CN109111506A - 一种用于治疗骨质疏松的多肽及其制备方法和应用 - Google Patents

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CN109111506A CN201810045599.9A CN201810045599A CN109111506A CN 109111506 A CN109111506 A CN 109111506A CN 201810045599 A CN201810045599 A CN 201810045599A CN 109111506 A CN109111506 A CN 109111506A
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龚海熠
程义云
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Abstract

本发明公开了一种用于治疗骨质疏松的多肽，其氨基酸序列为(Asp‑Ser‑Ser)6‑(D‑Tyr)‑Asn‑(D‑Trp)‑Asn‑Ser‑Phe‑(azaGly)‑Leu‑Arg(Me)‑Phe‑NH2((AspSerSer)6‑Kp‑10，SEQ ID NO：1)；本发明还公开了上述多肽的制备方法，其包括多肽的合成、多肽的切割以及多肽粗品的分离纯化，本发明还涉及上述多肽在制备治疗骨质疏松的药物中的应用。本发明通过研究证明了敲除Gpr54或者Kiss1基因导致骨质疏松和破骨细胞过度活化，Kp‑10通过激活Gpr54抑制破骨细胞的分化，肌动蛋白环(actin‑ring)的形成以及骨吸收；(AspSerSer)6‑Kp‑10具有更好的骨靶向作用，在体内比Kp‑10更有效地治疗由于卵巢切除导致的骨质疏松，其为治疗破骨细胞相关疾病提供理论依据。

Description

一种用于治疗骨质疏松的多肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种用于治疗骨质疏松的多肽及其应用。
背景技术
骨质疏松是最常见的骨相关疾病，也是发病率最高的疾病之一。据统计，50岁以后妇女骨质疏松的发病率约为50％，男性的发病率也高达20％，并且随着年龄的增长，发病率也随之上升。随着人口老龄化，我国骨质疏松症患者的数量已居世界首位，在过去的30年间，我国的骨质疏松症患者增加了300％。最新统计结果显示，我国骨质疏松患者达9000万，已成为严重的社会问题。破骨细胞的过度活化是造成骨质疏松的主要原因。妇女绝经之后，由于雌激素大量下降导致破骨细胞大量活化，破坏骨的微观结构，导致骨量不断下降，易发生骨折，这些都是骨质疏松疾病常见的症状。
破骨细胞是由造血系统中单核/巨噬细胞分化而来的，成骨细胞和间充质细胞分泌的细胞因子M‐CSF调控单核细胞的增殖、生存和向破骨细胞前体分化。成骨细胞和间充质细胞表达的破骨细胞活化因子RANKL与破骨细胞前体细胞表面受体RANK结合，决定单核破骨前体细胞最终向破骨细胞分化的命运。
Gpr54是G蛋白偶联受体中的视紫红质超家族一员。Gpr54的配体是Kissl基因表达的蛋白产物Kisspeptins(简称Kp)。Kiss1基因是在黑色素瘤中作为肿瘤抑制基因被发现，编码一个含145个氨基酸的蛋白，可被蛋白酶体切割，经剪切可生成由54个氨基酸组成的具有生物学活性的分泌肽，即kisspeptin-54，可进一步被酶切成kisspeptin-14，kisspeptin-13，Kisspeptin-10，都能与GPR54特异性结合而发挥生物学作用，是Gpr54的天然配体。其中Kisspeptin-10缩写Kp-10，是具有活性形式的最短的Kisspeptin，其是其中最小的生物活性肽，由10个氨基酸组成。通过基因敲除小鼠和临床病人遗传分析发现，Kiss1是Gpr54的天然配体，在下丘脑中高表达，多种物种中能调控黄体生成素(LH)的分泌，并且同样能调控GnRH的分泌，从而调控整个青春期的发生。
