CN103374054A - 一步法固相合成多肽的方法 - Google Patents
一步法固相合成多肽的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103374054A CN103374054A CN201210131067XA CN201210131067A CN103374054A CN 103374054 A CN103374054 A CN 103374054A CN 201210131067X A CN201210131067X A CN 201210131067XA CN 201210131067 A CN201210131067 A CN 201210131067A CN 103374054 A CN103374054 A CN 103374054A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dmf
- amino acid
- fmoc
- resin
- condensing agent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种一步法固相合成多肽的方法，每次连接保护氨基酸所进行的缩合反应中都采用了氮气或惰性气体吹入使挥发性溶剂挥发降温技术，向反应混合物中通入氮气或惰性气体使挥发性溶剂挥发可以保持反应体系温度在15-20℃。加入助缩合剂启动缩合反应后，通过保温装置使缩合反应体系温度一直稳定在22-28℃。在保护氨基酸缩合时，无需在活化器中低温活化氨基酸再转移至缩合反应器中，从而使合成多肽的所有化学反应在同一个反应器内依次连续完成。本发明提供的合成增血压素的方法环保、高效，对设备要求低，可应用于规模化工业生产。
Description
技术领域
本发明属于药物合成工艺领域。更具体地，本发明涉及一种一步法固相合成多肽的方法。
背景技术
多肽的化学合成目前主要有液相合成和固相合成两种方法。液相合成的优点是每步中间产物的合成可以直接进行过程控制，并有机会得以纯化；缺点是工艺复杂，占用较多工时与人力，需要较多设备与场地。固相合成工艺简单，占用工时与人力较少，物料转移较少而节省设备与场地；其缺点是每步中间产物不可以纯化，必须优化各步反应条件使得转化率接近100％、而且尽可能避免副反应的发生。专利US2978444中描述了一种液相合成增血压素的方法，该工艺路线运用了聚合式合成策略，具有较高的效率，但以下两个问题使得该路线较难获得高纯度产品：在肽片段缩合反应中，肽片段C端氨基酸、特别是His容易消旋；该路线中反复使用了皂化反应，在强碱性水溶液中Asn侧链容易脱酰胺。另外该方法使用了氢化反应，需要特殊设备和工作条件，还要使用较为昂贵的金属催化剂、且容易导致产品中残留重金属问题。更为重要的是，该专利方法无法实现连续合成，需要占用较多生产设备(如反应釜等)与人力、工时。文献Biochemistry 1965，Vol4：2394报道了一种线性合成策略，由于使用了固相合成技术，工艺相对简单，能够保证较高的收率。但该路线使用了氯甲基树脂，最后需要使用氢溴酸将肽链从树脂上解离下来，而且侧链保护基团硝基和苄基在氢化反应中难以完全解离。
多肽药物合成工艺的关键问题之一是对保护氨基酸消旋的控制(中国药物杂2010，Vol 19：102)。专利US6015881对抑制缩合反应中保护氨基酸的消旋提供了一种通行的解决方案。该方案认为在低温下预先活化氨基酸对抑制消旋十分重要。氨基酸按照以下方式预活化：Fmoc保护氨基酸、HOBt、DIPEA在室温下溶解后冷却到0-5℃，然后将HBTU加入到上述溶液中搅拌至溶解。HBTU最后加料是因为在其不存在时活化和消旋都不会发生。该方案在生产实施过程中需要有一套独立的反应釜A用于配料、控温和活化保护氨基酸，将活化保护氨基酸溶液转移至缩合反应釜B中，以及随后的设备清洁工作。更为重要的是，虽然保护氨基酸的OBt酯稳定性良好，但如果在反应釜A中贮存时间稍长，因不能和氨基缩合而走向消旋通路，故而对预活化时间需要严格的控制(J.Org.Chem.1997，Vol62：4307)。故而预活化方案增加了合成工艺的复杂度。
综上所述，现在还缺乏一种高效合成多肽的方法，因此仍然迫切需要开发新的多肽的生产工艺。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是克服现有的多肽固相合成中为抑制缩合反应中保护氨基酸的消旋需采用低温预先活化氨基酸，然后将活化保护氨基酸转移至缩合反应釜B中进行缩合反应，该预活化工艺复杂，需要多步骤操作，操作不便，且易造成消旋。为此，本发明对抑制缩合反应中保护氨基酸的消旋提供了一种通行的解决方案，该方案中配料和保护氨基酸的活化和缩合反应都在同一个反应器内连续进行，无需将保护氨基酸在活化器中低温活化再转移至缩合反应器中进行缩合反应。
本发明的技术方案如下：一种一步法固相合成多肽的方法，其中，合成多肽的所有化学反应在同一个反应器内依次连续完成，无需在活化器中低温活化保护氨基酸再转移至缩合反应器中，在进行任一保护氨基酸的缩合反应时，保护氨基酸、缩合剂先溶解在含有树脂或者肽树脂的反应混合物中，该混合物中含有挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂组成的溶剂，然后利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用挥发性有机溶剂的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至15-20℃，然后加入助缩合剂启动缩合反应，缩合反应温度控制在22-28℃。
本发明中，进行缩合反应所用的溶剂由挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂组成，其中可以是进行缩合反应的常规有机溶剂，较佳的，所述的非挥发性有机溶剂选自DMF和DMSO中的一种或两种；所述的挥发性有机溶剂选自DCM和Et2O中的一种或两种。利用氮气流将反应原料充分混匀并使挥发性有机溶剂的挥发，从而因挥发吸热将整个反应系统迅速降温至15-20℃，然后启动缩合反应。
本发明中，所述的树脂是常规的能够和第一个保护氨基酸进行缩合反应的树脂，优选的羧基树脂，更优选wang树脂或Rink Amide-MBHA树脂。
本发明中，所述的保护氨基酸是常规的氨基上有保护基保护的氨基酸，一般是Fmoc保护氨基酸，或者Boc保护氨基酸，优选Fmoc保护氨基酸。
本发明中，所述的缩合反应可以采用本领域常用的缩合体系，包括以下几种中的任何一种，其中第1列AA表示氨基酸，最后一列表示助缩合剂，中间列表示缩合剂，列和列之间用“/”相隔：
(1)AA/HOBt/DIC
(2)AA/HOBt/DCC
(3)AA/TBTU/HOBT/DIPEA或NMM
(4)AA/HATU/HOBT/DIPEA或NMM
(5)AA/HCTU/HOBT/DIPEA或NMM
(6)AA/PyBop/HOBT/DIPEA或NMM
(7)AA/Bop/HOBT/DIPEA或NMM
(8)AA/HATU/HOAT/DIPEA或NMM
(9)AA/HATU/HOBT/DIPEA或NMM
(10)AA/HCTU/HOBt/DIPEA或NMM
(11)AA/CDI/HOBt
(12)AA/CDI/HOAT。
其中，DCC性质和DIC相似，部分氨基酸偶联效果稍优于DIC，但容易结块，操作不便，缩合过程中，中间体不易洗涤，因此本发明优选DIC。
BOP、PyBOP、HATU、HBTU、HCTU均是鎓盐类缩合剂，HATU、HCTU的效果比HBTU好，缩合效率高，但其价格贵。有机碱NMM较DIPEA碱性弱，其他性质基本相似，根据情况可互换。
根据本发明，在缩合反应中，反应温度都控制在22-28℃。缩合反应的反应时间如常规，优选的反应时间是监测达到反应终点为止。
本发明的方法中，缩合反应前或后的步骤都是常规步骤，如脱保护反应、对反应产物肽树脂的洗涤、最后将多肽从树脂上切割下来并脱去保护基等步骤，当然也包括对树脂的溶胀等步骤。
优选的，本发明所述的一步法固相合成多肽的方法包括以下步骤：
(1)在树脂上连接第一个保护氨基酸
在反应容器中，加入溶胀处理后的树脂、第一个保护氨基酸、缩合剂、挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂并混合均匀，同时向反应体系中通入氮气或惰性气体使挥发性溶剂挥发并保持反应体系温度在15-20℃；加入助缩合剂启动保护氨基酸和树脂进行的缩合反应，反应温度控制在22-28℃；反应完全后抽干，将沉淀洗涤；
(2)连接第二个保护氨基酸
在步骤(1)洗涤后含有沉淀的反应容器中，加入有机溶剂和哌啶，进行脱保护基反应；反应完全后抽干，将沉淀洗涤；加入第二个保护氨基酸、缩合剂、挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂并混合均匀，同时向反应体系中通入氮气或惰性气体使挥发性溶剂挥发并保持反应体系温度在15-20℃；加入助缩合剂启动保护氨基酸和肽树脂进行的缩合反应，反应温度控制在22-28℃；反应完全后抽干，将沉淀洗涤；
(3)-(n)连接第三-n个保护氨基酸(n是大于等于4的自然数，是合成的多肽的氨基酸序列中所含的氨基酸残基的数目)
在步骤(2)或步骤(n-1)洗涤后含有沉淀的反应容器中，加入有机溶剂和哌啶，进行脱保护基反应；反应完全后抽干，将沉淀洗涤；加入第三个或者第n个保护氨基酸、缩合剂、挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂并混合均匀，同时向反应体系中通入氮气或惰性气体使挥发性溶剂挥发并保持反应体系温度在15-20℃；加入助缩合剂启动保护氨基酸和肽树脂进行缩合反应，反应温度控制在22-28℃；反应完全后抽干，将沉淀洗涤；
(n+1)脱保护基和切肽
将步骤(n)洗涤后的沉淀进行脱保护基和切肽反应，将切肽反应的反应产物过滤，从滤液中分离肽。
根据本发明，步骤(1)所述树脂的溶胀处理是常规技术，一般用反应溶剂进行充分的溶胀。优选DMF洗涤后用DCM溶胀。步骤(1)中加入助缩合剂启动保护氨基酸和树脂进行缩合反应是常规技术。如其中的助缩合剂一般为有机碱或者DMAP，优选DMAP。步骤(2)中加入助缩合剂启动保护氨基酸和肽树脂进行缩合反应是常规技术。如其中的助缩合剂一般为有机碱，所述的有机碱优选DIPEA，NMM或collidine。各步骤中，反应完全后将反应物抽干，将沉淀洗涤的步骤都是常规技术，一般将反应容器中的液体抽干，余下的固体用洗涤液洗涤，洗涤方法常规，所用的洗涤液常规，优选反应所采用的溶剂或甲醇等，更优选反应中所采用的挥发性有机溶剂，如DMF。
本发明的一较佳实例是，步骤(1)中所述的树脂是wang树脂；所述的保护氨基酸是Fmoc保护氨基酸，所述的缩合剂是HOBt和DIC，所述的非挥发性有机溶剂选自DMF和DMSO中的一种或两种，所述的挥发性有机溶剂选自DCM和Et2O中的一种或两种，所述的助缩合剂是DMAP。
本发明的另一较佳实例是，步骤(1)中所述的树脂是Rink Amide-MBHA树脂；所述的保护氨基酸是Fmoc保护氨基酸，所述的缩合剂是HOBt和HBTU，所述的非挥发性有机溶剂选自DMF和DMSO中的一种或两种，所述的挥发性有机溶剂选自DCM和Et2O中的一种或两种，所述的助缩合剂是DIPEA，NMM或collidine。
步骤(2)中，所述脱保护基反应是本领域常规技术，比如加入哌啶即可在温和的条件下脱除。较佳的是DMF溶剂中，将肽树脂和哌啶进行脱保护反应。一般在肽树脂中加入哌啶的DMF溶液在22-28℃反应即可。优选25℃反应20分钟，进行两次反应。
步骤(2)中所述的第二个保护氨基酸是常规的氨基上有保护基保护的氨基酸，一般是Fmoc保护氨基酸，或者Boc保护氨基酸，优选Fmoc保护氨基酸。步骤(2)中进行缩合反应所用的溶剂由挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂组成，其中可以是保护氨基酸和肽树脂进行缩合反应的常规有机溶剂，较佳的，所述的非挥发性有机溶剂选自DMF和DMSO中的一种或两种；所述的挥发性有机溶剂选自DCM和Et2O中的一种或两种。
本发明的一较佳实例是，步骤(2)中，缩合反应中加入的是Fmoc保护氨基酸，缩合剂是HOBt，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIC。
本发明的另一较佳实例是，步骤(2)中，缩合反应中加入的是Fmoc保护氨基酸，缩合剂是HOBt和HBTU，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIPEA。
本发明中，步骤(3)至步骤(n)和步骤(2)相同，仅仅是所采用的保护氨基酸是连接到树脂上的第3或第n个氨基酸的种类，其他条件相同。
本发明中，步骤(n+1)是本领域常规技术。其中脱保护基和切肽反应可以在一个反应中进行，也可以在两个反应中进行。将步骤(n)洗涤后的沉淀进行脱保护基和切肽反应，将切肽反应的反应产物过滤，从滤液中分离肽，按常规技术将肽脱去保护基，并从树脂上分离下来即可。从滤液中分离肽的技术也是常规技术，一般将滤液浓缩后洗涤干燥即获得多肽粗品。粗品通过常规技术精制即可纯品。精制方法优选制备型反相高压液相色谱分离技术，经梯度洗脱，分部收集所需组分，浓缩后除去溶剂即得纯品。
本发明的一较佳实例是，步骤(n)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的是Boc保护氨基酸，缩合剂是HOBt，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIC；步骤(n+1)中，所述的将步骤(n)洗涤后的沉淀进行脱保护基和切肽反应，包括在步骤(n)洗涤后含有沉淀的反应容器中，加入切肽试剂TFA∶TIS∶H2O＝95∶2.5∶2.5(V/V)进行切肽反应，反应完全后过滤，从滤液中分离肽。
本发明的另一较佳实例是，步骤(n)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的是Fmoc保护氨基酸，缩合剂是HOBt和HBTU，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIPEA；步骤(n+1)中，所述的将步骤(n)洗涤后的沉淀进行脱保护基和切肽反应，包括在步骤(n)洗涤后含有沉淀的反应容器中，加入哌啶的DMF溶液进行脱保护基反应，反应完全后加入切肽试剂如TFA∶TIS∶EDT∶H2O＝95∶2∶2∶1(V/V)(TFA∶TIS∶EDT∶H2O体积比为95∶2∶2∶1的混合物)进行切肽反应，反应完全后过滤，从滤液中分离肽。
本发明中，所述的非挥发性有机溶剂和挥发性有机溶剂的用量比可以是体积比1∶1-5∶1，优选体积比2∶1-3.5∶1。
本发明中，优选的，在所述的的缩合反应中，保护氨基酸是树脂摩尔数的1-3倍，缩合剂是树脂摩尔数的2-6倍，助缩合剂是树脂摩尔数的0.2-4倍，有机溶剂是树脂质量数的6-9倍。
优选的，本发明所述的一步法固相合成多肽的方法中，合成的多肽是增血压素，其中，
步骤(1)中，所述的溶胀处理后的树脂是经DCM溶胀处理的Wang树脂，保护氨基酸是Fmoc-Phe-OH，缩合剂是HOBt和DIC，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DMAP；
