JP3786909B2 - ポリペプチド及び同じものをコードしている核酸 - Google Patents

ポリペプチド及び同じものをコードしている核酸 Download PDF

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Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は概して、新規のＤＮＡの同定及び単離、並びに当該ＤＮＡによりコードされる新規のポリペプチドの組換え体製造に関する。
【０００２】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】
細胞外タンパク質は、多細胞生物の形成、分化、及び維持に重要な役割を演じている。多くの個々の細胞の成り行き、たとえば増殖、移行、分化又は他の細胞との相互作用は、典型的には他の細胞及び／又は隣接した環境からの情報によって決定されている。この情報は分泌されるポリペプチド（例えば分裂促進因子、生存因子（survival factors）、細胞毒性因子、分化因子、神経ペプチド、ホルモン）により伝達されることが多いが、これは次に多様な細胞レセプター又は膜結合性タンパク質により受容されて翻訳される。これら分泌されたポリペプチド又は信号伝達分子は通常、細胞性の分泌経路を通って、細胞外環境の自身の活性部位に到達する。
【０００３】
分泌されたタンパク質には種々の工業的適用性があるが、これには薬剤、診断、バイオセンサー、及びバイオリアクターが含まれる。現在入手可能なタンパク質薬剤の多く、例えば血栓溶解薬、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー形成活性化因子、及び他の種々のサイトカインは、分泌性のタンパク質である。これらのレセプターは膜タンパク質であるが、これは治療剤又は診断薬としての可能性を有している。産業界及び学術界の双方ともに、新規の天然の分泌性タンパク質を同定する努力を行っている。多くの研究においては、哺乳動物の組換えＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、新規の分泌性タンパク質のコード配列を同定することに焦点をあてている。スクリーニングの方法及び技術の例は、文献に記載されている（例えば、Kleinら, Proc.Natl.Acad,Sci.,93:7108-7113(1996); 米国特許第5536637号を参照）。
【０００４】
膜に結合したタンパク質及びレセプターは、多細胞生物の形成、分化、及び維持において重要な役割を演じている。多くの個々の細胞の成り行き、たとえば増殖、移行、分化又は他の細胞との相互作用は、典型的には他の細胞及び／又は隣接した環境からの情報によって決定されている。この情報は分泌されるポリペプチド（例えば分裂促進因子、生存因子（survival factors）、細胞毒性因子、分化因子、神経ペプチド、ホルモン）により伝達されることが多いが、これは次に多様な細胞レセプター又は膜結合性タンパク質により受容されて解釈される。このような膜に結合したタンパク質及び細胞レセプターには、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞-細胞相互作用に関与するレセプター、及びセレクチンやインテグリン等の細胞付着分子が含まれるが、これらには限定されない。例えば、細胞の増殖及び分化を制御する信号の変換は、一部には種々の細胞性タンパク質のリン酸化により制御されている。プロテインチロシンキナーゼは、そのプロセスを触媒する酵素であるが、これはまた増殖因子レセプターとしても作用する。実例には、線維芽細胞増殖因子レセプター、及び神経増殖因子レセプターが含まれる。
【０００５】
膜に結合したタンパク質及びレセプター分子には、種々の工業的適用性があり、これには薬剤及び診断薬が含まれる。レセプター免疫付着因子は例えば、レセプター−リガンド相互作用を阻止する治療薬として使用することができる。膜に結合したタンパク質はまた、関連したレセプター／リガンド相互作用の潜在的なペプチド性又は小分子性の阻害剤のスクリーニングに使用することができる。産業界及び学術界の双方ともに、新規の天然のレセプタータンパク質を同定する努力をしている。これらの研究の多くは、哺乳動物の組換えＤＮＡライブラリーをスクリーニングして新規のレセプタータンパク質のコード配列を同定することに焦点を当てている。
【０００６】
本願では、新規の分泌性及びトランスメンブレンポリペプチド、並びに当該ポリペプチドをコードする新規の核酸の同定及び特徴付けを記載する。
【０００７】
１.ＰＲＯ２４１
軟骨組織は、コラーゲン繊維のネットワークが密であり、プロテオグリカンが高含量の大型の細胞外マトリックスを有する特殊な結合組織である。軟骨組織中のプロテオグリカンの大部分は、アグリカン（aggrecan）であるが、これには多くの硫酸コンドロイチン及び硫酸ケラチンの鎖が含まれていて、連結タンパク質でヒアルロナン（hyaluronan）に結合することにより多分子凝集物を形成するが、一方、軟骨組織にはまた、数多くの小分子量のプロテオグリカンが含まれている。これらの小分子量プロテオグリカンのうちの一つは、ビグリカン（biglycan）と呼ばれるタンパク質であるが、これは他の種々の軟骨組織（腱、強膜、皮膚等が含まれる）の細胞外マトリックスに広く分布しているプロテオグリカンである。ビグリカンは、ロイシン富反復配列と、二つの硫酸コンドロイチン／硫酸デルマタン鎖であって、フィブロネクチンの細胞結合性領域に結合してそれへの細胞付着を阻害する機能があることが知られている。ビグリカン等の小分子量プロテオグリカンが、軟骨組織の増殖及び／又は修復、並びに関節炎等の縮退性疾患において重要な役割を演じていることが推論されている。このようにして、ビグリカンに対しての相同性を有する新規のポリペプチドを同定して特徴づけることに興味が持たれている。
【０００８】
本願では、ビグリカンに対する相同性を有する新規のポリペプチドを同定及び特徴付けすることを記載するが、ここではそのポリペプチドをＰＲＯ２４１ポリペプチドと呼ぶ。
【０００９】
２．ＰＲＯ２４３
（アフリカツメガエルの）コルディン（chordin）（Xchr）は、潜在的に背側化（dorsalizing）活性を有しているシュペーマン編成原（Spermann organizer）により分泌される可溶性因子である（Sasaiら、Cell 79:779-90(1994);Sasaiら、Nature 376:333-36(1995)）。その編成原により分泌される他の背側化因子には、ノギン（noggin）（SmithとHarlan,Cell 70:829-840(1992) Lambら、Science 262:713-718(1993)）及びフォリスタチン（follistatin)（Hemmanti-Brivanlouら、Cell 77:283-295(1994)）がある。コルディンは、原始外胚葉を、神経対非神経領域に細分化して、中胚葉の背側化により脊索形成及び筋形成を誘導する。これは、腹側化性（ventralizing）ＢＭＰ−４シグナルのアンタゴニストとして機能することにより起こる。この阻害は、コルディンが細胞外空間においてＢＭＰ−４に直接的に結合することにより介在されるが、それによってＢＭＰ−４によるＢＭＰ−４レセプターの活性化を阻止する（Piccoloら、Develop.Biol.182:5-20(1996))。
【００１０】
ＢＭＰ−４は、胚の腹側から勾配がかかって発現しているが、一方、コルディンは、ＢＭＰ−４のものとは相補的な勾配で発現している。コルディンはＢＭＰ−４を拮抗して、ＢＭＰ−４勾配の低い側の末端を確立する。従って、コルディンからのシグナル、及び他の編成原により誘導される因子の間の釣り合いと、ＢＭＰシグナルとの対比によって、外胚葉性胚葉が、その腹側−背側位置情報とともに提供される。コルディンはまた、中枢神経系の腹側−背側パターン形成にも関与することがある（Sasaiら、Cell 79:779-90(1994)）。これは更に、前方神経組織（前脳タイプ）を排他的に誘導し、これにより神経タイプを前方化（anteriorizing）する（Sasaiら、Cell 79:779-90(1997)）。ニューロンの誘導とパターン形成において関与するので、コルディンは神経退行性疾患、及び神経損傷、例えば外傷によるもの、又は化学療法後におけるものの治療に有益であるかもしれない。
【００１１】
本願では、コルディンに相同性のある新規のポリペプチドの同定及び特徴付けを記載するが、ここでは当該ポリペプチドをＰＲＯ２４３ポリペプチドと称す。
【００１２】
３．ＰＲＯ２９９
切痕（notch）タンパク質は、発生におけるシグナリングに関与する。このタンパク質は非対称な発生のポテンシャルに影響し、発生に関与する他のタンパク質の発現の引き金となる（Robey,E.,Curr.Opin.Genet.Dev.,7(4):551(1997)，Simpson,P.,Curr.Opin.Genet.Dev.7(4):537(1997)，Blobel,CP.,Cell 90(4):589(1997)，Nakayama, H.ら、Dev.Genet.,21(1):21(1997)，Nakayama H.ら、Dev.Genet.,21(1):21(1997)，Sullivan,S.A.ら、 Dev. Genet., 20(3):208 (1997)，及びHayashi, H.ら、Int.J.Dev.Biol.,40(6):1089(1996)を参照）。切痕のセラーテ（Serrate）介在性活性化が、ショウジョウバエの翅の成虫盤の背側区画において観察されている（Flemingら、Development,124(15):2973(1997)）。切痕は、発生における役割、及びシグナリング能力の両方において興味深い。発生及び／又はシグナリングにおいて役割を有する新規のポリペプチドもまた、興味深い。
【００１３】
本願では、切痕タンパク質に相同性のある新規のポリペプチドの同定及び特徴付けを記載するが、ここではそのポリペプチドをＰＲＯ２９９ポリペプチドと称す。
【００１４】
４． ＰＲＯ３２３
ジペプチダーゼは、非常に多様な異なるジペプチドを開裂する酵素性タンパク質であって、哺乳動物及び哺乳動物以外の生物において非常に重要な数多くの生物学的プロセスに関与するものである。多様な異なる哺乳動物及び哺乳動物以外の生物から、数多くの異なるジペプチダーゼが同定され、また特徴付けられている。哺乳動物のジペプチダーゼは、数多くの生物学的プロセスにおいて重要な役割を有するが、これには例えば、タンパク質の消化、活性化、不活化、又はジペプチドホルモン活性の調節、並びにタンパク質及び酵素の物理的特徴の変化が含まれる。
【００１５】
ジペプチダーゼ酵素が有する重要な生理学的役割に鑑み、産業界及び学術界の双方は、新規の天然のジペプチダーゼの相同物を同定する努力をしている。多くの研究においては、哺乳動物の組換えＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、新規の分泌性且つ膜結合型のレセプタータンパク質のコード配列を同定することに焦点をあてている。スクリーニングの方法及び技術の例が、文献に記載されている（例えばKleinら、Proc.Natl.Acad.Sci.,93:7108-7113(1996) ; 米国特許第5536637号を参照）。
【００１６】
本願では、種々のジペプチダーゼ酵素に相同性である新規のポリペプチドであるＰＲＯ３２３ポリペプチドの同定及び特徴付けを記載する。
【００１７】
５．ＰＲＯ３２７
下垂体前葉ホルモンプロラクチンは、数多くの成長ホルモン／プロラクチン／胎盤性ラクトゲンの遺伝子ファミリーによりコードされている。哺乳動物においてはプロラクチンは主として、乳汁分泌及び乳腺の発達の原因となっている。プロラクチンは、遺伝子転写及びｍＲＮＡの半減期の双方を増大することにより乳タンパク質の遺伝子発現を刺激するように機能する。
【００１８】
プロラクチンタンパク質の生理学的影響は、プロラクチンが細胞表面のプロラクチンレセプターに結合する能力を通じて介在される。プロラクチンレセプターは、種々の異なる細胞種において見られ、また約４００００の分子量を有し、ジスルフィド結合により、それ自身又は他のサブユニットとは明らかに結合していない。プロラクチンレセプターのレベルは、研究対象の組織に応じて異なった制御のされかたをしている。
【００１９】
細胞表面レセプター分子は、インビボで重要な生理学的役割を有するので、産業界及び学術界はともに新規の天然の膜結合性レセプタータンパク質を同定することに現在注力しているが、この中にはプロラクチンレセプターと相同性のある配列を有すものが含まれる。これらの研究の多くは、哺乳動物の組換えＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、新規の膜結合性レセプタータンパク質のコード配列を同定することに焦点をあてている。スクリーニングの方法及び技術の例は、文献に記載されている（例えばKleinら、Proc.Natl.Acad.Sci.,93:7108-7113(1996); 米国特許第5536637号を参照）。
【００２０】
本願では、プロラクチンレセプタータンパク質に高い相同性を示す新規のポリペプチドであるＰＲＯ３２７ポリペプチドの同定及び特徴付けを記載する。
【００２１】
６．ＰＲＯ２３３
細胞の酸化還元状態が細胞の成り行きに関しての重要な決定要素であることが研究報告されている。更に、反応性の酸素種が、細胞毒性であって炎症性疾患を引き起こすが、これには組織の壊死、器官不全、アテローム性動脈硬化症、不妊症、出生時欠損、早期老化、突然変異及び悪性腫瘍が含まれる。従って、酸化と還元の制御は、数多くの理由により重要であるが、これには卒中、心臓発作、酸化ストレス及び高血圧症を制御及び予防することが含まれる。
【００２２】
酸素のフリーラジカル及び抗酸化剤は、脳虚血及び再潅流後の中枢神経系において重要な役割を有することがわかっている。更に、心臓障害は、虚血及び再潅流に関係付けられるが、これはフリーラジカルの作用により引き起こされることが報告されている。この点において、還元酵素、特にはオキシドレダクターゼは興味深いものである。更に、転写因子、ＮＦ−カッパＢ及びＡＰ−１は酸化還元状態により制御され、ＡＩＤＳ、癌、アテローム性動脈硬化症、及び糖尿病合併症の病原性に関与すると考えられている多様な遺伝子の発現に影響することが知られている。この主題について更に記載している刊行物には、Kelseyら、Br.J.Cancer,76(6):852-854(1997); FriedrichとWeiss, J.Theor.Biol.,187(4):529-540(1997); Pieulleら、J.Bacteriol.,179(18):5684-5692(1997)が含まれる。インビボでの酸化還元反応の生理学的重要性に鑑み、酸化還元反応に関与する新規の天然のタンパク質を同定する研究が現在進行中である。本願では、酸化還元酵素に相同性である新規のポリペプチドであって、ＰＲＯ２３３ポリペプチドと本願で称するものの同定及び特徴付けを記載する。
【００２３】
７．ＰＲＯ３４４
補体タンパク質は、血清タンパク質の大きな群を具備するが、その中のいくつかは酵素カスケードにおいて活性であり、炎症に関与するエフェクター分子を産生する。この補体タンパク質は、炎症に関与する細胞の移行と機能を制御することにおいて生理学的に特に重要である。炎症及びインビボでの関連した機構の生理学的重要性に鑑み、炎症に関与する新規の天然のタンパク質を同定する研究が現在進行中である。本願では、補体タンパク質に相同性がある新規のポリペプチドであって、本願でＰＲＯ３４４ポリペプチドと称するものの同定及び特徴付けについて記載する。
【００２４】
８．ＰＲＯ３４７
システイン富タンパク質は一般には、複雑な三次元構造を有し、及び／又はジスルフィド架橋を形成することが可能な数多くのシステイン残基が存在することにより多量体として存在するタンパク質である。
【００２５】
９．ＰＲＯ３５４
インター-アルファ-トリプシンインヒビター（ＩＴＩ）は、多くの哺乳動物の種において見られる、大型（Ｍｒがほぼ２４００００）の循環性プロテアーゼインヒビターである。この無傷のインヒビターは糖タンパク質であり、強力なグリコサミノグリカン結合により相互作用する３つのグリコシル化サブユニットからなる。ＩＴＩの抗-トリプシン活性は、複合体の最小のサブユニット（即ち軽鎖）に位置するが、ここで軽鎖は現在、ビクニン（bikunin）として知られている。成熟した軽鎖は、２１アミノ酸のＮ末端配列からなり、Ｓｅｒ-１０でグリコシル化され、その後にタンデムなカニッツ（Kunitz）タイプの領域が二つあって、そのうちの最初のものはＡｓｎ-４５でグリコシル化されていて、そのうちの第二のものはトリプシン、キモトリプシン、及びプラスミンを阻害することができる。ＩＴＩ複合体の残りの二つの鎖は、当該複合体の酵素的に活性な軽鎖と相互作用するように機能する重鎖である。
【００２６】
産業界及び学術界はともに、新規の天然のタンパク質を同定する研究を行っている。多くの研究は、哺乳動物の組換えＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、新規の分泌性、且つ膜結合型のレセプタータンパク質のコード配列を同定することに焦点をあてている。スクリーニングの方法及び技術は、文献に記載されいている（例えばKleinら、Proc.Natl.Acad.Sci.,93:7108-7113(1996);米国特許第5536637号を参照）。本願では、ＩＴＩ重鎖に高い相同性を有する新規のポリペプチドであって、本願でＰＲＯ３５４ポリペプチドと称するものの同定及び特徴付けを記載する。
【００２７】
１０．ＰＲＯ３５５
細胞毒性又は制御性Ｔ細胞連結分子、又は「ＣＲＴＡＭ」タンパク質は、免疫グロブリンスーパーファミリーと構造的に関連している。このＣＲＴＡＭタンパク質は種々の免疫反応を介在することができるはずである。抗体は、概して高親和性でＣＲＴＡＭに結合する（Zlotnik,A.,Faseb,106(6):A1037,Abr.216,1996年6月）。Ｔ細胞抗原、及びインビボでの免疫プロセスの生理学的重要性に鑑み、免疫反応に関与する新規の天然のタンパク質を同定する研究が現在進行中である。Kennedyら、米国特許第5686257(1997)も参照。本願では、ＣＲＴＡＭに相同性である新規のポリペプチドであって、本願ではＰＲＯ３５５ポリペプチドと称すものの同定及び特徴付けについて記載する。
【００２８】
１１．ＰＲＯ３５７
タンパク質-タンパク質相互作用には、レセプターと抗原との複合体、並びにシグナリング機構が含まれる。タンパク質-タンパク質相互作用の基礎となる構造的及び機能的機構がよりわかるにつれて、タンパク質-タンパク質相互作用をより容易に操作してタンパク質-タンパク質相互作用の特定の結果を制御することが容易になる。従って、タンパク質-タンパク質相互作用の基礎となる機構は、科学的にいっても、医学的にいっても興味深い。
【００２９】
ロイシン富反復配列を含むタンパク質は全て、タンパク質-タンパク質相互作用に関与すると考えられる。ロイシン富反復配列は、機能と細胞の位置とがともに多様である数多くのタンパク質中に存在する短い配列モチーフである。リボヌクレアーゼインヒビタータンパク質の結晶構造は、ロイシン富反復配列がベータ-アルファ構造単位に対応することを示している。これらの単位は、一の表面が溶媒に露出して、平行なベータシートを形成するようにして配列し、当該タンパク質が異常な非球状形態を獲得する。これらの二つの特徴は、ロイシン富反復配列のタンパク質結合性機能の原因となっていることが示されている。KobeとDeisenhofer,Trends Biochem.Sci.,19(10):415-421(1994年10月)を参照。
【００３０】
組織編成機能を有し、個体発生中にコラーゲン繊維の方向付け及び配置を行うものであって、創傷治癒、組織修復、及び腫瘍間質形成等の病理学的プロセスに関与するロイシン富プロテオグリカンについての研究が報告されている（Iozzo,R.V.,Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.,32(2):141-174(1997)）。ロイシン富タンパク質が、創傷治癒や組織修復に関連するとした他の研究には、出血性疾患であるベルナール-スリエ症候群に関連した複合体中のロイシン富モチーフ中に変異があることが報告されているDe La Salle.C.ら、Vouv.Rev.Fr.Hematol.(ドイツ),37(4):215-222(1995)、血小板にはロイシン富反復配列があることが報告されているChelemetson,K.J.,Thromb.Haemost.(ドイツ),74(1):111-116 (1995年7月)、形質転換増殖因子βへのデコリン（decorin）の結合が、癌の治療、創傷治癒及び傷跡に影響を与えることが報告されているLa Jolla Cancer Reseach FoundationのRuoslahti, E.I.ら、WO9110727-Aがある。このグループのタンパク質の機能により関連付けられるものには、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）があるが、これは創傷治癒に有益であり、結合組織、皮膚、及び骨等の組織の再増殖に関する治療に関係し、また、ヒト及び動物の体の成長を促進し、更には他の増殖関連プロセスを刺激するからである。ＩＧＦの酸不安定サブユニット（ＡＬＳ）は、ＩＧＦの半減期を増大し、またインビボでのＩＧＦ複合体の一部であることから興味が持たれる。
【００３１】
ロイシン富反復配列を有することが報告されている別のタンパク質には、アルツハイマー病や、パーキンソン病等における神経障害等の神経退行性疾患の治療や、癌の診断に有益であることが報告されているＳＬＩＴタンパク質がある（Yale University,Artavanistsakonas,S.とRothberg,J.M., WO9210518-A1を参照）。膜糖タンパク質であってマウスの脳のグリア細胞内で特異的に発現し、ロイシン富反復配列及び免疫グロブリン様領域を有しているＬＩＧ−１もまた興味が持たれている（Suzukiら、J.Biol.Chem.(U.S.),271(37):22522(1996)）。ロイシン富反復配列を有するタンパク質の生物学的機能について報告している他の研究には以下のものが含まれる：Tayar,N.ら、Mol.Cell Endocrinol.,(アイルランド),125(1-2):65-70(1996年12月)（精線刺激ホルモンの関与）；Miura,Y.ら、日本臨床 (日本),54(7):1784-1789 (1996年7月)（アポトーシスの関与）；Harris,P.C.ら、J.Am.Soc.Nephrol.,6(4):1125-1113(Oct. 1995年10月)（腎臓疾患の関与）。
【００３２】
従って、産業界及び学術界はともに、タンパク質-タンパク質相互作用をより良く理解するために、ロイシン富反復配列を有する新規のタンパク質を同定する研究を行っている。特に興味深いのは、ロイシン富反復配列を有し、例えばインスリン様増殖因子の酸不安定サブユニット等の、ロイシン富反復配列を有する既知のタンパク質に相同的であるタンパク質である。多くの研究が、哺乳動物の組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行って、ロイシン富反復配列を有する新規の分泌性、且つ膜結合型のタンパク質のコード配列を同定することに焦点をあてている。スクリーニングの方法及び技術は、文献に記載されている（例えばKleinら、Proc.Natl.Acad.Sci.,93:7108-7113(1996)；米国特許第5536637号を参照）。
【００３３】
本願では、インスリン様増殖因子の酸不安定サブユニットと相同性が高い新規のポリペプチドであって、本願ではＰＲＯ３５７ポリペプチドと称するものの同定及び特徴付けを記載する。
【００３４】
１２．ＰＲＯ７１５
哺乳動物における細胞数の制御は、一部には細胞増殖と細胞死との間のバランスにより決定されるものと考えられている。細胞死の一の形態は、時として壊死性細胞死と呼ばれるものであって、ある種の外傷や細胞障害から生じる細胞の病理学的形態により典型的に特徴付けられるものである。対照的に、別の「生理学上の」細胞死の形態であって、通常は整然とした、又は制御された方法で進行するものがある。この整然とした、又は制御された形態の細胞死は「アポトーシス」と呼ばれる（例えば、Barrら、Bio/Technology,12:487-493(1994)；Stellerら、Science,267:1445-1449(1995)）。アポトーシス性の細胞死は、多くの生理学的プロセスにおいて自然と起こるものであるが、これには胚の発生、免疫系におけるクローン選択が含まれる（Itohら、Cell,66:233-243(1991)）。アポトーシス性細胞死のレベルの低下は、癌、狼瘡、ヘルペスウイルス感染等の種々の病理学的状態に関連している（Thompson,Science,267:1456-1462(1995)）。アポトーシス性細胞死のレベルの増大は、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索萎縮症、多発性硬化症、色素性網膜炎、小脳退縮、再生不良性貧血、心筋梗塞症、卒中、再潅流障害、及び毒素誘導性肝臓疾患等の種々の病理的状態に関連する可能性がある（上記のThompsonを参照）。
【００３５】
アポトーシス性細胞死は、典型的には細胞における一以上の形態学的又は生化学的変化を伴っているが、これには例えば、原形質の凝結、細胞質膜微小絨毛の喪失、核の分割、染色体ＤＮＡの分解、又はミトコンドリア機能の喪失等がある。種々の外来性及び内因性のシグナルが、このような形態学的及び生化学的細胞変化を誘発、又は誘導すると考えられている（Raff,Nature,256:397-400(1992)；Steller,上記; Sachsら、Blood,82:15(1993)）。例えば、これらは未成熟な胸腺細胞のグルココルチコイドホルモン等のホルモン刺激により誘発される（Watanabe-Fukunagaら、Nature,356:314-317(1992)）。また、ｍｙｃ、ｒｅｌ、及びＥ１Ａ等の同定した癌遺伝子のいくつか、ｐ５３等の腫瘍抑制因子は、アポトーシスの誘導にかかわることが報告されている。ある種の化学療法剤、及び放射線のある形態のものは、同様にアポトーシス誘導活性があることが観察されている（上記のThompson）。
【００３６】
種々の分子、例えば腫瘍壊死因子-α（"TNF-α"）、腫瘍壊死因子−β（"TNF-β"又は"リンホトキシン-α"）、リンホトキシン-β（"LT-β"）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ-４０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド（Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも呼ばれる）、及びＡｐｏ-２リガンド（ＴＲＡＩＬとも呼ばれる）は、サイトカインの腫瘍壊死因子（"TNF"）ファミリーのメンバーであることが同定された（GrussとDower,Blood,85:3378-3404(1995);Pittiら、J.Biol.Chem.,271:12687-12690(1996); Wileyら、Immunity,3:673-682(1995);Browningら、Cell,72:847-856(1993);Armitageら、Nature,357:80-82(1992)）。これらの分子の中では、ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β、ＣＤ３０リガンド、４-ＩＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド、及びＡｐｏ-２リガンド（ＴＲＡＩＬ）が、アポトーシス性細胞死に関与することが報告されている。ＴＮＦ-αとＴＮＦ-βとはともに、感受性の腫瘍細胞においてアポトーシス性細胞死を誘導することが報告されている（Schmidら、Proc.Natl.Acad.Sci.,83,1881(1986); Deltryら、Eur.J.Immunol.,17,:689(1987)）。Zhengらは、ＴＮＦ-αがＣＤ８陽性Ｔ細胞の刺激後アポトーシスに関与することを報告している（Zhengら、Nature,377,348-351(1995)）。ＣＤ３０リガンドが、胸腺における自己反応性Ｔ細胞の削除に関与することが、他の研究者らにより報告されている（Amakawaら、Cold Spring Habor Laboratory Symposium on Programmed Cell Death,Abst.No.10,(1995)）。
【００３７】
マウスのＦａｓ／Ａｐｏ-１レセプター又はリガンド遺伝子（それぞれlpr、gldと呼ばれる）における変異は、いくつかの自己免疫疾患に関連しているが、これはＡｐｏ-１リガンドが、末梢における自己反応性リンパ球のクローン的削除において役割を演じている可能性を示している（Krammerら、Curr.Op.Immunol.,6:279-289(1994); Nagataら、Science,267:1449-1456(1995)）。Ａｐｏ-１リガンドはまた、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球及びＢリンパ球における刺激後のアポトーシスを誘導し、その機能がもはや必要とされない活性化リンパ球の除去に関与することが報告されている（Krammerら、上記、Nagataら、上記）。Ａｐｏ-１レセプターに特異的に結合する作動薬的マウスモノクローナル抗体は、細胞殺傷活性を呈することが報告されているが、これはＴＮＦ-αにおけるものに匹敵するか又は同等である（Yoneharaら、J.Exp.Med.,169:1747-1756 (1989)）。
【００３８】
このようなＴＮＦファミリーのサイトカインにより介在される種々の細胞性反応の誘導は、その特定の細胞レセプターへの結合により開始されると考えられている。約５５ｋＤａ（ＴＮＦＲ１）、及び約７５ｋＤａ（ＴＮＦＲ２）の、二つの別個のＴＮＦレセプターが同定されている（Hohmanら、J.Biol.Chem.264,14927-14934(1989); Brockhausら、Proc.Natl.Acad.Sci.,87:3127-3131(1990);EP 417563、1991年3月20日発行）。この両者のタイプのレセプターに対応するヒト及びマウスのｃＤＮＡも同定・特徴付けされている（Loetscherら、Cell,61:351(1990); Schallら、Cell,61:361(1990); Smithら、Science,248:1019-1023(1990); Lewisら、Proc.Natl.Acad.Sci.,88:2830-2834(1991); Goodwinら、Mol.Cell.Biol.,11:3020-3026(1991)）。これまでに同定されているＴＮＦファミリーのリガンドは、リンホトキシン-α以外は、ＩＩ型のトランスメンブレンタンパク質であり、そのＣ末端は細胞外にある。対照的に、これまでに同定されたＴＮＦレセプター（ＴＮＦＲ）における多くのレセプターは、Ｉ型のトランスメンブレンタンパク質である。しかしながら、ＴＮＦリガンド及びそのレセプターファミリーの双方においては、ファミリーメンバー間で同定された相同性は、主として細胞外領域（"ＥＣＤ"）において見いだされている。ＴＮＦファミリーサイトカインのいくつかには、ＴＮＦ-α、Ａｐｏ-１リガンド、及びＣＤ４０リガンドが含まれるが、これらは細胞表面においてタンパク質的分解により開裂され、それぞれの場合に得られるタンパク質は、典型的には可溶性のサイトカインとして機能するホモ三量体分子を形成する。ＴＮＦレセプターファミリータンパク質はまた、通常はタンパク分解的に開裂されて、同起源のサイトカインの阻害剤として機能することが可能な、可溶性のレセプターＥＣＤを放出する。
【００３９】
最近になって、ＴＮＦＲファミリーの他のメンバーが同定された。このような、ＴＮＦＲファミリーの新規に同定されたメンバーには、ＣＡＲ１、ＨＶＥＭ、及びオステオプロテゲリン（osteoprotegerin；ＯＰＧ）が含まれる（Brojatschら、Cell,87:845-855(1996); Montgomeryら、Cell,87:427-436(1996); Marstersら、J.Biol.Chem.,272:14029-14032(1997); Simonetら、Cell,89:309-319(1997)）。他の既知のＴＮＦＲ様分子とは異なり、Simonetら（上記）は、ＯＰＧが疎水性のトランスメンブレン-スパンニング配列を全く含まないことを報告している。
【００４０】
ＴＮＦファミリーのサイトカイン及びそのレセプターについてのレビューは、上記のGrussとDowerを参照。
【００４１】
本明細書においては、腫瘍壊死因子ファミリーのメンバーのポリペプチドと相同性を有する新規のポリペプチドであって、本願でＰＲＯ７１５ポリペプチドと称すものについての同定及び特徴付けについて記載する。
【００４２】
１３．ＰＲＯ３５３
補体タンパク質は、その一部が酵素的カスケードで作用して炎症に関与するエフェクター分子を産生する、一群の血清タンパク質から構成されている。補体タンパク質は、炎症に関与する細胞の移行及び機能を制御することにおいて特に重要である。インビボにおける炎症及び関連した機構の生理学的重要性に鑑み、炎症に関与する新規の天然タンパク質を同定するために現在研究が進行中である。本願では、補体タンパク質に相同性があり、本願でＰＲＯ３５３ポリペプチドと称す新規の天然のタンパク質を同定、及び特徴付けする。
【００４３】
１４．ＰＲＯ３６１
ムチンは、発癌に関与することが示唆されている糖タンパク質のファミリーである。ムチン及びムチン様タンパク質は、正常な細胞及び形質転換した細胞の双方により分泌される。癌の医学的重要性に鑑み、癌を診断又は治療するために有益となる新規の天然のタンパク質を同定する研究が現在進行中である。
【００４４】
キチナーゼタンパク質は、植物における病原性反応において関与が示唆されているファミリーを構成する。キチナーゼタンパク質は、植物及び微生物により産生され、植物の傷害に対する防御において役割を演じる可能性がある。植物の防御機構の重要性に鑑み、植物における病原性関連反応の調節に有益となりうる新規の天然のタンパク質を同定する研究が現在進行中である。本願では、ムチン及びキチナーゼに相同性の新規のポリペプチドであって、本願においてＰＲＯ３６１ポリペプチドと称したものについての同定及び特徴付けを記載する。
【００４５】
１５．ＰＲＯ３６５
ヒト２−１９タンパク質等のポリペプチドは、サイトカインとして機能することが可能である。サイトカインとは、免疫細胞の分化、増殖、又は機能を刺激若しくは阻害する、低分子量タンパク質のことである。サイトカインは、細胞内メッセンジャーとして作用することがよくあり、また多様な生理学的効果を有する。免疫機構のインビボでの生理学的重要性に鑑み、免疫系への影響に関与する新規の天然タンパク質を同定する研究が現在進行中である。本願においては、ヒト２-１９タンパク質に相同性があり、本願でＰＲＯ３６５ポリペプチドと称す新規のポリペプチドの同定及び特徴付けを記載する。
【００４６】
【課題を解決するための手段】
発明の要約
１．ＰＲＯ２４１
本願においては、ビグリカンタンパク質に相同性である新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンが同定されているが、これは本願においてはＰＲＯ２４１と呼ぶ。
【００４７】
一の態様において、本発明は、ＰＲＯ２４１ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備する、単離された核酸分子を提供する。一の例においては、単離された核散分子は、図２（配列番号：２）に示されるＰＲＯ２４１ポリペプチドのアミノ酸残基１乃至３７９をコードしたＤＮＡを具備するか、又はそのようなコードした核酸配列に相補的であって、少なくとも中等度、そして適宜高度なストリンジェンシー条件下で安定に結合したままであるものである。
【００４８】
別の態様において本発明は、単離されたＰＲＯ２４１ポリペプチドを提供する。本発明は特に、単離された天然のＰＲＯ２４１ポリペプチド配列を提供するが、一の態様においてこれは図２（配列番号：２）の残基１乃至３７９を具備するアミノ酸配列を含んでいる。本発明の別の態様は、Ｎ末端のシグナルペプチドを欠失したＰＲＯ２４１ポリペプチドに関するが、ここでＰＲＯ２４１ポリペプチドは、全長ＰＲＯ２４１のアミノ酸配列（配列番号：２）のアミノ酸のほぼ１６位乃至３７９位を具備している。
【００４９】
２．ＰＲＯ２４３
本願では、新規のポリペプチドであって、本願ではＰＲＯ２４３と称するものをコードしたｃＤＮＡ（ＤＮＡ35917-1207）が同定されている。
【００５０】
一の態様において本発明は、（ａ）図４（配列番号：７）に示されるアミノ酸２４乃至９５４の配列を具備するＰＲＯ２４３ポリペプチドをコードしたＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補足物、に少なくとも約８０％の配列相同性を有する、単離された核酸分子を提供する。配列相同性は好ましくは、約８５％であり、より好ましくは約９０％、最も好ましくは約９５％である。一の例において、単離された核酸は、図４（配列番号：７）に示されるアミノ酸残基１乃至９５４を有するポリペプチドと少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列相同性を有する。好ましくは、最高の相同性は、図４（配列番号：７）の４つの保存されたシステインクラスター内（アミノ酸５１乃至１２５；アミノ酸７０５乃至７６２；アミノ酸７８４乃至８４９；アミノ酸８９７乃至９３１）で起こる。別の態様においては、単離された核散分子は、図４（配列番号：７）のアミノ酸残基２４乃至９５４を有するＰＲＯ２４３ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備するか、又はそのようなコード性核酸配列に相補的であって中等度、そして適宜高度なストリンジェンシー条件下でそれに安定に結合したままのものである。別の例において本発明は、ＡＴＣＣ受託番号がＡＴＣＣ209508でＡＴＣＣに寄託されたクローンＤＮＡ35917-1207、或いはＡＴＣＣ受託番号がＡＴＣＣ209508で寄託されたクローンＤＮＡ35917-1207の全長タンパク質の核酸を提供する。
【００５１】
更に別の態様において本発明は、単離されたＰＲＯ２４３ポリペプチドを提供する。本発明は特に、単離された天然のＰＲＯ２４３ポリペプチドの配列を提供するが、これはその一の態様において図４（配列番号７）の残基２４乃至９５４を具備するアミノ酸配列を含んでいる。天然のシグナル配列（図４（配列番号：７）のアミノ酸１乃至２３）を有するか、又は有さず、そして開始メチオニンを有するか、又は有しない、天然のＰＲＯ２４３ポリペプチド配列が特に含まれる。或いは本発明は、受託番号ＡＴＣＣ209508で寄託された核酸によりコードされるＰＲＯ２４３ポリペプチドを提供する。
【００５２】
３．ＰＲＯ２９９
本願では、新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定されているが、本願では当該ポリペプチドをＰＲＯ２９９と称す。
【００５３】
一の態様において本発明は、ＰＲＯ２９９ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備する、単離された核酸分子を提供する。一の例において、当該単離された核酸は、図９（配列番号：１５）のアミノ酸残基１乃至７３７を有するＰＲＯ２９９ポリペプチドをコードしたＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコード核酸配列に対して相補的であり、少なくとも中等度、そして適宜高度なストリンジェンシー条件下ではそれに安定に結合したままのものである。
【００５４】
別の態様において本発明は、単離されたＰＲＯ２９９ポリペプチドを提供する。特に本発明は、単離された天然のＰＲＯ２９９ポリペプチド配列を提供するが、一の態様においてこれは、図９（配列番号：１５）の残基１乃至７３７を具備するアミノ酸配列を含む。本発明の別の態様は、ＰＲＯ２９９ポリペプチドの単離された細胞外領域に関する。
【００５５】
４．ＰＲＯ３２３
本願では、ミクロソームジペプチドタンパク質に相同性を有する新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンが同定されたが、本願では当該ポリペプチドをＰＲＯ３２３と称す。
【００５６】
一の態様において本発明は、ＰＲＯ３２３ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備する、単離された核酸分子を提供する。一の例において当該単離された核散分子は、図１３（配列番号：２４）のアミノ酸残基１乃至４３３を有するＰＲＯ３２３ポリペプチドをコードしたＤＮＡを具備しているか、又はこれはそのようなコード核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等度、そして適宜高度なストリンジェンシー条件下でそれに安定に結合したままのものである。
【００５７】
別の態様において本発明は、単離されたＰＲＯ３２３ポリペプチドを提供する。特に本発明は、単離された天然のＰＲＯポリペプチド配列を提供するが、一の態様においてこれは、図１３（配列番号：２４）の残基１乃至４３３を具備したアミノ酸配列を含む。
【００５８】
５．ＰＲＯ３２７
本願では、プロラクチンレセプターに相同性である新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンが同定されたが、本願ではこれをＰＲＯ３２７と称す。
【００５９】
一の態様において本発明は、ＰＲＯ３２７ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備する、単離された核散分子が提供される。一の例において、当該単離された核酸は、図１７（配列番号：３２）のアミノ酸残基１乃至４２２を有するＰＲＯ３２７ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備しているか、又はそのようなコード核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等度、そして適宜高度なストリンジェンシー条件下でそれに安定に結合したままのものである。
【００６０】
別の態様において本発明は、ＰＲＯ３２７ポリペプチドを提供する。特に本発明は、単離された天然のＰＲＯ３２７ポリペプチド配列を提供するが、一の態様においてこれは、図１７（配列番号：３２）の残基１乃至４２２を具備するアミノ酸配列を含む。
【００６１】
６．ＰＲＯ２３３
本願では、新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンが同定されたが、本願では当該ポリペプチドをＰＲＯ２３３と称す。
【００６２】
一の態様において本発明は、ＰＲＯ２３３ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備する、単離された核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離された核酸は、図１９（配列番号：３７）のアミノ酸残基１乃至３００を有するＰＲＯ２３３ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコード核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等度、そして適宜高度なストリンジェンシー条件下でそれに安定に結合したままのものである。
【００６３】
別の態様において、本発明は単離されたＰＲＯ２３３ポリペプチドを提供する。特に本発明は、単離された天然のＰＲＯ２３３ポリペプチド配列を提供するが、一の態様においてこれは、図１９（配列番号：３７）の残基１乃至３００を具備するアミノ酸配列を含む。
【００６４】
７．ＰＲＯ３４４
本願では、新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定されたが、本願では当該ポリペプチドをＰＲＯ３４４と称す。
【００６５】
一の態様において本発明は、ＰＲＯ３４４ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備する、単離された核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離された核酸は、図２１（配列番号：４２）のアミノ酸残基１乃至２４３を有するＰＲＯ３４４ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコード核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等度、そして適宜高度なストリンジェンシー条件下でそれに安定に結合したままのものである。
【００６６】
別の態様において、本発明は単離されたＰＲＯ３４４ポリペプチドを提供する。特に本発明は、単離された天然のＰＲＯ３４４ポリペプチド配列を提供するが、一の態様においてこれは、図２１（配列番号：４２）の残基１乃至２４３を具備するアミノ酸配列を含む。
【００６７】
８．ＰＲＯ３４７
本願では、システイン富分泌タンパク質−３に相同性である新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定されたが、本願では当該ポリペプチドをＰＲＯ３４７と称す。
【００６８】
一の態様において本発明は、ＰＲＯ３４７ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備する、単離された核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離された核酸は、図２３（配列番号：５０）のアミノ酸残基１乃至４５５を有するＰＲＯ３４７ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコード核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等度、そして適宜高度なストリンジェンシー条件下でそれに安定に結合したままのものである。
【００６９】
別の態様において、本発明は単離されたＰＲＯ３４７ポリペプチドを提供する。特に本発明は、単離された天然のＰＲＯ３４７ポリペプチド配列を提供するが、一の態様においてこれは、図２３（配列番号：５０）の残基１乃至４５５を具備するアミノ酸配列を含む。
【００７０】
９．ＰＲＯ３５４
本願では、インター-アルファ-トリプシンインヒビター（ＩＴＩ）の重鎖に相同性である新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定されたが、本願では当該ポリペプチドをＰＲＯ３５４と称す。
【００７１】
