KR101769160B1 - Ｃａｄｍ１에 특이적인 완전 인간 항체 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 단리된 모노클로날 항체, 특히 인간 모노클로날 항체, 보다 특히 CADM1에 고친화도로 특이적으로 결합하는 Fc 수용체에 대한 결합이 증가되고/거나 ADCC에 대한 효능이 증가된 조작된 항체 또는 면역접합체를 제공한다. CADM1 항체를 코딩하는 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포 및 CADM1 항체를 발현시키는 방법을 또한 제공한다. CADM1 항체를 포함하는 이중특이적 분자 및 제약 조성물을 또한 제공한다. CADM1을 검출하는 방법, 뿐만 아니라 폐암 및 췌장암을 비롯한 다양한 암을 치료하는 방법을 개시한다.

Description

ＣＡＤＭ１에 특이적인 완전 인간 항체 {FULLY HUMAN ANTIBODIES SPECIFIC TO CADM1}
관련 출원
본원은 2009년 3월 5일자로 출원된 미국 가출원 번호 61/209471 및 2009년 3월 5일자로 출원된 미국 가출원 번호 61/209390의 우선권을 주장하며, 이는 둘 모두 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 면역학 및 분자 생물학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본원은 항체, 특히 Fc 수용체에 대한 결합이 증가되고/거나 ADCC에 대한 효능이 증가된 조작된 항체 및 면역접합체, 및 이뮤노글로불린-유사 부착 분자 CADM1에 대해 지시된 다른 치료 단백질, 그러한 항체 및 치료 단백질을 코딩하는 핵산, 본 발명의 모노클로날 항체 및 다른 치료 단백질의 제조 방법, 및 질환, 예컨대 CADM1 발현/활성에 의해 매개되고/거나 리간드의 비정상적 발현/활성과 관련된 암을 치료하는 방법을 제공한다.
세포 부착 분자는 일반적으로 카드헤린, 인테그린, 셀렉틴으로서, 또는 이뮤노글로불린 (Ig) 슈퍼패밀리의 구성원으로서 확인된다. 이뮤노글로불린 슈퍼패밀리 분자에는 세포 표면 항원 수용체, 공수용체 및 면역계의 공동-자극 분자, 림프구에의 항원 제시에 수반되는 분자, 세포 부착 분자 및 몇몇 시토카인 수용체가 포함된다. Ig 슈퍼패밀리 세포 부착 분자는 척추동물에서 100 개를 초과하는 분자로 구성되고, NCAM (신경 세포 부착 분자), L1 패밀리 CAM, ICAMS (세포내 세포 부착 분자), VCAMS (혈관 세포 부착 분자), SIGLEC (시알산 결합 Ig-유사 렉틴, CD22 및 CD83이 포함됨), 넥틴, CD2, CD48이 포함된다.
이뮤노글로불린 슈퍼패밀리 분자 CADM1은 많은 연구 그룹에 의해 초기에 특성화되었으며, 그 결과 상기 분자는 과학 문헌에서 세포 부착 분자 1, 시냅스 세포 부착 분자 (synCAM), 정자형성 이뮤노글로불린 슈퍼패밀리 분자 (sgIGSF), IGSF4, BL2, ST17, NECL2, RA175, 및 CADM1A을 비롯한 많은 명칭으로 확인된다. 추가로 초기에는 종양 억제자의 역할을 하는 것으로 보고되어, 또한 TSLC1으로도 알려져 있다 (문헌 [Murakami et al., Nature Genetics 27(4):427 (2001)]).
접착 활성을 위해 Ca+2 또는 Mg+2와 같은 2가 양이온을 필요로 하는 카드헤린 및 인테그린과는 달리, Ig 슈퍼패밀리 분자는 전형적으로 Ca+2 또는 Mg+2 비의존적이다. CADM1 구조는 3 개의 이뮤노글로불린-유사 모티프를 갖는 세포외 도메인, 단일 소수성 막-스패닝 α 헬릭스 및 DAL-1을 통해 액틴 섬유에 결합하는 세포내 도메인, 및 PDZ-결합 모티프를 함유하는 짧은 C-말단 세포질 꼬리를 갖는 것으로 특성화되어 있다. 2 개의 CADM1 이소형, NM_014333 및 NM_001098517이 공지되어 있으며, 후자는 27 개의 아미노산이 결실된 것이다. 분석은 CADM1의 세포질 도메인에 상응하는 아미노산 서열이 5 종의 포유동물에서 동일하며, 척추동물에서 매우 보존되어 있음을 보여주는데, 이는 정상적인 세포-세포 상호작용에서 CADM1의 역할이 중요함을 시사한다. 마우스 CADM1 오르토로그 (AAQ023810)는 인간 CADM1에 대해 97％ 동일성을 나타낸다. (문헌 [Fukami et al., Gene 295:7-12 (2002)).
CADM1은 신경 및 비만 세포 (문헌 [Ito et al., J Pharmacol Sci.;102(1):1-5 (2006)]), 폐포 세포 (문헌 [Ito et al., Histol Histopathol. 18(4):1321-9 (2003)]), 췌장 분비 세포 (문헌 [Shingai et al., J Biol Chem.; 278(37):35421-7 (2003)]), ([Wakayama et al., Blood;101(7):2601-8 (2003)])에서 발현된다. 이는 또한 간세포 암종 (HCC)과도 관련이 있다. CADM1은 태아 및 경변 성인 담관 세포에서 발현되는 것으로 보이지만, 질환에 걸리지 않은 성인 담관에는 존재하지 않는다 (문헌 [Ito et al., Hepatology;45(3):684-94 (2007)]). 추가로, 교모세포종 및 폐암과도 관련이 있는 것으로 보고되었다.
CADM1 불활성화를 야기하는 2 가지의 메카니즘이 확인되었다: 프로모터 메틸화를 통하는 것, 및 유전자 좌위에서 이형접합성의 손실을 통하는 것. CADM1 프로모터의 메틸화는 폐 식도암, 췌장암, 유방암, 및 전립선암을 비롯한 종양, 특히 공격적 거동을 갖는 종양에서 CADM1 발현의 손실을 야기하는 것으로 보고되어 있다. (문헌 [Murakami et al., Mol Cancer. 4:28 (2005)]).
발명의 개요
본 발명은 항체, 특히 CADM1에 대해 지시된, Fc 수용체에 대한 결합이 증가되고/거나 ADCC에 대한 효능이 증가된 조작된 항체 및 면역접합체, 그러한 항체 및 치료 단백질을 코딩하는 핵산, 항-CADM1 모노클로날 항체 및 다른 치료 단백질의 제조 방법, 및 질환, 예컨대 CADM1 매개 장애, 예를 들어 소세포 폐암, 성인 T-세포 백혈병, 비소세포 폐암 (편평세포 암종 및 선암종 포함), 흑색종, 유방암, 결장직장암, 난소암, 전립선암, 신경내분비 암 (폐, 부신, 뇌하수체, GI관, 신장, 간 (간세포 암종 포함), 췌장 (인슐린종 및 글루카곤종 포함)의 신경내분비 암 포함), 교모세포종, 및 카르시노이드 종양 (췌장, 폐, GI관, 간, 또는 신장의 카르시노이드 종양 포함)을 비롯한 인간 암의 치료 방법을 제공함으로써 이와 관련된 필요 및 다른 관련 필요들을 다룬다.
따라서, 본 발명은 하나 이상의 골 형태발생 단백질 및 이에 대한 수용체에 결합하고, 하나 이상의 바람직한 기능적 특성을 나타내는 단리된 모노클로날 항체, 특히 뮤린, 키메라, 인간화 및 완전 인간 모노클로날 항체를 제공한다. 그러한 특성으로는, 예를 들어 인간 CADM1에 대한 고친화도의 특이적 결합이 포함된다. 또한, 본 발명의 항체, 단백질, 및 조성물을 이용하여 다양한 CADM1-매개 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 서열 19, 20, 또는 21에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 22, 23, 또는 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체에 의해 인식되는 인간 CADM1 상의 에피토프에 결합하는 단리된 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 부분, 항체 단편, 또는 항체 모방체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 이소형의 전장 항체이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 전체 항체, 항체 단편, 인간화 항체, 단일 쇄 항체, 면역접합체, Fc 수용체에 대한 결합이 증가되고/거나 ADCC에 대한 효능이 증가된 조작된 항체, 및 이중특이적 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 면역접합체 또는 Fc 수용체에 대한 결합이 증가되고/거나 ADCC에 대한 효능이 증가된 조작된 항체이다. 항체 단편은 유니바디, 도메인 항체 및 나노바디로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 면역접합체는 치료제를 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 치료제는 세포독소 또는 방사성 동위원소이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 아피바디, DARPin, 안티칼린, 아비머, 베르사바디 및 듀오칼린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 측면에서, 항체는 인간 CADM1에 50 Nm 미만, 10 Nm 미만, 또는 1 Nm 미만의 EC50으로 결합한다.
대안적 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 단리된 항체 또는 항원 결합 부분 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명의 항체는 제1항의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 인간 CADM1 상의 에피토프에 결합하는 단리된 항체 또는 항원 결합 부분의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함한다. 본 발명의 다른 측면은 그러한 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터 및 이를 포함하는 숙주 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포를 수득하는 단계; 숙주 세포를 숙주 세포 배양물에서 성장시키는 단계; 하나 이상의 핵산 분자가 발현되는 숙주 세포 배양 조건을 제공하는 단계; 및 숙주 세포 또는 숙주 세포 배양물로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항-CADM1 항체의 제조 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 CADM1을 발현하는 표적 세포와 관련된 질환의 치료 또는 예방에 효과적인 양으로 대상체에게 항-CADM1 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 부분에 의해 치료 또는 예방되는 질환은 인간 암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체에 의해 치료 또는 예방되는 질환은 소세포 폐암, 성인 T-세포 백혈병, 비소세포 폐암 (편평세포 암종 및 선암종 포함), 흑색종, 유방암, 결장직장암, 난소암, 전립선암, 신경내분비 암 (폐, 부신, 뇌하수체, GI관, 신장, 간 (간세포 암종 포함), 췌장 (인슐린종 및 글루카곤종 포함)의 신경내분비 암 포함), 교모세포종, 및 카르시노이드 종양 (췌장, 폐, GI관, 간, 또는 신장의 카르시노이드 종양 포함)으로 이루어진 군으로부터 선택된 암이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 CADM1을 발현하는 표적 세포와 관련된 질환을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 항-CADM1 항체, 또는 그의 항원 결합 부분에 관한 것이다. 일부 측면에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 부분에 의해 치료 또는 예방되는 질환은 인간 암이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체에 의해 치료 또는 예방되는 질환은 소세포 폐암, 성인 T-세포 백혈병, 비소세포 폐암 (편평세포 암종 및 선암종 포함), 흑색종, 유방암, 결장직장암, 난소암, 전립선암, 신경내분비 암 (폐, 부신, 뇌하수체, GI관, 신장, 간 (간세포 암종 포함), 췌장 (인슐린종 및 글루카곤종 포함)의 신경내분비 암 포함), 교모세포종, 및 카르시노이드 종양 (췌장, 폐, GI관, 간, 또는 신장의 카르시노이드 종양 포함)으로 이루어진 군으로부터 선택된 암이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 CADM1을 발현하는 표적 세포와 관련된 질환을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 의약을 제조하기 위한 항-CADM1 항체, 또는 그의 항원 결합 부분의 용도에 관한 것이다. 일부 측면에서, 본 발명의 의약에 의해 치료 또는 예방되는 질환은 인간 암이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 의약에 의해 치료 또는 예방되는 질환은 소세포 폐암, 성인 T-세포 백혈병, 비소세포 폐암 (편평세포 암종 및 선암종 포함), 흑색종, 유방암, 결장직장암, 난소암, 전립선암, 신경내분비 암 (폐, 부신, 뇌하수체, GI관, 신장, 간 (간세포 암종 포함), 췌장 (인슐린종 및 글루카곤종 포함)의 신경내분비 암 포함), 교모세포종, 및 카르시노이드 종양 (췌장, 폐, GI관, 간, 또는 신장의 카르시노이드 종양 포함)으로 이루어진 군으로부터 선택된 암이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 19에 기재된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열 22에 기재된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열; 서열 20에 기재된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열 23에 기재된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열; 서열 21에 기재된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열 24에 기재된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체에 의해 인식되는 인간 CADM1 상의 에피토프에 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 항체 단편, 또는 항체 모방체이다. 추가 측면에서, 항체는 전체 항체, 항체 단편, 인간화 항체, 단일 쇄 항체, 면역접합체, Fc 수용체에 대한 결합이 증가되고/거나 ADCC에 대한 효능이 증가된 조작된 항체, 및 이중특이적 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 측면에서, 항체는 면역접합체 또는 Fc 수용체에 대한 결합이 증가되고/거나 ADCC에 대한 효능이 증가된 조작된 항체이다. 본 발명의 추가 측면에서, 항체 단편은 유니바디, 도메인 항체 및 나노바디로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항체 모방체는 아피바디, DARPin, 안티칼린, 아비머, 베르사바디 및 듀오칼린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 실시양태에서, 조성물은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 단리된 핵산 분자이며, 추가 측면에서 그러한 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 그러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 본 발명의 항체의 어느 하나의 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 발현하는 하이브리도마이다.
본 발명의 다른 측면은 인간 이뮤노글로불린 유전자를 포함하는 트랜스제닉 동물을 CADM1 펩티드로 면역화하는 단계; 상기 트랜스제닉 동물로부터 B 세포를 회수하는 단계; 상기 B 세포로부터 하이브리도마를 제조하는 단계; CADM1에 결합하는 항체를 발현하는 하이브리도마를 선별하는 단계; 및 상기 선별된 하이브리도마로부터 CADM1에 결합하는 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는 본 발명의 항체 제조 방법에 관한 것이다.
다른 실시양태에서, 항-CADM1 항체의 제조 방법은
인간 이뮤노글로불린 유전자를 포함하는 트랜스제닉 동물을 CADM1 펩티드로 면역화하는 단계;
상기 트랜스제닉 동물의 B 세포로부터 mRNA를 회수하는 단계;
상기 mRNA를 cDNA로 전환시키는 단계;
파지 내에서 상기 cDNA를 발현시켜 상기 cDNA에 의해 코딩된 항-CADM1 항체가 상기 파지의 표면 상에 제시되게 하는 단계;
항-CADM1 항체가 제시된 파지를 선별하는 단계;
상기 항-CADM1 이뮤노글로불린을 코딩하는 상기 선별된 파지로부터 핵산 분자를 회수하는 단계;
상기 회수된 핵산 분자를 숙주 세포에서 발현시키는 단계; 및
상기 숙주 세포로부터 CADM1에 결합하는 항체를 회수하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 일부 측면에서, 단리된 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 19, 20, 또는 21에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 22, 23, 또는 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체에 의해 인식되는 서열 43 또는 44의 아미노산 서열을 갖는 CADM1 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합한다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 제한적 의미로서 해석되지 않아야 하는 하기의 상세한 설명과 실시예로부터 명백해질 것이다. 본원 전체에서 인용되는 모든 참고문헌, 진뱅크 기탁 번호, 특허 및 공개된 특허 출원은 명백하게 본원에 참고로 포함된다.
도 1a는 PTA021_A1 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 25) 및 아미노산 서열 (서열 19)을 나타낸다. CDR1 (서열 1), CDR2 (서열 4) 및 CDR3 (서열 7) 영역을 도시하고, V, D 및 J 배선 유래를 표시한다.
도 1b는 PTA021_A1 인간 모노클로날 항체의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 28) 및 아미노산 서열 (서열 22)을 나타낸다. CDR1 (서열 10), CDR2 (서열 13) 및 CDR3 (서열 16) 영역을 도시하고, V 및 J 배선 유래를 표시한다.
도 2a는 PTA021_A2 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 26) 및 아미노산 서열 (서열 20)을 나타낸다. CDR1 (서열 2), CDR2 (서열 5) 및 CDR3 (서열 8) 영역을 도시하고, V 및 J 배선 유래를 표시한다.
도 2b는 PTA021_A2 인간 모노클로날 항체의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 29) 및 아미노산 서열 (서열 23)을 나타낸다. CDR1 (서열 11), CDR2 (서열 14) 및 CDR3 (서열 17) 영역을 도시하고, V 및 J 배선 유래를 표시한다.
도 3a는 PTA021_A3 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 27) 및 아미노산 서열 (서열 21)을 나타낸다. CDR1 (서열 3), CDR2 (서열 6) 및 CDR3 (서열 9) 영역을 도시하고, V, D 및 J 배선 유래를 표시한다.
도 3b는 PTA021_A3 인간 모노클로날 항체의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 30) 및 아미노산 서열 (서열 24)을 나타낸다. CDR1 (서열 12), CDR2 (서열 15) 및 CDR3 (서열 18) 영역을 도시하고, V 및 J 배선 유래를 표시한다.
도 4는 PTA021_A1의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 19)을 인간 배선 VH 2-05 아미노산 서열 (서열 31) 및 인간 배선 JH JH5b 아미노산 서열 (서열 37)과 함께 정렬한 것을 나타낸다.
도 5는 PTA021_A2의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 20)을 인간 배선 VH 2-05 아미노산 서열 (서열 32) 및 인간 배선 JH 5b 아미노산 서열 (서열 38)과 함께 정렬한 것을 나타낸다.
도 6은 PTA021_A3의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 21)을 인간 배선 VH 2-05 아미노산 서열 (서열 33) 및 인간 배선 JH 5b 아미노산 서열 (서열 39)과 함께 정렬한 것을 나타낸다.
도 7은 PTA021_A1의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 22)을 인간 배선 VK L15 아미노산 서열 (서열 34) 및 인간 배선 JK 4 아미노산 서열 (서열 40)과 함께 정렬한 것을 나타낸다.
도 8은 PTA021_A2의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 23)을 인간 배선 VK L15 아미노산 서열 (서열 35) 및 인간 배선 JK 4 아미노산 서열 (서열 41)과 함께 정렬한 것을 나타낸다.
도 9는 PTA021_A3의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 24)을 인간 배선 VK L15 아미노산 서열 (서열 36) 및 인간 배선 JK 4 아미노산 서열 (서열 42)과 함께 정렬한 것을 나타낸다.
도 10은 NCI-H69 소세포 폐암 세포에서 PTA021_A1, PTA021_A2 및 PTA021_A3에 대한 FACS 분석 결과를 나타낸다.
도 11a 및 11b는 NCI-H69 및 DMS79 소세포 폐암 세포 각각에서 PTA021_A1, PTA021_A2 및 PTA021_A3에 대한 FACS 분석 결과를 나타낸다.
도 12는 SKOV3 난소암 세포에서 PTA021_A3에 대한 FACS 분석 결과를 나타낸다.
도 13은 A549 비소세포 폐암 세포에서 PTA021_A3에 대한 FACS 분석 결과를 나타낸다.
도 14는 786-O 신세포 암종 세포 및 SkMel28 흑색종 세포에서 PTA021_A3에 대한 FACS 분석 결과를 나타낸다.
도 15는 NCI-H69 및 DMS79 소세포 폐암 세포에서 PTA021_A3 및 PTA021_A3의 비푸코실화 버전 (nf)에 대한 FACS 분석 결과를 나타낸다.
도 16a 및 16b는 각각 DMS79 및 NC1-H69 세포주에서의 PTA021_A1, PTA021_A2, 및 PTA021_A3에 의해 매개되는 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 나타낸다.
도 17a 및 17b는 각각 DMS79 및 NCI-H69 세포에서의 PTA021_A1, PTA021_A2, 및 PTA021_A3에 대한 Hum-ZAP 검정의 결과를 나타낸다.
도 18은 마우스 이종이식 모델에서 HepG2 종양 크기에 대한 푸코실화 또는 비푸코실화 PTA021_A3 항체를 이용한 처리 효과를 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 19는 마우스 이종이식 모델에서 HepG2 종양 크기에 대한 PTA021_A3-화학식 M 접합체에 의한 처리 효과를 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 20a는 마우스 이종이식 모델에서 DMS79 종양 크기에 대한 PTA021_A3-화학식 M 접합체의 0.3 μmol/kg 투여량에 의한 처리 효과를 보여주는 그래프를 나타낸다. 도 20b는 마우스 이종이식 모델에서 DMS79 종양 크기에 대한 PTA021_A3-화학식 M 접합체의 0.1 및 0.03 μmol/kg 투여량에 의한 처리 효과를 보여주는 그래프를 나타낸다. 연구는 제60일에 완료되었다.
도 21, 22 및 23은 각각 HepG2, 786-O 및 DMS79 세포에 대한 PTA021_A3 및 비푸코실화 PTA021_A3의 ADCC 활성을 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 24는 마우스 이종이식 모델에서 DMS79 종양 크기에 대한 PTA021_A3 항체 단독 또는 시스플라틴과의 조합 치료의 효과를 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 25a 및 25b는 시노몰구스 마카크에서 PTA021_A3 및 PTA021_A3의 비푸코실화 버전 (NF)에 대한 탐색적 독성학 연구에 있어서의 수컷 원숭이 및 암컷 원숭이 각각에 대한 체중 데이터를 나타낸다.
도 26a 및 26b는 시노몰구스 마카크에서 PTA021_A3 및 PTA021_A3의 비푸코실화 버전 (NF)에 대한 탐색적 독성학 연구에 있어서의 수컷 원숭이 및 암컷 원숭이 각각에 대한 글루코스 데이터를 나타낸다.
도 27a 및 27b는 시노몰구스 마카크에서 PTA021_A3 및 PTA021_A3의 비푸코실화 버전 (NF)에 대한 탐색적 독성학 연구에 있어서의 수컷 원숭이 및 암컷 원숭이 각각에 대한 알라닌 트랜스아미나제 데이터를 나타낸다.
도 28a 및 28b는 시노몰구스 마카크에서 PTA021_A3 및 PTA021_A3의 비푸코실화 버전 (NF)에 대한 탐색적 독성학 연구에 있어서의 수컷 원숭이 및 암컷 원숭이 각각에 대한 아스파르테이트 트랜스아미나제 데이터를 나타낸다.
도 29a 및 29b는 시노몰구스 마카크에서 PTA021_A3 및 PTA021_A3의 비푸코실화 버전 (NF)에 대한 탐색적 독성학 연구에 있어서의 수컷 원숭이 및 암컷 원숭이 각각에 대한 알칼리성 포스파타제 데이터를 나타낸다.
도 30a 및 30b는 시노몰구스 마카크에서 PTA021_A3 및 PTA021_A3의 비푸코실화 버전 (NF)에 대한 탐색적 독성학 연구에 있어서의 수컷 원숭이 및 암컷 원숭이 각각에 대한 락테이트 데히드로게나제 데이터를 나타낸다.
도 31a 및 31b는 시노몰구스 마카크에서 PTA021_A3 및 PTA021_A3의 비푸코실화 버전 (NF)에 대한 탐색적 독성학 연구에 있어서의 수컷 원숭이 및 암컷 원숭이 각각에 대한 RBC 데이터를 나타낸다.
도 32a 및 32b는 시노몰구스 마카크에서 PTA021_A3 및 PTA021_A3의 비푸코실화 버전 (NF)에 대한 탐색적 독성학 연구에 있어서의 수컷 원숭이 및 암컷 원숭이 각각에 대한 WBC 데이터를 나타낸다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 CADM1에 고친화도로 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체, 특히 인간 모노클로날 항체, 보다 특히 면역접합체 및 Fc 수용체에 대한 결합이 증가되고/거나 ADCC에 대한 효능이 증가된 조작된 항체에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 특정 중쇄 및 경쇄 배선 서열로부터 유래되고/거나 특정 아미노산 서열을 포함하는 CDR 영역과 같은 특정 구조적 특성을 포함한다. 본 발명은 단리된 항체, Fc 수용체에 대한 결합이 증가되고/거나 ADCC에 대한 효능이 증가된 조작된 항체, 면역접합체, 이중특이적 분자, 아피바디, 도메인 항체, 나노바디, 및 유니바디, 상기 분자의 제조 방법, 및 상기 분자 및 제약 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 분자의 이용 방법, 예컨대 CADM1의 검출 방법, 뿐만 아니라 CADM1의 발현과 관련된 질환 (예컨대 CADM1은 소세포 폐암의 종양을 비롯한 종양 및 신경내분비 췌장암, 폐 카르시노이드 및 위장 카르시노이드에서 발현됨)의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해서, 우선 특정 용어를 정의한다. 추가의 정의는 발명의 상세한 설명 전체에 기재되어 있다.
용어 "CADM1", "IGSF4", "이뮤노글로불린 슈퍼패밀리, 구성원 4D", "세포 부착 분자 1", "폐암에서의 종양 억제자 1", "TSLC1", "BL2", "ST17", "시냅스 세포 부착 분자", "신캠(syncam) 1", "넥틴-유사 단백질 2" 및 "NECL2"은 교환 가능하게 이용되고, 이에는 CADM1 이소형 1 (진뱅크 등록 번호 NM_014333), 및 2 (진뱅크 등록 번호 NM_001098517)를 비롯한 인간 CADM1의 변이체, 이소형 및 종 상동체가 포함된다. 또한, 본원에 그 전문이 참고로 포함되는 PCT 출원서 (OBT Docket No.:OGL-P121PCT)에는 2 개의 이소형이 OGTA025a 및 OGTA025b로서 확인되어 있다. 본 개시물의 인간 항체는, 특정 경우에 인간 이외의 종으로부터의 CADM1과 교차반응할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 하나 이상의 인간 CADM1에 대해 완벽하게 특이적일 수 있으며, 종 또는 다른 유형의 비인간 교차반응성을 나타내지 않을 수 있다. 예시적인 인간 CADM1의 완전한 아미노산 서열은 진뱅크 등록 번호 NM_014333을 갖는다.
용어 "면역 반응"은 병원체가 침입한 인체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암성 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우 정상 인간 세포 또는 조직에 대한 선택적인 손상, 파괴 또는 감소를 초래하는, 예를 들어 림프구, 항원 제시 세포, 식세포, 과립구, 및 상기 세포 또는 간에 의해 생산되는 가용성 거대분자 (항체, 시토카인, 및 보체 포함)의 작용을 지칭한다.
"신호 전달 경로"는 신호를 세포의 한 부분에서 세포의 다른 부분으로 전달하는데 소정의 역할을 수행하는 다양한 신호 전달 분자 사이의 생화학적 관계를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 어구 "세포 표면 수용체"는 예를 들어 신호를 수용하고 이 신호를 세포의 원형질 막을 통과하여 전달할 수 있는 분자 및 이러한 분자의 복합체를 포함한다. 본 발명의 "세포 표면 수용체"의 예는 CADM1 수용체이다.
본원에 언급된 용어 "항체"는 전체 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원 결합 부분") 또는 단일 쇄를 포함한다. "항체"는 디술피드 결합에 의하여 상호 연결되어 있는 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질 또는 그의 항원 결합 부분을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (이하, VH라 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (이하, VL 또는 VK라 약칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL/VK 영역은 프레임워크 영역 (FR)이라 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)이라 불리는 초가변 영역으로 보다 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL/VK는 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 이들은 아미노-말단에서 카르복시-말단 방향으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호 작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 숙주 조직 또는 인자, 예를 들어 면역계의 각종 세포 (예를 들어 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 항체의 "항원 결합 부분" (또는 간단히 "항체 부분")은 항원 (예를 들어, CADM1)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 용어 항체의 "항원 결합 부분"에 포함되는 결합 단편의 예에는, (i) Fab 단편, VL/VK, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 디술피드 브릿지에 의해 연결된 2 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) 힌지 영역 부분을 갖는 본질적으로 Fab인 Fab' 단편 (문헌 [FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993)] 참조); (iv) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (v) VL 및 VH 도메인으로 이루어진 단일 아암의 항체인 Fv 단편, (vi) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (문헌 [Ward et al., (1989) Nature 341:544-546]); (vii) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR); 및 (viii) 단일 가변 도메인 및 2 개의 불변 도메인을 함유하는 중쇄 가변 영역인 나노바디가 포함된다. 추가로, Fv 단편, VL/VK 및 VH의 2 개의 도메인은 분리된 유전자에 의해 코딩되어 있지만, 이들은 재조합 방법에 의해 이들을 단일 단백질 쇄로 만드는 합성 링커에 의해 연결될 수 있고, 이때 VL/VK 및 VH 영역은 쌍을 형성하여 1가 분자를 형성한다 (단일 쇄 Fv (scFv)로 공지됨; 예를 들어, 문헌 [Bird et al., (1988) Science 242:423-426]; 및 [Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조). 이러한 단일 쇄 항체 역시 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 것으로 한다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상의 기술을 이용하여 수득되며, 이 단편들은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
본원에서 사용된 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 존재하지 않는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다 (예를 들어, CADM1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 CADM1 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 존재하지 않는다). 그러나, CADM1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예컨대 다른 종으로부터의 CADM1 분자에 대한 교차 반응성을 지닐 수 있다. 추가로, 단리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 존재하지 않을 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성물인 항체 분자의 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 모두가 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래하는 가변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 추가로, 항체가 불변 영역을 함유할 경우, 이러한 불변 영역도 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발, 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "인간 항체"가 다른 포유동물 종, 예를 들어 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그라프팅된 항체를 포함하는 의도는 아니다.
용어 "인간 모노클로날 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 모두가 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래하는 가변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 보이는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스진(transgene) 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 제작 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 (a) 인간 이뮤노글로불린 유전자 또는 그로부터 제조된 하이브리도마에 대한 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조말인 동물 (예를 들어 마우스)로부터 단리된 항체 (이하에서 추가로 기재함), (b) 항체를 발현하도록 형질전환시킨 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 제작 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 실시양태에서, 이러한 재조합 인간 항체를 대상으로 하여 시험관내 돌연변이유발 (또는 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물을 사용하는 경우에는 생체내 체세포 돌연변이유발)을 행할 수 있기 때문에, 재조합 항체의 VH 및 VL/VK 영역의 아미노산 서열은 인간 배선 VH 및 VL/VK 서열로부터 유래되고 이와 관련이 있지만 생체내에서 인간 항체 배선 레퍼토리 내에 천연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
본원에서 사용되는 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스 (예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다.
어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 교환 가능하게 사용된다.
용어 "인간 항체 유도체"는 인간 항체의 임의의 변형된 형태, 예를 들어, 항체와 또 다른 작용제 또는 항체의 접합체를 지칭한다.
용어 "인간화 항체"는 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 그라프팅된 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 추가적인 프레임워크 영역 변형이 인간 프레임워크 서열 내에서 만들어질 수 있다.
용어 "키메라 항체"는 가변 영역 서열이 하나의 종에서 유래되고 불변 영역 서열은 다른 종으로부터 유래된 항체, 예컨대 가변 영역 서열은 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열은 인간 항체로부터 유래된 항체를 지칭하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이, "인간 CADM1에 특이적으로 결합하는" 항체는 인간 CADM1에 50 Nm 이하, 10 Nm 이하, 또는 보다 바람직하게는 1 Nm 이하의 EC50으로 결합하는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 단백질 또는 세포에 "실질적으로 결합하지 않는"은 단백질 또는 세포에 결합하지 않거나, 고친화도로 결합하는 것이 아닌 것, 즉 단백질 또는 세포에 1 x 10-6 M 이상, 보다 바람직하게는 1 x 10-5 M 이상, 보다 바람직하게는 1 x 10-4 M 이상, 보다 바람직하게는 1 x 10-3 M 이상, 훨씬 더 바람직하게는 1 x 10-2 M 이상의 KD로 결합하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "EC50"은 50％ 최대 반응/효과를 야기하는 농도를 정량함으로써, 화합물의 효능을 지칭하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "Kassoc" 또는 "Ka"는 특정 항체-항원 상호작용의 회합 속도를 지칭하는 것인 반면, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "Kdis" 또는 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭하는 것으로 의도된다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "KD"는 Kd 대 Ka의 비 (즉, Kd/Ka)로부터 수득하고 몰 농도 (M)로서 표현되는 해리 상수를 지칭한다. 항체에 대한 KD 값은 당업계에 널리 확립된 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 항체의 KD를 결정하기 위한 바람직한 방법은 표면 플라즈몬 공명, 바람직하게는 바이오센서 시스템, 예컨대 비아코어(Biacore)® 시스템을 사용하는 방법에 의하는 것이다.
본원에서 사용된 바와 같은 IgG 항체에 대한 용어 "고친화도"는 표적 항원에 대하여 1 x 10-7 M 이하, 보다 바람직하게는 5 x 10-8 M 이하, 보다 더 바람직하게는 1 x 10-8 M 이하, 보다 더 바람직하게는 5 x 10-9 M 이하, 및 보다 더 바람직하게는 1 x 10-9 M 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다. 그러나, "고친화도" 결합은 기타 항체 이소형에 대해 달라질 수 있다. 예를 들어, IgM 이소형에 대한 "고친화도" 결합은 KD가 10-6 M 이하, 보다 바람직하게는 10-7 M 이하, 보다 더 바람직하게는 10-8 M 이하인 항체를 지칭한다.
용어 "에피토프" 또는 "항원 결정기"는 이뮤노글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위를 지칭한다. 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병렬된 연속되지 않은 아미노산 또는 연속되는 아미노산 둘 다로부터 형성될 수 있다. 연속되는 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로, 변성 용매에 대한 노출시 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로, 변성 용매로의 처리시 상실된다. 에피토프에는 전형적으로, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산이 고유한 공간 입체 형태로 포함된다. 에피토프의 공간 입체 형태를 결정하는 방법에는 당업계에 공지되고 본원에 기재된 기술, 예를 들어 X 선 결정학 및 2차원적 핵 자기 공명이 포함된다 (예를 들어, 문헌 [Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)] 참조).