步骤(2)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Pro-OH，缩合剂是HOBt和HBTU，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIPEA；
步骤(3)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-His(Trt)-OH，缩合剂是HOBt和HBTU，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIPEA；
步骤(4)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Val-OH，缩合剂是HOBt和HBTU，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIPEA；
步骤(5)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Tyr(tBu)-OH，缩合剂是HOBt和HBTU，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIPEA；
步骤(6)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Val-OH，缩合剂是HOBt和HBTU，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIPEA；
步骤(7)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Arg(pbf)-OH，第一次缩合剂是HOBt和HBTU，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIPEA，第二次缩合剂是HOBt，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIC；
步骤(8)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Boc-Asn-OH，缩合剂是HOBt，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIC(得到保护增血压素树脂Boc-Asn-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂)；
步骤(9)中，所述的将步骤(8)洗涤后的沉淀进行脱保护基和切肽反应，包括在步骤(8)洗涤后含有沉淀的反应容器中，加入切肽试剂TFA∶TIS∶H2O＝95∶2.5∶2.5(V/V)进行切肽反应，反应完全后过滤，从滤液中分离肽，所得的肽是增血压素(H-Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-OH)。
优选的，本发明所述的一步法固相合成多肽的方法中，合成的多肽是比伐卢定，其中，
步骤(1)中，所述的溶胀处理后的树脂是经DCM溶胀处理的Wang树脂，保护氨基酸是Fmoc-Leu-OH，缩合剂是HOBt和DIC，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DMAP；
步骤(2)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Tyr(tBu)-OH，缩合剂是HOBt，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIC；
步骤(3)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Glu(OtBu)-OH，缩合剂是HOBt，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIC；
步骤(4)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Glu(OtBu)-OH，缩合剂是HOBt，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIC；
步骤(5)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Pro-OH，缩合剂是HOBt，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIC；
步骤(6)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Ile-OH，缩合剂是HOBt，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIC；
步骤(7)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Glu(OtBu)-OH，缩合剂是HOBt，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIC；
步骤(8)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Glu(OtBu)-OH，缩合剂是HOBt，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIC；
步骤(9)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Phe-OH，缩合剂是HOBt，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIC；
步骤(10)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Asp(OtBu)-OH，缩合剂是HOBt，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIC；
步骤(11)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Gly-OH，缩合剂是HOBt，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIC；
步骤(12)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Asn(Trt)-OH，缩合剂是HOBt，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIC；
步骤(13)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Gly-OH，缩合剂是HOBt，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIC；
步骤(14)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Gly-OH，缩合剂是HOBt，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIC；
步骤(15)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Gly-OH，缩合剂是HOBt，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIC；
步骤(16)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Gly-OH，缩合剂是HOBt，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIC；
步骤(17)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Pro-OH，缩合剂是HOBt，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIC；
步骤(18)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Arg(Pbf)-OH，进行两次缩合反应，第一次缩合剂是HOBt和HBTU，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIPEA，第二次缩合剂是HOBt，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIC；
步骤(19)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Pro-OH，缩合剂是HOBt，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIC；
步骤(20)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Boc-D-Phe-OH，缩合剂是HOBt，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIC(得到保护比伐卢定多肽树脂Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂)；
步骤(21)中，所述的将步骤(20)洗涤后的沉淀进行脱保护基和切肽反应，包括在步骤(20)洗涤后含有沉淀的反应容器中，加入切肽试剂TFA∶TIS∶H2O＝95∶2.5∶2.5(V/V)进行切肽反应，反应完全后过滤，从滤液中分离肽，所得的肽是比伐卢定(比伐卢定H-D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH)。
优选的，本发明所述的一步法固相合成多肽的方法中，合成的多肽是鞣酸加压素，其中，
步骤(1)中，所述的溶胀处理后的树脂是经DCM溶胀处理的Rink Amide-MBHA，保护氨基酸是Fmoc-Gly-OH，缩合剂是HOBt和HBTU，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIPEA；
步骤(2)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Arg(Pbf)-OH，缩合剂是HOBt和HBTU，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIPEA；
步骤(3)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Pro-OH，缩合剂是HOBt和HBTU，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIPEA；
步骤(4)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Cys(Trt)-OH，缩合剂是HOBt和HBTU，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIPEA；
步骤(5)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Asn(Trt)-OH，缩合剂是HOBt和HBTU，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIPEA；
步骤(6)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Gln(Trt)-OH，缩合剂是HOBt和HBTU，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIPEA；
步骤(7)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Phe-OH，缩合剂是HOBt和HBTU，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIPEA；
步骤(8)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Tyr(tBu)-OH，缩合剂是HOBt和HBTU，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIPEA；
步骤(9)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的保护氨基酸是Fmoc-Cys(Trt)-OH，缩合剂是HOBt和HBTU，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIPEA；
步骤(10)中，所述的将步骤(9)洗涤后的沉淀进行脱保护基和切肽反应，包括在步骤(9)洗涤后含有沉淀的反应容器中，加入哌啶的DMF溶液进行脱保护基反应，反应完全后(得到保护鞣酸加压素树脂H-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Arg(Pbf)-Gly-RinkAmide-MBHA树脂)抽干、洗涤，加入切肽试剂TFA∶TIS∶EDT∶H2O＝95∶2∶2∶1(V/V)(TFA∶TIS∶EDT∶H2O体积比为95∶2∶2∶1的混合物)进行切肽反应，反应完全后过滤，从滤液中分离肽，所得的肽是鞣酸加压素(还原型鞣酸加压素H-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-OH)。
本发明合成多肽的所有化学反应在同一个反应器内依次连续完成，包括洗涤、抽干。在任一保护氨基酸缩合时，无需在活化器中低温活化再转移至缩合反应器中。可参见图6的示意图。在进行缩合反应时，保护氨基酸、缩合剂先溶解在含有肽树脂的反应混合物中，该混合物中含有挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂组成的溶剂，然后利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用挥发性有机溶剂的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至15-20℃，然后加入助缩合剂启动缩合反应。
本发明中，树脂的载样量优选0.7-0.8mmol/g。
本发明每次连接保护氨基酸都采用了氮气吹入使DCM挥发降温技术，向反应混合物中通入氮气使挥发性溶剂挥发可以保持反应体系温度在15-20℃。在加入助缩合剂启动反应之前都需要利用DCM挥发使反应体系降温至15-20℃。当加入助缩合剂启动缩合反应后，通过保温装置使缩合反应体系温度一直稳定在22-28℃。因此，优选的，启动缩合反应后缩合反应的温度为22-28℃，更佳地为25℃。而缩合反应的反应时间一般是监测达到反应终点为止，监测方法是本领域常规方法，如茚三酮检测、四氯苯醌检测等。
