JP2003116587A - ポリペプチド及び同じものをコードしている核酸 - Google Patents

ポリペプチド及び同じものをコードしている核酸

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JP2003116587A JP2002303638A JP2002303638A JP2003116587A JP 2003116587 A JP2003116587 A JP 2003116587A JP 2002303638 A JP2002303638 A JP 2002303638A JP 2002303638 A JP2002303638 A JP 2002303638A JP 2003116587 A JP2003116587 A JP 2003116587A
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は概して、新規のＤＮＡの同定及び
単離、並びに当該ＤＮＡによりコードされる新規のポリ
ペプチドの組換え体製造に関する。 【解決手段】 本発明は新規のポリペプチドとそれらポ
リペプチドをコードしている核酸分子に向けられる。ま
た、それらの核酸配列を含むベクターと宿主細胞、異種
ポリペプチド配列に融合した本発明のポリペプチドを含
むキメラポリペプチド分子、本発明のポリペプチドに結
合する抗体及び本発明のポリペプチドの製造方法もここ
に提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は概して、新規のＤＮ
Ａの同定及び単離、並びに当該ＤＮＡによりコードされ
る新規のポリペプチドの組換え体製造に関する。
【０００２】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】細胞外タ
ンパク質は、多細胞生物の形成、分化、及び維持に重要
な役割を演じている。多くの個々の細胞の成り行き、た
とえば増殖、移行、分化又は他の細胞との相互作用は、
典型的には他の細胞及び／又は隣接した環境からの情報
によって決定されている。この情報は分泌されるポリペ
プチド（例えば分裂促進因子、生存因子（survival fac
tors）、細胞毒性因子、分化因子、神経ペプチド、ホル
モン）により伝達されることが多いが、これは次に多様
な細胞レセプター又は膜結合性タンパク質により受容さ
れて翻訳される。これら分泌されたポリペプチド又は信
号伝達分子は通常、細胞性の分泌経路を通って、細胞外
環境の自身の活性部位に到達する。
【０００３】分泌されたタンパク質には種々の工業的適
用性があるが、これには薬剤、診断、バイオセンサー、
及びバイオリアクターが含まれる。現在入手可能なタン
パク質薬剤の多く、例えば血栓溶解薬、インターフェロ
ン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー形
成活性化因子、及び他の種々のサイトカインは、分泌性
のタンパク質である。これらのレセプターは膜タンパク
質であるが、これは治療剤又は診断薬としての可能性を
有している。産業界及び学術界の双方ともに、新規の天
然の分泌性タンパク質を同定する努力を行っている。多
くの研究においては、哺乳動物の組換えＤＮＡライブラ
リーをスクリーニングして、新規の分泌性タンパク質の
コード配列を同定することに焦点をあてている。スクリ
ーニングの方法及び技術の例は、文献に記載されている
（例えば、Kleinら, Proc.Natl.Acad,Sci.,93:7108-711
3(1996); 米国特許第5536637号を参照）。
【０００４】膜に結合したタンパク質及びレセプター
は、多細胞生物の形成、分化、及び維持において重要な
役割を演じている。多くの個々の細胞の成り行き、たと
えば増殖、移行、分化又は他の細胞との相互作用は、典
型的には他の細胞及び／又は隣接した環境からの情報に
よって決定されている。この情報は分泌されるポリペプ
チド（例えば分裂促進因子、生存因子（survival facto
rs）、細胞毒性因子、分化因子、神経ペプチド、ホルモ
ン）により伝達されることが多いが、これは次に多様な
細胞レセプター又は膜結合性タンパク質により受容され
て解釈される。このような膜に結合したタンパク質及び
細胞レセプターには、サイトカインレセプター、レセプ
ターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞-細胞
相互作用に関与するレセプター、及びセレクチンやイン
テグリン等の細胞付着分子が含まれるが、これらには限
定されない。例えば、細胞の増殖及び分化を制御する信
号の変換は、一部には種々の細胞性タンパク質のリン酸
化により制御されている。プロテインチロシンキナーゼ
は、そのプロセスを触媒する酵素であるが、これはまた
増殖因子レセプターとしても作用する。実例には、線維
芽細胞増殖因子レセプター、及び神経増殖因子レセプタ
ーが含まれる。
【０００５】膜に結合したタンパク質及びレセプター分
子には、種々の工業的適用性があり、これには薬剤及び
診断薬が含まれる。レセプター免疫付着因子は例えば、
レセプター−リガンド相互作用を阻止する治療薬として
使用することができる。膜に結合したタンパク質はま
た、関連したレセプター／リガンド相互作用の潜在的な
ペプチド性又は小分子性の阻害剤のスクリーニングに使
用することができる。産業界及び学術界の双方ともに、
新規の天然のレセプタータンパク質を同定する努力をし
ている。これらの研究の多くは、哺乳動物の組換えＤＮ
Ａライブラリーをスクリーニングして新規のレセプター
タンパク質のコード配列を同定することに焦点を当てて
いる。
【０００６】本願では、新規の分泌性及びトランスメン
ブレンポリペプチド、並びに当該ポリペプチドをコード
する新規の核酸の同定及び特徴付けを記載する。
【０００７】１.ＰＲＯ２４１ 軟骨組織は、コラーゲン繊維のネットワークが密であ
り、プロテオグリカンが高含量の大型の細胞外マトリッ
クスを有する特殊な結合組織である。軟骨組織中のプロ
テオグリカンの大部分は、アグリカン（aggrecan）であ
るが、これには多くの硫酸コンドロイチン及び硫酸ケラ
チンの鎖が含まれていて、連結タンパク質でヒアルロナ
ン（hyaluronan）に結合することにより多分子凝集物を
形成するが、一方、軟骨組織にはまた、数多くの小分子
量のプロテオグリカンが含まれている。これらの小分子
量プロテオグリカンのうちの一つは、ビグリカン（bigl
ycan）と呼ばれるタンパク質であるが、これは他の種々
の軟骨組織（腱、強膜、皮膚等が含まれる）の細胞外マ
トリックスに広く分布しているプロテオグリカンであ
る。ビグリカンは、ロイシン富反復配列と、二つの硫酸
コンドロイチン／硫酸デルマタン鎖であって、フィブロ
ネクチンの細胞結合性領域に結合してそれへの細胞付着
を阻害する機能があることが知られている。ビグリカン
等の小分子量プロテオグリカンが、軟骨組織の増殖及び
／又は修復、並びに関節炎等の縮退性疾患において重要
な役割を演じていることが推論されている。このように
して、ビグリカンに対しての相同性を有する新規のポリ
ペプチドを同定して特徴づけることに興味が持たれてい
る。
【０００８】本願では、ビグリカンに対する相同性を有
する新規のポリペプチドを同定及び特徴付けすることを
記載するが、ここではそのポリペプチドをＰＲＯ２４１
ポリペプチドと呼ぶ。
【０００９】２．ＰＲＯ２４３ （アフリカツメガエルの）コルディン（chordin）（Xch
r）は、潜在的に背側化（dorsalizing）活性を有してい
るシュペーマン編成原（Spermann organizer）により分
泌される可溶性因子である（Sasaiら、Cell 79:779-90
(1994);Sasaiら、Nature 376:333-36(1995)）。その編
成原により分泌される他の背側化因子には、ノギン（no
ggin）（SmithとHarlan,Cell 70:829-840(1992) Lamb
ら、Science 262:713-718(1993)）及びフォリスタチン
（follistatin)（Hemmanti-Brivanlouら、Cell 77:283-
295(1994)）がある。コルディンは、原始外胚葉を、神
経対非神経領域に細分化して、中胚葉の背側化により脊
索形成及び筋形成を誘導する。これは、腹側化性（vent
ralizing）ＢＭＰ−４シグナルのアンタゴニストとして
機能することにより起こる。この阻害は、コルディンが
細胞外空間においてＢＭＰ−４に直接的に結合すること
により介在されるが、それによってＢＭＰ−４によるＢ
ＭＰ−４レセプターの活性化を阻止する（Piccoloら、D
evelop.Biol.182:5-20(1996))。
【００１０】ＢＭＰ−４は、胚の腹側から勾配がかかっ
て発現しているが、一方、コルディンは、ＢＭＰ−４の
ものとは相補的な勾配で発現している。コルディンはＢ
ＭＰ−４を拮抗して、ＢＭＰ−４勾配の低い側の末端を
確立する。従って、コルディンからのシグナル、及び他
の編成原により誘導される因子の間の釣り合いと、ＢＭ
Ｐシグナルとの対比によって、外胚葉性胚葉が、その腹
側−背側位置情報とともに提供される。コルディンはま
た、中枢神経系の腹側−背側パターン形成にも関与する
ことがある（Sasaiら、Cell 79:779-90(1994)）。これ
は更に、前方神経組織（前脳タイプ）を排他的に誘導
し、これにより神経タイプを前方化（anteriorizing）
する（Sasaiら、Cell 79:779-90(1997)）。ニューロン
の誘導とパターン形成において関与するので、コルディ
ンは神経退行性疾患、及び神経損傷、例えば外傷による
もの、又は化学療法後におけるものの治療に有益である
かもしれない。
【００１１】本願では、コルディンに相同性のある新規
のポリペプチドの同定及び特徴付けを記載するが、ここ
では当該ポリペプチドをＰＲＯ２４３ポリペプチドと称
す。
【００１２】３．ＰＲＯ２９９ 切痕（notch）タンパク質は、発生におけるシグナリン
グに関与する。このタンパク質は非対称な発生のポテン
シャルに影響し、発生に関与する他のタンパク質の発現
の引き金となる（Robey,E.,Curr.Opin.Genet.Dev.,7
(4):551(1997)，Simpson,P.,Curr.Opin.Genet.Dev.7
(4):537(1997)，Blobel,CP.,Cell 90(4):589(1997)，Na
kayama, H.ら、Dev.Genet.,21(1):21(1997)，Nakayama
H.ら、Dev.Genet.,21(1):21(1997)，Sullivan,S.A.ら、
Dev. Genet., 20(3):208 (1997)，及びHayashi, H.
ら、Int.J.Dev.Biol.,40(6):1089(1996)を参照）。切痕
のセラーテ（Serrate）介在性活性化が、ショウジョウ
バエの翅の成虫盤の背側区画において観察されている
（Flemingら、Development,124(15):2973(1997)）。切
痕は、発生における役割、及びシグナリング能力の両方
において興味深い。発生及び／又はシグナリングにおい
て役割を有する新規のポリペプチドもまた、興味深い。
【００１３】本願では、切痕タンパク質に相同性のある
新規のポリペプチドの同定及び特徴付けを記載するが、
ここではそのポリペプチドをＰＲＯ２９９ポリペプチド
と称す。
【００１４】４． ＰＲＯ３２３ ジペプチダーゼは、非常に多様な異なるジペプチドを開
裂する酵素性タンパク質であって、哺乳動物及び哺乳動
物以外の生物において非常に重要な数多くの生物学的プ
ロセスに関与するものである。多様な異なる哺乳動物及
び哺乳動物以外の生物から、数多くの異なるジペプチダ
ーゼが同定され、また特徴付けられている。哺乳動物の
ジペプチダーゼは、数多くの生物学的プロセスにおいて
重要な役割を有するが、これには例えば、タンパク質の
消化、活性化、不活化、又はジペプチドホルモン活性の
調節、並びにタンパク質及び酵素の物理的特徴の変化が
含まれる。
【００１５】ジペプチダーゼ酵素が有する重要な生理学
的役割に鑑み、産業界及び学術界の双方は、新規の天然
のジペプチダーゼの相同物を同定する努力をしている。
多くの研究においては、哺乳動物の組換えＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングして、新規の分泌性且つ膜結合
型のレセプタータンパク質のコード配列を同定すること
に焦点をあてている。スクリーニングの方法及び技術の
例が、文献に記載されている（例えばKleinら、Proc.Na
tl.Acad.Sci.,93:7108-7113(1996) ; 米国特許第553663
7号を参照）。
【００１６】本願では、種々のジペプチダーゼ酵素に相
同性である新規のポリペプチドであるＰＲＯ３２３ポリ
ペプチドの同定及び特徴付けを記載する。
【００１７】５．ＰＲＯ３２７ 下垂体前葉ホルモンプロラクチンは、数多くの成長ホル
モン／プロラクチン／胎盤性ラクトゲンの遺伝子ファミ
リーによりコードされている。哺乳動物においてはプロ
ラクチンは主として、乳汁分泌及び乳腺の発達の原因と
なっている。プロラクチンは、遺伝子転写及びｍＲＮＡ
の半減期の双方を増大することにより乳タンパク質の遺
伝子発現を刺激するように機能する。
【００１８】プロラクチンタンパク質の生理学的影響
は、プロラクチンが細胞表面のプロラクチンレセプター
に結合する能力を通じて介在される。プロラクチンレセ
プターは、種々の異なる細胞種において見られ、また約
４００００の分子量を有し、ジスルフィド結合により、
それ自身又は他のサブユニットとは明らかに結合してい
ない。プロラクチンレセプターのレベルは、研究対象の
組織に応じて異なった制御のされかたをしている。
【００１９】細胞表面レセプター分子は、インビボで重
要な生理学的役割を有するので、産業界及び学術界はと
もに新規の天然の膜結合性レセプタータンパク質を同定
することに現在注力しているが、この中にはプロラクチ
ンレセプターと相同性のある配列を有すものが含まれ
る。これらの研究の多くは、哺乳動物の組換えＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングして、新規の膜結合性レセ
プタータンパク質のコード配列を同定することに焦点を
あてている。スクリーニングの方法及び技術の例は、文
献に記載されている（例えばKleinら、Proc.Natl.Acad.
Sci.,93:7108-7113(1996); 米国特許第5536637号を参
照）。
【００２０】本願では、プロラクチンレセプタータンパ
ク質に高い相同性を示す新規のポリペプチドであるＰＲ
Ｏ３２７ポリペプチドの同定及び特徴付けを記載する。
【００２１】６．ＰＲＯ２３３ 細胞の酸化還元状態が細胞の成り行きに関しての重要な
決定要素であることが研究報告されている。更に、反応
性の酸素種が、細胞毒性であって炎症性疾患を引き起こ
すが、これには組織の壊死、器官不全、アテローム性動
脈硬化症、不妊症、出生時欠損、早期老化、突然変異及
び悪性腫瘍が含まれる。従って、酸化と還元の制御は、
数多くの理由により重要であるが、これには卒中、心臓
発作、酸化ストレス及び高血圧症を制御及び予防するこ
とが含まれる。
【００２２】酸素のフリーラジカル及び抗酸化剤は、脳
虚血及び再潅流後の中枢神経系において重要な役割を有
することがわかっている。更に、心臓障害は、虚血及び
再潅流に関係付けられるが、これはフリーラジカルの作
用により引き起こされることが報告されている。この点
において、還元酵素、特にはオキシドレダクターゼは興
味深いものである。更に、転写因子、ＮＦ−カッパＢ及
びＡＰ−１は酸化還元状態により制御され、ＡＩＤＳ、
癌、アテローム性動脈硬化症、及び糖尿病合併症の病原
性に関与すると考えられている多様な遺伝子の発現に影
響することが知られている。この主題について更に記載
している刊行物には、Kelseyら、Br.J.Cancer,76(6):85
2-854(1997); FriedrichとWeiss, J.Theor.Biol.,187
(4):529-540(1997); Pieulleら、J.Bacteriol.,179(1
8):5684-5692(1997)が含まれる。インビボでの酸化還元
反応の生理学的重要性に鑑み、酸化還元反応に関与する
新規の天然のタンパク質を同定する研究が現在進行中で
ある。本願では、酸化還元酵素に相同性である新規のポ
リペプチドであって、ＰＲＯ２３３ポリペプチドと本願
で称するものの同定及び特徴付けを記載する。
【００２３】７．ＰＲＯ３４４ 補体タンパク質は、血清タンパク質の大きな群を具備す
るが、その中のいくつかは酵素カスケードにおいて活性
であり、炎症に関与するエフェクター分子を産生する。
この補体タンパク質は、炎症に関与する細胞の移行と機
能を制御することにおいて生理学的に特に重要である。
炎症及びインビボでの関連した機構の生理学的重要性に
鑑み、炎症に関与する新規の天然のタンパク質を同定す
る研究が現在進行中である。本願では、補体タンパク質
に相同性がある新規のポリペプチドであって、本願でＰ
ＲＯ３４４ポリペプチドと称するものの同定及び特徴付
けについて記載する。
【００２４】８．ＰＲＯ３４７ システイン富タンパク質は一般には、複雑な三次元構造
を有し、及び／又はジスルフィド架橋を形成することが
可能な数多くのシステイン残基が存在することにより多
量体として存在するタンパク質である。
【００２５】９．ＰＲＯ３５４ インター-アルファ-トリプシンインヒビター（ＩＴＩ）
は、多くの哺乳動物の種において見られる、大型（Ｍｒ
がほぼ２４００００）の循環性プロテアーゼインヒビタ
ーである。この無傷のインヒビターは糖タンパク質であ
り、強力なグリコサミノグリカン結合により相互作用す
る３つのグリコシル化サブユニットからなる。ＩＴＩの
抗-トリプシン活性は、複合体の最小のサブユニット
（即ち軽鎖）に位置するが、ここで軽鎖は現在、ビクニ
ン（bikunin）として知られている。成熟した軽鎖は、
２１アミノ酸のＮ末端配列からなり、Ｓｅｒ-１０でグ
リコシル化され、その後にタンデムなカニッツ（Kunit
z）タイプの領域が二つあって、そのうちの最初のもの
はＡｓｎ-４５でグリコシル化されていて、そのうちの
第二のものはトリプシン、キモトリプシン、及びプラス
ミンを阻害することができる。ＩＴＩ複合体の残りの二
つの鎖は、当該複合体の酵素的に活性な軽鎖と相互作用
するように機能する重鎖である。
【００２６】産業界及び学術界はともに、新規の天然の
タンパク質を同定する研究を行っている。多くの研究
は、哺乳動物の組換えＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングして、新規の分泌性、且つ膜結合型のレセプタータ
ンパク質のコード配列を同定することに焦点をあててい
る。スクリーニングの方法及び技術は、文献に記載され
いている（例えばKleinら、Proc.Natl.Acad.Sci.,93:71
08-7113(1996);米国特許第5536637号を参照）。本願で
は、ＩＴＩ重鎖に高い相同性を有する新規のポリペプチ
ドであって、本願でＰＲＯ３５４ポリペプチドと称する
ものの同定及び特徴付けを記載する。
【００２７】１０．ＰＲＯ３５５ 細胞毒性又は制御性Ｔ細胞連結分子、又は「ＣＲＴＡ
Ｍ」タンパク質は、免疫グロブリンスーパーファミリー
と構造的に関連している。このＣＲＴＡＭタンパク質は
種々の免疫反応を介在することができるはずである。抗
体は、概して高親和性でＣＲＴＡＭに結合する（Zlotni
k,A.,Faseb,106(6):A1037,Abr.216,1996年6月）。Ｔ細
胞抗原、及びインビボでの免疫プロセスの生理学的重要
性に鑑み、免疫反応に関与する新規の天然のタンパク質
を同定する研究が現在進行中である。Kennedyら、米国
特許第5686257(1997)も参照。本願では、ＣＲＴＡＭに
相同性である新規のポリペプチドであって、本願ではＰ
ＲＯ３５５ポリペプチドと称すものの同定及び特徴付け
について記載する。
【００２８】１１．ＰＲＯ３５７ タンパク質-タンパク質相互作用には、レセプターと抗
原との複合体、並びにシグナリング機構が含まれる。タ
ンパク質-タンパク質相互作用の基礎となる構造的及び
機能的機構がよりわかるにつれて、タンパク質-タンパ
ク質相互作用をより容易に操作してタンパク質-タンパ
ク質相互作用の特定の結果を制御することが容易にな
る。従って、タンパク質-タンパク質相互作用の基礎と
なる機構は、科学的にいっても、医学的にいっても興味
深い。
【００２９】ロイシン富反復配列を含むタンパク質は全
て、タンパク質-タンパク質相互作用に関与すると考え
られる。ロイシン富反復配列は、機能と細胞の位置とが
ともに多様である数多くのタンパク質中に存在する短い
配列モチーフである。リボヌクレアーゼインヒビタータ
ンパク質の結晶構造は、ロイシン富反復配列がベータ-
アルファ構造単位に対応することを示している。これら
の単位は、一の表面が溶媒に露出して、平行なベータシ
ートを形成するようにして配列し、当該タンパク質が異
常な非球状形態を獲得する。これらの二つの特徴は、ロ
イシン富反復配列のタンパク質結合性機能の原因となっ
ていることが示されている。KobeとDeisenhofer,Trends
Biochem.Sci.,19(10):415-421(1994年10月)を参照。
【００３０】組織編成機能を有し、個体発生中にコラー
ゲン繊維の方向付け及び配置を行うものであって、創傷
治癒、組織修復、及び腫瘍間質形成等の病理学的プロセ
スに関与するロイシン富プロテオグリカンについての研
究が報告されている（Iozzo,R.V.,Crit.Rev.Biochem.Mo
l.Biol.,32(2):141-174(1997)）。ロイシン富タンパク
質が、創傷治癒や組織修復に関連するとした他の研究に
は、出血性疾患であるベルナール-スリエ症候群に関連
した複合体中のロイシン富モチーフ中に変異があること
が報告されているDe La Salle.C.ら、Vouv.Rev.Fr.Hema
tol.(ドイツ),37(4):215-222(1995)、血小板にはロイシ
ン富反復配列があることが報告されているChelemetson,
K.J.,Thromb.Haemost.(ドイツ),74(1):111-116 (1995年
7月)、形質転換増殖因子βへのデコリン（decorin）の
結合が、癌の治療、創傷治癒及び傷跡に影響を与えるこ
とが報告されているLa Jolla Cancer Reseach Foundati
onのRuoslahti, E.I.ら、WO9110727-Aがある。このグル
ープのタンパク質の機能により関連付けられるものに
は、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）があるが、これは
創傷治癒に有益であり、結合組織、皮膚、及び骨等の組
織の再増殖に関する治療に関係し、また、ヒト及び動物
の体の成長を促進し、更には他の増殖関連プロセスを刺
激するからである。ＩＧＦの酸不安定サブユニット（Ａ
ＬＳ）は、ＩＧＦの半減期を増大し、またインビボでの
ＩＧＦ複合体の一部であることから興味が持たれる。
【００３１】ロイシン富反復配列を有することが報告さ
れている別のタンパク質には、アルツハイマー病や、パ
ーキンソン病等における神経障害等の神経退行性疾患の
治療や、癌の診断に有益であることが報告されているＳ
ＬＩＴタンパク質がある（Yale University,Artavanist
sakonas,S.とRothberg,J.M., WO9210518-A1を参照）。
膜糖タンパク質であってマウスの脳のグリア細胞内で特
異的に発現し、ロイシン富反復配列及び免疫グロブリン
様領域を有しているＬＩＧ−１もまた興味が持たれてい
る（Suzukiら、J.Biol.Chem.(U.S.),271(37):22522(199
6)）。ロイシン富反復配列を有するタンパク質の生物学
的機能について報告している他の研究には以下のものが
含まれる：Tayar,N.ら、Mol.Cell Endocrinol.,(アイル
ランド),125(1-2):65-70(1996年12月)（精線刺激ホルモ
ンの関与）；Miura,Y.ら、日本臨床 (日本),54(7):1784
-1789 (1996年7月)（アポトーシスの関与）；Harris,P.
C.ら、J.Am.Soc.Nephrol.,6(4):1125-1113(Oct. 1995年
10月)（腎臓疾患の関与）。
【００３２】従って、産業界及び学術界はともに、タン
パク質-タンパク質相互作用をより良く理解するため
に、ロイシン富反復配列を有する新規のタンパク質を同
定する研究を行っている。特に興味深いのは、ロイシン
富反復配列を有し、例えばインスリン様増殖因子の酸不
安定サブユニット等の、ロイシン富反復配列を有する既
知のタンパク質に相同的であるタンパク質である。多く
の研究が、哺乳動物の組換えＤＮＡライブラリーのスク
リーニングを行って、ロイシン富反復配列を有する新規
の分泌性、且つ膜結合型のタンパク質のコード配列を同
定することに焦点をあてている。スクリーニングの方法
及び技術は、文献に記載されている（例えばKleinら、P
roc.Natl.Acad.Sci.,93:7108-7113(1996)；米国特許第5
536637号を参照）。
【００３３】本願では、インスリン様増殖因子の酸不安
定サブユニットと相同性が高い新規のポリペプチドであ
って、本願ではＰＲＯ３５７ポリペプチドと称するもの
の同定及び特徴付けを記載する。
【００３４】１２．ＰＲＯ７１５ 哺乳動物における細胞数の制御は、一部には細胞増殖と
細胞死との間のバランスにより決定されるものと考えら
れている。細胞死の一の形態は、時として壊死性細胞死
と呼ばれるものであって、ある種の外傷や細胞障害から
生じる細胞の病理学的形態により典型的に特徴付けられ
るものである。対照的に、別の「生理学上の」細胞死の
形態であって、通常は整然とした、又は制御された方法
で進行するものがある。この整然とした、又は制御され
た形態の細胞死は「アポトーシス」と呼ばれる（例え
ば、Barrら、Bio/Technology,12:487-493(1994)；Stell
erら、Science,267:1445-1449(1995)）。アポトーシス
性の細胞死は、多くの生理学的プロセスにおいて自然と
起こるものであるが、これには胚の発生、免疫系におけ
るクローン選択が含まれる（Itohら、Cell,66:233-243
(1991)）。アポトーシス性細胞死のレベルの低下は、
癌、狼瘡、ヘルペスウイルス感染等の種々の病理学的状
態に関連している（Thompson,Science,267:1456-1462(1
995)）。アポトーシス性細胞死のレベルの増大は、ＡＩ
ＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側
索萎縮症、多発性硬化症、色素性網膜炎、小脳退縮、再
生不良性貧血、心筋梗塞症、卒中、再潅流障害、及び毒
素誘導性肝臓疾患等の種々の病理的状態に関連する可能
性がある（上記のThompsonを参照）。
【００３５】アポトーシス性細胞死は、典型的には細胞
における一以上の形態学的又は生化学的変化を伴ってい
るが、これには例えば、原形質の凝結、細胞質膜微小絨
毛の喪失、核の分割、染色体ＤＮＡの分解、又はミトコ
ンドリア機能の喪失等がある。種々の外来性及び内因性
のシグナルが、このような形態学的及び生化学的細胞変
化を誘発、又は誘導すると考えられている（Raff,Natur
e,256:397-400(1992)；Steller,上記; Sachsら、Blood,
82:15(1993)）。例えば、これらは未成熟な胸腺細胞の
グルココルチコイドホルモン等のホルモン刺激により誘
発される（Watanabe-Fukunagaら、Nature,356:314-317
(1992)）。また、ｍｙｃ、ｒｅｌ、及びＥ１Ａ等の同定
した癌遺伝子のいくつか、ｐ５３等の腫瘍抑制因子は、
アポトーシスの誘導にかかわることが報告されている。
ある種の化学療法剤、及び放射線のある形態のものは、
同様にアポトーシス誘導活性があることが観察されてい
る（上記のThompson）。
【００３６】種々の分子、例えば腫瘍壊死因子-α（"TN
F-α"）、腫瘍壊死因子−β（"TNF-β"又は"リンホトキ
シン-α"）、リンホトキシン-β（"LT-β"）、ＣＤ３０
リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ
-４０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガン
ド（Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも呼ばれ
る）、及びＡｐｏ-２リガンド（ＴＲＡＩＬとも呼ばれ
る）は、サイトカインの腫瘍壊死因子（"TNF"）ファミ
リーのメンバーであることが同定された（GrussとDowe
r,Blood,85:3378-3404(1995);Pittiら、J.Biol.Chem.,2
71:12687-12690(1996); Wileyら、Immunity,3:673-682
(1995);Browningら、Cell,72:847-856(1993);Armitage
ら、Nature,357:80-82(1992)）。これらの分子の中で
は、ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β、ＣＤ３０リガンド、４-Ｉ
ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド、及びＡｐｏ-２リガ
ンド（ＴＲＡＩＬ）が、アポトーシス性細胞死に関与す
ることが報告されている。ＴＮＦ-αとＴＮＦ-βとはと
もに、感受性の腫瘍細胞においてアポトーシス性細胞死
を誘導することが報告されている（Schmidら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.,83,1881(1986); Deltryら、Eur.J.Immuno
l.,17,:689(1987)）。Zhengらは、ＴＮＦ-αがＣＤ８陽
性Ｔ細胞の刺激後アポトーシスに関与することを報告し
ている（Zhengら、Nature,377,348-351(1995)）。ＣＤ
３０リガンドが、胸腺における自己反応性Ｔ細胞の削除
に関与することが、他の研究者らにより報告されている
（Amakawaら、Cold Spring Habor Laboratory Symposiu
m on Programmed Cell Death,Abst.No.10,(1995)）。
【００３７】マウスのＦａｓ／Ａｐｏ-１レセプター又
はリガンド遺伝子（それぞれlpr、gldと呼ばれる）にお
ける変異は、いくつかの自己免疫疾患に関連している
が、これはＡｐｏ-１リガンドが、末梢における自己反
応性リンパ球のクローン的削除において役割を演じてい
る可能性を示している（Krammerら、Curr.Op.Immunol.,
6:279-289(1994); Nagataら、Science,267:1449-1456(1
995)）。Ａｐｏ-１リガンドはまた、ＣＤ４陽性Ｔリン
パ球及びＢリンパ球における刺激後のアポトーシスを誘
導し、その機能がもはや必要とされない活性化リンパ球
の除去に関与することが報告されている（Krammerら、
上記、Nagataら、上記）。Ａｐｏ-１レセプターに特異
的に結合する作動薬的マウスモノクローナル抗体は、細
胞殺傷活性を呈することが報告されているが、これはＴ
ＮＦ-αにおけるものに匹敵するか又は同等である（Yon
eharaら、J.Exp.Med.,169:1747-1756 (1989)）。
【００３８】このようなＴＮＦファミリーのサイトカイ
ンにより介在される種々の細胞性反応の誘導は、その特
定の細胞レセプターへの結合により開始されると考えら
れている。約５５ｋＤａ（ＴＮＦＲ１）、及び約７５ｋ
Ｄａ（ＴＮＦＲ２）の、二つの別個のＴＮＦレセプター
が同定されている（Hohmanら、J.Biol.Chem.264,14927-
14934(1989); Brockhausら、Proc.Natl.Acad.Sci.,87:3
127-3131(1990);EP 417563、1991年3月20日発行）。こ
の両者のタイプのレセプターに対応するヒト及びマウス
のｃＤＮＡも同定・特徴付けされている（Loetscher
ら、Cell,61:351(1990); Schallら、Cell,61:361(199
0); Smithら、Science,248:1019-1023(1990);Lewisら、
Proc.Natl.Acad.Sci.,88:2830-2834(1991); Goodwin
ら、Mol.Cell.Biol.,11:3020-3026(1991)）。これまで
に同定されているＴＮＦファミリーのリガンドは、リン
ホトキシン-α以外は、ＩＩ型のトランスメンブレンタ
ンパク質であり、そのＣ末端は細胞外にある。対照的
に、これまでに同定されたＴＮＦレセプター（ＴＮＦ
Ｒ）における多くのレセプターは、Ｉ型のトランスメン
ブレンタンパク質である。しかしながら、ＴＮＦリガン
ド及びそのレセプターファミリーの双方においては、フ
ァミリーメンバー間で同定された相同性は、主として細
胞外領域（"ＥＣＤ"）において見いだされている。ＴＮ
Ｆファミリーサイトカインのいくつかには、ＴＮＦ-
α、Ａｐｏ-１リガンド、及びＣＤ４０リガンドが含ま
れるが、これらは細胞表面においてタンパク質的分解に
より開裂され、それぞれの場合に得られるタンパク質
は、典型的には可溶性のサイトカインとして機能するホ
モ三量体分子を形成する。ＴＮＦレセプターファミリー
タンパク質はまた、通常はタンパク分解的に開裂され
て、同起源のサイトカインの阻害剤として機能すること
が可能な、可溶性のレセプターＥＣＤを放出する。
【００３９】最近になって、ＴＮＦＲファミリーの他の
メンバーが同定された。このような、ＴＮＦＲファミリ
ーの新規に同定されたメンバーには、ＣＡＲ１、ＨＶＥ
Ｍ、及びオステオプロテゲリン（osteoprotegerin；Ｏ
ＰＧ）が含まれる（Brojatschら、Cell,87:845-855(199
6); Montgomeryら、Cell,87:427-436(1996); Marsters
ら、J.Biol.Chem.,272:14029-14032(1997); Simonet
ら、Cell,89:309-319(1997)）。他の既知のＴＮＦＲ様
分子とは異なり、Simonetら（上記）は、ＯＰＧが疎水
性のトランスメンブレン-スパンニング配列を全く含ま
ないことを報告している。
【００４０】ＴＮＦファミリーのサイトカイン及びその
レセプターについてのレビューは、上記のGrussとDower
を参照。
【００４１】本明細書においては、腫瘍壊死因子ファミ
リーのメンバーのポリペプチドと相同性を有する新規の
ポリペプチドであって、本願でＰＲＯ７１５ポリペプチ
ドと称すものについての同定及び特徴付けについて記載
する。
【００４２】１３．ＰＲＯ３５３ 補体タンパク質は、その一部が酵素的カスケードで作用
して炎症に関与するエフェクター分子を産生する、一群
の血清タンパク質から構成されている。補体タンパク質
は、炎症に関与する細胞の移行及び機能を制御すること
において特に重要である。インビボにおける炎症及び関
連した機構の生理学的重要性に鑑み、炎症に関与する新
規の天然タンパク質を同定するために現在研究が進行中
である。本願では、補体タンパク質に相同性があり、本
願でＰＲＯ３５３ポリペプチドと称す新規の天然のタン
パク質を同定、及び特徴付けする。
【００４３】１４．ＰＲＯ３６１ ムチンは、発癌に関与することが示唆されている糖タン
パク質のファミリーである。ムチン及びムチン様タンパ
ク質は、正常な細胞及び形質転換した細胞の双方により
分泌される。癌の医学的重要性に鑑み、癌を診断又は治
療するために有益となる新規の天然のタンパク質を同定
する研究が現在進行中である。
【００４４】キチナーゼタンパク質は、植物における病
原性反応において関与が示唆されているファミリーを構
成する。キチナーゼタンパク質は、植物及び微生物によ
り産生され、植物の傷害に対する防御において役割を演
じる可能性がある。植物の防御機構の重要性に鑑み、植
物における病原性関連反応の調節に有益となりうる新規
の天然のタンパク質を同定する研究が現在進行中であ
る。本願では、ムチン及びキチナーゼに相同性の新規の
ポリペプチドであって、本願においてＰＲＯ３６１ポリ
ペプチドと称したものについての同定及び特徴付けを記
載する。
【００４５】１５．ＰＲＯ３６５ ヒト２−１９タンパク質等のポリペプチドは、サイトカ
インとして機能することが可能である。サイトカインと
は、免疫細胞の分化、増殖、又は機能を刺激若しくは阻
害する、低分子量タンパク質のことである。サイトカイ
ンは、細胞内メッセンジャーとして作用することがよく
あり、また多様な生理学的効果を有する。免疫機構のイ
ンビボでの生理学的重要性に鑑み、免疫系への影響に関
与する新規の天然タンパク質を同定する研究が現在進行
中である。本願においては、ヒト２-１９タンパク質に
相同性があり、本願でＰＲＯ３６５ポリペプチドと称す
新規のポリペプチドの同定及び特徴付けを記載する。
【００４６】
【課題を解決するための手段】発明の要約 １．ＰＲＯ２４１ 本願においては、ビグリカンタンパク質に相同性である
新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンが同
定されているが、これは本願においてはＰＲＯ２４１と
呼ぶ。
【００４７】一の態様において、本発明は、ＰＲＯ２４
１ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備する、単離さ
れた核酸分子を提供する。一の例においては、単離され
た核散分子は、図２（配列番号：２）に示されるＰＲＯ
２４１ポリペプチドのアミノ酸残基１乃至３７９をコー
ドしたＤＮＡを具備するか、又はそのようなコードした
核酸配列に相補的であって、少なくとも中等度、そして
適宜高度なストリンジェンシー条件下で安定に結合した
ままであるものである。
【００４８】別の態様において本発明は、単離されたＰ
ＲＯ２４１ポリペプチドを提供する。本発明は特に、単
離された天然のＰＲＯ２４１ポリペプチド配列を提供す
るが、一の態様においてこれは図２（配列番号：２）の
残基１乃至３７９を具備するアミノ酸配列を含んでい
る。本発明の別の態様は、Ｎ末端のシグナルペプチドを
欠失したＰＲＯ２４１ポリペプチドに関するが、ここで
ＰＲＯ２４１ポリペプチドは、全長ＰＲＯ２４１のアミ
ノ酸配列（配列番号：２）のアミノ酸のほぼ１６位乃至
３７９位を具備している。
【００４９】２．ＰＲＯ２４３ 本願では、新規のポリペプチドであって、本願ではＰＲ
Ｏ２４３と称するものをコードしたｃＤＮＡ（ＤＮＡ35
917-1207）が同定されている。
【００５０】一の態様において本発明は、（ａ）図４
（配列番号：７）に示されるアミノ酸２４乃至９５４の
配列を具備するＰＲＯ２４３ポリペプチドをコードした
ＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補足物、
に少なくとも約８０％の配列相同性を有する、単離され
た核酸分子を提供する。配列相同性は好ましくは、約８
５％であり、より好ましくは約９０％、最も好ましくは
約９５％である。一の例において、単離された核酸は、
図４（配列番号：７）に示されるアミノ酸残基１乃至９
５４を有するポリペプチドと少なくとも約８０％、好ま
しくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも
約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列相
同性を有する。好ましくは、最高の相同性は、図４（配
列番号：７）の４つの保存されたシステインクラスター
内（アミノ酸５１乃至１２５；アミノ酸７０５乃至７６
２；アミノ酸７８４乃至８４９；アミノ酸８９７乃至９
３１）で起こる。別の態様においては、単離された核散
分子は、図４（配列番号：７）のアミノ酸残基２４乃至
９５４を有するＰＲＯ２４３ポリペプチドをコードする
ＤＮＡを具備するか、又はそのようなコード性核酸配列
に相補的であって中等度、そして適宜高度なストリンジ
ェンシー条件下でそれに安定に結合したままのものであ
る。別の例において本発明は、ＡＴＣＣ受託番号がＡＴ
ＣＣ209508でＡＴＣＣに寄託されたクローンＤＮＡ3591
7-1207、或いはＡＴＣＣ受託番号がＡＴＣＣ209508で寄
託されたクローンＤＮＡ35917-1207の全長タンパク質の
核酸を提供する。
【００５１】更に別の態様において本発明は、単離され
たＰＲＯ２４３ポリペプチドを提供する。本発明は特
に、単離された天然のＰＲＯ２４３ポリペプチドの配列
を提供するが、これはその一の態様において図４（配列
番号７）の残基２４乃至９５４を具備するアミノ酸配列
を含んでいる。天然のシグナル配列（図４（配列番号：
７）のアミノ酸１乃至２３）を有するか、又は有さず、
そして開始メチオニンを有するか、又は有しない、天然
のＰＲＯ２４３ポリペプチド配列が特に含まれる。或い
は本発明は、受託番号ＡＴＣＣ209508で寄託された核酸
によりコードされるＰＲＯ２４３ポリペプチドを提供す
る。
【００５２】３．ＰＲＯ２９９ 本願では、新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡが
同定されているが、本願では当該ポリペプチドをＰＲＯ
２９９と称す。
【００５３】一の態様において本発明は、ＰＲＯ２９９
ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備する、単離され
た核酸分子を提供する。一の例において、当該単離され
た核酸は、図９（配列番号：１５）のアミノ酸残基１乃
至７３７を有するＰＲＯ２９９ポリペプチドをコードし
たＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコード核
酸配列に対して相補的であり、少なくとも中等度、そし
て適宜高度なストリンジェンシー条件下ではそれに安定
に結合したままのものである。
【００５４】別の態様において本発明は、単離されたＰ
ＲＯ２９９ポリペプチドを提供する。特に本発明は、単
離された天然のＰＲＯ２９９ポリペプチド配列を提供す
るが、一の態様においてこれは、図９（配列番号：１
５）の残基１乃至７３７を具備するアミノ酸配列を含
む。本発明の別の態様は、ＰＲＯ２９９ポリペプチドの
単離された細胞外領域に関する。
【００５５】４．ＰＲＯ３２３ 本願では、ミクロソームジペプチドタンパク質に相同性
を有する新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡクロ
ーンが同定されたが、本願では当該ポリペプチドをＰＲ
Ｏ３２３と称す。
【００５６】一の態様において本発明は、ＰＲＯ３２３
ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備する、単離され
た核酸分子を提供する。一の例において当該単離された
核散分子は、図１３（配列番号：２４）のアミノ酸残基
１乃至４３３を有するＰＲＯ３２３ポリペプチドをコー
ドしたＤＮＡを具備しているか、又はこれはそのような
コード核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中
等度、そして適宜高度なストリンジェンシー条件下でそ
れに安定に結合したままのものである。
【００５７】別の態様において本発明は、単離されたＰ
ＲＯ３２３ポリペプチドを提供する。特に本発明は、単
離された天然のＰＲＯポリペプチド配列を提供するが、
一の態様においてこれは、図１３（配列番号：２４）の
残基１乃至４３３を具備したアミノ酸配列を含む。
【００５８】５．ＰＲＯ３２７ 本願では、プロラクチンレセプターに相同性である新規
のポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンが同定さ
れたが、本願ではこれをＰＲＯ３２７と称す。
【００５９】一の態様において本発明は、ＰＲＯ３２７
ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備する、単離され
た核散分子が提供される。一の例において、当該単離さ
れた核酸は、図１７（配列番号：３２）のアミノ酸残基
１乃至４２２を有するＰＲＯ３２７ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡを具備しているか、又はそのようなコード
核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等度、
そして適宜高度なストリンジェンシー条件下でそれに安
定に結合したままのものである。
【００６０】別の態様において本発明は、ＰＲＯ３２７
ポリペプチドを提供する。特に本発明は、単離された天
然のＰＲＯ３２７ポリペプチド配列を提供するが、一の
態様においてこれは、図１７（配列番号：３２）の残基
１乃至４２２を具備するアミノ酸配列を含む。
【００６１】６．ＰＲＯ２３３ 本願では、新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡク
ローンが同定されたが、本願では当該ポリペプチドをＰ
ＲＯ２３３と称す。
【００６２】一の態様において本発明は、ＰＲＯ２３３
ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備する、単離され
た核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離さ
れた核酸は、図１９（配列番号：３７）のアミノ酸残基
１乃至３００を有するＰＲＯ２３３ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコー
ド核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等
度、そして適宜高度なストリンジェンシー条件下でそれ
に安定に結合したままのものである。
【００６３】別の態様において、本発明は単離されたＰ
ＲＯ２３３ポリペプチドを提供する。特に本発明は、単
離された天然のＰＲＯ２３３ポリペプチド配列を提供す
るが、一の態様においてこれは、図１９（配列番号：３
７）の残基１乃至３００を具備するアミノ酸配列を含
む。
【００６４】７．ＰＲＯ３４４ 本願では、新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡが
同定されたが、本願では当該ポリペプチドをＰＲＯ３４
４と称す。
【００６５】一の態様において本発明は、ＰＲＯ３４４
ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備する、単離され
た核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離さ
れた核酸は、図２１（配列番号：４２）のアミノ酸残基
１乃至２４３を有するＰＲＯ３４４ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコー
ド核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等
度、そして適宜高度なストリンジェンシー条件下でそれ
に安定に結合したままのものである。
【００６６】別の態様において、本発明は単離されたＰ
ＲＯ３４４ポリペプチドを提供する。特に本発明は、単
離された天然のＰＲＯ３４４ポリペプチド配列を提供す
るが、一の態様においてこれは、図２１（配列番号：４
２）の残基１乃至２４３を具備するアミノ酸配列を含
む。
【００６７】８．ＰＲＯ３４７ 本願では、システイン富分泌タンパク質−３に相同性で
ある新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定さ
れたが、本願では当該ポリペプチドをＰＲＯ３４７と称
す。
【００６８】一の態様において本発明は、ＰＲＯ３４７
ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備する、単離され
た核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離さ
れた核酸は、図２３（配列番号：５０）のアミノ酸残基
１乃至４５５を有するＰＲＯ３４７ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコー
ド核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等
度、そして適宜高度なストリンジェンシー条件下でそれ
に安定に結合したままのものである。
【００６９】別の態様において、本発明は単離されたＰ
ＲＯ３４７ポリペプチドを提供する。特に本発明は、単
離された天然のＰＲＯ３４７ポリペプチド配列を提供す
るが、一の態様においてこれは、図２３（配列番号：５
０）の残基１乃至４５５を具備するアミノ酸配列を含
む。
【００７０】９．ＰＲＯ３５４ 本願では、インター-アルファ-トリプシンインヒビター
（ＩＴＩ）の重鎖に相同性である新規のポリペプチドを
コードするｃＤＮＡが同定されたが、本願では当該ポリ
ペプチドをＰＲＯ３５４と称す。
【００７１】一の態様において本発明は、ＰＲＯ３５４
ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備する、単離され
た核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離さ
れた核酸は、図２５（配列番号：５５）のアミノ酸残基
１乃至６９４を有するＰＲＯ３５４ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコー
ド核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等
度、そして適宜高度なストリンジェンシー条件下でそれ
に安定に結合したままのものである。
【００７２】別の態様において、本発明は単離されたＰ
ＲＯ３５４ポリペプチドを提供する。特に本発明は、単
離された天然のＰＲＯ３５４ポリペプチド配列を提供す
るが、一の態様においてこれは、図２５（配列番号：５
５）の残基１乃至６９４を具備するアミノ酸配列を含
む。
【００７３】１０．ＰＲＯ３５５ 本願では、新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡが
同定されたが、本願では当該ポリペプチドをＰＲＯ３５
５と称す。
【００７４】一の態様において本発明は、ＰＲＯ３５５
ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備する、単離され
た核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離さ
れた核酸は、図２７（配列番号：６１）のアミノ酸残基
１乃至４４０を有するＰＲＯ３５５ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコー
ド核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等
度、そして適宜高度なストリンジェンシー条件下でそれ
に安定に結合したままのものである。
【００７５】別の態様において、本発明は単離されたＰ
ＲＯ３５５ポリペプチドを提供する。特に本発明は、単
離された天然のＰＲＯ３５５ポリペプチド配列を提供す
るが、一の態様においてこれは、図２７（配列番号：６
１）の残基１乃至４４０を具備するアミノ酸配列を含
む。
【００７６】１１．ＰＲＯ３５７ 本願では、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）の酸不安定
サブユニット（ＡＬＳ）に相同性である新規のポリペプ
チドをコードするｃＤＮＡが同定されたが、本願では当
該ポリペプチドをＰＲＯ３５７と称す。
【００７７】一の態様において本発明は、ＰＲＯ３５７
ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備する、単離され
た核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離さ
れた核酸は、図２９（配列番号：６９）のアミノ酸残基
１乃至５９８を有するＰＲＯ３５７ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコー
ド核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等
度、そして適宜高度なストリンジェンシー条件下でそれ
に安定に結合したままのものである。
【００７８】別の態様において、本発明は単離されたＰ
ＲＯ３５７ポリペプチドを提供する。特に本発明は、単
離された天然のＰＲＯ３５７ポリペプチド配列を提供す
るが、一の態様においてこれは、図２９（配列番号：６
９）の残基１乃至５９８を具備するアミノ酸配列を含
む。
【００７９】１２．ＰＲＯ７１５ 本願では、腫瘍壊死因子ファミリーポリペプチドに相同
性である新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同
定されたが、本願では当該ポリペプチドをＰＲＯ７１５
と称す。
【００８０】一の態様において本発明は、ＰＲＯ７１５
ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備する、単離され
た核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離さ
れた核酸は、図３１（配列番号：７６）のアミノ酸残基
１乃至２５０を有するＰＲＯ７１５ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコー
ド核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等
度、そして適宜高度なストリンジェンシー条件下でそれ
に安定に結合したままのものである。
【００８１】別の態様において、本発明は単離されたＰ
ＲＯ７１５ポリペプチドを提供する。特に本発明は、単
離された天然のＰＲＯ７１５ポリペプチド配列を提供す
るが、一の態様においてこれは、図３１（配列番号：７
６）の残基１乃至２５０を具備するアミノ酸配列を含
む。
【００８２】１３．ＰＲＯ３５３ 本願では、新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡが
同定されたが、本願では当該ポリペプチドをＰＲＯ３５
３と称す。
【００８３】一の態様において本発明は、ＰＲＯ３５３
ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備する、単離され
た核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離さ
れた核酸は、図３５（配列番号：８６）のアミノ酸残基
１乃至２８１を有するＰＲＯ３５３ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコー
ド核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等
度、そして適宜高度なストリンジェンシー条件下でそれ
に安定に結合したままのものである。
【００８４】別の態様において、本発明は単離されたＰ
ＲＯ３５３ポリペプチドを提供する。特に本発明は、単
離された天然のＰＲＯ３５３ポリペプチド配列を提供す
るが、一の態様においてこれは、図３５（配列番号：８
６）の残基１乃至２８１を具備するアミノ酸配列を含
む。
【００８５】１４．ＰＲＯ３６１ 本願では、新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡが
同定されたが、本願では当該ポリペプチドをＰＲＯ３６
１と称す。
【００８６】一の態様において本発明は、ＰＲＯ３６１
ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備する、単離され
た核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離さ
れた核酸は、図３７（配列番号：９１）のアミノ酸残基
１乃至４３１を有するＰＲＯ３６１ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコー
ド核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等
度、そして適宜高度なストリンジェンシー条件下でそれ
に安定に結合したままのものである。当該単離された核
酸配列は、１９９８年２月５日にＡＴＣＣ209621として
寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入物を具備していても
よいが、これはＰＲＯ３６１をコードするヌクレオチド
配列を含む。
【００８７】別の態様において、本発明は単離されたＰ
ＲＯ３６１ポリペプチドを提供する。特に本発明は、単
離された天然のＰＲＯ３６１ポリペプチド配列を提供す
るが、一の態様においてこれは、図３７（配列番号：９
１）の残基１乃至４３１を具備するアミノ酸配列を含
む。本発明の別の態様は、図３７（配列番号：９１）に
示されるアミノ酸配列のアミノ酸１乃至３７９を有する
ＰＲＯ３６１ポリペプチドの、単離された細胞外領域に
関する。ＰＲＯ３６１ポリペプチドは適宜、入手する
か、又は1998年2月5日にＡＴＣＣ209621として寄託され
たベクター中のｃＤＮＡ挿入物によりコードされるポリ
ペプチドを発現することにより手に入れることができ
る。
【００８８】１５．ＰＲＯ３６５ 本願では、新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡが
同定されたが、本願では当該ポリペプチドをＰＲＯ３６
５と称す。
【００８９】一の態様において本発明は、ＰＲＯ３６５
ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備する、単離され
た核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離さ
れた核酸は、図３９（配列番号：９９）のアミノ酸残基
１乃至２３５を有するＰＲＯ３６５ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコー
ド核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等
度、そして適宜高度なストリンジェンシー条件下でそれ
に安定に結合したままのものである。別の例において
は、単利された核酸は、図３９（配列番号：９９）のア
ミノ酸残基２１乃至２３５を有するＰＲＯポリペプチド
をコードするＤＮＡを具備するか、又はそのようなコー
ド核酸配列に相補的であって、少なくとも中等度、そし
て適宜高度なストリンジェンシー条件下でそれに安定に
結合したままのものである。
【００９０】別の態様において、本発明は単離されたＰ
ＲＯ３６５ポリペプチドを提供する。特に本発明は、単
離された天然のＰＲＯ３６５ポリペプチド配列を提供す
るが、一の態様においてこれは、図３９（配列番号：９
９）の残基１乃至２３５を具備するアミノ酸配列を含
む。本発明の別の態様は、図３９（配列番号：９９）の
アミノ酸２１乃至２３５を具備するアミノ酸配列に関す
る。
【００９１】１６．別の態様 本発明の別の態様においては、上記又は下記の何れかの
ポリペプチをコードするＤＮＡを具備したベクターが提
供される。そのような何れかのベクターを具備した宿主
細胞も提供される。例示としては、宿主細胞はＣＨＯ細
胞、大腸菌（E.coli）、又は酵母とすることができる。
上記又は下記のポリペプチドを産生する方法が提供され
るが、これは更に、宿主細胞を所望ポリペプチドの発現
に適した条件下で培養し、細胞培養物より所望のポリペ
プチドを回収することを具備している。
【００９２】別の態様において本発明は、上記又は下記
の何れかのポリペプチドであって異種のポリペプチド又
はアミノ酸配列に融合したものを具備したキメラ分子を
提供する。そのようなキメラ分子の例は、上記又は下記
のいずれかのポリペプチドであって、エピトープ標識配
列又は免疫グロブリンのＦｃ領域に融合したものであ
る。別の態様において、本発明は、上記又は以下に記載
したポリペプチドの何れかに特異的に結合する抗体を提
供する。任意に、該抗体はモノクローナル抗体である。
【００９３】別の態様において本発明は、ゲノム及びｃ
ＤＮＡのヌクレオチド配列を単離するのに有益なオリゴ
ヌクレオチドのプローブを提供するが、ここで、そのプ
ローブは上記又は下記の何れかのヌクレオチド配列に由
来するものとすることができる。
【００９４】
【発明の実施の形態】好適な実施態様の詳細な説明 Ｉ． 定義 ここで用い且つ数字の表記に直接続けられる場合に用語
「ＰＲＯポリペプチド」と「ＰＲＯ」は、各種のポリペ
プチドに関し、ここでの完全な表記（即ち、ＰＲＯ／数
字）は、ここに記載した特有のポリペプチド配列に関す
る。ここで用いる場合に用語「ＰＲＯ／数字ポリペプチ
ド」及び「ＰＲＯ／数字」は、天然配列ポリペプチドと
ポリペプチド変異体（ここで更に定義される）を包含す
る。ここに記載したＰＲＯポリペプチドは、ヒト組織タ
イプから或いは別な供給源からのような各種の供給源か
ら単離され、又は組換え或いは合成方法によって製造さ
れ得る。
【００９５】「天然配列ＰＲＯポリペプチド」は、相当
する天然から得られたＰＲＯポリペプチドと同じアミノ
酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配
列ＰＲＯポリペプチドは、天然物から単離することがで
き、又は組換え或いは合成によって製造することができ
る。用語「天然配列ＰＲＯポリペプチド」は、特異的Ｐ
ＲＯポリペプチドの自然発生端切り又は分泌形態（例え
ば、細胞外ドメイン配列）、自然発生変異形（例えば、
代替スプライス形）及びポリペプチドの自然発生アレル
変異体を特に包含する。本発明の各種の実施態様におい
て、天然配列ＰＲＯ２４１ポリペプチドは、図２（配列
番号：２）のアミノ酸１から３７９を含む成熟又は全長
天然配列ＰＲＯ２４１ポリペプチドであり、天然配列Ｐ
ＲＯ２４３は、Ｎ末端シグナル配列（残基１乃至約２
３）を持つ或いは無しの、及び位置１で開始メチオニン
を持つ或いは無しの、図４（配列番号：７）のアミノ酸
２４乃至９５４を含む成熟又は全長天然配列ポリペプチ
ドであり、天然配列ＰＲＯ２９９ポリペプチドは、図９
（配列番号：１５）のアミノ酸１乃至７３７を含む成熟
或いは全長天然配列ＰＲＯ２９９ポリペプチドである
か、又は天然配列ＰＲＯ２９９ポリペプチドは、全長Ｐ
ＲＯ２９９タンパク質の細胞外ドメインであり、但し全
長ＰＲＯ２９９タンパク質の予測トランスメンブレンド
メインは、図８に示したヌクレオチド２０２２で始まる
ヌクレオチドによってコードされ、天然配列ＰＲＯ３２
３ポリペプチドは、図１３（配列番号：２４）のアミノ
酸１乃至４３３を含む成熟或いは全長天然配列ＰＲＯ３
２３ポリペプチドであり、天然配列ＰＲＯ３２７ポリペ
プチドは、図１７（配列番号：３２）のアミノ酸１乃至
４２２を含む成熟或いは全長天然配列ＰＲＯ３２７ポリ
ペプチドであり、天然配列ＰＲＯ２３３ポリペプチド
は、図１９（配列番号：３７）のアミノ酸１乃至３００
を含む成熟或いは全長天然配列ＰＲＯ２３３ポリペプチ
ドであり、天然配列ＰＲＯ３４４ポリペプチドは、図２
１（配列番号：４２）のアミノ酸１乃至２４３を含む成
熟或いは全長天然配列ＰＲＯ３４４ポリペプチドであ
り、天然配列ＰＲＯ３４７ポリペプチドは、図２３（配
列番号：５０）のアミノ酸１乃至４５５を含む成熟或い
は全長天然配列ＰＲＯ３４７ポリペプチドであり、天然
配列ＰＲＯ３５４ポリペプチドは、図２５（配列番号：
５５）のアミノ酸１乃至６９４を含む成熟或いは全長天
然配列ＰＲＯ３５４ポリペプチドであり、天然配列ＰＲ
Ｏ３５５ポリペプチドは、図２７（配列番号：６１）の
アミノ酸１乃至４４０を含む成熟或いは全長天然配列Ｐ
ＲＯ３５５ポリペプチドであり、又は天然配列ＰＲＯ３
５５は、全長ＰＲＯ３５５タンパク質の細胞外ドメイン
であり、但し全長ＰＲＯ３５５タンパク質の予測トラン
スメンブレンドメインは、図２６に示したヌクレオチド
１１３８で始まるヌクレオチドによってコードされ、天
然配列ＰＲＯ３５７ポリペプチドは、図２９（配列番
号：６９）のアミノ酸１乃至５９８を含む成熟或いは全
長天然配列ＰＲＯ３５７ポリペプチドであり、又は天然
配列ＰＲＯ３５７ポリペプチドは、全長ＰＲＯ３５７タ
ンパク質の細胞外ドメインであり、但し全長ＰＲＯ３５
５タンパク質の予測トランスメンブレンドメインは、配
列番号：６８のヌクレオチド１５１８−１５７２、或い
は配列番号：６８の１４９１−１５７２によってコード
され、天然配列ＰＲＯ７１５ポリペプチドは、図３１
（配列番号：７６）のアミノ酸１乃至２５０を含む成熟
或いは全長天然配列ＰＲＯ７１５ポリペプチドであり、
天然配列ＰＲＯ３５３ポリペプチドは、図３５（配列番
号：８６）のアミノ酸１乃至２８１を含む成熟或いは全
長天然配列ＰＲＯ３５３ポリペプチドであり、又は天然
配列ＰＲＯ３５３ポリペプチドは、全長ＰＲＯ３５３タ
ンパク質の細胞外ドメインであり、天然配列ＰＲＯ３６
１ポリペプチドは、図３７（配列番号：９１）のアミノ
酸１乃至４３１を含む成熟或いは全長天然配列ＰＲＯ３
６１ポリペプチドであり、又は天然配列ＰＲＯ３６１ポ
リペプチドは、全長ＰＲＯ３６１タンパク質の細胞外ド
メインであり、但し全長ＰＲＯ３６１タンパク質の予測
トランスメンブレンドメインは、図３６に示したヌクレ
オチド１３６３で始まるヌクレオチドによってコードさ
れ、及び天然配列ＰＲＯ３６５ポリペプチドは、図３９
（配列番号：９９）のアミノ酸１乃至２３５を含む成熟
或いは全長天然配列ＰＲＯ３６５ポリペプチドである。
【００９６】ＰＲＯポリペプチド「細胞外ドメイン」又
は「ＥＣＤ」は、トランスメンブレン及び細胞質ドメイ
ンの本質的にないＰＲＯポリペプチドの形態に関する。
通例、ＰＲＯポリペプチドＥＣＤは、そのようなトラン
スメンブレン及び／又は細胞質ドメインの１％以内を有
するであろうし、好ましくはそのようなドメインの０．
５％以内を有するであろう。本発明のＰＲＯポリペプチ
ド用に同定した何れかのドメインが疎水性ドメインのそ
のタイプを同定するために当該分野で通常利用される基
準に従って同定されることが理解されるであろう。トラ
ンスメンブレンドメインの正確な境界は、変化し得る
が、しかし初めに同定したようなドメインのいずれか一
方の末端で約５アミノ酸以下が最もありそうに思われ
る。
【００９７】「ＰＲＯポリペプチド変異体」は、ここに
記載した全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列と少なく
とも約８０％アミノ酸配列同一性を有する上述の或いは
後述の活性ＰＲＯポリペプチドを意味する。そのような
ＰＲＯポリペプチド変異体は、例えば、１以上のアミノ
酸残基がその全長天然アミノ酸配列のＰＲＯポリペプチ
ドのＮ又はＣ末端で付加され、或いは欠失されるＰＲＯ
ポリペプチドを含む。通例、ＰＲＯポリペプチド変異体
は、ここに記載した全長天然アミノ酸配列のアミノ酸配
列と少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性、より好ま
しくは少なくとも約８５％アミノ酸配列同一性、更によ
り好ましくは少なくとも約９０％アミノ酸配列同一性、
更により好ましくは少なくとも約９５％アミノ酸配列同
一性、最も好ましくは少なくとも約９９％配列同一性を
有するであろう。
【００９８】ＰＲＯ２４３変異体に関して、語句「ＰＲ
Ｏ２４３変異体」は、（ａ）その天然シグナル配列を持
つ又は無しのＰＲＯ２４３ポリペプチドをコードしてい
るＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体
に対して少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性を有す
る後述した活性ＰＲＯ２４３を意味する。特有な実施態
様において、ＰＲＯ２４３変異体は、全長天然配列ＰＲ
Ｏ２４３についての図４（配列番号：７）に示した推定
アミノ酸配列を有するＰＲＯ２４３と少なくとも約８０
％アミノ酸配列相同性を有する。そのようなＰＲＯ２４
３変異体は、例えば、図４（配列番号：７）の配列のＮ
或いはＣ末端で１以上のアミノ酸残基が付加、又は欠失
されるＰＲＯ２４３ポリペプチドを含む。好ましくは、
核酸或いはアミノ酸配列同一性は、少なくとも約８５
％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好
ましくは少なくとも９５％である。
【００９９】ここで同定したＰＲＯポリペプチド配列に
関して「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、必
要であれば、最大パーセント配列同一性を達成するため
に、その配列のアライニング及びギャップ導入後、特異
的ＰＲＯポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一であ
る候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定
義され、且つ配列同一性の一部としていずれの保存的置
換も考慮しない。パーセントアミノ酸配列同一性を決定
する目的のためのアライメントは、例えば、ＢＬＡＳ
Ｔ，ＢＬＡＳＴ-２，ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ
（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に利用可
能なコンピューターソフトウェアを用いて、当業者の範
囲内である各種の手法で達成することができる。好適な
ソフトウェアアライメントプログラムは、ＢＬＡＳＴで
ある。当業者であれば、比較するべき配列の全長にわた
り最大のアライメントを達成するために必要とされるい
ずれのアルゴリズムをも含む、アライメントを測定する
ための適切なパラメーターを決定することができる。
【０１００】ここで同定した、ＰＲＯ-コード核酸配列
に関して「パーセント（％）核酸配列同一性」は、必要
であれば、最大パーセント配列同一性を達成するため
に、その配列のアライニング及びギャップ導入後、興味
あるＰＲＯ核酸配列中のヌクレオチドと同じである候補
配列中のヌクレオチドのパーセンテージとして定義され
る。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のための
アライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ，ＢＬＡＳＴ-
２，ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡ
Ｒ）ソフトウェアのような公的に利用可能なコンピュー
ターソフトウェアを用いて、当業者の範囲内である各種
の手法で達成することができる。当業者であれば、比較
するべき配列の全長にわたり最大のアライメントを達成
するために必要とされるいずれのアルゴリズムをも含
む、アライメントを測定するための適切なパラメーター
を決定することができる。
【０１０１】ここに開示した各種ポリペプチドを記述す
るために用いる場合、「単離した」とは、その天然環境
の成分から同定及び分離及び／又は回収されているポリ
ペプチドを意味する。その天然環境の不純成分は、その
ペプチドの診断的又は治療的な使用を典型的に妨害する
であろう材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパ
ク様又は非タンパク様溶質を含む。好適な実施態様にお
いて、該ポリペプチドは、（１）スピニングカップ配列
決定装置の使用によってＮ末端の少なくとも１５残基或
いは内部アミノ酸配列を得るために十分な度合まで、又
は（２）クマシーブルー又は、好ましくは銀染色を用い
た非還元又は還元条件下でＳＤＳ-ＰＡＧＥによって均
質となるまで、精製されるであろう。単離したポリペプ
チドは、ＰＲＯポリペプチド天然環境の成分の少なくと
も一つが存在しないであろうことから、組換え細胞内の
原位置のポリペプチドを含む。通常、しかしながら、単
離したポリペプチドは、少なくとも一の精製工程によっ
て作製されるだろう。
【０１０２】「単離した」ＰＲＯポリペプチド-コード
核酸分子は、ＰＲＯポリペプチド核酸の天然供給源に普
通に結合されることによって少なくとも一の不純核酸分
子から同定され且つ分離される核酸分子である。単離し
たＰＲＯポリペプチド核酸分子は、天然で見出される形
態又はセッティング以外のものである。単離したＰＲＯ
ポリペプチド核酸分子は、従って、それが天然細胞に存
在するような特異的ＰＲＯポリペプチド核酸分子と区別
される。しかしながら、単離したＰＲＯポリペプチド核
酸分子は、例えばその核酸分子が天然細胞のそれと異な
る染色体配置中にある場合、ＰＲＯポリペプチドを普通
に発現する細胞中に含んだＰＲＯポリペプチド核酸分子
を含む。
【０１０３】用語「制御配列」は、特有な宿主生体中の
操作可能に結合したコード配列の発現のために必要なＤ
ＮＡ配列に関する。原核生物のために好適な制御配列
は、例えば、プロモーター、任意にオペレーター配列、
及びリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞は、プロ
モーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサー
を用いることが知られる。
【０１０４】核酸は、それが別の核酸配列との機能的関
係に置かれる場合「操作可能に結合(operably linke
d)」される。例えば、予備配列決定又は分泌リーダーの
ためのＤＮＡは、もしそれが該ポリペプチドの分泌に参
与するプレタンパク質として発現されるならば、ポリペ
プチド用のＤＮＡに操作可能に結合される；プロモータ
ーとエンハンサーは、もしそれが該配列の転写に影響を
及ぼすならば、コード化配列に操作可能に結合される；
又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を促進する
ように配置されるならば、コード配列に操作可能に結合
される。一般に「操作可能に結合」は、結合されるその
ＤＮＡ配列が隣接され、且つ分泌リーダーのケースにお
いては隣接し且つリーディング相中にあることを意味す
る。しかしながら、エンハンサーは隣接されない。結合
は、利便的な制限部位での結紮によって達成される。も
しそのような部位が存在しないならば、合成オリゴヌク
レオチドアダプター又はリンカーが通常の実施に従って
使用される。
【０１０５】用語「抗体」は、最も広い認識で用いら
れ、単純な抗-ＰＲＯポリペプチド、モノクローナル抗
体（アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含
む）、及びポリエピトピック特異性を持つ抗-ＰＲＯポ
リペプチド抗体組成物を明確にカバーする。ここで用い
た用語「モノクローナル抗体」は、実質上均一な抗体の
集団から得られた抗体、即ちその集団に含まれる個別の
抗体が少量で存在し得る自然発生変異の可能性を除いて
同一であることに関する。
【０１０６】ここで意図する「活性な」又は「活性」
は、特異的な天然又は天然発生ＰＲＯポリペプチドの生
物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＰＲＯポリペ
プチドの形態に関する。ＰＲＯ２４３によって示された
通り、好適な活性は、コルディン(chordin)の活性に結
合する及び影響を及ぼす、例えば阻止する又はその他の
調整をするための能力であり、その活性は、好ましくは
脊索(notochord)の調節と筋肉形成を含む。
【０１０７】「治療」又は「治療する」は、治療的処置
及び予防又は予防的手段の両方に関する。治療の必要な
それらは、疾患に既にかかっている、同じくその疾患が
予防するべきものであるそれらの疾患を有する傾向にあ
るそれらを含む。
【０１０８】治療の目的のための「哺乳動物」は、ヒ
ト、家畜及び農業用動物、及び動物園の、スポーツの又
は愛玩用動物を含み、例えばヒツジ、イヌ、ウマ、ネ
コ、ウシなどの、哺乳動物として分類される何れかの動
物に関する。好ましくは、ここでの哺乳動物はヒトであ
る。
【０１０９】ここで用いたような「担体」は、用いる用
量と濃度でそれにさらされる細胞又は哺乳動物に無毒で
ある、薬学上許容される担体、賦形剤、又は安定化剤を
含む。しばしば生理学上許容される担体は、ｐＨ緩衝化
水溶液である。生理学上許容される担体の例は、リン酸
塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝液；アスコ
ルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０分子以
下）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免
疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリド
ンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、ア
スパラギン、アルギニン又はリシンのようなアミノ酸；
グルコース、マンノース、又はデキストリンを含むモノ
サッカリド、ジサッカリド、及び他の炭水化物；ＥＤＴ
Ａのようなキレート化剤；マンニトール又はソルビトー
ルのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成カ
ウンターイオン；及び／又はTWEENTM、ポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）、およびPLURONICSTMのような非イ
オン性界面活性剤を含む。
【０１１０】用語「アゴニスト」は、本発明の天然ＰＲ
Ｏポリペプチドのペプチド及び非-ペプチド類似物（天
然ＰＲＯポリペプチドは、pro-ＰＲＯポリペプチド、pr
e-ＰＲＯポリペプチド、prepro-ＰＲＯポリペプチド、
又は成熟ＰＲＯポリペプチドに関する）に関するとして
及びそれが天然ＰＲＯポリペプチドの少なくとも１の生
物学的活性を保持するという条件で、そのようなＰＲＯ
ポリペプチドに特異的に結合する抗体に関して用いられ
る。好ましくは、本発明のアゴニストは、天然ＰＲＯポ
リペプチドの少なくとも１の性質上の結合認識特性及び
レセプター活性化特性を保持する。
【０１１１】用語「アンタゴニスト」は、本発明の天然
ＰＲＯポリペプチドの生物学的活性を阻害する分子に関
し、ここでの天然ＰＲＯポリペプチドは、pro-ＰＲＯポ
リペプチド、pre-ＰＲＯポリペプチド、prepro-ＰＲＯ
ポリペプチド、又は成熟ＰＲＯポリペプチドに関する。
好ましくは、ここでのアンタゴニストは、結合パートナ
ーに対する本発明の天然ＰＲＯポリペプチドの結合を阻
害する。ＰＲＯポリペプチド「アンタゴニスト」は、Ｐ
ＲＯアンタゴニストエフェクター機能を妨害する又は干
渉する分子である（例えば、ＰＲＯポリペプチドによる
ＰＲＯポリペプチドレセプターの結合及び／又は活性化
を妨害又は干渉する分子）。そのような分子は、例え
ば、試験アンタゴニスト分子の存在及び不在において天
然ＰＲＯポリペプチドの結合をモニタリングすることに
よってＰＲＯポリペプチドレセプター活性化を競合的に
阻害するその能力によってスクリーンすることができ
る。本発明のアンタゴニストはまた、ＰＲＯポリペプチ
ド遺伝子に対するアンチセンスポリヌクレオチドも包含
し、アンチセンスポリヌクレオチドがＰＲＯポリペプチ
ド遺伝子の転写又は翻訳を阻止し、それによってその発
現と生物学的活性を阻害する。
【０１１２】「ストリンジェント条件」は、（１）洗浄
のための低いイオン強度と高温を使う、例えば５０℃で
0.015Mの塩化ナトリウム／0.0015Mのクエン酸ナトリウ
ム／0.1%ドデシル硫酸ナトリウム；（２）ハイブリダイ
ゼーションの間にホルムアミドのような変性剤を使う、
例えば４２℃で、0.1%ウシ血清アルブミンとともに50%
(vol/vol)ホルムアミド／0.1%のFicoll／0.1%ポリビニ
ルピロリドン／750mMの塩化ナトリウム、75mMのクエン
酸ナトリウムを伴う50mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH
6.5を用いることを意味する。別な実例は、0.2xSSCと0.
1%のSDS中４２℃での洗浄と共に、４２℃で50%ホルムア
ミド、5xSSC（0.75MのＮａＣｌ、0.075Mクエン酸ナトリ
ウム）、50mMのリン酸ナトリウム(pH6/8)、0.1%ピロリ
ン酸ナトリウム、５ｘデンハード溶液、音波処理したサ
ケ精子ＤＮＡ(50μg/ml)、0.1%ＳＤＳ、及び10%デキス
トラン硫酸の使用である。更に別な実例は、５５℃で10
%デキストリン硫酸の緩衝液、2xSSC（塩化ナトリウム／
クエン酸ナトリウム）と50%ホルムアミドを用いたハイ
ブリダイゼーション、続いて５５℃でＥＤＴＡ含有0.1x
SSCからなる高ストリンジェント洗浄である。
【０１１３】「中等度にストリンジェントな条件」は、
Sambrookら、上記、に記載され、且つ上述したよりも、
より劣る洗浄液とハイブリダイゼーション条件（例え
ば、温度、イオン強度、及び％ＳＤＳ）の使用を含む。
中等度にストリンジェントな条件の実例は、20%ホルム
アミド、5xSSC(150mMのＮａＣｌ、15mMのクエン酸三ナ
トリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.6)、５ｘデン
ハード溶液、10%デキストラン硫酸、及び20mg/mLの変性
し切断したサケ精子ＤＮＡを含む溶液中３７℃で一晩の
インキュベーション、続いて約37-50℃で1xSSC中で該フ
ィルターの洗浄、のような条件である。熟達した研究者
であれば、プローブ長などのようなファクターを調整す
るために必要な、温度、イオン強度などをどのように調
節するかを認識するであろう。
【０１１４】「サザン分析」又は「サザンブロッティン
グ」は、ＤＮＡ又はＤＮＡ含有組成物の制限エンドヌク
レアーゼ消化においてＤＮＡ配列の存在が、既知の標識
したオリゴヌクレオチド又はＤＮＡフラグメントへのハ
イブリダイゼーションによって確認される方法である。
サザン分析は、典型的に、アガロースゲル上でのＤＮＡ
消化物の電気泳動分離、電気泳動分離後のＤＮＡの変
性、及びSambrookら、Molecular Cloning: A Laborator
y Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory P
ress, 1989)のセクション9.37-9.52に記載されたよう
な、放射性標識した、ビオチン化した、又は酵素標識し
たプローブによる、ニトロセルロース、ナイロン又は分
析用に好適な別の膜への該ＤＮＡの転移を含む。
【０１１５】「ノーザン分析」又は「ノーザンブロッテ
ィング」は、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡフラグメン
ト、ｃＤＮＡ又はそのフラグメント、又はＲＮＡフラグ
メントのような既知のプローブにハイブリダイズするＲ
ＮＡ配列を同定するために用いる方法である。そのプロ
ーブは、32Ｐのような放射性同位体、又はビオチン化に
よって、又は酵素によって標識される。分析するべきＲ
ＮＡは、アガロース又はポリアクリルアミドゲル上で普
通に電気泳動的に分離され、ニトロセルロース、ナイロ
ン、又は他の適当な膜に転移し、さらにSambrookら、上
記、のセクション7.39-7.52中に記載されたそれらのよ
うな当該分野で周知の標準技術を用いて、該プローブと
ハイブリダイズされる。
【０１１６】ＩＩ．本発明の組成物と方法 １．全長ＰＲＯ２４１ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ２４１と本出願中で称したポリペプチ
ドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチ
ド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例
で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ２４１ポリペプチ
ドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。
ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュー
タプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ２４１ポリ
ペプチドの部分が各種のビグリカンタンパク質と顕著な
相同性を有することを知見した。従って、本出願中に開
示したＰＲＯ２４１ポリペプチドは、新たに同定された
ビグリカン同族体ポリペプチドであり、且つビグリカン
タンパク質の典型的な活性を所有し得るということをこ
こに確信した。
【０１１７】２．全長ＰＲＯ２４３ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ２４３と本出願中で称したポリペプチ
ドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチ
ド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例
で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ２４３ポリペプチ
ドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。
ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュー
タプログラムを用いて、本出願人は、全長天然配列ＰＲ
Ｏ２４３（図４及び配列番号：７に示した）が、アフリ
カツメガエル及びXenopusコルディン(chordin)と５０％
アミノ酸配列同一性を、及びラットコルディン(chordi
n)と７７％相同性を有することを知見した。従って、本
出願中に開示したＰＲＯ２４３ポリペプチドは、コルデ
ィン(chordin)タンパク質ファミリーの新たに同定され
たメンバーであり、且つ脊索に影響を及ぼすとともに中
胚葉の背方化(dorsalization)による筋肉形成の能力を
所有し得るということをここに確信した。
【０１１８】３．全長ＰＲＯ２９９ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ２９９と本出願中で称したポリペプチ
ドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチ
ド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例
で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ２９９ポリペプチ
ドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。
ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュー
タプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ２９９ポリ
ペプチドの各部が、切痕(notch)タンパク質と顕著な相
同性を有することを知見した。従って、本出願中に開示
したＰＲＯ２９９ポリペプチドは、切痕タンパク質の新
たに同定されたメンバーであり、且つ切痕タンパク質フ
ァミリーの典型的なシグナリング特性を所有し得るとい
うことをここに確信した。
【０１１９】４．全長ＰＲＯ３２３ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ３２３と本出願中で称したポリペプチ
ドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチ
ド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例
で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３２３ポリペプチ
ドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。
ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュー
タプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３２３ポリ
ペプチドの各部が、各種のジペプチダーゼタンパク質と
顕著な相同性を有することを知見した。従って、本出願
中に開示したＰＲＯ３２３ポリペプチドは、ジペプチダ
ーゼ活性を有する新たに同定されたジペプチダーゼ同族
体であるということをここに確信した。
【０１２０】５．全長ＰＲＯ３２７ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ３２７と本出願中で称したポリペプチ
ドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチ
ド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例
で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３２７ポリペプチ
ドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。
ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュー
タプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３２７ポリ
ペプチドの部分が、各種のプロラクチンレセプタータン
パク質と顕著な相同性を有することを知見した。従っ
て、本出願中に開示したＰＲＯ３２７ポリペプチドは、
新たに同定されたプロラクチンレセプター同族体であ
り、且つプロラクチンレセプタータンパク質の典型的な
活性を有するということをここに確信した。
【０１２１】６．全長ＰＲＯ２３３ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ２３３と本出願中で称したポリペプチ
ドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチ
ド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例
で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ２３３ポリペプチ
ドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。
ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュー
タプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ２３３ポリ
ペプチドの部分が、各種の還元酵素タンパク質と顕著な
相同性を有することを知見した。本出願人はまた、ＰＲ
Ｏ２３３をコードしているＤＮＡが、線虫(Caenorhabdi
tis elegans)からのタンパク質と顕著な相同性を有する
ことも見出した。従って、本出願中に開示したＰＲＯ２
３３ポリペプチドは、還元酵素ファミリーの新たに同定
されたメンバーであり、且つ還元酵素ファミリーの典型
的な細胞の酸化還元状態に影響を及ぼす能力を所有する
ということをここに確信した。
【０１２２】７．全長ＰＲＯ３４４ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ３４４と本出願中で称したポリペプチ
ドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチ
ド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例
で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３４４ポリペプチ
ドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。
ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュー
タプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３４４ポリ
ペプチドの部分が、ヒトとマウスの補体タンパク質(com
plement proteins)と顕著な相同性を有することを知見
した。従って、本出願中に開示したＰＲＯ３４４ポリペ
プチドは、補体ファミリーの新たに同定されたメンバー
であり、且つタンパク質の補体ファミリーに典型的な炎
症プロセスに影響を及ぼす能力を所有するということを
ここに確信した。
【０１２３】８．全長ＰＲＯ３４７ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ３４７と本出願中で称したポリペプチ
ドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチ
ド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例
で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３４７ポリペプチ
ドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。
ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュー
タプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３４７ポリ
ペプチドの部分が、各種のシステイン-富分泌タンパク
質(cysteine-rich secretory proteins)と顕著な相同性
を有することを知見した。従って、本出願中に開示した
ＰＲＯ３４７ポリペプチドは、新たに同定されたシステ
イン-富分泌タンパク質であり、且つシステイン-富分泌
タンパク質ファミリーの典型的な活性を所有し得るとい
うことをここに確信した。
【０１２４】９．全長ＰＲＯ３５４ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ３５４と本出願中で称したポリペプチ
ドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチ
ド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例
で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３５４ポリペプチ
ドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。
ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュー
タプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３５４ポリ
ペプチドの部分が、インター-アルファ-トリプシンイン
ヒビター重鎖タンパク質と顕著な相同性を有することを
知見した。従って、本出願中に開示したＰＲＯ３５４ポ
リペプチドは、新たに同定されたインター-アルファ-ト
リプシンインヒビター重鎖タンパク質ということをここ
に確信した。
【０１２５】１０．全長ＰＲＯ３５５ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ３５５と本出願中で称したポリペプチ
ドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチ
ド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例
で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３５５ポリペプチ
ドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。
ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュー
タプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３５５ポリ
ペプチドの各部が、ＣＲＴＡＭタンパク質と顕著な相同
性を有することを知見した。本出願人はまた、ＰＲＯ３