따라서, 또한 본 발명에는 본원에서 기재한 바와 같은 항체와 같은 에피토프에 결합하는 (즉, 인식하는) 항체가 포함된다 (즉, PTA021_A1, PTA021_A2 및 PTA021_A3). 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 표적 항원에 대한 참조 항체와 통계상 유의한 방식으로 교차-경쟁 (즉, 결합을 경쟁적으로 억제)할 수 있는 능력으로 확인할 수 있다. 경쟁적 억제는, 예를 들어 항체가 동일하거나 구조적으로 유사한 에피토프에 결합하는 경우 (예를 들어, 에피토프 중복), 또는 결합되었을 때 항체 간에 입체 장애를 야기하는 공간적으로 가까운 에피토프에 결합하는 경우에 일어날 수 있다.
경쟁적 억제는 일상적인 검정을 이용하여 결정할 수 있으며, 이때 시험 하의 이뮤노글로불린은 공통 항원에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 억제한다. 수많은 유형의 경쟁적 결합 검정이 공지되어 있고, 예를 들어 고체상 직접 또는 간접 방사성면역검정 (RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역검정 (EIA), 샌드위치 경쟁 검정 (문헌 [Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)] 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA (문헌 [Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)] 참조); 고체상 직접 표지된 검정, 고체상 직접 표지된 샌드위치 검정 (문헌 [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)] 참조); I-125 표지를 이용한 고체상 직접 표지 RIA (문헌 [Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)] 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA (문헌 [Cheung et al., Virology 176:546 (1990)]); 및 직접 표지된 RIA가 있다. (문헌 [Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)]). 전형적으로, 이러한 검정은 표지되지 않은 시험 이뮤노글로불린 및 표지된 참조 이뮤노글로불린 중 어느 하나를 보유하는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원의 사용을 포함한다. 경쟁적 억제는 시험 이뮤노글로불린의 존재하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정하여 측정한다. 통상적으로, 시험 이뮤노글로불린은 과량으로 존재한다. 통상적으로, 경쟁하는 항체가 과량으로 존재하는 경우, 이는 공통의 항원에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 적어도 50-55％, 55-60％, 60-65％, 65-70％, 70-75％ 만큼 또는 이를 초과하여 억제할 것이다.
그 밖의 기술로는, 예를 들어 에피토프 맵핑 방법, 예컨대 항원:항체 복합체 결정의 X 선 분석이 있으며, 이는 에피토프의 원자 해상도를 제공한다. 그 밖의 방법은 항원 단편 또는 항원의 돌연변이된 변이체에 대한 항체의 결합을 모니터링하는 것으로, 항원 서열 내의 아미노산 잔기의 변형으로 인한 결합의 상실은 종종 에피토프 요소를 나타내는 것으로 간주된다. 또한, 에피토프 맵핑에 대한 연산처리 조합 방법을 사용할 수도 있다. 이러한 방법은 조합 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리로부터 특이적인 짧은 펩티드를 친화 단리하는 관심 항체의 능력에 의존한다. 이어서, 펩티드는 펩티드 라이브러리를 스크리닝하는데 사용된 항체에 상응하는 에피토프를 정의하기 위한 본보기로서 간주된다. 에피토프 맵핑을 위해 연산처리 알고리즘이 또한 개발되어 있고, 이는 형태적으로 불연속적인 에피토프를 맵핑하는 것으로 밝혀졌다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
본 발명의 다양한 측면은 하기 서브섹션에서 추가로 상세하게 기재한다.
항-CADM1 항체
본 발명의 항체는 항체의 특정 기능적 특징 또는 특성에 의해 특징지을 수 있다. 예를 들어, 항체는 인간 CADM1에 특이적으로 결합한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 CADM1과 고친화도, 예를 들어 8 x 10-7 M 이하, 보다 더 전형적으로는 1 x 10-8 M 이하의 KD로 결합한다. 본 발명의 항-CADM1 항체는 바람직하게는 하기 특징 중 하나 이상을 나타낸다:
인간 CADM1에 50 Nm 이하, 10 Nm 이하, 또는 보다 바람직하게는 1 Nm 이하의 EC50으로 결합함;
CADM1을 발현하는 인간 세포에 결합함.
한 실시양태에서, 항체는 바람직하게는 CADM1 내에 존재하는 항원성 에피토프에 결합하며, 이 에피토프는 다른 단백질에는 존재하지 않는다. 항체는 전형적으로 CADM1에 결합하지만, 다른 단백질에는 결합하지 않거나 또는 단백질에 저친화도, 예컨대 1 x 10-6 M 이상, 보다 바람직하게는 1 x 10-5 M 이상, 보다 바람직하게는 1 x 10-4 M 이상, 보다 바람직하게는 1 x 10-3 M 이상, 보다 더 바람직하게는 1 x 10-2 M 이상의 KD로 결합한다. 바람직하게는, 항체는 관련 단백질에 결합하지 않고, 예를 들어 항체는 ICAM, VCAM, 또는 다른 세포 부착 분자에 실질적으로 결합하지 않는다. 한 실시양태에서, 항체는 CADM1을 발현하는 세포에 내재화될 수 있다. 항체 내재화를 평가하기 위한 표준 검정법이 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 HumZap 내재화 검정이 포함된다.
CADM1에 대한 항체의 결합능을 평가하기 위한 표준 검정법이 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯, RIA, 및 유동 세포측정 분석이 포함된다. 적합한 검정을 실시예에서 상세하게 기재한다. 또한, 항체의 결합 역학 (예를 들어, 결합 친화도)을 당업계에 공지되어 있는 표준 검정, 예컨대 비아코어® 시스템 분석으로 평가할 수 있다. 라지(Raji) 또는 다우디(Daudi) B 세포 종양 세포에 대한 결합을 평가하기 위해, 라지 (ATCC 기탁 번호 CCL-86) 또는 다우디 (ATCC 기탁 번호 CCL-213) 세포를 공중이 이용가능한 공급원, 예컨대 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에서 입수할 수 있고, 표준 검정, 예컨대 유동 세포측정 분석에 사용할 수 있다.
모노클로날 항체 PTA021_A1, PTA021_A2, PTA021_A3
본 발명의 바람직한 항체는 실시예 1, 2, 및 3에서 기재한 바와 같은 단리되고 구조적으로 특성화된 인간 모노클로날 항체 PTA021_A1, PTA021_A2, 및 PTA021_A3이다. PTA021_A1, PTA021_A2, 및 PTA021_A3의 VH 아미노산 서열을 각각 서열 19, 20, 및 21에 나타낸다. PTA021_A1, PTA021_A2, 및 PTA021_A3의 VK 아미노산 서열은 각각 서열 22, 23, 및 24에 나타낸다.
이들 각각의 항체가 CADM1에 결합할 수 있음을 고려할 때, VH 및 VK 서열을 "혼합 및 매칭"시켜 본 발명의 다른 항-CADM1 결합 분자를 제작할 수 있다. 이같은 "혼합 및 매칭"된 항체의 CADM1 결합은 상기 및 실시예에서 기재하는 결합 검정 (예를 들어, ELISA)을 이용하여 시험할 수 있다. 바람직하게는, VH 및 VK 쇄를 혼합 및 매칭시킬 경우, 특정 VH/VK 쌍으로부터의 VH 서열을 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체한다. 유사하게, 바람직하게는 특정 VH/VK 쌍으로부터의 VL 서열을 구조적으로 유사한 VK 서열로 대체한다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은
서열 19, 20, 및 21로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
서열 22, 23 및 24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 단리된 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 부분을 제공하며, 상기 항체는 CADM1, 바람직하게는 인간 CADM1에 특이적으로 결합한다.
바람직한 중쇄 및 경쇄 조합은
서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 PTA021_A1, PTA021_A2, 및 PTA021_A3의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 조합을 포함하는 항체를 제공한다. PTA021_A1, PTA021_A2, 및 PTA021_A3의 VH CDR1의 아미노산 서열은 서열 1, 2, 및 3에 나타낸다. PTA021_A1, PTA021_A2, 및 PTA021_A3의 VH CDR2의 아미노산 서열은 서열 4, 5, 및 6에 나타낸다. PTA021_A1, PTA021_A2, 및 PTA021_A3의 VH CDR3의 아미노산 서열은 서열 7, 8, 및 9에 나타낸다. PTA021_A1, PTA021_A2, 및 PTA021_A3의 VK CDR1의 아미노산 서열은 서열 10, 11, 및 12에 나타낸다. PTA021_A1, PTA021_A2, 및 PTA021_A3의 VK CDR2의 아미노산 서열은 서열 13, 14, 및 15에 나타낸다. PTA021_A1, PTA021_A2, 및 PTA021_A3의 VK CDR3의 아미노산 서열은 서열 16, 17, 및 18에 나타낸다. CDR 영역은 카바트 시스템 (문헌 [Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication number 91-3242])을 이용하여 도시한다.
이들 각 항체가 CADM1에 결합할 수 있고, 항원 결합 특이성이 일차적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역에 의해 제공된다는 점을 고려할 때, VH CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 및 VK CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 본 발명의 다른 항-CADM1 결합 분자를 제작하기 위해 "혼합 및 매칭"될 수 있다 (즉, 각 항체가 VH CDR1, CDR2 및 CDR3 및 VK CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함해야 하지만, 상이한 항체로부터의 CDR이 혼합 및 매칭될 수 있다). 이러한 "혼합 및 매칭된" 항체의 CADM1 결합은 상기 및 실시예에서 기재한 결합 검정 (예를 들어, ELISA, 비아코어® 분석)을 이용하여 시험할 수 있다. 바람직하게는, VH CDR 서열이 혼합 및 매칭될 때, 특정 VH 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체된다. 유사하게, VK CDR 서열이 혼합 및 매칭될 때, 특정 VK 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체된다. 신규한 VH 및 VK 서열은 하나 이상의 VH 및/또는 VL/VK CDR 영역 서열을 본 발명에서 개시하는 모노클로날 항체 PTA021_A1, PTA021_A2 및 PTA021_A3에 대한 CDR 서열로부터의 구조적으로 유사한 서열로 치환시켜 제작할 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은
서열 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
서열 4, 5 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
서열 7, 8 및 9로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
서열 10, 11 및 12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
서열 13, 14 및 15로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2;
서열 16, 17 및 18로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;
을 포함하는 단리된 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 부분을 제공하며, 상기 항체는 CADM1, 바람직하게는 인간 CADM1에 특이적으로 결합한다.
바람직한 실시양태에서, 항체는
서열 1을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
서열 4를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
서열 7을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
서열 10을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
서열 13을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
서열 16을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3
을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 항체는
서열 2를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
서열 5를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
서열 8을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
서열 11을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
서열 14를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
서열 17을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3
을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 항체는
서열 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
서열 6을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
서열 9를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
서열 12를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
서열 15를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
서열 18을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3
을 포함한다.
CDR1 및/또는 CDR2 도메인(들)과는 독립적으로, CDR3 도메인은 단독으로 동족(cognate) 항원에 대한 항체의 결합 특이성을 결정할 수 있고, 공통 CDR3 서열에 기초하여 동일한 결합 특이성을 갖는 여러 항체들을 예측가능하게 생성할 수 있다는 것이 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Klimka et al., British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000)] (뮤린 항-CD30 항체 Ki-4의 중쇄 가변 도메인 CDR3 만을 이용한 인간화 항-CD30 항체의 생산을 기술함); [Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296:833-849 (2000)] (모 뮤린 MOC-31 항-EGP-2 항체의 중쇄 CDR3 서열만을 이용한 재조합 상피 당단백질-2(EGP-2) 항체를 기술함); [Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:8910-8915 (1998)] (뮤린 항-인테그린 αvβ3 항체 LM609의 중쇄와 경쇄 가변 CDR3 도메인을 이용한 인간화 항-인테그린 αvβ3 항체의 패널을 기술함, 여기서 각 구성원 항체는 CDR3 도메인 외부에 별개의 서열을 포함하고 모 뮤린 항체 만큼 높거나 더 높은 친화도로 모 뮤린 항체와 동일한 에피토프에 결합할 수 있음); [Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994)] (CDR3 도메인이 항원 결합에 가장 중요한 기여를 제공한다는 것을 개시함); [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:2529-2533 (1995)] (인간 태반 DNA에 대한 3 종의 Fab (SI-1, SI-40 및 SI-32)의 중쇄 CDR3 서열의 항-파상풍 톡소이드(tetanus toxoid) Fab의 중쇄로의 그라프팅과 이에 따른 기존 중쇄 CDR3의 대체를 기술하고, CDR3 도메인이 단독으로 결합 특이성을 부여한다는 것을 증명함); 및 [Ditzel et al., J. Immunol. 157:739-749 (1996)] (모 다중특이적 Fab LNA3의 중쇄 CDR3 단독의 단일특이적 IgG 파상풍 톡소이드-결합 Fab p313 항체의 중쇄로의 이전이 상기 모 Fab의 결합 특이성을 유지하는데 충분한다는 것을 증명하는 그라프팅 연구를 기술함)을 참조한다. 이들 참고문헌은 각각 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
따라서 본 발명에서는 인간 또는 비인간 동물로부터 유래된 항체로부터 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 모노클로날 항체를 제공하는데, 여기서 상기 모노클로날 항체는 CADM1에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 측면에서, 본 발명은 비인간 항체, 예컨대 마우스 또는 래트 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하고, CADM1에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 비인간 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 상기 본 발명의 항체는 상응하는 모 비인간 항체와 (a) 결합을 위해 경쟁할 수 있고/있거나; (b) 그의 기능적 특성을 보유하고/하거나; (c) 그와 동일한 에피토프에 결합하고/하거나; (d) 그와 유사한 결합 친화도를 갖는다.
다른 측면에서, 본 발명은 CADM1에 특이적으로 결합할 수 있는 인간 항체, 예컨대 비인간 동물로부터 수득한 인간 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 모노클로날 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명에서는 제 1 인간 항체, 예컨대 비인간 동물로부터 수득된 인간 항체로부터 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 모노클로날 항체를 제공하는데, 여기서 상기 제 1 인간 항체는 CADM1에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 제 1 인간 항체로부터 CDR3 도메인은 CADM1에 대한 결합 특이성이 부재하는 인간 항체에서 CDR3 도메인을 대체하여 CADM1에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 인간 항체를 생성한다. 일부 실시양태에서, 제 1 인간 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 상기 본 발명의 항체는 상응하는 모 제 1 인간 항체와 (a) 결합을 위해 경쟁할 수 있고/있거나; (b) 그의 기능적 특성을 보유하고/하거나; (c) 그와 동일한 에피토프에 결합하고/하거나; (d) 그와 유사한 결합 친화도를 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 제 1 인간 항체는 PTA021_A1, PTA021_A2 또는 PTA021_A3이다.
특정한 배선 서열을 갖는 항체
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 특정한 배선 중쇄 이뮤노글로불린 유전자로부터의 중쇄 가변 영역 및/또는 특정한 배선 경쇄 이뮤노글로불린 유전자로부터의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
예를 들어, 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 인간 VH 2-05 유전자의 산물 또는 이로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 제공하며, 여기서 상기 항체는 CADM1에 특이적으로 결합한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 인간 VK L15 유전자의 산물 또는 이로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 제공하며, 여기서 상기 항체는 CADM1에 특이적으로 결합한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 제공하며, 상기 항체는:
인간 VH 2-05 유전자의 산물 또는 이로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하고 (상기 유전자는 각각 서열 31, 32, 또는 33에 기재된 아미노산 서열을 코딩함);
인간 VK L15 유전자의 산물 또는 이로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하며 (상기 유전자는 각각 서열 34, 35, 또는 36에 기재된 아미노산 서열을 코딩함);
CADM1, 바람직하게는 인간 CADM1에 특이적으로 결합한다. VH 2-05 및 VK L15 각각의 VH 및 VK를 갖는 항체의 예는 PTA021_A1, PTA021_A2, 및 PTA021_A3이다.
본원에서 사용된 바와 같은 인간 항체는 이러한 항체의 가변 영역이 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자를 이용하는 시스템으로부터 수득되는 경우에, 특정한 배선 서열의 "산물이거나" 또는 "이로부터 유래된" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이러한 시스템은 인간 이뮤노글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스를 관심 항원으로 면역화시키거나, 또는 파지에 디스플레이된 인간 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리를 관심 항원을 사용하여 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 배선 이뮤노글로불린 서열의 "산물"이거나 또는 "그로부터 유래된" 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 배선 이뮤노글로불린의 아미노산 서열과 비교한 후, 인간 항체의 서열과 가장 가까운 서열을 갖는 (즉, 최대 동일성 ％) 인간 배선 이뮤노글로불린 서열을 선택함으로써 확인될 수 있다. 특별한 인간 배선 이뮤노글로불린 서열의 "산물이거나" 또는 "이로부터 유래된" 인간 항체는, 예를 들어 자연 발생 체세포 돌연변이, 또는 부위 지정 돌연변이의 의도적 도입로 인해, 배선 서열과 비교해서 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 그러나, 선택된 인간 항체는 전형적으로, 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열 동일성이 적어도 90％이고, 기타 종의 배선 이뮤노글로불린 아미노산 서열 (예컨대, 뮤린 배선 서열)과 비교시 인간 항체를 확인시켜 주는 아미노산 잔기를 함유하고 있다. 특정한 경우, 인간 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성이 적어도 95％, 또는 심지어 적어도 96％, 97％, 98％, 또는 99％일 수 있다. 전형적으로, 특정 인간 배선 서열로부터 유래된 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과는 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 특정한 경우, 인간 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 5개 이하, 또는 심지어는 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다.
상동 항체
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 본원에서 설명되는 바람직한 항체의 아미노산 서열과 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 항체는 본 발명의 항-CADM1 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다.
예를 들어, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 제공하고, 여기서
중쇄 가변 영역은 서열 19, 20 및 21로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 80％ 상동성인 아미노산 서열을 포함하며;
경쇄 가변 영역은 서열 22, 23 및 24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 80％ 상동성인 아미노산 서열을 포함하고;
상기 항체는 10 Nm 이하의 EC50으로 인간 CADM1에 결합한다.
상기 항체는 또한 인간 CADM1으로 형질감염된 CHO 세포에도 결합할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 항체는 예를 들어 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.
다른 실시양태에서, VH 및/또는 VK 아미노산 서열은 상기 언급한 서열과의 상동성이 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％일 수 있다. 상기 언급한 서열의 VH 및 VK 영역에 대해 높은 (즉, 80％ 이상의) 상동성을 갖는 VH 및 VK 영역을 갖는 항체는 서열 25, 26, 27, 28, 29, 및 30을 코딩하는 핵산 분자를 돌연변이유발 (예를 들어, 부위 지정 또는 PCR 매개 돌연변이유발)시킨 후, 본 명세서에 기술된 기능적 검정을 이용하여 코딩된 변경된 항체에 대해 보유하는 기능을 시험하여 수득할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 2개의 아미노산 서열 사이의 상동성 백분율은 2개의 서열 사이의 동일성 백분율에 해당된다. 2개의 서열 사이의 동일성 백분율은 서열이 공유하는 동일한 위치의 수에 관한 함수 (즉, ％ 상동성 = 동일한 위치의 #/위치의 총 # x 100)로서, 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려한다. 2개 서열 사이의 서열 비교 및 동일성 백분율의 결정은 하기하는 비-제한적인 예에 기재된 바와 같이 수학적 알고리즘을 이용하여 이루어질 수 있다.
2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은 PAM120 가중 잔기 표, 갭 길이 패널티 12 및 갭 패널티 4를 이용하는 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 포함되어 있는 이. 메이어스(E. Meyers) 및 더블유. 밀러(W. Miller)의 알고리즘 (문헌 [Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)])을 이용하여 결정할 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은 블로섬(Blossum) 62 행렬 또는 PAM250 행렬, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4, 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 이용하는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com에서 이용가능)에 포함되어 있는 니들만(Needleman) 및 분쉬(Wunsch) (문헌 [J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)]) 알고리즘을 이용하여 결정할 수 있다.
추가로 또는 별법적으로, 본 발명의 단백질 서열은 예를 들어 관련 서열들을 확인하기 위해 공공 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질의 서열"로서 추가로 사용될 수도 있다. 이러한 검색은 문헌 [Altschul, et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 이용하여 수행할 수 있다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램 (스코어 = 50, 단어 길이 = 3)을 통하여 수행되고, 이에 의해 본 발명의 항체 분자에 상동성인 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교를 위한 갭 형성 정렬을 얻기 위해서는, 문헌 [Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402]에 기재되어 있는 바와 같이, Gapped BLAST를 사용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조한다.
보존적 변형을 갖는 항체
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 이러한 CDR 서열 중 하나 이상은 본원에서 기재한 바람직한 항체 (예를 들어, PTA021_A1, PTA021_A2 또는 PTA021_A3)에 기초한 명시된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 포함하고, 상기 항체는 본 발명의 항-CADM1의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 제공하고, 여기서,
중쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열 7, 8 및 9의 아미노산 서열 및 이들의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며;
경쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열 16, 17 및 18의 아미노산 서열 및 이들의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
상기 항체는 1 nM 이하의 EC50으로 인간 CADM1에 결합한다.
상기 항체는 또한 인간 CADM1으로 형질감염된 CHO 세포에 결합할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열 4, 5 및 6의 아미노산 서열, 및 이들의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열 13, 14 및 15의 아미노산 서열, 및 이들의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열 1, 2 및 3의 아미노산 서열, 및 이들의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열 10, 11 및 12의 아미노산 서열, 및 이들의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 실시양태에서, 항체는 예를 들어 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의한 영향을 미치지 않거나, 유의하게 이를 변형시키지 않는 아미노산의 변형을 지칭하는 것으로 의도된다. 그러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 당업계에 공지된 표준 기술, 예를 들어 부위 지정 돌연변이유발 및 PCR 매개 돌연변이유발에 의하여 본 발명의 항체에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체시키는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리는 당업계에 규정되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서 본 발명의 항체의 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변경된 항체는 본원에 기재된 기능적 검정을 이용하여 보유 기능에 대해 시험될 수 있다.
서열 1, 2, 또는 3의 중쇄 CDR1 서열은 하나 이상의 보존적 서열 변형, 예컨대 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있고/거나; 서열 10, 11, 또는 12의 경쇄 CDR1 서열은 하나 이상의 보존적 서열 변형, 예컨대 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있고/거나; 서열 4, 5, 또는 6에 도시된 중쇄 CDR2 서열은 하나 이상의 보존적 서열 변형, 예컨대 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있고/거나; 서열 13, 14, 또는 15에 도시된 경쇄 CDR2 서열은 하나 이상의 보존적 서열 변형, 예컨대 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있고/거나; 서열 7, 8, 또는 9에 도시된 중쇄 CDR3 서열은 하나 이상의 보존적 서열 변형, 예컨대 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있고/거나; 서열 16, 17, 또는 18에 도시된 경쇄 CDR3 서열은 하나 이상의 보존적 서열 변형, 예컨대 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있다.
본 발명의 항-CADM1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 CADM1 모노클로날 항체와 인간 CADM1 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다 (즉, 본 발명의 임의의 모노클로날 항체와 CADM1에의 결합에 대해 교차 경쟁하는 능력을 가진 항체). 바람직한 실시양태에서, 결합에 대한 교차 경쟁 연구를 위한 참조 항체는 모노클로날 항체 PTA021_A1 (각각 서열 19 및 22에 나타낸 바와 같은 VH 및 VK 서열을 가짐), 모노클로날 항체 PTA021_A2 (각각 서열 20 및 23에 나타낸 바와 같은 VH 및 VK 서열을 가짐), 또는 모노클로날 항체 PTA021_A3 (각각 서열 21 및 24에 나타낸 바와 같은 VH 및 VK 서열을 가짐)일 수 있다. 그러한 교차 경쟁 항체는 표준 CADM1 결합 검정에서 PTA021_A1, PTA021_A2 또는 PTA021_A3과의 교차 경쟁 능력에 기초하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 비아코아 분석, ELISA 검정 또는 유동 세포측정법을 이용하여 결합에 대한 본 발명의 항체와의 교차 경쟁을 확인할 수 있다. 예를 들어, PTA021_A1, PTA021_A2 또는 PTA021_A3의 인간 CADM1에 대한 결합을 억제하는 시험 항체의 능력은, 그러한 시험 항체가 인간 CADM1에의 결합에 대해 PTA021_A1, PTA021_A2 또는 PTA021_A3과 경쟁하므로 이것이 PTA021_A1, PTA021_A2 또는 PTA021_A3과 인간 CADM1 상의 동일한 에피토프에 결합할 수 있음을 확인시켜준다. 바람직한 실시양태에서, PTA021_A1, PTA021_A2 또는 PTA021_A3과 인간 CADM1 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 인간 모노클로날 항체이다. 그러한 인간 모노클로날 항체는 실시예에 기재한 바와 같이 제조 및 단리할 수 있다.
조작 및 변형된 항체
본 발명의 항체는 본 발명에 개시된 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열을 포함하는 항체를 이용하여 제조되고, 변형된 항체를 가공하기 위한 출발 물질로서 이용될 수 있는데, 상기 변형된 항체는 출발 항체와 비교하여 변화된 특성을 갖는다. 항체는 한쪽 또는 양쪽 가변 영역 (즉, VH 및/또는 VL) 내에서, 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역 내에서 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내에서 하나 이상의 아미노산을 변형함으로써 조작될 수 있다. 추가로 또는 별법적으로, 항체는 불변 영역(들) 내의 잔기들을 변형시켜 조작되어, 예를 들어 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 항체의 가변 영역을 조작하기 위해 CDR 그라프팅이 사용될 수 있다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 내에 위치하는 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 밖의 서열보다 개개의 항체 사이에서 더 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 특성을 지닌 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열에 그라프팅된 특이적 자연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 특이적 자연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Riechmann, L. et al., (1998) Nature 332:323-327]; [Jones, P. et al., (1986) Nature 321:522-525]; [Queen, C. et al., (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033]; 윈터(Winter)의 미국 특허 제5,225,539호, 및 퀸(Queen) 등의 미국 특허 제5,530,101호; 동 제5,585,089호; 동 제5,693,762호 및 동 제6,180,370호 참조).
따라서 본 발명의 또 다른 실시양태는 각각 서열 1, 2 및 3, 서열 4, 5 및 6, 및 서열 7, 8 및 9로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열 10, 11 및 12, 서열 13, 14 및 15, 및 서열 16, 17 및 18로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분에 관한 것이다. 따라서, 이러한 항체는 모노클로날 항체 PTA021_A1, PTA021_A2 또는 PTA021_A3의 VH 및 VK CDR 서열을 함유하지만, 이들 항체로부터의 상이한 프레임워크 서열을 함유할 수 있다.
이러한 프레임워크 서열은 배선 항체 유전자 서열을 포함하는 공공 DNA 데이터베이스 또는 간행된 문헌으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 "VBase" 인간 배선 서열 데이터베이스 (인터넷 상에서 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 이용가능) 뿐만 아니라 문헌 [Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication number 91-3242]; [Tomlinson, I. M., et al., (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798]; 및 [Cox, J. P. L. et al., (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836] (이들 각각의 내용은 본원에서 명백하게 참고로 포함됨)에서 찾아볼 수 있다. 또 다른 예에서, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 진뱅크 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다. 예를 들어, HCo7 HuMAb 마우스에서 발견된 다음 중쇄 배선 서열은 병기한 진뱅크 등록 번호로 이용가능하다: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 및 BC070333), 3-33 (NG_0010109 및 NT_024637) 및 3-7 (NG_0010109 및 NT_024637). 또 다른 예로서, HCo12 HuMAb 마우스에서 발견된 다음 중쇄 배선 서열은 병기한 진뱅크 등록 번호로 이용가능하다: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 및 BC070333), 5-51 (NG_0010109 및 NT_024637), 4-34 (NG_0010109 및 NT_024637), 3-30.3 (CAJ556644) 및 3-23 (AJ406678).
항체 단백질 서열은 당업자에게 널리 공지되어 있는 Gapped BLAST (문헌 [Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402])라 불리는 서열 유사성 검색 방법 중의 하나를 사용하여 컴파일링된 단백질 서열 데이터베이스에 대해 비교한다. BLAST는 항체 서열과 데이터베이스 서열 간의 통계상 유의한 정렬이 정렬된 워드의 높은-스코어링 절편 쌍 (HSP)를 함유하는 것으로 예상된다는 점에서 발견적 (heuristic) 알고리즘이다. 스코어가 연장 또는 트리밍 (trimming)에 의해 개선될 수 없는 절편 쌍이 히트 (hit)로 지칭된다. 간략하게, VBASE 기원 의 뉴클레오티드 서열 (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php)을 번역하고, FR1 내지 FR3 프레임워크 영역을 포함한 이들 간의 영역을 유지시킨다. 데이터베이스 서열은 평균 길이가 98개 잔기이다. 단백질 전체 길이에 걸쳐 정확히 매칭되는 중복 서열을 제거하였다. BLAST는 디폴트, 작동 중지되는 저 복잡성 필터를 제외한 표준 파라미터, 및 BLOSUM62의 치환 매트릭스, 서열 매치를 산출시키는 상위 5개 히트에 대한 필터를 수반한 프로그램 blastp을 이용하여 단백질을 검색한다. 뉴클레오티드 서열을 6개 프레임 모두에서 번역하고, 데이터베이스 서열의 매칭 절편 내의 중지 코돈을 전혀 수반하지 않은 프레임을 잠재적 히트로 간주한다. 이는 결국 BLAST 프로그램 tblastx을 이용하여 확인하는데, 이 프로그램은 항체 서열을 6개 모든 프레임에서 번역하고, 이러한 번역물을, 6개 모든 프레임에서 극적으로 번역된 VBASE 뉴클레오티드 서열과 비교한다.
동일하다는 것은 서열 전체 길이에 걸쳐 항체 서열과 단백질 데이터베이스 간에 아미노산이 정확히 매칭된다는 것이다. 양성 (동일성 + 치환 매치)이 동일한 것은 아니지만 BLOSUM62 치환 매트릭스에 의해 유도된 아미노산 치환이다. 항체 서열이 동일한 동일성으로 데이터베이스 서열 중의 2개와 매칭되는 경우, 가장 양성인 히트가 매칭 서열 히트로 결정될 것이다.
본 발명의 항체에 이용하기 바람직한 프레임워크 서열은 본 발명의 선택된 항체에 의해 이용되는 프레임워크 서열과 구조적으로 유사한 서열, 예를 들어 본 발명의 바람직한 모노클로날 항체에 의해 이용되는 VH 2-05 프레임워크 서열 (서열 31) 및/또는 VK L15 프레임워크 서열 (서열 34)과 유사한 서열이다. VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 VK CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 그로부터 프레임워크 서열이 유도되는 배선 이뮤노글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역 상에 그라프팅될 수 있거나, CDR 서열은 배선 서열에 비하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 프레임워크 영역 상에 그라프팅될 수 있다. 예를 들어, 특정 경우에는 프레임워크 영역 내의 잔기를 돌연변이시켜 항체의 항원 결합 능력을 유지 또는 증진시키는 것이 유익한 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 퀸 등의 미국 특허 제5,530,101호; 동 제5,585,089호; 동 제5,693,762호 및 동 제6,180,370호 참조).
또 다른 유형의 가변 영역 변형은 VH 및/또는 VK CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 관심 항체의 하나 이상의 결합 특성 (예를 들어, 친화도)을 개선하기 위한 것이다. 부위 지정 돌연변이유발 또는 PCR 매개 돌연변이유발을 수행하여 돌연변이(들)을 도입할 수 있고, 항체 결합에 대한 효과 또는 관심의 대상이 되는 다른 기능적 특성을 본원에 기재된 바와 같고 실시예에서 제공되는 바와 같은 시험관내 또는 생체내 검정으로 평가할 수 있다. 바람직하게는, (상기 논의되어 있는 바와 같은) 보존적 변형이 도입된다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있지만, 바람직하게는 치환이다. 추가로, 전형적으로는 CDR 영역 내의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 잔기를 변경시킨다.
따라서 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) 서열 1, 2 및 3, 또는 서열 1, 2 및 3과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1 영역; (b) 서열 4, 5 및 6, 또는 서열 4, 5 및 6과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 영역; (c) 서열 7, 8 및 9, 또는 서열 7, 8 및 9와 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3 영역; (d) 서열 10, 11 및 12, 또는 서열 10, 11 및 12와 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VK CDR1 영역; (e) 서열 13, 14 및 15, 또는 서열 13, 14 및 15와 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VK CDR2 영역; 및 (f) 서열 16, 17 및 18, 또는 서열 16, 17 및 18과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VK CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-CADM1 모노클로날 항체, 또는 이들의 항원 결합 부분을 제공한다.
본 발명의 조작된 항체는 VH 및/또는 VK 내의 프레임워크 잔기를 변형시켜, 예를 들어 항체의 특성을 개선하는 것을 포함한다. 전형적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 한가지 접근법은 하나 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 배선 서열로 "역돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로는, 체세포 돌연변이가 일어난 항체는 이러한 항체가 유래된 배선 서열과는 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래된 배선 서열과 비교함으로써 확인할 수 있다. 예를 들어, PTA021_A1의 경우에, 카바트 넘버링 시스템을 이용하면, VH의 아미노산 잔기 #30 (FR3 내)은 아스파라긴 (서열 19)인 반면, 상응하는 VH 2-05 배선 서열에서 상기 잔기는 세린 (서열 31)이다. 프레임워크 영역 서열을 그의 배선 배열로 복귀시키기 위하여, 체세포 돌연변이는 예를 들어 부위 지정 돌연변이유발 또는 PCR 매개 돌연변이유발에 의해 배선 서열로 "역돌연변이"될 수 있다 (예를 들어, PTA021_A1의 VH의 잔기 #30은 아스파라긴에서 세린으로 "역돌연변이"될 수 있음).