本发明对抑制缩合反应中保护氨基酸的消旋提供了一种通行的解决方案，该方案中配料和保护氨基酸的活化和缩合反应都在同一个反应器内连续进行，无需将保护氨基酸在活化器中低温活化再转移至缩合反应器中进行缩合反应。在进行缩合反应时，不需预活化氨基酸，却能够抑制缩合反应中保护氨基酸的消旋。
本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。
本发明提供的合成多肽的方法不需使用氢溴酸，环保、高效，对设备要求低，可应用于规模化工业生产。并且产物纯度高、产率高，纯度可达99.5％以上。本发明中，所有反应在一简单反应器皿中便可进行，可避免因手工操作和物料重复转移而产生的损失。缩合反应无需在反应器之外低温预活化，节省了生产设备、人力与工时。
附图说明
以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。
图1：本发明增血压素合成过程图。
图2：HBTU缩合Boc-Asn-OH所得增血压素粗品HPLC图。
图3：DIC/HOBt缩合Boc-Asn-OH所得增血压素粗品HPLC图。
图4：试验获得的增血压素醋酸盐纯品HPLC图谱。
图5：试验获得的增血压素醋酸盐质谱图。
图6：在线低温预活化示意图。
具体实施方式
本发明中，术语“羧基树脂”是树脂中与(第一个)氨基酸直接相连的反应基团是羧基的树脂。如王氏树脂。羧基树脂，通常加入适当的缩合剂，使被保护氨基酸与树脂形成共酯以完成氨基酸的固定。
本发明所有的化学反应均在一个反应器内连续完成，简化了传统固相合成中使用的低温预活化步骤。这对反应体系的变温控制提出了特殊要求。在提高合成效率的同时，也在中间体纯化方面受到很多限制。故而连续合成对化学反应、特别是缩合反应的效率方面有更高的要求。本发明的特别之处在于优化了各缩合步骤的最佳反应条件，使得高效、快速、连续合成也能获得有工业应用价值的高产率、高纯度产品。这将在以下几点中得到更加具体的体现。
第一，本发明避免了保护氨基酸预活化的繁琐操作。HBTU是非常高效的缩合试剂，需要有机碱如DIPEA来启动缩合反应。反应体系加入DIPEA过程中有大量热能释放出来，会出现温度骤升效应。该放热效应经常同一些氨基酸在缩合过程中的消旋副反应相联系，如Fmoc-His(Trt)-OH。一些多肽合成的经验表明，如果将Fmoc-His(Trt)-OH和HBTU、DIPEA在一个预活化反应器中低温混合以抑制放热效应，然后将经过预活化处理的溶液加入到氨基酸缩合反应器中，会显著抑制His的消旋(专利US6015881)。但在实际操作过程中，这种预活化的时间难以掌握，如果氨基酸已被活化而没有和氨基接触反应，也会增加消旋副反应的几率。因此，最好的解决方案是在氨基酸缩合反应器中实现即时的变温操作，使得在缩合全程中的温度始终保持在固定值。本发明将反应器的缩合温度稳定控制在22-28℃，即使是Fmoc-His(Trt)-OH的缩合也无需预活化。保护氨基酸、HBTU和HOBT先溶解在含有肽树脂的反应混合物中，该混合物的溶剂含有DMF和DCM。然后利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至15-20℃。然后滴加DIPEA，这样保证了保护氨基酸活化后不受环境高温的影响，而且一旦氨基酸被活化后即能有机会和氨基缩合。这一方法操作简单，所得产品质量与预活化方案相当。
第二，本发明提供一种可以规模化高效生产肽的合成路线(图1)。无需HBr或HF等处理，即可在TFA作用下高效解离得到C端为游离羧基的肽段；用Pbf保护Arg侧链、Trt保护His侧链、tBu保护Tyr侧链，确保在TFA处理时高效解离得到增血压素。最后一步缩合反应原料使用Boc保护氨基酸，而非常用原料Fmoc保护氨基酸，这样可以减少一步脱Fmoc反应。更为重要的是，有文献报道肽链N端Asn侧链若用Trt保护，该保护基团对三氟乙酸相当稳定，需要长时间处理才能完全除去(Pept.Res.1992，Vol5：145)，这样会引起其它的副反应。DIC与HBTU是多肽合成工业中的常用缩合剂。HOBt是常用的缩合添加剂，保护氨基酸与HOBt在缩合剂存在下形成的OBt活化酯，兼具良好的酰胺化反应性能与稳定性。一般而言，HBTU的肽键缩合速率较快，相应也会减少副反应发生的几率，保护氨基酸2倍投料，过量1倍以内即可缩合完全。
第三，本发明有效避免使用Asn侧链脱水副反应。Asn若无侧链保护，在用DCC或BOP缩合时容易导致侧链脱水副反应，使用DCC/HOBt可以避免该副反应(J.Org.Chem.1980，Vol45：55；Int.J.Pept.Protein Res.1989，Vol34：287)。在用HBTU缩合Fmoc-Asn-OH时，增血压素产物中存在分子量为[M-18]的杂质，推测可能为Asn侧链酰胺脱水(图2)。在改用DCC/HOBt后，有效地抑制了该副产物的生成。但考虑到在工业化生产中，DCC的产物难以处理，尝试用DIC/HOBt来替换DCC/HOBt，亦能抑制[M-18]副产物的生成，可将相对面积比控制在2％以下(图3)。
第四，本发明在Wang树脂上高载样量连续合成保护增血压素。Wang树脂是一种良好的连续合成支持物，但随着载样量的增高，会在空间上造成缩合反应困难、导致缩合不完全。很显然，从工业应用角度考虑，高载样量会有效降低树脂在合成中所占的物料成本比例、减小反应釜的体积、减少溶剂用量。保护增血压素的合成中需要缩合体积庞大的Fmoc-Arg(Pbf)-OH，当Fmoc-Phe-Wang树脂的载样量高于0.7mmol/g后，经常会导致Fmoc-Arg(Pbf)-OH缩合难以完全，而且增加投料比也不能解决该问题，在用醋酸酐封头后才能在茚三酮反应中得到阴性结果。本发明通过Fmoc-Arg(Pbf)-OH的二次缩合，解决了高载样量与缩合反应不完全的矛盾，实现了在Wang树脂上高载样量(Fmoc-Phe-Wang树脂，0.7-0.8mmol/g)连续合成保护增血压素。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
增血压素实施例
实施例1：Fmoc-Phe-Wang树脂的制备
称量Wang树脂50g(100-200目，1.23mmol/g)，装入砂芯反应器，用500mL DMF洗涤一次，抽干，再用500mL DCM使树脂充分溶胀，抽干。加Fmoc-Phe-OH(MW：387.4，Wang树脂摩尔数的3倍)71.5g，HOBt(MW：135.13，Wang树脂摩尔数的3倍)24.9g，DIC(MW：126.2，Wang树脂摩尔数的3倍)28.9mL，300mL DMF，100mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至16℃，缓慢加入DMAP(MW：122，Wang树脂摩尔数的0.2倍)1.5g，将混合物在26℃搅拌18小时。真空抽干，DMF洗涤两次，真空抽干。加Pyridine(MW：79.1，Wang树脂摩尔数的10倍)49mL，Ac2O(MW：102.09，Wang树脂摩尔数的10倍)58mL，500mL DCM，将混合物在27℃搅拌3小时，真空抽干，用DMF，MeOH交叉洗涤两次，真空抽干至恒重。测得Fmoc-Phe-Wang树脂的替代度为0.80mmol/g(Fmoc-Phe-Wang树脂总重75g，总摩尔数60mmol)。
实施例2：Fmoc-Pro-Phe-Wang树脂的制备
加入500mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入500mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Pro-OH(MW：337.4，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)40.5g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)16.2g，HBTU(MW：379.25，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)45.5g，350mL DMF，100mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至15℃，滴加DIPEA(MW：129.24，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)31.4mL，将混合物在25℃搅拌2.5小时，四氯苯醌检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例3：Fmoc-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂的制备
加入500mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入500mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-His(Trt)-OH(MW：619.7，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)74.4g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)16.2g，HBTU(MW：379.25，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)45.5g，350mL DMF，100mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至18℃，滴加DIPEA(MW：129.24，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)31.4mL，将混合物在23℃搅拌2小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例4：Fmoc-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂的制备
加入500mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入500mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Val-OH(MW：339.4，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)40.7g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)16.2g，HBTU(MW：379.25，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)45.5g，350mL DMF，100mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至20℃，滴加DIPEA(MW：129.24，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)31.4mL，将混合物在25℃搅拌2小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例5：Fmoc-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂的制备
加入500mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入500mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Tyr(tBu)-OH(MW：459.5，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)55.1g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)16.2g，HBTU(MW：379.25，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)45.5g，350mL DMF，100mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至18℃，滴加DIPEA(MW：129.24，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)31.4mL，将混合物在26℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例6：Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂的制备
加入500mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入500mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Val-OH(MW：339.4，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)40.7g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)16.2g，HBTU(MW：379.25，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)45.5g，350mL DMF，100mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至15℃，滴加DIPEA(MW：129.24，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)31.4mL，将混合物在28℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例7：
Fmoc-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂的制备
加入500mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入500mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Arg(Pbf)-OH(MW：648.8，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)77.9g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)16.2g，HBTU(MW：379.25，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)45.5g，350mL DMF，100mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至15℃，滴加DIPEA(MW：129.24，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)31.4mL，将混合物在25℃搅拌3小时，茚三酮检测呈非阴性，真空抽干，DMF洗涤两次，真空抽干。加Fmoc-Arg(Pbf)-OH(MW：648.8，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的1倍)39.0g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)16.2g，350mL DMF，100mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至18℃，滴加DIC(MW：126.2，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)18.8mL，将混合物在27℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例8：