kiss1/Gpr54能调控青春期发育，而骨骼的生长正是青春期发育的最显著的特点之一。因此，kiss1/Gpr54受体完全有可能调控骨质的重建，从而影响到如骨质疏松等疾病。但是，迄今为止这方面还没有任何相关文献报道。
发明内容
发明人在针对kiss1/Gpr54受体参与调控骨质的重建的研究中，发现缺失G蛋白偶联受体54(Gpr54)导致破骨细胞活化，骨质疏松，其天然配体Kp-10通过抑制破骨细胞的形成和功能，具有抗骨质疏松作用，(AspSerSer)6-Kp-10能更好地将Kp-10靶向骨，产生骨保护作用。
本发明针对骨质疏松的治疗，提供了一种用于治疗骨质疏松的多肽Kp-10或(AspSerSer)6-Kp-10。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种多肽Kp-10在制备治疗骨质疏松的药物。
本发明的第二个目的是提供一种多肽，其氨基酸序列为DSSDSSDSSDSSDSSDSSYNWNSFGLRF(SEQ ID NO：1)所示，具体为(Asp-Ser-Ser)6-(D-Tyr)-Asn-(D-Trp)-Asn-Ser-Phe-(azaGly)-Leu-Arg(Me)-Phe-NH2(简称(AspSerSer)6-Kp-10)(如SEQ ID NO：1所示)。本发明中所述的(AspSerSer)6-Kp-10，是将6个重复的天冬氨酸-丝氨酸-丝氨酸串联序列(AspSerSer)6结构连接在Kp-10的N端，其中(AspSerSer)6可以作为载体特异性靶向到骨表面。
天然分泌的Kp-10在血清中容易降解，半衰期比较短，活性也较低。根据文献报道(Taiji Asami,Naoki Nishizawa,Yoshihiro Ishibashi,Kimiko Nishibori,MasaharuNakayama,Yasuko Horikoshi,Shin-ichi Matsumoto,Masashi Yamaguchi,HirokazuMatsumoto,Naoki Tarui,Tetsuya Ohtaki,Chieko Kitada.Serum stability ofselected decapeptide agonists of KISS1R using pseudopeptides.Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,22(2012):6391–6396)，将Gly和Arg分别做了修饰，大大提高了Kp-10的稳定性和活性。修饰后的Kp-10的结构如下：
。
其中6个重复的天冬氨酸-丝氨酸-丝氨酸串联序列(AspSerSer)6可以作为载体特异性靶向到骨表面，可以将小RNA、小分子化合物、多肽等特异性携带致骨表面，从而使药物作用靶标更明确，减少副作用。因此，本发明将(AspSerSer)6连接在Kp-10的N端，其可将Kp-10携带至骨表面发挥抑制破骨细胞活性的作用。
本发明的第三个目的是提供一种用于治疗骨质疏松的多肽((AspSerSer)6-Kp-10)的制备方法，其包括如下步骤：
步骤(1)多肽的合成；
对树脂反应柱依次进行脱保护和脱保护洗涤；脱保护洗涤完成后，取适量的氨基酸混合溶液或保护氨基酸以及适量的缩合剂加入树脂反应器，再将适量的有机碱加入树脂反应器，进行反应；反应完成后对树脂反应器进行洗涤；重复脱保护、脱保护洗涤、反应和洗涤步骤，直到连完最后一个氨基酸；合成完毕后，对树脂反应柱进行洗涤，洗涤完成后将树脂从树脂反应柱中取出进行干燥，获得干燥树脂；
