KR20000053277A

KR20000053277A - 가용성 폴리펩티드

Info

Publication number: KR20000053277A
Application number: KR1019990704257A
Authority: KR
Inventors: 고시다쇼고
Original assignee: 스미토모 덴키 고교 가부시키가이샤
Priority date: 1996-11-18
Filing date: 1997-11-18
Publication date: 2000-08-25
Also published as: KR100522509B1; AU730367B2; AU4967397A; DE69735533T2; JP3903503B2; CA2272356A1; CA2272356C; EP1008603A1; US6372890B1; JPH10147597A; WO1998022505A1; CN100413888C; EP1008603A4; EP1008603B1; DE69735533D1; CN1237982A

Abstract

본 발명은, 상피세포에 대하여 형태형성 촉진작용 또는 세포증식작용을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이고, 사람-에피모르핀의 N 말단의 1번째로부터 103번째의 아미노산에 의해 특정되는 폴리펩티드, 및 마우스-에피모르핀의 N 말단의 1번째로부터 104번째의 아미노산에 의해 특정되는 폴리펩티드, 및 해당 폴리펩티드를 유효성분으로서 함유하는 의약을 제공한다. 이러한 폴리펩티드는 물에 가용성이고, 형태형성이상을 수반하는 질환, 예를 들면 염증성 질환, 화상, 창상 등의 치료 또는 예방을 위한 의약, 및 모 성장촉진에 사용되는 의약 등의 유효성분으로서 유용하다.

Description

가용성 폴리펩티드{Soluble polypeptides}

상피조직의 정상적인 형태형성은 상피조직의 둘레에 존재하는 간엽 세포로부터 유래한 인자에 의해 억제되는 것으로 알려져 있다. 또한, 상피조직의 형태형성 이상에 기인한 질환의 원인의 대부분이 간엽 세포의 이상에 의한 것으로 간주되고 있다. 이러한 지견에 기초하여, 간엽 세포에 의한 상피조직의 형태형성의 억제 메카니즘의 해명에 대하여 관심이 집중되고 있다. 그러나, 상피조직의 형태형성의 억제에 관여하는 물질군은 복잡한 계중에서 시간적 및 공간적인 억제를 받으면서 발현되고, 이러한 물질을 단리하여 기능을 해석하는 것은 극히 곤란한 것이며, 또한 상피조직의 형태형성을 단순화한 모델 실험계를 구축하는 것도 어렵다는 등의 이유로부터, 이러한 분야의 연구에는 지금까지 큰 진전이 보이지 않았다. 따라서, 상피조직의 형태형성에 기인하는 질환의 발병 메카니즘의 해명과, 이들 질환의 치료방법의 확립 등을 위해서, 상피조직에 있어서의 형태형성의 제어 메카니즘의 해석이 강하게 요망되고 있다.

이와 같은 상황하에서, 상피조직의 형태형성의 제어에 관여하는 에피모르핀이 분리 및 정제되었다(참조: 일본 특허 공개공보 제 94-25295 호). 이러한 물질은 277 내지 289개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코어 단백질로 하는 생리 활성 물질이고, 주로 간엽 세포에 의해 생합성되는 것으로 알려져 있다. 또한, 에피모르핀은 상피조직에 작용하여 상피조직의 형태형성을 촉진하는 작용을 한다는 사실, 및 에피모르핀이 기능을 발휘하지 않는 조건에서는 정상적인 조직 형성이 수행되지 않는 사실도 밝혀졌다.

또한, 에피모르핀의 구조적 특징에 있어서는, 에피모르핀 분자가 구조상 커다란 4개의 단편으로 나누어졌다는 사실이 밝혀져 있다(참조: 유럽 특허 공개공보 제 0698666 호). 즉, 에피모르핀의 전체 길이를 구성하는 폴리펩티드는 N 말단측부터, 코일드코일(coiled coil) 영역(1), 기능 도메인(2), 코일드코일 영역(3), 및 C 말단의 소수성 영역으로 나뉘어질 수 있다. 이들의 단편중, 기능 도메인(사람·에피모르핀에는 N 말단부터 104번째부터 187번째의 아미노산에 의해 특정되어 있는 영역)에 있어서는, 이러한 영역이 세포 접착에 관여하고 있고, 에피모르핀의 생리 활성의 발현에 밀접하게 관여하고 있다는 사실이 알려져 있다(참조: 유럽 특허 공개공보 제 0698666 호).

에피모르핀이 정상적인 형태형성을 촉진하는 작용을 갖는다는 사실로부터, 이러한 물질은 형태형성의 이상에 기인하는 질환 등의 예방 및 치료를 위한 의약, 또는 육모제 등의 의약의 유효성분으로서 유용한 것으로 기대되고 있다. 그렇지만, 포유류 동물로부터 수득된 천연형 에피모르핀은 생리식염수 등의 수성 매체에 난용성이고, 의약으로서 실용성을 제공하기가 어렵다. 이 때문에, 천연형 에피모르핀의 형태형성 촉진작용을 실질적으로 보유하는 동시에, 용해성이 우수한 에피모르핀 유도체를 만들어 내는 시험이 수행되고 있다. 예를 들면, C 말단부의 소수성 영역을 제거한 변이체(단편 123) 등이 공지되어 있다(일본 특허 공개공보 제 94-25295 호).

에피모르핀의 부분 구조인 코일드코일 영역(1)에 있어서는, 종래 이러한 영역이 에피모르핀을 가용화되도록 하는 작용을 갖는 것으로 밝혀져 있다. 그렇지만, 에피모르핀의 N 말단측으로부터 아미노산을 제거하여 코일드코일 영역(1)의 일부를 제거하면, 수득된 변이체의 세포 접착 활성이 저하해버리는 것도 동시에 밝혀졌다(참조: 유럽 특허 공개공보 제 0698666 호). 즉, 이러한 영역의 작용에 있어서, 가용성의 면에서는 단편(23)의 고차원적 구조를 변화시키는 등의 작용에 의해 긍적적으로 작용하지만, 세포 접착 활성에 있어서는 기능 도메인(2)을 마스터하는 등의 작용에 의해 부정적으로 작용하는 것으로 개시되어 있으며, 의약으로서의 적용가능성에 있어서는 부정적으로 개시되어 있다. 또한, 에피모르핀의 상기 각 영역(코일드코일 영역(1), 기능 도메인(2), 또는 코일드코일 영역(3))의 각각의 생리작용에 있어서는, 세포접착활성에 대해 보고되어 있지만, 에피모르핀과 유사한 형태형성 촉진작용에 대해서는 종래 공지되어 있지 않다.

발명의 요약

본 발명의 과제는, 상피세포에 대하여 형태형성 촉진작용을 갖는 가용성 폴리펩티드를 제공하는 것에 있다. 더욱 구체적으로는, 상피세포에 작용하여 상피조직의 형태형성을 촉진하고, 또한 생리 식염수 등의 수성 매체에 용해가능한 폴리펩티드를 제공하는 것이 본 발명의 과제이다.

또한 본 발명 또 다른 과제는, 상기 특징을 갖는 폴리펩티드를 유효성분으로서 함유하고, 형태형성 인자, 예를 들면 에피모르핀의 과소 발현에 기인하는, 또는 조직 또는 기관의 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료에 유용한 의약을 제공하는 것이다. 특히 본 발명의 또 다른 과제는, 상기 가용성 폴리펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 모 성장촉진제를 제공하는 것이다.

