DE69735533T2

DE69735533T2 - Lösliche Polypeptide bestehend aus der ersten Coiled coil Domäne aus Mensch- und Maus-Epimorphin

Info

Publication number: DE69735533T2
Application number: DE69735533T
Authority: DE
Inventors: Sumitomo Elect. Industries Shogo Yokohama-shi KOSHIDA
Original assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Current assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Priority date: 1996-11-18
Filing date: 1997-11-18
Publication date: 2006-10-12
Anticipated expiration: 2017-11-19
Also published as: AU4967397A; EP1008603A4; KR100522509B1; EP1008603A1; WO1998022505A1; AU730367B2; CA2272356C; DE69735533D1; US6372890B1; EP1008603B1; KR20000053277A; JP3903503B2; CN1237982A; JPH10147597A; CN100413888C; CA2272356A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung betrifft neue wasserlösliche Polypeptide mit Morphogenese-beschleunigender Aktivität und zellproliferierender Aktivität gegenüber Epithelzellen.
STAND DER TECHNIK
Es wird vorgeschlagen, dass Faktoren, die aus Mesenchymzellen abgeleitet sind, die um Epithelgewebe herum existieren, die normale Morphogenese des Epithelgewebes kontrollieren. Es ist auch anerkannt, dass viele der Ursachen von Krankheiten, die aus abnormaler Morphogenese von Epithelgeweben resultieren, durch die krankhafte Veränderung von Mesenchymzellen bedingt sind. Basierend auf solchen Ergebnissen gibt es ein Interesse an der Untersuchung des Steuerungsmechanismus der Morphogenese des Epithelgewebes durch die Mesenchymzellen. Jedoch gibt es, da eine Gruppe von Substanzen, die an der Kontrolle der Morphogenese von Epithelgeweben durch Mesenchymzellen teilhaben, in einem komplexen System unter Zeit- und Raumbeschränkungen exprimiert wird, große Schwierigkeiten bei der Isolierung dieser Substanzen und der Analyse ihrer Funktionen. Es ist auch schwierig, ein experimentelles Modellsystem zu konstruieren, dass die Morphogenese der Epithelgewebe vereinfacht. Aus diesen und anderen Gründen hat es in den Studien auf diesem Gebiet bis heute keine größeren Fortschritte gegeben. Dementsprechend ist es wirklich wünschenswert, dass der Kontrollmechanismus der Morphogenese von Epithelgeweben analysiert wird, um den Mechanismus der Störung durch Krankheiten zu untersuchen, die aus der Morphogenese der Epithelgewebe resultieren, oder Verfahren für die Behandlung dieser Erkrankungen zu etablieren.
Unter diesen Umständen wurde Epimorphin, das an der Kontrolle der Morphogenese von Epithelgeweben teilnimmt, abgetrennt und aufgereinigt. (Ungeprüfte japanische Patentveröffentlichung Hei 6-25,295, korrespondiert zu EP 0 562 123 .) Es wurde gezeigt, dass diese Substanz eine physiologisch aktive Substanz ist, deren Kernprotein ein Protein ist, das 277 bis 289 Aminosäuren umfasst und das hauptsächlich durch Mesenchymzellen biosynthetisch hergestellt wird. Es wurde auch gezeigt, dass Epimorphin eine Aktivität zur Beschleunigung der Morphogenese von Epithelgeweben durch die Einwirkung auf die Epithelzellen besitzt und dass die normale Morphogenese nicht unter solchen Bedingungen stattfindet, bei denen Epimorphin seine Funktion nicht ausübt.
Zusätzlich wurde in Bezug auf die strukturellen Eigenschaften von Epimorphin herausgefunden, dass das Epimorphinmolekül strukturell größtenteils in vier Fragmente aufgeteilt ist. (Europäische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. 0 698 666) Genauer gesagt kann das Polypeptid, das das Epimorphin in Gesamtlänge darstellt, von seiner N-terminalen Seite her in eine gewickelte Spiraldomäne (coiled coil domain) (1), eine funktionelle Domäne (2), eine gewickelte Spiraldomäne (coiled coil domain) (3) und eine hydrophobe Domäne an seinem C-terminalen Ende aufgeteilt werden. Für die funktionelle Domäne unter diesen Fragmenten (die Domäne, die durch die 104. bis 187. Aminosäuren von der N-terminalen Seite her in menschlichem Epimorphin definiert wird) wurde vorgeschlagen, dass diese Domäne an der Zelladhäsion partizipiert und stark in die Manifestierung der biologischen Aktivitäten von Epimorphin involviert ist. (Europäische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. 0 698 666, siehe oben.)
Da Epimorphin eine Aktivität für die Beschleunigung der normalen Morphogenese besitzt, wird erwartet, dass diese Substanz als ein Medikament für die Vorbeugung oder Behandlung von Erkrankungen nützlich ist, die aus der krankhaften Veränderung der Morphogenese resultieren, oder als der aktive Inhaltsstoff von Medikamenten wie einem das Haarwachstum unterstützenden Mittel nützlich ist. Jedoch hat es sich als schwer heraus gestellt, native Epimorphine, die aus Säugetieren erhalten wurden, in eine praktische Verwendung als Medikamente zu überführen, weil sie kaum in wässrigen Medien wie physiologischer Salzlösung löslich sind. Aus diesem Grund werden Versuche unternommen, de novo Epimorphinderivate herzustellen, die eine exzellente Wasserlöslichkeit aufweisen, während sie im Wesentlichen die Morphogenese beschleunigende Aktivität der nativen Epimorphine beibehalten. Zum Beispiel ist eine veränderte Form (Fragment 123) bekannt, die durch die Deletion der hydrophoben Domäne an dem C-terminalen Ende erhalten wird. (Ungeprüfte japanische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. Hei 6-25,295.)
In Bezug auf die gewickelte Spiraldomäne (coiled coil domain) (1), die eine Teilstruktur des Epimorphins ist, wurde zuvor gezeigt, dass diese Domäne eine Aktivität besitzt, Epimorphin mit seiner Löslichkeit auszustatten. Jedoch wurde auch gezeigt, dass wenn ein Teil der gewickelten Spiraldomäne (coiled coil domain) (1) durch Deletion der Aminosäuren von der N-terminalen Seite von Epimorphin entfernt wird, die Zelladhäsionsaktivität der resultierenden veränderten Form abgeschwächt wird. (Europäische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. 0 698 666.) Genauer gesagt wurde offenbart, dass in Bezug auf die Aktivität dieser Domäne sie positiv zu dem Aspekt der Löslichkeit durch eine solche Aktivität wie der der Änderung einer höheren Struktur von Fragment 23 beiträgt, dass sie aber negativ zu der Aktivität der Zelladhäsion durch solch eine Aktivität wie der Maskierung der funktionellen Domäne (2) beiträgt; und es gab eine negative Annahme bezüglich der Anwendbarkeit in Medikamenten. Zudem war, während es Berichte über die Aktivität der Zelladhäsion von jeder Domäne des Epimorphins (der gewickelten Spiraldomäne (1), der funktionellen Domäne (2) oder der gewickelten Spiraldomäne (3)) in Bezug auf seine physiologische Aktivität gab, die Morphogenese beschleunigende Aktivität ähnlich zu der von Epimorphin nicht bekannt.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe dieser Erfindung ist es, ein wasserläsliches Polypeptid mit Morphogenese beschleunigender Aktivität gegenüber Epithelzellen bereit zu stellen. Genauer gesagt ist es die Aufgabe der Erfindung, dass ein Polypeptid bereit gestellt wird, das auf Epithelzellen einwirkt, um die Morphogenese von Epithelgeweben zu beschleunigen, und das in einem wässrigen Medium wie einer physiologischen Salzlösung löslich ist.
Eine andere Aufgabe diese Erfindung ist es, ein Medikament bereit zu stellen, das ein Polypeptid mit den oben genannten Eigenschaften als wirksamen Inhaltsstoff enthält, und das zur Vorbeugung und/oder Behandlung einer Erkrankung nützlich ist, die aus morphogenetischen Faktoren wie Epimorphin resultiert oder die die Zerstörung eines Gewebes oder eines Organs involviert. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein das Haarwachstum unterstützendes Mittel bereit zu stellen, das das oben genannte wasserlösliche Polypeptid als wirksamen Inhaltsstoff enthält.
