CN115804851A - 一种兼具骨靶向功能的豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物及其在骨质疏松治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种兼具骨靶向功能的豇豆褪绿斑驳病毒‑多肽复合物及其在骨质疏松治疗中的应用，属于生物药物技术领域。本发明首先提供了一种氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的多肽，然后提供了一种在豇豆褪绿斑驳病毒表面接枝该多肽而得的复合物。本发明复合物能够用于预防和/或治疗骨质疏松。同时，本发明复合物具有骨靶向功能，能够指向性地靶向到骨组织，仅在骨组织中发挥作用，减少药物对全身其他器官和系统的影响；本发明复合物可以减少RANKL‑RANK信号通路被完全阻断所产生的副作用，对心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏等脏器无明显副作用。由此可见，本发明复合物具有安全、无毒性、稳定、效果好等优势，在治疗骨质疏松方面具有良好的应用前景。

Description

一种兼具骨靶向功能的豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物及其 在骨质疏松治疗中的应用

技术领域

本发明属于生物药物技术领域，具体涉及一种兼具骨靶向功能的豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物及其在骨质疏松治疗中的应用。

背景技术

骨质疏松症(osteoporosis)是一种常见的骨骼系统疾病，以骨量减少及骨微结构改变为主要特征，最常见于绝经后体内雌激素水平急剧下降的女性患者。据统计，50岁以上的女性中，每三人就有一人发生与骨质疏松相关的骨折，导致患者长期的疼痛和行动不便，同时也给社会带来巨大的经济和公共卫生负担。骨量的相对恒定，依赖以成骨细胞主导的骨质生成和以破骨细胞主导的骨质吸收间的动态平衡。骨质疏松的发生，意味着绝对骨量的减少，即骨生成减少和/或骨吸收增加。因此，现有的骨质疏松治疗方法大致包括以下几类：(1)抑制骨吸收类药物，如雌激素、降钙素、双磷酸盐、破骨细胞分化因子抑制剂等；(2)促进骨生成类药物，如甲状旁腺激素等；(3)兼具抑制骨吸收和促进骨生成类药物：如组织蛋白酶K抑制剂等。

现有的抑制骨吸收类药物包括双磷酸盐、破骨细胞分化因子抑制剂等。双磷酸盐类药物通过结合于骨组织中的羟基磷灰石，在破骨细胞行使骨吸收功能时进入成熟破骨细胞，阻碍破骨细胞进一步发挥功能并诱导破骨细胞凋亡，从而有效抑制骨吸收。然而，双磷酸盐存在一定的局限性：沉积于骨组织中以致在体内的代谢速率较慢、仅影响成熟破骨细胞的功能而不影响破骨细胞的分化和形成、导致功能丧失的破骨细胞大量积聚等。

破骨细胞分化因子抑制剂地诺单抗是核因子KB受体活化因子配体RANKL的特异性单克隆抗体，通过与RANKL结合，阻断RANKL与其受体RANK结合，抑制RANKL-RANK信号通路的激活，从而有效减少破骨细胞的分化形成并削弱其骨吸收功能。但该方法缺乏骨靶向功能，RANKL-RANK信号通路同样在免疫、炎症、感染等过程中发挥重要作用，因此阻断RANKL-RANK信号通路在减少破骨细胞形成及功能的同时，可能会增加感染风险等。

可见现有治疗骨质疏松的药物均存在一定问题。研究一种具有骨靶向功能，可以针对性抑制破骨细胞分化和形成，但不会增加感染风险的药物对于治疗骨质疏松症具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种兼具骨靶向功能的豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物及其在骨质疏松治疗中的应用。

本发明提供了一种多肽，所述多肽为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

本发明还提供了前述的多肽在制备具有骨靶向功能的药物中的用途。

进一步地，前述的多肽在制备预防和/或治疗骨质疏松的药物中的用途。

本发明还提供了一种豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物，它是在豇豆褪绿斑驳病毒表面接枝前述的多肽而得的复合物。所述接枝的含义为多肽通过酰胺键连接在豇豆褪绿斑驳病毒表面。