５５ポリペプチドをコードしているＤＮＡが、胸腺細胞
活性化及び発育タンパク質、Ｈ２０Ａレセプター、Ｈ２
０Ｂレセプター、ポリオウイルスレセプター及びオナガ
ザル(Cercopithecus aethiops)ＡＧＭデルタ１タンパク
質との相同性を有することも見出している。従って、本
出願中に開示したＰＲＯ３５５ポリペプチドは、ＣＲＴ
ＡＭタンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバー
であるということをここに確信した。
【０１２６】１１．全長ＰＲＯ３５７ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ３５７と本出願中で称したポリペプチ
ドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチ
ド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例
で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３５７ポリペプチ
ドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。
ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュー
タプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３５７ポリ
ペプチドの各部が、インスリン様成長因子の酸不安定サ
ブユニットと顕著な相同性を有することを知見した。本
出願人はまた、ＤＮＡ４４８０４-１２４８の非コード
領域が、ＷＯ９５／１４７７２中に記載されたヒト遺伝
子サイン(human gene signature)と整列(align)するこ
とも見出している。本出願人はさらに、ＤＮＡ４４８０
４-１２４８の非コード領域が、DeuringとDoerfler,Gen
e,26:283-289(1983)中に記載されたアデノウイルス型1/
2一組換えウイルスＤＮＡと整列することを見出してい
る。コード領域相同性に基づいて、本出願中に開示した
ＰＲＯ３５７ポリペプチドは、タンパク質のロイシン富
繰り返しファミリー(leucine rich repeat family)の新
たに同定されたメンバーであり、且つ特に、インスリン
様成長因子の酸不安定サブユニットに関連付けられると
いうことをここに確信した。それだけでＰＲＯ３５７
は、結合メカニズムに含まれ、且つ複合体の一部であろ
うと思われる。
【０１２７】１２．全長ＰＲＯ７１５ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ７１５と本出願中で称したポリペプチ
ドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチ
ド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例
で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ７１５ポリペプチ
ドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。
ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュー
タプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ７１５ポリ
ペプチドの各部が、タンパク質の腫瘍壊死ファミリーの
各種のメンバーと顕著な相同性を有することを知見し
た。従って、本出願中に開示したＰＲＯ７１５ポリペプ
チドは、タンパク質の腫瘍壊死因子の新たに同定された
メンバーであるということをここに確信した。
【０１２８】１３．全長ＰＲＯ３５３ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ３５３と本出願中で称したポリペプチ
ドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチ
ド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例
で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３５３ポリペプチ
ドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。
ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュー
タプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３５３ポリ
ペプチドの各部が、ヒトとマウスの補体タンパク質(com
plement proteins)と顕著な相同性を有することを知見
した。従って、本出願中に開示したＰＲＯ３５３ポリペ
プチドは、補体ファミリーの新たに同定されたメンバー
であり、且つタンパク質の補体ファミリーに典型的な炎
症プロセスに影響を及ぼす能力を所有するということを
ここに確信した。
【０１２９】１４．全長ＰＲＯ３６１ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ３６１と本出願中で称したポリペプチ
ドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチ
ド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例
で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３６１ポリペプチ
ドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。
ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュー
タプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３６１ポリ
ペプチドの各部が、ムチンとキチナーゼタンパク質と顕
著な相同性を有することを知見した。従って、本出願中
に開示したＰＲＯ３６１ポリペプチドは、ムチン及び／
又はキチナーゼタンパク質の新たに同定されたメンバー
であり、且つムチンとキチナーゼタンパク質のそれぞれ
に典型的な癌、植物病原性又はレセプター機能と関係付
けできるということをここに確信した。
【０１３０】１５．全長ＰＲＯ３６５ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ３６５と本出願中で称したポリペプチ
ドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチ
ド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例
で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３６５ポリペプチ
ドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。
ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュー
タプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３６５ポリ
ペプチドの各部が、ヒト２−１９タンパク質と顕著な相
同性を有することを知見した。従って、本出願中に開示
したＰＲＯ３６５ポリペプチドは、ヒト２−１９タンパ
ク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであるとい
うことをここに確信した。
【０１３１】１６．ＰＲＯポリペプチド変異体 ここに記載した全長天然配列ＰＲＯポリペプチドに加え
て、ＰＲＯポリペプチド変異体を調製できることが意図
される。ＰＲＯポリペプチド変異体は、ＰＲＯポリペプ
チドＤＮＡに変えられる適切なヌクレオチドを導入する
ことによって、或いは望まれるＰＲＯポリペプチドの合
成によって調製することができる。当業者であれば、ア
ミノ酸変更が、グリコシル化部位の数或いは位置を変更
すること、又は膜固定(membrane anchoring)特性を変更
することのような、ＰＲＯポリペプチドの後翻訳処理を
変更し得ることを予期するであろう。
【０１３２】天然全長配列ＰＲＯポリペプチドにおける
又はここに記載したＰＲＯポリペプチドの各種ドメイン
における変異は、例えば米国特許第５３６４９３４号中
に記載された保存的及び非保存的変異のための何れかの
技術とガイドラインとを用いて行うことができる。変異
は、天然配列ＰＲＯポリペプチドとの比較としてＰＲＯ
ポリペプチドのアミノ酸配列における変化に帰結するＰ
ＲＯポリペプチドをコードしている１以上のコドンの置
換、欠失又は挿入とし得る。任意に、変異は、ＰＲＯポ
リペプチドの１以上のドメインにおいて少なくとも１の
アミノ酸と何れかの他のアミノ酸との置換によるもので
ある。望まれる活性に不利な影響を与えることなしに、
アミノ酸残基が挿入され、置換され或いは欠失され得る
ことの測定におけるガイダンスは、知られたタンパク質
分子に相同なそれと該ＰＲＯポリペプチドの配列とを比
較すること及び高度に相同な領域で作られるアミノ酸配
列変化の数を最小にすることによって見出すことができ
る。アミノ酸置換は、セリンによるロイシンの置換、即
ち保存的アミノ酸置換のような、類似の構造及び／又は
化学特性を有する別なアミノ酸によって１のアミノ酸を
置換することの結果とすることができる。挿入又は欠失
は、任意に、１乃至５アミノ酸の範囲内として良い。許
容される変異は、該配列中のアミノ酸の挿入、欠失又は
置換を系統的に行うこと及び後述の実施例中に記載した
インビトロアッセイにおいて活性について得られた変異
体を試験することによって測定し得る。
【０１３３】特有な実施態様において、重要な保存的置
換が、好適な置換体の表題の下に表１中に示される。も
しそのような置換が生物学的活性における変化に帰結す
るのであれば、より現実的な変化、表１中に示した典型
的な置換体、又はアミノ酸分類に参照して更に後で記載
したように導入され且つ生生成物がスクリーンされる。
【０１３４】
【表１】
【０１３５】ＰＲＯポリペプチドの機能或いは免疫学的
同一性における実質上の改変は、（ａ）その置換の領域
中のポリペプチドバックボーンの構造、例えばシート或
いはヘリックスの立体配座としての、（ｂ）標的部位で
の該分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩、を維
持することについてのその作用において有意に異なる置
換体を選択することによって達成される。自然発生残基
は、共通の側鎖特性に基づいてグループに分けられる： （１）疎水性：ノルロイシン，ｍｅｔ，ａｌａ，ｖａ
ｌ，ｌｅｕ，ｉｌｅ； （２）中性親水性：ｃｙｓ，ｓｅｒ，ｔｈｒ； （３）酸性：ａｓｐ，ｇｌｕ； （４）塩基性：ａｓｎ，ｇｌｎ，ｈｉｓ，ｌｙｓ，ａｒ
ｇ； （５）鎖の方位に影響する残基：ｇｌｙ，ｐｒｏ；及び （６）芳香族性：ｔｒｐ，ｔｙｒ，ｐｈｅ。
【０１３６】非保存性置換は、別なクラスによってこれ
らのクラスの１のメンバーを交換することを必要とする
だろう。そのように置換した残基はまた、保存的置換部
位に、又は、より好ましくは、保持されている（非-保
存的）部位にも導入し得る。
【０１３７】該変異は、オリゴヌクレオチド介在（部位
特異的）変異誘発、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ
変異誘発のような当該分野で周知の方法を用いて作製で
きる。部位特異的変異誘発[Carterら、Nucl. Acids Re
s.,13:4331(1986)；Zollerら、Nucl. Acids Res.,10:64
87(1987)]、カセット変異誘導[Wellsら、Gene,34:315(1
985)]、制限選択変異誘導[Wellsら、Philos.Trans.R.So
c.London SerA,317:415(1986)]、又は他の周知の技術
は、望まれるＰＲＯポリペプチド変異体ＤＮＡを製造す
るためのクローン化ＤＮＡで実行できる。
【０１３８】スキャニングアミノ酸分析はまた、隣接配
列に従って１以上のアミノ酸を同定するために利用する
ことができる。スキャニングアミノ酸の中で好適なもの
は、相対的に小さい、中性アミノ酸である。そのような
アミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステ
インを含む。アラニンは、それがベータ炭素以外の側鎖
がなく、しかもその変異体の主鎖構造を変更する可能性
が少ないため、このグループの中で典型的に好ましいス
キャニングアミノ酸である[CunninghamとWells、Scienc
e,244:1081-1085(1989)]。アラニンはまた、それが最も
普通のアミノ酸であるため、典型的に好ましい。さら
に、それは埋もれた及び露出した位置の両方で頻繁に見
出される[Creighton,The Proteins(W.H.Freeman & Co.,
N.Y.);Chothia,J.Mol.Biol.,150:1(1976)]。もしアラニ
ン置換が変異体の要求量を生じないならば、アイソテリ
ックアミノ酸を使用することができる。
【０１３９】１７．ＰＲＯポリペプチドの修飾 ＰＲＯポリペプチドの共有結合修飾物は、本発明の範囲
内に含まれる。共有結合修飾の一つのタイプは、選択し
た側鎖又はＮかＣ末端残基と反応することができる有機
誘導化剤によって、ＰＲＯポリペプチドの標的としたア
ミノ酸残基を反応させることを含む。二官能剤による誘
導体化は、例えば抗-ＰＲＯポリペプチド抗体を精製す
るための方法において使用するために水不溶性支持体マ
トリックスに又は表面にＰＲＯポリペプチドを、及びそ
の反対を架橋するために有用である。普通に使用される
架橋剤は、例えば、1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェ
ニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスク
シンイミドエステル、例えば4-アジドサリチル酸とのエ
ステル、3,3'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオナ
ート)のようなジスクシンイミジルエステルを含むホモ
二官能イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-1,8-オク
タンのような二官能マレイミド、及びメチル-3-[(p-ア
ジドフェニル)ジチオ]プロピオイミダートのような剤を
含む。
【０１４０】他の修飾は、グルタミニルとアスパラギニ
ル残基をそれぞれ相当するグルタミルとアスパルチル残
基への脱アミド化、プロリンとリシンのヒドロキシル
化、セリル又はトレオニル残基の水酸基のリン酸化、リ
シン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基
のメチル化[T.E.Creighton,Proteins: Structure and M
olecular Properties,W.H.Freeman & Co.,San Francisc
o,pp.79-86(1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び
何れかのＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０１４１】本発明の範囲内に含まれるＰＲＯポリペプ
チドの共有結合修飾の別なタイプは、該ポリペプチドの
天然グリコシル化パターンを変えることを含む。「天然
グリコシル化パターンを変える」とは、天然配列ＰＲＯ
ポリペプチド中で見出される１以上の炭水化物部分を欠
失すること、及び／又は天然配列ＰＲＯポリペプチド中
に存在しない１以上のグリコシル化部位を加えること、
及び／又はグリコシル化部位に付着した糖残基の比率及
び／又は組成を変えることを意味すると、ここでの目的
のために意図される。
【０１４２】ＰＲＯポリペプチドへのグリコシル化部位
の付加は、アミノ酸配列を変えることによって達成し得
る。その変更は、例えば、天然配列ＰＲＯポリペプチド
への１以上のセリン又はトレオニン残基の付加、又はそ
れによる置換によって作製し得る（Ｏ-結合したグリコ
シル化部位の場合）。該ＰＲＯポリペプチドのアミノ酸
配列は、特にコドンが望まれるアミノ酸に翻訳されるで
あろうようにそれが生成されるよう、予備選択した塩基
で該ＰＲＯポリペプチドをコードしているＤＮＡを変異
することによって、ＤＮＡレベルでの変更を通して任意
に変更し得る。
【０１４３】ＰＲＯポリペプチドポリペプチド上の炭水
化物部分の数を増加するための別の手段は、ポリペプチ
ドへのグリコシドの化学的又は酵素的カップリングによ
るものである。そのような方法は、当該分野において、
例えば、1987年9月11日公開のＷＯ８７／０５３３０中
に、及びAplinとWriston,CRC Crit.Rev.Biochem.,259-3
06頁(1981)中に記載されている。
【０１４４】ＰＲＯポリペプチド上にある炭水化物部分
の除去は、化学的又は酵素的に、又はグリコシル化のた
めの標識として利用されるアミノ酸残基をコードしてい
るコドンの突然変異的置換によって達成し得る。化学的
な脱グリコシル化は、当該分野で周知であるとともに、
例えば、Hakimuddinら、Arch.Biochem.Biophys.,259:52
(1987)によって、及びEdgeら、Anal.Biochem.,118:131
(1981)によって記載される。ポリペプチド上の炭水化物
部分の酵素的な切断は、Thotakuraら、Meth. Enzymol.,
138:350(1987)により記載されたようなエンド-及びエキ
ソ-グリコシダーゼの使用によって達成することができ
る。
【０１４５】本発明のＰＲＯポリペプチドの共有結合修
飾の別なタイプは、米国特許第４６４０８３５；４４９
６６８９：４３０１１４４；４６７０４１７；４７９１
１９２又は４１７９３３７号中に記載される手法におい
て、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレング
リコール、又はポリオキシアルキレンのような各種の非
タンパク様ポリマーの一つにＰＲＯポリペプチドを結合
することを含む。
【０１４６】本発明のＰＲＯポリペプチドはまた、別
な、非相同ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＰ
ＲＯポリペプチドを含むキメラ分子を形成する手法にお
いても修飾され得る。一つの実施態様において、そのよ
うなキメラ分子は、ＰＲＯポリペプチドと、抗-標識抗
体(anti-tag antibody)が選択的に結合できるエピトー
プを提供する標識ポリペプチドとの融合体を含む。該エ
ピトープ標識は一般に、ＰＲＯポリペプチドのアミノ又
はカルボキシ末端に配される。そのようなエピトープ-
標識形(epitope-tagged forms)の存在は、該標識ポリペ
プチドに対する抗体を用いて検出することができる。ま
た、エピトープ標識の提供は、エピトープ標識に結合す
る抗-標識抗体又は別なタイプのアフィニティーマトリ
ックスを用いるアフィニティー精製によって容易に精製
されるＰＲＯポリペプチドを可能にする。代わりの実施
態様において、該キメラ分子は、ＰＲＯポリペプチド
と、免疫グロブリンとの又は免疫グロブリンの特有な領
域との融合を含み得る。キメラ分子の二価の形態のため
に、そのような融合はＩｇＧ分子のＦｃ領域までとする
ことができる。
【０１４７】各種の標識ポリペプチドとそのそれぞれの
抗体は、当該分野で良く知られる。実例は、ポリヒスチ
ジン（ポリ-his）又はポリヒスチジングリシン(ポリ-hi
s-gly)標識；ｆｌｕ ＨＡ標識ポリペプチドとその抗体
１２ＣＡ５[Fieldら、Mol.Cell.Biol.,8:2159-2165(198
8)]；ｃ-ｍｙｃ標識とそれの８Ｆ９，３Ｃ７，６Ｅ１
０，Ｇ４，Ｂ７，及び９Ｅ１０抗体[Evanら、Molecular
and Cellular Biology,5:3610-3616(1985)]；及び単純
ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）標識及びその
抗体[Paborskyら、Protein Engineering,3(6):547-553
(1990)]を含む。他の標識ポリペプチドは、Ｆｌａｇ-ペ
プチド[Hoppら、BioTechnology,6:1204-1210(1988)]；
ＫＴ３エピトープペプチド[Martinら、Science,255:192
-194(1992)]；α-チューブリンエピトープペプチド[Ski
nnerら、J.Biol.Chem.,266:15163-15166(1991)]；及び
Ｔ７遺伝子１０タンパク質ペプチド標識[Lutz-Freyermu
thら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6393-6397(1990)]を
含む。
【０１４８】１８．ＰＲＯポリペプチドの調製 以下の記載は、ＰＲＯポリペプチド核酸を含むベクター
によって形質転換した又はトランスフェクションした細
胞を培養することによるＰＲＯポリペプチドの調製に本
質的に関する。勿論、それはＰＲＯポリペプチドを製造
するために利用し得る、当該分野で周知の方法で代替す
ることが意図される。例えば、ＰＲＯポリペプチド配
列、又はその一部は、固相技術を用いて直接ペプチド合
成によって製造して良い[例えば、Stewartら、Solid-Ph
ase Peptide Synthesis,W.H.Freeman Co.,San Francisc
o,CA,(1969); Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,85:2149-215
4(1963)を参照]。インビトロタンパク質合成は、手動技
術を用いて又は自動によって実施して良い。自動化合成
は、例えば、製造者の指示に従ってApplied Biosystems
ペプチドシンセサイザー(Foster City,CA)を用いて達成
し得る。ＰＲＯポリペプチドの各部は、別々に化学合成
し、全長ＰＲＯポリペプチドを製造するための化学的又
は酵素的方法を用いて結合して良い。
【０１４９】Ａ．ＰＲＯポリペプチドをコードしている
ＤＮＡの単離 ＰＲＯポリペプチドをコードしているＤＮＡは、ＰＲＯ
ポリペプチドｍＲＮＡを持つとともに、それを検出可能
なレベルで発現すると思われる組織から調製したｃＤＮ
Ａライブラリーから得られる。従って、ヒトＰＲＯポリ
ペプチドＤＮＡは、実施例中に記載したようなヒト組織
から調製したｃＤＮＡライブラリーから利便的に得るこ
とができる。ＰＲＯポリペプチド-コード化遺伝子は、
ゲノムライブラリーから、或いはオリゴヌクレオチド合
成によって得ることもできる。
【０１５０】ライブラリーは、興味ある遺伝子又はそれ
によってコードしたタンパク質を同定するために設計し
たプローブ（ＰＲＯポリペプチドに対する抗体又は少な
くとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチドのよう
な）によってスクリーンすることができる。その選択し
たプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのス
クリーニングは、Sambrookら、Molecular Cloning:A La
boratory Manual(New York:Cold Spring Harbor Labora
tory Press,1989)中に記載されるような標準手法を用い
て処理し得る。望まれるＰＲＯポリペプチドをコードし
ている遺伝子を単離するための代替手段は、ＰＣＲ方法
論を使用することである[Sambrookら、上記；Dieffenba
chら、PCR Primer:A Laboratory Manual(Cold Spring H
arbor Laboratory Press,1995)]。
【０１５１】後述の実施例は、ｃＤＮＡライブラリーを
スクリーニングするための技術を記載する。プローブと
して選択したオリゴヌクレオチド配列は、擬陽性が最少
化されるように十分な長さにすると共に十分に明白なも
のにすべきである。そのオリゴヌクレオチドは、それが
スクリーンするべきライブラリー中のＤＮＡへのハイブ
リダイゼーションを検出できるように好ましくは標識さ
れる。標識化(labeling)の方法は、当該分野で周知であ
り、32Ｐ-標識したＡＴＰのような放射性標識、ビオチ
ン化、又は酵素標識を含む。中等度ストリンジェンシー
及び高度なストリンジェンシーを含むハイブリダイゼー
ション条件は、Sambrookら、上記、中に提供される。
【０１５２】そのようなライブラリースクリーニング法
で同定される配列は、寄託された及びＧｅｎＢａｎｋの
ような公共のデータベース又は他のプライベートな配列
データベースで利用可能な他の周知の配列と比較し且つ
アライメントすることができる。その分子の定められた
領域内の又は全長配列にわたる配列同一性（アミノ酸又
はヌクレオチドレベルでの何れか一方）は、相同性を測
定するため各種アルゴリズムを利用する、ＢＬＡＳＴ，
ＡＬＩＧＮ，ＤＮＡｓｔａｒ，及びＩＮＨＥＲＩＴのよ
うなコンピューターソフトウェアプログラムを用いた配
列アラインメントを経て決定することができる。
【０１５３】タンパク質コード配列を有する核酸は、初
めてここに記載した推定アミノ酸配列を用いて、もし必
要なら、プレカーサーを検出する及びｃＤＮＡに逆転写
されていないｍＲＮＡの中間体を加工するために、Samb
rookら、上記、中に記載したような通常のプライマー伸
長法を用いて、選択したｃＤＮＡ又はゲノムライブラリ
ーをスクリーニングすることによって得ることができ
る。
【０１５４】Ｂ．宿主細胞の選択と形質転換 宿主細胞は、ＰＲＯポリペプチド作製用にここに記載し
た発現又はクローニングベクターによって形質転換さ
れ、そしてプロモーターの誘導、形質転換体の選択、又
は望まれる配列をコードしている遺伝子の増幅のために
適切なように修正した通常の栄養培地中で培養される。
培地、温度、ｐＨなどのような培養条件は、過度の実験
なしに熟達した研究者であれば選択することができる。
一般に、細胞培養の生産性を最大化するための原理、プ
ロトコール、及び実践技術は、Mammalian Cell Biotech
nology: A Practical Approach,M.Butler,ed.(IRL Pres
s,1991)及びSambrookら、上記、中に見出すことができ
る。
【０１５５】トランスフェクションの方法は、例えば、
ＣａＰＯ4とエレクトロポレーションのように、当業者
に周知である。使用される宿主細胞に基づいて、形質転
換は、そのような細胞に対して適切な標準技術を用いて
実行される。Sambrookら、上記、に記載される塩化カル
シウムを用いるカルシウム処理、又はエレクトロポレー
ションは、一般に原核生物又は本質的に細胞壁バリアを
含む他の細胞用に使用される。アグロバクテリウム・チ
ュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)による
感染は、Shawら、Gene,23:315(1983)と1989年6月29日に
公開されたＷＯ８９／０５８５９によって記載されるよ
うなある種の植物細胞の形質転換のために使用される。
そのような細胞壁を持たない哺乳動物細胞のためには、
Grahamとvan der Eb,Virology,52:456-457(1978)のリン
酸カルシウム沈殿法が利用できる。哺乳動物細胞宿主系
形質転換の一般態様は、米国特許第４３９９２１６号中
に記載されている。酵母における形質転換は典型的に、
Van Solingenら、J.Bact.,130:946(1977)とHsiaoら、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.(USA),76:3829(1979)の方法に従って
行われる。しかしながら、核ミクロ注入、エレクトロポ
レーション、完全な細胞と細菌のプロトプラスト融合、
ポリカチオン、例えばポリブレン又はポリオルニチン、
のような細胞にＤＮＡを導入するための他の方法も使用
し得る。哺乳動物細胞を形質転換するための各種の技術
については、Keownら、Methods in Enzymology,185:527
-537(1990)とMansourら、Nature,336:348-352(1988)を
参照。
【０１５６】ここでのベクターにおいてＤＮＡをクロー
ニング又は発現するために好適な宿主細胞は、原核生
物、酵母、又は高等な真核生物を含む。適当な原核生物
は、真性細菌属に制限されることなく、グラム陰性又は
グラム陽性生物、例えば大腸菌のようなエシェリキア属
を含む。大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４(ATCC 31446)；大腸
菌Ｘ１７７６(ATCC 31537)；大腸菌Ｗ３１１０株(ATCC
27325)；及びＫ５ ７７２(ATCC 53635)のような各種の
大腸菌株が公的に利用可能である。他の好適な原核生物
宿主細胞は、例えば大腸菌のようなエシェリキア属、エ
ンテロバクター属、エルウイニア属、クレブシエラ属、
プロテウス属、サルモネラ属、例えばネズミチフス菌、
セラティア属、例えば霊菌、及びシゲラ属のような腸内
細菌科、同じくＢ．スブチリス、Ｂ．リケニホルミス
（例えば、Ｂ．リケニホルミス４１Ｐは1989年4月12日
に公開されたＤＤ２６６７１０中に開示される）のよう
なバチルス属、緑膿菌のようなシュードモナス属、及び
ストレプトマイセス属を含む。大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９
４(ATCC 31446)；大腸菌Ｘ１７７６(ATCC 31537)；大腸
菌Ｗ３１１０株(ATCC 27325)；及びＫ５ ７７２(ATCC 5
3635)のような各種の大腸菌株が公的に利用可能であ
る。これらの例示は、制限のためではなく説明のためで
ある。Ｗ３１１０株は、それが組み換えＤＮＡ製品発酵
のために普通の宿主株であるために特に好ましい宿主又
は親の一つである。好ましくは、該宿主細胞は、最少量
の蛋白分解酵素を分泌する。例えば、Ｗ３１１０株は、
完全な遺伝子型tonAを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ
２；完全な遺伝子型tonA ptr3を有する大腸菌Ｗ３１１
０株９Ｅ４；完全な遺伝子型tonA ptr3 phoA E15 (argF
-lac)169degP ompT kanrを有する大腸菌Ｗ３１１０株２
７Ｃ７(ATCC 55244)；完全な遺伝子型tonA ptr3 phoA E
15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanrを有する
大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性degT
欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４
０Ｂ４；及び1990年8月7日発行の米国特許第４９４６７
８３号中に開示される変異ペリプラズミックプロテアー
ゼを有する大腸菌株を含むそのような宿主の実例ととも
に、該宿主に内因性のタンパク質をコードしている遺伝
子中の遺伝的変異をもたらすように修正し得る。或い
は、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他
の核酸ポリメラーゼ反応が好適である。
【０１５７】原核生物に加えて、糸状真菌又は酵母のよ
うな真核微生物が、ＰＲＯポリペプチドをコードしてい
る核酸を含むベクターのための適当なクローニング又は
発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエは、普通
に用いられる下等な真核宿主微生物である。しかしなが
ら、多数の他の属、種、及び株が普通に利用でき且つこ
こで有用である、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ(B
eachとNurse, Nature,290: 140(1981); 1985年5月2日公
開のＥＰ１３９３８３)；クリベロマイセス宿主(米国特
許第４９４３５２９号；Fleerら、Bio/Technology, 9:9
68-975(1991))例えばＫ．ラクチス(MW98-8C, CBS683, C
BS4574; Louvencourtら、J. Bacteriol., 737(1983))、
Ｋ．フラジリス(ATCC 12424)、Ｋ．ブルガリクス(ATCC
16045)、Ｋ．ウイッケラミイ(ATCC 24178)、Ｋ．ワルチ
(ATCC 56500)、Ｋ．ドロソフィラルム(ATCC 36906; Van
den Bergら、Bio/Technology, 8:135(1990)、Ｋ．サー
モトレランス及びＫ．マキシアヌス；ヤロウィア(EP402
226)；ピシア・パストリス(EP183070；Sreekrishnaら、
J. Basic Microbiol., 28:265-278(1988))；カンジダ
属；トリコデルマ・リーシア(EP244,234)；ニューロス
ポラ・クラシア(Caseら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
76: 5259-5263(1979))；シュヴァニオミセス属、例え
ばシュヴァニオミセス・オクシデンタリス(1990年10月3
1日公開のEP394538)；及び糸状真菌、例えば、ニューロ
スポラ属、ペニシリウム属、トリポクラディウム属(199
1年1月10日公開のWO91/00357)のような、及びアスペル
ギルス属宿主、Ａ．ニドランス(Ballanceら、Biochem.
Biophys. Res. Commun., 112: 284-289(1983); Tilburn
ら、Gene, 26:205-221(1983); Yeltonら、Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 81:1470-1474(1984))及びＡ．ニガー
KellyとHynes, EMBO J., 4:475-479(1985)。メチロトロ
ピック酵母がここでは好適であり、制限されることなし
に、ハンセヌラ属、カンジダ属、クロエケラ属、ピシア
属、サッカロミセス属、トルロプシス属及びロドトルラ
属からなる属から選択されるメタノールで増殖可能な酵
母を含む。酵母のこのクラスの例示である特有の種のリ
ストは、C.Anthony, The Biochemistry of Methylotrop
hs, 269(1982)中に見出される。
【０１５８】グリコシル化ＰＲＯポリペプチドの発現用
に好適な宿主細胞は、多細胞生体から得られる。無脊椎
動物細胞の実例は、ショウジョウバエＳ２とスポドプテ
ラＳｆ９のような昆虫細胞、同じく植物細胞を含む。有
用な哺乳動物宿主細胞系の実例は、チャイニーズハムス
ター卵巣（ＣＨＯ）とＣＯＳ細胞を含む。より特有な例
は、ＳＶ４０によって形質転換したサル腎臓ＣＶ１系
(ＣＯＳ-７,ATCC CRL 1651)；ヒト胚腎臓系(２９３又は
懸濁培養での増殖用にサブクローンした２９３細胞、Gr
ahamら、J.Gen Virol.,36:59(1977))；チャイニーズハ
ムスター卵巣細胞/-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ、UrlaubとChasin,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980))；マウスセル
トーリ細胞(ＴＭ４，Mather,Biol.Reprod.,23:243-251
(1980))；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ATCC CCL 75)；ヒト肝
臓細胞(Hep G2, HB 8065)；及びマウス乳癌(MMT 06056
2, ATCC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、当業
者の範囲内と思われる。
【０１５９】Ｃ．複製可能ベクターの選択と使用 ＰＲＯポリペプチドをコードしている核酸（例えば、ｃ
ＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は、クローニングのため（そ
のＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能ベクターに
挿入し得る。各種のベクターが、公的に利用可能であ
る。該ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウ
イルス粒子、又はファージの形態とし得る。その適切な
核酸配列は、各種の手法によって該ベクター内に挿入し
得る。一般に、ＤＮＡは、当該分野で周知の技術を用い
て適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベ
クター構成要素は、一般に、制限されることなしに、１
以上のシグナル配列、複製の起点、１以上のマーカー遺
伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終止
配列を含む。これらの１以上の構成要素を含む適当なベ
クターの構築は、熟達した研究者に周知である標準的な
結紮技術を利用する。
【０１６０】興味あるＰＲＯポリペプチドは、直接的に
のみならず、シグナル配列又は成熟タンパク質又はポリ
ペプチドのＮ末端で特異的切断部位を有する他のポリペ
プチドとし得る非相同ポリペプチドとの融合ポリペプチ
ドとして組み換えによって製造し得る。一般に、該シグ
ナル配列は、ベクターの構成要素として良く、又はそれ
はベクターに挿入されるＰＲＯポリペプチド-コード化
ＤＮＡの一部とし得る。該シグナル配列は、例えばアル
カリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、又は心
臓-安定エンテロトキシンIIリーダーのような原核生物
のシグナル配列とし得る。酵母分泌用のシグナル配列
は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因
子リーダー(サッカロミセスとクリベロミセスα因子リ
ーダーを含む、後者は米国特許第５０１０１８２号中に
記載される)、又は酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．
アルビカンスグルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日
公開のEP362179)、又は1990年11月15日公開のＷＯ９０
／１３６４６に記載されたシグナルとして良い。哺乳動
物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列は、同じ又
は関連する種の分泌されたポリペプチドからのシグナル
配列のようなタンパク質の直接分泌、同じくウイルス分
泌リーダーに使用し得る。
【０１６１】発現及びクローニングベクターの両方は、
選択した宿主細胞の１以上の中でそのベクターの複製を
可能にする核酸配列を含む。そのような配列は、各種の
細菌、酵母、及びウイルスについて良く知られている。
プラスミドｐＢＲ３２２からの複製の起点は、大部分の
グラム陰性細菌用に好適であり、２μプラスミド起点
は、酵母用に好適であり、且つ各種のウイルス起点(Ｓ
Ｖ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、又はＢ
ＰＶ)は、哺乳動物細胞中のクローニングベクターに有
用である。
【０１６２】発現及びクローニングベクターは、典型的
に選択遺伝子、選択可能マーカーとも言われる、を含む
であろう。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質又は
他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトト
レキサート、又はテトラサイクリンに対する耐性を与え
る、（ｂ）補充栄養要求性欠如、又は（ｃ）例えばバチ
ルス属のＤ-アラニンラセマーゼをコードしている遺伝
子のような、複合培地から利用可能でない臨界栄養源の
供給、のタンパク質をコードする。
【０１６３】哺乳動物細胞用の適当な選択マーカーの実
例は、ＤＨＦＲ又はチミジンキナーゼのような、ＰＲＯ
ポリペプチド-コード核酸を取り込むための感応細胞の
同定を可能にするそれらである。野生型ＤＨＦＲが用い
られる場合に適当な宿主細胞は、Urlaubら、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA,77:4216(1980)によって記載されるように
製造され且つ増殖された、ＤＨＦＲ活性が不足したＣＨ
Ｏ細胞系である。酵母において使用するために適当な選
択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ
１遺伝子である[Stinchcombら、Nature,282:39(1979)；
Kingsmanら、Gene, 7:141(1979)；Tschemperら、Gene,1
0:157(1980)]。該ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中
で増殖する能力を欠いた酵母の変異株、例えば、ATCC N
o.44076又はPEP4-1用の選択マーカーを提供する[Jones,
Genetics,85:12(1977)]。
【０１６４】発現及びクローニングベクターは、ｍＲＮ
Ａ合成を導くためのＰＲＯポリペプチドコード核酸配列
に操作可能に結合したプロモーターを通例は含む。各種
の可能性のある宿主細胞によって認識されるプロモータ
ーは周知である。原核生物宿主で使用するために好適な
プロモーターは、β-ラクタマーゼとラクトースプロモ
ーター系[Changら、Nature,275:615(1978)；Goeddel
ら、Nature,281:544(1979)]、アルカリホスファター
ゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系[Goeddel, Nuc
leic Acids Res.,8:4057(1980); EP36776]、及びｔａｃ
プロモーターのようなハイブリッドプロモーター[deBoe
rら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:21-25(1983)]を含
む。細菌系において使用するためのプロモーターは、Ｐ
ＲＯポリペプチドをコードしているＤＮＡに操作可能に
結合したShine-Dalgarno(S.D.)配列をも含むであろう。
【０１６５】酵母宿主で使用するために適当なプロモー
ター配列の実例は、３-ホスホグリセラートキナーゼ[Hi
tzemanら、J.Biol.Chem.,255:2073(1980)]又はエノラー
ゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、
ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホス
ホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラー
ゼ、3-ホスホグリセラートムターゼ、ピルビン酸キナー
ゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグル
コースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼのような他の
解糖酵素[Hessら、J.Adv.Enzyme Reg.,7:149(1968);Hol
land,Biochemistry,17:4900(1978)]を含む。
【０１６６】増殖状態によって制御される転写の更なる
効果を有する誘導可能なプロモーターである、他の酵素
プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソ
シトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関係す
る分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-3
-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトースとガラクト
ース利用のための応答可能な酵素のプロモーター領域で
ある。酵母発現における使用のための適当なベクターと
プロモーターは、ＥＰ７３６５７中に更に記載される。
【０１６７】哺乳動物宿主細胞中のベクターからのＰＲ
Ｏポリペプチド転写は、例えばポリオーマウイルス、鶏
痘ウイルス(1989年7月5日公開のＵＫ２２１１５０４)、
アデノウイルス(アデノウイルス２のような)、ウシパピ
ローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイ
ルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びシミアン
ウイルス４０(SV40)のようなウイルスのゲノムから；非
相同哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモータ
ー又は免疫グロブリンプロモーター；及び宿主細胞系と
和合されるそのようなプロモーターを提供する、熱ショ
ックプロモーター、から得られたプロモーターによって
制御される。
【０１６８】より高等な真核生物によるＰＲＯポリペプ
チドをコードしているＤＮＡの転写は、ベクターへのエ
ンハンサー配列の挿入によって増加し得る。エンハンサ
ーは、通常約１０から３００ｂｐまでのＤＮＡのシス-
作用要素であり、その転写を増加するプロモーターに作
用する。多くのエンハンサー配列が哺乳動物から現在知
られている（グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、
α-フェトタンパク質、及びインスリン）。典型的に、
しかしながら、それは真核生物細胞ウイルスからのエン
ハンサーが使用されるだろう。実例は、複製起点の後の
側上のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００−２７０）、
サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、
複製起点の後方上のポリオーマエンハンサー、及びアデ
ノウイルスエンハンサーを含む。該エンハンサーは、Ｐ
ＲＯポリペプチドコード配列の位置５’又は３’でベク
ター内にスプライスされるが、しかし好ましくは該プロ
モーターから部位５’に配される。
【０１６９】真核生物細胞（酵母、カビ、昆虫、植物、
動物、ヒト、又は他の多細胞生物からの有核細胞）にお
いて使用される発現は、転写の終止のため及びｍＲＮＡ
を安定化するために必要な配列をも含むであろう。その
ような配列は普通、真核生物又はウイルスＤＮＡｓ又は
ｃＤＮＡｓの５’及び時折３’非翻訳領域から利用可能
である。これらの領域は、ＰＲＯポリペプチドをコード
しているｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル化フラ
グメントとして転写したヌクレオチドセグメントを含
む。
【０１７０】組換え脊椎動物細胞培養におけるＰＲＯポ
リペプチドの合成への適合のために好適な更に他の方
法、ベクター、及び宿主細胞は、Gethingら、Nature,29
3:620-625(1981); Manteiら、Nature,281:40-46(1979);
EP117060;とEP117058中に記載される。
【０１７１】Ｄ．遺伝子増幅／発現の検出 遺伝子増幅／発現は、直接試料で、例えば、ここに提供
した配列に基づいて、適切に標識したプローブを用い
て、通常のサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量す
るためのノーザンブロット法[Thomas, Proc.Natl.Acad.