Die vorliegenden Erfinder haben ausgiebige Versuche unternommen, die oben genannten Aufgaben zu lösen, und als ein Ergebnis davon haben sie herausgefunden, dass Polypeptide, die die gewickelte Spiraldomäne (coiled coil domain) (1) umfassen, die Epimorphin ausmacht, in wässrigen Medien löslich sind, auf Epithelzellen einwirken, um die Morphogenese von Epithelgewebe zu beschleunigen, und eine deutliche die Zellvermehrung beschleunigende Aktivität gegenüber Epithelzellen besitzt. Diese Erfindung wurde basierend auf den oben genannten Entdeckungen gemacht. Wie es hierin verwendet wird, bedeutet "die Zellvermehrung beschleunigende Aktivität", dass, wenn Zellen in einem serumfreien Medium für mehrere Tage kultiviert werden, sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen erhöhen kann. Genauer gesagt stellt diese Erfindung ein Polypeptid mit Morphogenese beschleunigender Aktivität bereit, wobei das Polypeptid durch die Aminosäuresequenz (1) definiert wird, wie sie unten beschrieben wird (SEQ ID No. 1 in der Sequenzauflistung), die in bestimmten Fällen als "Polypeptid (1)" in der vorliegenden Beschreibung bezeichnet wird:
Außerdem stellt die Erfindung ein Polypeptid mit Morphogenese beschleunigender Aktivität zur Verfügung, wobei das Polypeptid durch die Aminosäuresequenz (II) definiert wird, wie sie unten beschrieben wird (SEQ ID No. 2 in der Sequenzauflistung), die in bestimmten Fällen als "Polypeptid (II)" in der vorliegenden Beschreibung bezeichnet wird:
Gemäß einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung wird ein Medikament bereit gestellt, das das oben genannte Polypeptid als wirksamen Inhaltsstoff enthält. Als bevorzugte Ausführungsform dieses Medikaments wird ein Medikament zur Vorbeugung und/oder Behandlung einer Krankheit bereit gestellt, die aus einer zu geringen Expression von morphogenetischen Faktoren resultiert, oder einer Krankheit, die die Zerstörung von Gewebe oder einem Organ involviert, sowie ein Medikament zur Verwendung als das Haarwachstum unterstützendes Mittel. Zusätzlich zu diesen wird ein Verfahren zur Förderung des Wachstums von Haaren bereit gestellt, aber nicht beansprucht, das den Schritt der Verabreichung des Polypeptids an ein Säugetier einschließlich einen Menschen umfasst.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung wird ein Antikörper bereit gestellt, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch die oben genannten Polypeptide erkennt. Als bevorzugte Ausführungsformen des Antikörpers wird ein Antikörper bereit gestellt, der spezifisch an die Polypeptide bindet und die Morphogenese beschleunigende Aktivität der Polypeptide gegenüber Epithelzellen hemmt, sowie ein Antikörper, der spezifisch an ein Epimorphin mit einer gewickelten Spiraldomäne (1) bindet und die Morphogenese beschleunigende Aktivität des Epimorphins gegenüber Epithelzellen hemmt. Es wird auch ein Medikament bereit gestellt, das den Antikörper als wirksamen Inhaltsstoff enthält, vorzugsweise ein Medikament, das zur Vorbeugung und/oder Behandlung einer Erkrankung nützlich ist, die aus der übermäßigen Expression von Epimorphin resultiert, sowie ein Medikament zur Verwendung als ein das Haarwachstum unterstützendes Mittel. Zusätzlich zu diesen wird ein Verfahren zur Hemmung des Wachstums von Haaren bereit gestellt, nicht aber beansprucht, das den Schritt der Verabreichung des Antikörpers an ein Säugetier einschließlich eines Menschen umfasst.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Fotografie, die unter einem Mikroskop aufgenommen wurde, der Morphologie der Zellen, die durch das Kultivieren von MDCKII-Zellen (ein Zellstamm, der sich aus der Niere ableitet) in DH-Medium allein erhalten wurden, die als die Kontrolle in dem Test von Beispiel 2 dienten.
2 ist eine Fotografie, die unter einem Mikroskop aufgenommen wurde, der Morphologie der Zellen, die durch das Kultivieren von MDCKII-Zellen (Zellstamm, der sich aus der Niere ableitet) in der Gegenwart eines Polypeptids gemäß dieser Erfindung (15 μg/ml) erhalten wurden, sowie der Morphologie des Gewebes, das aus diesen Zellen abgeleitet ist.
3 ist eine Fotografie, die unter einem Mikroskop aufgenommen wurde, der Morphologie der Zellen, die durch das Kultivieren von MDCKII-Zellen (Zellstamm, der aus Niere ableitet ist) in der Gegenwart eines Polypeptids gemäß dieser Erfindung (15 μg/ml) erhalten wurden, sowie der Morphologie des Gewebes, das aus diesen Zellen abgeleitet ist, bei einer höheren Vergrößerung als in denen der Fälle der 1 und 2.
4 ist eine Fotografie, die unter einem Mikroskop aufgenommen wurde, der Morphologie der Zellen, die durch das Kultivieren von MDCKII-Zellen (Zellstamm, der aus Niere ableitet ist) in DH-Medium allein erhalten wurden, die als Kontrolle in dem Test von Beispiel 4 dienten.
5 ist eine Fotografie, die die Morphologie der Zellen und des Gewebes, das aus diesen Zellen abgeleitet wird, in dem Fall zeigt, in dem ein Polypeptid gemäß der Erfindung (H1, 3 μg/ml) zu einem Gel hinzu gegeben wurde und MDCKII-Zellen (Zellstamm, der aus Niere ableitet ist) kultiviert wurden, die als die Kontrolle (positive Kontrolle) in dem Test von Beispiel 4 dienten.
6 ist eine Fotografie, die die Morphologie der Zellen und des Gewebes zeigt, das aus diesen Zellen abgeleitet wird, in dem Fall, in dem das Polypeptid gemäß der Erfindung (H1, 3 μg/ml) und der anti-H1-Antikörper (5,2 μg/ml) zu einem Gel hinzu gegeben wurden und MDCKII-Zellen (Zellstamm, der aus Niere ableitet ist) kultiviert wurden.
7 ist eine Fotografie, die die Morphologie der Zellen und des Gewebes, das aus den Zellen abgeleitet wird, in dem Fall zeigt, in dem das Polypeptid gemäß der Erfindung (H1, 3 μg/ml) und der anti-H1-Antikörper (26 μg/ml) zu einem Gel hinzu gegeben wurden und MDCKII-Zellen (Zellstamm, der aus Niere ableitet ist) kultiviert wurden.
8 ist eine Fotografie, die die Morphologie der Zellen und des Gewebes, das aus diesen Zellen abgeleitet wird, in dem Fall zeigt, in dem das Polypeptid gemäß der Erfindung (H1, 3 μg/ml) und der anti-H1-Antikörper (130 μg/ml) zu einem Gel hinzu gegeben wurden und MDCKII-Zellen (Zellstamm, der aus Niere ableitet ist) kultiviert wurden.
9 ist eine Fotografie, die die Morphologie der Zellen und des Gewebes, das aus den Zellen abgeleitet wird, in dem Fall zeigt, in dem das Polypeptid gemäß der Erfindung (H1, 3 μg/ml) und der anti-H3-Antikörper (5,2 μg/ml) zu einem Gel hinzu gegeben wurden und MDCKII-Zellen (Zellstamm, der aus Niere ableitet ist) kultiviert wurden.
10 ist eine Fotografie, die die Morphologie der Zellen und des Gewebes, das aus den Zellen abgeleitet wird, in dem Fall zeigt, in dem das Polypeptid gemäß der Erfindung (H1, 3 μg/ml) und der anti-H3-Antikörper (26 μg/ml) zu einem Gel hinzu gegeben wurden und MDCKII-Zellen (Zellstamm, der aus Niere ableitet ist) kultiviert wurden.
11 ist eine Fotografie, die die Morphologie der Zellen und des Gewebes, das aus den Zellen abgeleitet wird, in dem Fall zeigt, in dem das Polypeptid gemäß der Erfindung (H1, 3 μg/ml) und der anti-H3-Antikörper (130 μg/ml) zu einem Gel hinzu gegeben wurden und MDCKII-Zellen (Zellstamm, der aus Niere ableitet ist) kultiviert wurden.
