-OH和X-Cl合成获得，反应溶剂为DCM，反应温度为0~15℃。Fmoc-4Aph（X）-OH中保护基团X为Trt或Alloc。
上述地加瑞克固相合成方法中，乙酸酐和吡啶的摩尔用量分别为N端自由氨基的10~40倍。
上述地加瑞克固相合成方法中，脱除Trt的试剂为TFA和DCM；脱除Alloc的试剂为Pd（Ph3P）4和苯硅烷和DCM。上述地加瑞克固相合成方法中， TFA和DCM中TFA的体积比为5~10%，常温搅拌反应1.5~2h。
上述地加瑞克固相合成方法中，Pd（Ph3P）4和苯硅烷和DCM中Pd（Ph3P）4的摩尔用量为侧链保护基的0.25~1倍；苯硅烷的摩尔用量为侧链保护基的10~20倍，常温搅拌反应0.5~1h。
上述地加瑞克固相合成方法中，裂解试剂为三氟乙酸和苯甲硫醚和苯甲醚和1,2-乙二硫醇，其体积比为90:5:3:2，裂解条件为室温搅拌2~3h，沉淀粗肽时无水乙醚体积为8~12倍。
上述地加瑞克固相合成方法中，使用偶联剂，偶联剂为DIC+Y，其中Y为HOBt或HOAt，反应溶剂为DMF或DMF和DCM混合溶剂，室温搅拌反应2~3h。
与已有的地加瑞克合成方法相比，本发明地加瑞克的固相合成工艺具有以下优点：
1）本发明采用了Fmoc策略，与WO2011066386采用的Boc策略相比，避免了剧毒、强腐蚀性的氟化氢的使用，反应条件更温和，使生产人员更安全，并大大减轻了环保压力。
2）本发明创造性的采用Fmoc-Aph（Cbm）-OH和Fmoc-Aph（X）-OH为地加瑞克序列C端第5和6个氨基酸的合成原料，其中X为Trt或Alloc。与WO2010121835相比，本发明在N端乙酰化化以后，才进行L-Hor基团的导入，避免了L-Hor与碱的接触，降低了其发生异构化的可能性。同时，本发明最终的裂解切割在无水条件下进行，进一步减少了L-Hor异构化的可能性。WO2010121835中，Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser-Aph（Z）-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2的含量为0.1~0.3%，采用本发明的合成方法，该杂质的含量能稳定有效的控制在0.1%以下。
3) 本发明通过合适的反应条件选择，保证了每步反应完全，不需要进行WO2010121835中繁琐的封闭操作，使得本发明操作简单，易于规模化生产。
具体实施方式
本发明公开了一种地加瑞克的固相合成工艺，主要用于降低相关杂质含量，提高地加瑞克的纯度和收率，利于规模化生产，其主要步骤包括：
1）树脂与Fmoc-D-Ala-OH得到Fmoc-D-Ala-树脂； 
2）采用Fmoc固相合成策略依次将Fmoc-Pro-OH、Fmoc-ILys（Boc）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-4Aph（Cbm）-OH、Fmoc-4Aph（X）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-D-3Pal-OH、Fmoc-D-Phe（4Cl）-OH以及Fmoc-D-2Nal-OH按地加瑞克的氨基酸排列顺序进行连接；
3）去除N端Fmoc，用乙酸酐和吡啶进行乙酰化；
4）去除C端第6个氨基酸残基-4Aph（X）上的保护基X；
5） 将L-4,5-dihydroorotic acid连接到C端第6个氨基酸残基-4Aph的侧链氨基上；
6）用裂解试剂切割肽树脂，无水乙醚沉淀，离心后得到粗肽；
7）经纯化分离得地加瑞克。
以下是对本发明技术方案的进行进一步详细描述。
实施例1：Fmoc-D-Ala-Sieber树脂的合成
将Sieber树脂（10mmol，替代度0.3mmol/g）装入固相反应柱，DMF洗两遍，加入500ml DMF溶胀30min。加入500ml 20% DBLK脱保护10min，再次加入500ml 20% DBLK脱保护15min，DMF洗涤6次。用60mlDMF溶解 9.34g Fmoc-D-Ala-OH和4.26gHOBt，冰浴10分钟，加入4.9ml DIC,预活化2~5min，将活化好的溶液加入固相反应柱，搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗6次，DCM洗3次，MeOH收缩三次（时间分别为5min，5min和10min）、干燥后得到Fmoc-D-Ala-Sieber树脂，经检测替代度为0.298mmol/g。