본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위해 면밀히 연구한 결과, 에피모르핀을 구성하는 코일드코일 영역(1)으로 이루어진 폴리펩티드가 수성 매체에 용해가능하고, 또한 상피세포에 작용하여 상피조직의 형태형성을 촉진한다는 사실, 및 상피세포에 대하여 현저한 세포증식 촉진작용을 갖는다는 사실을 발견하였다. 본 발명은 상기한 발견을 기초로하여 완성된 것이다. 여기서, 「세포증식 촉진작용」이란, 무혈청배지에서 세포를 수일간 배양하여 그 생세포수를 증가시킬 수 있는 것을 의미하는 것이다. 즉, 본 발명은 형태형성 촉진작용을 갖는 폴리펩티드로서, 서열번호: 1과 같은 아미노산 서열(I)(서열목록의 서열번호: 1)에 의해 특정되는 폴리펩티드(본 명세서에서 이러한 폴리펩티드를 "폴리펩티드(I)"이라 칭한다)를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명에 의해, 형태형성 촉진작용을 갖는 폴리펩티드로서는, 서열번호: 2와 같은 아미노산 서열(II)(서열목록의 서열번호: 2)에 의해 특정되는 폴리펩티드(본 명세서에서 이러한 폴리펩티드를 "폴리펩티드(II)"라 칭한다)가 제공된다.

또한, 본 발명에 따르면, 상기 아미노산 서열(I) 또는 (II)에 있어서 1 또는 2 이상의 아미노산이 치환, 부가, 및/또는 결실된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드; 천연형 에피모르핀의 형태형성 촉진작용과 실질적으로 동일한 형태형성 촉진작용을 갖는 상기 각 폴리펩티드; 및, 세포증식 촉진작용을 갖는 상기 각 폴리펩티드도 제공된다. 여기서, "아미노산의 치환, 부가, 결실"은, 예를 들면 부위특이적 변위 유발(site-directed mutagenesis)로 칭하는 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 각 양태에 따르면, 상기 폴리펩티드를 유효성분으로서 함유하는 의약이 제공된다. 이러한 의약의 바람직한 양태로서는, 형태형성 인자의 과소 발현에 기인하는, 또는 조직 또는 기관의 파괴를 수반하는 질환의 치료 및/또는 예방을 위해 사용하는 의약; 및 모 성장촉진제로서 사용하는 의약이 제공된다. 또한, 상기 폴리펩티드를 사람을 비롯한 포유류에게 투여하는 공정을 함유하고, 형태형성 인자의 과소발현에 기인하는, 또는 조직 또는 기관의 파괴를 수반하는 질환의 치료 및/또는 예방방법; 상기 폴리펩티드를 사람을 비롯한 포유류에 투여하는 공정을 함유하고, 에피모르핀의 발현과소에 기인하는 질환의 진단방법; 및, 상기 폴리펩티드를 사람을 비롯한 포유류에게 투여하는 공정을 함유하는 모 성장촉진방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 본 발명의 상기 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 항체, 바람직하게는 모노크로날 항체가 제공된다. 상기 항체의 바람직한 태양으로서는, 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고, 상피세포에 대한 상기 폴리펩티드의 형태형성 촉진작용을 저해하는 항체; 및 코일드코일 영역(1)을 갖는 에피모르핀류에 특이적으로 결합하고, 상피세포에 대한 상기 에피코르핀류의 형태형성 촉진작용을 저해하는 항체가 제공된다. 또한, 상기 항체를 유효성분으로서 함유하는 의약, 바람직하게는 에피모르핀의 발현 과다에 기인하는 질환의 예방 및/또는 치료에 유효한 의약, 및 모 성장저해제로서 작용하는 의약이 제공된다. 또한, 상기 항체를 사람을 비롯한 포유류에 투여하는 공정을 함유하고, 에피모르핀의 발현 과다에 기인하는 질환의 치료 및/또는 예방방법; 상기 항체를 사람을 비롯한 포유류에게 투여하는 공정을 함유하는, 에피모르핀의 발현 과다에 기인하는 질환의 진단방법; 및 상기 항체를 사람을 비롯한 포유류에 투여하는 공정을 함유하는 모 성장 저해방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상피세포에 대하여 형태형성 촉진작용 및 세포증식작용을 갖는 신규한 가용성 폴리펩티드에 관한 것이다.

도 1은 실시예 2의 시험의 대조군으로서, MDCKII세포(신장 유래 세포주)를 DH-배지에서만 배양한 세포의 형태를 현미경하에 촬영한 사진이다.

도 2는 본 발명의 폴리펩티드(15㎍/㎖)의 존재하에 MDCKII 세포(신장 유래 세포주)를 배양한 후 세포 및 해당 세포 유래의 관구조의 형태를 현미경하에 촬영한 사진이다.

도 3은, 본 발명의 폴리펩티드(15 ㎍/㎖)의 존재하에 MDCKII 세포(신장 유래 세포주)를 배양한 세포 및 해당 세포 유래의 관구조의 형태를 도 1 및 도 2의 경우보다 한층 더 고배율로 현미경 촬영한 결과를 나타내는 사진이다.

도 4는, 실시예 4의 시험의 대조군으로서, MDCKII 세포(신장 유래 세포주)를 DH-배지에서만 배양한 세포의 형태를 현미경하에 촬영한 사진이다.

도 5는, 실시예 4의 시험의 대조군(양성대조)으로서, 겔중에 본 발명의 폴리펩티드(H1, 3㎍/㎖)를 첨가하여 MDCKII 세포(신장 유래 세포주)를 배양한 경우의 세포 및 해당 세포 유래의 관구조의 형태를 표시하는 사진이다.

도 6은, 겔중에 본 발명의 폴리펩티드(H1, 3㎍/㎖) 및 항 H1 항체(5.2 ㎍/㎖)를 첨가하여 MDCKII 세포(신장 유래 세포주)를 배양한 경우의 세포 및 해당 세포유래의 관구조의 형태를 표시하는 사진이다.

도 7은, 겔중에 본 발명의 폴리펩티드(H1, 3㎍/㎖) 및 항 H1 항체(26 ㎍/㎖)를 첨가하여 MDCKII 세포(신장 유래 세포주)를 배양한 경우의 세포 및 해당 세포 유래의 관구조의 형태를 나타내는 사진이다.

도 8은 겔중에 본 발명의 폴리펩티드(H1, 3㎍/㎖) 및 항 H1 항체(130 ㎍/㎖)를 첨가하여 MDCKII 세포(신장 유래 세포주)를 배양한 경우의 세포의 형태를 나타내는 사진이다.

도 9는 겔중에 본 발명의 폴리펩티드(H1, 3 ㎍/㎖) 및 항 H3 항체(5.2 ㎍/㎖)를 첨가하여 MDCKII 세포(신장 유래 세포주)를 배양한 경우의 세포 및 해당 세포 유래의 관구조의 형태를 나타내는 사진이다.

도 10은 겔중에 본 발명의 폴리펩티드(H1, 3 ㎍/㎖) 및 항 H3 항체(26 ㎍/㎖)를 첨가하여 MDCKII 세포(신장 유래 세포주)를 배양한 경우의 세포 및 해당 세포 유래의 관구조의 형태를 나타내는 사진이다.