一の態様において本発明は、ＰＲＯ３５４ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備する、単離された核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離された核酸は、図２５（配列番号：５５）のアミノ酸残基１乃至６９４を有するＰＲＯ３５４ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコード核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等度、そして適宜高度なストリンジェンシー条件下でそれに安定に結合したままのものである。
【００７２】
別の態様において、本発明は単離されたＰＲＯ３５４ポリペプチドを提供する。特に本発明は、単離された天然のＰＲＯ３５４ポリペプチド配列を提供するが、一の態様においてこれは、図２５（配列番号：５５）の残基１乃至６９４を具備するアミノ酸配列を含む。
【００７３】
１０．ＰＲＯ３５５
本願では、新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定されたが、本願では当該ポリペプチドをＰＲＯ３５５と称す。
【００７４】
一の態様において本発明は、ＰＲＯ３５５ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備する、単離された核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離された核酸は、図２７（配列番号：６１）のアミノ酸残基１乃至４４０を有するＰＲＯ３５５ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコード核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等度、そして適宜高度なストリンジェンシー条件下でそれに安定に結合したままのものである。
【００７５】
別の態様において、本発明は単離されたＰＲＯ３５５ポリペプチドを提供する。特に本発明は、単離された天然のＰＲＯ３５５ポリペプチド配列を提供するが、一の態様においてこれは、図２７（配列番号：６１）の残基１乃至４４０を具備するアミノ酸配列を含む。
【００７６】
１１．ＰＲＯ３５７
本願では、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）の酸不安定サブユニット（ＡＬＳ）に相同性である新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定されたが、本願では当該ポリペプチドをＰＲＯ３５７と称す。
【００７７】
一の態様において本発明は、ＰＲＯ３５７ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備する、単離された核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離された核酸は、図２９（配列番号：６９）のアミノ酸残基１乃至５９８を有するＰＲＯ３５７ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコード核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等度、そして適宜高度なストリンジェンシー条件下でそれに安定に結合したままのものである。
【００７８】
別の態様において、本発明は単離されたＰＲＯ３５７ポリペプチドを提供する。特に本発明は、単離された天然のＰＲＯ３５７ポリペプチド配列を提供するが、一の態様においてこれは、図２９（配列番号：６９）の残基１乃至５９８を具備するアミノ酸配列を含む。
【００７９】
１２．ＰＲＯ７１５
本願では、腫瘍壊死因子ファミリーポリペプチドに相同性である新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定されたが、本願では当該ポリペプチドをＰＲＯ７１５と称す。
【００８０】
一の態様において本発明は、ＰＲＯ７１５ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備する、単離された核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離された核酸は、図３１（配列番号：７６）のアミノ酸残基１乃至２５０を有するＰＲＯ７１５ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコード核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等度、そして適宜高度なストリンジェンシー条件下でそれに安定に結合したままのものである。
【００８１】
別の態様において、本発明は単離されたＰＲＯ７１５ポリペプチドを提供する。特に本発明は、単離された天然のＰＲＯ７１５ポリペプチド配列を提供するが、一の態様においてこれは、図３１（配列番号：７６）の残基１乃至２５０を具備するアミノ酸配列を含む。
【００８２】
１３．ＰＲＯ３５３
本願では、新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定されたが、本願では当該ポリペプチドをＰＲＯ３５３と称す。
【００８３】
一の態様において本発明は、ＰＲＯ３５３ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備する、単離された核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離された核酸は、図３５（配列番号：８６）のアミノ酸残基１乃至２８１を有するＰＲＯ３５３ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコード核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等度、そして適宜高度なストリンジェンシー条件下でそれに安定に結合したままのものである。
【００８４】
別の態様において、本発明は単離されたＰＲＯ３５３ポリペプチドを提供する。特に本発明は、単離された天然のＰＲＯ３５３ポリペプチド配列を提供するが、一の態様においてこれは、図３５（配列番号：８６）の残基１乃至２８１を具備するアミノ酸配列を含む。
【００８５】
１４．ＰＲＯ３６１
本願では、新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定されたが、本願では当該ポリペプチドをＰＲＯ３６１と称す。
【００８６】
一の態様において本発明は、ＰＲＯ３６１ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備する、単離された核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離された核酸は、図３７（配列番号：９１）のアミノ酸残基１乃至４３１を有するＰＲＯ３６１ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコード核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等度、そして適宜高度なストリンジェンシー条件下でそれに安定に結合したままのものである。当該単離された核酸配列は、１９９８年２月５日にＡＴＣＣ209621として寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入物を具備していてもよいが、これはＰＲＯ３６１をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００８７】
別の態様において、本発明は単離されたＰＲＯ３６１ポリペプチドを提供する。特に本発明は、単離された天然のＰＲＯ３６１ポリペプチド配列を提供するが、一の態様においてこれは、図３７（配列番号：９１）の残基１乃至４３１を具備するアミノ酸配列を含む。本発明の別の態様は、図３７（配列番号：９１）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１乃至３７９を有するＰＲＯ３６１ポリペプチドの、単離された細胞外領域に関する。ＰＲＯ３６１ポリペプチドは適宜、入手するか、又は1998年2月5日にＡＴＣＣ209621として寄託されたベクター中のｃＤＮＡ挿入物によりコードされるポリペプチドを発現することにより手に入れることができる。
【００８８】
１５．ＰＲＯ３６５
本願では、新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定されたが、本願では当該ポリペプチドをＰＲＯ３６５と称す。
【００８９】
一の態様において本発明は、ＰＲＯ３６５ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備する、単離された核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離された核酸は、図３９（配列番号：９９）のアミノ酸残基１乃至２３５を有するＰＲＯ３６５ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコード核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等度、そして適宜高度なストリンジェンシー条件下でそれに安定に結合したままのものである。別の例においては、単利された核酸は、図３９（配列番号：９９）のアミノ酸残基２１乃至２３５を有するＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡを具備するか、又はそのようなコード核酸配列に相補的であって、少なくとも中等度、そして適宜高度なストリンジェンシー条件下でそれに安定に結合したままのものである。
【００９０】
別の態様において、本発明は単離されたＰＲＯ３６５ポリペプチドを提供する。特に本発明は、単離された天然のＰＲＯ３６５ポリペプチド配列を提供するが、一の態様においてこれは、図３９（配列番号：９９）の残基１乃至２３５を具備するアミノ酸配列を含む。本発明の別の態様は、図３９（配列番号：９９）のアミノ酸２１乃至２３５を具備するアミノ酸配列に関する。
【００９１】
１６．別の態様
本発明の別の態様においては、上記又は下記の何れかのポリペプチをコードするＤＮＡを具備したベクターが提供される。そのような何れかのベクターを具備した宿主細胞も提供される。例示としては、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌（E.coli）、又は酵母とすることができる。上記又は下記のポリペプチドを産生する方法が提供されるが、これは更に、宿主細胞を所望ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培養物より所望のポリペプチドを回収することを具備している。
【００９２】
別の態様において本発明は、上記又は下記の何れかのポリペプチドであって異種のポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したものを具備したキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例は、上記又は下記のいずれかのポリペプチドであって、エピトープ標識配列又は免疫グロブリンのＦｃ領域に融合したものである。
別の態様において、本発明は、上記又は以下に記載したポリペプチドの何れかに特異的に結合する抗体を提供する。任意に、該抗体はモノクローナル抗体である。
【００９３】
別の態様において本発明は、ゲノム及びｃＤＮＡのヌクレオチド配列を単離するのに有益なオリゴヌクレオチドのプローブを提供するが、ここで、そのプローブは上記又は下記の何れかのヌクレオチド配列に由来するものとすることができる。
【００９４】
【発明の実施の形態】
好適な実施態様の詳細な説明
Ｉ． 定義
ここで用い且つ数字の表記に直接続けられる場合に用語「ＰＲＯポリペプチド」と「ＰＲＯ」は、各種のポリペプチドに関し、ここでの完全な表記（即ち、ＰＲＯ／数字）は、ここに記載した特有のポリペプチド配列に関する。ここで用いる場合に用語「ＰＲＯ／数字ポリペプチド」及び「ＰＲＯ／数字」は、天然配列ポリペプチドとポリペプチド変異体（ここで更に定義される）を包含する。ここに記載したＰＲＯポリペプチドは、ヒト組織タイプから或いは別な供給源からのような各種の供給源から単離され、又は組換え或いは合成方法によって製造され得る。
【００９５】
「天然配列ＰＲＯポリペプチド」は、相当する天然から得られたＰＲＯポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列ＰＲＯポリペプチドは、天然物から単離することができ、又は組換え或いは合成によって製造することができる。用語「天然配列ＰＲＯポリペプチド」は、特異的ＰＲＯポリペプチドの自然発生端切り又は分泌形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、自然発生変異形（例えば、代替スプライス形）及びポリペプチドの自然発生アレル変異体を特に包含する。本発明の各種の実施態様において、天然配列ＰＲＯ２４１ポリペプチドは、図２（配列番号：２）のアミノ酸１から３７９を含む成熟又は全長天然配列ＰＲＯ２４１ポリペプチドであり、天然配列ＰＲＯ２４３は、Ｎ末端シグナル配列（残基１乃至約２３）を持つ或いは無しの、及び位置１で開始メチオニンを持つ或いは無しの、図４（配列番号：７）のアミノ酸２４乃至９５４を含む成熟又は全長天然配列ポリペプチドであり、天然配列ＰＲＯ２９９ポリペプチドは、図９（配列番号：１５）のアミノ酸１乃至７３７を含む成熟或いは全長天然配列ＰＲＯ２９９ポリペプチドであるか、又は天然配列ＰＲＯ２９９ポリペプチドは、全長ＰＲＯ２９９タンパク質の細胞外ドメインであり、但し全長ＰＲＯ２９９タンパク質の予測トランスメンブレンドメインは、図８に示したヌクレオチド２０２２で始まるヌクレオチドによってコードされ、天然配列ＰＲＯ３２３ポリペプチドは、図１３（配列番号：２４）のアミノ酸１乃至４３３を含む成熟或いは全長天然配列ＰＲＯ３２３ポリペプチドであり、天然配列ＰＲＯ３２７ポリペプチドは、図１７（配列番号：３２）のアミノ酸１乃至４２２を含む成熟或いは全長天然配列ＰＲＯ３２７ポリペプチドであり、天然配列ＰＲＯ２３３ポリペプチドは、図１９（配列番号：３７）のアミノ酸１乃至３００を含む成熟或いは全長天然配列ＰＲＯ２３３ポリペプチドであり、天然配列ＰＲＯ３４４ポリペプチドは、図２１（配列番号：４２）のアミノ酸１乃至２４３を含む成熟或いは全長天然配列ＰＲＯ３４４ポリペプチドであり、天然配列ＰＲＯ３４７ポリペプチドは、図２３（配列番号：５０）のアミノ酸１乃至４５５を含む成熟或いは全長天然配列ＰＲＯ３４７ポリペプチドであり、天然配列ＰＲＯ３５４ポリペプチドは、図２５（配列番号：５５）のアミノ酸１乃至６９４を含む成熟或いは全長天然配列ＰＲＯ３５４ポリペプチドであり、天然配列ＰＲＯ３５５ポリペプチドは、図２７（配列番号：６１）のアミノ酸１乃至４４０を含む成熟或いは全長天然配列ＰＲＯ３５５ポリペプチドであり、又は天然配列ＰＲＯ３５５は、全長ＰＲＯ３５５タンパク質の細胞外ドメインであり、但し全長ＰＲＯ３５５タンパク質の予測トランスメンブレンドメインは、図２６に示したヌクレオチド１１３８で始まるヌクレオチドによってコードされ、天然配列ＰＲＯ３５７ポリペプチドは、図２９（配列番号：６９）のアミノ酸１乃至５９８を含む成熟或いは全長天然配列ＰＲＯ３５７ポリペプチドであり、又は天然配列ＰＲＯ３５７ポリペプチドは、全長ＰＲＯ３５７タンパク質の細胞外ドメインであり、但し全長ＰＲＯ３５５タンパク質の予測トランスメンブレンドメインは、配列番号：６８のヌクレオチド１５１８−１５７２、或いは配列番号：６８の１４９１−１５７２によってコードされ、天然配列ＰＲＯ７１５ポリペプチドは、図３１（配列番号：７６）のアミノ酸１乃至２５０を含む成熟或いは全長天然配列ＰＲＯ７１５ポリペプチドであり、天然配列ＰＲＯ３５３ポリペプチドは、図３５（配列番号：８６）のアミノ酸１乃至２８１を含む成熟或いは全長天然配列ＰＲＯ３５３ポリペプチドであり、又は天然配列ＰＲＯ３５３ポリペプチドは、全長ＰＲＯ３５３タンパク質の細胞外ドメインであり、天然配列ＰＲＯ３６１ポリペプチドは、図３７（配列番号：９１）のアミノ酸１乃至４３１を含む成熟或いは全長天然配列ＰＲＯ３６１ポリペプチドであり、又は天然配列ＰＲＯ３６１ポリペプチドは、全長ＰＲＯ３６１タンパク質の細胞外ドメインであり、但し全長ＰＲＯ３６１タンパク質の予測トランスメンブレンドメインは、図３６に示したヌクレオチド１３６３で始まるヌクレオチドによってコードされ、及び天然配列ＰＲＯ３６５ポリペプチドは、図３９（配列番号：９９）のアミノ酸１乃至２３５を含む成熟或いは全長天然配列ＰＲＯ３６５ポリペプチドである。
【００９６】
ＰＲＯポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、トランスメンブレン及び細胞質ドメインの本質的にないＰＲＯポリペプチドの形態に関する。通例、ＰＲＯポリペプチドＥＣＤは、そのようなトランスメンブレン及び／又は細胞質ドメインの１％以内を有するであろうし、好ましくはそのようなドメインの０．５％以内を有するであろう。本発明のＰＲＯポリペプチド用に同定した何れかのドメインが疎水性ドメインのそのタイプを同定するために当該分野で通常利用される基準に従って同定されることが理解されるであろう。トランスメンブレンドメインの正確な境界は、変化し得るが、しかし初めに同定したようなドメインのいずれか一方の末端で約５アミノ酸以下が最もありそうに思われる。
【００９７】
「ＰＲＯポリペプチド変異体」は、ここに記載した全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列と少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性を有する上述の或いは後述の活性ＰＲＯポリペプチドを意味する。そのようなＰＲＯポリペプチド変異体は、例えば、１以上のアミノ酸残基がその全長天然アミノ酸配列のＰＲＯポリペプチドのＮ又はＣ末端で付加され、或いは欠失されるＰＲＯポリペプチドを含む。通例、ＰＲＯポリペプチド変異体は、ここに記載した全長天然アミノ酸配列のアミノ酸配列と少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％アミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９０％アミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９５％アミノ酸配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９９％配列同一性を有するであろう。
【００９８】
ＰＲＯ２４３変異体に関して、語句「ＰＲＯ２４３変異体」は、（ａ）その天然シグナル配列を持つ又は無しのＰＲＯ２４３ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体に対して少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性を有する後述した活性ＰＲＯ２４３を意味する。特有な実施態様において、ＰＲＯ２４３変異体は、全長天然配列ＰＲＯ２４３についての図４（配列番号：７）に示した推定アミノ酸配列を有するＰＲＯ２４３と少なくとも約８０％アミノ酸配列相同性を有する。そのようなＰＲＯ２４３変異体は、例えば、図４（配列番号：７）の配列のＮ或いはＣ末端で１以上のアミノ酸残基が付加、又は欠失されるＰＲＯ２４３ポリペプチドを含む。好ましくは、核酸或いはアミノ酸配列同一性は、少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％である。
【００９９】
ここで同定したＰＲＯポリペプチド配列に関して「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、必要であれば、最大パーセント配列同一性を達成するために、その配列のアライニング及びギャップ導入後、特異的ＰＲＯポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義され、且つ配列同一性の一部としていずれの保存的置換も考慮しない。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ，ＢＬＡＳＴ-２，ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを用いて、当業者の範囲内である各種の手法で達成することができる。好適なソフトウェアアライメントプログラムは、ＢＬＡＳＴである。当業者であれば、比較するべき配列の全長にわたり最大のアライメントを達成するために必要とされるいずれのアルゴリズムをも含む、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。
【０１００】
ここで同定した、ＰＲＯ-コード核酸配列に関して「パーセント（％）核酸配列同一性」は、必要であれば、最大パーセント配列同一性を達成するために、その配列のアライニング及びギャップ導入後、興味あるＰＲＯ核酸配列中のヌクレオチドと同じである候補配列中のヌクレオチドのパーセンテージとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ，ＢＬＡＳＴ-２，ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを用いて、当業者の範囲内である各種の手法で達成することができる。当業者であれば、比較するべき配列の全長にわたり最大のアライメントを達成するために必要とされるいずれのアルゴリズムをも含む、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。
【０１０１】
ここに開示した各種ポリペプチドを記述するために用いる場合、「単離した」とは、その天然環境の成分から同定及び分離及び／又は回収されているポリペプチドを意味する。その天然環境の不純成分は、そのペプチドの診断的又は治療的な使用を典型的に妨害するであろう材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク様又は非タンパク様溶質を含む。好適な実施態様において、該ポリペプチドは、（１）スピニングカップ配列決定装置の使用によってＮ末端の少なくとも１５残基或いは内部アミノ酸配列を得るために十分な度合まで、又は（２）クマシーブルー又は、好ましくは銀染色を用いた非還元又は還元条件下でＳＤＳ-ＰＡＧＥによって均質となるまで、精製されるであろう。単離したポリペプチドは、ＰＲＯポリペプチド天然環境の成分の少なくとも一つが存在しないであろうことから、組換え細胞内の原位置のポリペプチドを含む。通常、しかしながら、単離したポリペプチドは、少なくとも一の精製工程によって作製されるだろう。
【０１０２】
「単離した」ＰＲＯポリペプチド-コード核酸分子は、ＰＲＯポリペプチド核酸の天然供給源に普通に結合されることによって少なくとも一の不純核酸分子から同定され且つ分離される核酸分子である。単離したＰＲＯポリペプチド核酸分子は、天然で見出される形態又はセッティング以外のものである。単離したＰＲＯポリペプチド核酸分子は、従って、それが天然細胞に存在するような特異的ＰＲＯポリペプチド核酸分子と区別される。しかしながら、単離したＰＲＯポリペプチド核酸分子は、例えばその核酸分子が天然細胞のそれと異なる染色体配置中にある場合、ＰＲＯポリペプチドを普通に発現する細胞中に含んだＰＲＯポリペプチド核酸分子を含む。
【０１０３】
用語「制御配列」は、特有な宿主生体中の操作可能に結合したコード配列の発現のために必要なＤＮＡ配列に関する。原核生物のために好適な制御配列は、例えば、プロモーター、任意にオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを用いることが知られる。
【０１０４】
核酸は、それが別の核酸配列との機能的関係に置かれる場合「操作可能に結合(operably linked)」される。例えば、予備配列決定又は分泌リーダーのためのＤＮＡは、もしそれが該ポリペプチドの分泌に参与するプレタンパク質として発現されるならば、ポリペプチド用のＤＮＡに操作可能に結合される；プロモーターとエンハンサーは、もしそれが該配列の転写に影響を及ぼすならば、コード化配列に操作可能に結合される；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を促進するように配置されるならば、コード配列に操作可能に結合される。一般に「操作可能に結合」は、結合されるそのＤＮＡ配列が隣接され、且つ分泌リーダーのケースにおいては隣接し且つリーディング相中にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接されない。結合は、利便的な制限部位での結紮によって達成される。もしそのような部位が存在しないならば、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが通常の実施に従って使用される。
【０１０５】
用語「抗体」は、最も広い認識で用いられ、単純な抗-ＰＲＯポリペプチド、モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む）、及びポリエピトピック特異性を持つ抗-ＰＲＯポリペプチド抗体組成物を明確にカバーする。ここで用いた用語「モノクローナル抗体」は、実質上均一な抗体の集団から得られた抗体、即ちその集団に含まれる個別の抗体が少量で存在し得る自然発生変異の可能性を除いて同一であることに関する。
【０１０６】
ここで意図する「活性な」又は「活性」は、特異的な天然又は天然発生ＰＲＯポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＰＲＯポリペプチドの形態に関する。ＰＲＯ２４３によって示された通り、好適な活性は、コルディン(chordin)の活性に結合する及び影響を及ぼす、例えば阻止する又はその他の調整をするための能力であり、その活性は、好ましくは脊索(notochord)の調節と筋肉形成を含む。
【０１０７】
「治療」又は「治療する」は、治療的処置及び予防又は予防的手段の両方に関する。治療の必要なそれらは、疾患に既にかかっている、同じくその疾患が予防するべきものであるそれらの疾患を有する傾向にあるそれらを含む。
【０１０８】
治療の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家畜及び農業用動物、及び動物園の、スポーツの又は愛玩用動物を含み、例えばヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどの、哺乳動物として分類される何れかの動物に関する。好ましくは、ここでの哺乳動物はヒトである。
【０１０９】
ここで用いたような「担体」は、用いる用量と濃度でそれにさらされる細胞又は哺乳動物に無毒である、薬学上許容される担体、賦形剤、又は安定化剤を含む。しばしば生理学上許容される担体は、ｐＨ緩衝化水溶液である。生理学上許容される担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０分子以下）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含むモノサッカリド、ジサッカリド、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート化剤；マンニトール又はソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成カウンターイオン；及び／又はTWEENTM、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびPLURONICSTMのような非イオン性界面活性剤を含む。
【０１１０】
用語「アゴニスト」は、本発明の天然ＰＲＯポリペプチドのペプチド及び非-ペプチド類似物（天然ＰＲＯポリペプチドは、pro-ＰＲＯポリペプチド、pre-ＰＲＯポリペプチド、prepro-ＰＲＯポリペプチド、又は成熟ＰＲＯポリペプチドに関する）に関するとして及びそれが天然ＰＲＯポリペプチドの少なくとも１の生物学的活性を保持するという条件で、そのようなＰＲＯポリペプチドに特異的に結合する抗体に関して用いられる。好ましくは、本発明のアゴニストは、天然ＰＲＯポリペプチドの少なくとも１の性質上の結合認識特性及びレセプター活性化特性を保持する。
【０１１１】
用語「アンタゴニスト」は、本発明の天然ＰＲＯポリペプチドの生物学的活性を阻害する分子に関し、ここでの天然ＰＲＯポリペプチドは、pro-ＰＲＯポリペプチド、pre-ＰＲＯポリペプチド、prepro-ＰＲＯポリペプチド、又は成熟ＰＲＯポリペプチドに関する。好ましくは、ここでのアンタゴニストは、結合パートナーに対する本発明の天然ＰＲＯポリペプチドの結合を阻害する。ＰＲＯポリペプチド「アンタゴニスト」は、ＰＲＯアンタゴニストエフェクター機能を妨害する又は干渉する分子である（例えば、ＰＲＯポリペプチドによるＰＲＯポリペプチドレセプターの結合及び／又は活性化を妨害又は干渉する分子）。そのような分子は、例えば、試験アンタゴニスト分子の存在及び不在において天然ＰＲＯポリペプチドの結合をモニタリングすることによってＰＲＯポリペプチドレセプター活性化を競合的に阻害するその能力によってスクリーンすることができる。本発明のアンタゴニストはまた、ＰＲＯポリペプチド遺伝子に対するアンチセンスポリヌクレオチドも包含し、アンチセンスポリヌクレオチドがＰＲＯポリペプチド遺伝子の転写又は翻訳を阻止し、それによってその発現と生物学的活性を阻害する。
【０１１２】
「ストリンジェント条件」は、（１）洗浄のための低いイオン強度と高温を使う、例えば５０℃で0.015Mの塩化ナトリウム／0.0015Mのクエン酸ナトリウム／0.1%ドデシル硫酸ナトリウム；（２）ハイブリダイゼーションの間にホルムアミドのような変性剤を使う、例えば４２℃で、0.1%ウシ血清アルブミンとともに50%(vol/vol)ホルムアミド／0.1%のFicoll／0.1%ポリビニルピロリドン／750mMの塩化ナトリウム、75mMのクエン酸ナトリウムを伴う50mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.5を用いることを意味する。別な実例は、0.2xSSCと0.1%のSDS中４２℃での洗浄と共に、４２℃で50%ホルムアミド、5xSSC（0.75MのＮａＣｌ、0.075Mクエン酸ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム(pH6/8)、0.1%ピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード溶液、音波処理したサケ精子ＤＮＡ(50μg/ml)、0.1%ＳＤＳ、及び10%デキストラン硫酸の使用である。更に別な実例は、５５℃で10%デキストリン硫酸の緩衝液、2xSSC（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）と50%ホルムアミドを用いたハイブリダイゼーション、続いて５５℃でＥＤＴＡ含有0.1xSSCからなる高ストリンジェント洗浄である。
【０１１３】
「中等度にストリンジェントな条件」は、Sambrookら、上記、に記載され、且つ上述したよりも、より劣る洗浄液とハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中等度にストリンジェントな条件の実例は、20%ホルムアミド、5xSSC(150mMのＮａＣｌ、15mMのクエン酸三ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.6)、５ｘデンハード溶液、10%デキストラン硫酸、及び20mg/mLの変性し切断したサケ精子ＤＮＡを含む溶液中３７℃で一晩のインキュベーション、続いて約37-50℃で1xSSC中で該フィルターの洗浄、のような条件である。熟達した研究者であれば、プローブ長などのようなファクターを調整するために必要な、温度、イオン強度などをどのように調節するかを認識するであろう。
【０１１４】
「サザン分析」又は「サザンブロッティング」は、ＤＮＡ又はＤＮＡ含有組成物の制限エンドヌクレアーゼ消化においてＤＮＡ配列の存在が、既知の標識したオリゴヌクレオチド又はＤＮＡフラグメントへのハイブリダイゼーションによって確認される方法である。サザン分析は、典型的に、アガロースゲル上でのＤＮＡ消化物の電気泳動分離、電気泳動分離後のＤＮＡの変性、及びSambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)のセクション9.37-9.52に記載されたような、放射性標識した、ビオチン化した、又は酵素標識したプローブによる、ニトロセルロース、ナイロン又は分析用に好適な別の膜への該ＤＮＡの転移を含む。
【０１１５】
「ノーザン分析」又は「ノーザンブロッティング」は、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡ又はそのフラグメント、又はＲＮＡフラグメントのような既知のプローブにハイブリダイズするＲＮＡ配列を同定するために用いる方法である。そのプローブは、32Ｐのような放射性同位体、又はビオチン化によって、又は酵素によって標識される。分析するべきＲＮＡは、アガロース又はポリアクリルアミドゲル上で普通に電気泳動的に分離され、ニトロセルロース、ナイロン、又は他の適当な膜に転移し、さらにSambrookら、上記、のセクション7.39-7.52中に記載されたそれらのような当該分野で周知の標準技術を用いて、該プローブとハイブリダイズされる。
【０１１６】
ＩＩ．本発明の組成物と方法
１．全長ＰＲＯ２４１ポリペプチド
本発明は、ＰＲＯ２４１と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ２４１ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ２４１ポリペプチドの部分が各種のビグリカンタンパク質と顕著な相同性を有することを知見した。従って、本出願中に開示したＰＲＯ２４１ポリペプチドは、新たに同定されたビグリカン同族体ポリペプチドであり、且つビグリカンタンパク質の典型的な活性を所有し得るということをここに確信した。
【０１１７】
２．全長ＰＲＯ２４３ポリペプチド
本発明は、ＰＲＯ２４３と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ２４３ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、全長天然配列ＰＲＯ２４３（図４及び配列番号：７に示した）が、アフリカツメガエル及びXenopusコルディン(chordin)と５０％アミノ酸配列同一性を、及びラットコルディン(chordin)と７７％相同性を有することを知見した。従って、本出願中に開示したＰＲＯ２４３ポリペプチドは、コルディン(chordin)タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、且つ脊索に影響を及ぼすとともに中胚葉の背方化(dorsalization)による筋肉形成の能力を所有し得るということをここに確信した。
【０１１８】
３．全長ＰＲＯ２９９ポリペプチド
本発明は、ＰＲＯ２９９と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ２９９ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ２９９ポリペプチドの各部が、切痕(notch)タンパク質と顕著な相同性を有することを知見した。従って、本出願中に開示したＰＲＯ２９９ポリペプチドは、切痕タンパク質の新たに同定されたメンバーであり、且つ切痕タンパク質ファミリーの典型的なシグナリング特性を所有し得るということをここに確信した。
【０１１９】
４．全長ＰＲＯ３２３ポリペプチド
本発明は、ＰＲＯ３２３と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３２３ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３２３ポリペプチドの各部が、各種のジペプチダーゼタンパク質と顕著な相同性を有することを知見した。従って、本出願中に開示したＰＲＯ３２３ポリペプチドは、ジペプチダーゼ活性を有する新たに同定されたジペプチダーゼ同族体であるということをここに確信した。
【０１２０】
５．全長ＰＲＯ３２７ポリペプチド
本発明は、ＰＲＯ３２７と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３２７ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３２７ポリペプチドの部分が、各種のプロラクチンレセプタータンパク質と顕著な相同性を有することを知見した。従って、本出願中に開示したＰＲＯ３２７ポリペプチドは、新たに同定されたプロラクチンレセプター同族体であり、且つプロラクチンレセプタータンパク質の典型的な活性を有するということをここに確信した。
【０１２１】
６．全長ＰＲＯ２３３ポリペプチド
本発明は、ＰＲＯ２３３と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ２３３ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ２３３ポリペプチドの部分が、各種の還元酵素タンパク質と顕著な相同性を有することを知見した。本出願人はまた、ＰＲＯ２３３をコードしているＤＮＡが、線虫(Caenorhabditis elegans)からのタンパク質と顕著な相同性を有することも見出した。従って、本出願中に開示したＰＲＯ２３３ポリペプチドは、還元酵素ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、且つ還元酵素ファミリーの典型的な細胞の酸化還元状態に影響を及ぼす能力を所有するということをここに確信した。
【０１２２】
７．全長ＰＲＯ３４４ポリペプチド
本発明は、ＰＲＯ３４４と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３４４ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３４４ポリペプチドの部分が、ヒトとマウスの補体タンパク質(complement proteins)と顕著な相同性を有することを知見した。従って、本出願中に開示したＰＲＯ３４４ポリペプチドは、補体ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、且つタンパク質の補体ファミリーに典型的な炎症プロセスに影響を及ぼす能力を所有するということをここに確信した。
【０１２３】
８．全長ＰＲＯ３４７ポリペプチド
本発明は、ＰＲＯ３４７と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３４７ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３４７ポリペプチドの部分が、各種のシステイン-富分泌タンパク質(cysteine-rich secretory proteins)と顕著な相同性を有することを知見した。従って、本出願中に開示したＰＲＯ３４７ポリペプチドは、新たに同定されたシステイン-富分泌タンパク質であり、且つシステイン-富分泌タンパク質ファミリーの典型的な活性を所有し得るということをここに確信した。
【０１２４】
９．全長ＰＲＯ３５４ポリペプチド
本発明は、ＰＲＯ３５４と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３５４ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３５４ポリペプチドの部分が、インター-アルファ-トリプシンインヒビター重鎖タンパク質と顕著な相同性を有することを知見した。従って、本出願中に開示したＰＲＯ３５４ポリペプチドは、新たに同定されたインター-アルファ-トリプシンインヒビター重鎖タンパク質ということをここに確信した。
【０１２５】
１０．全長ＰＲＯ３５５ポリペプチド
本発明は、ＰＲＯ３５５と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３５５ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３５５ポリペプチドの各部が、ＣＲＴＡＭタンパク質と顕著な相同性を有することを知見した。本出願人はまた、ＰＲＯ３５５ポリペプチドをコードしているＤＮＡが、胸腺細胞活性化及び発育タンパク質、Ｈ２０Ａレセプター、Ｈ２０Ｂレセプター、ポリオウイルスレセプター及びオナガザル(Cercopithecus aethiops)ＡＧＭデルタ１タンパク質との相同性を有することも見出している。従って、本出願中に開示したＰＲＯ３５５ポリペプチドは、ＣＲＴＡＭタンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであるということをここに確信した。
【０１２６】
１１．全長ＰＲＯ３５７ポリペプチド
本発明は、ＰＲＯ３５７と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３５７ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３５７ポリペプチドの各部が、インスリン様成長因子の酸不安定サブユニットと顕著な相同性を有することを知見した。本出願人はまた、ＤＮＡ４４８０４-１２４８の非コード領域が、ＷＯ９５／１４７７２中に記載されたヒト遺伝子サイン(human gene signature)と整列(align)することも見出している。本出願人はさらに、ＤＮＡ４４８０４-１２４８の非コード領域が、DeuringとDoerfler,Gene,26:283-289(1983)中に記載されたアデノウイルス型1/2一組換えウイルスＤＮＡと整列することを見出している。コード領域相同性に基づいて、本出願中に開示したＰＲＯ３５７ポリペプチドは、タンパク質のロイシン富繰り返しファミリー(leucine rich repeat family)の新たに同定されたメンバーであり、且つ特に、インスリン様成長因子の酸不安定サブユニットに関連付けられるということをここに確信した。それだけでＰＲＯ３５７は、結合メカニズムに含まれ、且つ複合体の一部であろうと思われる。
【０１２７】
１２．全長ＰＲＯ７１５ポリペプチド
本発明は、ＰＲＯ７１５と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ７１５ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ７１５ポリペプチドの各部が、タンパク質の腫瘍壊死ファミリーの各種のメンバーと顕著な相同性を有することを知見した。従って、本出願中に開示したＰＲＯ７１５ポリペプチドは、タンパク質の腫瘍壊死因子の新たに同定されたメンバーであるということをここに確信した。
【０１２８】
１３．全長ＰＲＯ３５３ポリペプチド
本発明は、ＰＲＯ３５３と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３５３ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３５３ポリペプチドの各部が、ヒトとマウスの補体タンパク質(complement proteins)と顕著な相同性を有することを知見した。従って、本出願中に開示したＰＲＯ３５３ポリペプチドは、補体ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、且つタンパク質の補体ファミリーに典型的な炎症プロセスに影響を及ぼす能力を所有するということをここに確信した。
【０１２９】
１４．全長ＰＲＯ３６１ポリペプチド
本発明は、ＰＲＯ３６１と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３６１ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３６１ポリペプチドの各部が、ムチンとキチナーゼタンパク質と顕著な相同性を有することを知見した。従って、本出願中に開示したＰＲＯ３６１ポリペプチドは、ムチン及び／又はキチナーゼタンパク質の新たに同定されたメンバーであり、且つムチンとキチナーゼタンパク質のそれぞれに典型的な癌、植物病原性又はレセプター機能と関係付けできるということをここに確信した。
【０１３０】
１５．全長ＰＲＯ３６５ポリペプチド
本発明は、ＰＲＯ３６５と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述する実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３６５ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３６５ポリペプチドの各部が、ヒト２−１９タンパク質と顕著な相同性を有することを知見した。従って、本出願中に開示したＰＲＯ３６５ポリペプチドは、ヒト２−１９タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであるということをここに確信した。
【０１３１】
１６．ＰＲＯポリペプチド変異体
ここに記載した全長天然配列ＰＲＯポリペプチドに加えて、ＰＲＯポリペプチド変異体を調製できることが意図される。ＰＲＯポリペプチド変異体は、ＰＲＯポリペプチドＤＮＡに変えられる適切なヌクレオチドを導入することによって、或いは望まれるＰＲＯポリペプチドの合成によって調製することができる。当業者であれば、アミノ酸変更が、グリコシル化部位の数或いは位置を変更すること、又は膜固定(membrane anchoring)特性を変更することのような、ＰＲＯポリペプチドの後翻訳処理を変更し得ることを予期するであろう。
【０１３２】
天然全長配列ＰＲＯポリペプチドにおける又はここに記載したＰＲＯポリペプチドの各種ドメインにおける変異は、例えば米国特許第５３６４９３４号中に記載された保存的及び非保存的変異のための何れかの技術とガイドラインとを用いて行うことができる。変異は、天然配列ＰＲＯポリペプチドとの比較としてＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列における変化に帰結するＰＲＯポリペプチドをコードしている１以上のコドンの置換、欠失又は挿入とし得る。任意に、変異は、ＰＲＯポリペプチドの１以上のドメインにおいて少なくとも１のアミノ酸と何れかの他のアミノ酸との置換によるものである。望まれる活性に不利な影響を与えることなしに、アミノ酸残基が挿入され、置換され或いは欠失され得ることの測定におけるガイダンスは、知られたタンパク質分子に相同なそれと該ＰＲＯポリペプチドの配列とを比較すること及び高度に相同な領域で作られるアミノ酸配列変化の数を最小にすることによって見出すことができる。アミノ酸置換は、セリンによるロイシンの置換、即ち保存的アミノ酸置換のような、類似の構造及び／又は化学特性を有する別なアミノ酸によって１のアミノ酸を置換することの結果とすることができる。挿入又は欠失は、任意に、１乃至５アミノ酸の範囲内として良い。許容される変異は、該配列中のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に行うこと及び後述の実施例中に記載したインビトロアッセイにおいて活性について得られた変異体を試験することによって測定し得る。