BESTER WEG ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Das oben genannten Polypeptid (1), das durch diese Erfindung bereit gestellt wird, korrespondiert mit einer gewickelten Spiraldomäne (coiled coil domain) (1), die durch die 1. bis zu 103. Aminosäure des menschlichen Epimorphins definiert ist (europäische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. 0 698 666). Das oben genannte Polypeptid (II) korrespondiert mit einer gewickelten Spiraldomäne (coiled coil domain) (1), die durch die 1. bis 104. Aminosäure des Epimorphins aus Maus definiert ist (europäische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. 0 698 666, siehe oben). Diese Polypeptide sind dadurch gekennzeichnet, dass sie im Vergleich zu den nativen Epimorphinen exzellent wasserlöslich sind und in wässrigen Medien wie destilliertem Wasser, physiologischer Salzlösung oder mit Phosphorsäure gepufferter physiologischer Salzlösung löslich sind. Zum Beispiel wird, wenn diese Polypeptide in wässrigen Medien aufgelöst und bei 100000 × g für 1 – 2 h zentrifugiert werden, keine wesentliche Bildung von Präzipitaten beobachtet, wenn deren Konzentrationen 0,2 mg/ml oder weniger betragen. Nichtsdestotrotz sollte der Begriff "wasserlöslich", wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, nicht dahingehend ausgelegt werden, dass er auf die oben genannte spezifische Löslichkeit beschränkt ist.
Die Polypeptide (I) und (II) sind dadurch gekennzeichnet, dass sie im Wesentlichen die gleiche Aktivität wie die Morphogenese beschleunigende Aktivität des nativen Epimorphins gegenüber Epithelzellen aufweisen. Unter "das native Epimorpin" ist z. B. ein Epimorphin gemeint, das durch die Mesenchymzellen eines Säugetiers biologisch synthetisiert wird. Beispiele des nativen Epimorphins sind Epimorphine, die sich aus Menschen, Affen, Rindern, Pferden, Schafen, Hunden, Katzen, Kaninchen, Ratten und Mäusen ableiten, vorzugsweise solche, die aus dem Menschen abgeleitet sind.
Manchmal kann eine Vielzahl von Isoformen für das native Epimorphin bedingt durch dessen Genspleissen existieren. Zum Beispiel existiert in Bezug auf das menschliche Epimorphin ein menschliches Epimorphin, das 288 Aminosäuren umfasst, sowie die Isoformen A und B des menschlichen Epimorphins, die jeweils 287 Aminosäuren und 277 Aminosäuren umfassen; in Bezug auf das murine Epimorphin existiert ein murines Epimorphin, das 289 Aminosäuren umfasst, sowie die Isoformen A und B des murinen Epimorphins, die jeweils 288 Aminosäuren und 279 Aminosäuren umfassen. Dort, wo in der vorliegenden Beschreibung auf das native Epimorphin Bezug genommen wird, wird es als ein Konzept verwendet, das all diese Isoformen umfasst.
Die Polypeptide der Erfindung umfassen Polypeptide, die das Polypeptid (I) oder (II) umfassen, die im Wesentlichen eine Morphogenese beschleunigende Aktivität oder zellproliferierende Aktivität aufweisen. Ein oder mehrere Aminosäuren können an die N- oder C-endständigen Enden des Polypeptids (I) oder (II) gebunden sein, und vorzugsweise jegliches Oligopeptid, das zwei oder mehr beliebige Aminosäuren umfasst. Die Art einer solchen Aminosäure ist nicht sonderlich beschränkt, aber diese ist bevorzugt aus L-Aminosäuren ausgewählt. Zum Beispiel ist ein Polypeptid, das durch die Bindung von ein bis zehn, vorzugsweise fünf bis sieben, mehr bevorzugt sechs L-Histidinen (die als eine tag-Sequenz dienen) an das N-tenninale Ende des Polypeptids (I) oder (II) erhalten wird, vom Standpunkt der Herstellungseffizienz her bevorzugt, weil es leicht durch die Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch an die daran gebundene tag-Sequenz oder eine Substanz wie Nickel bindet, aufgereinigt und nachgewiesen werden kann. Es ist auch möglich, dass spezifische tag-Sequenzen an die Polypeptide für den Zweck der Verbesserung von deren Funktionen wie einer verstärkten Hydrophilie oder einer in vivo Stabilität oder zur Verstärkung von deren Morphogenese beschleunigender Aktivität gebunden werden. Zudem können Fusionsproteine oder Ähnliche mit verbesserter Medikamentenverabreichungseffizienz in bestimmten Geweben oder Organen durch das Binden von tag-Sequenzen hergestellt werden, die in der Lage sind, spezifische Moleküle zu binden.
Die oben genannten Polypeptide können in ihren freien Formen vorliegen, können aber auch als Salze von Säuren wie Hydrochloride, Acetate oder p-Toluolsulfonate oder als deren Baseadditionssalze wie Ammoniumsalze oder organische Aminsalze bereit gestellt werden. Daher sollte, wenn auf "Polypeptid(e)" in der vorliegenden Beschreibung Bezug genommen wird, es in dem Sinne ausgelegt werden, dass es das oben genannte Polypeptid in seiner Salzform mit umfasst. Auch mit umfasst in dem Umfang der Polypeptide dieser Erfindung sind solche, die durch das Binden des jeweiligen Polypeptids an ein beliebig gewähltes Kohlenhydrat (Monosaccharid, Disaccharid, Oligosaccharid und Polysaccharid) erhalten werden, solche, die an Lipide gebunden sind, und weiterhin solche, die phosphoryliert sind.
In den Beispielen der vorliegenden Beschreibung werden Testverfahren für die Morphogenese beschleunigende Aktivität gegenüber MDCKII-Zellen, die aus der Niere abgeleitet sind, konkret in Bezug auf das Polypeptid (I) erklärt werden, das eine bevorzugte Ausführungsform des oben genannten wasserlöslichen Polypeptids ist. Somit können die Fachleute auf dem Gebiet leicht sicherstellen, dass jedes oben definierte Peptid die gewünschte Morphogenese beschleunigende Aktivität aufweist, während auf diese Beispiele oder geeignete Änderungen oder Modifikationen zusätzlich zu diesen Verfahren Bezug genommen wird. Zudem macht, da die Beispiele der japanischen nicht-geprüften Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. Hei 6-25, 295, die mit der EP 0 562 123 korrespondiert, auch die Morphogenese beschleunigende Aktivität von Epimorphin gegenüber Epithelgeweben im Detail beschreibt, die Anwendung eines solchen Testsystems es möglich, die Morphogenese beschleunigende Aktivität sicher zu bestimmen.
In dem nativen menschlichen Epimorphin ist die zelladhäsive Domäne, die in dem mittleren Fragment (die funktionelle Domäne: ein Fragment, das durch die 104. bis 187. Aminosäurereste vom N-terminalen Ende her definiert ist) existiert, an die Oberflächen von Epithelzellen durch die Bindung an Epimorphinrezeptoren, die auf den äußeren zellulären Oberflächen der Epithelzellen existieren, fixiert; und zur gleichen Zeit bindet oder wechselwirkt die Domäne, die das Polypeptid (I) enthält (die gewickelte Spiraldomäne des nativen menschlichen Epimorphins: ein Teil, der das N-terminale Ende bis zu dem 103. Aminosäurerest des Epimorphins umfasst) an oder mit den Rezeptoren, die an der Morphogenese teilhaben, wodurch sich dessen Morphogenese beschleunigende Aktivi tät manifestiert. Obwohl man nicht an eine spezielle Theorie gebunden sein möchte, ist dies eine Möglichkeit.
Zudem haben die Polypeptide dieser Erfindung im Wesentlichen die gleiche Morphogenese beschleunigende Aktivität gegenüber Epithelzellen wie das native Epimorphin, aber die Stärke von deren Aktivität ist nicht sonderlich beschränkt. Zum Beispiel ist es bevorzugt, dass sie die Morphogenese beschleunigende Aktivität in den gleichen Konzentrationsmengen oder weniger als das menschliche native Epimorphin ausüben können. Obwohl das repräsentative Testverfahren für die Morphogenese beschleunigende Aktivität (das Testverfahren auf eine Aktivität zur Bildung röhrenförmiger Strukturen bei aus Niere abgeleiteten Zellen) konkret in den Beispielen der vorliegenden Beschreibung beschrieben werden wird, ist die Morphogenese beschleunigende Aktivität der Polypeptide nicht auf diese Aktivität beschränkt. Die Polypeptide dieser Erfindung besitzen auch starke die Zellproliferation beschleunigende Aktivität gegenüber Epithelzellen. Daher ist die Morphogenese, die durch die Polypeptide der Erfindung erreicht wird, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit der Proliferation von Zellen einhergeht (eine Erhöhung in der Zellzahl). Ein Testbeispiel der die Zellproliferation beschleunigenden Aktivität durch die Polypeptide der Erfindung wird in den Beispielen der vorliegenden Beschreibung beschrieben werden, aber die die Zellproliferation beschleunigende Aktivität der Polypeptide der Erfindung ist nicht auf die spezifische Aktivität, die in diesem Testbeispiel gezeigt wird, beschränkt.