도 11은, 겔중에 본 발명의 폴리펩티드(H1, 3㎍/㎖) 및 항 H3 항체(130 ㎍/㎖)를 첨가하여 MDCKII 세포(신장 유래 세포주)를 배양한 경우의 세포 및 해당 세포 유래의 관구조의 형태를 나타내는 사진이다.

본 발명에 따라 제공되는 상기 폴리펩티드(I)는 사람-에피모르핀의 N 말단의 1번째로부터 103번째의 아미노산에 의해 특정되는 코일드코일 영역(1)(유럽 특허 공개공보 제 0698666 호 참조)에 상당하는 것이다. 또한, 상기 폴리펩티드(II)는 마우스-에피모르핀의 N 말단의 1번째로부터 104번째의 아미노산에 의해 특정되는 코일드코일 영역(1)(유럽 특허 공개공보 제 0698666 호 참조)에 상당하는 것이다. 이들의 폴리펩티드는, 천연형 에피모르핀에 비해 수용성이 우수한 것이고, 증류수, 생리식염수, 인산 완충생리 식염수 등의 수성 매체에 가용성인 것을 특징으로 한다. 예를 들면, 이러한 폴리펩티드를 수성 매체에 용해시켜 100,000 × g에서 1 내지 2 시간 원심처리하여도 0.2 ㎎/㎖ 이하의 농도이면 실질적으로 침전이 발생하지 않는다. 다만, 본 명세서에서 사용되는 "가용"이라고 하는 용어를 상기 특정의 용해성에 한정하여 해석해서는 안된다.

또한, 상기 폴리펩티드(I) 또는 폴리펩티드(II)는 천연형 에피모르핀의 상피세포에 대한 형태형성 촉진작용과 실질적으로 동일한 작용을 갖는 것을 특징으로 한다. 천연형 에피모르핀으로서는, 예를 들면 포유류 등의 간엽 세포에 의해 생합성되는 에피모르핀을 의미한다. 천연형 에피모르핀으로서는 예를 들면 사람, 원숭이, 소, 말, 양, 개, 고양이, 토끼, 래트, 마우스 등으로부터 유래하는 에피모르핀, 바람직하게는 사람으로부터 유래하는 에피모르핀 등을 들 수 있다.

천연형의 에피모르핀에는 유전자의 스프라이싱에 의해 복수의 이소폼이 존재하는 경우가 있다. 예를 들면, 사람-에피모르핀에 있어서는 일본 특허 공개공보 제 94-25295 호에 나타낸 바와 같은 288개의 아미노산으로 이루어진 사람-에피모르핀, 및 각각 287개 및 277개의 아미노산으로 이루어진 사람-에피모르핀의 이소폼 A 및 B가 존재하고, 마우스·에피모르핀에 있어서는, 289개의 아미노산으로 이루어진 마우스·에피모르핀, 및 각각 288개 및 279개의 아미노산으로 이루어진 마우스-에피모르핀의 이소폼 A 및 B가 존재한다. 본 명세서에 있어서 천연형 에피모르핀이라고 하는 경우는 이들의 이소폼류를 모두 함유하는 개념으로 사용하는 것이다.

본 발명의 폴리펩티드에는 상기한 폴리펩티드(I) 및 폴리펩티드(II) 이외에, 상기 폴리펩티드(I) 또는 폴리펩티드(II)의 구성 아미노산 가운데 1개 내지 2개 이상의 아미노산이 그 밖의 아미노산에 의해 치환되고, 이들의 구성 아미노산 가운데 1개 또는 2개 이상의 아미노산이 결실하고/결실하거나 상기 폴리펩티드 쇄중에 1개 또는 2개 이상의 임의의 아미노산이 부가된 상기 폴리펩티드(I) 또는 폴리펩티드(II)의 아미노산 변이체이고, 실질적으로 상피세포에 대하여 형태형성 촉진작용 또는 세포증식작용을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. 치환 및/또는 부가된 1 또는 2 이상의 아미노산의 종류는 특히 한정되지 않지만, L-아미노산인 것이 바람직하다.

본 발명의 폴리펩티드에는 상기 폴리펩티드(I) 또는 폴리펩티드(II), 또는 아미노산 변이체를 그 부분서열로서 함유하고, 실질적으로 형태형성 촉진작용 또는 세포증식작용을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. 예를 들면, 상기 폴리펩티드(I) 또는 폴리펩티드(II)의 N 말단 및/또는 C 말단에는 1개 또는 2개 이상의 아미노산이 결합될 수 있고, 바람직하게는 2개 이상의 임의의 아미노산으로 구성된 임의의 올리고펩티드가 결합될 수 있다. 이와 같은 아미노산의 종류는 특히 한정되지 않지만, L-아미노산으로부터 선택된 것이 바람직하다. 예를 들면, 상기 폴리펩티드(I) 또는 폴리펩티드(II)의 N 말단에 1 내지 10개 정도, 바람직하게는 5 내지 7개, 특히 바람직하게는 6개의 L-히스티딘을 택(tag) 서열로서 결합한 것은, 부가한 택 서열에 특이적으로 결합하는 항체 또는 니켈 등의 물질을 사용하여 간편하게 정제하고, 검출할 수 있기 때문에 생산효율 등의 관점으로부터 바람직한 폴리펩티드이다. 또한, 친수성 또는 체내 안정성을 높이는 등의 기능성이 개선되고 형태형성 촉진작용을 높이는 등의 목적으로 특정의 택 서열을 폴리펩티드에 부가하는 것도 가능하다. 그 밖에, 특정 분자에 결합가능한 택 서열을 부가함으로써, 특정의 조직 또는 기관에 대한 약물 전달 효율을 개선한 융합 단백질 등을 제조할 수 있다.

상기 폴리펩티드는 유리형태일 수도 있지만, 염산염, 아세트산염, 또는 파라톨루엔설폰산 등의 산 부가염, 또는 암모늄 염 또는 유기 아민염 등의 염기 부가염으로서 제공될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 있어서 폴리펩티드라고 하는 경우는, 상기한 바와 같은 염의 형태의 폴리펩티드를 포함하는 의미로 해석될 수 있다. 또한, 상기의 각 폴리펩티드에 임의의 당류(단당, 이당, 올리고당, 또는 다당)이 결합한 것 또는 지질류 등이 결합한 것 이외에, 인산화된 것도 본 발명의 폴리펩티드의 범위에 포함된다.

본 명세서의 실시예에는, 상기 가용성 폴리펩티드의 바람직한 태양인 폴리펩티드(I)에 있어서, 신장 유래 MDCKII 세포에 대한 형태형성 촉진작용의 시험방법이 구체적으로 설명되어 있다. 따라서, 당업자는 이들의 시험예를 참조하면서 또는 이들의 방법에 적당한 변화 또는 변형을 가함으로써, 상기에 정의된 각 폴리펩티드가 원하는 형태형성 촉진작용을 갖고 있는 것을 용이하게 확인할 수 있다. 또한, 상피조직에 대한 에피모르핀의 형태형성의 촉진작용은 예를 들면 일본 특허 공개공보 제 94-25295 호의 실시예에도 상세히 기재되어 있지만, 이와 같은 시험계를 응용함으로써도 형태형성 촉진작용을 확인할 수 있다.