【０１３３】
特有な実施態様において、重要な保存的置換が、好適な置換体の表題の下に表１中に示される。もしそのような置換が生物学的活性における変化に帰結するのであれば、より現実的な変化、表１中に示した典型的な置換体、又はアミノ酸分類に参照して更に後で記載したように導入され且つ生生成物がスクリーンされる。
【０１３４】
【表１】
Figure 0003786909
【０１３５】
ＰＲＯポリペプチドの機能或いは免疫学的同一性における実質上の改変は、（ａ）その置換の領域中のポリペプチドバックボーンの構造、例えばシート或いはヘリックスの立体配座としての、（ｂ）標的部位での該分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩、を維持することについてのその作用において有意に異なる置換体を選択することによって達成される。自然発生残基は、共通の側鎖特性に基づいてグループに分けられる：
（１）疎水性：ノルロイシン，ｍｅｔ，ａｌａ，ｖａｌ，ｌｅｕ，ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ，ｓｅｒ，ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ，ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ，ｇｌｎ，ｈｉｓ，ｌｙｓ，ａｒｇ；
（５）鎖の方位に影響する残基：ｇｌｙ，ｐｒｏ；及び
（６）芳香族性：ｔｒｐ，ｔｙｒ，ｐｈｅ。
【０１３６】
非保存性置換は、別なクラスによってこれらのクラスの１のメンバーを交換することを必要とするだろう。そのように置換した残基はまた、保存的置換部位に、又は、より好ましくは、保持されている（非-保存的）部位にも導入し得る。
【０１３７】
該変異は、オリゴヌクレオチド介在（部位特異的）変異誘発、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ変異誘発のような当該分野で周知の方法を用いて作製できる。部位特異的変異誘発[Carterら、Nucl. Acids Res.,13:4331(1986)；Zollerら、Nucl. Acids Res.,10:6487(1987)]、カセット変異誘導[Wellsら、Gene,34:315(1985)]、制限選択変異誘導[Wellsら、Philos.Trans.R.Soc.London SerA,317:415(1986)]、又は他の周知の技術は、望まれるＰＲＯポリペプチド変異体ＤＮＡを製造するためのクローン化ＤＮＡで実行できる。
【０１３８】
スキャニングアミノ酸分析はまた、隣接配列に従って１以上のアミノ酸を同定するために利用することができる。スキャニングアミノ酸の中で好適なものは、相対的に小さい、中性アミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、それがベータ炭素以外の側鎖がなく、しかもその変異体の主鎖構造を変更する可能性が少ないため、このグループの中で典型的に好ましいスキャニングアミノ酸である[CunninghamとWells、Science,244:1081-1085(1989)]。アラニンはまた、それが最も普通のアミノ酸であるため、典型的に好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方で頻繁に見出される[Creighton,The Proteins(W.H.Freeman & Co.,N.Y.);Chothia,J.Mol.Biol.,150:1(1976)]。もしアラニン置換が変異体の要求量を生じないならば、アイソテリックアミノ酸を使用することができる。
【０１３９】
１７．ＰＲＯポリペプチドの修飾
ＰＲＯポリペプチドの共有結合修飾物は、本発明の範囲内に含まれる。共有結合修飾の一つのタイプは、選択した側鎖又はＮかＣ末端残基と反応することができる有機誘導化剤によって、ＰＲＯポリペプチドの標的としたアミノ酸残基を反応させることを含む。二官能剤による誘導体化は、例えば抗-ＰＲＯポリペプチド抗体を精製するための方法において使用するために水不溶性支持体マトリックスに又は表面にＰＲＯポリペプチドを、及びその反対を架橋するために有用である。普通に使用される架橋剤は、例えば、1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4-アジドサリチル酸とのエステル、3,3'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオナート)のようなジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-1,8-オクタンのような二官能マレイミド、及びメチル-3-[(p-アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミダートのような剤を含む。
【０１４０】
他の修飾は、グルタミニルとアスパラギニル残基をそれぞれ相当するグルタミルとアスパルチル残基への脱アミド化、プロリンとリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基の水酸基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E.Creighton,Proteins: Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,pp.79-86(1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び何れかのＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０１４１】
本発明の範囲内に含まれるＰＲＯポリペプチドの共有結合修飾の別なタイプは、該ポリペプチドの天然グリコシル化パターンを変えることを含む。「天然グリコシル化パターンを変える」とは、天然配列ＰＲＯポリペプチド中で見出される１以上の炭水化物部分を欠失すること、及び／又は天然配列ＰＲＯポリペプチド中に存在しない１以上のグリコシル化部位を加えること、及び／又はグリコシル化部位に付着した糖残基の比率及び／又は組成を変えることを意味すると、ここでの目的のために意図される。
【０１４２】
ＰＲＯポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を変えることによって達成し得る。その変更は、例えば、天然配列ＰＲＯポリペプチドへの１以上のセリン又はトレオニン残基の付加、又はそれによる置換によって作製し得る（Ｏ-結合したグリコシル化部位の場合）。該ＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列は、特にコドンが望まれるアミノ酸に翻訳されるであろうようにそれが生成されるよう、予備選択した塩基で該ＰＲＯポリペプチドをコードしているＤＮＡを変異することによって、ＤＮＡレベルでの変更を通して任意に変更し得る。
【０１４３】
ＰＲＯポリペプチドポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加するための別の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学的又は酵素的カップリングによるものである。そのような方法は、当該分野において、例えば、1987年9月11日公開のＷＯ８７／０５３３０中に、及びAplinとWriston,CRC Crit.Rev.Biochem.,259-306頁(1981)中に記載されている。
【０１４４】
ＰＲＯポリペプチド上にある炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、又はグリコシル化のための標識として利用されるアミノ酸残基をコードしているコドンの突然変異的置換によって達成し得る。化学的な脱グリコシル化は、当該分野で周知であるとともに、例えば、Hakimuddinら、Arch.Biochem.Biophys.,259:52(1987)によって、及びEdgeら、Anal.Biochem.,118:131(1981)によって記載される。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的な切断は、Thotakuraら、Meth. Enzymol.,138:350(1987)により記載されたようなエンド-及びエキソ-グリコシダーゼの使用によって達成することができる。
【０１４５】
本発明のＰＲＯポリペプチドの共有結合修飾の別なタイプは、米国特許第４６４０８３５；４４９６６８９：４３０１１４４；４６７０４１７；４７９１１９２又は４１７９３３７号中に記載される手法において、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンのような各種の非タンパク様ポリマーの一つにＰＲＯポリペプチドを結合することを含む。
【０１４６】
本発明のＰＲＯポリペプチドはまた、別な、非相同ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＰＲＯポリペプチドを含むキメラ分子を形成する手法においても修飾され得る。一つの実施態様において、そのようなキメラ分子は、ＰＲＯポリペプチドと、抗-標識抗体(anti-tag antibody)が選択的に結合できるエピトープを提供する標識ポリペプチドとの融合体を含む。該エピトープ標識は一般に、ＰＲＯポリペプチドのアミノ又はカルボキシ末端に配される。そのようなエピトープ-標識形(epitope-tagged forms)の存在は、該標識ポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープ標識の提供は、エピトープ標識に結合する抗-標識抗体又は別なタイプのアフィニティーマトリックスを用いるアフィニティー精製によって容易に精製されるＰＲＯポリペプチドを可能にする。代わりの実施態様において、該キメラ分子は、ＰＲＯポリペプチドと、免疫グロブリンとの又は免疫グロブリンの特有な領域との融合を含み得る。キメラ分子の二価の形態のために、そのような融合はＩｇＧ分子のＦｃ領域までとすることができる。
【０１４７】
各種の標識ポリペプチドとそのそれぞれの抗体は、当該分野で良く知られる。実例は、ポリヒスチジン（ポリ-his）又はポリヒスチジングリシン(ポリ-his-gly)標識；ｆｌｕ ＨＡ標識ポリペプチドとその抗体１２ＣＡ５[Fieldら、Mol.Cell.Biol.,8:2159-2165(1988)]；ｃ-ｍｙｃ標識とそれの８Ｆ９，３Ｃ７，６Ｅ１０，Ｇ４，Ｂ７，及び９Ｅ１０抗体[Evanら、Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616(1985)]；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）標識及びその抗体[Paborskyら、Protein Engineering,3(6):547-553(1990)]を含む。他の標識ポリペプチドは、Ｆｌａｇ-ペプチド[Hoppら、BioTechnology,6:1204-1210(1988)]；ＫＴ３エピトープペプチド[Martinら、Science,255:192-194(1992)]；α-チューブリンエピトープペプチド[Skinnerら、J.Biol.Chem.,266:15163-15166(1991)]；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチド標識[Lutz-Freyermuthら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6393-6397(1990)]を含む。
【０１４８】
１８．ＰＲＯポリペプチドの調製
以下の記載は、ＰＲＯポリペプチド核酸を含むベクターによって形質転換した又はトランスフェクションした細胞を培養することによるＰＲＯポリペプチドの調製に本質的に関する。勿論、それはＰＲＯポリペプチドを製造するために利用し得る、当該分野で周知の方法で代替することが意図される。例えば、ＰＲＯポリペプチド配列、又はその一部は、固相技術を用いて直接ペプチド合成によって製造して良い[例えば、Stewartら、Solid-Phase Peptide Synthesis,W.H.Freeman Co.,San Francisco,CA,(1969); Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2154(1963)を参照]。インビトロタンパク質合成は、手動技術を用いて又は自動によって実施して良い。自動化合成は、例えば、製造者の指示に従ってApplied Biosystemsペプチドシンセサイザー(Foster City,CA)を用いて達成し得る。ＰＲＯポリペプチドの各部は、別々に化学合成し、全長ＰＲＯポリペプチドを製造するための化学的又は酵素的方法を用いて結合して良い。
【０１４９】
Ａ．ＰＲＯポリペプチドをコードしているＤＮＡの単離
ＰＲＯポリペプチドをコードしているＤＮＡは、ＰＲＯポリペプチドｍＲＮＡを持つとともに、それを検出可能なレベルで発現すると思われる組織から調製したｃＤＮＡライブラリーから得られる。従って、ヒトＰＲＯポリペプチドＤＮＡは、実施例中に記載したようなヒト組織から調製したｃＤＮＡライブラリーから利便的に得ることができる。ＰＲＯポリペプチド-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから、或いはオリゴヌクレオチド合成によって得ることもできる。
【０１５０】
ライブラリーは、興味ある遺伝子又はそれによってコードしたタンパク質を同定するために設計したプローブ（ＰＲＯポリペプチドに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチドのような）によってスクリーンすることができる。その選択したプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中に記載されるような標準手法を用いて処理し得る。望まれるＰＲＯポリペプチドをコードしている遺伝子を単離するための代替手段は、ＰＣＲ方法論を使用することである[Sambrookら、上記；Dieffenbachら、PCR Primer:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1995)]。
【０１５１】
後述の実施例は、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための技術を記載する。プローブとして選択したオリゴヌクレオチド配列は、擬陽性が最少化されるように十分な長さにすると共に十分に明白なものにすべきである。そのオリゴヌクレオチドは、それがスクリーンするべきライブラリー中のＤＮＡへのハイブリダイゼーションを検出できるように好ましくは標識される。標識化(labeling)の方法は、当該分野で周知であり、32Ｐ-標識したＡＴＰのような放射性標識、ビオチン化、又は酵素標識を含む。中等度ストリンジェンシー及び高度なストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件は、Sambrookら、上記、中に提供される。
【０１５２】
そのようなライブラリースクリーニング法で同定される配列は、寄託された及びＧｅｎＢａｎｋのような公共のデータベース又は他のプライベートな配列データベースで利用可能な他の周知の配列と比較し且つアライメントすることができる。その分子の定められた領域内の又は全長配列にわたる配列同一性（アミノ酸又はヌクレオチドレベルでの何れか一方）は、相同性を測定するため各種アルゴリズムを利用する、ＢＬＡＳＴ，ＡＬＩＧＮ，ＤＮＡｓｔａｒ，及びＩＮＨＥＲＩＴのようなコンピューターソフトウェアプログラムを用いた配列アラインメントを経て決定することができる。
【０１５３】
タンパク質コード配列を有する核酸は、初めてここに記載した推定アミノ酸配列を用いて、もし必要なら、プレカーサーを検出する及びｃＤＮＡに逆転写されていないｍＲＮＡの中間体を加工するために、Sambrookら、上記、中に記載したような通常のプライマー伸長法を用いて、選択したｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。
【０１５４】
Ｂ．宿主細胞の選択と形質転換
宿主細胞は、ＰＲＯポリペプチド作製用にここに記載した発現又はクローニングベクターによって形質転換され、そしてプロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は望まれる配列をコードしている遺伝子の増幅のために適切なように修正した通常の栄養培地中で培養される。培地、温度、ｐＨなどのような培養条件は、過度の実験なしに熟達した研究者であれば選択することができる。一般に、細胞培養の生産性を最大化するための原理、プロトコール、及び実践技術は、Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach,M.Butler,ed.(IRL Press,1991)及びSambrookら、上記、中に見出すことができる。
【０１５５】
トランスフェクションの方法は、例えば、ＣａＰＯ4とエレクトロポレーションのように、当業者に周知である。使用される宿主細胞に基づいて、形質転換は、そのような細胞に対して適切な標準技術を用いて実行される。Sambrookら、上記、に記載される塩化カルシウムを用いるカルシウム処理、又はエレクトロポレーションは、一般に原核生物又は本質的に細胞壁バリアを含む他の細胞用に使用される。アグロバクテリウム・チュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)による感染は、Shawら、Gene,23:315(1983)と1989年6月29日に公開されたＷＯ８９／０５８５９によって記載されるようなある種の植物細胞の形質転換のために使用される。そのような細胞壁を持たない哺乳動物細胞のためには、Grahamとvan der Eb,Virology,52:456-457(1978)のリン酸カルシウム沈殿法が利用できる。哺乳動物細胞宿主系形質転換の一般態様は、米国特許第４３９９２１６号中に記載されている。酵母における形質転換は典型的に、Van Solingenら、J.Bact.,130:946(1977)とHsiaoら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),76:3829(1979)の方法に従って行われる。しかしながら、核ミクロ注入、エレクトロポレーション、完全な細胞と細菌のプロトプラスト融合、ポリカチオン、例えばポリブレン又はポリオルニチン、のような細胞にＤＮＡを導入するための他の方法も使用し得る。哺乳動物細胞を形質転換するための各種の技術については、Keownら、Methods in Enzymology,185:527-537(1990)とMansourら、Nature,336:348-352(1988)を参照。
【０１５６】
ここでのベクターにおいてＤＮＡをクローニング又は発現するために好適な宿主細胞は、原核生物、酵母、又は高等な真核生物を含む。適当な原核生物は、真性細菌属に制限されることなく、グラム陰性又はグラム陽性生物、例えば大腸菌のようなエシェリキア属を含む。大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４(ATCC 31446)；大腸菌Ｘ１７７６(ATCC 31537)；大腸菌Ｗ３１１０株(ATCC 27325)；及びＫ５ ７７２(ATCC 53635)のような各種の大腸菌株が公的に利用可能である。他の好適な原核生物宿主細胞は、例えば大腸菌のようなエシェリキア属、エンテロバクター属、エルウイニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えばネズミチフス菌、セラティア属、例えば霊菌、及びシゲラ属のような腸内細菌科、同じくＢ．スブチリス、Ｂ．リケニホルミス（例えば、Ｂ．リケニホルミス４１Ｐは1989年4月12日に公開されたＤＤ２６６７１０中に開示される）のようなバチルス属、緑膿菌のようなシュードモナス属、及びストレプトマイセス属を含む。大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４(ATCC 31446)；大腸菌Ｘ１７７６(ATCC 31537)；大腸菌Ｗ３１１０株(ATCC 27325)；及びＫ５ ７７２(ATCC 53635)のような各種の大腸菌株が公的に利用可能である。これらの例示は、制限のためではなく説明のためである。Ｗ３１１０株は、それが組み換えＤＮＡ製品発酵のために普通の宿主株であるために特に好ましい宿主又は親の一つである。好ましくは、該宿主細胞は、最少量の蛋白分解酵素を分泌する。例えば、Ｗ３１１０株は、完全な遺伝子型tonAを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型tonA ptr3を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kanrを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７(ATCC 55244)；完全な遺伝子型tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanrを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性degT欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び1990年8月7日発行の米国特許第４９４６７８３号中に開示される変異ペリプラズミックプロテアーゼを有する大腸菌株を含むそのような宿主の実例とともに、該宿主に内因性のタンパク質をコードしている遺伝子中の遺伝的変異をもたらすように修正し得る。或いは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好適である。
【０１５７】
原核生物に加えて、糸状真菌又は酵母のような真核微生物が、ＰＲＯポリペプチドをコードしている核酸を含むベクターのための適当なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエは、普通に用いられる下等な真核宿主微生物である。しかしながら、多数の他の属、種、及び株が普通に利用でき且つここで有用である、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ(BeachとNurse, Nature, 290: 140(1981); 1985年5月2日公開のＥＰ１３９３８３)；クリベロマイセス宿主(米国特許第４９４３５２９号；Fleerら、Bio/Technology, 9:968-975(1991))例えばＫ．ラクチス(MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourtら、J. Bacteriol., 737(1983))、Ｋ．フラジリス(ATCC 12424)、Ｋ．ブルガリクス(ATCC 16045)、Ｋ．ウイッケラミイ(ATCC 24178)、Ｋ．ワルチ(ATCC 56500)、Ｋ．ドロソフィラルム(ATCC 36906; Van den Bergら、Bio/Technology, 8:135(1990)、Ｋ．サーモトレランス及びＫ．マキシアヌス；ヤロウィア(EP402226)；ピシア・パストリス(EP183070；Sreekrishnaら、J. Basic Microbiol., 28:265-278(1988))；カンジダ属；トリコデルマ・リーシア(EP244,234)；ニューロスポラ・クラシア(Caseら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263(1979))；シュヴァニオミセス属、例えばシュヴァニオミセス・オクシデンタリス(1990年10月31日公開のEP394538)；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ属、ペニシリウム属、トリポクラディウム属(1991年1月10日公開のWO91/00357)のような、及びアスペルギルス属宿主、Ａ．ニドランス(Ballanceら、Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289(1983); Tilburnら、Gene, 26:205-221(1983); Yeltonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474(1984))及びＡ．ニガー KellyとHynes, EMBO J., 4:475-479(1985)。メチロトロピック酵母がここでは好適であり、制限されることなしに、ハンセヌラ属、カンジダ属、クロエケラ属、ピシア属、サッカロミセス属、トルロプシス属及びロドトルラ属からなる属から選択されるメタノールで増殖可能な酵母を含む。酵母のこのクラスの例示である特有の種のリストは、C.Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269(1982)中に見出される。
【０１５８】
グリコシル化ＰＲＯポリペプチドの発現用に好適な宿主細胞は、多細胞生体から得られる。無脊椎動物細胞の実例は、ショウジョウバエＳ２とスポドプテラＳｆ９のような昆虫細胞、同じく植物細胞を含む。有用な哺乳動物宿主細胞系の実例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）とＣＯＳ細胞を含む。より特有な例は、ＳＶ４０によって形質転換したサル腎臓ＣＶ１系(ＣＯＳ-７,ATCC CRL 1651)；ヒト胚腎臓系(２９３又は懸濁培養での増殖用にサブクローンした２９３細胞、Grahamら、J.Gen Virol.,36:59(1977))；チャイニーズハムスター卵巣細胞/-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ、UrlaubとChasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980))；マウスセルトーリ細胞(ＴＭ４，Mather,Biol.Reprod.,23:243-251(1980))；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ATCC CCL 75)；ヒト肝臓細胞(Hep G2, HB 8065)；及びマウス乳癌(MMT 060562, ATCC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、当業者の範囲内と思われる。
【０１５９】
Ｃ．複製可能ベクターの選択と使用
ＰＲＯポリペプチドをコードしている核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は、クローニングのため（そのＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能ベクターに挿入し得る。各種のベクターが、公的に利用可能である。該ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とし得る。その適切な核酸配列は、各種の手法によって該ベクター内に挿入し得る。一般に、ＤＮＡは、当該分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター構成要素は、一般に、制限されることなしに、１以上のシグナル配列、複製の起点、１以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終止配列を含む。これらの１以上の構成要素を含む適当なベクターの構築は、熟達した研究者に周知である標準的な結紮技術を利用する。
【０１６０】
興味あるＰＲＯポリペプチドは、直接的にのみならず、シグナル配列又は成熟タンパク質又はポリペプチドのＮ末端で特異的切断部位を有する他のポリペプチドとし得る非相同ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして組み換えによって製造し得る。一般に、該シグナル配列は、ベクターの構成要素として良く、又はそれはベクターに挿入されるＰＲＯポリペプチド-コード化ＤＮＡの一部とし得る。該シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、又は心臓-安定エンテロトキシンIIリーダーのような原核生物のシグナル配列とし得る。酵母分泌用のシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(サッカロミセスとクリベロミセスα因子リーダーを含む、後者は米国特許第５０１０１８２号中に記載される)、又は酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンスグルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日公開のEP362179)、又は1990年11月15日公開のＷＯ９０／１３６４６に記載されたシグナルとして良い。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列は、同じ又は関連する種の分泌されたポリペプチドからのシグナル配列のようなタンパク質の直接分泌、同じくウイルス分泌リーダーに使用し得る。
【０１６１】
発現及びクローニングベクターの両方は、選択した宿主細胞の１以上の中でそのベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は、各種の細菌、酵母、及びウイルスについて良く知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製の起点は、大部分のグラム陰性細菌用に好適であり、２μプラスミド起点は、酵母用に好適であり、且つ各種のウイルス起点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、又はＢＰＶ)は、哺乳動物細胞中のクローニングベクターに有用である。
【０１６２】
発現及びクローニングベクターは、典型的に選択遺伝子、選択可能マーカーとも言われる、を含むであろう。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質又は他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、又はテトラサイクリンに対する耐性を与える、（ｂ）補充栄養要求性欠如、又は（ｃ）例えばバチルス属のＤ-アラニンラセマーゼをコードしている遺伝子のような、複合培地から利用可能でない臨界栄養源の供給、のタンパク質をコードする。
【０１６３】
哺乳動物細胞用の適当な選択マーカーの実例は、ＤＨＦＲ又はチミジンキナーゼのような、ＰＲＯポリペプチド-コード核酸を取り込むための感応細胞の同定を可能にするそれらである。野生型ＤＨＦＲが用いられる場合に適当な宿主細胞は、Urlaubら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980)によって記載されるように製造され且つ増殖された、ＤＨＦＲ活性が不足したＣＨＯ細胞系である。酵母において使用するために適当な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である[Stinchcombら、Nature,282:39(1979)；Kingsmanら、Gene, 7:141(1979)；Tschemperら、Gene,10:157(1980)]。該ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠いた酵母の変異株、例えば、ATCC No.44076又はPEP4-1用の選択マーカーを提供する[Jones,Genetics,85:12(1977)]。
【０１６４】
発現及びクローニングベクターは、ｍＲＮＡ合成を導くためのＰＲＯポリペプチドコード核酸配列に操作可能に結合したプロモーターを通例は含む。各種の可能性のある宿主細胞によって認識されるプロモーターは周知である。原核生物宿主で使用するために好適なプロモーターは、β-ラクタマーゼとラクトースプロモーター系[Changら、Nature,275:615(1978)；Goeddelら、Nature,281:544(1979)]、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系[Goeddel, Nucleic Acids Res.,8:4057(1980); EP36776]、及びｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーター[deBoerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:21-25(1983)]を含む。細菌系において使用するためのプロモーターは、ＰＲＯポリペプチドをコードしているＤＮＡに操作可能に結合したShine-Dalgarno(S.D.)配列をも含むであろう。
【０１６５】
酵母宿主で使用するために適当なプロモーター配列の実例は、３-ホスホグリセラートキナーゼ[Hitzemanら、J.Biol.Chem.,255:2073(1980)]又はエノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセラートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼのような他の解糖酵素[Hessら、J.Adv.Enzyme Reg.,7:149(1968);Holland,Biochemistry,17:4900(1978)]を含む。
【０１６６】
増殖状態によって制御される転写の更なる効果を有する誘導可能なプロモーターである、他の酵素プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関係する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトースとガラクトース利用のための応答可能な酵素のプロモーター領域である。酵母発現における使用のための適当なベクターとプロモーターは、ＥＰ７３６５７中に更に記載される。
【０１６７】
哺乳動物宿主細胞中のベクターからのＰＲＯポリペプチド転写は、例えばポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス(1989年7月5日公開のＵＫ２２１１５０４)、アデノウイルス(アデノウイルス２のような)、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びシミアンウイルス４０(SV40)のようなウイルスのゲノムから；非相同哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター；及び宿主細胞系と和合されるそのようなプロモーターを提供する、熱ショックプロモーター、から得られたプロモーターによって制御される。
【０１６８】
より高等な真核生物によるＰＲＯポリペプチドをコードしているＤＮＡの転写は、ベクターへのエンハンサー配列の挿入によって増加し得る。エンハンサーは、通常約１０から３００ｂｐまでのＤＮＡのシス-作用要素であり、その転写を増加するプロモーターに作用する。多くのエンハンサー配列が哺乳動物から現在知られている（グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトタンパク質、及びインスリン）。典型的に、しかしながら、それは真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーが使用されるだろう。実例は、複製起点の後の側上のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００−２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後方上のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーを含む。該エンハンサーは、ＰＲＯポリペプチドコード配列の位置５’又は３’でベクター内にスプライスされるが、しかし好ましくは該プロモーターから部位５’に配される。
【０１６９】
真核生物細胞（酵母、カビ、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物からの有核細胞）において使用される発現は、転写の終止のため及びｍＲＮＡを安定化するために必要な配列をも含むであろう。そのような配列は普通、真核生物又はウイルスＤＮＡｓ又はｃＤＮＡｓの５’及び時折３’非翻訳領域から利用可能である。これらの領域は、ＰＲＯポリペプチドをコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル化フラグメントとして転写したヌクレオチドセグメントを含む。
【０１７０】
組換え脊椎動物細胞培養におけるＰＲＯポリペプチドの合成への適合のために好適な更に他の方法、ベクター、及び宿主細胞は、Gethingら、Nature,293:620-625(1981); Manteiら、Nature,281:40-46(1979); EP117060;とEP117058中に記載される。
【０１７１】
Ｄ．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子増幅／発現は、直接試料で、例えば、ここに提供した配列に基づいて、適切に標識したプローブを用いて、通常のサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノーザンブロット法[Thomas, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:5201-5205(1980)]、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、又はin situハイブリダイゼーションで測定し得る。あるいは、抗体は、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク質二本鎖を含む特異的二本鎖を認識できるそれを利用し得る。その結果抗体は、標識されて良く、且つ該アッセイは、その二本鎖がその表面上に二本鎖の形成において、該二本鎖に結合した抗体の存在が検出できるように表面に結合される場合、実行し得る。
【０１７２】
あるいは遺伝子発現は、細胞の免疫組織学的染色又は組織切片のような免疫学的方法及び遺伝子生成物の発現を直接定量するため、細胞培養又は体液のアッセイによって測定し得る。流体試料の免疫組織学的染色のために有用な抗体は、モノクローナル又はポリクローナルのいずれかとして良く、また何れの哺乳動物においても作製し得る。利便的に、該抗体は、天然配列ＰＲＯポリペプチドに対して、又はここに提供したＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して又はＰＲＯポリペプチドＤＮＡと特異的抗体エピトープをコードしているものと融合した外因性配列に対して製造し得る。
【０１７３】
Ｅ．ポリペプチドの精製
ＰＲＯポリペプチドの形成物は、培地又は宿主細胞溶解物から回収し得る。もし膜に結合しているならば、それは適当な洗剤溶液(例えばTriton-X100)を用いて又は酵素的な切断によってその膜から離すことができる。ＰＲＯポリペプチドの発現において用いた細胞は、凍結-融解サイクル、音波処理、機械的粉砕、又は細胞溶解剤のような各種の物理的化学的手段によって破砕することができる。
【０１７４】
それは組換え細胞タンパク質又はポリペプチドからＰＲＯポリペプチドを精製するために望まれるであろう。以下の手法は、好適な精製手法の例示である：イオン交換カラムでの分画によって；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカでの又はＤＥＡＥのようなカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫安沈殿；例えばSEPHADEXTMG-75を用いたゲル濾過；ＩｇＧのような不純物を除去するためのプロテインＡSEPHAROSETMカラム；及びＰＲＯポリペプチドのエピトープ-標識化形を結合する金属キレート化カラム。タンパク質精製の各種の方法を用いて良く、さらにそのような方法は当該分野で周知であり、且つ、例えば、Deutscher,Methods in Enzymology,182(1990);及びScopes, Protein Purification: Principles and Practice (Springer-Verlag: New York,1982)中に記載される。選択した精製工程は、例えば使用した生生成物の及び生産した特有のＰＲＯポリペプチドの本質に基づくであろう。
【０１７５】
１９．ＰＲＯポリペプチドの使用
本発明のＰＲＯポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列（又はその相補体）は、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡとＤＮＡの生成においてハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含む、当該分野及び分子生物学の分野における各種の適用を有する。ＰＲＯポリペプチド-コード核酸は、ここに記載した組換え技術によってＰＲＯポリペプチドの製造用にも有用であろう。
【０１７６】
全長天然配列ＰＲＯポリペプチド-コード核酸又はその一部は、全長ＰＲＯポリペプチド遺伝子を単離するための、或いはＰＲＯポリペプチド核酸配列と同一の望まれる配列を有する、更に他の遺伝子（例えば、ＰＲＯポリペプチドの天然発生変異体又は他の種からのＰＲＯポリペプチド）を単離するためのｃＤＮＡライブラリー用のハイブリダイゼーションプローブとして使用し得る。任意に、該プローブの長さは、約２０乃至約５０塩基とされるであろう。該ハイブリダイゼーションプローブは、ここに開示した何れかのＤＮＡ分子のヌクレオチド配列から、或いは天然配列ＰＲＯポリペプチドコード化ＤＮＡのプロモーター、エンハンサー要素及びイントロンを含むゲノム配列から得ることができる。例えば、スクリーニング法は、約４０塩基の選択したプローブを合成するための周知のＤＮＡ配列を用いてＰＲＯポリペプチド遺伝子のコード化領域を単離することを含むであろう。ハイブリダイゼーションプローブは、32Ｐ又は35Ｓのような放射性ヌクレオチド、又はアビジン／ビオチン結合系に結合したアルカリホスファターゼのような酵素標識を含む、各種の標識によって標識し得る。本発明のＰＲＯポリペプチド遺伝子のそれに相補な配列を有する標識化プローブは、プローブをハイブリダイズするそのようなライブラリーのメンバーを決定するためヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーンするために使用することができる。ハイブリダイゼーション技術は、後述の実施例中に更に詳細に記載される。
【０１７７】
本出願中に開示したＥＳＴｓは、ここに開示した方法を用いて、プローブと同様に利用し得る。
【０１７８】
該プローブはまた、密接に関係したＰＲＯポリペプチド配列の同定のための配列のプールを生成するためのＰＣＲ技術においても利用し得る。
【０１７９】
ＰＲＯポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列はまた、ＰＲＯポリペプチドをコードするその遺伝子のマッピングのため及び遺伝的疾患を持つ個人の遺伝的分析のためのハイブリダイゼーションプローブを構築するためにも使用できる。ここに提供されたヌクレオチド配列は、in situハイブリダイゼーション、周知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリーによるハイブリダイゼーションスクリーニングのような周知技術を用い、染色体及び染色体の特有の領域にマッピングし得る。
【０１８０】
ＰＲＯポリペプチド用のコード配列が別なタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合に、該ＰＲＯポリペプチドは、そのリガンドを同定するためのアッセイにおいて使用することができる。同様に、レセプター／リガンド結合相互作用のインヒビターを同定することができる。そのような結合相互作用に含まれたタンパク質はまた、ペプチド又は小分子インヒビター又は結合相互作用のアゴニストをスクリーンするために使用することもできる。スクリーニングアッセイは、天然ＰＲＯポリペプチド又はＰＲＯポリペプチド用レセプターの生物学的活性を模倣するリード化合物を見出すために設計することができる。そのようなスクリーニングアッセイは、小分子薬剤候補を同定するために特に好適なそれらを作る、化合物ライブラリーの高スループットスクリーニングに服しやすいアッセイを含むであろう。意図される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。該アッセイは、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、免疫アッセイ及び当該分野において十分に特徴付けされる細胞ベースのアッセイを含む、各種の方式において実行することができる。
【０１８１】
ＰＲＯポリペプチド又は何れかのその修正された形態をコードしている核酸は、治療的に有効な試薬の開発又はスクリーニングにおいて、その結果有用であるトランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物の何れか一方を生産するためにも使用できる。トランスジェニック動物（例えばマウス又はラット）は、出生前の、例えば胎児段階で、トランスジーンがその動物に、又はその動物の親に導入された、トランスジーンを含む細胞を有する動物である。トランスジーンは、開発するトランスジェニック動物からの細胞のゲノム内に導入されるＤＮＡである。一つの実施態様において、ＰＲＯポリペプチドをコードしているｃＤＮＡは、ＰＲＯポリペプチドをコードしているＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を生成するために用いた確立した技術及びゲノムの配列に従いＰＲＯポリペプチドをコードしているゲノムＤＮＡをクローンするため使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラットのような動物を作製するための方法は、当該分野において通常的になされており、例えば米国特許第４７３６８６６と４８７０００９号中に記載される。典型的に、個々の細胞は、組織特異的エンハンサーによるＰＲＯポリペプチドトランスジーン組み込みのための標的とされるであろう。胎児段階でその動物の生殖細胞系に導入したＰＲＯポリペプチドをコードしているトランスジーンのコピーを含むトランスジェニック動物は、ＰＲＯポリペプチドをコードしているＤＮＡの増加した発現の作用を実験するために用いることができる。そのような動物は、例えば、それの過剰発現と関連した病的状態からの保護を与えることを通して試薬のためのテスター動物として使用することができる。本発明のこの態様に従い、動物はその試薬で治療され、その病的状態の可能性のある治療的な介入を示すであろう、該トランスジーンを持つ治療しない動物と比べて、病的状態の発生が減じられる。