进一步地，制备豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物时，所述豇豆褪绿斑驳病毒和前述的多肽的质量比为1：(0.1～50)；

优选地，所述豇豆褪绿斑驳病毒和前述的多肽的质量比为1：50。

本发明还提供了前述的豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物的制备方法，它包括如下步骤：

将前述的多肽上的羧基活化后，与豇豆褪绿斑驳病毒混合，在溶剂中，活化的羧基与豇豆褪绿斑驳病毒上的氨基发生缩合反应，将反应混合物洗脱、透析，即得。

进一步地，

所述活化为使用EDC和NHS活化多肽上的羧基；

和/或，所述溶剂为PBS缓冲液或Tris缓冲液；

和/或，所述缩合反应为在4～25℃孵育1～12小时；

和/或，所述洗脱为通过脱盐柱洗脱；

和/或，所述透析为在PBS缓冲液中透析。

进一步地，

所述多肽、EDC和NHS的摩尔比为1:0.9:1；

和/或，所述洗脱的洗脱液为PBS缓冲液；和/或，所述洗脱时淋洗速度为0.5mL/min；和/或，所述洗脱时淋洗体积为24mL；

和/或，所述透析时分子截留量为14kDa；和/或，所述透析时间为12小时；和/或，所述透析时每隔3小时换一次透析液。

本发明还提供了前述的豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物在制备预防和/或治疗骨质疏松的药物中的用途；

优选地，所述药物为抑制破骨细胞形成的药物；

更优选地，所述药物为具有骨靶向功能的药物。

本发明还提供了一种药物，它是以前述的豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药物。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供了一种豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物，该复合物能够有效抑制破骨细胞的形成和分化，可有效改善骨质疏松患者的骨量和骨质，用于预防和/或治疗骨质疏松。同时，本发明复合物具有骨靶向功能，能够指向性地靶向到骨组织，仅在骨组织中发挥作用，减少药物对全身其他器官和系统的影响；本发明复合物安全性强，无细胞毒性，且可以减少RANKL-RANK信号通路被完全阻断所产生的副作用，对心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏等脏器无明显副作用。由此可见，本发明复合物具有安全、无毒性、稳定、效果好等优势，在治疗骨质疏松方面具有良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为实施例1制备的BTRM-VNPs的表征结果：A为VNPs和BTRM-VNPs进行FPLC时的洗脱体积；B为VNPs和BTRM-VNPs的动态力学粒径测试结果；C为VNPs和BTRM-VNPs的Zeta电位测试结果；D为紫外分光光度计表征BTRM-VNPs的紫外吸收光谱；E为VNPs的TEM检测结果；F为BTRM-VNPs的TEM检测结果；图E和F中，bar＝50nm。

图2为实施例1制备的BTRM-VNPs对骨髓巨噬细胞(BMDM)生长影响的CCK-8检测结果：A为不同浓度BTRM-VNPs处理1天的检测结果；B为不同浓度BTRM-VNPs处理2天的检测结果；C为不同浓度BTRM-VNPs处理3天的检测结果。

图3为共聚焦显微镜检测实施例1制备的BTRM-VNPs的入胞能力及稳定性结果。

图4为TRAP染色检测实施例1制备的BTRM-VNPs对破骨细胞形成的抑制效果。

图5为组织荧光成像技术检测实施例1制备的BTRM-VNPs的骨靶向作用。

图6为Micro-CT检测实施例1制备的BTRM-VNPs对骨质疏松小鼠骨量的改善情况。

图7为HE染色观察实施例1制备的BTRM-VNPs对脏器组织结构的影响。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