어떠한 특정 이론에도 구속받고자 하는 것은 아니지만, 천연형 사람-에피모르핀은 중앙 단편(기능 도메인: N 말단으로부터 104번째로부터 187번째의 아미노산 잔기에 의해 특정된 단편)에 존재하는 세포 접착성 영역이 상피세포의 세포외 표면에 존재하는 에피모르핀-수용체에 결합하여 상피세포 표면에 고정되면서, 폴리펩티드(I)를 함유하는 영역(천연형의 사람-에피모르핀의 코일드코일 영역: 에피모르핀의 N-말단으로부터 103번째의 아미노산 잔기까지의 부분)이 형태형성에 관여하는 수용체에 결합하지 않고 작용하여 형태형성작용을 발현할 가능성이 있다.

또한, 본 발명의 상기 폴리펩티드는, 상피조직에 대하여 천연형 에피모르핀과 실질적으로 동일한 형태형성 촉진작용을 갖지만, 이러한 작용의 강약은 특히 한정되지 않는다. 예를 들면, 천연형의 사람-에피모르핀과 동일한 정도 또는 그 이하의 농도에서 형태형성 촉진 작용을 발휘할 수 있는 것이 바람직하다. 또한, 본 명세서의 실시예에는 형태형성 촉진작용의 대표적 시험방법(신장유래 세포에 대한 관 구조 형태형성 작용의 시험방법)을 구체적으로 기재하였지만, 상기 폴리펩티드의 형태형성 촉진작용은 이러한 작용에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 상피세포에 대하여 강력한 세포증식 촉진작용을 갖고 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드에 의해 달성되는 형태형성은, 세포의 증식(세포수의 증가)를 수반하는 형태형성인 것을 특징으로 한다. 본 명세서의 실시예에는 본 발명의 폴리펩티드에 의한 세포증식 촉진 활성의 시험예가 개시되어 있지만, 본 발명의 폴리펩티드의 세포증식 촉진 작용은 이러한 시험예에 의해 밝혀진 특정의 작용에 한정되는 것은 아니다.

또한, 천연형 에피모르핀에 있어서 수종의 형태형성 촉진작용이 보고되어 있지만, 이들은 천연형 에피모르핀의 효과가 있는 다양한 형태형성 촉진작용의 일부일 가능성이 있다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 형태형성 촉진작용이라고 하는 용어는, 종래 보고되거나 확인되어 있는 형태형성 촉진작용에 한정되지 않고, 가장 광의로 해석할 필요가 있다. 또한, 예를 들면 형태형성 유도활성, 기관 및 형태형성 지지작용 등의 개념도 형태형성 촉진작용에 포함되는 개념이다. 또한, 실질적으로 동일하다고 하는 용어도 한정적으로 해석해서는 안된다. 본 발명의 폴리펩티드가 천연형 에피모르핀의 형태형성 촉진작용에 덧붙여, 이러한 작용과 상이한 그 밖의 형태형성 촉진작용을 갖고 있는 경우도 본 발명의 범위에 포함된다.

상기 폴리펩티드는 펩티드 합성에 통상 사용되는 고상법 및 액상법 등의 화학적 수법에 의해 합성할 수 있다. 펩티드 합성에 있어서 아미노기 등의 보호기 및 축합반응의 축합제로서는, 예를 들면 "단백질 공학 기초와 응용"(스즈키(Suzuki, K.) Ed; 1992년, 마루젠 가부시키가이샤(Maruzen Co., Ltd.)); 본단스키(Bondansky) 등의 "펩티드 합성"(1976년, John Wiley & Sons, 뉴욕); 및 스튜어트(Stewart) 등의 "고체상 펩티드 합성"(1969년, W.H.Freeman and Co.: 샌프란시스코) 등에 기재된 것을 사용할 수 있다. 고상법으로는 시판중인 각종 펩티드 합성 장치를 이용할 수 있다. 또한, 통상의 유전자 발현 조작 등의 생물학적 수법에 따라, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 반복하는 벡터를 제조한 후, 해당 벡타에 의해 형질전환시킨 미생물(형질전환체)을 제조하고, 해당형질전환체를 배양한 배양액으로부터 소정의 상기 가용성 폴리펩티드를 분리-정제할 수 있다. 또한, 상기 가용성 폴리펩티드의 제조방법은 이러한 화학적 방법 및 생물학적 방법에 한정되지 않는다.

유전자 발현에 의한 제조방법에 이용가능한 DNA로서는, 서열번호: 3 등을 들 수 있다(상보적인 염기서열을 생략하여 센스쇄만을 나타내고, 서열중, 시점이 5' 말단이고, 종점이 3'말단이다)

이러한 DNA는, 천연형 사람-에피모르핀의 전체 길이를 코딩하는 DNA(일본 특허 공개공보 제 94-25295 호에 개시되어 있는 식 6에 나타낸 해당 산서열)중, 첫 번째로부터 309번째의 뉴클레오티드에 상응하고, 상기 폴리펩티드(I)를 코딩하는 DNA이다. 상기 폴리펩티드(II)의 제조에는 예를 들면 천연형 마우스-에피모르핀의 전체 길이를 코딩하는 DNA(일본 특허 공개공보 제 94-25295 호에 개시되어 있는 식(12)로 나타내는 해당 산서열)중, 첫 번째로부터 312번째의 뉴클레오티드에 의해 특정되는 DNA를 이용할 수 있다.

또한, 상기 사람으로부터 유래한 DNA 또는 마우스로부터 유래한 DNA를 사용하여 통상의 방법에 의해 아미노산 변이체를 용이하게 제조할 수 있다. 이와 같은 방법으로서는 예를 들면, "PCR 실험 매뉴얼"(1991년, HJB 출판국) 155 내지 160쪽에 기재되어 있는 재조합 PCR법 및 "실험 의학 증간 Vol.8, No.9"(1990년, 요도 가부시키가이샤(Yodo Co., Ltd)) 63 내지 67쪽에 기재된 PCR을 사용한 변이 유전자의 작성법 등을 이용할 수 있다. 원하는 폴리펩티드를 제조하기 위해 이용가능한 유전자 발현 방법으로서는 예를 들면 유럽 특허 공개공보 제 0698666 호 명세서의 실시예에 상세하게 기재된 방법을 이용할 수 있지만, 이들의 방법에 한정되지 않는다.

본 발명의 상기 폴리펩티드는 상기 세포에 작용하여, 상피성의 조직 또는 기관 등의 형태형성을 촉진하는 작용을 갖고 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 내인성의 형태형성 인자의 과소발현 등에 기인하는 조직 또는 기관의 형태형성의 이상을 수반하는 질환, 또는 조직 또는 기관의 파괴를 수반하는 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 또는 상기 질환의 진단을 위한 의약의 유효성분으로서 유용하다. 또한, 상기 폴리펩티드는 모 성장촉진제로서 사용하는 의약의 유효성분으로서도 유용하다. 본 명세서에 있어서 의약이라고 하는 용어는, 사람을 비롯한 포유류의 병 기운의 예방, 치료, 및 진단에 사용하는 것 이외에, 통상은 의약부외품으로서 분류되는 모 성장촉진제 또는 모성장 저해제 등을 포함하는 종류로 가장 광의로 사용한다.