Obwohl verschiedene Arten von Morphogenese beschleunigender Aktivität für natives Epimorphin berichtet wurden, sollte man verstehen, dass sie möglicherweise ein Teil von verschiedenen Morphogenese beschleunigenden Aktivitäten sind, die durch das native Epimorphin ausgeübt werden. Daher ist der Begriff "Morphogenese beschleunigende Aktivität" nicht auf die Morphogenese beschleunigende Aktivität beschränkt, die in der Vergangenheit berichtet oder bestätigt wurde, und muss breiter interpretiert werden. Zusätzlich sind die Konzepte wie z. B. eine Morphogenese induzierende Aktivität und eine Organmorphogenese unterstützende Aktivität, ein Konzept, das von der Morphogenese beschleunigenden Aktivität mit umfasst wird. Zudem sollte der Begriff "im Wesentlichen die gleiche" nicht als einschränkend interpretiert werden. Dort wo die Polypeptide dieser Erfindung zusätzlich zu der Morphogenese beschleunigenden Aktivität des nativen Epimorphins andere Morphogeneseaktivitäten besitzen, die sich davon unterscheiden, sind diese im Umfang der Erfindung enthalten.
Die oben genannten Polypeptide können durch chemische Techniken wie das Festphasenverfahren und das Flüssigphasenverfahren hergestellt werden, die üblicher Weise in der Peptidsynthese verwendet werden. Zum Schützen von Gruppen der Aminogruppen und Anderen sowie als Kondensationsmittel für eine Kondensationsreaktion in der Peptidsynthese können solche verwendet werden, die z. B in Protein Engineering Basics and Application; Suzuki, K., Ed.; Maruzen Co. LTd.: 1992, Bondansky et al. in Peptide Synthesis; John Wiley & Sons: New York, 1976 und Stewart et al., in Solid Phase Peptide Synthesis; W.H. Freeman und Co.: San Franzisko, 1969 beschrieben werden. Eine Reihe von Peptidsynthesevorrichtungen, die kommerziell verfügbar sind, können in dem Festphasenverfahren verwendet werden. Zudem werden rekombinante Vektoren, die DNA-Sequenzen enthalten, die die oben genannten Polypeptide kodieren, gemäß biologischen Techniken wie üblichen Manipulationen der Genexpression hergestellt; und dann werden Mikroorgenismen (Transformanten), die mit den Vektoren transformiert sind, hergestellt, und die oben genannten gewünschten wasserlöslichen Polypeptide können von den Kulturprodukten der Transformanten abgetrennt und aufgereinigt werden. Jedoch sind die Verfahren der Herstellung der wasserlöslichen Polypeptide nicht auf diese chemischen und biologischen Verfahren beschränkt.
Die unten beschriebene Basissequenz kann als DNA genannt werden, die in den Produktionsverfahren durch Genexpression verwendet werden kann:
wobei nur die Sense-Kette unter Weglassen der komplementären Basensequenz gezeigt wird, und der Startpunkt das 5'-Ende ist und der Endpunkt das 3'-Ende ist.
Diese DNA korrespondiert mit den 1. bis 309. Nukleotiden innerhalb der DNA, die das native menschliche Epimorhin in seiner Gesamtlänge kodiert (die Nukleinsäuresequenz wird in Formel (6) gezeigt, wie sie in der japanischen ungeprüften Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. Hei 6-25,295 offenbart wird), und ist DNA, die das oben genannte Polypeptid (I) kodiert. Die Herstellung des Polypeptids (II) kann z. B. die DNA einsetzen, die durch die 1. bis 312. Nukleotide in der DNA definiert ist, die das native murine Epimorphin in seiner Gesamtlänge kodiert (die Nukleinsäuresequenz, die in der Formel (12) in der japanischen nicht-geprüften Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. Hei 6-25,295 offenbart wird).
Zudem ist es möglich, die Aminosäurevarianten leicht durch übliche Verfahren unter Verwendung der oben genannten aus Mensch oder aus Maus abgeleiteten DNA herzustellen. Solche Verfahren können z. B. die rekombinante PCR-Technik verwenden, wie sie in PCR-Protocols; HJB Publisher: 1991, S. 155-160 beschrieben wird, oder das Herstellungsverfahren von mutierten Genen unter Verwendung einer PCR, wie es in Experimental Medicine, Ergänzungsband 8, Nr. 9; Yodo Co. Ltd.: 1990, S. 63-67 beschrieben wird. Verfahren zur Genexpression, die verwendet werden können, um die gewünschten Polypeptide herzustellen, können z. B. die Technik einsetzen, die vollständig in den Beispielen der Beschreibung der europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. 0 698 666 beschrieben wird, sind aber nicht darauf eingeschränkt.
Die oben genannten Polypeptide dieser Erfindung besitzen eine Aktivität zur Beschleunigung der Morphogenese von Epithelgeweben oder Organen durch Einwirkung auf die Epithelzellen. Dementsprechend sind die Polypeptide der Erfindung als wirksamer Inhaltsstoff eines Medikaments zur Behandlung und/oder Vorbeugung einer Krankheit nützlich, die die krankhafte Änderung der Morphogenese eines Gewebes oder eines Organs involviert, oder einer Krankheit, die die Zerstörung eines Gewebes oder eines Organs involviert, die jeweils aus endogenen morphogenetischen Faktoren resultieren, oder sie sind als wirksame Inhaltsstoffe eines Medikaments für die Diagnose der oben genannten Erkrankungen nützlich. Die Polypeptide sind auch als der wirksame Inhaltsstoff eines Medikaments zur Verwendung für ein das Haarwachstum unterstützendes Mittel nützlich. Der Begriff "Medikament(e)" in der vorliegenden Beschreibung wird im weitesten Sinne verwendet, was solche Mittel zur Verwendung bei der Vorbeugung, Behandlung oder Diagnose von Erkrankungen von Säugetieren einschließlich Menschen zusätzlich zu Haarwachstum unterstützenden Mitteln und Haarwachstumshemmem, die normaler Weise als "quasi-Medikamente" klassifiziert werden, mit umfasst.
Eine Reihe von morphogenetischen Faktoren einschließlich nativer Epimorphine ist bekannt. Die Medikamente dieser Erfindung sind bei der Vorbeugung und/oder Behandlung von Krankheiten nützlich, die die krankhafte Veränderung der Morphogenese eines Gewebes oder eines Organs involvieren, die aus morphogenetischen Faktoren, insbesondere Epimorphin, resultiert. Zudem können die Medikamente dieser Erfindung für den Zweck der Beschleunigung der Regeneration von Epithelgeweben und Organen bei Erkrankungen verwendet werden (wie es hierin verwendet wird, umfasst dies auch eine Verletzung), die die Zerstörung von Epithelgeweben oder Organen involvieren, wie entzündliche Erkrankungen, Karzinome, Verbrennungen, Operationen oder Wunden sowie deren Heilungsprozesse. Genauer gesagt wird vorgeschlagen, dass andere physiologisch aktive Substanzen mit Morphogenese beschleunigender Aktivität (z. B. HGF und EGF) Erkrankungen wie die Folgenden behandeln können: eine Nierenerkrankung wie chronische Nephritis; chronische und akute pulmonare Erkrankungen wie Lungenentzündung, Lungenemphysem, Lungentuberkulose, chronische obstruktive pulmonare Erkrankung, Pneumokoniose und Aspiratonspneumonie; tracheale und bronichiale Erkrankungen wie chronische Bronchitis; Lebererkrankungen wie akute Hepatitis, chronische Hepatitis, Zirrhose und fulminante Hepatitis, Karzinome; gutartige Prostatahyperplasie; Magengeschwür, eine Wunde und Hautgeschwür. Es wird daher erwartet, dass die Medikamente dieser Erfindung gegen diese Erkrankungen wirksam sind.