实施例2：Fmoc-D-Ala-Sieber树脂的合成
将Sieber树脂（10mmol，替代度0.5mmol/g）装入固相反应柱，DMF洗两遍，加入500ml DMF溶胀30min。加入500ml 20% DBLK脱保护10min，再次加入500ml 20% DBLK脱保护15min，DMF洗涤6次。用60mlDMF溶解 9.34g Fmoc-D-Ala-OH和4.26gHOBt，冰浴10分钟，加入4.9ml DIC,预活化2~5min，将活化好的溶液加入固相反应柱，搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗6次，DCM洗3次，MeOH收缩三次（时间分别为5min，5min和10min），干燥后得到Fmoc-D-Ala-Sieber树脂,经检测替代度为0.495mmol/g.
实施例3：Fmoc-D-Ala-Sieber树脂的合成
将Sieber树脂（10mmol，替代度0.8mmol/g）装入固相反应柱，DMF洗两遍，加入500ml DMF溶胀30min。加入500ml 20% DBLK脱保护10min，再次加入500ml 20% DBLK脱保护15min，DMF洗涤6次。用60mlDMF溶解 9.34g Fmoc-D-Ala-OH和4.26gHOBt，冰浴10分钟，加入4.9ml DIC,预活化2~5min，将活化好的溶液加入固相反应柱，搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗6次，DCM洗3次，MeOH收缩三次（时间分别为5min，5min和10min），干燥后得到Fmoc-D-Ala-Sieber树脂，经检测替代度为0.799mmol/g。
实施例4：Ac-D-2Nal-D-Phe（4Cl）-D-Pal-Ser-Aph（Alloc）-Aph（Cbm）-Leu-ILys（Boc）-Pro-D-Ala-Sieber树脂的合成
将Fmoc-D-Ala-Sieber树脂（10mmol）装入固相反应柱，DMF洗2次，再次加入100mlDMF溶胀30min，20% DBLK脱保护两次（时间分别为5min和7min），DMF洗涤6次。
用60mlDMF溶解 10.122g Fmoc-D-Pro-OH和4.26gHOBt，冰浴10分钟，加入4.9ml DIC,预活化2~5min，将活化好的溶液加入固相反应柱，搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗3次，20% DBLK脱保护两次（时间分别为5min和7min），DMF洗涤6次。
重复以上步骤，依次完成Fmoc-ILys（Boc）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-4Aph（Cbm）-OH、Fmoc-4Aph（Alloc）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-D-3Pal-OH、Fmoc-D-Phe（4Cl）-OH以及Fmoc-D-2Nal-OH的连接。
将40g乙酸酐和32g吡啶混合均匀后加入到固相反应柱，搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DCM洗涤3次，DMF洗涤6次。
实施例5：Ac-D-2Nal-D-Phe（4Cl）-D-Pal-Ser-Aph（Trt）-Aph（Cbm）-Leu-ILys（Boc）-Pro-D-Ala-Sieber树脂的合成
将Fmoc-D-Ala-Sieber树脂（10mmol）装入固相反应柱，DMF洗2次，再次加入100mlDMF溶胀30min，20% DBLK脱保护两次（时间分别为5min和7min），DMF洗涤6次。