【０１８２】
あるいは、「ノックアウト」動物は、該ポリペプチドをコードしている内因性遺伝子と、該動物の胚細胞に導入した同じポリペプチドをコードしている変更したゲノムＤＮＡとの間の相同組換えの結果として、興味あるＰＲＯポリペプチドをコードしている欠陥のある又は変更された遺伝子を有するものを構築することができる。例えば、ＰＲＯポリペプチドをコードしているｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ＰＲＯポリペプチドをコードしているゲノムＤＮＡをクローンするために用いることができる。ＰＲＯポリペプチドをコードしているゲノムＤＮＡの一部は、欠失されるか、或いはモニター組込みに用いることができる選択可能なマーカーをコードしている遺伝子のような、別な遺伝子と置換することができる。典型的に、変更していない隣接ＤＮＡの数キロ塩基（５’と３’での両方）は、ベクター中に含まれる[例えば、相同組換えベクターの記載についてのThomasとCapecchi,Cell,51:503(1987)を参照]。該ベクターは、胚の幹細胞系内に導入され（例えばエレクトロポレーションで）、内因性ＤＮＡで相同的に組み換えられている導入されたＤＮＡで細胞が選択される[例えば、Liら、Cell,69:915(1992)を参照]。選択した細胞は、次いで凝集キメラを形成するために動物（例えばマウス又はラット）の芽細胞に注入される[例えば、Bradley,Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach,E.J.Robertson,ed.(IRL,Oxford,1987),113-152頁中を参照]。キメラの胚は、適当な偽妊娠メス里親動物に移植することができ、その胚は「ノックアウト」動物が生成するまで成長させる。それの生殖細胞における相同的に組換えたＤＮＡを持った子孫は、標準的な技術によって同定することができ、相同的に組み換えたＤＮＡを含むその動物の全ての全ての細胞が動物繁殖に使用できる。ノックアウト動物は、例えば、ある種の病的状態に対して防御するその能力によって及びＰＲＯポリペプチドの不在のための病的状態のその進行によって特徴付けできる。
【０１８３】
ＰＲＯポリペプチドのインビトロ投与が利用される場合、正常な用量は、投薬のルートに基づいて、約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ動物体重又は１日当たりまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日乃至１０ｍｇ／ｋｇ／日に変更し得る。特有な用量とデリバリーの方法のためのガイダンスは、文献中に提供されている；例えば米国特許第４６５７７６０；５２０６３４４；又は５２２５２１２号を参照。異なる処方は、一つの器官又は組織を標的化する投与が、例えば別の器官又は組織のそれとは異なる手法でデリバリーを必要とするであろう異なる治療用化合物と異なる疾患のために有効となるであろう。
【０１８４】
ＰＲＯポリペプチドの徐放性投与がＰＲＯポリペプチドの必要とされる何れかの疾患或いは疾病の治療に好適な放出特性を持つ処方に望まれる場合、ＰＲＯポリペプチドのミクロカプセル化が企図される。遅延した放出用の組換えタンパク質のミクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、インターフェロン-（ｒｈＩＦＮ-）、インターロイキン-２、及びＭＮｒｇｐ１２０で成功裏に行われている。Johnsonら、Nat.Med.,2:795-799(1996);Yasuda,Biomed.Ther.,27:1221-1223(1993);Horaら、Bio/Technology,8:755-758(1990);Cleland,"Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems,"in Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach,Powell and Newman,eds,(Plenum Press:New York,1995)439-462頁；ＷＯ９７／０３６９２，ＷＯ９６／４００７２，ＷＯ９６／０７３９９；及び米国特許第５６５４０１０号。
【０１８５】
これらのタンパク質の徐放性処方は、その生物和合性及び広範な生物分解特性のため、ポリ-乳酸-共グリコール酸（ＰＬＧＡ）を用いて開発された。ＰＬＧＡ、乳酸及びグリコール酸の分解生成物は、ヒトの体内で迅速に分解できる。その上、このポリマーの分解は、その分子量と組成に基づいて、数ヶ月から数年まで調節することができる。Lewis,"Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer,"in:M.ChasinとR.Langer(Eds.),Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems(Marcel Dekker:New York,1990)1-41頁。
【０１８６】
例えば、８５ｋｇの最大体重を持った哺乳動物においてほぼ８０g/kg/日の用量を提供することができる処方のためには、最も多い用量は、１日当たりＰＲＯポリペプチドのほぼ６．８ｍｇとされるであろう。この用量レベルを達成するために、最も低いと思われる最初のバースト（＜２０％）とともに最大と思われる負荷タンパク質(15-20%w/wＰＲＯポリペプチド）を含む徐放性処方が必要である。１−２週間ミクロ粒子からのＰＲＯポリペプチドの継続（ゼロ-オーダー）放出もまた望まれる。加えて、放出すべき被包化タンパク質は、望まれる放出期間にわたりその形状及び安定性を維持すべきである。
【０１８７】
内因性ビグリカンタンパク質のそれに放出される生物学的活性を所有する本発明のＰＲＯ２４１ポリペプチドは、治療目的のインビボ及びインビトロの両方で利用し得る。当業者であれば、そのような目的のために本発明のＰＲＯ２４１ポリペプチドをどのように利用するかを十分に承知しているであろう。
【０１８８】
コルディン(chordin)（ＣＨＤ）は、示差的な顔の特徴(低い前毛髪線、眉毛叢生症、前傾の外鼻孔、上顎前突症、長い人中、こい口(carp mouth))、出生前又は出生後の成長遅延、精神遅延及び、しばしば、しかし常時ではない上肢奇形によって特徴付けられるコルネリア・ド・ランゲ症候群として知られる異形症候群のための候補遺伝子である。また、ＣＤＬが血小板減少症との関連において存在するレアケースもある。ＣＤＬの遺伝子は、3q26.3(OMIM#122470)への結合によってマップされている。初期アフリカツメガエル(early Xenopus)パターン化におけるＸｃｈｄ（アフリカツメガエルコルディン(Xenopus chordin)）包含及び神経系統発育は、興味のある候補遺伝子中にＣＨＤを作る。ＣＨＤは、染色体３上の適切な領域にマップされる。それはＴＨＰＯに非常に密接し、ＴＨＰＯとＣＨＤの両方を包含する欠失は、血小板減少症と発育異形症のレアケースに帰結できる。全成人組織の大部分がＣＨＤ発現に対して陰性である顕現したＣＤのin situ分析において、僅かに陽性のシグナルが、長い骨の発育と推定上の成長においてＣＨＤを関連させる大腿骨頭と寛骨臼（股関節）との間に形成される発育中の滑膜性の連結の割線において観測された。そのような機能は、もし混乱したならば、成長遅延をもたらすことができる。
【０１８９】
ｃＤＮＡから予測したヒトＣＨＤアミノ酸配列は、Ｘｃｈｄに５０％同一性（及び６６％保存された）である。４システイン-富ドメイン中の全ての４０システインが保存される。これらのシステイン富ドメインは、トロンボスポンジン、プロコラーゲン及びフォン・ビルブラント因子中で観測されたそれらに類似している。Bornstein,P.FASEB J 6:3290-3299(1992);Hunt,L.& Barker,W.Biochem.Biophys.Res.Commun.144:876-882(1987)。
【０１９０】
ヒトＣＨＤ座（ゲノムＰＲＯ２４３）は、ゲノムＤＮＡの９．６ｋｂ中に２３エキソンを含む。ＣｐＧ島は、５’及びエキソン１のほぼ１００ｂｐ５’で始まる５’で配置され、且つ該遺伝子の第１のイントロン内に第１のエキソンと末端を通して延長される。ＴＨＰＯとＣＨＤ配座は、その転写開始部位を分離するほぼ２．２ｋｂの頭−頭(head-to-head)形態で構成される。タンパク質レベルで、ＰＲＯ２４３は、アフリカツメガエルコルディン(Xchd)に５１％同一性である。１のアミノ末端と３のカルボキシ末端システイン-富クラスター中の４０システインの全てが保存される。
【０１９１】
ＰＲＯ２４３は、残基１乃至約２３でシグナル配列を有する９５４アミノ酸ポリペプチドである。４のシステインクラスター：（１）残基約５１乃至約１２５；（２）残基約７０５乃至約７６１；（３）残基約７８４乃至約８４９；及び（４）残基約８９７乃至約９３１、がある。残基約３１５乃至約３９６で潜在ロイシンジッパーと、残基２１７，３５１，３６５と４３４でＮ-グリコシル化部位がある。
【０１９２】
ＰＲＯ２９９ポリペプチドと切痕タンパク質に相同性を有するその部分は、インビボでの治療目的のために、同じく各種の他の適用のために有用となり得る。新規の切痕タンパク質と関連した分子の同定は、発育に作用するそれらのような多数のヒトの疾患に関連付けできる。かくして、新規切痕タンパク質と切痕様分子の同定は、そのようなタンパク質が、各種の異なるヒトの疾患のための潜在的な治療として奉仕し得るそれにおいて特に重要である。そのようなポリペプチドはまた、バイオテクノロジーと医学リサーチ同じく各種の工業的な適用において重要な役割を演じ得る。結果として、ＰＲＯ２９９のような新規の分子において特有な科学的及び医学的な興味がある。
【０１９３】
１以上の内因性ジペプチダーゼタンパク質のそれに関連した生物学的活性を所有する本発明のＰＲＯ３２３ポリペプチドは、治療的目的のためにインビボとインビトロの両方で利用し得る。当業者であれば、そのような目的のために本発明のＰＲＯ３２３ポリペプチドをどのように利用するか十分に承知しているだろう。
【０１９４】
内因性プロラクチンレセプタータンパク質のそれに関連した生物学的活性を所有する本発明のＰＲＯ３２７ポリペプチドは、治療的目的のためにインビボとインビトロの両方で利用し得る。当業者であれば、そのような目的のために本発明のＰＲＯ３２７ポリペプチドをどのように利用するか十分に承知しているだろう。プロラクチンに結合する能力を所有するＰＲＯ３２７ポリペプチドは、プロラクチンアンタゴニストとしてインビボとインビトロの両方で機能し得る。
【０１９５】
ＰＲＯ２３３ポリペプチドと還元酵素に相同性を有するその部分はまた、インビボでの治療目的のために、同じく各種の他の適用のために有用となり得る。新規の還元酵素タンパク質と関連した分子の同定は、炎症性疾患、器官不全、アテローム性動脈硬化症、心臓損傷、不妊症、出生時欠損、成熟前老化、ＡＩＤＳ、癌、糖尿病合併症及び一般の変異のような多数のヒトの疾患に関連付けできる。多数の疾患プロセスにおいて重要な役割を演じるように思える酸素フリーラジカルと抗酸化剤を与える新規還元酵素タンパク質と還元酵素様分子の同定は、そのようなタンパク質が、各種の異なるヒトの疾患のための潜在的な治療として奉仕し得るそれにおいて特に重要である。そのようなポリペプチドはまた、バイオテクノロジーと医学リサーチ同じく各種の工業的な適用において重要な役割を演じ得る。結果として、ＰＲＯ２３３のような新規の分子において特有な科学的及び医学的な興味がある。
【０１９６】
ＰＲＯ３４４ポリペプチドと補体(complement)タンパク質に相同性を有するその部分はまた、インビボでの治療目的のために、同じく各種の他の適用のために有用となり得る。新規補体タンパク質と関連分子の同定は、免疫系の細胞の炎症応答に作用するような多数のヒトの疾患に関連付けされる。かくして、新規補体タンパク質と補体様分子の同定は、そのようなタンパク質が、各種の異なるヒトの疾患のための潜在的な治療として奉仕し得るそれにおいて特に重要である。そのようなポリペプチドはまた、バイオテクノロジーと医学リサーチ同じく各種の工業的な適用において重要な役割を演じ得る。結果として、ＰＲＯ３４４のような新規の分子において特有な科学的及び医学的な興味がある。
【０１９７】
システイン-富分泌タンパク質のそれに関連した生物学的活性を所有する本発明のＰＲＯ３４７ポリペプチドは、治療的目的のためにインビボとインビトロの両方で利用し得る。当業者であれば、そのような目的のために本発明のＰＲＯ３４７ポリペプチドをどのように利用するか十分に承知しているだろう。
【０１９８】
インター-アルファ-トリプシンインヒビタータンパク質の重鎖のそれに関連した生物学的活性を所有する本発明のＰＲＯ３５４ポリペプチドは、治療的目的のためにインビボとインビトロの両方で利用し得る。当業者であれば、そのような目的のために本発明のＰＲＯ３５４ポリペプチドをどのように利用するか十分に承知しているだろう。
【０１９９】
ＰＲＯ３５５ポリペプチドとＣＲＴＡＭに相同性を有するその部分はまた、インビボでの治療目的のために、同じく各種の他の適用のために有用となり得る。Ｔ細胞に関連付けられる新規分子の同定は、一般に免疫系に含まれる病状のような多数のヒトの疾患に関連付けられる。多数の疾患プロセスにおいて重要な役割を演じるＣＲＴＡＭタンパク質結合抗体を与える、新規ＣＲＴＡＭタンパク質とＣＲＴＡＭ様分子の同定は、そのようなタンパク質が、各種の異なるヒトの疾患のための潜在的な治療として奉仕し得るそれにおいて特に重要である。そのようなポリペプチドはまた、バイオテクノロジーと医学リサーチ同じく各種の工業的な適用において重要な役割を演じ得る。結果として、ＰＲＯ３５５のような新規の分子において特有な科学的及び医学的な興味がある。
【０２００】
ＰＲＯ３５７は、ＡＬＳに関してその活性を測定するためにＡＬＳとの競合結合アッセイにおいて使用することができる。その上、ＰＲＯ３５７は、より長いインビボでの半減期を有するものに複合化し得るポリペプチドを延長するかを測定するためのアッセイにおいて使用することができる。ＰＲＯ３５７は、又それが相同性を有するカルボキシペプチダーゼとのアッセイにおいて同様に使用することができる。その結果は、それ相応に適用することができる。
【０２０１】
タンパク質の腫瘍壊死因子ファミリーのそれに関連した生物学的活性を所有する本発明のＰＲＯ７１５ポリペプチドは、治療的目的のためにインビボとインビトロの両方で利用し得る。当業者であれば、そのような目的のために本発明のＰＲＯ７１５ポリペプチドをどのように利用するか十分に承知しているだろう。ＰＲＯ７１５ポリペプチドは、それに特異的なレセプターに結合し、それによってそのようなレセプターを活性化することが予期される。本発明のＰＲＯ７１５ポリペプチドの変異体は、その特異的レセプター活性のアゴニスト或いはアンタゴニストとして機能し得る。
【０２０２】
ＰＲＯ３５３ポリペプチドと補体(complement)タンパク質に相同性を有するその部分はまた、インビボでの治療目的のために、同じく各種の他の適用のために有用となり得る。新規補体タンパク質と関連分子の同定は、免疫系の細胞の炎症応答に作用するような多数のヒトの疾患に関連付けされる。かくして、新規補体タンパク質と補体様分子の同定は、そのようなタンパク質が、各種の異なるヒトの疾患のための潜在的な治療として奉仕し得るそれにおいて特に重要である。そのようなポリペプチドはまた、バイオテクノロジーと医学リサーチ同じく各種の工業的な適用において重要な役割を演じ得る。結果として、ＰＲＯ３５３のような新規の分子において特有な科学的及び医学的な興味がある。
【０２０３】
ＰＲＯ３６１ポリペプチドと、ムチン及びキチナーゼタンパク質に相同性を有するその部分はまた、インビボでの治療目的のために、同じく各種の他の適用のために有用となり得る。新規ムチン及びキチナーゼタンパク質と関連分子の同定は、癌或いは細胞表面分子又はレセプターに含まれるそれらのような多数のヒトの疾患に関連付けされる。かくして、新規ムチン及びキチナーゼタンパク質の同定は、そのようなタンパク質が、各種の異なるヒトの疾患のための潜在的な治療として奉仕し得るそれにおいて特に重要である。そのようなポリペプチドはまた、バイオテクノロジーと医学リサーチ同じく各種の工業的な適用において重要な役割を演じ得る。結果として、ＰＲＯ３６１のような新規の分子において特有な科学的及び医学的な興味がある。
【０２０４】
ＰＲＯ３６５ポリペプチドと、ヒト２−１９タンパク質に相同性を有するその部分はまた、インビボでの治療目的のために、同じく各種の他の適用のために有用となり得る。新規ヒト２−１９タンパク質と関連分子の同定は、免疫系の細胞の結合或いは活性を調節するような多数のヒト疾患に関連付けられる。かくして、新規ヒト２−１９タンパク質とヒト２−１９タンパク質様分子の同定は、そのようなタンパク質が、各種の異なるヒトの疾患のための潜在的な治療として奉仕し得るそれにおいて特に重要である。そのようなポリペプチドはまた、バイオテクノロジーと医学リサーチ同じく各種の工業的な適用において重要な役割を演じ得る。結果として、ＰＲＯ３６５のような新規の分子において特有な科学的及び医学的な興味がある。
【０２０５】
２０．抗-ＰＲＯポリペプチド抗体
本発明は、さらに抗-ＰＲＯポリペプチド抗体を提供する。典型的な抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異的、及びヘテロ接合抗体を含む。
【０２０６】
Ａ．ポリクローナル抗体
本発明の抗-ＰＲＯポリペプチド抗体は、ポリクローナル抗体を含み得る。ポリクローナル抗体の製造方法は、熟達した研究者に周知である。ポリクローナル抗体は、例えば、免疫化剤の、及び望まれるなら、アジュバントとともに１回以上の注射によって哺乳動物中に生じさせることができる。典型的に、該免疫化剤及び／又はアジュバントは、多重皮下又は腹腔内注射によって該哺乳動物に注射されるであろう。該免疫化剤は、ＰＲＯポリペプチド又はその融合タンパク質を含み得る。それは、免疫化される哺乳動物において免疫原であることが知られたタンパク質に対する免疫化剤を接合するために有用となり得る。そのような免疫原性タンパク質の実例は、制限されることなしに、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、及びダイズトリプシンインヒビターを含む。利用し得るアジュバントの実例は、フロイント完全アジュバントとＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノマイコラート）を含む。該免疫化プロトコールは、過度の実験なしに当業者によって選択され得る。
【０２０７】
Ｂ．モノクローナル抗体
抗-ＰＲＯポリペプチド抗体は、それに代えてモノクローナル抗体とし得る。
モノクローナル抗体は、KohlerとMilstein,Nature,256:495(1975)によって記載されたそれらのようなハイブリドーマ法を用いて作製し得る。ハイブリドーマ法において、マウス、ハムスター、又は他の適当な宿主動物が、免疫化剤に特異的に結合するであろう抗体を生成する又は精製することができるリンパ球を引き出すための免疫化剤によって典型的に免疫化される。あるいは、該リンパ球はインビトロで免疫化し得る。
【０２０８】
該免疫化剤は、興味あるＰＲＯポリペプチド又はその融合タンパク質を典型的に含むであろう。一般に、もしヒト起源の細胞が望まれるなら末梢血液リンパ球("ＰＢＬｓ")が使用され、或いは非ヒト哺乳動物源が望まれるなら脾臓細胞又はリンパ節細胞が用いられる。該リンパ球は、次いでハイブリドーマ細胞を形成するために、ＰＥＧのような適当な融合化剤を用いて、不朽化細胞系に融合される[Goding,Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,Academic Press,(1986)59-103頁]。不朽化細胞系は、哺乳類細胞、特に齧歯類の骨髄腫細胞、ウシ、及びヒト起源が通例形質転換される。通例、ラット又はマウス骨髄腫細胞系が利用される。該ハイブリドーマ細胞は、融合していない不朽化細胞の増殖又は生存を阻害する１以上の物質を好ましくは含む適当な培養培地中で培養し得る。例えば、もしその親細胞が酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠くならば、そのハイブリドーマ用の培養培地は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を阻害する物質、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを典型的に含むであろう(「ＨＡＴ培地」)。
【０２０９】
好ましい不朽化細胞系は、十分に融合する、選択した抗体生産細胞によって抗体の安定な抗レベル発現を支持する、且つそのようなＨＡＴ培地のような培地に感受性であるそれらである。より好ましい不朽化細胞系は、例えば、Salk Insitute Cell Distribution Center,San Diego,California,及びAmerican Type Culture Collection,Rockville,Marylandから得ることができるネズミ骨髄腫系である。ヒト骨髄腫及びマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞系はまた、ヒトモノクローナル抗体の生産のために記載されている[Kozbor, J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeurら、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Marcel Dekker,Inc.,New York,(1987)51-63頁]。
【０２１０】
ハイブリドーマが培養される培養培地は、次いで興味あるＰＲＯポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在について測定することができる。好ましくは、該ハイブリドーマ細胞によって製造されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素免疫吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)のようなインビトロ結合アッセイによって測定される。そのような技術と測定法は、当該分野で周知である。該モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、MunsonとPollard,Anal.Biochem.,107:220(1980)のスキャッチャード分析によって測定することができる。
【０２１１】
望まれるハイブリドーマが同定された後、そのクローンは、制限希釈法と標準法による増殖によってサブクローンし得る[Goding,上記]。この目的のための適当な培養培地は、例えば、Dulbecco's修正イーグル培地とＲＰＭＩ-１６４０培地を含む。あるいは、該ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物中の腹水としてインビボで増殖し得る。
【０２１２】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-Sepharose、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような通常の免疫グロブリン精製法によって培地又は腹水液から単離又は精製し得る。
【０２１３】
モノクローナル抗体はまた、米国特許第４８１６５６７号中に記載されるそれらのような組換えＤＮＡ法によっても作製し得る。本発明のモノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、通常の手法（例えば、ネズミ抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）を用いて容易に単離及び配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として利用される。一度単離した該ＤＮＡは、発現ベクターの中に組み込むことができ、次いで組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得るため、他の免疫グロブリンタンパク質を生産しない類人猿ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞のような宿主細胞内にトランスフェクトされる。そのＤＮＡはまた、例えば相同ネズミ配列[米国特許第４８１６５６７号；Morrisonら、上記]の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列で置換することにより、又は非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列の全部又は一部を免疫グロブリンコード化配列に共有結合接続することによって修正され得る。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインを置換することができ、又はキメラ二価抗体を創造するように本発明の抗体の１の抗原結合部位の可変領域と置換することができる。
【０２１４】
該抗体は、一価抗体とし得る。一価抗体を製造するための方法は、当該分野で周知である。例えば、一つの方法は、免疫グロブリン軽鎖と修正した重鎖との組換え発現を含む。該重鎖は、重鎖架橋化を防ぐため、Ｆｃ領域中の何れかのポイントで一般に端切りされる。あるいは、関係のあるシステイン残基は、他のアミノ酸残基で置換され又は架橋を防ぐために欠失される。
【０２１５】
インビトロでの方法はまた、一価抗体を調製するためにも適当である。そのフラグメント、特にＦａｂフラグメントを生産するための抗体の消化は、当該分野において知られたルーチンの技術を用いて達成することができる。
【０２１６】
Ｃ．ヒト化抗体
本発明の抗-ＰＲＯポリペプチド抗体は、ヒト化抗体又はヒト抗体をさらに含む。非ヒト(例えばネズミ)抗体のヒト化形は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又は非-ヒト免疫グロブリンから得られる最小配列を含むそのフラグメント(Fv,Fab,Fab',F(ab')2、又は抗体の他の抗原結合配列のような)である。
ヒト化抗体は、レセプターの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、望まれる特異性、親和性、及び用量を有する、マウス、ラット、又はウサギのような非-ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲからの残基によって置換されるヒト免疫グロブリン（レセプター抗体）を含む。いずれかの場合、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、相当する非ヒト残基と置換される。ヒト化抗体はまた、該レセプター抗体中にも、或いは移入したＣＤＲ又はフレームワーク配列中にも見出されない残基を含み得る。一般に、該ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンのそれに相当するＣＤＲ領域の全て又は実質上全て、及びＦＲ領域の全て又は実質上全てがヒト免疫グロブリン共通配列のそれである可変領域の少なくとも１，及び典型的には２の実質上全てを含むであろう。ヒト化抗体は、好ましくは免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも部分をも含むであろう[Jonesら、Nature,321:522-525(1986)；Riechmannら、Nature,332:323-329(1988)；及びPresta, Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)]。
【０２１７】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野において周知である。一般に、ヒト化抗体は、ヒトでない供給源からそれに導入した１以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「移入」可変領域から典型的に取られる「移入」残基として関係する。ヒト化は、ヒト抗体の相当する配列で齧歯類ＣＤＲｓ又はＣＤＲ配列を置換することによって、Winterと共同研究者の方法[Jonesら、Nature 321,522-525(1986);Riechmannら、Nature,332,323-327(1988);Verhoeyenら、Science 239,1534-1536(1988)]に従い本質的に実行される。従って、そのような「ヒト化した」抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４８１６５６７号）、完全なヒト可変領域よりも実質上劣るものが非ヒト種からの相当する配列により置換されている。実際、ヒト化した抗体は幾つかのＣＤＲ残基と可能性のある幾つかのＦＲ残基が齧歯類中の類似部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【０２１８】
ヒト化抗体はまた、ファージディスプレーライブラリーを含む、当該分野で周知の各種の技術を用いて製造することもできる[HoogenboomとWinter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marksら、J.Mol.Biol.,222:581(1991)]。Coleら及びBoernerらの技術はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のためにも利用可能である(Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)及びBoernerら、J.Immunol.,147(1):86-95(1991)]。
【０２１９】
Ｄ．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２の異なる抗原に特異的結合性を有する、好ましくはヒト又はヒト化したモノクローナル抗体である。本ケースにおいて、特異的結合性の一つは、ＰＲＯポリペプチドのためのものであり、他方は、何れかの他の抗原のためのものであり、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットのためのものである。
【０２２０】
二重特異性抗体の製造方法は、当該分野で周知である。従来、二重特異性抗体の組み換え体生産は、二つの重鎖が異なる特異性を有する場合、二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖ペアの共発現に基づいている[MilsteinとCuello, Nature 305,537-539(1983)]。免疫グロブリン重鎖と軽鎖の取り合わせがランダムであるために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、一つのみが正しい二重特異性構造を有する１０の異なる抗体分子の可能性のある混合物が生産される。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通例は達成される。類似の手法は、1993年5月13日公開のＷＯ９３／０８８２９中に、及びTrauneckerら、EMBO J.,10:3655-3659(1991)中に開示される。
【０２２１】
望まれる結合特異性を持つ抗体可変ドメイン(抗体-抗原結合部位)は、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合することができる。その融合は、好ましくはヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインを伴う。その融合体の少なくとも一つにおいて存在する軽鎖結合のために必要な部位を含む第１の重鎖定常領域(ＣＨ１)を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、及びもし望むなら、免疫グロブリン軽鎖、をコードしているＤＮＡは、別個の発現ベクターに挿入され、且つ適当な宿主生物に共トランスフェクトされる。二重特異性抗体を生成するための更なる詳細のために、例えば、Sureshら、Methods in Enzymology,121:210(1986)を参照。
【０２２２】
Ｅ．ヘテロ接合抗体
ヘテロ接合抗体もまた、本発明の範囲内である。ヘテロ接合抗体は、共有結合した二つの抗体から構成される。そのような抗体は、例えば、希望しない細胞に免疫系細胞を標的化する[米国特許第４６７６９８０号]、及びＨＩＶ感染の治療のために提案されている[ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９]。該抗体は、架橋剤が含まれるそれらを含む、合成タンパク質化学において周知の方法を用いてインビトロで製造し得る。例えば、イムノトキシンは、ジスルフィド交換反応を用いて又はチオエーテル結合を形成することによって構築し得る。この目的のための好適な試薬の実例は、イミノチオラートとメチル-4-メルカプトブチルイミダート及び米国特許第４６７６９８０号中に記載されるそれらを含む。
【０２２３】
２１．抗-ＰＲＯポリペプチド抗体の使用
本発明の抗-ＰＲＯポリペプチド抗体は、各種の有用性を有する。例えば、抗-ＰＲＯポリペプチド抗体は、例えば特有の細胞、組織、又は血清におけるその発現を検出するための、ＰＲＯポリペプチド用の診断アッセイにおいて使用し得る。競合結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び異種又は同種相で実施される免疫沈降アッセイ[Zola,Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques,CRC Press,Inc.(1987)147-158頁]のような当該分野で周知の各種診断アッセイ技術が使用し得る。診断アッセイにおいて使用した抗体は、検出可能な部分で標識することができる。該検出可能な部分は、直接又は間接的のいずれか一方で、検出可能なシグナルをもたらすことができるべきである。例えば、検出可能な部分は、3Ｈ，14Ｃ，32Ｐ，35Ｓ，又は125Ｉのような放射性同位体、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、又はルシフェリンのような蛍光又は化学発光化合物、又はアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼのような酵素とし得る。該検出可能部分への抗体の接合のための当該分野で周知のいずれかの方法は、Hunterら、Nature,144:945(1962);Davidら、Biochemistry,13:1014(1974);Painら、J.Immunol.Meth.,40:219(1981);及びNygren,J.Histochem.and Cytochem.,30:407(1982)によって記載されたそれらの方法を含み、利用し得る。
【０２２４】
抗-ＰＲＯポリペプチド抗体はまた、組換え細胞培養又は天然供給源からのＰＲＯポリペプチドのアフィニティー精製に有用である。この方法において、ＰＲＯポリペプチドに対する抗体は、当該分野で周知の方法を用いて、Sephadex樹脂又は濾紙のような適当な支持体上に固定化される。固定化した抗体は、次いで精製するべきＰＲＯポリペプチドを含む試料に接触させ、その後該支持体は、ＰＲＯポリペプチド以外の試料中の実質上全ての材料を除去するであろう適当な溶媒で洗浄される。最後に、該支持体は、該抗体からＰＲＯポリペプチドを放出するであろう別の適当な溶媒で洗浄される。
【０２２５】
コルディン(chordin)（ＣＨＤ）は、示差的な顔の特徴(低い前毛髪線、眉毛叢生症、前傾の外鼻孔、上顎前突症、長い人中、こい口(carp mouth))、出生前又は出生後の成長遅延、精神遅延及び、しばしば、しかし常時ではない上肢奇形によって特徴付けられるコルネリア・ド・ランゲ症候群として知られる異形症候群のための候補遺伝子である。また、ＣＤＬが血小板減少症との関連において存在するレアケースもある。ＣＤＬの遺伝子は、3q26.3(OMIM#122470)への結合によってマップされている。初期アフリカツメガエル(early Xenopus)パターン化におけるＸｃｈｄ（アフリカツメガエルコルディン(Xenopus chordin)）包含及び神経系統発育は、興味のある候補遺伝子中にＣＨＤを作る。ＣＨＤは、染色体３上の適切な領域にマップされる。それはＴＨＰＯに非常に密接し、ＴＨＰＯとＣＨＤの両方を包含する欠失は、血小板減少症と発育異形症のレアケースに帰結できる。全成人組織の大部分がＣＨＤ発現に対して陰性である顕現したＣＤのin situ分析において、僅かに陽性のシグナルが、長い骨の発育と推定上の成長においてＣＨＤを関連させる大腿骨頭と寛骨臼（股関節）との間に形成される発育中の滑膜性の連結の割線において観測された。そのような機能は、もし混乱したならば、成長遅延をもたらすことができる。
【０２２６】
ｃＤＮＡから予測したヒトＣＨＤアミノ酸配列は、Ｘｃｈｄに５０％同一性（及び６６％保存された）である。４システイン-富ドメイン中の全ての４０システインが保存される。これらのシステイン富ドメインは、トロンボスポンジン、プロコラーゲン及びフォン・ビルブラント因子中で観測されたそれらに類似している。Bornstein,P.FASEB J 6:3290-3299(1992);Hunt,L.& Barker,W.Biochem.Biophys.Res.Commun.144:876-882(1987)。
【０２２７】
ＰＲＯ２４３コルディン(chordin)に対する抗体は、ＰＲＯ２４３の過剰発現によって特徴付けされる条件でポリペプチドを結合するものを作ることができる。
【０２２８】
以下の実施例は、説明の目的のためにのみ提供され、且ついずれの手法も本発明の範囲を制限することを意図していない。
【０２２９】
本明細書中に引用した全ての特許と参考文献は、それらの全体が参照によりここに組み込まれる。
【０２３０】
【実施例】
本実施例に関する商業的に利用できる試薬は、特に示さない限り、製造元の指示書に従って用いた。以下の実施例、および明細書を通して、ＡＴＣＣ受託番号によって同定される細胞源は、Ａｍｅｉｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄである。
【０２３１】
実施例１：新規なポリペプチドおよびこれらをコードするｃＤＮＡを同定するための細胞外ドメイン相同性スクリーニング
ＥＳＴデータベースを検索するために、公的Ｓｗｉｓ−Ｐｒｏｔデータベースからの約９５０個の既知分泌タンパク質から、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列（もしもあるならば、分泌シグナル配列を含む）を用いた。ＥＳＴデータベースは、公的データベース（例えば、Ｄａｔｈｏｆｆ、Ｇｅｎｅｂａｎｋ）と私的データベース（例えば、ＬＩＦＥＳＥＱTM、Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ．ＣＡ）を含む。ＥＣＤタンパク質配列をＥＳＴ配列の６フレーム翻訳と比較するため、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２（ＡｌｔｓｃｈｕｌとＧｉｓｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０−４８０（１９９６））を用いて検索を行った。既知のタンパク質をコードしていない７０（いくつかの事例においては、９０）以上のＢｌａｓｔスコアーとのそれらの比較を、プログラム「ｐｈａｒｐ」［Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ；（ｈｔｔｐ：／／ｂｏｚｅｍａｎ．ｍｂｔ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈｒａｐ．ｄｏｃｓ／ｐｈｒａｐ．ｈｔｍｌ］を用いてまとめ、コンセンサスＤＮＡ配列に集めた。
【０２３２】
この細胞外ドメイン相同性スクリーニングを用い、コンセンサスＤＮＡ配列を、ｐｈｒａｐを用い、その他の同定されているＥＳＴ配列に対応してまとめた。さらに、上記ＥＳＴ配列の供給源を用い、得られたコンセンサス配列をできる限り伸長させるために、しばしば（いつもではないが）ＢＬＡＳＴとｐｈｒａｐの反復サイクルを用いて、該コンセンサス配列を伸長した。
【０２３３】
次いで、上記のように得られたコンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲによって興味ある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、およびＰＲＯポリペプチドをコードする全長配列のクローンを単離するためのプローブとして用いるために使用した。前進（．ｆ）と逆進（．ｒ）ＰＣＲプライマーは、一般的に、２０から３０ヌクレオチドまでの範囲とし、しばしば、長さ約１００−１０００ｂｐのＰＣＲ生成物を与えるように設計される。いくつかの事例において、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂよりも大きい時に、付加的なオリゴヌクレオチドが合成される。全長クローンのためのいくつかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからＤＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに従って、ＰＣＲプライマー対を用い、ＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、興味ある遺伝子をコードするクローンを、オリゴヌクレオチドプローブもしくはプライマー対の一つを用いて単離するために、陽性のライブラリーを用いた。
【０２３４】
ｃＤＮＡクローンを単離するために用いたｃＤＮＡライブラリーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡなどから商業的に利用できる試薬を用いた標準的な方法によって構築した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴプライマーで合成し、ＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに平滑端で連結し、ＮｏｔＩ部位で切断し、ゲル電気泳動により適切にサイズ分画し、好適なクローニングベクター［例えば、ｐＲＫＢもしくはｐＲＫＤ；ｐＲＫ５Ｂは、ＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１２７８−１２８０（１９９１）参照］に、特有のＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ部位で、定められた方向でクローニングした。
【０２３５】
実施例２：アミラーゼスクリーニングによるｃＤＮＡクローンの単離
１．オリゴｄＴプライマーで合成されたｃＤＮＡライブラリーの調製
ｍＲＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからの試薬とプロトコール（Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ２）を用い、興味のあるヒト組織から単離した。このＲＮＡは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ（Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ）の試薬とプロトコールを用い、ベクターｐＲＫ５Ｄ中、オリゴｄＴプライマーで合成したｃＤＮＡライブラリーを作製するために用いた。この操作で、二本鎖ｃＤＮＡは、１０００ｂｐよりも大きなサイズとなり、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩリンカー化ｃＤＮＡを、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩで切断したベクターにクローニングした。ｐＲＫ５Ｄは、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ ｃＤＮＡクローニング部位に先立つＳｆｉＩ制限酵素部位が続くｓｐ６転写開始部位を有するクローニングベクターである。
【０２３６】
２．ランダムプライマーで合成されたｃＤＮＡライブラリーの調製
第２のｃＤＮＡライブラリーは、第１のｃＤＮＡクローンの５’末端を優先的に発現させるために産出した。Ｓｐ６ ＲＮＡは、第１のライブラリー（上記）から産出し、このＲＮＡを、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ、上記）からの試薬とプロトコールを用い、ベクターｐＳＳＴ−ＡＭＹ．０中、ランダムプライマーで合成したｃＤＮＡライブラリーを産出するために用いた。この操作で、二本鎖ｃＤＮＡは、５００−１０００ｂｐのサイズとなり、ＮｏｔＩアダプターに平滑端で連結し、ＳｆｉＩで切断し、ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩで切断したベクターにクローニングした。ｐＳＳＴ−ＡＭＹ．０は、ｃＤＮＡクローニング部位に先立つ酵母アルコールデヒドロゲナーゼプロモーターと、クローニングサイトの後であって、酵母アルコールデヒドロゲナーゼターミネーターが続くマウスアミラーゼ配列（分泌シグナルを有さない成熟配列）を有するクローニングベクターである。このようにアミラーゼ配列とフレーム内で融合したベクター中にクローニングされたｃＤＮＡは、適切にトランスフェクションした酵母コロニーからアミラーゼを分泌するようになる。
【０２３７】
３．形質転換と検出
上記段落２に記載したライブラリーからのＤＮＡは、電気受容能のあるＤＨ１０８細菌（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２０ｍｌ）を加えるために、氷上で冷却した。次いで、細菌とベクターの混合物を、製造元によって推奨される方法によってエレクトロポレーションした。続いて、ＳＯＣ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１ｍｌ）を加え、混合物を３７℃で３０分間インキュベーションした。次いで、形質転換体を、アンピシリンを含有する標準的な１５０ｍｍＬＢプレート２０枚に播き、１６時間（３７℃）インキュベーションした。陽性コロニーを、プレートからこすり取り、ＣｓＣｌ−密度勾配などの標準的なプロトコールを用い、細菌ペレットからＤＮＡを単離した。次いで、精製したＤＮＡを用いて、以下の酵母のプロトコールを行った。