Zudem wird, wenn die Medikamente dieser Erfindung an Patienten verabreicht werden, die an diesen Erkrankungen leiden, die aus einer zu geringen Expression von Epimorphin resultieren, im Allgemeinen die Verbesserung der Symptome dieser Krankheit festgestellt, und somit wird eine abschließende Diagnose dieser Erkrankung möglich gemacht. Wie spezifisch in den Beispielen der vorliegenden Beschreibung gezeigt wird, besitzen die Polypeptide der Erfindung eine starke zellproliferierende und Morphogenese beschleunigende Aktivität insbesondere gegenüber Nierenzellen. Daher können die Medikamente der Erfindung am meisten bevorzugt gegen Nierenerkrankungen verwendet werden, die die Regeneration und den Schutz von Nierengewebe benötigen, wie die Epithelzellen der Nierentubuli zu dem Zeitpunkt von deren Behandlung. Zum Beispiel können die Medikamente der Erfindung auf Nierenerkrankungen wie chronische Nephritis (z. B. akute glomeruläre Nephritis, schnell fortschreitende Nephritis oder chronische glomeruläre Nephritis), nephritisches Syndrom, chronische Niereninsuffizienz und Nierenkarzinom angewendet werden.
Die Zustände, auf die die Medikamente dieser Erfindung angewendet werden, sind nicht auf die oben illustrierten Erkrankungen beschränkt, und es sollte verstanden werden, dass sie auf Erkrankungen anwendbar sind, für die morphogenetische Faktoren, insbesondere Epimorphin, angenommener Weise verantwortlich sind, und auf Erkrankungen, die die wesentliche Zerstörung eines Gewebes und eines Organs involvieren. Zusätzlich sollte der Nutzen eines Haarwachstum unterstützenden Mittels, das das Polypeptid der Erfindung als wirksamen Inhaltsstoff enthält, im breitesten Sinne interpretiert werden, so dass es das Wachstum von Haar unterstützt und fördert.
Eine oder mehrere Arten einer Substanz, die aus den oben genannten Polypeptiden ausgewählt ist, kann für ein Medikament dieser Erfindung als solches verwendet werden; jedoch ist es bevorzugt, eine medizinische Zusammensetzung, die eine oder mehrere Arten der Substanz als den wirksamen Inhaltsstoff zusammen mit einer oder mehreren Arten von pharmazeutisch verträglichen Hilfsmitteln für Formulierungszwecke herzustellen, und die medizinische Zusammensetzung für die Behandlung und/oder Vorbeugung der oben genannten Erkrankungen zu verwenden. Von dem Standpunkt der in vivo Kinetiken wie der Löslichkeit, der Absorption und der Ausscheidung und/oder der Produktionsverfahren können die oben genannten Polypeptide in der Form von physiologisch verträglichen Salzen vorliegen. In Bezug auf die Wege der Verabreichung der medizinischen Zusammensetzungen können die systemische Verabreichung wie die intravenöse, rektale und orale und zusätzlich die lokale Verabreichung wie die externe Anwendung durch Augentropfen, Nasentropfen oder Ohrentropfen und die lokale Injektion genannt werden.
Die bevorzugten Formen der medizinischen Zusammensetzungen dieser Erfindung sind z. B. Mittel zur systemischen Verabreichung wie injizierbare Mittel oder Tropflösungen zur intravenösen Verabreichung und Mittel zur lokalen Verabreichung wie Salben, Cremes, Pflaster und lokal injizierbare Mittel. In bestimmten Fällen können medizinische Zusammensetzungen, bei denen die wirksamen Inhaltsstoffe in einem Liposom oder Ähnlichem enthalten sind, und solche, die an Antikörper oder Ähnliches gebunden sind, verwendet werden, um möglicher Weise deren Affinität und Selektivität gegenüber den gezielten Organe zu verbessem. Es ist jedoch überflüssig, zu erwähnen, dass die Verabreichungswege abhängig von der Art der Erkrankung, die Gegenstand der Anwendung ist, dem Zweck der Behandlung oder der Vorbeugung, der Art des betroffenen Teils, der Zustände der Patienten ausgewählt werden können und dass auch die Dosierungsformen, die für die jeweiligen Wege der Verabreichung geeignet sind, geeignet ausgewählt werden können. Die Formen in den Fällen, bei denen sie für diagnostische Mittel verwendet werden, sind nicht sonderlich beschränkt. Die Verfahren der Diagnose umfassen die Fälle, bei denen lebensfähige Proben, die aus Patienten entnommen und gesammelt werden, verwendet werden, zusätzlich zu solchen, bei denen Medikamente dieser Erfindung den Patienten verabreicht werden.
Zudem kann das das Haarwachstum unterstütrende Mittel, das als den wirksamen Inhaltsstoff eine oder mehrere Arten der oben genannten Polypeptide enthält, vorzugsweise als die Dosierungsform bereit gestellt werden, die für den Zweck der Verwendung geeignet ist, die ein das Haarwachstum unterstützendes Mittel wie eine Creme, ein Spray, eine Lösung zur Anwendung oder ein Pflaster ist. Die oben genannten wasserlöslichen Polypeptide können in der Form physiologisch verträglicher Salze vorliegen; und vorzugsweise können geeignete Tenside oder fettlösliche Substanzen auch mit in die Cremes oder Ähnlichem verarbeitet werden, so dass die wasserlöslichen Polypeptide, die die wirksamen Inhaltsstoffe sind, wirksam transdermal durch kutane Keratinschichten absorbiert werden können. Zudem ist der Nutzen der Polypeptide dieser Erfindung nicht auf die oben genannten Medikamente beschränkt und sie können als Hilfsstoffe für Zellkulturmedien verwendet werden.
Gemäß der zweiten Ausführungsform dieser Erfindung wird ein Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, bereit gestellt, der spezifisch das Polypeptid dieser Erfindung (vorzugsweise das oben genannte Polypeptid (I) oder (II)) erkennt. Die Antikörper der Erfindung können spezifisch an die Polypeptide der Erfindung (vorzugsweise die oben genannten Peptide (I) und (II)) oder an epimorphinartige Faktoren mit der gewickelten Spiraldomäne (1) (vorzugsweise das native Epimorphin, das aus Mensch oder Maus abgeleitet ist) binden, und sie haben eine hemmende Funktion gegen die Morphogenese beschleunigende Aktivität von solchen Substanzen gegenüber Epithelzellen. Der Begriff "ein epimorphinartiger Faktor", wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, ist ein Konzept, das native Epimorphine, veränderte Formen davon, die im Wesentlichen die gleichen physiologischen Aktivitäten wie die nativen Epimorphine besitzen (modifiziertes Epimorphin), und Mutanten davon mit einer Aminosäuremutation, die im Wesentlichen die gleichen physiologischen Aktivitäten wie die nativen Epimorphine aufweisen, umfasst.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet "modifiziertes Epimorphin" ein Polypeptid mit im Wesentlichen den gleichen physiologischen Aktivitäten wie das native Epimorphin (z. B. Zelladhäsionsaktivität gegenüber Epithelzellen und Morphogenese beschleunigende Aktivität gegenüber Epithelzellen); und es bedeutet eines des Folgenden: ein Polypeptid, das eine Teilpolypeptidsequenz ist, die aus einer Polypeptidsequenz des nativen Epimorphins abgeleitet ist (normalerweise ein Polypeptid, das 277 bis 289 Aminosäuren umfasst) sowie ein Polypeptid, das die Teilpolypeptidsequenz enthält, die aus der Polypeptidsequenz des nativen Epimorphins abgeleitet ist. Zum Beispiel ist das Polypeptid, das durch die Deletion der hydrophoben Domäne an dem C-terminalen Ende des nativen Epimorphins erhalten wird (ungeprüfte japanische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. Hei 6-25,295), eine repräsentative Verbindung des modifizierten Epimorphins. Zudem bedeutet in der vorliegenden Beschreibung "Mutanten des nativen Epimorphins mit einer Aminosäuremutation (hiernach "Mutanten") oder modifiziertes Epimorphin" ein Polypeptid mit im Wesentlichen den gleichen wie den oben genannten physiologischen Aktivitäten für das native Epimorphin; und in das native Epimorphin oder das modifizierte Epimorphin werden eine oder mehrere Aminosäuren der Aminosäuren, die eine Polypeptidkette davon ausmachen, mit anderen Aminosäuren substituiert oder diese werden deletiert und/oder eine oder mehrere beliebige Aminosäuren werden in die Polypeptidkette eingeführt, was zu dem Polypeptid führt.