本实验由(1)四川省自然科学基金2022NSFSC1511；(2)四川大学华西口腔医院探索与研发项目基础与应用基础研究项目RD-02-202207支持。

实施例1、兼具骨靶向功能的豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物的制备

本发明兼具骨靶向功能的豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物的制备主要包括如下步骤：

1、RANK结构域相关多肽的制备

本发明将骨靶向多肽Asp8与RANK关键结构域Motif2/3相关多肽合并，制备得到RANK结构域相关多肽，命名为BTRM。RANK结构域相关多肽(BTRM)的氨基酸序列为：SRPVQEQGGADDDDDDDD(SEQ ID NO.1)。RANK结构域相关多肽采用常规的多肽固相合成法制备而得。

2、豇豆褪绿斑驳病毒纳米颗粒的扩增

本实验使用的豇豆褪绿斑驳病毒来自ATCC，它的平台编号为Bio-46614。

CCMV储存液是pH为5，NaOAc浓度为1M，DTT浓度为5mM的水溶液。

豇豆褪绿斑驳病毒(CCMV)是一种病毒纳米颗粒(virus nanoparticles,VNPs)，通过将CCMV人工感染豇豆叶子，并通过一系列分离提纯，可对其进行扩增，具体方法如下：

将豇豆种子播种在植物培育房中，7-10天后长出幼叶，将CCMV病毒溶液(溶剂是CCMV储存液，CCMV病毒浓度是1mg/mL)通过人工摩擦感染在嫩叶上，具体来说：摘取6-7片豇豆幼叶，研钵将其研碎，加入100μL CCMV病毒溶液，以及100mL蒸馏水，充分混匀，利用指腹蘸取少许上述浑浊液，在幼叶表面反复摩擦，直至表面出现轻微伤痕，再培育8-10天后，摘取所有的豇豆叶子，通过破壁机破壁，纱布过滤，离心取得上清液，获得含有大量蛋白质的粗产物，然后将离心上清液与PEG6000以10：1(体积质量比，mL/g)比例混合，将蛋白沉淀，离心获得蛋白沉淀，然后用CCMV储存液悬浮上述沉淀获得CCMV粗产物，然后通过超速离心机进行梯度离心(40000RPM，17h，4℃)，获得CCMV纳米颗粒(VNPs)，并将其透析到CCMV储存液中(分子截留量为14kDa，透析时间7天，每天换一次液)。

3、兼具骨靶向功能的豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物的制备

本发明复合物是步骤2制备得到的豇豆褪绿斑驳病毒纳米颗粒(VNPs)和步骤1制备得到的多肽(BTRM)按照质量比1:50，通过缩合反应将BTRM修饰于VNPs表面制备而得。具体制备方法为：

首先将BTRM与EDC/NHS以摩尔比1:0.9:1混合，以PBS缓冲液作为溶剂，室温反应10-15min，活化BTRM氮端的羧基，然后将得到的混合液加入VNPs溶液(溶剂为PBS缓冲液)中，使BTRM活化的羧基与VNPs表面的氨基反应形成酰胺键，其中VNPs和BTRM的质量比为1:50，所述反应为4℃孵育2小时。然后将反应混合物通过脱盐柱洗脱，洗脱液为PBS缓冲液(pH＝7.2)，淋洗速度为0.5mL/min，淋洗体积为24mL。洗脱后将洗脱液放入分子截留量为14kDa的透析袋，在PBS透析液中透析12小时，每隔3小时换一次透析液，透析后得到豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物(BTRM-VNPs)。将所得溶液保存在-20℃。