【０２３８】
酵母の方法は３種類に分けられる：（１）プラスミド／ｃＤＮＡ結合ベクターによる酵母の形質転換；（２）アミラーゼを分泌している酵母クローンの検出と単離；および（３）酵母コロニーからの直接的な挿入物のＰＣＲ増幅、および配列決定と、更なる分析のためのＤＮＡの精製。
【０２３９】
用いられた酵母株は、ＨＤ５６−５Ａ（ＡＴＣＣ−９０７８５）であった。この株は、以下の遺伝子型を有する：ＭＡＴアルファ、ｕｒａ３−５２、ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１１２、ｈｉｓ３−１１、ｈｉｓ３−１５、ＭＡＬ+、ＳＵＣ+、ＧＡＬ+。好ましくは、翻訳後経路を欠失している酵母変異株を用いることができる。そのような変異株は、ｓｅｃ７１、ｓｅｃ７２、ｓｅｃ６２において、転座欠失アレルを有しており、端切りしたｓｅｃ７１が最も好ましい。もしくは、これらの遺伝子の正常な作用を阻害するアンタゴニスト（アンチセンスヌクレオチドおよび／またはリガンドを含む）、この翻訳後経路に関連するその他のタンパク質（例えば、ＳＥＣ６１ｐ、ＳＥＣ７２ｐ、ＳＥＣ６２ｐ、ＳＥＣ６３ｐ、ＴＤＪ１ｐ、もしくはＳＳＡ１ｐ−４ｐ）、もしくはこれらのタンパク質の混合体も、アミラーゼ発現酵母と組み合わせて好適に用いられる。
【０２４０】
形質転換は、Ｇｉｅｔｚら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２０：１４２５（１９９２）によって略述されたプロトコールに基づいて行った。次いで、形質転換細胞を、寒天からＹＥＰＤ混合培地（１００ｍｌ）に播種し、３０℃で一晩培養した。ＹＥＰＤ培地は、Ｋａｉｓｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐ．２０７（１９９４）に記載されたように調製した。次いで、一晩培養物を、新鮮なＹＥＰＤ培地（５００ｍｌ）で、約２ｘ１０6細胞／ｍｌ（約ＯＤ600＝０．１）に希釈し、１ｘ１０7細胞／ｍｌ（約ＯＤ600＝０．４−０．５）となるまで再度培養した。
【０２４１】
次いで、細胞を回収し、ＳｏｒｖａｌＧＳ３ローターで、５０００ｒｐｍ、５分間で、ＧＳ３ローターボトルに移し、上清を除去し、次いで、滅菌水に再度懸濁し、再び５０ｍｌファルコンチューブ中、Ｂｅｃｋｍａｎ ＧＳ−６ＫＲ遠心分離機３５００ｒｐｍで遠心分離することにより、形質転換用に調製した。上清を除去し、続けて細胞をＬｉＡｃ／ＴＥ（１０ｍｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍ ＭＥＤＴＡ ｐＨ７．５、１００ｍＭのＬｉ2ＯＯＣＣＨ3）で洗浄し、ＬｉＡｃ／ＴＥ（２．５ｍｌ）中に再度懸濁した。
【０２４２】
形質転換は、調製した細胞（１００μｌ）に、新たに変性させた一本鎖サケ精子ＤＮＡ（Ｌｏｆｓｔｒａｎｄ Ｌａｂｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）と形質転換させるＤＮＡ（１μｇ、容量＜１０μｌ）とを、マイクロ遠心分離チューブ内で混合することによって行った。混合液を、渦動撹拌により簡単に混合し、次いで、４０％ＰＥＧ／ＴＥ（６００μｌポリエチレングリコール−４０００、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１００ｍＭＬｉ2ＯＯＣＣＨ3ｐＨ７．５）を添加した。この混合液を、穏やかに混合し、３０分間凝集させながら３０℃でインキュベーションした。この細胞を、次いで、４２℃で１５分間、熱刺激し、この反応チューブを、マイクロ遠心分離機で、１２０００ｒｐｍ、５−１０秒間遠心し、デカンテーションし、ＴＥ（５００μｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ ｐＨ７．５）で再度懸濁し、続けて再度遠心分離した。次いで、細胞をＴＥ（１ｍｌ）中に希釈し、予め１５０ｍｍ培養プレート（ＶＷＲ）に調製した選択培地上に、２０μｌずつ分注した。
【０２４３】
もしくは、多数の小さな反応の代わりに、形質転換を、単一、大規模の反応で、試薬量もそれに応じて増やして行った。
【０２４４】
用いた選択培地は、Ｋａｉｓｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐ．２０８−２１０（１９９４）によって記載されたように調製されたウラシル欠失合成完全デキストロース（ＳＣＤ−Ｕｒａ）寒天とした。形質転換体は、３０℃で２−３日間培養した。
【０２４５】
アミラーゼを分泌しているコロニーの検出は、選択増殖培地中に赤色澱粉を含ませることによって行った。澱粉を、Ｂｉｅｌｙら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７２：１７６−１７９（１９８８）によって記載された手順に従って、赤色染料（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ−１２０、Ｓｉｇｍａ）と結合させた。結合させた澱粉を、ＳＣＤ−Ｕｒａ寒天プレート中、最終濃度０．１５％（ｗ／ｖ）で取り込ませ、リン酸カリウムでｐＨ７．０に緩衝化した（最終濃度５０−１００ｍＭ）。
【０２４６】
十分に単離、同定できる単一コロニーを得るために、陽性コロニーを拾い、新鮮な選択培地（１５０ｍｍプレート上）に塗布した。アミラーゼの分泌が陽性である十分に単離された単一コロニーは、緩衝化したＳＣＤ−Ｕｒａ寒天への赤色澱粉の直接的な取り込みによって検出した。陽性コロニーは、直接目視可能な陽性コロニー周囲の透明な輪を生じさせる澱粉分解能によって決定した。
【０２４７】
４．ＰＣＲ増幅によるＤＮＡの単離
陽性コロニーを単離する時、その部位を楊枝で拾い上げ、９６ウェルプレート中の滅菌水（３０μｌ）に希釈した。この時、陽性コロニーを、続く分析用に凍結保存するか、直ちに増幅する。分注した細胞（５μｌ）を、２５μｌ容量：０．５μｌのＫｌｅｎｔａｑ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）；４．０μｌ１０ｍＭｄＮＴＰ'ｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）；２．５μｌＫｌｅｎｔａｑ緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）；０．２５μｌ前進オリゴ１；０．２５μｌ逆進オリゴ；１２．５μｌ滅菌水を含む、でのＰＣＲ反応の鋳型として用いた。前進オリゴヌクレオチド１の配列は： ５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＴＡＡＡＴＡＧＡＣＣＴＧＣＡＡＴＴＡＴＴＡＡＴＣＴ−３’（配列番号：１６）。
逆進オリゴヌクレオチド２び配列は： ５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＣＣＡＴＴ−３’（配列番号：１７）。
【０２４８】
次いで、ＰＣＲを以下のように行った：
ａ． 変性 ９２℃、５分
ｂ． ３サイクル： 変性 ９２℃、３０秒 アニーリング ５９℃、３０秒 伸長 ７２℃、６０秒
ｃ． ３サイクル： 変性 ９２℃、３０秒 アニーリング ５７℃、３０秒 伸長 ７２℃、６０秒
ｄ． ２５サイクル：変性 ９２℃、３０秒 アニーリング ５５℃、３０秒 伸長 ７２℃、６０秒
ｅ． 保持 ４℃
【０２４９】
オリゴヌクレオチドの下線部位は、ＡＤＨプロモーター領域とアミラーゼ領域に各々アニーリングし、挿入が無い場合は、ベクターｐＳＳＴ−ＡＭＹ．０から３０７ｂｐ領域を増幅した。典型的には、これらのオリゴヌクレオチドの５’末端の最初の１８ヌクレオチドに、配列決定用プライマーのアニーリング部位を含ませた。このように、空ベクターからのＰＣＲ反応の生成物は、３４３ｂｐであった。一方、シグナル配列を融合させたｃＤＮＡは、かなり長いヌクレオチド配列となった。
【０２５０】
ＰＣＲに続けて、分注した反応生成物（５μｌ）を、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載されたように、Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝系を用いた１％アガロースゲルのアガロースゲル電気泳動によって調べた。４００ｂｐよりも大きい単一で強いＰＣＲ生成物が得られたクローンを、９６Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｃｌｅａｎ−ｕｐ ｃｏｌｕｍ （Ｑｉａｇｅｎ社、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）で精製した後、さらにＤＮＡ配列決定によって分析した。
【０２５１】
実施例３：ヒトＰＲＯ２４１をコードしているｃＤＮＡの単離
コンセンサスＤＮＡ配列は、上記実施例１に記載した他のＥＳＴ配列に対応してまとめた。このコンセンサス配列を、ここにＤＮＡ３０８７６と称する。ＤＮＡ３０８７６のコンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲによる興味ある配列を含むｃＤＮＡライブラリーの同定、および２）ＰＲＯ２４１をコードする全長配列のクローンを単離するためのプローブとしての使用、のために、オリゴヌクレオチドを合成した。
【０２５２】
ＰＣＲプライマー（前進および逆進）を合成した：
前進ＰＣＲプライマー ５’−ＧＧＡＡＡＴＧＡＧＴＧＣＡＡＡＣＣＣＴＣ−３’ （配列番号：３）
逆進ＰＣＲプライマー ５’−ＴＣＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＴＧＣ−３’ （配列番号：４）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌクレオチド配列を有するコンセンサスＤＮＡ３０８７６配列から構築した。
ハイブリダイゼーションプローブ５’−ＧＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＴＣＣＡＴＡＴＣＡＧＡＡＴＴＧＣＡＧＡＡＧＣＡＡＡＡＣＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＴ−３’（配列番号：５）
【０２５３】
全長クローンの供給源としてのいくつかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからＤＮＡを、上記同定されたＰＣＲプライマー対を用いたＰＣＲ増幅によって、スクリーニングした。次いで、陽性のライブラリーを、オリゴヌクレオチドプローブおよび該ＰＣＲプライマーの一つを用いて、ＰＲＯ２４１をコードするクローンを単離するために用いた。ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのＲＮＡを、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２９）から単離した。
【０２５４】
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列から、ＰＲＯ２４１の全長ＤＮＡ配列［ここに、ＵＮＱ２１５（ＤＮＡ３４３９２−１１７０）と称する］（配列番号：１）と、ＰＲＯ２４１のタンパク質配列を得た。
【０２５５】
ＵＮＱ２１５（ＤＮＡ３４３９２−１１７０）の全ヌクレオチド配列を図１に示す（配列番号：１）。クローンＵＮＱ２１５（ＤＮＡ３４３９２−１１７０）は、ヌクレオチド部位２３４−２３６に見かけ上の翻訳開始部位と、ヌクレオチド部位１３７１−１３７３に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリーディングフレームを含む（図１）。推定されるポリペプチドプレカーサーは３７９アミノ酸長（図２）である。図２に示した全長のＰＲＯ２４１タンパク質は、推定上、約４３３０２ダルトンの分子量と、約７．３０のｐＩを有する。クローンＵＮＱ２１５（ＤＮＡ３４３９２−１１７０）は、ＡＴＣＣに寄託し、ＡＴＣＣ寄託番号ＡＴＣＣ ２０９５２６が付与されている。
【０２５６】
全長ＰＲＯ２４１ポリペプチドアミノ酸配列の分析により、様々なビグリカンプロテオグリカンタンパク質と有意な相同性を有することが提示されており、これによってＰＲＯ２４１が新規のビグリカン相同ポリペプチドであることが示されている。
【０２５７】
実施例４： 染色体ウォーキングによるヒトＰＲＯ２４３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
概論： ヒトトロンボポエチン（ＴＨＰＯ）は、２つのドメインからなる３５２アミノ酸のグリコシル化されたホルモンである。エリスロポエチンと５０％の類似性を共有するＮ末端ドメインは、生物活性を発現する。Ｃ末端領域は、分泌に必要とされる。トロンボポエチン（ＴＨＰＯ）遺伝子は、ヒト染色体３ｑ２７−ｑ２８に位置し、ここで、この遺伝子の６つのエキソンは、染色体ＤＮＡ７キロ塩基対に及ぶ（Ｇｕｒｎｅｙら、Ｂｌｏｏｄ ８５：９８１−９８８（１９９５））。ＴＨＰＯに近接して位置するＴＨＰＯ相同体をコードする遺伝子が存在するかを調べるために、この領域の染色体ＤＮＡフラグメントを同定し、配列決定した。ＴＨＰＯ遺伝子座を包囲している３つのＰ１クローンと１つのＰＡＣクローン（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；カタログ番号、Ｐ１−２５３５とＰＡＣ−６３５９）を単離し、１４０ｋｂ領域を、定序ショットガン方法（orderd shotgun strategy）（Ｃｈｅｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １７：６５１−６５６（１９９３））を用い、ＰＣＲに基づくギャップ充填方法（gap filling approach）と組み合わせて配列決定した。分析により、該領域は、ＴＨＰＯに非常に隣接して位置する４つの付加遺伝子：腫瘍壊死因子−受容体１型付随タンパク２（ＴＲＡＰ２）、伸長開始因子γ（ｅｌｆ４ｇ）、塩素チャネル２（ＣＬＣＮ２）およびＲＮＡポリメラーゼＩＩサブユニットｈＲＰＢ１７、と共に遺伝子が豊富であることが明らかとなった。その領域でＴＨＰＯ相同体が見い出されなかったものの、４つの新規な遺伝子が、コンピューター補助遺伝子検出器（ＧＲＡＩＬ）［Ｘｕら、Ｇｅｎ．Ｅｎｇｉｎ．１６：２４１−２５３（１９９４）］、ＣｐＧ島の存在［Ｃｒｏｓｓ，Ｓ．とＢｉｒｄ，Ａ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．と Ｄｅｖｅｌ．５：１０９−３１４（１９９５）］、および既知の遺伝子との相同性（ＷＵ−ＢＬＡＳＴ２．０によって検出）（ＡｌｔｓｃｈｕｌとＧｉｓｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０−４８０（１９９６）（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ）によって推測されている。
【０２５８】
Ｐ１クローンとＰＡＣクローン： ＴＨＰＯ染色体配列［Ａ．Ｌ．Ｇｕｒｒｎｅｙら、Ｂｌｏｏｄ ８５：９８１−８８（１９９５）］から設計されたＰＣＲプライマーでスクリーニングされた染色体Ｐ１ライブラリー（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ：カタログ番号：Ｐ１−２５３５）から最初のヒトＰ１クローンを単離した。ＰＣＲプライマーは、このＰ１クローンから得られた末端配列から設計し、次いで、重複するクローンを同定するため、ＰＩとＰＡＣライブラリー（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号：Ｐ１−２５３５＆ＰＡＣ−６５３９）をスクリーニングするために用いた。
【０２５９】
定序ショットガン方法： 定序ショットガン方法（ＯＳＳ）（Ｃｈｅｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１７：６５１−６５６（１９９３））は、段階的アプローチによる、巨大な染色体ＤＮＡクローンの位置決定や配列決定を含む。Ｐ１クローンまたはＰＡＣクローンは、音波処理し、断片をラムダベクター（λＢｌｕｅｓｔａｒ）（Ｎｏｖａｇｅｎ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ；カタログ番号６９２４２−３）にサブクローニングした。該ラムダサブクローン挿入物は、長距離ＰＣＲ（Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：２２１６−２２２０（１９９４））によって単離し、末端を配列決定した。本来のクローンの部分的な地図を作製するために、ラムダ−末端配列を重複させた。重複する末端配列を含むラムダクローンを同定し、プラスミドベクター（ｐＵＣ９もしくはｐＵＣ１８）にサブクローニングした挿入物とプラスミドサブクローンの末端を配列決定し、隣接している配列を産出するために、まとめた。この直接的な配列決定法により、興味のある領域を読み取り、まとめるために要求される重複が最小になる。
【０２６０】
ＴＨＰＯ遺伝子座をより良好に定め、ヘマトポエチンファミリーに関連するその他の遺伝子を検索するため、４つの染色体クローンを、ヒトＰＩとＰＡＣライブラリー（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号：Ｐ１−２５３５とＰＡＣ−６５３９）のＰＣＲスクリーニングによってこの領域から単離した。染色体フラグメントのサイズは以下の通りである：Ｐ１．ｔは４０ｋｂ；Ｐ１．ｇは７０ｋｂ；Ｐ１．ｕは７０ｋｂ；およびＰＡＣ．ｚは２００ｋｂ。これらの４つの染色体クローン間の関係を図５に図示する。２００ｋｂ染色体ＤＮＡ領域の約８０％を、定序ショットガン方法（ＯＳＳ）（Ｃｈｅｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１７：６５１−６５６（１９９３））によって配列決定し、Ａｕｔｏ ＡｓｓｅｍｂｌｅｒTM（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ、カタログ番号９０３２２７）を用い、コンティグにまとめた。これらのコンティグの予備的な順序は、手動分析によって決定した。４６コンティグがあり、ギャップ充填を用いた。表２にギャップの数とサイズを要約した。
【０２６１】
表２
１４０ｋｂ領域におけるギャップの要約
ギャップのサイズ 数
＜５０ｂｐ １３
５０−１５０ｂｐ ７
１５０−３００ｂｐ ７
３００−１０００ｂｐ １０
１０００−５０００ｂｐ ７
＞５０００ｂｐ ２ （１５０００ｂｐ）
【０２６２】
ＤＮＡ配列決定： ＡＢＩ ＤＹＥ−ｐｒｉｍｅｒTM ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ；カタログ番号４０２１１２）を、ラムダとプラスミドサブクローンの末端を配列決定するために用いた。ＡＢＩ ＤＹＥ−ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒTM ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ；カタログ番号４０３０４４）を、各々のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ生成物の配列決定に用いた。配列は、ＡＢＩ３７７機器でまとめた。１ｋｂよりも大きなＰＣＲ生成物のために、ウォーキングプライマーを用いた。コンティグ配列を、ＡｕｔｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒTM（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ、カタログ番号９０３２２７）におけるＯＯＳ方法によって産出し、ギャップ充填配列を記録したファイルを、ＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒTM（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ社、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）に、重複と編集のために組み込ませた。
【０２６３】
ＰＣＲに基づくギャップ充填方法：プライマーは、各コンティグの５’−と３’−末端配列に基づき、反復と低い精度の配列領域を除くように設計した。全てのプライマーは、１９−２４ｍｅｒで、５０−７０％のＧ／Ｃ含有量となるように設計した。オリゴを標準的な方法で合成し、ゲル−精製した。
【０２６４】
コンティグの方向と順序が未知なので、プライマーの過変異を増幅反応において用いた。２つのＰＣＲキットを用いた：第１に、ＸＬ ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ；カタログ番号Ｎ８０８０２０５）、伸長時間約１０分；および第２に、もしＸＬ ＰＣＲキットでスメアーが生じる（smeared）もしくは多重生成物が観察されたならば、Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ社、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ；カタログ番号：２０１２２３）を、高ストリンジェント条件下で用いた。成功した各反応から主なＰＣＲ生成物を、０．９％低融点アガロースゲルから抽出し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットで、配列決定の前に精製した。
【０２６５】
分析： コード化領域の同定と特徴付けを以下のように行った：最初に、反復する配列を、反復エレメントのライブラリーに対するＦａｓｔＡフォーマットで、ＤＮＡ配列をスクリーニングし、マスクされた疑わしい配列に戻るＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ（Ａ．Ｆ．Ａ Ｓｍｉｔ ＆ Ｐ．Ｇｒｅｅｎ， ｈｔｔｐ：／／ｆｔｐ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ＲＭ／ＲＭ ｄｅｔａｉｌｓ．ｈｅｍｌ）を用いてマスクした。マスクされていない反復は、ＷＵＢＬＡＳＴ［Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ ＆ Ｇｉｓｈ， Ｗ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０−４８０（１９９６）］を用い、ＧｅｎＢａｎｋデーターベースと配列を比較することによって同定し、手動でマスクした。
【０２６６】
次に、ＷＵＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを用いた、染色体領域とＧｅｎｅｎｔｅｃｈのタンパク質データベースとの比較によって、既知遺伝子を明らかにし、次いで、他で大きく異なる配列間で局所的に同定された領域を見出すために、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｃｈ（ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）アルゴリズムを用い、各遺伝子の染色体およびｃＤＮＡ配列を整列することによって注釈付けた。この方法により、この領域における５つの既知遺伝子、ＴＨＰＯ、ＴＲＡＰ２、ｅｌＦ４ｇ、ＣＬＣＮ２およびｈＲＰＢ１７の全てのエキソンを検出した（表３）。
【０２６７】
表３
分析された１４０ｋｂ領域に局在する既知遺伝子の要約
既知遺伝子 遺伝子座
真核生物翻訳開始因子４γ ３ｑ２７−ｑｔｅｒ
トロンボポエチン ３ｑ２６−ｑ２７
塩素チャネル２ ３ｑ２６−ｑｔｅｒ
ＴＮＦレセプター付随タンパク２ 予めマップされていないＲＮＡポリメラーゼＩＩサブユニットｈＲＰＢ１７ 予めマップされていない
【０２６８】
最後に、新規な転写単位を多くの方法を用いて推測した。ＣｐＧ島（Ｓ．Ｃｒｏｓｓ ＆ Ｂｉｒｄ，Ａ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．５： １０９−３１４（１９９５））はプロモーター領域を定めるために用い、ＧＣ富、６または８−ｍｅｒパリンドローム配列を認識する酵素によって切断されるクラスター部位として同定した。ＣｐＧ島には、通常、遺伝子のプロモーター領域が付随している。ＧｅｎＢａｎｋに対して、短い染色体領域（１０−２０ｋｂ）のＷＵＢＬＡＳＴ２．０分析により、ＥＳＴとの一致を明らかにした。個別のＥＳＴ配列（もしくは、可能ならば、それらの配列のクロマトグラムのファイル）を検索し、理論上のｃＤＮＡ配列（ここにＤＮＡ３４４１５として称される）を提供するため、シークエンサーにまとめた。ＧＲＡＩＬ２（ＡｐｏＣｏｍ社、Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，ＴＮ，ＤＥＣαに対する指揮系統）は、新規なエキソンを推測するために用いた。この領域における５つの既知遺伝子は、ＧＲＡＩＬアルゴリズムの成功裏の内部対照として機能した。
【０２６９】
単離： Ｃｈｏｒｄｉｎ ｃＤＮＡクローンは、オリゴｄＴプライマーで合成されたヒト胎児肺ライブラリーから単離した。ヒト胎児肺ポリＡ+ ＲＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（カタログ番号６５２８−１、ロット番号４３７７７）から購入し、５ｍｇを、ｐＫＲ５Ｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ， ＬＩＢ２６）のｃＤＮＡライブラリーを構築するために用いた。３’−プライマー（ｐＧＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ）（配列番号：８）と、５’−リンカー（ｐＣＧＧＡＣＧＣＧＴＧＧＧＧＣＣＴＧＣＧＣＡＣＣＣＡＧＣＴ）（配列番号：９）を、ＳａｌＩとＮｏｔＩ制限酵素部位を導入するように設計した。提示された染色体遺伝子のエキソンを手動で「スプライシング」して導き出された推定上のヒトコルディンｃＤＮＡ配列（ＤＮＡ３４４１５）から設計したオリゴヌクレオチドプローブで、クローンをスクリーニングした。配列決定する前にｃＤＮＡクローンの同一性を確認するため、ＰＣＲプライマーの側腹に位置するプローブを用いた。
【０２７０】
オリゴヌクレオチドプローブのスクリーニングを以下のように行った：
ＯＬＩ５６４０ ３４４１５．ｐ１ ５’−ＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＧＡＡＣＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＣＡＧＡＡ−３’（配列番号：１０）とＯＬＩ５６４０ ３４４１５．ｐ２ ５’−ＧＧＣＧＣＡＣＡＧＣＡＣＧＣＡＧＣＧＣＡＴＣＡＣＣＣＣＧＡＡＴＧＧＣＴＣ−３’（配列番号：１１）；と、用いた側腹に位置するプローブは以下のものであった：
ＯＬＩ５６３９ ３４４１５． ｆ１ ５’−ＧＴＧＣＴＧＣＣＣＡＴＣＣＧＴＴＣＴＧＡＧＡＡＧＧＡ−３’（配列番号：１２）と、ＯＬＩ５６４３ ３４４１５．ｒ ５’−ＧＣＡＧＧＧＴＧＣＴＣＡＡＡＣＡＧＧＡＣＡＣ−３’（配列番号：１３）。
【０２７１】
実施例５：ＰＲＯ２４３のノーザンブロットおよびｉｎ ｓｉｔｕ ＲＮＡハイブリダイゼーション分析
ヒト組織におけるＰＲＯ２４３ ｍＲＮＡの発現を、ノーザンブロットによって試験した。ヒト胎児および成人組織から得られたヒトポリＡ+ＲＮＡブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ；カタログ番号７７６０−１と７７５６−１）を、全長ＰＲＯ２４３ ｃＤＮＡに基づいた32Ｐ−標識ｃＤＮＡフラグメントプローブとハイブリダイズさせた。ブロットは、プローブと共に、ハイブリダイゼーション緩衝液（５ｘＳＳＰＥ；２ｘデンハート溶液；１００ｍｇ／ｍｌ変性切断サケ精子ＤＮＡ；５０％ホルムアミド；２％ＳＤＳ）中、６０時間、４２℃でインキュベーションした。ブロットを、２ｘＳＳＣで複数回；０．０５％ＳＤＳで室温１時間洗浄し、続けて、高ストリンジェントな洗浄を、３０分間、０．１ｘＳＳＣ；０．１％ＳＤＳ中、５０℃で行い、オートラジオグラフィーに供した。ブロットを一晩露光させた後、フォスフォイメージャ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）分析機（Ｆｕｊｉ）によって現像した。
【０２７２】
図６に示すように、ＰＲＯ２４３ ｍＲＮＡ転写生成物を検出した。発現パターンの分析により、予想される４．０ｋｂ転写物の強いシグナルが、成熟および胎児の肝臓において、および、非常に弱いシグナルが成熟腎臓において示された。胎児の脳、肺および腎臓は陰性であり、成熟心臓、脳、肺および脾臓は陰性であった。より小さな転写生成物が、胎盤（２．０ｋｂ）、成熟骨格筋（１．８ｋｂ）および胎児肝臓（２．０ｋｂ）において観察された。
【０２７３】
ＰＲＯ２４３の成人組織のＩｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、陽性シグナルが、大腿骨頭と寛骨臼との間に形成される発育中の滑膜性連結の割線において得られた。他の全組織は陰性であった。ヒト胎児の顔、頭、四肢とマウス胚子のさらなる切片標本についても試験した。ヒト胎児組織における発現は、発育している四肢および骨膜傍の間葉における顔骨に隣接して観察された。発現は高く特異的であり、しばしば血管新生している領域に隣接していた。また、発現は、発育時の一時的に胎児脳の後頭葉に観察されるが、脳においてそれ以外では観察されなかった。さらに、発現は、発育中の内耳の神経節において認められた。マウスの組織において、ヒトプローブにより、発現を認めることはできなかった（図７参照）。
【０２７４】
Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、最適化されたプロトコールで、ＰＣＲ産出33Ｐ標識リボプローブ［ＬｕとＧｉｌｌｅｔｔ，Ｃｅｌｌ Ｖｉｓｉｏｎ １：１６９−１７６（１９９４）］を用いて行った。ホルマリン固定、パラフィン包埋したヒト胎児および成人組織を薄切し、脱パラフィン化し、プロテアーゼＫ（２０ｇ／ｍｌ）で１５分間、３７℃で除タンパクし、さらに、ＬｕとＧｉｌｌｅｔｔ（１９９４）によって記載されたように、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用に処理した。［33Ｐ］−ＵＴＰ標識アンチセンスリボプローブをＰＣＲ生成物から産出し、５５℃で一晩ハイブリダイズさせた。スライドを、Ｋｏｄａｋ ＮＴＢ２ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｃｋ感光紙に浸し、４週間露光させた。
【０２７５】
実施例６：ヒトＰＲＯ２９９をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ここでＤＮＡ２８８４７として称するｃＤＮＡ配列（図１０；配列番号：１８）を、上記実施例２に記載したように単離した。さらなる分析後、ＤＮＡ２８８４７の３’端切り型が見出され、これをここにＤＮＡ３５８７７（図１１；配列番号：１９）と称する。ＤＮＡ３５８７７配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを、１）ＰＣＲによって、興味のある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、および２）ＰＲＯ２９９をコードする全長の配列のクローンを単離するためのプローブとして使用するため、合成した。前進および逆進ＰＣＲプライマーは、一般的に、２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば、長さ約１００−１０００ｂｐのＰＣＲ生成物を得るように設計する。プローブの配列は、典型的には、長さ４０−５５ｂｐである。いくつかの事例において、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂｐよりも大きくなる時、付加的オリゴヌクレオチドを合成する。全長のクローンのための複数個のライブラリーをスクリーニングするために、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに従って、ＰＣＲプライマー対を用い、ライブラリーからＤＮＡをＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、オリゴヌクレオチドプローブと該プライマー対の一つを用い、興味のある遺伝子をコードするクローンを単離するために、陽性のライブラリーを用いた。
【０２７６】
前進と逆進ＰＣＲプライマーを合成した：
前進ＰＣＲプライマー（３５８７７．ｆ１） ５’−ＣＴＣＴＧＧＡＡＧＧＴＣＡＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧ−３’（配列番号：２０）
逆進ＰＣＲプライマー（３５８７７．ｒ１） ５’−ＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＴＴＧＧＣＡＡＡＧＣＴＣＴＣ−３’（配列番号：２１）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ３５８７７配列から構築した。
ハイブリダイゼーションプローブ（３５８７７．ｐ１）
５’−ＣＡＧＴＧＣＴＣＣＣＴＣＡＴＡＧＡＴＧＧＡＣＧＡＡＡＧＴＧＴＧＡＣＣＣＣＣＣＴＴＴＣＡＧＧＣＧＡＧＡＧＣＴＴＴＧＣＣＡＡＣＣＧＡＡＣＴＧＡ−３’（配列番号：２２）
【０２７７】
全長クローンの供給源として複数個のライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからＤＮＡを、上記同定されたＰＣＲプライマー対の一つを用い、ＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、オリゴヌクレオチドプローブを用い、ＰＲＯ２９９配列をコードするクローンを単離するために、陽性ライブラリーを用いた。
【０２７８】
ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのＲＮＡを、ヒト胎児脳組織から単離した。ｃＤＮＡクローンを単離するために用いたｃＤＮＡライブラリーを、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡなどから商業的に利用できる試薬を用いた標準的な方法により構築した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴプライマーで合成し、ＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに平滑端で連結し、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおおよそのサイズに分画し、定められた方向で適切なクローニングベクター［例えば、ｐＲＫＢもしくはｐＲＫＤ；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１２７８−１２８０（１９９１）参照］に、特有のＸｈｏＩとＮｏｔＩ部位で、クローニングした。
【０２７９】
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、ＰＲＯ２９９の全長のＤＮＡ配列［ここにＵＮＱ２６２（ＤＮＡ３９９７６−１２１５）と称する］を得て、ＰＲＯ２９９のタンパク質配列を推定した。
【０２８０】
ＵＮＱ２６２（ＤＮＡ３９９７６−１２１５）の全ヌクレオチド配列を図８に示す（配列番号：１４）。クローンＵＮＱ２６２（ＤＮＡ３９９７６−１２１５）は、ヌクレオチド部位１１１−１１３に見かけ上の翻訳開始部位と、ヌクレオチド部位２３２２−２３２４に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリーディングフレームを含む（図８）。この推定されるポリペプチドプレカーサーは、７３７アミノ酸長である（図９）。クローンＵＮＱ２６２（ＤＮＡ３９９７６−１２１５）によってコードされるポリペプチド配列の重要な領域が同定され、以下のものを含む：アミノ酸１−２８に相当する単一ペプチド、アミノ酸６３８−６６２に相当する推定トランスメンブレン領域、アミノ酸８０−１０６、１２１−２０３、３３６−３６０、３７８−４１５、４１６−４４１、４５４−４９０、４９１−５２８、５２９−５４８、５６７−６０４および６０５−６２２に相当する１０個のＥＧＦの反復、アミノ酸１０−１２０，２０４−２０７，２０８−２２２，２２３−２８５，２８６−３０４，３６１−３７４，３７５−３７７，４４２−４５３，５４９−５６３，および５６４−５６６に相当する、潜在的な１０個のＮ−グリコシル化部位。クローンＵＮＱ２６２（ＤＮＡ３９９７６−１２１５）が、ＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号がＡＴＣＣ２０９５２４と付与されている。
【０２８１】
全長のＰＲＯ２９９ポリペプチドのアミノ酸配列の分析から、それの一部が、切痕タンパク質(notch protein)と有意な相同性を有することが提示され、それによって、ＰＲＯ２９９が新規な切痕タンパク相同体であり、典型的な切痕タンパク質の活性を有することが示唆されている。
【０２８２】
実施例７： ヒトＰＲＯ３２３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
コンセンサスＤＮＡ配列を、上記実施例１に記載されたように、他のＥＳＴ配列に対応してまとめた。このコンセンサス配列を、ここに、ＤＮＡ３０８７５と称する。ＤＮＡ３０８７５コンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを、１）ＰＣＲによって、興味のある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、および２）ＰＲＯ３２３の全長をコードする配列のクローンを単離するためのプローブとして使用するため、合成した。
【０２８３】
ＰＣＲプライマー（２個の前進と１個の逆進）を合成した：
前進ＰＣＲプライマー１ ５’−ＡＧＴＴＣＴＧＧＴＣＡＧＣＣＴＡＴＧＴＧＣＣ−３’（配列番号：２５）
前進ＰＣＲプライマー２ ５’−ＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＣＡＴＧＧＧ−３’（配列番号：２６）
逆進ＰＣＲプライマー ５’−ＣＴＣＣＡＣＣＡＡＴＣＣＣＧＡＴＧＡＡＣＴＴＧＧ−３’（配列番号：２７）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌクレオチド配列を有するコンセンサスＤＮＡ３０８７５配列から構築した。
ハイブリダイゼーションプローブ５’−ＧＡＧＣＡＧＡＴＴＧＡＣＣＴＣＡＴＡＣＧＣＣＧＣＡＴＧＴＧＴＧＣＣＴＣＣＴＡＴＴＣＴＧＡＧＣＴＧＧＡ−３’（配列番号：２８）
【０２８４】
全長クローンの供給源としての複数個のライブラリーをスクリーニングするため、ライブラリーからＤＮＡを、上記同定されたＰＣＲプライマー対を用いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、ＰＲＯ３２３遺伝子をコードするクローンを、オリゴヌクレオチドプローブと該ＰＣＲプライマー対の一つを用いて単離するため、陽性ライブラリーを用いた。ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡを、ヒト胎児肝組織（ＬＩＢ６）から単離した。
【０２８５】
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定によって、ＰＲＯ３２３［ここに、ＵＮＱ２８４（ＤＮＡ３５５９５−１２２８）と称する］（配列番号：２３）が得られ、ＰＲＯ３２３のタンパク質配列が推定された。
【０２８６】
ＵＮＱ２８４（ＤＮＡ３５５９５−１２２８）の全ヌクレオチド配列を図１２（配列番号：２３）に示す。クローンＵＮＱ２８４（ＤＮＡ３５５９５−１２２８）は、ヌクレオチド部位１１０−１１２に見かけ上の翻訳開始部位と、ヌクレオチド部位１４０９−１４１１に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリーディングフレームを含む（図１２）。推測されるポリペプチドプレカーサーは、４３３アミノ酸長である（図１３）。図１３に示された全長ＰＲＯ３２３タンパク質は、分子量約４７７８７ダルトンで、ＰＩ約６．１１であると推測される。クローンＵＮＱ２８４（ＤＮＡ３５５９５−１２２８）は、ＡＴＣＣに寄託しており、ＡＴＣＣ寄託番号２０９５２８が付与される。
【０２８７】
全長ＰＲＯ３２３ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、それの一部が、様々なジペプチダーゼタンパク質と有意な相同性を有することが示され、それによって、ＰＲＯ３２３が、新規なジペプチダーゼタンパク質であることが示唆されている。
【０２８８】
実施例８： ヒトＰＲＯ３２７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
発現配列標識（expressed sequence tag）（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース（ＬＩＦＥＳＥＱTM，Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を検索し、様々なＥＳＴ配列が、ヒトプロラクチン受容体タンパク質とのある程度の相同性を示すことを確認した。これらのＥＳＴ配列を、ｐｈｒａｐを用いて整列し、コンセンサス配列を得た。次いで、上記ＥＳＴ配列の供給源を用いて、コンセンサス配列をできるかぎり伸長するため、このコンセンサスＤＮＡ配列を、ＢＬＡＳとｐｈｒａｐの反復サイクルを用いて伸長した。伸長し、まとめた配列を、ここにＤＮＡ３８１１０と称する。上記検索は、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２を用いて行った（Ａｌｔｓｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０−４８０（１９９６））。既知のタンパク質をコードしないＢＬＡＳＴスコアー７０（もしくは、いくつかの事例において９０）以上となるこれらの比較結果を、グループ化し、プログラム「ｐｈａｒｐ」（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ；ｈｔｔｐ：／／ｂｏｚｅｍａｎ．ｍｂｔ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈｒａｐ．ｄｏｃｓ／ｐｈｒａｐ．ｈｔｍｌ）により、コンセンサスＤＮＡ配列にまとめた。
【０２８９】
上記のように得られたＤＮＡ３８１１０コンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを、１）興味のある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを、ＰＣＲによって同定するため、および２）ＰＲＯ３２７をコードする全長の配列のクローンを単離するためのプローブとしての使用のため、合成した。
【０２９０】
ＰＣＲプライマー（前進と逆進）を以下のように合成した：
前進プライマー ５’−ＣＣＣＧＣＣＣＧＡＣＧＴＧＣＡＣＧＴＧＡＧＣＣ−３’（配列番号：３３）
逆進プライマー ５’−ＴＧＡＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡＡＣＴＧＣＴＴＧ−３’（配列番号：３４）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌクレオチド配列を有するコンセンサスＤＮＡ３８１１０コンセンサス配列から構築した。
ハイブリダイゼーションプローブ５’−ＣＡＡＧＴＧＣＧＣＴＧＣＡＡＣＣＣＣＴＴＴＧＧＣＡＴＣＴＡＴＧＧＣＴＣＣＡＡＧＡＡＡＧＣＣＧＧＧＡＴ−３’（配列番号：３５）
【０２９１】
全長クローンの供給源としての複数個のライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからＤＮＡを、上記ＰＣＲプライマー対を用いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、陽性ライブラリーを、オリゴヌクレオチドプローブと上記ＰＣＲプライマーの一つを用い、ＰＲＯ３２７遺伝子をコードするクローンを単離するために用いた。ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡを、ヒト胎児肺組織（ＬＩＢ２６）から単離した。
【０２９２】
上記単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、ＰＲＯ３２７の全長ＤＮＡ配列［ここに、ＵＮＱ２８８（ＤＮＡ３８１１３−１２３０）として称する］（配列番号：１６）を得て、ＰＲＯ３２７のタンパク質配列を推定した。
【０２９３】
ＵＮＱ２８８（ＤＮＡ３８１１３−１２３０）の全ヌクレオチド配列を、図１６（配列番号：３１）に示す。クローンＵＮＱ２８８（ＤＮＡ３８１１３−１２３０）は、ヌクレオチド部位１１９−１２１に見かけ上の翻訳開始部位と、ヌクレオチド部位１３８５−１３８７に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリーディングフレームを含む（図１６）。推測されるポリペプチドプレカーサーは、４２２アミノ酸長である（図１７）。図１７に示された全長ＰＲＯ３２７タンパク質は、分子量約４６３０２ダルトンで、ＰＩ約９．４２であると推測される。クローンＵＮＱ２８８（ＤＮＡ３８１１３−１２３０）は、ＡＴＣＣに寄託しており、ＡＴＣＣ寄託番号２０９５３０が付与されている。
【０２９４】
全長ＰＲＯ３２７ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、それの一部が、ヒトプロラクチン受容体タンパク質と有意な相同性を有することが提示され、それによって、ＰＲＯ３２７が、新規なプロラクチン結合タンパク質であることが示唆されている。
【０２９５】
実施例９： ヒトＰＲＯ２３３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
コンセンサスＤＮＡ配列を、上記実施例１に記載されたように、他のＥＳＴ配列と対応してまとめた。このコンセンサス配列を、ここに、ＤＮＡ３０９４５と称する。ＤＮＡ３０９４５コンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを、１）ＰＣＲによって、興味のある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、および２）ＰＲＯ２３３の全長をコードする配列のクローンを単離するためのプローブとして使用するため、合成した。