步骤(2)多肽的切割；
将步骤(1)中获得的干燥树脂移至容器中，在该容器中加入切割液，恒温振荡，进行反应产物的切割，获得切割产物；将切割产物进行过滤，滤除树脂，收集滤液，将无水乙醚加入滤液中，析出白色固体，获得初级多肽粗品；将初级多肽粗品进行离心，去除上清液，然后对白色固体进行重复洗涤和离心；将洗涤后的白色固体进行干燥，获得多肽粗品；
步骤(3)多肽粗品的分离纯化：
超声溶解步骤(2)获得的多肽粗品，溶解完全后用滤膜过滤，将过滤好的多肽粗品进行制备，并收集馏分、检验纯度，纯度合格的多肽粗品进行氧化；将氧化好的多肽粗品重新制备，并收集馏分、检验纯度，纯度合格的多肽粗品进行冷冻干燥，获得多肽精品。
为了进一步优化上述制备方法，本发明的技术措施还包括：
进一步地，所述缩合剂选自HOBT、HBTU、TBTU中的一种，更优选为HBTU。所述有机碱选自二异丙基乙胺(DIEA)、N-甲基吗啉(NMM)中的一种，更优选为NMM。所述树脂选自PAM、MBHA、Wang、2-Cl-Trt、Rink-Amide-MBHA中的一种，更优选为Rink-Amide-MBHA树脂。
进一步地，所述步骤(1)多肽的合成包括如下具体步骤：
1a)脱保护：在树脂反应柱中加入适量脱保护溶液，通氮气，抽干；
1b)脱保护洗涤：向树脂反应柱中加入适量二甲基甲酰胺(DMF)，通氮气，抽干；
1c)投料、反应：取适量的氨基酸混合溶液或保护氨基酸以及适量的HBTU加入树脂反应器，再加入适量的NMM，通氮气，抽干；
1d)反应后洗涤：加入适量DMF，通氮气，抽干；
1e)反应产物的检测：取树脂反应器中的适量树脂进行检测，若反应没有完全，则重新再反应一次，若反应完全，则重复上述步骤1a)～1d)，直到连完最后一个氨基酸；
1f)合成完毕后，对树脂反应柱进行洗涤，洗涤完成后将树脂从树脂反应柱中取出进行干燥，获得干燥树脂。
进一步地，所述树脂反应柱为80ml玻璃反应柱。
进一步地，所述树脂反应柱在进行步骤1a)脱保护之前还包括树脂溶胀步骤，其具体为：称Rink amid MBHA Resin树脂倒入反应柱中，加入.二氯甲烷(DCM)浸泡，抽干。
进一步地，所述氨基酸混合溶液的量为树脂的2～4倍摩尔量，HBTU的量为树脂的2～3.5倍摩尔量，NMM的量为树脂的4～8倍摩尔量；更优选地，所述氨基酸混合溶液的量为树脂的3倍摩尔量，HBTU的量为树脂的2.85倍摩尔量，NMM的量为树脂的6倍摩尔量。
进一步地，所述脱保护溶液的组成及其体积比为：20％的六氢吡啶，80％的DMF；
所述保护氨基酸包括Fmoc-Arg(Me.pbf)-OH、Fmoc-Asp(otbu)-oh、Fmoc-Ser(tbu)-oh、Fmoc-Asn(trt)-OH、Fmoc-Phe-oh、Fmoc-AzaGly-Leu-oh、Fmoc-D-Trp(boc)-oh、Fmoc-D-Tyr(tbu)-oh；
所述氨基酸混合溶液由各保护氨基酸溶于DMF溶液中配制而成，其浓度为0.3mmol/ml；
所述反应产物的检测步骤中使用的检测液包括A液体积比为：80％的苯酚+20％的无水乙醇；B液：重蒸吡啶；以及C液：5g茚三酮+100ML无水乙醇。
进一步地，步骤1e)反应产物的检测包括如下具体步骤：取适量树脂于小试管中，加入A，B，C液各两滴。放入干式加热器中加热3分钟(110℃)；取出后若溶液显蓝色，树脂有杂色不透明，则反应没有完全，需要重新再反应一次；若溶液颜色微黄，树脂无色透明则为反应完全，可以连接下一个氨基酸，重复步骤1a)～1d)，直到连完最后一个氨基酸。
进一步地，步骤(2)中的切割液的组成及其重量配比为：87.5％TFA+5％苯甲硫醚+2.5％苯酚+2.5％EDT+2.5％H2O。