또 다른 예로서, PTA021_A1의 경우 VH의 아미노산 잔기 #54는 아스파르트산 (서열 19)인 반면, 상응하는 VH 2-05 배선 서열에서 이 잔기는 아스파라긴 (서열 31)이다. 프레임워크 영역 서열을 그의 배선 배열로 복귀시키기 위하여, 예를 들어 PTA021_A1의 VH의 잔기 #54를 아스파르트산에서 아스파라긴으로 "역돌연변이"시킬 수 있다. 그러한 "역돌연변이된" 항체도 또한 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
또 다른 예로서, PTA021_A1의 경우 VK의 아미노산 잔기 #50은 글리신 (서열 22)인 반면, 상응하는 VK L15 배선 서열에서 이 잔기는 알라닌 (서열 34)이다. 프레임워크 영역 서열을 그의 배선 배열로 복귀시키기 위하여, 예를 들어 PTA021_A1의 VK의 잔기 #50을 글리신에서 알라닌으로 "역돌연변이"시킬 수 있다. 그러한 "역돌연변이된" 항체도 또한 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
또 다른 예로서, PTA021_A1의 경우 VK의 아미노산 잔기 #77은 아스파라긴 (서열 22)인 반면, 상응하는 VK L15 배선 서열에서 이 잔기는 세린 (서열 34)이다. 프레임워크 영역 서열을 그의 배선 배열로 복귀시키기 위하여, 예를 들어 PTA021_A1의 VK의 잔기 #77을 아스파라긴에서 세린으로 "역돌연변이"시킬 수 있다. 그러한 "역돌연변이된" 항체도 또한 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
또 다른 예로서, PTA021_A2의 경우 VH의 아미노산 잔기 #54는 아스파르트산 (서열 20)인 반면, 상응하는 VH 2-05 배선 서열에서 이 잔기는 아스파라긴 (서열 32)이다. 프레임워크 영역 서열을 그의 배선 배열로 복귀시키기 위하여, 예를 들어, PTA021_A2의 VH의 잔기 #54를 아스파르트산에서 아스파라긴으로 "역돌연변이"시킬 수 있다. 그러한 "역돌연변이된" 항체도 또한 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
또 다른 예로서, PTA021_A2의 경우 VH의 아미노산 잔기 #89는 이소류신 (서열 20)인 반면, 상응하는 VH 2-05 배선 서열에서 이 잔기는 트레오닌 (서열 32)이다. 프레임워크 영역 서열을 그의 배선 배열로 복귀시키기 위하여, 예를 들어 PTA021_A2의 VH의 FR1 내의 잔기 #89를 이소류신에서 트레오닌으로 "역돌연변이"시킬 수 있다. 그러한 "역돌연변이된" 항체도 또한 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
또 다른 예로서, PTA021_A3의 경우 VH의 아미노산 잔기 #54가 아스파르트산 (서열 21)인 반면, 상응하는 VH 2-05 배선 서열에서 이 잔기는 아스파라긴 (서열 33)이다. 프레임워크 영역 서열을 그의 배선 배열로 복귀시키기 위하여, 예를 들어 PTA021_A3의 VH의 잔기 #54를 아스파르트산에서 아스파라긴으로 "역돌연변이"시킬 수 있다. 그러한 "역돌연변이된" 항체도 또한 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
또 다른 예로서, PTA021_A3의 경우 VK의 아미노산 잔기 #77이 아스파라긴 (서열 24)인 반면, 상응하는 VK L15 배선 서열에서 이 잔기는 세린 (서열 36)이다. 프레임워크 영역 서열을 그의 배선 배열로 복귀시키기 위하여, 예를 들어 PTA021_A1의 VK의 잔기 #77을 아스파라긴에서 세린으로 "역돌연변이"시킬 수 있다. 그러한 "역돌연변이된" 항체도 또한 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
또 다른 유형의 프레임워크 변형은 프레임워크 영역 내의, 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역 내의 하나 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T 세포 에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적인 면역원성을 감소시키는 것을 수반하였다. 이러한 접근법은 "탈면역화(deimmunization)"로서 지칭되고, 미국 특허 공보 번호 20030153043 (카르(Carr) 등)에서 보다 상세하게 기술된다.
프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형에 추가하여 또는 이러한 변형과는 별법적으로, 본 발명의 항체는 전형적으로 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원 의존적 세포성 세포독성을 변경시키는 변형을 Fc 영역 내에 포함하도록 조작될 수 있다. 추가로, 본 발명의 항체를 화학적으로 변형시킬 수도 있고 (예를 들어, 하나 이상의 화학 모이어티를 항체에 부착시킬 수 있음), 그의 글리코실화를 변경시켜 항체의 하나 이상의 기능적 특성이 다시 변경되도록 변형시킬 수도 있다. 각각의 이러한 실시양태는 하기에서 추가로 상세하게 기재된다. Fc 영역 내 잔기의 넘버링은 카바트의 EU 지수의 넘버링이다.
한 실시양태에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역 내 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예를 들어 증가 또는 감소되도록 변형된다. 이러한 접근법은 미국 특허 제5,677,425호 (보드머(Bodmer) 등)에 추가로 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기 수는, 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 어셈블리를 용이하게 하거나 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키도록 변경된다.
또 다른 실시양태에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 감소시키도록 돌연변이될 수 있다. 보다 구체적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역 내로 도입하여 항체가 천연 Fc-힌지 도메인 스타필로코쿠스 단백질 A (SpA) 결합에 비해 손상된 SpA 결합을 갖도록 한다. 이러한 접근법은 미국 특허 제6,165,745호 (왈드(Ward) 등)에 보다 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 그의 생물학적 반감기가 증가되도록 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 미국 특허 제6,277,375호 (왈드)에 기재된 바와 같이, 하나 이상의 다음과 같은 돌연변이를 도입할 수 있다: T252L, T254S, T256F. 별법적으로, 미국 특허 제5,869,046호 및 동 제6,121,022호 (프레스타(Presta) 등)에 기재된 바와 같이, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해서 항체를 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경시켜서 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개 루프로부터의 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 WO/2007/059782에 기재된 바와 같은 유니바디로서 생산된다.
또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체하여 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시킴으로써 변경된다. 예를 들어, 항체가 이펙터 리간드에 대한 친화도는 변경되지만 모 항체의 항원 결합 능력은 보유하도록, 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322 중으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 제5,624,821호 및 동 제5,648,260호 (둘다 윈터 등)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 예에서, 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소되거나 제거된 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 갖도록 아미노산 잔기 329, 331 및 322로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체시킬 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 제6,194,551호 (이듀소기(Idusogie) 등)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 예에서, 아미노산 위치 231 및 239 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경시킴으로써 보체를 고정시키는 항체의 능력을 변경시킨다. 이러한 접근법은 PCT 공보 WO 94/29351 (보드머 등)에 추가로 기재되어 있다.
또 다른 예에서, 항체의 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하는 능력을 증가시키고/거나 항체의 Fcγ 수용체에 대한 친화도를 증가시키기 위해 다음과 같은 위치에서 하나 이상의 아미노산을 변형시켜 Fc 영역을 변형시킨다: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439. 이러한 접근법은 PCT 공보 WO 00/42072 (프레스타)에 추가로 기재되어 있다. 또한, FcγR1, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위가 맵핑되어 있으며, 결합이 개선된 변이체가 기재되어 있다 (문헌 [Shields, R.L. et al., (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604] 참조). 위치 256, 290, 298, 333, 334 및 339에서의 특이적 돌연변이가 FcγRIII에 대한 결합을 개선시키는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 다음과 같은 조합 돌연변이체는 FcγRIII 결합을 개선시키는 것으로 밝혀졌다: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 및 S298A/E333A/K334A.
또 다른 실시양태에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 비글리코실화 항체가 생성될 수 있다 (즉, 항체에 글리코실화가 결여됨). 글리코실화는 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화도가 증가하도록 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시켜 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위를 제거하여 이 부위에서 글리코실화가 일어나지 않도록 하는 하나 이상의 아미노산 치환을 만들 수 있다. 이러한 비글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 제5,714,350호 및 동 제6,350,861호 (코(Co) 등)에 보다 상세하게 기재되어 있다.
추가로 또는 별법적으로, 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 항체, 예컨대 푸코실 잔기 수가 감소된 저푸코실화 항체 또는 이분화 GlcNac 구조가 증가된 항체가 생성될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴이 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증된 바 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포 내에서 항체를 발현시켜서 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 당업계에 기재되어 있으며, 본 발명의 재조합 항체를 발현시켜 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생성하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포주 Ms704, Ms705 및 Ms709는 푸코실트랜스퍼라제 유전자인 FUT8 (알파 (1,6)푸코실트랜스퍼라제)이 결여되어 있어서, Ms704, Ms705 및 Ms709 세포주에서 발현된 항체의 탄수화물에 푸코스가 존재하지 않는다. Ms704, Ms705, 및 Ms709 FUT8-/- 세포주는 2 개의 대체 벡터를 사용하여 CHO/DG44 세포 내에서 FUT8 유전자를 표적화 파괴하여 제작하였다 (야만(Yamane) 등의 미국 특허 공보 번호 20040110704 및 문헌 [Yamane-Ohnuki et al., (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22] 참조). 또 다른 예로서, EP 1,176,195 (하나이(Hanai) 등)에는 푸코실 트랜스퍼라제를 코딩하는, 기능상 붕괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주가 기재되어 있는데, 이로써 상기 세포주에서 발현된 항체는 상기 알파 1,6 결합-관련 효소를 감소 또는 제거함으로써 저푸코실화를 나타낸다. 하나이 등은 또한, 항체의 Fc 영역과 결합하거나 또는 효소 활성을 지니지 않은 N-아세틸글루코사민에 푸코스를 부가하기 위한 낮은 효소 활성을 지닌 세포주, 예를 들어 래트 골수종 세포주 YB2/0 (ATCC CRL 1662)를 기술하였다. 프레스타의 PCT 공보 WO 03/035835에는 푸코스를 Asn(297)-연결된 탄수화물에 부착시키는 능력이 감소되고, 또한 숙주 세포에서 발현된 항체를 저푸코실화시키는 변이체 CHO 세포주, Lec13 세포가 기재되어 있다 (또한, 문헌 [Shields, R.L. et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). PCT 공보 WO 99/54342 (움마나(Umana) 등)에는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 (예를 들어, 베타(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 세포주를 조작하여, 조작된 세포주 내에서 발현된 항체의 이분화 GlcNAc 구조가 증가하도록 만들고, 이에 의해 항체의 ADCC 활성을 증가시키는 것이 기재되어 있다 (또한, 문헌 [Umana et al., (1999) Nat. Biotech. 17:176-180] 참조). 별법적으로, 항체의 푸코스 잔기는 푸코시다제 효소를 사용하여 절단 제거할 수 있다. 예를 들어, 푸코시다제 알파-L-푸코시다제는 항체로부터 푸코실 잔기를 제거한다 (문헌 [Tarentino, A.L. et al., (1975) Biochem. 14:5516-23]).
본 발명에 의해 고려되는 본원의 항체의 또 다른 변형으로서는 PEG화가 있다. 항체는 PEG화되어, 예를 들어 항체의 생물학적 (예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시킬 수 있다. 항체를 PEG화시키기 위해서는, 이러한 항체 또는 그의 단편을 전형적으로 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건하에 PEG, 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응시킨다. 바람직하게, PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통하여 수행한다. 본원에 사용된 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화하기 위해 사용되는 임의의 형태의 PEG, 예컨대 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포함하는 것으로 의도된다. 특정 실시양태에서, PEG화되는 항체는 글리코실화되지 않은 항체이다. 단백질을 PEG화하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 항체에 적용할 수 있다. 예를 들어, EP 0 154 316 (니시무라(Nishimura) 등) 및 EP 0 401 384 (이시까와(Ishikawa) 등)를 참조한다.
항체 물리적 특성
본 발명의 항체는 항-CADM1 항체의 다양한 물리적 특성에 의해 추가로 특성화될 수 있다. 다양한 검정을 이용하여 이들 물리적 특성에 기초한 항체의 상이한 부류의 항체를 검출 및/또는 구별할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 경쇄 또는 중쇄 가변 영역에서 하나 이상의 글리코실화 부위를 함유할 수 있다. 가변 영역 내에서 하나 이상의 글리코실화 부위의 존재는 변경된 항원 결합으로 인하여, 항체의 증가된 면역원성 또는 항체의 pK의 변경을 야기할 수 있다 (문헌 [Marshall et al., (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702]; [Gala FA and Morrison SL (2004) J Immunol 172:5489-94]; [Wallick et al., (1988) J Exp Med 168:1099-109]; [Spiro RG (2002) Glycobiology 12:43R-56R]; [Parekh et al., (1985) Nature 316:452-7]; [Mimura et al., (2000) Mol Immunol 37:697-706]). 글리코실화는 N-X-S/T 서열을 함유하는 모티프에서 발생하는 것으로 알려져 있다. 항체를 절단시켜 Fab를 생성시킨 다음, 이를 대상으로 하여 퍼요오데이트 산화와 시프 (Schiff) 염기 형성을 측정하는 검정을 이용하여 글리코실화에 관하여 시험하는 글리코블롯 (Glycoblot) 검정을 이용하여 가변 영역 글리코실화를 시험할 수 있다. 별법적으로, Fab로부터 사카라이드를 절단시켜 모노사카라이드를 수득하고, 개별적 사카라이드 함량을 분석하는 디오넥스(Dionex) 광 크로마토그래피 (Dionex-LC)를 이용하여 가변 영역 글리코실화를 시험할 수 있다. 일부 경우에, 가변 영역 글리코실화를 함유하지 않는 항-CADM1 항체를 갖는 것이 바람직하다. 이는 가변 영역 내에서 글리코실화 모티프를 내포하지 않는 항체를 선택함으로써, 또는 당업계에 널리 공지된 표준 기술을 이용하여 글리코실화 모티프 내에서 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다.
글리코실화의 예로서, PTA021_A1의 경우 카바트 넘버링 시스템을 이용한 VH의 아미노산 잔기 #30 (FR3 내)은 아스파라긴 (서열 19)이다. 이는 잠재적인 글리코실화 부위이고, 이 잔기는 글루타민으로 돌연변이될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 아스파라긴 이성질현상 부위를 함유하지 않는다. 탈아미드화 또는 이소아스파르트산 효과는 각각, N-G 또는 D-G 서열 상에서 나타날 수 있다. 탈아미드화 또는 이소아스파르트산 효과는 사슬 주쇄 보다는 측쇄 카르복시 말단 외부에 꼬임 구조(kinked structure)를 만듦으로써 항체의 안정성을 감소시키는 이소아스파르트산의 발생을 야기한다. 이소아스파르트산의 생성은 이소-정량 검정을 이용하여 측정될 수 있는데, 이는 역상 HPLC를 이용하여 이소아스파르트산을 시험한다.
각 항체는 고유의 등전점(pI)을 가지긴 하지만, 일반적으로 항체는 6 내지 9.5의 pH 범위에 들어간다. IgG1 항체에 대한 pI는 전형적으로 7-9.5의 pH 범위에 해당하고, IgG4 항체에 대한 pI는 전형적으로 6-8의 pH 범위에 해당한다. 항체는 이러한 범위를 벗어나는 pI를 가질 수도 있다. 이들 효과가 전반적으로 알려져 있진 않지만, 정상 범위를 벗어나는 pI를 갖는 항체는 생체내 조건 하에서 상당한 풀림(unfolding)과 불안정성을 가질 것으로 추측된다. 등전점은 pH 구배를 발생시키는 모세관 등전점 포커싱 검정을 이용하여 조사될 수 있으며, 증가된 정확도를 위하여 레이저 포커싱을 이용할 수도 있다 (문헌 [Janini et al., (2002) Electrophoresis 23:1605-11]; [Ma et al., (2001) Chromatographia 53:S75-89]; [Hunt et al., (1998) J Chromatogr A 800:355-67]). 일부 경우에, 정상 범위에 들어가는 pI 수치를 갖는 항-CADM1 항체를 수득하은 것이 바람직하다. 이는 정상 범위에서 pI를 갖는 항체를 선택함으로써, 또는 당업계에 널리 공지된 표준 기술을 이용하여 하전 표면 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다.
각 항체는 열 안정성을 나타내는 용융 온도를 가진다 (문헌 [Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71]). 보다 높은 열 안정성은 생체내에서 보다 큰 전체 항체 안정성을 나타낸다. 항체의 융점은 시차 주사 열량법과 같은 기술을 이용하여 측정할 수 있다 (문헌 [Chen et al., (2003) Pharm Res 20:1952-60]; [Ghirlando et al., (1999) Immunol Lett 68:47-52]). TM1은 항체의 초기 풀림 온도를 나타낸다. TM2는 항체의 완전한 풀림 온도를 나타낸다. 일반적으로, 본 발명의 항체의 TM1은 60℃ 초과, 바람직하게는 65℃ 초과, 보다 더 바람직하게는 70℃를 초과한다. 별법적으로, 항체의 열 안정성은 원편광 이색성을 이용하여 측정할 수도 있다 (문헌 [Murray et al., (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9]).
바람직한 실시양태에서, 신속하게 분해되지 않는 항체를 선별한다. 항-CADM1 항체의 단편화는 당업계에서 잘 이해되는 바와 같이 모세관 전기영동 (CE) 및 MALDI-MS를 이용하여 측정할 수 있다 (문헌 [Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32]).
또 다른 바람직한 실시양태에서, 최소 응집 효과를 갖는 항체가 선별된다. 응집은 원치 않는 면역 반응 및/또는 변경되거나 바람직하지 않은 약동학 특성의 촉발로 이어질 수 있다. 일반적으로, 응집이 25％ 이하, 바람직하게는 20％ 이하, 보다 더 바람직하게는 15％ 이하, 보다 더 바람직하게는 10％ 이하, 보다 더 바람직하게는 5％ 이하인 항체가 허용된다. 응집은 크기-배제 칼럼 (SEC), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 및 단량체, 이량체, 삼량체 또는 다량체를 확인하기 위한 광 산란을 비롯한, 당업계에 널리 공지된 여러 기술에 의해 측정될 수 있다.
항체의 조작 방법
앞서 논의한 바와 같이, 본 발명에 개시된 VH 및 VK 서열을 포함하는 항-CADM1 항체는 VH 및/또는 VK 서열, 또는 이들에 부착된 불변 영역(들)을 변형함으로써 새로운 항-CADM1 항체를 생성하는데 이용될 수 있다. 따라서 본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 항-CADM1 항체, 예를 들어 PTA021_A1, PTA021_A2, 또는 PTA021_A3의 구조적 특징은 본 발명의 항체의 적어도 하나의 기능적 특성, 예컨대 인간 CADM1에 대한 결합을 보유하는 구조적으로 관련된 항-CADM1 항체를 생성하는데 이용된다. 예를 들어, PTA021_A1, PTA021_A2, 또는 PTA021_A3, 또는 이들의 돌연변이의 하나 이상의 CDR 영역은 공지의 프레임워크 영역 및/또는 다른 CDR과 재조합 방식으로 조합되어, 상기 논의한 바와 같이 재조합 방식으로 조작된 본 발명의 추가의 항-CADM1 항체를 생성할 수 있다. 다른 유형의 변형은 상기 섹션에 기재된 것들을 포함한다. 조작 방법을 위한 출발 물질은 본원에 제공된 VH 및/또는 VK 서열 중의 하나 이상, 또는 그의 하나 이상의 CDR 영역이다. 조작된 항체를 생성하기 위해, 본원에서 제공되는 하나 이상의 VH 및/또는 VK 서열, 또는 그의 하나 이상의 CDR 영역을 갖는 항체를 실제로 제조하는 (즉, 단백질로서 발현하는) 것은 필요하지 않다. 오히려, 이들 서열(들) 내에 함유된 정보를 출발 물질로서 사용하여 본래의 서열(들)로부터 유래된 "제 2 세대" 서열(들)을 제작한 다음, 이러한 "제 2 세대" 서열(들)을 단백질로서 제조 및 발현시킨다.
따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은
(i) 서열 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열, 서열 4, 5 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2 서열 및/또는 서열 7, 8 및 9로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 항체 서열; 및/또는 (ii) 서열 10, 11 및 12로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열, 서열 13, 14 및 15로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2 서열 및/또는 서열 16, 17 및 18로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 항체 서열을 제공하는 단계;
중쇄 가변 영역 항체 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 항체 서열 내에서 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변경하여 적어도 하나의 변경된 항체 서열을 생성하는 단계; 및
변경된 항체 서열을 단백질로 발현시키는 단계
를 포함하는 항-CADM1 항체의 제조 방법을 제공한다.
표준 분자 생물학 기술을 이용하여, 변경된 항체 서열을 제조하고 발현시킬 수 있다.
바람직하게는, 변경된 항체 서열(들)에 의해 코딩되는 항체는 본원에서 설명되는 항-CADM1 항체의 하나, 일부 또는 모든 기능적 특성을 갖는 것이고, 상기 기능적 특성에는
인간 CADM1에 1 x 10-7 M 이하의 KD로 결합하는 것;
CADM1로 형질감염된 인간 CHO 세포에 결합하는 것
이 포함되지만 이로 제한되지 않는다.
변경된 항체의 기능적 특성은 당업계에서 이용가능하고/하거나 본원에서 설명되는 표준 분석, 예를 들어 실시예에 기재된 것 (예를 들어, 유동 세포측정법, 결합 검정)을 이용하여 평가할 수 있다.
본 발명의 항체의 조작 방법의 특정 실시양태에서, 돌연변이는 항-CADM1 항체 코딩 서열의 전체 또는 일부를 따라 무작위로 또는 선택적으로 도입될 수 있고, 생성되는 변형된 항-CADM1 항체는 결합 활성 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 다른 기능적 특성에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 방법은 당업계에 기재되어 있다. 예를 들어, PCT 공보 WO 02/092780 (쇼트(Short))은 포화 돌연변이유발, 합성 라이게이션 어셈블리, 또는 이들의 조합을 이용하여 항체 돌연변이를 생성하고 스크리닝하는 방법을 기재한다. 별법적으로, PCT 공보 WO 03/074679 (라자(Lazar) 등)는 항체의 물리화학적 특성을 최적화하는 전산 스크리닝 방법을 이용한 방법을 기재한다.
본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 핵산은 온전한 세포 중에, 세포 용해물 중에, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 표준 기술, 예를 들어 알칼리성/SDS 처리, CsCl 밴딩, 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계 공지의 기타 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어 세포의 다른 핵산 또는 단백질로부터 정제된 경우에 "단리"되거나 "실질적으로 순수한" 상태이다. 문헌 [F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York]을 참조한다. 본 발명의 핵산은 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있고, 인트론 서열을 함유할 수도 있고 함유하지 않을 수도 있다. 바람직한 실시양태에서, 핵산은 cDNA 분자이다.
본 발명의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 수득할 수 있다. 하이브리도마 (예를 들어, 이하에서 추가로 기재하는 바와 같이 인간 이뮤노글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현되는 항체의 경우, 하이브리도마에 의해 제조된 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 수득할 수 있다. 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리로부터 수득한 항체의 경우에는 (예를 들어, 파지 디스플레이 기술을 사용하는 경우), 이러한 항체를 코딩하는 핵산을 상기 라이브러리로부터 회수할 수 있다.
본 발명의 바람직한 핵산 분자는 PTA021_A1, PTA021_A2 또는 PTA021_A3 모노클로날 항체의 VH 및 VL 서열을 코딩하는 것이다. PTA021_A1, PTA021_A2 및 PTA021_A3의 VH 서열을 코딩하는 DNA 서열을 각각 서열 25, 26 및 27에 나타낸다. PTA021_A1, PTA021_A2 및 PTA021_A3의 VK 서열을 코딩하는 DNA 서열은 각각 서열 28, 29 및 30에 나타낸다.
본 발명의 다른 바람직한 핵산은 서열 25, 26, 27, 28, 29 및 30에 나타낸 서열 중 하나와 적어도 80％ 서열 동일성, 예컨대 적어도 85％, 적어도 90％, 적어도 95％, 적어도 98％ 또는 적어도 99％ 서열 동일성을 갖는 핵산으로, 이들 핵산은 본 발명의 항체, 또는 그의 항원 결합 부분을 코딩한다.
2개의 핵산 서열 사이의 동일성 백분율은 이들 두 서열의 최적 정렬을 위하여 도입되는 갭의 총수와 각 갭의 길이를 고려하여, 서열 내에서 뉴클레오티드가 동일한 위치의 총수이다. 서열의 비교와 두 서열 사이에 동일성 백분율의 결정은 수학적 알고리즘, 예컨대 메이어스 및 밀러의 알고리즘 또는 앞서 기술된 알츠슐(Altschul)의 XBLAST 프로그램을 이용하여 달성될 수 있다.
추가로, 본 발명의 바람직한 핵산은 서열 25, 26, 27, 28, 29 및 30에 나타낸 핵산 서열의 하나 이상의 CDR-코딩 부분을 포함한다. 이러한 실시양태에서, 핵산은 PTA021_A1, PTA021_A2, 또는 PTA021_A3의 중쇄 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 또는 PTA021_A1, PTA021_A2, 또는 PTA021_A3의 경쇄 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열을 코딩할 수 있다.
서열 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 (VH 및 VK 서열)의 그러한 CDR-코딩 부분과 적어도 80％, 예컨대 적어도 85％, 적어도 90％, 적어도 95％, 적어도 98％ 또는 적어도 99％의 서열 동일성을 갖는 핵산 역시 본 발명의 바람직한 핵산이다. 이같은 핵산은 비-CDR 코딩 영역 및/또는 CDR-코딩 영역 내에서 서열 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30의 상응하는 부분과 상이할 수 있다. 이러한 차이가 CDR-코딩 영역 내에 존재하는 경우에, 핵산에 의해 코딩된 핵산 CDR 영역은 전형적으로 PTA021_A1, PTA021_A2, 또는 PTA021_A3의 상응하는 CDR 서열과 비교하여 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 보존적 서열 변형을 포함한다.
일단 VH 및 VK 절편을 코딩하는 DNA 단편을 수득하게 되면, 이들 DNA 단편을 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작하여, 예를 들어 가변 영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환시킬 수 있다. 이러한 조작에서, VK- 또는 VH-코딩 DNA 단편은 또 다른 단백질, 예컨대 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 코딩하는 또 다른 DNA 단편에 작동가능하게 연결된다. 이와 관련하여 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 2개의 DNA 단편에 의해 코딩된 아미노산 서열이 인-프레임으로 유지되도록 이들 2개의 DNA 단편을 연결하는 것을 의미하는 것으로 의도된다.
VH 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VH-코딩 DNA를 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 전장 중쇄 유전자로 전환시킬 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication number 91-3242] 참조), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH-코딩 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다.
VL/VK 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VL-코딩 DNA를 경쇄 불변 영역 CL을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결됨으로써 전장 경쇄 유전자 (및 또한 Fab 경쇄 유전자)로 전환시킬 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication number 91-3242] 참조), 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편을 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.
scFv 유전자를 생성하기 위해, VH- 및 VL/VK-코딩 DNA 단편은 가요성 링커를 코딩하는, 예를 들어 아미노산 서열 (Gly4-Ser)3을 코딩하는 다른 단편에 작동가능하게 연결되어, VH 및 VL/VK 서열이 인접한 단일 쇄 단백질로서 발현될 수 있고, 여기서 VL/VK 및 VH 영역은 가요성 링커에 의해 연결된다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al., (1988) Science 242:423-426]; [Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]; [McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554] 참조).
모노클로날 항체의 생산
본 발명의 모노클로날 항체 (mAb)는 통상적인 모노클로날 항체 방법론, 예를 들어, 문헌 [Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495]의 표준 체세포 혼성화 기술을 비롯한 다양한 기술에 의해 생산할 수 있다. 체세포 혼성화 절차가 바람직하지만, 원칙적으로, 모노클로날 항체를 생산하기 위한 다른 기술, 예를 들어, B 림프구의 바이러스 또는 종양원성 형질전환을 사용할 수 있다.
하이브리도마를 제조하는 데 바람직한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서 하이브리도마 생산은 매우 잘 확립된 절차이다. 면역화 프로토콜, 및 융합을 위해 면역화된 비장세포를 단리하는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예를 들어, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차 또한 공지되어 있다.
본 발명의 키메라 또는 인간화 항체는 앞서 기술된 바와 같이 제조된 비인간 모노클로날 항체의 서열에 기초하여 제조될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 DNA는 관심 비인간 하이브리도마로부터 수득할 수 있고, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 비-뮤린 (예를 들어, 인간) 이뮤노글로불린 서열을 함유하도록 조작할 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 생성하기 위해서, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 뮤린 가변 영역을 인간 불변 영역에 연결시킬 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 (카빌리(Cabilly) 등) 참조). 인간화 항체를 제작하기 위하여, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 뮤린 CDR 영역을 인간 프레임워크 내로 삽입시킬 수 있다 (예를 들어, 윈터의 미국 특허 제5,225,539호, 및 퀸 등의 미국 특허 제5,530,101호; 동 제5,585,089호; 동 제5,693,762호 및 동 제6,180,370호 참조).
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 모노클로날 항체이다. CADM1에 대해 지시된 이같은 인간 모노클로날 항체는 마우스 면역계보다는 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조믹 마우스를 사용하여 생성시킬 수 있다. 이들 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조믹 마우스에는 본원에서 각각 HuMAb 마우스® 및 KM 마우스® 계통의 마우스로 칭하는 마우스가 포함되며, 본원에서는 총칭하여 "인간 Ig 마우스"라 칭한다.
HuMAb 마우스® 계통 (메다렉스(Medarex)®, 인크.)은 내인성 μ 및 κ 쇄 좌위를 비활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께, 재정렬되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자 미니좌위(miniloci)를 함유한다 (예를 들어, 문헌 [Lonberg, et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859] 참조). 따라서, 상기 마우스는 감소된 마우스 IgM 또는 κ 발현을 나타내고, 면역화에 반응하여 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진은 클래스 스위칭 및 체세포 돌연변이를 거쳐 고친화도의 인간 IgGκ 모노클로날 항체로 생성된다 (문헌 [Lonberg, N. et al., (1994), 상기 문헌]; [Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101]; [Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93], 및 [Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546]에서 고찰됨). HuMAb 마우스®의 제조 및 사용, 및 그러한 마우스에 의해 운반되는 게놈 변형은 문헌 [Taylor, L. et al., (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295]; [Chen, J. et al., (1993) International Immunology 5: 647-656]; [Tuaillon et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724]; [Choi et al., (1993) Nature Genetics 4:117-123]; [Chen, J. et al., (1993) EMBO J. 12: 821-830]; [Tuaillon et al., (1994) J. Immunol. 152:2912-2920]; [Taylor, L. et al., (1994) International Immunology 6: 579-591]; 및 [Fishwild, D. et al., (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851]에 추가로 기재되어 있고, 이들 모두의 내용은 그 전문이 본원에 구체적으로 참고로 포함된다. 추가로, 미국 특허 제5,545,806호; 동 제5,569,825호; 동 제5,625,126호; 동 제5,633,425호; 동 제5,789,650호; 동 제5,877,397호; 동 제5,661,016호; 동 제5,814,318호; 동 제5,874,299호; 및 동 제5,770,429호 (모두 론버그(Lonberg) 및 케이(Kay)); 미국 특허 제5,545,807호 (수라니(Surani) 등); PCT 공보 번호 WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 및 WO 99/45962 (모두 론버그 및 케이); 및 PCT 공보 번호 WO 01/14424 (코르만(Korman) 등)을 참조한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 인간 항체는 트랜스진 및 트랜스크로모좀 상에 인간 이뮤노글로불린 서열을 보유하는 마우스, 예컨대 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스크로모좀을 보유하는 마우스를 사용하여 생성할 수 있다. 이러한 마우스는 본원에서 "KM 마우스®" 계통의 마우스로 지칭되고, PCT 공보 WO 02/43478 (이시다(Ishida) 등)에 상세하게 기재되어 있다.
추가로, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 트랜스제닉 동물 시스템이 당업계에서 이용가능하고, 본 발명의 항-CADM1 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제노마우스 (암젠, 인크.(Amgen, Inc.))로 지칭되는 대안적 트랜스제닉 시스템이 이용될 수 있고; 이러한 마우스는 예를 들어 미국 특허 제5,939,598호; 동 제6,075,181호; 동 제6,114,598호; 동 제6,150,584호 및 동 제6,162,963호 (쿠체르라파티(Kucherlapati) 등)에 기재되어 있다.
또한, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 트랜스크로모조믹 동물 시스템이 당업계에서 이용가능하고, 본 발명의 항-CADM1 항체를 생성하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 트랜스크로모좀 및 인간 경쇄 트랜스크로모좀을 둘 모두 보유하는 마우스 ("TC 마우스"라 칭함)를 사용할 수 있고; 이러한 마우스는 문헌 [Tomizuka et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 기재되어 있다. 추가로, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스크로모좀을 보유하는 소가 당업계 (문헌 [Kuroiwa et al., (2002) Nature Biotechnology 20:889-894]) 및 PCT 출원 번호 WO/2002/092812에 보고되어 있고, 본 발명의 항-CADM1 항체를 생산하는데 이를 이용될 수 있다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 인간 이뮤노글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파지 디스플레이 방법을 이용하여 제조할 수도 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 그러한 파지 디스플레이 방법은 당업계에 확립되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,223,409호; 동 제5,403,484호; 및 동 제5,571,698호 (래드너(Ladner) 등); 미국 특허 제5,427,908호 및 동 제5,580,717호 (도워(Dower) 등); 미국 특허 제5,969,108호 및 동 제6,172,197호 (맥카퍼티(McCafferty) 등); 및 미국 특허 제5,885,793호; 동 제6,521,404호; 동 제6,544,731호; 동 제6,555,313호; 동 제6,582,915호 및 동 제6,593,081호 (그리피스(Griffiths) 등)을 참조한다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 인간 면역 세포를 재구축한 SCID 마우스를 사용하여 제조할 수도 있는데, 이로써 면역화시에 인간 항체 반응이 발생할 수 있다. 이러한 마우스는 예를 들어 미국 특허 제5,476,996호 및 동 제5,698,767호 (윌슨(Wilson) 등)에 기재되어 있다.