【０２９６】
ＰＣＲプライマーを以下のように合成した：
前進ＰＣＲプライマー１ ５’−ＧＧＴＧＡＡＧＧＣＡＧＡＡＡＴＴＧＧＡＧＡＴＧ−３’（配列番号：３８）
逆進ＰＣＲプライマー ５’−ＡＴＣＣＣＡＴＧＣＡＴＣＡＧＣＣＴＧＴＴＴＡＣＣ−３’（配列番号：３９）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌクレオチド配列を有するコンセンサスＤＮＡ３０９４５配列から構築した。
ハイブリダイゼーションプローブ５’−ＧＣＴＧＧＴＧＴＡＧＴＣＴＡＴＡＣＡＴＣＡＧＡＴＴＴＧＴＴＴＧＣＴＡＣＡＣＡＡＧＡＴＣＣＴＣＡＧ−３’（配列番号：４０）
【０２９７】
全長クローンの供給源としての複数個のライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからＤＮＡを、上記同定されたＰＣＲプライマー対を用いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、ＰＲＯ２３３遺伝子をコードするクローンをオリゴヌクレオチドプローブを用いて単離するために、陽性ライブラリーを用いた。ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡを、ヒト胎児脳組織から単離した。
【０２９８】
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定によって、ＰＲＯ２３３［ここに、ＵＮＱ２０７（ＤＮＡ３４４３６−１２３８）と称する］（配列番号：３６）が得られ、ＰＲＯ２３３のタンパク質配列が推定された。
【０２９９】
ＵＮＱ２０７（ＤＮＡ３４４３６−１２３８）の全ヌクレオチド配列を図１８（配列番号：３６）に示す。クローンＵＮＱ２０７（ＤＮＡ３４４３６−１２３８）は、ヌクレオチド部位１０１−１０３に見かけ上の翻訳開始部位と、ヌクレオチド部位１００１−１００３に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリーディングフレームを含む（図１８）。推測されるポリペプチドプレカーサーは、３００アミノ酸長である（図１９）。図１９に示された全長ＰＲＯ２３３タンパク質は、分子量約３２９６４ダルトンで、ＰＩ約９．５２であると推測される。さらに、単一ペプチドと推定上の酸化還元酵素活性部位を含む興味のある領域を、図１９に示す。クローンＵＮＱ２０７（ＤＮＡ３４４３６−１２３８）は、ＡＴＣＣに寄託しており、ＡＴＣＣ寄託番号２０９５２３が付与されている。
【０３００】
全長ＰＲＯ２３３ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、それの一部が、様々な還元酵素タンパク質と有意な相同性を有することが提示され、それによって、ＰＲＯ２３３が、新規な還元酵素タンパク質であることが示唆されている。
【０３０１】
実施例１０： ヒトＰＲＯ３４４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
コンセンサスＤＮＡ配列を、上記実施例１に記載されたように、他のＥＳＴ配列に対応してまとめた。このコンセンサス配列を、ここに、ＤＮＡ３４３９８と称する。ＤＮＡ３４３９８コンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを、１）ＰＣＲによって、興味のある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、および２）ＰＲＯ３４４の全長をコードする配列のクローンを単離するためのプローブとして使用するため、合成した。
【０３０２】
ＤＮＡ３４３９８コンセンサス配列に基づいて、前進と逆進ＰＣＲプライマーを合成した：
前進ＰＣＲプライマー（３４３９８．ｆ１） ５’−ＴＡＣＡＧＧＣＣＣＡＧＴＣＡＧＧＡＣＣＡＧＧＧＧ−３’（配列番号：４３）
前進ＰＣＲプライマー（３４３９８．ｆ２） ５’−ＡＧＣＣＡＧＣＣＴＣＧＣＴＣＴＣＧＧ−３’（配列番号：４４）
前進ＰＣＲプライマー（３４３９８．ｆ３） ５’−ＧＴＣＴＧＣＧＡＴＣＡＧＧＴＣＴＧＧ−３’（配列番号：４５）
逆進ＰＣＲプライマー（３４３９８．ｒ１） ５’−ＧＡＡＡＧＡＧＧＣＡＡＴＧＧＡＴＴＣＧＣ−３’（配列番号：４６）
逆進ＰＣＲプライマー（３４３９８．ｒ２） ５’−ＧＡＣＴＴＡＣＡＣＴＴＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＡＣ−３’（配列番号：４７）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ３４３９８コンセンサス配列から構築した。
ハイブリダイゼーションプローブ５’−ＧＧＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＣＧＧＡＧＴＡＧＣＧＡＧＣＧＣＣＣＣＧＡＡＧ−３’（配列番号：４８）
【０３０３】
全長クローンの供給源としての複数個のライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからＤＮＡを、上記同定されたＰＣＲプライマー対を用いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、オリゴヌクレオチドプローブと該ＰＣＲプライマーの一つを用いて、ＰＲＯ３４４遺伝子をコードするクローンを単離するために、陽性ライブラリーを用いた。ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡを、ヒト胎児腎組織から単離した。
【０３０４】
上記のように単離されたクローンのＤＮＡ配列決定によって、ＰＲＯ３４４の全長のＤＮＡ配列［ここに、ＵＮＱ３０３（ＤＮＡ４０５９２−１２４２）と称する］（配列番号：４１）を得て、ＰＲＯ３４４のタンパク質配列を推定した。
【０３０５】
ＵＮＱ３０３（ＤＮＡ４０５９２−１２４２）の全ヌクレオチド配列を図２０（配列番号：４１）に示す。クローンＵＮＱ３０３（ＤＮＡ４０５９２−１２４２）は、ヌクレオチド部位２２７−２２９に見かけ上の翻訳開始部位と、ヌクレオチド部位９５６−９５８に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリーディングフレームを含む（図２０）。推測ポリペプチドプレカーサーは、２４３アミノ酸長である（図２１）。ＰＲＯ３４４のヌクレオチド１から７２９によってコードされたアミノ酸配列の重要な領域は、図２１に示されているように、単一ペプチド、成熟タンパク質の開始、および潜在的な２個のＮ−ミリストイル化部位を含む。クローンＵＮＱ３０３（ＤＮＡ４０５９２−１２４２）は、ＡＴＣＣに寄託しており、ＡＴＣＣ寄託番号ＡＴＣＣ２０９４９２が付与されている。
【０３０６】
全長ＰＲＯ３４４ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、それらの一部が、様々なヒトおよび齧歯動物の補体タンパク質と有意な相同性を有することが提示され、それによって、ＰＲＯ３４４が、新規な補体タンパク質であることが示唆されている。
【０３０７】
実施例１１： ヒトＰＲＯ３４７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
コンセンサスＤＮＡ配列を、上記実施例１に記載されたように、他のＥＳＴ配列に対応してまとめた。このコンセンサス配列を、ここに、ＤＮＡ３９４９９と称する。ＤＮＡ３９４９９コンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドが、１）ＰＣＲによって、興味のある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、および２）ＰＲＯ３４７の全長をコードする配列のクローンを単離するためのプローブとして使用するため、合成した。
【０３０８】
ＰＣＲプライマー（前進と逆進）を以下のように合成した：
前進ＰＣＲプライマー ５’−ＡＧＧＡＡＣＴＴＣＴＧＧＡＴＣＧＧＧＣＴＣＡＣＣ−３’（配列番号：５１）
逆進ＰＣＲプライマー ５’−ＧＧＧＴＣＴＧＧＧＣＣＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＡＧ−３’（配列番号：５２）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌクレオチド配列を有するコンセンサスＤＮＡ３９４９９配列から構築した。
ハイブリダイゼーションプローブ５’−ＧＣＣＡＡＧＧＡＣＴＣＣＴＴＣＣＧＣＴＧＧＧＣＣＡＣＡＧＧＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＣＣＴＴＣ−３’（配列番号：５３）
【０３０９】
全長クローンの供給源としての複数個のライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからＤＮＡを、上記同定したＰＣＲプライマー対を用いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、オリゴヌクレオチドプローブと該ＰＣＲプライマーの一つを用いて、ＰＲＯ３４７遺伝子をコードするクローンを単離するために、陽性ライブラリーを用いた。ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡを、ヒト胎児腎組織（ＬＩＢ２２８）から単離した。
【０３１０】
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定によって、ＰＲＯ３４７の全長のＤＮＡ配列［ここに、ＵＮＱ３０６（ＤＮＡ４４１７６−１２４４）と称する］（配列番号：４９）を得て、ＰＲＯ３４７のタンパク質配列を推定した。
【０３１１】
ＵＮＱ３０６（ＤＮＡ４４１７６−１２４４）の全ヌクレオチド配列を図２２（配列番号：４９）に示す。クローンＵＮＱ３０６（ＤＮＡ４４１７６−１２４４）は、ヌクレオチド部位１２３−１２５に見かけ上の翻訳開始部位と、ヌクレオチド部位１４８８−１４９０に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリーディングフレームを含む（図２２）。推測されるポリペプチドプレカーサーは、４５５アミノ酸長である（図２３）。図２３に示された全長ＰＲＯ３４７タンパク質は、分子量約５０４７８ダルトンで、ＰＩ約８．４４であると推測される。クローンＵＮＱ３０６（ＤＮＡ４４１７６−１２４４）は、ＡＴＣＣに寄託しており、ＡＴＣＣ寄託番号２０９５３２が付与されている。
【０３１２】
全長ＰＲＯ３４７ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、それの一部が、様々なシステインに富む分泌タンパク質と有意な相同性を有することが提示され、それによって、ＰＲＯ３４７が、新規なシステインに富む分泌タンパク質であることが示唆されている。
【０３１３】
実施例１２： ヒトＰＲＯ３５４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
発現配列標識（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ）（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース（ＬＩＦＥＳＥＱTM， Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を検索し、インター-アルファ-トリプシンインヒビター重鎖と、およびお互いに、ある程度の相同性を有する様々なＥＳＴ配列を同定した。次いで、相同のＥＳＴ配列を整列し、コンセンサス配列を得た。次いで、公的ＥＳＴデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）と私的ＥＳＴ ＤＮＡデータベース（ＬＩＦＥＳＥＱTM，Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）の両方から得られた相同ＥＳＴ配列を用い、コンセンサス配列をできるかぎり伸長するために、ＢＬＡＳとｐｈｒａｐの反復サイクルを用い、得られたコンセンサスＤＮＡ配列を伸長した。伸長し、まとめた配列を、ここにＤＮＡ３９６３３と称する。上記検索を、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２を用いて実行した（Ａｌｔｓｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０−４８０（１９９６））。既知のタンパク質をコードしないＢＬＡＳＴスコアー７０（もしくは、いくつかの事例において９０）以上となるこれらの比較結果を、プログラム「ｐｈａｒｐ」（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ； ｈｔｔｐ：／／ｂｏｚｅｍａｎ．ｍｂｔ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈｒａｐ．ｄｏｃｓ／ｐｈｒａｐ．ｈｔｍｌ）を用い、グループ化し、コンセンサスＤＮＡ配列にまとめた。
【０３１４】
ＤＮＡ３９６３３コンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを、１）興味のある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを、ＰＣＲによって同定するため、および２）ＰＲＯ３５４をコードする全長配列のクローンを単離するためのプローブとしての使用のため、合成した。前進と逆進ＰＣＲプライマーは、一般的に、２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば、長さ約１００−１０００ｂｐのＰＣＲ生成物を与えるように設計する。プローブの配列は、典型的には、長さ４０−５５ｂｐである。いくつかの事例において、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂを超える時、付加的なオリゴヌクレオチドを合成する。全長クローンのためのいくつかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからＤＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに従って、ＰＣＲプライマー対を用い、ＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、オリゴヌクレオチドプローブもしくはプライマー対の一つを用い、興味のある遺伝子をコードするクローンを単離するために、陽性のライブラリーを用いた。
【０３１５】
ＰＣＲプライマー（前進と逆進）を以下のように合成した：
前進プライマー１（３９６３３．ｆ１） ５’−ＧＴＧＧＧＡＡＣＣＡＡＡＣＴＣＣＧＧＣＡＧＡＣＣ−３’（配列番号：５６）
前進プライマー２（３９６３３．ｆ２） ５’−ＣＡＣＡＴＣＧＡＧＣＧＴＣＴＣＴＧＧ−３’（配列番号：５７）
逆進プライマー（３９６３３．ｒ１） ５’−ＡＧＣＣＧＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＧＧＴＴＣＡＴＣＧ−３’（配列番号：５８）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌクレオチド配列を有するコンセンサスＤＮＡ３９６３３配列から構築した。
ハイブリダイゼーションプローブ５’−ＴＧＧＡＡＧＧＡＣＣＡＣＴＴＧＡＴＡＴＣＡＧＴＣＡＣＴＣＣＡＧＡＣＡＧＣＡＴＣＡＧＧＧＡＴＧＧＧ−３’（配列番号：５９）
【０３１６】
全長クローンの供給源としての複数個のライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからＤＮＡを、上記ＰＣＲプライマー対を用いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、オリゴヌクレオチドプローブと上記ＰＣＲプライマーの一つを用いて、ＰＲＯ３５４遺伝子をコードするクローンを単離するために、陽性のライブラリーを用いた。
【０３１７】
ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡを、ヒト胎児腎組織（ＬＩＢ２２７）から単離した。ｃＤＮＡクローンを単離するために用いたｃＤＮＡライブラリーを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡなどから商業的に利用できる試薬を用いた標準的な方法によって構築した。ｃＤＮＡを、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴプライマーで合成し、ＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに平滑端で連結し、ＮｏｔＩ部位で切断し、適切にゲル電気泳動によりサイズ分画し、好適なクローニングベクター［例えば、ｐＲＫＢもしくはｐＲＫＤ；ｐＲＫ５Ｂは、ＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１２７８−１２８０（１９９１）参照］に、特有のＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ部位で、定められた方向でクローニングした。
【０３１８】
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列により、ＰＲＯ３５４の全長のＤＮＡ配列［ここに、ＵＮＱ３１１（ＤＮＡ４４１９２−１２４６）として称する］（配列番号：５４）を得て、ＰＲＯ３５４のタンパク質配列を推定した。
【０３１９】
ＵＮＱ３１１（ＤＮＡ４４１９２−１２４６）の全ヌクレオチド配列を図２４（配列番号：５４）に示す。クローンＵＮＱ３１１（ＤＮＡ４４１９２−１２４６）は、ヌクレオチド部位７２−７４に見かけ上の翻訳開始部位と、ヌクレオチド部位２１５４−２１５６に終止コドンでの終止とを有する単一のオープンリーディングフレームを含む（図２４）。推測されるポリペプチドプレカーサーは、６９４アミノ酸長である（図２５）。図２５に示した全長ＰＲＯ３５４タンパク質は、分子量約７７４００ダルトンで、ＰＩ約９．５４であると推測される。クローンＵＮＱ３１１（ＤＮＡ４４１９２−１２４６）は、ＡＴＣＣに寄託しており、ＡＴＣＣ寄託番号ＡＴＣＣ２０９５３１が付与されている。
【０３２０】
全長ＰＲＯ３５４ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、それの一部が、インター-アルファ-トリプシンインヒビター重鎖タンパク質と有意な相同性を有することが提示され、それによって、ＰＲＯ３５４が、新規なインター-アルファ-トリプシンインヒビター重鎖タンパク相同体であることが示唆されている。
【０３２１】
実施例１３： ヒトＰＲＯ３５５をコードするｃＤＮＡクローンの単離
コンセンサスＤＮＡ配列を、上記実施例１に記載されたように、ＢＬＡＳＴとｐｈｒａｐを用いて、他のＥＳＴ配列に対応してまとめた。このコンセンサス配列を、ここに、ＤＮＡ３５７０２と称する。ＤＮＡ３５７０２コンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを、１）ＰＣＲによって、興味ある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、および２）ＰＲＯ３５５の全長をコードする配列のクローンを単離するためのプローブとして使用するため、合成した。
【０３２２】
前進と逆進のＰＣＲプライマーを以下のように合成した：
前進ＰＣＲプライマー（．ｆ１） ５’−ＧＧＣＴＴＣＴＧＣＴＧＴＴＧＣＴＣＴＴＣＴＣＣＧ−３’（配列番号：６２）
前進ＰＣＲプライマー（．ｆ２） ５’−ＧＴＡＣＡＣＴＧＴＧＡＣＣＡＧＴＣＡＧＣ−３’（配列番号：６３）
前進ＰＣＲプライマー（．ｆ３） ５’−ＡＴＣＡＴＣＡＣＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡＧＣ−３’（配列番号：６４）
逆進ＰＣＲプライマー（．ｒ１） ５’−ＴＴＣＡＡＴＣＴＣＣＴＣＡＣＣＴＴＣＣＡＣＣＧＣ−３’（配列番号：６５）
逆進ＰＣＲプライマー（．ｒ２） ５’−ＡＴＡＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＣＴＧＣＧ−３’（配列番号：６６）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌクレオチド配列を有するコンセンサスＤＮＡ３５７０２配列から構築した。
ハイブリダイゼーションプローブ５’−ＣＧＣＧＧＣＡＣＴＧＡＴＣＣＣＣＡＣＡＧＧＴＧＡＴＧＧＧＣＡＧＡＡＴＣＴＧＴＴＴＡＣＧＡＡＡＧＡＣＧ−３’（配列番号：６７）
【０３２３】
全長のクローンの供給源としての複数個のライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからＤＮＡを、上記同定されたＰＣＲプライマー対の一つを用いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、陽性ライブラリーを、オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ＰＲＯ３５５遺伝子をコードするクローンを単離するために用いた。ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡを、ヒト胎児肝組織から単離した。
【０３２４】
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定によって、ＰＲＯ３５５の全長のＤＮＡ配列［ここに、ＵＮＱ３１２（ＤＮＡ３９５１８−１２４７）と称する］（配列番号：６０）を得て、ＰＲＯ３５５のタンパク質配列を推定した。
【０３２５】
ＵＮＱ３１２（ＤＮＡ３９５１８−１２４７）の全ヌクレオチド配列を図２６（配列番号：６０）に示す。クローンＵＮＱ３１２（ＤＮＡ３９５１８−１２４７）は、ヌクレオチド部位２２−２４に見かけ上の翻訳開始部位と、ヌクレオチド部位１３４２−１３４４に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリーディングフレームを含む（図２６）。推測されるポリペプチドプレカーサーは、４４０アミノ酸長である（図２７）。図２７に示された全長ＰＲＯ３５５タンパク質は、分子量約４８２４０ダルトンで、ＰＩ約４．９３であると推測される。さらに、単一ペプチド、細胞外ドメインにおけるＩｇ反復、潜在的なＮ−グリコシル化部位、および潜在的なトランスメンブランドメインを含む興味ある領域が、図２７に示されている。クローンＵＮＱ３１２（ＤＮＡ３９５１８−１２４７）は、ＡＴＣＣに寄託しており、ＡＴＣＣ寄託番号ＡＴＣＣ２０９５２９が付与されている。
【０３２６】
全長ＰＲＯ３５５ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、それの一部が、ＣＲＴＡＭタンパク質と有意な相同性を有することが提示され、それによって、ＰＲＯ３５５が、ＣＲＴＡＭタンパク質であることが示唆されている。
【０３２７】
実施例１４： ヒトＰＲＯ３５７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡによるｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔａｇクローン番号「２４５２９７２」を、データベース検索を始めるために用いた。Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ公的タンパク質データベースからの約９５０個の既知分泌タンパク質から、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列（もしあるならば、分泌シグナルを含む）を、Ｉｎｃｙｔｅ ＥＳＴクローン番号「２４５２９７２」の一部と重複した発現配列標識（ＥＳＴ）データベースを検索するために用いた。ＥＳＴデータベースは、公的ＥＳＴデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）と、私的ＥＳＴ ＤＮＡデータベース（ＬＩＦＥＳＥＱTM，Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を含む。上記検索を、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２を用い［Ａｌｔｓｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０−４８０（１９９６）］、ＥＣＤタンパク質配列をＥＳＴ配列の６フレーム翻訳と比較して実行した。既知のタンパク質をコードしないＢＬＡＳＴスコアー７０（もしくは、いくつかの事例において９０）以上となるこれらの比較結果を、プログラム「ｐｈａｒｐ」（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ；ｈｔｔｐ：／／ｂｏｚｅｍａｎ．ｍｂｔ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈｒａｐ．ｄｏｃｓ／ｐｈｒａｐ．ｈｔｍｌ）を用い、グループ化し、コンセンサスＤＮＡ配列にまとめた。
【０３２８】
次いで、コンセンサスＤＮＡ配列を、ｐｈｒａｐを用い、他のＥＳＴ配列に対応してまとめた。このコンセンサス配列を、ここではＤＮＡ３７１６２と称する。この事例において、上記ＥＳＴ配列の供給源を用い、コンセンサス配列をできるかぎり伸長させるために、コンセンサスＤＮＡ配列を、ＢＬＡＳとｐｈｒａｐの反復サイクルを用いて伸長した。
【０３２９】
ＤＮＡ３７１６２コンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを、１）興味のある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを、ＰＣＲによって同定するため、および２）ＰＲＯ３５７をコードする全長配列のクローンを単離するためのプローブとしての使用のため、合成した。前進と逆進ＰＣＲプライマーは、一般的に、２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば、長さ約１００−１０００ｂｐのＰＣＲ生成物を得るために設計される。プローブの配列は、典型的には、長さ４０−５５ｂｐである。いくつかの事例において、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂを超える時、付加的なオリゴヌクレオチドを合成する。全長のクローンのためのいくつかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからＤＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｅ Ｐｒｏｒｏｃｏｌｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに従って、ＰＣＲプライマー対を用いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、陽性のライブラリーを、オリゴヌクレオチドプローブとプライマー対の一つを用い、興味のある遺伝子をコードするクローンを単離するために用いた。
【０３３０】
ＰＣＲプライマーを以下のように合成した：
前進プライマー１ ５’−ＣＣＣＴＣＣＡＣＴＧＣＣＣＣＡＣＣＧＡＣＴ−３’（配列番号：７０）；
逆進プライマー１ ５’−ＣＧＧＴＴＣＴＧＧＧＧＡＣＧＴＴＡＧＧＧＣＴＣＧ−３’（配列番号：７１）；および前進プライマー２ ５’−ＣＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＣＣＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＡＴ−３’（配列番号：７２）。
さらに、２つの合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌクレオチド配列を有するコンセンサスＤＮＡ３７１６２配列から構築した。
ハイブリダイゼーションプローブ１；
５’−ＡＧＧＡＣＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＣＣＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＡＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＴＧＣＣＡＣＣ−３’（配列番号：７３）；およびハイブリダイゼーションプローブ２５’−ＡＣＧＣＡＡＡＧＣＣＣＴＡＣＡＴＣＴＡＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＣＡＧＧＧＣＡＧＣＴＧＧＧ−３’（配列番号：７４）。
【０３３１】
全長クローンの供給源としての複数個のライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからＤＮＡを、上記ＰＣＲプライマー対を用いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、オリゴヌクレオチドプローブとＰＣＲプライマーの一つを用い、ＰＲＯ３５７遺伝子をコードするクローンを単離するため、陽性のライブラリーを用いた。
【０３３２】
ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのＲＮＡを、ヒト胎児肝組織から単離した。ｃＤＮＡクローンを単離するために用いたｃＤＮＡライブラリーを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡなどから商業的に利用できる試薬を用いた標準的な方法によって構築した。ｃＤＮＡを、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴプライマーで合成し、ＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに平滑端で連結し、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動により適切にサイズ分画し、好適なクローニングベクター［例えば、ｐＲＫＢもしくはｐＲＫＤ；ｐＲＫ５Ｂは、ＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１２７８−１２８０（１９９１）参照］に、特有のＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ部位で、定められた方向でクローニングした。
【０３３３】
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、ＰＲＯ３５７の全長のＤＮＡ配列［ここに、ＵＮＱ３１４（ＤＮＡ４４８０４−１２４８）としてする］（配列番号：６８）を得て、ＰＲＯ３５７のタンパク質配列を推定した。
【０３３４】
ＵＮＱ３１４（ＤＮＡ４４８０４−１２４８）の全ヌクレオチド配列を図２８（配列番号：６８）に示す。クローンＵＮＱ３１４（ＤＮＡ４４８０４−１２４８）は、ヌクレオチド部位１３７−１３９に見かけ上の翻訳開始部位と、ヌクレオチド部位１９３１−１９３３に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリーディングフレームを含む（図２８）。推測されるポリペプチドプレカーサーは、５９８アミノ酸長である（図２９）。クローンＵＮＱ３１４（ＤＮＡ４４８０４−１２４８）は、ＡＴＣＣに寄託しており、ＡＴＣＣ寄託番号ＡＴＣＣ２０９５２７が付与されている。
【０３３５】
さらなる分析により、図２９に示すような様々な特性が示されている。図２９には、配列番号：６８のヌクレオチド１３７から１９３０まで得られたアミノ酸配列（配列番号：６９）を示す。分子量が６３０３０ダルトン；ｐＩが７．２４；およびＮＴ（Ｓ／Ｔ）が３である。推定されるトランスメンブレンドメインは、図２９においてアミノ酸５０６から５２４までに示される。もしくは、トランスメンブレン領域はアミノ酸４９７の「Ｇ」で始まる。潜在的なＮ−グリコシル化部位は、図２９の下線部位である。ＥＧＦ様ドメインのシステインパターンサインが、アミノ酸３５５から３６６までに見られる。また、この領域は、ラットにおける乳脂乳球タンパク質、切痕、もしくは肝細胞増殖因子変換酵素においても認められる。また、このシグナルペプチドは、図２９のアミノ酸１−２２にもある。ＡＬＳとの相同の最初と、細胞外ドメインにおける他のロイシン反復に富むタンパク質が、アミノ酸部位２４から始まる。
【０３３６】
これゆえ、全長ＰＲＯ３５７のアミノ酸配列の分析から、それの一部が、ＡＬＳとの有意な相同性を有することが提示され、これによって、ＰＲＯ３５７がＡＬＳに関する新規のロイシン富反復タンパク質であることが示唆される。
【０３３７】
実施例１５： ヒトＰＲＯ７１５をコードするｃＤＮＡクローンの単離
私的ＥＳＴ ＤＮＡデータベース（ＬＩＦＥＳＥＱTM，Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を、ヒトＴＮＦ−αの相同性を有するポリペプチドをコードするＥＳＴ配列について検索した。この検索により、Ｉｎｃｙｔｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ Ｎｏ．２０９９８５５を同定した。
【０３３８】
次いで、コンセンサスＤＮＡ配列を、ｓｅｑｅｘｔと「ｐｈｒａｐ」（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ； ｈｔｔｐ：／／ｂｏｚｅｍａｎ．ｍｂｔ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈｒａｐ．ｄｏｃｓ／ｐｈｒａｐ．ｈｔｍｌ）を用い、その他のＥＳＴ配列に対応してまとめた。このコンセンサス配列を、ここにＤＮＡ５２０９２と称する。この構成に同定された様々なＥＳＴクローンの定序に基づいて、Ｍｅｒｃｋ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＥＳＴセット（ＥＳＴクローン番号．７２５８８７、受託番号．ＡＡ２９２３５８）から単一のＥＳＴクローンを得て、その挿入物を配列決定した。次いで、全長ＤＮＡ５２７２２−１２２９配列を、ＥＳＴクローン番号．７２５８８７からの挿入ＤＮＡの配列決定によって得た。
【０３３９】
ＵＮＱ３８３（ＤＮＡ５２７２２−１２２９）の全ヌクレオチド配列を、図３０（配列番号：７５）において示す。クローンＵＮＱ３８３（ＤＮＡ５２７２２−１２２９）は、ヌクレオチド部位１１４−１１６に見かけ上の翻訳開始部位を含み、ヌクレオチド部位８６４−８６６に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリ−ディングフレームを含む。推定されるポリペプチドは、２５０アミノ酸長（図３１）である。図３１に示される全長のＰＲＯ７１５は、分子量約２７４３３ダルトン、ｐＩ約９．８５であると推定される。
【０３４０】
全長ＰＲＯ７１５ポリペプチドのアミノ酸配列の分析より、タンパク質の腫瘍壊死因子ファミリーの一員と有意な相同性を有すことが提示され、それによって、ＰＲＯ７１５が、新規な腫瘍壊死因子タンパク質であることが示されている。
【０３４１】
実施例１６： ヒトＰＲＯ３５３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
コンセンサスＤＮＡ配列を、上記実施例１に記載されたように、ｐｈｒａｐを用い、他のＥＳＴ配列に対応してまとめた。このコンセンサス配列を、ここに、ＤＮＡ３６３６３と称する。上記ＥＳＴ配列の供給源を用い、コンセンサス配列をできる限り伸長させるため、ＢＬＡＳＴおよびｐｈｒａｐの反復サイクルを用い、該コンセンサスＤＮＡ配列を伸長した。ＤＮＡ３６３６３コンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを、１）ＰＣＲによって、興味のある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、および２）ＰＲＯ３５３の全長をコードする配列のクローンを単離するためのプローブとして使用するため、合成した。
【０３４２】
ＤＮＡ３６３６３コンセンサス配列に基づいて、前進と逆進のＰＣＲプライマーを以下のように合成した：
前進ＰＣＲプライマー（３６３６３．ｆ１） ５’−ＴＡＣＡＧＧＣＣＣＡＧＴＣＡＧＧＡＣＣＡＧＧＧＧ−３’（配列番号：８７）
逆進ＰＣＲプライマー（３６３６３．ｒ１） ５’−ＣＴＧＡＡＧＡＡＧＴＡＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＡＣＧ−３’（配列番号：８８）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌクレオチド配列を有するコンセンサスＤＮＡ３６３６３配列から構築した。
ハイブリダイゼーションプローブ ３６３６３．ｐ１５’−ＣＣＣＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＣＴＧＣＴＧＴＧＡＣＣＣＣＧＧＴＡＣＣＴＣＣＡＴＧＴＡＣＣＣＧＧ−３’（配列番号：８９）
【０３４３】
全長クローンの供給源としての複数個のライブラリーをスクリーニングするため、ライブラリーからＤＮＡを、上記同定されたＰＣＲプライマー対の一つを用いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、オリゴヌクレオチドプローブとＰＣＲプライマー対の一つを用いて、ＰＲＯ３５５遺伝子をコードするクローンを単離するため、陽性ライブラリーを用いた。ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡを、ヒト胎児腎組織から単離した。
【０３４４】
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定によって、ＰＲＯ３５３の全長のＤＮＡ配列［ここに、ＵＮＱ３１０（ＤＮＡ４１２３４−１２４２）と称する］（配列番号：８５）を得て、ＰＲＯ３５３のタンパク質配列を推定した。
【０３４５】
ＵＮＱ３１０（ＤＮＡ４１２３４−１２４２）の全ヌクレオチド配列を図３４（配列番号：８５）に示す。クローンＵＮＱ３１０（ＤＮＡ４１２３４−１２４２）は、ヌクレオチド部位３０５−３０７に見かけ上の翻訳開始部位と、ヌクレオチド部位１１４８−１１５０に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリーディングフレームを含む（図３４）。推測されるポリペプチドプレカーサーは、２８１アミノ酸長である（図３５）。ＰＲＯ３５３によってコードされるアミノ酸配列の重要な領域には、アミノ酸１−２６に相当する単一ペプチド、アミノ酸部位２７に成熟タンパクの開始、アミノ酸９３−９８に相当する潜在的なＮ−グリコシル化部位、および、アミノ酸９９−２８１に相当する、３０ｋｄの脂肪細胞補体−関連タンパク質前駆体と相同性を有する領域を含む。クローンＵＮＱ３１０（ＤＮＡ４１２３４−１２４２）は、ＡＴＣＣに寄託しており、ＡＴＣＣ寄託番号ＡＴＣＣ２０９６１８が付与されている。
【０３４６】
全長ＰＲＯ３５３ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、それらの一部が、ヒトおよび齧歯動物の補体タンパク質と有意な相同性を有することが示され、それによって、ＰＲＯ３５５が、新規な補体タンパク質であることが示唆されている。
【０３４７】
実施例１７： ヒトＰＲＯ３６１をコードするｃＤＮＡクローンの単離 コンセンサスＤＮＡ配列を、上記実施例１に記載されたように、ｐｈｒａｐを用い、他のＥＳＴ配列に対応してまとめた。このコンセンサス配列を、ここに、ＤＮＡ４０６５４と称する。ＤＮＡ４０６５４コンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを、１）ＰＣＲによって、興味のある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、および２）ＰＲＯ３６１の全長をコードする配列のクローンを単離するためのプローブとして使用するため、合成した。
【０３４８】
前進と逆進のＰＣＲプライマーを以下のように合成した：
前進ＰＣＲプライマー（．ｆ１） ５’−ＡＧＧＧＡＧＧＡＴＴＡＴＣＣＴＴＧＡＣＣＴＴＴＧＡＡＧＡＣＣ−３’（配列番号：９２）
前進ＰＣＲプライマー（．ｆ２） ５’−ＧＡＡＧＣＡＡＧＴＧＣＣＣＡＧＣＴＣ−３’（配列番号：９３）
前進ＰＣＲプライマー（．ｆ３） ５’−ＣＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＴＣＴＴＴＧＧ−３’（配列番号：９４）
逆進ＰＣＲプライマー（．ｒ１） ５’−ＣＡＣＣＧＴＡＧＣＴＧＧＧＡＧＣＧＣＡＣＴＣＡＣ−３’（配列番号：９５）
逆進ＰＣＲプライマー（．ｒ２） ５’−ＡＧＴＧＴＡＡＧＴＣＡＡＧＣＴＣＣＣ−３’（配列番号：９６）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌクレオチド配列を有するコンセンサスＤＮＡ４０６５４配列から構築した。
ハイブリダイゼーションプローブ ５’−ＧＣＴＴＣＣＴＧＡＣＡＣＴＡＡＧＧＣＴＧＴＣＴＧＣＴＡＧＴＣＡＧＡＡＴＴＧＣＣＴＣＡＡＡＡＡＧＡＧ−３’（配列番号：９７）
【０３４９】
全長のクローンの供給源としての複数個のライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからＤＮＡを、上記同定されたＰＣＲプライマー対の一つを用いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、オリゴヌクレオチドプローブを用い、ＰＲＯ３６１遺伝子をコードするクローンを単離するため、陽性ライブラリーを用いた。ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡを、ヒト胎児腎組織から単離した。
【０３５０】
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定によって、ＰＲＯ３５３の全長のＤＮＡ配列［ここに、ＵＮＱ３１６（ＤＮＡ４５１４０−１２５０）と称する］（配列番号：９０）を得て、ＰＲＯ３５３のタンパク質配列を推定した。
【０３５１】
ＵＮＱ３１６（ＤＮＡ４５４１０−１２５０）の全ヌクレオチド配列を図３６（配列番号：９０）に示す。クローンＵＮＱ３１６（ＤＮＡ４５４１０−１２５０）は、ヌクレオチド部位２２６−２２８に見かけ上の翻訳開始部位と、ヌクレオチド部位１５１９−１５２１に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリーディングフレームを含む（図３６）。推測されるポリペプチドプレカーサーは、４３１アミノ酸長である（図３７）。図３７に示されている全長のＰＲＯ３６１タンパク質は、分子量約４６８１０ダルトン、ｐＩ約６．４５であると推定される。さらに、トランスメンブレンドメイン（アミノ酸３８０−４０９）とアルギナーゼファミリーのタンパク質に典型的な配列（アミノ酸３−１４と３９−５７）を含む興味のある領域を、図３７に示す。クローンＵＮＱ３１６（ＤＮＡ４５４１０−１２５０）は、ＡＴＣＣに寄託しており、ＡＴＣＣ寄託番号ＡＴＣＣ２０９６２１が付与されている。
【０３５２】
全長ＰＲＯ３６１ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、それの一部が、ムチンおよび／もしくはキチナーゼタンパク質と有意な相同性を有することが示され、それによって、ＰＲＯ３５５が、新規なムチンおよび／もしくはキチナーゼタンパク質であることが示唆されている。
【０３５３】
実施例１８： ヒトＰＲＯ３６５をコードするｃＤＮＡクローンの単離
コンセンサスＤＮＡ配列を、上記実施例１に記載したように、ｐｈｒａｐを用い、他のＥＳＴ配列に対応してまとめた。このコンセンサス配列を、ここに、ＤＮＡ３５６１３と称する。ＤＮＡ３５６１３コンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを、１）ＰＣＲによって、興味のある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、および２）ＰＲＯ３６５の全長をコードする配列のクローンを単離するためのプローブとして使用するため、合成した。
【０３５４】
前進と逆進のＰＣＲプライマーを以下のように合成した：
前進ＰＣＲプライマー（．ｆ１−３５６１３） ５’−ＡＡＴＧＴＧＡＣＣＡＣＴＧＧＡＣＴＣＣＣ−３’（配列番号：１００）
前進ＰＣＲプライマー（．ｆ２−３５６１３） ５’−ＡＧＧＣＴＴＧＧＡＡＣＴＣＣＣＴＴＣ−３’（配列番号：１０１）
逆進ＰＣＲプライマー（．ｒ１−３５６１３） ５’−ＡＡＧＡＴＴＣＴＴＧＡＧＣＧＡＴＴＣＣＡＧＣＴＧ−３’（配列番号：１０２）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌクレオチド配列を有するコンセンサスＤＮＡ３５６１３配列から構築した。
ハイブリダイゼーションプローブ ５’−ＡＡＴＣＣＣＴＧＣＴＣＴＴＣＡＴＧＧＴＧＡＣＣＴＡＴＧＡＣＧＡＣＧＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＡＣＴＧ−３’（配列番号：１０３）
【０３５５】
全長のクローンの供給源としての複数個のライブラリーをスクリーニングするため、ライブラリーからＤＮＡを、上記同定したＰＣＲプライマー対の一つを用いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ＰＲＯ３６５遺伝子をコードするクローンを単離するために、陽性ライブラリーを用いた。ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡを、ヒト胎児腎組織から単離した。
【０３５６】
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定によって、ＰＲＯ３６５の全長のＤＮＡ配列［ここに、ＵＮＱ３２０（ＤＮＡ４６７７７−１２５３）と称する］（配列番号：９８）を得て、ＰＲＯ３６５のタンパク質配列を推定した。
【０３５７】
ＵＮＱ３２０（ＤＮＡ４６７７７−１２５３）の全ヌクレオチド配列を図３８（配列番号：９８）に示す。クローンＵＮＱ３２０（ＤＮＡ４６７７７−１２５３）は、ヌクレオチド部位１５−１７に見かけ上の翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド部位７２０−７２２に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリーディングフレームを含む（図３８）。推測されるポリペプチドプレカーサーは、２３５アミノ酸長である（図３９）。クローンＵＮＱ３２０（ＤＮＡ４６７７７−１２５３）によってコードされるポリペプチド配列の重要な領域が、同定され、図３９に示す以下のものを含む：アミノ酸１−２０に相当する単一ペプチド、アミノ酸２１に相当する成熟タンパクの開始、多数の潜在的なＮ−グリコシル化部位。クローンＵＮＱ３２０（ＤＮＡ４６７７７−１２５３）は、ＡＴＣＣに寄託しており、ＡＴＣＣ寄託番号ＡＴＣＣ２０９６１９が付与されている。
