ES2222959T3 - Polipeptidos pro241 y acido nucleico codificante de los mismos. - Google Patents
Polipeptidos pro241 y acido nucleico codificante de los mismos.Info
- Publication number
- ES2222959T3 ES2222959T3 ES01126188T ES01126188T ES2222959T3 ES 2222959 T3 ES2222959 T3 ES 2222959T3 ES 01126188 T ES01126188 T ES 01126188T ES 01126188 T ES01126188 T ES 01126188T ES 2222959 T3 ES2222959 T3 ES 2222959T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- sequence
- polypeptide
- pro polypeptide
- cells
- pro
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Phenolic Resins Or Amino Resins (AREA)
- Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)
Abstract
Ácido nucleico aislado que codifica una secuencia aminoacídica que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con la secuencia aminoacídica que se muestra en la Figura 2 (SEC ID Nº 2), o su complementaria, en donde dicha identidad de secuencia se determina considerando toda la longitud de las secuencias que se comparan.
Description
Polipéptidos PRO241 y ácido nucleico codificante
de los mismos.
La presente invención hace referencia a la
identificación y aislamiento de un nuevo DNA y a la producción
recombinante de nuevos polipéptidos codificados por dicho DNA.
Las proteínas extracelulares desempeñan un papel
importante en la formación, diferenciación y mantenimiento de los
organismos multicelulares. El destino de muchas células, p.ej., la
proliferación, la migración, la diferenciación o la interacción con
otras células, se rige de forma característica por la información
recibida por otras células y/o el entorno inmediato. Esta
información se transmite a menudo por los polipéptidos secretados
(por ejemplo, factores mitogénicos, factores de supervivencia,
factores citotóxicos, factores de diferenciación, neuropéptidos y
hormonas) que, a su vez, son recibidos y transmitidos por diversos
receptores celulares o proteínas unidas a membrana. Estos
polipéptidos secretados o moléculas de señalización pasan
normalmente a través de la vía secretora celular hasta alcanzar el
lugar de acción en el entorno extracelular.
Las proteínas secretadas tienen diversas
aplicaciones, incluyendo las farmacéuticas, diagnósticas, los
biosensores y los bioreactores. La mayoría de fármacos proteicos
disponibles actualmente, como los agentes trombolíticos, los
interferones, las interleucinas, las eritropoyetinas, los factores
estimuladores de colonias y otras citoquinas, son proteínas
secretoras. Sus receptores, que son proteínas de membrana, también
tienen un potencial como agentes terapéuticos o diagnósticos. Se
han llevado a cabo diversos esfuerzos tanto por la industria como
por centros académicos para identificar nuevas proteínas nativas
secretadas. Muchos esfuerzos se han centralizado en el cribaje de
librerías de DNA recombinantes para identificar las secuencias
codificantes de nuevas proteínas secretadas. Ejemplos de
procedimientos y técnicas de cribaje se describen en la literatura
[véase, por ejemplo, Klein y col., Proc. Natl. Acad. Sci.,
93:7108-7113 (1996); patente americana U.S.
5.536.637)].
Las proteínas unidas a membrana y los receptores
pueden desempeñar una función importante en la formación,
diferenciación y mantenimiento de los organismos multicelulares. El
destino de muchas células, p.ej., la proliferación, la migración,
la diferenciación o la interacción con otras células, se rige de
forma característica por la información recibida de otras células
y/o del entorno inmediato. Esta información a menudo se transmite
por los polipéptidos secretados (por ejemplo, factores mitogénicos,
factores de supervivencia, factores citotóxicos, factores de
diferenciación, neuropéptidos y hormonas) que, a su vez, son
recibidas e interpretadas por diversos receptores celulares o
proteínas unidas a membrana. Dichas proteínas de unión a membrana y
los receptores celulares incluyen, pero no se limitan a, los
receptores quinasas, los receptores fosfatasas, los receptores
implicados en las interacciones célula-célula y las
moléculas de adhesión celular como las selectinas y las integrinas.
Por ejemplo, la transducción de señales que regula el crecimiento y
la diferenciación celular se regula en parte mediante fosforilación
de diversas proteínas celulares. Las
protein-tirosina quinasas, enzimas que catalizan
dicho proceso, pueden también actuar como receptores de factores de
crecimiento. Ejemplos incluyen el receptor del factor de
crecimiento y el receptor del factor de crecimiento nervioso.
Las proteínas de unión a membrana y las moléculas
de receptor tienen diversas aplicaciones industriales, incluyendo
las farmacéuticas y como agentes diagnósticos. Las inmunoadhesinas
de receptor, por ejemplo, se pueden utilizar como agentes
terapéuticos para bloquear la interacción
receptor-ligando. Las proteínas unidas a membrana
pueden también utilizarse para el rastreo de inhibidores
potenciales, péptidos o pequeñas moléculas, de la interacción
relevante receptor/ligando. Se han llevado a cabo esfuerzos tanto
por la industria como por los centros académicos para identificar
nuevas proteínas receptoras nativas. Muchos de los esfuerzos se han
centrado en el rastreo de librerías de DNA recombinante para
identificar las secuencias codificantes de nuevas proteínas
receptoras.
En la presente invención se describe aquí la
caracterización de nuevos polipéptidos transmembrana secretados y
nuevos ácidos nucleicos que codifican estos polipéptidos.
El cartílago es un tejido conectivo con una
amplia matriz extracelular que contiene una malla densa de fibras
de colágeno y un contenido elevado de proteoglicanos. Mientras que
el proteoglicano mayoritario del cartílago es un agrecano, que
contiene muchas cadenas de condroitín sulfato y queratín sulfato y
forma agregados multimoleculares mediante la unión de la proteína
con el hialuronán, el cartílago también contiene varios
proteoglicanos de peso molecular menor. Uno de estos proteoglicanos
de peso molecular menor es una proteína denominada biglicano, un
proteoglicano ampliamente distribuido en la matriz extracelular de
diversos tejidos conectivos, incluyendo el tendón, la esclerótica,
la piel y similares. El biglicano posee secuencias repetidas ricas
en leucina y dos cadenas de condroitín sulfato/dermatán sulfato que
sirven para unirse al dominio de unión celular de la fibronectina
con el fin de inhibir la adhesión celular. Se especula que los
proteoglicanos de pequeño peso molecular como el biglicano pueden
desempeñar funciones importantes en el crecimiento y/o reparación
celular del cartílago y en las enfermedades degenerativas como la
artritis. Por ello, existe un interés en identificar y caracterizar
nuevos polipéptidos que tengan homología con la proteína del
biglicano.
En la presente invención se describe la
identificación y caracterización de nuevos polipéptidos con
homología con la proteína del biglicano, habiéndose denominado
dichos polipéptidos en la presente invención como PRO241.
Los inventores han identificado un clon de cDNA
que codifica un nuevo polipéptido que tiene homología con la
proteína del biglicano, en donde el polipéptido se denomina en la
presente solicitud "PRO241".
En la realización, la invención proporciona una
molécula de ácido nucleico aislado que comprende un DNA que
codifica un polipéptido PRO241. En un aspecto de la invención, el
ácido nucleico aislado comprende el DNA que codifica el polipéptido
PRO241 y que contiene los residuos aminoacídicos 1 a 379 de la
Figura 2 (SEC ID Nº2), o es complementario a dicha secuencia de
ácido nucleico, y permanece unido de forma estable a ésta en al
menos condiciones de astringencia moderada y opcionalmente elevada
astringencia.
En otra realización, la invención proporciona el
polipéptido PRO241 aislado. En particular, la invención proporciona
la secuencia nativa aislada del polipéptido PRO241, el cual en una
realización, incluye una secuencia aminoacídica que comprende los
residuos 1 a 379 de la Figura 2 (SEC ID Nº 2). Otra realización de
la presente invención está dirigida al polipéptido PRO241 que carece
del péptido señal N-terminal, en donde el
polipéptido PRO241 comprende los aminoácidos 16 a 379 de la
secuencia aminoacídica PRO241 de tamaño completo (SEC ID Nº2).
En otras realizaciones de la presente invención,
la invención proporciona vectores que comprenden el DNA que
codifica cualquiera de los polipéptidos descritos anteriormente.
También se proporciona la célula hospedadora que contiene
cualquiera de dichos vectores. A modo de ejemplo, las células
hospedadoras pueden ser células CHO, E. coli, o levaduras. Se
proporciona además un procedimiento para la producción de
cualquiera de los polipéptidos descritos anteriormente o más
adelante y comprende el cultivo de las células hospedadoras en
condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido deseado y
la recuperación del polipéptido deseado a partir del cultivo
celular.
En otras realizaciones, la invención proporciona
las moléculas quiméricas que comprenden cualquiera de los
polipéptidos descritos con anterioridad o más adelante fusionados a
un polipéptido heterólogo o secuencia aminoacídica. Un ejemplo de
dicha molécula quimérica comprende cualquiera de los polipéptidos
descritos con anterioridad o más adelante, fusionados a una
secuencia etiquetada con un epitopo o una región Fc de una
inmunoglobulina.
En otra realización, la invención proporciona un
anticuerpo que se une específicamente a cualquiera de los
polipéptidos descritos con anterioridad o más adelante.
Opcionalmente, el anticuerpo es un monoclonal.
En otras realizaciones, la invención proporciona
sondas oligonucleotídicas de utilidad para aislar secuencias
genómicas y de cDNA, en donde dichas sondas pueden derivarse de
cualquiera de las secuencias nucleotídicas descritas anteriormente
o más adelante.
La Figura 1 muestra la secuencia nucleotídica
(SEC ID Nº1) de un cDNA de secuencia nativa PRO241, en donde la SEC
ID Nº 1 es un clon denominado aquí como "UNQ215" y/o
"DNA34392-1170".
La Figura 2 muestra la secuencia aminoacídica
(SEC ID Nº2) derivada de la secuencia codificante de la SEC ID Nº1
que se muestra en la Figura 1. También se muestra en la Figura 2,
la localización de un posible péptido señal, una región de
cremallera de leucinas y un sitio de N-glicosilación
potencial.
Los términos "polipéptido PRO" y "PRO"
tal como se utilizan aquí y cuando van seguidos de un número hacen
referencia a diversos polipéptidos, en donde la denominación
completa (es decir, PRO/número) hace referencia a secuencias
polipeptídicas específicas tal como se describen aquí. Los términos
"PRO/polipéptido número" y "PRO/número" tal como se
utilizan aquí abarcan los polipéptidos de secuencia nativa y las
variantes de polipéptidos (que se definen aquí más adelante). Los
polipéptidos PRO descritos aquí pueden aislarse a partir de
diversas fuentes, por ejemplo las derivadas de tejidos humanos o de
cualquier otra fuente, o pueden prepararse mediante procedimientos
recombinantes o sintéticos.
Un "polipéptido PRO de secuencia nativa"
comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia aminoacídica
que la correspondiente al polipéptido derivado de la naturaleza.
Dichos polipéptidos PRO de secuencia nativa pueden aislarse de la
naturaleza o pueden producirse mediante procedimientos recombinantes
o sintéticos. El término "polipéptido PRO de secuencia nativa"
abarca específicamente las formas truncadas de origen natural o las
secretadas del polipéptido PRO específico (p.ej., una secuencia de
dominio extracelular), las formas variantes de origen natural
(p.ej., las formas ayustadas alternativamente) y las variantes
alélicas de origen natural del polipéptido. En diversas
realizaciones de la invención, el polipéptido PRO241 de secuencia
nativa es un polipéptido PRO241 de secuencia nativa de tamaño
completo que comprende los aminoácidos 1 a 379 de la Figura 2 (SEC
ID Nº2).
El "dominio extracelular" del polipéptido
PRO o "ECD" hace referencia a una forma del polipéptido PRO
que carece de los dominios transmembrana y citoplasmático.
Generalmente, un ECD del polipéptido PRO tendrá menos del 1% de
dichos dominios transmembrana y/o citoplasmáticos y preferentemente,
tendrá menos del 0,5% de dichos dominios. Se entenderá que
cualquier dominio transmembrana identificado para los polipéptidos
PRO de la presente invención ha sido identificado según los
criterios de rutina utilizados en la materia para identificar el
tipo de dominio hidrofóbico. Los límites exactos de un dominio
transmembrana pueden variar pero generalmente no más de
aproximadamente 5 aminoácidos en cada extremo del dominio
identificado inicialmente.
El término "variante del polipéptido PRO"
hace referencia a un polipéptido PRO activo tal como se definió
antes y más adelante que tiene por lo menos el 80% de identidad de
secuencia aminoacídica con la secuencia del polipéptido PRO nativa
que se describe en la presente invención. Dichas variantes del
polipéptido PRO incluyen, por ejemplo, los polipéptidos PRO en los
que uno o más residuos aminoacídicos se han añadido, o delecionado,
en el extremo N- o C-terminal de la secuencia
aminoacídica nativa de tamaño completo. Generalmente, una variante
del polipéptido PRO tendrá por lo menos un 80% de identidad de
secuencia aminoacídica, preferentemente al menos un 85%, más
preferentemente al menos un 90%, todavía más preferentemente al
menos un 95% y todavía mejor un 99% de identidad de secuencia
aminoacídica con la secuencia aminoacídica nativa de tamaño
completo tal como se describe aquí.
"El porcentaje (%) de identidad de secuencia
aminoacídica" respecto a las secuencias del polipéptido PRO
identificadas aquí se define como el porcentaje de residuos
aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos con los
residuos aminoacídicos en la secuencia del polipéptido PRO
específica, después de alinear las secuencias e introducir los
huecos, si fuera necesario, para lograr el porcentaje máximo de
identidad de secuencia y sin considerar ninguna sustitución
conservadora como parte de la identidad de secuencia. El
alineamiento con el objetivo de determinar el porcentaje de
identidad de secuencia aminoacídica puede lograrse de diversas
maneras conocidas por los expertos en la materia, por ejemplo,
utilizando los programas de disponibilidad pública BLAST,
BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). El programa de
alineamiento preferido es el BLAST. Aquellos expertos en la materia
pueden determinar los parámetros adecuados para cuantificar el
alineamiento, incluyendo cualquier algoritmo que se necesite para
lograr el máximo alineamiento con las secuencias de tamaño completo
que se comparan.
El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de
ácido nucleico" respecto a las secuencias de ácido nucleico que
codifican el polipéptido PRO identificadas aquí se define como el
porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son
idénticos con los nucleótidos en la secuencia de ácido nucleico PRO
de interés, después de alinear las secuencias e introducir los
huecos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de
identidad de secuencias. El alineamiento con el objetivo de
determinar el porcentaje de identidad de secuencia aminoacídica
puede lograrse de diversas maneras conocidas por los expertos en la
materia, por ejemplo, utilizando los programas de disponibilidad
pública BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR).
Los expertos en la materia pueden determinar parámetros adecuados
para cuantificar el alineamiento, incluyendo cualquier algoritmo
que se requiera para lograr el máximo de alineamiento sobre las
secuencias de tamaño completo que se comparan.
El término "aislado" cuando se utiliza para
describir los diversos polipéptidos descritos aquí, hace referencia
a un polipéptido que se ha identificado y separado y/o recuperado
de un componente de su entorno natural. Los componentes
contaminantes de su entorno natural son materiales que pueden
interferir generalmente con la utilización diagnóstica o
terapéutica del polipéptido y pueden incluir enzimas, hormonas y
otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones
preferidas, el polipéptido se purificará (1) a un grado suficiente
para obtener al menos 15 residuos de la secuencia aminoacídica
N-terminal o interna utilizando un secuenciador
spinning-cup, o (2) a homogeneidad mediante
SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras
utilizando Coomassie-blue o, preferentemente, la
tinción de plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido
in situ dentro de las células recombinantes, ya que al menos
un componente del entorno natural del polipéptido PRO no estará
presente. Sin embargo, por lo general el polipéptido aislado se
preparará mediante una etapa de purificación como mínimo.
Un ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO
"aislado" es una molécula de ácido nucleico que se identifica
y aísla de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con
la que generalmente está asociado en la fuente original del ácido
nucleico del polipéptido PRO. Una molécula de ácido nucleico del
polipéptido PRO aislado es distinta en la forma o disposición que se
halla en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico del
polipéptido PRO aislado se distinguen, en consecuencia, de la
molécula de ácido nucleico del polipéptido PRO específico que
existe en las células normales. Sin embargo, una molécula de ácido
nucleico de un polipéptido PRO aislado incluye moléculas de ácido
nucleico del polipéptido PRO contenidas en las células que
normalmente expresan el polipéptido PRO en las que, por ejemplo, la
molécula de ácido nucleico se halle en una localización distinta a
la de las células normales.
El término "secuencias controles" hace
referencia a las secuencias de DNA necesarias para la expresión de
una secuencia codificante unida operativamente a éstas en un
organismo huésped determinado. Las secuencias control que son
adecuadas para los procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor,
opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión a
ribosomas. En cambio, las células eucariotas utilizan promotores,
señales de poliadenilación e intensificadores de la
transcripción.
El ácido nucleico está "unido
operativamente" cuando está colocado en una relación funcional
con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el DNA para una
presecuencia o líder secretor está unido operativamente al DNA de un
polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la
secreción del polipéptido; un promotor o intensificador está unido
operativamente a una secuencia codificante si ello afecta a la
transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está
unido operativamente a una secuencia codificante si está colocado
para facilitar la traducción. En general, "unido
operativamente" significa que las secuencias de DNA unidas son
contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en la
misma pauta de lectura. Sin embargo, los intensificadores no tienen
porque ser contiguos. La unión se consigue mediante ligación en
dianas de restricción adecuadas. Si dichas dianas no existen, se
utilizan adaptadores oligonucleotídicos sintéticos o engarces de
acuerdo con la práctica convencional.
El término "anticuerpo" se utiliza en un
sentido amplio y abarca específicamente composiciones de
anticuerpos monoclonales anti-polipéptido PRO con
especificidad poliepitópica. El término "anticuerpo
monoclonal", tal como se utiliza aquí, hace referencia a un
anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos esencialmente
homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales comprendidos en
la población son idénticos excepto por las mutaciones que puedan
haber ocurrido de forma natural y que pueden estar en cantidades
menores.
Los términos "Activo" o "actividad"
para los propósitos de la presente invención hacen referencia a
la(s) forma(s) del polipéptido PRO que retiene las
actividades biológicas y/o inmunológicas del polipéptido PRO nativo
o que tiene lugar de forma natural.
El término "tratamiento" hace referencia al
tratamiento terapéutico y a las medidas profilácticas o
preventivas. Aquellos que necesitan un tratamiento incluyen los que
ya padecen el trastorno, así como los propensos a
desarrollarlo.
El término "mamífero" para los propósitos de
tratamiento hace referencia a cualquier animal clasificado como
mamífero, incluyendo los humanos, los animales domésticos, de
granja, del zoológico o los animales de compañía, como ovejas,
perros, caballos, gatos, vacas y similares. Preferentemente, el
mamífero es un humano.
El término "vehículos" tal como se utiliza
aquí incluye los vehículos aceptables farmacéuticamente, los
excipientes, o los estabilizantes que no son tóxicos para la célula
o para el mamífero que se expone a las dosificaciones y
concentraciones utilizadas. A menudo, el vehículo aceptable
fisiológicamente se halla en una solución de pH tamponada. Ejemplos
de vehículos aceptables fisiológicamente incluyen los tampones como
el fosfato, el citrato y otros ácidos orgánicos; los antioxidantes
incluyendo el ácido ascórbico; el polipéptido de bajo peso
molecular (inferior a aproximadamente 10 residuos); las proteínas,
como la seroalbúmina, la gelatina, o las inmunoglobulinas; los
polímeros hidrofílicos como el polivinilpirrolidona; los aminoácidos
como la glicina, la glutamina, la asparraguina, la arginina o la
lisina; los monosacáridos, los disacáridos y otros carbohidratos
incluyendo la glucosa, la manosa, o las dextrinas; los agentes
quelantes como el EDTA; los alcoholes de azúcar como el manitol o
el sorbitol; los iones formadores de sales como el sodio; y/o los
tensioactivos como el TWEEN^{TM}, el polietilén glicol (PEG) y el
PLURONICS^{TM}.
El término "agonista" se utiliza para
referirse a los análogos peptídicos y no peptídicos de los
polipéptidos PRO nativos (donde polipéptido PRO nativo hace
referencia a un pro-polipéptido PRO,
pre-polipéptido PRO,
prepro-polipéptido PRO, o polipéptido PRO maduro)
de la presente invención y a los anticuerpos de unión específica
con los polipéptidos PRO nativos, siempre que retengan por lo menos
la actividad biológica de un polipéptido PRO nativo.
Preferentemente, los agonistas de la presente invención retienen
las propiedades de reconocimiento de unión cualitativa y las
propiedades de activación del receptor del polipéptido PRO
nativo.
El término "antagonista" se utiliza para
referirse a una molécula que inhibe la actividad biológica de un
polipéptido PRO nativo de la presente invención, en donde el
polipéptido PRO nativo hace referencia al
pro-polipéptido PRO,
pre-polipéptido PRO,
pre-pro-polipéptido PRO, o al
polipéptido PRO maduro. Preferentemente, los antagonistas inhiben
la unión de un polipéptido PRO nativo de la presente invención con
una pareja de unión. Un polipéptido PRO "antagonista" es una
molécula que prevenga, o interfiera con, una función efectora
antagonista de PRO (p.ej., una molécula que evita o interfiere con
la unión y/o la activación de un receptor del polipéptido PRO por
el polipéptido PRO). Dichas moléculas pueden seleccionarse por su
capacidad para inhibir competitivamente la activación del receptor
del polipéptido PRO mediante el control de la unión del polipéptido
PRO nativo en presencia y ausencia de la molécula antagonista test,
por ejemplo. Un antagonista de la invención también puede abarcar
un polinucleótido antisentido contra el gen del polipéptido PRO.