Sci.USA,77:5201-5205(1980)]、ドットブロッティング
（ＤＮＡ分析）、又はin situハイブリダイゼーション
で測定し得る。あるいは、抗体は、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮ
Ａ二本鎖、及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二本鎖又は
ＤＮＡ-タンパク質二本鎖を含む特異的二本鎖を認識で
きるそれを利用し得る。その結果抗体は、標識されて良
く、且つ該アッセイは、その二本鎖がその表面上に二本
鎖の形成において、該二本鎖に結合した抗体の存在が検
出できるように表面に結合される場合、実行し得る。
【０１７２】あるいは遺伝子発現は、細胞の免疫組織学
的染色又は組織切片のような免疫学的方法及び遺伝子生
成物の発現を直接定量するため、細胞培養又は体液のア
ッセイによって測定し得る。流体試料の免疫組織学的染
色のために有用な抗体は、モノクローナル又はポリクロ
ーナルのいずれかとして良く、また何れの哺乳動物にお
いても作製し得る。利便的に、該抗体は、天然配列ＰＲ
Ｏポリペプチドに対して、又はここに提供したＤＮＡ配
列に基づく合成ペプチドに対して又はＰＲＯポリペプチ
ドＤＮＡと特異的抗体エピトープをコードしているもの
と融合した外因性配列に対して製造し得る。
【０１７３】Ｅ．ポリペプチドの精製 ＰＲＯポリペプチドの形成物は、培地又は宿主細胞溶解
物から回収し得る。もし膜に結合しているならば、それ
は適当な洗剤溶液(例えばTriton-X100)を用いて又は酵
素的な切断によってその膜から離すことができる。ＰＲ
Ｏポリペプチドの発現において用いた細胞は、凍結-融
解サイクル、音波処理、機械的粉砕、又は細胞溶解剤の
ような各種の物理的化学的手段によって破砕することが
できる。
【０１７４】それは組換え細胞タンパク質又はポリペプ
チドからＰＲＯポリペプチドを精製するために望まれる
であろう。以下の手法は、好適な精製手法の例示であ
る：イオン交換カラムでの分画によって；エタノール沈
殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカでの又はＤＥＡＥのようなカ
チオン交換樹脂でのクロマトグラフィー；クロマトフォ
ーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫安沈殿；例えばSEPHA
DEXTMG-75を用いたゲル濾過；ＩｇＧのような不純物を
除去するためのプロテインＡSEPHAROSETMカラム；及び
ＰＲＯポリペプチドのエピトープ-標識化形を結合する
金属キレート化カラム。タンパク質精製の各種の方法を
用いて良く、さらにそのような方法は当該分野で周知で
あり、且つ、例えば、Deutscher,Methods in Enzymolog
y,182(1990);及びScopes, Protein Purification: Prin
ciples and Practice (Springer-Verlag: New York,198
2)中に記載される。選択した精製工程は、例えば使用し
た生生成物の及び生産した特有のＰＲＯポリペプチドの
本質に基づくであろう。
【０１７５】１９．ＰＲＯポリペプチドの使用 本発明のＰＲＯポリペプチドをコードしているヌクレオ
チド配列（又はその相補体）は、染色体及び遺伝子マッ
ピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡとＤＮＡの生
成においてハイブリダイゼーションプローブとしての使
用を含む、当該分野及び分子生物学の分野における各種
の適用を有する。ＰＲＯポリペプチド-コード核酸は、
ここに記載した組換え技術によってＰＲＯポリペプチド
の製造用にも有用であろう。
【０１７６】全長天然配列ＰＲＯポリペプチド-コード
核酸又はその一部は、全長ＰＲＯポリペプチド遺伝子を
単離するための、或いはＰＲＯポリペプチド核酸配列と
同一の望まれる配列を有する、更に他の遺伝子（例え
ば、ＰＲＯポリペプチドの天然発生変異体又は他の種か
らのＰＲＯポリペプチド）を単離するためのｃＤＮＡラ
イブラリー用のハイブリダイゼーションプローブとして
使用し得る。任意に、該プローブの長さは、約２０乃至
約５０塩基とされるであろう。該ハイブリダイゼーショ
ンプローブは、ここに開示した何れかのＤＮＡ分子のヌ
クレオチド配列から、或いは天然配列ＰＲＯポリペプチ
ドコード化ＤＮＡのプロモーター、エンハンサー要素及
びイントロンを含むゲノム配列から得ることができる。
例えば、スクリーニング法は、約４０塩基の選択したプ
ローブを合成するための周知のＤＮＡ配列を用いてＰＲ
Ｏポリペプチド遺伝子のコード化領域を単離することを
含むであろう。ハイブリダイゼーションプローブは、32
Ｐ又は35Ｓのような放射性ヌクレオチド、又はアビジン
／ビオチン結合系に結合したアルカリホスファターゼの
ような酵素標識を含む、各種の標識によって標識し得
る。本発明のＰＲＯポリペプチド遺伝子のそれに相補な
配列を有する標識化プローブは、プローブをハイブリダ
イズするそのようなライブラリーのメンバーを決定する
ためヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はｍＲＮＡのライ
ブラリーをスクリーンするために使用することができ
る。ハイブリダイゼーション技術は、後述の実施例中に
更に詳細に記載される。
【０１７７】本出願中に開示したＥＳＴｓは、ここに開
示した方法を用いて、プローブと同様に利用し得る。
【０１７８】該プローブはまた、密接に関係したＰＲＯ
ポリペプチド配列の同定のための配列のプールを生成す
るためのＰＣＲ技術においても利用し得る。
【０１７９】ＰＲＯポリペプチドをコードしているヌク
レオチド配列はまた、ＰＲＯポリペプチドをコードする
その遺伝子のマッピングのため及び遺伝的疾患を持つ個
人の遺伝的分析のためのハイブリダイゼーションプロー
ブを構築するためにも使用できる。ここに提供されたヌ
クレオチド配列は、in situハイブリダイゼーション、
周知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラ
リーによるハイブリダイゼーションスクリーニングのよ
うな周知技術を用い、染色体及び染色体の特有の領域に
マッピングし得る。
【０１８０】ＰＲＯポリペプチド用のコード配列が別な
タンパク質に結合するタンパク質をコードする場合に、
該ＰＲＯポリペプチドは、そのリガンドを同定するため
のアッセイにおいて使用することができる。同様に、レ
セプター／リガンド結合相互作用のインヒビターを同定
することができる。そのような結合相互作用に含まれた
タンパク質はまた、ペプチド又は小分子インヒビター又
は結合相互作用のアゴニストをスクリーンするために使
用することもできる。スクリーニングアッセイは、天然
ＰＲＯポリペプチド又はＰＲＯポリペプチド用レセプタ
ーの生物学的活性を模倣するリード化合物を見出すため
に設計することができる。そのようなスクリーニングア
ッセイは、小分子薬剤候補を同定するために特に好適な
それらを作る、化合物ライブラリーの高スループットス
クリーニングに服しやすいアッセイを含むであろう。意
図される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。該
アッセイは、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生
化学スクリーニングアッセイ、免疫アッセイ及び当該分
野において十分に特徴付けされる細胞ベースのアッセイ
を含む、各種の方式において実行することができる。
【０１８１】ＰＲＯポリペプチド又は何れかのその修正
された形態をコードしている核酸は、治療的に有効な試
薬の開発又はスクリーニングにおいて、その結果有用で
あるトランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物
の何れか一方を生産するためにも使用できる。トランス
ジェニック動物（例えばマウス又はラット）は、出生前
の、例えば胎児段階で、トランスジーンがその動物に、
又はその動物の親に導入された、トランスジーンを含む
細胞を有する動物である。トランスジーンは、開発する
トランスジェニック動物からの細胞のゲノム内に導入さ
れるＤＮＡである。一つの実施態様において、ＰＲＯポ
リペプチドをコードしているｃＤＮＡは、ＰＲＯポリペ
プチドをコードしているＤＮＡを発現する細胞を含むト
ランスジェニック動物を生成するために用いた確立した
技術及びゲノムの配列に従いＰＲＯポリペプチドをコー
ドしているゲノムＤＮＡをクローンするため使用するこ
とができる。トランスジェニック動物、特にマウス又は
ラットのような動物を作製するための方法は、当該分野
において通常的になされており、例えば米国特許第４７
３６８６６と４８７０００９号中に記載される。典型的
に、個々の細胞は、組織特異的エンハンサーによるＰＲ
Ｏポリペプチドトランスジーン組み込みのための標的と
されるであろう。胎児段階でその動物の生殖細胞系に導
入したＰＲＯポリペプチドをコードしているトランスジ
ーンのコピーを含むトランスジェニック動物は、ＰＲＯ
ポリペプチドをコードしているＤＮＡの増加した発現の
作用を実験するために用いることができる。そのような
動物は、例えば、それの過剰発現と関連した病的状態か
らの保護を与えることを通して試薬のためのテスター動
物として使用することができる。本発明のこの態様に従
い、動物はその試薬で治療され、その病的状態の可能性
のある治療的な介入を示すであろう、該トランスジーン
を持つ治療しない動物と比べて、病的状態の発生が減じ
られる。
【０１８２】あるいは、「ノックアウト」動物は、該ポ
リペプチドをコードしている内因性遺伝子と、該動物の
胚細胞に導入した同じポリペプチドをコードしている変
更したゲノムＤＮＡとの間の相同組換えの結果として、
興味あるＰＲＯポリペプチドをコードしている欠陥のあ
る又は変更された遺伝子を有するものを構築することが
できる。例えば、ＰＲＯポリペプチドをコードしている
ｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ＰＲＯポリペプチ
ドをコードしているゲノムＤＮＡをクローンするために
用いることができる。ＰＲＯポリペプチドをコードして
いるゲノムＤＮＡの一部は、欠失されるか、或いはモニ
ター組込みに用いることができる選択可能なマーカーを
コードしている遺伝子のような、別な遺伝子と置換する
ことができる。典型的に、変更していない隣接ＤＮＡの
数キロ塩基（５’と３’での両方）は、ベクター中に含
まれる[例えば、相同組換えベクターの記載についてのT
homasとCapecchi,Cell,51:503(1987)を参照]。該ベクタ
ーは、胚の幹細胞系内に導入され（例えばエレクトロポ
レーションで）、内因性ＤＮＡで相同的に組み換えられ
ている導入されたＤＮＡで細胞が選択される[例えば、L
iら、Cell,69:915(1992)を参照]。選択した細胞は、次
いで凝集キメラを形成するために動物（例えばマウス又
はラット）の芽細胞に注入される[例えば、Bradley,Ter
atocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practica
l Approach,E.J.Robertson,ed.(IRL,Oxford,1987),113-
152頁中を参照]。キメラの胚は、適当な偽妊娠メス里親
動物に移植することができ、その胚は「ノックアウト」
動物が生成するまで成長させる。それの生殖細胞におけ
る相同的に組換えたＤＮＡを持った子孫は、標準的な技
術によって同定することができ、相同的に組み換えたＤ
ＮＡを含むその動物の全ての全ての細胞が動物繁殖に使
用できる。ノックアウト動物は、例えば、ある種の病的
状態に対して防御するその能力によって及びＰＲＯポリ
ペプチドの不在のための病的状態のその進行によって特
徴付けできる。
【０１８３】ＰＲＯポリペプチドのインビトロ投与が利
用される場合、正常な用量は、投薬のルートに基づい
て、約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ動物体重又
は１日当たりまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日乃至
１０ｍｇ／ｋｇ／日に変更し得る。特有な用量とデリバ
リーの方法のためのガイダンスは、文献中に提供されて
いる；例えば米国特許第４６５７７６０；５２０６３４
４；又は５２２５２１２号を参照。異なる処方は、一つ
の器官又は組織を標的化する投与が、例えば別の器官又
は組織のそれとは異なる手法でデリバリーを必要とする
であろう異なる治療用化合物と異なる疾患のために有効
となるであろう。
【０１８４】ＰＲＯポリペプチドの徐放性投与がＰＲＯ
ポリペプチドの必要とされる何れかの疾患或いは疾病の
治療に好適な放出特性を持つ処方に望まれる場合、ＰＲ
Ｏポリペプチドのミクロカプセル化が企図される。遅延
した放出用の組換えタンパク質のミクロカプセル化は、
ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、インターフェロン-
（ｒｈＩＦＮ-）、インターロイキン-２、及びＭＮｒｇ
ｐ１２０で成功裏に行われている。Johnsonら、Nat.Me
d.,2:795-799(1996);Yasuda,Biomed.Ther.,27:1221-122
3(1993);Horaら、Bio/Technology,8:755-758(1990);Cle
land,"Design andProduction of Single Immunization
Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphe
re Systems,"in Vaccine Design:The Subunit and Adju
vant Approach,Powell and Newman,eds,(Plenum Press:
New York,1995)439-462頁；ＷＯ９７／０３６９２，Ｗ
Ｏ９６／４００７２，ＷＯ９６／０７３９９；及び米国
特許第５６５４０１０号。
【０１８５】これらのタンパク質の徐放性処方は、その
生物和合性及び広範な生物分解特性のため、ポリ-乳酸-
共グリコール酸（ＰＬＧＡ）を用いて開発された。ＰＬ
ＧＡ、乳酸及びグリコール酸の分解生成物は、ヒトの体
内で迅速に分解できる。その上、このポリマーの分解
は、その分子量と組成に基づいて、数ヶ月から数年まで
調節することができる。Lewis,"Controlled release of
bioactive agents fromlactide/glycolide polymer,"i
n:M.ChasinとR.Langer(Eds.),Biodegradable Polymers
as Drug Delivery Systems(Marcel Dekker:New York,19
90)1-41頁。
【０１８６】例えば、８５ｋｇの最大体重を持った哺乳
動物においてほぼ８０g/kg/日の用量を提供することが
できる処方のためには、最も多い用量は、１日当たりＰ
ＲＯポリペプチドのほぼ６．８ｍｇとされるであろう。
この用量レベルを達成するために、最も低いと思われる
最初のバースト（＜２０％）とともに最大と思われる負
荷タンパク質(15-20%w/wＰＲＯポリペプチド）を含む徐
放性処方が必要である。１−２週間ミクロ粒子からのＰ
ＲＯポリペプチドの継続（ゼロ-オーダー）放出もまた
望まれる。加えて、放出すべき被包化タンパク質は、望
まれる放出期間にわたりその形状及び安定性を維持すべ
きである。
【０１８７】内因性ビグリカンタンパク質のそれに放出
される生物学的活性を所有する本発明のＰＲＯ２４１ポ
リペプチドは、治療目的のインビボ及びインビトロの両
方で利用し得る。当業者であれば、そのような目的のた
めに本発明のＰＲＯ２４１ポリペプチドをどのように利
用するかを十分に承知しているであろう。
【０１８８】コルディン(chordin)（ＣＨＤ）は、示差
的な顔の特徴(低い前毛髪線、眉毛叢生症、前傾の外鼻
孔、上顎前突症、長い人中、こい口(carp mouth))、出
生前又は出生後の成長遅延、精神遅延及び、しばしば、
しかし常時ではない上肢奇形によって特徴付けられるコ
ルネリア・ド・ランゲ症候群として知られる異形症候群
のための候補遺伝子である。また、ＣＤＬが血小板減少
症との関連において存在するレアケースもある。ＣＤＬ
の遺伝子は、3q26.3(OMIM#122470)への結合によってマ
ップされている。初期アフリカツメガエル(early Xenop
us)パターン化におけるＸｃｈｄ（アフリカツメガエル
コルディン(Xenopus chordin)）包含及び神経系統発育
は、興味のある候補遺伝子中にＣＨＤを作る。ＣＨＤ
は、染色体３上の適切な領域にマップされる。それはＴ
ＨＰＯに非常に密接し、ＴＨＰＯとＣＨＤの両方を包含
する欠失は、血小板減少症と発育異形症のレアケースに
帰結できる。全成人組織の大部分がＣＨＤ発現に対して
陰性である顕現したＣＤのin situ分析において、僅か
に陽性のシグナルが、長い骨の発育と推定上の成長にお
いてＣＨＤを関連させる大腿骨頭と寛骨臼（股関節）と
の間に形成される発育中の滑膜性の連結の割線において
観測された。そのような機能は、もし混乱したならば、
成長遅延をもたらすことができる。
【０１８９】ｃＤＮＡから予測したヒトＣＨＤアミノ酸
配列は、Ｘｃｈｄに５０％同一性（及び６６％保存され
た）である。４システイン-富ドメイン中の全ての４０
システインが保存される。これらのシステイン富ドメイ
ンは、トロンボスポンジン、プロコラーゲン及びフォン
・ビルブラント因子中で観測されたそれらに類似してい
る。Bornstein,P.FASEB J 6:3290-3299(1992);Hunt,L.&
Barker,W.Biochem.Biophys.Res.Commun.144:876-882(1
987)。
【０１９０】ヒトＣＨＤ座（ゲノムＰＲＯ２４３）は、
ゲノムＤＮＡの９．６ｋｂ中に２３エキソンを含む。Ｃ
ｐＧ島は、５’及びエキソン１のほぼ１００ｂｐ５’で
始まる５’で配置され、且つ該遺伝子の第１のイントロ
ン内に第１のエキソンと末端を通して延長される。ＴＨ
ＰＯとＣＨＤ配座は、その転写開始部位を分離するほぼ
２．２ｋｂの頭−頭(head-to-head)形態で構成される。
タンパク質レベルで、ＰＲＯ２４３は、アフリカツメガ
エルコルディン(Xchd)に５１％同一性である。１のアミ
ノ末端と３のカルボキシ末端システイン-富クラスター
中の４０システインの全てが保存される。
【０１９１】ＰＲＯ２４３は、残基１乃至約２３でシグ
ナル配列を有する９５４アミノ酸ポリペプチドである。
４のシステインクラスター：（１）残基約５１乃至約１
２５；（２）残基約７０５乃至約７６１；（３）残基約
７８４乃至約８４９；及び（４）残基約８９７乃至約９
３１、がある。残基約３１５乃至約３９６で潜在ロイシ
ンジッパーと、残基２１７，３５１，３６５と４３４で
Ｎ-グリコシル化部位がある。
【０１９２】ＰＲＯ２９９ポリペプチドと切痕タンパク
質に相同性を有するその部分は、インビボでの治療目的
のために、同じく各種の他の適用のために有用となり得
る。新規の切痕タンパク質と関連した分子の同定は、発
育に作用するそれらのような多数のヒトの疾患に関連付
けできる。かくして、新規切痕タンパク質と切痕様分子
の同定は、そのようなタンパク質が、各種の異なるヒト
の疾患のための潜在的な治療として奉仕し得るそれにお
いて特に重要である。そのようなポリペプチドはまた、
バイオテクノロジーと医学リサーチ同じく各種の工業的
な適用において重要な役割を演じ得る。結果として、Ｐ
ＲＯ２９９のような新規の分子において特有な科学的及
び医学的な興味がある。
【０１９３】１以上の内因性ジペプチダーゼタンパク質
のそれに関連した生物学的活性を所有する本発明のＰＲ
Ｏ３２３ポリペプチドは、治療的目的のためにインビボ
とインビトロの両方で利用し得る。当業者であれば、そ
のような目的のために本発明のＰＲＯ３２３ポリペプチ
ドをどのように利用するか十分に承知しているだろう。
【０１９４】内因性プロラクチンレセプタータンパク質
のそれに関連した生物学的活性を所有する本発明のＰＲ
Ｏ３２７ポリペプチドは、治療的目的のためにインビボ
とインビトロの両方で利用し得る。当業者であれば、そ
のような目的のために本発明のＰＲＯ３２７ポリペプチ
ドをどのように利用するか十分に承知しているだろう。
プロラクチンに結合する能力を所有するＰＲＯ３２７ポ
リペプチドは、プロラクチンアンタゴニストとしてイン
ビボとインビトロの両方で機能し得る。
【０１９５】ＰＲＯ２３３ポリペプチドと還元酵素に相
同性を有するその部分はまた、インビボでの治療目的の
ために、同じく各種の他の適用のために有用となり得
る。新規の還元酵素タンパク質と関連した分子の同定
は、炎症性疾患、器官不全、アテローム性動脈硬化症、
心臓損傷、不妊症、出生時欠損、成熟前老化、ＡＩＤ
Ｓ、癌、糖尿病合併症及び一般の変異のような多数のヒ
トの疾患に関連付けできる。多数の疾患プロセスにおい
て重要な役割を演じるように思える酸素フリーラジカル
と抗酸化剤を与える新規還元酵素タンパク質と還元酵素
様分子の同定は、そのようなタンパク質が、各種の異な
るヒトの疾患のための潜在的な治療として奉仕し得るそ
れにおいて特に重要である。そのようなポリペプチドは
また、バイオテクノロジーと医学リサーチ同じく各種の
工業的な適用において重要な役割を演じ得る。結果とし
て、ＰＲＯ２３３のような新規の分子において特有な科
学的及び医学的な興味がある。
【０１９６】ＰＲＯ３４４ポリペプチドと補体(complem
ent)タンパク質に相同性を有するその部分はまた、イン
ビボでの治療目的のために、同じく各種の他の適用のた
めに有用となり得る。新規補体タンパク質と関連分子の
同定は、免疫系の細胞の炎症応答に作用するような多数
のヒトの疾患に関連付けされる。かくして、新規補体タ
ンパク質と補体様分子の同定は、そのようなタンパク質
が、各種の異なるヒトの疾患のための潜在的な治療とし
て奉仕し得るそれにおいて特に重要である。そのような
ポリペプチドはまた、バイオテクノロジーと医学リサー
チ同じく各種の工業的な適用において重要な役割を演じ
得る。結果として、ＰＲＯ３４４のような新規の分子に
おいて特有な科学的及び医学的な興味がある。
【０１９７】システイン-富分泌タンパク質のそれに関
連した生物学的活性を所有する本発明のＰＲＯ３４７ポ
リペプチドは、治療的目的のためにインビボとインビト
ロの両方で利用し得る。当業者であれば、そのような目
的のために本発明のＰＲＯ３４７ポリペプチドをどのよ
うに利用するか十分に承知しているだろう。
【０１９８】インター-アルファ-トリプシンインヒビタ
ータンパク質の重鎖のそれに関連した生物学的活性を所
有する本発明のＰＲＯ３５４ポリペプチドは、治療的目
的のためにインビボとインビトロの両方で利用し得る。
当業者であれば、そのような目的のために本発明のＰＲ
Ｏ３５４ポリペプチドをどのように利用するか十分に承
知しているだろう。
【０１９９】ＰＲＯ３５５ポリペプチドとＣＲＴＡＭに
相同性を有するその部分はまた、インビボでの治療目的
のために、同じく各種の他の適用のために有用となり得
る。Ｔ細胞に関連付けられる新規分子の同定は、一般に
免疫系に含まれる病状のような多数のヒトの疾患に関連
付けられる。多数の疾患プロセスにおいて重要な役割を
演じるＣＲＴＡＭタンパク質結合抗体を与える、新規Ｃ
ＲＴＡＭタンパク質とＣＲＴＡＭ様分子の同定は、その
ようなタンパク質が、各種の異なるヒトの疾患のための
潜在的な治療として奉仕し得るそれにおいて特に重要で
ある。そのようなポリペプチドはまた、バイオテクノロ
ジーと医学リサーチ同じく各種の工業的な適用において
重要な役割を演じ得る。結果として、ＰＲＯ３５５のよ
うな新規の分子において特有な科学的及び医学的な興味
がある。
【０２００】ＰＲＯ３５７は、ＡＬＳに関してその活性
を測定するためにＡＬＳとの競合結合アッセイにおいて
使用することができる。その上、ＰＲＯ３５７は、より
長いインビボでの半減期を有するものに複合化し得るポ
リペプチドを延長するかを測定するためのアッセイにお
いて使用することができる。ＰＲＯ３５７は、又それが
相同性を有するカルボキシペプチダーゼとのアッセイに
おいて同様に使用することができる。その結果は、それ
相応に適用することができる。
【０２０１】タンパク質の腫瘍壊死因子ファミリーのそ
れに関連した生物学的活性を所有する本発明のＰＲＯ７
１５ポリペプチドは、治療的目的のためにインビボとイ
ンビトロの両方で利用し得る。当業者であれば、そのよ
うな目的のために本発明のＰＲＯ７１５ポリペプチドを
どのように利用するか十分に承知しているだろう。ＰＲ
Ｏ７１５ポリペプチドは、それに特異的なレセプターに
結合し、それによってそのようなレセプターを活性化す
ることが予期される。本発明のＰＲＯ７１５ポリペプチ
ドの変異体は、その特異的レセプター活性のアゴニスト
或いはアンタゴニストとして機能し得る。
【０２０２】ＰＲＯ３５３ポリペプチドと補体(complem
ent)タンパク質に相同性を有するその部分はまた、イン
ビボでの治療目的のために、同じく各種の他の適用のた
めに有用となり得る。新規補体タンパク質と関連分子の
同定は、免疫系の細胞の炎症応答に作用するような多数
のヒトの疾患に関連付けされる。かくして、新規補体タ
ンパク質と補体様分子の同定は、そのようなタンパク質
が、各種の異なるヒトの疾患のための潜在的な治療とし
て奉仕し得るそれにおいて特に重要である。そのような
ポリペプチドはまた、バイオテクノロジーと医学リサー
チ同じく各種の工業的な適用において重要な役割を演じ
得る。結果として、ＰＲＯ３５３のような新規の分子に
おいて特有な科学的及び医学的な興味がある。
【０２０３】ＰＲＯ３６１ポリペプチドと、ムチン及び
キチナーゼタンパク質に相同性を有するその部分はま
た、インビボでの治療目的のために、同じく各種の他の
適用のために有用となり得る。新規ムチン及びキチナー
ゼタンパク質と関連分子の同定は、癌或いは細胞表面分
子又はレセプターに含まれるそれらのような多数のヒト
の疾患に関連付けされる。かくして、新規ムチン及びキ
チナーゼタンパク質の同定は、そのようなタンパク質
が、各種の異なるヒトの疾患のための潜在的な治療とし
て奉仕し得るそれにおいて特に重要である。そのような
ポリペプチドはまた、バイオテクノロジーと医学リサー
チ同じく各種の工業的な適用において重要な役割を演じ
得る。結果として、ＰＲＯ３６１のような新規の分子に
おいて特有な科学的及び医学的な興味がある。
【０２０４】ＰＲＯ３６５ポリペプチドと、ヒト２−１
９タンパク質に相同性を有するその部分はまた、インビ
ボでの治療目的のために、同じく各種の他の適用のため
に有用となり得る。新規ヒト２−１９タンパク質と関連
分子の同定は、免疫系の細胞の結合或いは活性を調節す
るような多数のヒト疾患に関連付けられる。かくして、
新規ヒト２−１９タンパク質とヒト２−１９タンパク質
様分子の同定は、そのようなタンパク質が、各種の異な
るヒトの疾患のための潜在的な治療として奉仕し得るそ
れにおいて特に重要である。そのようなポリペプチドは
また、バイオテクノロジーと医学リサーチ同じく各種の
工業的な適用において重要な役割を演じ得る。結果とし
て、ＰＲＯ３６５のような新規の分子において特有な科
学的及び医学的な興味がある。
【０２０５】２０．抗-ＰＲＯポリペプチド抗体 本発明は、さらに抗-ＰＲＯポリペプチド抗体を提供す
る。典型的な抗体は、ポリクローナル、モノクローナ
ル、ヒト化、二重特異的、及びヘテロ接合抗体を含む。
【０２０６】Ａ．ポリクローナル抗体 本発明の抗-ＰＲＯポリペプチド抗体は、ポリクローナ
ル抗体を含み得る。ポリクローナル抗体の製造方法は、
熟達した研究者に周知である。ポリクローナル抗体は、
例えば、免疫化剤の、及び望まれるなら、アジュバント
とともに１回以上の注射によって哺乳動物中に生じさせ
ることができる。典型的に、該免疫化剤及び／又はアジ
ュバントは、多重皮下又は腹腔内注射によって該哺乳動
物に注射されるであろう。該免疫化剤は、ＰＲＯポリペ
プチド又はその融合タンパク質を含み得る。それは、免
疫化される哺乳動物において免疫原であることが知られ
たタンパク質に対する免疫化剤を接合するために有用と
なり得る。そのような免疫原性タンパク質の実例は、制
限されることなしに、キーホールリンペットヘモシアニ
ン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、及びダイズ
トリプシンインヒビターを含む。利用し得るアジュバン
トの実例は、フロイント完全アジュバントとＭＰＬ-Ｔ
ＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレ
ハロースジコリノマイコラート）を含む。該免疫化プロ
トコールは、過度の実験なしに当業者によって選択され
得る。
【０２０７】Ｂ．モノクローナル抗体 抗-ＰＲＯポリペプチド抗体は、それに代えてモノクロ
ーナル抗体とし得る。モノクローナル抗体は、Kohlerと
Milstein,Nature,256:495(1975)によって記載されたそ
れらのようなハイブリドーマ法を用いて作製し得る。ハ
イブリドーマ法において、マウス、ハムスター、又は他
の適当な宿主動物が、免疫化剤に特異的に結合するであ
ろう抗体を生成する又は精製することができるリンパ球
を引き出すための免疫化剤によって典型的に免疫化され
る。あるいは、該リンパ球はインビトロで免疫化し得
る。
【０２０８】該免疫化剤は、興味あるＰＲＯポリペプチ
ド又はその融合タンパク質を典型的に含むであろう。一
般に、もしヒト起源の細胞が望まれるなら末梢血液リン
パ球("ＰＢＬｓ")が使用され、或いは非ヒト哺乳動物源
が望まれるなら脾臓細胞又はリンパ節細胞が用いられ
る。該リンパ球は、次いでハイブリドーマ細胞を形成す
るために、ＰＥＧのような適当な融合化剤を用いて、不
朽化細胞系に融合される[Goding,Monoclonal Antibodie
s: Principles and Practice,Academic Press,(1986)59
-103頁]。不朽化細胞系は、哺乳類細胞、特に齧歯類の
骨髄腫細胞、ウシ、及びヒト起源が通例形質転換され
る。通例、ラット又はマウス骨髄腫細胞系が利用され
る。該ハイブリドーマ細胞は、融合していない不朽化細
胞の増殖又は生存を阻害する１以上の物質を好ましくは
含む適当な培養培地中で培養し得る。例えば、もしその
親細胞が酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠く
ならば、そのハイブリドーマ用の培養培地は、ＨＧＰＲ
Ｔ欠損細胞の増殖を阻害する物質、ヒポキサンチン、ア
ミノプテリン、及びチミジンを典型的に含むであろう
(「ＨＡＴ培地」)。
【０２０９】好ましい不朽化細胞系は、十分に融合す
る、選択した抗体生産細胞によって抗体の安定な抗レベ
ル発現を支持する、且つそのようなＨＡＴ培地のような
培地に感受性であるそれらである。より好ましい不朽化
細胞系は、例えば、Salk Insitute Cell Distribution
Center,San Diego,California,及びAmerican Type Cult
ure Collection,Rockville,Marylandから得ることがで
きるネズミ骨髄腫系である。ヒト骨髄腫及びマウス-ヒ
トヘテロ骨髄腫細胞系はまた、ヒトモノクローナル抗体
の生産のために記載されている[Kozbor, J.Immunol.,13
3:3001(1984);Brodeurら、Monoclonal Antibody Produc
tion Techniques and Applications (Marcel Dekker,In
c.,New York,(1987)51-63頁]。
【０２１０】ハイブリドーマが培養される培養培地は、
次いで興味あるＰＲＯポリペプチドに対するモノクロー
ナル抗体の存在について測定することができる。好まし
くは、該ハイブリドーマ細胞によって製造されたモノク
ローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって又はラ
ジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素免疫吸着測定法
(ＥＬＩＳＡ)のようなインビトロ結合アッセイによって
測定される。そのような技術と測定法は、当該分野で周
知である。該モノクローナル抗体の結合親和性は、例え
ば、MunsonとPollard,Anal.Biochem.,107:220(1980)の
スキャッチャード分析によって測定することができる。
【０２１１】望まれるハイブリドーマが同定された後、
そのクローンは、制限希釈法と標準法による増殖によっ
てサブクローンし得る[Goding,上記]。この目的のため
の適当な培養培地は、例えば、Dulbecco's修正イーグル
培地とＲＰＭＩ-１６４０培地を含む。あるいは、該ハ
イブリドーマ細胞は、哺乳動物中の腹水としてインビボ
で増殖し得る。
【０２１２】サブクローンによって分泌されるモノクロ
ーナル抗体は、例えばプロテインＡ-Sepharose、ヒドロ
キシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透
析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような通
常の免疫グロブリン精製法によって培地又は腹水液から
単離又は精製し得る。
【０２１３】モノクローナル抗体はまた、米国特許第４
８１６５６７号中に記載されるそれらのような組換えＤ
ＮＡ法によっても作製し得る。本発明のモノクローナル
抗体をコードしているＤＮＡは、通常の手法（例えば、
ネズミ抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特
異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いる
ことによって）を用いて容易に単離及び配列決定するこ
とができる。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのよう
なＤＮＡの好ましい供給源として利用される。一度単離
した該ＤＮＡは、発現ベクターの中に組み込むことがで
き、次いで組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体
の合成を得るため、他の免疫グロブリンタンパク質を生
産しない類人猿ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵
巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞のような宿主細胞
内にトランスフェクトされる。そのＤＮＡはまた、例え
ば相同ネズミ配列[米国特許第４８１６５６７号；Morri
sonら、上記]の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン
のコード化配列で置換することにより、又は非免疫グロ
ブリンポリペプチドのコード化配列の全部又は一部を免
疫グロブリンコード化配列に共有結合接続することによ
って修正され得る。そのような非免疫グロブリンポリペ
プチドは、本発明の抗体の定常ドメインを置換すること
ができ、又はキメラ二価抗体を創造するように本発明の
抗体の１の抗原結合部位の可変領域と置換することがで
きる。
【０２１４】該抗体は、一価抗体とし得る。一価抗体を
製造するための方法は、当該分野で周知である。例え
ば、一つの方法は、免疫グロブリン軽鎖と修正した重鎖
との組換え発現を含む。該重鎖は、重鎖架橋化を防ぐた
め、Ｆｃ領域中の何れかのポイントで一般に端切りされ
る。あるいは、関係のあるシステイン残基は、他のアミ
ノ酸残基で置換され又は架橋を防ぐために欠失される。
【０２１５】インビトロでの方法はまた、一価抗体を調
製するためにも適当である。そのフラグメント、特にＦ
ａｂフラグメントを生産するための抗体の消化は、当該
分野において知られたルーチンの技術を用いて達成する
ことができる。
【０２１６】Ｃ．ヒト化抗体 本発明の抗-ＰＲＯポリペプチド抗体は、ヒト化抗体又
はヒト抗体をさらに含む。非ヒト(例えばネズミ)抗体の
ヒト化形は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン
鎖、又は非-ヒト免疫グロブリンから得られる最小配列
を含むそのフラグメント(Fv,Fab,Fab',F(ab')2、又は抗
体の他の抗原結合配列のような)である。ヒト化抗体
は、レセプターの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基
が、望まれる特異性、親和性、及び用量を有する、マウ
ス、ラット、又はウサギのような非-ヒト種(ドナー抗
体)のＣＤＲからの残基によって置換されるヒト免疫グ
ロブリン（レセプター抗体）を含む。いずれかの場合、
ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、相当
する非ヒト残基と置換される。ヒト化抗体はまた、該レ
セプター抗体中にも、或いは移入したＣＤＲ又はフレー
ムワーク配列中にも見出されない残基を含み得る。一般
に、該ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンのそれに相
当するＣＤＲ領域の全て又は実質上全て、及びＦＲ領域
の全て又は実質上全てがヒト免疫グロブリン共通配列の
それである可変領域の少なくとも１，及び典型的には２
の実質上全てを含むであろう。ヒト化抗体は、好ましく
は免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グ
ロブリンのそれの少なくとも部分をも含むであろう[Jon
esら、Nature,321:522-525(1986)；Riechmannら、Natur
e,332:323-329(1988)；及びPresta, Curr.Op.Struct.Bi
ol.,2:593-596(1992)]。
【０２１７】非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当
該分野において周知である。一般に、ヒト化抗体は、ヒ
トでない供給源からそれに導入した１以上のアミノ酸残
基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばし
ば、「移入」可変領域から典型的に取られる「移入」残
基として関係する。ヒト化は、ヒト抗体の相当する配列
で齧歯類ＣＤＲｓ又はＣＤＲ配列を置換することによっ
て、Winterと共同研究者の方法[Jonesら、Nature 321,5
22-525(1986);Riechmannら、Nature,332,323-327(198
8);Verhoeyenら、Science 239,1534-1536(1988)]に従い
本質的に実行される。従って、そのような「ヒト化し
た」抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４８１６５
６７号）、完全なヒト可変領域よりも実質上劣るものが
非ヒト種からの相当する配列により置換されている。実
際、ヒト化した抗体は幾つかのＣＤＲ残基と可能性のあ
る幾つかのＦＲ残基が齧歯類中の類似部位からの残基に
よって置換されたヒト抗体である。
【０２１８】ヒト化抗体はまた、ファージディスプレー
ライブラリーを含む、当該分野で周知の各種の技術を用
いて製造することもできる[HoogenboomとWinter,J.Mol.
Biol.,227:381(1991)；Marksら、J.Mol.Biol.,222:581
(1991)]。Coleら及びBoernerらの技術はまた、ヒトモノ
クローナル抗体の調製のためにも利用可能である(Cole
ら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan
R.Liss,p.77(1985)及びBoernerら、J.Immunol.,147(1):
86-95(1991)]。
【０２１９】Ｄ．二重特異性抗体 二重特異性抗体は、少なくとも２の異なる抗原に特異的
結合性を有する、好ましくはヒト又はヒト化したモノク
ローナル抗体である。本ケースにおいて、特異的結合性
の一つは、ＰＲＯポリペプチドのためのものであり、他
方は、何れかの他の抗原のためのものであり、好ましく
は細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサ
ブユニットのためのものである。
【０２２０】二重特異性抗体の製造方法は、当該分野で
周知である。従来、二重特異性抗体の組み換え体生産
は、二つの重鎖が異なる特異性を有する場合、二つの免
疫グロブリン重鎖／軽鎖ペアの共発現に基づいている[M
ilsteinとCuello, Nature 305,537-539(1983)]。免疫グ
ロブリン重鎖と軽鎖の取り合わせがランダムであるため
に、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、一つ
のみが正しい二重特異性構造を有する１０の異なる抗体
分子の可能性のある混合物が生産される。正しい分子の
精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によっ
て通例は達成される。類似の手法は、1993年5月13日公
開のＷＯ９３／０８８２９中に、及びTrauneckerら、EM
BO J.,10:3655-3659(1991)中に開示される。
【０２２１】望まれる結合特異性を持つ抗体可変ドメイ
ン(抗体-抗原結合部位)は、免疫グロブリン定常ドメイ
ン配列に融合することができる。その融合は、好ましく
はヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の少なくとも一部を
含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインを伴う。その融合
体の少なくとも一つにおいて存在する軽鎖結合のために
必要な部位を含む第１の重鎖定常領域(ＣＨ１)を有する
ことが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、及びもし
望むなら、免疫グロブリン軽鎖、をコードしているＤＮ
Ａは、別個の発現ベクターに挿入され、且つ適当な宿主
生物に共トランスフェクトされる。二重特異性抗体を生
成するための更なる詳細のために、例えば、Sureshら、
Methods in Enzymology,121:210(1986)を参照。
【０２２２】Ｅ．ヘテロ接合抗体 ヘテロ接合抗体もまた、本発明の範囲内である。ヘテロ
接合抗体は、共有結合した二つの抗体から構成される。
そのような抗体は、例えば、希望しない細胞に免疫系細
胞を標的化する[米国特許第４６７６９８０号]、及びＨ
ＩＶ感染の治療のために提案されている[ＷＯ９１／０
０３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８
９]。該抗体は、架橋剤が含まれるそれらを含む、合成
タンパク質化学において周知の方法を用いてインビトロ
で製造し得る。例えば、イムノトキシンは、ジスルフィ
ド交換反応を用いて又はチオエーテル結合を形成するこ
とによって構築し得る。この目的のための好適な試薬の
実例は、イミノチオラートとメチル-4-メルカプトブチ
ルイミダート及び米国特許第４６７６９８０号中に記載
されるそれらを含む。
【０２２３】２１．抗-ＰＲＯポリペプチド抗体の使用 本発明の抗-ＰＲＯポリペプチド抗体は、各種の有用性
を有する。例えば、抗-ＰＲＯポリペプチド抗体は、例
えば特有の細胞、組織、又は血清におけるその発現を検
出するための、ＰＲＯポリペプチド用の診断アッセイに
おいて使用し得る。競合結合アッセイ、直接又は間接サ
ンドウィッチアッセイ及び異種又は同種相で実施される
免疫沈降アッセイ[Zola,Monoclonal Antibodies: A Man
ual of Techniques,CRC Press,Inc.(1987)147-158頁]の
ような当該分野で周知の各種診断アッセイ技術が使用し
得る。診断アッセイにおいて使用した抗体は、検出可能
な部分で標識することができる。該検出可能な部分は、
直接又は間接的のいずれか一方で、検出可能なシグナル
をもたらすことができるべきである。例えば、検出可能
な部分は、3Ｈ，14Ｃ，32Ｐ，35Ｓ，又は125Ｉのような
放射性同位体、イソチオシアン酸フルオレセイン、ロー
ダミン、又はルシフェリンのような蛍光又は化学発光化
合物、又はアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクト
シダーゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼのよ
うな酵素とし得る。該検出可能部分への抗体の接合のた
めの当該分野で周知のいずれかの方法は、Hunterら、Na
ture,144:945(1962);Davidら、Biochemistry,13:1014(1
974);Painら、J.Immunol.Meth.,40:219(1981);及びNygr
en,J.Histochem.and Cytochem.,30:407(1982)によって
記載されたそれらの方法を含み、利用し得る。
【０２２４】抗-ＰＲＯポリペプチド抗体はまた、組換
え細胞培養又は天然供給源からのＰＲＯポリペプチドの
アフィニティー精製に有用である。この方法において、
ＰＲＯポリペプチドに対する抗体は、当該分野で周知の
方法を用いて、Sephadex樹脂又は濾紙のような適当な支
持体上に固定化される。固定化した抗体は、次いで精製
するべきＰＲＯポリペプチドを含む試料に接触させ、そ
の後該支持体は、ＰＲＯポリペプチド以外の試料中の実
質上全ての材料を除去するであろう適当な溶媒で洗浄さ
れる。最後に、該支持体は、該抗体からＰＲＯポリペプ
チドを放出するであろう別の適当な溶媒で洗浄される。
【０２２５】コルディン(chordin)（ＣＨＤ）は、示差
的な顔の特徴(低い前毛髪線、眉毛叢生症、前傾の外鼻
孔、上顎前突症、長い人中、こい口(carp mouth))、出
生前又は出生後の成長遅延、精神遅延及び、しばしば、
しかし常時ではない上肢奇形によって特徴付けられるコ
ルネリア・ド・ランゲ症候群として知られる異形症候群
のための候補遺伝子である。また、ＣＤＬが血小板減少
症との関連において存在するレアケースもある。ＣＤＬ
の遺伝子は、3q26.3(OMIM#122470)への結合によってマ
ップされている。初期アフリカツメガエル(early Xenop
us)パターン化におけるＸｃｈｄ（アフリカツメガエル
コルディン(Xenopus chordin)）包含及び神経系統発育
は、興味のある候補遺伝子中にＣＨＤを作る。ＣＨＤ
は、染色体３上の適切な領域にマップされる。それはＴ
ＨＰＯに非常に密接し、ＴＨＰＯとＣＨＤの両方を包含
する欠失は、血小板減少症と発育異形症のレアケースに
帰結できる。全成人組織の大部分がＣＨＤ発現に対して
陰性である顕現したＣＤのin situ分析において、僅か
に陽性のシグナルが、長い骨の発育と推定上の成長にお
いてＣＨＤを関連させる大腿骨頭と寛骨臼（股関節）と
の間に形成される発育中の滑膜性の連結の割線において
観測された。そのような機能は、もし混乱したならば、
成長遅延をもたらすことができる。
【０２２６】ｃＤＮＡから予測したヒトＣＨＤアミノ酸
配列は、Ｘｃｈｄに５０％同一性（及び６６％保存され
た）である。４システイン-富ドメイン中の全ての４０
システインが保存される。これらのシステイン富ドメイ
ンは、トロンボスポンジン、プロコラーゲン及びフォン
・ビルブラント因子中で観測されたそれらに類似してい
る。Bornstein,P.FASEB J 6:3290-3299(1992);Hunt,L.&
Barker,W.Biochem.Biophys.Res.Commun.144:876-882(1
987)。
【０２２７】ＰＲＯ２４３コルディン(chordin)に対す
る抗体は、ＰＲＯ２４３の過剰発現によって特徴付けさ
れる条件でポリペプチドを結合するものを作ることがで
きる。
【０２２８】以下の実施例は、説明の目的のためにのみ
提供され、且ついずれの手法も本発明の範囲を制限する
ことを意図していない。
【０２２９】本明細書中に引用した全ての特許と参考文
献は、それらの全体が参照によりここに組み込まれる。
【０２３０】
【実施例】本実施例に関する商業的に利用できる試薬
は、特に示さない限り、製造元の指示書に従って用い
た。以下の実施例、および明細書を通して、ＡＴＣＣ受
託番号によって同定される細胞源は、Ａｍｅｉｒｉｃａ
ｎ Ｔｙｐｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄである。
【０２３１】実施例１：新規なポリペプチドおよびこれ
らをコードするｃＤＮＡを同定するための細胞外ドメイ
ン相同性スクリーニング ＥＳＴデータベースを検索するために、公的Ｓｗｉｓ−
Ｐｒｏｔデータベースからの約９５０個の既知分泌タン
パク質から、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列（もしもあ
るならば、分泌シグナル配列を含む）を用いた。ＥＳＴ
データベースは、公的データベース（例えば、Ｄａｔｈ
ｏｆｆ、Ｇｅｎｅｂａｎｋ）と私的データベース（例え
ば、ＬＩＦＥＳＥＱTM、Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌｓ．Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ．ＣＡ）を含
む。ＥＣＤタンパク質配列をＥＳＴ配列の６フレーム翻
訳と比較するため、コンピュータープログラムＢＬＡＳ
ＴもしくはＢＬＡＳＴ２（ＡｌｔｓｃｈｕｌとＧｉｓ
ｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６