【０３５８】
全長ＰＲＯ３６５ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、それの一部が、ヒト２−１９タンパク質と有意な相同性を有することが示され、それによって、ＰＲＯ３６５が、新規なヒト２−１９タンパク相同体であることが示唆されている。
【０３５９】
実施例１９：ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸のハイブリダイゼーションプローブとしての使用
以下の方法は、ハイブリダイゼーションプローブとして、ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸配列の使用について記載する。
ここに開示された興味のあるＰＲＯポリペプチドのコード化配列を含むＤＮＡを、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリーもしくはヒト組織染色体ライブラリーにおいて、相同ＤＮＡ（例えば、ＰＲＯポリペプチドの天然の変種をコードするものなど）をスクリーニングするためのプローブとして、もしくはプローブを調製するための塩基として用いることができる。
【０３６０】
どちらかのライブラリーＤＮＡを含むフィルターのハイブリダイゼーションおよび洗浄は、以下の高ストリンジェント条件下で行う。放射性同位元素標識化ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸由来のプローブのフィルターへのハイブリダイゼーションを、５０％ホルムアミド溶液、５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２ｘデンハート溶液、および１０％デキストラン硫酸中、４２℃で２０時間行う。フィルターの洗浄は、０．１ｘＳＳＣと０．１％ＳＤＳの水溶液中、４２℃で行う。
【０３６１】
次いで、全長の天然ＰＲＯポリペプチド配列をコードするＤＮＡと同一の所望の配列を有するＤＮＡを、当該分野において公知の標準的な方法を用いて同定することができる。
【０３６２】
実施例２０： 大腸菌におけるＰＲＯポリペプチドの発現
本実施例では、大腸菌における組み換え発現による所望のＰＲＯポリペプチドのグリコシル化されていない型の調製について説明する。
【０３６３】
所望のＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、最初に、選択したＰＣＲプライマーを用いて増幅する。該プライマーは、選択された発現ベクター上の制限酵素部位に相当する制限酵素部位を含まなければならない。様々な発現ベクターが用いられ得る。好適なベクターの例は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２２［大腸菌由来；Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ、２：９５（１９９７）参照］である。ベクターは、制限酵素で消化し、脱リン酸化する。次いで、ＰＣＲで増幅した配列を、ベクター内に結紮させる。ベクターは、好ましくは、抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ポリｈｉｓリーダー（最初の６ＳＴＩＩコドン、ポリｈｉｓ配列およびエンテロキナーゼ切断部位を含む）、特異的ＰＲＯポリペプチドコード化領域、ラムダ転写終結因子、ａｒｇＵ遺伝子をコードする配列を含む。
【０３６４】
次いで、結紮混合物を、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載された方法を用いて、選択された大腸菌株を形質転換するために用いた。形質転換体は、ＬＢプレート上での増殖能によって同定し、次いで、抗生物質耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素分析およびＤＮＡ配列決定によって確認することができる。
【０３６５】
選択したクローンを、抗生物質を補充したＬＢ培地などの液体培養培地中で一晩培養することができる。続いて、一晩培養物を、大規模培養に播種するために用いる。次いで、発現プロモータが始動する所望の光学密度まで、細胞を培養する。
【０３６６】
さらに数時間培養後、細胞を遠心分離によって回収することができる。遠心分離によって得られた細胞ペレットを、当該分野において公知の様々な試薬を用いて可溶化し、次いで、可溶化ＰＲＯポリペプチドを、該タンパク質との強固な結合を許容する条件下で金属錯体カラムを用い、精製することができる。
【０３６７】
ＰＲＯ２４１は、以下の操作により、ポリ−Ｈｉｓ標識化形態で、大腸菌に発現させることができた。ＰＲＯ２４１をコードするＤＮＡは、最初に、選択したＰＣＲプライマーを用いて増幅した。該プライマーは、選択された発現ベクター上の制限酵素部位に相当する制限酵素や、効果的かつ確かな翻訳の開始、金属錯体カラム上での速やかな精製、およびエンテロキナーゼのタンパク分解除去を提供するその他の有用な配列を含む。ＰＣＲ増幅、ポリ−Ｈｉｓ標識化配列を、次いで、発現ベクターに結紮し、株５２（Ｗ３１１０ｆｕｈＡ（ｔｏｎＡ） ｌｏｎ ｇａｌＥ ｒｐｏＨｉｓ（ｈｔｐＲｔｓ） ｃＩｐＰ（ｌａｃＩｑ）に基づく大腸菌宿主を形質転換させるために用いた。最初に、形質転換体を、５０ｍｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＬＢ培地中、３０℃で、Ｏ．Ｄ．６００が３−５になるまで、振とう培養した。次いで、培養物を、ＣＲＡＰ培地［１１０ｍＭ ＭＰＯＳ、ｐＨ７．３、０．５５％（ｗ／ｖ）グルコースおよび７ｍＭ ＭｇＳＯ4と同様に、３．５７ｇ （ＮＨ4）2ＳＯ4、０．７１ｇクエン酸ナトリウム・２水和物、１．０７ｇＫＣｌ、５．３６ｇ Ｄｉｆｃｏ酵母エキス、５．３６ｇ Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ ｈｙｃａｓｅ ＳＦを５００ｍＬ水に混合することによって調製した］中、５０−１００倍に希釈し、おおよそ２０−３０時間、３０℃で振とう培養した。試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって発現を確かめるために除去し、大量の培養物を遠心分離して細胞ペレットとした。細胞ペレットは、精製および再生まで凍結させた。
【０３６８】
０．５から１Ｌ培養物から得られた大腸菌ペースト（６−１０ｇペレト）を、７Ｍグアニジン、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８緩衝液中、１０容量（ｗ／ｖ）に懸濁させた。固形の亜硫酸ナトリウム塩と液体の四チオン酸塩を、最終濃度が各々０．１Ｍおよび０．０２Ｍとなるまで添加し、溶液を４℃で一晩攪拌させた。このステップにより、全システイン残基が亜硫酸化により保護された変性タンパク質となる。溶液を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｉｆｕｇｅで３０分間、４００００回転で遠心分離した。上清を、金属錯体カラム緩衝液（６Ｍグアニジン、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４）の３−５容量で希釈し、０．２２ミクロンフィルターに濾過して透明化した。垂下する透明化した抽出物を、金属錯体カラム緩衝液で平衡化した５ｍｌ Ｑｉａｇｅｎ Ｎｉ−ＮＴＡ金属錯体カラム上に、負荷した。カラムを、５０ｍＭイミダゾール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｕｔｒｏｌ ｇｒａｄｅ）、ｐＨ７．４を含む付加用緩衝液で洗浄した。タンパク質を、２５０ｍＭイミダゾールを含む緩衝液で溶出した。所望のタンパク質を含む画分を採取し、４℃で保存した。タンパク濃度は、アミノ酸配列に基づいて算出した吸光係数を用い、２８０ｎｍにおける吸光度によって評価した。
【０３６９】
タンパク質は、新鮮に調製した再生緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．６、０．３ＭＮａＣｌ、２．５Ｍ尿素、５ｍＭシステイン、２０ｍＭグリシンおよび１ｍＭＥＤＴＡからなる）中、試料をゆっくりと希釈させることにより、再生させた。再生容量は、最終タンパク質濃度が、５０から１００マイクログラム／ｍｌの間となるように選択した。再生溶液は、緩やかに、４℃で１２−３６時間攪拌した。ＴＦＡを最終濃度０．４％（ｐＨがおおよそ３）となるまで添加することによって、再生反応を終了させた。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を０．２２ミクロンフィルターで濾過し、アセトニトリルが２−１０％の最終濃度となるように添加した。再生したタンパク質を、０．１％ＴＦＡの泳動用緩衝液を用いたＰｏｒｏｓ Ｒ１／Ｈ逆相カラム上、約１０から８０％までのアセトニトリル濃度勾配で、クロマトグラフィーにかけた。Ａ２８０吸光を有する分画溶液を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、再生相同タンパク質を含む分画を採取した。一般的に、適切に再生した大部分のタンパク質は、最も凝縮して、逆相樹脂との相互作用から疎水性内部がシールされているため、アセトニトリルの最低濃度で溶出される。凝集している種は、たいてい、高いアセトニトリル濃度で溶出される。逆相の過程で、所望の型からミスフォールディングされた型を排除することに加えて、試料からエンドトキシンをも除去する。
【０３７０】
所望の折畳されたＰＲＯ２４１タンパク質を含む分画を採取し、アセトニトリルを、溶液に導かれる緩やかな窒素の流れを用いて除去する。透析によって、もしくは、フォーミュレーション緩衝液で平衡化したＧ２５Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）樹脂を用いたゲル濾過によって、０．１４Ｍ塩化ナトリウムと、４％マンニトールを含む２０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．８中、タンパク質を形成し、滅菌濾過した。
【０３７１】
実施例２１： 哺乳動物細胞におけるＰＲＯポリペプチドの発現
本実施例では、哺乳動物細胞での組み換え発現による所望のＰＲＯポリペプチドのグリコシル化された型の調製について説明する。
【０３７２】
ベクター、ｐＲＫ５（１９８９年３月１５日に出版されたＥＰ３０７２４７参照）が、発現ベクターとして用いられる。任意で、ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡを、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載された結紮方法を用い、ＰＲＯポリペプチドＤＮＡの挿入を許容する選択された制限酵素でｐＲＫ５に結紮する。得られたベクターを、ｐＲＫ５−ＰＲＯポリペプチドと称する。
【０３７３】
一つの実施態様において、選択された宿主細胞は、２９３細胞である。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５７３）は、組織培養プレートで、胎児ウシ血清と、任意で栄養成分および／もしくは抗生物質で補充したＤＭＥＭなどの培地中で、集密になるまで増殖させる。約１０μｇのｐＲＫ５−ＰＲＯポリペプチドＤＮＡを、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ［Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａら、Ｃｅｌｌ、３１：５４３（１９８２）］１μｇと混合し、５００μｌの、０．１ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．２２７ＭＣａＣｌ2に溶解する。この混合物に、５００μのｌ５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭＮａＣｌ、１．５ｍＭＮａＰＯ4を添加、滴下し、沈殿物を２５℃、１０分間かけて形成させる。この沈殿物を懸濁し、２９３細胞に添加し、３７℃で約４時間静置する。培養培地を、吸引除去し、ＰＢＳ中２０％グリセリン２ｍｌを３０秒間添加する。次いで、２９３細胞を無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約５日間インキュベーションする。
【０３７４】
トランスフェクション後、おおよそ２４時間で、培養培地を除去し、培養培地（のみ）もしくは２００μＣｉ／ｍｌ35Ｓ−システインおよび２００μＣｉ／ｍｌ35Ｓ−メチオニンを含む培養培地に置換する。１２時間のインキュベーション後、馴化培地を回収し、スピンフィルター上で濃縮し、１５％ＳＤＳゲルにかける。工程にかけたゲルを、乾燥させ、ＰＲＯポリペプチドの存在が確認できるのに必要な時間だけ、フィルムに露光する。形質転換細胞を含む培養物を、さらにインキュベーション（無血清培地中）し、その培地を選択されたバイオアッセイで試験した。
【０３７５】
代替技術において、ＰＲＯポリペプチドを、Ｓｏｍｐａｒｙｒａｃら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１２：７５７５（１９８１）によって記載されたようにデキストラン硫酸法を用い、一過的に２９３細胞に導入させる。２９３細胞は、スピナーフラスコ中で最大密度まで培養し、７００μｇのｐＲＫ５−ＰＲＯポリペプチドＤＮＡを添加する。最初に細胞を、遠心分離によって、スピナーフラスコから濃縮し、ＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を、細胞ペレット上で４時間インキュベーションする。細胞を、２０％グリセリンで９０秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、５μｇ／ｍｌウシインスリン、および０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入する。約４日後、細胞と破片を除去するために、馴化培地を遠心分離し、濾過する。次いで、発現ＰＲＯポリペプチドを含む試料を、透析および／もしくはカラムクロマトグラフィーなどのあらゆる選択される方法によって、濃縮、および精製する。
【０３７６】
他の実施態様において、ＰＲＯポリペプチドは、ＣＨＯ細胞において発現させることができる。ＣａＰＯ4もしくはＤＥＡＥ−デキストランなどの公知の試薬を用いて、ｐＲＫ５−ＰＲＯポリペプチドは、ＣＨＯ細胞にトランスフェクションすることができる。上記のように、細胞培養物をインキュベーションし、培地を培養培地（のみ）もしくは、35Ｓ−メチオニンなどの放射性ラベルを含む培地と置換する。ＰＲＯポリペプチドの存在を決定した後、培養培地を無血清培地に置換する。好ましくは、培養物は、約６日間インキュベーションし、次いで、馴化培地を回収する。次いで、発現ＰＲＯポリペプチドを含む培地は、選択されるいずれかの方法によって濃縮、精製することができる。
【０３７７】
また、エピトープ標識化ＰＲＯポリペプチドは、宿主ＣＨＯ細胞に発現させることができる。ＰＲＯポリペプチドは、ｐＲＫ５ベクターからサブクローニングする。サブクローン挿入物は、バキュロウィルス発現ベクター中、ポリ−ｈｉｓ標識などの選択されたエピトープ標識とフレーム内で融合するために、ＰＣＲを行うことができる。次いで、ポリ−ｈｉｓ標識化ＰＲＯポリペプチド挿入物は、安定株の選択のためのＤＨＦＲなどの選択マーカを含むＳＶ４０駆動ベクター内にサブクローニングすることができる。最後に、ＣＨＯ細胞は、（上記のように）ＳＶ４０駆動ベクターでトランスフェクションさせることができる。発現を確認するために、上記のように標識することができる。次いで、発現したポリ−Ｈｉｓ標識化ＰＲＯポリペプチドを含む培養培地を、Ｎｉ2+−錯体アフィニティークロマトグラフィーなど、選択されるあらゆる方法によって、濃縮、精製することができる。
【０３７８】
ＰＲＯ２４１を、一過的および安定発現方法の両方によって、ＣＨＯ細胞にうまく発現させることができた。さらに、ＰＲＯ２４３、ＰＲＯ３２３およびＰＲＯ２３３を、ＣＨＯ細胞に一過的に発現させることができた。
【０３７９】
ＣＨＯ細胞における安定発現は、以下の方法を用いて行った。タンパク質は、各タンパク質の可溶型（例えば、細胞外ドメイン）のコード配列が、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ２ドメインを含むＩｇＧ１定常領域配列に融合させたＩｇＧ構造物（免疫接合体）、および／もしくはポリ−ｈｉｓ標識化形態となるように発現させた。
【０３８０】
ＰＣＲの増幅に次いで、各ＤＮＡを、Ａｕｓｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｕｎｉｔ３．１６， Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙとＳｏｎｓ（１９９７）において記載されているような標準的な技術を用いて、ＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングした。ｃＤＮＡの便利な往復を許容するように、興味のあるＤＮＡの５’および３’と適合する制限酵素部位５’を有するように、ＣＨＯ発現ベクターを構築する。ＣＨＯ細胞における発現に用いたベクターは、例えば、Ｌｕｃａｓら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：９（１７７４−１７７９（１９９６）に記載されたものであり、興味のあるｃＤＮＡとジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の発現を駆動するためにＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲの発現により、トランスフェクションに続いて、プラスミドの安定維持株を選定することができる。
【０３８１】
所望のプラスミドＤＮＡ１２μｇは、商業的に利用できるトランスフェクション試薬Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）、ＤｏｓｐｅｒもしくはＦｕｇｅｎｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用い、約１０００万個のＣＨＯ細胞内に導入させた。細胞を培養し、上記Ｌｕｃａｓらにおいて記載した。おおよそ３ｘ１０7個の細胞を、さらなる増殖と下記の産生のために、アンプル中で凍結させる。
【０３８２】
プラスミドＤＮＡを含むアンプルを、水槽中に置いて融解させ、渦動攪拌で混合した。内容物を、１０ｍＬの培地を含む遠心分離用チューブにピペットで移し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を吸引除去し、細胞を１０ｍＬの選択培地（０．２μｍフィルターで濾過した５％胎児ウシ血清を含むＰＳ２０を０．２μｍフィルターで濾過したもの）に再度懸濁した。次いで、細胞を、９０ｍＬ選択培地を含む１００ｍＬスピナーに分注した。１−２日後、細胞を、１５０ｍＬ選択増殖培地で満たした２５０ｍＬスピナーに移し、３７℃でインキュベーションした。さらに２−３日後、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、および２０００ｍＬスピナーに、３ｘ１０5細胞／ｍＬを播種した。細胞培地を、遠心分離によって新鮮な培地に交換し、産生用培地に再度懸濁した。好適なあらゆるＣＨＯ培地を用いることができるが、１９９２年６月１６日に発行された米国特許第５１２２４６９号に記載されている産生培地を、実際には用いた。３Ｌ産生スピナーに、０．２ｘ１０6細胞／ｍＬで播種した。０日目、細胞数、ｐＨを測定した。１日目、スピナーから標本を取り、濾過空気の散布を開始した。２日目、スピナーから標本を取り、温度を３３℃に上げ、３０ｍＬの５００ｇ／Ｌグルコースと、０．６ｍＬの１０％消泡剤（例えば、３５％ポリジメチルシロキサン乳剤 、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ，３６５ 医薬用グレードエマルジョン）を加えた。産生時にｐＨを必要な限り、約７．２に保った。１０日目後、もしくは、生存率が７０％以下に落ち込む前に、細胞培養物を、遠心分離と０．２２μｍフィルター濾過により、回収した。濾過物は、４℃で保存、もしくは直ちに精製用のカラムにかけた。
【０３８３】
ポリ−ｈｉｓ標識化構築物用に、タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅ）を用いて精製した。精製前に、イミダゾールを、馴化培地に５ｍＭ濃度となるように添加した。馴化培地を、０．３ＭＮａＣｌと５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、緩衝液で平衡化させた６ｍｌＮｉ−ＮＴＡカラムに、流速４−５ｍｌ／ｍｉｎ、４℃でポンプ注入した。負荷後、カラムをさらに平衡化用緩衝液で洗浄し、０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡化用緩衝液でタンパク質を溶出した。続けて、高純度に精製したタンパク質を、１０ｍＭＨｅｐｅｓ、０．１４ＭＮａＣｌおよび４％マンニトール、ｐＨ６．８を含む保存用緩衝液中、２５ｍｌ Ｇ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で脱塩し、−８０℃で保存した。
【０３８４】
免疫接合体（Ｆｃ含有）構造物を、以下のように馴化培地から精製した。該馴化培地を、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８で平衡化した５ｍｌプロテインＡカラム上にポンプ注入した。注入後、１００ｍＭクエン酸、ｐＨ３．５での溶出の前に、カラムを平衡化用緩衝液で十分に洗浄した。２７５μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ９中に、１ｍｌ画分を採取して、溶出したタンパク質を直ちに中和した。続けて、高純度に精製したタンパク質を、ポリ−Ｈｉｓ標識化タンパク質用に、保存用緩衝液中、上記の様に脱塩した。同一性を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルおよびエドマン分解によるＮ末端アミノ酸配列決定によって評価した。
【０３８５】
ＰＲＯ２４１、ＰＲＯ２４３、ＰＲＯ２９９、ＰＲＯ３２３、ＰＲＯ３２７、ＰＲＯ２３３、ＰＲＯ３４４、ＰＲＯ３４７、ＰＲＯ３５４、ＰＲＯ３５５、ＰＲＯ３５７、ＰＲＯ３５３、ＰＲＯ３６１、およびＰＲＯ３６５も、また、ＣＯＳ細胞において、一過的にうまく発現させることができた。
【０３８６】
実施例２２：酵母におけるＰＲＯポリペプチドの発現
以下の方法は、酵母における所望のＰＲＯポリペプチドの組み換え発現について記載したものである。
【０３８７】
最初に、酵母発現ベクターを、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからＰＲＯポリペプチドの細胞内産生もしくは分泌のために構築する。所望のＰＲＯポリペプチド、選択されたシグナルペプチド、およびプロモータをコードするＤＮＡを、ＰＲＯポリペプチドの細胞内発現を導くために選択したプラスミドの適切な制限酵素部位に挿入する。分泌の場合には、ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡを、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモータ、酵母α因子分泌シグナル／リーダー配列、および（必要ならば）ＰＲＯポリペプチド発現用リンカー配列をコードするＤＮＡと共に、選択したプラスミドにクローニングする。
【０３８８】
次いで、例えば、酵母株ＡＢ１１０のような酵母細胞を、上記発現プラスミドと共に形質転換し、選択した培養液中で培養することができる。形質転換した酵母の上清を、１０％トリクロロ酢酸で沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クマシーブルー染色によるゲル染色により分析する。
【０３８９】
続けて、酵母細胞を遠心分離により、培養液から除去し、次いで、選択したカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することにより、組み換えＰＲＯポリペプチドを、単離精製することができる。ＰＲＯポリペプチドを含む濃縮物は、さらに、選択したカラムクロマトグラフィー樹脂を用いて精製する。
【０３９０】
実施例２３： バキュロウィルス−感染昆虫細胞におけるＰＲＯポリペプチドの発現
以下の方法は、バキュロウィルス−感染昆虫細胞におけるＰＲＯポリペプチドの組み換え発現について記載する。
【０３９１】
選択したＰＲＯポリペプチドを、バキュロウィルス発現ベクターに含まれるエピトープ標識の上流に融合させる。そのようなエピトープ標識は、ポリ−ｈｉｓ標識およびイムノグロブリン標識（例えば、ＩｇＧのＦｃ領域）を含む。ｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）のような商業的に利用できるプラスミドを含み、様々なプラスミドが用いられる。簡単には、ＰＲＯポリペプチドもしくはＰＲＯポリペプチドの所望の部分（例えば、トランスメンブランタンパク質の細胞外ドメインをコードする配列など）を、５’および３’領域に相補するプライマーを用いたＰＣＲによって増幅する。５’プライマーは、両端に（選択された）制限酵素部位を組み込ませることができる。次いで、生成物を、前記の選択した制限酵素で消化し、発現ベクター中にサブクローニングする。
【０３９２】
組み換えバキュロウィルスは、リポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから商業的に利用できる）を用い、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（Ｓｆ９）細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）に、上記プラスミドとＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウィルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、共−トランスフェクションさせることによって産出される。２８℃で４−５日間インキュベーション後、遊離されたウィルスを回収し、さらなる増幅に用いる。ウィルス感染とタンパク質発現を、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｅｙら、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）によって記載されたように行う。
【０３９３】
次いで、発現したポリ−ｈｉｓ標識化ＰＲＯポリポペプチドを、例えば、以下のようにＮｉ2+−錯体アフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。抽出物を、Ｒｕｐｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：１７５−１７９（１９９３）によって記載されたように、組み換えウィルス感染Ｓｆ９細胞から調製する。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、音波処理用緩衝液（２５ｍＬ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．９；１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０％グリセリン；０．１％ ＮＰ−４０；０．４Ｍ ＫＣｌ）に懸濁し、氷上で２０秒間、２回、音波処理する。音波処理物を遠心分離によって透明化し、上清をローディング緩衝液（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセリン、ｐＨ７．８）で５０倍に希釈し、０．４５μｍフィルターで濾過する。Ｎｉ2+−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎから商業的に利用できる）を、基底容量５ｍＬで調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬのローディング緩衝液で平衡化する。濾過した細胞抽出物を、０．５ｍＬ／分でカロムにかける。ローディング緩衝液でＡ280のベースラインになるまでカラムを洗浄し、そこで分画の採取を始める。次に、カラムを二次洗浄用緩衝液（５０ｍＭリン酸塩；３００ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセリン、ｐＨ６．０）で洗浄し、非特異的に結合したタンパク質を溶出する。再度Ａ280ベースラインに到達後、カラムを、二次洗浄用緩衝液中、０から５００ｍＭイミダゾール濃度勾配で展開する。１ｍＬ画分を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと銀染色、もしくはＮｉ2+−ＮＴＡ−アルカリフォスファターゼ複合体（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたウェスタンブロットにより分析する。溶出したＨｉｓ10−標識化ＰＲＯポリペプチドを含む画分を収集し、ローディング緩衝液に対して透析する。
【０３９４】
もしくは、ＩｇＧ標識化（もしくはＦｃ標識化）ＰＲＯポリペプチドの精製を、例えば、プロテインＡもしくはプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む、公知のクロマトグラフィー技術を用いて行うことができる。
【０３９５】
ＰＲＯ２４１、ＰＲＯ３２７およびＰＲＯ３４４を、バキュロウィスル感染Ｓｆ９昆虫細胞に発現させることができる。実際には、発現を、０．５−２Ｌスケールで実行させたが、それはより大きな（例えば、８Ｌ）調製用に容易にスケールアップすることができる。タンパク質は、細胞外領域が、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ１定常領域配列に融合したＩｇＧ構造物（免疫接合体）として、および／もしくはポリ−Ｈｉｓ標識化形態として発現した。
【０３９６】
バキュロウィスル感染Ｓｇ９細胞における発現のために、ＰＣＲ増幅に次いで、各コード化配列をバキュロウイスル発現ベクター（ＩｇＧ融合体にはｐｂ．ＰＨ．ＩｇＧ、ポリ−Ｈｉｓ標識化タンパク質にはｐｂ．ＰＨ．Ｈｉｓ．ｃ）にサブクローニングし、リポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて、１０５スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（Ｓｆ９）細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）に、上記ベクターとＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウィルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、共−トランスフェクションした。ｐｂ．ＰＨ．ＩｇＧおよびｐｂ．ＰＨ．Ｈｉｓは、商業的に利用できるバキュロウィルス発現ベクターｐＶＬ１３９３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に、ＨｉｓもしくはＦｃ標識配列を含むように修飾したポリリンカー領域を有する修飾体である。細胞は、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＨｉｎｋ’ｓ ＴＮＭ−ＦＨ培地で培養した。細胞を、２８℃で５日間インキュベーションした。上清を回収し、続けて、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＨｉｎｋ’ｓ ＴＮＭ−ＦＨ培地中で、おおよそ感染多重度（ＭＯＩ）１０で、Ｓｆ９細胞を感染させることにより、第１のウィルス増幅のために用いた。細胞を、２８℃で３日間インキュベーションした。上清を回収し、バキュロウィルス発現ベクターにおける構築物の発現を、ヒスチジン標識化タンパク質に対するＮｉ−ＮＴＡビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）もしくはＩｇＧ標識化タンパク質に対するプロテイン−ＡセファロースＣＬ−４Ｂビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）２５ｍＬに、上清１ｍＬをバッチ結合し、次いで、クマシーブルー染色によりタンパク質標準の既知濃度との比較を行うＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって測定した。
【０３９７】
第１のウィルス増幅上清を、ＥＳＦ−９２１培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＬＬＣ）中、約ＭＯＩ０．１で培養したＳｆ９細胞のスピナー培養物（５００ｍＬ）を感染するために用いた。細胞を、２８℃で３日間インキュベーションした。上清を回収し、濾過した。バッチ結合と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、必要に応じて、スピナー培養の発現が確認されるまで繰り返した。
【０３９８】
形質転換細胞からの馴化培地（０．５から３Ｌ）を、細胞を除去するための遠心分離によって回収し、０．２２ミクロンフィルターで濾過した。ポリ−Ｈｉｓ標識化構築物の場合、タンパク質をＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。精製前に、イミダゾールを馴化培地に濃度５ｍＭとなるように添加した。馴化培地は、０．３Ｍ ＮａＣｌおよび５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４緩衝液で平衡化した６ｍｌ Ｎｉ−ＮＴＡカラムに、流速４−５ｍｌ／分、４℃でポンプ注入した。注入後、カラムをさらなる平衡化緩衝液で洗浄し、タンパク質を、０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡化緩衝液で溶出した。続いて、高純度に精製したタンパク質を、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、４％マンニトール、ｐＨ６．８を含む保存用緩衝液中、２５ｍｌ Ｇ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムで脱塩、−８０℃で保存した。
【０３９９】
タンパク質の免疫接合体（Ｆｃ含有）構築物を、馴化培地から、以下のように精製した。馴化培地を、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８で平衡化されている５ｍｌプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にポンプ注入した。注入後、カラムを、１００ｍＭクエン酸、ｐＨ３．５での溶出の前に、平衡化緩衝液で十分に洗浄した。溶出したタンパク質を、２７５ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ９を含むチューブ中に、１ｍＬ画分を採取することによって、直ちに中和した。続いて、高純度に精製したタンパク質を、ポリ−Ｈｉｓ標識化タンパク質用に、保存用緩衝液中、上記のように脱塩した。タンパク質の同一性を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＰＥＧ）電気泳動およびエドマン分解によるＮ末端アミノ酸配列決定によって確認した。
【０４００】
ＰＲＯ２４３、ＰＲＯ３２３、ＰＲＯ３４４およびＰＲＯ３５５は、バキュロウィルス感染Ｈｉ５昆虫細胞に発現させることができる。実際には、発現を０．５−２Ｌスケールで行ったが、容易に、より大きな（例えば、８Ｌ）調製用にスケールアップすることができる。
【０４０１】
バキュロウィルス感染Ｈｉ５昆虫細胞での発現のために、ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡは、例えば、Ｐｆｕ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）などの好適なシステムで増幅させる、もしくはバキュロウィルス発現ベクターに含まれるエピトープ標識の上流（５’−）に融合させることができる。そのようなエピトープ標識は、ポリ−Ｈｉｓ標識およびイムノグロブリン標識（例えば、ＩｇＧのＦｃ領域のような）を含む。ｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）のような商業的に利用できるプラスミドを含み、様々なプラスミドが用いられる。簡単には、ＰＲＯポリペプチドもしくはＰＲＯポリペプチドの所望の部分（例えば、トランスメンブレンタンパク質の細胞外ドメインをコードする配列など）を、５’および３’領域に相補するプライマーを用いたＰＣＲによって増幅する。５’プライマーは、両端に（選択された）制限酵素部位を組み込み得る。次いで、生成物を上記選択した制限酵素で消化し、発現ベクターにサブクローニングする。例えば、ｐＶＬ１３９３誘導体は、ＮＡＭＥ配列の下流（３’−）に、ヒトＩｇＧのＦｃ領域（ｐｂ．ＰＨ．ＩｇＧ）もしくは８ヒスチジン標識（ｐｂ．ＰＨ．Ｈｉｓ）を含む。
【０４０２】
Ｈｉ５細胞は、２７℃で、ＣＯ2とペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）を加えない条件下で、５０％集密まで培養した。各１５０ｍＭプレートに、ＰＲＯポリペプチドを含むｐＩＥに基づくベクター３０μｇを、１ｍｌ Ｅｘ−Ｃｅｌｌ培地［培地：Ｅｘ−Ｃｅｌｌ４０１＋１／１００ Ｌ−ＧｌｕＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃１４４０１−７８Ｐ（注解；この培地は光感受性である）］を混合し、各チューブで、１００μｌＣｅｌｌ Ｆｅｃｔｉｎ［ＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ＃１０３６２−０１０）（混合のために渦動撹拌したもの）］を、１ｍｌのＥｘ−Ｃｅｌｌ培地と混合した。２つの溶液を、混合し、室温で１５分間インキュベーションした。８ｍｌのＥｘ−Ｃｅｌｌ培地を２ｍｌ ＤＮＡ／ＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ混合物に添加し、これを一度Ｅｘ−Ｃｅｌｌ培地で洗浄しているＨｉ５細胞に重層した。次いで、プレートを、暗所で、室温、１時間インキュベーションした。次いで、ＤＮＡ／ＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ混合物を吸引し、過剰量のＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮを除去するために、細胞を、一度洗浄した。３０ｍｌの新鮮なＥｘ−Ｃｅｌｌ培地を添加し、細胞を２８℃で３日間インキュベートした。上清を回収し、バキュロウィルス発現ベクターにおけるＰＲＯポリペプチドの発現を、ヒスチジン標識化タンパク質に対するＮｉ−ＮＴＡビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）もしくはＩｇＧ標識化タンパク質に対するプロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂビーズ２５ｍＬに、上清１ｍＬをバッチ結合し、次いで、クマシーブルー染色によりタンパク質標準の既知濃度との比較を行うＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって測定した。
【０４０３】
形質転換細胞から馴化培地（０．５から３Ｌ）を、細胞を除去するための遠心分離によって回収し、０．２２ミクロンフィルターで濾過した。ポリ−Ｈｉｓ標識化構築物として、ＰＲＯポリペプチドを含むタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。精製前に、イミダゾールを、濃度５ｍＭになるまで、馴化培地に添加した。馴化培地を、０．３Ｍ ＮａＣｌおよび５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４緩衝液で、平衡化した６ｍｌ Ｎｉ−ＮＴＡカラムに、流速４−５ｍｌ／分、４℃でポンプ注入した。注入後、カラムをさらなる平衡化緩衝液で洗浄し、０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡化緩衝液で、タンパク質を溶出した。続いて、高純度に精製したタンパク質を、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．１４Ｍ ＮａＣｌおよび４％マンニトール、ｐＨ６．８を含む保存用緩衝液中、２５ｍｌ Ｇ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムで脱塩し、−８０℃で保存した。
【０４０４】
タンパク質の免疫接合体（Ｆｃ含有）は、馴化培地から、以下のように精製した。馴化培地を、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８で平衡化した５ｍｌプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上にポンプ注入した。注入後、カラムを、１００ｍＭクエン酸、ｐＨ３．５で溶出する前に、平衡化緩衝液で十分に洗浄した。２７５ｍＬの１ＭＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ９を含むチューブ中に、１ｍＬ画分を採取することによって、溶出タンパク質を直ちに中和した。続けて、高純度に精製したタンパク質を、上記のようにポリ−Ｈｉｓ標識化タンパク質用に、保存用緩衝液中で脱塩した。タンパク質の同一性を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＰＥＧ）およびエドマン分解によるＮ末端アミノ酸配列決定、および所望もしくは必要に応じてその他の分析方法によって確認した。
【０４０５】
実施例２４：ＰＲＯポリペプチドに結合する抗体の調製
この実施例では、ＰＲＯポリペプチドと特異的に結合し得るモノクローナル抗体の調製について説明する。
【０４０６】
モノクローナル抗体の作製技術は、当該分野において公知であり、例えば、上記Ｇｏｄｉｎｇ，に記載されている。用いられる免疫原は、精製されたＰＲＯポリペプチド、ＰＲＯポリペプチドを含む融合タンパク質、および細胞表面に組み換えＰＲＯポリペプチドを発現している細胞を含む。免疫原の選択は、過度な実験を行わずに、当該分野の技術者がなし得るものである。
【０４０７】
ＰＲＯポリペプチド免疫原をフロイント完全アジュバントで乳化し、１−１００μｇ量を、皮下もしくは腹腔内注射して、Ｂａｌｂ／ｃなどのマウスを免疫化した。もしくは、免疫原は、ＭＰＩ−ＴＤＭアジュバント（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）に乳化し、動物の後足に注入した。次いで、１０から１２日後に、所定のアジュバントに乳化させた追加免疫原を、免疫化されたマウスに追加注射した。それから数週間後、再び、マウスに追加免疫原を注射した。抗ＰＲＯポリペプチド抗体を検出するためのＥＬＩＳＡアッセイ用に、血清試料を、定期的にマウスから、後眼窩採血によって採取することができる。
【０４０８】
適切な抗体力価が検出された後、抗体に「陽性」の動物に、ＰＲＯポリペプチドの最後の静脈注射を行うことができる。３から４日後、このマウスを屠殺して、脾臓細胞を採取した。次いで、脾臓細胞を、例えば、ＡＴＣＣ、Ｎｏ．ＣＲＬ１５９７から利用できるＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１などの選択された齧歯類の骨髄腫細胞株に、（３５％ポリエチレングリコールを用いて）融合した。ハイブリドーマ細胞を融合により産出し、次いで、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するために、ＨＡＴ（ヒポキサチン、アミノプテリン、チミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに平板培養させることができる。
【０４０９】
ハイブリドーマ細胞は、ＰＲＯポリペプチドに対する反応性についてＥＬＩＳＡでスクリーニングした。ＰＲＯポリペプチドに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「陽性」ハイブリドーマ細胞の確定は、当該分野における技術範囲内である。
【０４１０】
陽性ハイブリドーマ細胞は、抗ＰＲＯポリペプチドモノクローナル抗体を含む腹水を産生させるために、同系のＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に注入させることができる。あるいは、このハイブリドーマ細胞は、組織培養フラスコもしくはローラーボトルで生育させることもできる。腹水中に産生されたモノクローナル抗体の精製は、硫安沈殿、次いでゲル濾過クロマトグラフィーを用いて行うことができる。あるいは、プロテインＡもしくはプロテインＧに対する抗体の結合に基づいたアフィニティークロマトグラフィーを用いることができる。
【０４１１】
実施例２５：キメラＰＲＯポリペプチド
ＰＲＯポリペプチドを、タンパク精製を容易にするために付加された１以上の付加ポリペプチドドメインを有するキメラタンパク質として発現させることができる。そのような精製を容易にするドメインは、限定されないが、固相化された金属上での精製ができるヒスチジン−トリプトファンモジュール、固相化されたイムノグロブリン上での精製ができるプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳTM伸長／アフィニティー精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ Ｗａｓｈ）において利用されるドメインなどの金属錯体ペプチドを含む。精製用ドメインとＰＲＯポリペプチド配列との間に、Ｆａｃｔｏｒ ＸＡもしくはエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの切断できるリンカー配列を含むことは、ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡの発現を促進するのに有用である。
【０４１２】
実施例２６： 特異抗体を用いたＰＲＯポリペプチドの精製