Dicho polinucleótido antisentido bloquea la transcripción o la
traducción del gen de polipéptido PRO, inhibiendo en consecuencia
su expresión y su actividad biológica.
El término "condiciones astringentes" hace
referencia a (1) la utilización de una fuerza iónica baja y una
temperatura elevada para el lavado, por ejemplo, cloruro sódico
0,015 M/citrato sódico 0,0015M/sodio dodecil sulfato al 0,1% a
50ºC, o (2) la utilización durante la hibridación de un agente
desnaturalizante, como la formamida, por ejemplo, formamida la 50%
(v/v) con albúmina sérica bovina al 0,1%/Ficoll al
0,1%/polivinilpirrolidona al 1%/tampón fosfato sódico 50 nM a pH
6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC. Otro
ejemplo es utilizar formamida al 50%, 5xSSC (NaCl 0,75 M, citrato
sódico 0,075M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico
al 0,1%, solución de Denhardts 5X, DNA de esperma de salmón
sonicado (50 \mug/ml), SDS al 0,1% y dextrán sulfato al 10% a
42ºC con lavados a 42ºC en 0,2XSSC y SDS al 0,1%. Otro ejemplo es
la hibridación que utiliza un tampón de dextrán sulfato al 10%,
2XSSC (cloruro sódico/citrato sódico) y formamida al 50% a 55ºC,
seguido por un lavado a astringencia elevada consistente en 0,1XSSC
con EDTA a 55ºC.
"Condiciones de astringencia moderada" son
las descritas por Sambrook y col., supra, e incluyen la
utilización de una solución de lavado y condiciones de hibridación
(p.ej., temperatura, fuerza iónica, y % de SDS) menos astringentes
que las utilizadas con anterioridad. Un ejemplo de condiciones
astringentes moderadas es una incubación a 37ºC durante toda la
noche en una solución que comprende: formamida al 20%, 5XSSC (NaCl
150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6),
solución de 5X Denhardts, sulfato de dextrano al 10% y 20 mg/ml de
DNA de esperma de salmón desmenuzado y desnaturalizado, seguido de
un lavado de los filtros en 1XSSC a aproximadamente
37-50ºC. El experto en la materia reconocerá cómo
ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc., según sea necesario
para acomodar factores como la longitud de la sonda y
similares.
El "análisis de Southern" o "transferencia
de Southern" es un procedimiento por el que se confirma la
presencia de secuencias de DNA en una digestión de endonucleasas de
restricción o de una composición que contenga DNA mediante
hibridación con un oligonucleótido marcado o fragmento de DNA. El
análisis de Southern implica de forma característica la separación
electroforética de las digestiones de DNA en geles de agarosa, la
desnaturalización del DNA después de la separación electroforética
y la transferencia del DNA a un soporte de nitrocelulosa, nylon u
otro tipo de membrana adecuado para el análisis con una sonda
marcada isotópicamente, biotinilada o marcada con una enzima tal
como se describe en las secciones 9.37-9.52 de
Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York:
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
El "análisis de Northern" o "transferencia
de Northern" es un procedimiento que se utiliza para identificar
las secuencias de RNA que hibridan con una sonda conocida como por
ejemplo un oligonucleótido, un fragmento de DNA, cDNA o fragmento
de lo mismo, o un fragmento de RNA. La sonda se marca con un isótopo
radioactivo como el P^{32}, o mediante biotinilación, o con una
enzima. El RNA a analizar se separa electroforéticamente en un gel
de agarosa o poliacrilamida, se transfiere a la nitrocelulosa,
nylon u otra membrana adecuada y se hibrida con la sonda,
utilizando técnicas estándares bien conocidas en la materia como
las descritas en las secciones 7.39-7.52 de Sambrook
y col., supra.
La presente invención proporciona secuencias
nucleotídicas identificadas de nuevo y aisladas que codifican los
polipéptidos referidos en la presente solicitud como PRO241. En
particular, los solicitantes han identificado y aislado el cDNA que
codifica un polipéptido PRO241, tal como se describe con mayor
detalle en los Ejemplos de más adelante. Utilizando los programas
informáticos de alineamiento de secuencia BLAST y FASTA, los
solicitantes hallaron que las porciones del polipéptido PRO241
tienen una homología significativa con diversas proteínas del
biglicanos. Según ello, se cree que el polipéptido PRO241 descrito
en la presente solicitud es un nuevo polipéptido homólogo del
biglicano que puede poseer la actividad característica de las
proteínas del biglicano.
Además de los polipéptidos PRO de secuencia
nativa de tamaño completo aquí descritos, se contempla que puedan
prepararse variantes del polipéptido PRO mediante la introducción
de cambios nucleotídicos adecuados en el DNA del polipéptido PRO, o
mediante síntesis del polipéptido PRO deseado. Los expertos en la
materia apreciarán que los cambios de aminoácidos pueden alterar los
procesos post-traduccionales de los polipéptidos
PRO, como por ejemplo cambiando el número o la posición de los
sitios de glicosilación o alterando las características de anclaje
en la membrana.
Las variaciones en los polipéptidos PRO de
secuencia de longitud completa o en diversos dominios de los
polipéptidos PRO aquí descritos, pueden realizarse por ejemplo,
utilizando cualquiera de las técnicas y protocolos para generar las
mutaciones conservadoras y no conservadoras indicadas, por ejemplo,
en la patente americana U.S. 5.364.934. Las variaciones pueden ser
una sustitución, deleción o inserción de uno o más codones que
codifican el polipéptido PRO que dé como resultado un cambio en la
secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO en comparación con el
polipéptido PRO de secuencia nativa. Opcionalmente, la variación es
por sustitución de por lo menos un aminoácido con cualquier
aminoácido en uno o más dominios del polipéptido PRO. Una guía para
determinar qué residuo de aminoácido puede insertarse, sustituirse
o delecionarse sin afectar de forma negativa la actividad deseada
puede hallarse comparando la secuencia del polipéptido PRO con la
de las proteínas conocidas homólogas y minimizando el número de
cambios de secuencia aminoacídica en las regiones de elevada
homología. Las sustituciones aminoacídicas pueden resultar del
reemplazamiento de un aminoácido por otro que tenga propiedades
estructurales y/o químicas similares, como por ejemplo el
reemplazamiento de una leucina con una serina, es decir,
reemplazamientos de aminoácidos conservadores. Las inserciones o
deleciones pueden opcionalmente hallarse en el rango de 1 ó 5
aminoácidos. La variación permitida puede determinarse
sistemáticamente mediante inserciones, deleciones o sustituciones
aminoacídicas en la secuencia y comprobando las variantes
resultantes por su actividad en el ensayo in vitro descrito
en los Ejemplos de más adelante.
En la Tabla 1 se muestran las sustituciones
conservadoras de interés bajo el encabezamiento de sustituciones
preferidas para realizaciones particulares. Si dichas sustituciones
dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces se
introducen más cambios esenciales, denominados ejemplos de
sustituciones en la Tabla 1, o como se describe más adelante
referente a las clases de aminoácidos, y a continuación se rastrean
los productos.
Las modificaciones esenciales en la función o en
la identidad inmunológica del polipéptido PRO se logran
seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su
efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del armazón
polipeptídico en el área de la sustitución, por ejemplo, como una
hoja o conformación helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la
molécula en el lugar diana, o (c) el volumen de la cadena lateral.
Los residuos aminoacídicos naturales se dividen en dos grupos según
las propiedades comunes de la cadena lateral:
(1) hidrofóbico: norleucina, met, ala, val, leu,
ile;
(2) hidrofílico neutro: cys, ser, thr;
(3) acídico: asp, glu;
(4) básico: asn, gln, his, lys, arg;
(5) residuos que influencian la orientación de la
cadena: gly, pro; y
(6) aromático: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservadoras implicarán el
intercambio de un miembro de una clase por otro de otra clase.
Dichos residuos sustituidos también pueden introducirse en los
sitios de sustitución conservadora o, más preferentemente, en los
sitios restantes (no-conservados).
Las variaciones pueden realizarse utilizando
procedimientos conocidos en la materia como la mutagénesis por
oligonucleótidos (mutagénesis dirigida), el rastreo de alaninas y
la mutagénesis por PCR. La mutagénesis dirigida [Carter y col.,
Nucl. Acids, Res., 13:4331 (1986); Zoller y col., Nucleic Acids
Res., 10:6487 (1987)], la mutagénesis en cassette [Wells y
col., Gene, 34:315 (1985)], la mutagénesis por selección de
restricción [Wells y col., Philos, Trans, R. Soc, London SerA,
317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas pueden realizarse con el
DNA clonado para producir la variante de DNA del polipéptido PRO
deseada.
El análisis de rastreo de aminoácidos también
puede utilizarse para identificar uno o más aminoácidos en una
secuencia contigua. Entre los aminoácidos preferidos para el
análisis de rastreo destacan los relativamente pequeños y neutros.
Dichos aminoácidos incluyen la alanina, la glicina, la serina y la
cisteína. La alanina es generalmente un aminoácido de rastreo
preferido entre este grupo porque elimina la cadena lateral después
del carbono beta y seguramente altera menos la conformación de la
cadena principal de la variante. Generalmente, también se prefiere
la alanina porque es el aminoácido más común. Además, se halla
frecuentemente tanto en posiciones expuestas como escondidas
[Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chthia, J.
Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si las sustituciones de alanina no
producen cantidades adecuadas de variante, se puede utilizar un
aminoácido isotérico.
Se incluyen dentro del ámbito de la presente
invención las modificaciones covalentes de los polipéptidos PRO. Un
tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar los
residuos aminoacídicos diana del polipéptido PRO con un agente
derivante orgánico que sea capaz de reaccionar con las cadenas
laterales seleccionadas o con los residuos N- o C- terminales del
polipéptido PRO. La derivación con agentes bifuncionales es útil,
por ejemplo, para unir un polipéptido PRO a una matriz de soporte o
superficie insoluble en agua para utilizar en el procedimiento de
purificación de anticuerpos anti-polipéptido PRO y
vice-versa. Los agentes de unión utilizados
comúnmente incluyen, p.ej., el
1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano,
el glutaraldehído, los ésteres de
N-hidroxisuccimida, por ejemplo, los ésteres con el
ácido 4-azidosalicílico, los imidoésteres
homobifuncionales, incluyendo los ésteres de disuccinimidil como el
3-3'-ditiobis(succinimilpropionato),
las maleimidas bifuncionales como el
bis-N-maleimida-1,8-octano
y los agentes como el
metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.
Otras modificaciones incluyen la desamidación de
los residuos glutaminil y asparraguinil a los correspondientes
residuos glutamil y aspartil, respectivamente, la hidroxilación de
la prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de
residuos seril o treonil, la metilación de los grupos
\alpha-amino de las cadenas laterales de la
lisina, arginina e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure
and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco,
pp. 79-86 (1983)], la acetilación de la amina
N-terminal y la amidación del grupo carboxilo
C-terminal.
Otro tipo de modificación covalente de los
polipéptidos PRO incluidos dentro delámbito de la presente
invención comprende la alteración del patrón de glicosilación
nativo del polipéptido. En la presente invención, la "alteración
del patrón de glicosilación nativo" se realiza con el propósito
de delecionar una o más porciones de carbohidratos que se hallen en
un polipéptido PRO de secuencia nativa, y/o añadir uno o más sitios
de glicosilación que no estén presentes en el polipéptido PRO de
secuencia nativa, y/o alterar la proporción y/o composición de los
residuos de azúcar unidos al sitio(s) de glicosilación.
La adición de sitios de glicosilación al
polipéptido PRO puede lograrse alterando la secuencia aminoacídica.
La alteración puede realizarse, por ejemplo, mediante la adición
de, o la sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina
al polipéptido PRO de secuencia nativa (para los sitios de
O-glicosilación). La secuencia aminoacídica del
polipéptido PRO puede alterarse opcionalmente mediante cambios a
nivel del DNA, en particular mutando el DNA que codifica el
polipéptido PRO en bases preseleccionadas para que los codones que
se generen traduzcan los aminoácidos deseados.
Otros medios para aumentar el número de porciones
de carbohidratos en el polipéptido PRO se lleva a cabo mediante el
acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al polipéptido.
Dichos procedimientos se describen en la materia, p.ej., en la
patente internacional WO 87/05330 publicada el 11 de setiembre de
1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp.
259-306 (1981).
La eliminación de porciones de carbohidratos
presentes en el polipéptido PRO puede lograrse química o
enzimáticamente o mediante la sustitución mutacional de codones que
codifique para residuos aminoacídicos que sirven como dianas para la
glicosilación. Las técnicas de desglicosilación química son
conocidas en la materia y se describen, por ejemplo, por
Hakimuddin, y col., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y por
Edge y col., Anal. Biochem., 118:131 (1981). El corte enzimático de
las porciones de carbohidratos en los polipéptidos puede lograrse
utilizando diversas endo- y exo-glicosidasas como
las descritas por Thotakura y col., Meth. Enzymol., 138:350
(1987).
(1987).
Otro tipo de modificación covalente de los
polipéptidos PRO de la invención comprende la unión del polipéptido
PRO con uno de los muchos polímeros no-proteicos
existentes, p.ej., el polietilén glicol, el polipropilén glicol, o
los polialquilenos, tal como se describe en las patentes americanas
U.S. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 417; 4.791.192 ó
4.179.337.
Los polipéptidos PRO de la presente invención
también pueden modificarse para formar una molécula quimérica que
comprenda un polipéptido PRO fusionado con otro, polipéptido o
secuencia aminoacídica heteróloga. En una realización, una tal
molécula quimérica comprende una fusión del polipéptido PRO con un
polipéptido etiqueta que proporciona un epitopo al que se puede unir
selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta. La
etiqueta epitópica se coloca generalmente en el extremo amino- o
carboxi-terminal del polipéptido PRO. La presencia
de dichas formas etiquetadas con epitopos del polipéptido PRO puede
detectarse utilizando un anticuerpo contra el polipéptido etiqueta.
También, la provisión de la etiqueta epitópica permite que el
polipéptido PRO sea fácilmente purificable mediante purificación
por afinidad utilizando un anticuerpo anti-etiqueta
u otro tipo de matriz de afinidad que se une a la etiqueta
epitópica. En una realización alternativa, la molécula quimérica
puede comprender una fusión del polipéptido PRO con una
inmunoglobulina o una región determinada de inmunoglobulina. Para
una forma bivalente de la molécula quimérica, dicha fusión podría
ser la región Fc de una molécula de IgG.
Se conocen en la materia diversos polipéptidos
etiqueta y sus respectivos anticuerpos. Los ejemplos incluyen las
etiquetas de
poli-histidina(poli-his) o
poli-histidina-glicina
(poli-his-gly); el polipéptido
etiqueta HA del virus del resfriado y su anticuerpo 12CA5 [Field y
col., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; la
etiqueta de c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10,
G4, B7 y 9E10 [Evan y col., Molecular and Cellular Biology,
5:3610-3616 (1985)]; y la de la glicoproteína D
(gD) del virus Herpes Simplex y su anticuerpo [Paborsky y col.,
Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)].
Otros polipéptidos etiqueta incluyen el péptido Flag [Hopp y col.,
bioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; el péptido
epitópico KT3 [Martin y col., Science, 255:192-194
(1992)]; un péptido epitópico de la
\alpha-tubulina [Skinner y col., J. Biol. Chem.,
266:15163-15166 (1991)]; y la etiqueta peptídica de
la proteína 10 del gen T7 [Lutz-Freyermuth y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397
(1990)].
La descripción de más adelante hace referencia en
primer lugar a la producción de polipéptidos PRO mediante el
cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que
contenga el ácido nucleico del polipéptido PRO deseado. Se
contempla, desde luego, que procedimientos alternativos, que son
bien conocidos en la materia, puedan utilizarse para preparar el
polipéptido PRO. Por ejemplo, la secuencia del polipéptido PRO, o
porciones de ésta, puede producirse mediante síntesis peptídica
directa utilizando técnicas de fase sólida [véase, p.ej., Stewart y
col., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman
co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc.,
85:2149-2154 (1963)]. La síntesis de proteínas
in vitro puede realizarse utilizando técnicas manuales o
automáticas. La síntesis automatizada puede llevarse a cabo, por
ejemplo, utilizando un sintetizador de péptidos de Applied
Biosystems (Foster City, CA) según las instrucciones del
fabricante. Diversas porciones del polipéptido PRO deseado pueden
sintetizarse químicamente por separado y combinarse utilizando
procedimientos químicos o enzimáticos para producir el polipéptido
PRO de tamaño completo.
El DNA que codifica los polipéptidos PRO puede
obtenerse a partir de una librería de cDNA preparada a partir de
tejido que supuestamente expresan el mRNA del polipéptido PRO a un
nivel detectable. Según ello, el DNA del polipéptido PRO humano
puede obtenerse de forma adecuada a partir de una librería de cDNA
preparada a partir de tejido humano, tal como se describe en los
Ejemplos. El gen que codifica para el polipéptido también puede
obtenerse a partir de una librería genómica o mediante síntesis de
oligonucleótidos.
Las librerías pueden rastrearse con sondas (como
por ejemplo anticuerpos contra el polipéptido PRO deseado u
oligonucleótidos de por lo menos 20-80 bases)
diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína
codificada. El rastreo de la librería genómica o de cDNA con la
sonda seleccionada puede realizarse mediante procedimientos
estándares, como el descrito en Sambrook y col., Molecular
Clonings: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo para aislar el gen que
codifica el polipéptido PRO es utilizar la metodología de la PCR
[Sambrook y col., supra; Dieffenbach y col., PCR Primer: A
Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
Los ejemplos siguientes describen técnicas para
el rastreo de una librería de cDNA. Las secuencias de
oligonucleótidos seleccionadas como sondas deberían ser de longitud
suficiente y lo suficientemente no ambiguas para minimizar los
falsos positivos. Es preferible marcar el oligonucleótido para que
pueda ser detectado después de la hibridación con el DNA en la
librería que se rastrea. Los procedimientos de marcaje son bien
conocidos en la materia e incluyen la utilización de ATP marcado
con P^{-32}, biotina o con una enzima. Las condiciones de
hibridación, incluyendo la astringencia moderada y elevada, se
describen en Sambrook y col., supra.
Las secuencias identificadas en dichos
procedimientos de rastreo de librerías pueden compararse y
alinearse con las secuencias conocidas depositadas y disponibles en
las bases de datos públicas como GenBank u otras bases de datos de
secuencias privadas. La identidad de secuencia puede determinarse
mediante alineamiento de secuencias utilizando el programa
informático como BLAST, ALIGN, DNAstar e INHERIT que utilizan
algoritmos para cuantificar la homología.
El ácido nucleico que contiene la secuencia
codificante de la proteína puede obtenerse mediante el rastreo de
librerías de cDNA o genómicas seleccionadas utilizando la secuencia
aminoacídica deducida que se describe por primera vez, y, si fuera
necesario, utilizando procedimientos convencionales de extensión del
cebador tal como se describe en Sambrook y col., supra, para
detectar los precursores y los intermediarios del procesamiento del
mRNA que no se han transcrito de forma inversa en cDNA.
Las células hospedadoras se transfectan o
transforman con los vectores de expresión o clonaje aquí descritos
para la producción del polipéptido PRO y se cultivan en medios
nutritivos convencionales modificados según convenga para inducir
los promotores, seleccionar los transformantes o amplificar los
genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de
cultivo, como el medio, la temperatura, el pH y similares, pueden
seleccionarse por el experto en la materia sin excesiva
experimentación. En general, las indicaciones, protocolos y
técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos
celulares se pueden hallan en Mammalian Cell Biotechnology: a
Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook y
col., supra.
Los procedimientos de transfección son conocidos
por el experto en la materia, por ejemplo, el CaPO4 y la
electroporación. Dependiendo de la célula hospedadora utilizada, la
transformación se realiza utilizando técnicas estándares adecuadas
para dichas células. Generalmente, se utiliza el tratamiento del
cloruro cálcico, tal como se describe en Sambrook y col.,
supra, o la electroporación para células procariotas u otras
células que contengan barreras de paredes celulares importantes. La
infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la
transformación de ciertas células vegetales, tal como se describe
por Shaw y col., Gene, 23:315 (1983) y la patente internacional WO
89/05859 publicada el 29 de junio de 1989. Para las células de
mamífero sin paredes celulares, puede utilizarse el procedimiento
de la precipitación con fosfato cálcico de Graham y van der Eb,
Virology, 52:456-457 (1978). En la patente
americana U.S. 4.399.216 se describen aspectos generales de la
transformación de células hospedadoras. Las transformaciones en
levaduras se llevan a cabo típicamente de acuerdo con el
procedimiento de Van Solingen y col., J. Bact., 130:946 (1977) y
Hsiao y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Sin
embargo, también se pueden utilizar otros procedimientos para la
introducción de DNA en las células, como la microinyección nuclear,
la electroporación, la fusión de protoplastos bacterianos con
células intactas, o los policationes p.ej., el polibreno y la
poliornitina. Para diversas técnicas de transformación de células
de mamífero, véase también, Keown y col., Methods in Enzymology
185:527-537 (1990) y Mansour y col., Nature,
336:348-352 (1988).