Es ist zu verstehen, dass neben den modifizierten Epimorphinen, wie solchen, die in den oben genannten Patentveröffentlichungen und Anderen offenbart werden, modifizierte Epimorphine, die gemäß den offenbarten Verfahren hergestellt werden können, oder deren modifizierte (einschließlich chemisch modifizierte) Versionen, durch das modifizierte Epimorphin, wie es in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, mit umfasst werden, solange sie die oben genannten Definitionen erfüllen. Zudem werden Verfahren zur Herstellung der Aminosäurevarianten eines nativen Epimorphins oder eines modifizierten Epimorphins konkret in den Beschreibungen der japanischen Patentanmeldungen mit den Nr. Hei 7-175,539, korrespondierend zu der EP 0 698 666 , und Hei 8-99,684, korrespondierend zu der JP 065895 , erklärt. Jedoch sollten sie nicht auf diese Verfahren eingeschränkt werden und können die Aminosäurevarianten sein, die durch jegliches Verfahren hergestellt werden. Zudem können Verfahren zur Untersuchung der physiologischen Aktivitäten dieser modifizierten Epimorphine und deren Aminosäurevarianten mit einer Änderung durchgeführt werden, wenn es notwendig ist, dem Verfahren zur Untersuchung der physiologischen Aktivitäten von nativen Epimorphinen wie es vollständig in der japanischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. Hei 6-25295 oder in der internationalen Veröffentlichung WO 97/40158 beschrieben wird. Zum Beispiel kann die Morphogenese beschleunigende Aktivität gegen murine fötale Bron chie oder die Morphogenese beschleunigende Aktivität gegen murine fötale maxilläre Cutis, wie es in den Beispielen der Beschreibung der japanischen Patentveröffentlichung mit der Nr. Hei 8-102553 beschrieben wird, sichergestellt werden.
In der Vergangenheit war MC-1 für einen Antikörper bekannt, der Epimorphine bindet und deren Aktivitäten hemmt. (Japanische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. Hei 6-25295; Cell 69, 571-481 (1992).) Die Antikörper dieser Erfindung, die zu MC-1 ähnlich sind, sind bei der Untersuchung des Mechanismus der normalen Morphogenese von Epithelgeweben durch epimorphinartige Faktoren nützlich; sie können auch bei der Untersuchung des kritischen Mechanismus von Erkrankungen genutzt werden, die aus der abnormalen Expression (exzessiven Expression) von nativen Epimorphinen resultieren, und sie können auch als wirksame Inhaltsstoffe von Medikamenten verwendet werden, die zur Vorbeugung und/oder Behandlung dieser Erkrankungen vorteilhaft sind. Zudem sind die Antikörper der Erfindung als wirksame Inhaltsstoffe von Medikamenten, die als Haarwachstumshemmer verwendet werden, nützlich.
Als ein Beispiel des Herstellungsverfahrens der Antikörper dieser Erfindung wird das Verfahren zur Herstellung eines polyklonalen Antikörpers durch die Verwendung des oben genannten Polypeptids (II) vollständig in den Beispielen beschrieben. Somit werden die Fachleute auf dem Gebiet leicht das Folgende verstehen: die Polypeptide dieser Erfindung können als Antigene gegen Säugetiere unter geeigneten Bedingungen dienen; sie können die Tiere gemäß üblichen Verfahren immunisieren; und polyklonale Antikörper oder monoklonale Antikörper, die spezifisch beliebige Polypeptide erkennen, die von den Polypeptiden der Erfindung umfasst werden, können leicht gemäß wohl bekannten und konventionellen Verfahren hergestellt werden.
Beispiele der Erkrankungen, die aus der exzessiven Expression von einem oder mehreren Faktoren unter den morphogenetischen Faktoren resultieren, sind chronisches artikuläres Rheuma, Krebsarten wie Nierenzellkarzinom und Karzinom Cutaneum, Arteriosklerose, Kollagenerkrankung, hematopoetische Organerkrankung, Nierenerkrankung, Muskeldystrophie, Osteoporose, Neurofibromatose, Sturge-Weber-Syndrom, noduläre Sklerose, Dysraphismus, abnormale Segmentierung, Vagusnerverkrankung, Callosalgenese, Enzephaloforamenerkrankung und Hydrocephalus. Von den Medikamenten, die die Antikörper dieser Erfindung als wirksame Inhaltsstoffe enthalten, kann erwartet werden, dass sie bei der Behandlung und/oder Vorbeugung dieser Erkrankungen sowie zu deren Diagnose nützlich sind.
Nichtsdestotrotz sollte man verstehen, dass der Gegenstand der Anwendung der Medikamente der Erfindung nicht auf diese Erkrankungen eingeschränkt ist und stattdessen alle Erkrankungen sein kann, für die angeblich die exzessive Expression von einem oder mehreren morphogenetischen Faktoren, insbesondere nativen Morphinen, verantwortlich ist. Zudem ist der Nutzen der Haarwachstumshemmer, die die oben genannten Antikörper als wirksame Inhaltsstoffe enthalten, im weitesten Sinne zu interpretieren, einschließlich Epilieren, Haarwachstumshemmung und trichogenöse Hemmung. Zudem werden die Medikamente, die die Antikörper der Erfindung als wirksame Inhaltsstoffe enthalten, normalerweise als medizinische Zusammensetzungen durch Verwendung von einem oder mehreren Hilfsstoffen für Formulierungszwecke, die pharmazeutisch verträglich sind, hergestellt, und das, was oben erklärt wurde, kann unter anderem auch auf die Formen, die Herstellungsverfahren und die Arten der Verabreichungen in Bezug auf die medizinischen Zusammensetzungen anwendbar sein.
BEISPIELE
Obwohl diese Erfindung in mehr Detail hiernach beschrieben werden wird, ist der Umfang der Erfindung nicht auf die Beispiele, die folgen, beschränkt.
Beispiel 1: Herstellung des Polypeptids der Erfindung
Eine PCR wurde durchgeführt, um cDNA herzustellen:
ATGCATCATCATCATCATCAT, die Methionin und sechs Histidine kodiert, wurde an die 5'-Seite einer DNA-Sequenz gebunden, die die 1. bis 104. Aminosäure des N-terminalen Endes des nativen Epimorphins kodiert, das aus der Maus abgeleitet ist (DNA, die durch die 1. bis 312. Nukleotide der Nukleinsäuresequenz definiert ist, die in der Formel (12) dargestellt wird, die in der japanischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. Hei 6-25,295 offenbart wurde), und es wurde ein Stoppkodon an das 3'-Ende davon gebunden, um die DNA herzustellen, die insgesamt 111 Aminosäuren kodiert. Die cDNA wurde in Ndel- und Nhell-Positionen eines pET3C Vektors, dessen Domäne zwischen den zwei EcoRV-Positionen deletiert worden war, eingebaut und es wurde ein Expressionsvektor hergestellt.
Gemäß dem Verfahren von Hanahan (Laboratory Manual Genetic Engineering: veröffentlicht durch die Maruzen Co.) wurde der resultierende Vektor in einen E. coli BL21-Stamm eingeführt, der in kompetente Zellen überführt worden war. Das Einführungsver fahren wurde wie folgt durchgeführt: die kompetenten Zellen wurden auf Eis aufgelöst; der Vektor wurde zu 100 μl der Lösung in der geeigneten Menge (1 μl der DNA-Lösung, deren Konzentration 1 mg/ml betrug) hinzu gegeben; er wurde auf Eis für 30 Minuten stehen gelassen; anschließend wurde die Lösung in einem Inkubator bei 42 °C für 2 Minuten stehen gelassen; und zuletzt wurde auf Eis für 30 Minuten stehen gelassen, um die Einführung durchzuführen.