实施例2、兼具骨靶向功能的豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物的制备

按照实施例1所述方法，仅在步骤3时，将VNPs和BTRM的质量比改为5:1，制备得到BTRM-VNPs。

实施例3、兼具骨靶向功能的豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物的制备

按照实施例1所述方法，仅在步骤3时，将VNPs和BTRM的质量比改为1:1，制备得到BTRM-VNPs。

实施例4、兼具骨靶向功能的豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物的制备

按照实施例1所述方法，仅在步骤3时，将VNPs和BTRM的质量比改为1:5，制备得到BTRM-VNPs。

实施例5、兼具骨靶向功能的豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物的制备

按照实施例1所述方法，仅在步骤3时，将VNPs和BTRM的质量比改为1:10，制备得到BTRM-VNPs。

实施例6、兼具骨靶向功能的豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物的制备

按照实施例1所述方法，仅在步骤3时，将VNPs和BTRM的质量比改为1:20，制备得到BTRM-VNPs。

以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。

试验例1、豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物(BTRM-VNPs)的表征

1、实验方法

利用体积色谱排除柱(FPLC)、紫外分光光度计、Zeta电位、透射电镜等对实施例1制备的BTRM-VNPs和VNPs进行表征。

其中，体积色谱排除柱(FPLC)的流动相为PBS缓冲液(pH＝7.2)，缓冲液的淋洗速度为0.5mL/min，淋洗体积为24mL，检测样品均分散在PBS缓冲液中，上样前需对样品进行过滤(过滤器孔径为200μm)，以除掉大的杂质避免堵塞柱子。

紫外分光光度计检测波长为220-700nm，扫描速度100nm/min，检测样品为FPLC分离提纯后的BTRM-VNPs溶液。

Zeta电位检测所用样品池为石墨电极，所需样品体积为1mL，检测样品为FPLC分离提纯后的BTRM-VNPs溶液。

透射电镜检测电压为400V，并将为FPLC分离提纯后的BTRM-VNPs溶液取5μL滴在铜网上，用滤纸轻轻吸掉多余液体，然后滴加5μL乙酸双氧铀染色液，室温染色45-60s，再次用滤纸吸去多于液体，室温干燥等待检测。

2、实验结果

BTRM-VNPs的表征结果如图1所示。图1A为通过FPLC对所制备的BTRM-VNPs进行分离提纯，实验结果显示BTRM-VNPs在约11.5ml左右的淋洗体积洗出，收集该组分并进行下一步的表征。图1B为动态力学粒径测试(DLS)结果，结果显示改性后BTRM-VNPs粒径与改性前的VNPs相比并无显著变化，大小均在30nm左右。图1C的Zeta电位测试结果显示，改性后的BTRM-VNPs与VNPs均略带负电，并未发现明显差异。图1D为紫外分光光度计表征BTRM-VNPs的紫外吸收光谱，说明BTRM改性后的VNPs在紫外吸收光谱上并未发生明显变化。图1E为VNPs的TEM检测结果，显示其大小与DLS测试结果一致。图1F为BTRM-VNPs的TEM检测结果，表明其大小以及形貌与VNPs类似，这与DLS测试结果一致。

上述实验结果说明BTRM-VNPs与VNPs在理化性质上并未有明显区别。

试验例2、BTRM-VNPs的细胞实验

一、CCK-8检测BTRM-VNPs是否存在细胞毒性

1、实验方法

取处于对数生长期的骨髓巨噬细胞(BMDM)，将其配置成细胞悬液(细胞密度为1.5万)，然后在200μL细胞悬液中分别加入5μM、1μM、0.2μM、0.04μM浓度的实施例1制备的BTRM-VNPs(培养基配制)，37℃孵育骨髓巨噬细胞(BMDM)1天、2天和3天，处理后分别使用CCK8检测细胞活性。使用不加BTRM-VNPs处理的骨髓巨噬细胞作为对照组(Ctrl)。

2、实验结果

不同浓度BTRM-VNPs处理骨髓巨噬细胞(BMDM)1天、2天和3天后，CCK8检测结果如图2所示。与对照组(Ctrl)相比，5μM的BTRM-VNPs处理1天、2天和3天后对BMDM的增殖有显著的影响；而其他浓度的BTRM-VNPs与对照组(Ctrl)相比没有统计学差异。

上述实验结果说明：浓度不高于1μM的BTRM-VNPs对BMDM细胞的增殖无明显影响，无细胞毒性。

二、共聚焦显微镜检测BTRM-VNPs的入胞率及稳定性

1、实验方法

带有荧光标记的BTRM-VNPs的制备方法与实施例1的BTRM-VNPs的制备方法类似，其中BTRM肽段在固相合成后，采用常规化学改性的方法(形成酰胺键)将FITC标记在其N端，最后通过HPLC分离提纯，并冻干储存。