Las células hospedadoras adecuadas para el
clonaje o la expresión del DNA en los vectores de la presente
invención incluyen las células procariotas, levaduras o eucariotas
superiores. Los procariotas adecuados incluyen pero no se limitan a
las eubacterias, como los organismos Gram-negativos
o Gram positivos, por ejemplo, las Enterobacteriáceas como E.
coli. Diversas cepas de E. coli están disponibles
públicamente, como E. coli K12 cepa MM294 (ATC 31.446);
E. coli X1776 (ATCC 31.537); E. coli cepa W3110 (ATCC
27.325) y K5 772 (ATCC 53.635). Otras células hospedadoras
procariotas adecuadas incluyen las Enterobacteriáceas como
Escherichia, p.ej., E. coli, Enterobacter,
Erwinina, Klebsiella, Proteus, Salmonella, p.ej.,
Salmonella typhimurium, Serratia, p.ej., Serratina
marcescans y Shigella, así como B. Subtilis y
B. licheniformis (p.ej., B. licheniformis 41P
descrito en la patente DD 266.710, publicada el 12 de Abril de
1989), Pseudomonas como P. aeruginosa, y
Streptomyces. Diversas cepas de E. coli son de
disponibilidad pública, como E. coli K12 cepa MM294 (ATCC
31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); E. coli cepa
W3110 (ATCC 27.325) y K5 772 (ATCC 53.635). Estos ejemplos son
ilustrativos en lugar de limitantes. La cepa W3110 es uno de los
huéspedes especialmente preferidos o huésped parental porque es una
cepa huésped común para las fermentaciones de productos del DNA
recombinante. Preferentemente, la célula hospedadora secreta
cantidades mínimas de enzimas proteolíticos. Por ejemplo, la cepa
W3110 puede modificarse para obtener una mutación genética en los
genes que codifican las proteínas endógenas del huésped. Ejemplos
de ello incluyen la cepa 1A2 de E. coli W3110, que tiene el
genotipo completo tonA; la cepa 9E4 de E. coli W3110,
que tiene el genotipo completo de tonA ptr3; la cepa 27C7 de
W3110 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo tonA ptr3
phoA E15 (argF-lac)169 degP
ompT Karn^{r}; la cepa 37D6 de E. coli W3110, que
tiene el genotipo completo tonA ptr3phoA E15
(argF-lac)169 degP ompT rbs7itvG
Kan^{r}; la cepa 40B4 de E. coli W3110, que la cepa
37D6 con una mutación, deleción degP, de no resistencia a la
kanamicina; y una cepa de E. coli que tiene una proteasa
periplásmica mutante descrita en la patente americana U.S.
4.946.783, publicada el 7 de agosto de 1990. Alternativamente,
también son adecuados los procedimientos in vitro de
clonaje, p.ej., PCR u otras reacciones de la polimerasa de ácidos
nucleicos.
Además de los procariotas, los microbios
eucariotas como los hongos filamentosos o las levaduras son
adecuados para el clonaje o expresión de vectores que codifican el
polipéptido PRO. Sacharomyces cerevisiae es un microorganismo
huésped eucariota inferior utilizado comúnmente. Otros huéspedes
incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, 290; 140
[1981]; patente europea EP 139.383 publicada el 2 de mayo de 1985);
Kluyveromyces (patente americana U.S. 4.943.529; Fleer y
col., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) como por
ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574;
Louvencourt y col., J. Bacteriol., 737 [1983]), K. fragilis
(ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii
(ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K.
drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg y col.,
Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans y K.
marxianus; Yarrowia (patente europea EP 402.226);
Pichia pastoris (patente europea EP 183.070; Sreekrishna y
col., J. Basic. Microbiol., 28:265-278 [1988]);
Candida; Trichoderma reesia (patente europea EP 244.234);
Neurospora crassa (Case y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces como
Schwanniomyces occidentalis (patente europea EP 394.538,
publicada el 31 de octubre de 1990); y los hongos filamentosos como
por ejemplo Neurospora, Penicillium, tolypocladium (patente
internacional WO 91/00357, publicada el 10 de Enero de 1991), y
huéspedes de Aspergillus como A. nidulans (Ballance y
col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289
[1983]; Tilburn y col., Gene, 26:205-221 [1983];
Yelton y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
81:1470-1474 [1984]) y A. niger (Kelly y
Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]). Las levaduras
metilotrópicas son adecuadas aquí e incluyen, pero no se limitan a,
las levaduras capaces de crecer en metanol seleccionadas a partir
del género que consisten en Hansenula, Candida, Kleokera,
Pichia, Sacharomyces, Torulopsis y Rhodotorula. Una
lista de especies específicas que son ejemplos de esta clase de
levaduras puede hallarse en C. Anthony. The Biochemistry of
Methylotrophs, 269 (1982).
Las células hospedadoras adecuadas para la
expresión de los polipéptidos PRO glicosilados se derivan de
organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados
incluyen las células de insecto como las de Drosophila S2 y
Spodoptera Sf9, así como células vegetales. Ejemplos de líneas
celulares de mamíferos útiles incluyen las células de ovario de
hámster chino (CHO) y las células COS. Ejemplos más específicos
incluyen la línea CV1 de riñón de mono transformada con SV40
(COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embrional
humano (293 o células 293 subclonadas para el crecimiento en
cultivo en suspensión, Graham y col., J. Gen. Virol., 36:59
(1977)); las células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub
y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); las células
de sertoli murinas (TM4, Mather, Biol. Reprod.,
23:243-251 (1980)); las células de pulmón humano
(W138, ATCC CCL 75); las células de hígado humano (Hep G2, HB
8065); y de tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51). La
selección de la célula hospedadora adecuada dependerá del experto en
la materia.
El ácido nucleico (p.ej., cDNA o DNA genómico)
que codifica un polipéptido PRO deseado puede insertarse en un
vector replicable para el clonaje (amplificación del DNA) o para la
expresión. Diversos vectores están disponibles públicamente. El
vector, por ejemplo, puede estar en la forma de un plásmido,
cósmido, partícula viral o fago. La secuencia de ácido nucleico
adecuada puede insertarse en el vector mediante diversos
procedimientos. En general, el DNA se inserta en una(s)
diana(s) de restricción utilizando técnicas conocidas en la
materia. Los componentes del vector incluyen generalmente, pero no
se limitan a, una o más secuencias señal, un origen de replicación,
uno o más genes marcadores, un elemento intensificador, un promotor
y una secuencia de terminación de la transcripción. La construcción
de vectores adecuados que contiene uno o más de estos componentes
utiliza técnicas de ligación estándares que son conocidas por el
experto en la materia.
El polipéptido PRO de interés puede producirse de
forma recombinante, no sólo directamente sino también como un
polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser
una secuencia señal u otro polipéptido que contenga una diana de
corte específica en el extremo N-terminal de la
proteína o polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede
ser un componente del vector, o puede ser una parte del DNA del
polipéptido PRO que se inserta en el vector. La secuencia señal
puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo,
a partir del grupo de la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, lpp o
los líderes de la enterotoxina II termo-estables.
Para la secreción en levaduras, la secuencia señal puede ser, por
ejemplo, el líder de la invertasa de levaduras, el líder del factor
alfa (incluyendo los líderes del factor-\alpha de
Sacharomyces y Kluyveromyces, este último descrito en
la patente americana U.S. 5.010.182), o el líder de la fosfatasa
ácida, el líder de la glucoamilasa de C. albicans (patente europea
EP 362.179, publicada el 4 de abril de 1990), o la secuencia señal
de la patente internacional WO 90/13646, publicada el 15 de
noviembre de 1990. En la expresión en células de mamífero, las
secuencias señal pueden utilizarse para dirigir la secreción de la
proteína, como las secuencias señal de polipéptidos secretados en
la misma o especies relacionadas, así como de líderes secretores
virales.
Tanto los vectores de expresión como de clonaje
contienen una secuencia de ácido nucleico que permite la
replicación del vector en una o más células hospedadoras
seleccionadas. Dichas secuencias se conocen en diversas bacterias,
levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido PBR322 es
adecuado para la mayoría de bacterias
Gram-negativas, el origen del plásmido 2 \mu es
adecuado para levaduras, y varios orígenes virales (SV40, polioma,
adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonaje en las
células de mamífero.
Los vectores de expresión y clonaje contendrán
característicamente un gen de selección, también denominado un
marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican
proteínas que (a) confieren resistencia a los antibióticos u otras
toxinas, p.ej., ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina,
(b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) aportan
nutrientes críticos no disponibles a partir de medios complejos,
p.ej., el gen que codifica la D-alanina racemasa de
Bacilli.
Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados
para células de mamífero son los que permiten la identificación de
células competentes para incorporar el ácido nucleico del
polipéptido PRO, como el DHFR o la timidina quinasa. Una célula
hospedadora adecuada cuando se utiliza el DHFR de tipo salvaje es la
línea celular CHO deficiente en actividad DHFR, preparada y
propagada tal como se describe por Urlaub y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección adecuado para
utilizar con levaduras es el gen trp1 presente en el
plásmido de levaduras YRp7 [Stinchcomb y col., Nature, 282:39
(1979); Kingsman y col., Gene, 7:141 (1979); Tschemper y col., Gene,
10:157 (1980)]. El gen trp1 proporciona un marcador seleccionable
para una cepa mutante de levaduras carente de la capacidad para
crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC Nº 44076 o
PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].
Los vectores de expresión y clonaje contienen
generalmente un promotor unido operativamente a la secuencia de
ácido nucleico del polipéptido PRO para dirigir la síntesis del
mRNA. Los promotores reconocidos por una diversidad de células
hospedadoras potenciales son bien conocidos en la materia. Los
promotores adecuados para utilizar con huéspedes procariotas
incluyen los sistemas del promotor de la
\beta-lactamasa y la lactosa [Chang y col.,
Nature, 275:615 (1978); Goeddel y col., Nature, 281:544 (1979)], el
promotor de la fosfatasa alcalina, el promotor del triptófano (trp)
[Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); patente europea EP
36.776], y los promotores híbridos como el promotor tac [deBoer y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)].
Los promotores para utilizar con sistemas bacterianos también
contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.)
unida operativamente al DNA que codifica el polipéptido PRO
deseado.
Ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para
utilizar con huéspedes de levaduras incluyen los promotores de la
3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman y col., J. Biol.
Chem., 255:2073 (1980)] u otras enzimas glicolíticas [Hess y col.,
J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900
(1978)], como la enolasa, la
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, la hexoquinasa, la piruvato descarboxilasa, la
fosfofructoquinasa, la
glucosa-6-fosfato isomerasa, la
3-fosfoglicerato mutasa, la piruvato quinasa, la
triosafosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa y la
glucoquinasa.
Otro de los promotores de levaduras inducibles,
que tienen la ventaja adicional de presentar una transcripción
controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones
promotoras de la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C,
fosfatasa ácida, las enzimas de degradación asociadas con el
metabolismo del nitrógeno, la metalotioneina, la
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa y las enzimas responsables de la utilización de la
maltosa y la galactosa. Los vectores adecuados y los promotores
para utilizar en la expresión con levaduras se describen en la
patente europea EP 73.657.
La transcripción del polipéptido PRO a partir de
vectores en células hospedadoras de mamífero se controla, por
ejemplo, mediante promotores obtenidos a partir del genoma de virus
como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar (patente
inglesa UK 2.211.504, publicada el 5 de julio de 1989), el
adenovirus (como el Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el
virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, el
virus de la hepatitis B y el Simian Virus 40 (SV40), también a
partir de promotores de mamífero heterólogos, p.ej., el promotor de
la actina o un promotor de la inmunoglobulina, y a partir de
promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean
compatibles con los sistemas de células hospedadoras.
La transcripción de un DNA que codifica el
polipéptido PRO deseado por eucariotas superiores puede
incrementarse por la inserción de una secuencia intensificadora en
el vector. Los intensificadores son elementos de actuación en cis
del DNA, generalmente de aproximadamente 10 a 300 pb, que actúan
sobre un promotor incrementando su transcripción. Actualmente, se
conocen muchas secuencias intensificadoras de mamíferos (globina,
elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e
insulina). Sin embargo, se utilizará generalmente un intensificador
de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el
intensificador de SV40 en la región tardía del origen de replicación
(pb 100-270), el intensificador del promotor
temprano de citomegalovirus, el intensificador del polioma en la
región tardía del origen de replicación y los intensificadores del
adenovirus. El intensificador puede ayustarse en el vector en una
posición 5' o 3' de la secuencia codificante del polipéptido PRO,
pero se localiza preferentemente en posición 5' del
promotor.
promotor.
Los vectores de expresión utilizados en las
células eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales,
humanos, o células nucleadas de otros organismos multicelulares)
contendrán también secuencias necesarias para la finalización de la
transcripción y para la estabilización del mRNA. Dichas secuencias
están comúnmente en las regiones terminales no traducidas 5' y,
ocasionalmente, en 3' de los DNAs virales o eucariotas o cDNAs.
Estas regiones contienen segmentos nucleotídicos transcritos como
fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del mRNA que
codifica los polipéptidos PRO.
En Gething y col., Nature,
293:620-625 (1981); Mantel y col., nature
281:40-46 (1979); patente europea EP 117.060 y EP
117.058, se describen otros procedimientos, vectores y células
hospedadoras adecuados para la adaptación a la síntesis de
polipéptidos PRO en cultivos de células de vertebrados
recombinantes.
La amplificación y/o la expresión génica puede
cuantificarse directamente en una muestra, por ejemplo, mediante
transferencia de Southern convencional, o la transferencia de
Northern para cuantificar la transcripción del mRNA [Thomas, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)],
transferencia de mancha (análisis de DNA), o la hibridación in
situ, utilizando una sonda marcada adecuada, basada en las
secuencias proporcionadas aquí. Alternativamente, se pueden
utilizar anticuerpos que puedan reconocer dúplex específicos,
incluyendo dúplex de DNA, dúplex de RNA y dúplex de híbridos
DNA-RNA o de DNA-proteína. Los
anticuerpos a su vez pueden marcarse y el ensayo se puede llevar a
cabo si el dúplex se une a una superficie de modo que, tras la
formación del dúplex sobre la superficie, sea posible detectar la
presencia del anticuerpo unido al dúplex.
Alternativamente, la expresión del gen puede
detectarse mediante procedimientos inmunológicos, como la tinción
inmunohistoquímica de células o secciones de tejido y ensayo del
cultivo de células o fluidos corporales, para cuantificar
directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos de
utilidad para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo de
muestras de fluido pueden ser monoclonales o policlonales, y pueden
prepararse a partir de cualquier mamífero. De forma conveniente,
los anticuerpos pueden generarse contra una secuencia nativa del
polipéptido PRO o contra un péptido sintético basado en las
secuencias de DNA proporcionadas en la presente invención o contra
secuencias exógenas fusionadas con un DNA del polipéptido PRO y que
codifican un epitopo específico para el anticuerpo.
Las formas de los polipéptidos PRO pueden
recuperarse a partir del medio de cultivo o a partir de lisados de
células hospedadoras. Si está unido a la membrana celular, puede
liberarse de la membrana utilizando una solución detergente
adecuada (p.ej., Triton X-100) o mediante corte
enzimático. Las células utilizadas en la expresión de los
polipéptidos PRO pueden romperse por diversos medios físicos o
químicos, como ciclos de congelación y descongelación, sonicación,
rotura mecánica o por agentes de lisis celular.
Puede ser deseable purificar los polipéptidos PRO
de las proteínas o polipéptidos recombinantes de las células. Los
siguientes procedimientos son ejemplos de procesos de purificación
adecuados: mediante fraccionamiento o una columna de intercambio
iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa;
cromatografía en sílice o con una resina de intercambio catiónico
como el DEAE; el cromatoenfoque; SDS-PAGE;
precipitación con persulfato amónico; filtración en gel utilizando,
por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A
Sepharose para eliminar los contaminantes como la IgG; y columnas
de quelación de metales para unir las formas etiquetadas con
epitopo del polipéptido PRO. Se pueden utilizar diversos
procedimientos de purificación de proteínas, que son conocidos en
la materia y están descritos por ejemplo en Deutsche, Methods in
Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles
and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). La
etapa(s) de purificación seleccionada dependerá, por
ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y del
polipéptido PRO particular producido.
Las secuencias nucleotídicas (o su complemento)
que codifican los polipéptidos PRO de la presente invención tienen
diversas aplicaciones en el campo de la biología molecular,
incluyendo utilizaciones como sondas de hibridación, en el mapeo de
cromosomas y genes y en la generación de DNA y RNA
anti-sentido. El ácido nucleico que codifica el
polipéptido PRO también será de utilidad para la preparación de los
polipéptidos PRO mediante las técnicas recombinantes descritas
aquí.
El ácido nucleico del polipéptido PRO de
secuencia nativa y completa o porciones de lo mismo pueden
utilizarse como sondas de hibridación para una librería de cDNA con
el fin de aislar el gen del polipéptido PRO de tamaño completo, o
para aislar otros genes (por ejemplo, aquellos que codifican
variantes naturales del polipéptido PRO o polipéptidos PRO de otras
especies), que tienen una identidad de secuencia deseada con las
secuencias de ácidos nucleicos de polipéptidos PRO. Opcionalmente,
la longitud de las sondas será de aproximadamente 20 a 50 bases.
Las sondas de hibridación pueden derivarse de la secuencia
nucleotídica de cualquiera de las moléculas de DNA o de secuencias
genómicas incluyendo los promotores, elementos intensificadores e
intrones del DNA que codifica el polipéptido Pro de secuencia
nativa. A modo de ejemplo, un procedimiento de cribaje comprenderá
el aislamiento de la región codificante del gen del polipéptido PRO
utilizando la secuencia de DNA conocida para sintetizar una sonda
seleccionada de aproximadamente 40 bases. Las sondas de hibridación
pueden marcarse mediante diversos marcajes, incluyendo los
radionucleótidos como el P^{32} o S^{35}, o marcajes
enzimáticos como la fosfatasa alcalina acoplada a la sonda mediante
sistemas de acoplamiento avidina/biotina. Las sondas marcadas que
tienen una secuencia complementaria con la específica del gen del
polipéptido PRO de la presente invención pueden utilizarse para
rastrear librerías humanas de cDNA, DNA genómico o mRNA y
determinar qué miembros de dichas librerías hibridan con la sonda.
Las técnicas de hibridación se describen con mayor detalle en los
Ejemplos de más adelante.
Los ESTs descritos en la presente solicitud
pueden utilizarse también como sondas con los procedimientos
descritos aquí.
Las sondas también pueden utilizarse en técnicas
de PCR para generar un grupo de secuencias para la identificación
de secuencias de polipéptidos PRO estrechamente relacionadas.
Las secuencias nucleotídicas que codifican un
polipéptido PRO también pueden utilizarse para construir sondas de
hibridación para el mapeo del gen que codifica el polipéptido PRO y
para el análisis genético de los individuos con trastornos
genéticos. Las secuencias nucleotídicas que aquí se proporcionan
pueden localizarse en un cromosoma determinado y en las regiones
específicas de éste cromosoma utilizando técnicas conocidas, como
la hibridación in situ, el análisis de ligamiento contra
marcadores cromosómicos conocidos y el rastreo de librerías
mediante hibrida-
ción.
ción.
Cuando la secuencia codificante para el
polipéptido PRO codifica una proteína que se une a otra proteína,
puede utilizarse el polipéptido PRO en ensayos para identificar sus
ligandos. De manera similar, pueden identificarse los inhibidores
de la interacción de unión receptor/ligando. Las proteínas
implicadas en dichas interacciones de unión pueden también
utilizarse para rastrear los inhibidores de péptidos o de moléculas
pequeñas agonistas de la interacción de la unión. Los ensayos de
cribaje pueden diseñarse para hallar compuestos importantes que
mimeticen la actividad biológica de un polipéptido PRO nativo o un
ligando para el polipéptido PRO. Dichos ensayos de rastreo
incluirán ensayos capaces de realizar un análisis de alto
rendimiento de las librerías químicas, haciéndolos en especial
adecuados para la identificación de moléculas pequeñas como
fármacos candidatos. Estas moléculas pequeñas incluyen los
compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos. Los ensayos pueden
realizarse en diversos formatos, incluyendo los ensayos de unión
proteína-proteína, los ensayos de rastreo
bioquímico, los inmunoensayos y los ensayos basados en células, los
cuales están bien caracterizados en la materia.
Los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido
PRO o sus formas modificadas se pueden también utilizar para
generar animales transgénicos o "knock out" que, a su vez, son
de utilidad en el desarrollo y rastreo de reactivos de utilidad
terapéutica. Un animal transgénico (p.ej., un ratón o una rata) es
un animal que tiene células que contienen un transgén, el cual se
ha introducido en el animal o en un ancestro del animal en un
estadio prenatal, p.ej., embrional. Un transgén es un DNA que se ha
integrado en el genoma de una célula, a partir de la cual se
desarrolla el animal transgénico. En una realización, el cDNA que
codifica un polipéptido PRO de interés puede utilizarse para clonar
el DNA genómico que codifica el polipéptido PRO de acuerdo con las
técnicas establecidas y las secuencias genómicas se pueden utilizar
para generar animales transgénicos que contengan células que
expresen el DNA que codifica el polipéptido PRO. Los procedimientos
para generar animales transgénicos, en particular animales como
ratones o ratas, se han convertido en convencionales en la materia
y se describen, por ejemplo, en las patentes americanas U.S.