형태형성 인자로서는 천연형 에피모르핀을 함유하여 거듭하는 것으로 공지되어 있다. 본 발명의 의약은, 상기 형태형성 인자, 특히 에피모르핀의 과소 발현에 기인하는 조직 또는 기관의 형태형성 이상을 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료에 유용하다. 또한, 염병성 질환, 암, 화상, 수술, 또는 창상, 및 이들의 치료과정 등, 상피성의 조직 또는 기관의 파괴를 수반하는 질환(상해를 함유하는 개념으로서 사용된다)에 대해, 상피조직 또는 기관의 재생을 촉진하는 목적으로 본 발명의 의약을 사용할 수 있다. 더욱 구체적으로는, 예를 들면 만성 신장염 등의 신장 질환; 폐렴, 폐기종, 폐결핵, 만성 폐색성 폐질환, 진폐증, 흡인성 폐렴 등의 만성 및 급성 폐질환; 만성 기관지염등의 기관 및 기관지 질환; 급성 간염, 만성 간염, 간경변, 극증간염(fulminant hepatitis) 등의 간질환; 암; 양성 전립선 비대; 소화성 유상; 창상; 피부궤상등의 질환은, 형태형성 촉진작용을 갖는 그 밖의 생리활성물질(예를 들면 HGF 또는 EGF 등)에 의해 치료가능한 것이 시사되기 때문에, 본 발명의 의약은 이들의 질환에 대해 유효할 것으로 기재된다.

또한, 본 발명의 의약을 에피모르핀의 과소발현에 기인하는 질환의 환자에게 투여하는 경우, 일반적으로는 해당 질환의 증상의 경과가 확인되기 때문에, 해당 질환을 확정 진단할 수 있다. 본 명세서의 실시예에 구체적으로 나타낸 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드는 특히 신장 세포에 대하여 강력한 세포증식작용 및 형태형성 촉진작용을 갖고 있다. 따라서, 치료에 대하여 신장 조직, 예를 들면 신요세관 상피세포의 재생 또는 보호가 필요한 신장 질환에 대하여, 본 발명의 의약을 특히 적당하게 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 의약을 급성 사구체신염, 급속진행성 신염, 만성 사구체신염 등의 만성 신염, 네프로제 증후군, 만성 신부전, 신장암 등의 신장 질환에 적용할 수 있다.

본 발명의 의약의 적용 대상은 상기에 예시한 질환에 한정되는 것은 아니고, 1 또는 2 이상의 형태형성인자의 발현 과소, 특히 에피모르핀의 발현과소가 관여되어 있는 것으로 생각되는 질환, 및 조직 또는 기관의 실질적인 파괴를 수반하는 질환에 대하여 적용가능하다는 것을 이해해야 한다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 모성장 촉진제의 용도는 육모 촉진 및 발모 촉진 등을 포함하여 가장 광의로 해석해야 한다.

본 발명의 의약으로서는, 상기한 폴리펩티드로부터 선택된 1 또는 2종 이상의 물질을 그대로 사용할 수 있지만, 통상은 제제학적으로 허용되는 1 또는 2종 이상의 제제용 첨가물을 사용하여 상기 물질의 1 또는 2 이상을 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물을 제조하고, 상기 질환의 치료 및/또는 예방을 위해 사용하는 것이 바람직하다. 용해도, 흡수 및 배설 등의 체내동태, 및/또는 제조방법 등의 관점으로부터, 상기한 폴리펩티드는 생리학적으로 허용되는 형태일 수 있다. 상기한 의약 조성물의 관여 경로로서는, 예를 들면 정맥내 투여, 직장내 투여, 경구투여 등의 전신 투여 이외에, 외용, 점안, 점비, 점이, 국소주사 등의 국소 투여를 들 수 있다.

예를 들면, 정맥내 투여용 주사제 또는 점적제 등의 전신 투여제, 또는 연고, 크림제, 첩부제, 또는 국소주사제 등의 국소 투여제는 본 발명의 의약 조성물의 바람직한 형태이다. 유효성분을 리포솜 등에 봉입한 의약 조성물 또는 항체 등을 결합한 의약 조성물을 사용함으로써, 표적 기관에 대한 친화성 또는 선택성을 개선할 수 있는 경우가 있다. 게다가, 투여 경로는 적용 대상이 되는 질환의 종류, 치료 또는 예방의 목적, 환부의 종류, 환자의 상태 등에 따라서 적당히 선택가능하고, 여러 가지의 투여 경로에 적당한 제제형태도 적당히 선택할 수 있다. 진단약으로서 사용하는 경우의 형태도 특히 한정되지 않지만, 진단방법에는 본 발명의 의약을 환자에 투여하는 경우 이외에, 환자로부터 분리 및 채취한 생체시료를 사용하여 수행하는 경우도 포함된다.

또한, 상기의 폴리펩티드의 1종 또는 2종 이상을 유효성분으로서 함유하는 모 성장촉진제는 크림제, 분무제, 도포용의 용액제, 또는 접착제 등, 모 성장촉진제로서의 사용목적에 적당한 형태의 제제로서 제공되는 것이 바람직하다. 상기 가용성 폴리펩티드는 생리학적으로 허용되는 염의 형태일 수 있고, 피부의 케라틴층을 통해 유효성분인 상기 가용성 폴리펩티드를 효율적으로 경피흡수시키기 위해, 적당한 계면활성제 또는 지용성 물질 등을 크림제 등에 배합하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드의 용도는 상기한 의약에 한정되지 않고, 예를 들면 세포배양용의 배지에 대한 첨가제로서 사용될 수 있다.

본 발명의 제 2 양태에 따르면, 본 발명의 폴리펩티드, 바람직하게는 상기 폴리펩티드(I) 또는 (II)를 특이적으로 인식하는 항체, 바람직하게는 모노크로날 항체가 제공된다. 본 발명의 항체는 본 발명의 폴리펩티드(바람직하게는 상기 폴리펩티드(I) 또는 (II)), 또는 코일드코일 영역(1)을 갖는 에피모르핀류(바람직하게는 사람 또는 마우스 유래의 천연형 에피모르핀)에 대하여 특이적으로 결합할 수 있고, 이들 물질의 상피세포에 대한 형태형성 촉진작용을 저해하는 작용을 갖고 있다. 본 명세서에 있어서 에피모르핀류라고 하는 용어는 천연형 에피모르핀 및 천연형 에피모르핀과 실질적으로 동일한 생리작용을 갖는 천연형 에피모르핀의 변이체(에피모르핀 변이체), 및 천연형 에피모르핀과 실질적으로 동일한 생리작용을 갖는 이들의 아미노산 변이체를 포함하는 개념으로 사용된다.