인간 Ig 마우스의 면역화
인간 Ig 마우스를 이용하여 본 발명의 인간 항체를 생성하는 경우, 이같은 마우스를 문헌 [Lonberg, N. et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859]; [Fishwild, D. et al., (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851]; 및 PCT 공보 WO 98/24884 및 WO 01/14424에 기재되어 있는 바와 같이, CADM1 항원 및/또는 재조합 CADM1, 또는 CADM1을 발현하는 세포, 또는 CADM1 융합 단백질의 정제되거나 강화된 제제로 면역화시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 마우스는 처음 주입시 6-16 주령일 것이다. 예를 들어, CADM1 항원의 정제되거나 재조합 제제 (5-50 ㎍)를 이용하여 인간 Ig 마우스를 복강내로 면역화시킬 수 있다.
CADM1에 대한 완전 인간 모노클로날 항체를 생성하기 위한 상세한 절차는 하기 실시예 1에서 기술한다. 각종 항원을 이용하여 실험한 누적 결과는, 초기에는 완전 프로인트 아주반트 중의 항원으로 복강내 (IP) 면역화한 다음, 불완전 프로인트 아주반트 중의 항원으로 격주로 IP 면역 (최대 총 6회)화한 경우에 트랜스제닉 마우스가 반응하는 것으로 나타났다. 그러나, 프로인트 이외의 아주반트 역시 유효한 것으로 밝혀졌다. 또한, 아주반트의 부재 하에서의 완전 세포가 고도로 면역원성인 것으로 밝혀졌다. 면역 반응은 후안와 채혈로 수득한 혈장 샘플을 이용한 면역화 프로토콜 과정 동안 모니터링할 수 있다. 혈장은 ELISA (아래 설명됨)에 의해 스크리닝할 수 있고, 충분한 역가의 항-CADM1 인간 이뮤노글로불린을 갖는 마우스를 융합을 위해 사용할 수 있다. 마우스를 희생시키고 비장을 꺼내기 3일 전에 항원을 이용하여 정맥내로 부스팅시킬 수 있다. 각각의 면역화를 위해 2-3회 융합이 이루어질 필요가 있는 것으로 예상된다. 각 항원에 대해 전형적으로 6 내지 24마리의 마우스를 면역화한다. 한 실시양태에서, HCo7, HCo12 또는 HCo17 인간 중쇄 트랜스진 계통을 보유하는 마우스 계통이 이용될 수 있다. 별법적으로 또는 부가적으로, KM 마우스® 계통을 사용할 수 있다. 이에 더하여, 2 이상의 이들 계통을 복수의 상이한 인간 중쇄 트랜스진을 보유하는 단일 마우스 중에서 함께 사육할 수 있다.
인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성
본 발명의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화시킨 마우스로부터의 비장세포 및/또는 림프절 세포를 단리하고 적절한 불멸화 세포주, 예컨대 마우스 골수종 세포주에 융합시킬 수 있다. 생성된 하이브리도마를 항원 특이적 항체 생산을 위해 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터의 비장 림프구의 단일 세포 현탁액을, 50％ PEG를 이용하여 P3X63-Ag8.653 비분비성 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL 1580) 수의 1/6과 융합시킬 수 있다. 별법적으로, 면역화한 마우스로부터의 비장 림프구의 단일 세포 현탁액을, 시토펄스(CytoPulse) 대형 챔버 세포 융합 전기천공기 (시토펄스 사이언시즈, 인크., 메릴랜드주 그렌 버니 소재)를 사용하여, 전기장에 의거한 전기융합 방법을 이용하여 융합시킬 수 있다. 세포를 편평 바닥 마이크로타이터 플레이트에 대략 2 x 105로 플레이팅한 후, 20％ 태아 클론 혈청, 18％ "653" 조건화 배지, 5％ 오리겐 (IGEN), 4 mM L-글루타민, 1 mM 나트륨 피루베이트, 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-메르캅토에탄올, 50 단위/ml 페니실린, 50 mg/ml 스트렙토마이신, 50 mg/ml 겐타마이신 및 1X HAT (시그마 (Sigma); HAT는 융합 24시간 후에 첨가함)를 함유하는 선별 배지 내에서 2주 인큐베이션한다. 대략 2주 후, HAT를 HT로 대체시킨 배지에서 세포를 배양할 수 있다. 이어서, 개개의 웰을 인간 모노클로날 IgM 및 IgG 항체에 대해 ELISA에 의해 스크리닝할 수 있다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 일어나면, 배지를 대체로 10-14일 후에 관찰할 수 있다. 항체 분비성 하이브리도마를 재플레이팅하고, 다시 스크리닝하고, 인간 IgG에 대해 여전히 양성인 경우에는, 모노클로날 항체를 제한 희석함으로써 적어도 2회 서브클로닝할 수 있다. 이어서, 안정한 서브클론을 시험관 내에서 배양하여 조직 배양 배지 중에 특성화를 위한 소량의 항체를 생성시킬 수 있다.
인간 모노클로날 항체를 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마를 모노크로날 항체 정제를 위해 2 ℓ의 스피너-플라스크에서 성장시킬 수 있다. 상청액을 여과하고, 농축시킨 후, 단백질 A-세파로스 (파마시아(Pharmacia), 뉴저지주 피스카타웨이 소재)로 친화성 크로마토그래피할 수 있다. 용출된 IgG를 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피로 확인하여 순도를 보장할 수 있다. 완충 용액을 PBS로 교환시키고, 흡광 계수 1.43을 사용하여 OD280에 의해 농도를 결정할 수 있다. 모노클로날 항체를 분취하고 -80℃에서 보관할 수 있다.
모노클로날 항체를 생산하는 트랜스펙토마의 생성
본 발명의 항체는 또한 예를 들어, 당업계에 널리 공지된 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법의 조합을 이용하여 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Morrison, S. (1985) Science 229:1202]).
예를 들어, 항체 또는 그의 항체 단편을 발현시키기 위해, 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자 생물학 기술 (예를 들어, 관심 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용하는 cDNA 클로닝 또는 PCR 증폭)에 의해 수득할 수 있고, 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결되도록 DNA를 발현 벡터 내로 삽입할 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "작동가능하게 연결된"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 이들의 의도된 기능을 수행하도록, 항체 유전자가 벡터 내로 라이게이션되는 것을 의미한다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 상용가능한 것을 선택한다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별개의 벡터 내로 삽입될 수 있거나, 보다 전형적으로 두 유전자는 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체 유전자를 표준 방법 (예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터상의 상보적 제한 부위의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우에는 평활 말단 라이게이션)에 의해 발현 벡터 내로 삽입한다. 본원에 설명되는 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역은, VH 절편이 벡터 내에서 CH 절편(들)에 작동가능하게 연결되고 VK 절편이 벡터 내에서 CL 절편에 작동가능하게 연결되도록 이들을 이미 목적하는 이소형의 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 코딩하는 발현 벡터 내로 삽입함으로써 임의의 항체 이소형의 전장 항체 유전자를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 추가로 또는 별법적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터의 항체 사슬 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 사슬 유전자를 벡터 내로 클로닝하여 신호 펩티드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 인 프레임 연결되도록 할 수 있다. 신호 펩티드는 이뮤노글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드 (즉, 비-이뮤노글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 사슬 유전자 이외에도, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 항체 사슬 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 보유하고 있다. 용어 "조절 서열"은 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 서열은 예를 들어 문헌 [Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))]에 기재되어 있다. 당업자는 조절 서열의 선택을 비롯한 발현 벡터의 디자인이 형질전환시킬 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있음을 알 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위해 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 고수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예를 들어 시토메갈로바이러스 (CMV), 원숭이 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래하는 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 별법적으로, 비-바이러스 조절 서열, 예컨대 유비퀴틴 프로모터 또는 β-글로빈 프로모터를 사용할 수 있다. 추가로, SV40 초기 프로모터 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 유형 1의 긴 말단 반복체로부터의 서열을 함유하는 SRα 프로모터 시스템과 같은 상이한 공급원으로부터의 서열들로 구성된 조절 요소 (문헌 [Takebe, Y. et al., (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472]).
항체 사슬 유전자 및 조절 서열에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가의 서열, 예컨대 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예를 들어, 복제 기원) 및 선택 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다 (예를 들어, 미국 특허 제4,399,216호, 동 제4,634,665호 및 동 제5,179,017호 (모두 악셀(Axel) 등) 참조). 예를 들어, 전형적으로, 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에서 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선택 마커 유전자는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선택/증폭과 함께 dhfr- 숙주 세포에서 사용하기 위한 것) 및 neo 유전자 (G418 선택을 위한 것)를 포함한다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)를 표준 기술에 의해 숙주 세포로 형질감염시킨다. 다양한 형태의 용어 "형질감염"은 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 외인성 DNA를 도입하는데 일반적으로 이용되는 광범위하게 다양한 기술, 예를 들어 전기천공, 칼슘 포스페이트 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시키는 것이 이론상 가능하긴 하지만, 항체를 진핵 세포, 가장 바람직하게는 포유동물 숙주 세포에서 발현시키는 것이 가장 바람직한데, 이는 이러한 진핵 세포, 특히 포유동물 세포가 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 어셈블리하고 분비하는데 있어서 원핵 세포보다 더 적합하기 때문이다. 항체 유전자의 원핵생물 발현은 활성 항체의 고수율 생산을 위해 비효과적인 것으로 보고되었다 (문헌 [Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13]).
본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위해 바람직한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포) (예를 들어, 문헌 [R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같은 DHFR 선택 마커와 함께 사용되는, 문헌 [Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재되어 있는 dhfr- CHO 세포 포함), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히, NSO 골수종 세포와 함께 이용하기 위하여, 또 다른 바람직한 발현 시스템은 WO 87/04462 (윌슨), WO 89/01036 (베빙톤(Bebbington)) 및 EP 338,841 (베빙톤)에 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 포유동물 숙주 세포 내로 도입할 때, 항체는 숙주 세포에서 항체의 발현을 허용하기 위해, 또는 보다 바람직하게는 숙주 세포를 성장시키는 배양 배지 내로 항체의 분비를 허용하기 위해 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산한다. 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 항체를 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
항원에 대한 항체 결합의 특성화
본 발명의 항체는 예를 들어, 표준 ELISA에 의해 CADM1에 대한 결합에 대해 시험될 수 있다. 간략하게, 마이크로타이터 플레이트를 PBS 중의 정제된 CADM1으로 0.25 ㎍/㎖로 코팅한 다음, PBS 중에서 5％ 소 혈청 알부민으로 차단시킨다. 항체 희석액 (예를 들어, CADM1-면역화된 마우스로부터의 혈장 희석액)을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1-2시간 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 PBS/트윈으로 세척한 다음, 알칼리성 포스파타제와 접합된 2차 시약 (예를 들어, 인간 항체의 경우에는 염소-항-인간 IgG Fc-특이적 폴리클로날 시약)과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 세척 후, 플레이트를 pNPP 기질 (1 mg/ml)로 발색시키고, OD 405-650에서 분석한다. 바람직하게는, 가장 높은 역가를 발색하는 마우스를 융합에 사용할 것이다.
상기 기술한 바와 같은 ELISA 검정이 CADM1 면역원과의 양성 반응성을 나타내는 하이브리도마를 스크리닝하는데 또한 사용될 수 있다. CADM1에 높은 결합력으로 결합하는 하이브리도마는 서브클로닝되고 보다 특성화된다. -140℃ 하에 저장된 5 내지 10개 바이알 세포 은행을 만들고 항체를 정제하기 위해, 모 세포의 반응성을 보유하고 있는 (ELISA에 의함) 각 하이브리도마로부터의 1개 클론을 선택할 수 있다.
항-CADM1 항체를 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마를 모노크로날 항체 정제를 위해 2 리터의 스피너-플라스크에서 성장시킬 수 있다. 상청액을 여과하고, 농축시킨 후, 단백질 A-세파로스 (파마시아, 뉴저지주 피스카타웨이 소재)로 친화성 크로마토그래피할 수 있다. 용출된 IgG를 겔 전기영동 및 고 성능 액체 크로마토그래피로 확인하여 순도를 보장할 수 있다. 완충 용액을 PBS로 교환시키고, 흡광 계수 1.43을 사용하여 OD280에 의해 농도를 결정할 수 있다. 모노클로날 항체를 분취하고 -80℃에서 보관할 수 있다.
선택된 항-CADM1 모노클로날 항체가 고유한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위하여, 각 항체를 시판되는 시약 (피어스(Pierce), 일리노이주 록포드 소재)으로 비오티닐화할 수 있다. 비표지된 모노클로날 항체 및 비오티닐화된 모노클로날 항체를 이용한 본 발명의 항체와의 결합 경쟁 연구는 상기에서 기술한 바와 같은 CADM1 코팅된-ELISA 플레이트를 이용하여 수행할 수 있다. 비오티닐화된 mAb 결합은 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 프로브로 검출할 수 있다.
정제된 항체의 이소형을 결정하기 위해, 특별한 이소형의 항체에 특이적인 시약을 이용하여 이소형 ELISA를 수행할 수 있다. 예를 들어, 인간 모노클로날 항체의 이소형을 결정하기 위하여, 마이크로타이터 플레이트의 웰을 4℃에서 밤새 1 ㎍/㎖의 항-인간 이뮤노글로불린으로 코팅시킬 수 있다. 1％ BSA로 차단시킨 후, 플레이트를 주위 온도에서 1 내지 2시간 동안 1 ㎍/ml 이하의 시험 모노클로날 항체 또는 정제된 이소형 대조군과 반응시킨다. 이어서, 웰을 인간 IgG1 또는 인간 IgM-특이적 알칼리성 포스파타제-접합된 프로브와 반응시킬 수 있다. 플레이트를 상기에서 기재한 바와 같이 발색시키고 분석한다.
항-CADM1 인간 IgG는 웨스턴 블롯팅에 의해 CADM1 항원과의 반응성에 대해 추가로 시험될 수 있다. 간략하게, CADM1을 제조하고, 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 처리할 수 있다. 전기영동 후에, 분리된 항원을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 10％ 소 태아 혈청으로 차단하고, 시험할 모노클로날 항체로 프로빙한다. 항-인간 IgG 알칼리성 포스파타제를 이용하여 인간 IgG 결합을 검출할 수 있고 BCIP/NBT 기질 정제 (시그마 켐. 코포레이션(Sigma Chem. Co.), 미주리주 세인트 루이스 소재)를 이용하여 발색시킬 수 있다.
본 발명의 항체의 결합 특이성은 또한, 예를 들어 유동 세포측정법에 의해 CADM1을 발현하는 세포에 대한 항체의 결합을 모니터링함으로써 결정할 수 있다. 전형적으로, 세포주, 예컨대 CHO 세포주를 막횡단 형태의 CADM1을 코딩하는 발현 벡터로 형질감염시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노 말단에 HA 태그를 갖는 전장 CADM1 분자 (서열 43)가 CHO 세포주의 세포 표면 상에서 발현된다. 이와 같이 형질감염시킨 단백질은 태그에 대한 항체를 사용하여 검출하기 위해, 바람직하게는 N-말단에 태그, 예컨대 myc-태그를 포함할 수 있다. CADM1에 대한 본 발명의 항체의 결합은 형질감염된 세포를 상기 항체와 함께 배양하고, 결합된 항체를 검출함으로써 결정될 수 있다. 형질감염시킨 단백질 상의 태그에 대한 항체의 결합을 양성 대조군으로서 사용할 수 있다.
CADM1에 대한 본 발명의 항체의 특이성은 CADM1에 대한 결합을 결정하는 동일한 방법을 이용하여 항체가 다른 단백질, 예컨대 TSLL2/CADM1C 또는 이뮤노글로불린 슈퍼패밀리의 다른 구성원에 결합하는지 여부를 결정함으로써 추가로 연구할 수 있다.
항체-파트너 분자 접합체
바람직한 측면에서, 본 발명에 따른 항-CADM1 항체 및 파트너 분자를 포함하는 접합체를 제공하며, 상기 접합체는 하기 화학식 a로 나타내어진다.
<화학식 a>
Figure 112011077117717-pct00001
상기 식에서, Z는 본 발명에 따른 항체이며; D는 파트너 분자이고; (XZ)aC(XD)b는 이것이 첫번째 2 개의 성분을 연결하기 때문에, "링커 모이어티" 또는 "링커"라 총칭한다. 링커에서, C는 파트너 분자 D의 의도된 생물학적 작용 부위에서 절단되도록 설계된 절단가능한 기이고; XZ 및 XD는 이들이 Z와 C 및 C와 D를 각각 벌려두기 때문에 스페이서 모이어티 (또는 "스페이서")라 칭하며; 아래첨자 a 및 b는 독립적으로 0 또는 1이고 (즉, XZ 및/또는 XD의 존재는 임의적임); 아래첨자 m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 (바람직하게는 1, 2, 3, 또는 4)이다. 각각의 상기 용어를 본 명세서의 하단에서 보다 상세하게 정의한다.
항체 Z는 표적 조직 또는 그의 항원이 위치하는 세포에 결합함으로써 표적화 기능을 제공하며, 접합체를 그 곳으로 이끈다. 바람직하게는, 표적 조직 또는 세포는 종양 또는 암 세포이며, 항원은 종양-관련 또는 종양-특이적 항원이다. 표적 조직 또는 세포에서 C 기의 절단은 파트너 분자 D를 방출시켜 그것의 의도하는 생물학적 기능이 수행되도록 한다. 일부 경우에, 접합체는 세포내 이입에 의해 표적 세포 내로 내재화되어 절단이 표적 세포 내에서 일어난다. 이러한 방식으로, 작용 부위로의 파트너 분자 D의 정확한 전달이 이루어져서, 요구되는 투여량이 감소된다. 또한, 파트너 분자 D는 정상적으로는 접합된 상태에서 생물학적으로 불활성이므로 (또는 활성이 유의하게 낮으므로), 비-표적 조직 또는 세포에 대한 바람직하지 않는 독성이 감소된다. 항암 약물이 종종 낮은 치료 지수를 가지면서 매우 독성이므로, 이는 중요한 고려사항이다.
아래첨자 m에 의해 반영되는 바와 같이, 각각의 항체 Z 분자는 접합에 이용가능한 부위의 개수 및 이용되는 실험 조건에 따라 하나를 초과하는 파트너 분자 D와 접합될 수 있다. 당업자는 각각의 항체 Z 분자가 파트너 분자 D에 정수의 개수로 접합되지만, 접합체의 제조시에는 통계적 평균을 반영하여 항체 Z에 대한 파트너 분자 D의 비-정수 비율을 검토할 수 있음을 인식할 것이다.
항체 Z
항체 Z 상의 여러 다양한 반응성 기 중 어느 하나, 예를 들어 리신 잔기 내의 ε-아미노 기, 팬던트 탄수화물 모이어티, 카르복실산 기, 디술피드 기, 및 티올 기를 접합 부위로 사용할 수 있다. 각 유형의 반응성 기는 몇몇 이점을 갖지만 몇몇 상쇄적인 제한을 갖는 균형을 나타낸다. 접합에 적합한 항체 반응성 기의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Garnett, Adv. Drug Delivery Rev. 53 (2001), 171-216] 및 [Dubowchik and Walker, Pharmacology & Therapeutics 83 (1999), 67-123] (이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨)을 참조한다.
한 실시양태에서, 항체 Z는 리신 ε-아미노 기를 통해 접합된다. 대부분의 항체는 리신 ε-아미노 기에 여러회 노출되며, 이종이관능성 작용제에 의한 변형을 비롯한 당업계 공지의 기술을 이용한 아미드, 우레아, 티오우레아, 또는 카르바메이트 결합을 통해 접합될 수 있다 (본원의 하단에서 추가로 기재함). 그러나, 접합체 제조에 있어서 잠재적인 배치-대-배치 변동성이 야기되도록 어떤 ε-아미노 기를 얼마나 많이 반응시킬지 제어하는 것은 어렵다. 또한, 접합은 항체의 천연 형태를 유지하는데 중요한 양성화된 ε-아미노 기를 중화시킬 수 있거나, 또는 어느 것도 바람직한 것이 아닌 항원 결합 부위 근처 또는 그 부위에서 일어날 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 많은 항체가 글리코실화되는 것과 같이 항체 Z를 탄수화물 측쇄를 통해 접합시킬 수 있다. 탄수화물 측쇄는 퍼요오데이트에 의해 산화되어 알데히드 기를 생성할 수 있고, 이는 차례로 아민과 반응하여 세미카르바존, 옥심 또는 히드라존에서와 같은 이민 기를 형성할 수 있다. 원하는 경우에, 이민 기를 나트륨 시아노보로히드라이드로 환원시켜 보다 안정한 결합을 생성할 수 있다. 탄수화물 측쇄를 통한 접합에 대한 추가의 개시내용은, 예를 들어 문헌 [Rodwell et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83, 2632-2636 (1986)]을 참조하고, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 리신 ε-아미노 기에서와 같은, 접합 부위(들)의 위치 및 화학량론에 관한 관심이 존재한다.
또 다른 실시양태에서, 항체 Z는 카르복실산 기를 통해 접합될 수 있다. 한 실시양태에서, 말단 카르복실산 기는 관능화되어 카르보히드라지드로 되며, 이어서 이는 알데히드-보유 접합 보이어티와 반응한다. 문헌 [Fisch et al., Bioconjugate Chemistry 1992, 3, 147-153]을 참조한다.
또 다른 실시양태에서, 항체 Z는 항체 Z 상의 시스테인 잔기의 황 및 접합체의 다른 부분 상의 황을 가교하는 디술피드 기를 통해 접합될 수 있다. 몇몇 항체 (예컨대 IgG 이소형)는 유리 티올 기가 결여되어 있지만, 예를 들어 힌지 영역에 디술피드 기를 갖는다. 그러한 경우에, 천연 디술피드 기의 환원에 의해 유리 티올 기가 생성될 수 있다. 그렇게 생성된 티올 기가 후속하여 접합에 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Packard et al., Biochemistry 1986, 25, 3548-3552]; [King et al., Cancer Res. 54, 6176-6185 (1994)]; 및 [Doronina et al., Nature Biotechnol. 21(7), 778-784 (2003)]을 참조하고, 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 다시, 접합 위치 및 화학량론 및 항체 천연 형태의 가능한 붕괴에 관한 관심이 존재한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 항체 Z는 티올 기의 친핵성 부가 산물을 통해 수용자 모이어티에 접합된다. 바람직한 수용자 모이어티는 말레이미드 기로, 그의 항체 티올 기와의 반응을 이하에서 설명한다:
Figure 112011077117717-pct00002
천연 디술피드 결합을 파괴하지 않으면서 항체에 유리 티올 기를 도입하기 위한 다수의 방법들이 개발되어 있고, 그러한 방법을 본 발명의 항체 Z와 함께 수행할 수 있다. 사용하는 방법에 따라, 특정 위치에 예측가능한 수의 유리 술프히드릴을 도입하는 것이 가능할 수 있다. 한가지 접근법에서, 시스테인을 다른 아미노산으로 치환시킨 돌연변이된 항체가 제조된다. 예를 들어, 에이겐브로트(Eigenbrot) 등의 US 2007/0092940 A1; 문헌 [Chilkoti et al., Bioconjugate Chem. 1994, 5, 504-507]; 유르노비츠(Urnovitz) 등의 US 4,698,420 (1987); [Stimmel et al., J. Biol. Chem., 275 (39), 30445-30450 (2000)]; 밤(Bam) 등의 US 7,311,902 B2 (2007); [Kuan et al., J. Biol. Chem., 269 (10), 7610-7618 (1994)]; [Poon et al., J. Biol. Chem., 270 (15), 8571-8577 (1995)]을 참조한다. 또 다른 접근법에서, 여분의 시스테인이 C 말단에 부가된다. 예를 들어, 문헌 [Cumber et al., J. Immunol., 149, 120-126 (1992)]; [King et al., Cancer Res., 54, 6176-6185 (1994)]; [Li et al., Bioconjugate Chem., 13, 985-995 (2002)]; [Yang et al., Protein Engineering, 16, 761-770 (2003)]; 및 [Olafson et al., Protein Engineering Design & Selection, 17, 21-27 (2004)]을 참조한다. 유리 시스테인을 도입하기 위한 바람직한 방법이 2007년 8월 22일자로 출원된 킹(King)의 미국 가출원 연속 번호 60/957,271에 교지되어 있으며, 여기서는 시스테인 보유 아미노산 서열을 항체 중쇄의 C 말단에 부가한다. 이러한 방법은 공지된 수의 시스테인 잔기 (중쇄 당 하나)를 항원 결합 부위와 떨어진 공지된 위치에 도입한다. 본 단락에서 언급한 문헌의 개시내용은 모두 본원에 참고로 포함된다.
또 다른 실시양태에서, 리신 ε-아미노 기를 2-이미노티올란 또는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP)와 같은 이종이관능성 시약으로 변형시켜 ε-아미노 기를 티올 또는 디술피드 기로 전환시킴으로써 - 이를테면 시스테인 대용물을 생성할 수 있다. 그러나, 이러한 방법은 동일한 접합 위치 및 적절한 ε-아미노 기와 관련된 화학량론 제한으로 인해 곤란을 겪게 된다.
파트너 분자 D
파트너 분자 D는 치료제 또는 마커일 수 있다. 전자의 경우, 이는 예를 들어 세포독소, 비-세포독성 약물 (예를 들어, 면역억제제), 방사성 작용제, 또 다른 항체, 또는 효소 또는 그의 활성 단편, 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예컨대 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ; 또는, 생물학적 반응 조절자, 예컨대 림포킨, 인터류킨-1 ("IL-1"), 인터류킨-2 ("IL-2"), 인터류킨-6 ("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 ("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자 ("G-CSF"), 또는 다른 성장 인자일 수 있다. 후자의 경우, 이는 검출가능한 신호를 생성하는 임의의 모이어티, 예컨대 방사성표지, 형광 표지, 또는 기질에 대한 검출가능한 변형을 촉매하는 효소일 수 있다. 진단 또는 치료 목적으로 이용하기 위해 항체에 접합될 수 있는 방사성 동위원소의 예에는 요오드131, 인듐111, 이트륨90 및 루테튬177이 포함되지만 이들에 제한되지 않는다. 방사성면역접합체를 제조하는 방법은 당업계에 확립되어 있다. 제발린® (IDEC 파마슈티칼스(IDEC Pharmaceuticals)) 및 벡사르® (코릭사 파마슈티칼스(Corixa Pharmaceuticals))를 비롯한 방사성면역접합체의 예가 시판되고 있으며, 본 발명의 항체를 이용하여 방사성면역접합체를 제조하는데 유사한 방법이 이용될 수 있다.
세포독소 또는 세포독성제에는 세포에게 해로운 (예를 들어, 사멸시키는) 임의의 작용제가 포함된다. 예로는 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 브롬화에티듐, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신 및 이들의 유사체 또는 상동체가 포함된다.
파트너 분자 D가 치료제일 경우, 적합한 치료제 부류로는 항대사물, 알킬화제, DNA 작은 홈 결합제, DNA 삽입제, DNA 가교제, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 핵 유출 억제제, 프로테아좀 억제제, 토포이소머라제 I 또는 II 억제제, 열 충격 단백질 억제제, 티로신 키나제 억제제, 항생제 및 항-유사분열제가 포함된다. 적합한 치료제의 예에는 악티노마이신 D, 안트라시클린, 안트라마이신 (AMC), 아우리스타틴, 블레오마이신, 부술판, 칼리케아미신, 캄프토테신, 카르무스틴, 클로람부실, 시스-디클로로디아민 백금 (II) (DDP), 시스플라틴, 콜히친, 시클로포스파미드, 시타라빈, 시토칼라신 B, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데카르바진, 1-데히드로테스토스테론, 디브로모만니톨, 디히드록시안트라신디온, 독소루비신, 에메틴, 에포틸론, 브롬화에티듐, 에토포시드, 5-플루오로우라실, 겜시타빈, 글루코코르티코이드, 그라미시딘 D, 이마티닙, 이리노테칸, β-라파콘, 리도카인, 로무스틴, 메이탄신, 메클로레타민, 멜팔란, 6-메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미트라마이신, 미토마이신 C, 미톡산트론, 파클리탁셀, 프로카인, 프로프라놀롤, 퓨로마이신, 리신, 스트렙토조토신, 수베로일아닐리드 히드록삼산 (SAHA), 탈리소마이신, 테노포시드, 테트라카인, 티오에파, 6-티오구아닌, 튜불라이신, 빈블라스틴, 빈크리스틴 및 이들의 유사체, 상동체 또는 유도체가 포함된다.
바람직하게는, 파트너 분자 D는 아우리스타틴 (특히 MMAE 및 MMAF), 에네디인 항생제 (특히 칼리케아미신 및 CalichDMH), 독소루비신, 메이탄시노이드 (특히 DM1 및 DM4), 슈도모나스 외독소 A (특히 그의 말단절단 형태), DNA 작은 홈-결합 알킬화기 (특히 CC-1065 및 두오카르마이신 유사체) 및 이들의 유사체 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 세포독소이다. 칼리케아미신 항체 접합체의 예는 시판되고 있다 (밀로타르그®; 아메리칸 홈 프로덕츠(American Home Products)). 당업자는 상기 세포독소가 대부분 천연 산물이며, 일부 그의 변형물 - 즉, 유도체화된 것 - 이 그들을 접합에 이용하는데 바람직하거나 또는 필요할 수 있음을 인식할 것이다.
바람직한 DNA 작은 홈-결합 알킬화기는 CC-1065 및 구조적으로 관련된 두오카르마이신의 유사체 또는 유도체이며, 그의 적합한 예가 Ng 등의 US 7,087,600 B2 (2006); Ng 등의 US 6,989,452 B2 (2006); Ng 등의 US 7,129,261 B2 (2006); Ng 등의 WO 02/096910 A1 (2002); 보이드(Boyd) 등의 US 2006/0024317 A1 (2006); 첸(Chen) 등의 US 2006/0004081 A1 (2006); 강와르(Gangwar) 등의 US 2006/0247295 A1 (2006); 보이드 등의 WO 2007/038658 A2 (2007); 강와르 등의 WO 2007/051081 A1 (2007); 강와르 등의 WO 2007/059404 A2 (2007); 수피(Sufi) 등의 WO 2008/083312 A2 (2008); 및 첸 등의 PCT 출원 번호 PCT/US2008/054362 (2008년 2월 20일자 출원)에 개시되어 있고, 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 이같은 바람직한 파트너 분자 D는 하기 화학식 b로 나타낼 수 있다:
<화학식 b>
Figure 112011077117717-pct00003
상기 식에서,
고리계 A는 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬 기, 예컨대 페닐 또는 피롤이고;
E 및 G는 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 헤테로원자 또는 단일 결합이거나, 또는 E 및 G는 연결되어 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴 및 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬로부터 선택된 고리계를 형성하며;
X는 O, S 또는 NR23이고, 여기서 R23은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬 또는 아실이며;
R3은 (=O) 또는 OH이고;
R4, R4', R5 및 R5'은 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 할로겐, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(=O)NR15R16, OC(=O)OR15, C(=O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16 또는 O(CH2)nN(CH3)2이며, 여기서 n은 1 내지 20의 정수이거나, 또는 R4, R4', R5 및 R5'의 임의의 인접 쌍은 이들에 부착된 탄소 원자와 함께 연결되어 4 내지 6개의 구성원을 갖는 치환 또는 비치환된 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬 고리계를 형성하며;
R15 및 R16은 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬 또는 치환 또는 비치환된 펩티딜이며, 여기서 R15 및 R16은 이들에 부착된 질소 원자와 함께 임의로 연결되어 4 내지 6개의 구원성을 갖고, 임의로 2개 이상의 헤테로원자를 함유하는 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬 고리계를 형성하고;
R6은 존재하거나 또는 부재하는 단일 결합이고;
R7은 CH2-X1 또는 -CH2-이며, 단 R6이 존재하는 경우에, R6 및 R7은 연결되어 시클로프로필 고리를 형성하고;
X1은 이탈기, 예컨대 Cl, Br, F, 메실레이트 또는 토실레이트이다.
화학식 b의 파트너 분자는 R3, R4, R4', R5, 및 R5' 중 하나를 통해, 바람직하게는 R3 (R3이 OH인 경우) 또는 R4를 통해, 보다 바람직하게는 R4를 통해 접합될 수 있다. 또한, 아래에서 논의된 것처럼, R3은 전구약물화 모이어티를 보유할 수 있다.
화학식 b의 바람직한 파트너 분자는 하기 화학식 c로 표시된다:
<화학식 c>
Figure 112011077117717-pct00004
상기 식에서,
R3, R4, R4', R5, R5', R6 및 R7은 상기에서 정의한 바와 같고;
Z는 O, NH 또는 N (저급 알킬)이며;
R1, R1', R2, 및 R2'은 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 저급 알킬, 시아노, 알콕시, 할로겐, C(=O)R8 또는 CO2R8이고, 여기서 R8은 NR9R10 또는 OR9이고, 여기서 R9 및 R10은 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 알킬 또는 치환 또는 비치환된 헤테로알킬이다.
보다 바람직한 실시양태를 하기 화학식 d에 나타낸다:
<화학식 d>
Figure 112011077117717-pct00005
상기 식에서 X1은 상기에서 정의한 바와 같고, X2는
Figure 112011077117717-pct00006
이다.