4.736.866 y 4.870.009. En general, la expresión del transgén del
polipéptido PRO está dirigida a células determinadas mediante la
incorporación de intensificadores específicos de tejido. Los
animales transgénicos con una copia de un transgén que codifica un
polipéptido Pro introducido en la línea germinal del animal en un
estadio embrionario pueden utilizarse para examinar el efecto en el
aumento de la expresión del DNA que codifica el polipéptido PRO.
Dichos animales pueden utilizarse como animales de prueba para
reactivos que confieran protección contra, por ejemplo, las
condiciones patológicas asociadas con su sobreexpresión. De acuerdo
con esta faceta de la invención, se trata un animal con el reactivo
y se relaciona la reducción en la incidencia de la condición
patológica, en comparación con los animales no tratados que también
portan el transgén, con una indicación de un posible terapéutico
para la condición patológica.
Alternativamente, se pueden utilizar homólogos
no-humanos de polipéptidos PRO para construir un
animal "knock out" del polipéptido PRO que tenga un gen
defectuoso o alterado que codifique un polipéptido PRO de interés.
Ello se produce como resultado de la recombinación homóloga entre
el gen endógeno que codifica el polipéptido PRO y el DNA genómico
alterado que codifica el polipéptido PRO introducido en una célula
embrional del animal. Por ejemplo, el cDNA que codifica un
polipéptido PRO puede utilizarse para clonar el DNA genómico del
polipéptido PRO de acuerdo con técnicas establecidas. Una porción
del DNA genómico que codifica un polipéptido PRO puede delecionarse
o reemplazarse por otro gen, como un gen que codifica un marcador
seleccionable que puede utilizarse para controlar la integración.
De forma característica, en el vector se incluyen varias kilobases
de DNA flanqueante inalterado (tanto en el extremo 5' como en el
3') [véase p.ej., Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una
descripción de vectores de recombinación homóloga]. El vector se
introduce en una línea celular embrional (p.ej., mediante
electroporación) y se seleccionan las células en las que se ha
introducido el DNA que se ha recombinado homólogamente con el DNA
endógeno [véase p.ej., Cell, 69:915 (1992)]. Las células
seleccionadas se inyectan a continuación en un blastocisto de un
animal (p.ej., un ratón o una rata) para formar quimeras por
agregación [véase p.ej., Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic
Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed., (IRL,
Oxford, 1987), pp. 113-152]. A continuación, se
implanta un embrión quimérico en un animal huésped hembra
pseudopreñada y se lleva a término el embrión para crear un animal
"knock out". La progenie portadora del DNA recombinado
homólogamente en las células germinales puede identificarse
mediante técnicas estándares y utilizarse para criar animales en
los que todas las células del animal contendrán el DNA recombinado
de forma homóloga. Los animales knock out pueden caracterizarse por
ejemplo, por su capacidad para defenderse contra ciertas condiciones
patológicas y por su desarrollo de las condiciones patológicas
debido a la ausencia del polipéptido PRO.
Cuando se utiliza la administración in
vivo de un polipéptido PRO, las cantidades normales de
dosificación pueden variar desde 10 ng/Kg hasta 100 mg/Kg de peso
corporal del mamífero o más por día, preferentemente de
aproximadamente 1 \mug/Kg/día a 10 mg/Kg/día, dependiendo de la
vía de administración. Una guía para dosificaciones particulares y
procedimientos de liberación se proporciona en la literatura; véase
por ejemplo, las patentes americanas U.S. 4.657.760; 5.206.344; ó
5.225.212. Se espera que distintas formulaciones sean efectivas en
compuestos para tratamientos distintos y trastornos diversos, y que
dicha administración dirigida a un órgano o tejido pueda necesitar
una liberación de forma distinta para un órgano o tejido
distinto.
Cuando se requiere una administración de
liberación prolongada de un polipéptido PRO en una formulación con
características adecuadas de liberación para el tratamiento de
cualquier enfermedad o trastorno que necesite la administración del
polipéptido PRO, se contempla la microencapsulación del polipéptido
PRO. La microencapsulación de proteínas recombinantes para la
liberación prolongada se ha realizado satisfactoriamente con la
hormona de crecimiento humano (rhGH), el interferón-(rhIFN), la
interleuquina-2 y el MN rgp120. Johnson y col., Nat.
Mod. 2:795-799 81996); Yasuda, Biomed. Ther.,
27:1221-1223 (1993); Hora y col., bio/Technology,
8:755-758 (1990); Cleland, "Desing and Production
of Single Inmunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide
Micrsophere Systems", enVaccin Desing: The Subunit and Adjuvant
Approach, Powell and Newman, ed., (Plenum Press: New York, 1995),
pp. 439-462; las patentes internacionales WO
97/03692; WO 96/40072; WO 96/07399; y la patente americana U.S.
5.654.010.
Las formulaciones de liberación prolongada de
estas proteínas se desarrollaron utilizando el polímero de ácido
poli-láctico-glicólico (PLGA) por su
biocompatibilidad y amplia gama de propiedades biodegradables. Los
productos de degradación de PLGA, ácidos láctico y glicólico,
pueden eliminarse rápidamente del cuerpo humano. Además, la
degradabilidad de este polímero puede ajustarse de meses a años
dependiendo de su peso molecular y composición. Lewis, "Controlled
release of bioactive agents from lactide/gliclide polymer", en:
M. Chasin y R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug
Delivery Systems (Marcel Dekker, New York, 1990), pp.
1-41.
Por ejemplo, para una formulación que pueda
proporcionar una dosificación de aproximadamente 80 g/Kg/día en
mamíferos con un peso corporal máximo de 85 Kg, una dosificación
más amplia sería de aproximadamente 6,8 mg del polipéptido PRO por
día. Con el fin de lograr este nivel de dosis, es necesario una
formulación de liberación prolongada que contenga una carga de
proteína máxima (15-20% p/p del polipéptido PRO)
con una descarga inicial mínima <20%). También es deseable, una
liberación continua (del orden de cero) del polipéptido PRO a partir
de micropartículas durante 1-2 semanas. Además, la
proteína encapsulada a liberar debería mantener su integridad y
estabilidad sobre el período de liberación deseado.
Los polipéptidos PRO241 de la presente invención
que poseen actividad biológica en relación con la proteína
biglicano endógena pueden utilizarse tanto en in vivo para
propósitos terapéuticos e in vitro. Los expertos en la
materia conocerán cómo utilizar los polipéptidos PRO de la presente
invención para dichos propósitos.
Chordin es un gen candidato para un síndrome
dismórfico conocido como el Cornelia de Lange (CDL) que se
caracteriza por rasgos faciales distintivos (línea del cuero
cabelludo anterior baja, sinofrisis, orificios nasales
antevertidos, prognatismo maxilar, philtrum largo, comisuras
labiales hacia abajo), retraso del crecimiento prenatal y
postnatal, retraso mental y a menudo, aunque no siempre, anomalías
de extremidades superiores. Existen casos raros en donde el CDL se
presenta en asociación con trombocitopenia. El gen de CDL se ha
localizado mediante ligamiento en 3q26.3 (OMIM#122470). La
implicación de Xchd en el patrón temprano y desarrollo del sistema
nervioso de Xenopus hacen del CHD un gen candidato interesante. El
CHD se localiza en la región adecuada del cromosoma 3 y muy próximo
a TGHPO. Las deleciones que abarcan tanto THPO como CHD podrían
producir casos raros de trombocitopenia y anomalías del desarrollo.
El análisis in situ de CD demostró que casi todos los tejidos
adultos son negativos para la expresión de CHD, la única señal
positiva observada se halló en la línea de corte de la articulación
sinovial en desarrollo que se forma entre la cabeza del fémur y el
acetabulurum (articulación de la cadera) implicando CHD en el
desarrollo y presuntamente el crecimiento de huesos largos. Por lo
que la interrupción de dicha función podría producir un retraso del
crecimiento.
La secuencia aminoacídica de CHD humano predicha
a partir del cDNA es idéntica en un 50% (y conservada en un 66%)
respecto a Xchd. Todas las 40 cisteínas en los 4 dominios ricos en
cisteína están conservadas. Estos dominios ricos en cisteína son
similares a los observados en la trombospondina, procolágeno y el
factor de von Willebrand. Bornstein, P. FASEB J.,
6:3290-3299 (1992); Hunt, L. & Baker, W.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 144:876-882
(1987).
La presente invención proporciona además
anticuerpos anti-polipéptido PRO.Ejemplos de
anticuerpos incluyen los policlonales, monoclonales, humanizados,
biespecíficos y los heteroconjugados.
Los anticuerpos anti-polipéptido
PRO pueden comprenden anticuerpos policlonales. Los procedimientos
de preparación de anticuerpos policlonales son conocidos por los
expertos en la materia. Los anticuerpos policlonales pueden
producirse en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más
inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante.
Típicamente, el agente inmunizante y/o adyuvante se inyectará al
mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o
intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir el
polipéptido PRO o una proteína de fusión de lo mismo. Puede ser de
utilidad conjugar el agente inmunizador con una proteína conocida
por ser inmunogénica en el mamífero a ser inmunizado. Ejemplos de
dichas proteínas inmunogénicas incluyen, pero no se limitan a, la
hemocianina de la lapa, la seroalbúmina, la tiroglobulina bovina y
el inhibidor de tripsina de soja. Ejemplos de adyuvantes que pueden
utilizarse incluyen el adyuvante completo de Freund y el adyuvante
MPL-TDM (monofosforil lípido A, trehalosa
dicorinomicolato sintética). El protocolo de inmunización puede
seleccionarse por un experto en la materia sin excesiva
experimentación.
Los anticuerpos anti-polipéptido
PRO pueden, alternativamente, ser anticuerpos monoclonales, los
cuales pueden prepararse con los procedimientos de hibridomas, como
los descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975). En un
procedimiento de hibridomas, generalmente se inmuniza un ratón, un
hámster u otro animal huésped adecuado con un agente inmunizante
para provocar que los linfocitos produzcan o sean capaces de
producir anticuerpos que se unirán específicamente con el agente
inmunizante. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse
in vitro.
El agente inmunizante incluirá típicamente el
polipéptido PRO de interés o una proteína de fusión de lo mismo. En
general, se utilizan linfocitos de sangre periférica (PBLS) si se
requieren células de origen humano, o células del bazo o células de
nódulos linfáticos si se requieren fuentes de mamífero
no-humanos. Los linfocitos se fusionan con una
línea celular inmunizada utilizando un agente de fusión adecuado,
como el polietilén glicol, para formar una célula de hibridoma
[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic
Press, (1986) pp. 59-103]. Las líneas celulares
inmortalizadas son por lo general células de mamífero
transformadas, en particular células de mieloma de roedor, bovino o
de origen humano. En general, se utilizan líneas de mieloma de rata
o ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de
cultivo adecuado que contenga preferentemente una o más sustancias
que inhiban el crecimiento o la supervivencia de las células
inmortalizadas y no fusionadas. Por ejemplo, si las células
parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil
transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para el hibridoma
incluirá comúnmente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio
HAT), sustancias que inhiben el crecimiento de las células
deficientes en HGPRT.
Las líneas celulares inmortalizadas preferidas
son las que se fusionan de forma eficiente, soportan un nivel
elevado de expresión estable de anticuerpos por las células
productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio
como el HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son
las líneas de mieloma murino, que pueden obtenerse por ejemplo del
Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y
del American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Las
líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma
ratón-humano también se han descrito para la
producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J.
Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur y col., Monoclonal Antibody
Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New
York, (1987) pp. 51-63].
El medio de cultivo en donde se cultivan las
células puede analizarse para la presencia de anticuerpos
monoclonales dirigidos contra el polipéptido PRO de interés.
Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos
monoclonales producida por las células de hibridoma se determina
mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in
vitro, como el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). Dichas técnicas y ensayos
son conocidos en la materia. La afinidad de unión del anticuerpo
monoclonal puede, por ejemplo, determinarse por al análisis de
Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).
Después de identificar las células de hibridoma
deseadas, se sublonan los clones mediante dilución limitante y se
crecen por procedimientos estándares [Goding, supra]. El
medio de cultivo adecuado para este propósito incluye, por ejemplo,
el medio Dulbecco Modified Eagle Medium y el
RPMI-1640. Alternativamente, las células de
hibridoma pueden crecer in vivo como ascitas en un
mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones pueden aislarse a partir del medio de cultivo o del
fluido ascítico mediante procedimientos de purificación de
inmunoglobulinas como, por ejemplo, la cromatografía con proteína
A-Sepharose, con hidroxilapatita, la electroforesis
en gel, la diálisis o la cromatografía de afinidad.
Los anticuerpos monoclonales pueden también
generarse mediante procedimientos del DNA recombinante, como los
descritos en la patente americana U.S. 4.816.567. El DNA que
codifica los anticuerpos monoclonales de la invención se aislarse
fácilmente y secuencian utilizando procedimientos convencionales
(p.ej., sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse
específicamente a genes que codifican cadenas pesadas y ligeras de
anticuerpos murinos). Las células de hibridomas de la invención
sirven como fuente preferida de dicho DNA. Una vez aislado, el DNA
se coloca en vectores de expresión, que a continuación se
transfectan en células hospedadoras como las células de simio COS,
las células de ovario de hámster chino (CHO), o las células de
mieloma que de otra forma no producirían una proteína de
inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos
monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. El DNA
también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia
codificante de los dominios constantes de cadena ligera y pesada
murinas homólogas por las humanas [patente americana U.S.
4.816.567; Morrison y col., supra] o mediante la unión
covalente con toda la secuencia codificante de inmunoglobulina o
con parte de ella para un polipéptido
no-inmunoglobulínico. Dicho polipéptido
no-inmunoglobulínico puede sustituirse por los
dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o puede
sustituirse por los dominios variables de un sitio de combinación
antigénico de un anticuerpo de la invención para crear un
anticuerpo bivalente quimérico.
Los anticuerpos pueden ser monovalentes. Los
procedimientos para la preparación de anticuerpos monovalentes son
bien conocidos en la materia. Por ejemplo, un procedimiento implica
la expresión recombinante de la cadena ligera de la inmunoglobulina
y la cadena pesada modificada. La cadena pesada se trunca
generalmente por cualquier punto en la región Fc para evitar la
unión con la cadena pesada. Alternativamente, los residuos de
cisteína relevantes se sustituyen con otro residuo aminoacídico o
se delecionan para evitar las uniones.
Para la preparación de anticuerpos monovalentes,
también son adecuados los procedimientos in vitro. La
digestión de anticuerpos para producir fragmentos de éstos,
fragmentos Fab, se puede lograr utilizando técnicas de rutina
conocidas en la materia.
Los anticuerpos anti-polipéptido
PRO de la invención pueden comprender anticuerpos humanizados o
humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no- humanos (p.ej.,
murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de
inmunoglobulinas o fragmentos de éstas (como el Fv, Fab, Fab',
F(ab')2 u otras subsecuencias de unión al antígeno de los
anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de una
inmunoglobulina no-humana. Los anticuerpos
humanizados incluyen las inmunoglobulinas humanas (anticuerpo
receptor) en la que residuos de una región determinante
complementaria (CDR) del receptor se reemplazan por residuos de una
CDR de especies no-humanas (anticuerpo donante)
como el ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y
capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de
entramado Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los
residuos correspondientes no-humanos. Los
anticuerpos humanizados pueden también comprender residuos que no
se hallen en el anticuerpo receptor ni tampoco en la CDR importada o
secuencias de entramado. En general. El anticuerpo humanizado
comprenderá esencialmente por lo menos un dominio variable
completo, y generalmente dos dominios, en los que todas o
esencialmente todas las regiones CDR corresponden con las de una
inmunoglobulina no-humana y todas o esencialmente
todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de
inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado en su forma óptima
comprenderá por lo menos una porción de una región constante de
inmunoglobulina (Fc), típicamente el de una inmunoglobulina humana
[Jones y col., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann
y col., Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr.
Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].
Los procedimientos para la humanización de
anticuerpos no-humanos son bien conocidos en la
materia. En general, un anticuerpo humanizado contiene uno o más
residuos introducidos de origen no-humano. Estos
residuos aminoacídicos no-humanos son a menudo
referidos como residuos de "importación", y generalmente
proceden de un dominio variable de "importación". La
humanización se puede realizar esencialmente con el procedimiento
de Winter y colaboradores [Jones y col., Nature,
321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature,
332:323-327 (1988); Verheoyen y col., Science,
239:1534-1536 (1988)], sustituyendo las CDRs o
secuencias de CDRs humanas por las secuencias correspondientes de un
anticuerpo de roedor. Según ello, dichos anticuerpos
"humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente americana
U.S. 4.816.567), en donde menos de un dominio variable intacto se
ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie
no-humana. En la práctica, los anticuerpos
humanizados son anticuerpos humanos en los que algunos residuos CDR
y probablemente algunos residuos FR se han sustituido por residuos
de sitios análogos de anticuerpos de roedor.
Los anticuerpos humanos también pueden producirse
utilizando diversas técnicas conocidas en la materia, incluyendo
las librerías de expresión de fagos [Hoogenboom y Winter, J. Mol.
Biol., 227:381 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol., 222:581
(1991)]. Las técnicas de Cole y col., y Boemer y col., son también
adecuadas para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos
(Cole y col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R
Liss, p. 77 (1985) y Boemer y col., J. Immunol.,
147(1):86-95 (1991)].
Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos
monoclonales, preferentemente humanos o humanizados que tienen
especificidades de unión para por lo menos dos antígenos distintos.
En el caso actual, una de las especificidades de unión es para el
polipéptido PRO, la otra es para cualquier otro antígeno, y
preferentemente para una proteína de superficie celular o receptor o
subunidad de receptor.
Los procedimientos para la realización de
anticuerpos biespecíficos son conocidos en la materia.
Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos
biespecíficos se basa en la co-expresión de dos
parejas de cadenas ligera/pesada de inmunoglobulina, teniendo cada
una de las dos cadenas pesadas una especificidad distinta [Milstein
y Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)]. Debido al
barajamiento aleatorio de las cadenas ligeras y pesadas, estos
hibridomas (quadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas
de anticuerpo distintas, de las cuales sólo una tiene la estructura
biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta se
realiza generalmente mediante etapas de cromatografía de afinidad.
En la patente internacional WO 93/08829, publicada el 13 de mayo de
1993 y en Traunecker y col., EMBO J., 10:3655-3659
(1991) se describen procedimientos similares.
Los dominios variables de anticuerpos con las
especificidades de unión deseadas (sitios de combinación
anticuerpo-antígeno) pueden fusionarse con
secuencias de dominios constantes de inmunoglobulina.
Preferentemente, la fusión se produce con un dominio constante de
cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende por lo menos la
bisagra, las regiones CH2 y CH3. Por lo menos en algunas fusiones,
es preferible tener la primera región constante de cadena pesada
(CH1) que incluye el sitio necesario para la unión de la cadena
ligera. Los DNAs que codifican las fusiones de cadena pesada de
inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de
inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y
se co-transfectan en un organismo huésped adecuado.
Para detalles adicionales sobre la generación de anticuerpos
biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh y col., Methods in
Enzymology, 121:210 (1986).
Los anticuerpos heteroconjugados se hallan
también dentro del ámbito de la presente invención. Los anticuerpos
heteroconjugados se componen de dos anticuerpos unidos
covalentemente. Estos anticuerpos han sido propuestos, por ejemplo,
para dirigir células del sistema inmune contra células no deseadas
[patente americana U.S. 4.676.980], y para el tratamiento de la
infección por VIH [patente internacional WO 91/00360; patente
internacional WO 92/200373; patente europea EP 03089]. Se contempla
que los anticuerpos puedan prepararse in vitro utilizando
procedimientos conocidos en la química de proteínas sintéticas,
incluyendo aquellos basados en agentes de acoplamiento. Por ejemplo,
las inmunotoxinas pueden construirse utilizando una reacción de
intercambio de disulfuros o por formación de un enlace tioéter.
Ejemplos de reactivos apropiados para este propósito incluyen el
iminotiolato y el
metil-4-mercaptobutirimidato y los
descritos, por ejemplo, en la patente americana U.S. 4.676.980.
Los anticuerpos anti-polipéptidos
PRO de la invención tienen varias utilidades. Por ejemplo, los
anticuerpos anti-polipéptidos PRO pueden utilizarse
en ensayos diagnósticos para un polipéptido PRO, por ejemplo,
detectando su expresión en células y tejidos específicos o en
suero. Se pueden utilizar varias técnicas de ensayos diagnósticos
conocidas, tales como los ensayos de unión competitiva, los ensayos
de sándwich directo o indirecto y los ensayos de inmunoprecipitación
llevada a cabo en fase heterogénea u homogénea [Zola, Monoclonal
Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, INC. (1987) pp.