使用带有荧光标记的BTRM-VNPs处理BMDM细胞，分别在处理第1天、第3天、第5天或者第7天后，通过共聚焦显微镜观察BTRM-VNPs能否进入细胞，以及在细胞中存在的时间。具体方法如下：

取处于对数生长期的骨髓巨噬细胞(BMDM)，将其配置成细胞悬液(细胞密度为10万)，然后在1mL细胞悬液中加入1μM浓度的带有荧光标记的BTRM-VNPs(使用培养基配制)，37℃孵育骨髓巨噬细胞(BMDM)1天、3天、5天和7天，然后通过共聚焦显微镜观察BTRM-VNPs能否进入细胞，以及在细胞中存在的时间。

2、实验结果

实验结果如图3所示：BTRM-VNPs在第1天即可进入细胞质，并于7天左右代谢完全。实验结果说明BTRM-VNPs能够被细胞高效摄取且能够在细胞中稳定存在5天，相较于单纯的多肽来讲，提高了其效率和稳定性。同时，BTRM上带有荧光标记，因此只有在VNPs上成功接枝BTRM后，才能观察到荧光，这进一步证明了BTRM-VNPs制备成功。

三、TRAP染色检测BTRM-VNPs对破骨细胞形成的抑制效果

1、实验方法

本实验方法中使用的BTRM-VNPs为实施例1制备的BTRM-VNPs。

分别使用对照溶剂PBS、RANKL、RANKL+BTRM、RANKL+VNPs、RANKL+BTRM-VNPs处理BMDM细胞4天后，对细胞进行TRAP染色。具体方法如下：

取处于对数生长期的骨髓巨噬细胞(BMDM)，将其配置成细胞悬液(细胞密度为10万)，然后在1mL细胞悬液中分别加入1μM浓度的BTRM-VNPs、1μM浓度的BTRM或VNPs(VNPs的浓度是根据搭载率等量换算而得)，37℃孵育骨髓巨噬细胞(BMDM)1天，然后各组加入100ng/ml浓度的RANKL，对照溶剂组加入等量PBS，继续在37℃孵育4天。细胞培养结束后，使用4％多聚甲醛固定细胞30分钟，再行TRAP染色。

2、实验结果

实验结果如图4所示：单独使用BTRM和VNPs均不能抑制破骨细胞的形成，而浓度1μM的BTRM-VNPs能够有效抑制破骨细胞的形成。

试验例3、BTRM-VNPs的动物实验

一、组织荧光成像技术检测BTRM-VNPs的骨靶向作用

1、实验方法

使用实施例1制备的BTRM-VNPs的PBS溶液，对C57/BL6小鼠仅进行1次尾静脉注射(浓度为1μM，100μL)，并于3天后解剖分离小鼠的四肢骨及脊柱，进行组织荧光成像检测。

2、实验结果

BTRM-VNPs的骨靶向作用结果如图5所示，图5显示BTRM-VNPs具有良好的骨靶向特性。

二、Micro-CT染色检测BTRM-VNPs对骨质疏松小鼠骨量的改善情况

1、实验方法

通过切除C57/BL6小鼠双侧卵巢建立小鼠骨质疏松模型(OVX)。模型建立后第二天开始，分别使用BTRM、VPNs、BTRM-VNPs(实施例1制备)经尾静脉注射入骨质疏松小鼠体内，注射药物浓度均为1μM(100μL，PBS为溶媒)，注射次数为8次(每周注射2次)。注射完毕后，Micro-CT扫描，对小鼠股骨骨小梁进行三维重建，并分析BV/TV(骨组织体积/总体积)、Tb.Th(骨小梁厚度)、Tb.Sp(骨小梁间隙)、Tb.N(骨小梁数目)等参数的组间差异。