进一步地，步骤(3)中多肽粗品的制备及重新制备的步骤均为：以制备条件平衡仪器约6分钟后停所有泵，将滤好的样品用进样阀进样，运行制备梯度，先跑5-5％的梯度20min，再执行80-80％的梯度，收集馏分；收集结束后，停泵；将收集的馏分在分析仪器上检验纯度。
本发明的第四个目的是提供一种多肽((AspSerSer)6-Kp-10)在制备治疗骨质疏松的药物中的应用，所述药物包括(AspSerSer)6-Kp-10的常用的药物辅剂。
与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
本发明通过研究验证了敲除Gpr54或者Kiss1基因导致骨质疏松和破骨细胞过度活化，Kp-10可以抑制破骨前体细胞向成熟破骨细胞分化并可抑制成熟破骨细胞肌动蛋白环(actin-ring)的形成以及可抑制破骨细胞对骨片的吸收功能；通过进一步研究可知，(AspSerSer)6-Kp-10具有更好的骨靶向作用，在体内比Kp-10更有效地治疗由于卵巢切除导致的骨质疏松。
本发明首次明确发现kiss1/Gpr54在破骨细胞中具有重要作用，为治疗破骨细胞相关疾病提供理论依据。
附图说明
图1表示本发明一实施例中的Kiss1和Gpr54在破骨细胞分化过程中的表达水平的示意图；
图2表示本发明一实施例中的敲除Kiss1或Gpr54后的骨量变化示意图；
图3表示本发明一实施例中敲除Gpr54或者Kiss1后抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的变化示意图；
图4表示本发明一实施例中敲除Gpr54或者Kiss1后破骨细胞活化示意图。
图5表示本发明一实施例中Kp-10抑制破骨细胞的分化和吸收及破骨细胞标志基因Ca.k和TRAP的表达；
图6表示本发明一实施例中(AspSerSer)6-Kp-10与Kp-10的抑制去除卵巢导致的骨丢失的对比图。
具体实施方式
本发明涉及一种用于治疗骨质疏松的多肽，其氨基酸序列如下所示：(Asp-Ser-Ser)6-(D-Tyr)-Asn-(D-Trp)-Asn-Ser-Phe-(azaGly)-Leu-Arg(Me)-Phe-NH2((AspSerSer)6-Kp-10)；本发明还涉及上述序列的多肽的制备方法和应用。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
本实施例明确kiss1和Gpr54在破骨细胞分化中的表达。
原理：骨髓单核细胞在细胞因子M-CSF和RANKL的继续刺激下，一周可以分化为破骨细胞，参与调控破骨细胞的基因应该在破骨细胞分化过程中高表达。因此我们首先检测Kiss1和Gpr54在破骨细胞分化过程中的表达情况。
方法：本实施例用RANKL诱导小鼠原代骨髓单核细胞BMMs向破骨细胞分化，收取不同诱导天数的细胞RNA，然后检测Kiss1和Gpr54的mRNA在破骨细胞分化过程中的表达水平。
结果与评价：
其结果如图1所示，该结果显示Kiss1和Gpr54在破骨细胞分化过程中上调。这提示Kiss1和Gpr54可能参与调控了破骨细胞的分化过程。因此得出结论：Gpr54在破骨细胞分化过程中表达上调，提示Kiss1/Gpr54很可能调控骨代谢。
实施例2
本实施例确定kiss1及其受体Gpr54正调控骨量的作用，并得出敲除Gpr54或者Kiss1基因导致骨质疏松。
原理：在基因组上对小鼠kiss1及其受体Gpr54基因进行编辑，令其功能丧失，分别获得kiss1和Gpr54敲除小鼠。通过micro-CT 3D成像技术分析骨参数变化。
方法：将8周野生型(WT)和Gpr54敲除(KO)小鼠的股骨取出，4％的多聚甲醛固定24小时，进行micro-CT检测，并将生长板下100张3D成像分析。