147-158]. Los anticuerpos utilizados en los ensayos
diagnósticos pueden marcarse con moléculas detectables. La molécula
detectable debería ser capaz de producir directa o indirectamente
una señal detectable. Por ejemplo, la molécula detectable podría
ser un radioisótopo como el H^{3}, el C^{14}, el P^{32}, el
S^{35}, o el I^{125}, un compuesto fluorescente o
quimioluminescente, tal como la fluoresceína, el isotiocianato, la
rodamina, o la luciferina, o una enzima, como la fosfatasa
alcalina, la beta-galactosidasa o la peroxidasa de
rábano. Puede utilizarse cualquier procedimiento conocido en la
materia para conjugar el anticuerpo a la molécula detectable,
incluyendo aquellos procedimientos descritos por Hunter y col.,
Nature, 144: 945 (1962); David y col., Biochemistry, 13:1014
(1974); Pain y col., J. Inmunol. Meth., 40: 219 (1981); y Nygren,
J. Histochem. And Cytochem., 30: 407 (1982).
Los anticuerpos anti-polipéptidos
PRO son también útiles para la purificación por afinidad del
polipéptido PRO procedente de cultivos celulares recombinantes o de
fuentes naturales. En este proceso, los anticuerpos contra el
polipéptido PRO se inmovilizan en un soporte adecuado, como la
resina Sephadex o el papel de filtro, utilizando procedimientos
bien conocidos en la materia. El anticuerpo inmovilizado se pone en
contacto con la muestra que contiene el polipéptido PRO a
purificar, y después se lava el soporte con solventes adecuados que
eliminarán esencialmente todo el material en la muestra excepto el
polipéptido PRO que se ha unido al anticuerpo inmovilizado. Por
último, el soporte se lava con otro solvente adecuado que liberará
el polipéptido PRO del anticuerpo.
Se ofrecen los siguientes ejemplos únicamente con
propósitos ilustrativos, y sin ánimo de limitar el ámbito de la
presente invención.
Todas las patentes y referencias de la literatura
citadas en la presente especificación se han incorporado por
referencia en su totalidad.
Los reactivos disponibles comercialmente a los
que se refieren los ejemplos se utilizaron de acuerdo con las
instrucciones del fabricante, salvo que se indique lo contrario. La
fuente de las células identificadas en los siguientes ejemplos, y a
través de la especificación, por los números de entrada ATCC hace
referencia al American Type Cultura Collection, Rockville,
Maryland.
Se utilizaron secuencias del dominio extracelular
(ECD) (incluyendo la secuencia de la señal de secreción, si la
hubiera) de unas 950 proteínas bien conocidas de la base de datos
pública Swiss-Prot para buscar en las bases de datos
EST. Las bases de datos EST incluyen las bases de datos públicas
(p.ej., Dayhoff, Genbank), y las bases de datos privadas (p.ej.
LIFESEQ^{TM}, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA). La búsqueda
fue llevada a cabo utilizando el programa BLAST o BLAST2 (Altschul
and Gish, Methods in Enzymology 266: 460-480
(1996)) como una comparación de secuencias de proteínas ECD hasta
unas 6 pautas de traducción de las secuencias EST. Aquellas
comparaciones con una puntuación Blast de 70 (o en algunos casos de
90) o superior que no codifican para proteínas conocidas se
agruparon y alinearon con las secuencias de DNA consenso con el
programa "phrap" (Phil Green, Universiad de Washington,
Seattle, WA;
(http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/phrap.html).
Utilizando esta búsqueda de homología de dominios
extracelulares, las secuencias de DNA consenso se alinearon en
relación con las otras secuencias EST identificadas usando phrap.
Además, las secuencias de DNA consenso obtenidas fueron a menudo
(pero no siempre) extendidas con ciclos repetidos de BLAST y phrap
para extender las secuencias consenso tan lejos como fuera posible
usando las fuentes de secuencias EST discutidas más arriba.
Basándose en las secuencias consenso obtenidas
tal y como se ha descrito anteriormente, se sintetizaron los
oligonucleótidos y se utilizaron para identificar por PCR una
librería de cDNA que contenía la secuencia de interés y para
utilizarlos como sondas para aislar un clon con la secuencia
codificante completa de un polipéptido PRO. Los cebadores de
sentido de transcripción 5' (.f) y 3' (.r) fueron por lo general de
20 a 30 nucleótidos de longitud y se diseñaron para obtener
productos de PCR de cerca de 100-1000 pb de
longitud. Las secuencias de las sondas (.p) fueron típicamente de
40-55 pb de longitud. En algunos casos, se
sintetizaron nucleótidos adicionales si las secuencias consenso
eran mayores que 1-1.5 pkb. Para efectuar un rastreo
de varias librerías y hallar clones completos, el DNA de las
librerías se sometió a un rastreo mediante amplificación por PCR,
tal y como se describe por Ausubel y col., Current Protocols in
Molecular Biology, con el par de cebadores de PCR. Se utilizó una
librería positiva para aislar clones que codificaban el gen de
interés usando la sonda oligonucleotídica y una de las parejas de
cebadores.
Las librerías de cDNA utilizadas para aislar los
clones de cDNA se construyeron por procedimientos estándares con
reactivos comerciales procedentes, por ejemplo, de Invitrogen, San
Diego, CA. El cDNA se cebó con oligo dT que contenía una diana
NotI, se unió por extremos romos a adaptores semifosforilados SalI,
se cortó con Notl, y se calculó su tamaño de forma adecuada mediante
electroforesis en gel, y se clonó en una orientación definida en un
vector de clonación apropiado (como pRKB o pRKD; pRKB5 es un
precursor de pRK5D que no contiene el sitio Sfil; véase, Colmes y
col., Science, 253: 1278-1280 (1991)) en las dianas
únicas XhoI y Notl.
Se aisló el mRNA de un tejido humano de interés
usando los reactivos y protocolos de Invitrogen, San Diego, CA
(Fast Track 2). Este RNA se utilizó para generar una, librería de
cDNA cebada con oligo dT en el vector pRK5D usando los reactivos y
protocolos de Life Technologies, Gaithersburg, MD (Super Script
Plasmid System). En este procedimiento, se generó una doble cadena
de cDNA no superior a 1000 pb y el cDNA ligado SaII/Notl se clonó
en el vector digerido con XhoI/Notl. El pRK5D es un vector de
clonaje que tiene un sitio de iniciación de la transcripción sp6
seguido de una diana de enzima de restricción Sfil que precede a
las dianas de clonación XhoI/Notl del cDNA.
Se generó una librería de cDNA secundaria se
generó preferentemente para representar los extremos 5' de los
clones primarios de cDNA. El RNA de Sp6 se generó a partir de la
librería primaria (descrita anteriormente), y este RNA se usó para
generar librería de cDNA cebada aleatoriamente en el vector
pSST-AMY.0 utilizando los reactivos y protocolos de
Life Technologies (Super Script Plasmid Systems, referencia
anterior). En este procedimiento, se generó una doble cadena de
cDNA de 500-1000 pb, se ligó con adaptadores romos
NotI y se digirió con Sfil, clonándose en un vector digerido con
Sfil/Notl. El pSST-AMY.0 es un vector de clonación
que tiene el promotor de la alcohol deshidrogenasa de levadura que
precede a las dianas de clonación del cDNA y una secuencia de la
amilasa de ratón (la secuencia madura sin la señal de secreción)
seguida del terminador de la alcohol deshidrogenasa de levadura
después de las dianas de clonación. Así, los cDNAs clonados en este
vector que se fusionaron en la misma pauta de lectura con la
secuencia la amilasa dirigirán la secreción de la amilasa de las
colonias de levadura transfectadas adecuadamente.
El DNA de la librería descrita en el párrafo 2 se
enfrió en hielo y se le añadieron las bacterias DH10B
electrocompetentes (Life Technologies, 20 ml). La mezcla de
bacterias y vector se electropororó tal como recomienda el
fabricante. Después, se añadió medio SOC (Life Technologies, 1 ml)
y la mezcla se incubó a 37ºC durante 30 minutos. Los transformantes
se sembraron en 20 placas LB estándar de 150 mm que contenía
ampicilina y se incubaron durante 16 horas (37ºC). Se aislaron de
las placas las colonias positivas y a continuación se aisló se
aislaron el DNA del sedimento bacteriano utilizando protocolos
estándares, p.ej. el gradiente de CsCl. Al DNA purificado se le
aplicaron los protocolos de levadura descritos a continuación.
Los protocolos de levadura se dividieron en tres
categorías: (1) Transformación de las levaduras con el vector
combinado plásmido/cDNA; (2) Detección y aislamiento de clones de
levaduras que secretan amilasa; y (3) amplificación por PCR del
inserto directamente de la colonia de levadura y purificación del
DNA para la secuenciación y análisis adicionales.
La cepa de levadura utilizada fue la
HD56-5A (ATCC-90785). Esta cepa
tiene el siguiente genotipo: alfa MAT, ura3-52,
leu2-3, leu2-112,
his3-11, his 3-15, MAL^{+},
SUC^{+}, GAL^{+}. Preferentemente, se pueden utilizar los
mutantes de levadura que presentan vías
post-traduccionales deficientes. Estos mutantes
pueden tener alelos deficientes de translocación en sec71, sec72,
sec62, siendo los más preferentes los que contienen sec71 truncados.
Alternativamente, los antagonistas (incluyendo los nucleótidos
antisentido y/o ligandos) que interfieren con la operación normal
de estos genes, otras proteínas implicadas en el proceso de
post-traducción (p.ej., SEC61p, SEC72p, SEC62p,
SEC63p, TDJ1p o SSA1p-4p) o la formación del
complejo de estas proteínas puede ser preferentemente empleado en
combinación con levaduras que expresen la amilasa.
La transformación se llevó a cabo basándose en el
protocolo llevado a cabo por Gietz y col. Nucl. Acid. Res., 20:
1425 (1992). Las células transformadas se inocularon del agar al
medio de cultivo complejo YEPD (100 ml) y se dejaron crecer durante
toda la noche a 30ºC. El medio de cultivo YEPD se preparó tal y
como se describe por Kaiser y col., Methods in Yeast Genetics, Cold
Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 207 (1994). El
cultivo resultante de la incubación durante toda la noche se diluyó
hasta unas 2x10^{6} células/ml (aprox. OD_{600}=0,1) en medio
fresco de cultivo YEPD (500 ml) y se dejó crecer hasta alcanzar
1x10^{7} células/ml (aprox.
OD_{600}=0,4-0,5).
Después, se recolectaron las células y se
prepararon para la transformación transfiriéndolas a botellas
centrifugadoras para un rotor GS3 y se centrifugaron en un rotor
Sorval GS3 a 5.000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se desechó
y se resuspendió el sedimento en agua estéril, centrifugándose de
nuevo en tubos Falcon de 50 ml a 3.500 rpm en una centrífuga
Beckman GC-6KR. El sobrenadante se desechó y las
células se lavaron posteriormente con LiAc/TE (10 ml,
Tris-HCl10 mM, EDTA 1 mM a pH 7,5,
Li_{2}OOCCH_{3}100 mM), y se resuspendieron en LiAc/TE (2,5
ml).
La transformación tuvo lugar mezclando las
células preparadas (100 \mul) con DNA de esperma de salmón de
cadena sencilla recién desnaturalizado (Lofstrand Labs,
Gaithersburg, MD) y el DNA transformante (1 \mug, vol. < 10
\mul) en tubos de microcentrífuga. La mezcla se mezcló brevemente
con un vórtex y después se añadió PEG/TE al 40% (600 \mul de
polietilenglicol-4000 al 40%,
Tris-HCl 10 mM, EDTA1 mM, Li_{2}OOCCH_{3} 100
mM, pH 7,5). La mezcla se agitó suavemente y se incubó a 30ºC en
agitación durante 30 minutos. Después las células se sometieron a
un choque térmico a 42ºC durante 15 minutos, y el tubo de reacción
se centrifugó en una microcentrífuga a 12.000 rpm durante
5-10 segundos, se decantó y se resuspendió en TE
(500 \mul, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5)
seguido de una recentrifugación. Después, las células se diluyeron
en TE (1 ml) y se dispensaron alícuotas (200 \mul) en placas de
crecimiento de 150 mm (VWR) previamente preparadas con medios
selectivos.
Alternativamente, en lugar de realizar múltiples
pequeñas reacciones, la transformación se llevó a cabo mediante una
sola reacción a gran escala, escalándose las cantidades de
reactivos proporcionalmente.
El medio selectivo utilizado fue un agar de
dextrosa completamente sintético y sin uracilo
(SCD-Ura), preparado tal y como se describe por
Kaiser y col., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press,
Cold Spring Harbor, NY, p. 208-210 (1994). Las
células transformadas se dejaron crecer a 30ºC durante
2-3 días.
La detección de las colonias que secretaban
amilasa se llevó a cabo incluyendo el sistema
rojo-almidón en el medio de cultivo selectivo. El
almidón está acoplado a un colorante rojo (Reactive
Red-120, Sigma) según el procedimiento de Biely y
col., Anal. Biochem., 172: 176-179 (1988). El
almidón acoplado se incorporó a las placas de agar
SCD-Ura a una concentración final del 0,15% (p/v) y
el medio se tamponó con fosfato potásico a pH 7,0 (concentración
final de 50-100 mM).
Las colonias positivas se seleccionaron y se
sembraron en medio selectivo (en placas de 150 mm) para obtener
colonias simples aisladas e identificables. Las colonias simples
bien aisladas y positivas para la secreción de amilasa se
detectaron por incorporación directa de rojo-almidón
en el agar SCD-Ura tamponado. Se determinaron las
colonias positivas por su capacidad de romper el almidón resultante
en un halo claro alrededor de la colonia positiva mediante
visualización directa.
Cuando se aisló una colonia positiva, se pinchó
una parte de ésta con un palillo y se diluyó en agua estéril (30
\mul) en una placa de 96 pocillos. Al mismo tiempo, las colonias
positivas se congelaron y guardaron para el análisis posterior o se
amplificaron inmediatamente. Una alícuota de células (5 \mul) se
utilizó como molde para la reacción de PCR en un volumen de 25
\mul que contenía: 0,5 \mul de Klentaq (Clontech, Palo Alto,
CA); 4,0 \mul de dNTPs 10 mM (Perkin
Elmer-Cetus); 2,5 \mul tampón Kentaq (Clontech);
0,25 \mul de oligo-1 de sentido de la
transcripción 5'; 0,5 \mul de oligo-2 de sentido
de la transcripción 3' y 12,5 \mul de agua destilada. La
secuencia del oligonucleótido-1 de sentido 5'
fue:
5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT-3'
(SEC ID NO: 6)
La secuencia del
oligonucleótido-2 de sentido 3' fue:
5'-CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT-3'
(SEC ID NO: 7)
La PCR se realizó tal y como se muestra a
continuación:
Las regiones subrayadas de los nucleótidos
hibridaron con la región promotora de ADH y la región de la amilasa,
respectivamente. Ante la ausencia de inserto, se amplificó una
región de 307 pb del vector pSST-AMY.0. En general,
los primeros 18 nucleótidos del extremo 5' de estos
oligonucleótidos contenían los sitios de hibridación para los
cebadores de secuenciación. Así el producto total de la reacción de
PCR a partir de un vector vacío fue de 343 pb. Por otra parte, el
cDNA fusionado con la secuencia señal resultó ser una secuencia
nucleotídica considerablemente más larga.
Después de la PCR, se examinó una alícuota de la
reacción (5 \mul) en electroforesis en gel de agarosa al 1% con
un tampón Tris-Borato-EDTA (TBE),
tal y como se describe por Sambrook y col., supra. Los
clones que produjeron como resultado una banda única y abundante
como producto de PCR superior a 400 pb se analizados además por
secuenciación del DNA después de una purificación con una columna
de lavado 96 Qiaquick PCR (Qiagen INC., Chatsworth, CA).
Se alineó una secuencia DNA consenso en relación
con las otras secuencias EST, tal y como se describe en el Ejemplo
1 anterior. Esta secuencia consenso se denomina aquí DNA30876.
Basándose en la secuencia consenso DNA30876, se sintetizaron los
siguientes nucleótidos: 1) para identificar por PCR una librería de
cDNA que contenía la secuencia de interés, y 2)para
utilizarlos como sondas para aislar un clon de secuencia
codificante completa para PRO241.
Se sintetizaron los cebadores de PCR (5' y
3'):
Cebador de PCR de sentido 5':
5'-GGAAATGAGTGCAAACCCTC-3' (SEC ID
NO: 3)
Cebador de PCR de sentido 3':
5'-TCCCAAGCTGAACACTCATTCTGC-3' (SEC
ID NO: 4)
Adicionalmente, se construyó una sonda
oligonucleotídica sintética a partir de la secuencia consenso
DNA30876 que tenía la siguiente secuencia nucleotídica:
5'-GGGTGACGGTGTTCCATATCAGAATTGCAGAAGCAAAACTGACCTCAGTT-3'
(SEC ID NO: 5)
Para efectuar un rastreo de diversas librerías
para buscar un clon de tamaño completo, el DNA de las librerías se
sometió a un análisis de amplificación por PCR con el par de
cebadores de PCR identificados anteriormente. Se utilizó una
librería positiva para aislar clones que codificaran el gen de
PRO241 utilizando la sonda oligonucleotídica y uno de los cebadores
de la PCR. El RNA para la construcción de las librerías de cDNA se
aisló de tejido fetal de riñón humano (LIB29).
La secuenciación del DNA de los clones aislados
tal y como se ha descrito anteriormente dio como resultado una
secuencia de tamaño completo para PRO241 [denominada aquí UNQ215
(DNA34392-1170)] (SEC ID NO: 1) y la secuencia
proteicaderivada para PRO241.
La secuencia nucleotídica completa de UNQ215 (DNA
34392-1170) se muestra en la Figura 1 (SEC ID Nº
1). El clon UNQ215 (DNA34392-1170) contiene una
única pauta de abierta de lectura con un sitio aparente de
iniciación de traducción en las posiciones nucleotídicas
234-236 y un codón de parada de la traducción en las
posiciones nucleotídicas 1371-1373 (Figura 1). El
precursor polipeptídico predecible es de 379 aminoácidos (Figura
2). La proteína PRO241 de tamaño completo que se muestra en la
Figura 2 tiene un peso molecular estimado de aproximadamente 43.302
daltons y un pI de aproximadamente 4,30. El clon UNQ215
(DNA34392-1170) se ha depositado en el ATCC con el
número ATCC 209526.
El análisis de la secuencia aminoacídica del
polipéptido PRO241 de tamaño completo sugiere que posee una
homología significativa con las proteínas de proteoglicanos del
biglicán, lo que indica que el PRO241 es un nuevo polipéptido
homólogo del biglicán.
El procedimiento descrito a continuación se
refiere a la utilización de una secuencia nucleotídica que codifica
para el polipétido PRO, como sonda de hibridación.
El DNA que comprende la secuencia que codifica
para el polipéptido de interés PRO, descrito aquí, puede utilizarse
como sonda o como base para la preparación de otras sondas que
permitan localizar DNAs homólogos (tales como los que codifican
para las variantes del polipétido PRO originadas de forma natural)
en librerías de cDNAs o en librerías genómicas obtenidas a partir
de tejidos humanos.
La hibridación y el lavado de los filtros que
contienen las librerías de DNAs se realizan bajo las siguientes
condiciones de astringencia elevada. La hibridación de la sonda
derivada de la secuencia nucleotídica que codifica para el
polipéptido PRO marcada radioactivamente con los filtros se realiza
en una solución de formamida al 50%, 5xSSC, pirofosfato sódico al
0,1%, fosfato sódico 50 mM pH 6,8, solución de Denhardt 2x y
sulfato de dextrano al 10% a 42ºC durante 20 horas. El lavado de
los filtros se realiza en una solución acuosa de 0,1xSSC y SDS al
0,1% a 42ºC.
Los DNAs con la identidad de secuencia deseada
respecto a la secuencia de DNA completa nativa que codifica para el
polipétido PRO se identifican mediante las técnicas estándares
habituales.
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
no glicosilada de un polipéptido PRO mediante expresión
recombinante en E.coli.
La secuencia de DNA que codifica para el
polipéptido PRO deseado se amplifica inicialmente mediante
cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores deben incluir dianas
para enzimas de restricción que correspondan con las mismas dianas
que contiene el vector de expresión escogido. Pueden emplearse una
gran variedad de vectores de expresión. Un ejemplo de vector idóneo
es el pBR322 (derivado de E. coli; véase Bolívar et
al., Gene, 2:95 (1977)) que contiene los genes
para la resistencia a la ampicilina y la tetraciclina. El vector se
digiere con una enzima de restricción y se desfoforilan sus
extremos. A continuación, las secuencias de PCR amplificadas se
ligan en el vector. El vector, preferentemente, incluirá secuencias
que codifican para un gen que confiera resistencia a un
antibiótico, un promotor trp, un líder poli-his
(incluyendo los primeros seis codones STII, la secuencia
poli-his y un lugar de corte para enteroquinasa),
la región que codifica para el polipétido específico PRO, el
terminador de la transcripción de lambda y un gen argU.
Seguidamente, la mezcla de ligación se emplea en
la transformación de una cepa seleccionada de E.coli según
los métodos descritos en Sambrook et al., supra. Los
transformantes se identifican por su facilidad para crecer en
placas de LB y se seleccionan las colonias resistentes a los
antibióticos. El DNA plasmídico se aísla y se confirma por análisis
de restricción y secuenciación de su DNA.