６：４６０−４８０（１９９６））を用いて検索を行っ
た。既知のタンパク質をコードしていない７０（いくつ
かの事例においては、９０）以上のＢｌａｓｔスコアー
とのそれらの比較を、プログラム「ｐｈａｒｐ」［Ｐｈ
ｉｌ Ｇｒｅｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓ
ｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ；（ｈｔｔｐ：
／／ｂｏｚｅｍａｎ．ｍｂｔ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．
ｅｄｕ／ｐｈｒａｐ．ｄｏｃｓ／ｐｈｒａｐ．ｈｔｍ
ｌ］を用いてまとめ、コンセンサスＤＮＡ配列に集め
た。
【０２３２】この細胞外ドメイン相同性スクリーニング
を用い、コンセンサスＤＮＡ配列を、ｐｈｒａｐを用
い、その他の同定されているＥＳＴ配列に対応してまと
めた。さらに、上記ＥＳＴ配列の供給源を用い、得られ
たコンセンサス配列をできる限り伸長させるために、し
ばしば（いつもではないが）ＢＬＡＳＴとｐｈｒａｐの
反復サイクルを用いて、該コンセンサス配列を伸長し
た。
【０２３３】次いで、上記のように得られたコンセンサ
ス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣ
Ｒによって興味ある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを
同定するため、およびＰＲＯポリペプチドをコードする
全長配列のクローンを単離するためのプローブとして用
いるために使用した。前進（．ｆ）と逆進（．ｒ）ＰＣ
Ｒプライマーは、一般的に、２０から３０ヌクレオチド
までの範囲とし、しばしば、長さ約１００−１０００ｂ
ｐのＰＣＲ生成物を与えるように設計される。いくつか
の事例において、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂ
よりも大きい時に、付加的なオリゴヌクレオチドが合成
される。全長クローンのためのいくつかのライブラリー
をスクリーニングするために、ライブラリーからＤＮＡ
を、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ ｉｎ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙに従っ
て、ＰＣＲプライマー対を用い、ＰＣＲ増幅によってス
クリーニングした。次いで、興味ある遺伝子をコードす
るクローンを、オリゴヌクレオチドプローブもしくはプ
ライマー対の一つを用いて単離するために、陽性のライ
ブラリーを用いた。
【０２３４】ｃＤＮＡクローンを単離するために用いた
ｃＤＮＡライブラリーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａ
ｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡなどから商業的に利用できる試薬
を用いた標準的な方法によって構築した。ｃＤＮＡは、
ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴプライマーで合成し、Ｓ
ａｌＩヘミキナーゼアダプターに平滑端で連結し、Ｎｏ
ｔＩ部位で切断し、ゲル電気泳動により適切にサイズ分
画し、好適なクローニングベクター［例えば、ｐＲＫＢ
もしくはｐＲＫＤ；ｐＲＫ５Ｂは、ＳｆｉＩ部位を含ま
ないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２５３：１２７８−１２８０（１９９１）
参照］に、特有のＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ部位で、定め
られた方向でクローニングした。
【０２３５】実施例２：アミラーゼスクリーニングによ
るｃＤＮＡクローンの単離 １．オリゴｄＴプライマーで合成されたｃＤＮＡライブ
ラリーの調製 ｍＲＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ，ＣＡからの試薬とプロトコール（Ｆａｓｔ Ｔｒａ
ｃｋ２）を用い、興味のあるヒト組織から単離した。こ
のＲＮＡは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇ
ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ（Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉ
ｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ）の試薬とプロトコ
ールを用い、ベクターｐＲＫ５Ｄ中、オリゴｄＴプライ
マーで合成したｃＤＮＡライブラリーを作製するために
用いた。この操作で、二本鎖ｃＤＮＡは、１０００ｂｐ
よりも大きなサイズとなり、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩリンカ
ー化ｃＤＮＡを、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩで切断したベクタ
ーにクローニングした。ｐＲＫ５Ｄは、ＸｈｏＩ／Ｎｏ
ｔＩ ｃＤＮＡクローニング部位に先立つＳｆｉＩ制限
酵素部位が続くｓｐ６転写開始部位を有するクローニン
グベクターである。
【０２３６】２．ランダムプライマーで合成されたｃＤ
ＮＡライブラリーの調製 第２のｃＤＮＡライブラリーは、第１のｃＤＮＡクロー
ンの５’末端を優先的に発現させるために産出した。Ｓ
ｐ６ ＲＮＡは、第１のライブラリー（上記）から産出
し、このＲＮＡを、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ （ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓ
ｔｅｍ、上記）からの試薬とプロトコールを用い、ベク
ターｐＳＳＴ−ＡＭＹ．０中、ランダムプライマーで合
成したｃＤＮＡライブラリーを産出するために用いた。
この操作で、二本鎖ｃＤＮＡは、５００−１０００ｂｐ
のサイズとなり、ＮｏｔＩアダプターに平滑端で連結
し、ＳｆｉＩで切断し、ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩで切断した
ベクターにクローニングした。ｐＳＳＴ−ＡＭＹ．０
は、ｃＤＮＡクローニング部位に先立つ酵母アルコール
デヒドロゲナーゼプロモーターと、クローニングサイト
の後であって、酵母アルコールデヒドロゲナーゼターミ
ネーターが続くマウスアミラーゼ配列（分泌シグナルを
有さない成熟配列）を有するクローニングベクターであ
る。このようにアミラーゼ配列とフレーム内で融合した
ベクター中にクローニングされたｃＤＮＡは、適切にト
ランスフェクションした酵母コロニーからアミラーゼを
分泌するようになる。
【０２３７】３．形質転換と検出 上記段落２に記載したライブラリーからのＤＮＡは、電
気受容能のあるＤＨ１０８細菌（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ、２０ｍｌ）を加えるために、氷上で冷
却した。次いで、細菌とベクターの混合物を、製造元に
よって推奨される方法によってエレクトロポレーション
した。続いて、ＳＯＣ培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ、１ｍｌ）を加え、混合物を３７℃で３０分間
インキュベーションした。次いで、形質転換体を、アン
ピシリンを含有する標準的な１５０ｍｍＬＢプレート２
０枚に播き、１６時間（３７℃）インキュベーションし
た。陽性コロニーを、プレートからこすり取り、ＣｓＣ
ｌ−密度勾配などの標準的なプロトコールを用い、細菌
ペレットからＤＮＡを単離した。次いで、精製したＤＮ
Ａを用いて、以下の酵母のプロトコールを行った。
【０２３８】酵母の方法は３種類に分けられる：（１）
プラスミド／ｃＤＮＡ結合ベクターによる酵母の形質転
換；（２）アミラーゼを分泌している酵母クローンの検
出と単離；および（３）酵母コロニーからの直接的な挿
入物のＰＣＲ増幅、および配列決定と、更なる分析のた
めのＤＮＡの精製。
【０２３９】用いられた酵母株は、ＨＤ５６−５Ａ（Ａ
ＴＣＣ−９０７８５）であった。この株は、以下の遺伝
子型を有する：ＭＡＴアルファ、ｕｒａ３−５２、ｌｅ
ｕ２−３、ｌｅｕ２−１１２、ｈｉｓ３−１１、ｈｉｓ
３−１５、ＭＡＬ+、ＳＵＣ+、ＧＡＬ+。好ましくは、
翻訳後経路を欠失している酵母変異株を用いることがで
きる。そのような変異株は、ｓｅｃ７１、ｓｅｃ７２、
ｓｅｃ６２において、転座欠失アレルを有しており、端
切りしたｓｅｃ７１が最も好ましい。もしくは、これら
の遺伝子の正常な作用を阻害するアンタゴニスト（アン
チセンスヌクレオチドおよび／またはリガンドを含
む）、この翻訳後経路に関連するその他のタンパク質
（例えば、ＳＥＣ６１ｐ、ＳＥＣ７２ｐ、ＳＥＣ６２
ｐ、ＳＥＣ６３ｐ、ＴＤＪ１ｐ、もしくはＳＳＡ１ｐ−
４ｐ）、もしくはこれらのタンパク質の混合体も、アミ
ラーゼ発現酵母と組み合わせて好適に用いられる。
【０２４０】形質転換は、Ｇｉｅｔｚら、Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２０：１４２５（１９９２）によっ
て略述されたプロトコールに基づいて行った。次いで、
形質転換細胞を、寒天からＹＥＰＤ混合培地（１００ｍ
ｌ）に播種し、３０℃で一晩培養した。ＹＥＰＤ培地
は、Ｋａｉｓｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ，ＮＹ，ｐ．２０７（１９９４）に記載されたように
調製した。次いで、一晩培養物を、新鮮なＹＥＰＤ培地
（５００ｍｌ）で、約２ｘ１０6細胞／ｍｌ（約ＯＤ600
＝０．１）に希釈し、１ｘ１０7細胞／ｍｌ（約ＯＤ600
＝０．４−０．５）となるまで再度培養した。
【０２４１】次いで、細胞を回収し、ＳｏｒｖａｌＧＳ
３ローターで、５０００ｒｐｍ、５分間で、ＧＳ３ロー
ターボトルに移し、上清を除去し、次いで、滅菌水に再
度懸濁し、再び５０ｍｌファルコンチューブ中、Ｂｅｃ
ｋｍａｎ ＧＳ−６ＫＲ遠心分離機３５００ｒｐｍで遠
心分離することにより、形質転換用に調製した。上清を
除去し、続けて細胞をＬｉＡｃ／ＴＥ（１０ｍｌ、１０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍ ＭＥＤＴＡ ｐＨ７．５、
１００ｍＭのＬｉ2ＯＯＣＣＨ3）で洗浄し、ＬｉＡｃ／
ＴＥ（２．５ｍｌ）中に再度懸濁した。
【０２４２】形質転換は、調製した細胞（１００μｌ）
に、新たに変性させた一本鎖サケ精子ＤＮＡ（Ｌｏｆｓ
ｔｒａｎｄ Ｌａｂｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍ
Ｄ）と形質転換させるＤＮＡ（１μｇ、容量＜１０μ
ｌ）とを、マイクロ遠心分離チューブ内で混合すること
によって行った。混合液を、渦動撹拌により簡単に混合
し、次いで、４０％ＰＥＧ／ＴＥ（６００μｌポリエチ
レングリコール−４０００、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１００ｍＭＬｉ2ＯＯＣＣＨ 3ｐＨ
７．５）を添加した。この混合液を、穏やかに混合し、
３０分間凝集させながら３０℃でインキュベーションし
た。この細胞を、次いで、４２℃で１５分間、熱刺激
し、この反応チューブを、マイクロ遠心分離機で、１２
０００ｒｐｍ、５−１０秒間遠心し、デカンテーション
し、ＴＥ（５００μｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、
１ｍＭＥＤＴＡ ｐＨ７．５）で再度懸濁し、続けて再
度遠心分離した。次いで、細胞をＴＥ（１ｍｌ）中に希
釈し、予め１５０ｍｍ培養プレート（ＶＷＲ）に調製し
た選択培地上に、２０μｌずつ分注した。
【０２４３】もしくは、多数の小さな反応の代わりに、
形質転換を、単一、大規模の反応で、試薬量もそれに応
じて増やして行った。
【０２４４】用いた選択培地は、Ｋａｉｓｅｒら、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐ．２０８−２
１０（１９９４）によって記載されたように調製された
ウラシル欠失合成完全デキストロース（ＳＣＤ−Ｕｒ
ａ）寒天とした。形質転換体は、３０℃で２−３日間培
養した。
【０２４５】アミラーゼを分泌しているコロニーの検出
は、選択増殖培地中に赤色澱粉を含ませることによって
行った。澱粉を、Ｂｉｅｌｙら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．，１７２：１７６−１７９（１９８８）によって
記載された手順に従って、赤色染料（Ｒｅａｃｔｉｖｅ
Ｒｅｄ−１２０、Ｓｉｇｍａ）と結合させた。結合さ
せた澱粉を、ＳＣＤ−Ｕｒａ寒天プレート中、最終濃度
０．１５％（ｗ／ｖ）で取り込ませ、リン酸カリウムで
ｐＨ７．０に緩衝化した（最終濃度５０−１００ｍ
Ｍ）。
【０２４６】十分に単離、同定できる単一コロニーを得
るために、陽性コロニーを拾い、新鮮な選択培地（１５
０ｍｍプレート上）に塗布した。アミラーゼの分泌が陽
性である十分に単離された単一コロニーは、緩衝化した
ＳＣＤ−Ｕｒａ寒天への赤色澱粉の直接的な取り込みに
よって検出した。陽性コロニーは、直接目視可能な陽性
コロニー周囲の透明な輪を生じさせる澱粉分解能によっ
て決定した。
【０２４７】４．ＰＣＲ増幅によるＤＮＡの単離 陽性コロニーを単離する時、その部位を楊枝で拾い上
げ、９６ウェルプレート中の滅菌水（３０μｌ）に希釈
した。この時、陽性コロニーを、続く分析用に凍結保存
するか、直ちに増幅する。分注した細胞（５μｌ）を、
２５μｌ容量：０．５μｌのＫｌｅｎｔａｑ（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）；４．０μｌ１
０ｍＭｄＮＴＰ'ｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔ
ｕｓ）；２．５μｌＫｌｅｎｔａｑ緩衝液（Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）；０．２５μｌ前
進オリゴ１；０．２５μｌ逆進オリゴ；１２．５μｌ滅
菌水を含む、でのＰＣＲ反応の鋳型として用いた。前進
オリゴヌクレオチド１の配列は： ５’−ＴＧＴＡＡＡ
ＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＴＡＡＡＴＡＧＡＣＣＴＧＣ
ＡＡＴＴＡＴＴＡＡＴＣＴ−３’（配列番号：１６）。
逆進オリゴヌクレオチド２び配列は： ５’−ＣＡＧＧ
ＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣＡＣＣ
ＴＧＣＡＡＡＴＣＣＡＴＴ−３’（配列番号：１７）。
【０２４８】次いで、ＰＣＲを以下のように行った： ａ． 変性 ９２℃、５分 ｂ． ３サイクル： 変性 ９２℃、３０秒 アニーリン
グ ５９℃、３０秒 伸長７２℃、６０秒 ｃ． ３サイクル： 変性 ９２℃、３０秒 アニーリン
グ ５７℃、３０秒 伸長７２℃、６０秒 ｄ． ２５サイクル：変性 ９２℃、３０秒 アニーリン
グ ５５℃、３０秒 伸長７２℃、６０秒 ｅ． 保持 ４℃
【０２４９】オリゴヌクレオチドの下線部位は、ＡＤＨ
プロモーター領域とアミラーゼ領域に各々アニーリング
し、挿入が無い場合は、ベクターｐＳＳＴ−ＡＭＹ．０
から３０７ｂｐ領域を増幅した。典型的には、これらの
オリゴヌクレオチドの５’末端の最初の１８ヌクレオチ
ドに、配列決定用プライマーのアニーリング部位を含ま
せた。このように、空ベクターからのＰＣＲ反応の生成
物は、３４３ｂｐであった。一方、シグナル配列を融合
させたｃＤＮＡは、かなり長いヌクレオチド配列となっ
た。
【０２５０】ＰＣＲに続けて、分注した反応生成物（５
μｌ）を、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載されたよう
に、Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝
系を用いた１％アガロースゲルのアガロースゲル電気泳
動によって調べた。４００ｂｐよりも大きい単一で強い
ＰＣＲ生成物が得られたクローンを、９６Ｑｉａｑｕｉ
ｃｋ ＰＣＲ ｃｌｅａｎ−ｕｐ ｃｏｌｕｍ （Ｑｉａｇ
ｅｎ社、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）で精製した後、
さらにＤＮＡ配列決定によって分析した。
【０２５１】実施例３：ヒトＰＲＯ２４１をコードして
いるｃＤＮＡの単離 コンセンサスＤＮＡ配列は、上記実施例１に記載した他
のＥＳＴ配列に対応してまとめた。このコンセンサス配
列を、ここにＤＮＡ３０８７６と称する。ＤＮＡ３０８
７６のコンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲによる
興味ある配列を含むｃＤＮＡライブラリーの同定、およ
び２）ＰＲＯ２４１をコードする全長配列のクローンを
単離するためのプローブとしての使用、のために、オリ
ゴヌクレオチドを合成した。
【０２５２】ＰＣＲプライマー（前進および逆進）を合
成した： 前進ＰＣＲプライマー ５’−ＧＧＡＡＡＴＧＡＧＴＧ
ＣＡＡＡＣＣＣＴＣ−３’ （配列番号：３） 逆進ＰＣＲプライマー ５’−ＴＣＣＣＡＡＧＣＴＧＡ
ＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＴＧＣ−３’ （配列番号：４） さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーショ
ンプローブを、以下のヌクレオチド配列を有するコンセ
ンサスＤＮＡ３０８７６配列から構築した。ハイブリダ
イゼーションプローブ５’−ＧＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴ
ＴＣＣＡＴＡＴＣＡＧＡＡＴＴＧＣＡＧＡＡＧＣＡＡＡ
ＡＣＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＴ−３’（配列番号：５）
【０２５３】全長クローンの供給源としてのいくつかの
ライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリ
ーからＤＮＡを、上記同定されたＰＣＲプライマー対を
用いたＰＣＲ増幅によって、スクリーニングした。次い
で、陽性のライブラリーを、オリゴヌクレオチドプロー
ブおよび該ＰＣＲプライマーの一つを用いて、ＰＲＯ２
４１をコードするクローンを単離するために用いた。ｃ
ＤＮＡライブラリーを構築するためのＲＮＡを、ヒト胎
児腎臓組織（ＬＩＢ２９）から単離した。
【０２５４】上記のように単離したクローンのＤＮＡ配
列から、ＰＲＯ２４１の全長ＤＮＡ配列［ここに、ＵＮ
Ｑ２１５（ＤＮＡ３４３９２−１１７０）と称する］
（配列番号：１）と、ＰＲＯ２４１のタンパク質配列を
得た。
【０２５５】ＵＮＱ２１５（ＤＮＡ３４３９２−１１７
０）の全ヌクレオチド配列を図１に示す（配列番号：
１）。クローンＵＮＱ２１５（ＤＮＡ３４３９２−１１
７０）は、ヌクレオチド部位２３４−２３６に見かけ上
の翻訳開始部位と、ヌクレオチド部位１３７１−１３７
３に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリーデ
ィングフレームを含む（図１）。推定されるポリペプチ
ドプレカーサーは３７９アミノ酸長（図２）である。図
２に示した全長のＰＲＯ２４１タンパク質は、推定上、
約４３３０２ダルトンの分子量と、約７．３０のｐＩを
有する。クローンＵＮＱ２１５（ＤＮＡ３４３９２−１
１７０）は、ＡＴＣＣに寄託し、ＡＴＣＣ寄託番号ＡＴ
ＣＣ ２０９５２６が付与されている。
【０２５６】全長ＰＲＯ２４１ポリペプチドアミノ酸配
列の分析により、様々なビグリカンプロテオグリカンタ
ンパク質と有意な相同性を有することが提示されてお
り、これによってＰＲＯ２４１が新規のビグリカン相同
ポリペプチドであることが示されている。
【０２５７】実施例４： 染色体ウォーキングによるヒ
トＰＲＯ２４３をコードするｃＤＮＡクローンの単離 概論： ヒトトロンボポエチン（ＴＨＰＯ）は、２つの
ドメインからなる３５２アミノ酸のグリコシル化された
ホルモンである。エリスロポエチンと５０％の類似性を
共有するＮ末端ドメインは、生物活性を発現する。Ｃ末
端領域は、分泌に必要とされる。トロンボポエチン（Ｔ
ＨＰＯ）遺伝子は、ヒト染色体３ｑ２７−ｑ２８に位置
し、ここで、この遺伝子の６つのエキソンは、染色体Ｄ
ＮＡ７キロ塩基対に及ぶ（Ｇｕｒｎｅｙら、Ｂｌｏｏｄ
８５：９８１−９８８（１９９５））。ＴＨＰＯに近
接して位置するＴＨＰＯ相同体をコードする遺伝子が存
在するかを調べるために、この領域の染色体ＤＮＡフラ
グメントを同定し、配列決定した。ＴＨＰＯ遺伝子座を
包囲している３つのＰ１クローンと１つのＰＡＣクロー
ン（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｓｔ Ｌｏｕｉ
ｓ，ＭＯ；カタログ番号、Ｐ１−２５３５とＰＡＣ−６
３５９）を単離し、１４０ｋｂ領域を、定序ショットガ
ン方法（orderd shotgun strategy）（Ｃｈｅｎら、Ｇ
ｅｎｏｍｉｃｓ １７：６５１−６５６（１９９３））
を用い、ＰＣＲに基づくギャップ充填方法（gap fillin
g approach）と組み合わせて配列決定した。分析によ
り、該領域は、ＴＨＰＯに非常に隣接して位置する４つ
の付加遺伝子：腫瘍壊死因子−受容体１型付随タンパク
２（ＴＲＡＰ２）、伸長開始因子γ（ｅｌｆ４ｇ）、塩
素チャネル２（ＣＬＣＮ２）およびＲＮＡポリメラーゼ
ＩＩサブユニットｈＲＰＢ１７、と共に遺伝子が豊富で
あることが明らかとなった。その領域でＴＨＰＯ相同体
が見い出されなかったものの、４つの新規な遺伝子が、
コンピューター補助遺伝子検出器（ＧＲＡＩＬ）［Ｘｕ
ら、Ｇｅｎ．Ｅｎｇｉｎ．１６：２４１−２５３（１９
９４）］、ＣｐＧ島の存在［Ｃｒｏｓｓ，Ｓ．とＢｉｒ
ｄ，Ａ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．と Ｄｅ
ｖｅｌ．５：１０９−３１４（１９９５）］、および既
知の遺伝子との相同性（ＷＵ−ＢＬＡＳＴ２．０によっ
て検出）（ＡｌｔｓｃｈｕｌとＧｉｓｈ、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０−４８０（１９９
６）（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ
／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ）によって推測
されている。
【０２５８】Ｐ１クローンとＰＡＣクローン： ＴＨＰ
Ｏ染色体配列［Ａ．Ｌ．Ｇｕｒｒｎｅｙら、Ｂｌｏｏｄ
８５：９８１−８８（１９９５）］から設計されたＰ
ＣＲプライマーでスクリーニングされた染色体Ｐ１ライ
ブラリー（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ， ＭＯ：カタログ番号：Ｐ１−２５３５）か
ら最初のヒトＰ１クローンを単離した。ＰＣＲプライマ
ーは、このＰ１クローンから得られた末端配列から設計
し、次いで、重複するクローンを同定するため、ＰＩと
ＰＡＣライブラリー（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ
社、カタログ番号：Ｐ１−２５３５＆ＰＡＣ−６５３
９）をスクリーニングするために用いた。
【０２５９】定序ショットガン方法： 定序ショットガ
ン方法（ＯＳＳ）（Ｃｈｅｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１
７：６５１−６５６（１９９３））は、段階的アプロー
チによる、巨大な染色体ＤＮＡクローンの位置決定や配
列決定を含む。Ｐ１クローンまたはＰＡＣクローンは、
音波処理し、断片をラムダベクター（λＢｌｕｅｓｔａ
ｒ）（Ｎｏｖａｇｅｎ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ；カタ
ログ番号６９２４２−３）にサブクローニングした。該
ラムダサブクローン挿入物は、長距離ＰＣＲ（Ｂａｒｎ
ｅｓ，Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ９１：２２１６−２２２０（１９９４））によって
単離し、末端を配列決定した。本来のクローンの部分的
な地図を作製するために、ラムダ−末端配列を重複させ
た。重複する末端配列を含むラムダクローンを同定し、
プラスミドベクター（ｐＵＣ９もしくはｐＵＣ１８）に
サブクローニングした挿入物とプラスミドサブクローン
の末端を配列決定し、隣接している配列を産出するため
に、まとめた。この直接的な配列決定法により、興味の
ある領域を読み取り、まとめるために要求される重複が
最小になる。
【０２６０】ＴＨＰＯ遺伝子座をより良好に定め、ヘマ
トポエチンファミリーに関連するその他の遺伝子を検索
するため、４つの染色体クローンを、ヒトＰＩとＰＡＣ
ライブラリー（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタ
ログ番号：Ｐ１−２５３５とＰＡＣ−６５３９）のＰＣ
Ｒスクリーニングによってこの領域から単離した。染色
体フラグメントのサイズは以下の通りである：Ｐ１．ｔ
は４０ｋｂ；Ｐ１．ｇは７０ｋｂ；Ｐ１．ｕは７０ｋ
ｂ；およびＰＡＣ．ｚは２００ｋｂ。これらの４つの染
色体クローン間の関係を図５に図示する。２００ｋｂ染
色体ＤＮＡ領域の約８０％を、定序ショットガン方法
（ＯＳＳ）（Ｃｈｅｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１７：６５
１−６５６（１９９３））によって配列決定し、Ａｕｔ
ｏ ＡｓｓｅｍｂｌｅｒTM（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ
Ｃｉｔｙ，ＣＡ、カタログ番号９０３２２７）を用い、
コンティグにまとめた。これらのコンティグの予備的な
順序は、手動分析によって決定した。４６コンティグが
あり、ギャップ充填を用いた。表２にギャップの数とサ
イズを要約した。
【０２６１】表２ １４０ｋｂ領域におけるギャップの要約 ギャップのサイズ 数 ＜５０ｂｐ １３ ５０−１５０ｂｐ ７ １５０−３００ｂｐ ７ ３００−１０００ｂｐ １０ １０００−５０００ｂｐ ７ ＞５０００ｂｐ ２ （１５０００ｂｐ）
【０２６２】ＤＮＡ配列決定： ＡＢＩ ＤＹＥ−ｐｒｉ
ｍｅｒTM ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ；カタロ
グ番号４０２１１２）を、ラムダとプラスミドサブクロ
ーンの末端を配列決定するために用いた。ＡＢＩ ＤＹ
Ｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒTM ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｐ
ＥＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅ
ｒ Ｃｉｔｙ；カタログ番号４０３０４４）を、各々の
ＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ生成物の配列決定に用
いた。配列は、ＡＢＩ３７７機器でまとめた。１ｋｂよ
りも大きなＰＣＲ生成物のために、ウォーキングプライ
マーを用いた。コンティグ配列を、ＡｕｔｏＡｓｓｅｍ
ｂｌｅｒTM（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ、カタログ番号９０
３２２７）におけるＯＯＳ方法によって産出し、ギャッ
プ充填配列を記録したファイルを、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅ
ｒTM（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ社、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，Ｍ
Ｉ）に、重複と編集のために組み込ませた。
【０２６３】ＰＣＲに基づくギャップ充填方法：プライ
マーは、各コンティグの５’−と３’−末端配列に基づ
き、反復と低い精度の配列領域を除くように設計した。
全てのプライマーは、１９−２４ｍｅｒで、５０−７０
％のＧ／Ｃ含有量となるように設計した。オリゴを標準
的な方法で合成し、ゲル−精製した。
【０２６４】コンティグの方向と順序が未知なので、プ
ライマーの過変異を増幅反応において用いた。２つのＰ
ＣＲキットを用いた：第１に、ＸＬ ＰＣＲキット（Ｐ
ｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ；カタ
ログ番号Ｎ８０８０２０５）、伸長時間約１０分；およ
び第２に、もしＸＬ ＰＣＲキットでスメアーが生じる
（smeared）もしくは多重生成物が観察されたならば、
Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＰＣＲキット（Ｑｉａｇ
ｅｎ社、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ；カタログ番号：２０
１２２３）を、高ストリンジェント条件下で用いた。成
功した各反応から主なＰＣＲ生成物を、０．９％低融点
アガロースゲルから抽出し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ ＤＮ
Ａ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットで、配列決定の前
に精製した。
【０２６５】分析： コード化領域の同定と特徴付けを
以下のように行った：最初に、反復する配列を、反復エ
レメントのライブラリーに対するＦａｓｔＡフォーマッ
トで、ＤＮＡ配列をスクリーニングし、マスクされた疑
わしい配列に戻るＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ（Ａ．Ｆ．
Ａ Ｓｍｉｔ ＆ Ｐ．Ｇｒｅｅｎ， ｈｔｔｐ：／／ｆｔ
ｐ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／Ｒ
Ｍ／ＲＭ ｄｅｔａｉｌｓ．ｈｅｍｌ）を用いてマスク
した。マスクされていない反復は、ＷＵＢＬＡＳＴ［Ａ
ｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ ＆ Ｇｉｓｈ， Ｗ．， Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０−４８０（１
９９６）］を用い、ＧｅｎＢａｎｋデーターベースと配
列を比較することによって同定し、手動でマスクした。
【０２６６】次に、ＷＵＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズム
を用いた、染色体領域とＧｅｎｅｎｔｅｃｈのタンパク
質データベースとの比較によって、既知遺伝子を明らか
にし、次いで、他で大きく異なる配列間で局所的に同定
された領域を見出すために、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕ
ｎｃｈ（ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）アル
ゴリズムを用い、各遺伝子の染色体およびｃＤＮＡ配列
を整列することによって注釈付けた。この方法により、
この領域における５つの既知遺伝子、ＴＨＰＯ、ＴＲＡ
Ｐ２、ｅｌＦ４ｇ、ＣＬＣＮ２およびｈＲＰＢ１７の全
てのエキソンを検出した（表３）。
【０２６７】 表３ 分析された１４０ｋｂ領域に局在する既知遺伝子の要約 既知遺伝子 遺伝子座 真核生物翻訳開始因子４γ ３ｑ２７−ｑｔｅｒ トロンボポエチン ３ｑ２６−ｑ２７ 塩素チャネル２ ３ｑ２６−ｑｔｅｒ ＴＮＦレセプター付随タンパク２ 予めマップされていない ＲＮＡポリメラーゼＩＩサブユニットｈＲＰＢ１７ 予めマップされていない
【０２６８】最後に、新規な転写単位を多くの方法を用
いて推測した。ＣｐＧ島（Ｓ．Ｃｒｏｓｓ ＆ Ｂｉｒ
ｄ，Ａ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．
５：１０９−３１４（１９９５））はプロモーター領域
を定めるために用い、ＧＣ富、６または８−ｍｅｒパリ
ンドローム配列を認識する酵素によって切断されるクラ
スター部位として同定した。ＣｐＧ島には、通常、遺伝
子のプロモーター領域が付随している。ＧｅｎＢａｎｋ
に対して、短い染色体領域（１０−２０ｋｂ）のＷＵＢ
ＬＡＳＴ２．０分析により、ＥＳＴとの一致を明らかに
した。個別のＥＳＴ配列（もしくは、可能ならば、それ
らの配列のクロマトグラムのファイル）を検索し、理論
上のｃＤＮＡ配列（ここにＤＮＡ３４４１５として称さ
れる）を提供するため、シークエンサーにまとめた。Ｇ
ＲＡＩＬ２（ＡｐｏＣｏｍ社、Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，Ｔ
Ｎ，ＤＥＣαに対する指揮系統）は、新規なエキソンを
推測するために用いた。この領域における５つの既知遺
伝子は、ＧＲＡＩＬアルゴリズムの成功裏の内部対照と
して機能した。
【０２６９】単離： Ｃｈｏｒｄｉｎ ｃＤＮＡクローン
は、オリゴｄＴプライマーで合成されたヒト胎児肺ライ
ブラリーから単離した。ヒト胎児肺ポリＡ+ ＲＮＡを、
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（カタログ番号６５２８−１、ロット
番号４３７７７）から購入し、５ｍｇを、ｐＫＲ５Ｂ
（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ， ＬＩＢ２６）のｃＤＮＡライ
ブラリーを構築するために用いた。３’−プライマー
（ｐＧＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣＧＣＧＡＧＣＧＧ
ＣＣＧＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ）（配列
番号：８）と、５’−リンカー（ｐＣＧＧＡＣＧＣＧＴ
ＧＧＧＧＣＣＴＧＣＧＣＡＣＣＣＡＧＣＴ）（配列番
号：９）を、ＳａｌＩとＮｏｔＩ制限酵素部位を導入す
るように設計した。提示された染色体遺伝子のエキソン
を手動で「スプライシング」して導き出された推定上の
ヒトコルディンｃＤＮＡ配列（ＤＮＡ３４４１５）から
設計したオリゴヌクレオチドプローブで、クローンをス
クリーニングした。配列決定する前にｃＤＮＡクローン
の同一性を確認するため、ＰＣＲプライマーの側腹に位
置するプローブを用いた。
【０２７０】オリゴヌクレオチドプローブのスクリーニ
ングを以下のように行った：ＯＬＩ５６４０ ３４４１
５．ｐ１ ５’−ＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＧＡＡＣＧＧＧ
ＣＡＧＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＣＡＧＡＡ−３’（配列
番号：１０）とＯＬＩ５６４０ ３４４１５．ｐ２ ５’
−ＧＧＣＧＣＡＣＡＧＣＡＣＧＣＡＧＣＧＣＡＴＣＡＣ
ＣＣＣＧＡＡＴＧＧＣＴＣ−３’（配列番号：１１）；
と、用いた側腹に位置するプローブは以下のものであっ
た：ＯＬＩ５６３９ ３４４１５． ｆ１ ５’−ＧＴＧ
ＣＴＧＣＣＣＡＴＣＣＧＴＴＣＴＧＡＧＡＡＧＧＡ−
３’（配列番号：１２）と、ＯＬＩ５６４３ ３４４１
５．ｒ ５’−ＧＣＡＧＧＧＴＧＣＴＣＡＡＡＣＡＧＧ
ＡＣＡＣ−３’（配列番号：１３）。
【０２７１】実施例５：ＰＲＯ２４３のノーザンブロッ
トおよびｉｎ ｓｉｔｕ ＲＮＡハイブリダイゼーション
分析 ヒト組織におけるＰＲＯ２４３ ｍＲＮＡの発現を、ノ
ーザンブロットによって試験した。ヒト胎児および成人
組織から得られたヒトポリＡ+ＲＮＡブロット（Ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ；カタログ番号
７７６０−１と７７５６−１）を、全長ＰＲＯ２４３
ｃＤＮＡに基づいた32Ｐ−標識ｃＤＮＡフラグメントプ
ローブとハイブリダイズさせた。ブロットは、プローブ
と共に、ハイブリダイゼーション緩衝液（５ｘＳＳＰ
Ｅ；２ｘデンハート溶液；１００ｍｇ／ｍｌ変性切断サ
ケ精子ＤＮＡ；５０％ホルムアミド；２％ＳＤＳ）中、
６０時間、４２℃でインキュベーションした。ブロット
を、２ｘＳＳＣで複数回；０．０５％ＳＤＳで室温１時
間洗浄し、続けて、高ストリンジェントな洗浄を、３０
分間、０．１ｘＳＳＣ；０．１％ＳＤＳ中、５０℃で行
い、オートラジオグラフィーに供した。ブロットを一晩
露光させた後、フォスフォイメージャ（ｐｈｏｓｐｈｏ
ｒｉｍａｇｅｒ）分析機（Ｆｕｊｉ）によって現像し
た。
【０２７２】図６に示すように、ＰＲＯ２４３ ｍＲＮ
Ａ転写生成物を検出した。発現パターンの分析により、
予想される４．０ｋｂ転写物の強いシグナルが、成熟お
よび胎児の肝臓において、および、非常に弱いシグナル
が成熟腎臓において示された。胎児の脳、肺および腎臓
は陰性であり、成熟心臓、脳、肺および脾臓は陰性であ
った。より小さな転写生成物が、胎盤（２．０ｋｂ）、
成熟骨格筋（１．８ｋｂ）および胎児肝臓（２．０ｋ
ｂ）において観察された。
【０２７３】ＰＲＯ２４３の成人組織のＩｎ ｓｉｔｕ
ハイブリダイゼーションにより、陽性シグナルが、大腿
骨頭と寛骨臼との間に形成される発育中の滑膜性連結の
割線において得られた。他の全組織は陰性であった。ヒ
ト胎児の顔、頭、四肢とマウス胚子のさらなる切片標本
についても試験した。ヒト胎児組織における発現は、発
育している四肢および骨膜傍の間葉における顔骨に隣接
して観察された。発現は高く特異的であり、しばしば血
管新生している領域に隣接していた。また、発現は、発
育時の一時的に胎児脳の後頭葉に観察されるが、脳にお
いてそれ以外では観察されなかった。さらに、発現は、
発育中の内耳の神経節において認められた。マウスの組
織において、ヒトプローブにより、発現を認めることは
できなかった（図７参照）。
【０２７４】Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
は、最適化されたプロトコールで、ＰＣＲ産出33Ｐ標識
リボプローブ［ＬｕとＧｉｌｌｅｔｔ，Ｃｅｌｌ Ｖｉ
ｓｉｏｎ １：１６９−１７６（１９９４）］を用いて
行った。ホルマリン固定、パラフィン包埋したヒト胎児
および成人組織を薄切し、脱パラフィン化し、プロテア
ーゼＫ（２０ｇ／ｍｌ）で１５分間、３７℃で除タンパ
クし、さらに、ＬｕとＧｉｌｌｅｔｔ（１９９４）によ
って記載されたように、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼ
ーション用に処理した。［33Ｐ］−ＵＴＰ標識アンチセ
ンスリボプローブをＰＣＲ生成物から産出し、５５℃で
一晩ハイブリダイズさせた。スライドを、Ｋｏｄａｋ
ＮＴＢ２ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｃｋ感光紙に浸し、４
週間露光させた。
【０２７５】実施例６：ヒトＰＲＯ２９９をコードする
ｃＤＮＡクローンの単離 ここでＤＮＡ２８８４７として称するｃＤＮＡ配列（図
１０；配列番号：１８）を、上記実施例２に記載したよ
うに単離した。さらなる分析後、ＤＮＡ２８８４７の
３’端切り型が見出され、これをここにＤＮＡ３５８７
７（図１１；配列番号：１９）と称する。ＤＮＡ３５８
７７配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを、１）ＰＣ
Ｒによって、興味のある配列を含むｃＤＮＡライブラリ
ーを同定するため、および２）ＰＲＯ２９９をコードす
る全長の配列のクローンを単離するためのプローブとし
て使用するため、合成した。前進および逆進ＰＣＲプラ
イマーは、一般的に、２０から３０ヌクレオチドの範囲
であり、しばしば、長さ約１００−１０００ｂｐのＰＣ
Ｒ生成物を得るように設計する。プローブの配列は、典
型的には、長さ４０−５５ｂｐである。いくつかの事例
において、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂｐより
も大きくなる時、付加的オリゴヌクレオチドを合成す
る。全長のクローンのための複数個のライブラリーをス
クリーニングするために、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙに従って、ＰＣＲプライマー対を用い、
ライブラリーからＤＮＡをＰＣＲ増幅によってスクリー
ニングした。次いで、オリゴヌクレオチドプローブと該
プライマー対の一つを用い、興味のある遺伝子をコード
するクローンを単離するために、陽性のライブラリーを
用いた。
【０２７６】前進と逆進ＰＣＲプライマーを合成した： 前進ＰＣＲプライマー（３５８７７．ｆ１） ５’−Ｃ
ＴＣＴＧＧＡＡＧＧＴＣＡＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧ−３’
（配列番号：２０） 逆進ＰＣＲプライマー（３５８７７．ｒ１） ５’−Ｃ
ＴＣＡＧＴＴＣＧＧＴＴＧＧＣＡＡＡＧＣＴＣＴＣ−
３’（配列番号：２１） さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーショ
ンプローブを、以下のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ
３５８７７配列から構築した。 ハイブリダイゼーションプローブ（３５８７７．ｐ１） ５’−ＣＡＧＴＧＣＴＣＣＣＴＣＡＴＡＧＡＴＧＧＡＣ
ＧＡＡＡＧＴＧＴＧＡＣＣＣＣＣＣＴＴＴＣＡＧＧＣＧ
ＡＧＡＧＣＴＴＴＧＣＣＡＡＣＣＧＡＡＣＴＧＡ−３’
（配列番号：２２）
【０２７７】全長クローンの供給源として複数個のライ
ブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーか
らＤＮＡを、上記同定されたＰＣＲプライマー対の一つ
を用い、ＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次い
で、オリゴヌクレオチドプローブを用い、ＰＲＯ２９９
配列をコードするクローンを単離するために、陽性ライ
ブラリーを用いた。
【０２７８】ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのＲ
ＮＡを、ヒト胎児脳組織から単離した。ｃＤＮＡクロー
ンを単離するために用いたｃＤＮＡライブラリーを、例
えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃ
Ａなどから商業的に利用できる試薬を用いた標準的な方
法により構築した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオ
リゴｄＴプライマーで合成し、ＳａｌＩヘミキナーゼア
ダプターに平滑端で連結し、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電
気泳動でおおよそのサイズに分画し、定められた方向で
適切なクローニングベクター［例えば、ｐＲＫＢもしく
はｐＲＫＤ；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲ
Ｋ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２５３：１２７８−１２８０（１９９１）参照］
に、特有のＸｈｏＩとＮｏｔＩ部位で、クローニングし
た。
【０２７９】上記のように単離したクローンのＤＮＡ配
列決定により、ＰＲＯ２９９の全長のＤＮＡ配列［ここ
にＵＮＱ２６２（ＤＮＡ３９９７６−１２１５）と称す
る］を得て、ＰＲＯ２９９のタンパク質配列を推定し
た。
【０２８０】ＵＮＱ２６２（ＤＮＡ３９９７６−１２１
５）の全ヌクレオチド配列を図８に示す（配列番号：１
４）。クローンＵＮＱ２６２（ＤＮＡ３９９７６−１２
１５）は、ヌクレオチド部位１１１−１１３に見かけ上
の翻訳開始部位と、ヌクレオチド部位２３２２−２３２
４に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリーデ
ィングフレームを含む（図８）。この推定されるポリペ
プチドプレカーサーは、７３７アミノ酸長である（図
９）。クローンＵＮＱ２６２（ＤＮＡ３９９７６−１２
１５）によってコードされるポリペプチド配列の重要な
領域が同定され、以下のものを含む：アミノ酸１−２８
に相当する単一ペプチド、アミノ酸６３８−６６２に相
当する推定トランスメンブレン領域、アミノ酸８０−１
０６、１２１−２０３、３３６−３６０、３７８−４１
５、４１６−４４１、４５４−４９０、４９１−５２
８、５２９−５４８、５６７−６０４および６０５−６
２２に相当する１０個のＥＧＦの反復、アミノ酸１０−
１２０，２０４−２０７，２０８−２２２，２２３−２
８５，２８６−３０４，３６１−３７４，３７５−３７
７，４４２−４５３，５４９−５６３，および５６４−
５６６に相当する、潜在的な１０個のＮ−グリコシル化
部位。クローンＵＮＱ２６２（ＤＮＡ３９９７６−１２
１５）が、ＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号がＡ
ＴＣＣ２０９５２４と付与されている。
【０２８１】全長のＰＲＯ２９９ポリペプチドのアミノ
酸配列の分析から、それの一部が、切痕タンパク質(not
ch protein)と有意な相同性を有することが提示され、
それによって、ＰＲＯ２９９が新規な切痕タンパク相同
体であり、典型的な切痕タンパク質の活性を有すること
が示唆されている。
【０２８２】実施例７： ヒトＰＲＯ３２３をコードす
るｃＤＮＡクローンの単離 コンセンサスＤＮＡ配列を、上記実施例１に記載された
ように、他のＥＳＴ配列に対応してまとめた。このコン
センサス配列を、ここに、ＤＮＡ３０８７５と称する。
ＤＮＡ３０８７５コンセンサス配列に基づいて、オリゴ
ヌクレオチドを、１）ＰＣＲによって、興味のある配列
を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、および
２）ＰＲＯ３２３の全長をコードする配列のクローンを
単離するためのプローブとして使用するため、合成し
た。
【０２８３】ＰＣＲプライマー（２個の前進と１個の逆
進）を合成した： 前進ＰＣＲプライマー１ ５’−ＡＧＴＴＣＴＧＧＴＣ
ＡＧＣＣＴＡＴＧＴＧＣＣ−３’（配列番号：２５） 前進ＰＣＲプライマー２ ５’−ＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧ
ＴＣＴＴＴＧＴＣＣＡＴＧＧＧ−３’（配列番号：２
６） 逆進ＰＣＲプライマー ５’−ＣＴＣＣＡＣＣＡＡＴＣ
ＣＣＧＡＴＧＡＡＣＴＴＧＧ−３’（配列番号：２７） さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーショ
ンプローブを、以下のヌクレオチド配列を有するコンセ
ンサスＤＮＡ３０８７５配列から構築した。ハイブリダ
イゼーションプローブ５’−ＧＡＧＣＡＧＡＴＴＧＡＣ
ＣＴＣＡＴＡＣＧＣＣＧＣＡＴＧＴＧＴＧＣＣＴＣＣＴ
ＡＴＴＣＴＧＡＧＣＴＧＧＡ−３’（配列番号：２８）
【０２８４】全長クローンの供給源としての複数個のラ
イブラリーをスクリーニングするため、ライブラリーか
らＤＮＡを、上記同定されたＰＣＲプライマー対を用い
たＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、Ｐ
ＲＯ３２３遺伝子をコードするクローンを、オリゴヌク
レオチドプローブと該ＰＣＲプライマー対の一つを用い
て単離するため、陽性ライブラリーを用いた。ｃＤＮＡ
ライブラリーの構築のためのＲＮＡを、ヒト胎児肝組織
（ＬＩＢ６）から単離した。
【０２８５】上記のように単離したクローンのＤＮＡ配
列決定によって、ＰＲＯ３２３［ここに、ＵＮＱ２８４
（ＤＮＡ３５５９５−１２２８）と称する］（配列番
号：２３）が得られ、ＰＲＯ３２３のタンパク質配列が
推定された。
【０２８６】ＵＮＱ２８４（ＤＮＡ３５５９５−１２２
８）の全ヌクレオチド配列を図１２（配列番号：２３）
に示す。クローンＵＮＱ２８４（ＤＮＡ３５５９５−１
２２８）は、ヌクレオチド部位１１０−１１２に見かけ
上の翻訳開始部位と、ヌクレオチド部位１４０９−１４
１１に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリー
ディングフレームを含む（図１２）。推測されるポリペ
プチドプレカーサーは、４３３アミノ酸長である（図１
３）。図１３に示された全長ＰＲＯ３２３タンパク質
は、分子量約４７７８７ダルトンで、ＰＩ約６．１１で
あると推測される。クローンＵＮＱ２８４（ＤＮＡ３５
５９５−１２２８）は、ＡＴＣＣに寄託しており、ＡＴ
ＣＣ寄託番号２０９５２８が付与される。
【０２８７】全長ＰＲＯ３２３ポリペプチドのアミノ酸
配列の分析により、それの一部が、様々なジペプチダー
ゼタンパク質と有意な相同性を有することが示され、そ
れによって、ＰＲＯ３２３が、新規なジペプチダーゼタ
ンパク質であることが示唆されている。
【０２８８】実施例８： ヒトＰＲＯ３２７をコードす
るｃＤＮＡクローンの単離 発現配列標識（expressed sequence tag）（ＥＳＴ）Ｄ
ＮＡデータベース（ＬＩＦＥＳＥＱTM，Ｉｎｃｙｔｅ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔ
ｏ，ＣＡ）を検索し、様々なＥＳＴ配列が、ヒトプロラ
クチン受容体タンパク質とのある程度の相同性を示すこ