Boc-Asn-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂的制备
加入500mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入500mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Boc-Asn-OH(MW：232.1，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)27.8g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的4倍)32.5g，350mL DMF，100mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至19℃，滴加DIC(MW：126.2，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的4倍)37.5mL，将混合物在25℃搅拌3小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，MeOH洗涤三次，真空抽干至恒重，得到保护血管紧张树脂157.4g。
实施例9：H-Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-OH的制备
按TFA∶TIS∶H2O＝95∶2.5∶2.5(体积比)配制切肽溶液1.6L，冷冻后，在搅拌的情况下，将157.4g的保护增血压素树脂加入到切肽溶液中，26℃搅拌2.5小时。过滤，滤液通过减压蒸馏浓缩，加甲基叔丁基醚沉淀，离心沉降收集到70.5g增血压素(MW：1030.5)粗品，合成收率为114％。
实施例10：H-Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-OH的精制
将70.5g增血压素粗品用5％ACN/水(V/V)溶解，配成10g/L，利用制备型高效液相在0.1％TFA/水(V/V)和0.1％TFA/ACN(V/V)梯度洗脱，分部收集需要的组分并检测，将合格的组分再次上制备柱脱盐，用水和ACN梯度洗脱，向得洗脱液中加入HAc，经减压旋蒸浓缩并除ACN，最后经冷冻干燥得H-Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-OHxHAc白色固体，HPLC分析纯度为99.5％(见图4)。质谱鉴定结构正确(见图5)。仪器：美国Waters公司QTOF Premier质谱仪，极性：正，毛细管电压：3.0kV，采样锥：45V，碰撞能量：4EV离子源温度：100℃，去溶剂化温度：350℃，脱溶剂气体：600l/hr，扫描范围：M/z为1002000，扫描时间：0.3秒，扫描间的时间：0.02秒。
讨论
使用Wang树脂合成多肽的一个重要障碍是二酮哌嗪问题，即在缩合两个氨基酸后，在用有机碱脱去氨基保护基Fmoc时，容易发生两肽自身环化形成二酮哌嗪而从树脂上脱落，合成产率降低。本发明中详细考察了合成产物的收率，没有发现明显的收率下降现象，由此推测无严重的二酮哌嗪问题。
该方法工艺简单、过程可控，可以稳定制备高纯度增血压素，非常适合于自动化的高效生产。
比伐卢定实施例
实施例11：Fmoc-Leu-Wang树脂的制备
称量Wang树脂100g(100-200目，1.23mmol/g)，装入砂芯反应器，用1000mLDMF洗涤一次，抽干，再用1000mL DCM使树脂充分溶胀，抽干。加Fmoc-Leu-OH(MW：353.5，Wang树脂摩尔数的1倍)43.5g，HOBt(MW：135.13，Wang树脂摩尔数的1倍)16.6g，DIC(MW：129.24，Wang树脂摩尔数的1倍)19.3mL，500mL DMF，250mLDCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至16℃，缓慢加入DMAP(MW：122，Wang树脂摩尔数的0.2倍)3.0g，将混合物在26℃搅拌3小时。真空抽干，DMF洗涤两次，真空抽干。加Pyridine(MW：79.1，Wang树脂摩尔数的10倍)99.0mL，Ac2O(MW：102.09，Wang树脂摩尔数的10倍)116.3mL，500mL DMF，将混合物在27℃搅拌3小时，真空抽干，用DMF，MeOH，DMF，MeOH，MeOH，MeOH交叉洗涤，真空抽干至恒重。测得Fmoc-Leu-Wang树脂的替代度为0.57mmol/g(Fmoc-Leu-Wang树脂总重120.3g，总摩尔数68.6mmol)。
实施例12：Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂的制备
加入1000mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Tyr(tBu)-OH(MW：495.5，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的2倍)68.0g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)37.1g，600mL DMF，250mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至15℃，加入DIC(MW：126.2，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)43.0mL，将混合物在25℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例13：Fmoc-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂的制备
加入1000mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Glu(OtBu)-OH(MW：425.5，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的2倍)58.4g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)37.1g，600mL DMF，250mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至16℃，加入DIC(MW：126.2，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)43.0mL，将混合物在26℃搅拌2小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例14：Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂的制备
加入1000mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Glu(OtBu)-OH(MW：425.5，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的2倍)58.4g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)37.1g，600mL DMF，250mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至19℃，加入DIC(MW：126.2，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)43.0mL，将混合物在26℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例15：Fmoc-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂的制备
加入1000mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Pro-OH(MW：337.4，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的2倍)46.3g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)37.1g，600mL DMF，250mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至18℃，加入DIC(MW：126.2，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)43.0mL，将混合物在27℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例16：Fmoc-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂的制备
加入1000mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Ile-OH(MW：353.4，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的2倍)48.5g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)37.1g，600mL DMF，250mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至16℃，加入DIC(MW：126.2，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)43.0mL，将混合物在25℃搅拌5.5小时，四氯苯醌检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例17：
Fmoc-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂的制备
加入1000mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Glu(OtBu)-OH(MW：425.5，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的2倍)58.4g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)37.1g，600mL DMF，250mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至19℃，加入DIC(MW：126.2，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)43.0mL，将混合物在26℃搅拌2小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例18：
Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂的制备
加入1000mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Glu(OtBu)-OH(MW：425.5，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的2倍)58.4g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)37.1g，600mL DMF，250mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至18℃，加入DIC(MW：126.2，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)43.0mL，将混合物在28℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例19：
Fmoc-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂的制备
加入1000mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Phe-OH(MW：387.4，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的2倍)53.2g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)37.1g，600mL DMF，250mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至20℃，加入DIC(MW：126.2，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)43.0mL，将混合物在25℃搅拌3小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例20：
Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂的制备
加入1000mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Asp(OtBu)-OH(MW：411.5，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的2倍)56.5g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)37.1g，600mL DMF，250mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至17℃，加入DIC(MW：126.2，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)43.0mL，将混合物在24℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例21：
Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂的制备
加入1000mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Gly-OH(MW：297.3，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的2倍)40.8g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)37.1g，600mL DMF，250mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至18℃，加入DIC(MW：126.2，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)43.0mL，将混合物在25℃搅拌2小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例22：
Fmoc-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂的制备
加入1000mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Asn(Trt)-OH(MW：596.7，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的2倍)40.8g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)37.1g，600mL DMF，250mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至17℃，加入DIC(MW：126.2，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)43.0mL，将混合物在25℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例23：
Fmoc-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂的制备
加入1000mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Gly-OH(MW：297.3，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的2倍)40.8g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)37.1g，600mL DMF，250mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至17℃，加入DIC(MW：126.2，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)43.0mL，将混合物在27℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例24：
Fmoc-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂的制备
加入1000mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Gly-OH(MW：297.3，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的2倍)40.8g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)37.1g，600mL DMF，250mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至18℃，加入DIC(MW：126.2，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)43.0mL，将混合物在25℃搅拌2小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例25：
Fmoc-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂的制备
加入1000mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Gly-OH(MW：297.3，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的2倍)40.8g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)37.1g，600mL DMF，250mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至15℃，加入DIC(MW：126.2，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)43.0mL，将混合物在28℃搅拌2小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例26：
Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂的制备
加入1000mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Gly-OH(MW：297.3，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的2倍)40.8g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)37.1g，600mL DMF，250mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至18℃，加入DIC(MW：126.2，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)43.0mL，将混合物在25℃搅拌2小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例27：
Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂的制备
加入1000mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Pro-OH(MW：337.4，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的2倍)46.3g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)37.1g，600mL DMF，250mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至18℃，加入DIC(MW：126.2，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)43.0mL，将混合物在25℃搅拌2小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例28：
Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂的制备
加入1000mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Arg(Pbf)-OH(MW：648.8，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的2倍)89.0g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的2倍)18.5g，HBTU(MW：379.3，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的2倍)52.0g，600mLDMF，250mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至16℃，加入DIPEA(MW：129.24，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的3倍)35.8mL，将混合物在28℃搅拌3小时，四氯苯醌检测呈非阴性，真空抽干，DMF洗涤两次，真空抽干。加Fmoc-Arg(Pbf)-OH(MW：648.8，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的1倍)44.5g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的2倍)18.5g，500mLDMF，250mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至18℃，加入DIC(MW：126.2，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的2倍)21.5mL，将混合物在28℃搅拌7.5小时，四氯苯醌检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例29：
Fmoc-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂的制备
加入1000mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Pro-OH(MW：337.4，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的2倍)46.3g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)37.1g，600mL DMF，250mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至19℃，加入DIC(MW：126.2，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)43.0mL，将混合物在28℃搅拌3小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例30：
Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂的制备
加入1000mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入1000mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Boc-D-Phe-OH(MW：265.3，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的2倍)36.4g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)37.1g，600mL DMF，250mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至18℃，加入DIC(MW：126.2，Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔数的4倍)43.0mL，将混合物在25℃搅拌3小时，四氯苯醌检测呈阴性，真空抽干，DMF洗涤一次，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，MeOH洗涤三次次，真空抽干。真空干燥至恒重，得保护比伐卢定多肽树脂254.4g。
实施例31：
H-D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH的制备
按TFA∶TIS∶H2O＝95∶2.5∶2.5(V/V)配制切肽溶液2.5L，冷冻后，在搅拌的情况下，将254.4g的保护比伐卢定树脂加入到切肽溶液中，26℃搅拌3小时。过滤，滤液通过减压蒸馏浓缩，加冷甲基叔丁基醚沉淀，离心沉降收集到145.7g比伐卢定(MW：2180.3)粗品，合成收率为97.4％。
实施例32：
H-D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH的精制
将145.7g比伐卢定粗品用5％ACN/水(V/V)溶解，配成15g/L，利用制备型高效液相在0.1％TFA/水(V/V)和0.1％TFA/ACN(V/V)梯度洗脱，分部收集需要的组分并检测，将合格的组分经减压旋蒸浓缩并除ACN，最后经冷冻干燥得99.0％H-D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH xTFA白色纯品。经质谱鉴定，结构正确。
鞣酸加压素实施例
实施例33：Fmoc-Gly-Rink Amide-MBHA树脂的制备
称量Rink Amide-MBHA树脂50g(100-200目，0.50mmol/g)，装入砂芯反应器，用500mL DMF洗涤一次，抽干，再用500mL DCM使树脂充分溶胀，抽干。加Fmoc-Gly-OH(MW：297.3，Rink Amide-MBHA树脂摩尔数的2倍)14.9g，HOBt(MW：135.13，RinkAmide-MBHA树脂摩尔数的2倍)7.8g，HBTU(MW：379.25，Rink Amide-MBHA树脂摩尔数的2倍)19.0g，300mL DMF，100mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至16℃，加入DIPEA(MW：129.24，RinkAmide-MBHA树脂摩尔数的3倍)13.1mL，将混合物在26℃搅拌1小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，DMF洗涤一次，MeOH洗两次，真空抽干。
实施例34：Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Rink Amide-MBHA树脂的制备