Los clones seleccionados, pueden crecerse toda la
noche en un medio de cultivo líquido tal como el caldo LB
suplementado con antibióticos. El cultivo de una noche
subsecuentemente se usa para inocular un cultivo a gran escala. A
continuación, las células crecen, estando activo el promotor durante
dicho crecimiento, hasta la densidad óptica deseada.
Después de cultivar las células por unas cuantas
horas más, las células se recogen mediante centrifugación. El
precipitado celular obtenido mediante la centrifugación se
solubiliza con varios agentes según procedimientos habituales, y el
polipéptido PRO una vez solubilizado se purifica utilizando una
columna queladora de metales en condiciones que permiten la unión
estrecha de la proteína.
El polipéptido PRO241 se expresó
satisfactoriamente en E. coli en una forma etiquetada con
una cola de poli-His mediante el siguiente
procedimiento. El DNA que codifica para PRO241 se amplificó
inicialmemte con cebadores escogidos para la PCR. Los cebadores
contenían dianas de enzimas de restricción que coincidían con
dianas de restricción presentes en el vector, además de otras
secuencias utilizadas para obtener una iniciación de la traducción
eficiente y adecuada, una purificación rápida en una columna
queladora de metales y la liberación de la proteína mediante
digestión con enteroquinasa. Las secuencias amplificadas por PCR y
ligadas a las colas poli-His se unieron seguidamente
al vector que posteriormente se utilizó para transformar una cepa
huésped de E. coli derivada de la cepa 52 (W3110
fuhA(tonA) Ion gal/E
rpoHts(htpRts)clpP(laclq). Los transformantes
se crecieron primero en LB conteniendo 50 mg/ml de carbenicilina a
30ºC con agitación hasta alcanzar una D.O._{600} de
3-5. Los cultivos se diluyeron
50-100 veces en medio CRPA (preparado mezclando 3,57
g de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,71 g de citrato
sódico-2H_{2}O, 1,07 g de KCl, 5,35 g de extracto
de levadura Difco, 5.36 g de hycase de Sheffield (SF) en 500
ml de agua, así como MPOS 110 mM a pH 7,3, glucosa al 0,55% (w/V) y
MgSO_{4}7 mM) y se crecieron durante 20-30 horas
aproximadamente a 30ºC con agitación. Se tomaron muestras para
confirmar la expresión por análisis en geles de
SDS-PAGE y el conjunto del cultivo se centrifugó
para precipitar las células. Los precipitados celulares se
congelaron hasta su purificación y renaturalización.
La pasta de las fermentaciones de E.coli
de 0,5 a 1 l (6-10 g de precipitado) se resuspendió
en 10 volúmenes (w/v) de tampón de guanidina 7 M, Tris 20 mM, pH 8.
Se añadió sulfito sódico sólido y tetrationato sódico para obtener
unas concentraciones finales de 0,1 M y 0,02 M respectivamente y la
solución se dejó en agitación magnética toda la noche a 4ºC. Este
paso resulta en la desnaturalización de la proteína con todos los
residuos de cisteína bloqueados por sulfitolización. La solución se
centrifugó a 40.000 rpm en una ultracentrífuga Beckman durante 30
min. El sobrenadante se diluyó en 3-5 volúmenes de
tampón de la columna queladora de metales (guanidina 6 M, Tris 20
mM, pH 7,4) y se filtró a través de filtros de 0,22 micras para su
clarificación. Dependiendo de la clarificación del extracto, se
cargó éste en una columna queladora de metales Quiagen
Ni-NTA de 5 ml equilibrada con el tampón propio de
la columna queladora de metales. La columna se lavó con tampón
extra que contenía imidazol 50 mM (Calbiochem, grado Utrol), pH 7,4.
La proteína se eluyó con el tampón que contenía imidazol 250 mM. Se
recogieron las fracciones con la proteína deseada y se guardaron a
4ºC. La concentración proteica se estimó según la lectura de su
absorbancia a 280 nm utilizando un coeficiente de extinción
calculado según la composición aminoacídica de la secuencia.
Las proteínas se replegaron mediante dilución
lenta de la muestra en tampón fresco de replegado, consistente en
Tris 20 mM pH 8,6, NaCl 0,3 M, urea 2,5 M, cisteína 5 mM, glicina
20 mM y EDTA 1 mM. Los volúmenes de replegado se escogieron de
manera que la concentración de la proteína estuviera entre los 50 a
100 microgramos/ml. La solución de renaturalización se dejó en
agitación magnética a 4ºC entre 12-36 horas. La
reacción de renaturalización se paró con la adición de TFA a una
concentración final del 0,4% (en un pH aproximado de 3).
Previamente a cualquier purificación de la proteína, la solución se
filtró a través de un filtro de 0,2 micras y se añadió acetonitrilo
hasta un 2-10% de concentración final. La proteína
replegada se sometió a cromatografía en una columna de fase inversa
Poros R1/H con TFA al 0,1% como tampón de movilidad y eluyéndose en
un gradiente de acetonitrilo del 10 al 80%. De las alícuotas de la
fracciones se realizaron lecturas de la absorbancia y se analizaron
en geles de poliacrilamida y SDS; se agruparon las fracciones que
contenían la proteína replegada homogénea. En general, las especies
replegadas correctamente de la mayoría de las proteínas se eluyen a
las concentraciones menores de acetonitrilo, ya que estas especies
son las más compactas debido a que su interior hidrofóbico está
protegido de la interacción con la resina de fase inversa. Las
especies agregadas habitualmente se eluyen a altas concentraciones
de acetonitrilo. Además, para separar las formas de proteína con un
replegamiento incompleto de la forma deseada, en la etapa de la fase
inversa también se extrae la endotoxina de las muestras.
Las fracciones que contenían la forma deseada de
la proteína plegada PRO241 se agruparon y el acetonitrilo se
extrajo utilizando un ligero flujo de nitrógeno dirigido sobre la
solución. Las proteínas se formularon en Hepes 20 mM, pH 6,8 con de
cloruro sódico 0,14 M y manitol al 4% por diálisis o por filtración
en gel con la resina G25 Superfine (Pharmacia) equilibrada en el
tampón de formulación y filtrada estérilmente.
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
glicosilada del polipéptido PRO deseado mediante expresión
recombinante en células de mamífero.
El vector pRK5 (véase la patente europea EP
307,247, publicada el 15 de marzo de 1989), se utiliza como vector
de expresión. Opcionalmente, el DNA codificante para el polipéptido
PRO se ligó con el PRK5 mediante digestión con enzimas de
restricción para permitir la inserción del DNA del polipéptido PRO
con los métodos de ligación similares a los descritos en Sambroock
y col., supra. El vector resultante se denominó pRK5-
polipéptido PRO.
En una realización de la presente invención, las
células hospedadoras fueron las células 293. Las células humanas
293 (ATCC CCL 1573) se crecieron hasta la confluencia en placas
para el cultivo de tejidos con medio DMEM suplementado con suero
bovino fetal y opcionalmente con otros componentes, nutrientes y/o
antibióticos. Unos 10 \mug de DNA del
pRK5-polipéptido PRO se mezclaron con 1 \mug de
DNA que codifica el gen VA RNA [Thimmappaya et al.,
Cell, 31:543 (1982)] y se disolvieron en 500 \mul
de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl_{2} 0,227 M.
A esta mezcla se añadió gota a gota, 500 \mul de HEPES 50 mM (pH
7,35), NaCl 280 mM, NaPO_{4} 1,5 mM, y se dejó formar un
precipitado durante 10 min a 25ºC. El precipitado se resuspendió y
añadió a las células 293, dejándose reposar durante cuatro hora a
37ºC. El medio de cultivo se aspiró y se añadieron 2 ml de glicerol
al 20% en PBS durante 30 segundos. Las células 293 se lavaron a
continuación con medio sin suero, se añadió medio fresco,
incubándose de nuevo las células durante 5 días.
Aproximadamente unas 24 horas después de la
transfección, se retiró el medio de cultivo y se reemplazó con
medio de cultivo nuevo (sólo) o con medio que contenía 200
\muCi/ml de ^{35}S-cisteína y 200 \muCi/ml de
^{35}S-metionina. Al cabo de 12 horas de
incubación, el medio condicionado se recogió, se concentró en un
filtro mediante centrifugación y se cargó en un gel de SDS al 15%.
El gel procesado puede secarse y exponerse con una película
radiográfica durante un tiempo fijo para revelar la presencia del
polipéptido PRO. Los cultivos que contienen las células
transfectadas pueden incubarse por un tiempo adicional (en medio
sin suero) y el medio se analiza en bioensayos específicos.
En una técnica alternativa, el polipéptido PRO
puede introducirse en las células 293 de manera transitoria
utilizando sulfato de dextrano según el procedimiento de Somparyrac
y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575(1981). Las células
293 se crecen hasta una densidad máxima en frasco de cultivo
centrifugador y se añaden 700 \mug del DNA de
pRK5-polipéptido PRO. Las células procedentes del
frasco de cultivo se concentran en primer lugar por centrifugación
y se lavan con PBS. El precipitado de DNA-dextrano
se incuba sobre el precipitado celular durante cuatro horas. Las
células se tratan con glicerol al 20% durante 90 segundos, se lavan
con medio de cultivo y se reintroducen en un frasco de cultivo
centrifugador que contiene medio de cultivo de tejidos, insulina
bovina 5 \mug/ml y 0,1 \mug/ml de transferrina bovina. Después
de aproximadamente cuatro días, el medio condicionado se centrifuga
y filtra para extraer las células y los desechos. La muestra que
contiene el polipéptido PRO expresado puede a continuación
concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento
escogido, como una diálisis y/o una columna de cromatografía.
En otra realización, los polipéptidos PRO pueden
expresarse en células CHO. El pRK5-polipéptido PRO
puede transfectarse en células CHO con reactivos como el CaPO_{4}
o el DEAE-dextrano. Como se describió anteriormente,
los cultivos celulares pueden incubarse y el medio reemplazarse con
medio de cultivo (sólo) o medio que contenga un trazador
radioactivo como la ^{35}S-metionina. Después de
determinar la presencia del polipéptido PRO, el medio de cultivo
puede reemplazarse con medio sin suero. Preferentemente, los
cultivos se incuban durante 6 días, y después se recoge el medio
condicionado. A continuación, el medio que contiene el polipéptido
PRO expresado puede concentrarse y purificarse mediante cualquier
procedimiento seleccionado.
El polipéptido PRO etiquetado con un epitopo
también puede expresarse en células hospedadora CHO. El polipéptido
PRO puede subclonarse fuera del vector pRK5. El inserto del
subclón, mediante PCR, se une en la misma pauta de lectura a una
etiqueta epitópica seleccionada, como por ejemplo un
poli-his, en un vector de expresión de Baculovirus.
El inserto del polipéptido PRO etiquetado con
poli-his puede a continuación subclonarse en un
vector dirigido de SV40, que contiene un marcador de selección como
el DHFR para la selección de clones estables. Por último, las
células CHO puede transfectarse (tal como se ha descrito
anteriormente) con el vector dirigido de SV40. El marcaje puede
realizarse tal como se ha descrito anteriormente, para confirmar su
expresión. El medio de cultivo que contiene polipéptido PRO
expresado y etiquetado con un poli-His, a
continuación puede concentrarse y purificarse con cualquier método
escogido como por ejemplo cromatografía de afinidad quelante de
Ni^{2+}.
El PRO241 se expresó satisfactoriamente en las
células CHO con los dos procedimientos de expresión, transitoria y
estable.
La expresión estable en las células CHO se
realizó con el procedimiento referido a continuación. Las proteínas
se expresaron como una construcción de IgG (immunoadhesina), en el
que las secuencias codificantes para las formas solubles (p.ej.
dominios extracelulares) de las proteínas respectivas están
fusionadas con una secuencia que incluye una secuencia de la región
constante de IgG, así como una región bisagra, los dominios CH2 y
CH3 y/o una forma etiquetada con poli-His.
A continuación de la amplificación por PCR, los
DNAs respectivos se subclonaron en un vector de expresión para CHO
con técnicas estándares según se describe en Ausubel et al.
Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, Jhon
Wiley y Sons (1997). Los vectores de expresión en CHO se
construyeron para tener dianas restricción compatibles en los
extremos 5' y 3' con el DNA de interés y permitir así la inserción
correcta de los cDNAs. El vector de expresión para células CHO
utilizado es el descrito en Lucas et al., Nucl. Adds.
Res. 24:9(1774-1779 (1996), y
utiliza el promotor/intensificador temprano de SV40 para dirigir la
expresión del cDNA de interés y el gen de la dihidrofolato
reductasa (DHFR). La expresión de la DHFR permite la selección para
la permanencia estable del plásmido después de la transfección.
Doce microgramos del DNA plasmídico deseado se
introdujeron en aproximadamente 10 millones de células CHO con
reactivos de transfección disponibles comercialmente Superfect
(Quiagen), Dosper o Fugene (Boehringer Mannheim). Las células se
crecieron tal como se describe en Lucas et al., supra.
Aproximadamente, se congelaron 3x10^{7} células en una ampolla de
congelación un para futuro crecimiento y producción tal como se
describió más adelante.
Las ampollas que contenían el DNA plasmídico se
descongelaron colocándolas en un baño-maría y se
mezclaron mediante vórtex. El contenido se pipeteó en un tubo de
centrífuga que contenía 10 ml del medio y se centrifugó a 1000 rpm
durante 5 minutos. El sobrenadante se aspiró y las células se
resuspendieron en 10 ml de medio selectivo (PSV20, suero bovino
fetal al 0,5% filtrado dos veces con un filtro de poro de 0,2
\mum). Las células se alicuotaron a continuación en un frasco
centrifugador de 100 ml que contenía 90 ml de medio selectivo.
Después de 1-2 días, las células se transfirieron a
un frasco de cultivo centrifugador de 250 ml con 150 ml de medio de
crecimiento selectivo y se incubaron a 37ºC. Al cabo de otros
2-3 días, los frascos de cultivo centrifugadores de
250 ml, 500 ml y 2000 ml se sembraron con 3 x 10^{5} células/ml.
El medio celular se cambió por medio fresco mediante centrifugación
y las células se resuspendieron en medio de producción. Aunque,
para las células CHO puede utilizarse cualquier medio, se utilizó
en realidad un medio de producción descrito en la patente americana
US 5. 122. 469, editada el 16 de Junio 16 de 1992. Un frasco de
cultivo centrifugador de 3 l de producción se sembró con 1,2 x
10^{6} células/ml. El día O se determinó el número de células y
el pH. El día 1, se obtuvieron muestras del frasco de cultivo
centrifugador y se inició la agitación con aire filtrado. El día 2,
se obtuvo una muestra del frasco de cultivo centrifugador, la
temperatura se cambió a 33ºC y se añadieron 30 ml de glucosa 500
g/l y 0,6 ml de antiespumante al 10% (p.ej., emulsión de
polidimetilsiloxán al 35%, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion).
Durante la producción, el pH se ajustó si era necesario a
aproximadamente 7,2. Después de 10 días, o hasta que la
variabilidad disminuyó por debajo del 70%, el cultivo celular se
recogió mediante centrifugación y se filtró a través de un filtro
de 0,22 \mum. El filtrado se guardó a 4ºC o se cargó
inmediatamente en las columnas para su purificación.
Para las construcciones con etiquetas de
poli-His, las proteínas se purificaron mediante una
columna Ni-NTA (Quiagen). Antes de su purificación,
se añadió imidazol al medio condicionado a una concentración de 5
mM. El medio condicionado se introdujo por bombeo en una columna de
6 ml de Ni-NTA equilibrada con tampón Hepes 20 mM,
pH 7,4 que contenía NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a una velocidad de
flujo de 4-5 ml/min a 4ºC. Después de cargada, la
columna se lavó con un tampón de equilibrado adicional y la
proteína se eluyó con un tampón de equilibrado que contenía
imidazol 0,25 M. La proteína altamente purificada se desaló
subsiguientemente en un tampón de almacenado que contenía Hepes 10
mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8 con una columna de 25 ml de
G25 Superfine (Pharmacia)y se guardó a -80ºC.
Las construcciones de Immunoadhesina (que
contienen Fc) se purificaron del medio condicionado tal como se
describe a continuación. El medio condicionado se bombeó en una
columna de Proteína-A (Pharmacia) de 5 ml que había
sido previamente equilibrada con tampón de fosfato de Na, pH 6,8.
Después de cargada, la columna se lavó extensivamente con tampón de
equilibrado antes de su elución con ácido cítrico 100 mM a pH 3,5.
La proteína eluída se neutralizó inmediatamente recogiendo
fracciones de 1 ml en tubos que contenían 275 \mul de tampón Tris
1M, a pH 9. La proteína altamente purificada se desaló
subsiguientemente en tampón de almacenado tal como se ha descrito
anteriormente para las proteínas etiquetadas con
poli-His. La homogeneidad se determinó con geles de
poliacrilamida-SDS y secuenciación en el extremo
N-terminal por degradación de Edman.
PRO241 se expresó también satisfactoriamente de
forma transitoria en las células COS.
El método descrito a continuación describe la
expresión recombinante del polipéptido PRO deseado en levaduras.
En primer lugar, los vectores de expresión de
levaduras se construyeron para la producción intracelular o
secreción de polipéptidos PRO a partir del promotor ADH2/GAPDH. El
DNA codificante para el polipéptido PRO deseado, un péptido señal
seleccionado y el promotor se insertaron en una diana de restricción
enzimática adecuada en el plásmido escogido para dirigir la
expresión intracelular del polipéptido PRO. Para la secreción, el
DNA codificante para el polipéptido PRO puede ser clonado en un
plásmido escogido, junto con el DNA codificante para el promotor
ADH2/GAPDH, la secuencia señal/líder de secreción del factor alfa de
levaduras, y las secuencias engarces (si fueran necesarias) para la
expresión del polipéptido PRO.
Las células de levadura, como la cepa de levadura
AB110, pueden ser transformadas con los plásmidos de expresión
descritos más adelante y cultivadas en medios de fermentación
seleccionados. Los sobrenadantes de las levaduras transformadas
pueden analizarse por precipitación con tricloroacético al 10% y
separación en SDS-PAGE, seguido por la tinción de
los geles con el colorante Azul de Coomassie.
El polipéptido PRO recombinante puede
subsecuentemente aislarse y purificarse extrayendo las células de
levadura del medio de fermentación mediante centrifugación y
después concentrando el medio con filtros en cartuchos
seleccionados. El concentrado que contiene el polipéptido PRO puede
purificarse en mayor grado utilizando resinas de columnas de
cromatografía seleccionadas.
El procedimiento descrito a continuación describe
la expresión recombinante de polipéptidos PRO en células de insecto
infectadas con Baculovirus.
EL polipéptido PRO deseado se fusiona por el
extremo 5' con una etiqueta epitópica contenida en un vector de
expresión de baculovirus. Las etiquetas epitópicas incluyen el
poli-his y etiquetas de immunoglobulina (como las
regiones Fc de IgG). Puede utilizarse una gran variedad de
plásmidos, incluyendo aquéllos derivados de los plásmidos
disponibles comercialmente como el pVL1393 (Novagen). En resumen,
el polipéptido PRO o la porción deseada del polipéptido PRO (como
la secuencia que codifica el dominio extracelular de una proteína
transmembranaria) se amplifica por PCR con los cebadores
complementarios de las regiones 5'y 3. El cebador 5' puede
incorporar dianas de restricción enzimática flanqueantes
(seleccionadas). El producto se digiere a continuación con dichas
enzimas de restricción seleccionadas y se subclona en el vector de
expresión.
El baculovirus recombinante se genera por
cotransfección del plásmido descrito más arriba y el virus de DNA
BaculoGold^{TM} (Pharmingen) en las células Spodoptera
frugiperda ("Sf9")(ATCC CRL 1711) con lipofectin
(disponible comercialmente por GIBCO-BRL). Al cabo
de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus
liberados son recogidos y utilizados para futuras amplificaciones.
La infección vírica y la expresión proteica se realiza según
O'Reilley y col., Baculovirus expression vectors: A laboratory
Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).
El polipéptido PRO etiquetado con
poli-His expresado puede ser purificado a
continuación, por ejemplo mediante una cromatografía de afinidad
Ni^{2+} quelante, tal como se describe a continuación. Los
extractos se preparan a partir de virus recombinantes que infectan
células Sf9 tal como describe por Rupert y col., Nature,
362:175-179 (1993). Brevemente, las células Sf9 se
lavan, resuspenden en tampón de sonicación (25 ml de Hepes, pH 7,9;
MgCl_{2} 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; Glicerol al
10%,NP-40 al 0,1%, KCl 0,54 M) y se sonican dos
veces durante 20 segundos en hielo. Los sonicados se lavan mediante
centrifugación y el sobrenadante se diluye 50 veces con tampón de
carga (fosfato 50 mM, NaCl 300mM, glicerol al 10%, pH 7,8) y se
filtra a través de una membrana de 0,45 \mum. Se prepara una
columna de Ni2+-NTA agarosa (disponible comercialmente por Quiagen)
con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua y se
equilibra con 25 ml de tampón de carga. El extracto celular
filtrado se carga en la columna a 0,5 ml/minuto. La columna se lava
con tampón de carga hasta alcanzar una A280 de nivel basal, en cuyo
momento se inicia la recolección de las fracciones. A continuación,
la columna se lava con un segundo tampón (fosfato 50 mM, NaCl 300
mM, glicerol la 10%, pH 6,0), que eluye las proteínas unidas
inespecíficas. Después de alcanzar de nuevo una A_{280} de nivel
basal, la columna se continua con un gradiente de imidazol de 0 a
500 mM en el tampón de lavado secundario. Se recogen fracciones de
1 ml y se analizan en SDS-PAGE con tinción con
plata o transferencia de western con Ni^{2+}-NTA-
conjugado con fosfatasa alcalina (Quiagen). Las fracciones eluídas
que contienen el polipéptido PRO etiquetado con His_{10} se
agrupan y dializan contra tampón de carga.