天然もしくはＰＲＯポリペプチドを、当該分野のタンパク精製において標準的な様々な技術により精製することができる。例えば、前駆ＰＲＯポリペプチド、成熟ＰＲＯポリペプチドもしくは前ＰＲＯポリペプチドを、興味あるＰＲＯポリペプチドに対する特異抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。一般に、イムノアフィニティーカラムは、抗ＰＲＯポリペプチド抗体の活性クロマトグラフィー樹脂との共有結合によって構築される。
【０４１３】
ポリクローナルイムノグロブリンは、免疫された血清から、硫安沈殿もしくは固相化プロテインＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｉｓｃａｔｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）における精製のどちらかによって調製した。同様に、モノクローナル抗体は、マウス腹水液から、硫安沈殿もしくは固相化プロテインＡ上でのクロマトグラフィーによって調製した。部分的に精製されたイムノグロブリンは、ＣｎＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥTM（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）などのクロマトグラフィー樹脂に共有結合した。抗体を樹脂に結合させて樹脂を保護し、修飾した樹脂を製造元の指示書に従って洗浄した。
【０４１４】
そのようなイムノアフィニティーカラムは、ＰＲＯポリペプチドを含む細胞から画分を可溶型で調製することによって、ＰＲＯポリペプチドの精製時に使用し得る。この調製物は、全細胞もしくは界面活性剤の添加によって遠心分離して得られた細胞画分の可溶化、もしくは当該分野において公知の他の方法によって得ることができる。もしくは、シグナル配列を含む可溶性ＰＲＯポリペプチドを、細胞が生育している培地中に、有用量で分泌させることができる。
【０４１５】
可溶性ＰＲＯポリペプチド含有調製物は、イムノアフィニティーカラムに通し、カラムは、ＰＲＯポリペプチドの好ましい吸光度となるような条件下（例えば、界面活性剤含有高イオン強度緩衝液）で洗浄した。次いで、カラムは、抗体／ＰＲＯポリペプチド結合体が分離する条件下（例えば、約ｐＨ２−３などの低いｐＨ緩衝液、または尿素もしくはチオシアネートイオンなどの高濃度のカオトロープ）で溶出させ、ＰＲＯポリペプチドを回収した。
【０４１６】
実施例２７：薬剤スクリーニング
本発明は、様々な薬剤スクリーニング技術において、ＰＲＯポリペプチドもしくはそれに結合するフラグメントを用いた化合物のスクリーニングに一部有用である。そのような試験において用いられるＰＲＯポリペプチドもしくはフラグメントは、溶液中に遊離、固形支持物に付着、細胞表面上に産出、もしくは細胞内に局在させることができる。薬剤スクリーニングの一つの方法として、ＰＲＯポリペプチドもしくはフラグメントを発現する組み換え核酸で安定的に形質転換した真核生物もしくは原核生物の宿主細胞を用いる。そのような形質転換細胞に対して、競合的結合アッセイにおいて、薬剤をスクリーニングする。そのような細胞は、生存もしくは固定された形態のどちらかで、標準的な結合アッセイに用いることができる。例えば、ＰＲＯポリペプチドもしくはフラグメントと試薬との複合体形成を測定することができる。もしくは、試薬によって引き起こされる、ＰＲＯポリペプチドと標的細胞もしくは標的受容体との複合体形成の減少を測定することができる。
【０４１７】
このように、本発明は、ＰＲＯポリペプチド−付随疾患もしくは障害に影響を及ぼし得る薬剤もしくはその他の試薬のスクリーニング方法を提供するものである。これらの方法は、ＰＲＯポリペプチドもしくはそのフラグメントと、そのような試薬との接触、および当該分野において公知の方法によって行う（Ｉ）試薬とＰＲＯポリペプチドもしくはフラグメントとの複合体の存在、もしくは（ｉｉ）ＰＲＯポリペプチドもしくはフラグメントと細胞との複合体の存在のアッセイを含む。そのような競的合結合アッセイにおいて、典型的には、ＰＲＯポリペプチドもしくはフラグメントを標識する。適切にインキュベーション後、遊離ＰＲＯポリペプチドもしくはフラグメントを、結合型から分離し、遊離もしくは複合化していない標識量を、ＰＲＯポリペプチドと結合する、もしくはＰＲＯポリペプチド／細胞複合化を妨げる試薬特有の性能の指標とする。
【０４１８】
薬剤スクリーニングの他の技術は、ポリペプチドに対して好適な結合親和性を有する化合物の高スループットスクリーニングを提供し、１９８４年、９月１３日に公開されたＷＯ ８４／０３５６４に詳細に記載されている。簡単に述べると、様々な小さいペプチド試験化合物を大量に、固形支持物上、例えばプラスチックピンなどの表面に合成させる。ＰＲＯポリペプチドに適用する時は、ペプチド試験化合物を、ＰＲＯポリペプチドと反応させ、洗浄する。結合したＰＲＯポリペプチドを、当該分野において公知の方法で検出する。また、精製したＰＲＯポリペプチドを、前記薬剤スクリーニング技術における使用のために、直接プレート上に被覆させることができる。さらに、ペプチドを捕捉し、固形支持物上に固相化するために、非中和抗体を使用することもできる。
【０４１９】
また、本発明は、中和抗体が、ＰＲＯポリペプチド、もしくはそのフラグメントに結合する試験化合物と競合して、特異的にＰＲＯポリペプチドと結合し得る競合的薬剤スクリーニングアッセイの使用を意図する。この様式において、抗体は、ＰＲＯポリペプチドと、１以上の抗原決定基を共有するペプチドの存在を検出するために使用することができる。
【０４２０】
実施例２８：合理的薬剤設計
合理的薬剤設計の目的は、生物学的に活性な興味あるポリペプチド（すなわち、ＰＲＯポリペプチド）もしくはそれらと相互作用する低分子（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、もしくはインヒビター）の構造類似体を産出することである。これらの例は、ＰＲＯポリペプチドのより活性もしくは安定な形状、またはｉｎ ｖｉｖｏでのＰＲＯポリペプチドの機能を増強する、もしくは阻害する薬剤を作るために用いることができる（Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１９−２１（１９９１）参照）。
【０４２１】
一つの方法において、ＰＲＯポリペプチドもしくはＰＲＯポリペプチド−インヒビター複合体の３次元構造を、ｘ線結晶学、コンピューターモデリング、もしくはより典型的に、該２つの方法の組み合わせによって確定する。構造を解明し、分子の活性部位を決定するために、ＰＲＯポリペプチドの形状と電荷を確定しなければならない。頻繁でないが、ＰＲＯポリペプチドの構造に関する有用な情報を、相同タンパク質の構造に基づくモデリングによって得ることができる。両方の事例において、関連する構造の情報が、類似するＰＲＯポリペプチド様分子の設計もしくは効果的なインヒビターの同定に用いられる。合理的薬剤設計の有用な実施例は、ＢｒａｘｔｏｎとＷｅｌｌｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：７７９６−７８０１（１９８２）によって示されているように、活性もしくは安定性が向上した、もしくはＡｔｈａｕｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１３：７４２−７４６（１９９３）によって示されているように、天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、もしくはアンタゴニストとして作用する分子を含む。
【０４２２】
また、上記のように選択した機能的アッセイによって、標的特異抗体を単離し、その結晶構造を解明することができる。この方法は、おおむね、続く薬剤設計の基礎となるファーマコアー（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）を産出する。機能的、薬学的に活性な抗体に対する抗イディオタイプ抗体（ａｎｒｉ−ｉｄｓ）を産出することによって、タンパク質結晶学を完全に迂回することができる。鏡像の鏡像なので、抗イディオタイプ抗体の結合部位が、本来の受容体の類似体であると予想される。次いで、化学的もしくは生物学的に産出したペプチドの貯蔵物から、ペプチドを同定および単離するために、抗イディオタイプ抗体を用いることができる。次いで、単離したペプチドを、ファーマコアーとして作用させる。
【０４２３】
本発明によって、Ｘ線結晶学のような分析的な研究を行うのに、十分量のＰＲＯポリペプチドを利用することができるようになる。さらに、ここに提供されるＰＲＯポリペプチドアミノ酸配列についての情報は、Ｘ線構造学に代わる、もしくは加えて、コンピューターモデリング技術を用いるための手引きを提供するものである。
【０４２４】
実施例２９： ＰＲＯ２４１の軟骨からのプロテオグリカンの遊離を刺激する性能 ＰＲＯ２４１の軟骨組織からのプロテオグリカンの遊離を刺激する性能を、以下のように測定した。
【０４２５】
生後４−６ヶ月のブタの中手指節関節を、無菌的に切開し、関節軟骨を、注意深く下層の骨を除去しながら、手で切り取った。軟骨を細かく刻み、９５％空気、５％ＣＯ2の湿潤環境下、０．１％ＢＳＡと１００Ｕ／ｍｌペニシリンと、１００μｇストレプトマイシンを含む無血清（ＳＦ）培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２ １：１）中、２４時間大量培養した。３回洗浄後、約１００ｍｇの関節を、マイクロ遠心チューブに分注し、上記無血清培地中、さらに２４時間インキュベーションした。次いで、ＰＲＯ２４１ポリペプチドを、単独もしくは１８ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−１α（公知の軟骨組織からのプロテオグリカン遊離刺激因子）と組み合わせて、１％添加した。次いで、上清を回収し、１，９−ジメチルーメチレンブルー（ＤＭＢ）比色定量アッセイ（ＦａｒｎｄａｌｅとＢｕｔｔｌｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ８８３：１７３−１７７（１９８５））を用いて、プロテオグリカン量をアッセイした。このアッセイにおける陽性結果は、測定したポリペプチドが、例えば、スポーツ関連関節損傷、関節軟骨欠損、変形性関節症、もしくは慢性関節リウマチの治療において用いられ得ることを示す。
【０４２６】
ＰＲＯ２４１ポリペプチドを上記アッセイで測定すると、ポリペプチドは、単独およびインターロイキン−１αと共に刺激後、および処置後２４時間と７２時間で、軟骨組織からのプロテオグリカンの遊離を顕著に刺激し、このことから、ＰＲＯ２４１ポリペプチドが、軟骨組織からのプロテオグリカンの遊離を刺激するために有用であることが示された。
【０４２７】
実施例３０：Ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、細胞もしくは組織調製物内の核酸配列の検出と局在測定に強力かつ用途の広い技術である。例えば、遺伝子の発現部位の同定、転写の組織分布の分析、ウィルス感染の同定と局在測定、特異的ｍＲＮＡ合成の変化の追跡および染色体マップ作製を促進するのに有用である。
【０４２８】
Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ＬｕとＧｉｌｌｅｔｔ、Ｃｅｌｌ Ｖｉｓｉｏｎ １：１６９−１７６（１９９４）による以下の最適化された方法で、ＰＣＲ−産生33Ｐ−標識化リボプローブを用い行った。簡単には、ホルマリン固定し、パラフィン包埋したヒト組織を、薄切し、脱パラフィン化し、プロテアーゼＫ（２０ｇ／ｍｌ）で１５分間、３７℃で除蛋白し、さらに上記ＬｕおよびＧｉｌｌｅｔｔによって記載されたように、Ｉｎ Ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのためにさらに処理を行った。（33Ｐ）ＵＴＰ−標識化アンチセンスリボプローブを、ＰＣＲ生成物から産生し、５５℃で一晩ハイブリダイズさせた。このスライドを、Ｋｏｄａｋ ＮＴＢ２核飛跡感光乳剤に浸し、４週間露光させた。
【０４２９】
33Ｐ−リボプローブの合成
６．０μｌ（１２５ｍＣｉ）の33Ｐ−ＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢＦ １００２， ＳＡ＜２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を、急速真空乾燥させた。乾燥した33Ｐ−ＵＴＰを含む各チューブに、下記成分を添加した：
２．０μｌ ５ｘ転写緩衝液
１．０μｌ ＤＴＴ（１００ｍＭ）
２．０μｌ ＮＴＰ 混合物（２．５ｍＭ：１０μｌ：各１０ｍＭＧＴＰ、ＣＴＰ＆ＡＴＰ＋１０μｌ 水）
１．０μｌ ＵＴＰ（５０μＭ）
１．０μｌ Ｒｎａｓｉｎ
１．０μｌ 鋳型ＤＮＡ（１μｇ）
１．０μｌ 水
１．０μｌ ＲＮＡポリメラーゼ（通常、ＰＣＲ生成物Ｔ３＝ＡＳ、Ｔ７＝Ｓ）
【０４３０】
該チューブを、３７℃で１時間インキュベーションした。１．０μｌ ＲＱ１ＤＮアーゼを添加し、３７℃で１５分間インキュベーションした。９０μｌＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．６ ／１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）を添加し、その混合液を、ＤＥ８１紙上にピペットで移した。残った溶液をＭｉｃｒｏｃｏｎ−５０限外濾過ユニットに負荷し、プログラム１０（６分）を用いて遠心分離した。濾過ユニットを、第２のチューブに入れ、プログラム２（３分）を用いて遠心分離した。最終の回収遠心分離後、１００μｌＴＥを添加した。次いで、１μｌの最終生成物を、ＤＥ８１紙上にピペットで移し、６ｍｌのＢｉｏｆｌｏｕｒ ＩＩでカウントした。
【０４３１】
プローブを、ＴＢＥ／尿素ゲル上で泳動した。３μｌのローディング緩衝液に、１−３μｌのプローブもしくは５μｌのＲＮＡ Ｍｒｋ ＩＩＩを添加した。９５℃のヒートブロック上で３分間加熱後、直ちにゲルを氷上に置いた。ゲルのウェルを平らにし、試料をかけ、１８０−２５０ボルトで４５分間泳動した。ゲルをサランラップで包み、−７０℃のフリーザー中、１時間から一晩、増感紙を用いてＸＡＲフィルムに露光した。
【０４３２】
33Ｐ−ハイブリダイゼーション
Ａ．凍結切片の調製
スライドを、フリーザーから取り出し、アルミニウムトレイ上に置き、室温で５分間解凍させた。トレイを、凝結を低減させるために、５５℃のインキュベーター内に５分間置いた。スライドを、ドラフト内の氷上の４％パラホルムアルデヒド中で、１０分間固定し、０．５ｘＳＳＣで５分間、室温で洗浄した（２５ｍｌ ２０ｘＳＳＣ＋９７５ｍｌＳＱ Ｈ2Ｏ）。０．５μｇ／ｍｌプロテアーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ保存液１２．５μｌを、予め暖められたＲＮアーゼ−不含ＲＮアーゼ緩衝液２５０ｍｌで希釈したもの）中で、１０分間、３７℃で除蛋白後、切片を、室温で１０分間、０．５ｘＳＳＣで洗浄した。切片を、７０％、９５％、および１００％エタノール中で、各２分間ずつ脱水させた。
【０４３３】
Ｂ．パラフィン包埋切片の前処理
スライドを、脱パラフィン化し、ＳＱＨ2Ｏ中に置き、２ｘＳＳＣで、室温、各５分間ずつ、２回洗浄した。切片を、ヒト胚芽組織の場合は、２０μｇ／ｍｌプロテアーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ保存液５００μｌをＲＮアーゼ−不含ＲＮアーゼ緩衝液２５０ｍｌに希釈；３７℃、１５分）で、もしくはホルマリン組織切片の場合は、８ｘプロテアーゼＫ（１００μｌをＲｎアーゼ緩衝液２５０ｍｌに希釈、３７℃、３０分）で除蛋白した。続けて０．５ｘＳＳＣでの洗浄、脱水を、上記のように行った。
【０４３４】
Ｃ．プレハイブリダイゼーション
Ｂｏｘ緩衝液（４ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド）で飽和させた濾紙を配列したプラスチック箱に、スライドを配置した。組織を、５０μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（３．７５ｇ デキストラン硫酸＋６ｍｌＳＱＨ2Ｏ）で覆い、渦動攪拌し、フタを緩めた状態で、マイクロ波で２分間加熱した。氷上で冷却した後、ホルムアミド１８．７５ｍｌ、２０ｘＳＳＣ３．７５ｍｌ、およびＳＱＨ2Ｏ９ｍｌを加え、組織を十分に渦動攪拌し、４２℃で１−４時間インキュベーションした。
【０４３５】
Ｄ．ハイブリダイゼーション
１スライド当たり、プローブ１．０ｘ１０6ｃｐｍおよびｔＲＮＡ（５０ｍｇ／ｍｌ保存液）１．０μｌを、９５℃で３分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、ハイブリダイゼーション緩衝液４８μｌを１スライド当たり加えた。渦動攪拌後、33Ｐ混合液５０μｌを、スライド上のプレハイブリダイゼーション５０μｌに添加した。該スライドを、５５℃で一晩インキュベーションした。
【０４３６】
Ｅ．洗浄
洗浄を、２ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡを用い、２ｘ１０分間、室温で行い（２０ｘＳＳＣ＋０．２５Ｍ ＥＤＴＡ１６ｍｌ、Ｖf＝４Ｌ）、次いで、ＲＮアーゼＡ処理を、３７℃で３０分間行った（１０ｍｇ／ｍｌ保存液５００μｌをＲｎアーゼ緩衝液２５０ｍｌで希釈＝２０μｇ／ｍｌ）。スライドを、２ｘ１０分間、２ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡで、室温で洗浄した。ストリンジェントな洗浄条件は、以下のようにした：５５℃で２時間、０．１ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡ（２０ｘＳＳＣ２０ｍｌ＋ＥＤＴＡ１６ｍｌ、Ｖf＝４Ｌ）。
【０４３７】
Ｆ．オリゴヌクレオチド
Ｉｎ ｓｉｔｕ分析を、ここに示した様々なＤＮＡ配列で行った。これらの分析に用いたオリゴヌクレオチドは、以下の通りである。
（１）ＤＮＡ４４８０４−１２４８（ＰＲＯ３５７）
ｐｌ：５’−ＧＧＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＧＣＣＣＧＣＡＡＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＴＧ−３’（配列番号：１０４）
ｐ２：５’−ＣＴＡＴＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＣＣＧＣＡＧＣＴＧＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＡ−３’（配列番号：１０５）
（２）ＤＮＡ５２７２２−１２２９（ＰＲＯ７１５）
ｐｌ：５’−ＧＧＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＣＣＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＴ−３’（配列番号：１０６）
ｐ２：５’−ＣＴＡＴＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＣＴＣＧＡＧＡＣＡＣＣＡＣＣＴＧＡＣＣＣＡ−３’（配列番号：１０７）
ｐ３：５’−ＧＧＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＣＡＡＧＧＡＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＣＴＣＴ−３’（配列番号：１０８）
ｐ４：５’−ＣＴＡＴＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＣＴＡＧＧＧＧＧＴＧＧＧＡＡＴＧＡＡＡＡＧ−３’（配列番号：１０９）
（３）ＤＮＡ３８１１３−１２３０（ＰＲＯ３２７）
ｐｌ：５’−ＧＧＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＧＣＴＣＴＣＣＣＧＴＧＴＡ−３’（配列番号：１１０）
ｐ２：５’−ＣＴＡＴＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＧＧＣＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＴＣＧＴＡＧＡ−３’（配列番号：１１１）
（４）ＤＮＡ３５９１７−１２０７（ＰＲＯ２４３）
ｐｌ：５’−ＧＧＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧＧＡＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＧＡ−３’（配列番号：１１２）
ｐ２：５’−ＣＴＡＴＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＴ−３’（配列番号：１１３）
【０４３８】
Ｇ．結果
Ｉｎ Ｓｉｔｕ分析を、ここに開示した様々なＤＮＡ配列で行った。これらの分析結果は以下のようである。
（１）ＤＮＡ４４８０４−１２４８（ＰＲＯ３５７）
胎児組織における骨形成部位と悪性骨肉腫細胞において、低から中程度の発現。胎盤および腱においてかろうじて検出できるシグナル。他の全組織は陰性。
試験した胎児の組織（Ｅ１２−Ｅ１６）は以下を含む：肝臓、腎臓、副腎、肺、心臓、大脈管、食道、胃、脾臓、性腺、脳、脊髄および体壁。
試験した成人の組織：肝臓、腎臓、胃、脾臓、副腎、膵臓、肺、結腸腫瘍、腎細胞腫瘍および骨肉腫。アセトアミノフェン誘導肝障害、肝硬変。
試験したチンパンジーの組織は以下を含む：甲状腺、上皮小体、リンパ節、神経、舌、胸腺、副腎、胃粘膜および唾液腺。
アカゲザル：大脳と小脳。
【０４３９】
（２）ＤＮＡ５２７２２−１２２９（ＰＲＯ７１５）
総合すると、高いシグナルが多くの組織に亘って認められた−中でも高いシグナルが、胎盤、骨芽細胞、損傷した腎尿細管、損傷した肝臓、結腸直腸肝臓転移および胆嚢で認められた。
試験した胎児の組織（Ｅ１２−Ｅ１６）は以下を含む：胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大脈管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤および下肢。
試験した成人の組織：肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、肺、皮膚、軟骨肉腫、眼、胃、結腸、結腸腫瘍、前立腺、膀胱粘膜および胆嚢。アセトアミノフェン誘導肝障害、肝硬変。
試験したアカゲザル：大脳皮質（ｒｍ）、海馬（ｒｍ）
試験したチンパンジー：甲状腺、上皮小体、リンパ節、神経、舌、胸腺、副腎、胃粘膜および唾液腺。
【０４４０】
（３）ＤＮＡ３８１１３−１２３０（ＰＲＯ３２７）
高レベルの発現が、発育中のマウスとヒトの胎児の肺で観察された。正常の成人の肺（気管支上皮を含む）は、陰性であった。ヒト胎児気管の粘膜下組織で発現しており、筋肉細胞でかろうじて発現していた。また、ヒト胎盤において組織発生が不確かである非栄養膜細胞においても発現が認められた。マウスにおいては、発育中の鼻および発育中の舌において観察された。他の全ての組織は陰性であった。推定される機能：気管支発育においての確かな機能。
試験した胎児の組織（Ｅ１２−Ｅ１６）は以下を含む：胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大脈管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、骨盤および下肢。
試験した成体の組織は以下を含む：肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、皮膚、大脳（ｒｍ）、海馬（ｒｍ）、陰茎、眼、膀胱、胃、胃粘膜、結腸、結腸腫瘍、甲状腺（チンパンジー）、上皮小体（チンパンジー）、卵巣（チンパンジー）および軟骨肉腫。
（４）ＤＮＡ３５９１７−１２０７（ＰＲＯ２４３）
コルネリア・ド・ランゲ症候群（Ｃｏｒｎｅｌｉａ ｄｅ Ｌａｎｇｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＣｄＬＳ）は、先天性の症候群である。それは、生まれた時から出現することを意味する。ＣｄＬＳは、身体、知能および言語の発育遅延を引き起こす疾患である。ＣｄＬＳを有する小児の大多数は、軽度から重度におよぶ精神遅延の程度で、精神的に遅延している。報告されたＩＱは、３０から８５である。ＩＱの平均値は５３である。頭と顔の特徴は、小さい頭、しばしば中央でつながっている薄い両眉、長い睫毛、短い上唇、薄い下唇、低位置の耳と高い弓なりの口蓋もしくは口蓋破裂を含む。他の特徴は、言葉遅延（最も軽度な傷害においても）、遅延した発育と低い身長、低い泣き声、小さい手足、内側に曲がった５本の指、猿線、および多毛を含む。診断は、これらの特徴の組み合わせの出現によって決まる。これらの特徴の多くが、様々な程度で出現する。いくつかの事例において、これらの特徴は、出現しないかもしれないし、とても軽度であるため、熟達した遺伝学者もしくはこの症候群に習熟したその他の者によって観察された時のみ認識されるかもしれない。ＣｄＬＳについて多くのことが知られているが、最近の報告では、より多くの研究されるべきことがあることが報告されている。
【０４４１】
この研究において、ヒト胎児の顔、頭、四肢およびマウス胎芽が試験された。マウス組織においては、全く発現が認められなかった。発現は、アンチセンスプローブでのみ認められた。
【０４４２】
発現は、発育中の四肢および骨膜傍の間葉細胞における顔骨に隣接して観察された。発現は、高特異的であり、しばしば、血管新生している領域に隣接していた。分布は、コルネリア・ド・ランゲ症候群において観察された骨格異常と一致している。また、発現は、発育時の一時的に胎児脳の後頭葉においても観察されたが、その他には観察されなかった。さらに、発現は、発育中の内耳の神経節において認められた；この発見の有意性は明らかではない。
【０４４３】
これらのデータは、機能的な情報を提供するものではないが、分布は、この症候群に最も重篤な影響を与えることが知られている部位に一致する。
【０４４４】
さらに、わずかな発現が、大腿骨頭と寛骨臼との間（股関節）に形成されている発育中の滑膜性連結における割線に観察された。この発現パターンが、その他の連結形成部位において観察されるのであれば、コルネリア・ド・ランゲ症候群に観察される顔と四肢の異常を説明できる。
【０４４５】
実施例３１： アフリカツメガエル卵母細胞におけるＰＲＯ２４３ ｍＲＮＡの活性
ＰＲＯ２４３をコードするヒトｃｈｏｒｄｉｎクローン（ＤＮＡ３５９１７−１２０７）が、アフリカツメガエルコルディン(chordin)とショウジョウバエｓｏｇ遺伝子によって推測されるように、機能し、作用することを証明するために、ＤＮＡ３５９１７−１２０７から超らせん状のプラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎによって調製し、アフリカツメガエルの胚芽に注入するために用いた。アフリカツメガエルのコルディンｍＲＮＡの腹側の植物極割球へのマイクロインジェクションにより、第２（２倍）軸を誘導し（Ｓａｓａｉら、Ｃｅｌｌ ７９：７７９−７９０（１９９４））と、ショウジョウバエｓｏｇも、アフリカツメガエル胚芽の側腹位に異所的に発現する時に、第２軸を誘導する（Ｈｏｌｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３７６：２４９−２５３（１９９５）と、Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１：４３１９−４３２８（１９９５））。アフリカツメガエル卵母細胞において機能するｓｏｇの性能は、背腹軸 パターン形成に含まれる過程が、進化時に保存されていることを示している。
【０４４６】
方法
カエル胚芽の操作：
成熟雌のカエルを、使用３日前に、受胎している雌馬の血清２０００Ｉ．Ｕ．を、および注入前夜にヒトの絨毛性のゴナドトロピン８００Ｉ．Ｕ．をブースト（boost）した。翌朝、新鮮な卵母細胞を、雌のカエルから搾取し、卵母細胞を、雄のカエルから切開して取り出しミンチ状にした精巣と混合することにより、インビトロでの卵母細胞の受精を行った。ＮｉｅｕｗｋｏｏｐとＦａｂｅｒ、Ｎｏｒｍａｌ Ｔａｂｌｅ ｏｆ Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ，Ｎ．−Ｈ．Ｐ社監修（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９６７）に従って、胚芽の発育を維持し、段階づけた。
【０４４７】
受精した卵を、２％システイン（ｐＨ７．８）で１０分間脱ゼリー化させ、滅菌水で１回洗浄し、５％Ｆｉｃｏｌｌを含む０．１ｘＭＢＳに移した。受精した卵を、インジェクショントレー上、５％Ｆｉｃｏｌｌを含む０．１ｘＭＢＳ中に配列した。２細胞期に発育したアフリカツメガエル胚芽に、野生型ｃｈｏｒｄｉｎ（ＤＮＡ３５９１７−１２０７）を含むｐＲＫ５を２００ｐｇ、もしくは対照として挿入物を含まないｐＲＫ５を２００ｐｇ注入した。注入した胚芽を、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンを含む０．１ｘＭＢＳに移した後、Ｎｉｅｕｋｗｋｏｏｐｋｉ３７−３８に到達するまで、トレー上でさらに６時間保持した。
【０４４８】
結果：
ヒトｃｈｏｒｄｉｎ ｃＤＮＡを単一の割球に注入したところ、おたまじゃくしの側腹になった。おたまじゃくしの側腹は、尾が短くねじれ、セメント腺が拡張して見える。ヒトｃｈｏｒｄｉｎのアフリカツメガエルにおける側腹剤として機能する性能は、ＤＮＡ３５９１７−１２０７によってコードされたタンパク質が、カエルにおける背腹パターン形成に機能、かつ影響を及ぼすことを示し、そして、腹側パターン形成において含まれる過程が、進化時に保存されていて、作用機構がヒト、ハエおよびカエルの間で共通に保存されていることが提示するものである。
【０４４９】
材料の寄託
以下の材料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に寄託されている：
材料 ＡＴＣＣ寄託番号 寄託日
ＤＮＡ３４３９２−１１７０ ＡＴＣＣ２０９５２６ 1997年12月10日
ＤＮＡ３５９１７−１２０７ ＡＴＣＣ２０９５０８ 1997年12月 3日
ＤＮＡ３９９７６−１２１５ ＡＴＣＣ２０９５２４ 1997年12月10日
ＤＮＡ３５５９５−１２２８ ＡＴＣＣ２０９５２８ 1997年12月10日
ＤＮＡ３８１１３−１２３０ ＡＴＣＣ２０９５３０ 1997年12月10日
ＤＮＡ３４４３６−１２３８ ＡＴＣＣ２０９５２３ 1997年12月10日
ＤＮＡ４０５９２−１２４２ ＡＴＣＣ２０９４９２ 1997年11月21日
ＤＮＡ４４１７６−１２４４ ＡＴＣＣ２０９５３２ 1997年12月10日
ＤＮＡ４４１９２−１２４６ ＡＴＣＣ２０９５３１ 1997年12月10日
ＤＮＡ３９５１８−１２４７ ＡＴＣＣ２０９５２９ 1997年12月10日
ＤＮＡ４４８０４−１２４８ ＡＴＣＣ２０９５２７ 1997年12月10日
ＤＮＡ５２７２２−１２２９ ＡＴＣＣ２０９５７０ 1998年 1月 7日
ＤＮＡ４１２３４−１２４２ ＡＴＣＣ２０９６１８ 1998年 2月 5日
ＤＮＡ４５４１０−１２５０ ＡＴＣＣ２０９６２１ 1998年 2月 5日
ＤＮＡ４６７７７−１２５３ ＡＴＣＣ２０９６１９ 1998年 2月 5日
【０４５０】
これらの寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定およびそれに基づく規則の下で行われた（ブダペスト条約）。これは、寄託日から３０年間、寄託物の生存可能な培養物の維持を保証する。寄託物はブダペスト条約の下でＡＴＣＣにより入手可能であり、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社とＡＴＣＣとの間の合意を得ることを条件として、直接関係する米国特許の発行、もしくは米国またはその他の国の早い方の特許出願の公開に基づいて、公衆に寄託物の培養物の子孫の永久的かつ無制限の利用可能性を保証し、そして、その子孫の入手を、米国特許法第１２２条およびそれに準ずる長官規則（特に８８６ＯＧ６３８に関して米国特許法施行規則§１．１４を含む）に従って付与される米国特許商標庁長官によって定められた者に保証する。
【０４５１】
本願の譲受人は、寄託物の培養物が適切な条件下で培養された場合に死滅または損なわれた場合には、この材料を速やかに同一物で置き換えることに同意した。寄託材料の利用可能性は、その国の特許法に従って政府の権力の下に付与された権利に違反して本発明を実施するライセンスとして解釈されない。
【０４５２】
上記明細書は、当業者が本発明を十分に実施できるものと解する。寄託された実施態様は、本発明の一部の態様の単なる例示に過ぎないこと、並びに、機能的に均等なあらゆる構成物が本発明の範囲に含まれることから、本発明は、寄託された構築物により、範囲が制限されるものではない。ここに言う材料の寄託は、上記記述が、その最良の形態を含めた本発明のあらゆる態様の実施を可能にするのに不適切であることの承認、あるいは、それが示す特定の例示に請求の範囲を限定すると解釈されるとの承認を構成するものではない。実際に、ここに記載または示されたものに加えて、本発明の種々の変更が、上記記載から当業者にとって明白になり、添付された請求の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、天然配列ＰＲＯ２４１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１）を示し、配列番号：１は、「ＵＮＱ２１５」及び／又は「ＤＮＡ３４３９２-１１７０」とここで称したクローンである。
【図２】 図２は、図１に示した配列番号：１のコード配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。また図２中には、推定シグナルペプチド、潜在ロイシンジッパー領域及び潜在Ｎ-グリコシル化部位の位置も提供される。
【図３】 図３は、天然配列ＰＲＯ２４３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：６）を示し、配列番号：６は、「ＵＮＱ２１７」及び／又は「ＤＮＡ３５９１７-１２０７」とここで称したクローンである。
【図４】 図４は、図３中に示した配列番号：６のコード配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：７）を示す。
【図５】 図５は、ヒト染色体３ｑ２７-ｑ２８のＴＨＰＯ領域中のゲノムクローンの形成を示す。
【図６】 図６は、ヒト成人及び胎児組織の発現を示す。６Ａは、ヒトコルディン(chordin)（ＰＲＯ２４３）プローブにハイブリダイズした成人及び胎児組織のノーザンブロットである。下方パネルはアクチン対照を示す。６Ｂは、示される保存システインブロックをコードしているコドンの位置とともにヒトコルディン（ＰＲＯ２４３）ｃＤＮＡの図である。用いたプローブの範囲は、実線によって示される。
【図７】 図７は、大腿骨頭と寛骨臼との間に形成される発育途上の滑膜性の連結の割線において陽性シグナルを与える成人組織のＰＲＯ２４３in situハイブリダイゼーションを示す。
【図８】 図８は、天然配列ＰＲＯ２９９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１４）を示し、配列番号：１４は「ＵＮＱ２６２」及び／又は「ＤＮＡ３９９７６-１２１５」とここで称したクローンである。
【図９】 図９は、図８に示した配列番号：１４のコード配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：１５）を示す。
【図１０】 図１０は、ＤＮＡ２８８４７（配列番号：１８）とここで称したヌクレオチド配列を示す。
【図１１】 図１１は、ＤＮＡ３５８７７（配列番号：１９）とここで称したヌクレオチド配列を示す。
【図１２】 図１２は、天然配列ＰＲＯ３２３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２３）を示し、配列番号：２３は、「ＵＮＱ２８４」及び／又は「ＤＮＡ３５５９５-１２２８」とここで称したクローンである。
【図１３】 図１３は、図１２に示した配列番号：２３のコード配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：２４）を示す。
【図１４】 図１４は、ＰＲＯ３２３-融合ポリペプチドとＩｇＧ定常ドメインの部分との間のキメラ融合タンパク質のヌクレオチド配列（ヌクレオチド７９−１４１６）を含む一本鎖ヌクレオチド配列（配列番号：２９）を示し、該キメラ融合タンパク質は「ＰＲＯ４５４」とここで称した。ＰＲＯ３２３／ＩｇＧ融合タンパク質（ＰＲＯ４５４）をコードしている一本鎖ヌクレオチド配列（配列番号：２９）は、「ＤＮＡ３５８７２」とここで称した。
【図１５】 図１５は、図１４に示したヌクレオチド配列のヌクレオチド７９−１４１６から得られたアミノ酸配列（配列番号：３０）を示す。ＰＲＯ３２３-誘導配列とＩｇＧ-誘導配列との間のＰＲＯ４５４アミノ酸配列における連結は、該図中のアミノ酸４１５−４１６の間と思われる。
【図１６】 図１６は、天然配列ＰＲＯ３２７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３１）を示し、配列番号：３１は、「ＵＮＱ３２７」及び／又は「ＤＮＡ３８１１３-１２３０」とここで称したクローンである。
【図１７】 図１７は、図１６に示した配列番号：３１のコード配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図１８】 図１８は、天然配列ＰＲＯ２３３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３６）を示し、配列番号：３６は「ＵＮＱ２０７」及び／又は「ＤＮＡ３４４３６-１２３８」とここで称したクローンである。
【図１９】 図１９は、図１８に示した配列番号：３６のコード配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：３７）を示す。
【図２０】 図２０は、天然配列ＰＲＯ３４４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４１）を示し、配列番号：４１は、「ＵＮＱ３０３」及び／又は「ＤＮＡ４０５９２-１２４２」とここで称したクローンである。
【図２１】 図２１は、図２０に示した配列番号：４１のコード配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：４２）を示す。
【図２２】 図２２は、天然配列ＰＲＯ３４７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４９）を示し、配列番号：４９は、「ＵＮＱ３０６」及び／又は「ＤＮＡ４４１７６-１２４４」とここで称したクローンである。
【図２３】 図２３は、図２２に示した配列番号：４９のコード配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：５０）を示す。
【図２４】 図２４は、天然配列ＰＲＯ３５４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５４）を示し、配列番号：５４は、「ＵＮＱ３１１」及び／又は「ＤＮＡ４４１９２-１２４６」とここで称したクローンである。
【図２５】 図２５は、図２４に示した配列番号：５４のコード配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：５５）を示す。
【図２６】 図２６は、天然配列ＰＲＯ３５５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：６０）を示し、配列番号：６０は、「ＵＮＱ３１２」及び／又は「ＤＮＡ３９５１８-１２４７」とここで称したクローンである。
【図２７】 図２７は、図２６に示した配列番号：６０のコード配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：６１）を示す。
【図２８】 図２８は、天然配列ＰＲＯ３５７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：６８）を示し、配列番号：６８は、「ＵＮＱ３１４」及び／又は「ＤＮＡ４４８０４-１２４８」とここで称したクローンである。
【図２９】 図２９は、図２８に示した配列番号：６８のコード配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：６９）を示す。
【図３０】 図３０は、天然配列ＰＲＯ７１５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：７５）を示し、配列番号：７５は、「ＵＮＱ３８３」及び／又は「ＤＮＡ５２７２２-１２２９」とここで称したクローンである。
【図３１】 図３１は、図３０に示した配列番号：７５のコード配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：７６）を示す。
【図３２】 図３２は、ヒト腫瘍壊死因子-α（ＴＮＦＡ＿ヒト）（配列番号：７７）と、ＤＮＡ５２７２２-１２２９のヌクレオチド１１４−８６３から得られたアミノ酸配列（配列番号：７６）との比較を示す。同じアミノ酸は箱で囲んだ。
【図３３】 図３３は、ＤＮＡ５２７２２-１２２９のヌクレオチド１１４−８６３から得られたアミノ酸配列（配列番号：７６）とタンパク質の腫瘍壊死ファミリーの各種のメンバーの配列（配列番号：７８−８４）との比較を示す。同じアミノ酸は箱で囲った。
【図３４】 図３４は、天然配列ＰＲＯ３５３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：８５）を示し、配列番号：８５は、「ＵＮＱ３１０」及び／又は「ＤＮＡ４１２３４-１２４２」とここで称したクローンである。
【図３５】 図３５は、図３４に示した配列番号：８５のコード配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：８６）を示す。
【図３６】 図３６は、天然配列ＰＲＯ３６１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：９０）を示し、配列番号：９０は、「ＵＮＱ３１６」及び／又は「ＤＮＡ４５４１０-１２５１」とここで称したクローンである。
【図３７】 図３７は、図３６に示した配列番号：９０のコード配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：９１）を示す。
【図３８】 図３８は、天然配列ＰＲＯ３６５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：９８）を示し、配列番号：９８は、「ＵＮＱ３２０」及び／又は「ＤＮＡ４６７７７-１２５３」とここで称したクローンである。
【図３９】 図３９は、図３８に示した配列番号：９８のコード配列から得られたアミノ酸配列（配列番号：９９）を示す。

Claims (20)

  1. (i) 図２（配列番号：２）に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸；及び
    (ii) (i)の核酸と相補的なヌクレオチド配列からなる核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列からなり、軟骨からのプロテオグリカンの遊離を刺激する能力を有するタンパク質をコードする核酸；
    からなる群から選択される単離した核酸。
  2. 上記ヌクレオチド配列が、図１（配列番号：１）又はその相補体からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む請求項１記載の核酸。
  3. 上記ヌクレオチド配列が、図１（配列番号：１）に示した配列の全長コード配列、又はその相補体からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む請求項１記載の核酸。
  4. 受託番号ＡＴＣＣ２０９５２６の下に寄託したＤＮＡの全長コード配列を含む単離した核酸。
  5. 請求項１記載の核酸を含むベクター。
  6. 該ベクターで形質転換した宿主細胞により認識される制御配列に操作可能に結合した請求項５記載のベクター。
  7. 請求項５記載のベクターを含む宿主細胞。
  8. 上記細胞がＣＨＯ細胞である請求項７記載の宿主細胞。
  9. 上記細胞が大腸菌である請求項７記載の宿主細胞。
  10. 上記細胞が酵母細胞である請求項７記載の宿主細胞。
  11. 図２（配列番号：２）に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドの製造方法であり、上記図２（配列番号：２）に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現のために好適な条件下で請求項７記載の宿主細胞を培養すること及びその細胞培養物から図２（配列番号：２）に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドを回収することを含む方法。
  12. (i) 図２（配列番号：２）に示したアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び
    (ii) (i)のアミノ酸配列において１乃至数個程度のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入によって得られるアミノ酸配列からなり、軟骨からのプロテオグリカンの遊離を刺激する能力を有するポリペプチド；
    からなる群から選択される単離した天然配列ポリペプチド。
  13. (i) 受託番号ＡＴＣＣ２０９５２６の下に寄託したヌクレオチドによってコードされたポリペプチド；及び
    (ii) (i)のアミノ酸配列において１乃至数個程度のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入によって得られるアミノ酸配列からなり、軟骨からのプロテオグリカンの遊離を刺激する能力を有するポリペプチド；
    からなる群から選択される単離したポリペプチド。
  14. 異種アミノ酸配列に融合した請求項１２記載のポリペプチドを含むキメラ分子。
  15. 上記異種アミノ酸配列が、エピトープ標識配列である請求項１４記載のキメラ分子。
  16. 上記異種アミノ酸配列が、免疫グロブリンのＦｃ領域である請求項１４記載のキメラ分子。
  17. 請求項１２記載のＰＲＯポリペプチドに特異的に結合する抗体。
  18. 上記抗体がモノクローナル抗体である請求項１７記載の抗体。
  19. 図２（配列番号：２）に示したアミノ酸配列を含む、単離された天然ＰＲＯポリペプチド２４１。
  20. 図２（配列番号：２）の残基１６乃至３７９を含むアミノ酸配列を含む、天然シグナル配列を含まない単離された天然ＰＲＯポリペプチド２４１。
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