结果与评价：micro-CT扫射成像结果显示Gpr54敲除小鼠骨量明显下降，骨小梁疏松，出现骨质疏松症状。其结果如图2所示，统计结果显示，与WT小鼠比较，Gpr54敲除小鼠骨密度(BMD)下降近50％，骨小梁体积/总体积(BV/TV)，骨小梁厚度(Tb.Th)及骨小梁个数(Tb.N)都有所降低，而骨小梁间距(Tb.Sp)相应有所上升。这些结果都表明相较于WT小鼠，Gpr54敲除小鼠骨丢失。
实施例3
本实施例确定kiss1及其受体Gpr54正调控破骨细胞分化的作用(体内/体外)，并得出敲除Gpr54或者Kiss1导致破骨细胞活化(体内)，敲除Gpr54或者Kiss1导致破骨细胞活化(体外)。
原理：骨髓单核细胞在细胞因子M-CSF的刺激下，会向破骨前体细胞分化，同时，单核的破骨前体细胞在细胞因子M-CSF和RANKL的继续刺激下，细胞间相互接触融合形成多核细胞，紧接着会继续分化、形成具有密封圈结构的成熟破骨细胞，表达特异性抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)参与降解骨质矿化物。成熟破骨细胞能够吸附在骨基质上，通过分泌蛋白酶降解骨质，从而导致骨质疏松。
方法：
体内破骨细胞活性检测：本实施例将8周kiss1和Gpr54小鼠头盖骨和胫骨取出，剔除肌肉，4％多聚甲醛固定24小时，头盖骨可以直接进行TRAP染色，胫骨需要脱钙2个星期，石蜡包埋切片，然后进行TRAP染色。
体外破骨细胞检测：从四周龄kiss1和Gpr54小鼠胫骨和股骨中分离BMM细胞，将骨上皮肤和肌肉去除后，将骨置于PBS中清洗两遍，用剪刀剪断骨头两端，并用装有培养基的10mL针头将骨髓中细胞冲出；将骨髓细胞收集于50mL离心管中，1000rpm离心5分钟后将收集的细胞用5mL培养基重悬；加入20mL红细胞裂解液上下振荡几次后加入25mL培养基，1200rpm离心5分钟收集细胞；含10％FBS的培养基重悬细胞并加入M-CSF(5ng/mL)培养。24小时后收集悬浮细胞加入M-CSF(20ng/mL)培养至细胞贴壁长满即可得到破骨细胞前体细胞。破骨细胞前体细胞在含有M-CSF(20ng/ml)和RANKL(30ng/ml)的培养基中贴壁后培养6天，期间隔天换液。破骨细胞形成后，将细胞固定，对细胞进行TRAP活性分析。TRAP阳性的大于5个核的巨细胞被统计为破骨细胞。
结果与评价：
缺失Kiss1或者Gpr54体内促进破骨细胞活化：其结果如图3所示，头骨上TRAP着色主要区域为人字缝区域，TRAP染色阳性区域呈现酒红色(图3中箭头所指位置)。由图3可知，与WT组对照，Kiss1和Gpr54敲除小鼠头盖骨TRAP着色更深范围更广，这表明Gpr54缺失之后破骨细胞活性和面积增强。同时我们将小鼠股骨进行石蜡包埋和TRAP染色，同样显示敲除Kiss1和Gpr54促进破骨细胞活性。统计结果显示Kiss1和Gpr54敲除促进破骨细胞面积和骨面积的比值(Oc.s/BS)，血清中TRAP的量都上调。
缺失Kiss1或者Gpr54体外促进破骨细胞活化：体外用M-CSF和RANKL诱导骨髓单核细胞分化为破骨细胞，进行TRAP染色，镜检统计结果。其结果如图4所示，由图4壳子，Gpr54缺失之后，BMMs分化的大部分破骨细胞单个面积比WT要大，这表明敲除Gpr54或者Kiss1促进破骨细胞活化。
实施例4
本实施例探索及验证Kp-10抑制破骨细胞分化和功能的作用。
原理：骨髓单核细胞在细胞因子M-CSF和RANKL分化为成熟的破骨细胞。因此，可以通过检测破骨细胞的形成能力来检测药物对于骨质疏松的潜在治疗效果。
方法：破骨细胞前体细胞在含有M-CSF(20ng/ml)和RANKL(30ng/ml)的培养基中贴壁后，分别加入0、0.1、1nM的Kp-10继续培养6天,期间隔天换液。破骨细胞形成后，将细胞固定，对细胞进行TRAP活性分析。TRAP阳性大于5个核的巨细胞统计为破骨细胞，同时收RNA检测破骨细胞标志基因Ca.k和TRAP的表达变化。