De forma alternativa, la purificación del
polipéptido PRO etiquetado con IgG (o Fc) puede realizarse
utilizando las técnicas corrientes de cromatografía, incluyendo
desde luego la cromatografía en columnas de Proteína A y Proteína
G.
El PRO241 se expresó satisfactoriamente en
células de insecto Sf9 infectadas con baculovirus. Aunque la
expresión se realizó en realidad en una escala de
0,5-2 L, pueden obtenerse preparaciones en escala
superior (p.ej. 8 l). Las proteínas se expresaron como
construcciones de IgG (immoadhesina) en las que la región
extracelular de la proteína se fusionó a una secuencia de región
constante de de IgG que contenía una región bisagra, los dominios
CH2 y CH3 y/o formas etiquetadas con poli-His.
Para la expresión en células Sf9infectadas con
baculovirus, después de la amplificación por PCR, las secuencias
codificantes respectivas se subclonaron en un vector de expresión
de baculovirus (pb.PH. IgG para fusiones de IgG, y pg.PH.His.c.
para proteínas etiquetadas con poli-his), y se
cotransfectaron el DNA de baculovirus Baculogold® DNA (Pharmigen) y
el vector en las células 105 de Spodoptera frugiperda
("Sf9") (ATCC CRL 1711) con Lipofectin (Gibco BRL). El
pb.PH.IgG y el pb.PH.His son modificaciones del vector de expresión
pVL1393 (Pharmigen) disponibles comercialmente, con regiones del
poliengarce modificadas que incluyen las secuencias con etiquetas
His o Fc. Las células se crecieron en medio de Hink
TNM-FH suplementado con FBS 10% (Hyclone). Las
células se incubaron durante 5 días a 28ºC. El sobrenadante se
recogió y a continuación se utilizó para la primera amplificación
vírica por infección de las células Sf9 en el medio de Hink
TNM-FH suplementado con FBS al 10% y a una
multiplicidad de infección (MOI) aproximada de 10. Las células se
incubaron durante 3 días a 28ºC. Se recogió el sobrenadante y la
expresión de las construcciones en el vector de expresión de
baculovirus se determinó uniendo de 1 ml del sobrenadante del grupo
a 25 ml de bolas de Ni-NTA (QIAGEN) para las
proteínas etiquetadas con histidina, o con bolas de
Proteína-A Sepharose CL-4B
(Pharmacia) para las proteínas etiquetadas con IgG. Luego se
prosiguió con el análisis en SDS-PAGE, comparando
una concentración conocida de un estándar de proteína por tinción
con azul de Coomassie.
El sobrenadante de la primera amplificación
vírica se empleó para infectar un frasco de cultivo (500 ml) de
células Sf9 crecidas en medio ESF-921 (Expression
Systems LLC) a una MOI aproximada de 0,1. Las células se incubaron
durante 3 días a 28ºC. El sobrenadante se recogió y filtró. Tanto
la unión de los grupos a las bolas modificas como el análisis por
SDS-PAGE se repitió cuantas veces fuera necesario
hasta confirmar la expresión en el frasco de cultivo
centrifugador.
El medio condicionado de las células
transfectadas (0,5 a 3 l) se recogió, se centrifugó para extraer
las células y se filtró a través de filtros de 0,22 micras. Para
las construcciones etiquetadas con poli-His, la
proteína se purificó con una columna
Ni-NTA(Quiagen). Antes de la purificación, se
añadió imidazol al medio condicionado hasta una concentración de 5
mM. El medio condicionado se bombeó en una columna de
Ni-NTA de 6 ml equilibrada con Hepes 20 mM, pH 7,4,
que contenía NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a una velocidad de flujo de
4-5 ml/min a 4ºC. Después de la carga, la columna se
lavó con tampón de equilibrado adicional y la proteína se eluyó con
tampón de equilibrado que contenía imidazol 0,25 M. La proteína
altamente purificada se desaló subsiguientemente en tampón de
almacenado que contenía Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y mannitol al 4%,
pH 6,8 en una columna G25 Superfine (Pharmacia) de 25 ml y se
guardó a -80ºC.
Las construcciones de immunoadhesina (que
contienen Fc) se purificaron del medio condicionado tal como se
describe a continuación. El medio condicionado se bombeó en una
columna de 5 ml de Proteína A (Pharmacia) previamente equilibrada
en tampón fosfato 20 mM, pH 6,8. Después de cargada, la columna se
lavó extensamente con tampón de equilibrado antes de la elución con
ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluída fue neutralizada
inmediatamente mediante recolección de fracciones de 1 ml en tubos
que contenían 275 ml de tampón Tris 1 M, pH 9. La proteína
altamente purificada fue subsiguientemente desalada en tampón de
almacenado tal como se describió anteriormente para las proteínas
etiquetadas con poli-His. La homogeneidad de las
proteínas se verificó por electroforesis en geles de SDS y
poliacrilamida (PEG) y secuenciación aminoacídica
N-terminal por degradación de Edman.
En la patente europea EP 1 037 979 A (98 960
440.0), los polipéptidos PRO243, PRO323, PRO344 y PRO355 se
expresaron con éxito en las células de insecto Hi5 infectadas con
baculovirus. Aunque la expresión se realizó a una escala de
0,5-2 l, es posible obtener fácilmente
preparaciones a escalas mayores (p.ej. 8 l).
Para la expresión en células de insecto Hi5
infectadas por baculovirus, el DNA que codifica para el polipéptido
PRO puede ser amplificado utilizando sistemas adecuados como la
polimerasa Pfu (Stratagene), o fusionado cadena arriba (en el
extremo 5'-) con una etiqueta epitópica contenida en un vector de
expresión de baculovirus. Las etiquetas epitópicas incluye el
poli-his y las etiquetas de inmunoglobulina (como
las regiones Fc de IgG). Pueden utilizarse diversos plásmidos,
incluyendo los derivados de plásmidos disponibles comercialmente
como el pVL 1393 (Novagen). En resumen, el polipéptido PRO o la
porción deseada del polipéptido PRO (como la secuencia codificante
para el dominio extracelular de una proteína transmembranaria) se
amplifica por PCR con los cebadores complementarios de las dos
regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar dianas de
restricción enzimática flanqueantes (seleccionadas). A continuación,
el producto se digiere con dichas enzimas de restricción
seleccionadas y se subclona en el vector de expresión. Por ejemplo,
los derivados del pVL1393 pueden incluir la región Fc de la IgG
humana (pb.PH.IgG) o una etiqueta de 8 histidinas (pg.PG.His)
cadena abajo (3'-) de la secuencia de NOMBRE X. Preferentemente, el
vector construido se secuencia para su confirmación.
Las células Hi5 se crecen hasta una confluencia
del 50% a 27ºC, sin CO_{2} y sin penicilina/estreptomicina. Para
cada placa de 150 mm, se mezclan 30 \mug de un vector basado en
el plE que contiene el polipéptido PRO con 1 ml de medio
Ex-Cell (Medio: Ex-Cell 401 + 1/100
L-Glu JRH Biosciences #14401-78P
(nota: este medio es sensible a la luz)), y en un tubo separado se
mezclan 100 \mul de CellFectin (CellFECTIN (GibcoBRL
#10362-010) (mezclar con vórtex)) con 1 ml de medio
Ex-Cell. Las dos soluciones se combinan y se dejan
incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añaden 8 ml
de medio Ex-Cell a los 2 ml de la mezcla de
DNA/CellFECTIN, depositándose sobre las células Hi5 que han sido
lavadas una vez con medio Ex-Cell. A continuación,
la placa se incuba en la oscuridad durante 1 hora a temperatura
ambiente. La mezcla de DNA/CellFECTIN se aspira a continuación, y
las células se lavan una vez con Ex-Cell para
eliminar el exceso de CellFECTIN. Se aspiran 30 ml de medio
Ex-Cell y las células se incuban durante 3 días a
28ºC. El sobrenadante se recoge y se determina la expresión del
polipéptido PRO en el vector de expresión de baculovirus mediante
unión de 1 ml del sobrenadante de los grupos con 25 ml de bolas de
Ni-NTA (QUIAGEN) para las proteínas etiquetadas con
histidina, o con bolas de Protein-A Sepharose
CL-48 (Pharmacia) para las proteínas etiquetadas con
IgG. Se prosigue con el análisis en SDS-PAGE
comparando con una concentración conocida de estándar proteico y
con tinción con azul de Comassie.
El medio condicionado de las células
transfectadas (de 0,5 a 3 l) se recoge por centrifugación para
desechar las células y se filtra a través de un filtro de 0,22
micras. Para las construcciones etiquetadas con
poli-His, la proteína comprendiendo el polipéptido
PRO se purifica con una columna Ni-NTA (Quiagen).
Antes de la purificación, se añade imidazol a una concentración de 5
mM al medio condicionado. El medio condicionado se bombea a una
columna de Ni-NTA de 6 ml equilibrada con Hepes 20
mM, pH 7,4 y NaCl O,3 M e imidazole 5 mM a una velocidad de flujo
de 4-5 ml/min, a 4ºC. Después de cargada, la columna
se lava con tampón de equilibrado extra y la proteína eluída con
tampón de equilibrado que contiene imidazol 0,25 M. La proteína
altamente purificada se desala a continuación en tampón de
almacenado que contiene Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4%,
pH 6,8 con una columna de G25 Superfine (Pharmacia) de 25 ml y se
guarda a -80ºC.
Las construcciones de proteínas de immunoadhesina
(que contienen Fc) se purifican del medio condicionado tal como se
describe a continuación. El medio condicionado se bombea en una
columna de Proteína A (Pharmacia) de 5 ml equilibrada con tampón
fosfato 20 mM, pH 6,8. Después de cargada, la columna se lava
extensamente con tampón de equilibrado antes de la elución con ácido
cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluida se neutraliza
inmediatamente recogiendo las fracciones de 1 ml en tubos que
contienen 275 ml de tampón Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente
purificada se desala subsiguientemente en tampón de almacenado tal
como se describió anteriormente para las proteínas etiquetadas con
poli-His. La homogeneidad del polipéptido PRO puede
determinarse en geles de SDS y poliacrilamida y por secuenciación
aminoacídica del extremo N-terminal por degradación
de Edman y otros métodos analíticos si se desea o fuera
necesario.
Este ejemplo ilustra la preparación de
anticuerpos monoclonales que pueden unirse de manera específica con
el polipéptido PRO.
Las técnicas para producir anticuerpos
monoclonales son conocidas en la materia y están descritas, por
ejemplo, en Goding, supra. En los inmunógenos que pueden
utilizarse, se incluyen los polipéptidos PRO purificados, las
proteínas de fusión que contienen el polipéptido PRO y células que
expresan el polipéptido recombinante PRO en su superficie. La
selección del inmunógeno puede realizarse por un experto en la
materia sin excesiva experimentación.
Ratones, como los Balb/c; se inmunizaron con el
inmunógeno polipéptido PRO emulsionado en el adyuvante completo de
Freund e inyectado subcutánea o intraperitonealmente en una
cantidad de 1-100 microgramos. De forma alternativa,
el inmunógeno se emulsiona en el adyuvante MPL-TDM
(Ribi Immmunochemical Research, Hamilton, NT) y se inyecta en los
cojinetes de las patas traseras del animal. El animal inmunizado es
estimulado 10 a 12 días más tarde con inmunógeno adicional
emulsionado en el adyuvante seleccionado. Durante algunas semanas el
ratón puede ser estimulado con inyecciones de inmunización
adicionales. De manera periódica, se pueden obtener muestras de
suero del ratón por sangrado retro-orbital para
examinar en ensayos de ELISA la presencia de anticuerpos
anti-polipéptido PRO.
Una vez obtenido el título de anticuerpo
adecuado, los animales "positivos" para los anticuerpos pueden
inyectarse con una inyección intravenosa final de polipéptido PRO.
Tres o cuatro días más tarde, el ratón se sacrifica y se extraen
las células del bazo. Estas células se fusionan después (con
polietilén glicol al 35%) con una línea celular murina de mieloma
seleccionada, como por ejemplo la P3X63AgU.1, disponible en el
ATCC, No. CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que
pueden después ser sembradas en una placa de cultivo de tejidos de
96 pocillos con medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina)
para inhibir la proliferación de las células no fusionadas, los
híbridos de mieloma y los híbridos de células del bazo.
Las células del hibridoma se ensayan en un ELISA
para su reactividad contra el polipéptido PRO. La localización de
células de hibridoma positivas, que secretan los anticuerpos
deseados contra el polipéptido PRO, se realiza según el criterio de
los expertos en la materia.
Las células de hibridoma positivas pueden
inyectarse intraperitonealmente en ratones singénicos Balb/c para
producir ascitas que contengan los anticuerpos monoclonales
anti-polipéptido PRO. De manera alternativa, las
células del hibridoma pueden crecerse en botellas de cultivo de
tejidos o en botellas de cultivo para agitación. La purificación de
los anticuerpos monoclonales producidos en las acitas puede
realizarse mediante precipitación con sulfato amónico seguida de
cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, se puede
emplear la cromatografía de afinidad basada en la unión del
anticuerpo a la proteína A o a la proteína G.
Los polipéptidos PRO pueden expresarse como
proteínas quiméricas con uno o más dominios polipeptídicos
adicionales añadidos para facilitas la purificación de la proteína.
Los dominios facilitadores de la purificación incluyen, pero no se
limitan a, los péptidos quelantes de metales como los módulos de
histidina-triptófano que permiten la purificación en
metales inmovilizados, los dominios de la proteína A que permite la
purificación en la inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio
utilizado en el sistema de purificación por extensión/afinidad
FLAGS^{TM} (Immunex Corp., Seattle Wash.). La inclusión de una
secuencia engarce que pueda sufrir un corte como el Factor XA o la
enteroquinasa (Invitrogen, San Diego Calif.) entre el dominio de
purificación y la secuencia del polipéptido PRO puede ser útil para
facilitar la expresión del DNA que codifica el polipéptido PRO.
Los polipéptidos PRO nativos y recombinantes
pueden purificase mediante una variedad de técnicas estándares en
el campo de la purificación de proteínas. Por ejemplo. el
pro-polipéptido PRO, el polipéptido PRO maduro, o el
polipéptido pre-PRO se purifican mediante
cromatografía de inmunoafinidad con anticuerpos específicos para el
PRO polipéptido de interés. En general, una columna de
inmunoafinidad se construye por acoplamiento covalente del
anticuerpo anti-polipéptido PRO a una resina de
cromatografía activada.
Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a
partir de suero inmune tanto por precipitación con sulfato amónico
como por purificación con Proteína-A inmovilizada
(Pharmacia LkB Biotechnology, Piscataway, N.J.). De igual manera,
los anticuerpos monoclonales se preparan a partir del fluido de
ascitas de ratones mediante precipitación con sulfato amónico o
cromatografía con proteína-A inmovilizada.
La inmunoglobulina parcialmente purificada se
acopla covalentemente a una resina cromatográfica como la
SEPHAROSE^{TM} CnBr-activada (Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo se acopla a la resina, la resina se bloquea y la resina derivada se lava según las instrucciones del fabricante.
SEPHAROSE^{TM} CnBr-activada (Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo se acopla a la resina, la resina se bloquea y la resina derivada se lava según las instrucciones del fabricante.
Una tal columna de inmunoafinidad se utiliza en
la purificación del polipéptido PRO preparando una fracción de
células que contienen el PRO polipéptido en una forma soluble. La
preparación se deriva de la solubilización del conjunto todas las
células o de una fracción subcelular obtenida mediante
centrifugación diferencial por la adición de detergente o por otros
métodos bien conocidos en la materia. De manera alternativa, el
polipéptido PRO soluble que contiene la secuencia señal puede
secretarse en una cantidad útil en el medio en el que las células
han crecido.
Un polipéptido PRO soluble que contiene la
preparación se pasa a través de una columna de inmunoafinidad y la
columna se lava n condiciones que permitan la absorbancia
preferencial del polipéptido PRO (p.ej. tampones con alta fuerza
iónica en presencia de detergente). La columna se eluye después, en
condiciones que rompen la unión entre el anticuerpo y el
polipéptido PRO (p.ej., tampón de pH bajo, aproximadamente
2-3, o una alta concentración de un caotropo como la
urea o el ión tiocianato) y a continuación se recupera el
polipéptido PRO.
Esta invención es particularmente útil para la
selección de compuestos utilizando el polipéptido PRO o el
fragmento de unión del mismo en cualquiera de las técnicas de
rastreo de fármacos. El polipéptido PRO o el fragmento utilizado en
el ensayo puede estar libre en solución o fijo sobre un soporte
sólido, expresado en una superficie celular, o localizado
intracelularmente. Un método de selección de fármacos utiliza
células hospedadoras eucariotas o procariotas que están
transformadas de forma estable con ácidos nucleicos recombinantes
que expresan el polipéptido PRO o un fragmento de éste. Los
fármacos se seleccionan mediante ensayos de unión competitiva con
las células transformadas. Estas células, tanto en su forma viable
o fijada, pueden utilizarse en ensayos estándares de unión. Por
ejemplo, se puede cuantificar la formación de complejos entre el
polipéptido PRO o un fragmento de éste y el agente que se quiere
analizar. Alternativamente, se puede examinar la disminución en la
formación del complejo entre el polipéptido PRO y su célula diana o
los receptores diana, provocada por el agente que se analiza.
Por tanto, la presente invención proporciona
procedimientos de rastreo y selección de fármacos o de otros
agentes que puedan influir en la enfermedad o trastorno asociados
con el polipéptido PRO. Estos procedimientos comprenden el contacto
de un agente con un polipéptido PRO o un fragmento de éste y el
ensayo para (i) la presencia de un complejo entre el agente y el
polipéptido PRO o fragmento de éste, o para (ii) la presencia del
complejo entre el polipéptido PRO o fragmento y la célula, mediante
procedimientos bien conocidos en la materia. En estos ensayos de
unión competitiva, el polipéptido PRO o el fragmento de éste están
generalmente marcados. Después de una incubación adecuada, el
polipéptido PRO se separa de la forma unida y la cantidad de
marcaje libre o no acomplejado es una medida de la capacidad de un
agente particular para unirse a un polipéptido PRO o para
interferir con el complejo del polipéptido PRO y la célula.
Otra técnica para el rastreo de fármacos que
proporciona un alto rendimiento en la investigación de compuestos
con una afinidad de unión adecuada al polipéptido, se describen con
detalle en la patente internacional WO 84/03564, publicada el 13 de
septiembre de 1984. En resumen, se sintetizó un gran número de
compuestos de ensayo de péptidos pequeños distintos sobre un
sustrato sólido como clavos de plástico u otra superficie. Tal como
se aplicó a un polipéptido PRO, los compuestos del ensayo peptídico
reaccionaron con el polipéptido PRO y a continuación se lavaron. El
polipéptido PRO unido se detectó mediante procedimientos bien
conocidos en la materia. El polipéptido PRO purificado puede
también recubrir directamente las placas para utilizar técnicas de
rastreo de fármacos mencionadas anteriormente. Además, los
anticuerpos no neutralizantes pueden utilizarse para capturar el
péptido e inmovilizar éste en el soporte sólido.
La presente invención también contempla la
utilización de ensayos competitivos de rastreo de fármacos en los
que los anticuerpos neutralizantes capaces de unirse al polipéptido
PRO específicamente compiten con un compuesto del ensayo por la
unión con el polipéptido PRO o a fragmentos de éste. De esta manera,
los anticuerpos pueden utilizarse para detectar la presencia de
cualquier péptido que comparta uno o más antígenos determinantes
con el polipéptido PRO.
El objetivo del diseño de fármacos es la
producción de análogos de polipéptidos activos biológicamente de
interés (es decir., un polipéptido PRO) o de pequeñas moléculas con
las que pueda interactuar, p.ej., agonistas, antagonistas o
inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos pueden utilizarse como
modelos de fármacos que sean formas más activos o estables del
polipéptido PRO o que aumenten o interfieran con la función del
polipéptido PRO in vivo (c.f., Hodgson, Bio/Technology,
9; 19-21 (1991)).
En un enfoque de la presente invención, se
determina la estructura tridimensional del polipéptido PRO, o de un
complejo entre el polipéptido PRO y el inhibidor, mediante
cristalografía de rayos X o por modelaje informático o, más
habitualmente por la combinación de ambos enfoques. Tanto la forma y
como las cargas del polipéptido PRO deben comprobarse para elucidar
la estructura y determinar los sitios activos de la molécula. Menos
frecuentemente, también puede obtenerse la información adecuada
sobre la estructura del polipéptido PRO mediante modelaje basado en
la estructura de proteínas homólogas. En ambos casos, la
información estructural relevante se utiliza para diseñar moléculas
similares a polipéptidos PRO análogos similares o para identificar
inhibidores eficientes. Ejemplos útiles del diseño racional de
fármacos incluyen moléculas que han mejorado su actividad o
estabilidad tal como se muestra por Braxton y Wells, Biochemistry,
31:7796-7801 (1992), o que actúan como inhibidores,
agonistas, o antagonistas de los péptidos nativos tal y como se
muestra en Athauda y col., J Biochem., 113; 742-746
(1993).