Als nächstes wurden die oben genannten Transformanten auf eine LB-Platte (1 % Baktotrypton, 0,5 % Baktohefeextrakt, 1 % NaCl und 1,5 % Baktoagar), die Ampizillin (50 μg/ml) enthält, inokuliert und gewachsene Kolonien wurden ausgewählt und die erste Untersuchung der Transformanten wurde durchgeführt. Zudem wurde, um letztendlich Transformanten mit dem Expressionsvektor zu bestätigen, die Anwesenheit oder Abwesenheit von DNA, die das gewünschte Polypeptid kodiert, durch PCR bestimmt, zu welchem Zeitpunkt die DNA in neun von zehn Klonen enthalten war; somit wurden Transformanten mit dem Expresssionsvektor erhalten. Die resultierende Transformante wurde in einer großen Menge durch Schüttelkultur bei 37 °C unter Verwendung von flüssigem LB-Medium (1 %Baktotrypton, 0,5 % Baktohefeextrakt und 1 % NaCl), das Ampizillin (50 μg/ml) enthält; wachsen gelassen und dann wurde IPTG, eine Substanz zur Induktion der Expression, zu dem Medium hinzu gegeben, so dass dessen Endkonzentration 1 mM betrug. Anschließend wurde die Schüttelkultur bei 37 °C für 2 Stunden weitergeführt und das gewünschte Polypeptid wurde in E. coli exprimiert. Die Aufreinigung des exprimierten Polypeptids wurde unter Verwendung einer Ni²⁺-NTA-Agarose (hergestellt durch QIAGEN Kat.-Nr. 30,230) gemäß dem Protokoll dazu durchgeführt. Die SDS-PAGE (CBB-Färbung) bestätigte, dass das aufgereinigte Polypeptid eine Reinheit von nicht weniger als 95 % aufwies. Die Löslichkeit des Polypeptids nach der Aufreinigung in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) betrug 0,15 mg/ml.
Beispiel 2: Morphogenese beschleunigende Aktivität des Polypeptids der Erfindung gegenüber MDCKII – Zellen (ein Stamm der aus Niere abgeleitet ist)
Die Organmorphogenese beschleunigende Aktivität des Polypeptids, das in Beispiel 1 hergestellt wurde, wurde in der folgenden Weise untersucht.
Ein sterilisiertes Tref-Röhrchen wurde in Eis gestellt. Zu dem Tref-Röhrchen wurde ein 1/10 Volumenanteil eines 10 × DH-Mediums (gemischtes Medium aus gleichen Mengen an Dulbeco-modifiziertem MEM-Medium und Ham F12-Medium) und ein 1/10 Volumenanteil eines Rekonstitutionspuffers (260 mM NaHCO₃, 200 mM HEPES und 50 mM NaOH) hinzu gegeben. Zudem wurde ein 8/10 Volumenanteil einer Kollagenlösung I-P (verfügbar von Nitta Gelatin) in das Tref-Röhrchen hinzu gegeben und durch Pipetieren vermischt. Nachdem das Polypeptid, das in Beispiel 1 hergestellt worden war, gegen ein DH-Medium dialysiert worden war, wurde es zu dem Tref-Röhrchen so hinzu gegeben, dass dessen Endkonzentration 15 μg/ml betrug. Eine gleiche Menge an DH-Medium wurde als eine Kontrolle hinzu gegeben. Anschließend wurden MDCKII-Zellen, ein Stamm, der aus Niere abgeleitet ist, zu dem Tref-Röhrchen hinzu gegeben und durch Pipetieren vermischt.
Zu 48 Wells einer Multiwellplatte wurden 200 μl/Well der oben genannten Mischung hinzu gegeben und die Mischung wurde durch die Aufbewahrung in einem Inkubator bei 37 °C für eine Stunde geliert. Serumfreies DH-Medium wurde mit 800 μl/Well hinzu gegeben und die Äquilibrierung wurde bei 37 °C für eine Stunde durchgeführt und dann wurde das Medium vorsichtig entfernt, um das Gel nicht zu beschädigen. Anschließend wurde ein serumfreies DH-Medium mit 500 μl/Well hinzu gegeben und die morphologische Beobachtung wurde durch das Kultivieren des Mediums in einem Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 °C für 1 – 2 Wochen durchgeführt.
Die 1 – 3 sind Fotografien, die die Ergebnisse des Fotografierens der Zellen und des Gewebes, das aus den Zellen nach zwei Wochen der Kultivierung generiert wurde, zeigen. 1 zeigt das Ergebnis der Kontrolle (nur DH-Medium) und 2 zeigt das Ergebnis der Kultivierung des Gels unter Zugabe des Polypeptids dieser Erfindung (15 μg/ml). Die Fotografien der 1 und 2 zeigen die Ergebnisse des Fotografierens in der gleichen Vergrößerung (40fach). Die 3 zeigt das Ergebnis des Fotografierens der Kultur, die durch die Zugabe des Polypeptids der Erfindung (15 μg/ml) zu dem Gel erhalten wurde, bei einer großen Vergrößerung (100fach). Wenn das Polypeptid der Erfindung zu einem Kollagengel hinzu gegeben wurde, bildeten die Zellen (MDCKII) eine röhrenförmige Struktur in einer dreidimensionalen Weise. Dieses Ergebnis zeigt an, dass das Polypeptid der Erfindung Morphogenese beschleunigende Aktivität (Organmorphogenese unterstützende Aktivität) besitzt.
Beispiel 3: Herstellung des Polypeptids der Erfindung
Ähnlich zu Beispiel 1 wurde ein Polypeptid dieser Erfindung hergestellt: eine DNA-Sequenz, die die ersten 103 Aminosäuren von dem N-terminalen Ende des nativen Epimorphins, das aus dem Menschen abgeleitet ist, kodiert (die DNA ist durch die 1. bis 309. Nukleotide der Nukleinsäuresequenz definiert, die in Formel (6) dargestellt wird, die in der japanischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. Hei 6-25,259 offenbart wurde), wurde anstelle der DNA-Sequenz, die die ersten 104 Aminosäuren aus dem N-terminalen Ende des nativen Epimorphins, das aus der Maus abgeleitet ist, kodiert, verwendet. Das gleiche Experiment wie in Beispiel 2 wurde mit diesem Polypeptid durchgeführt. Es wurde dann bestätigt, dass dieses Peptid Organmorphogenese beschleunigende Aktivität gegenüber den MDCKII-Zellen, ein Zellstamm, der aus der Niere abgeleitet ist, in ähnlicher Weise zu der des Polypeptids von Beispiel 1 aufweist.
Beispiel 4: Herstellung eines Antikörpers der spezifisch an das Polypeptid der Erfindung bindet und die Hemmung der Morphogenese durch diesen Antikörper
Ratten wurden gemäß dem üblichen Verfahren (Monoclonal Antibody Experimental Manual; Kodansha Scientific: S. 184 – 188) unter Verwendung des Polypeptids, das in Beispiel 1 erhalten wurde (hiernach als "H1" bezeichnet), und jeweils einem Polypeptid als die Kontrolle (hiernach als "H3" bezeichnet) immunisiert. Methionin und sechs Histidine wurden an das N-terminale Ende eines Teilpolypeptids des nativen Epimorphins gebunden, das aus der Maus abgeleitet ist, das keine Morphogenese beschleunigende Aktivität besitzt (ein Polypeptid, das durch die Aminosäuresequenz der 189. bis zur 263. Aminosäure vom N-terminalen Ende her definiert ist), um das Kontrollpeptid zu bilden. Antiseren gegen die jeweiligen Polypeptide wurden so erhalten. Die IgG-Fraktionen wurden von jedem Antiserum unter Verwendung einer HiTrap-Protein G (verfügbar von Pharmacia Inc.; Kode-Nr. 17-0404-01) aufgereinigt, um einen polyklonalen Antikörper herzustellen. Die Aufreinigungsschritte wurden gemäß dem beigefügten Protokoll durchgeführt. Nachdem die resultierenden polyklonalen Antikörper einem Western Blot ausgesetzt worden waren, um die jeweilige Spezifität zu überprüfen, wurden deren Titer zur Verwendung in den folgendem Experiment angepasst.
Unter Einsatz der experimentellen Bedingungen von Beispiel 2, bei denen röhrenförmige Strukturen in den MDCKII-Zellen, dem Zellstamm, der aus Niere abgeleitet ist, durch das Polypeptid dieser Erfindung gebildet wurden, wurde jeder polyklonale Antikörper zu einem serumfreien DH-Medium (500 μl/Well) direkt vor der endgültigen Inkubation hinzu gegeben. Die Untersuchung wurde dann durchgeführt, um die Wirkung von jedem der oben genannten Antikörper bezüglich dessen Einfluss auf die Morphogenese beschleunigende Aktivität des Polypeptids der Erfindung herauszufinden. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 und den 4 – 11 gezeigt. In der Tabelle zeigt "++" an, dass die Morphogenese fortgeschritten ist; "+" zeigt an, dass die Morphogenese zu 80 % ge hemmt wurde; und "–' zeigt an, dass die Morphogenese zu 100 % gehemmt wurde. Die 4 – 11 sind Fotografien, die die Ergebnisse des Fotografierens der Zellen und des Gewebes, das durch die Zellen am 11. Tag der Kultivierung generiert wurde, unter einem Mikroskop zeigt. 4 zeigt das Ergebnis der Kontrolle (nur DH-Hedium) und 5 zeigt das Ergebnis der Kultivierung unter Zugabe des Polypeptids der Erfindung (H1, 3 μg/ml) in das Gel. Die 6, 7 und 8 zeigen die Ergebnisse der Fälle, in denen der Anti-H1 Antikörper in Konzentrationen von 5,2 μg/ml, 26 μg/ml und 130 μg/ml hinzu gegeben wurde, und die 9, 10 und 11 zeigen die Ergebnisse der Fälle, in denen der Anti-H3 Antikörper jeweils in Konzentrationen von 5,2 μg/ml, 26 μg/ml und 130 μg/ml hinzu gegeben wurde. Alle diese Fotografien wurden mit der gleichen Vergrößerung (40fach) aufgenommen.