とを確認した。これらのＥＳＴ配列を、ｐｈｒａｐを用
いて整列し、コンセンサス配列を得た。次いで、上記Ｅ
ＳＴ配列の供給源を用いて、コンセンサス配列をできる
かぎり伸長するため、このコンセンサスＤＮＡ配列を、
ＢＬＡＳとｐｈｒａｐの反復サイクルを用いて伸長し
た。伸長し、まとめた配列を、ここにＤＮＡ３８１１０
と称する。上記検索は、コンピュータープログラムＢＬ
ＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２を用いて行った（Ａｌｔｓ
ｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
２６６：４６０−４８０（１９９６））。既知のタンパ
ク質をコードしないＢＬＡＳＴスコアー７０（もしく
は、いくつかの事例において９０）以上となるこれらの
比較結果を、グループ化し、プログラム「ｐｈａｒｐ」
（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎ
ｇｔｏｎ；ｈｔｔｐ：／／ｂｏｚｅｍａｎ．ｍｂｔ．ｗ
ａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈｒａｐ．ｄｏｃｓ／
ｐｈｒａｐ．ｈｔｍｌ）により、コンセンサスＤＮＡ配
列にまとめた。
【０２８９】上記のように得られたＤＮＡ３８１１０コ
ンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを、
１）興味のある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを、Ｐ
ＣＲによって同定するため、および２）ＰＲＯ３２７を
コードする全長の配列のクローンを単離するためのプロ
ーブとしての使用のため、合成した。
【０２９０】ＰＣＲプライマー（前進と逆進）を以下の
ように合成した： 前進プライマー ５’−ＣＣＣＧＣＣＣＧＡＣＧＴＧＣ
ＡＣＧＴＧＡＧＣＣ−３’（配列番号：３３） 逆進プライマー ５’−ＴＧＡＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧ
ＡＡＣＴＧＣＴＴＧ−３’（配列番号：３４） さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーショ
ンプローブを、以下のヌクレオチド配列を有するコンセ
ンサスＤＮＡ３８１１０コンセンサス配列から構築し
た。 ハイブリダイゼーションプローブ５’−ＣＡＡＧＴＧＣ
ＧＣＴＧＣＡＡＣＣＣＣＴＴＴＧＧＣＡＴＣＴＡＴＧＧ
ＣＴＣＣＡＡＧＡＡＡＧＣＣＧＧＧＡＴ−３’（配列番
号：３５）
【０２９１】全長クローンの供給源としての複数個のラ
イブラリーをスクリーニングするために、ライブラリー
からＤＮＡを、上記ＰＣＲプライマー対を用いたＰＣＲ
増幅によってスクリーニングした。次いで、陽性ライブ
ラリーを、オリゴヌクレオチドプローブと上記ＰＣＲプ
ライマーの一つを用い、ＰＲＯ３２７遺伝子をコードす
るクローンを単離するために用いた。ｃＤＮＡライブラ
リーの構築のためのＲＮＡを、ヒト胎児肺組織（ＬＩＢ
２６）から単離した。
【０２９２】上記単離したクローンのＤＮＡ配列決定に
より、ＰＲＯ３２７の全長ＤＮＡ配列［ここに、ＵＮＱ
２８８（ＤＮＡ３８１１３−１２３０）として称する］
（配列番号：１６）を得て、ＰＲＯ３２７のタンパク質
配列を推定した。
【０２９３】ＵＮＱ２８８（ＤＮＡ３８１１３−１２３
０）の全ヌクレオチド配列を、図１６（配列番号：３
１）に示す。クローンＵＮＱ２８８（ＤＮＡ３８１１３
−１２３０）は、ヌクレオチド部位１１９−１２１に見
かけ上の翻訳開始部位と、ヌクレオチド部位１３８５−
１３８７に終止コドンでの終止を有する単一のオープン
リーディングフレームを含む（図１６）。推測されるポ
リペプチドプレカーサーは、４２２アミノ酸長である
（図１７）。図１７に示された全長ＰＲＯ３２７タンパ
ク質は、分子量約４６３０２ダルトンで、ＰＩ約９．４
２であると推測される。クローンＵＮＱ２８８（ＤＮＡ
３８１１３−１２３０）は、ＡＴＣＣに寄託しており、
ＡＴＣＣ寄託番号２０９５３０が付与されている。
【０２９４】全長ＰＲＯ３２７ポリペプチドのアミノ酸
配列の分析により、それの一部が、ヒトプロラクチン受
容体タンパク質と有意な相同性を有することが提示さ
れ、それによって、ＰＲＯ３２７が、新規なプロラクチ
ン結合タンパク質であることが示唆されている。
【０２９５】実施例９： ヒトＰＲＯ２３３をコードす
るｃＤＮＡクローンの単離 コンセンサスＤＮＡ配列を、上記実施例１に記載された
ように、他のＥＳＴ配列と対応してまとめた。このコン
センサス配列を、ここに、ＤＮＡ３０９４５と称する。
ＤＮＡ３０９４５コンセンサス配列に基づいて、オリゴ
ヌクレオチドを、１）ＰＣＲによって、興味のある配列
を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、および
２）ＰＲＯ２３３の全長をコードする配列のクローンを
単離するためのプローブとして使用するため、合成し
た。
【０２９６】ＰＣＲプライマーを以下のように合成し
た： 前進ＰＣＲプライマー１ ５’−ＧＧＴＧＡＡＧＧＣＡ
ＧＡＡＡＴＴＧＧＡＧＡＴＧ−３’（配列番号：３８） 逆進ＰＣＲプライマー ５’−ＡＴＣＣＣＡＴＧＣＡＴ
ＣＡＧＣＣＴＧＴＴＴＡＣＣ−３’（配列番号：３９） さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーショ
ンプローブを、以下のヌクレオチド配列を有するコンセ
ンサスＤＮＡ３０９４５配列から構築した。 ハイブリダイゼーションプローブ５’−ＧＣＴＧＧＴＧ
ＴＡＧＴＣＴＡＴＡＣＡＴＣＡＧＡＴＴＴＧＴＴＴＧＣ
ＴＡＣＡＣＡＡＧＡＴＣＣＴＣＡＧ−３’（配列番号：
４０）
【０２９７】全長クローンの供給源としての複数個のラ
イブラリーをスクリーニングするために、ライブラリー
からＤＮＡを、上記同定されたＰＣＲプライマー対を用
いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、
ＰＲＯ２３３遺伝子をコードするクローンをオリゴヌク
レオチドプローブを用いて単離するために、陽性ライブ
ラリーを用いた。ｃＤＮＡライブラリーの構築のための
ＲＮＡを、ヒト胎児脳組織から単離した。
【０２９８】上記のように単離したクローンのＤＮＡ配
列決定によって、ＰＲＯ２３３［ここに、ＵＮＱ２０７
（ＤＮＡ３４４３６−１２３８）と称する］（配列番
号：３６）が得られ、ＰＲＯ２３３のタンパク質配列が
推定された。
【０２９９】ＵＮＱ２０７（ＤＮＡ３４４３６−１２３
８）の全ヌクレオチド配列を図１８（配列番号：３６）
に示す。クローンＵＮＱ２０７（ＤＮＡ３４４３６−１
２３８）は、ヌクレオチド部位１０１−１０３に見かけ
上の翻訳開始部位と、ヌクレオチド部位１００１−１０
０３に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリー
ディングフレームを含む（図１８）。推測されるポリペ
プチドプレカーサーは、３００アミノ酸長である（図１
９）。図１９に示された全長ＰＲＯ２３３タンパク質
は、分子量約３２９６４ダルトンで、ＰＩ約９．５２で
あると推測される。さらに、単一ペプチドと推定上の酸
化還元酵素活性部位を含む興味のある領域を、図１９に
示す。クローンＵＮＱ２０７（ＤＮＡ３４４３６−１２
３８）は、ＡＴＣＣに寄託しており、ＡＴＣＣ寄託番号
２０９５２３が付与されている。
【０３００】全長ＰＲＯ２３３ポリペプチドのアミノ酸
配列の分析により、それの一部が、様々な還元酵素タン
パク質と有意な相同性を有することが提示され、それに
よって、ＰＲＯ２３３が、新規な還元酵素タンパク質で
あることが示唆されている。
【０３０１】実施例１０： ヒトＰＲＯ３４４をコード
するｃＤＮＡクローンの単離 コンセンサスＤＮＡ配列を、上記実施例１に記載された
ように、他のＥＳＴ配列に対応してまとめた。このコン
センサス配列を、ここに、ＤＮＡ３４３９８と称する。
ＤＮＡ３４３９８コンセンサス配列に基づいて、オリゴ
ヌクレオチドを、１）ＰＣＲによって、興味のある配列
を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、および
２）ＰＲＯ３４４の全長をコードする配列のクローンを
単離するためのプローブとして使用するため、合成し
た。
【０３０２】ＤＮＡ３４３９８コンセンサス配列に基づ
いて、前進と逆進ＰＣＲプライマーを合成した： 前進ＰＣＲプライマー（３４３９８．ｆ１） ５’−Ｔ
ＡＣＡＧＧＣＣＣＡＧＴＣＡＧＧＡＣＣＡＧＧＧＧ−
３’（配列番号：４３） 前進ＰＣＲプライマー（３４３９８．ｆ２） ５’−Ａ
ＧＣＣＡＧＣＣＴＣＧＣＴＣＴＣＧＧ−３’（配列番
号：４４） 前進ＰＣＲプライマー（３４３９８．ｆ３） ５’−Ｇ
ＴＣＴＧＣＧＡＴＣＡＧＧＴＣＴＧＧ−３’（配列番
号：４５） 逆進ＰＣＲプライマー（３４３９８．ｒ１） ５’−Ｇ
ＡＡＡＧＡＧＧＣＡＡＴＧＧＡＴＴＣＧＣ−３’（配列
番号：４６） 逆進ＰＣＲプライマー（３４３９８．ｒ２） ５’−Ｇ
ＡＣＴＴＡＣＡＣＴＴＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＡＣ−
３’（配列番号：４７） さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーショ
ンプローブを、以下のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ
３４３９８コンセンサス配列から構築した。 ハイブリダイゼーションプローブ５’−ＧＧＡＧＣＡＣ
ＣＡＣＣＡＡＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＣＧＧＡＧＴＡＧＣ
ＧＡＧＣＧＣＣＣＣＧＡＡＧ−３’（配列番号：４８）
【０３０３】全長クローンの供給源としての複数個のラ
イブラリーをスクリーニングするために、ライブラリー
からＤＮＡを、上記同定されたＰＣＲプライマー対を用
いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、
オリゴヌクレオチドプローブと該ＰＣＲプライマーの一
つを用いて、ＰＲＯ３４４遺伝子をコードするクローン
を単離するために、陽性ライブラリーを用いた。ｃＤＮ
Ａライブラリーの構築のためのＲＮＡを、ヒト胎児腎組
織から単離した。
【０３０４】上記のように単離されたクローンのＤＮＡ
配列決定によって、ＰＲＯ３４４の全長のＤＮＡ配列
［ここに、ＵＮＱ３０３（ＤＮＡ４０５９２−１２４
２）と称する］（配列番号：４１）を得て、ＰＲＯ３４
４のタンパク質配列を推定した。
【０３０５】ＵＮＱ３０３（ＤＮＡ４０５９２−１２４
２）の全ヌクレオチド配列を図２０（配列番号：４１）
に示す。クローンＵＮＱ３０３（ＤＮＡ４０５９２−１
２４２）は、ヌクレオチド部位２２７−２２９に見かけ
上の翻訳開始部位と、ヌクレオチド部位９５６−９５８
に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリーディ
ングフレームを含む（図２０）。推測ポリペプチドプレ
カーサーは、２４３アミノ酸長である（図２１）。ＰＲ
Ｏ３４４のヌクレオチド１から７２９によってコードさ
れたアミノ酸配列の重要な領域は、図２１に示されてい
るように、単一ペプチド、成熟タンパク質の開始、およ
び潜在的な２個のＮ−ミリストイル化部位を含む。クロ
ーンＵＮＱ３０３（ＤＮＡ４０５９２−１２４２）は、
ＡＴＣＣに寄託しており、ＡＴＣＣ寄託番号ＡＴＣＣ２
０９４９２が付与されている。
【０３０６】全長ＰＲＯ３４４ポリペプチドのアミノ酸
配列の分析により、それらの一部が、様々なヒトおよび
齧歯動物の補体タンパク質と有意な相同性を有すること
が提示され、それによって、ＰＲＯ３４４が、新規な補
体タンパク質であることが示唆されている。
【０３０７】実施例１１： ヒトＰＲＯ３４７をコード
するｃＤＮＡクローンの単離 コンセンサスＤＮＡ配列を、上記実施例１に記載された
ように、他のＥＳＴ配列に対応してまとめた。このコン
センサス配列を、ここに、ＤＮＡ３９４９９と称する。
ＤＮＡ３９４９９コンセンサス配列に基づいて、オリゴ
ヌクレオチドが、１）ＰＣＲによって、興味のある配列
を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、および
２）ＰＲＯ３４７の全長をコードする配列のクローンを
単離するためのプローブとして使用するため、合成し
た。
【０３０８】ＰＣＲプライマー（前進と逆進）を以下の
ように合成した： 前進ＰＣＲプライマー ５’−ＡＧＧＡＡＣＴＴＣＴＧ
ＧＡＴＣＧＧＧＣＴＣＡＣＣ−３’（配列番号：５１） 逆進ＰＣＲプライマー ５’−ＧＧＧＴＣＴＧＧＧＣＣ
ＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＡＧ−３’（配列番号：５２） さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーショ
ンプローブを、以下のヌクレオチド配列を有するコンセ
ンサスＤＮＡ３９４９９配列から構築した。 ハイブリダイゼーションプローブ５’−ＧＣＣＡＡＧＧ
ＡＣＴＣＣＴＴＣＣＧＣＴＧＧＧＣＣＡＣＡＧＧＧＧＡ
ＧＣＡＣＣＡＧＧＣＣＴＴＣ−３’（配列番号：５３）
【０３０９】全長クローンの供給源としての複数個のラ
イブラリーをスクリーニングするために、ライブラリー
からＤＮＡを、上記同定したＰＣＲプライマー対を用い
たＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、オ
リゴヌクレオチドプローブと該ＰＣＲプライマーの一つ
を用いて、ＰＲＯ３４７遺伝子をコードするクローンを
単離するために、陽性ライブラリーを用いた。ｃＤＮＡ
ライブラリーの構築のためのＲＮＡを、ヒト胎児腎組織
（ＬＩＢ２２８）から単離した。
【０３１０】上記のように単離したクローンのＤＮＡ配
列決定によって、ＰＲＯ３４７の全長のＤＮＡ配列［こ
こに、ＵＮＱ３０６（ＤＮＡ４４１７６−１２４４）と
称する］（配列番号：４９）を得て、ＰＲＯ３４７のタ
ンパク質配列を推定した。
【０３１１】ＵＮＱ３０６（ＤＮＡ４４１７６−１２４
４）の全ヌクレオチド配列を図２２（配列番号：４９）
に示す。クローンＵＮＱ３０６（ＤＮＡ４４１７６−１
２４４）は、ヌクレオチド部位１２３−１２５に見かけ
上の翻訳開始部位と、ヌクレオチド部位１４８８−１４
９０に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリー
ディングフレームを含む（図２２）。推測されるポリペ
プチドプレカーサーは、４５５アミノ酸長である（図２
３）。図２３に示された全長ＰＲＯ３４７タンパク質
は、分子量約５０４７８ダルトンで、ＰＩ約８．４４で
あると推測される。クローンＵＮＱ３０６（ＤＮＡ４４
１７６−１２４４）は、ＡＴＣＣに寄託しており、ＡＴ
ＣＣ寄託番号２０９５３２が付与されている。
【０３１２】全長ＰＲＯ３４７ポリペプチドのアミノ酸
配列の分析により、それの一部が、様々なシステインに
富む分泌タンパク質と有意な相同性を有することが提示
され、それによって、ＰＲＯ３４７が、新規なシステイ
ンに富む分泌タンパク質であることが示唆されている。
【０３１３】実施例１２： ヒトＰＲＯ３５４をコード
するｃＤＮＡクローンの単離 発現配列標識（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ ｔａｇ）（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース（ＬＩＦＥ
ＳＥＱTM， Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を検索し、インタ
ー-アルファ-トリプシンインヒビター重鎖と、およびお
互いに、ある程度の相同性を有する様々なＥＳＴ配列を
同定した。次いで、相同のＥＳＴ配列を整列し、コンセ
ンサス配列を得た。次いで、公的ＥＳＴデータベース
（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）と私的ＥＳＴ ＤＮＡデー
タベース（ＬＩＦＥＳＥＱTM，Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒ
ｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）
の両方から得られた相同ＥＳＴ配列を用い、コンセンサ
ス配列をできるかぎり伸長するために、ＢＬＡＳとｐｈ
ｒａｐの反復サイクルを用い、得られたコンセンサスＤ
ＮＡ配列を伸長した。伸長し、まとめた配列を、ここに
ＤＮＡ３９６３３と称する。上記検索を、コンピュータ
ープログラムＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２を用いて
実行した（Ａｌｔｓｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０−４８０（１９９
６））。既知のタンパク質をコードしないＢＬＡＳＴス
コアー７０（もしくは、いくつかの事例において９０）
以上となるこれらの比較結果を、プログラム「ｐｈａｒ
ｐ」（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏ
ｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ
ｉｎｇｔｏｎ； ｈｔｔｐ：／／ｂｏｚｅｍａｎ．ｍｂ
ｔ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈｒａｐ．ｄｏ
ｃｓ／ｐｈｒａｐ．ｈｔｍｌ）を用い、グループ化し、
コンセンサスＤＮＡ配列にまとめた。
【０３１４】ＤＮＡ３９６３３コンセンサス配列に基づ
いて、オリゴヌクレオチドを、１）興味のある配列を含
むｃＤＮＡライブラリーを、ＰＣＲによって同定するた
め、および２）ＰＲＯ３５４をコードする全長配列のク
ローンを単離するためのプローブとしての使用のため、
合成した。前進と逆進ＰＣＲプライマーは、一般的に、
２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば、長
さ約１００−１０００ｂｐのＰＣＲ生成物を与えるよう
に設計する。プローブの配列は、典型的には、長さ４０
−５５ｂｐである。いくつかの事例において、コンセン
サス配列が約１−１．５ｋｂを超える時、付加的なオリ
ゴヌクレオチドを合成する。全長クローンのためのいく
つかのライブラリーをスクリーニングするために、ライ
ブラリーからＤＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅ
ｎｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙに従って、ＰＣＲプライマー対を用い、Ｐ
ＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、オリゴ
ヌクレオチドプローブもしくはプライマー対の一つを用
い、興味のある遺伝子をコードするクローンを単離する
ために、陽性のライブラリーを用いた。
【０３１５】ＰＣＲプライマー（前進と逆進）を以下の
ように合成した： 前進プライマー１（３９６３３．ｆ１） ５’−ＧＴＧ
ＧＧＡＡＣＣＡＡＡＣＴＣＣＧＧＣＡＧＡＣＣ−３’
（配列番号：５６） 前進プライマー２（３９６３３．ｆ２） ５’−ＣＡＣ
ＡＴＣＧＡＧＣＧＴＣＴＣＴＧＧ−３’（配列番号：５
７） 逆進プライマー（３９６３３．ｒ１） ５’−ＡＧＣＣ
ＧＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＧＧＴＴＣＡＴＣＧ−３’（配
列番号：５８） さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーショ
ンプローブを、以下のヌクレオチド配列を有するコンセ
ンサスＤＮＡ３９６３３配列から構築した。 ハイブリダイゼーションプローブ５’−ＴＧＧＡＡＧＧ
ＡＣＣＡＣＴＴＧＡＴＡＴＣＡＧＴＣＡＣＴＣＣＡＧＡ
ＣＡＧＣＡＴＣＡＧＧＧＡＴＧＧＧ−３’（配列番号：
５９）
【０３１６】全長クローンの供給源としての複数個のラ
イブラリーをスクリーニングするために、ライブラリー
からＤＮＡを、上記ＰＣＲプライマー対を用いたＰＣＲ
増幅によってスクリーニングした。次いで、オリゴヌク
レオチドプローブと上記ＰＣＲプライマーの一つを用い
て、ＰＲＯ３５４遺伝子をコードするクローンを単離す
るために、陽性のライブラリーを用いた。
【０３１７】ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮ
Ａを、ヒト胎児腎組織（ＬＩＢ２２７）から単離した。
ｃＤＮＡクローンを単離するために用いたｃＤＮＡライ
ブラリーを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ，ＣＡなどから商業的に利用できる試薬を用いた標準
的な方法によって構築した。ｃＤＮＡを、ＮｏｔＩ部位
を含むオリゴｄＴプライマーで合成し、ＳａｌＩヘミキ
ナーゼアダプターに平滑端で連結し、ＮｏｔＩ部位で切
断し、適切にゲル電気泳動によりサイズ分画し、好適な
クローニングベクター［例えば、ｐＲＫＢもしくはｐＲ
ＫＤ；ｐＲＫ５Ｂは、ＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５
Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２５３：１２７８−１２８０（１９９１）参照］に、特
有のＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ部位で、定められた方向で
クローニングした。
【０３１８】上記のように単離したクローンのＤＮＡ配
列により、ＰＲＯ３５４の全長のＤＮＡ配列［ここに、
ＵＮＱ３１１（ＤＮＡ４４１９２−１２４６）として称
する］（配列番号：５４）を得て、ＰＲＯ３５４のタン
パク質配列を推定した。
【０３１９】ＵＮＱ３１１（ＤＮＡ４４１９２−１２４
６）の全ヌクレオチド配列を図２４（配列番号：５４）
に示す。クローンＵＮＱ３１１（ＤＮＡ４４１９２−１
２４６）は、ヌクレオチド部位７２−７４に見かけ上の
翻訳開始部位と、ヌクレオチド部位２１５４−２１５６
に終止コドンでの終止とを有する単一のオープンリーデ
ィングフレームを含む（図２４）。推測されるポリペプ
チドプレカーサーは、６９４アミノ酸長である（図２
５）。図２５に示した全長ＰＲＯ３５４タンパク質は、
分子量約７７４００ダルトンで、ＰＩ約９．５４である
と推測される。クローンＵＮＱ３１１（ＤＮＡ４４１９
２−１２４６）は、ＡＴＣＣに寄託しており、ＡＴＣＣ
寄託番号ＡＴＣＣ２０９５３１が付与されている。
【０３２０】全長ＰＲＯ３５４ポリペプチドのアミノ酸
配列の分析により、それの一部が、インター-アルファ-
トリプシンインヒビター重鎖タンパク質と有意な相同性
を有することが提示され、それによって、ＰＲＯ３５４
が、新規なインター-アルファ-トリプシンインヒビター
重鎖タンパク相同体であることが示唆されている。
【０３２１】実施例１３： ヒトＰＲＯ３５５をコード
するｃＤＮＡクローンの単離 コンセンサスＤＮＡ配列を、上記実施例１に記載された
ように、ＢＬＡＳＴとｐｈｒａｐを用いて、他のＥＳＴ
配列に対応してまとめた。このコンセンサス配列を、こ
こに、ＤＮＡ３５７０２と称する。ＤＮＡ３５７０２コ
ンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを、
１）ＰＣＲによって、興味ある配列を含むｃＤＮＡライ
ブラリーを同定するため、および２）ＰＲＯ３５５の全
長をコードする配列のクローンを単離するためのプロー
ブとして使用するため、合成した。
【０３２２】前進と逆進のＰＣＲプライマーを以下のよ
うに合成した： 前進ＰＣＲプライマー（．ｆ１） ５’−ＧＧＣＴＴＣ
ＴＧＣＴＧＴＴＧＣＴＣＴＴＣＴＣＣＧ−３’（配列番
号：６２） 前進ＰＣＲプライマー（．ｆ２） ５’−ＧＴＡＣＡＣ
ＴＧＴＧＡＣＣＡＧＴＣＡＧＣ−３’（配列番号：６
３） 前進ＰＣＲプライマー（．ｆ３） ５’−ＡＴＣＡＴＣ
ＡＣＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡＧＣ−３’（配列番号：６
４） 逆進ＰＣＲプライマー（．ｒ１） ５’−ＴＴＣＡＡＴ
ＣＴＣＣＴＣＡＣＣＴＴＣＣＡＣＣＧＣ−３’（配列番
号：６５） 逆進ＰＣＲプライマー（．ｒ２） ５’−ＡＴＡＧＣＴ
ＧＴＧＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＣＴＧＣＧ−３’（配列番
号：６６） さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーショ
ンプローブを、以下のヌクレオチド配列を有するコンセ
ンサスＤＮＡ３５７０２配列から構築した。 ハイブリダイゼーションプローブ５’−ＣＧＣＧＧＣＡ
ＣＴＧＡＴＣＣＣＣＡＣＡＧＧＴＧＡＴＧＧＧＣＡＧＡ
ＡＴＣＴＧＴＴＴＡＣＧＡＡＡＧＡＣＧ−３’（配列番
号：６７）
【０３２３】全長のクローンの供給源としての複数個の
ライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリ
ーからＤＮＡを、上記同定されたＰＣＲプライマー対の
一つを用いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。
次いで、陽性ライブラリーを、オリゴヌクレオチドプロ
ーブを用いて、ＰＲＯ３５５遺伝子をコードするクロー
ンを単離するために用いた。ｃＤＮＡライブラリーの構
築のためのＲＮＡを、ヒト胎児肝組織から単離した。
【０３２４】上記のように単離したクローンのＤＮＡ配
列決定によって、ＰＲＯ３５５の全長のＤＮＡ配列［こ
こに、ＵＮＱ３１２（ＤＮＡ３９５１８−１２４７）と
称する］（配列番号：６０）を得て、ＰＲＯ３５５のタ
ンパク質配列を推定した。
【０３２５】ＵＮＱ３１２（ＤＮＡ３９５１８−１２４
７）の全ヌクレオチド配列を図２６（配列番号：６０）
に示す。クローンＵＮＱ３１２（ＤＮＡ３９５１８−１
２４７）は、ヌクレオチド部位２２−２４に見かけ上の
翻訳開始部位と、ヌクレオチド部位１３４２−１３４４
に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリーディ
ングフレームを含む（図２６）。推測されるポリペプチ
ドプレカーサーは、４４０アミノ酸長である（図２
７）。図２７に示された全長ＰＲＯ３５５タンパク質
は、分子量約４８２４０ダルトンで、ＰＩ約４．９３で
あると推測される。さらに、単一ペプチド、細胞外ドメ
インにおけるＩｇ反復、潜在的なＮ−グリコシル化部
位、および潜在的なトランスメンブランドメインを含む
興味ある領域が、図２７に示されている。クローンＵＮ
Ｑ３１２（ＤＮＡ３９５１８−１２４７）は、ＡＴＣＣ
に寄託しており、ＡＴＣＣ寄託番号ＡＴＣＣ２０９５２
９が付与されている。
【０３２６】全長ＰＲＯ３５５ポリペプチドのアミノ酸
配列の分析により、それの一部が、ＣＲＴＡＭタンパク
質と有意な相同性を有することが提示され、それによっ
て、ＰＲＯ３５５が、ＣＲＴＡＭタンパク質であること
が示唆されている。
【０３２７】実施例１４： ヒトＰＲＯ３５７をコード
するｃＤＮＡクローンの単離 Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐａ
ｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡによるｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎ ｔａｇクローン番号「２４５２９７２」
を、データベース検索を始めるために用いた。Ｓｗｉｓ
ｓ−Ｐｒｏｔ公的タンパク質データベースからの約９５
０個の既知分泌タンパク質から、細胞外ドメイン（ＥＣ
Ｄ）配列（もしあるならば、分泌シグナルを含む）を、
Ｉｎｃｙｔｅ ＥＳＴクローン番号「２４５２９７２」
の一部と重複した発現配列標識（ＥＳＴ）データベース
を検索するために用いた。ＥＳＴデータベースは、公的
ＥＳＴデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）と、私
的ＥＳＴ ＤＮＡデータベース（ＬＩＦＥＳＥＱTM，Ｉ
ｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐａｌ
ｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を含む。上記検索を、コンピュー
タープログラムＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２を用い
［Ａｌｔｓｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ ２６６：４６０−４８０（１９９６）］、Ｅ
ＣＤタンパク質配列をＥＳＴ配列の６フレーム翻訳と比
較して実行した。既知のタンパク質をコードしないＢＬ
ＡＳＴスコアー７０（もしくは、いくつかの事例におい
て９０）以上となるこれらの比較結果を、プログラム
「ｐｈａｒｐ」（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌ
ｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ；ｈｔｔｐ：／／ｂｏｚｅｍ
ａｎ．ｍｂｔ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈｒ
ａｐ．ｄｏｃｓ／ｐｈｒａｐ．ｈｔｍｌ）を用い、グル
ープ化し、コンセンサスＤＮＡ配列にまとめた。
【０３２８】次いで、コンセンサスＤＮＡ配列を、ｐｈ
ｒａｐを用い、他のＥＳＴ配列に対応してまとめた。こ
のコンセンサス配列を、ここではＤＮＡ３７１６２と称
する。この事例において、上記ＥＳＴ配列の供給源を用
い、コンセンサス配列をできるかぎり伸長させるため
に、コンセンサスＤＮＡ配列を、ＢＬＡＳとｐｈｒａｐ
の反復サイクルを用いて伸長した。
【０３２９】ＤＮＡ３７１６２コンセンサス配列に基づ
いて、オリゴヌクレオチドを、１）興味のある配列を含
むｃＤＮＡライブラリーを、ＰＣＲによって同定するた
め、および２）ＰＲＯ３５７をコードする全長配列のク
ローンを単離するためのプローブとしての使用のため、
合成した。前進と逆進ＰＣＲプライマーは、一般的に、
２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば、長
さ約１００−１０００ｂｐのＰＣＲ生成物を得るために
設計される。プローブの配列は、典型的には、長さ４０
−５５ｂｐである。いくつかの事例において、コンセン
サス配列が約１−１．５ｋｂを超える時、付加的なオリ
ゴヌクレオチドを合成する。全長のクローンのためのい
くつかのライブラリーをスクリーニングするために、ラ
イブラリーからＤＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒ
ｅｎｅ Ｐｒｏｒｏｃｏｌｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙに従って、ＰＣＲプライマー対を用いた
ＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、陽性
のライブラリーを、オリゴヌクレオチドプローブとプラ
イマー対の一つを用い、興味のある遺伝子をコードする
クローンを単離するために用いた。
【０３３０】ＰＣＲプライマーを以下のように合成し
た： 前進プライマー１ ５’−ＣＣＣＴＣＣＡＣＴＧＣＣＣ
ＣＡＣＣＧＡＣＴ−３’（配列番号：７０）； 逆進プライマー１ ５’−ＣＧＧＴＴＣＴＧＧＧＧＡＣ
ＧＴＴＡＧＧＧＣＴＣＧ−３’（配列番号：７１）；お
よび前進プライマー２ ５’−ＣＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴ
ＣＣＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＡＴ−３’（配列番号：７
２）。 さらに、２つの合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼ
ーションプローブを、以下のヌクレオチド配列を有する
コンセンサスＤＮＡ３７１６２配列から構築した。 ハイブリダイゼーションプローブ１；５’−ＡＧＧＡＣ
ＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＣＣＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＡＴＧ
ＧＧＧＧＣＡＣＡＴＧＣＣＡＣＣ−３’（配列番号：７
３）；およびハイブリダイゼーションプローブ２５’−
ＡＣＧＣＡＡＡＧＣＣＣＴＡＣＡＴＣＴＡＡＧＣＣＡＧ
ＡＧＡＧＡＧＡＣＡＧＧＧＣＡＧＣＴＧＧＧ−３’（配
列番号：７４）。
【０３３１】全長クローンの供給源としての複数個のラ
イブラリーをスクリーニングするために、ライブラリー
からＤＮＡを、上記ＰＣＲプライマー対を用いたＰＣＲ
増幅によってスクリーニングした。次いで、オリゴヌク
レオチドプローブとＰＣＲプライマーの一つを用い、Ｐ
ＲＯ３５７遺伝子をコードするクローンを単離するた
め、陽性のライブラリーを用いた。
【０３３２】ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのＲ
ＮＡを、ヒト胎児肝組織から単離した。ｃＤＮＡクロー
ンを単離するために用いたｃＤＮＡライブラリーを、Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡなどか
ら商業的に利用できる試薬を用いた標準的な方法によっ
て構築した。ｃＤＮＡを、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄ
Ｔプライマーで合成し、ＳａｌＩヘミキナーゼアダプタ
ーに平滑端で連結し、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動
により適切にサイズ分画し、好適なクローニングベクタ
ー［例えば、ｐＲＫＢもしくはｐＲＫＤ；ｐＲＫ５Ｂ
は、ＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体であ
る；Ｈｏｌｍｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１２７
８−１２８０（１９９１）参照］に、特有のＸｈｏＩお
よびＮｏｔＩ部位で、定められた方向でクローニングし
た。
【０３３３】上記のように単離したクローンのＤＮＡ配
列決定により、ＰＲＯ３５７の全長のＤＮＡ配列［ここ
に、ＵＮＱ３１４（ＤＮＡ４４８０４−１２４８）とし
てする］（配列番号：６８）を得て、ＰＲＯ３５７のタ
ンパク質配列を推定した。
【０３３４】ＵＮＱ３１４（ＤＮＡ４４８０４−１２４
８）の全ヌクレオチド配列を図２８（配列番号：６８）
に示す。クローンＵＮＱ３１４（ＤＮＡ４４８０４−１
２４８）は、ヌクレオチド部位１３７−１３９に見かけ
上の翻訳開始部位と、ヌクレオチド部位１９３１−１９
３３に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリー
ディングフレームを含む（図２８）。推測されるポリペ
プチドプレカーサーは、５９８アミノ酸長である（図２
９）。クローンＵＮＱ３１４（ＤＮＡ４４８０４−１２
４８）は、ＡＴＣＣに寄託しており、ＡＴＣＣ寄託番号
ＡＴＣＣ２０９５２７が付与されている。
【０３３５】さらなる分析により、図２９に示すような
様々な特性が示されている。図２９には、配列番号：６
８のヌクレオチド１３７から１９３０まで得られたアミ
ノ酸配列（配列番号：６９）を示す。分子量が６３０３
０ダルトン；ｐＩが７．２４；およびＮＴ（Ｓ／Ｔ）が
３である。推定されるトランスメンブレンドメインは、
図２９においてアミノ酸５０６から５２４までに示され
る。もしくは、トランスメンブレン領域はアミノ酸４９
７の「Ｇ」で始まる。潜在的なＮ−グリコシル化部位
は、図２９の下線部位である。ＥＧＦ様ドメインのシス
テインパターンサインが、アミノ酸３５５から３６６ま
でに見られる。また、この領域は、ラットにおける乳脂
乳球タンパク質、切痕、もしくは肝細胞増殖因子変換酵
素においても認められる。また、このシグナルペプチド
は、図２９のアミノ酸１−２２にもある。ＡＬＳとの相
同の最初と、細胞外ドメインにおける他のロイシン反復
に富むタンパク質が、アミノ酸部位２４から始まる。
【０３３６】これゆえ、全長ＰＲＯ３５７のアミノ酸配
列の分析から、それの一部が、ＡＬＳとの有意な相同性
を有することが提示され、これによって、ＰＲＯ３５７
がＡＬＳに関する新規のロイシン富反復タンパク質であ
ることが示唆される。
【０３３７】実施例１５： ヒトＰＲＯ７１５をコード
するｃＤＮＡクローンの単離 私的ＥＳＴ ＤＮＡデータベース（ＬＩＦＥＳＥＱTM，
Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐａ
ｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を、ヒトＴＮＦ−αの相同性を
有するポリペプチドをコードするＥＳＴ配列について検
索した。この検索により、Ｉｎｃｙｔｅ Ｅｘｐｒｅｓ
ｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ Ｎｏ．２０９９８５
５を同定した。
【０３３８】次いで、コンセンサスＤＮＡ配列を、ｓｅ
ｑｅｘｔと「ｐｈｒａｐ」（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ，Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅ
ａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ； ｈｔｔｐ：／／
ｂｏｚｅｍａｎ．ｍｂｔ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄ
ｕ／ｐｈｒａｐ．ｄｏｃｓ／ｐｈｒａｐ．ｈｔｍｌ）を
用い、その他のＥＳＴ配列に対応してまとめた。このコ
ンセンサス配列を、ここにＤＮＡ５２０９２と称する。
この構成に同定された様々なＥＳＴクローンの定序に基
づいて、Ｍｅｒｃｋ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｍ Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ ＥＳＴセット（ＥＳＴクローン番号．７
２５８８７、受託番号．ＡＡ２９２３５８）から単一の
ＥＳＴクローンを得て、その挿入物を配列決定した。次
いで、全長ＤＮＡ５２７２２−１２２９配列を、ＥＳＴ
クローン番号．７２５８８７からの挿入ＤＮＡの配列決
定によって得た。
【０３３９】ＵＮＱ３８３（ＤＮＡ５２７２２−１２２
９）の全ヌクレオチド配列を、図３０（配列番号：７
５）において示す。クローンＵＮＱ３８３（ＤＮＡ５２
７２２−１２２９）は、ヌクレオチド部位１１４−１１
６に見かけ上の翻訳開始部位を含み、ヌクレオチド部位
８６４−８６６に終止コドンでの終止を有する単一のオ
ープンリ−ディングフレームを含む。推定されるポリペ
プチドは、２５０アミノ酸長（図３１）である。図３１
に示される全長のＰＲＯ７１５は、分子量約２７４３３
ダルトン、ｐＩ約９．８５であると推定される。
【０３４０】全長ＰＲＯ７１５ポリペプチドのアミノ酸
配列の分析より、タンパク質の腫瘍壊死因子ファミリー
の一員と有意な相同性を有すことが提示され、それによ
って、ＰＲＯ７１５が、新規な腫瘍壊死因子タンパク質
であることが示されている。
【０３４１】実施例１６： ヒトＰＲＯ３５３をコード
するｃＤＮＡクローンの単離 コンセンサスＤＮＡ配列を、上記実施例１に記載された
ように、ｐｈｒａｐを用い、他のＥＳＴ配列に対応して
まとめた。このコンセンサス配列を、ここに、ＤＮＡ３
６３６３と称する。上記ＥＳＴ配列の供給源を用い、コ
ンセンサス配列をできる限り伸長させるため、ＢＬＡＳ
Ｔおよびｐｈｒａｐの反復サイクルを用い、該コンセン
サスＤＮＡ配列を伸長した。ＤＮＡ３６３６３コンセン
サス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを、１）ＰＣ
Ｒによって、興味のある配列を含むｃＤＮＡライブラリ
ーを同定するため、および２）ＰＲＯ３５３の全長をコ
ードする配列のクローンを単離するためのプローブとし
て使用するため、合成した。
【０３４２】ＤＮＡ３６３６３コンセンサス配列に基づ
いて、前進と逆進のＰＣＲプライマーを以下のように合
成した： 前進ＰＣＲプライマー（３６３６３．ｆ１） ５’−Ｔ
ＡＣＡＧＧＣＣＣＡＧＴＣＡＧＧＡＣＣＡＧＧＧＧ−
３’（配列番号：８７） 逆進ＰＣＲプライマー（３６３６３．ｒ１） ５’−Ｃ
ＴＧＡＡＧＡＡＧＴＡＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＡＣＧ−
３’（配列番号：８８） さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーショ
ンプローブを、以下のヌクレオチド配列を有するコンセ
ンサスＤＮＡ３６３６３配列から構築した。 ハイブリダイゼーションプローブ ３６３６３．ｐ１
５’−ＣＣＣＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＣＴＧＣＴＧＴＧＡ
ＣＣＣＣＧＧＴＡＣＣＴＣＣＡＴＧＴＡＣＣＣＧＧ−
３’（配列番号：８９）
【０３４３】全長クローンの供給源としての複数個のラ
イブラリーをスクリーニングするため、ライブラリーか
らＤＮＡを、上記同定されたＰＣＲプライマー対の一つ
を用いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次い
で、オリゴヌクレオチドプローブとＰＣＲプライマー対
の一つを用いて、ＰＲＯ３５５遺伝子をコードするクロ
ーンを単離するため、陽性ライブラリーを用いた。ｃＤ
ＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡを、ヒト胎児腎
組織から単離した。
【０３４４】上記のように単離したクローンのＤＮＡ配
列決定によって、ＰＲＯ３５３の全長のＤＮＡ配列［こ
こに、ＵＮＱ３１０（ＤＮＡ４１２３４−１２４２）と
称する］（配列番号：８５）を得て、ＰＲＯ３５３のタ
ンパク質配列を推定した。
【０３４５】ＵＮＱ３１０（ＤＮＡ４１２３４−１２４
２）の全ヌクレオチド配列を図３４（配列番号：８５）
に示す。クローンＵＮＱ３１０（ＤＮＡ４１２３４−１
２４２）は、ヌクレオチド部位３０５−３０７に見かけ
上の翻訳開始部位と、ヌクレオチド部位１１４８−１１
５０に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリー
ディングフレームを含む（図３４）。推測されるポリペ
プチドプレカーサーは、２８１アミノ酸長である（図３
５）。ＰＲＯ３５３によってコードされるアミノ酸配列
の重要な領域には、アミノ酸１−２６に相当する単一ペ
プチド、アミノ酸部位２７に成熟タンパクの開始、アミ
ノ酸９３−９８に相当する潜在的なＮ−グリコシル化部
位、および、アミノ酸９９−２８１に相当する、３０ｋ
ｄの脂肪細胞補体−関連タンパク質前駆体と相同性を有
する領域を含む。クローンＵＮＱ３１０（ＤＮＡ４１２
３４−１２４２）は、ＡＴＣＣに寄託しており、ＡＴＣ
Ｃ寄託番号ＡＴＣＣ２０９６１８が付与されている。
【０３４６】全長ＰＲＯ３５３ポリペプチドのアミノ酸
配列の分析により、それらの一部が、ヒトおよび齧歯動
物の補体タンパク質と有意な相同性を有することが示さ
れ、それによって、ＰＲＯ３５５が、新規な補体タンパ
ク質であることが示唆されている。
【０３４７】実施例１７： ヒトＰＲＯ３６１をコード
するｃＤＮＡクローンの単離 コンセンサスＤＮＡ配列
を、上記実施例１に記載されたように、ｐｈｒａｐを用
い、他のＥＳＴ配列に対応してまとめた。このコンセン
サス配列を、ここに、ＤＮＡ４０６５４と称する。ＤＮ
Ａ４０６５４コンセンサス配列に基づいて、オリゴヌク
レオチドを、１）ＰＣＲによって、興味のある配列を含
むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、および２）Ｐ
ＲＯ３６１の全長をコードする配列のクローンを単離す
るためのプローブとして使用するため、合成した。
【０３４８】前進と逆進のＰＣＲプライマーを以下のよ
うに合成した： 前進ＰＣＲプライマー（．ｆ１） ５’−ＡＧＧＧＡＧ
ＧＡＴＴＡＴＣＣＴＴＧＡＣＣＴＴＴＧＡＡＧＡＣＣ−
３’（配列番号：９２） 前進ＰＣＲプライマー（．ｆ２） ５’−ＧＡＡＧＣＡ
ＡＧＴＧＣＣＣＡＧＣＴＣ−３’（配列番号：９３） 前進ＰＣＲプライマー（．ｆ３） ５’−ＣＧＧＧＴＣ
ＣＣＴＧＣＴＣＴＴＴＧＧ−３’（配列番号：９４） 逆進ＰＣＲプライマー（．ｒ１） ５’−ＣＡＣＣＧＴ
ＡＧＣＴＧＧＧＡＧＣＧＣＡＣＴＣＡＣ−３’（配列番
号：９５） 逆進ＰＣＲプライマー（．ｒ２） ５’−ＡＧＴＧＴＡ
ＡＧＴＣＡＡＧＣＴＣＣＣ−３’（配列番号：９６） さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーショ
ンプローブを、以下のヌクレオチド配列を有するコンセ
ンサスＤＮＡ４０６５４配列から構築した。 ハイブリダイゼーションプローブ ５’−ＧＣＴＴＣＣ
ＴＧＡＣＡＣＴＡＡＧＧＣＴＧＴＣＴＧＣＴＡＧＴＣＡ
ＧＡＡＴＴＧＣＣＴＣＡＡＡＡＡＧＡＧ−３’（配列番
号：９７）
【０３４９】全長のクローンの供給源としての複数個の
ライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリ
ーからＤＮＡを、上記同定されたＰＣＲプライマー対の
一つを用いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。
次いで、オリゴヌクレオチドプローブを用い、ＰＲＯ３
６１遺伝子をコードするクローンを単離するため、陽性
ライブラリーを用いた。ｃＤＮＡライブラリーの構築の
ためのＲＮＡを、ヒト胎児腎組織から単離した。
【０３５０】上記のように単離したクローンのＤＮＡ配
列決定によって、ＰＲＯ３５３の全長のＤＮＡ配列［こ
こに、ＵＮＱ３１６（ＤＮＡ４５１４０−１２５０）と
称する］（配列番号：９０）を得て、ＰＲＯ３５３のタ
ンパク質配列を推定した。
【０３５１】ＵＮＱ３１６（ＤＮＡ４５４１０−１２５
０）の全ヌクレオチド配列を図３６（配列番号：９０）
に示す。クローンＵＮＱ３１６（ＤＮＡ４５４１０−１
２５０）は、ヌクレオチド部位２２６−２２８に見かけ
上の翻訳開始部位と、ヌクレオチド部位１５１９−１５
２１に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリー
ディングフレームを含む（図３６）。推測されるポリペ
プチドプレカーサーは、４３１アミノ酸長である（図３
７）。図３７に示されている全長のＰＲＯ３６１タンパ
ク質は、分子量約４６８１０ダルトン、ｐＩ約６．４５
であると推定される。さらに、トランスメンブレンドメ
イン（アミノ酸３８０−４０９）とアルギナーゼファミ
リーのタンパク質に典型的な配列（アミノ酸３−１４と
３９−５７）を含む興味のある領域を、図３７に示す。
クローンＵＮＱ３１６（ＤＮＡ４５４１０−１２５０）
は、ＡＴＣＣに寄託しており、ＡＴＣＣ寄託番号ＡＴＣ
Ｃ２０９６２１が付与されている。
【０３５２】全長ＰＲＯ３６１ポリペプチドのアミノ酸
配列の分析により、それの一部が、ムチンおよび／もし
くはキチナーゼタンパク質と有意な相同性を有すること
が示され、それによって、ＰＲＯ３５５が、新規なムチ
ンおよび／もしくはキチナーゼタンパク質であることが
示唆されている。
【０３５３】実施例１８： ヒトＰＲＯ３６５をコード
するｃＤＮＡクローンの単離 コンセンサスＤＮＡ配列を、上記実施例１に記載したよ
うに、ｐｈｒａｐを用い、他のＥＳＴ配列に対応してま
とめた。このコンセンサス配列を、ここに、ＤＮＡ３５
６１３と称する。ＤＮＡ３５６１３コンセンサス配列に
基づいて、オリゴヌクレオチドを、１）ＰＣＲによっ
て、興味のある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定
するため、および２）ＰＲＯ３６５の全長をコードする
配列のクローンを単離するためのプローブとして使用す
るため、合成した。
【０３５４】前進と逆進のＰＣＲプライマーを以下のよ
うに合成した： 前進ＰＣＲプライマー（．ｆ１−３５６１３） ５’−
ＡＡＴＧＴＧＡＣＣＡＣＴＧＧＡＣＴＣＣＣ−３’（配
列番号：１００） 前進ＰＣＲプライマー（．ｆ２−３５６１３） ５’−
ＡＧＧＣＴＴＧＧＡＡＣＴＣＣＣＴＴＣ−３’（配列番
号：１０１） 逆進ＰＣＲプライマー（．ｒ１−３５６１３） ５’−
ＡＡＧＡＴＴＣＴＴＧＡＧＣＧＡＴＴＣＣＡＧＣＴＧ−
３’（配列番号：１０２） さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーショ
ンプローブを、以下のヌクレオチド配列を有するコンセ
ンサスＤＮＡ３５６１３配列から構築した。 ハイブリダイゼーションプローブ ５’−ＡＡＴＣＣＣ
ＴＧＣＴＣＴＴＣＡＴＧＧＴＧＡＣＣＴＡＴＧＡＣＧＡ
ＣＧＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＡＣＴＧ−３’（配列番号：
１０３）
【０３５５】全長のクローンの供給源としての複数個の
ライブラリーをスクリーニングするため、ライブラリー
からＤＮＡを、上記同定したＰＣＲプライマー対の一つ
を用いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次い