본 명세서에 있어서, 에피모르핀 변이체로서는, 천연형의 에피모르핀과 실질적으로 동일한 생리작용(예를 들면, 상피세포에 대한 세포접착작용과 상피 세포에 대한 형태형성 촉진작용)을 갖는 폴리펩티드이고, 상기 천연형 에피모르핀의 폴리펩티드 서열(통상은 277 내지 289개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드이다)에 유래하는 부분 폴리펩티드 서열이거나, 또는 천연형 에피모르핀의 폴리펩티드 서열에 유래하는 상기 부분 폴리펩티드 서열을 이의 부분 서열로서 함유하는 폴리펩티드이다. 예를 들면, 천연형 에피모르핀의 C 말단 소수성 영역을 제거한 폴리펩티드(일본 특허 공개공보 제 94-25295 호)는 에피모르핀 변이체의 대표적 화합물이다. 또한 본 명세서에 있어서, 천연형 에피모르핀 또는 에피모르핀 변이체의 아미노산 변이체로서는, 천연형의 에피모르핀과 실질적으로 동일한 상기 생리작용을 갖는 폴리펩티드이고, 상기 천연형 에피모르핀 또는 에피모르핀 변이체의 폴리펩티드쇄를 구성하는 아미노산 가운데 1개 또는 2개 이상의 아미노산이 그 밖의 아미노산에 의해 치환되고, 이들의 구성 아미노산 가운데 1 또는 2개 이상의 아미노산이 결실되어 있고/있거나, 상기 폴리펩티드 쇄중에 1개 또는 2개 이상의 임의의 아미노산이 삽입된 것을 의미하고 있다.

상기 공보 등에 개시된 에피모르핀 변이체 이외에도, 개시된 방법에 따라서, 또는 이들에 변화 내지 변형을 가한 방법에 의해 제조가능한 에피모르핀 변이체는 어느것도 상기 정의를 만족하는 한 본 명세서에 있어서 에피모르핀 변이체에 포함된다는 것을 이해해야 한다. 또한, 천연형 에피모르핀 또는 에피모르핀 변이체의 아미노산 변이체의 제조방법에 있어서는, 예를 들면 일본 특허 공개공보 제 95-175539 호 명세서 및 일본 특허 공개공보 제 96-99684 호 명세서에 구체적으로 설명되어 이는 것이 이들의 방법으로서 한정되는 것은 아니고, 임의의 방법에 의해 제조된 아미노산 변이체이어도 좋다. 또한, 이들의 에피모르핀 변이체 또는 이의 아미노산 변이체의 생리활성의 검정방법에 있어서, 일본 특허 공개공보 제 94-25295 호 공보 또는 국제공개공보 제 WO 97/40158 호에 있어서 상세히 설명된 천연형 에피모르핀의 생리활성의 검정방법에 준하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 일본 특허 공개공보 제 96-102553 호 명세서의 실시예에 기재된 마우스 태아폐의 기관지의 형태형성 촉진작용, 마우스 태아 상악 피부의 형태형성 촉진작용 등을 확인할 수 있다.

에피모르핀류에 결합하여 이들의 작용을 저해하는 항체로서, 종래 MC-1가 공지되어 있다(일본 특허 공개공보 제 94-25295 호; CELL, 69, pp. 471-481, 1992). 본 발명의 항체는 상기 MC-1과 동일하게, 에피모르핀류에 의한 상피조직의 정상적인 형태형성 메카니즘을 밝히기 위해 유용하고, 또한 천연형 에피모르핀의 발현 이상(발현과다)에 기인한 질환의 발병의 메카니즘의 해명, 및 이들의 질환의 예방 및/또는 치료에 유용한 의약의 유효성분으로서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체를 모 성장저해제로서 사용하는 의약의 유효성분으로서도 유용하다.

본 발명의 항체의 제조방법의 일례로서, 상기 폴리펩티드(II)를 사용한 폴리크로날 항체의 제조방법의 상세한 내용을 실시예에 기재하였다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드가 적당한 조건하에 있어서 포유류 동물에 대하여 항원으로서 작용하는 것이 가능하고, 통상의 방법에 따라서 포유류 동물을 면역하는 것이 가능하다는 것, 및 주지 또는 관용의 방법에 따라, 본 발명의 폴리펩티드에 포함되는 임의의 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 폴리크로날 항체 또는 모노크로날 항체를 용이하게 제조할 수 있다는 것은 당업자에게 용이하게 이해될 수 있다.

형태형성인자의 1 또는 2 이상의 인자의 발현과다에 기인하는 질환으로서는 예를 들면 만성 간접류마티스, 신장 세포암 또는 피부암 등의 암, 동맥경화증, 교원병, 조혈기 질환, 신장 질환, 근 영양장애, 골다공증, 신경선유종증, 스터지-웨버(Sturge-Weber) 증후군, 결절성 경화증, 신경관폐색장해, 분절이상, 미주장해, 뇌량형성, 뇌공증, 및 수두증 등을 들 수 있지만, 본 발명의 항체를 유효성분으로서 함유하는 의약은 이들의 질환의 치료 및/또는 예방, 및 진단에 유용할 것으로 기대될 수 있다.

또한, 본 발명의 의약의 적용대상은 이들의 질환에 한정되는 것은 아니고, 1 또는 2 이상의 형태형성인자의 발현과다, 특히 천연형 에피모르핀의 발현과다가 관여되어 있다고 고려되는 질환은 전부 적용대상이 된다는 것을 이해해야 한다. 또한, 상기 항체를 유효성분으로서 함유하는 모 성장 저해제의 용도는 탈모, 육모저해, 및 발모저해 등을 함유하여 가장 광의로 해석되어야 한다. 또한, 본 발명의 항체를 유효성분으로서 함유하는 의약은 통상은, 제제학적으로 허용되는 1 또는 2종 이상의 제제용 첨가제를 사용하여 의약 조성물로서 조제되지만, 그 형태, 조제방법, 및 의약 조성물의 투여경로 등은 상기 설명한 것을 응용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

본 발명의 폴리펩티드의 제조

마우스로부터 유래한 천연형 에피모르핀의 N 말단 아미노산부터 1 내지 104 번째의 아미노산을 코딩하는 DNA 서열(일본 특허 공개공보 제 94-25295 호의 식 12에서 나타낸 산 서열예중, 첫 번째로부터 312번째의 뉴클레오티드에 의해 특정되는 DNA)의 5'측에 메티오닌 및 6개의 히스티딘을 코딩하는 서열목록의 서열번호: 4의 DNA가 부가되고(합계 111개의 아미노산을 코딩함), 3' 말단에 종결코드가 부가된 cDNA를 PCR에 의해 조제하였다. 해당 cDNA를 2개의 EcoRV 사이트의 사이의 영역이 결실한 pET3C 벡터의 NdeI, NheI 사이트에 집어넣고, 발현용 벡터를 제작하였다.

수득된 발현 벡터를 하나한(Hanahan)법("라보매뉴얼 유전자 공학", 마루젠 가부시키가이샤 발행)에 의해 콤피턴트 세포(competent cell)로 만든 대장균 BL21주에 도입하였다. 도입법으로서는, 얼음 위에서 콤피턴트 세포를 용해하고, 이의 용액 100 ㎕에 발현 벡터를 적량(1 mg/mL의 DNA 용액을 1 ㎕) 첨가하고, 얼음 위에서 10분간 방치하였다. 그 후에, 42℃의 배양기에서 2분간 방치하고, 최후에 얼음 위에서 30분 방치함으로써 도입을 완료하였다.