加入500mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入500mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Arg(Pbf)-OH(MW：648.8，RinkAmide-MBHA树脂摩尔数的2倍)32.4g，HOBt(MW：135.13，Rink Amide-MBHA树脂摩尔数的2倍)7.8g，HBTU(MW：379.25，Rink Amide-MBHA树脂摩尔数的2倍)19.0g，300mL DMF，100mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至17℃，加入DIPEA(MW：129.24，Rink Amide-MBHA树脂摩尔数的3倍)26.1mL，将混合物在26℃搅拌1小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，DMF洗涤一次，MeOH洗两次，真空抽干。
实施例35：Fmoc-Pro-Arg(Pbf)-Gly-Rink Amide-MBHA树脂的制备
加入500mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入500mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Pro-OH(MW：337.4，Rink Amide-MBHA树脂摩尔数的2倍)16.9g，HOBt(MW：135.13，Rink Amide-MBHA树脂摩尔数的2倍)7.8g，HBTU(MW：379.25，Rink Amide-MBHA树脂摩尔数的2倍)19.0g，300mL DMF，100mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至16℃，加入DIPEA(MW：129.24，Rink Amide-MBHA树脂摩尔数的3倍)26.1mL，将混合物在27℃搅拌1.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，DMF洗涤一次，MeOH洗两次，真空抽干。
实施例36：Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Arg(Pbf)-Gly-Rink Amide-MBHA树脂的制备
加入500mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入500mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Cys(Trt)-OH(MW：585.7，RinkAmide-MBHA树脂摩尔数的2倍)29.3g，HOBt(MW：135.13，Rink Amide-MBHA树脂摩尔数的2倍)7.8g，HBTU(MW：379.25，Rink Amide-MBHA树脂摩尔数的2倍)19.0g，300mL DMF，100mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至18℃，加入DIPEA(MW：129.24，Rink Amide-MBHA树脂摩尔数的3倍)26.1mL，将混合物在25℃搅拌1.5小时，四氯苯醌检测呈阴性，真空抽干，DMF洗涤一次，MeOH洗两次，真空抽干。
实施例37：Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Arg(Pbf)-Gly-Rink Amide-MBHA树脂的制备
加入500mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入500mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Asn(Trt)-OH(MW：596.7，RinkAmide-MBHA树脂摩尔数的2倍)29.9g，HOBt(MW：135.13，Rink Amide-MBHA树脂摩尔数的2倍)7.8g，HBTU(MW：379.25，Rink Amide-MBHA树脂摩尔数的2倍)19.0g，300mL DMF，100mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至17℃，加入DIPEA(MW：129.24，Rink Amide-MBHA树脂摩尔数的3倍)26.1mL，将混合物在26℃搅拌2小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，DMF洗涤一次，MeOH洗两次，真空抽干。
实施例38：
Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Arg(Pbf)-Gly-Rink Amide-MBHA树脂的制备
加入500mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入500mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Gln(Trt)-OH(MW：610.7，RinkAmide-MBHA树脂摩尔数的2倍)30.5g，HOBt(MW：135.13，Rink Amide-MBHA树脂摩尔数的2倍)7.8g，HBTU(MW：379.25，Rink Amide-MBHA树脂摩尔数的2倍)19.0g，300mL DMF，100mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至15℃，加入DIPEA(MW：129.24，Rink Amide-MBHA树脂摩尔数的3倍)26.1mL，将混合物在26℃搅拌2小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，DMF洗涤一次，MeOH洗两次，真空抽干。
实施例39：
Fmoc-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Arg(Pbf)-Gly-Rink Amide-MBHA树脂的制备
加入500mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入500mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Phe-OH(MW：387.4，Rink Amide-MBHA树脂摩尔数的2倍)19.4g，HOBt(MW：135.13，Rink Amide-MBHA树脂摩尔数的2倍)7.8g，HBTU(MW：379.25，Rink Amide-MBHA树脂摩尔数的2倍)19.0g，300mL DMF，100mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至19℃，加入DIPEA(MW：126.2，Rink Amide-MBHA树脂摩尔数的3倍)26.1mL，将混合物在22℃搅拌2小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，DMF洗涤一次，MeOH洗两次，真空抽干。
实施例40：
Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Arg(Pbf)-Gly-RinkAmide-MBHA树脂的制备
加入500mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入500mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Tyr(tBu)-OH(MW：495.5，RinkAmide-MBHA树脂摩尔数的2倍)24.8g，HOBt(MW：135.13，Rink Amide-MBHA树脂摩尔数的2倍)7.8g，HBTU(MW：379.25，Rink Amide-MBHA树脂摩尔数的2倍)19.0g，300mL DMF，100mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至20℃，加入DIPEA(MW：126.2，Rink Amide-MBHA树脂摩尔数的3倍)26.1mL，将混合物在27℃搅拌2小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，DMF洗涤一次，MeOH洗两次，真空抽干。
实施例41：
Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Arg(Pbf)-Gly-Rink Amide-MBHA树脂的制备
加入500mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入500mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Cys(Trt)-OH(MW：585.7，RinkAmide-MBHA树脂摩尔数的2倍)29.3g，HOBt(MW：135.13，Rink Amide-MBHA树脂摩尔数的2倍)7.8g，HBTU(MW：379.25，Rink Amide-MBHA树脂摩尔数的2倍)19.0g，300mL DMF，100mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至18℃，加入DIPEA(MW：126.2，Rink Amide-MBHA树脂摩尔数的3倍)26.1mL，将混合物在24℃搅拌1.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，DMF洗涤一次，MeOH洗两次，真空抽干。
实施例42：
H-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Arg(Pbf)-Gly-Rink Amide-MBHA树脂的制备
加入500mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入500mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤两次，MeOH洗涤三次，真空抽干至恒重，得到保护加压素树脂110.8g。
实施例43：H-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-OH的制备
按TFA∶TIS∶EDT∶H2O＝95∶2∶2∶1(V/V)配制切肽溶液1.1L，冷冻后，在搅拌的情况下，将110.8g的保护增血压素树脂加入到切肽溶液中，25℃搅拌2.5小时。过滤，滤液通过减压蒸馏浓缩，加冷甲基叔丁基醚沉淀，离心沉降收集，真空干燥得28.4g还原型加压素(MW：1086.4)粗品，合成收率为105％。质谱验证结构正确。
实施例44：[Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys]-Pro-Arg-Gly-OH的制备
将28.4g还原型加压素粗品，用少量HAc溶解至完全，用水稀释至28.4L，搅拌的情况下，用氨水调节溶液的pH为7.7(氧化/环化反应pH范围：7.2-8.0)，同时向溶液中通入氧气，常温下环化反应8小时，加入HAc调节pH为4.2终止氧化反应，即得到氧化型加压素[Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys]-Pro-Arg-Gly-OH溶液。HPLC分析，纯度为88.79％。质谱验证结构正确。
实施例45：鞣酸加压素的制备
将氧化型加压素溶液(效价大于100u/mL，PH值为3.0-4.5)，缓慢加入20％(W/V)鞣酸水溶液，鞣酸用量按每1万单位加压素加1克鞣酸计，边加边振摇摇，既有白色沉淀产生，4℃放置过夜。次日，用4号砂芯漏斗滤去沉淀物，母液送化验其残余效价，沉淀物用蒸馏水洗涤3次，五氧化二磷真空干燥至基本恒重(水分：2.0％)，即为鞣酸加压素成品。
胸腺五肽实施例(HBTU/HOBt/NMM缩合体系)
实施例46：Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin的制备
称量Wang树脂20g(100-200目，1.0mmol/g)，装入砂芯反应器，用200mL DMF洗涤一次，抽干，再用200mL DCM使树脂充分溶胀，抽干。加Fmoc-Tyr(tBu)-OH(MW：459.5，Wang树脂摩尔数的4倍)36.8g，HOBt(MW：135.13，Wang树脂摩尔数的4.4倍)11.9g，DIC(MW：129.24，Wang树脂摩尔数的4.4倍)13.7mL，100mL DMF，50mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至17℃，缓慢加入DMAP(MW：122，Wang树脂摩尔数的0.4倍)1.0g，将混合物在26℃搅拌8小时。真空抽干，DMF洗涤两次，真空抽干。加Pyridine(MW：79.1，Wang树脂摩尔数的10倍)18.9mL，Ac2O(MW：102.09，Wang树脂摩尔数的10倍)16.1mL，100mL DMF，将混合物在27℃搅拌3小时，真空抽干，用DMF，MeOH，DMF，MeOH，MeOH，MeOH交叉洗涤，真空抽干至恒重。测得Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂的替代度为0.715mmol/g(Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂总重26.54g，总摩尔数19mmol)。
实施例47：Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Wang树脂的制备
向装有26.54g的Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂加入260mL DMF洗涤一次，加入260mL DCM充分溶胀一次。加入200mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入200mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Val-OH(MW：339.4，Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂摩尔数的2倍)12.9g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂摩尔数的2倍)5.1g，HBTU(MW：379.3，Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂摩尔数的2倍)14.4g，100mL DMF，50mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至15℃，加入NMM(MW：101.15，Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂摩尔数的3倍)6.3mL，将混合物在25℃搅拌2小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例48：Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-Wang树脂的制备