用60mlDMF溶解 10.122g Fmoc-D-Pro-OH和4.26gHOBt，冰浴10分钟，加入4.9ml DIC,预活化2~5min，将活化好的溶液加入固相反应柱，搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗3次，20% DBLK脱保护两次（时间分别为5min和7min），DMF洗涤6次。
重复以上步骤，依次完成氨基酸Fmoc-ILys（Boc）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-4Aph（Cbm）-OH、Fmoc-4Aph（Trt）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-D-3Pal-OH、Fmoc-D-Phe（4Cl）-OH以及Fmoc-D-2Nal-OH的连接。
将40g乙酸酐和32g吡啶混合均匀后加入到固相反应柱，搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DCM洗涤3次，DMF洗涤6次。
实施例6：Ac-D-2Nal-D-Phe（4Cl）-D-Pal-Ser-Aph-Aph（Cbm）-Leu-ILys（Boc）-Pro-D-Ala-Sieber树脂的合成
在装有Ac-D-2Nal-D-Phe（4Cl）-D-Pal-Ser-Aph（Alloc）-Aph（Cbm）-Leu-ILys（Boc）-Pro-D-Ala-Sieber树脂的固相反应柱中加入2.89g四（三苯基膦）钯、12.99g苯硅烷和100ml DCM,搅拌反应0.5h,抽干，DCM洗涤3次，DMF洗涤6次，DCM再洗涤3次。
实施例7：Ac-D-2Nal-D-Phe（4Cl）-D-Pal-Ser-Aph-Aph（Cbm）-Leu-ILys（Boc）-Pro-D-Ala-Sieber树脂的合成
在装有Ac-D-2Nal-D-Phe（4Cl）-D-Pal-Ser-Aph（Trt）-Aph（Cbm）-Leu-ILys（Boc）-Pro-D-Ala-Sieber树脂的固相反应柱中加入100ml 10% TFA/DCM溶液，室温搅拌反应2h，抽干，DCM洗涤3次，DMF洗涤6次。
实施例8：Ac-D-2Nal-D-Phe（4Cl）-D-Pal-Ser-Aph（L-Hor）-Aph（Cbm）-Leu-ILys（Boc）-Pro-D-Ala-Sieber树脂的合成
用60ml DMF溶解4.93g L-hydroorotic acid和4.26g HOBt，冰浴10分钟，加入4.9ml DIC,预活化2~5min，将活化好的溶液加入到装有Ac-D-2Nal-D-Phe（4Cl）-D-Pal-Ser-Aph-Aph（Cbm）-Leu-ILys（Boc）-Pro-D-Ala-Sieber树脂（10mmol）的固相反应柱，搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤6次，DCM洗涤3次，收缩三次（时间分别为5min，5min和10min），真空干燥后得到36.81g肽树脂。
实施例9：肽树脂的裂解
将360ml冰冻（-5℃）好的裂解液（三氟乙酸：苯甲硫醚：苯甲醚：1,2-乙二硫醇=90:5:3:2）加入到装有肽树脂的圆底烧瓶中，室温搅拌反应2h，过滤，滤液加入到3.6L冰冻无水乙醚中，离心，干燥后得到16.8g粗肽（收率:99.4%，纯度：92%）。
实施例10：粗肽的纯化
（1）溶解
将粗肽称重，碾碎放至烧杯中，以约30g/L量加入40%(v/v)乙腈+60%(v/v)水溶液，超声波超声至完全溶解。使用0.45μm尼龙66微孔滤膜过滤。
（2）纯化
a）第一次纯化：
将色谱柱用50%乙腈冲洗干净后用5%乙腈平衡系统5分钟后，以16-23克/次的上样量进行HPLC纯化，于280nm波长处监测，根据色谱峰分段收集馏分，并将收集的馏分用分析液相色谱仪进行检测，纯度≥99.0％且单杂≤0.2％馏分即为第一步合格馏分。其余为不合格馏分，不合格馏分中纯度大于80％部分再进行回收纯化，纯度小于80％作废液处理。