で、オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ＰＲＯ３６
５遺伝子をコードするクローンを単離するために、陽性
ライブラリーを用いた。ｃＤＮＡライブラリーの構築の
ためのＲＮＡを、ヒト胎児腎組織から単離した。
【０３５６】上記のように単離したクローンのＤＮＡ配
列決定によって、ＰＲＯ３６５の全長のＤＮＡ配列［こ
こに、ＵＮＱ３２０（ＤＮＡ４６７７７−１２５３）と
称する］（配列番号：９８）を得て、ＰＲＯ３６５のタ
ンパク質配列を推定した。
【０３５７】ＵＮＱ３２０（ＤＮＡ４６７７７−１２５
３）の全ヌクレオチド配列を図３８（配列番号：９８）
に示す。クローンＵＮＱ３２０（ＤＮＡ４６７７７−１
２５３）は、ヌクレオチド部位１５−１７に見かけ上の
翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド部位７２０−７２２
に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリーディ
ングフレームを含む（図３８）。推測されるポリペプチ
ドプレカーサーは、２３５アミノ酸長である（図３
９）。クローンＵＮＱ３２０（ＤＮＡ４６７７７−１２
５３）によってコードされるポリペプチド配列の重要な
領域が、同定され、図３９に示す以下のものを含む：ア
ミノ酸１−２０に相当する単一ペプチド、アミノ酸２１
に相当する成熟タンパクの開始、多数の潜在的なＮ−グ
リコシル化部位。クローンＵＮＱ３２０（ＤＮＡ４６７
７７−１２５３）は、ＡＴＣＣに寄託しており、ＡＴＣ
Ｃ寄託番号ＡＴＣＣ２０９６１９が付与されている。
【０３５８】全長ＰＲＯ３６５ポリペプチドのアミノ酸
配列の分析により、それの一部が、ヒト２−１９タンパ
ク質と有意な相同性を有することが示され、それによっ
て、ＰＲＯ３６５が、新規なヒト２−１９タンパク相同
体であることが示唆されている。
【０３５９】実施例１９：ＰＲＯポリペプチドをコード
する核酸のハイブリダイゼーションプローブとしての使
用 以下の方法は、ハイブリダイゼーションプローブとし
て、ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸配列の使用に
ついて記載する。ここに開示された興味のあるＰＲＯポ
リペプチドのコード化配列を含むＤＮＡを、ヒト組織ｃ
ＤＮＡライブラリーもしくはヒト組織染色体ライブラリ
ーにおいて、相同ＤＮＡ（例えば、ＰＲＯポリペプチド
の天然の変種をコードするものなど）をスクリーニング
するためのプローブとして、もしくはプローブを調製す
るための塩基として用いることができる。
【０３６０】どちらかのライブラリーＤＮＡを含むフィ
ルターのハイブリダイゼーションおよび洗浄は、以下の
高ストリンジェント条件下で行う。放射性同位元素標識
化ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸由来のプローブ
のフィルターへのハイブリダイゼーションを、５０％ホ
ルムアミド溶液、５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１
％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、
ｐＨ６．８、２ｘデンハート溶液、および１０％デキス
トラン硫酸中、４２℃で２０時間行う。フィルターの洗
浄は、０．１ｘＳＳＣと０．１％ＳＤＳの水溶液中、４
２℃で行う。
【０３６１】次いで、全長の天然ＰＲＯポリペプチド配
列をコードするＤＮＡと同一の所望の配列を有するＤＮ
Ａを、当該分野において公知の標準的な方法を用いて同
定することができる。
【０３６２】実施例２０： 大腸菌におけるＰＲＯポリ
ペプチドの発現 本実施例では、大腸菌における組み換え発現による所望
のＰＲＯポリペプチドのグリコシル化されていない型の
調製について説明する。
【０３６３】所望のＰＲＯポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列を、最初に、選択したＰＣＲプライマーを用い
て増幅する。該プライマーは、選択された発現ベクター
上の制限酵素部位に相当する制限酵素部位を含まなけれ
ばならない。様々な発現ベクターが用いられ得る。好適
なベクターの例は、アンピシリンおよびテトラサイクリ
ン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２２［大腸菌由来；Ｂｏｌ
ｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ、２：９５（１９９７）参照］で
ある。ベクターは、制限酵素で消化し、脱リン酸化す
る。次いで、ＰＣＲで増幅した配列を、ベクター内に結
紮させる。ベクターは、好ましくは、抗生物質耐性遺伝
子、ｔｒｐプロモーター、ポリｈｉｓリーダー（最初の
６ＳＴＩＩコドン、ポリｈｉｓ配列およびエンテロキナ
ーゼ切断部位を含む）、特異的ＰＲＯポリペプチドコー
ド化領域、ラムダ転写終結因子、ａｒｇＵ遺伝子をコー
ドする配列を含む。
【０３６４】次いで、結紮混合物を、上記Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋらに記載された方法を用いて、選択された大腸菌株
を形質転換するために用いた。形質転換体は、ＬＢプレ
ート上での増殖能によって同定し、次いで、抗生物質耐
性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、制
限酵素分析およびＤＮＡ配列決定によって確認すること
ができる。
【０３６５】選択したクローンを、抗生物質を補充した
ＬＢ培地などの液体培養培地中で一晩培養することがで
きる。続いて、一晩培養物を、大規模培養に播種するた
めに用いる。次いで、発現プロモータが始動する所望の
光学密度まで、細胞を培養する。
【０３６６】さらに数時間培養後、細胞を遠心分離によ
って回収することができる。遠心分離によって得られた
細胞ペレットを、当該分野において公知の様々な試薬を
用いて可溶化し、次いで、可溶化ＰＲＯポリペプチド
を、該タンパク質との強固な結合を許容する条件下で金
属錯体カラムを用い、精製することができる。
【０３６７】ＰＲＯ２４１は、以下の操作により、ポリ
−Ｈｉｓ標識化形態で、大腸菌に発現させることができ
た。ＰＲＯ２４１をコードするＤＮＡは、最初に、選択
したＰＣＲプライマーを用いて増幅した。該プライマー
は、選択された発現ベクター上の制限酵素部位に相当す
る制限酵素や、効果的かつ確かな翻訳の開始、金属錯体
カラム上での速やかな精製、およびエンテロキナーゼの
タンパク分解除去を提供するその他の有用な配列を含
む。ＰＣＲ増幅、ポリ−Ｈｉｓ標識化配列を、次いで、
発現ベクターに結紮し、株５２（Ｗ３１１０ｆｕｈＡ
（ｔｏｎＡ） ｌｏｎ ｇａｌＥ ｒｐｏＨｉｓ（ｈｔｐ
Ｒｔｓ） ｃＩｐＰ（ｌａｃＩｑ）に基づく大腸菌宿主
を形質転換させるために用いた。最初に、形質転換体
を、５０ｍｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＬＢ培地中、
３０℃で、Ｏ．Ｄ．６００が３−５になるまで、振とう
培養した。次いで、培養物を、ＣＲＡＰ培地［１１０ｍ
Ｍ ＭＰＯＳ、ｐＨ７．３、０．５５％（ｗ／ｖ）グル
コースおよび７ｍＭ ＭｇＳＯ4と同様に、３．５７ｇ
（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．７１ｇクエン酸ナトリウム・２
水和物、１．０７ｇＫＣｌ、５．３６ｇ Ｄｉｆｃｏ酵
母エキス、５．３６ｇ Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ ｈｙｃａｓ
ｅ ＳＦを５００ｍＬ水に混合することによって調製し
た］中、５０−１００倍に希釈し、おおよそ２０−３０
時間、３０℃で振とう培養した。試料を、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ分析によって発現を確かめるために除去し、大量の
培養物を遠心分離して細胞ペレットとした。細胞ペレッ
トは、精製および再生まで凍結させた。
【０３６８】０．５から１Ｌ培養物から得られた大腸菌
ペースト（６−１０ｇペレト）を、７Ｍグアニジン、２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８緩衝液中、１０容量（ｗ／
ｖ）に懸濁させた。固形の亜硫酸ナトリウム塩と液体の
四チオン酸塩を、最終濃度が各々０．１Ｍおよび０．０
２Ｍとなるまで添加し、溶液を４℃で一晩攪拌させた。
このステップにより、全システイン残基が亜硫酸化によ
り保護された変性タンパク質となる。溶液を、Ｂｅｃｋ
ｍａｎ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｉｆｕｇｅで３０分間、４
００００回転で遠心分離した。上清を、金属錯体カラム
緩衝液（６Ｍグアニジン、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ
７．４）の３−５容量で希釈し、０．２２ミクロンフィ
ルターに濾過して透明化した。垂下する透明化した抽出
物を、金属錯体カラム緩衝液で平衡化した５ｍｌ Ｑｉ
ａｇｅｎ Ｎｉ−ＮＴＡ金属錯体カラム上に、負荷し
た。カラムを、５０ｍＭイミダゾール（Ｃａｌｂｉｏｃ
ｈｅｍ，Ｕｔｒｏｌ ｇｒａｄｅ）、ｐＨ７．４を含む
付加用緩衝液で洗浄した。タンパク質を、２５０ｍＭイ
ミダゾールを含む緩衝液で溶出した。所望のタンパク質
を含む画分を採取し、４℃で保存した。タンパク濃度
は、アミノ酸配列に基づいて算出した吸光係数を用い、
２８０ｎｍにおける吸光度によって評価した。
【０３６９】タンパク質は、新鮮に調製した再生緩衝液
（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．６、０．３ＭＮａＣ
ｌ、２．５Ｍ尿素、５ｍＭシステイン、２０ｍＭグリシ
ンおよび１ｍＭＥＤＴＡからなる）中、試料をゆっくり
と希釈させることにより、再生させた。再生容量は、最
終タンパク質濃度が、５０から１００マイクログラム／
ｍｌの間となるように選択した。再生溶液は、緩やか
に、４℃で１２−３６時間攪拌した。ＴＦＡを最終濃度
０．４％（ｐＨがおおよそ３）となるまで添加すること
によって、再生反応を終了させた。タンパク質をさらに
精製する前に、溶液を０．２２ミクロンフィルターで濾
過し、アセトニトリルが２−１０％の最終濃度となるよ
うに添加した。再生したタンパク質を、０．１％ＴＦＡ
の泳動用緩衝液を用いたＰｏｒｏｓ Ｒ１／Ｈ逆相カラ
ム上、約１０から８０％までのアセトニトリル濃度勾配
で、クロマトグラフィーにかけた。Ａ２８０吸光を有す
る分画溶液を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析
し、再生相同タンパク質を含む分画を採取した。一般的
に、適切に再生した大部分のタンパク質は、最も凝縮し
て、逆相樹脂との相互作用から疎水性内部がシールされ
ているため、アセトニトリルの最低濃度で溶出される。
凝集している種は、たいてい、高いアセトニトリル濃度
で溶出される。逆相の過程で、所望の型からミスフォー
ルディングされた型を排除することに加えて、試料から
エンドトキシンをも除去する。
【０３７０】所望の折畳されたＰＲＯ２４１タンパク質
を含む分画を採取し、アセトニトリルを、溶液に導かれ
る緩やかな窒素の流れを用いて除去する。透析によっ
て、もしくは、フォーミュレーション緩衝液で平衡化し
たＧ２５Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）樹
脂を用いたゲル濾過によって、０．１４Ｍ塩化ナトリウ
ムと、４％マンニトールを含む２０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐ
Ｈ６．８中、タンパク質を形成し、滅菌濾過した。
【０３７１】実施例２１： 哺乳動物細胞におけるＰＲ
Ｏポリペプチドの発現 本実施例では、哺乳動物細胞での組み換え発現による所
望のＰＲＯポリペプチドのグリコシル化された型の調製
について説明する。
【０３７２】ベクター、ｐＲＫ５（１９８９年３月１５
日に出版されたＥＰ３０７２４７参照）が、発現ベクタ
ーとして用いられる。任意で、ＰＲＯポリペプチドをコ
ードするＤＮＡを、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載され
た結紮方法を用い、ＰＲＯポリペプチドＤＮＡの挿入を
許容する選択された制限酵素でｐＲＫ５に結紮する。得
られたベクターを、ｐＲＫ５−ＰＲＯポリペプチドと称
する。
【０３７３】一つの実施態様において、選択された宿主
細胞は、２９３細胞である。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ １５７３）は、組織培養プレートで、胎児ウシ
血清と、任意で栄養成分および／もしくは抗生物質で補
充したＤＭＥＭなどの培地中で、集密になるまで増殖さ
せる。約１０μｇのｐＲＫ５−ＰＲＯポリペプチドＤＮ
Ａを、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ［Ｔｈｉ
ｍｍａｐｐａｙａら、Ｃｅｌｌ、３１：５４３（１９８
２）］１μｇと混合し、５００μｌの、０．１ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．２２７ＭＣａ
Ｃｌ2に溶解する。この混合物に、５００μのｌ５０ｍ
ＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭＮａＣｌ、
１．５ｍＭＮａＰＯ4を添加、滴下し、沈殿物を２５
℃、１０分間かけて形成させる。この沈殿物を懸濁し、
２９３細胞に添加し、３７℃で約４時間静置する。培養
培地を、吸引除去し、ＰＢＳ中２０％グリセリン２ｍｌ
を３０秒間添加する。次いで、２９３細胞を無血清培地
で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約５日間インキ
ュベーションする。
【０３７４】トランスフェクション後、おおよそ２４時
間で、培養培地を除去し、培養培地（のみ）もしくは２
００μＣｉ／ｍｌ35Ｓ−システインおよび２００μＣｉ
／ｍｌ35Ｓ−メチオニンを含む培養培地に置換する。１
２時間のインキュベーション後、馴化培地を回収し、ス
ピンフィルター上で濃縮し、１５％ＳＤＳゲルにかけ
る。工程にかけたゲルを、乾燥させ、ＰＲＯポリペプチ
ドの存在が確認できるのに必要な時間だけ、フィルムに
露光する。形質転換細胞を含む培養物を、さらにインキ
ュベーション（無血清培地中）し、その培地を選択され
たバイオアッセイで試験した。
【０３７５】代替技術において、ＰＲＯポリペプチド
を、Ｓｏｍｐａｒｙｒａｃら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．，１２：７５７５（１９８１）によっ
て記載されたようにデキストラン硫酸法を用い、一過的
に２９３細胞に導入させる。２９３細胞は、スピナーフ
ラスコ中で最大密度まで培養し、７００μｇのｐＲＫ５
−ＰＲＯポリペプチドＤＮＡを添加する。最初に細胞
を、遠心分離によって、スピナーフラスコから濃縮し、
ＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を、細
胞ペレット上で４時間インキュベーションする。細胞
を、２０％グリセリンで９０秒間処理し、組織培養培地
で洗浄し、組織培養培地、５μｇ／ｍｌウシインスリ
ン、および０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含
むスピナーフラスコに再度導入する。約４日後、細胞と
破片を除去するために、馴化培地を遠心分離し、濾過す
る。次いで、発現ＰＲＯポリペプチドを含む試料を、透
析および／もしくはカラムクロマトグラフィーなどのあ
らゆる選択される方法によって、濃縮、および精製す
る。
【０３７６】他の実施態様において、ＰＲＯポリペプチ
ドは、ＣＨＯ細胞において発現させることができる。Ｃ
ａＰＯ4もしくはＤＥＡＥ−デキストランなどの公知の
試薬を用いて、ｐＲＫ５−ＰＲＯポリペプチドは、ＣＨ
Ｏ細胞にトランスフェクションすることができる。上記
のように、細胞培養物をインキュベーションし、培地を
培養培地（のみ）もしくは、35Ｓ−メチオニンなどの放
射性ラベルを含む培地と置換する。ＰＲＯポリペプチド
の存在を決定した後、培養培地を無血清培地に置換す
る。好ましくは、培養物は、約６日間インキュベーショ
ンし、次いで、馴化培地を回収する。次いで、発現ＰＲ
Ｏポリペプチドを含む培地は、選択されるいずれかの方
法によって濃縮、精製することができる。
【０３７７】また、エピトープ標識化ＰＲＯポリペプチ
ドは、宿主ＣＨＯ細胞に発現させることができる。ＰＲ
Ｏポリペプチドは、ｐＲＫ５ベクターからサブクローニ
ングする。サブクローン挿入物は、バキュロウィルス発
現ベクター中、ポリ−ｈｉｓ標識などの選択されたエピ
トープ標識とフレーム内で融合するために、ＰＣＲを行
うことができる。次いで、ポリ−ｈｉｓ標識化ＰＲＯポ
リペプチド挿入物は、安定株の選択のためのＤＨＦＲな
どの選択マーカを含むＳＶ４０駆動ベクター内にサブク
ローニングすることができる。最後に、ＣＨＯ細胞は、
（上記のように）ＳＶ４０駆動ベクターでトランスフェ
クションさせることができる。発現を確認するために、
上記のように標識することができる。次いで、発現した
ポリ−Ｈｉｓ標識化ＰＲＯポリペプチドを含む培養培地
を、Ｎｉ2+−錯体アフィニティークロマトグラフィーな
ど、選択されるあらゆる方法によって、濃縮、精製する
ことができる。
【０３７８】ＰＲＯ２４１を、一過的および安定発現方
法の両方によって、ＣＨＯ細胞にうまく発現させること
ができた。さらに、ＰＲＯ２４３、ＰＲＯ３２３および
ＰＲＯ２３３を、ＣＨＯ細胞に一過的に発現させること
ができた。
【０３７９】ＣＨＯ細胞における安定発現は、以下の方
法を用いて行った。タンパク質は、各タンパク質の可溶
型（例えば、細胞外ドメイン）のコード配列が、ヒン
ジ、ＣＨ２およびＣＨ２ドメインを含むＩｇＧ１定常領
域配列に融合させたＩｇＧ構造物（免疫接合体）、およ
び／もしくはポリ−ｈｉｓ標識化形態となるように発現
させた。
【０３８０】ＰＣＲの増幅に次いで、各ＤＮＡを、Ａｕ
ｓｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｕｎｉｔ３．
１６， Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙとＳｏｎｓ（１９９７）に
おいて記載されているような標準的な技術を用いて、Ｃ
ＨＯ発現ベクターにサブクローニングした。ｃＤＮＡの
便利な往復を許容するように、興味のあるＤＮＡの５’
および３’と適合する制限酵素部位５’を有するよう
に、ＣＨＯ発現ベクターを構築する。ＣＨＯ細胞におけ
る発現に用いたベクターは、例えば、Ｌｕｃａｓら、Ｎ
ｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：９（１７７４−１
７７９（１９９６）に記載されたものであり、興味のあ
るｃＤＮＡとジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の発現
を駆動するためにＳＶ４０初期プロモーター／エンハン
サーを用いる。ＤＨＦＲの発現により、トランスフェク
ションに続いて、プラスミドの安定維持株を選定するこ
とができる。
【０３８１】所望のプラスミドＤＮＡ１２μｇは、商業
的に利用できるトランスフェクション試薬Ｓｕｐｅｒｆ
ｅｃｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）、ＤｏｓｐｅｒもしくはＦｕ
ｇｅｎｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）
を用い、約１０００万個のＣＨＯ細胞内に導入させた。
細胞を培養し、上記Ｌｕｃａｓらにおいて記載した。お
およそ３ｘ１０7個の細胞を、さらなる増殖と下記の産
生のために、アンプル中で凍結させる。
【０３８２】プラスミドＤＮＡを含むアンプルを、水槽
中に置いて融解させ、渦動攪拌で混合した。内容物を、
１０ｍＬの培地を含む遠心分離用チューブにピペットで
移し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を吸
引除去し、細胞を１０ｍＬの選択培地（０．２μｍフィ
ルターで濾過した５％胎児ウシ血清を含むＰＳ２０を
０．２μｍフィルターで濾過したもの）に再度懸濁し
た。次いで、細胞を、９０ｍＬ選択培地を含む１００ｍ
Ｌスピナーに分注した。１−２日後、細胞を、１５０ｍ
Ｌ選択増殖培地で満たした２５０ｍＬスピナーに移し、
３７℃でインキュベーションした。さらに２−３日後、
２５０ｍＬ、５００ｍＬ、および２０００ｍＬスピナー
に、３ｘ１０5細胞／ｍＬを播種した。細胞培地を、遠
心分離によって新鮮な培地に交換し、産生用培地に再度
懸濁した。好適なあらゆるＣＨＯ培地を用いることがで
きるが、１９９２年６月１６日に発行された米国特許第
５１２２４６９号に記載されている産生培地を、実際に
は用いた。３Ｌ産生スピナーに、０．２ｘ１０6細胞／
ｍＬで播種した。０日目、細胞数、ｐＨを測定した。１
日目、スピナーから標本を取り、濾過空気の散布を開始
した。２日目、スピナーから標本を取り、温度を３３℃
に上げ、３０ｍＬの５００ｇ／Ｌグルコースと、０．６
ｍＬの１０％消泡剤（例えば、３５％ポリジメチルシロ
キサン乳剤 、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ，３６５ 医薬用
グレードエマルジョン）を加えた。産生時にｐＨを必要
な限り、約７．２に保った。１０日目後、もしくは、生
存率が７０％以下に落ち込む前に、細胞培養物を、遠心
分離と０．２２μｍフィルター濾過により、回収した。
濾過物は、４℃で保存、もしくは直ちに精製用のカラム
にかけた。
【０３８３】ポリ−ｈｉｓ標識化構築物用に、タンパク
質を、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅ）を用いて精製
した。精製前に、イミダゾールを、馴化培地に５ｍＭ濃
度となるように添加した。馴化培地を、０．３ＭＮａＣ
ｌと５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐ
Ｈ７．４、緩衝液で平衡化させた６ｍｌＮｉ−ＮＴＡカ
ラムに、流速４−５ｍｌ／ｍｉｎ、４℃でポンプ注入し
た。負荷後、カラムをさらに平衡化用緩衝液で洗浄し、
０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡化用緩衝液でタンパ
ク質を溶出した。続けて、高純度に精製したタンパク質
を、１０ｍＭＨｅｐｅｓ、０．１４ＭＮａＣｌおよび４
％マンニトール、ｐＨ６．８を含む保存用緩衝液中、２
５ｍｌ Ｇ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）で脱塩し、−８０℃で保存した。
【０３８４】免疫接合体（Ｆｃ含有）構造物を、以下の
ように馴化培地から精製した。該馴化培地を、２０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８で平衡化した５ｍ
ｌプロテインＡカラム上にポンプ注入した。注入後、１
００ｍＭクエン酸、ｐＨ３．５での溶出の前に、カラム
を平衡化用緩衝液で十分に洗浄した。２７５μｌの１Ｍ
Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ９中に、１ｍｌ画分を採取し
て、溶出したタンパク質を直ちに中和した。続けて、高
純度に精製したタンパク質を、ポリ−Ｈｉｓ標識化タン
パク質用に、保存用緩衝液中、上記の様に脱塩した。同
一性を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルおよびエドマン
分解によるＮ末端アミノ酸配列決定によって評価した。
【０３８５】ＰＲＯ２４１、ＰＲＯ２４３、ＰＲＯ２９
９、ＰＲＯ３２３、ＰＲＯ３２７、ＰＲＯ２３３、ＰＲ
Ｏ３４４、ＰＲＯ３４７、ＰＲＯ３５４、ＰＲＯ３５
５、ＰＲＯ３５７、ＰＲＯ３５３、ＰＲＯ３６１、およ
びＰＲＯ３６５も、また、ＣＯＳ細胞において、一過的
にうまく発現させることができた。
【０３８６】実施例２２：酵母におけるＰＲＯポリペプ
チドの発現 以下の方法は、酵母における所望のＰＲＯポリペプチド
の組み換え発現について記載したものである。
【０３８７】最初に、酵母発現ベクターを、ＡＤＨ２／
ＧＡＰＤＨプロモーターからＰＲＯポリペプチドの細胞
内産生もしくは分泌のために構築する。所望のＰＲＯポ
リペプチド、選択されたシグナルペプチド、およびプロ
モータをコードするＤＮＡを、ＰＲＯポリペプチドの細
胞内発現を導くために選択したプラスミドの適切な制限
酵素部位に挿入する。分泌の場合には、ＰＲＯポリペプ
チドをコードするＤＮＡを、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロ
モータ、酵母α因子分泌シグナル／リーダー配列、およ
び（必要ならば）ＰＲＯポリペプチド発現用リンカー配
列をコードするＤＮＡと共に、選択したプラスミドにク
ローニングする。
【０３８８】次いで、例えば、酵母株ＡＢ１１０のよう
な酵母細胞を、上記発現プラスミドと共に形質転換し、
選択した培養液中で培養することができる。形質転換し
た酵母の上清を、１０％トリクロロ酢酸で沈殿させ、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クマシーブルー染色によるゲ
ル染色により分析する。
【０３８９】続けて、酵母細胞を遠心分離により、培養
液から除去し、次いで、選択したカートリッジフィルタ
ーを用いて培地を濃縮することにより、組み換えＰＲＯ
ポリペプチドを、単離精製することができる。ＰＲＯポ
リペプチドを含む濃縮物は、さらに、選択したカラムク
ロマトグラフィー樹脂を用いて精製する。
【０３９０】実施例２３： バキュロウィルス−感染昆
虫細胞におけるＰＲＯポリペプチドの発現 以下の方法は、バキュロウィルス−感染昆虫細胞におけ
るＰＲＯポリペプチドの組み換え発現について記載す
る。
【０３９１】選択したＰＲＯポリペプチドを、バキュロ
ウィルス発現ベクターに含まれるエピトープ標識の上流
に融合させる。そのようなエピトープ標識は、ポリ−ｈ
ｉｓ標識およびイムノグロブリン標識（例えば、ＩｇＧ
のＦｃ領域）を含む。ｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅ
ｎ）のような商業的に利用できるプラスミドを含み、様
々なプラスミドが用いられる。簡単には、ＰＲＯポリペ
プチドもしくはＰＲＯポリペプチドの所望の部分（例え
ば、トランスメンブランタンパク質の細胞外ドメインを
コードする配列など）を、５’および３’領域に相補す
るプライマーを用いたＰＣＲによって増幅する。５’プ
ライマーは、両端に（選択された）制限酵素部位を組み
込ませることができる。次いで、生成物を、前記の選択
した制限酵素で消化し、発現ベクター中にサブクローニ
ングする。
【０３９２】組み換えバキュロウィルスは、リポフェク
チン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから商業的に利用できる）を
用い、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugi
perda）（Ｓｆ９）細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）
に、上記プラスミドとＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウィルス
ＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、共−トランスフェ
クションさせることによって産出される。２８℃で４−
５日間インキュベーション後、遊離されたウィルスを回
収し、さらなる増幅に用いる。ウィルス感染とタンパク
質発現を、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｅｙら、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒ
ｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ：Ａ ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）によって記載
されたように行う。
【０３９３】次いで、発現したポリ−ｈｉｓ標識化ＰＲ
Ｏポリポペプチドを、例えば、以下のようにＮｉ2+−錯
体アフィニティークロマトグラフィーによって精製する
ことができる。抽出物を、Ｒｕｐｅｒｔら、Ｎａｔｕｒ
ｅ，３６２：１７５−１７９（１９９３）によって記載
されたように、組み換えウィルス感染Ｓｆ９細胞から調
製する。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、音波処理用緩
衝液（２５ｍＬ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．９；１２．５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０％グリセリ
ン；０．１％ ＮＰ−４０；０．４Ｍ ＫＣｌ）に懸濁
し、氷上で２０秒間、２回、音波処理する。音波処理物
を遠心分離によって透明化し、上清をローディング緩衝
液（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％
グリセリン、ｐＨ７．８）で５０倍に希釈し、０．４５
μｍフィルターで濾過する。Ｎｉ2+−ＮＴＡアガロース
カラム（Ｑｉａｇｅｎから商業的に利用できる）を、基
底容量５ｍＬで調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍ
Ｌのローディング緩衝液で平衡化する。濾過した細胞抽
出物を、０．５ｍＬ／分でカロムにかける。ローディン
グ緩衝液でＡ280のベースラインになるまでカラムを洗
浄し、そこで分画の採取を始める。次に、カラムを二次
洗浄用緩衝液（５０ｍＭリン酸塩；３００ｍＭＮａＣ
ｌ、１０％グリセリン、ｐＨ６．０）で洗浄し、非特異
的に結合したタンパク質を溶出する。再度Ａ280ベース
ラインに到達後、カラムを、二次洗浄用緩衝液中、０か
ら５００ｍＭイミダゾール濃度勾配で展開する。１ｍＬ
画分を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと銀染色、もしくはＮ
ｉ2+−ＮＴＡ−アルカリフォスファターゼ複合体（Ｑｉ
ａｇｅｎ）を用いたウェスタンブロットにより分析す
る。溶出したＨｉｓ10−標識化ＰＲＯポリペプチドを含
む画分を収集し、ローディング緩衝液に対して透析す
る。
【０３９４】もしくは、ＩｇＧ標識化（もしくはＦｃ標
識化）ＰＲＯポリペプチドの精製を、例えば、プロテイ
ンＡもしくはプロテインＧカラムクロマトグラフィーを
含む、公知のクロマトグラフィー技術を用いて行うこと
ができる。
【０３９５】ＰＲＯ２４１、ＰＲＯ３２７およびＰＲＯ
３４４を、バキュロウィスル感染Ｓｆ９昆虫細胞に発現
させることができる。実際には、発現を、０．５−２Ｌ
スケールで実行させたが、それはより大きな（例えば、
８Ｌ）調製用に容易にスケールアップすることができ
る。タンパク質は、細胞外領域が、ヒンジ、ＣＨ２およ
びＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ１定常領域配列に融合し
たＩｇＧ構造物（免疫接合体）として、および／もしく
はポリ−Ｈｉｓ標識化形態として発現した。
【０３９６】バキュロウィスル感染Ｓｇ９細胞における
発現のために、ＰＣＲ増幅に次いで、各コード化配列を
バキュロウイスル発現ベクター（ＩｇＧ融合体にはｐ
ｂ．ＰＨ．ＩｇＧ、ポリ−Ｈｉｓ標識化タンパク質には
ｐｂ．ＰＨ．Ｈｉｓ．ｃ）にサブクローニングし、リポ
フェクチン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて、１０５ス
ポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）
（Ｓｆ９）細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）に、上記
ベクターとＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウィルスＤＮＡ（Ｐ
ｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、共−トランスフェクションし
た。ｐｂ．ＰＨ．ＩｇＧおよびｐｂ．ＰＨ．Ｈｉｓは、
商業的に利用できるバキュロウィルス発現ベクターｐＶ
Ｌ１３９３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に、Ｈｉｓもしく
はＦｃ標識配列を含むように修飾したポリリンカー領域
を有する修飾体である。細胞は、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃ
ｌｏｎｅ）を補充したＨｉｎｋ’ｓ ＴＮＭ−ＦＨ培地
で培養した。細胞を、２８℃で５日間インキュベーショ
ンした。上清を回収し、続けて、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃ
ｌｏｎｅ）を補充したＨｉｎｋ’ｓ ＴＮＭ−ＦＨ培地
中で、おおよそ感染多重度（ＭＯＩ）１０で、Ｓｆ９細
胞を感染させることにより、第１のウィルス増幅のため
に用いた。細胞を、２８℃で３日間インキュベーション
した。上清を回収し、バキュロウィルス発現ベクターに
おける構築物の発現を、ヒスチジン標識化タンパク質に
対するＮｉ−ＮＴＡビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）もしくはＩ
ｇＧ標識化タンパク質に対するプロテイン−Ａセファロ
ースＣＬ−４Ｂビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）２５ｍＬ
に、上清１ｍＬをバッチ結合し、次いで、クマシーブル
ー染色によりタンパク質標準の既知濃度との比較を行う
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって測定した。
【０３９７】第１のウィルス増幅上清を、ＥＳＦ−９２
１培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＬＬ
Ｃ）中、約ＭＯＩ０．１で培養したＳｆ９細胞のスピナ
ー培養物（５００ｍＬ）を感染するために用いた。細胞
を、２８℃で３日間インキュベーションした。上清を回
収し、濾過した。バッチ結合と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
を、必要に応じて、スピナー培養の発現が確認されるま
で繰り返した。
【０３９８】形質転換細胞からの馴化培地（０．５から
３Ｌ）を、細胞を除去するための遠心分離によって回収
し、０．２２ミクロンフィルターで濾過した。ポリ−Ｈ
ｉｓ標識化構築物の場合、タンパク質をＮｉ−ＮＴＡカ
ラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。精製前に、イ
ミダゾールを馴化培地に濃度５ｍＭとなるように添加し
た。馴化培地は、０．３Ｍ ＮａＣｌおよび５ｍＭイミ
ダゾールを含む２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４緩衝
液で平衡化した６ｍｌ Ｎｉ−ＮＴＡカラムに、流速４
−５ｍｌ／分、４℃でポンプ注入した。注入後、カラム
をさらなる平衡化緩衝液で洗浄し、タンパク質を、０．
２５Ｍイミダゾールを含む平衡化緩衝液で溶出した。続
いて、高純度に精製したタンパク質を、１０ｍＭ Ｈｅ
ｐｅｓ、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、４％マンニトール、ｐ
Ｈ６．８を含む保存用緩衝液中、２５ｍｌ Ｇ２５ Ｓｕ
ｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムで脱塩、
−８０℃で保存した。
【０３９９】タンパク質の免疫接合体（Ｆｃ含有）構築
物を、馴化培地から、以下のように精製した。馴化培地
を、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８で平
衡化されている５ｍｌプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）にポンプ注入した。注入後、カラムを、１０
０ｍＭクエン酸、ｐＨ３．５での溶出の前に、平衡化緩
衝液で十分に洗浄した。溶出したタンパク質を、２７５
ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ９を含むチューブ中
に、１ｍＬ画分を採取することによって、直ちに中和し
た。続いて、高純度に精製したタンパク質を、ポリ−Ｈ
ｉｓ標識化タンパク質用に、保存用緩衝液中、上記のよ
うに脱塩した。タンパク質の同一性を、ＳＤＳポリアク
リルアミドゲル（ＰＥＧ）電気泳動およびエドマン分解
によるＮ末端アミノ酸配列決定によって確認した。
【０４００】ＰＲＯ２４３、ＰＲＯ３２３、ＰＲＯ３４
４およびＰＲＯ３５５は、バキュロウィルス感染Ｈｉ５
昆虫細胞に発現させることができる。実際には、発現を
０．５−２Ｌスケールで行ったが、容易に、より大きな
（例えば、８Ｌ）調製用にスケールアップすることがで
きる。
【０４０１】バキュロウィルス感染Ｈｉ５昆虫細胞での
発現のために、ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡ
は、例えば、Ｐｆｕ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）などの好
適なシステムで増幅させる、もしくはバキュロウィルス
発現ベクターに含まれるエピトープ標識の上流（５’
−）に融合させることができる。そのようなエピトープ
標識は、ポリ−Ｈｉｓ標識およびイムノグロブリン標識
（例えば、ＩｇＧのＦｃ領域のような）を含む。ｐＶＬ
１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）のような商業的に利用でき
るプラスミドを含み、様々なプラスミドが用いられる。
簡単には、ＰＲＯポリペプチドもしくはＰＲＯポリペプ
チドの所望の部分（例えば、トランスメンブレンタンパ
ク質の細胞外ドメインをコードする配列など）を、５’
および３’領域に相補するプライマーを用いたＰＣＲに
よって増幅する。５’プライマーは、両端に（選択され
た）制限酵素部位を組み込み得る。次いで、生成物を上
記選択した制限酵素で消化し、発現ベクターにサブクロ
ーニングする。例えば、ｐＶＬ１３９３誘導体は、ＮＡ
ＭＥ配列の下流（３’−）に、ヒトＩｇＧのＦｃ領域
（ｐｂ．ＰＨ．ＩｇＧ）もしくは８ヒスチジン標識（ｐ
ｂ．ＰＨ．Ｈｉｓ）を含む。
【０４０２】Ｈｉ５細胞は、２７℃で、ＣＯ2とペニシ
リン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）を加
えない条件下で、５０％集密まで培養した。各１５０ｍ
Ｍプレートに、ＰＲＯポリペプチドを含むｐＩＥに基づ
くベクター３０μｇを、１ｍｌ Ｅｘ−Ｃｅｌｌ培地
［培地：Ｅｘ−Ｃｅｌｌ４０１＋１／１００ Ｌ−Ｇｌ
ｕＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃１４４０１−７８
Ｐ（注解；この培地は光感受性である）］を混合し、各
チューブで、１００μｌＣｅｌｌ Ｆｅｃｔｉｎ［Ｃｅ
ｌｌＦＥＣＴＩＮ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ＃１０３６２−０
１０）（混合のために渦動撹拌したもの）］を、１ｍｌ
のＥｘ−Ｃｅｌｌ培地と混合した。２つの溶液を、混合
し、室温で１５分間インキュベーションした。８ｍｌの
Ｅｘ−Ｃｅｌｌ培地を２ｍｌ ＤＮＡ／ＣｅｌｌＦＥＣ
ＴＩＮ混合物に添加し、これを一度Ｅｘ−Ｃｅｌｌ培地
で洗浄しているＨｉ５細胞に重層した。次いで、プレー
トを、暗所で、室温、１時間インキュベーションした。
次いで、ＤＮＡ／ＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ混合物を吸引
し、過剰量のＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮを除去するために、
細胞を、一度洗浄した。３０ｍｌの新鮮なＥｘ−Ｃｅｌ
ｌ培地を添加し、細胞を２８℃で３日間インキュベート
した。上清を回収し、バキュロウィルス発現ベクターに
おけるＰＲＯポリペプチドの発現を、ヒスチジン標識化
タンパク質に対するＮｉ−ＮＴＡビーズ（ＱＩＡＧＥ
Ｎ）もしくはＩｇＧ標識化タンパク質に対するプロテイ
ンＡ−セファロースＣＬ−４Ｂビーズ２５ｍＬに、上清
１ｍＬをバッチ結合し、次いで、クマシーブルー染色に
よりタンパク質標準の既知濃度との比較を行うＳＤＳ−
ＰＡＧＥ分析によって測定した。
【０４０３】形質転換細胞から馴化培地（０．５から３
Ｌ）を、細胞を除去するための遠心分離によって回収
し、０．２２ミクロンフィルターで濾過した。ポリ−Ｈ
ｉｓ標識化構築物として、ＰＲＯポリペプチドを含むタ
ンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用
いて精製した。精製前に、イミダゾールを、濃度５ｍＭ
になるまで、馴化培地に添加した。馴化培地を、０．３
Ｍ ＮａＣｌおよび５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４緩衝液で、平衡化した６ｍｌ
Ｎｉ−ＮＴＡカラムに、流速４−５ｍｌ／分、４℃でポ
ンプ注入した。注入後、カラムをさらなる平衡化緩衝液
で洗浄し、０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡化緩衝液
で、タンパク質を溶出した。続いて、高純度に精製した
タンパク質を、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．１４Ｍ Ｎａ
Ｃｌおよび４％マンニトール、ｐＨ６．８を含む保存用
緩衝液中、２５ｍｌ Ｇ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）カラムで脱塩し、−８０℃で保存し
た。
【０４０４】タンパク質の免疫接合体（Ｆｃ含有）は、
馴化培地から、以下のように精製した。馴化培地を、２
０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８で平衡化し
た５ｍｌプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上
にポンプ注入した。注入後、カラムを、１００ｍＭクエ
ン酸、ｐＨ３．５で溶出する前に、平衡化緩衝液で十分
に洗浄した。２７５ｍＬの１ＭＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ９
を含むチューブ中に、１ｍＬ画分を採取することによっ
て、溶出タンパク質を直ちに中和した。続けて、高純度
に精製したタンパク質を、上記のようにポリ−Ｈｉｓ標
識化タンパク質用に、保存用緩衝液中で脱塩した。タン
パク質の同一性を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（Ｐ
ＥＧ）およびエドマン分解によるＮ末端アミノ酸配列決
定、および所望もしくは必要に応じてその他の分析方法
によって確認した。
【０４０５】実施例２４：ＰＲＯポリペプチドに結合す
る抗体の調製 この実施例では、ＰＲＯポリペプチドと特異的に結合し
得るモノクローナル抗体の調製について説明する。
【０４０６】モノクローナル抗体の作製技術は、当該分
野において公知であり、例えば、上記Ｇｏｄｉｎｇ，に
記載されている。用いられる免疫原は、精製されたＰＲ
Ｏポリペプチド、ＰＲＯポリペプチドを含む融合タンパ
ク質、および細胞表面に組み換えＰＲＯポリペプチドを
発現している細胞を含む。免疫原の選択は、過度な実験
を行わずに、当該分野の技術者がなし得るものである。
【０４０７】ＰＲＯポリペプチド免疫原をフロイント完
全アジュバントで乳化し、１−１００μｇ量を、皮下も
しくは腹腔内注射して、Ｂａｌｂ／ｃなどのマウスを免
疫化した。もしくは、免疫原は、ＭＰＩ−ＴＤＭアジュ
バント（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）に乳化し、動
物の後足に注入した。次いで、１０から１２日後に、所
定のアジュバントに乳化させた追加免疫原を、免疫化さ
れたマウスに追加注射した。それから数週間後、再び、
マウスに追加免疫原を注射した。抗ＰＲＯポリペプチド
抗体を検出するためのＥＬＩＳＡアッセイ用に、血清試
料を、定期的にマウスから、後眼窩採血によって採取す
ることができる。
【０４０８】適切な抗体力価が検出された後、抗体に
「陽性」の動物に、ＰＲＯポリペプチドの最後の静脈注
射を行うことができる。３から４日後、このマウスを屠
殺して、脾臓細胞を採取した。次いで、脾臓細胞を、例
えば、ＡＴＣＣ、Ｎｏ．ＣＲＬ１５９７から利用できる
Ｐ３Ｘ６３ＡｇＵ．１などの選択された齧歯類の骨髄腫
細胞株に、（３５％ポリエチレングリコールを用いて）
融合した。ハイブリドーマ細胞を融合により産出し、次
いで、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、脾臓細胞ハイ
ブリッドの増殖を阻害するために、ＨＡＴ（ヒポキサチ
ン、アミノプテリン、チミジン）培地を含む９６ウェル
組織培養プレートに平板培養させることができる。
【０４０９】ハイブリドーマ細胞は、ＰＲＯポリペプチ
ドに対する反応性についてＥＬＩＳＡでスクリーニング
した。ＰＲＯポリペプチドに対する所望のモノクローナ
ル抗体を分泌する「陽性」ハイブリドーマ細胞の確定
は、当該分野における技術範囲内である。
【０４１０】陽性ハイブリドーマ細胞は、抗ＰＲＯポリ
ペプチドモノクローナル抗体を含む腹水を産生させるた
めに、同系のＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に注入させる
ことができる。あるいは、このハイブリドーマ細胞は、
組織培養フラスコもしくはローラーボトルで生育させる
こともできる。腹水中に産生されたモノクローナル抗体
の精製は、硫安沈殿、次いでゲル濾過クロマトグラフィ
ーを用いて行うことができる。あるいは、プロテインＡ
もしくはプロテインＧに対する抗体の結合に基づいたア
フィニティークロマトグラフィーを用いることができ
る。
【０４１１】実施例２５：キメラＰＲＯポリペプチド ＰＲＯポリペプチドを、タンパク精製を容易にするため
に付加された１以上の付加ポリペプチドドメインを有す
るキメラタンパク質として発現させることができる。そ
のような精製を容易にするドメインは、限定されない
が、固相化された金属上での精製ができるヒスチジン−
トリプトファンモジュール、固相化されたイムノグロブ
リン上での精製ができるプロテインＡドメイン、および
ＦＬＡＧＳ TM伸長／アフィニティー精製システム（Ｉｍ
ｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ Ｗａｓｈ）に
おいて利用されるドメインなどの金属錯体ペプチドを含
む。精製用ドメインとＰＲＯポリペプチド配列との間
に、Ｆａｃｔｏｒ ＸＡもしくはエンテロキナーゼ（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの切断できるリンカー配列を
含むことは、ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡの
発現を促進するのに有用である。
【０４１２】実施例２６： 特異抗体を用いたＰＲＯポ
リペプチドの精製 天然もしくはＰＲＯポリペプチドを、当該分野のタンパ
ク精製において標準的な様々な技術により精製すること
ができる。例えば、前駆ＰＲＯポリペプチド、成熟ＰＲ
Ｏポリペプチドもしくは前ＰＲＯポリペプチドを、興味
あるＰＲＯポリペプチドに対する特異抗体を用いたイム
ノアフィニティークロマトグラフィーによって精製す
る。一般に、イムノアフィニティーカラムは、抗ＰＲＯ
ポリペプチド抗体の活性クロマトグラフィー樹脂との共
有結合によって構築される。
【０４１３】ポリクローナルイムノグロブリンは、免疫
された血清から、硫安沈殿もしくは固相化プロテインＡ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ，Ｐｉｓｃａｔｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）における精製の
どちらかによって調製した。同様に、モノクローナル抗
体は、マウス腹水液から、硫安沈殿もしくは固相化プロ
テインＡ上でのクロマトグラフィーによって調製した。
部分的に精製されたイムノグロブリンは、ＣｎＢｒ−活
性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥTM（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫ
Ｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）などのクロマトグラ
フィー樹脂に共有結合した。抗体を樹脂に結合させて樹
脂を保護し、修飾した樹脂を製造元の指示書に従って洗
浄した。
【０４１４】そのようなイムノアフィニティーカラム
は、ＰＲＯポリペプチドを含む細胞から画分を可溶型で