También es posible aislar un anticuerpo
específico contra una diana, seleccionándolo mediante un ensayo
funcional, tal y como se describió anteriormente y a continuación
resolver la estructura cristalina. Este enfoque, en principio
produce un fármaco básico o farmacore sobre el que puede basarse el
diseño de fármacos. Es posible evitar utilizar la cristalografía de
proteínas generando anticuerpos anti-idiotípicos
(anti-ids) contra un anticuerpo activo
farmacológicamente funcional. Como una imagen en espejo, el lugar de
unión del un anti-ids se esperaría que fuera un
análogo del receptor original. El anti-id podría
utilizarse para identificar y aislar péptidos de bancos peptídicos
producidos química o biológicamente. Dichos péptidos aislados
podrían actuar como farmacores.
Gracias a la presente invención, puede disponerse
de la suficiente cantidad del polipéptido PRO para estudios
analíticos como la cristalografía de rayos X. Además, el
conocimiento de la secuencia aminoacídica del polipéptido PRO aquí
proporcionado, servirá de guía para aquellos que utilicen técnicas
de modelaje informático en lugar de o de forma complementaria a la
cristalografía de rayos X.
La capacidad del PRO241 para estimular la
liberación de proteoglicanos del cartílago se analizó como se
describe a continuación.
La articulación
metacarpiana-falangeal de cerdos de
4-6 meses de edad se diseccionó de manera aséptica
y se extrajo el cartílago articular a mano realizando cortes en
rebanadas y cuidando de evitar el hueso subyacente. El cartílago se
desmenuzó y la mayor parte de éste se cultivó durante 24 horas en
una atmósfera humidificada con aire al 95% y CO_{2} al 5%, en
medio (DME/F12 1:1) sin suero (SF)con BSA al 0,1% y 100 U/ml
de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina. Después de lavar
tres veces, aproximadamente 100 mg de cartílago articular se
distribuyeron en alícuotas en tubos micronics y se incubaron
durante 24 horas adicionales en el medio anterior con SF. Los
polipéptidos PRO241 se añadieron a continuación al 1%, solos o en
combinación con 18 mg/ml de
interleuquina-1\alpha, un conocido estimulante de
la liberación de proteoglicanos del cartílago. El sobrenadante se
reservó y a continuación se analizó la cantidad de proteoglicanos
mediante un ensayo colorimétrico con azul de
1,9-dimetril-metilén (metilen blue,
DMB) (Farndale y Buttle, Biochem Biophys
Acta__883:173-177 (1985)). Un resultado positivo en
este ensayo indica que el polipéptido examinado tendrá utilidad por
ejemplo, en el tratamiento de los problemas de articulaciones
relacionados con el deporte, los defectos articulares del
cartílago, la osteoartritis o la artritis reumatoide.
Cuando los polipéptidos PRO241 se analizaron con
el ensayo descrito, los polipéptidos demostraron un marcado efecto
en estimular la liberación de los proteoglicanos del cartílago
tanto de manera basal como después de la estimulación con
interleuquina-1\alpha y entre
24-72 horas de tratamiento, lo que indicaba que los
polipéptidos PRO241 eran útiles para estimular la liberación de los
proteoglicanos del cartílago.
La hibridación in situ es una técnica
poderosa y versátil para detectar y localizar secuencias de ácidos
nucleicos en las preparaciones de células y de tejidos. Puede ser
de utilidad, por ejemplo, para identificar lugares de expresión
génica, analizar la distribución tisular de la transcripción,
identificar y localizar infecciones virales, seguir los cambios en
la síntesis de mRNA específico y como una ayuda en el mapeo
cromosómico.
La hibridación in situ se realizó
siguiendo una versión optimizada del protocolo de Lu y Gillett,
Cell Vision 1:169-176 (1994), mediante ribosondas
marcadas con p^{32} y generadas por PCR. En resumen, se obtuvieron
secciones de tejidos humanos fijados con formalina y embebidos en
parafina, se desparafinizaron y deproteinizaron con proteinasa K
(20 mg/ml) durante 15 minutos a 37ºC, y se procesaron para la
hibridación in situ según Lu y Gillet, supra. Se
generó una ribosonda antisentido marcada con
[^{33}-P]UTP a partir de un producto de PCR
y se hibridó a 55ºC durante toda la noche. Las secciones se
impregnaron con emulsión nuclear Kodak NTB2 y se expusieron durante
4 semanas.
Seis microlitros 6,0 (125 mCi) de
^{33}P-UTP (Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/mmol)
se secaron en una centrífuga al vacío. A cada tubo que contenía el
^{33}P-UTP seco, se añadieron los siguientes
ingredientes:
2,0 \mul de 5x tampón de transcripción
1,0 \mul de DTT(100 mM)
2,0 \mul NTP (2.5 mM: 10 \mul de cada 10 mM
GTP, CTP & ATP + 10 \mul H_{2}O)
1,0 \mul de UTP (50 \muM)
1,0 \mul de Rnasin
1,0 \mul DNA molde(1 \mug)
1,0 \mul de H_{2}O
1,0 \mul de RNA polimerasa (para productos de
PCR T3= AS, T7= S)
Los tubos se incubaron a 37ºC durante una hora.
Se añadió 1,0 \mul de RQ1 DNAasa seguido de una incubación a 37ºC
durante 15 minutos. 90 \mul de TE (Tris 10 mM pH 7,6/ EDTA 1 mM
pH 8,0) se añadieron y la mezcla se pipeteó en papel DE81. La
solución restante se cargó en una unidad de ultrafiltración
Microcon-50 y se centrifugó conn el programa 10 (6
minutos). La unidad de filtración se invirtió sobre un segundo tubo
y se centrifugó con el programa 2 (3 minutos). Después de la última
centrifugación, se añadieron 100 \mul de TE al producto. Se
pipetiteó 1 \mul del producto final sobre papel DE81 y se realizó
un contaje de centelleo con 6 ml de Biofluor II.
La sonda se migró en un gel de TBE/urea. De
1-3 \mul de la sonda o 5 \mul de RNA Mnk III se
mezclaron con 3 \mul de tampón de carga, se calentaron en una
placa calefactora a 95ºC durante tres minutos y a continuación se
colocaron inmediatamente en hielo. Los pocillos del gel se lavaron,
la muestra se cargó y se migró a 180-250 voltios
durante 45 minutos. El gel se envolvió con plástico transparente y
se expuso a una película de XAR con pantalla intensificadora en un
congelador de -70º una hora o durante toda la noche.
Las preparaciones de secciones tisulares se
sacaron del congelador y se colocaron en una bandeja de aluminio
donde se descongelaron a temperatura ambiente durante 5 minutos.
Las bandejas se colocaron en un incubador a 55ºC durante cinco
minutos para reducir la condensación. Las preparaciones se fijaron
durante 10 minutos en paraformaldehído al 4% en hielo en la campana
de gases y se lavaron con 0,5XSCC durante 5 minutos a temperatura
ambiente (25 ml 20x SSC + 975 ml H_{2}O SQ). Después de la
desproteinización conn proteinasa K 0,5 \mug/ml durante 10
minutos a 37ºC (12,5 \mul de una solución madre de 10 mg/ml en
250 ml de tampón precalentado de RNAsa libre de RNAsas), las
secciones se lavaron en 0,5XSSC durante 10 minutos a temperatura
ambiente. Las secciones se deshidrataron con etanoles al 70%, 95%,
100%, 2 minutos en cada uno.
Las preparaciones se desparafinaron, se pusieron
en H_{2}O SQ, y se lavaron dos veces en 2xSSC a temperatura
ambiente, durante 5 minutos cada vez. Las secciones se
desproteinizaron con 20 \mug/ml de proteinasa K (500 \mul de 10
mg/ml en 250 ml de tampón de RNAsa libre de RNAsas a 37º 15 minutos)
para embriones humanos, o con 8X proteinasa K (100 \mul en 250 ml
de tampón RNAsa, 37ºC, 30 minutos) para tejidos en formalina. El
siguiente lavado con 0.5xSSC y la deshidratación se realizaron tal
como se ha describió anteriormente.
Las preparaciones se colocaron en una caja de
plástico forrada con papel de filtro saturado con tampón (4xSSC,
formamida al 50%). El tejido se cubrió con 50 \mul de tampón de
hibridación (3,75 g de sulfato de dextrano + 6 ml de H_{2}O SQ)
se mezcló con el vórtex y calentó en el microondas durante 2 minutos
con la tapa aflojada. Después de enfriar en hielo, se añadieron
18.75 ml de formamida, 3,75 ml de 20xSSC y 9 ml de H_{2}O SQ, el
tejidos se mezcló bien con el vórtex y se incubó a 42ºC durante
1-4 horas.
Se calentaron a 95ºC durante 3 minutos, 1,0 x
10^{6} cpm de la sonda y 1,0 \mul de tRNA (50 mg/ml de solución
madre) por preparación en un portaobjetos. Las preparaciones se
enfriaron en hielo y se añadieron 48 \mul de tampón de
hibridación por preparación. Después de mezclar con el vórtex, se
añadieron 50 \mul de la mezcla con ^{33}P a los 50 \mul de
prehibridación en la preparación. A continuación, las preparaciones
se incubaron toda la noche a 55ºC.
El lavado se realizó con 2xSSC y EDTA (400 ml de
20xSSC + 16 ml de EDTA 0,25 M, V_{f}=4l) durante 10 minutos a
temperatura ambiente, seguido por un tratamiento a 37ºC durante 30
minutos con RNAasa (500 \mul de una solución a 10 mg/ml en 250 ml
de tampón RNAasa = 20 \mug/ml). Las preparaciones se lavaron 2 x
10 minutos con 2xSSC, EDTA a temperatura ambiente. La astringencia
de las condiciones de lavado fue la siguiente: 2 horas a 55ºC,
0,1xSSC, EDTA (20 ml de 20xSSC + 16 ml de EDTA, V_{f}=4 l).
Los siguientes materiales han sido depositados en
el American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, MD, USA (ATCC):
| Material | ATCC Dep. No | Fecha de depósito |
| DNA34392-1170 | ATCC 209526 | 10 de diciembre, 1997 |
Este depósito se realizó de acuerdo con las
disposiciones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento
internacional del depósito de microorganismos a los fines del
procedimiento en materia de patentes y sus regulaciones (Tratado de
Budapest). Este asegura el mantenimiento de un cultivo viable del
depósito durante 30 años a partir de la fecha del depósito. Los
depósitos estarán disponibles por el ATCC en los términos del
Tratado de Budapest y sujetos a un acuerdo entre Genentech, Inc., y
ATCC, que asegura la disponibilidad permanente y sin restricciones
de la progenie del cultivo del depósito para el público después de
la emisión de la patente americana pertinente, o la apertura al
público de cualquier patente americana o extranjera que proceda
primero y asegure la disponibilidad de la progenie para una
determinada por el Comisario americano de Patentes y Marcas
Registradas a denominar de acuerdo con el 35 USC & 122 y las
normas del Comisionado correspondientes (incluyendo 37 CFR &
1.14 con especial referencia a la 886 OG 638).
El concesionario de la presente invención ha
acordado que si un cultivo de los materiales en depósito debiera
destruirse o eliminarse cuando se cultiva en condiciones adecuadas,
los materiales se reemplazarán rápidamente tras su notificación con
otro similar. La disponibilidad del material depositado no debe
interpretarse como una licencia para la práctica de la invención en
contravención de los derechos garantizados bajo la autoridad de
cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes sobre patentes.
<110> Genentech, Inc.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Polipéptidos y ácidos nucleicos que
los codifican
\vskip0.400000\baselineskip
<130> CMD/PF5962980
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 01126188.0
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2001-11-05
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 9896440.0
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-12-01
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/069.334
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1997-12-11
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2454
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
<210 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 379
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Descripción de Secuencia
Artificial:Sintética"
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaaatgagt gcaaaccctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Descripción de Secuencia
Artificial:Sintética"
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcccaagctg aacactcatt ctgc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Descripción de Secuencia
Artificial:Sintética"
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtgacggt gttccatatc agaattgcag aagcaaaact gacctcagtt
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Descripción de Secuencia
Artificial:Sintética"
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtaaaacga cggccagtta aatagacctg caattattaa tct
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Descripción de Secuencia
Artificial:Sintética"
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggaaacag ctatgaccac ctgcacacct gcaaatccat t
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (28)
1. Ácido nucleico aislado que codifica una
secuencia aminoacídica que tiene una identidad de secuencia de al
menos un 80% con la secuencia aminoacídica que se muestra en la
Figura 2 (SEC ID Nº 2), o su complementaria, en donde dicha
identidad de secuencia se determina considerando toda la longitud de
las secuencias que se comparan.
2. Ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde el grado de identidad es de al menos el
90%.
3. Ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 2, en donde el grado de identidad es de al menos el
95%.
4. Ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 1, que codifica un polipéptido que comprende la
secuencia aminoacídica que se muestra en la Figura 2 (SEC ID Nº
2).
5. Ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde dicha secuencia de nucleótidos comprende
la secuencia codificante de longitud completa de la secuencia que
se muestra en la Figura 1 (SEC ID Nº 1), o su complementaria.
6. Ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde dicha secuencia de nucleótidos comprende
la secuencia nucleotídica que se muestra en la Figura 1 (SEC ID Nº
1), o su complementaria.
7. Ácido nucleico aislado que tiene al menos un
80% de identidad de secuencia con una secuencia nucleotídica que
codifica un polipéptido, la cual comprende la secuencia
aminoacídica que se muestra en la Figura 2 (SEC ID Nº2) o su
complementaria, en donde dicha identidad de secuencia se determina
considerando toda la longitud de las secuencias que se
comparan.
8. Ácido nucleico aislado que comprende la
secuencia codificante de longitud completa del inserto de ácido
nucleico (DNA 34392-1170) comprendido en el número
de acceso ATCC 209526.
9. Vector que comprende el ácido nucleico de
cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
10. Vector de acuerdo con la reivindicación 9
unido operativamente a las secuencias control reconocidas por una
célula hospedadora transformada con el vector.
11. Célula hospedadora que comprende el vector de
acuerdo con la reivindicación 9 ó reivindicación 10.
12. Célula hospedadora de acuerdo con la
reivindicación 11, en donde dicha célula es un célula CHO.
13. Célula hospedadora de acuerdo con la
reivindicación 11, en donde dicha célula es una célula de E.
coli.
14. Célula hospedadora de acuerdo con la
reivindicación 11, en donde dicha célula es una célula de
levadura.
15. Proceso para la producción de un polipéptido
que comprende el cultivo de la célula hospedadora de cualquiera de
las reivindicaciones 11-14 en condiciones adecuadas
para la expresión de dicho polipéptido y la recuperación de dicho
polipéptido del cultivo celular.
16. Polipéptido aislado que tiene una identidad
de secuencia de al menos el 80% con la secuencia aminoacídica que
se muestra en la Figura 2 (SEC ID Nº 2), en donde dicha identidad
de secuencia se determina considerando toda la longitud de las
secuencias que se comparan.
17. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación
16 que consiste en la secuencia aminoacídica que se muestra en la
Figura 2 (SEC ID Nº 2).
18. Polipéptido aislado que contiene una
identidad de secuencia de al menos el 80% con la secuencia
aminoacídica codificada por la secuencia codificante de longitud
completa del inserto de ácido nucleico (DNA
34392-1170) comprendido en el número de acceso ATCC
209526, en donde dicha identidad de secuencia se determina
considerando toda la longitud de las secuencias que se comparan.
19. Polipéptido aislado de acuerdo con la
reivindicación 18 que consiste en la secuencia aminoacídica
codificada por la secuencia codificante de longitud completa del
inserto de ácido nucleico (DNA 34392-1170)
comprendido en el número de acceso ATCC 209526.
20. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación
16 ó la reivindicación 18, en donde el grado de identidad es de al
menos el 90%.
21. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación
20, en donde el grado de identidad es de al menos el 95%.
22. Molécula quimérica que comprende un
polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a
21, fusionado con una secuencia aminoacídica heteróloga.
23. Molécula quimérica de acuerdo con la
reivindicación 22, en donde dicha secuencia aminoacídica heteróloga
es una secuencia de etiqueta epitópica.
24. Molécula quimérica de acuerdo con la
reivindicación 22, en donde dicha secuencia aminoacídica heteróloga
es una región Fc de una inmunoglobulina.
25. Anticuerpo que se une específicamente al
polipéptido PRO de acuerdo con la reivindicación 17 ó la
reivindicación 19.
26. Anticuerpo de acuerdo con la reivindicación
25, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
27. Polipéptido de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 21 para utilizar en un procedimiento de
tratamiento médico.
28. Composición farmacéutica que comprende un
polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a
21 con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US6933497P | 1997-12-11 | 1997-12-11 | |
| US69334P | 1997-12-11 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2222959T3 true ES2222959T3 (es) | 2005-02-16 |
Family
ID=32467286
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES01126188T Expired - Lifetime ES2222959T3 (es) | 1997-12-11 | 1998-12-01 | Polipeptidos pro241 y acido nucleico codificante de los mismos. |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1191101B1 (es) |
| AT (1) | ATE268819T1 (es) |
| DE (1) | DE69824455T2 (es) |
| DK (1) | DK1191101T3 (es) |
| ES (1) | ES2222959T3 (es) |
| PT (1) | PT1191101E (es) |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1418183A1 (en) * | 1989-08-22 | 2004-05-12 | HSC Research Development Corporation | Cystic fibrosis gene |
| US5536637A (en) * | 1993-04-07 | 1996-07-16 | Genetics Institute, Inc. | Method of screening for cDNA encoding novel secreted mammalian proteins in yeast |
| AU6926194A (en) * | 1994-05-09 | 1995-11-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Use of chondroitin sulphate proteoglycans for protection of neurons |
| US6001970A (en) * | 1994-11-07 | 1999-12-14 | Merck & Co., Inc | Modified human neuropeptide Y1 Receptors |
| US5707829A (en) * | 1995-08-11 | 1998-01-13 | Genetics Institute, Inc. | DNA sequences and secreted proteins encoded thereby |
| AU1532697A (en) * | 1996-01-12 | 1997-08-01 | Genetics Institute Inc. | Beta-chemokine, h1305 (mcp-2) |
| DE69835777T2 (de) * | 1997-08-01 | 2007-09-06 | Serono Genetics Institute S.A. | 5' EST's für sekretierte Proteine, die in verschiedenen Geweben exprimiert werden |
| JP2002511259A (ja) * | 1998-04-09 | 2002-04-16 | ジェンセット | ５’ｅｓｔおよびコードされるヒトタンパク質 |
-
1998
- 1998-12-01 ES ES01126188T patent/ES2222959T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-01 DE DE69824455T patent/DE69824455T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-01 AT AT01126188T patent/ATE268819T1/de active
- 1998-12-01 DK DK01126188T patent/DK1191101T3/da active
- 1998-12-01 PT PT01126188T patent/PT1191101E/pt unknown
- 1998-12-01 EP EP01126188A patent/EP1191101B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69824455D1 (de) | 2004-07-15 |
| EP1191101A3 (en) | 2002-08-28 |
| ATE268819T1 (de) | 2004-06-15 |
| EP1191101B1 (en) | 2004-06-09 |
| DE69824455T2 (de) | 2005-06-16 |
| EP1191101A2 (en) | 2002-03-27 |
| PT1191101E (pt) | 2004-10-29 |
| DK1191101T3 (da) | 2004-10-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU736506B2 (en) | Polypeptides and nucleic acids encoding the same | |
| JP2004000006A (ja) | 新規なポリペプチド及びそれをコードする核酸 | |
| ES2253320T3 (es) | Polipeptido y acido nucleico que lo codifica. | |
| ES2222959T3 (es) | Polipeptidos pro241 y acido nucleico codificante de los mismos. | |
| EP1241179B1 (en) | Human protein having in vitro antiproliferative activity | |
| ES2229016T3 (es) | Proteina que aumenta la supervivencia de celulas fotorreceptoras bastones y el acido nucleico que la codifica. | |
| ES2298310T3 (es) | Proteina de tipo prostasina humana y acidos nucleicos que la codifican. | |
| ES2264456T3 (es) | Acido nucleico amplificado dentro de los tumores y procedimientos y materiales relacionados. | |
| EP1209168B1 (en) | PRO243 polypeptides and nucleic acids encoding the same | |
| ES2312510T3 (es) | Proteina de tipo hcar humana y acidos nucleicos que la codifican. | |
| EP1249491B1 (en) | Nucleic acid that is amplified in human tumours and related materials and methods | |
| AU2002301731C1 (en) | Novel pr0363 polypeptides and nucleic acids encoding same | |
| ES2236394T3 (es) | Acido nucleico que esta amplificado en tumores humanos y materiales y metodos relacionados. | |
| EP1241180A2 (en) | Human A33 antigen-like protein and nucleic acids encoding it | |
| EP1247817A2 (en) | Human CD23-like protein and nucleic acids encoding it | |
| EP1217006A2 (en) | Polypeptides and nucleic acids encoding the same | |
| AU4236802A (en) | Polypeptides and nucleic acids encoding the same | |
| CA2408167A1 (en) | Pro243 polypeptides and nucleic acids encoding the same | |
| MXPA00005354A (es) | Polipeptidos y acidos nucleicos que codifican los mismos |