    b）第二次纯化：
将色谱柱用50%乙腈冲洗干净后用5%乙腈平衡系统5分钟后，以14-20克/次的上样量进行HPLC纯化，于280nm波长处监测，根据色谱峰分段收集馏分，并将收集的馏分用分析液相色谱仪进行检测，纯度≥99.8％且单杂≤0.1％馏分即为第二步合格馏分。其余为不合格馏分，不合格馏分中纯度大于80％部分再进行回收纯化，纯度小于80％作废液处理。
c）脱盐、浓缩及冻干：
将色谱柱用50%乙腈冲洗干净后用流动相A2相和5%乙腈平衡柱子5min上样，上样17-23克。样品若已析出聚集，加入30%醋酸超声溶解后加水稀释，按照上述梯度要求进行转盐，于280nm波长处监测色谱峰，收集出峰馏分，浓缩至20mg/ml左右，冻干后得到6.8g精肽（收率40%，纯度：99.8%）。
实施例11：Fmoc-Aph（Alloc）-OH的合成
向500ml的两口圆底烧瓶中加入Fmoc-4-Amino-L-Phe–OH 16g（40mmol），加入二氯甲烷100ml，搅拌下溶解。冰水浴保持二氯甲烷溶液的温度处于0~15℃之间，向二氯甲烷溶液中加入三乙胺 11.1ml（80mmol），继续搅拌。烯丙氧羰基氯（Alloc-Cl）8.5ml（80mmol）溶于 100ml二氯甲烷中，缓慢滴加至圆底烧瓶中，期间控制圆底烧瓶内的二氯甲烷溶液温度低于15℃。滴加完毕之后保持0~15℃两个小时，之后恢复至室温反应两个小时。
反应液过滤，滤液用碳酸氢钠水溶液（5%）洗涤（100ml*3），柠檬酸水溶液（5%）洗涤（100ml*3），无水硫酸钠干燥有机相。过滤，旋干，残余物柱层析纯化，洗脱剂乙酸乙酯：石油醚=1:3，得到最终产物Fmoc-4-Amino-L-Phe(Alloc)-OH 15.2g，收率78%。 
实施例12：FmocAph（Trt）-OH的合成
向500ml的两口圆底烧瓶中加入Fmoc-4-Amino-L-Phe–OH 16g（40mmol），加入二氯甲烷100ml，搅拌下溶解。冰水浴保持二氯甲烷溶液的温度处于0~15℃之间，向二氯甲烷溶液中加入三乙胺 11.1ml（80mmol），继续搅拌。三苯甲基氯（Trt-Cl）22.3g（80mmol）溶于 100ml二氯甲烷中，缓慢滴加至圆底烧瓶中，期间控制圆底烧瓶内的二氯甲烷溶液温度低于15℃。滴加完毕之后保持0~15℃两个小时，之后恢复至室温反应两个小时。
反应液过滤，滤液用碳酸氢钠水溶液（5%）洗涤（100ml*3），柠檬酸水溶液（5%）洗涤（100ml*3），无水硫酸钠干燥有机相。过滤，旋干，残余物柱层析纯化，洗脱剂乙酸乙酯：石油醚=1:3，得到最终产物Fmoc-4-Amino-L-Phe(Trt)-OH 20.8g，收率80.1%。 
实施例13：Fmoc-D-Aph（Cbm）-OH的合成
在一个100ml单口烧瓶中，30ml DMF溶解Fmoc-4-Amino-D-Phe–OH（40g，0.1mol），冰水浴下保持反应体系内部温度处于0~15℃之间。三甲基硅基异氰酸酯（trimethylsilyl isocyanate）27ml（0.2mol）溶于20ml DMF中，剧烈搅拌下缓慢滴加至反应瓶中，滴加过程中保持反应温度处于0~15℃之间，之后保持0~15℃两个小时，之后保持室温搅拌24h。
反应液倒入3L水中，析出白色固体，抽滤，得到粗产品约40g。五氧化二磷真空干燥5小时。硅胶柱层析进行纯化，展开剂乙酸乙酯：石油醚=1:2，得最终产物Fmoc-4-ureido-D-Phe-OH 20g，收率45%。
以上描述中，缩写及其代表如下：
DIC N,N'-二异丙基碳二亚胺
HOBt 1-羟基苯并三唑
DCM 二氯甲烷
DMF N,N-二甲基甲酰胺
20%DBLK 20%六氢吡啶（v）/N,N-二甲基甲酰胺 (v)
Fmoc-D-4Aph(Cbm)-OH Fmoc-4-ureido-D-Phe-OH
Fmoc-4Aph(Alloc)-OH Fmoc-4-Amino-L-Phe(Alloc)-OH
Fmoc-4Aph(L-Hor)-OH Fmoc-4-Amino-L-Phe(hydroorotyl)-OH