다음에, 상기의 형질전환체를 앰피실린(50 ㎍/mL)을 함유하는 LB 플레이트(1% 박토-트립톤(Bacto-tryptone), 0.5% 박토-이스트 추출물, 1% NaCl, 1.5% 박토-아가)에 넣고, 생육하여 온 배지를 선택하여 형질전환체를 1차 스크리닝하였다. 또한, 발현 벡터를 갖는 형질전환체의 최종 확인으로서, PCR에 의해 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 유무를 확인하고(이러한 시점에서 10개중 9개의 클론에 DNA가 유지되어 있다), 발현 벡터를 갖는 형질전환체를 수득하였다. 수득한 형질전환체는, 앰피실린(50 ㎍/mL)를 포함하는 액체 LB 배지(1% 박토-트립톤, 0.5% 박토-이스트 추출물, 1% NaCl)를 사용하고, 37℃에서의 진탕배양에 의해 대량으로 증식시킨 후, 발현을 유도하기 위한 물질 IPTG를 배지중에 최종 농도 1 mM이 되도록 첨가하였다. 이어서, 37℃에서 2시간 진탕배양을 계속하고, 목적하는 폴리펩티드를 대장균 안에서 발현시켰다. 발현한 폴리펩티드의 정제는 QIAGEN사의 Ni²⁺-NTA-아가로즈(카탈로그 번호 30230)를 사용하여 첨부한 프로토콜에 따라서 수행하였다. 정제한 폴리펩티드는 SDS-PAGE(CBB 염색)에 의해 95% 이상의 순도를 갖고 있는 것이 확인되었다. 또한, 정제후의 폴리펩티드의 인산 완충생리식염수(PBS)에 대한 용해도는 0.15 mg/mL이었다.

실시예 2

본 발명의 폴리펩티드의 MDCKII세포(신장 유래 세포주)에 대한 형태형성 촉진작용

실시예 1에서 조제한 폴리펩티드의 기관 및 형태형성 촉진작용을 다음과 같이 평가하였다.

멸균한 트랩 튜브를 얼음중에 세우고, 트랩 튜브에 1/10 용량의 10 × DH-배지(달베코(Dalbeco) 변형된 MEM 배지와 HamF12 배지의 등량 혼합배지), 1/10 용량의 재구성용 완충액(260 mM NaHCO₃, 200mM HEPES, 50mM NaOH)를 첨가하였다. 또한, 트랩 튜브 안에 신전 제라틴제 콜라겐 용액 I-P을 8/10 용량 첨가하고, 피페팅에 의해 혼합하였다. 실시예 1에서 제조한 폴리펩티드를 DH-배지에 대해 투석한 후, 최종 농도가 15 ㎍/mL이 되도록 트랩 튜브에 첨가하였다. 대조군으로서, DH-배지를 동량 첨가하였다. 이어서 신장 유래 세포주 MDCKII 세포(104 세포/웰)를 트랩 튜브에 첨가하고, 피페팅에 의해 혼합하였다.

48 웰의 멀티웰 디쉬에 상기 혼합물을 200 ㎕/웰씩 첨가하고, 37℃의 항온기중에서 1시간 동안 보온하여 혼합물을 겔화하였다. 무혈청의 DH-배지를 800 ㎕/웰씩 첨가하여 37℃에서 1시간 평형화시킨 후, 겔을 상하지 않도록 주의하여 배지를 제거하였다. 이어서, 무혈청의 DH-배지를 500 ㎕/웰씩 첨가하고, 37℃의 5% 탄산 기체 항온기중에서 1 내지 2주간 배양하여 형태를 관찰하였다.

도 1 내지 도 3은 2주간 배양을 수행한 후의 세포 및 이의 세포로부터 발생한 조직을 현미경하에 촬영한 결과를 나타낸 사진이다. 도 1은 대조군(DH-배지만)의 결과를 나타내고, 도 2는 겔중에 본 발명의 폴리펩티드(15 ㎍/mL)를 첨가하여 배양한 결과를 나타낸다. 도 1 및 도 2의 사진은 동배율(40배)에서 촬영한 결과를 나타내고, 도 3은 겔중에 본 발명의 폴리펩티드(15 ㎍/mL)를 첨가하여 배양한 것에 대해 고배율(100배)로 촬영을 수행한 결과를 나타내고 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 콜라겐겔중에 첨가한 경우에는 세포(MDCKII)가 3차원적으로 관구성을 형성하였다. 그 결과는 본 발명의 폴리펩티드가 형태형성 촉진작용(기관·형태형성지지작용)을 갖고 있는 것을 나타내는 것이다.

실시예 3

본 발명의 폴리펩티드의 조제

마우스 유래의 천연형 에피모르핀의 N-말단 아미노산으로부터 1 내지 104번째의 아미노산을 코딩하는 DNA 서열에 대하여, 사람 유래의 천연형 에피모르핀의 N 말단으로부터 1 내지 103번째의 아미노산을 코딩하는 DNA 서열(일본 특허 공개공보 제 94-25295 호에 개시된 식 6에 나타낸 해당 산 서열중, 첫 번째로부터 309번째의 뉴클레오티드에 의해 특정되는 DNA)를 사용하고, 실시예 1과 동일하게 하여 본 발명의 폴리펩티드를 제조하였다. 이러한 폴리펩티드에 있어서 실시예 2와 동일한 시험을 수행하면, 이러한 폴리펩티드가 신장 유래 세포주 MDCKII 세포에 대하여 실시예 1의 폴리펩티드와 동일한 기관·형태형성 지지작용을 갖는 것이 확인되었다.

실시예 4

본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체의 작성 및 해당 항체에 의한 형태형성의 저해

실시예 1에서 수득한 폴리펩티드(이하 H1로 칭함), 및 대조군으로서 형태형성 촉진작용을 갖지 않는 마우스 유래 천연형 에피모르핀의 부분 폴리펩티드(N 말단으로부터 189번째로부터 263번째의 아미노산 서열에 의해 특정되는 폴리펩티드)의 N 말단에 메티오닌과 6개의 히스티딘을 부가한 폴리펩티드(이하, H3이라 칭함)을 각각 사용하여, 통상의 방법에 따라(고단샤 사이언티픽(Kodansha Scientific), 모노클로날 항체 실험 매뉴얼, pp 184-188) 래트를 면역하고, 각각의 폴리펩티드에 대한 항혈청을 수득하였다. 각각의 혈청으로부터, 파마시아제 하이트랩 프로틴 G(HiTrap Protein G)(코드번호 제 17-0404-01)을 사용하여 IgG 화분을 정제하여 폴리크로날 항체를 수득하였다. 정제조작은 첨부된 프로토콜에 따라 수행하였다. 수득된 폴리크로날 항체를 웨스턴 블롯팅(western blotting)에 대하여 각각의 특이성을 첵크한 후, 타입을 나누어 이하의 실험에 사용하였다.