구체적인 파트너 분자 D의 예를 하기 화학식 e에 나타낸다:
<화학식 e>
Figure 112011077117717-pct00007
파트너 분자 D가 세포독소인 경우, 이는 전구약물화, 즉 전구약물 모이어티에 부착될 수 있으며, 제거를 위해서는 활성화시키는 것이 요구된다. 바람직하게는, 전구약물 기는 (1) 접합체로부터 세포독소를 절단시키는 것과는 다른 반응 메카니즘에 의해 제거되며, (2) 접합체가 혈액 혈장 내에서 순환 중인 동안에는 제거되지 않거나 오직 천천히 제거되지만, (3) 표적 조직 또는 세포에서는 효과적으로 제거된다. 따라서, 접합체가 표적 조직 또는 세포에 도달하기 전에 우연히 제거된 경우, 세포독소는 비-표적 조직 또는 세포에 대한 세포독성이 제거되거나 감소된 여전히 불활성인 전구약물 형태로 방출된다. 즉, 세포독소 활성화를 위해 제2 절단이 요구된다는 것은 안전 요소를 제공한다. 화학식 b, c, d 또는 e에 따른 세포독소의 예에서, 전구약물 기의 부착을 위한 바람직한 부위는 "4"로 표시된 위치이다. C 기의 절단 및 전구약물 모이어티의 제거가 둘 모두 효소에 의해 매개되는 경우 안전 요소를 증가시키기 위해서는, 관여되는 효소가 상이한 것이 바람직하다.
전구약물 기의 비제한적인 예에는 에스테르, 카르바메이트, 포스페이트 및 글리코시드가 포함된다. 예시를 위해, 화학식 b-e의 세포독소 내 4-위치 히드록실을 하기 전구약물 모이어티로 전구약물화할 수 있다:
Figure 112011077117717-pct00008
파트너 분자 D는 또한 마커일 수 있다. 마커는 검출가능한 신호를 생성하는 임의의 표지, 예컨대 방사성표지, 형광 표지, 또는 기질에 대한 검출가능한 변형을 촉매하는 효소일 수 있다. 마커 (또한 리포터 기 또는 검출가능한 표지라고도 함)는 면역검정, 생의학 연구 및 의학 진단 분야에 널리 공지되어 있고, 분광적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출될 수 있다. 마커는 바람직하게는 방사성 동위원소, 형광 또는 화학발광제 또는 그의 전구체, 발색단, 효소, 또는 이들의 조합이다. 적합한 효소의 예는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제 및 글루코스 옥시다제이다. 형광 작용제에는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론 등이 포함된다. 화학발광 화합물에는 루시페린 및 2,3-디히드로프탈라진디온, 예컨대 루미놀이 포함된다.
링커 -(X Z ) a C(X D ) b -
상기에서 기재한 바와 같이, 본 발명의 접합체의 링커 부분은 최대 3개의 요소: 절단가능한 기 C 및 임의의 스페이서 XZ 및 XD를 포함한다.
절단가능한 기 C는 접합체가 혈액 혈장 중에서 일반적인 순환 중에도 비교적 안정하지만, 접합체가 의도하는 작용 부위에 도달했을 때에는 쉽게 절단되는 것으로 선택된다. 바람직하게는, 접합체는 항체 Z가 표적 세포의 표면 상에 디스플레이된 항원에 결합되었을 때 표적 세포에 의한 세포내 이입에 의해 내재화된다. 후속하여, 표적 세포의 소포체 (초기 엔도좀, 후기 엔도좀 또는 특히 리소좀)에서 C 기의 절단이 일어난다.
한 실시양태에서, C 기는 pH 감수성 기이다. 혈액 혈장 내 pH는 중성을 약간 초과하지만, 리소좀 내의 pH는 산성, 약 5이다. 따라서, 절단이 산 촉매되는 C 기는 혈액 혈장 내에서의 속도에 비해 리소좀 내에서 수 자릿수 더 빠른 속도로 절단될 것이다. 적합한 산-감수성 기의 예에는 센(Shen) 등의 US 4,631,190 (1986); 센 등의 US 5,144,011 (1992); 문헌 [Shen et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 102, 1048-1054 (1981)] 및 [Yang et al., Proc. Natl Acad. Sci (USA), 85, 1189-1193 (1988)]에 기재된 바와 같은 시스-아코니틸 아미드 및 히드라존이 포함되며, 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
또 다른 실시양태에서, C 기는 디술피드이다. 디술피드는 티올-디술피드 교환 메카니즘에 의해 주위 티올 농도에 의존한 속도로 절단될 수 있다. 글루타티온 및 다른 티올의 세포내 농도가 그의 혈청 농도에 비해 높기 때문에, 디술피드의 절단 속도는 세포내에서 더 높을 것이다. 또한, 티올-디술피드 교환 속도는 디술피드의 입체 및 전자 특성을 조정하는 것에 의해 조절될 수 있으며 (예를 들어, 알킬-아릴 디술피드 대 알킬-알킬 디술피드; 아릴 고리 상에서의 치환 등), 혈청 안정성 또는 특정 절단 속도를 향상시키는 디술피드 연결을 설계하는 것이 가능하다. 접합체 내의 디술피드 절단가능한 기와 관련된 추가의 개시내용에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Thorpe et al., Cancer Res. 48, 6396-6403 (1988)]; 산티(Santi) 등의 US 2005/0287155 A1 (2005); Ng 등의 US 6,989,452 B2 (2006); Ng 등의 WO 2002/096910 A1 (2002); 보이드 등의 US 2006/0024317 A1 (2006); 및 수피 등의 WO 2008/083312 A2 (2008)를 참조하고, 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
바람직한 C 기로는, 혈청 내의 프로테아제에 의하는 것과는 대조적으로, 의도하는 작용 부위에서 프로테아제에 의해 우세하게 절단되는 펩티드 결합이 포함된다. 전형적으로, C 기는 1 내지 20개의 아미노산, 바람직하게는 1 내지 6개의 아미노산, 보다 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산을 포함한다. 아미노산(들)은 천연 및/또는 비천연 α-아미노산일 수 있다. 천연 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩된 것, 뿐만 아니라 그로부터 유래된 아미노산, 예를 들어 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 시트룰린 및 O-포스포세린이다. 용어 아미노산에는 또한 아미노산 유사체 및 모방체가 포함된다. 유사체는 R 기가 천연 아미노산 중에서 발견되는 것이 아닌 것임을 제외하고, 천연 아미노산의 동일한 일반 H2N(R)CHCO2H 구조를 갖는 화합물이다. 유사체의 예에는 호모세린, 노르류신, 메티오닌-술폭시드 및 메티오닌 메틸 술포늄이 포함된다. 아미노산 모방체는 α-아미노산의 일반 화학 구조와 다른 구조를 갖지만, 그와 유사한 방식으로 기능하는 화합물이다. 용어 "비천연 아미노산"은 "D" 입체화학적 형태를 나타내는 것으로 의도되며, 천연 아미노산은 "L" 형태를 갖는다.
바람직하게는, C 기는 프로테아제를 위한 절단 인식 서열인 아미노산 서열을 함유한다. 많은 절단 인식 서열이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Matayoshi et al., Science 247: 954 (1990)]; [Dunn et al., Meth. Enzymol. 241: 254 (1994)]; [Seidah et al., Meth. Enzymol. 244: 175 (1994)]; [Thornberry, Meth. Enzymol. 244: 615 (1994)]; [Weber et al., Meth. Enzymol. 244: 595 (1994)]; [Smith et al., Meth. Enzymol. 244: 412 (1994)]; 및 [Bouvier et al., Meth. Enzymol. 248: 614 (1995)]을 참조하고, 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
세포에 의해 내재화되는 것이 의도되지 않는 접합체의 경우, C 기가 표적 조직의 부근의 세포외 기질에 존재하는 프로테아제, 예를 들어 근처의 죽어가는 세포에 의해 방출되는 프로테아제 또는 종양 관련 프로테아제에 의해 절단되도록 이를 선택할 수 있다. 예시적인 세포외 종양 관련 프로테아제는 티메트 올리고펩티다제 (TOP) 및 CD10이다.
세포에 의해 내재화되도록 설계된 접합체의 경우, C 기는 바람직하게는 엔도좀 또는 리소좀 프로테아제, 특히 후자에 의해 절단되도록 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 그러한 프로테아제의 비제한적인 예에는 카텝신 B, C, D, H, L 및 S, 특히 카텝신 B가 포함된다. 카텝신 B는 서열 -AA2-AA1- (여기서 AA1은 염기성 또는 강력한 수소 결합 아미노산 (예컨대 리신, 아르기닌, 또는 시트룰린)이고, AA2는 소수성 아미노산 (예컨대 페닐알라닌, 발린, 알라닌, 류신 또는 이소류신)임), 예를 들어 Val-Cit (여기서 Cit은 시트룰린을 나타냄) 또는 Val-Lys에서 펩티드를 우세하게 절단한다. (본원에서, 아미노산 서열은 달리 명확하게 문맥상 언급하지 않는 한, H2N-AA2-AA1-CO2H와 같이 N-에서-C 방향으로 기재한다.) 카텝신-절단가능한 기에 관한 추가의 정보에 대해서는, 문헌 [Dubowchik et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 8, 3341-3346 (1998)]; [Dubowchik et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 8 3347-3352 (1998)]; 및 [Dubowchik et al., Bioconjugate Chem. 13, 855-869 (2002)]을 참조하고, 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
한 실시양태에서, C 기는 2개의 아미노산 서열 -AA2-AA1-을 포함하는 펩티드이며, 여기서 AA1은 리신, 아르기닌, 또는 시트룰린이고, AA2는 페닐알라닌, 발린, 알라닌, 류신 또는 이소류신이다. 또 다른 실시양태에서, C는 Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val (서열 45), Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser, 및 Glu로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 내지 5개의 아미노산 서열로 이루어진다.
단일 아미노산을 포함하는 절단가능한 C 기의 제조 및 설계에 대해서는 추가로 2008년 2월 20일자로 출원된 첸 등의 PCT 출원 번호 PCT/US2008/054362에 논의되어 있으며, 이 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
C 기는 또한 광절단가능한 것, 예를 들어 빛에 노출되었을 때 절단되는 니트로벤질 에테르일 수 있다.
C 기는 항체 Z 또는 파트너 분자 D에 직접 결합될 수 있으며; 즉, 경우에 따라 스페이서 XZ 및 XD가 존재하지 않을 수 있다. 예를 들어, C 기가 디술피드인 경우, 2개의 황 중 하나는 시스테인 잔기일 수 있거나 또는 항체 Z에 대한 대용물일 수 있다. 또는, C 기는 탄수화물 측쇄 상의 알데히드에 결합된 히드라존일 수 있다. 또는, C 기는 항체 Z의 리신 ε-아미노 기에 의해 형성된 펩티드 결합일 수 있다.
존재할 경우, 스페이서 XZ는 C 기와 항체 Z 사이에 전자가 후자에 의한 항원 결합을 입체적으로 방해하거나 또는 후자가 전자의 절단을 입체적으로 방해하지 않도록 공간적인 분리를 제공한다. 또한, 스페이서 XZ는 접합체에 증가된 용해도 또는 감소된 응집 특성을 부여하는데 사용될 수 있다. 스페이서 XZ는 하나 이상의 모듈화된 절편을 포함할 수 있으며, 이는 임의의 수의 조합으로 어셈블리될 수 있다. 스페이서 XZ에 적합한 절편의 예로는:
Figure 112011077117717-pct00009
,
Figure 112011077117717-pct00010
,
Figure 112011077117717-pct00011
, 및
Figure 112011077117717-pct00012
,
가 있으며, 여기서 아래첨자 r은 1 내지 24, 바람직하게는 2 내지 4이다. 이들 절편이 조합되어
Figure 112011077117717-pct00013
또는
Figure 112011077117717-pct00014
.
와 같은 스페이서 XZ를 만들 수 있다.
스페이서 XD는, 존재할 경우, C 기와 파트너 분자 D 사이에 후자가 전자의 절단을 입체적으로 또는 전자적으로 방해하지 않도록 공간적인 분리를 제공한다. 스페이서 XD는 또한 접합체에 부가적인 분자 질량 및 화학적 관능성이 도입되도록 작용할 수 있다. 일반적으로, 부가적인 질량 및 관능성은 혈청 반감기 및 그 밖의 접합체 특성에 영향을 미칠 것이다. 따라서, 스페이서 기의 현명한 선택을 통해 접합체의 혈청 반감기를 조정할 수 있다. 스페이서 XD는 또한 스페이서 XZ와 관련하여 상기에서 기재한 바와 같이 모듈화된 절편으로부터 조립될 수 있다.
스페이서 XZ 또는 XD 중 어느 하나, 또는 둘 모두는 자기 희생 모이어티를 포함할 수 있다. 간략하게, 자기 희생 모이어티는 (1) C 기 및 항체 Z 또는 파트너 분자 D 중 어느 하나에 결합되고 (2) C 기의 절단이 경우에 따라 자기 희생 모이어티가 항체 Z 또는 파트너 분자 D로부터 그 자신을 비결합시키는 반응 서열이 개시되도록 하는 구조를 갖는 모이어티이다. 다시 말하면, 항체 Z 또는 파트너 분자 D로부터 떨어진 부위에서의 반응 (C 기의 절단)은 또한 XZ-Z 또는 XD-D 결합이 파열되게 한다. 자기 희생 모이어티의 존재는 스페이서 XD의 경우에 바람직한데, 이는 접합체가 절단된 후 스페이서 XD 또는 그의 부분이 계속해서 파트너 분자 D에 부착된 채로 존재하는 경우, 후자의 생물학적 활성이 악화될 수 있기 때문이다. 자기 희생 모이어티의 이용은 절단가능한 기 C가 폴리펩티드인 경우에 특히 바람직하다.
파트너 분자 D 상의 히드록실 또는 아미노 기에 결합된 자기 희생 모이어티 (i)-(v)의 예를 이하에 나타낸다:
Figure 112011077117717-pct00015
각 경우에서, 자기 희생 모이어티는 점선 a 및 b 사이의 구조이고, 인접 구조적 특징은 문맥에 제공한다. 자기 희생 모이어티 (i) 및 (v)는 파트너 분자 D-NH2에 결합하는 반면 (즉, 파트너 분자 D는 아미노 기를 통해 접합됨), 자기 희생 모이어티 (ii), (iii), 및 (iv)는 파트너 분자 D-OH에 결합한다 (즉, 파트너 분자 D는 히드록실기를 통해 접합됨). 점선 b에서의 아미드 결합의 절단 (즉, C 기는 펩티드임)은 아민 질소로서 아미드 질소를 방출시켜, 경우에 따라 점선 a에서의 결합의 절단 및 파트너 분자 D-OH 또는 D-NH2의 후속 방출을 야기하는 반응 서열을 개시시킨다. 자기 희생 모이어티에 관한 추가의 개시내용은, 문헌 [Carl et al., J. Med. Chem., 24 (3), 479-480 (1981)]; [Carl et al., WO 81/01145 (1981)]; [Dubowchik et al., Pharmacology & Therapeutics, 83, 67-123 (1999)]; 파이어스톤(Firestone) 등의 US 6,214,345 B1 (2001); [Toki et al., J. Org. Chem. 67, 1866-1872 (2002)]; [Doronina et al., Nature Biotechnology 21 (7), 778-784 (2003) (erratum, p. 941)]; 보이드 등의 WO 2005/112919 (2005); 보이드 등의 WO 2007/038658 (2007); 수피 등의 WO 2008/083312 A2 (2008); 펭(Feng)의 US 7,375,078 B2 (2008); 및 센터(Senter) 등의 US 2003/0096743 A1 (2003)을 참조하고, 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
접합체의 예
본 발명의 항체 Z(SH)m (여기서 m은 1, 2, 3, 4, 또는 5임)과 함께 제조된 접합체의 예를 이하에 나타낸다. 접합체 A-1 내지 A-6 및 A-8 내지 A-15는 절단가능한 기 C가 펩티드 결합을 포함하는 접합체이다. 접합체 A-7 및 A-16은 절단가능한 기 C가 히드라존인 접합체이다. 접합체 A-17 및 A-18은 절단가능한 기 C가 디술피드인 접합체이다. 접합체 A-1 내지 A-2, A-5 내지 A-9, A-11 내지 A-14, 및 A-16에서, 파트너 분자 D는 전구약물 모이어티가 접합된 세포독소이다. 접합체 A-10, A-11, A-14, 및 A-15는 자기 희생 모이어티를 갖는 접합체이다 (접합체 A-10의 경우에는 2개). 접합체 A-1 내지 A-8 및 A-10 내지 A-18은 모듈화된 절편을 갖는 스페이서를 사용한 예이다.
Figure 112011077117717-pct00016
Figure 112011077117717-pct00017
Figure 112011077117717-pct00018
Figure 112011077117717-pct00019
Figure 112011077117717-pct00020
상기 화학식에서 존재하는 경우, Hal은 Cl 또는 Br이고, R30은 이하에 나타낸 바와 같은 카르복시에스테라제-절단가능한 카르바메이트 전구약물 기이다:
Figure 112011077117717-pct00021
.
접합체의 제조
본 발명의 접합체는 바람직하게는 먼저 파트너 분자 D 및 링커 (XZ)aC(XD)b를 연결시켜 모이어티 D-(XZ)aC(XD)b-R31 (여기서 R31은 항체 Z 상의 관능기와 반응하는데 적합한 관능기임)를 형성시켜 접합체를 형성하는 것에 의해 제조된다. 접합한 R21 기의 예에는
Figure 112011077117717-pct00022
이 포함되며, 여기서 R32는 Cl, Br, F, 메실레이트, 또는 토실레이트이고, R33은 Cl, Br, I, F, OH, -O-N-숙신이미딜, -O-(4-니트로페닐), -O-펜타플루오로페닐, 또는 -O-테트라플루오로페닐이다. 적합한 모이어티 D-(XZ)aC(XD)b-R31의 제조에 대해서는 Ng 등의 US 7,087,600 B2 (2006); Ng 등의 US 6,989,452 B2 (2006); Ng 등의 US 7,129,261 B2 (2006); Ng 등의 WO 02/096910 A1 (2002); 보이드 등의 US 2006/0024317 A1 (2006); 첸 등의 US 2006/0004081 A1 (2006); 강와르 등의 US 2006/0247295 A1 (2006); 보이드 등의 WO 2007/038658 A2 (2007); 강와르 등의 WO 2007/051081 A1 (2007); 강와르 등의 WO 2007/059404 A2 (2007); 수피 등의 WO 2008/083312 A2 (2008); 및 첸 등의 2008년 2월 20일자로 출원된 PCT 출원 번호 PCT/US2008/054362에 개시되어 있으며, 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
이하에서 나타낸 바와 같이 접합체 A-2 (여기서 Hal은 Cl임) 및 항체 Z(SH)m을 이용한 바람직한 실시양태에서 (화학식 M), R31은 말레이미드 기이고, 항체 Z 상의 관능기는 티올기이다:
Figure 112011077117717-pct00023
다음은 유리 티올 기를 항체에 도입하는 것에 기초한 예시적인 절차로, 이는 그의 리신 ε-아미노 기를 2-이미노티올란과 반응시킨 후, 약물-링커 모이어티 D-(XZ)aC(XD)b-R31 (여기서 R31은 말레이미드임)과 반응시키는 것에 의한다. 먼저 항체를 50 mM NaCl 및 2 mM DTPA를 함유하는 0.1 M 포스페이트 완충제 (pH 8.0)로 완충제 교환하고, 5-10 mg/mL로 농축시킨다. 2-이미노티올란을 항체에 첨가하는 것을 통해 티올화가 이루어진다. 첨가하는 2-이미노티올란의 양은 예비 실험에 의해 결정될 수 있고, 항체마다 다를 수 있다. 예비 실험에서, 증가량의 2-이미노티올란의 적정을 항체에 첨가한 후, 항체와 함께 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하고, 세파덱스 G-25 칼럼을 이용하여 항체를 50 mM pH 6.0 HEPES 완충제로 탈염시키고, 디티오디피리딘 (DTDP)과 반응시켜 도입된 티올 기의 수를 신속하게 결정한다. 티올기의 DTDP와의 반응은 티오피리딘을 유리시키고, 이는 324 nm에서 분광분석에 의해 모니터링할 수 있다. 전형적으로 0.5-1.0 mg/mL 단백질 농도의 샘플을 사용한다. 280 nm에서의 흡광도를 이용하여 샘플 내 단백질 농도를 정확하게 결정할 수 있고, 이어서 각 샘플의 분취액 (0.9 mL)을 0.1 mL DTDP (에탄올 중 5 mM 원액)와 함께 10 분 동안 실온에서 인큐베이션한다. 블랭크 완충제 샘플 단독 + DTDP를 또한 나란히 인큐베이션한다. 10 분 후에, 324 nm에서의 흡광도를 측정하고, 티오피리딘에 대한 소광 계수 19,800 M-1을 이용하여 티올 기의 수를 정량한다.
전형적으로 본 절차에서는 항체 당 3개의 티올 기의 티올화 수준이 요망된다. 예를 들어, 일부 항체의 경우, 이는 2-이미노티올란을 15 배 몰 과량으로 첨가한 후 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하는 것에 의해 달성될 수 있다. 이어서, 항체를 2-이미노티올란과 함께 목적하는 몰비로 인큐베이션한 다음, 접합 완충제 (5 mM 글리신 및 2 mM DTPA를 함유하는 50 mM pH 6.0 HEPES 완충제)로 탈염시킨다. 티올화 물질을 빙상에 유지시키면서 도입된 티올의 개수를 상기한 바와 같이 정량한다.
도입된 티올의 개수를 확인한 후에, 약물-링커 모이어티 D-(XZ)aC(XD)b-R31을 티올 당 3 배 몰 과량으로 첨가한다. 최종 농도의 5％ 디메틸술폭시드 (DMSO), 또는 유사한 대안 용매를 또한 함유하는 접합 완충제 중에서 접합 반응이 진행되도록 한다. 통상, 약물-링커 원액을 100％ DMSO에 용해시킨다. 원액을 티올화된 항체에 직접 첨가하여 첨가된 DMSO가 최종 농도를 10％에 이르게 하는데 충분하게 하거나, 또는 최종 농도 10％의 DMSO를 함유하는 접합 완충제 중에 사전-희석시킨 후, 동 부피의 티올화된 항체를 첨가한다.
접합 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하면서 인큐베이션한다. 인큐베이션 후에, 접합 반응 혼합물을 원심분리하고, 0.2 μm 필터를 통해 여과한다. 접합체의 정제는 많은 방법을 이용하여 크로마토그래피를 통해 달성할 수 있다. 한 방법에서, 접합체는 5 mM 글리신 및 50 mM NaCl을 함유하는 50 mM pH 7.2 HEPES 완충제로 사전 평형화시킨 세파크릴 S200 칼럼 상에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제한다. 크로마토그래피는 28 cm/h의 선형 유량으로 행한다. 접합체를 함유하는 분획을 모으고, 풀링하고, 농축시킨다. 별법적 방법에서는, 이온 교환 크로마토그래피를 통해 정제를 달성할 수 있다. 조건은 항체마다 다르며, 각 경우에서 최적화되어야 한다. 예를 들어, 항체-약물 접합체 반응 혼합물을 5 mM 글리신을 함유하는 50 mM pH 5.5 HEPES 중에 사전 평형화된 SP-세파로스 칼럼에 적용한다. 항체 접합체를 평형 완충제 중의 0-1 M NaCl 구배를 이용하여 pH 5.5에서 용출시킨다. 접합체를 함유하는 적절한 분획을 풀링하고, 제제 완충제 (5 mM 글리신 및 100 mM NaCl을 함유하는 50 mM pH 7.2 HEPES 완충제)에 대해 투석한다.
당업자는 상술한 조건 및 방법론이 예시적인 것이며 비제한적이고, 항체를 접합시키는 것에 대한 다른 접근법이 당업계에 공지되어 있으며 본 발명에서 이용가능하다는 것을 이해할 것이다.
ADEPT
또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체를 항체 지시된 효소 전구약물 요법 (ADEPT)에 사용하기 위해 효소에 접합시킨다. ADEPT에서, 효소는 그에 접합된 항체에 의해 종양 부위로 안내된다. 그 곳에서, 효소는 후속 투여된 전구약물에 작용하여 상응하는 활성 약물이 국소적으로 방출되게 한다. 예를 들어, 문헌 [Melton et al., J. Natl Cancer Inst. 88(3/4), 153-165 (1996)]을 참조한다. ADEPT에 사용하기 위해 접합될 수 있는 효소의 예로는 카르복시펩티다제 A 및 G2, 알칼리성 포스파타제, β-글루쿠로니다제, β-락타마제, β-글루코시다제, 페니실린 아미다제, 아미노펩티다제, 시토신 데아미나제 및 니트로리덕타제가 포함된다.
ADEPT가 항체로부터의 효소의 방출을 필요로 하지 않기 때문에, 항체 및 효소 사이의 절단가능한 기의 존재는 강제되지 않는다. 따라서, ADEPT 접합체는 하기 화학식 f로 표시될 수 있고,
<화학식 f>
Figure 112011077117717-pct00024
여기서 Z는 본 발명의 항체이며; D는 효소이고, X는 Z와 D를 연결하는 링커이다.
면역접합체
하나 이상의 세포독소를 포함하는 면역접합체를 "면역독소"라 지칭한다.
세포독소는 당업계에서 이용가능한 링커 기술을 이용하여 본 발명의 항체에 접합시킬 수 있다. 세포독소를 항체에 접합시키는데 사용되는 링커 유형의 예로는 히드라존, 티오에테르, 에스테르, 디술피드 및 펩티드-함유 링커가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어 리소좀 구획 내의 낮은 pH에 의한 절단에 감수성이거나 또는 프로테아제, 예를 들어 종양 조직에서 우선적으로 발현되는 프로테아제, 예를 들어 카텝신 (예를 들어, 카텝신 B, C, D)에 의한 절단에 감수성인 링커가 선택될 수 있다.
이중특이적 분자
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-CADM1 항체, 또는 그의 단편을 포함하는 이중특이적 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 다른 기능적 분자, 예를 들어, 다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 수용체에 대한 다른 항체 또는 리간드)에 유도체화되거나 연결되어, 적어도 2개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성할 수 있다. 본 발명의 항체는 실제로, 2개를 초과하는 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이적 분자를 생성하기 위하여 유도되거나 또는 하나를 초과하는 다른 기능적 분자에 연결될 수도 있고; 이런 다중특이적 분자 역시 본원에서 용어 "이중특이적 분자"에 포함되는 것으로 의도된다. 본 발명의 이중특이적 분자를 생성하기 위해, 본 발명의 항체는 하나 이상의 다른 결합 분자, 예를 들어 또 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 기능적으로 연결 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 회합 등에 의함)될 수 있어서 이중특이적 분자가 생성된다.
따라서, 본 발명은 CADM1에 대해 적어도 하나의 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대해 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 분자를 포함한다. 본 발명의 특정한 실시양태에서, 제2 표적 에피토프는 Fc 수용체, 예를 들어, 인간 FcγRI(CD64) 또는 인간 Fcα 수용체(CD89)이다. 따라서, 본 발명은 FcγR 또는 FcαR 발현 이펙터 세포 (예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 다형핵 세포 (PMN)) 및 CADM1을 발현하는 표적 세포 둘 모두에 결합할 수 있는 이중특이적 분자를 포함한다. 이들 이중특이적 분자는 CADM1 발현 세포를 이펙터 세포에 표적화하고, Fc 수용체-매개 이펙터 세포 활성, 예컨대 CADM1 발현 세포의 식세포작용, 항체 의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC), 시토카인 방출, 또는 수퍼옥시드 음이온 생성을 촉발한다.
이중특이적 분자가 다중특이적 분자인 본 발명의 한 실시양태에서, 분자는 항-Fc 결합 특이성 및 항-CADM1 결합 특이성에 더하여 제3 결합 특이성을 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 제3 결합 특이성은 항-증진 인자 (EF) 부분, 예를 들어 세포독성 활성에 관여한 표면 단백질과 결합함으로써 표적 세포에 대항한 면역 반응을 증가시키는 분자이다. "항-증진 인자 부분"은 주어진 분자, 예를 들어 항원 또는 수용체에 결합하여, Fc 수용체 또는 표적 세포 항원에 대한 결합 결정인자의 효과를 증진시키는 항체, 기능적 항체 단편 또는 리간드일 수 있다. "항-증진 인자 부분"은 Fc 수용체 또는 표적 세포 항원에 결합할 수 있다. 별법적으로, 항-증진 인자 부분은 제1 및 제2 결합 특이성 부분이 결합하는 엔티티와 상이한 엔티티에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항-증진 인자 부분은 세포독성 T-세포와 결합할 수 있다 (예를 들어, CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1, 또는 표적 세포에 대한 면역 반응을 증가시켜 주는 기타 면역 세포에 의함).
한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 분자는 결합 특이체로서 적어도 하나의 항체, 또는 그의 항체 단편을 포함하며, 이에는 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, dAb 또는 단일 쇄 Fv가 포함된다. 항체는 또한, 래드너(Ladner) 등의 미국 특허 제4,946,778호 (이의 내용은 명백하게 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같은 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 그의 임의의 최소 단편, 예컨대 Fv 또는 단일 쇄 구축물일 수도 있다.
한 실시양태에서, Fcγ 수용체에 대한 결합 특이성은 모노클로날 항체에 의해 제공되는데, 그의 결합은 인간 이뮤노글로불린 G (IgG)에 의해 차단되지 않는다. 본원에서 사용되는 용어 "IgG 수용체"는 염색체 1 상에 위치하는 8개의 γ-쇄 유전자 중 임의의 것을 지칭한다. 이들 유전자는 3 종의 Fcγ 수용체 클래스: FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)으로 분류되는 총 12 종의 막횡단 또는 가용성 수용체 이소형을 코딩한다. 한 바람직한 실시양태에서, Fcγ 수용체는 인간 고친화도 FcγRI이다. 인간 FcγRI은 단량체 IgG에 대해 고친화도를 나타내는 (108 내지 109 M-1) 72 kDa 분자이다.
특정의 바람직한 항-Fcγ 모노클로날 항체의 생산 및 특성화는 PCT 공보 WO 88/00052 및 미국 특허 제4,954,617호 (팽거(Fanger) 등)에 기재되어 있으며, 이들의 교시내용은 모두 본원에 참고로 포함된다. 이들 항체는 수용체의 Fcγ 결합 부위와 별개인 부위에서 FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII의 에피토프와 결합하므로, 이들의 결합이 IgG의 생리학적 수준에 의해 실질적으로 차단되지 않는다. 본 발명에 유용한 구체적인 항-FcγRI 항체는 mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 및 mAb 197이다. mAb 32를 생산하는 하이브리도마는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC 등록 번호 HB9469)으로부터 입수 가능하다. 다른 실시양태에서, 항-Fcγ 수용체 항체는 모노클로날 항체 22의 인간화 형태 (H22)이다. H22 항체의 생산 및 특성화는 문헌 [Graziano, R.F. et al., (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002] 및 PCT 공보 WO 94/10332 (템페스트(Tempest) 등)에 기재되어 있다. H22 항체 생산 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 명칭 HA022CL1 하에 기탁되었고, 등록 번호는 CRL 11177이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 결합 특이성은 인간 IgA 수용체, 예를 들어 Fc-알파 수용체 FcαRI (CD89)와 결합하는 항체에 의해 제공되는데, 그의 결합은 바람직하게, 인간 이뮤노글로불린 A (IgA)에 의해 차단되지 않는다. 용어 "IgA 수용체"는 염색체 19 상에 위치하는 하나의 α-유전자 (FcαRI)의 유전자 산물을 포함하도록 의도된다. 이러한 유전자는 55 내지 110 kDa의 몇 가지 별법적으로 스플라이싱된 막횡단 이소형을 코딩하는 것으로 공지되어 있다. FcαRI (CD89)은 단핵구/대식세포, 호산구성 및 호중구성 과립구 상에서 구성적으로 발현되지만, 비-이펙터 세포 집단 상에서는 그렇지 않다. FcαRI은 IgA1 및 IgA2 둘 다에 대한 중간 정도의 친화도 (약 5 x 107 M-1)를 갖고, 이는 G-CSF 또는 GM-CSF와 같은 시토카인에 대한 노출시 증가된다 (문헌 [Morton, H.C. et al., (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440]). IgA 리간드 결합 도메인 외부에서 FcαRI에 결합하는, A3, A59, A62 및 A77로 확인된 4 종의 FcαRI-특이적 모노클로날 항체가 보고되어 있다 (문헌 [Monteiro, R.C. et al., (1992) J. Immunol. 148:1764]).
FcαRI와 FcγRI는 본 발명의 이중특이적 분자에서 사용하기에 바람직한 촉발 수용체인데, 그 이유는 이들 수용체가 (1) 면역 이펙터 세포, 예를 들어 단핵구, PMN, 대식세포 및 수지상 세포에서 일차적으로 발현되고; (2) 높은 수준 (예를 들어, 세포당 5,000-100,000개)으로 발현되고; (3) 세포독성 활성 (예를 들어, ADCC, 식세포작용)의 매개자이고; (4) 그들을 표적으로 하는, 자기 항원(self-antigen)을 비롯한 항원의 강화된 항원 제시를 매개하기 때문이다.
인간 모노클로날 항체가 바람직하긴 하지만, 본 발명의 이중특이적 분자에 이용될 수 있는 기타 항체는 뮤린, 키메라 및 인간화 모노클로날 항체이다.
본 발명의 이중특이적 분자는 당업계에 공지된 방법을 이용하여, 구성성분 결합 특이체, 예를 들어 항-FcR 및 항-CADM1 결합 특이체를 접합시켜 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 분자의 각 결합 특이체를 별도로 생성시킨 후에 서로 접합시킬 수 있다. 결합 특이체가 단백질 또는 펩티드인 경우에는, 공유 접합을 위해 각종 커플링제 또는 가교제를 사용할 수 있다. 가교제의 예에는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)가 포함된다 (예를 들어, 문헌 [Karpovsky et al., (1984) J. Exp. Med. 160:1686]; [Liu, MA et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조). 다른 방법으로는, 문헌 [Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132]; [Brennan et al., (1985) Science 229:81-83], 및 [Glennie et al., (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375]에 기재된 것들이 포함된다. 바람직한 접합제는 SATA 및 술포-SMCC이며, 이들 둘 다 피어스 케미컬 코포레이션 (일리노이주 록포드 소재)으로부터 입수가능하다.