調製することによって、ＰＲＯポリペプチドの精製時に
使用し得る。この調製物は、全細胞もしくは界面活性剤
の添加によって遠心分離して得られた細胞画分の可溶
化、もしくは当該分野において公知の他の方法によって
得ることができる。もしくは、シグナル配列を含む可溶
性ＰＲＯポリペプチドを、細胞が生育している培地中
に、有用量で分泌させることができる。
【０４１５】可溶性ＰＲＯポリペプチド含有調製物は、
イムノアフィニティーカラムに通し、カラムは、ＰＲＯ
ポリペプチドの好ましい吸光度となるような条件下（例
えば、界面活性剤含有高イオン強度緩衝液）で洗浄し
た。次いで、カラムは、抗体／ＰＲＯポリペプチド結合
体が分離する条件下（例えば、約ｐＨ２−３などの低い
ｐＨ緩衝液、または尿素もしくはチオシアネートイオン
などの高濃度のカオトロープ）で溶出させ、ＰＲＯポリ
ペプチドを回収した。
【０４１６】実施例２７：薬剤スクリーニング 本発明は、様々な薬剤スクリーニング技術において、Ｐ
ＲＯポリペプチドもしくはそれに結合するフラグメント
を用いた化合物のスクリーニングに一部有用である。そ
のような試験において用いられるＰＲＯポリペプチドも
しくはフラグメントは、溶液中に遊離、固形支持物に付
着、細胞表面上に産出、もしくは細胞内に局在させるこ
とができる。薬剤スクリーニングの一つの方法として、
ＰＲＯポリペプチドもしくはフラグメントを発現する組
み換え核酸で安定的に形質転換した真核生物もしくは原
核生物の宿主細胞を用いる。そのような形質転換細胞に
対して、競合的結合アッセイにおいて、薬剤をスクリー
ニングする。そのような細胞は、生存もしくは固定され
た形態のどちらかで、標準的な結合アッセイに用いるこ
とができる。例えば、ＰＲＯポリペプチドもしくはフラ
グメントと試薬との複合体形成を測定することができ
る。もしくは、試薬によって引き起こされる、ＰＲＯポ
リペプチドと標的細胞もしくは標的受容体との複合体形
成の減少を測定することができる。
【０４１７】このように、本発明は、ＰＲＯポリペプチ
ド−付随疾患もしくは障害に影響を及ぼし得る薬剤もし
くはその他の試薬のスクリーニング方法を提供するもの
である。これらの方法は、ＰＲＯポリペプチドもしくは
そのフラグメントと、そのような試薬との接触、および
当該分野において公知の方法によって行う（Ｉ）試薬と
ＰＲＯポリペプチドもしくはフラグメントとの複合体の
存在、もしくは（ｉｉ）ＰＲＯポリペプチドもしくはフ
ラグメントと細胞との複合体の存在のアッセイを含む。
そのような競的合結合アッセイにおいて、典型的には、
ＰＲＯポリペプチドもしくはフラグメントを標識する。
適切にインキュベーション後、遊離ＰＲＯポリペプチド
もしくはフラグメントを、結合型から分離し、遊離もし
くは複合化していない標識量を、ＰＲＯポリペプチドと
結合する、もしくはＰＲＯポリペプチド／細胞複合化を
妨げる試薬特有の性能の指標とする。
【０４１８】薬剤スクリーニングの他の技術は、ポリペ
プチドに対して好適な結合親和性を有する化合物の高ス
ループットスクリーニングを提供し、１９８４年、９月
１３日に公開されたＷＯ ８４／０３５６４に詳細に記
載されている。簡単に述べると、様々な小さいペプチド
試験化合物を大量に、固形支持物上、例えばプラスチッ
クピンなどの表面に合成させる。ＰＲＯポリペプチドに
適用する時は、ペプチド試験化合物を、ＰＲＯポリペプ
チドと反応させ、洗浄する。結合したＰＲＯポリペプチ
ドを、当該分野において公知の方法で検出する。また、
精製したＰＲＯポリペプチドを、前記薬剤スクリーニン
グ技術における使用のために、直接プレート上に被覆さ
せることができる。さらに、ペプチドを捕捉し、固形支
持物上に固相化するために、非中和抗体を使用すること
もできる。
【０４１９】また、本発明は、中和抗体が、ＰＲＯポリ
ペプチド、もしくはそのフラグメントに結合する試験化
合物と競合して、特異的にＰＲＯポリペプチドと結合し
得る競合的薬剤スクリーニングアッセイの使用を意図す
る。この様式において、抗体は、ＰＲＯポリペプチド
と、１以上の抗原決定基を共有するペプチドの存在を検
出するために使用することができる。
【０４２０】実施例２８：合理的薬剤設計 合理的薬剤設計の目的は、生物学的に活性な興味あるポ
リペプチド（すなわち、ＰＲＯポリペプチド）もしくは
それらと相互作用する低分子（例えば、アゴニスト、ア
ンタゴニスト、もしくはインヒビター）の構造類似体を
産出することである。これらの例は、ＰＲＯポリペプチ
ドのより活性もしくは安定な形状、またはｉｎ ｖｉｖ
ｏでのＰＲＯポリペプチドの機能を増強する、もしくは
阻害する薬剤を作るために用いることができる（Ｈｏｄ
ｇｓｏｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１９−
２１（１９９１）参照）。
【０４２１】一つの方法において、ＰＲＯポリペプチド
もしくはＰＲＯポリペプチド−インヒビター複合体の３
次元構造を、ｘ線結晶学、コンピューターモデリング、
もしくはより典型的に、該２つの方法の組み合わせによ
って確定する。構造を解明し、分子の活性部位を決定す
るために、ＰＲＯポリペプチドの形状と電荷を確定しな
ければならない。頻繁でないが、ＰＲＯポリペプチドの
構造に関する有用な情報を、相同タンパク質の構造に基
づくモデリングによって得ることができる。両方の事例
において、関連する構造の情報が、類似するＰＲＯポリ
ペプチド様分子の設計もしくは効果的なインヒビターの
同定に用いられる。合理的薬剤設計の有用な実施例は、
ＢｒａｘｔｏｎとＷｅｌｌｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，３１：７７９６−７８０１（１９８２）によって示
されているように、活性もしくは安定性が向上した、も
しくはＡｔｈａｕｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１
３：７４２−７４６（１９９３）によって示されている
ように、天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、も
しくはアンタゴニストとして作用する分子を含む。
【０４２２】また、上記のように選択した機能的アッセ
イによって、標的特異抗体を単離し、その結晶構造を解
明することができる。この方法は、おおむね、続く薬剤
設計の基礎となるファーマコアー（ｐｈａｒｍａｃｏｒ
ｅ）を産出する。機能的、薬学的に活性な抗体に対する
抗イディオタイプ抗体（ａｎｒｉ−ｉｄｓ）を産出する
ことによって、タンパク質結晶学を完全に迂回すること
ができる。鏡像の鏡像なので、抗イディオタイプ抗体の
結合部位が、本来の受容体の類似体であると予想され
る。次いで、化学的もしくは生物学的に産出したペプチ
ドの貯蔵物から、ペプチドを同定および単離するため
に、抗イディオタイプ抗体を用いることができる。次い
で、単離したペプチドを、ファーマコアーとして作用さ
せる。
【０４２３】本発明によって、Ｘ線結晶学のような分析
的な研究を行うのに、十分量のＰＲＯポリペプチドを利
用することができるようになる。さらに、ここに提供さ
れるＰＲＯポリペプチドアミノ酸配列についての情報
は、Ｘ線構造学に代わる、もしくは加えて、コンピュー
ターモデリング技術を用いるための手引きを提供するも
のである。
【０４２４】実施例２９： ＰＲＯ２４１の軟骨からの
プロテオグリカンの遊離を刺激する性能 ＰＲＯ２４１
の軟骨組織からのプロテオグリカンの遊離を刺激する性
能を、以下のように測定した。
【０４２５】生後４−６ヶ月のブタの中手指節関節を、
無菌的に切開し、関節軟骨を、注意深く下層の骨を除去
しながら、手で切り取った。軟骨を細かく刻み、９５％
空気、５％ＣＯ2の湿潤環境下、０．１％ＢＳＡと１０
０Ｕ／ｍｌペニシリンと、１００μｇストレプトマイシ
ンを含む無血清（ＳＦ）培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２ １：
１）中、２４時間大量培養した。３回洗浄後、約１００
ｍｇの関節を、マイクロ遠心チューブに分注し、上記無
血清培地中、さらに２４時間インキュベーションした。
次いで、ＰＲＯ２４１ポリペプチドを、単独もしくは１
８ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−１α（公知の軟骨組
織からのプロテオグリカン遊離刺激因子）と組み合わせ
て、１％添加した。次いで、上清を回収し、１，９−ジ
メチルーメチレンブルー（ＤＭＢ）比色定量アッセイ
（ＦａｒｎｄａｌｅとＢｕｔｔｌｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ８８３：１７３−１７７
（１９８５））を用いて、プロテオグリカン量をアッセ
イした。このアッセイにおける陽性結果は、測定したポ
リペプチドが、例えば、スポーツ関連関節損傷、関節軟
骨欠損、変形性関節症、もしくは慢性関節リウマチの治
療において用いられ得ることを示す。
【０４２６】ＰＲＯ２４１ポリペプチドを上記アッセイ
で測定すると、ポリペプチドは、単独およびインターロ
イキン−１αと共に刺激後、および処置後２４時間と７
２時間で、軟骨組織からのプロテオグリカンの遊離を顕
著に刺激し、このことから、ＰＲＯ２４１ポリペプチド
が、軟骨組織からのプロテオグリカンの遊離を刺激する
ために有用であることが示された。
【０４２７】実施例３０：Ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイ
ゼーション ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、細胞もしく
は組織調製物内の核酸配列の検出と局在測定に強力かつ
用途の広い技術である。例えば、遺伝子の発現部位の同
定、転写の組織分布の分析、ウィルス感染の同定と局在
測定、特異的ｍＲＮＡ合成の変化の追跡および染色体マ
ップ作製を促進するのに有用である。
【０４２８】Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
は、ＬｕとＧｉｌｌｅｔｔ、ＣｅｌｌＶｉｓｉｏｎ
１：１６９−１７６（１９９４）による以下の最適化さ
れた方法で、ＰＣＲ−産生33Ｐ−標識化リボプローブを
用い行った。簡単には、ホルマリン固定し、パラフィン
包埋したヒト組織を、薄切し、脱パラフィン化し、プロ
テアーゼＫ（２０ｇ／ｍｌ）で１５分間、３７℃で除蛋
白し、さらに上記ＬｕおよびＧｉｌｌｅｔｔによって記
載されたように、Ｉｎ Ｓｉｔｕハイブリダイゼーショ
ンのためにさらに処理を行った。（33Ｐ）ＵＴＰ−標識
化アンチセンスリボプローブを、ＰＣＲ生成物から産生
し、５５℃で一晩ハイブリダイズさせた。このスライド
を、Ｋｏｄａｋ ＮＴＢ２核飛跡感光乳剤に浸し、４週
間露光させた。
【０４２９】33Ｐ−リボプローブの合成 ６．０μｌ（１２５ｍＣｉ）の33Ｐ−ＵＴＰ（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ ＢＦ １００２， ＳＡ＜２０００Ｃｉ／ｍｍ
ｏｌ）を、急速真空乾燥させた。乾燥した33Ｐ−ＵＴＰ
を含む各チューブに、下記成分を添加した： ２．０μｌ ５ｘ転写緩衝液 １．０μｌ ＤＴＴ（１００ｍＭ） ２．０μｌ ＮＴＰ 混合物（２．５ｍＭ：１０μｌ：各
１０ｍＭＧＴＰ、ＣＴＰ＆ＡＴＰ＋１０μｌ 水） １．０μｌ ＵＴＰ（５０μＭ） １．０μｌ Ｒｎａｓｉｎ １．０μｌ 鋳型ＤＮＡ（１μｇ） １．０μｌ 水 １．０μｌ ＲＮＡポリメラーゼ（通常、ＰＣＲ生成物
Ｔ３＝ＡＳ、Ｔ７＝Ｓ）
【０４３０】該チューブを、３７℃で１時間インキュベ
ーションした。１．０μｌ ＲＱ１ＤＮアーゼを添加
し、３７℃で１５分間インキュベーションした。９０μ
ｌＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．６ ／１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ ｐＨ８．０）を添加し、その混合液を、ＤＥ８
１紙上にピペットで移した。残った溶液をＭｉｃｒｏｃ
ｏｎ−５０限外濾過ユニットに負荷し、プログラム１０
（６分）を用いて遠心分離した。濾過ユニットを、第２
のチューブに入れ、プログラム２（３分）を用いて遠心
分離した。最終の回収遠心分離後、１００μｌＴＥを添
加した。次いで、１μｌの最終生成物を、ＤＥ８１紙上
にピペットで移し、６ｍｌのＢｉｏｆｌｏｕｒ ＩＩで
カウントした。
【０４３１】プローブを、ＴＢＥ／尿素ゲル上で泳動し
た。３μｌのローディング緩衝液に、１−３μｌのプロ
ーブもしくは５μｌのＲＮＡ Ｍｒｋ ＩＩＩを添加し
た。９５℃のヒートブロック上で３分間加熱後、直ちに
ゲルを氷上に置いた。ゲルのウェルを平らにし、試料を
かけ、１８０−２５０ボルトで４５分間泳動した。ゲル
をサランラップで包み、−７０℃のフリーザー中、１時
間から一晩、増感紙を用いてＸＡＲフィルムに露光し
た。
【０４３２】33Ｐ−ハイブリダイゼーション Ａ．凍結切片の調製 スライドを、フリーザーから取り出し、アルミニウムト
レイ上に置き、室温で５分間解凍させた。トレイを、凝
結を低減させるために、５５℃のインキュベーター内に
５分間置いた。スライドを、ドラフト内の氷上の４％パ
ラホルムアルデヒド中で、１０分間固定し、０．５ｘＳ
ＳＣで５分間、室温で洗浄した（２５ｍｌ ２０ｘＳＳ
Ｃ＋９７５ｍｌＳＱ Ｈ2Ｏ）。０．５μｇ／ｍｌプロテ
アーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ保存液１２．５μｌを、予め
暖められたＲＮアーゼ−不含ＲＮアーゼ緩衝液２５０ｍ
ｌで希釈したもの）中で、１０分間、３７℃で除蛋白
後、切片を、室温で１０分間、０．５ｘＳＳＣで洗浄し
た。切片を、７０％、９５％、および１００％エタノー
ル中で、各２分間ずつ脱水させた。
【０４３３】Ｂ．パラフィン包埋切片の前処理 スライドを、脱パラフィン化し、ＳＱＨ2Ｏ中に置き、
２ｘＳＳＣで、室温、各５分間ずつ、２回洗浄した。切
片を、ヒト胚芽組織の場合は、２０μｇ／ｍｌプロテア
ーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ保存液５００μｌをＲＮアーゼ
−不含ＲＮアーゼ緩衝液２５０ｍｌに希釈；３７℃、１
５分）で、もしくはホルマリン組織切片の場合は、８ｘ
プロテアーゼＫ（１００μｌをＲｎアーゼ緩衝液２５０
ｍｌに希釈、３７℃、３０分）で除蛋白した。続けて
０．５ｘＳＳＣでの洗浄、脱水を、上記のように行っ
た。
【０４３４】Ｃ．プレハイブリダイゼーション Ｂｏｘ緩衝液（４ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド）で飽
和させた濾紙を配列したプラスチック箱に、スライドを
配置した。組織を、５０μｌのハイブリダイゼーション
緩衝液（３．７５ｇ デキストラン硫酸＋６ｍｌＳＱＨ2
Ｏ）で覆い、渦動攪拌し、フタを緩めた状態で、マイク
ロ波で２分間加熱した。氷上で冷却した後、ホルムアミ
ド１８．７５ｍｌ、２０ｘＳＳＣ３．７５ｍｌ、および
ＳＱＨ2Ｏ９ｍｌを加え、組織を十分に渦動攪拌し、４
２℃で１−４時間インキュベーションした。
【０４３５】Ｄ．ハイブリダイゼーション １スライド当たり、プローブ１．０ｘ１０6ｃｐｍおよ
びｔＲＮＡ（５０ｍｇ／ｍｌ保存液）１．０μｌを、９
５℃で３分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、ハイ
ブリダイゼーション緩衝液４８μｌを１スライド当たり
加えた。渦動攪拌後、33Ｐ混合液５０μｌを、スライド
上のプレハイブリダイゼーション５０μｌに添加した。
該スライドを、５５℃で一晩インキュベーションした。
【０４３６】Ｅ．洗浄 洗浄を、２ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡを用い、２ｘ１０分間、
室温で行い（２０ｘＳＳＣ＋０．２５Ｍ ＥＤＴＡ１６
ｍｌ、Ｖf＝４Ｌ）、次いで、ＲＮアーゼＡ処理を、３
７℃で３０分間行った（１０ｍｇ／ｍｌ保存液５００μ
ｌをＲｎアーゼ緩衝液２５０ｍｌで希釈＝２０μｇ／ｍ
ｌ）。スライドを、２ｘ１０分間、２ｘＳＳＣ、ＥＤＴ
Ａで、室温で洗浄した。ストリンジェントな洗浄条件
は、以下のようにした：５５℃で２時間、０．１ｘＳＳ
Ｃ、ＥＤＴＡ（２０ｘＳＳＣ２０ｍｌ＋ＥＤＴＡ１６ｍ
ｌ、Ｖf＝４Ｌ）。
【０４３７】Ｆ．オリゴヌクレオチド Ｉｎ ｓｉｔｕ分析を、ここに示した様々なＤＮＡ配列
で行った。これらの分析に用いたオリゴヌクレオチド
は、以下の通りである。 （１）ＤＮＡ４４８０４−１２４８（ＰＲＯ３５７） ｐｌ：５’−ＧＧＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧＧＧＣＴＧＣＣＣＧＣＡＡＣＣＣＣＴＴＣＡ
ＡＣＴＧ−３’（配列番号：１０４） ｐ２：５’−ＣＴＡＴＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣ
ＴＡＡＡＧＧＧＡＣＣＧＣＡＧＣＴＧＧＧＴＧＡＣＣＧ
ＴＧＴＡ−３’（配列番号：１０５） （２）ＤＮＡ５２７２２−１２２９（ＰＲＯ７１５） ｐｌ：５’−ＧＧＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＣＣＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＴ−
３’（配列番号：１０６） ｐ２：５’−ＣＴＡＴＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣ
ＴＡＡＡＧＧＧＡＣＴＣＧＡＧＡＣＡＣＣＡＣＣＴＧＡ
ＣＣＣＡ−３’（配列番号：１０７） ｐ３：５’−ＧＧＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧＧＧＣＣＣＡＡＧＧＡＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡ
ＣＴＣＴ−３’（配列番号：１０８） ｐ４：５’−ＣＴＡＴＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣ
ＴＡＡＡＧＧＧＡＣＴＡＧＧＧＧＧＴＧＧＧＡＡＴＧＡ
ＡＡＡＧ−３’（配列番号：１０９） （３）ＤＮＡ３８１１３−１２３０（ＰＲＯ３２７） ｐｌ：５’−ＧＧＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧＧＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＧＣＴＣＴＣＣＣＧ
ＴＧＴＡ−３’（配列番号：１１０） ｐ２：５’−ＣＴＡＴＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣ
ＴＡＡＡＧＧＧＡＡＧＧＣＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＴＣＧ
ＴＡＧＡ−３’（配列番号：１１１） （４）ＤＮＡ３５９１７−１２０７（ＰＲＯ２４３） ｐｌ：５’−ＧＧＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧＧＡＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＡＧ
ＧＡＧＡ−３’（配列番号：１１２） ｐ２：５’−ＣＴＡＴＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣ
ＴＡＡＡＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＣＴＧ
ＡＧＴ−３’（配列番号：１１３）
【０４３８】Ｇ．結果 Ｉｎ Ｓｉｔｕ分析を、ここに開示した様々なＤＮＡ配
列で行った。これらの分析結果は以下のようである。 （１）ＤＮＡ４４８０４−１２４８（ＰＲＯ３５７） 胎児組織における骨形成部位と悪性骨肉腫細胞におい
て、低から中程度の発現。胎盤および腱においてかろう
じて検出できるシグナル。他の全組織は陰性。 試験した胎児の組織（Ｅ１２−Ｅ１６）は以下を含む：
肝臓、腎臓、副腎、肺、心臓、大脈管、食道、胃、脾
臓、性腺、脳、脊髄および体壁。 試験した成人の組織：肝臓、腎臓、胃、脾臓、副腎、膵
臓、肺、結腸腫瘍、腎細胞腫瘍および骨肉腫。アセトア
ミノフェン誘導肝障害、肝硬変。 試験したチンパンジーの組織は以下を含む：甲状腺、上
皮小体、リンパ節、神経、舌、胸腺、副腎、胃粘膜およ
び唾液腺。 アカゲザル：大脳と小脳。
【０４３９】（２）ＤＮＡ５２７２２−１２２９（ＰＲ
Ｏ７１５） 総合すると、高いシグナルが多くの組織に亘って認めら
れた−中でも高いシグナルが、胎盤、骨芽細胞、損傷し
た腎尿細管、損傷した肝臓、結腸直腸肝臓転移および胆
嚢で認められた。 試験した胎児の組織（Ｅ１２−Ｅ１６）は以下を含む：
胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大
脈管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊
髄、体壁、骨盤および下肢。 試験した成人の組織：肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動
脈、肺、皮膚、軟骨肉腫、眼、胃、結腸、結腸腫瘍、前
立腺、膀胱粘膜および胆嚢。アセトアミノフェン誘導肝
障害、肝硬変。 試験したアカゲザル：大脳皮質（ｒｍ）、海馬（ｒｍ） 試験したチンパンジー：甲状腺、上皮小体、リンパ節、
神経、舌、胸腺、副腎、胃粘膜および唾液腺。
【０４４０】（３）ＤＮＡ３８１１３−１２３０（ＰＲ
Ｏ３２７） 高レベルの発現が、発育中のマウスとヒトの胎児の肺で
観察された。正常の成人の肺（気管支上皮を含む）は、
陰性であった。ヒト胎児気管の粘膜下組織で発現してお
り、筋肉細胞でかろうじて発現していた。また、ヒト胎
盤において組織発生が不確かである非栄養膜細胞におい
ても発現が認められた。マウスにおいては、発育中の鼻
および発育中の舌において観察された。他の全ての組織
は陰性であった。推定される機能：気管支発育において
の確かな機能。 試験した胎児の組織（Ｅ１２−Ｅ１６）は以下を含む：
胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大
脈管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊
髄、骨盤および下肢。 試験した成体の組織は以下を含む：肝臓、腎臓、副腎、
心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、皮膚、大
脳（ｒｍ）、海馬（ｒｍ）、陰茎、眼、膀胱、胃、胃粘
膜、結腸、結腸腫瘍、甲状腺（チンパンジー）、上皮小
体（チンパンジー）、卵巣（チンパンジー）および軟骨
肉腫。 （４）ＤＮＡ３５９１７−１２０７（ＰＲＯ２４３） コルネリア・ド・ランゲ症候群（Ｃｏｒｎｅｌｉａ ｄ
ｅ Ｌａｎｇｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＣｄＬＳ）は、先
天性の症候群である。それは、生まれた時から出現する
ことを意味する。ＣｄＬＳは、身体、知能および言語の
発育遅延を引き起こす疾患である。ＣｄＬＳを有する小
児の大多数は、軽度から重度におよぶ精神遅延の程度
で、精神的に遅延している。報告されたＩＱは、３０か
ら８５である。ＩＱの平均値は５３である。頭と顔の特
徴は、小さい頭、しばしば中央でつながっている薄い両
眉、長い睫毛、短い上唇、薄い下唇、低位置の耳と高い
弓なりの口蓋もしくは口蓋破裂を含む。他の特徴は、言
葉遅延（最も軽度な傷害においても）、遅延した発育と
低い身長、低い泣き声、小さい手足、内側に曲がった５
本の指、猿線、および多毛を含む。診断は、これらの特
徴の組み合わせの出現によって決まる。これらの特徴の
多くが、様々な程度で出現する。いくつかの事例におい
て、これらの特徴は、出現しないかもしれないし、とて
も軽度であるため、熟達した遺伝学者もしくはこの症候
群に習熟したその他の者によって観察された時のみ認識
されるかもしれない。ＣｄＬＳについて多くのことが知
られているが、最近の報告では、より多くの研究される
べきことがあることが報告されている。
【０４４１】この研究において、ヒト胎児の顔、頭、四
肢およびマウス胎芽が試験された。マウス組織において
は、全く発現が認められなかった。発現は、アンチセン
スプローブでのみ認められた。
【０４４２】発現は、発育中の四肢および骨膜傍の間葉
細胞における顔骨に隣接して観察された。発現は、高特
異的であり、しばしば、血管新生している領域に隣接し
ていた。分布は、コルネリア・ド・ランゲ症候群におい
て観察された骨格異常と一致している。また、発現は、
発育時の一時的に胎児脳の後頭葉においても観察された
が、その他には観察されなかった。さらに、発現は、発
育中の内耳の神経節において認められた；この発見の有
意性は明らかではない。
【０４４３】これらのデータは、機能的な情報を提供す
るものではないが、分布は、この症候群に最も重篤な影
響を与えることが知られている部位に一致する。
【０４４４】さらに、わずかな発現が、大腿骨頭と寛骨
臼との間（股関節）に形成されている発育中の滑膜性連
結における割線に観察された。この発現パターンが、そ
の他の連結形成部位において観察されるのであれば、コ
ルネリア・ド・ランゲ症候群に観察される顔と四肢の異
常を説明できる。
【０４４５】実施例３１： アフリカツメガエル卵母細
胞におけるＰＲＯ２４３ ｍＲＮＡの活性 ＰＲＯ２４３をコードするヒトｃｈｏｒｄｉｎクローン
（ＤＮＡ３５９１７−１２０７）が、アフリカツメガエ
ルコルディン(chordin)とショウジョウバエｓｏｇ遺伝
子によって推測されるように、機能し、作用することを
証明するために、ＤＮＡ３５９１７−１２０７から超ら
せん状のプラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎによって調製
し、アフリカツメガエルの胚芽に注入するために用い
た。アフリカツメガエルのコルディンｍＲＮＡの腹側の
植物極割球へのマイクロインジェクションにより、第２
（２倍）軸を誘導し（Ｓａｓａｉら、Ｃｅｌｌ ７９：
７７９−７９０（１９９４））と、ショウジョウバエｓ
ｏｇも、アフリカツメガエル胚芽の側腹位に異所的に発
現する時に、第２軸を誘導する（Ｈｏｌｌｅｙら、Ｎａ
ｔｕｒｅ ３７６：２４９−２５３（１９９５）と、Ｓ
ｃｈｍｉｄｔら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１：４
３１９−４３２８（１９９５））。アフリカツメガエル
卵母細胞において機能するｓｏｇの性能は、背腹軸 パ
ターン形成に含まれる過程が、進化時に保存されている
ことを示している。
【０４４６】方法 カエル胚芽の操作：成熟雌のカエルを、使用３日前に、
受胎している雌馬の血清２０００Ｉ．Ｕ．を、および注
入前夜にヒトの絨毛性のゴナドトロピン８００Ｉ．Ｕ．
をブースト（boost）した。翌朝、新鮮な卵母細胞を、
雌のカエルから搾取し、卵母細胞を、雄のカエルから切
開して取り出しミンチ状にした精巣と混合することによ
り、インビトロでの卵母細胞の受精を行った。Ｎｉｅｕ
ｗｋｏｏｐとＦａｂｅｒ、Ｎｏｒｍａｌ Ｔａｂｌｅ ｏ
ｆ Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ，Ｎ．−Ｈ．Ｐ社監修
（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９６７）に従って、胚芽の発
育を維持し、段階づけた。
【０４４７】受精した卵を、２％システイン（ｐＨ７．
８）で１０分間脱ゼリー化させ、滅菌水で１回洗浄し、
５％Ｆｉｃｏｌｌを含む０．１ｘＭＢＳに移した。受精
した卵を、インジェクショントレー上、５％Ｆｉｃｏｌ
ｌを含む０．１ｘＭＢＳ中に配列した。２細胞期に発育
したアフリカツメガエル胚芽に、野生型ｃｈｏｒｄｉｎ
（ＤＮＡ３５９１７−１２０７）を含むｐＲＫ５を２０
０ｐｇ、もしくは対照として挿入物を含まないｐＲＫ５
を２００ｐｇ注入した。注入した胚芽を、５０ｍｇ／ｍ
ｌゲンタマイシンを含む０．１ｘＭＢＳに移した後、Ｎ
ｉｅｕｋｗｋｏｏｐｋｉ３７−３８に到達するまで、ト
レー上でさらに６時間保持した。
【０４４８】結果：ヒトｃｈｏｒｄｉｎ ｃＤＮＡを単
一の割球に注入したところ、おたまじゃくしの側腹にな
った。おたまじゃくしの側腹は、尾が短くねじれ、セメ
ント腺が拡張して見える。ヒトｃｈｏｒｄｉｎのアフリ
カツメガエルにおける側腹剤として機能する性能は、Ｄ
ＮＡ３５９１７−１２０７によってコードされたタンパ
ク質が、カエルにおける背腹パターン形成に機能、かつ
影響を及ぼすことを示し、そして、腹側パターン形成に
おいて含まれる過程が、進化時に保存されていて、作用
機構がヒト、ハエおよびカエルの間で共通に保存されて
いることが提示するものである。
【０４４９】材料の寄託 以下の材料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１ Ｐａｒｋｌａ
ｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ
（ＡＴＣＣ）に寄託されている： 材料 ＡＴＣＣ寄託番号 寄託日 ＤＮＡ３４３９２−１１７０ ＡＴＣＣ２０９５２６ 1997年12月10日 ＤＮＡ３５９１７−１２０７ ＡＴＣＣ２０９５０８ 1997年12月 3日 ＤＮＡ３９９７６−１２１５ ＡＴＣＣ２０９５２４ 1997年12月10日 ＤＮＡ３５５９５−１２２８ ＡＴＣＣ２０９５２８ 1997年12月10日 ＤＮＡ３８１１３−１２３０ ＡＴＣＣ２０９５３０ 1997年12月10日 ＤＮＡ３４４３６−１２３８ ＡＴＣＣ２０９５２３ 1997年12月10日 ＤＮＡ４０５９２−１２４２ ＡＴＣＣ２０９４９２ 1997年11月21日 ＤＮＡ４４１７６−１２４４ ＡＴＣＣ２０９５３２ 1997年12月10日 ＤＮＡ４４１９２−１２４６ ＡＴＣＣ２０９５３１ 1997年12月10日 ＤＮＡ３９５１８−１２４７ ＡＴＣＣ２０９５２９ 1997年12月10日 ＤＮＡ４４８０４−１２４８ ＡＴＣＣ２０９５２７ 1997年12月10日 ＤＮＡ５２７２２−１２２９ ＡＴＣＣ２０９５７０ 1998年 1月 7日 ＤＮＡ４１２３４−１２４２ ＡＴＣＣ２０９６１８ 1998年 2月 5日 ＤＮＡ４５４１０−１２５０ ＡＴＣＣ２０９６２１ 1998年 2月 5日 ＤＮＡ４６７７７−１２５３ ＡＴＣＣ２０９６１９ 1998年 2月 5日
【０４５０】これらの寄託物は、特許手続上の微生物の
寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定および
それに基づく規則の下で行われた（ブダペスト条約）。
これは、寄託日から３０年間、寄託物の生存可能な培養
物の維持を保証する。寄託物はブダペスト条約の下でＡ
ＴＣＣにより入手可能であり、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社と
ＡＴＣＣとの間の合意を得ることを条件として、直接関
係する米国特許の発行、もしくは米国またはその他の国
の早い方の特許出願の公開に基づいて、公衆に寄託物の
培養物の子孫の永久的かつ無制限の利用可能性を保証
し、そして、その子孫の入手を、米国特許法第１２２条
およびそれに準ずる長官規則（特に８８６ＯＧ６３８に
関して米国特許法施行規則§１．１４を含む）に従って
付与される米国特許商標庁長官によって定められた者に
保証する。
【０４５１】本願の譲受人は、寄託物の培養物が適切な
条件下で培養された場合に死滅または損なわれた場合に
は、この材料を速やかに同一物で置き換えることに同意
した。寄託材料の利用可能性は、その国の特許法に従っ
て政府の権力の下に付与された権利に違反して本発明を
実施するライセンスとして解釈されない。
【０４５２】上記明細書は、当業者が本発明を十分に実
施できるものと解する。寄託された実施態様は、本発明
の一部の態様の単なる例示に過ぎないこと、並びに、機
能的に均等なあらゆる構成物が本発明の範囲に含まれる
ことから、本発明は、寄託された構築物により、範囲が
制限されるものではない。ここに言う材料の寄託は、上
記記述が、その最良の形態を含めた本発明のあらゆる態
様の実施を可能にするのに不適切であることの承認、あ
るいは、それが示す特定の例示に請求の範囲を限定する
と解釈されるとの承認を構成するものではない。実際
に、ここに記載または示されたものに加えて、本発明の
種々の変更が、上記記載から当業者にとって明白にな
り、添付された請求の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、天然配列ＰＲＯ２４１ｃＤＮＡのヌ
クレオチド配列（配列番号：１）を示し、配列番号：１
は、「ＵＮＱ２１５」及び／又は「ＤＮＡ３４３９２-
１１７０」とここで称したクローンである。
【図２】 図２は、図１に示した配列番号：１のコード
配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：２）を示
す。また図２中には、推定シグナルペプチド、潜在ロイ
シンジッパー領域及び潜在Ｎ-グリコシル化部位の位置
も提供される。
【図３】 図３は、天然配列ＰＲＯ２４３ｃＤＮＡのヌ
クレオチド配列（配列番号：６）を示し、配列番号：６
は、「ＵＮＱ２１７」及び／又は「ＤＮＡ３５９１７-
１２０７」とここで称したクローンである。
【図４】 図４は、図３中に示した配列番号：６のコー
ド配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：７）を示
す。
【図５】 図５は、ヒト染色体３ｑ２７-ｑ２８のＴＨＰ
Ｏ領域中のゲノムクローンの形成を示す。
【図６】 図６は、ヒト成人及び胎児組織の発現を示
す。６Ａは、ヒトコルディン(chordin)（ＰＲＯ２４
３）プローブにハイブリダイズした成人及び胎児組織の
ノーザンブロットである。下方パネルはアクチン対照を
示す。６Ｂは、示される保存システインブロックをコー
ドしているコドンの位置とともにヒトコルディン（ＰＲ
Ｏ２４３）ｃＤＮＡの図である。用いたプローブの範囲
は、実線によって示される。
【図７】 図７は、大腿骨頭と寛骨臼との間に形成され
る発育途上の滑膜性の連結の割線において陽性シグナル
を与える成人組織のＰＲＯ２４３in situハイブリダイ
ゼーションを示す。
【図８】 図８は、天然配列ＰＲＯ２９９ｃＤＮＡのヌ
クレオチド配列（配列番号：１４）を示し、配列番号：
１４は「ＵＮＱ２６２」及び／又は「ＤＮＡ３９９７６
-１２１５」とここで称したクローンである。
【図９】 図９は、図８に示した配列番号：１４のコー
ド配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：１５）を
示す。
【図１０】 図１０は、ＤＮＡ２８８４７（配列番号：
１８）とここで称したヌクレオチド配列を示す。
【図１１】 図１１は、ＤＮＡ３５８７７（配列番号：
１９）とここで称したヌクレオチド配列を示す。
【図１２】 図１２は、天然配列ＰＲＯ３２３ｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列（配列番号：２３）を示し、配列番
号：２３は、「ＵＮＱ２８４」及び／又は「ＤＮＡ３５
５９５-１２２８」とここで称したクローンである。
【図１３】 図１３は、図１２に示した配列番号：２３
のコード配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：２
４）を示す。
【図１４】 図１４は、ＰＲＯ３２３-融合ポリペプチド
とＩｇＧ定常ドメインの部分との間のキメラ融合タンパ
ク質のヌクレオチド配列（ヌクレオチド７９−１４１
６）を含む一本鎖ヌクレオチド配列（配列番号：２９）
を示し、該キメラ融合タンパク質は「ＰＲＯ４５４」と
ここで称した。ＰＲＯ３２３／ＩｇＧ融合タンパク質
（ＰＲＯ４５４）をコードしている一本鎖ヌクレオチド
配列（配列番号：２９）は、「ＤＮＡ３５８７２」とこ
こで称した。
【図１５】 図１５は、図１４に示したヌクレオチド配
列のヌクレオチド７９−１４１６から得られたアミノ酸
配列（配列番号：３０）を示す。ＰＲＯ３２３-誘導配
列とＩｇＧ-誘導配列との間のＰＲＯ４５４アミノ酸配
列における連結は、該図中のアミノ酸４１５−４１６の
間と思われる。
【図１６】 図１６は、天然配列ＰＲＯ３２７ｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列（配列番号：３１）を示し、配列番
号：３１は、「ＵＮＱ３２７」及び／又は「ＤＮＡ３８
１１３-１２３０」とここで称したクローンである。
【図１７】 図１７は、図１６に示した配列番号：３１
のコード配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：３
２）を示す。
【図１８】 図１８は、天然配列ＰＲＯ２３３ｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列（配列番号：３６）を示し、配列番
号：３６は「ＵＮＱ２０７」及び／又は「ＤＮＡ３４４
３６-１２３８」とここで称したクローンである。
【図１９】 図１９は、図１８に示した配列番号：３６
のコード配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：３
７）を示す。
【図２０】 図２０は、天然配列ＰＲＯ３４４ｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列（配列番号：４１）を示し、配列番
号：４１は、「ＵＮＱ３０３」及び／又は「ＤＮＡ４０
５９２-１２４２」とここで称したクローンである。
【図２１】 図２１は、図２０に示した配列番号：４１
のコード配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：４
２）を示す。
【図２２】 図２２は、天然配列ＰＲＯ３４７ｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列（配列番号：４９）を示し、配列番
号：４９は、「ＵＮＱ３０６」及び／又は「ＤＮＡ４４
１７６-１２４４」とここで称したクローンである。
【図２３】 図２３は、図２２に示した配列番号：４９
のコード配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：５
０）を示す。
【図２４】 図２４は、天然配列ＰＲＯ３５４ｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列（配列番号：５４）を示し、配列番
号：５４は、「ＵＮＱ３１１」及び／又は「ＤＮＡ４４
１９２-１２４６」とここで称したクローンである。
【図２５】 図２５は、図２４に示した配列番号：５４
のコード配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：５
５）を示す。
【図２６】 図２６は、天然配列ＰＲＯ３５５ｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列（配列番号：６０）を示し、配列番
号：６０は、「ＵＮＱ３１２」及び／又は「ＤＮＡ３９
５１８-１２４７」とここで称したクローンである。
【図２７】 図２７は、図２６に示した配列番号：６０
のコード配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：６
１）を示す。
【図２８】 図２８は、天然配列ＰＲＯ３５７ｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列（配列番号：６８）を示し、配列番
号：６８は、「ＵＮＱ３１４」及び／又は「ＤＮＡ４４
８０４-１２４８」とここで称したクローンである。
【図２９】 図２９は、図２８に示した配列番号：６８
のコード配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：６
９）を示す。
【図３０】 図３０は、天然配列ＰＲＯ７１５ｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列（配列番号：７５）を示し、配列番
号：７５は、「ＵＮＱ３８３」及び／又は「ＤＮＡ５２
７２２-１２２９」とここで称したクローンである。
【図３１】 図３１は、図３０に示した配列番号：７５
のコード配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：７
６）を示す。
【図３２】 図３２は、ヒト腫瘍壊死因子-α（ＴＮＦＡ
＿ヒト）（配列番号：７７）と、ＤＮＡ５２７２２-１
２２９のヌクレオチド１１４−８６３から得られたアミ
ノ酸配列（配列番号：７６）との比較を示す。同じアミ
ノ酸は箱で囲んだ。
【図３３】 図３３は、ＤＮＡ５２７２２-１２２９のヌ
クレオチド１１４−８６３から得られたアミノ酸配列
（配列番号：７６）とタンパク質の腫瘍壊死ファミリー
の各種のメンバーの配列（配列番号：７８−８４）との
比較を示す。同じアミノ酸は箱で囲った。
【図３４】 図３４は、天然配列ＰＲＯ３５３ｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列（配列番号：８５）を示し、配列番
号：８５は、「ＵＮＱ３１０」及び／又は「ＤＮＡ４１
２３４-１２４２」とここで称したクローンである。
【図３５】 図３５は、図３４に示した配列番号：８５
のコード配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：８
６）を示す。
【図３６】 図３６は、天然配列ＰＲＯ３６１ｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列（配列番号：９０）を示し、配列番
号：９０は、「ＵＮＱ３１６」及び／又は「ＤＮＡ４５
４１０-１２５１」とここで称したクローンである。
【図３７】 図３７は、図３６に示した配列番号：９０
のコード配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：９
１）を示す。
【図３８】 図３８は、天然配列ＰＲＯ３６５ｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列（配列番号：９８）を示し、配列番
号：９８は、「ＵＮＱ３２０」及び／又は「ＤＮＡ４６
７７７-１２５３」とここで称したクローンである。
【図３９】 図３９は、図３８に示した配列番号：９８
のコード配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：９
９）を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ｂ (31)優先権主張番号 ６０／０６９，２７８ (32)優先日 平成９年12月11日(1997．12．11) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０６９，４２５ (32)優先日 平成９年12月12日(1997．12．12) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０６９，６９６ (32)優先日 平成９年12月16日(1997．12．16) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０６９，６９４ (32)優先日 平成９年12月16日(1997．12．16) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０６９，７０２ (32)優先日 平成９年12月16日(1997．12．16) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０６９，８７０ (32)優先日 平成９年12月17日(1997．12．17) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０６９，８７３ (32)優先日 平成９年12月17日(1997．12．17) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０６８，０１７ (32)優先日 平成９年12月18日(1997．12．18) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０７０，４４０ (32)優先日 平成10年１月５日(1998．1．5) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０７４，０８６ (32)優先日 平成10年２月９日(1998．2．9) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０７４，０９２ (32)優先日 平成10年２月９日(1998．2．9) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０７５，９４５ (32)優先日 平成10年２月25日(1998．2．25) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 オードレイ・ゴッダード アメリカ合衆国・カリフォルニア・ 94131・サン・フランシスコ・コンゴ・ス トリート・110 (72)発明者 オースティン・エル・ガーニー アメリカ合衆国・カリフォルニア・ 94002・ベルモント・ワン・デビー・レー ン（番地なし) (72)発明者 ジーン・ユアン アメリカ合衆国・カリフォルニア・ 94403・サン・マテオ・ウエスト・サーテ ィーセヴンス・アヴェニュー・176 (72)発明者 ケヴィン・ピー・ベイカー アメリカ合衆国・メリーランド・20878・ ダーンスタウン・インディアン・ラン・ド ライブ・14006 (72)発明者 ジャン・チェン アメリカ合衆国・ニュー・ジャージー・ 08540・プリンストン・ヨーク・ドライ ブ・121 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA07 CA09 DA02 DA06 DA12 EA04 GA11 GA18 GA19 HA03 HA08 HA14 4B064 AG01 CA02 CA06 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA26X AA72X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4H045 AA10 AA20 BA10 BA41 CA40 DA75 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 図４（配列番号：７）に示したアミノ酸
    配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
    に少なくとも８０％配列同一性を有している単離した核
    酸。
  2. 【請求項２】 上記ヌクレオチド配列が、図３（配列番
    号：６）又はその相補体からなる群から選択されるヌク
    レオチド配列を含む請求項１記載の核酸。
  3. 【請求項３】 上記ヌクレオチド配列が、図３（配列番
    号：６）に示した配列の全長コード配列、又はその相補
    体からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む請
    求項１記載の核酸。
  4. 【請求項４】 受託番号ＡＴＣＣ２０９５０８の下に寄
    託したＤＮＡの全長コード配列を含む単離した核酸。
  5. 【請求項５】 請求項１記載の核酸を含むベクター。
  6. 【請求項６】 該ベクターで形質転換した宿主細胞によ
    り認識される制御配列に操作可能に結合した請求項５記
    載のベクター。
  7. 【請求項７】 請求項５記載のベクターを含む宿主細
    胞。
  8. 【請求項８】 上記細胞がＣＨＯ細胞である請求項７記
    載の宿主細胞。
  9. 【請求項９】 上記細胞が大腸菌である請求項７記載の
    宿主細胞。
  10. 【請求項１０】 上記細胞が酵母細胞である請求項７記
    載の宿主細胞。
  11. 【請求項１１】 ＰＲＯポリペプチドの製造方法であ
    り、上記ＰＲＯポリペプチドの発現のために好適な条件
    下で請求項７記載の宿主細胞を培養すること及びその細
    胞培養物からＰＲＯポリペプチドを回収することを含む
    方法。
  12. 【請求項１２】 図４（配列番号：７）に示したアミノ
    酸配列に少なくとも８０％配列同一性を有している単離
    した天然配列ＰＲＯポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 受託番号ＡＴＣＣ２０９５０８の下に
    寄託したヌクレオチドによってコードされたアミノ酸配
    列に少なくとも８０％配列同一性を有する単離したＰＲ
    Ｏポリペプチド。
  14. 【請求項１４】 異種アミノ酸配列に融合した請求項１
    ２記載のポリペプチドを含むキメラ分子。
  15. 【請求項１５】 上記異種アミノ酸配列が、エピトープ
    標識配列である請求項１４記載のキメラ分子。
  16. 【請求項１６】 上記異種アミノ酸配列が、免疫グロブ
    リンのＦｃ領域である請求項１４記載のキメラ分子。
  17. 【請求項１７】 図４（配列番号：７）に示したアミノ
    酸配列を含む、単離された天然ＰＲＯポリペプチド２４
    ３。
  18. 【請求項１８】 図４（配列番号：７）の残基２４乃至
    ９５４を含むアミノ酸配列を含む、天然シグナル配列を
    含まない単離された天然ＰＲＯポリペプチド２４３。
  19. 【請求項１９】 図４（配列番号：７）の残基２乃至９
    ５４を含むアミノ酸配列を含む、開始メチオニンを含ま
    ない単離された天然ＰＲＯポリペプチド２４１。
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