Fmoc-4Aph(Trt)-OH Fmoc-4-Amino-L-Phe(Trt)-OH
Fmoc-D-3Pal-OH Fmoc-3-(3-Pyridyl)-D-Alanine
Fmoc-D-Phe(4Cl)-OH Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH
Fmoc-D-2Nal-OH Fmoc-3-(2-Naphthyl)-D-alanine
Fmoc-ILys(Boc)-OH Fmoc-N(ε)-isopropyl-N(ε)-Boc-lysine

Claims (8)

1.一种地加瑞克的制备方法，包括以下步骤：
1）树脂与Fmoc-D-Ala-OH得到Fmoc-D-Ala-树脂；
2）采用Fmoc固相合成策略依次将Fmoc-Pro-OH、Fmoc-ILys（Boc）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-4Aph（Cbm）-OH、Fmoc-4Aph（X）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-D-3Pal-OH、Fmoc-D-Phe（4Cl）-OH以及Fmoc-D-2Nal-OH按地加瑞克的氨基酸排列顺序进行连接，所述Fmoc-4Aph（X）-OH的保护基团X为Trt或Alloc，所述Fmoc-4Aph（X）-OH由Fmoc-D-4Aph-OH和X-Cl合成获得，反应溶剂为DCM，反应温度为0～15℃；
3）去除N端Fmoc，用乙酸酐和吡啶进行乙酰化；
4）去除C端第6个氨基酸残基-4Aph（X）上的保护基X；
5）将L-4,5-dihydroorotic acid连接到C端第6个氨基酸残基-4Aph的侧链氨基上；
6）用裂解试剂切割肽树脂，无水乙醚沉淀，离心后得到粗肽；
7）经纯化分离得地加瑞克。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：树脂为Rink Amide-BHA树脂、Sieber树脂或9-Fmoc-Aminoxanthen-3-yloxy-polystyrene树脂，替代度为0.3～0.8mmol/g。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述Fmoc-D-4Aph（Cbm）-OH由Fmoc-D-4Aph-OH和三甲基硅基异氰酸酯合成获得，反应溶剂为DMF,反应温度为0～15℃。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤4）中去除C端第6个氨基酸残基-4Aph（X）上的保护基X，X为Trt或Alloc，去除Trt的试剂为TFA和DCM的混合试剂；去除Alloc的试剂为Pd（Ph3P）4和苯硅烷和DCM的混合试剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述TFA和DCM的混合试剂中TFA的体积比为5～10%，常温搅拌反应1.5～2h。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述Pd（Ph3P）4和苯硅烷和DCM的混合试剂中Pd（Ph3P）4的摩尔用量为侧链保护基Alloc的0.25～1倍；苯硅烷的摩尔用量为侧链保护基Alloc的10～20倍，常温搅拌反应0.5～1h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述裂解试剂为三氟乙酸和苯甲硫醚和苯甲醚和1,2-乙二硫醇的混合试剂，其体积比为90:5:3:2，裂解条件为室温搅拌2～3h，沉淀粗肽时无水乙醚体积为裂解试剂的8～12倍。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述固相合成过程中使用偶联剂，偶联剂为DIC+Y，其中Y为HOBt或HOAt，反应溶剂为DMF或DMF和DCM混合溶剂，室温搅拌反应2～3h。
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