결합 특이체가 항체인 경우에는, 이들을 2개의 중쇄의 C-말단 힌지 영역을 술프히드릴 결합시킴으로써 접합시킬 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 힌지 영역은 접합 전에 홀수, 바람직하게는 1개의 술프히드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.
별법적으로, 2개의 결합 특이체 모두가 동일한 벡터에서 코딩되어 동일한 숙주 세포에서 발현 및 조립될 수 있다. 이 방법은 이중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이적 분자는 하나의 단일 쇄 항체 및 결합 결정 인자를 포함하는 단일 쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정 인자를 포함하는 단일 쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 적어도 2개의 단일 쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 분자를 제조하는 방법은 예를 들어 미국 특허 제5,260,203호; 동 제5,455,030호; 동 제4,881,175호; 동 제5,132,405호; 동 제5,091,513호; 동 제5,476,786호; 동 제5,013,653호; 동 제5,258,498호; 및 동 제5,482,858호에 기재되어 있고, 이들은 모두 명백하게 본원에 참고로 포함된다.
그의 특이적 표적에 대한 이중특이적 분자의 결합은, 예를 들어 효소 연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 방사성면역검정 (RIA), FACS 분석, 생물검정 (예를 들어 성장 억제) 또는 웨스턴 블롯 검정에 의해 확인할 수 있다. 이들 검정 각각은 일반적으로 특별히 관심있는 단백질-항체 복합체에 특이적인 표지된 시약 (예를 들어 항체)을 이용함으로써 상기 복합체의 존재를 검출한다. 예를 들어, FcR-항체 복합체는 예를 들어 항체-FcR 복합체를 인식하여 이와 특이적으로 결합하는 효소 연결된 항체 또는 항체 단편을 사용하여 검출할 수 있다. 별법적으로, 복합체는 임의의 다양한 다른 면역검정을 사용하여 검출할 수 있다. 예를 들어, 항체를 방사성 표지시킬 수 있고, 방사성면역검정 (RIA)에 사용할 수 있다 (예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986] 참조). 방사성 동위원소는 γ 계수기 또는 섬광 계수기를 사용하는 것과 같은 수단에 의해, 또는 오토라디오그래피에 의해 검출할 수 있다.
항체 단편 및 항체 모방체
본 발명은 종래의 항체로 제한되지 않고, 항체 단편 및 항체 모방체를 이용하는 것을 통해 실행될 수 있다. 이하에서 상술하는 바와 같이, 매우 다양한 항체 단편 및 항체 모방 기술이 현재 개발되어 있고, 당업계에 널리 공지되어 있다. 다수의 이러한 기술, 예컨대 도메인 항체, 나노바디, 및 유니바디가 종래의 항체 구조의 단편 또는 그에 대한 다른 변형을 이용한 것이지만, 아피바디, DARPin, 안티칼린스, 아비머 및 베르사바디와 같은 별법적 기술도 또한 존재하며, 이는 종래의 항체 결합을 모방하는 것이기는 하지만, 별개의 메카니즘으로부터 생성되어 그를 통해 기능하는 결합 구조를 이용한다.
도메인 항체 (dAb)는 항체의 가장 작은 기능적 결합 단위로, 인간 항체의 중쇄 (VH) 또는 경쇄 (VL) 중 어느 하나의 가변 영역에 상응한다. 도메인 항체는 분자량이 대략 13 kDa이다. 도만티스(Domantis)는 일련의 대형 및 매우 기능적인 완전 인간 VH 및 VL dAb 라이브러리 (각 라이브러리 내에는 100 억 초과의 상이한 서열)를 개발하였고, 이들 라이브러리는 치료 표적에 대해 특이적인 dAb를 선별하는데 사용된다. 많은 종래의 항체와 대조적으로, 도메인 항체는 박테리아, 효모, 및 포유동물 세포 시스템에서 잘 발현된다. 도메인 항체 및 그의 생산 방법에 대한 추가의 상세내용은 미국 특허 제6,291,158호; 동 제6,582,915호; 동 제6,593,081호; 동 제6,172,197호; 동 제6,696,245호; 미국 가출원 번호 2004/0110941; 유럽 특허 출원 번호 1433846 및 유럽 특허 0368684 & 0616640; WO05/035572, WO04/101790, WO04/081026, WO04/058821, WO04/003019 및 WO03/002609를 참조하여 수득할 수 있고, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
나노바디는 자연 발생 중쇄 항체의 독특한 구조와 기능적 특성을 가진 항체 유래의 치료 단백질이다. 이들 중쇄 항체는 단일 가변 도메인 (VHH) 및 2개의 불변 도메인 (CH2 및 CH3)을 함유한다. 중요한 것은, 클로닝 및 단리된 VHH 도메인은 본래의 중쇄 항체의 완전한 항원 결합능을 보유하는 완벽하게 안정한 폴리펩티드이다. 나노바디는 인간 항체의 VH 도메인과 높은 상동성을 갖고, 어떤 활성 손실도 없이 추가로 인간화될 수 있다. 중요하게는, 나노바디는 낮은 면역원성 잠재력을 가지며, 이는 나노바디 선도 화합물을 이용한 영장류 연구에서 확인되었다.
나노바디는 종래의 항체의 이점과 소분자 약물의 중요한 특성을 조합한다. 종래의 항체와 마찬가지로, 나노바디는 높은 표적 특이성, 그의 표적에 대한 고친화도, 및 낮은 고유 독성을 나타낸다. 그러나, 소분자 약물처럼 이는 효소를 억제할 수 있고, 수용체 틈에 쉽게 접근할 수 있다. 추가로, 나노바디는 극히 안정하며, 주사 이외의 수단에 의해 투여될 수 있고 (예를 들어 본원에 그 전문이 참고로 포함되는 WO 04/041867 참조), 제조가 용이하다. 나노바디의 다른 이점으로는, 그것의 크기가 작기 때문에 흔하지 않거나 숨겨진 에피토프를 인식한다는 것, 단백질 표적의 캐비티 또는 활성 부위에 고친화도로 결합한다는 것, 그의 독특한 3 차원적, 약물 포맷 가요성으로 인한 선택성, 반감기 조정 및 약물 발견의 용이성 및 신속성이 있다.
나노바디는 단일 유전자에 의해 코딩되며, 거의 모든 원핵 및 진핵 숙주, 예를 들어 이. 콜라이 (예를 들어, 본원에 그 전문이 참고로 포함되는 US 6,765,087 참조), 곰팡이 (예를 들어 아스페르길루스 또는 트리코데르마) 및 효모 (예를 들어 사카로미세스, 클루이베로미세스, 한세눌라 또는 피키아) (예를 들어, 본원에 그 전문이 참고로 포함되는 US 6,838,254 참조)에서 효율적으로 생산된다. 생산 방법은 확장가능하며, 다중 킬로그램 양의 나노바디가 생산된다. 나노바디가 종래의 항체에 비해 우수한 안정성을 나타내기 때문에, 이는 긴 반감기의 즉시 사용가능한 용액으로서 제제화될 수 있다.
나노클론 방법 (예를 들어, 본원에 그 전문이 참고로 포함되는 WO 06/079372 참조)은 B 세포의 자동화된 고-처리량 선별을 기초로 목적하는 표적에 대한 나노바디를 생성하기 위한 독점적인 방법으로, 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다.
유니바디는 또 다른 항체 단편 기술이지만; 이는 IgG4 항체의 힌지 영역의 제거를 기초로 하는 것이다. 힌지 영역의 제거는 크기가 종래의 IgG4 항체 크기의 본질적으로 1/2인 분자를 야기하고, IgG4 항체의 2가 결합 영역이 아닌 1가 결합 영역을 갖게 한다. 또한 IgG4 항체가 불활성이며, 따라서 면역계와 상호작용하지 않아 면역 반응이 바람직하지 않은 질환을 치료하는데 있어서 유익할 수 있으며, 이러한 이점은 유니바디에 해당한다는 사실이 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 유니바디는 그것이 결합하는 세포를 저해하거나 침묵시키기만, 사멸시키지는 않도록 기능할 수 있다. 또한, 종양 세포에 결합하는 유니바디는 세포가 증식하도록 자극하지 않는다. 또한, 유니바디는 크기가 종래의 IgG4 항체의 약 1/2이기 때문에, 이는 잠재적으로 유익한 효능으로 보다 큰 고형 종양 상에서 더 나은 분포를 나타낼 수 있다. 유니바디는 전체 IgG4 항체와 유사한 속도로 신체에서 소실되며, 전체 항체와 유사한 친화도로 항원에 결합할 수 있다. 유니바디에 대한 추가의 상세내용은 본원에 그 전문이 참고로 포함되는 특허 WO2007/059782를 참조하여 수득할 수 있다.
아피바디 분자는 스타필로코쿠스 단백질 A의 IgG 결합 도메인 중 하나로부터 유래된 58개의 아미노산 잔기 단백질 도메인에 기초한 친화도 단백질의 새로운 클래스를 대표한다. 이의 3개의 헬릭스 번들 도메인은 조합 파지미드 라이브러리의 구축을 위한 스캐폴드로서 이용되며, 이로부터 파지 디스플레이 기술을 이용하여 목적하는 분자를 표적으로 하는 아피바디 변이체를 선별할 수 있다 (문헌 [Nord K, Gunneriusson E, Ringdahl J, Stahl S, Uhlen M, Nygren PA, Binding Proteins selected from combinatorial libraries of an α-helical bacterial receptor domain, Nat Biotechnol 1997;15:772-7]. [Ronmark J, Gronlund H, Uhlen M, Nygren PA, Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, Eur J Biochem 2002;269:2647-55].). 저분자량 (6 kDa)을 가지면서 단순한, 탄탄한 구조의 아피바디 분자는 이를 매우 다양한 적용분야에 적합하게 하며, 예를 들어 검출 시약 (문헌 [Ronmark J, Hansson M, Nguyen T, et al., Construction and characterization of affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli, J Immunol Methods 2002;261:199-211])으로서, 그리고 수용체 상호작용을 억제하는데 (문헌 [Sandstorm K, Xu Z, Forsberg G, Nygren PA, Inhibition of the CD28-CD80 co-stimulation signal by a CD28-binding Affibody ligand developed by combinatorial protein engineering, Protein Eng 2003;16:691-7]) 적합하다. 아피바디 및 그의 생산 방법에 대한 추가의 상세내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5831012호를 참조하여 수득할 수 있다.
표지된 아피바디는 또한 풍부한 이소형을 결정하기 위한 영상 분야에 유용할 수 있다.
DARPin (디자인된 안키린 반복 단백질)은 비-항체 폴리펩티드의 결합 능력을 활용하기 위해 개발된 항체 모방체 DRP (디자인된 반복 단백질) 기술의 한 예이다. 안키린 또는 류신 풍부 반복 단백질과 같은 반복 단백질은 항체와 달리 세포내 및 세포외적으로 존재하는 편재성 결합 분자이다. 이들의 고유한 모듈 구조는 가변적 및 모듈화된 표적-결합 표면을 디스플레이하는 신장된 반복 도메인을 형성하기 위해 겹겹이 쌓여 있는 반복 구조 단위 (반복체)를 특징으로 한다. 이러한 모듈성에 기초하여, 고도로 다양해진 결합 특이성을 지닌 폴리펩티드의 조합 라이브러리를 생성시킬 수 있다. 이러한 전략에는 반복 도메인 내로의 그의 무작위 어셈블리 및 가변 표면 잔기를 디스플레이하는 자가-상용성 반복체의 컨센서스 설계가 포함된다.
DARPin은 박테리아 발현 시스템에서 매우 높은 수율로 생산될 수 있으며, 알려진 가장 안정한 단백질에 속한다. 인간 수용체, 시토카인, 키나제, 인간 프로테아제, 바이러스 및 막 단백질을 비롯한 넓은 범위의 표적 단백질에 대한 매우 특이적인 고친화도 DARPin이 선별되었다. 한 자릿수의 나노몰 내지 피코몰 범위의 친화도를 갖는 DARPin을 수득할 수 있다.
DARPin은 ELISA, 샌드위치 ELISA, 유동 세포측정 분석 (FACS), 면역조직화학 (IHC), 칩 분야, 친화성 정제 또는 웨스턴 블롯팅을 비롯한 다양한 범위의 분야에서 사용되어 왔다. DARPin은 또한 세포내 구획에서, 예를 들어 녹색 형광 단백질 (GFP)에 융합된 세포내 마커 단백질로서 매우 활성이 있는 것으로 입증되었다. DARPin은 추가로 pM 범위의 IC50으로 바이러스 진입을 억제하는 데에도 사용되었다. DARPin은 단백질-단백질 상호작용을 차단하는데 뿐만 아니라, 효소를 억제하는 데에도 이상적이다. 가장 빈번하게는 알로스테릭 억제 모드로 프로테아제, 키나제 및 수송체가 성공적으로 억제되었다. 종양에서의 매우 신속하고 특이적인 강화 및 매우 바람직한 종양 대 혈액 비는 DARPin을 생체내 진단 또는 치료적 접근법에 매우 적합하게 만든다.
DARPin 및 다른 DRP 기술에 대한 추가의 정보는 미국 특허 출원 공보 번호 2004/0132028, 및 국제 특허 출원 공보 번호 WO 02/20565에서 찾아볼 수 있으며, 이들은 둘 모두 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
안티칼린는 추가의 항체 모방 기술이지만, 이 경우 결합 특이성은 천연적으로 인간 조직 및 체액에서 풍부하게 발현되는 저분자량 단백질 패밀리인 리포칼린으로부터 유래된다. 리포칼린은 화학적으로 감수성이거나 불용성인 화합물의 생리적 수송 및 저장과 관련된 일정 범위의 생체내 기능을 수행하도록 진화되어 왔다. 리포칼린은 해당 단백질의 1개 말단에 4개의 루프를 지지시켜 주는 고도로 보존된 β-배럴을 포함하는 강건한 고유 구조를 지니고 있다. 이들 루프는 결합 포켓에 대한 입구를 형성하고, 이러한 분자 일부에서의 입체 형태적 차이는 개별 리포칼린 간의 결합 특이성 상의 변동을 설명하고 있다.
보존된 β-시트 프레임워크에 의해 지지된 초가변 루프의 전반적인 구조가 이뮤노글로불린을 연상시키긴 하지만, 리포칼린은 160개 내지 180개 아미노산의 단일 폴리펩티드 쇄로 구성되는, 크기 측면에서 항체와 상당히 상이하다 (이는 단일 이뮤노글로불린 도메인 보다 아주 조금 더 크다).
리포칼린은 클로닝되며, 그의 루프를 조작하여 안티칼린를 제작할 수 있다. 구조적으로 다양한 안티칼린의 라이브러리가 생성되었고, 안티칼린 디스플레이는 결합 기능의 선별 및 스크리닝에 이어 원핵 또는 진핵 시스템에서의 추가 분석을 위한 가용성 단백질의 발현 및 생성을 가능하게 한다. 연구 결과, 실질적으로 임의의 인간 표적 단백질에 특이적인 안티칼린을 개발 및 단리할 수 있고, 나노몰 이상의 범위의 결합 친화도를 수득할 수 있는 것으로 성공적으로 입증되었다.
안티칼린은 또한 이중 표적화 단백질, 소위 듀오칼린으로 포맷될 수 있다. 듀오칼린은 그의 2개의 결합 도메인의 구조적 배향에 관계없이 표적 특이성 및 친화성을 보유하면서 누구든 표준 제조 방법을 이용하여 쉽게 생산하는 단량체 단백질 내의 2개의 별개의 치료 표적에 결합한다.
단일 분자를 통한 다중 표적의 조절은 하나를 초과한 원인 인자가 관련된 공지의 질환에 있어서 특히 유익하다. 게다가, 듀오칼린과 같은 2가 또는 다가 결합 포맷은 질환에서 세포 표면 분자를 표적화하거나, 신호 전달 경로에 대해 효능작용 효과를 매개하거나, 또는 세포 표면 수용체의 결합 및 클러스터링을 통한 증가된 내재화 효과를 유도하는데 있어서 상당한 잠재력을 갖는다. 또한, 듀오칼린의 높은 고유의 안정성은 단량체 안티칼린과 유사하여, 듀오칼린에 대해 탄력적 제제 및 전달 잠재력을 부여한다.
안티칼린에 관한 추가의 정보는 미국 특허 제7,250,297호 및 국제 특허 출원 공보 번호 WO 99/16873에서 찾아볼 수 있으며, 이들은 둘 모두 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 발명과 관련하여 유용한 또 다른 항체 모방 기술은 아비머이다. 아비머는 시험관내 엑손 셔플링(exon shuffling) 및 파지 디스플레이에 의해 인간 세포외 수용체 도메인 거대 패밀리로부터 진화되는데, 이로써 결합성과 억제성을 지닌 멀티도메인 단백질이 생성된다. 다수의 독립적인 결합 도메인을 연결시키는 것이 결합력을 창출시키고, 통상적인 단일-에피토프 결합 단백질과 비교해서 친화성 및 특이성을 개선시키는 것으로 밝혀졌다. 기타 잠재적 이점으로 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 내에서 다중 표적-특이적 분자가 단순하고도 효율적으로 생성되고, 열안정성이 개선되며 프로테아제에 대한 내성이 있다는 것이다. 각종 표적에 대하여 친화도가 나노몰 이하인 아비머가 수득되었다.
아비머에 관한 추가의 정보는 미국 특허 출원 공보 번호 2006/0286603, 2006/0234299, 2006/0223114, 2006/0177831, 2006/0008844, 2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0089932, 2005/0053973, 2005/0048512, 2004/0175756에서 찾아볼 수 있으며, 이들은 모두 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
베르사바디 (Versabody)는 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 또 다른 항체 모방 기술이다. 베르사바디는 전형적인 단백질이 갖고 있는 소수성 코어를 대체하는 높은 디술피드 밀도 스캐폴드를 형성하는, 시스테인 함량이 15％ 초과인 3 내지 5 kDa의 소형 단백질이다. 소수성 코어를 포함하는 다수의 소수성 아미노산을 소수의 디술피드로 대체하는 것에 의해, 보다 작고, 보다 친수성이며 (덜 응집되고 특이적 결합이 덜하며), 프로테아제 및 열에 대한 내성이 더 크고, 보다 저 밀도의 T-세포 에피토프를 갖는 단백질이 생성되는데, 이는 MHC 제시에 가장 기여하는 잔기가 소수성이기 때문이다. 모든 4 가지의 이들 특성은 면역원성에 영향을 미치는 것으로 널리 공지되어 있고, 이들 특성은 함께 면역원성에 있어서 상당한 저하를 유발시킬 것으로 예상된다.
베르사바디에 대한 영감은 뜻밖의 낮은 면역원성을 나타내는 것으로 알려져 있는 거머리, 뱀, 거미, 전갈, 달팽이, 및 아네모네에 의해 생산되는 천연의 주사가능한 생물약제로부터 유래되었다. 선별된 천연 단백질 패밀리로부터 시작하여, 설계하고 크기, 소수성, 단백질분해 항원 프로세싱, 및 에피토프 밀도를 스크리닝하는 것에 의해, 천연의 주사가능한 단백질의 평균보다 훨씬 낮은 수준으로 최소화시켰다.
베르사바디의 구조가 주어지면, 이들 항체 모방체는 다가, 다특이성, 반감기 메카니즘의 다양성, 조직 표적화 모듈 및 항체 Fc 영역의 부재를 포함하는 다양한 포맷을 제공한다. 더우기, 베르사바디는 이. 콜라이에서 고 수율로 제조되고, 친수성이고 크기가 작기 때문에, 베르사바디는 고도로 가용성이며, 고 농도로 제제화될 수 있다. 베르사바디는 유난히 열 안정적이고 (비등이 가능함) 연장된 저장 수명을 제공한다.
베르사바디에 관한 추가의 정보는 미국 특허 출원 공보 번호 2007/0191272에서 찾아볼 수 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
상기에서 제공한 항체 단편 및 항체 모방 기술의 상세한 설명은 본 명세서에서 사용될 수 있는 모든 기술을 종합한 목록인 것으로 의도되지 않는다. 예를 들어, 그리고 또한 제한없이, 별법적인 폴리펩티드-기반 기술, 예컨대 문헌 [Qui et al., Nature Biotechnology, 25(8) 921-929 (2007)] (이는 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 개략된 바와 같은 상보성 결정 영역의 융합, 뿐만 아니라 핵산-기반 기술, 예컨대 미국 특허 제5,789,157호, 동 제5,864,026호, 동 제5,712,375호, 동 제5,763,566호, 동 제6,013,443호, 동 제6,376,474호, 동 제6,613,526호, 동 제6,114,120호, 동 제6,261,774호, 및 동 제6,387,620호 (이들은 모두 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 RNA 압타머 기술을 비롯한 다양한 추가의 기술을 본 발명과 관련하여 사용할 수 있다.
제약 조성물
또 다른 측면에서, 본 발명에서는 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된, 본 발명의 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 부위(들) 중 하나 또는 이들의 조합물을 함유하는 조성물, 예를 들어 제약 조성물을 제공한다. 그러한 조성물은 본 발명의 (예를 들어, 2개 이상의 상이한) 항체, 또는 면역접합체 또는 이중특이적 분자 중 하나 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제약학적 조성물은 표적 항원 상에서 상이한 에피토프에 결합하거나, 또는 상보적 활성을 갖는 항체 (또는 면역접합체 또는 이중특이체)의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 조합 요법으로, 즉 다른 작용제와 조합되어 투여될 수 있다. 예를 들어, 이러한 조합 요법은 적어도 하나의 다른 소염제 또는 면역억제제와 조합된 본 발명의 항-CADM1 항체를 포함할 수 있다. 조합 요법에 사용할 수 있는 치료제의 예는 본 발명의 항체의 용도에 대한 아래 섹션에서 보다 상세히 설명한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "제약상 허용되는 담체"는 생리적으로 상용가능한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의함)에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 항체, 면역접합체, 또는 이중특이적 분자는 상기 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산과 다른 자연 조건의 작용으로부터 상기 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.
본 발명의 제약 화합물은 하나 이상의 제약상 허용되는 염을 포함할 수 있다. "제약상 허용되는 염"은 모 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 보유하고 있고 바람직하지 않은 어떤 독성학적 효과도 제공하지 않는 염을 지칭한다 (예를 들어, 문헌 [Berge, S.M., et al., (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19] 참조). 이러한 염의 예는 산 부가염 및 염기 부가염을 포함한다. 산 부가염은 비독성 무기 산, 예컨대 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등, 및 또한 비독성 유기 산, 예컨대 지방족 모노- 및 디카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부터 유래된 것을 포함한다. 염기 부가염은 알칼리성 토금속, 예컨대 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등 및 또한 비독성 유기 아민, 예컨대 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래된 것을 포함한다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 제약상 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 항산화제의 예에는 (1) 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 유용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예컨대 구연산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등이 포함된다.
본 발명의 제약 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어 코팅 물질, 예컨대 레시틴의 사용, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용으로 유지될 수 있다.
이들 조성물은 또한 아주반트, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물 존재의 방지는 상기한 멸균 절차 및 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 도입 둘 다에 의해 보장될 수 있다. 또한, 등장화제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직할 수도 있다. 추가로, 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 주사가능한 제약 형태의 흡수를 연장시킬 수 있다.
제약상 허용되는 담체는 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고는, 본 발명의 제약 조성물에서 이들을 사용하는 것이 고려된다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
치료 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건하에 멸균이고 안정적이어야 한다. 조성물은 용액제, 마이크로에멀젼제, 리포좀제, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제제화될 수 있다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 코팅제, 예컨대 레시틴의 사용, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용으로 유지될 수 있다. 많은 경우에서 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물을 장기간 흡수시키는 것은 조성물에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 수행할 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 필요량의 활성 화합물을 필요에 따라 상기 기재된 성분들 중 하나 또는 이들의 조합물과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후에 멸균 마이크로여과를 수행하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것 중의 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내에 혼입시켜 제조한다. 멸균 주사가능한 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 냉동 건조 (동결건조)인데, 이로써 앞서 멸균-여과시킨 그의 용액으로부터 부가의 목적 성분이 활성 성분에 부가된 분말이 생성된다.
담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 치료받는 대상체, 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 나타내는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로 100％를 기준으로, 그 양은 제약상 허용되는 담체와 조합되어 약 0.01％ 내지 약 99％ 활성 성분, 바람직하게 약 0.1％ 내지 약 70％, 가장 바람직하게 약 1％ 내지 약 30％ 활성 성분의 범위일 것이다.
투여 요법은 목적하는 최적의 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수도 있고, 여러 분할 용량이 시간 경과에 따라 투여될 수도 있고, 또는 용량이 치료 상황의 긴급성에 따라 정해지는 바에 비례하여 감소 또는 증가될 수 있다. 비경구 조성물을 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 투여 단위 형태는 치료할 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고, 각 단위는 요구되는 제약 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 제공하도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 관한 상세사항은 (a) 활성 화합물의 고유한 특징 및 달성하고자 하는 특별한 치료 효과, 및 (b) 개체에서 감수성 치료를 위해 상기 활성 화합물을 배합하는 분야에 존재하는 제한 사항에 의해 지시되고 이에 직접적으로 좌우된다.
항체의 투여에 대해, 투여량은 숙주 체중을 기준으로 약 0.0001 내지 100 ㎎/kg, 보다 통상적으로는 0.01 내지 5 ㎎/kg 범위이다. 예를 들어, 투여량은 0.3 mg/kg 체중, 1 mg/kg 체중, 3 mg/kg 체중, 5 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중일 수도 있고, 또는 1 내지 10 mg/kg의 범위 이내일 수도 있다. 예시적인 치료법은 1주 1회 투여, 2주 당 1회 투여, 3주 당 1회 투여, 4주 당 1회 투여, 1개월 당 1회 투여, 3개월 당 1회 투여, 또는 3개월 내지 6개월 당 1회 투여를 포함한다. 본 발명의 항-CADM1 항체에 대한 바람직한 투여 요법은 정맥내 투여를 통해 1 mg/kg 체중 또는 3 mg/kg 체중으로 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항체는 다음 투여 스케줄 중 하나를 이용하여 제공된다: (i) 6회 용량에 대해 4주마다, 이어서 3개월마다; (ii) 3주마다; (iii) 3 mg/kg 체중으로 1회, 이어서 3주마다 1 mg/kg 체중.
일부 방법에서, 결합 특이성이 상이한 2가지 이상의 모노클로날 항체가 동시에 투여되고, 이러한 경우 투여되는 각각의 항체의 투여량은 지시된 범위 내에 속한다. 항체는 일반적으로 여러회 투여된다. 단일 투여량들 사이의 간격은, 예를 들어 1주일, 1개월, 3개월 또는 1년일 수 있다. 또한, 환자에서 표적 항원에 대한 항체의 혈중 농도를 측정함으로써 지시되는 바와 같이 간격이 불규칙적일 수 있다. 일부 방법에서, 투여량은 약 1-1000 ㎍/ml, 일부 방법에서는 약 25-300 ㎍/ml의 혈장 항체 농도를 달성하도록 조정된다.
별법적으로, 빈도를 덜하게 하여 투여하는 것이 요구되는 경우에는 항체를 지속 방출 제제로서 투여할 수 있다. 투여량 및 빈도는 환자에서의 항체의 반감기에 따라서 달라진다. 일반적으로, 인간 항체가 가장 긴 반감기를 나타내고, 그 다음으로 인간화 항체, 키메라 항체 및 비인간 항체 순이다. 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방을 위한 것인지 치료를 위한 것인지의 여부에 따라 달라질 수 있다. 예방을 위해 적용하는 경우에는 비교적 낮은 투여량이 비교적 빈번하지 않은 간격으로 장기간의 시간에 걸쳐 투여된다. 일부 환자는 그의 나머지 일생 동안 계속 처치를 받는다. 치료 용도에서는, 때때로 질환의 진행이 감소되거나 종결될 때까지, 바람직하게는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 완화를 보일 때까지 상대적으로 짧은 간격의 상대적으로 높은 투여량이 요구된다. 그 후, 환자에게 예방적 요법제를 투여할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이 없으면서 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양이 달성되도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정 조성물 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 처치 기간, 사용되는 특정 조성물과 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 처치를 받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전의 의학적 병력 및 의학 분야에 널리 공지된 유사 인자를 포함하는 다양한 약동학 인자에 따라 달라될 것이다.
본 발명의 항-CADM1 항체의 "치료 유효 투여량"은 질환 증상의 중증도를 감소시키거나, 질환 증상이 없는 기간의 빈도와 지속 기간을 증가시키거나, 또는 질환 고통으로 인한 장애 또는 무능력을 방지한다. 예를 들어, CADM1+ 종양의 치료의 경우, "치료 유효 투여량"은 세포 성장 또는 종양 성장을 치료되지 않은 대상에 비해 바람직하게는 적어도 약 20％ 만큼, 보다 바람직하게는 적어도 약 40％ 만큼, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 60％ 만큼, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 80％ 만큼 억제한다. 종양 성장을 억제하는 화합물의 능력을 인간 종양에서의 효능을 예보하는 동물 모델 시스템에서 평가할 수 있다. 별법적으로, 조성물의 이러한 특성은 세포 성장을 저해하는 화합물의 능력을 조사함으로써 평가될 수 있고, 이런 저해는 숙련된 진료의에게 공지된 검정에 의해 시험관내에서 측정될 수 있다. 치료 화합물의 치료 유효량은 대상체에게서 종양 크기를 감소시키거나 또는 증상을 완화시킬 수 있다. 당업자는 대상체의 크기, 대상체의 증상의 중증도, 및 선택된 특정 조성물 또는 투여 경로와 같은 인자에 기초하여 치료 유효량을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법 중에서 한 가지 이상을 이용하여 한 가지 이상의 투여 경로를 통하여 투여될 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 투여 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 항체에 대한 바람직한 투여 경로에는 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척수 또는 기타 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입 경로가 포함된다. 본원에서 사용된 바와 같은 어구 "비경구 투여"는 대체로 주사에 의한, 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 비제한적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
별법적으로, 본 발명의 항체는 비-비경구 경로, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어 비강내, 경구, 질, 직장, 설하 또는 국소 투여될 수 있다.
활성 화합물은 예를 들어 제어 방출 제제, 예컨대 이식물, 경피 패치, 및 미세캡슐화 전달 시스템과 같이 급속 방출에 대해 화합물을 보호하는 담체와 함께 제조될 수 있다. 생분해성의 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제의 제조를 위한 많은 방법이 특허를 받았거나 또는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc, New York, 1978]을 참조한다.
치료 조성물은 당업계에 공지된 의료 장치를 이용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 치료 조성물은 바늘 없는 피하 주사 장치, 예컨대 미국 특허 제5,399,163호; 동 제5,383,851호; 동 제5,312,335호; 동 제5,064,413호; 동 제4,941,880호; 동 제4,790,824호; 또는 동 제4,596,556호에 개시된 장치로 투여될 수 있다. 본 발명에 유용한 널리 공지된 이식물 및 모듈의 예에는 미국 특허 제4,487,603호에 개시된, 제어된 속도로 약제를 분배하기 위한 이식가능 마이크로-주입 펌프; 미국 특허 제4,486,194호에 개시된, 피부를 통하여 약제를 투여하기 위한 치료 장치; 미국 특허 제4,447,233호에 개시된, 정확한 주입 속도로 약제를 전달하기 위한 약제 주입 펌프; 미국 특허 제4,447,224호에 개시된, 연속 약물 전달을 위한 가변 유동 이식가능 주입 기구; 미국 특허 제4,439,196호에 개시된, 멀티-챔버 구획을 보유하는 삼투성 약물 전달 시스템; 및 미국 특허 제4,475,196호에 개시된, 삼투성 약물 전달 시스템이 포함된다. 이들 특허는 본원에 참고로 포함된다. 많은 다른 이러한 이식물, 전달 시스템 및 모듈이 당업자에게 공지되어 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 생체 내에서 적합한 분포를 보장하기 위해 제제화될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 고도로 친수성인 많은 화합물을 배제시킨다. 본 발명의 치료 화합물이 (목적하는 경우) BBB를 확실히 횡단하도록 하기 위해서는, 이들을 예를 들어 리포좀 내에 제제화할 수 있다. 리포좀의 제조 방법에 대해서는 예를 들어 미국 특허 4,522,811; 5,374,548; 및 5,399,331을 참조한다. 리포좀은 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있으며, 이는 특이적 세포 또는 기관 내로 선택적으로 수송되어 표적화 약물 전달을 증강시킨다 (예를 들어, 문헌 [V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685] 참조). 예시적인 표적화 모이어티로는 폴레이트 또는 비오틴 (예를 들어, 미국 특허 5,416,016 (로우(Low) 등) 참조); 만노시드 (문헌 [Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038]); 항체 (문헌 [P.G. Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357:140]; [M. Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180]); 계면활성제 단백질 A 수용체 (문헌 [Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233:134)]; p120 (문헌 [Schreier et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:9090])이 포함되며, 또한 문헌 [K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123]; [J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273]을 참조한다.