본 발명의 폴리펩티드에 의해 신장 유래 세포주 MDCKII 세포에 관구성이 형성된 실시예 2의 실험 조건을 사용하여, 최종의 항온처리 직전에 각각의 폴리크로날 항체를 무혈청의 DH-배지(500 ㎕/웰)중에 첨가하고, 본 발명의 폴리펩티드의 형태형성 촉진작용에 미치는 상기 각 항체의 영향을 조사하였다. 결과를 표 1 및 도 4 내지 도 11에 나타낸다. 표중, (++)은 형태형성이 진행한 것을 나타내고, (+)은 형태형성이 80% 저해된 것을 나타내고, (-)은 형태형성이 100% 저해된 것을 나타낸다. 도 4 내지 도 11은, 배양 11일의 세포 및 이의 세포로부터 발생한 조직을 현미경하에 촬영한 결과를 나타내는 사진이다. 도 4는 대조군(DH-배지만)의 결과를 나타내고, 도 5는 겔중에 본 발명의 폴리펩티드(H1, 3 ㎍/mL)를 첨가하여 배양한 결과를 나타낸다. 도 6, 도 7, 및 도 8은 항 H1 항체를 각각 5.2 ㎍/mL, 26 ㎍/mL, 및 130 ㎍/mL의 농도에서 첨가한 경우의 결과를 나타내고, 도 9, 도 10 및 도 11은 항 H3 항체를 각각 5.2 ㎍/mL, 26 ㎍/mL, 및 130 ㎍/mL의 농도로 첨가한 경우의 결과를 나타내고 있다. 사진은 어느 것이라도 등배율(40배)로 촬영하였다.

이들의 결과로부터 명백하듯이, 항 H1 항체는 본 발명의 폴리펩티드(H1)의 MDCKII 세포에 대한 형태형성 유도활성을 농도의존적으로 저해하지만, 항 H3 항체는 상기 형태형성 유도활성에 대한 저해작용을 갖지 않는다. 이러한 사실로부터, 실시예 2의 실험에서 관찰된 형태형성 촉진작용은, 예를 들면 대장균의 불순물등에서 유래하는 것이 아니고, 본 발명의 폴리펩티드(H1) 자체의 작용에 기인하는 것인 것이 증명되었다. 또한, 본 발명의 항 H1 항체가 폴리펩티드 H1의 에피모르핀과 유사한 형태형성 촉진작용을 효율적으로 저해한다는 사실로부터, 이의 항체가 에피모르핀의 과잉발현에 기인하는 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 의약으로서 유용하다는 사실도 증명되었다.

실시예 5

세포증식에 대한 본 발명의 폴리펩티드의 작용

실시예 1에서 제조한 본 발명의 폴리펩티드의 세포증식에 대한 효과를 다음과 같이 평가하였다. 배지로서 무혈청의 DH-배지 또는 0.003 내지 0.15 mg/mL의 본 발명의 폴리펩티드를 용해시킨 무혈청의 DH-배지를 사용하고, 조직 배양용의 24 웰 디쉬에 12,000 세포/mL가 되도록 MDCKII 세포를 뿌렸다. 37℃의 5% 탄산 기체 항온기중에서 5일간 배양한 후, 배지를 제거하여 PBS(-)에서 2회 세정하였다. 트립신-EDTA에서 세포를 웰 바닥으로부터 벗겨낸 후, 트리판 블루(trypan blue)로 염색하여 생세포를 계수하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, MDCKII 세포를 무혈청 배지에서 단층배양한 경우에는, 배양액에 본 발명의 폴리펩티드를 첨가하지 않으면 5일 후에는 약 1/10로 생세포가 감소하였다(대조군). 한편, 배양액에 본 발명의 폴리펩티드를 첨가한 경우는, 무혈청 배지에 관계없이, 첨가한 본 발명 폴리펩티드의 농도에 의존하여 MDCKII 세포의 증식이 유도되었다. 본 발명의 폴리펩티드 0.075 mg/mL을 배양액에 첨가한 경우, 5일간 배양한 후에는 배양 개시시와 비교하여 10배 이상의 생세포가 존재하는 것이 확인되지만, 이러한 결과는 10% 소 태아혈청 첨가의 효과에 필적하는 것이고, 본 발명의 폴리펩티드가 극히 강한 세포증식 활성을 갖는다는 것이 밝혀지게 되었다.

본 발명의 폴리펩티드는 생리식염수 등의 수성 매체에 가용성이고, 상피조직에 대한 형태형성 촉진작용을 갖고 있기 때문에, 형태형성의 이상에 기인하는 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하는 의약의 유효성분 등에 유용하다.

Claims

서열목록의 서열번호: 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
제 1 항에 있어서,

아미노산 서열중 1개 또는 2개 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 상피세포에 대한 형태형성 촉진작용을 갖는 폴리펩티드.
제 2 항에 있어서,

상피세포에 대한 형태형성 촉진작용이 천연형 에피모르핀과 유사한 작용인 폴리펩티드.
제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,

세포증식작용을 추가로 갖는 폴리펩티드.
제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서,

아미노산 서열중 아미노산 잔기가 당류, 지질류, 인산기로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상으로 변형되는 폴리펩티드.
제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드를 유효성분으로 하는 의약.
제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드를 유효성분으로 하는, 형태형성인자의 과소발현에 기인하는 질환을 치료하고/치료하거나 예방하기 위한 의약.
제 7 항에 있어서,

형태형성 인자가 에피모르핀인 의약.
제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드를 유효성분으로 하는, 조직 또는 기관의 파괴를 수반하는 질환을 치료하고/치료하거나 예방하기 위한 의약.
제 9 항에 있어서,

질환이 신장 질환인 의약.
제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드를 유효성분으로 하는 모 성장촉진제.
서열목록의 서열번호: 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
제 12 항에 있어서,

아미노산 서열중 1개 또는 2개 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 상피세포에 대한 형태형성 촉진작용을 갖는 폴리펩티드.
제 13 항에 있어서,

상피세포에 대한 형태형성 촉진작용이 천연형 에피모르핀과 유사한 작용인 폴리펩티드.
제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,

세포증식작용을 추가로 갖는 폴리펩티드.
제 12 항 내지 제 15 항중 어느 한 항에 있어서,

아미노산 서열중 아미노산 잔기가 당류, 지질류, 인산기로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상과 결합하는 폴리펩티드.
제 12 항 내지 제 16 항중 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드를 유효성분으로 하는 의약.
제 12 항 내지 제 16 항중 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드를 유효성분으로 하는, 형태형성인자의 과소발현에 기인하는 질환을 치료하고/치료하거나 예방하기 위한 의약.
제 18 항에 있어서,

형태형성인자가 에피모르핀인 의약.
제 12 항 내지 제 16 항중 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드를 유효성분으로 하는, 조직 또는 기관의 파괴를 수반하는 질환을 치료하고/치료하거나 예방하기 위한 의약.
제 20 항에 있어서,

질환이 신장 질환인 의약.
제 12 항 내지 제 16 항중 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드를 유효성분으로 하는 모 성장촉진제.
제 4 항 또는 제 15 항에 따르는 폴리펩티드를 포함하는 세포배양배지.
제 1 항 내지 제 5 항 및 제 12 항 내지 제 16 항중 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드에 대한 항체.
제 24 항에 있어서,

폴리펩티드의 형태형성 촉진작용 또는 세포증식작용을 저해하는 항체.
제 24 항에 있어서,

코일드코일 영역(1)을 갖는 에피모르핀류에 특이적으로 결합하고, 상피세포에 대한 상기 에피모르핀류의 형태형성 촉진작용 또는 세포증식작용을 저해하는 항체.
제 24 항 또는 제 26 항에 따르는 항체를 유효성분으로 하는 의약.
제 27 항에 있어서,

에피모르핀 발현과다에 기인하는 질환을 치료하거나 예방하기 위한 의약.
제 24 항 또는 제 26 항에 따르는 항체를 유효성분으로 하는 모 성장촉진제.