加入200mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入200mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Asp(OtBu)-OH(MW：411.5，Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂摩尔数的2倍)15.6g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂摩尔数的2倍)5.1g，HBTU(MW：379.3，Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂摩尔数的2倍)14.4g，100mL DMF，50mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至15℃，加入NMM(MW：101.15，Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂摩尔数的3倍)6.3mL，将混合物在25℃搅拌2小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例49：Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-Wang树脂的制备
加入200mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入200mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Lys(Boc)-OH(MW：468.5，Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂摩尔数的2倍)17.8g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂摩尔数的2倍)5.1g，HBTU(MW：379.3，Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂摩尔数的2倍)14.4g，100mL DMF，50mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至19℃，加入NMM(MW：101.15，Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂摩尔数的3倍)6.3mL，将混合物在25℃搅拌2小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例50：Fmoc-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-Wang树脂的制备
加入200mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入200mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Arg(Pbf)-OH(MW：468.5，Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂摩尔数的2倍)24.7g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂摩尔数的2倍)5.1g，HBTU(MW：379.3，Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂摩尔数的2倍)14.4g，100mL DMF，50mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至17℃，加入NMM(MW：101.15，Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂摩尔数的3倍)6.3mL，将混合物在27℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
实施例51：H-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-Wang树脂的制备
加入200mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入200mL20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤两次，MeOH洗涤三次，真空抽干。真空干燥至恒重，得胸腺五肽树脂54.8g。
实施例52：Arg-Lys-Asp-Val-Tyr的制备
按TFA∶TIS∶H2O＝95∶2.5∶2.5(V/V)配制切肽溶液550mL，冷冻后，在搅拌的情况下，将54.8g的保护胸腺五肽树脂加入到切肽溶液中，27℃搅拌2.5小时。过滤，滤液通过减压蒸馏浓缩，加冷甲基叔丁基醚沉淀，离心沉降收集，干燥得到胸腺五肽粗肽18.4g，进行粗肽的含量检测，粗肽中目标肽含量约为72.4％，HPLC纯度为91.2％。质谱验证结构正确。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
所用的原料的名称和生产厂商：
原料 生产厂商
Wang树脂 天津南开和成科技有限公司
保护氨基酸 上海吉尔生化有限公司
本发明中所有的缩略语的确切名称如下：
DMF：N，N’-二甲基甲酰胺
DCM：二氯甲烷
Fmoc：9-芴甲氧羰基
Boc：叔丁氧羰基
HOBt：1-羟基苯并-三氮唑
DIC：N，N-二异丙基碳二亚胺
DMAP：4-二甲氨基吡啶
Pyridine(PipPy)：哌啶吡啶
Piperidine：哌啶
Ac2O：乙酸酐
MeOH：甲醇
HBTU：苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐
DIPEA：N，N-二异丙基乙胺
Trt：三苯甲基
tBu：叔丁基
PbfPbf：2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
TFA：三氟乙酸
TIS：三异丙基硅烷
DCC：二环己基碳二亚胺
BOP：苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐
ACN：乙腈
HAc：醋酸
Claims (10)
1.一种一步法固相合成多肽的方法，其特征在于，合成多肽的所有化学反应在同一个反应器内依次连续完成，无需在活化器中低温活化保护氨基酸再转移至缩合反应器中，在进行任一保护氨基酸的缩合反应时，保护氨基酸、缩合剂先溶解在含有树脂或者肽树脂的反应混合物中，该混合物中含有挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂组成的溶剂，然后利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用挥发性有机溶剂的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至15-20℃，然后加入助缩合剂启动缩合反应，缩合反应温度控制在22-28℃。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非挥发性有机溶剂选自DMF和DMSO中的一种或两种，所述的挥发性有机溶剂选自DCM和Et2O中的一种或两种。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的树脂是wang树脂或RinkAmide-MBHA树脂；所述的保护氨基酸是Fmoc保护氨基酸或Boc保护氨基酸；所述的缩合反应的缩合体系包括以下几种中的任何一种，其中第1列AA表示氨基酸，最后一列表示助缩合剂，中间列表示缩合剂，列和列之间用“/”相隔：
(1)AA/HOBt/DIC
(2)AA/HOBt/DCC
(3)AA/TBTU/HOBT/DIPEA或NMM
(4)AA/HATU/HOBT/DIPEA或NMM
(5)AA/HCTU/HOBT/DIPEA或NMM
(6)AA/PyBop/HOBT/DIPEA或NMM
(7)AA/Bop/HOBT/DIPEA或NMM
(8)AA/HATU/HOAT/DIPEA或NMM
(9)AA/HATU/HOBT/DIPEA或NMM
(10)AA/HCTU/HOBt/DIPEA或NMM
(11)AA/CDI/HOBt
(12)AA/CDI/HOAT。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在树脂上连接第一个保护氨基酸
在反应容器中，加入溶胀处理后的树脂、第一个保护氨基酸、缩合剂、挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂并混合均匀，同时向反应体系中通入氮气或惰性气体使挥发性溶剂挥发并保持反应体系温度在15-20℃；加入助缩合剂启动保护氨基酸和树脂进行的缩合反应，反应温度控制在22-28℃；反应完全后抽干，将沉淀洗涤；
(2)连接第二个保护氨基酸
在步骤(1)洗涤后含有沉淀的反应容器中，加入有机溶剂和哌啶，进行脱保护基反应；反应完全后抽干，将沉淀洗涤；加入第二个保护氨基酸、缩合剂、挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂并混合均匀，同时向反应体系中通入氮气或惰性气体使挥发性溶剂挥发并保持反应体系温度在15-20℃；加入助缩合剂启动保护氨基酸和肽树脂进行的缩合反应，反应温度控制在22-28℃；反应完全后抽干，将沉淀洗涤；
(3)-(n)连接第三-n个保护氨基酸(n是大于等于4的自然数，是合成的多肽的氨基酸序列中所含的氨基酸残基的数目)
在步骤(2)或步骤(n-1)洗涤后含有沉淀的反应容器中，加入有机溶剂和哌啶，进行脱保护基反应；反应完全后抽干，将沉淀洗涤；加入第三个或者第n个保护氨基酸、缩合剂、挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂并混合均匀，同时向反应体系中通入氮气或惰性气体使挥发性溶剂挥发并保持反应体系温度在15-20℃；加入助缩合剂启动保护氨基酸和肽树脂进行的缩合反应，反应温度控制在22-28℃；反应完全后抽干，将沉淀洗涤；
(n+1)脱保护基和切肽
将步骤(n)洗涤后的沉淀进行脱保护基和切肽反应，将切肽反应的反应产物过滤，从滤液中分离肽。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的树脂是wang树脂；所述的保护氨基酸是Fmoc保护氨基酸，所述的缩合剂是HOBt和DIC。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的树脂是RinkAmide-MBHA树脂；所述的保护氨基酸是Fmoc保护氨基酸，所述的缩合剂是HOBt和HBTU，所述的助缩合剂是DIPEA，NMM或collidine，步骤(2)中所述脱保护基反应是在肽树脂中加入哌啶的DMF溶液在22-28℃反应即可。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，缩合反应中加入的是Fmoc保护氨基酸，缩合剂是HOBt和或HBTU，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIC或DIPEA，步骤(n)中脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(n)中缩合反应中加入的是Boc保护氨基酸，缩合剂是HOBt，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIC；步骤(n+1)中，所述的将步骤(n)洗涤后的沉淀进行脱保护基和切肽反应，包括在步骤(n)洗涤后含有沉淀的反应容器中，加入切肽试剂TFA∶TIS∶H2O体积比为95∶2.5∶2.5的混合物进行切肽反应，反应完全后过滤，从滤液中分离肽，所得的肽是比伐卢定。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(n)中，脱保护基反应加入的是哌啶的DMF溶液，缩合反应中加入的是Fmoc保护氨基酸，缩合剂是HOBt和HBTU，有机溶剂是DMF和DCM，助缩合剂是DIPEA；步骤(n+1)中，所述的将步骤(n)洗涤后的沉淀进行脱保护基和切肽反应，包括在步骤(n)洗涤后含有沉淀的反应容器中，加入哌啶的DMF溶液进行脱保护基反应，反应完全后加入切肽试剂TFA∶TIS∶EDT∶H2O体积比为95∶2∶2∶1的混合物进行切肽反应，反应完全后过滤，从滤液中分离肽，所得的肽是加压素。
10.如权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述的非挥发性有机溶剂和挥发性有机溶剂的体积比是2∶1-3.5∶1；在所述的的缩合反应中，保护氨基酸是树脂摩尔数的1-3倍，缩合剂是树脂摩尔数的2-6倍，有机溶剂是树脂质量数的6-9倍，助缩合剂是树脂摩尔数的0.2-4倍。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210131067.XA CN103374054B (zh) | 2012-04-28 | 2012-04-28 | 一步法固相合成多肽的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210131067.XA CN103374054B (zh) | 2012-04-28 | 2012-04-28 | 一步法固相合成多肽的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103374054A true CN103374054A (zh) | 2013-10-30 |
| CN103374054B CN103374054B (zh) | 2014-12-24 |
Family
ID=49459935
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210131067.XA Active CN103374054B (zh) | 2012-04-28 | 2012-04-28 | 一步法固相合成多肽的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103374054B (zh) |
Cited By (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103980351A (zh) * | 2014-05-27 | 2014-08-13 | 上海第一生化药业有限公司 | 加压素、加压素鞣酸盐的制备方法 |
| CN106478780A (zh) * | 2017-01-03 | 2017-03-08 | 上海上药第生化药业有限公司 | 一种缩宫素[4‑Glu]的制备方法 |
| CN106518975A (zh) * | 2017-01-03 | 2017-03-22 | 上海上药第生化药业有限公司 | 一种加压素的制备方法 |