용도 및 방법
본 발명의 항체, 특히 인간 항체, 항체 조성물 및 방법은 CADM1 매개된 장애의 진단과 치료를 수반하는 다수의 시험관내 및 생체내 진단과 치료 효용을 갖는다. 예를 들어, 이들 분자를 배양 중인 세포에 시험관내 또는 생체외 투여하거나, 또는 인간 대상체에, 예를 들어 생체내 투여하여 각종 장애를 치료, 예방 또는 진단할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "대상체"는 인간 및 비인간 동물을 포함하는 것으로 의도된다. 비인간 동물은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류 및 파충류를 포함한다. 바람직한 대상체에는 CADM1 활성에 의해 매개되는 장애를 갖는 인간 환자가 포함된다. 방법은 비정상적인 CADM1 발현과 관련된 장애를 갖는 인간 환자를 치료하는데 특히 적합하다. CADM1에 대한 항체를 또 다른 작용제와 함께 투여할 경우, 이들 둘은 어느 각각의 순서로 또는 동시에 투여될 수 있다.
CADM1에 대한 본 발명의 항체의 특이적인 결합을 고려할 때, 본 발명의 항체는 세포의 표면 상에서 CADM1 발현을 특이적으로 검출하는데 이용될 수 있고, 또한 면역친화성 정제를 통하여 CADM1을 정제하는데 이용될 수 있다.
또한, 다양한 종양 세포 상에서의 CADM1의 발현을 고려할 때, 본 발명의 인간 항체, 항체 조성물 및 방법은 종양형성 장애, 예를 들어 CADM1을 발현하는 종양 세포의 존재를 특징으로 하는 장애, 예를 들어 소세포 폐암, 성인 T-세포 백혈병, 신경내분비 암 (폐, 부신, 뇌하수체, GI관, 신장, 간 (간세포 암종 포함), 췌장 (인슐린종 및 글루카곤종 포함)의 신경내분비 암 포함), 교모세포종, 및 카르시노이드 종양 (췌장, 폐, GI관, 간, 또는 신장의 카르시노이드 종양 포함)을 갖는 대상체를 치료하는데 이용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체 (예를 들어, 인간 모노클로날 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자 및 조성물)는 CADM1의 수준, 또는 막 표면 상에 CADM1을 함유하는 세포의 수준을 검출하는데 이용될 수 있으며, 이들 수준은 이어서 특정 질환 증상과 연결될 수 있다. 별법적으로, 항체는 CADM1 기능을 억제 또는 차단하는데 사용될 수 있고, 차례로 이는 특정 질환 증상의 방지 또는 완화에 연결될 수 있어, CADM1이 질환의 매개자임을 확인시켜줄 수 있다. 이는, 샘플 및 대조군 샘플을 항-CADM1 항체와, 항체 및 CADM1 사이에 복합체가 형성되게 하는 조건 하에서 접촉시킴으로써 달성할 수 있다. 항체와 CADM1 사이에 형성된 임의의 복합체는 샘플 및 대조군에서 검출되고 비교된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 조성물)는 처음에 시험관 내에서 치료 또는 진단 용도와 연관된 결합 활성에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 아래 실시예에서 설명되는 유동 세포측정 검정을 사용하여 시험할 수 있다.
본 발명의 항체 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자, 면역접합체 및 조성물)는 CADM1 관련 질환의 요법 및 진단에서 추가의 유용성을 갖는다. 예를 들어, 인간 모노클로날 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자 및 면역접합체는 생체내 또는 시험관내에서 하기의 생물학적 활성들 중 하나 이상을 유도하는데 사용될 수 있다: CADM1을 발현하는 세포의 성장을 억제하고/하거나 이러한 세포를 사멸시키는 것; 인간 이펙터 세포의 존재 하에 CADM1을 발현하는 세포의 식세포작용 또는 ADCC를 매개하는 것, 또는 CADM1에 대한 CADM1 리간드의 결합을 차단하는 것.
특정한 실시양태에서, 항체 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 조성물)는 다양한 CADM1 관련 질환을 치료 또는 예방하거나 진단하기 위해 생체 내에서 이용된다. CADM1 관련 질환의 예에는, 특히 소세포 폐암, 신경내분비 췌장암, 간암, 폐 카르시노이드 및 위장 카르시노이드를 나타내는 인간 암 조직이 포함된다.
본 발명의 항체 조성물 (예를 들어, 인간 모노클로날 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 면역접합체)을 생체 내 및 시험관 내에서 투여하는 적합한 경로는 당업계에 널리 공지되어 있고, 당업자가 선택할 수 있다. 예를 들어, 항체 조성물은 주사 (예를 들어, 정맥내 또는 피하)에 의해 투여될 수 있다. 사용된 분자의 적합한 투여량은 대상체의 연령 및 체중 및 항체 조성물의 농도 및/또는 제제에 따라 결정될 것이다.
앞서 기재한 바와 같이, 본 발명의 인간 항-CADM1 항체는 하나 이상의 다른 치료제, 예를 들어, 세포독성제, 방사성 독성제 또는 면역억제제와 동시-투여될 수 있다. 항체는 상기 작용제에 연결될 수 있거나 (면역복합체로서), 상기 작용제와 별도로 투여될 수 있다. 후자의 경우에 (별개의 투여), 항체는 상기 작용제의 투여 전에, 후에 또는 상기 작용제와 동시에 투여될 수 있거나, 다른 공지의 요법, 예를 들어 항암 요법, 예를 들어 방사선 조사와 동시-투여될 수 있다. 이같은 치료제에는 특히 그 자체로는 환자에게 독성 또는 준독성인 수준에서만 효과적인 항신생물제, 예컨대 독소루비신 (아드리아마이신), 시스플라틴 블레오마이신 술페이트, 카르무스틴, 클로람부실, 및 시클로포스파미드 히드록시우레아가 포함된다. 시스플라틴은 100 mg/kg 용량을 4주 마다 1회씩 정맥내 투여하고, 아드리아마이신은 60 내지 75 mg/ml 용량을 21일마다 1회씩 정맥내 투여한다. 화학치료제와 본 발명의 인간 항-CADM1 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 동시 투여는 인간 종양 세포에 세포독성 효과를 일으키는 상이한 메카니즘을 통해 작용하는 2가지 항암제를 제공한다. 이러한 동시-투여는 항체에 비반응성이 되도록 할 약물에 대한 내성의 발생 또는 종양 세포의 항원성의 변화로 인한 문제를 해결할 수 있다.
표적-특이적 이펙터 세포, 예를 들어, 본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)에 연결된 이펙터 세포가 또한 치료제로서 사용될 수 있다. 표적화를 위한 이펙터 세포는 인간 백혈구, 예를 들어 대식세포, 호중구 또는 단핵구일 수 있다. 다른 세포로는 호산구, 천연 킬러 세포 및 다른 IgG- 또는 IgA-수용체 보유 세포가 포함된다. 원하는 경우에, 이펙터 세포는 치료하려는 대상으로부터 수득할 수 있다. 표적-특이적 이펙터 세포는 생리학상 허용되는 용액 중의 세포 현탁액으로서 투여될 수 있다. 투여되는 세포의 수는 약 108-109 일 수 있지만, 치료 목적에 따라 변할 것이다. 일반적으로, 그러한 양은 표적 세포, 예를 들어 CADM1을 발현하는 종양 세포에 국지화시키고, 예를 들어 식세포작용에 의한 세포 사멸에 영향을 미치는데 충분할 것이다. 투여 경로는 또한 달라질 수 있다.
표적-특이적 이펙터 세포를 사용하는 요법은 표적화된 세포의 제거를 위한 다른 기술과 함께 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자) 및/또는 이들 조성물로 보강된 이펙터 세포를 사용하는 항-종양 요법은 화학요법과 함께 사용될 수 있다. 추가로, 2 가지 별개의 세포독성 이펙터 집단을 종양 세포 거부반응과 맞서게 하는데 조합 면역요법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-Fc-감마 RI 또는 항-CD3에 연결된 항-CADM1 항체는 IgG- 또는 IgA-수용체 특이적 결합제와 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 또한 예를 들어, 세포 표면 상의 수용체를 캐핑(capping)하고 제거함으로써 이펙터 세포에 대한 FcγR 또는 FcγR 수준을 조정하기 위해 사용될 수 있다. 항-Fc 수용체의 혼합물이 또한 상기 목적을 위해 사용될 수 있다.
보체 결합 부위, 예를 들어 보체에 결합하는 IgG1, -2, 또는 -3 또는 IgM으로부터 부분을 포함하는 본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간, 인간화, 또는 키메라 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자와 면역접합체)은 보체의 존재하에서도 이용될 수 있다. 한 실시양태에서는, 표적 세포를 포함하는 세포 집단을 본 발명의 결합제 및 적당한 이펙터 세포를 이용하여 생체외 처리하는 것은 보체 또는 보체 함유 혈청을 부가함으로써 보충시킬 수 있다. 본 발명의 결합제로 코팅시킨 표적 세포의 식세포작용은 보체 단백잴의 결합에 의해 개선될 수 있다. 또 다른 실시양태에서는, 본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)로 코팅된 표적 세포를 보체에 의해 용해시킬 수도 있다. 또 다른 실시양태에서는, 본 발명의 조성물이 보체를 활성화시키지 못한다.
본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간, 인간화, 또는 키메라 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자와 면역접합체)은 또한, 보체와 함께 투여될 수도 있다. 특정 실시양태에서, 본원은 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자 및 혈청 또는 보체를 포함하는 조성물을 제공한다. 이들 조성물은 보체가 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자에 아주 근접하여 위치하는 경우에 유리할 수 있다. 별법적으로, 본 발명의 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자 및 보체 또는 혈청을 개별적으로 투여할 수 있다.
본 발명의 항체 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 이중특이적 또는 다중특이적 분자, 또는 면역접합체) 및 사용 지침서를 포함하는 키트가 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 이러한 키트는 한 가지 이상의 부가 시약, 예컨대 면역억제 시약, 세포독성제 또는 방사성독성제, 또는 본 발명의 한 가지 이상의 부가 항체 (예를 들어, 제1 인간 항체와 별개로 CADM1 항원 내의 에피토프와 결합하는 상보성 활성을 지닌 인간 항체)를 추가로 함유할 수 있다.
따라서 본 발명의 항체 조성물로 치료되는 환자는 본 발명의 인간 항체의 치료 효과를 향상 또는 증강시키는 다른 치료제, 예컨대 세포독성제 또는 방사성독성제 (본 발명의 인간 항체의 투여 이전에, 투여와 동시에, 또는 투여 이후에)가 부가적으로 투여될 수 있다.
다른 실시양태에서는, 예를 들어 대상체를 시토카인으로 치료함으로써, Fcγ 또는 Fcγ 수용체의 발현 또는 활성을 조정하는, 예를 들어 증강시키거나 억제시키는 작용제로 부가적으로 치료할 수 있다. 다중특이적 분자를 이용하여 치료하는 동안에 투여하기 바람직한 시토카인에는 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 인터페론-γ (IFN-γ), 및 종양 괴사 인자 (TNF)가 포함된다.
또한, 본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 분자 및 이중특이적 분자)은 예를 들어 FcγR 또는 CADM1을 발현하는 표적 세포를 표지하기 위하여, 이들 세포를 표적화하는데 이용될 수 있다. 이와 같이 사용하기 위해서는, 검출될 수 있는 분자에 결합제를 연결시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 Fc 수용체, 예컨대 FcγR, 또는 CADM1을 발현하는 세포를 생체외 또는 시험관 내에서 국소화시키는 방법을 제공한다. 검출 가능한 표지는, 예를 들어 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소, 또는 효소 보조인자일 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 샘플 내에서 CADM1 항원의 존재를 검출하거나, 또는 CADM1 항원의 양을 측정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 항체 또는 그의 일부 및 CADM1 사이에 복합체가 형성되게 하는 조건 하에서, 샘플 및 대조 샘플을 CADM1에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 부분과 접촉시키는 단계를 포함한다. 이어서, 복합체 형성이 검출되고, 여기서 대조 샘플에 비해 샘플 사이의 복합체 형성 차이는 샘플 내에 CADM1 항원의 존재를 나타낸다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 CADM1 매개 장애, 예를 들어 소세포 폐암, 신경내분비 암 (폐, 부신, 뇌하수체, GI관, 신장, 간, 췌장 (인슐린종 및 글루카곤종 포함)의 신경내분비 암 포함), 및 카르시노이드 종양 (췌장, 폐, GI관, 간, 또는 신장의 카르시노이드 종양 포함)을 비롯한 인간 암을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 면역접합체는 화합물 (예를 들어, 치료제, 표지, 세포독소, 방사성독소, 면역억제제 등)을 항체에 연결함으로써, CADM1 세포 표면 수용체를 갖는 세포로 이들 화합물을 표적화시키는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 항-CADM1 항체는 미국 특허 제6,281,354호 및 동 제6,548,530호, 미국 특허 공보 번호 20030050331, 20030064984, 20030073852, 및 20040087497에 기재되거나, 또는 WO 03/022806에 공개된 임의의 독소 화합물에 접합될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 CADM1을 발현하는 세포를 (예를 들어, 검출가능한 표지, 예컨대 방사성동위원소, 형광 화합물, 효소, 또는 효소 보조인자로) 생체외 또는 생체내에서 국소화하는 방법을 또한 제공한다. 별법적으로, 면역접합체는 CADM1에 세포독소 또는 방사성독소를 표적화함으로써 CADM1 세포 표면 수용체를 갖는 세포를 사멸시키는데 이용될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 추가의 제한으로 해석되지 않아야 한다. 본 명세서 전반에 걸쳐 인용된 모든 도면 및 참고 문헌, 특허 및 공개 특허 출원의 내용은 본원에 명백히 참고로 포함된다.
실시예
실시예 1: CADM1 항원에 대한 인간 모노클로날 항체의 생성
비-CADM1 폴리펩티드 (his 단백질)에 연결된 CADM1의 세포외 도메인 (CADM1 ECD) (서열 44)으로 구성된 재조합 융합 단백질을 표준 재조합 방법으로 생성하였고, 이를 면역화를 위한 항원으로서 사용하였다 (하기 참조).
트랜스제닉 HuMAb 마우스 ® 및 KM 마우스 ® 계통
각각 인간 항체 유전자를 발현하는 트랜스제닉 HuMAb 마우스®의 HCo7 및 HCo27 계통 및 트랜스제닉 트랜스크로모조믹 마우스의 KM 계통을 이용하여 CADM1에 대한 완전 인간 모노클로날 항체를 제조하였다. 각각의 이들 마우스 계통에서, 내인성 마우스 카파 경쇄 유전자는 문헌 [Chen et al., (1993) EMBO J. 12:811-820]에 기재되어 있는 바와 같이 동형접합 방식으로 교란되어 있고, 내인성 마우스 중쇄 유전자는 PCT 공보 WO 01/09187의 실시예 1에 기재되어 있는 바와 같이 동형접합 방식으로 교란되어 있다. 각각의 이들 마우스 계통은 문헌 [Fishwild et al., (1996) Nature Biotechnology 14:845-851]에 기재되어 있는 바와 같은 인간 카파 경쇄 트랜스진, KCo5를 보유한다. HCo7 계통은 미국 특허 제5,545,806호; 동 제5,625,825호; 및 동 제5,545,807호에 기재되어 있는 바와 같은 HCo7 인간 중쇄 트랜스진을 보유한다. HCo27 계통은 PCT 공보 WO 01/09187에 기재되어 있는 바와 같은 HCo27 인간 중쇄 트랜스진을 보유한다. KM 마우스® 계통은 PCT 공보 WO 02/43478에 기재되어 있는 바와 같은 SC20 트랜스크로모좀을 함유한다.
HuMab 및 KM 면역화
CADM1에 대한 완전 인간 모노클로날 항체를 생성하기 위해, HCo7, HCo27 및 KM 마우스 계통의 HuMab 마우스를 정제된 재조합 CADM1-ECD-his 단백질로 면역화시켰다. 이들 마우스의 일반적인 면역화 방식이 문헌 [Lonberg, N. et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859]; [Fishwild, D. et al., (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851] 및 PCT 공보 WO 98/24884에 기재되어 있다. 제1 항원 주입시 마우스는 6-16 주령이었다. CADM1-ECD-his 단백질의 정제된 재조합 제제 (5-50 ㎍)를 이용하여 HuMab 및 KM 마우스®를 면역화시켰다.
트랜스제닉 마우스를 Ribi 아주반트 중의 항원으로 복막내로 (IP), 피하로 (Sc) 또는 발바닥을 통해 (FP) 3-21일 간격으로 면역화시켰다 (최대 총 9회 면역화). 후안와 채혈을 통해 면역 반응을 모니터링하였다. 혈장을 ELISA에 의해 스크리닝하고 (이하에서 기술함), 충분한 역가의 항-CADM1 인간 이뮤노글로불린을 갖는 마우스를 융합에 사용하였다. 마우스를 희생시켜 비장을 제거하기 3 및 2 일 전에 항원을 이용하여 정맥내로 부스팅시켰다. 전형적으로, 각 항원에 대해 10-20 융합을 수행하였다. 수십 마리의 마우스를 각 항원에 대해 면역화시켰다.
HuMab 마우스 ® 또는 KM 마우스 ® 동물 생산 항-CADM1 항체의 선별
CADM1에 결합하는 HuMab 마우스® 또는 KM 마우스® 동물 생산 항체를 선별하기 위해, 면역화된 동물로부터의 혈청을 문헌 [Fishwild, D. et al., (1996)(상기 문헌)]에 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 시험하였다. 간략하게, 마이크로타이터 플레이트를 PBS 중의 정제된 재조합 CADM1로 1-2 ㎍/ml로 코팅하고, 50 ㎕/웰을 4℃에서 밤새 인큐베이션한 다음, PBS/트윈 중의 5％ 닭 혈청 (0.05％) 200 ㎕/웰로 차단시켰다. CADM1 면역화된 마우스로부터의 혈장 희석액을 각 웰에 첨가하고, 1-2 시간 동안 주위 온도에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/트윈으로 세척한 다음, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)와 접합된 염소-항-인간 IgG Fc 폴리클로날 항체와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 세척한 후에, 플레이트를 ABTS 기질 (모스 인크(Moss Inc), 제품: ABTS-1000)로 발색시키고, 분광광도계에 의해 OD 415-495에서 분석하였다. 최고 역가의 항-CADM1 항체가 발생된 마우스를 융합에 사용하였다. 하기에 기술된 바와 같이 융합을 수행하였고, 하이브리도마 상청액을 ELISA 및 FACS로 항-CADM1 활성에 대해 시험하였다.
CADM1에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성
HuMab 마우스® 및/또는 KM 마우스®로부터 단리한 마우스 비장세포를 사이토 펄스 대형 챔버 세포 융합 전기천공기 (사이토 펄스 사이언시스, 인크.(Cyto Pulse Sciences, Inc.), 메릴랜드주 글렌 버니 소재)를 이용한 전기장 기반 전기융합을 이용하여 마우스 골수종 세포주와 융합시켰다. 간략하게, 면역화된 마우스로부터의 비장 림프구의 단세포 현탁액을 동 개수의 Sp2/0 비분비형 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL 1581)와 융합시켰다. 세포를 편평 바닥 마이크로타이터 플레이트 내에 대략 2 x 104/웰의 밀도로 플레이팅한 다음, 10％ 태아 소 혈청, 10％ P388D1 (ATCC, CRL TIB-63) 조건화 배지, DMEM (미디어테크(Mediatech), CRL 10013, 고 글루코스, L-글루타민 및 나트륨 피루베이트 포함) + 5 mM HEPES 중의 3-5％ 오리겐 (IGEN), 0.055 mM 2-메르캅토에탄올, 50 mg/ml 겐타마이신 및 1x HAT (시그마(Sigma), CRL P-7185)을 함유하는 선별 배지에서 인큐베이션하였다. 1-2 주 후에, HAT를 HT로 대체한 배지에서 세포를 배양하였다. 세포를 플레이팅하고 대략 10-14일 후에, 개별 웰로부터의 상청액에 대해 인간 g,k 항체를 함유하는지 여부에 대해 1차로 스크리닝하였다. 이어서 후속하여 인간 g,k에 대해 양성으로 스코어링된 상청액을 ELISA 및 FACS (상기에서 기술함)에 의해 인간 항-CADM1 모노클로날 IgG 항체에 대해 스크리닝하였다. 항체를 분비하는 하이브리도마를 24 웰 플레이트로 옮기고, 다시 스크리닝하고, 여전히 인간 항-CADM1 IgG 모노클로날 항체에 대해 양성일 경우, 한계 희석에 의해 적어도 2회 서브클로닝하였다. 이어서, 안정한 서브클론을 시험관 내에서 배양하여, 추가의 특성화를 위해 조직 배양 배지 내에 소량의 항체를 생성하였다.
추가의 분석을 위해 KM 마우스®로부터 생성된 하이브리도마 클론 PTA021_A1, PTA021_A2, 및 PTA021_A3을 선별하였다.
실시예 2: 인간 모노클로날 항체 PTA021_A1, PTA021_A2, 또는 PTA021_A3의 구조 특성화
PTA021_A1, PTA021_A2, 및 PTA021_A3 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA 서열을 표준 PCR 기술을 이용하여 PTA021_A1, PTA021_A2, 및 PTA021_A3 하이브리도마로부터 각각 수득하고, 표준 DNA 시퀀싱 기술을 이용하여 시퀀싱하였다.
항체 서열을 돌연변이유발시켜 하나 이상의 잔기에서 배선 잔기로 되돌릴 수 있다. 예를 들어, PTA021_A1 중쇄 가변 영역을 특정 부위 (예를 들어, 잔기 30)에서 배선 서열을 반영하도록 돌연변이유발시켜 글리코실화 부위를 제거할 수 있다 (예를 들어, N30Q 돌연변이).
PTA021_A1의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 각각 도 1a 및 서열 19 및 25에 나타낸다.
PTA021_A1의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 각각 도 1b 및 서열 28 및 22에 나타낸다.
PTA021_A1 중쇄 이뮤노글로불린 서열을 공지된 인간 배선 이뮤노글로불린 중쇄 서열과 비교한 결과 PTA021_A1 중쇄가 인간 배선 VH 2-05로부터의 VH 절편, 인간 배선 6-6으로부터의 D 절편, 및 인간 배선 JH 5b로부터의 JH 절편을 이용하는 것으로 밝혀졌다. PTA021_A1 VH 서열을 배선 VH 2-05 서열에 대해 정렬하여 도 4에 나타낸다. CDR 영역 결정의 카바트 시스템을 이용하여 PTA021_A1 VH 서열을 추가로 분석한 결과 각각 도 1a 및 4, 및 서열 1, 4 및 7에 나타낸 바와 같은 중쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역으로 나타났다.
PTA021_A1 경쇄 이뮤노글로불린 서열을 공지된 인간 배선 이뮤노글로불린 경쇄 서열과 비교한 결과 PTA021_A1 경쇄가 인간 배선 VK L15로부터의 VK 절편 및 인간 배선 JK 4로부터의 JK 절편을 이용하는 것으로 밝혀졌다. PTA021_A1 VK 서열을 배선 VK L15 서열에 대해 정렬하여 도 7에 나타낸다. CDR 영역 결정의 카바트 시스템을 이용하여 PTA021_A1 VK 서열을 추가로 분석한 결과 각각 도 1b 및 7, 및 서열 10, 13 및 16에 나타낸 바와 같은 경쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역으로 나타났다.
PTA021_A2의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 도 2a 및 서열 26 및 20에 나타낸다.
PTA021_A2의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 도 2b 및 서열 29 및 23에 나타낸다.
PTA021_A2 중쇄 이뮤노글로불린 서열을 공지된 인간 배선 이뮤노글로불린 중쇄 서열과 비교한 결과 PTA021_A2 중쇄가 인간 배선 VH 2-05로부터의 VH 절편, 인간 배선 6-6으로부터의 D 절편, 및 인간 배선 JH 5b로부터의 JH 절편을 이용하는 것으로 밝혀졌다. PTA021_A2 VH 서열을 배선 VH 2-05 서열에 대해 정렬하여 도 5에 나타낸다. CDR 영역 결정의 카바트 시스템을 이용하여 PTA021_A2 VH 서열을 추가로 분석한 결과 각각 도 2a 및 5, 및 서열 2, 5 및 8에 나타낸 바와 같은 중쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역으로 나타났다.
PTA021_A2 경쇄 이뮤노글로불린 서열을 공지된 인간 배선 이뮤노글로불린 경쇄 서열과 비교한 결과 PTA021_A2 경쇄가 인간 배선 VK L15로부터의 VK 절편 및 인간 배선 JK 4로부터의 JK 절편을 이용하는 것으로 밝혀졌다. PTA021_A2 VL 서열을 배선 VK L15 서열에 대해 정렬하여 도 8에 나타낸다. CDR 영역 결정의 카바트 시스템을 이용하여 PTA021_A2 VK 서열을 추가로 분석한 결과 각각 도 2b 및 8, 및 서열 11, 14 및 17에 나타낸 바와 같은 경쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역으로 나타났다.
PTA021_A3의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 각각 도 3a 및 서열 27 및 21에 나타낸다.
PTA021_A3의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 각각 도 3b 및 서열 30 및 24에 나타낸다.
PTA021_A3 중쇄 이뮤노글로불린 서열을 공지된 인간 배선 이뮤노글로불린 중쇄 서열과 비교한 결과 PTA021_A3 중쇄가 인간 배선 VH 2-05로부터의 VH 절편, 인간 배선 6-6으로부터의 D 절편, 및 인간 배선 JH JH5b로부터의 JH 절편을 이용하는 것으로 밝혀졌다. PTA021_A3 VH 서열을 배선 VH 2-05 서열에 대해 정렬하여 도 6에 나타낸다. CDR 영역 결정의 카바트 시스템을 이용하여 PTA021_A3 VH 서열을 추가로 분석한 결과 각각 도 3a 및 6, 및 서열 3, 6 및 9에 나타낸 바와 같은 중쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역으로 나타났다.
PTA021_A3 경쇄 이뮤노글로불린 서열을 공지된 인간 배선 이뮤노글로불린 경쇄 서열과 비교한 결과 PTA021_A3 경쇄가 인간 배선 VK L15로부터의 VK 절편 및 인간 배선 JK 4로부터의 JK 절편을 이용하는 것으로 밝혀졌다. PTA021_A3 VL 서열을 배선 VK L15 서열에 대해 정렬하여 도 9에 나타낸다. CDR 영역 결정의 카바트 시스템을 이용하여 PTA021_A3 VL 서열을 추가로 분석한 결과 각각 도 3b 및 9, 및 서열 12, 15, 및 18에 나타낸 바와 같은 경쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역으로 나타났다.
실시예 3: CADM1 모노클로날 항체의 결합 특성의 특성화
유동 세포측정 연구
본 실시예에서는, mAb PTA021_A1, PTA021_A2, PTA021_A3 및 PTA021_A3의 비푸코실화 버전 (NF)의 세포 표면 CADM1에 대한 결합을 유동 세포측정법에 의해 조사하였다.
항체가 세포 표면 CADM1 단백질에 결합하는 능력을 시험하기 위해, 항체를 상이한 CADM1-발현 세포: NCI-H69 (ATCC 명칭 HTB-119™), 인간 소세포 폐암 세포주; DMS79 (ATCC 명칭 CRL-2049™), 인간 소세포 폐암 라인; SKOV3 (ATCC 명칭 HTB-77™), 인간 난소암 세포주; A549 (ATCC 명칭 CCL-185™), 인간 비소세포 폐암 세포주; SkMel28 (ATCC 명칭 HTB-72™), 인간 흑색종 세포주 및 786-O (ATCC 명칭 CRL-1932™), 인간 신세포 암종 세포주와 함께 인큐베이션하였다. 유동 세포측정 연구를 위해, PTA021_A1, PTA021_A2, PTA021_A3 및 PTA021_A3 (NF) 모노클로날 항체를 냉 1x PBS + 0.1 ％ BSA로 40 ㎍/ml로 희석하였다. 결합 반응을 위해, 50 ㎕의 희석된 항체 용액을 4 x 105 세포를 함유하는 50 ㎕ 세포 현탁액에 첨가하고, 혼합물을 빙상에서 30-60 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 1x PBS + 0.1 ％ BSA로 3 회 세척하였다. R-피코에리트린-표지된 염소 항-인간 IgG FγF(ab)2 단편 (잭슨 이뮤노리서치 랩스(Jackson ImmunoResearch Labs), Cat. # 109-116-098)의 1:50 희석액을 첨가하고, 혼합물을 빙상에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 냉 1x PBS + 0.1 ％ BSA로 2 회 세척하였다. 최종 세척 이후에, 냉 1x PBS + 0.1％ BSA 200 ㎕를 각 용액에 첨가하고, FACS에 의해 항체 결합을 분석하였다.
도 10 및 하기 표 1은 유동 세포측정 분석의 결과 및 NCI-H69 세포주에의 결합에 대한 EC50을 보여준다. 모든 3 종의 모노클로날 항체가 세포 표면 인간 CADM1에 효과적으로 결합하는 것으로 밝혀졌다.
Figure 112011077117717-pct00025
도 11a 및 11b는 NCI-H69 및 DMS79 소세포 폐암 세포주에서의 유동 세포측정 분석 결과를 보여준다.
도 12는 SKOV3 난소암 세포주에서의 항체 PTA021_A3에 대한 유동 세포측정 분석 결과를 보여준다.
도 13은 A549 비소세포 폐암 세포주에서의 항체 PTA021_A3에 대한 유동 세포측정 분석 결과를 보여준다.
도 14는 786-O 신세포 암종 및 SkMel28 흑색종 세포주에서의 항체 PTA021_A3에 대한 유동 세포측정 분석 결과를 보여준다.
도 11 내지 14의 결과는 PTA021_A3이 상이한 CADM1 발현 세포에서 세포 표면 인간 CADM1에 효과적으로 결합하는 것으로 나타났다.
도 15는 NCI-H69 및 DMS79 소세포 폐암 세포주에서의 PTA021_A3의 비푸코실화 버전 (NF)에 대한 유동 세포측정 분석 결과를 보여준다. 이들 결과는 비푸코실화가 세포 표면 인간 CADM1에 대한 PTA021_A3의 결합에 영향을 미치지 않음을 보여주었다.
실시예 4 항-CADM1 mAb에 의해 매개되는 항체 의존적 세포성 세포독성
항-CADM1 mAb가 이펙터 세포의 존재하에서 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 통해 CADM1 발현 세포를 사멸시키는 능력을 결정하기 위해서, 2 종의 세포주, NCI-H69 및 DMS79를 표적 세포로서 이용하였다.
인간 이펙터 세포는 전혈로부터 다음과 같이 제조하였다. 인간 말초 혈액 단핵 세포를 헤파린처리한 전혈로부터 표준 피콜(Ficoll)-파크 분리에 의해 정제하였다. 세포를 10％ FBS (열 불활성화된 것) 및 인간 IL-2 200 U/ml를 함유하는 RPMI1640 배지 중에 재현탁시키고, 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다. 다음날, 세포를 모으고, 배양 배지에서 4회 세척하고, 1 x 107 세포/ml로 재현탁시켰다. 표적 세포는 BATDA 시약 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 메사추세츠주 웰즐리 소재)과 함께 1 x 106 표적 세포/mL 당 2.5 ㎕ BATDA로 20 분 동안 37℃에서 인큐베이션시켜 제조하였다. 표적 세포를 4 회 세척하고, 스핀 다운시키고, 1 x 105 세포/ml의 최종 부피에 이르게 하였다.
표적 세포에 대해 다음과 같이 델피아(Delfia) 형광 방사 분석을 이용하여 인간 항-CADM1 모노클로날 항체에 대한 항체 특이적 ADCC를 시험하였다. NCI-H69 또는 DMS79 세포 (표지된 표적 세포 100 ㎕, 104 세포/웰)를 이펙터 세포 50 ㎕ (106 세포/웰) 및 항체 50 ㎕ (최종 농도 10 ㎍/ml)와 함께 인큐베이션하였다. 실험 동안 1:25의 표적 대 이펙터 비를 이용하였다. 모든 연구에서, 인간 IgG1 이소형 대조군을 음성 대조군으로 사용하였다. 세포를 2000 rpm으로 스핀 다운시키고, 1 시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 상청액을 수집하고, 원심분리시키고, 상청액 20 ㎕를 편평 바닥 플레이트로 옮겼고, 여기에 Eu 용액 (퍼킨 엘머, 메사추세츠주 웰즐리 소재) 180 ㎕를 첨가하고, 루비스타(RubyStar) 판독기 (BMG 랩테크)에서 판독하였다. 다음과 같이 용해 ％를 계산하였다: (샘플 방출 - 자연 방출 * 100) / (최대 방출 - 자연 방출), 여기서 자연 방출은 표적 세포 + 이펙터 세포를 함유하는 웰로부터의 형광이며, 최대 방출은 표적 세포를 함유하는 웰로부터의 형광이고, 2％ 트리톤-X로 처리된 것이다.
결과를 하기 표 2 및 도 16a 및 16b에 요약하였고, PTA021_A1, PTA021_A2, 및 PTA021_A3이 CADM1 발현 암 세포주에 대해 ADCC를 특이적으로 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
Figure 112011077117717-pct00026
실시예 5: CADM1 항체 내재화
모노클로날 항체 PTA021_A1, PTA021_A2, 및 PTA021_A3은 Hum-Zap 검정에 의하면 세포에의 결합시에 NCI-H69 및 DMS79 세포에 의해 내재화되는 것으로 나타났다. Hum-ZAP 검정은 독소 사포린에 접합된 항-인간 IgG 2차 항체의 결합을 통해 항-CADM1 모노클로날 항체가 내재화됨을 보여주었다. (어드밴스드 타겟팅 시스템(Advanced Targeting System), 캘리포나이주 샌 디에고 소재, IT-22-100). 먼저, PTA021_A1, PTA021_A2, 및 PTA021_A3이 NCI-H69 또는 DMS79 세포의 표면에 결합되었다. 이어서, Hum-ZAP 항체가 1차 항체에 결합되었다. 다음으로, 1차 항체/Hum-ZAP 복합체가 세포에 의해 내재화되었다. 세포로의 사포린의 진입은 단백질 합성을 억제하였고, 궁극적으로 세포를 사멸시켰다.