2、实验结果

实验结果如图6所示：BTRM-VNPs明显改善了骨质疏松小鼠股骨BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N等参数值(有统计学差异)。而BTRM组或VNPs组与骨质疏松小鼠间未有明显的统计学差异。说明BTRM-VNPs可以显著改善骨质疏松小鼠股骨骨小梁的骨量和骨微结构。

三、HE染色观察BTRM-VNPs对脏器组织结构的影响

1、实验方法

通过切除C57/BL6小鼠双侧卵巢建立小鼠骨质疏松模型(OVX)。模型建立后第二天开始，分别使用BTRM、VPNs、BTRM-VNPs(实施例1制备)经尾静脉注射入骨质疏松小鼠体内，注射药物浓度均为1μM(100μL，PBS为溶媒)，注射次数为8次(每周注射2次)。注射完毕后，解剖分离小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏等脏器，将对应的石蜡切片进行HE染色。

2、实验结果

实验结果如图7所示：各个脏器的微观结构未有组间明显差异。实验结果说明：BTRM-VNPs具有很好的生物相容性，在改善骨质疏松小鼠骨量和骨微结构的同时，并未对其他器官(心、肝、脾、肺、肾等)造成明显的损伤。

综上，本发明提供了一种豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物，该复合物能够有效抑制破骨细胞的形成和分化，可有效改善骨质疏松患者的骨量和骨质，用于预防和/或治疗骨质疏松。同时，本发明复合物具有骨靶向功能，能够指向性地靶向到骨组织，仅在骨组织中发挥作用，减少药物对全身其他器官和系统的影响；本发明复合物安全性强，无细胞毒性，且可以减少RANKL-RANK信号通路被完全阻断所产生的副作用，对心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏等脏器无明显副作用。由此可见，本发明复合物具有安全、无毒性、稳定、效果好等优势，在治疗骨质疏松方面具有良好的应用前景。

Claims (10)

1.一种多肽，其特征在于：所述多肽为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的多肽在制备具有骨靶向功能的药物中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：权利要求1所述的多肽在制备预防和/或治疗骨质疏松的药物中的用途。

4.一种豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物，其特征在于：它是在豇豆褪绿斑驳病毒表面接枝权利要求1所述的多肽而得的复合物。

5.根据权利要求4所述的豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物，其特征在于：制备豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物时，所述豇豆褪绿斑驳病毒和权利要求1所述的多肽的质量比为1：(0.1～50)；

优选地，所述豇豆褪绿斑驳病毒和权利要求1所述的多肽的质量比为1：50。

6.权利要求4或5所述的豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：

将权利要求1所述的多肽上的羧基活化后，与豇豆褪绿斑驳病毒混合，在溶剂中，活化的羧基与豇豆褪绿斑驳病毒上的氨基发生缩合反应，将反应混合物洗脱、透析，即得。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：

所述活化为使用EDC和NHS活化多肽上的羧基；

和/或，所述溶剂为PBS缓冲液或Tris缓冲液；

和/或，所述缩合反应为在4～25℃孵育1～12小时；

和/或，所述洗脱为通过脱盐柱洗脱；

和/或，所述透析为在PBS缓冲液中透析。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：

所述多肽、EDC和NHS的摩尔比为1:0.9:1；

和/或，所述洗脱的洗脱液为PBS缓冲液；和/或，所述洗脱时淋洗速度为0.5mL/min；和/或，所述洗脱时淋洗体积为24mL；

和/或，所述透析时分子截留量为14kDa；和/或，所述透析时间为12小时；和/或，所述透析时每隔3小时换一次透析液。

9.权利要求4或5所述的豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物在制备预防和/或治疗骨质疏松的药物中的用途；

优选地，所述药物为抑制破骨细胞形成的药物；

更优选地，所述药物为具有骨靶向功能的药物。

10.一种药物，其特征在于：它是以权利要求4或5所述的豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药物。

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