结果与评价：结果如图5所示，用Kp-10处理后，形成的破骨细胞数量变少，蚀骨能力减弱，破骨细胞标志基因Ca.k和TRAP的表达下调，这表明Kp-10在体外抑制破骨细胞的分化和骨吸收。
实施例5
本实施例为多肽(AspSerSer)6-Kp-10的合成工艺。
(一)本实施例中多肽合成工艺中所采用的原料、试剂、设备等如下所示：
多肽序列：(DSSDSSDSSDSSDSSDSSYNWNSFGLRF(SEQ ID NO：1))
(Asp-Ser-Ser)6-(D-Tyr)-Asn-(D-Trp)-Asn-Ser-Phe-(azaGly)-Leu-Arg(Me)-Phe-NH2
原料：
保护氨基酸：
Fmoc-Arg(Me.pbf)-OH
Fmoc-Asp(otbu)-oh
Fmoc-Ser(tbu)-oh
Fmoc-Asn(trt)-OH
Fmoc-Phe-oh
Fmoc-AzaGly-Leu-oh
Fmoc-D-Trp(boc)-oh
Fmoc-D-Tyr(tbu)-oh
起始树脂：Rink amid MBHAResin；
缩合剂及有机碱：HBTU，NMM；
溶剂：DMF，DCM，甲醇，六氢吡啶。
设备及仪器：
80ml玻璃反应柱，真空水泵，干式加热器，低俗大容量离心机，恒温摇床，真空干燥皿。
各种试剂的配制：
9种氨基酸混合溶液的配制：
称取以上9种保护氨基酸各1mmol溶于63.4mlDMF溶液中，配制成0.3mmol/ml的氨基酸混合溶液，备用。
Kaiser test试剂的配制(体积比)：
A液：80％的苯酚+20％的无水乙醇；
B液：重蒸吡啶；
C液：5克茚三酮+100ML无水乙醇。
脱保护溶液的配制(体积比)：20％的六氢吡啶+80％的DMF。
多肽切割液的配制(重量配比)：87.5％TFA+5％苯甲硫醚+2.5％苯酚+2.5％EDT+2.5％H2O。
(二)本实施例中多肽(AspSerSer)6-Kp-10的合成工艺包括如下步骤：
1.多肽的合成：
a.树脂溶胀：称Rink amid MBHAResin树脂倒入反应柱中，加入DCM浸泡30分钟，抽干。
b.脱保护：向反应柱中加入适量脱保护溶液，通氮气搅拌鼓动30分钟，抽干。
c.称料：量取树脂3倍摩尔量的氨基酸混合溶液或称取同样量的保护氨基酸，再称取2.85倍摩尔量的HBTU，备用。
d.脱保护洗涤：向反应柱中加入适量DMF，氮气鼓动2分钟，抽干，重复操作6次。
e.投料：将已备好的氨基酸混合溶液或保护氨基酸和HBTU加入反应柱中，再加入树脂6倍摩尔量的NMM，氮气搅拌鼓动30分钟。
f.反应后洗涤：将反应柱中的溶液抽干，加入适量DMF洗涤，氮气鼓动2分钟，抽干，重复操作3次。
g.检测：取适量(10-20颗)树脂于小试管中，加入A，B，C液各两滴。放入干式加热器中加热3分钟(110摄氏度)；
取出后若溶液显蓝色，树脂有杂色不透明，则反应没有完全，需要重新再反应一次；若溶液颜色微黄，树脂无色透明则为反应完全，可以连接下一个氨基酸，具体步骤重复以上b-f这五个步骤，直到连完最后一个氨基酸。
h.合成完毕后的洗涤和干燥：在连完最后一个氨基酸并已脱保护洗涤之后，抽干，向反应柱中加入适量甲醇，氮气鼓动2分钟，抽干，再加入适量DCM，氮气鼓动2分钟，抽干重复操作3次。最后反应釜中加入适量甲醇，氮气鼓动2分钟，抽干，重复操作2次，将树脂装入合适器皿中置于真空干燥器内真空干燥12小时待切割
2.多肽的合成：
a.切割：将干燥后的树脂装入合适的圆底烧瓶中，加入适量配好的切割液(1g/10ml)，放置于恒温摇床中25C恒温振荡2小时。
b.过滤：用50ml的砂芯漏斗过滤掉树脂颗粒，然后将滤液倒入100ml的离心管内，加入6-8倍体积量的无水乙醚，边加边搅拌，析出的白色固体为即所需多肽粗品。