Tabelle 1
Es ist aus diesen Ergebnissen zu erkennen, dass der Anti-H1 Antikörper die Morphogenese induzierende Aktivität des Polypeptids (H1) dieser Erfindung gegenüber MDCKII-Zellen in einer konzentrationsabhängigen Weise hemmt, wohingegen der Anti-H3 Antikörper keinerlei hemmende Aktivität auf die Morphogenese induzierende Aktivität aufweist. Diese Tatsache zeigte, dass die Morphogenese beschleunigende Aktivität, die im Experiment von Beispiel 2 beobachtet wurde, nicht aus z. B. Unreinheiten von E. coli herstammt, sondern von der Aktivität des Polypeptids (H1) der Erfindung selbst abhängt. Zudem wurde, weil der Anti-H1 Antikörper der Erfindung wirksam die Morphogenese beschleunigende Aktivität des Polypeptids H1 in ähnlicher Weise zu der von Epimorphin hemmt, etabliert, dass dieser Antikörper als eine Medikament zur Behandlung und/oder Vorbeugung einer Erkrankung nützlich ist, die aus einer übermäßigen Expression von Epimorphin resultiert.
Beispiel 5: Aktivität des Polypeptids der Erfindung gegen eine Zellvermehrung
Die Wirkung des Polypeptids der Erfindung, das in Beispiel 1 hergestellt wurde, auf die Zellvermehrung, wurde in der folgenden Weise untersucht. Als das Medium wurde ein serumfreies DH-Medium oder ein serumfreies DH-Medium verwendet, in dem 0,003– 0,15 mg/ml des Polypeptids der Erfindung aufgelöst worden waren, und MDCKII-Zellen wurden so inokuliert, dass 12000 Zellen/ml in einer 24 Wellplatte für Gewebekultur erhalten werden konnten. Nach der Kultivierung in einem Inkubator mit 5 % Kohlenstoffdioxidgas bei 37 °C für 5 Tage wurde das Medium entfernt und ein Waschen mit PBS (-) wurde zwei Mal durchgeführt. Die Zellen wurden aus dem Boden der Wells mit Trypsin-EDTA abgezogen und wurden dann mit Vulkanblau gefärbt, um lebensfähige Zellen zu zählen. Wie Tabelle 2 zeigt, verringerten sich, wenn die MDCKII-Zellen als Monoschicht in dem serumfreien Medium kultiviert worden waren, die überlebensfähigen Zellen um ungefähr 1/10 nach Tag 5, wenn das Polypeptid der Erfindung nicht zu der Kulturlösung (Kontrolle) hinzu gegeben wurde. Auf der anderen Seite wurde, wenn das Polypeptid der Erfindung zu der Kulturlösung hinzu gegeben wurde, die Vermehrung der MDCKII-Zellen in einer Weise trotz der serumfreien Kultivierung induziert, die abhängig von der Konzentration des hinzu gegebenen Polypeptids der Erfindung ist. Wenn 0,075 mg/ml des Polypeptids der Erfindung zu der Kulturlösung hinzu gegeben wurden, wurde bestätigt, dass nach 5 Tagen der Kultivierung lebensfähige Zellen in mehr als der 10fachen Menge im Vergleich zu dem Beginn der Kultivierung vorhanden waren. Dieses Ergebnis ist mit der Wirkung der Zugabe von 10 % fötalem Rinderserum vergleichbar und es wurde gezeigt, dass das Polypeptid der Erfindung eine sehr starke zellproliferierende Aktivität aufweist.
Tabelle 2
Die Zahl der Zellen zu Beginn der Kultivierung: 12000
GEWERBLICHE ANWENDBARKEIT
Die Polypeptide dieser Erfindung sind in wässrigen Medien wie physiologischer Salzlösung löslich und haben eine Morphogenese beschleunigende Aktivität gegenüber Epithelgeweben; sie sind daher als wirksame Inhaltsstoffe von Medikamenten zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Erkrankungen nützlich, die aus einer Abweichung der Morphogenese resultieren.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die in der Sequenzauflistung in SEQ ID NO:1 dargstellt wird.
Das Polypeptid gemäß Anspruch 1, wobei wenigstens ein Mitglied, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Zucker, Lipid und einer Phosphatgruppe besteht, Aminosäuregruppe(n) der Aminosäuresequenz modifiziert hat.
Ein Medikament, das als einen wirksamen Inhaltsstoff ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 2 enthält.
Ein Medikament zur Behandlung und/oder Vorbeugung einer Krankheit, die aus der geringen Expression eines morphogenetischen Faktors resultiert, wobei das Medikament als einen wirksamen Inhaltsstoff ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 2 enthält.
Das Medikament gemäß Anspruch 4, wobei der morphogenetische Faktor Epimorphin ist.
Ein Medikament zur Behandlung und/oder Vorbeugung einer Krankheit, die die Zerstörung von Gewebe oder eines Organs involviert, wobei das Medikament als einen wirksamen Inhaltsstoff ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 2 enthält.
Das Medikament gemäß Anspruch 6, worin die Krankheit eine Nierenerkrankung ist.
Ein das Haarwachstum unterstützendes Mittel, das als einen wirksamen Inhaltsstoff ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 2 enthält.
Ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die in der Sequenzauflistung in SEQ ID NO: 2 dargestellt wird.
Das Polypeptid gemäß Anspruch 9, wobei wenigstens ein Mitglied, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Zucker, Lipid und einer Phosphorsäuregruppe besteht, einen Aminosäurerest(e) der Aminosäuresequenz bindet.
Ein Medikament, das als einen wirksamen Inhaltsstoff ein Polypeptid gemäß Anspruch 9 oder 10 enthält.
Ein Medikament zur Behandlung und/oder Vorbeugung einer Krankheit, die aus der geringen Expression eines morphogenetischen Faktors resultiert, wobei das Medikament als einen wirksamen Inhaltsstoff ein Polypeptid gemäß Anspruch 9 oder 10 enthält.
Das Medikament gemäß Anspruch 12, wobei der morphogenetische Faktor Epimorphin ist.
Ein Medikament zur Behandlung und/oder Vorbeugung einer Krankheit, die die Zerstörung von Gewebe oder eines Organs involviert, wobei das Medikament als einen wirksamen Inhaltsstoff ein Polypeptid gemäß Anspruch 9 oder 10 enthält.
Das Medikament gemäß Anspruch 14, wobei die Krankheit eine Nierenerkrankung ist.
Ein das Haarwachstum unterstützendes Mittel, das als einen wirksamen Inhaltsstoff ein Polypeptid gemäß Anspruch 9 oder 10 enthält.
Ein Zellkulturmedium, das ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 9 enthält.
Ein Antikörper, der spezifisch an ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 1 oder 2 dargestellt wird, bindet.
Der Antikörper gemäß Anspruch 18, der zusätzlich die Morphogenesebeschleunigende Aktivität oder die zellproliferierende Aktivität des Polypeptid hemmt.
Der Antikörper gemäß Anspruch 19, der zusätzlich spezifisch an einen dem Epimorphin ähnlichen Faktor bindet, der eine gewickelte Spiraldomäne (1) aufweist und die Morphogenese-beschleunigende Aktivität oder die zellproliferierende Aktivität des Epimorphins gegenüber ephithelialen Zellen hemmt.
Ein Medikament, das als einen aktiven Inhaltsstoff einen Antikörper gemäß Anspruch 18 oder 20 enthält.
Das Medikament gemäß Anspruch 21 zur Behandlung oder Vorbeugung einer Krankheit, die aus der übermäßigen Expression von Ephimorphin resultiert.