Hum-ZAP 검정은 다음과 같이 수행하였다. 각각의 세포를 웰당 3 x 103 세포의 밀도로 시딩하였다. 항-CADM1 모노클로날 항체 또는 이소형 대조군 인간 IgG를 연속 희석한 다음, 세포에 첨가하였다. 이어서, Hum-ZAP을 2 ㎍/ml의 농도로 첨가하고, 플레이트를 96 시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트 내 세포 생존율을 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)® 발광 세포 생존율 검정 키트 (프로메가(Promega), G7571)로 검출하고, 플레이트를 루미노미톨(Luminomitor) (터너 바이오시스템즈(Tuner BioSystems), 캘리포니아주 서니베일 소재)로 490 nM에서 판독하였다. 데이터를 프리즘(Prism) (그래프패드(Graphpad))으로 분석하였다. 세포 사멸은 PTA021_A1, PTA021_A2, 및 PTA021_A3 모노클로날 항체의 농도에 비례하였다. 도 17a 및 17b는 항-CADM1 모노클로날 항체가 hIgG1 이소형 대조군 항체에 비해 각각 DMS79 및 NCI-H69 세포에 의해 효율적으로 내재화됨을 보여준다.
실시예 6: CADM1은 LAMP1과 공동 국소화된다
모노클로날 항체 PTA021_A3은 LAMP1과 공동 국소화되어 내재화되는 것으로 밝혀졌다. PTA021_A3을 NCI-H69 세포에 결합시키고, 세척하고, 37℃에서 45 분 동안 인큐베이션하였다. FITC 표지된 항-인간 항체를 통해 PTA021_A3 항체를 추적하였다.
일부 세포가 투과될 수 있었고, 항-인간 LAMP1에 의해 염색되었으며, TRITC 표지된 2차에 의해 검출되었다.
그 결과 PTA021_A3 및 LAMP1은 엔도좀에 공동 국소화되는 것으로 나타났다.
실시예 7: 항-CADM1 항체는 암 조직에 결합한다
항-CADM1 모노클로날 항체 PTA021_A1, PTA021_A2, 및 PTA021_A3은 소세포 폐암, 신경내분비 췌장암, 간암, 폐 카르시노이드 및 위장 카르시노이드를 나타내는 조직을 비롯한 인간 암 조직에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 암 환자로부터 생검을 수득하고, 항체를 면역조직화학 염색에 사용하였다 (시토믹스(Cytomyx), MA). 5 μm 조직 코어를 사용하였다. 30 분 동안 슬라이드 상에서 건조시킨 후, 조직 절편을 아세톤으로 실온에서 5 분 동안 고정시켰다. 슬라이드를 PBS 중에서 세정한 다음, 혈청 무함유 단백질 및 퍼옥시다제 차단제 (다코(Dako) S2001, CO)로 차단시키고, 후속하여 1차 항체 복합체 5 ㎍/ml와 실온에서 45 분 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 슬라이드를 세척하고, FITC-접합된 2차 항체 (잭슨 이뮤노리서치 랩, 109-097-003)와 함께 30 분 동안 인큐베이션하고, 다시 PBS로 세척하고, 중합체 HRP 접합체 (다코, CO, K4063)와 함께 20 분 동안 인큐베이션시켰다. 크로모겐 (다코 K3464)을 기질로서 사용하였고, 갈색으로 염색되었다. 슬라이드를 파라마운트 수성 탑재 배지 (다코, S3025) 중에 탑재시켰다. PTA021_A1, PTA021_A2 및 PTA021_A3은 상기에서 열거한 유형의 종양 세포에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다. 이들 모노클로날 항체로 염색한 경우, 다른 기관은 음성으로 또는 비특이적으로 염색되었고, 그러한 기관에는 자궁, 폐, 간, 신장, 결장, 자궁경부, 유방, 골수, 소뇌, 대뇌, 식도, 심장, 전립선, 태반, 뇌하수체, 난소, 중피, 톤실, 피부, 소장, 골격근, 위, 비장, 흉선 및 갑상선이 포함된다. 데이터는 항-CADM1 HuMab PTA021_A1, PTA021_A2, 및 PTA021_A3이 종양 상에서 발현된 CADM1을 인식하는 것으로 보여주었고, 그러한 종양으로는 소세포 폐암, 비소세포 폐암 (편평세포 암종 및 선암종 포함), 신경내분비 암 (췌장, 폐 및 위장관의 신경내분비 암 포함), 간암, 폐 카르시노이드, 유방암, 결장암, 전립선암, 난소암, 신장암, 및 위장 카르시노이드의 종양이 포함되었다.
소세포 폐암 조직 샘플 내의 항체 PTA021_A3에 대한 면역조직화학은 모든 종양 세포의 높은 수준 (+++)의 막 염색의 75％ 유병율을 나타내었다. 간암 조직 샘플 내의 항체 PTA021_A3에 대한 면역조직화학은 샘플의 75％-95％에서 양성 염색을 나타내었고, 종양의 45％가 모든 종양 세포의 높은 수준 (+++)의 막 염색을 나타내었다. 비소세포 폐암, 유방암, 전립선암, 결장직장암, 난소암 및 신세포 암종의 좀 더 작은 샘플 세트에서 PTA021_A3에 대한 추가의 연구를 수행하였다. 비소세포 폐 암종, 유방 암종 및 신장 투명 세포 암종에서 양성 염색의 유병율은 약 66％였고; 전립선 암종 및 난소 암종에서의 유병율은 100％였으며, 결장직장 선암종은 샘플의 17％에서 양성 염색을 나타내었다. 폐, 췌장 및 위장관의 신경내분비 종양을 또한 시험하였고, 폐 카르시노이드 및 신경내분비 췌장 샘플은 75％ 유병율을 나타내었으며, 위장관 신경내분비 종양은 샘플의 65％에서 양성 염색을 나타내었다.
실시예 8: 마우스 이종이식 모델에서 간암 종양 성장에 대한 푸코실화 및 비푸코실화 항-CADM1 항체의 효과
마우스 이종이식 모델에서 간암 유래 HepG2 세포의 성장에 대한 PTA021_A3 및 PTA021_A3의 비푸코실화 버전 (NF)의 효과를 조사하였다. 본 이종이식 모델에서, SCID 마우스 (CB17, 찰스 리버 래버러터리즈(Charles River Laboratories), 캘리포니아주 홀리스터 소재)에 2.5 x 106 HepG2 세포/마우스를 이식하고, HepG2 세포를 대략 30 일 동안 성장시켰다. 이어서, 마우스를 무작위화하고, 표 3에 나타낸 바와 같이 복강내 (i.p.) 처리하였다:
Figure 112011077117717-pct00027
신세포 암종 및 간암을 치료하는데 사용되는 화학물질 기반의 다중 키나제 억제제인 넥사바르 소라페닙을 표적 요법에 대한 대조군으로서 사용하였다.
도 18에서 볼 수 있는 바와 같이, PTA021_A3 및 PTA021_A3 NF 항체에 의한 처리는 종양 성장 속도를 현저하게 감소시켰고, 비푸코실화 PTA021_A3 NF 항체가 보다 강력하였다.
실시예 9: 항-CADM1 항체-약물 접합체는 마우스 이종이식 모델에서 HepG2 세포 성장을 억제한다
마우스 이종이식 모델에서 간세포 암종 유래 HepG2 세포의 성장에 대한 화학식 M에 따른 PTA021_A3 접합체 (이하에서는 "PTA021_A3-화학식 A 접합체" 또는 "PTA021_A3-화학식 M"이라 칭함)의 효과를 조사하였다. 본 이종이식 모델에서, SCID 마우스 (CB17, 찰스 리버 래버러터리즈, 캘리포니아주 홀리스터 소재)에 2.5 x 106 HepG2 세포/마우스를 이식하고, HepG2 세포를 대략 30 일 동안 성장시켰다. 이어서, 마우스를 무작위화하고, PTA021_A3-화학식 M 접합체 (0.1 μmole/kg, 또는 0.03 μmol/kg)로 복강내 (i.p.) 처리하였다. DT, 및 항 디프테리아 독소 항체를 비 결합 이소형 대조군으로 사용하였다. 신세포 암종 및 간암을 치료하는데 사용되는 화학물질 기반의 다중 키나제 억제제인 넥사바르 소라페닙을 표적 요법에 대한 대조군으로서 사용하였다.
도 19에서 볼 수 있는 바와 같이, PTA021_A3-화학식 M 접합체에 의한 처리는 용량 의존적 방식으로 종양 성장 속도를 현저하게 억제하였다.
실시예 10: 항-CADM1 항체-약물 접합체는 마우스 이종이식 모델에서 DMS79 세포 성장을 억제한다
마우스 이종이식 모델에서 소세포 폐암 유래 DMS79 세포의 성장에 대한 PTA021_A3-화학식 M의 효과를 조사하였다. 본 이종이식 모델에서, SCID 마우스 (CB17, 찰스 리버 래버러터리즈, 캘리포니아주 홀리스터 소재)에 5 x 106 DMS79 세포/마우스를 이식하고, DMS79 세포를 평균 종양 부피가 대략 200 mm3이 될 때까지 성장시켰다. 이어서, 마우스를 무작위화하고, 두 연구에서 PTA021_A3-화학식 M 접합체로 복강내 (i.p.) 처리하였다.
도 20a에서 볼 수 있는 바와 같이, PTA021_A3-화학식 M 접합체 0.3 μmole/kg에 의한 처리는 연구에 걸쳐 모든 마우스에서 완벽하게 종양을 퇴화시켰다 (제88일). 도 20b에서 볼 수 있는 바와 같이, PTA021_A3-화학식 M 접합체에 의한 처리는 제60일에 완료된 연구에 걸쳐 0.1 μmol/kg 용량에서 종양을 퇴화시켰다. 0.03 μmol/kg의 저용량은 종양 성장을 현저하게 지연시켰다.
실시예 11: PTA021_A3 및 비푸코실화 PTA021_A3에 의해 매개되는 항체 의존적 세포성 세포독성
형광 세포독성 검정을 이용하여 비푸코실화 PTA021_A3 항-CADM1 mAb의 이펙터 세포의 존재하에서 항체 의존적 세포성 세포독성 (HepG2, 786-O 및 DMS79 세포에 의한 ADCC)을 통해 CADM1 발현 세포를 사멸시키는 능력을 결정하였다.
인간 이펙터 세포는 전혈로부터 다음과 같이 제조하였다. 인간 말초 혈액 단핵 세포를 헤파린처리한 전혈로부터 표준 피콜-파크 분리에 의해 정제하였다. 세포를 10％ FBS (열 불활성화된 것) 및 인간 IL-2 200 U/ml를 함유하는 RPMI1640 배지 중에 재현탁시키고, 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다. 다음날, 세포를 모으고, 배양 배지에서 4회 세척하고, 2 x 107 세포/ml로 재현탁시켰다. 표적 CHO-중피 세포는 BATDA 시약 (퍼킨 엘머, 메사추세츠주 웰즐리 소재)과 함께 1 x 106 표적 세포/mL 당 2.5 ㎕ BATDA로 20 분 동안 37℃에서 인큐베이션시켜 제조하였다. 표적 세포를 4 회 세척하고, 스핀 다운시키고, 1 x 105 세포/ml의 최종 부피에 이르게 하였다.
HepG2, 786-O 및 DMS79 세포에 대해 다음과 같이 델피아 형광 방사 분석을 이용하여 인간 항-CADM1 PTA021_A3 모노클로날 항체 및 PTA021_A3의 비푸코실화 제제에 대한 항체 특이적 ADCC를 시험하였다. HepG2, 786-O 또는 DMS79 (표지된 표적 세포 100 ㎕, 104 세포/웰)를 이펙터 세포 50 ㎕ (106 세포/웰) 및 항체 50 ㎕ (최종 농도 10 ㎍/ml)와 함께 인큐베이션하였다. 실험 동안 1:100의 표적 대 이펙터 비를 이용하였다. 모든 연구에서, 인간 IgG1 이소형 대조군을 음성 대조군으로 사용하였다. 세포를 2000 rpm으로 스핀 다운시키고, 1 시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 상청액을 수집하고, 원심분리시키고, 상청액 20 ㎕를 편평 바닥 플레이트로 옮겼고, 여기에 Eu 용액 (퍼킨 엘머, 메사추세츠주 웰즐리 소재) 180 ㎕를 첨가하고, 루비스타 판독기 (BMG 랩테크)에서 판독하였다. 다음과 같이 용해 ％를 계산하였다: (샘플 방출 - 자연 방출 * 100) / (최대 방출 - 자연 방출), 여기서 자연 방출은 표적 세포 + 이펙터 세포를 함유하는 웰로부터의 형광이며, 최대 방출은 표적 세포를 함유하는 웰로부터의 형광이고, 2％ 트리톤-X로 처리된 것이다.
도 21, 22 및 23은 PTA021_A3 및 비푸코실화 PTA021_A3이 둘 모두 HepG2, 786-O 및 DMS79 세포에 대해 ADCC를 도출할 수 있으며, 비푸코실화 PTA021_A3이 보다 강력한 항체임을 보여준다. 동일한 효과를 CADM1을 발현하는 다른 세포주, 예컨대 SCLC 라인 NCI-H69에서 관찰할 수 있었다.
실시예 12: 항-CADM1 항체/시스플라틴은 마우스 이종이식 모델에서 DMS79 세포 성장을 억제한다
마우스 이종이식 모델에서 SCLC 유래 DMS79 세포의 성장에 대한 PTA021_A3 단독 및 시스플라틴과의 조합 효과를 조사하였다. 본 이종이식 모델에서, SCID 마우스 (CB17, 찰스 리버 래버러터리즈, 캘리포니아주 홀리스터 소재)에 5 x 106 DMS79 세포/마우스를 이식하고, DMS79 세포를 종양이 평균 200 mm3에 이를 때까지 성장시켰다. 이어서, 마우스를 무작위화하고, 종양 부피 플롯에 나타낸 바와 같이 복강내 (i.p.) 처리하였다.
도 24에서 볼 수 있는 바와 같이, PTA021_A3 단독 처리는 종양 성장을 지연시켰고, 시스플라틴과 조합된 경우 유의하고 상승작용적인 항-종양 활성을 나타내었다.
실시예 13: PTA021_A3NF, PTA021_A3 및 PTA021_A3-화학식 M의 독성 평가.
비푸코실화 항체 및 항체-약물 접합체를 비롯한 항 CADM1 항체의 독성 프로파일을, 예를 들어 PTA021_A3 및 그의 유도체를 이용하여 시노몰구스 마카크에서 평가하였다. IHC 검정 결과 시노몰구스 원숭이 및 인간은 PTA021_A3을 이용한 IHC에서 유사한 CADM1 발현 패턴을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 또한, CADM1 단백질은 시노 및 인간에서 높은 동일성을 나타내었다. 인간에서의 임상 시험을 위해 적절한 용량을 확인하는데 사용하기 위한 최대 내약 용량을 결정하기 위하여, 예를 들어 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg의 다중 IV 용량을 이용하였다.
시노몰구스 마카크에서 PTA021_A3 및 PTA021_A3의 비푸코실화 버전 (NF)에 대한 탐색적 독성학 연구를 수행하였다. 8 마리의 4 년령 비-나이브 (생물제제에 대해서는 나이브하지만, 앞서 소분자 약동학 연구에서 처리된 것) 시노몰구스 원숭이를 본 연구에서 이용하여, 각 그룹당 2 마리의 수컷 및 2 마리의 암컷이 포함된 2 개의 그룹에서 평가하였다. 그룹 1의 동물은 비푸코실화 PTA021_A3(NF) 항체를 1 mg/kg의 단일 정맥내 (IV) 용량으로 처리하였다. 그룹 2의 동물은 PTA021_A3 항체를 1 mg/kg의 단일 IV 용량으로 처리하였다.
임상 관찰 및 사망률/이환율을 매일 2회 am 및 pm으로 평가하였다. 체중, 혈액학 및 혈액 화학을 제-11일, 제0일, 제1일, 제3일, 제8일, 제15일 및 제22일에 분석하였다. 혈액학 평가에는 RBC, HGB, HCT, PLT, MCH, MCV, 망상적혈구, WBC 백분율이 포함되었다. 혈액 화학 평가에는 AST, ALT, ALP, CRE, BUN, GLU, CHO, TP, ALB, TBIL, LDH, TG, Ca, P, A/G, K, Na 및 Cl이 포함되었다.
연구 동안, 어떤 중요한 명백한 관찰사항 (예를 들어, 섭식 거동)은 존재하지 않았다. 신경내분비 조직에 대한 어떤 관찰가능한 효과 (예를 들어, 거동 변화 및 통증 징후를 야기하는 호르몬 변화)도 없었다. 또한, 주목할 만한 어떤 통증 및 떨림의 증거도 존재하지 않았다. 도 25 내지 32는 수행된 모든 분석이 정상 기대치 내에 있음을 보여준다.
도 25a 및 25b는 수컷 원숭이 및 암컷 원숭이 각각에 대한 체중 데이터를 보여준다.
도 26a 및 26b는 수컷 원숭이 및 암컷 원숭이 각각에 대한 글루코스 데이터를 보여준다.
도 27a 및 27b는 수컷 원숭이 및 암컷 원숭이 각각에 대한 알라닌 트랜스아미나제 데이터를 보여준다.
도 28a 및 28b는 수컷 원숭이 및 암컷 원숭이 각각에 대한 아스파르테이트 트랜스아미나제 데이터를 보여준다.
도 29a 및 29b는 수컷 원숭이 및 암컷 원숭이 각각에 대한 알칼리성 포스파타제 데이터를 보여준다.
도 30a 및 30b는 수컷 원숭이 및 암컷 원숭이 각각에 대한 락테이트 데히드로게나제 데이터를 보여준다.
도 31a 및 31b는 수컷 원숭이 및 암컷 원숭이 각각에 대한 RBC 데이터를 보여준다.
도 32a 및 32b는 수컷 원숭이 및 암컷 원숭이 각각에 대한 WBC 데이터를 보여준다.
실시예 14: PTA021_A3NF, PTA021_A3 및 PTA021_A3-화학식 M의 효능 평가.
CADM1은 PTA021_A3 HuMAb을 이용한 IHC에 의하면 많은 종양 유형에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. 다양한 암을 치료하기 위해, 암 종양 모델을 대표하는 세포주를 이용하여 네이키드 및 독소 접합된 항 CADM1 항체의 효능을 입증하였다. 예를 들어, PTA021_A3 및 그의 유도체를 그 자체로만 또는 치료 표준물질과 조합하여 CADM1을 발현하는 신암 (786-O 세포), 흑색종 (SkMel28 세포) 및 소세포 폐암 (DMS79 세포) 효능 모델에서 사용하였다. PTA021_A3 및 다른 항-CADM1 항체를 신경내분비 암, 결장암, 유방암, 난소암 및 전립선암과 같은 암을 대표하는 CADM1 발현 세포주를 이용하여 이종이식 동물 모델과 함께 이용할 수 있다.
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SEQUENCE LISTING <110> Oxford BioTherapeutic Ltd & MEDAREX, INC TERRETT Jonathan Alexander LEBLANC, Heidi HUANG, Haichun MEADDOUGH, Erika PAN,Chin CHEN,Bingliang RAO-NAIK, Chetana <120> FULLY HUMAN ANTIBODIES SPECIFIC TO CADM1 <160> 45 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Thr Ser Gly Val Gly Val Gly 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Thr Ser Gly Val Gly Val Gly 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Thr Ser Gly Val Gly Val Gly 1 5 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Leu Ile Val Glu Trp Val Ala Leu Ala Gly Asn Trp Phe Asp Pro 1 5 10 15 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Arg Arg Val Glu Trp Phe Ala Leu Ala Gly Asn Trp Phe Asp Pro 1 5 10 15 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Arg Arg Val Glu Trp Val Thr Leu Ala Gly Asn Trp Phe Asp Pro 1 5 10 15 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 19 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asn Thr Ser 20 25 30 Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala His Arg Arg Val Glu Trp Val Ala Leu Ala Gly Asn Trp Phe 100 105 110 Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 20 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala His Arg Arg Val Glu Trp Phe Ala Leu Ala Gly Asn Trp Phe 100 105 110 Asp Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 21 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala His Arg Arg Val Glu Trp Val Thr Leu Ala Gly Asn Trp Phe 100 105 110 Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 22 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 23 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 24 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 25 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 cagatcacct tgaaggagtc tggtcctacg ctggtgaaac ccacacagac cctcacgctg 60 acctgcacct tctctgggtt ctcactcaat actagtggag tgggtgtggg ctggatccgt 120 cagcccccag gaaaggccct ggagtggctt gcactcattt attgggacga tgataagcgc 180 tacagcccat ctctgaagag caggctcacc atcaccaagg acacctccaa aaaccaggtg 240 gtccttacaa tgaccaacat ggaccctgtg gacacagcca catattactg tgcacacagg 300 agagttgaat gggtcgccct ggcagggaac tggttcgacc cctggggcca gggaaccctg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 26 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 cagatcacct tgaaggagtc tggtcctacg ctggtgaaac ccacacagac cctcacgctg 60 acctgcacct tctctgggtt ctcactcagc actagtggag tgggtgtggg ctggatccgt 120 cagcccccag gaaaggccct ggagtggctt gcactcattt attgggatga tgataagcgc 180 tacagcccat ctctgaagag caggctcacc atcaccaagg acacctccaa aaaccaggtg 240 gtccttacaa tgaccaacat ggaccctgtg gacacagcca tatattactg tgcgcacagg 300 agagttgagt ggttcgccct ggcagggaac tggttcgacc cctggggcca gggatccctg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 27 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 cagatcacct tgaaggagtc tggtcctacg ctggtgaaac ccacacagac cctcacgctg 60 acctgcacct tctctgggtt ctcactcagt actagtggag tgggtgtggg ctggatccgt 120 cagcccccag gaaaggccct ggagtggctt gcactcattt attgggacga tgataagcgc 180 tacagcccat ctctgaagag caggctcacc atcaccaagg acacctccaa aaaccaggtg 240 gtccttacaa tgaccaacat ggaccctgtg gacacagcca catattactg tgcacacagg 300 agagttgagt gggtcaccct ggcagggaac tggttcgacc cctggggcca gggaaccctg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 28 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120 gagaaagccc ctaagtccct gatctatggt gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accctctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 29 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120 gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accctctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 30 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120 gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accctctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 31 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asn Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala His Arg 100 <210> 32 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asn Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala His Arg 100 <210> 33 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asn Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala His Arg 100 <210> 34 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro 85 90 95 <210> 35 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro 85 90 95 <210> 36 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro 85 90 95 <210> 37 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 38 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 39 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 41 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 43 <211> 387 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu 1 5 10 15 Ala Gln Asn Leu Phe Thr Lys Asp Val Thr Val Ile Glu Gly Glu Val 20 25 30 Ala Thr Ile Ser Cys Gln Val Asn Lys Ser Asp Asp Ser Val Ile Gln 35 40 45 Leu Leu Asn Pro Asn Arg Gln Thr Ile Tyr Phe Arg Asp Phe Arg Pro 50 55 60 Leu Lys Asp Ser Arg Phe Gln Leu Leu Asn Phe Ser Ser Ser Glu Leu 65 70 75 80 Lys Val Ser Leu Thr Asn Val Ser Ile Ser Asp Glu Gly Arg Tyr Phe 85 90 95 Cys Gln Leu Tyr Thr Asp Pro Pro Gln Glu Ser Tyr Thr Thr Ile Thr 100 105 110 Val Leu Val Pro Pro Arg Asn Leu Met Ile Asp Ile Gln Lys Asp Thr 115 120 125 Ala Val Glu Gly Glu Glu Ile Glu Val Asn Cys Thr Ala Met Ala Ser 130 135 140 Lys Pro Ala Thr Thr Ile Arg Trp Phe Lys Gly Asn Thr Glu Leu Lys 145 150 155 160 Gly Lys Ser Glu Val Glu Glu Trp Ser Asp Met Tyr Thr Val Thr Ser 165 170 175 Gln Leu Met Leu Lys Val His Lys Glu Asp Asp Gly Val Pro Val Ile 180 185 190 Cys Gln Val Glu His Pro Ala Val Thr Gly Asn Leu Gln Thr Gln Arg 195 200 205 Tyr Leu Glu Val Gln Tyr Lys Pro Gln Val His Ile Gln Met Thr Tyr 210 215 220 Pro Leu Gln Gly Leu Thr Arg Glu Gly Asp Ala Leu Glu Leu Thr Cys 225 230 235 240 Glu Ala Ile Gly Lys Pro Gln Pro Val Met Val Thr Trp Val Arg Val 245 250 255 Asp Asp Glu Met Pro Gln His Ala Val Leu Ser Gly Pro Asn Leu Phe 260 265 270 Ile Asn Asn Leu Asn Lys Thr Asp Asn Gly Thr Tyr Arg Cys Glu Ala 275 280 285 Ser Asn Ile Val Gly Lys Ala His Ser Asp Tyr Met Leu Tyr Val Tyr 290 295 300 Asp Ser Arg Ala Gly Glu Glu Gly Ser Ile Arg Ala Val Asp His Ala 305 310 315 320 Val Ile Gly Gly Val Val Ala Val Val Val Phe Ala Met Leu Cys Leu 325 330 335 Leu Ile Ile Leu Gly Arg Tyr Phe Ala Arg His Lys Gly Thr Tyr Phe 340 345 350 Thr His Glu Ala Lys Gly Ala Asp Asp Ala Ala Asp Ala Asp Thr Ala 355 360 365 Ile Ile Asn Ala Glu Gly Gly Gln Asn Asn Ser Glu Glu Lys Lys Glu 370 375 380 Tyr Phe Ile 385 <210> 44 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu 1 5 10 15 Thr Gln Asn Leu Phe Thr Lys Asp Val Thr Val Ile Glu Gly Glu Val 20 25 30 Ala Thr Ile Ser Cys Gln Val Asn Lys Ser Asp Asp Ser Val Ile Gln 35 40 45 Leu Leu Asn Pro Asn Arg Gln Thr Ile Tyr Phe Arg Asp Phe Arg Pro 50 55 60 Leu Lys Asp Ser Arg Phe Gln Leu Leu Asn Phe Ser Ser Ser Glu Leu 65 70 75 80 Lys Val Ser Leu Thr Asn Val Ser Ile Ser Asp Glu Gly Arg Tyr Phe 85 90 95 Cys Gln Leu Tyr Thr Asp Pro Pro Gln Glu Ser Tyr Thr Thr Ile Thr 100 105 110 Val Leu Val Pro Pro Arg Asn Leu Met Ile Asp Ile Gln Lys Asp Thr 115 120 125 Ala Val Glu Gly Glu Glu Ile Glu Val Asn Cys Thr Ala Met Ala Ser 130 135 140 Lys Pro Ala Thr Thr Ile Arg Trp Phe Lys Gly Asn Thr Glu Leu Lys 145 150 155 160 Gly Lys Ser Glu Val Glu Glu Trp Ser Asp Met Tyr Thr Val Thr Ser 165 170 175 Gln Leu Met Leu Lys Val His Lys Glu Asp Asp Gly Val Pro Val Ile 180 185 190 Cys Gln Val Glu His Pro Ala Val Thr Gly Asn Leu Gln Thr Gln Arg 195 200 205 Tyr Leu Glu Val Gln Tyr Lys Pro Gln Val His Ile Gln Met Thr Tyr 210 215 220 Pro Leu Gln Gly Leu Thr Arg Glu Gly Asp Ala Leu Glu Leu Thr Cys 225 230 235 240 Glu Ala Ile Gly Lys Pro Gln Pro Val Met Val Thr Trp Val Arg Val 245 250 255 Asp Asp Glu Met Pro Gln His Ala Val Leu Ser Gly Pro Asn Leu Phe 260 265 270 Ile Asn Asn Leu Asn Lys Thr Asp Asn Gly Thr Tyr Arg Cys Glu Ala 275 280 285 Ser Asn Ile Val Gly Lys Ala His Ser Asp Tyr Met Leu Tyr Val Tyr 290 295 300 Asp Ser Arg Ala Gly Glu Glu Gly Ser Ile Arg Ala Val Asp Ala Ser 305 310 315 320 His His His His His His 325 <210> 45 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide conjugate <400> 45 Pro Val Gly Val Val 1 5

Claims (34)

  1. 서열 19, 20, 또는 21에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 22, 23, 또는 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 인간 CADM1 상의 에피토프에 결합하는, 단리된 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 부분, 또는 항체 단편.
  2. 인간 CADM1에 대한 본래 서열의 결합의 90％를 유지하는 아미노산 변화를 포함하는, 서열 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 4 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 7 내지 9로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 10 내지 12로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 13 내지 15로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 16 내지 18로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하며, 인간 CADM1 상의 에피토프에 결합하는, 단리된 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 부분, 또는 항체 단편.
  3. (a) 서열 1을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,
    서열 4를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,
    서열 7을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,
    서열 10을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,
    서열 13을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및
    서열 16을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3
    을 포함하거나; 또는
    (b) 서열 2를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,
    서열 5를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,
    서열 8을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,
    서열 11을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,
    서열 14를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및
    서열 17을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3
    을 포함하거나; 또는
    (c) 서열 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,
    서열 6을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,
    서열 9를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,
    서열 12를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,
    서열 15를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및
    서열 18을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3
    을 포함하며,
    인간 CADM1 상의 에피토프에 결합하는 단리된 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 부분, 또는 항체 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 이소형의 전장 항체인 항체.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 전체 항체, 항체 단편, 인간화 항체, 인간 항체, 단일 쇄 항체, Fc 수용체에 대한 결합이 증가되고/거나 ADCC에 대한 효능이 증가된 조작된 항체, 및 이중특이적 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 항체.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유니바디 및 도메인 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제에 접합된 항체.
  8. 제7항에 있어서, 치료제가 세포독소 또는 방사성 동위원소인 항체.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 CADM1에 50 nM 미만의 범위의 EC50으로 결합하는 단리된 항체.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 CADM1에 10 nM 미만의 범위의 EC50으로 결합하는 단리된 항체.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 CADM1에 1 nM 미만의 범위의 EC50으로 결합하는 단리된 항체.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  13. 제12항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  14. 제13항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포를 수득하는 단계;
    숙주 세포를 숙주 세포 배양물에서 성장시키는 단계;
    하나 이상의 핵산 분자가 발현되는 숙주 세포 배양 조건을 제공하는 단계; 및
    숙주 세포 또는 숙주 세포 배양물로부터 항체를 회수하는 단계
    를 포함하는 항-CADM1 항체의 제조 방법.
  16. 인간 암의 치료 또는 예방에 효과적인 양으로 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 항-CADM1 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는, 인간 암을 치료 또는 예방하기 위한 제약 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 인간 암이 소세포 폐암; 성인 T-세포 백혈병; 편평세포 암종 및 선암종을 포함하는 비소세포 폐암; 흑색종; 유방암; 결장직장암; 난소암; 전립선암; 간세포 암종, 인슐린종 및 글루카곤종을 포함하는, 폐, 부신, 뇌하수체, GI관, 신장, 간, 췌장의 신경내분비 암; 교모세포종; 및 췌장, 폐, GI관, 간, 및 신장의 카르시노이드 종양을 포함하는 카르시노이드 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
  18. 서열 19에 기재된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열 22에 기재된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열;
    서열 20에 기재된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열 23에 기재된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열;
    서열 21에 기재된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열 24에 기재된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열
    로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 인간 CADM1 상의 에피토프에 결합하는, 단리된 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 부분, 또는 항체 단편.
  19. 제18항에 있어서, 전체 항체, 항체 단편, 인간화 항체, 인간 항체, 단일 쇄 항체, Fc 수용체에 대한 결합이 증가되고/거나 ADCC에 대한 효능이 증가된 조작된 항체, 및 이중특이적 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 단리된 항체.
  20. 제18항에 있어서, 유니바디 및 도메인 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편.
  21. (i) 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항의 단리된 항체 및 (ii) 치료제를 포함하는 면역접합체.
  22. 제18항의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 인간 암을 치료 또는 예방하기 위한 조성물.
  23. 제18항의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  24. 제23항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  25. 제24항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  26. 제1항 내지 제3항 및 제18항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 발현하는 하이브리도마.
  27. 인간 이뮤노글로불린 유전자를 포함하는 트랜스제닉 동물을 CADM1 펩티드로 면역화하는 단계;
    상기 트랜스제닉 동물로부터 B 세포를 회수하는 단계;
    상기 B 세포로부터 하이브리도마를 제조하는 단계;
    CADM1에 결합하는 항체를 발현하는 하이브리도마를 선별하는 단계; 및
    상기 선별된 하이브리도마로부터 CADM1에 결합하는 상기 항체를 회수하는 단계
    를 포함하는, 제1항 내지 제3항 및 제18항 중 어느 한 항의 항체의 제조 방법.
  28. 인간 이뮤노글로불린 유전자를 포함하는 트랜스제닉 동물을 CADM1 펩티드로 면역화하는 단계;
    상기 트랜스제닉 동물의 B 세포로부터 mRNA를 회수하는 단계;
    상기 mRNA를 cDNA로 전환시키는 단계;
    파지 내에서 상기 cDNA를 발현시켜 상기 cDNA에 의해 코딩된 항-CADM1 항체가 상기 파지의 표면 상에 제시되게 하는 단계;
    항-CADM1 항체가 제시된 파지를 선별하는 단계;
    상기 선별된 파지로부터 상기 항-CADM1 이뮤노글로불린을 코딩하는 핵산 분자를 회수하는 단계;
    상기 회수된 핵산 분자를 숙주 세포에서 발현시키는 단계; 및
    상기 숙주 세포로부터 CADM1에 결합하는 항체를 회수하는 단계
    를 포함하는, 제1항 내지 제3항 및 제18항 중 어느 한 항의 항체의 제조 방법.
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