c.洗涤：将离心管密封后放入离心机中以4000转每分钟的转速离心3分钟，取出，将上层清液倒掉，再加入乙醚，用玻璃棒搅拌均匀，再次离心；如此重复操作洗涤5次。
d.干燥：将以洗涤5次的后的多肽放入真空干燥器中真空干燥24小时。最后的所得白色粉末即为所需多肽的粗品，称量。
3.多肽的纯化：
a.制备条件：
仪器：高效液相色谱仪，配紫外检测器；
波长：220nm；
流速：30ml/min；
制备柱：30*250mm C18柱；
流动相：A：100％ACN；
B：100％H2O；
b.粗品分析
取少量样品于0.5ml离心管中用纯水超声溶解至澄清，过滤进样。用梯度10-100％分析。
c.分离纯化
c1.溶解样品：称量200mg样品于10ml的烧杯中，加入7.5ml纯水和2.5mlACN超声溶解，待样品完全溶解后用0.45μ的滤膜过滤。
c2.制备样品：以制备条件平衡仪器约6分钟后停所有泵，将滤好的样品用进样阀进样，运行制备梯度，先跑5-5％的梯度20min，再执行80-80％的梯度，收集馏分。收集结束后，停泵。将收集的馏分在分析仪器上检验纯度，纯度合格的样品进行氧化。
c3.氧化：将2制备后的样品PH用稀氨水调到8左右，搅拌24小时，通过质朴来判断是否氧化。
c4.二次制备：将氧化好的样品重新按照2中方法再制备一次，然后分析仪器上检验纯度，纯度合格后的样品进行冷冻干燥。
c5.冷冻干燥：将收集的馏分用旋转蒸发仪将溶液中的有机溶剂旋蒸掉之后上冷冻干燥机冷冻干燥。
c6.称量检测：冻干两天后开冷冻干燥机，取出精品称量重量装入精品管中，送QC检测，待检测合格入库。依次重复以上操作。
实施例6
本实施例确定(AspSerSer)6-Kp-10与Kp-10在去除卵巢导致的骨质疏松小鼠模型中抗骨质疏松的作用。
原理：妇女绝经导致雌激素大量下降，破骨细胞活化因子RANKL大量上调导致破骨细胞过度活化。将小鼠卵巢摘除可以模拟妇女绝经导致的骨质疏松症。
方法：
本实施例在12周时对小鼠进行去除卵巢手术，4周后，开始尾静脉分别注射100nmol/kg Kp-10与(AspSerSer)6-Kp-10 4周，microCT检测骨量变化。
结果与评价：
其检测结果如图6所示，由图6可知，(AspSerSer)6-Kp-10比Kp-10能更好地抑制去除卵巢所导致的骨丢失。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海长征医院
<120> 一种用于治疗骨质疏松的多肽及其制备方法和应用
<160> 1
<210> 1
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> (AspSerSer) 6-Kp-10，其为6个重复的天冬氨酸-丝氨酸-丝氨酸串联序列结构连接在Kp-10的N端；其中，Kp-10的Gly和Arg分别做了修饰，具体为azaGly和Arg(Me)
<400> 1
Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp
1 5 10 15
Ser Ser Tyr Asn Trp Asn Ser Phe Gly Leu Arg Phe
20 25

Claims (8)

1.一种用于治疗骨质疏松的多肽，其特征在于，其具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
2.一种如权利要求1所述的多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)多肽的合成；
对树脂反应柱依次进行脱保护和脱保护洗涤；脱保护洗涤完成后，取适量的氨基酸混合溶液或保护氨基酸以及适量的缩合剂加入树脂反应器，再将适量的有机碱加入树脂反应器，进行反应；反应完成后对树脂反应器进行洗涤；重复脱保护、脱保护洗涤、反应和洗涤步骤，直到连完最后一个氨基酸；合成完毕后，对树脂反应柱进行洗涤，洗涤完成后将树脂从树脂反应柱中取出进行干燥，获得干燥树脂；
步骤(2)多肽的切割；
将步骤(1)中获得的干燥树脂移至容器中，在该容器中加入切割液，恒温振荡，进行反应产物的切割，获得切割产物；将切割产物进行过滤，滤除树脂，收集滤液，将无水乙醚加入滤液中，析出白色固体，获得初级多肽粗品；将初级多肽粗品进行离心，去除上清液，然后对白色固体进行重复洗涤和离心；将洗涤后获得的白色固体进行干燥，获得多肽粗品；
步骤(3)多肽粗品的分离纯化；
超声溶解步骤(2)获得的多肽粗品，溶解完全后用滤膜过滤，将过滤好的多肽粗品进行制备，并收集馏分、检验纯度，纯度合格的多肽粗品进行氧化；将氧化好的多肽粗品重新制备，并收集馏分、检验纯度，纯度合格的多肽粗品进行冷冻干燥，获得多肽精品。
3.根据权利要求2所述的多肽的制备方法，其特征在于，所述缩合剂选自HOBT、HBTU、TBTU中的一种；所述有机碱选自DIEA、NMM中的一种；所述树脂选自PAM、MBHA、Wang、2-Cl-Trt、Rink-Amide-MBHA中的一种。
4.根据权利要求3所述的多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)多肽的合成包括如下具体步骤：
1a)脱保护：在树脂反应柱中加入适量脱保护溶液，通氮气，抽干；
1b)脱保护洗涤：向树脂反应柱中加入适量DMF，通氮气，抽干；
1c)投料、反应：取适量的氨基酸混合溶液或保护氨基酸以及适量的HBTU加入树脂反应器，再加入适量的NMM，通氮气，抽干；
1d)反应后洗涤：加入适量DMF，通氮气，抽干；
1e)反应产物的检测：取树脂反应器中的适量树脂进行检测，若反应没有完全，则重新再反应一次，若反应完全，则重复上述步骤1a)～1d)，直到连完最后一个氨基酸；
1f)合成完毕后，对树脂反应柱进行洗涤，洗涤完成后将树脂从树脂反应柱中取出进行干燥，获得干燥树脂。
5.根据权利要求4所述的多肽的制备方法，其特征在于，
所述脱保护溶液为20v％的六氢吡啶和80v％的DMF；
所述保护氨基酸包括Fmoc-Arg(Me.pbf)-OH、Fmoc-Asp(otbu)-oh、Fmoc-Ser(tbu)-oh、Fmoc-Asn(trt)-OH、Fmoc-Phe-oh、Fmoc-AzaGly-Leu-oh、Fmoc-D-Trp(boc)-oh、Fmoc-D-Tyr(tbu)-oh；
所述氨基酸混合溶液由各保护氨基酸溶于DMF溶液中配制而成，其浓度为0.3mmol/ml；
所述反应产物的检测步骤中使用的检测液包括A液：80v％的苯酚和20v％的无水乙醇；B液：重蒸吡啶；以及C液：5g茚三酮和100ML无水乙醇。
6.根据权利要求2所述的多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的切割液的组成及其重量配比为：87.5％TFA、5％苯甲硫醚、2.5％苯酚、2.5％EDT和2.5％H2O。
7.根据权利要求2所述的多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中多肽粗品的制备及重新制备的步骤均为：以制备条件平衡仪器约6分钟后停所有泵，将滤好的样品用进样阀进样，运行制备梯度，先跑5-5％的梯度20min，再执行80-80％的梯度，收集馏分；收集结束后，停泵；将收集的馏分在分析仪器上检验纯度。
8.一种如权利要求1所述的多肽在制备治疗骨质疏松的药物中的应用。
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