| CN106518978A (zh) * | 2017-01-03 | 2017-03-22 | 上海上药第生化药业有限公司 | 一种加压素[4‑Glu,5‑Asp]的制备方法 |
| CN106518976A (zh) * | 2017-01-03 | 2017-03-22 | 上海上药第生化药业有限公司 | 一种缩宫素[4‑Glu,5‑Asp]的制备方法 |
| CN106517102A (zh) * | 2016-10-31 | 2017-03-22 | 重庆市南川区庆岩福利碱厂 | 粒状硫化钠生产工艺 |
| CN106518977A (zh) * | 2017-01-03 | 2017-03-22 | 上海上药第生化药业有限公司 | 一种缩宫素[5‑Asp]的制备方法 |
| CN106674332A (zh) * | 2017-01-03 | 2017-05-17 | 上海上药第生化药业有限公司 | 一种缩宫素的制备方法 |
| CN106699851A (zh) * | 2017-01-03 | 2017-05-24 | 上海上药第生化药业有限公司 | 一种加压素脱酰胺杂质的制备方法 |
| CN106749539A (zh) * | 2017-01-03 | 2017-05-31 | 上海上药第生化药业有限公司 | 一种缩宫素脱酰胺杂质的制备方法 |
| CN106749541A (zh) * | 2017-01-03 | 2017-05-31 | 上海上药第生化药业有限公司 | 一种加压素[5‑Asp]的制备方法 |
| CN106749540A (zh) * | 2017-01-03 | 2017-05-31 | 上海上药第生化药业有限公司 | 一种加压素[4‑Glu]的制备方法 |
| CN107857807A (zh) * | 2017-12-13 | 2018-03-30 | 成都医学院 | 一种软刀素肽的制备方法 |
| CN108752416A (zh) * | 2018-06-29 | 2018-11-06 | 烟台智本知识产权运营管理有限公司 | 氨基酸多肽的制备方法 |
| CN109111506A (zh) * | 2018-01-17 | 2019-01-01 | 上海长征医院 | 一种用于治疗骨质疏松的多肽及其制备方法和应用 |
| CN110204596A (zh) * | 2019-06-06 | 2019-09-06 | 南京迪维奥医药科技有限公司 | 一种具有明显促进睫毛生长的肉豆蔻酰五肽-17及其固相合成方法 |
| WO2019241903A1 (en) * | 2018-06-19 | 2019-12-26 | Shanghai Space Peptides Pharmaceutical Co., Ltd. | Synthetic method of bivalirundin |
| CN114948850A (zh) * | 2022-05-26 | 2022-08-30 | 中国药科大学 | 可载药寡肽及其可溶性分层微针的制备方法和应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1303299A (zh) * | 1998-03-23 | 2001-07-11 | 特莱默里斯公司 | 关于肽合成的方法以及组合物 |
| CN101570570A (zh) * | 2009-06-03 | 2009-11-04 | 兰州大学 | 一种生长抑素的合成方法 |
| CN102532274A (zh) * | 2012-02-13 | 2012-07-04 | 成都圣诺生物制药有限公司 | 一种比伐卢定的制备方法 |
-
2012
- 2012-04-28 CN CN201210131067.XA patent/CN103374054B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1303299A (zh) * | 1998-03-23 | 2001-07-11 | 特莱默里斯公司 | 关于肽合成的方法以及组合物 |
| CN101570570A (zh) * | 2009-06-03 | 2009-11-04 | 兰州大学 | 一种生长抑素的合成方法 |
| CN102532274A (zh) * | 2012-02-13 | 2012-07-04 | 成都圣诺生物制药有限公司 | 一种比伐卢定的制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 周逸明等: "加压素固相合成方法的研究", 《中国医药工业杂志》 * |
Cited By (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103980351B (zh) * | 2014-05-27 | 2016-05-18 | 上海第一生化药业有限公司 | 加压素、加压素鞣酸盐的制备方法 |
| CN103980351A (zh) * | 2014-05-27 | 2014-08-13 | 上海第一生化药业有限公司 | 加压素、加压素鞣酸盐的制备方法 |
| CN106517102A (zh) * | 2016-10-31 | 2017-03-22 | 重庆市南川区庆岩福利碱厂 | 粒状硫化钠生产工艺 |
| CN106517102B (zh) * | 2016-10-31 | 2019-02-19 | 重庆市南川区庆岩福利碱厂 | 粒状硫化钠生产工艺 |
| CN106674332A (zh) * | 2017-01-03 | 2017-05-17 | 上海上药第生化药业有限公司 | 一种缩宫素的制备方法 |
| CN106518975B (zh) * | 2017-01-03 | 2019-10-15 | 上海上药第一生化药业有限公司 | 一种加压素的制备方法 |
| CN106518978A (zh) * | 2017-01-03 | 2017-03-22 | 上海上药第生化药业有限公司 | 一种加压素[4‑Glu,5‑Asp]的制备方法 |
| CN106518977A (zh) * | 2017-01-03 | 2017-03-22 | 上海上药第生化药业有限公司 | 一种缩宫素[5‑Asp]的制备方法 |
| CN106518975A (zh) * | 2017-01-03 | 2017-03-22 | 上海上药第生化药业有限公司 | 一种加压素的制备方法 |
| CN106699851A (zh) * | 2017-01-03 | 2017-05-24 | 上海上药第生化药业有限公司 | 一种加压素脱酰胺杂质的制备方法 |
| CN106749539A (zh) * | 2017-01-03 | 2017-05-31 | 上海上药第生化药业有限公司 | 一种缩宫素脱酰胺杂质的制备方法 |
| CN106749541A (zh) * | 2017-01-03 | 2017-05-31 | 上海上药第生化药业有限公司 | 一种加压素[5‑Asp]的制备方法 |
| CN106749540A (zh) * | 2017-01-03 | 2017-05-31 | 上海上药第生化药业有限公司 | 一种加压素[4‑Glu]的制备方法 |
| CN106749540B (zh) * | 2017-01-03 | 2020-02-18 | 上海上药第一生化药业有限公司 | 一种加压素[4-Glu]的制备方法 |
| CN106749541B (zh) * | 2017-01-03 | 2020-02-18 | 上海上药第一生化药业有限公司 | 一种加压素[5-Asp]的制备方法 |
| CN106518978B (zh) * | 2017-01-03 | 2019-12-31 | 上海上药第一生化药业有限公司 | 一种加压素[4-Glu，5-Asp]的制备方法 |
| CN106478780A (zh) * | 2017-01-03 | 2017-03-08 | 上海上药第生化药业有限公司 | 一种缩宫素[4‑Glu]的制备方法 |
| CN106478780B (zh) * | 2017-01-03 | 2019-12-31 | 上海上药第一生化药业有限公司 | 一种缩宫素[4-Glu]的制备方法 |
| CN106699851B (zh) * | 2017-01-03 | 2019-10-15 | 上海上药第一生化药业有限公司 | 一种加压素脱酰胺杂质的制备方法 |
| CN106518976A (zh) * | 2017-01-03 | 2017-03-22 | 上海上药第生化药业有限公司 | 一种缩宫素[4‑Glu,5‑Asp]的制备方法 |
| CN106749539B (zh) * | 2017-01-03 | 2019-10-15 | 上海上药第一生化药业有限公司 | 一种缩宫素脱酰胺杂质的制备方法 |
| CN106674332B (zh) * | 2017-01-03 | 2019-10-15 | 上海上药第一生化药业有限公司 | 一种缩宫素的制备方法 |
| CN106518977B (zh) * | 2017-01-03 | 2019-12-31 | 上海上药第一生化药业有限公司 | 一种缩宫素[5-Asp]的制备方法 |
| CN106518976B (zh) * | 2017-01-03 | 2019-12-31 | 上海上药第一生化药业有限公司 | 一种缩宫素[4-Glu,5-Asp]的制备方法 |
| CN107857807A (zh) * | 2017-12-13 | 2018-03-30 | 成都医学院 | 一种软刀素肽的制备方法 |
| CN109111506A (zh) * | 2018-01-17 | 2019-01-01 | 上海长征医院 | 一种用于治疗骨质疏松的多肽及其制备方法和应用 |
| WO2019241903A1 (en) * | 2018-06-19 | 2019-12-26 | Shanghai Space Peptides Pharmaceutical Co., Ltd. | Synthetic method of bivalirundin |
| CN112424216A (zh) * | 2018-06-19 | 2021-02-26 | 上海胜泽泰医药科技有限公司 | 比伐卢定的合成方法 |
| EP3810627A4 (en) * | 2018-06-19 | 2022-03-09 | Shanghai Space Peptides Pharmaceutical Co., Ltd. | METHODS OF SYNTHESIS OF BIVALIRUNDIN |
| CN108752416A (zh) * | 2018-06-29 | 2018-11-06 | 烟台智本知识产权运营管理有限公司 | 氨基酸多肽的制备方法 |
| CN110204596A (zh) * | 2019-06-06 | 2019-09-06 | 南京迪维奥医药科技有限公司 | 一种具有明显促进睫毛生长的肉豆蔻酰五肽-17及其固相合成方法 |
| CN114948850A (zh) * | 2022-05-26 | 2022-08-30 | 中国药科大学 | 可载药寡肽及其可溶性分层微针的制备方法和应用 |
| CN114948850B (zh) * | 2022-05-26 | 2024-02-27 | 中国药科大学 | 可载药寡肽及其可溶性分层微针的制备方法和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103374054B (zh) | 2014-12-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103374054B (zh) | 一步法固相合成多肽的方法 | |
| CN101033249B (zh) | 固相多肽合成比筏芦定的制备方法 | |
| CN101357936B (zh) | 固相多肽合成曲普瑞林的制备方法 | |
| CN109456401A (zh) | 一种索马鲁肽的合成方法 | |
| CN103351428B (zh) | 一种固相片段法合成地加瑞克 | |
| EP3392266A1 (en) | Linaclotide synthesis method | |
| CN101463072B (zh) | 一种八肽胆囊收缩素的制备方法 | |
| CN1865280B (zh) | 固相多肽合成亮丙瑞林的制备方法 | |
| CN104231051A (zh) | 一种利那洛肽的制备方法 | |
| CN109575109B (zh) | 片段缩合制备地加瑞克的方法 | |
| CN110684077A (zh) | 一种阿基瑞林的规模化合成方法 | |
| CN101279998A (zh) | 一种c-端乙胺化多肽及其衍生物的制备方法 | |
| CN105085634A (zh) | 一种地加瑞克的制备方法 | |
| CN110903352A (zh) | 一种西曲瑞克的制备方法 | |
| CN101857629A (zh) | 布雷默浪丹的固相合成方法 | |
| CN112062811B (zh) | 一种维拉卡肽的合成方法 | |
| CN103992378A (zh) | 一种制备醋酸地加瑞克的方法 | |
| CN103374058B (zh) | 增血压素固相合成工艺及其中间体和应用 | |
| CN114478708A (zh) | 一种加尼瑞克的片段固相合成方法 | |
| Slomczynska et al. | Facilitated synthesis of peptaibols: alamethicin via enzymatic segment condensation | |
| CN104558159B (zh) | 比伐芦定中间体的固相合成方法 | |
| WO2021026800A1 (zh) | 醋酸地加瑞克的合成方法 | |
| CN116947966B (zh) | 一种伊特卡肽中间体及伊特卡肽的制备方法 | |
| CN104558160B (zh) | 比伐芦定中间体的固相合成方法 | |
| CN112574285B (zh) | 一种含一对二硫键的多肽药物的固液相合成方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 200240 Shanghai city Minhang District Jianchuan Road No. 1317 Patentee after: Add medicine to the first biochemical pharmaceutcal corporation, Ltd in Shanghai Address before: 200240 Shanghai city Minhang District Jianchuan Road No. 1317 Patentee before: Shanghai No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., Ltd. |
|
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |