ES2312510T3 - Proteina de tipo hcar humana y acidos nucleicos que la codifican. - Google Patents
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Abstract
Ácido nucleico aislado, que: (i) comprende ADN codificante de un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos 80% con la secuencia de aminoácidos de la figura 2 (SEC ID nº 2), en la que dicho polipéptido es capaz de estimular la proliferación de las células de soporte utricular de rata, (ii) comprende ADN codificante de un polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de residuos 1 a 373 de la figura 2 (SEC ID nº 2), (iii) comprende ADN codificante de un polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de residuos 1 a X de la figura 2 (SEC ID nº 2), en la que X es cualquier residuo entre 216 y 225, (iv) presenta una identidad de secuencia de ácidos nucleicos de por lo menos 80% con la secuencia de ácidos nucleicos de la figura 1 (SEC ID nº 1) que codifica la secuencia de aminoácidos de la fig. 2 (SEC ID nº 2) y codifica un polipéptido capaz de estimular la proliferación de células de soporte utricular de rata, (v) comprende la secuencia codificante de longitud completa de la secuencia de ácidos nucleicos de la fig. 1 (SEC ID nº 1), (vi) comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la fig. 1 (SEC ID nº 1), o (vii) comprende la secuencia codificante de longitud completa de la inserción de ADNc (DNA45419-1252) depositada bajo el número de acceso nº ATCC209616.
Description
Proteína de tipo HCAR humana y ácidos nucleicos
que la codifican.
La presente invención hace referencia de manera
general a la identificación y aislamiento de un nuevo ADN y a la
producción recombinante de polipéptidos nuevos codificados por dicho
ADN.
Las proteínas extracelulares desempeñan un papel
importante en la formación, diferenciación y mantenimiento de los
organismos multicelulares. El destino de muchas células
individuales, por ejemplo su proliferación, migración,
diferenciación o interacción con otras células, está gobernado
generalmente por la información recibida de otras células y/o del
entorno inmediato. Esta información con frecuencia es transmitida
por polipéptidos secretados (por ejemplo factores mitogénicos,
factores de supervivencia, factores citotóxicos, factores de
diferenciación, neuropéptidos y hormonas) que, a su vez, son
recibidos e interpretados por diversos receptores celulares o
proteínas unidas a membrana. Estos polipéptidos secretados o
moléculas de señalización normalmente pasan por la ruta secretoria
celular hasta alcanzar su sitio de acción en el ambiente
extracelular.
Las proteínas secretadas tienen diversas
aplicaciones industriales, incluyendo las farmacéuticas,
diagnósticas, los biosensores y los biorreactores. La mayoría de
fármacos proteicos disponibles en la actualidad, tales como los
agentes trombolíticos, los interferones, las interleucinas, las
eritropoyetinas, los factores estimulantes de la formación de
colonias y diversas otras citocinas, son proteínas de secreción. Sus
receptores, que son proteínas de membrana, también presentan un
potencial como agentes terapéuticos o diagnósticos. Se han realizado
numerosos esfuerzos, tanto en la industria como en el ámbito
académico, para identificar nuevas proteínas de secreción. Muchos
de los esfuerzos se han concentrado en el cribado de bibliotecas de
ADN recombinante de mamífero para identificar secuencias
codificantes de nuevas proteínas secretadas. En la literatura se
describen diversos ejemplos de procedimientos y técnicas de cribado
[ver, por ejemplo, Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
93:7108-7113, 1996; patente US nº
5.536.637)].
5.536.637)].
Las proteínas unidas a membrana y los receptores
pueden desempeñar una importante función en la formación,
diferenciación y mantenimiento de los organismos multicelulares. El
destino de muchas células individuales, por ejemplo su
proliferación, migración o interacción con otras células, está
gobernado en general por la información recibida de otras células
y/o del entorno inmediato. Esta información, con frecuencia es
transmitida por polipéptidos secretados (por ejemplo, factores
mitogénicos, factores de supervivencia, factores citotóxicos,
factores de diferenciación, neuropéptidos y hormonas) que, a su vez,
son recibidos e interpretados por diversos receptores celulares o
proteínas unidas a membrana. Dichas proteínas unidas a membrana y
receptores celulares incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los
receptores de citocinas, los receptores quinasas, los receptores
fosfatasas, los receptores implicados en las interacciones
célula-célula y las moléculas de adhesión, tales
como las selectinas y las integrinas. Por ejemplo la transducción de
señales que regulan el crecimiento y la diferenciación celular está
regulada en parte por la fosforilación de diversas proteínas
celulares. Las proteínas tirosina quinasa, enzimas que catalizan
dicho proceso, también pueden actuar como receptores de factores de
crecimiento. Se incluyen como ejemplos el receptor del factor de
crecimiento fibroblástico y el factor de crecimiento nervioso.
Las proteínas unidas a membrana y las moléculas
de receptor presentan diversas aplicaciones industriales, por
ejemplo agentes farmacéuticos y diagnósticos. Por ejemplo los
receptores de inmunoadhesinas pueden utilizarse como agentes
terapéuticos para bloquear la interacción de
receptor-ligando. Las proteínas unidas a membrana
también pueden utilizarse para el cribado de inhibidores potenciales
de molécula pequeña o inhibidores péptidos de la interacción
receptor/ligando relevante. Se están realizando esfuerzos tanto en
la industria como en el ámbito académico para identificar nuevas
proteínas receptoras nativas. Muchos esfuerzos se han centrado en
el cribado de bibliotecas de ADN recombinantes para identificar las
secuencias codificantes de nuevas proteínas receptoras.
Se ha descubierto que el factor de crecimiento
fibroblástico y el factor de crecimiento de tipo insulina inducen
la proliferación celular en cultivos celulares de epitelio de oído
interno de rata (Zweng et al., The Journal of Neuroscience
17:216-226, 1997).
En la presente invención se describe la
identificación y caracterización de nuevos polipéptidos secretados
y transmembrana y nuevos ácidos nucleicos codificantes de dichos
polipéptidos
PRO363
La proteína de superficie celular HCAR es una
proteína unida a membrana que actúa como receptor para el subgrupo
C de adenovirus y para el subgrupo B de virus coxsackie. De esta
manera, la HCAR puede proporcionar un medio para mediar en la
infección vírica de células en el aspecto de que la presencia del
receptor de HCAR sobre la superficie celular proporciona un sitio
de unión para las partículas víricas, facilitando de esta manera la
infección vírica.
En vista de la importancia fisiológica de las
proteínas unidas a membrana y específicamente de aquéllas que
sirven de receptor de superficie celular para los virus, en la
actualidad se están realizando esfuerzos tanto en la industria como
en la universidad para identificar nuevas proteínas receptoras
nativas unidas a membrana. Muchos de estos esfuerzos se centran en
el cribado de bibliotecas de ADN recombinante de mamífero para
identificar las secuencias codificantes de nuevas proteínas
receptoras. En la presente invención se describe un nuevo
polipéptido unido a membrana que presenta homología con la proteína
de superficie celular HCAR y con diversos antígenos tumorales,
incluyendo A33 y el antígeno carcinoembrionario, denominado en la
presente invención PRO363, en la que este polipéptido podría ser un
nuevo receptor de superficie celular para virus o un nuevo antígeno
tumoral.
PRO363
Los solicitantes han identificado un clon de
ADNc que codifica un nuevo polipéptido que presenta homología con
la proteína receptora de superficie celular HCAR, en el que el
polipéptido se denomina en la presente solicitud "PRO363".
En una realización, la invención proporciona una
molécula aislada de ácido nucleico según se define en las
reivindicaciones, que comprende ADN codificante de un polipéptido
PRO363. En un aspecto, el ácido nucleico aislado comprende ADN
codificante del polipéptido PRO363 que presenta los residuos
aminoácidos 1 a 373 de la figura 2 (SEC ID nº 2) o que es
complementario a dicha secuencia de ácido nucleico codificante, y
sigue establemente unido a la misma bajo condiciones de
astringencia por lo menos moderada y opcionalmente elevada. En otro
aspecto, el ácido nucleico aislado comprende ADN codificante de un
polipéptido de dominio extracelular de PRO363 que presenta los
residuos aminoácidos 1 a X de la figura 2 (SEC ID nº 2), en el que X
es cualquier aminoácido entre el aminoácido 216 y el aminoácido
225, o que es complementario a dicha secuencia de ácido nucleico
codificante, y sigue establemente unido a la misma bajo condiciones
de astringencia por lo menos moderada y opcionalmente elevada. La
secuencia de ácido nucleico asilada puede comprender la inserción de
ADNc del vector DNA45419-1252, depositado el 5 de
febrero de 1998 como ATCC nº 209616, que incluye la secuencia de
nucleótidos que codifica PRO363.
En otra realización, la invención proporciona un
polipéptido PRO363 aislado según se define en las reivindicaciones.
En particular, la invención proporciona un polipéptido PRO363
aislado de secuencia nativa, que en una realización incluye una
secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 1 a 373 de la
figura 2 (SEC ID nº 2). Una realización adicional de la presente
invención se refiere a un dominio extracelular aislado de un
polipéptido PRO363, en el que el dominio extracelular puede
comprende los aminoácidos 1 a X de la secuencia mostrada en la
figura 2 (SEC ID nº 2), en la que X es cualquier aminoácido entre
los aminoácidos 216 y 225. Opcionalmente, el polipéptido PRO363 se
obtiene o es obtenible mediante la expresión del polipéptido
codificado por la inserción de ADNc del vector
DNA45419-1252, depositado el 5 de febrero de 1998
como ATCC nº 209616.
En otras realizaciones de la presente invención,
la invención proporciona vectores que comprenden ADN codificante de
cualquiera de entre los polipéptidos indicados anteriormente o
posteriormente. También se proporciona una célula huésped que
comprende cualquiera de dichos vectores. A título de ejemplo, las
células huésped pueden ser células CHO, de E. coli o de
levadura. Además se proporciona un procedimiento para producir
cualquiera de los polipéptidos anteriormente o posteriormente
indicados y comprende cultivar células huésped bajo condiciones
adecuadas para la expresión del polipéptido deseado y recuperar el
polipéptido deseado a partir del cultivo celular.
En otras realizaciones, la invención proporciona
moléculas quiméricas que comprenden cualquiera de los polipéptidos
anteriormente o posteriormente indicados fusionados con un
polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácidos. Un ejemplo de
dicha molécula quimérica comprende cualquiera de los polipéptidos
anteriormente o posteriormente indicados fusionado con una
secuencia de etiqueta epítopo o una región Fc de una
inmunoglobulina.
En otra realización, la invención proporciona un
anticuerpo que se une específicamente a cualquiera de los
polipéptidos anteriormente o posteriormente indicados.
Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
En todavía otras realizaciones, la invención
proporciona sondas oligonucleótidos útiles para aislar secuencias
de nucleótidos genómicos y de ADNc, en las que aquellas sondas
pueden derivarse de cualquiera de las secuencias de nucleótidos
anteriormente o posteriormente indicadas.
La figura 1 muestra una secuencia de nucleótidos
(SEC ID nº 1) de un ADNc de PRO363 de secuencia nativa, en la que
la SEC ID nº 1 es un clon denominado en la presente invención
"UNQ318" y/o "DNA45419-1252".
La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos
(SEC ID nº 2) derivada de la secuencia codificante de la SEC ID nº
1 mostrada en la figura 1.
Las expresiones "polipéptido PRO" y
"PRO" tal como se utilizan en la presente invención y en el
caso de que les siga inmediatamente una designación numérica, se
refieren a diversos polipéptidos, en las que la designación
completa (es decir PRO/número) se refiere a secuencias específicas
de polipéptido tal como se describe en la presente invención. Las
expresiones "polipéptido PRO/número" y "PRO/número" tal
como se utilizan en la presente invención comprenden polipéptidos
de secuencia nativa y variantes de polipéptido (que se definen
adicionalmente en la presente invención). Los polipéptidos PRO
indicados en la presente invención pueden aislarse a partir de una
diversidad de fuentes, tales como tipos de tejido humano o de otra
fuente, o prepararse mediante procedimientos recombinantes o
sintéticos.
Un "polipéptido PRO de secuencia nativa"
comprende un polipéptido que presenta la misma secuencia de
aminoácidos que el polipéptido PRO correspondiente derivado de la
naturaleza. Dichos polipéptidos PRO de secuencia nativa pueden
aislarse de la naturaleza o pueden producirse mediante medios
recombinantes o sintéticos. La expresión "polipéptido PRO de
secuencia nativa" específicamente comprende las formas truncadas
o secretadas de origen natural del polipéptido PRO específico (por
ejemplo una secuencia de dominio extracelular), formas variantes de
origen natural (por ejemplo formas Alternativamente procesadas) y
variantes alélicas de origen natural del polipéptido. En diversas
realizaciones de la invención, el polipéptido PRO363 de secuencia
nativa es un polipéptido PRO363 de secuencia nativa de longitud
completa que comprende los aminoácidos 1 a 373 de la figura 2 (SEC
ID nº 2).
La expresión "dominio extracelular" o
"ECD" del polipéptido PRO se refiere a una forma del
polipéptido PRO que se encuentra esencialmente libre respecto a los
dominios transmembranales y citoplasmáticos. Habitualmente un ECD
de polipéptido PRO presentará menos de 1% de dichos dominios
transmembranales y/o citoplasmáticos y preferentemente presentará
menos de 0,5% de dichos dominios. Se entiende que cualquier dominio
transmembranal identificado para los polipéptidos PRO de la
presente invención se identifican según criterios utilizados
rutinariamente en la técnica de identificación de ese tipo de
dominio hidrofóbico. Los límites exactos de un dominio
transmembranal pueden variar, pero más probablemente en no más de
aproximadamente 5 aminoácidos en cualquiera de los dos extremos del
dominio según se ha identificado inicialmente. Por lo tanto,
opcionalmente un dominio extracelular de un polipéptido PRO puede
contener entre aproximadamente 5 o menos aminoácidos en cualquiera
de los dos extremos del dominio transmembranal según se ha
identificado inicialmente.
La expresión "variante de polipéptido PRO"
se refiere a un polipéptido PRO activo tal como se ha definido
anteriormente o posteriormente, que presenta una identidad de
secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 80% con la
secuencia del polipéptido PRO de secuencia nativa de longitud
completa tal como se da a conocer en la presente invención. Entre
dichas variantes de polipéptido PRO se incluyen, por ejemplo,
polipéptidos PRO en los que uno o más residuos aminoácidos se
añaden, o se delecionan, en el extremo C-terminal o
N-terminal de la secuencia de aminoácidos nativa de
longitud completa. Habitualmente, una variante de polipéptido PRO
presentará una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos
aproximadamente 80%, más preferentemente de por lo menos 85% y
todavía más preferentemente de por lo menos aproximadamente 90%,
todavía más preferentemente de por lo menos 91%, todavía más
preferentemente de por lo menos 92%, todavía más preferentemente de
por lo menos 93%, todavía más preferentemente de por lo menos 94%,
todavía más preferentemente de por lo menos 95%, todavía más
preferentemente de por lo menos 96%, todavía más preferentemente de
por lo menos 97%, todavía más preferentemente de por lo menos 98%,
y más preferentemente de por lo menos aproximadamente 99% de
identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de
aminoácidos de la secuencia de aminoácidos nativa de longitud
completa tal como se da a conocer en la presente invención.
La expresión "porcentaje (%) de identidad de
secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias del
polipéptido PRO identificadas en la presente invención, se define
como el porcentaje de residuos aminoácidos en una secuencia
candidata que son idénticos a los residuos aminoácidos en la
secuencia específica del polipéptido PRO después de alinear las
secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para conseguir el
máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar
ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de
secuencia. Se pueden realizar alineamientos con el objetivo de
determinar el porcentaje de identidad de la secuencia de
aminoácidos de maneras diversas que se encuentran comprendidas
dentro del alcance de la técnica, por ejemplo utilizando programas
informáticos disponibles públicamente, tales como los programas
BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). El
programa de alineamiento preferente es el BLAST. Los expertos en la
materia podrán determinar los parámetros adecuados para medir el
alineamiento, incluyendo cualquier algoritmo necesario para
conseguir el máximo alineamiento a lo largo de la totalidad de las
secuencias que están comparándose. Los valores de % de identidad
usados en la presente invención se han generado con el programa
informático WU-BLAST-2 (Altschul
et al., Methods in Enzymology 266:460-480
(1996); http://blast.wustl/edu/blast/README.html). La mayoría de
parámetros de búsqueda de WU-BLAST-2
se ajustan a los valores por defecto. Los parámetros ajustables se
ajustan con los valores siguientes: tramo de solapamiento=1,
fracción de solapamiento=0,125, valor umbral(T)=11 y
puntuación de matriz = BLOSUM62. Los parámetros HSP S y HSP S2, que
son valores dinámicos usados por BLAST-2, son
establecidos por el propio programa en dependencia de la composición
de la secuencia de interés y la composición en la base de datos con
la que se está comparando la secuencia. Sin embargo, los valores
pueden ajustarse para aumentar la sensibilidad. Un valor de % de
identidad de secuencia se determina por la fracción de residuos
idénticos dividido por el número total de residuos en la región
alineada.
La expresión "porcentaje (%) de identidad de
secuencia de ácidos nucleicos" con respecto a las secuencias de
ácidos nucleicos que codifican PRO e identificadas en la presente
invención se define como el porcentaje de nucleótidos que en una
secuencia candidata son idénticos a los nucleótidos en las secuencia
de ácidos nucleicos del PRO de interés después de alinear las
secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para conseguir
el máximo porcentaje de identidad de secuencia. Pueden realizarse
alineamientos con el propósito de determinar el porcentaje de
identidad de una secuencia nucleica de diversas maneras que se
encuentran comprendidas dentro de los conocimientos de un experto
en la materia, por ejemplo utilizando programas informáticos
disponibles públicamente, tales como los programas BLAST,
BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en
la materia podrán determinar los parámetros adecuados para medir el
alineamiento, incluyendo cualquier algoritmo necesario para
conseguir el máximo alineamiento a lo largo de la totalidad de las
secuencias que están comparándose. Los valores de identidad usados
en la presente invención se generan mediante el módulo BLASTN del
WU-BLAST-2 fijado a los parámetros
por defecto, con tramo de solapamiento y fracción de solapamiento
fijados a 1 y 0,125, respectivamente.
El término "positivos" en el contexto de la
comparación de secuencias realizado tal como se ha descrito
anteriormente, incluye residuos en las secuencias comparadas que no
son idénticos pero que presentan propiedades similares (por ejemplo
como resultado de sustituciones conservadoras). El valor de % de
positivos se determina a través de la fracción de residuos que
puntúan un valor positivo en la matriz BLOSUM 62 dividido por el
número total de residuos en la región alineada, tal como se ha
definido anteriormente.
La expresión "etiqueta epítopo" se refiere
en la presente invención a un polipéptido quimérico que comprende
el polipéptido PRO, o a un dominio de la secuencia del mismo,
fusionado con un "polipéptido etiqueta". El polipéptido
etiqueta presenta suficientes residuos para proporcionar un epítopo
contra el que se puede generar un anticuerpo, o que puede ser
identificado por algún otro agente, pero que es suficientemente
corto para no interferir en la actividad del polipéptido PRO de
interés. El polipéptido etiqueta preferentemente es bastante único
de forma que el anticuerpo no reacciona substancialmente de forma
cruzada con otros epitopos. Los polipéptidos etiqueta apropiados
generalmente presentan por lo menos seis residuos de aminoácidos y
habitualmente aproximadamente entre 8 y 50 residuos aminoácidos
(preferentemente entre 10 y 20 residuos).
El término "aislado" tal como se utiliza
para describir varios polipéptidos usados en la presente invención,
se refiere a aquel polipéptido que ha sido identificado y separado
y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los
componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que
típicamente interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos
del polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos
de naturaleza proteica o no proteica. En las realizaciones
preferidas, el polipéptido será purificado (1) en un grado
suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de la secuencia de
aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de
un secuenciador de taza giratoria, o (2) a homogeneidad mediante
SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras o
reductoras usando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción de
plata. El aislamiento del polipéptido incluye el polipéptido
aislado en células recombinantes, en los que por lo menos un
componente del entorno natural del polipéptido PRO no estará
presente. Habitualmente, sin embargo, el polipéptido aislado se
preparará mediante por lo menos una etapa de purificación.
Un ácido nucleico "aislado" codificante de
un polipéptido PRO es una molécula de ácido nucleico que se
identifica y separa de por lo menos una molécula contaminante de
ácido nucleico con la cual está asociado habitualmente en la fuente
natural del ácido nucleico del polipéptido PRO. Una molécula de
ácido nucleico de un polipéptido PRO aislado es aquella cuya forma
es distinta de la que se encuentra en la naturaleza. Las moléculas
de ácido nucleico para un polipéptido PRO aislado se distinguen, por
tanto, de la molécula de ácido nucleico del polipéptido PRO
específico ya que existe en células naturales. Sin embargo, una
molécula de ácido nucleico para un polipéptido PRO incluye
moléculas de ácido nucleico para el polipéptido PRO contenidas en
las células que ordinariamente expresan el polipéptido PRO en donde,
por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se encuentra en una
localización cromosómica diferente de la de las células
naturales.
La expresión "secuencias control" hace
referencia a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una
secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped
particular. Las secuencias control que son adecuadas para
procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una
secuencia operadora, y un sitio de unión al ribosoma. Las células
eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación e
intensificadores.
El ácido nucleico está "unido
operativamente" cuando está situado en una relación funcional
con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una
presecuencia o un líder secretor está unido operativamente al ADN
correspondiente a un polipéptido si se expresa como una preproteína
que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o un
intensificador está unido operativamente a una secuencia codificante
si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión
al ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante
si está situado de manera que facilite la traducción. Generalmente
"unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que
están unidas son contiguas, y, en el caso de un líder secretor,
contiguo y en la misma pauta de lectura. Sin embargo, los
intensificadores no tienen porqué ser contiguos. La unión se
consigue mediante ligación en dianas de restricción adecuadas. Si
tales dianas no existen, se usan adaptadores o línkers de
oligonucleótidos sintéticos según prácticas convencionales.
El término "anticuerpo" se usa en el
sentido más amplio de la palabra y comprende específicamente
anticuerpos monoclonales contra un solo polipéptido PRO (incluyendo
agonistas, antagonistas y anticuerpos de neutralización) y
composiciones de anticuerpos anti-polipéptido PRO
con especificidad poliepitópica. El término "anticuerpo
monoclonal" tal como se usa en la presente invención se refiere a
un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos
substancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales
que comprenden la población son idénticos excepto por posibles
mutaciones naturales que puedan estar presentes en cantidades
inferiores.
"Activo" o "actividad" para los
objetivos de esta invención se refiere a forma(s) del
polipéptido PRO que retienen la actividad biológica y/o
inmunológica del polipéptido PRO nativo o natural.
"Tratamiento" se refiere tanto al
tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o
preventivas. Aquellos con necesidad de tratamiento incluyen los que
ya presentan el trastorno, como los propensos a padecerlo.
El término "mamífero" para los propósitos
de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como
mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos, de granja y de
parque zoológico, de competición deportiva o mascotas, tales como
ovejas, perros, caballos, gatos, vacas y similares. Preferentemente
el mamífero en la presente invención es un ser humano.
La expresión "portadores", tal como se usa
en la presente invención, incluye los vehículos, excipientes o
estabilizantes farmacéuticamente aceptables que no son tóxicos para
la célula o el mamífero que se está exponiendo a los mismos a las
dosis y concentraciones empleadas. Con frecuencia, el vehículo
fisiológicamente aceptable es una solución acuosa tamponada. Entre
los ejemplos de vehículos fisiológicamente aceptables se incluyen
tampones como el fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos;
antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo
peso molecular (menos de 10 residuos); proteínas, tales como
albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros
hidrofílicos, tales como la polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales
como la glicina, la glutamina, la asparraguina, la arginina o la
lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos,
incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes, tales
como el EDTA; alcoholes de azúcares, tales como el manitol o el
sorbitol; iones que forman sales, tales como el sodio; y/o
tensoactivos no iónicos, tales como TWEEN^{TM}, polietilénglicol
(PEG) y PLURONICS^{TM}.
El término "agonista" se usa para referirse
a análogos peptídicos y no peptídicos de los polipéptidos PRO
nativos (en donde polipéptido PRO nativo se refiere a un
pro-polipéptido PRO, un
pre-polipéptido PRO, un
prepro-polipéptido PRO o un polipéptido PRO maduro)
de la presente invención y a los anticuerpos que específicamente se
unen a dichos polipéptidos PRO nativos; debido a que retienen por lo
menos una actividad biológica de un polipéptido PRO nativo.
Preferentemente, los agonistas de la presente invención retienen las
propiedades cualitativas de reconocimiento de unión y las
propiedades de activación del receptor del polipéptido PRO
nativo.
El término "antagonista" se usa en la
presente invención para referirse a una molécula que inhibe una
actividad biológica de un polipéptido PRO nativo de la presente
invención en donde el polipéptido PRO nativo se refiere a un
pro-polipéptido PRO, un
pre-polipéptido PRO, un
prepro-polipéptido PRO o un polipéptido PRO maduro.
Preferentemente, los antagonistas en la presente invención inhiben
la unión de un polipéptido PRO nativo de la presente invención a
una pareja de unión. Un "antagonista" del polipéptido PRO es
una molécula que previene, o interfiere con, una función efectora
antagonista PRO (por ejemplo, una molécula que previene o
interfiere con la unión y/o activación del polipéptido PRO a un
receptor del polipéptido PRO.). Dichas moléculas pueden ser
cribadas por su capacidad para inhibir competitivamente la
activación del receptor del polipéptido PRO mediante la
monitorización de la unión de un polipéptido PRO nativo en
presencia y ausencia de la molécula antagonista a analizar. Un
antagonista de la invención incluye también un polinucleótido
antisentido contra el gen del polipéptido PRO, polinucleótido
antisentido que bloquea la transcripción o traducción del gen del
polipéptido PRO, de ese modo inhibe su expresión y su actividad
biológica.
La "astringencia" de las reacciones de
hibridación se determina fácilmente por los expertos en la materia
y generalmente es un cálculo empírico que depende de la longitud de
la sonda, la temperatura de lavado, y la concentración de sales. En
general las sondas más largas requieren temperaturas más altas para
que la hibridación sea adecuada, mientras que las sondas más cortas
necesitan temperaturas más bajas. La hibridación generalmente
depende de la capacidad del ADN desnaturalizado para rehibridarse
cuando las cadenas complementarias están presentes en un entorno
por debajo de sus temperaturas de fusión. Cuanto mayor es el grado
de homología deseado entre la sonda y la secuencia a hibridar,
mayor es la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado,
se deriva que temperaturas relativas más altas tenderían a hacer las
condiciones de reacción más astringentes, mientras que temperaturas
más bajas lo serían menos. Para detalles y explicaciones sobre la
astringencia de las reacciones de hibridación ver Ausubel et
al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience
Publishers, (1995).
"Condiciones de astringencia" significa (1)
emplear fuerzas iónicas bajas y temperaturas altas para el lavado,
por ejemplo cloruro sódico 0,015M/citrato sódico 0,0015M/ dodecil
sulfato sódico 0,1% a 50ºC, o (2) emplear un agente
desnaturalizante durante la hibridación, como por ejemplo formamida
al 50% (vol/vol) con albúmina sérica bovina al 0,1%/Ficoll al
0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/ tampón de fosfato sódico 50 nM a
pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC. Otro
ejemplo es usar formamida al 50%, 5X de SSC (NaCl 0,75M, citrato
sódico 0,075M), fosfato sódico 50 mM (pH 6/8), pirofosfato sódico al
0,1%, solución Denhart 5X, ADN de esperma de salmón sonicado (50
\mug/ml), SDS al 0,1%, y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC en SSC
2X y SDS al 0,1%. Otro ejemplo más de hibridación usa un tampón de
sulfato de dextrano al 10%, SSC 2X (cloruro sódico/citrato sódico)
y formamida al 50% a 55ºC, seguido de un lavado a alta astringencia
que consiste en SSC 0,1X conteniendo EDTA a 55ºC.
"Condiciones moderadamente astringentes" se
describen en Sambrook et al., supra, e incluye el uso
de una solución de lavado y de condiciones de hibridación (por
ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos astringentes
que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones
moderadamente astringentes es una incubación durante la noche a
37ºC en una solución compuesta por: formamida al 20%, SSC 5X (150 mM
de NaCl, 15 mM de citrato trisódico), fosfato sódico 50 mM (pH
7,6), solución Denhart 5X, sulfato de dextrano al 10% y 20 mg/ml de
ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, seguido de
un lavado de los filtros en SSC 1X a aproximadamente
37-50ºC. El personal capacitado reconocerá como
ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc., como sea necesario
para adaptarse a factores como la longitud de la sonda y
similares.
El "análisis de Southern" o la
"transferencia de Southern" es un procedimiento por el cual la
presencia de secuencias de ADN en un ADN digerido con enzimas de
restricción o una composición que contenga ADN se confirma por
hibridación a un oligonucleótido marcado o a un fragmento de ADN
conocidos. El análisis de Southern implica habitualmente la
separación electroforética del ADN digerido en geles de agarosa, la
desnaturalización del ADN después de la separación electroforética
y la transferencia del ADN a un soporte de membrana de
nitrocelulosa, nylon o cualquier otro soporte adecuado para el
análisis con una sonda marcada radioactivamente, biotinilada o
marcada enzimáticamente como se describe en las secciones
9.37-9.52 de Sambrook et al., Molecular
Cloning: A laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989).
El "análisis de Northern" o la
"transferencia de Northern" es un procedimiento usado para
identificar secuencias de ARN que hibridan a una sonda conocida
como un oligonucleótido, un fragmento de ADN, un fragmento de su
ADNc o un fragmento de ARN. La sonda se marca con un radioisótopo
como P^{32}, o por biotinilización o enzimáticamente. El ARN que
va a analizarse habitualmente se separa electroforéticamente en gel
de agarosa o poliacrilamida, transferido a una membrana de
nitrocelulosa, nilon, o cualquier otra membrana adecuada, e
hibridada con la sonda, usando técnicas estándar bien conocidas en
el área como las descritas en las secciones
7.39-7.52 de Sambrook et al.,
supra.
supra.
Tal como se usa en la presente invención, el
término "inmunoadhesina" designa moléculas tipo anticuerpo que
combinan la unión específica a una proteína heteróloga (una
"adhesina") con las funciones efectoras de los dominios
constantes de una inmunoglobulina. Estructuralmente, las
inmunoadhesinas comprenden una fusión entre una secuencia de
aminoácidos con la especificidad de unión deseada que no es otra que
los sitios de reconocimiento del antígeno y el sitio de unión de un
anticuerpo (es decir, es "heteróloga"), y la secuencia de un
dominio constante de inmunoglobulina. La región adhesina de una
molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia de
aminoácidos contigua que comprende por lo menos el sitio de unión de
un receptor o un ligando. La secuencia del dominio constante de
inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse a partir de
cualquier inmunoglobulina como los subtipos IgG-1,
IgG-2, IgG-3, o
IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e
IgA-2), IgE, IgD o IgM.
El término administración "crónica" se
refiere a la administración del agente(s) de modo continuo
contrariamente a un modo agudo, para mantener el efecto terapéutico
inicial (actividad) durante un periodo de tiempo prolongado.
Administración "intermitente" es aquel tratamiento que no se
realiza consecutivamente sin interrupción, sino que tiene una
naturaleza cíclica.
La administración "en combinación con" uno
o más agentes terapéuticos incluye la administración simultánea
(concurrente) y consecutiva en cualquier orden.
El término "vector de expresión" se usa
para definir un vector, en el cual un ácido nucleico que codifica
para el polipéptido PRO está unido operativamente a secuencias
control capaces de afectar su expresión en una célula huésped
adecuada. Los vectores habitualmente llevan un sitio de replicación
(aunque éste no es necesario si se produce integración
cromosómica). Los vectores de expresión también incluyen secuencias
marcadoras que son capaces de proporcionar una selección fenotípica
en las células transformadas. Por ejemplo E. coli
típicamente se transforma con PBR322, un plásmido derivado de una
especie de E. coli (Bolivar, et al., Gene
2:95[1977]). El PBR322 contiene genes que codifican para
resistencia a ampicilina y tetraciclina y por tanto proporciona un
procedimiento sencillo para identificar las células transformadas
para objetivos de clonación o expresión. Los vectores de expresión
óptimamente también contendrán secuencias útiles para el control de
la transcripción y la traducción, por ejemplo, promotores y
secuencias Shine-Dalgarno (para procariotas) o
promotores e intensificadores (para células mamíferas). Los
promotores pueden ser, pero no necesariamente, inducibles; incluso
promotores fuertes constitutivos como el promotor del CMV para
huéspedes mamíferos se ha observado que produce el LHR sin
toxicidad para la célula huésped. Aunque es posible que los vectores
de expresión no necesiten contener ningún control de expresión,
secuencias replicativas o genes de selección, su ausencia puede
dificultar la identificación de transformantes híbridos y el logro
de niveles de expresión elevados de la inmunoglobulina híbrida.
El término "lipopolisacárido" o "LPS"
se usa en la presente invención como sinónimo de endotoxina. Los
lipopolisacáridos (LPS) son componentes característicos de la
membrana externa de bacterias Gram-negativas,por
ejemplo, Escherichia coli. Consisten en una parte de
polisacárido y una lipídica denominada lípido A. El polisacárido,
que varía de una especie bacteriana a otra, está compuesto por una
cadena específica O (constituida a base de unidades repetidas de
tres a ocho azúcares) y el núcleo de dos partes. El lípido A
virtualmente siempre incluye dos azúcares de glucosamina
modificados por un fosfato y un número variable de ácidos grasos.
Para más información ver, por ejemplo, Rietschel and Brade,
Scientific American Agosto 1992,54-61.
El término "choque séptico" se usa en la
presente invención en el sentido más amplio, incluyendo algunas
definiciones descritas en Bone, Ann. Intern. Med. 114,
332-333 (1991). Específicamente, el choque séptico
comienza con una respuesta sistémica a la infección, un síndrome
llamado sepsis. Cuando este síndrome resulta en hipotensión y
disfunción orgánica, se denomina choque séptico. El choque séptico
puede ser iniciado por organismos Gram-positivos y
hongos, así como por organismos Gram-negativos que
contengan endotoxina. Por consiguiente, la definición indicada no
se limita al "choque por endotoxina".
Las frases "amplificación génica" y
"duplicación génica" son intercambiables y se refieren a un
proceso por el cual en una célula o línea celular particular se
forman múltiples copias de un gen o de fragmentos de un gen. La
región duplicada (un tramo de ADN amplificado) se denomina
frecuentemente como "amplicón". Habitualmente la cantidad de
ARN mensajero (ARNm) producido, es decir, el nivel de expresión
génica, también aumenta en proporción con el número de copias
hechas del gen particular expresado.
"Tumor" tal como se usa en la presente
invención, se refiere a todo crecimiento y proliferación celular
neoplásico, tanto maligno o benigno, y a todas las células y tejidos
pre-cancerosos y cancerosos. Los términos
"cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la
condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente
por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer
incluyen, aunque no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma,
sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de dichos cánceres
incluyen el cáncer de mama, de próstata, de colon, el carcinoma de
las células espinales, el cáncer de pulmón de células pequeñas, el
cáncer de pulmón de células no pequeñas, el cáncer gastrointestinal,
el cáncer de páncreas, el glioblastoma, el cáncer de cérvix, el
cáncer de ovarios, el cáncer hepático, el cáncer de vejiga, el
hepatoma, el cáncer colorectal, el carcinoma de endometrio, el
carcinoma de glándulas salivares, el cáncer de riñón, el cáncer de
vulva, el cáncer de tiroides, el carcinoma hepático, y varios tipos
de cáncer de cabeza y cuello.
El término "agente citotóxico" tal como se
usa en la presente invención se refiere a una substancia que inhibe
o previene la función de las células y/o que causa destrucción
celular. El término incluye isótopos radioactivos (por ejemplo,
I^{131}, I^{125}, Y^{90}, y Re^{186}), agentes
quimioterapéuticos, y toxinas como toxinas activas enzimáticamente
de origen bacteriano, fúngico, de plantas o animales, o sus
fragmentos.
Un "agente quimioterapéutico" es un
compuesto químico útil para el tratamiento del cáncer. Entre los
ejemplos de agentes quimioterapéuticos se incluyen adriamicina,
doxorrubicina, epirrubicina, 5-fluorouracil,
arabinósido de citosina ("Ara-C"),
ciclofosfamida, tiotepa, busulfan, taxoides, por ejemplo, paclitaxel
(Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton,
NJ) y doxetaxel (Taxotere®, Rhone-Poulenc Rorer,
Antony, France), taxotere, metotrexato, cisplatino, melfalan,
vinblastina, bleomicina, etopósido, ifosmamida, mitomicina C,
mitoxantrone, vincristina, vinorelbina, carboplatino, tenipósido,
daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina,
mitomicinas, esperamicinas (ver patente americana US 4.675.187),
melfalan y otras mostazas nitrogenadas relacionadas. También se
incluyen en esta definición agentes hormonales que regulan o inhiben
la acción de hormonas sobre tumores como tamoxifeno y
onapristona.
Un "agente inhibidor del crecimiento"
cuando se usa en la presente invención se refiere a un compuesto o
composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente
una célula cancerosa que sobreexprese cualquiera de los genes
identificados en la presente invención, tanto in vitro como
in vivo. Por tanto, el agente inhibidor del crecimiento es
aquel que reduce significativamente el porcentaje de células que
sobreexpresan dichos genes en fase S. Entre los ejemplos de
inhibidores del crecimiento se incluyen agentes que bloquean la
progresión del ciclo (en otra fase distinta de la fase S), como
aquellos agentes que inducen la quiescencia celular en fase G1 y M.
Entre los agentes que clásicamente bloquean la fase M se incluyen
las vincas (vincristina y vinblastina), el taxol, e inhibidores de
la topo II como la doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina,
etopósido, y bleomicina. Aquellos agentes que producen quiescéncia
en G1 también producen quiescéncia en fase S, por ejemplo agentes
alquilantes del ADN como tamoxifeno, prednisona, dacarbazida,
mecloretamina, cisplatino, metotrexato,
5-fluorouracilo y ara-C. Puede
encontrarse información adicional en The Molecular Basis of Cancer,
Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, titulado "Cell cycle
regulation, oncogens and antineoplastic drugs" por Murakami et
al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente pag 13.
La "doxorrubicina" es un antibiótico
antraciclina.
El término "citoquina" es un término
genérico para proteínas liberadas por una población celular que
actúa sobre otras células como mediadores intercelulares. Entre los
ejemplos de citoquinas están las linfoquinas, las monoquinas, y las
hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citoquinas se
incluyen hormonas de crecimiento como la hormona del crecimiento
humana, la hormona del crecimiento humana
N-metionil, la hormona del crecimiento bovina, la
hormona paratiroidea, la tiroxina, la insulina, la proinsulina, la
relaxina, la prorelaxina y similares. Tal como se usa en la
presente invención el término citoquina incluye proteínas de origen
natural u obtenidas a partir de cultivos celulares recombinantes con
una actividad biológica equivalente a las de las citoquinas
nativas.
"Anticuerpos nativos" e "inmunoglobulinas
nativas" son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente
150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y
dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a
una cadena pesada mediante un enlace covalente disulfuro, mientras
el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de
diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y
ligera también tiene puentes disulfuro intracatenarios espaciados
regularmente. Cada cadena pesada tiene en su extremo un dominio
variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada
cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un
dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la
cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena
pesada, y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con
dominio variable de la cadena pesada. Se considera que los residuos
aminoácidos particulares forman una superficie entre los dominios
variables de las cadenas ligera y pesada.
El término "variable" se refiere al hecho
de que ciertas porciones de los dominios variables difieren
extensamente en secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y
en la especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno.
Sin embargo, la variabilidad no está distribuida regularmente por
todos los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en 3
segmentos denominados regiones determinantes de complementariedad
(CDRs) o regiones hipervariables tanto en los dominios variables de
la cadena ligera y la cadena pesada. Las regiones de los dominios
variables más altamente conservadas se denominan regiones de
entramado (FR). Cada uno de los dominios variables de las cadenas
ligera y pesada nativas comprende cuatro regiones FR, que adoptan
una configuración de hoja beta, conectadas por 3 CDRs, los cuales
forman bucles de conexión, y en algunos casos forman parte de la
estructura hoja beta. Los 3 CDRs en cada cadena están unidos en
proximidad con las regiones FR y, con los CDRs de la otra cadena,
contribuyen a la formación del sitio de unión del antígeno de los
anticuerpos (ver Kabat y col, NIH Publ. Nº91-3242,
Vol I páginas 647-669 (1991)). Los dominios
constantes no están implicados directamente en la unión del
anticuerpo al antígeno, pero muestran diversas funciones efectoras,
como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular
dependiente del anticuerpo.
Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden
fracciones de un anticuerpo intacto, preferentemente las regiones
de unión al antígeno o las región variables del anticuerpo intacto.
Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo se incluyen los
fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos, anticuerpos
lineales (Zapata et al., Protein Eng. 8(10):
1057-1062 [1995]); moléculas de anticuerpos de
cadena simple; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de
fragmentos de anticuerpos.
La digestión con papaína de los anticuerpos
produce dos fragmentos idénticos de unión a antígeno, llamados
fragmentos "Fab", cada uno con un sitio simple de unión a
antígeno, y un fragmento residual "Fc", una designación que
refleja la capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con
pepsina da lugar a un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios
de combinación de antígeno y que todavía es capaz de unirse al
antígeno.
El fragmento "Fv" es el fragmento mínimo
que contiene un sitio de reconocimiento del antígeno y de unión
completa. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable
de cadena pesada y otro de cadena ligera en estrecha asociación no
covalente. Es en esta configuración que las tres CDRs de cada
dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión
antígeno-anticuerpo en la superficie del dímero
VH-VL. Colectivamente, las seis CDRs confieren la
especificidad de unión del anticuerpo al antígeno. Sin embargo,
incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende
solo tres CDRs específicas para un antígeno) tienen la capacidad de
reconocer y unirse al antígeno, aunque con menor afinidad que el
sitio de unión completo.
El fragmento Fab también contiene el dominio
constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1)
de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos
Fab' por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxilo
del dominio CH1 de la cadena pesada incluyendo una o más cisteínas
de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la
designación usada en la presente invención para Fab' en el cual
el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes
llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos F(ab')2 de un
anticuerpo originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab'
que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros
acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.
Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos
(inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden
clasificarse en dos tipos claramente diferenciados, denominados
kappa y lambda, basados en las secuencias de aminoácidos de sus
dominios constantes.
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del
dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas
pueden asignarse a diferentes clases. Hay 5 clases fundamentales de
inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, y varias de ellas
pueden ser divididas en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1,
IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2.
Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena
simple" o "sFv" comprenden los dominios VH y VL del
anticuerpo, en donde dichos dominios se encuentran presentes en una
única cadena polipeptídica. Preferentemente el polipéptido Fv
comprende además un línker polipeptídico entre los dominios VH y VL
que permite al sFv formar la estructura deseada para la unión del
antígeno. Para una revisión sobre sFv, ver Pluckthun en: The
Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore
eds., Springer-Verlag, New York, páginas 269 a 315
(1994).
La expresión "diacuerpos" se refiere a
pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión del
antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena
pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL)
en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Mediante
el uso de un línker demasiado corto para permitir la unión entre
los dos dominios en la misma cadena, los dominios están forzados a
unirse con los dominios complementarios de otras cadenas y crear
dos sitios de unión de antígeno. Los diacuerpos se describen en
mayor profundidad en, por ejemplo, la patente europea 404.097; la
patente mundial WO93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).
Un anticuerpo "aislado" es aquel que ha
sido identificado y separado o recuperado a partir de un componente
de su entorno natural. Son componentes contaminantes de su entorno
natural materiales que interferirían en el uso diagnóstico o
terapéutico del anticuerpo, y puede incluir enzimas, hormonas, y
otros solutos de naturaleza proteica o no proteica. En
realizaciones preferentes, el anticuerpo podrá ser purificado (1) a
más de un 95% en peso de anticuerpo determinado por el
procedimiento de Lowry, y más preferentemente a más del 99% en
peso, (2) a un grado suficiente para obtener por lo menos 15
residuos del extremo N-terminal o de la secuencia
de aminoácidos interna mediante el uso de un secuenciador de
spinning cup o, (3) a homogeneidad mediante
SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras
usando azul de Comassie o, preferentemente, tinción con plata. El
anticuerpo aislado incluye el anticuerpo localizado dentro de las
células recombinantes en el que por lo menos un componente del
entorno natural del anticuerpo no estará presente. Ordinariamente,
sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante una etapa
de purificación.
El término "marcaje" cuando se usa en la
presente invención se refiere a un compuesto o composición
detectable que está conjugado directa o indirectamente con el
anticuerpo para generar un anticuerpo "marcado". El marcaje
puede detectarse por sí mismo (por ejemplo, marcajes radioactivos o
fluorescentes) o, en el caso del marcaje enzimático, puede
catalizar una alteración química de un compuesto o composición
substrato que es detectable.
La expresión "fase sólida" se refiere a una
matriz no acuosa a la cual puede adherirse el anticuerpo de la
presente invención. Los ejemplos de fases sólidas incluyen aquellos
formados parcialmente o en su totalidad por vidrio (por ejemplo,
vidrio de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa),
poliacrilamidas, poliestireno, alcohol polivinílico y siliconas. En
ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida
puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras es una
purificación por columna (por ejemplo, una columna de cromatografía
de afinidad). Este término incluye también una fase sólida
discontinua de partículas discretas, como las descritas en la
patente US 4.275.149.
Un "liposoma" es una pequeña vesícula
compuesta por varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensoactivos
que es útil para la administración de un fármaco en un mamífero.
Los componentes del liposoma se disponen comúnmente en formación de
bicapa, similar a la organización de las membranas biológicas.
La presente invención proporciona secuencias de
nucleótidos nuevamente identificadas y aisladas codificantes de
polipéptidos a los que se hace referencia en la presente solicitud
como PRO363. En particular, los solicitantes han identificado y
aislado ADNc codificante de un polipéptido PRO363, tal como se da a
conocer en más detalle en los Ejemplos, posteriormente. Mediante la
utilización de los programas informáticos de alineación de
secuencias BLAST y FastA, los solicitantes han descubierto que el
polipéptido PRO363 presenta una similitud significativa con la
proteína de superficie celular HCAR. Por consiguiente, en la
actualidad se cree que el polipéptido PRO363 dado a conocer en la
presente solicitud es un nuevo homólogo de HCAR.
Además de la secuencia nativa completa de los
polipéptidos PRO descritos en la presente invención, se contempla
que pueden prepararse variantes del polipéptido PRO. Las variantes
del polipéptido PRO pueden prepararse mediante la introducción de
cambios adecuados en el ADN del polipéptido PRO, o mediante síntesis
del polipéptido PRO deseado. Los expertos en la materia apreciarán
que los cambios de aminoácidos pueden alterar procesos
post-traduccionales de los polipéptidos PRO, tales
como la modificación del número o de la posición de sitios de
glucosilación o la alteración de las características de anclaje a la
membrana.
Las variaciones en la secuencia completa de los
polipéptidos PRO o en varios dominios de los polipéptidos PRO
descritas en la presente invención, pueden realizarse, por ejemplo,
usando cualquiera de las técnicas y pautas sobre mutaciones
conservativas y no conservativas marcadas, por ejemplo, en la
patente US 5.364.934. Las variaciones pueden ser sustituciones,
deleciones, o inserciones de un o más codones que codifican para el
polipéptido PRO que resulten en un cambio de secuencia de
aminoácidos del polipéptido PRO comparado con la secuencia nativa
del polipéptido PRO. Opcionalmente, la variación es por
substitución de por lo menos un aminoácido por otro aminoácido en
un o más dominios del polipéptido PRO. La pauta para determinar qué
residuo aminoácido puede ser insertado, sustituido, o delecionado
sin afectar adversamente la actividad deseada puede encontrarse
comparando la secuencia del polipéptido PRO con la de moléculas
proteicas homólogas conocidas y minimizando el número de cambios en
la secuencia de aminoácidos en regiones con alta homología. Las
sustituciones aminoacídicas pueden ser el resultado de reemplazar
un aminoácido por otro que muestre similitud estructural y/o de
propiedades químicas, como la substitución de una leucina por una
serina, es decir, sustituciones conservativas. Las inserciones o
deleciones opcionalmente pueden estar en el rango de 1 a 5
aminoácidos. La variación permitida puede determinarse haciendo
inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en la
secuencia sistemáticamente, y analizando las variaciones de
actividad resultantes en el ensayo in vitro descrito
más adelante en los Ejemplos.
En realizaciones particulares, las sustituciones
conservativas de interés se muestran en la Tabla 1 bajo el título de
sustituciones preferentes. Si tales sustituciones resultan en un
cambio en la actividad biológica, entonces se introducen cambios
más substanciales, denominados en la Tabla 1 sustituciones
ejemplares, o como se describe más abajo en referencia a clase de
aminoácidos, y se analizarán los productos.
Se consiguen modificaciones substanciales de la
función o de la identidad inmunológica del polipéptido PRO mediante
la selección de sustituciones que difieren significativamente en su
efecto de mantenimiento de: (a) la estructura del esqueleto del
polipéptido en el área de substitución, por ejemplo, con una
conformación de hélice u hoja, (b) la carga de hidrofobicidad de la
molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral.
Los residuos que se producen de forma natural se dividen en grupos
basados en propiedades comunes de la cadena lateral:
- (1)
- hidrofóbico: norleucina, met, ala, val, leu, ile;
- (2)
- hidrofílico neutro: cys,ser,thr:
- (3)
- acídico: asp, glu;
- (4)
- básico: asn, gln, his, lys, arg;
- (5)
- residuos que influyen sobre la orientación de la cadena: gly, pro; y
- (6)
- aromáticos: trp, tyr, phe
Las sustituciones no conservativas implicarán el
cambio de un miembro de estas clases por otro de otra clase. Tales
residuos sustituidos pueden introducirse en los sitios de
substitución conservativa, o más preferentemente, en los sitios
remanentes (no conservativos).
Las variaciones pueden realizarse usando
procedimientos conocidos en el área tales como la mutagénesis
mediada por oligonucleótidos (dirigida), el cribado de alanina y la
mutagénesis por PCR. La mutagénesis dirigida [Carter et al.,
Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids
Res.,10:6487 (1987)], la mutagénesis de casete [Wells et
al., Gene, 34: 315(1985)], la mutagénesis de selección
por restricción [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London
SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas pueden ser
utilizadas sobre el ADN clonado para producir la variante de ADN del
polipéptido PRO deseado.
El análisis de cribado de aminoácidos puede
emplearse también para identificar un o más aminoácidos a lo largo
de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos preferidos para el
cribado están los aminoácidos neutros, relativamente pequeños.
Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La
alanina es uno de los aminoácido de cribado preferidos entre este
grupo ya que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y
es menos probable que altere la conformación de la cadena principal
en la variante. También se prefiere habitualmente la alanina porque
es el aminoácido más común. Además, se encuentra frecuentemente
tanto en posiciones escondidas como en las expuestas [Creghton, The
Proteins, (W. H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol.,
150: 1 (1976)]. Si la sustitución por alanina no rinde suficiente
cantidad de variante, se puede utilizar un aminoácido
isotérico.
Se encuentran comprendidas dentro del alcance de
la presente invención las modificaciones covalentes de los
polipéptidos PRO. Un tipo de modificación covalente incluye la
reacción de los residuos de aminoácidos diana del polipéptido PRO
con un agente orgánico derivatizante que es capaz de reaccionar con
cadenas laterales seleccionadas o con los residuos
N-terminales o C-terminales del
polipéptido PRO.
La modificación con agentes bifuncionales es
útil, por ejemplo, para la unión del polipéptido PRO a una matriz
de soporte insoluble en agua o a una superficie para purificar
anticuerpos anti-polipéptido PRO y viceversa. Los
agentes de unión comúnmente más usados incluyen, por ejemplo,
1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano,
glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida,
por ejemplo, ésteres con el ácido 4-azidosalicílico,
imidoésteres homobifuncionales, incluidos disuccinimidil ésteres
tales como el
3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato),
maleimidas bifuncionales como
bis-N-maleimido-1,8-octano
y agentes tales como el
metil-3-[p-azidobenil)-dithio]propioimidato.
Otras modificaciones incluyen la deamidación de
residuos glutaminil y asparaginil a los correspondientes residuos
glutamil y aspartil, respectivamente, la hidroxilación de prolina y
lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos seril o
treonil, la metilación de los grupos \alpha-amino
de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina [T.E.
Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H.
Freeman &Co., San Francisco, pp 79-86 (1983)],
la acetilación de la amina N-terminal y la amidación
de cualquier grupo carboxilo C-terminal.
Otro tipo de modificación covalente de los
polipéptidos PRO incluida dentro del ámbito de esta invención
comprende la alteración del patrón de glicosilación nativo del
polipéptido. "La alteración del patrón de glicosilación"
significa en la presente invención, de cara a los objetivos
previstos, la eliminación de un o más grupos carbohidrato que se
encuentran en una secuencia nativa del polipéptido PRO, y/o la
adición de un o más sitios de glicosilación que están presentes en
la secuencia del polipéptido PRO nativa, y/o la alteración del ratio
y/o composición de los residuos de azúcar unidos al sitio(s)
de glicosilación.
La adición de sitios de glicosilación al
polipéptido PRO puede conseguirse alterando la secuencia de
aminoácidos. Esta alteración puede lograrse, por ejemplo, mediante
la adición de, o la sustitución por, un o más residuos de serinas o
treoninas a la secuencia nativa del polipéptido PRO (para lugares de
O-glicosilación). La secuencia de aminoácidos del
polipéptido PRO puede ser alterada opcionalmente a través de cambios
a nivel de ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el
polipéptido PRO en bases preseleccionadas de tal modo que los
codones que se generen se traduzcan en los aminoácidos deseados.
El acoplamiento químico o enzimático de
glicósidos al polipéptido constituye otro mecanismo para incrementar
el número de grupos carbohidrato en el polipéptido del polipéptido
PRO. Estos procedimientos están descritos en la materia, por
ejemplo, en la patente internacional WO87/05330 publicada el 11 de
Septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem.,
pp 259-306 (1981).
La eliminación de grupos carbohidrato presentes
en el polipéptido PRO puede conseguirse químicamente o
enzimáticamente o mediante substitución mutacional de codones que
codifican para residuos aminoácidos que sirven como dianas de
glicosilación. Las técnicas de deglicosilación química se conocen
en el área y se describen, por ejemplo, por Hakimuddin et
al., Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987) y por Edge et
al., Anal. Biochem., 118: 131 (1981). La ruptura enzimática de
los grupos carbohidrato en los polipéptidos puede lograrse usando
distintas endo- y exo-glicosidasas como describe
Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138: 350 (1987).
Otro tipo de modificación covalente de los
polipéptidos PRO de la invención comprende la unión del polipéptido
PRO a uno de los diversos polímeros no proteicos, e.j.
polietilénglicol, polipropilénglicol o
poli-oxialquilenos, tal como se indica en las
patentes US 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144;4.670.417;4.791.192 ó
4.179.337.
Los polipéptidos PRO de la presente invención
pueden ser modificados también para formar una molécula quimérica
que comprenda el polipéptido PRO unido a otro polipéptido heterólogo
o a una secuencia de aminoácidos. En una realización tal molécula
quimérica comprende una fusión del polipéptido PRO con un
polipéptido etiqueta que proporciona un epitopo al cual un
anticuerpo anti-etiqueta puede unirse de forma
selectiva. El epitopo etiqueta generalmente se sitúa en el extremo
amino o carboxil del polipéptido PRO. La presencia de dichas formas
epitopo-etiqueta del polipéptido PRO pueden
detectarse usando un anticuerpo contra el polipéptido etiqueta.
También la provisión del epitopo etiqueta permite al polipéptido PRO
estar listo para ser purificado fácilmente por afinidad usando un
anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de
afinidad que se una al epitopo etiqueta. Alternativamente, la
molécula quimera puede comprender una fusión del polipéptido PRO
con una inmunoglobulina o una región particular de una
inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica,
dicha fusión podría ser a la región Fc o a una molécula IgG.
Son bien conocidos en la materia varios
polipéptidos etiqueta y sus respectivos anticuerpos. Los ejemplos
incluyen etiquetas de poli-histidina
(poli-his) o
poli-histidina-glicina; el
polipéptido etiqueta flu HA y su anticuerpo 12CA5 [Fleid et
al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; la
etiqueta c-myc y sus anticuerpos, el 8F9, el 3C7,
el 6E10,el G4, el B7 y el 9E10 [Evan et al., Molecular and
Cellular Biology,5:3610-3616 (1985)] y la etiqueta
de la glicoproteína D del virus del herpes simple (gD) y su
anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering,
3(6): 547-553 (1990)]. Otros polipéptidos
etiqueta incluyen el péptido Flag [Hoop et al.,
Biotechnology, 6: 1204-1210 (1988)]; el péptido del
epitopo KT3 [Martin et al., Science,
225:192-194 (1992)]; el péptido de un epitopo de
\alpha-tubulina [Skinner et al., J. Biol.
Chem., 266:15163-15166 (1991)] y el péptido
etiqueta de la proteína 10 del gen T7.
[Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 87: 6393-9397 (1990).
La descripción a continuación se refiere
principalmente a la producción de polipéptidos PRO mediante el
cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que
contiene el ácido nucleico correspondiente al polipéptido PRO
deseado. Por supuesto, se contempla que se puedan utilizar
procedimientos alternativos para preparar el polipéptido PRO, bien
conocidos en la materia. Por ejemplo, la secuencia del polipéptido
PRO o fracciones del mismo, pueden producirse mediante síntesis
peptídica directa usando técnicas de fase sólida [ver, por ejemplo
Stewart et al., Solid-Phas Peptide Synthesis,
W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am.
Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)]. La síntesis
proteica in vitro puede realizarse usando técnicas manuales
o mediante automatización. La síntesis automática puede conseguirse,
por ejemplo, usando un Sintetizador de Péptidos de Applied
Biosystems (Foster City, CA) siguiendo las instrucciones del
fabricante. Se pueden sintetizar químicamente varias porciones del
polipéptido PRO deseado separadamente y combinarlas usando
procedimientos químicos o enzimáticos para producir el polipéptido
PRO completo.
El ADN que codifica para el polipéptido PRO
puede obtenerse de una biblioteca de ADNc preparada a partir de un
tejido que se considera que posee el ARNm del polipéptido PRO y que
lo expresa en un nivel detectable. Por consiguiente, el ADN del
polipéptido PRO humano puede ser obtenido adecuadamente a partir de
una biblioteca de ADNc preparada de un tejido humano, tal como se
describe en los Ejemplos. El gen que codifica para el polipéptido
PRO puede obtenerse también a partir de una biblioteca genómica o
mediante síntesis con oligonucleóti-
dos.
dos.
Las bibliotecas pueden cribarse con sondas
(tales como anticuerpos contra el polipéptido PRO deseado u
oligonucleótidos de aproximadamente 20-80 bases)
diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína
codificada por el mismo. El cribado de una biblioteca de ADNc o
genómica con la sonda seleccionada puede realizarse utilizando
procedimientos estándar, como los descritos en Sambrook et
al., Molecular Cloning: A laboratory Manual (New York: Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Otro medio alternativo para
aislar el gen que codifica para el polipéptido PRO deseado consiste
en usar la metodología del PCR [Sambrook et al.,
supra: Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory
Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
Los Ejemplos posteriormente describen técnicas
para el cribado de bibliotecas de ADNc. Las secuencias de
oligonucleótidos seleccionadas como sondas deben ser de longitud
suficiente y suficientemente específicas como para minimizar falsos
positivos. Preferentemente el oligonucleótido se marca de tal forma
que tras la hibridación al ADN puede ser detectado en la biblioteca
que se está cribando. Los procedimientos de marcaje son bien
conocidos en el área, e incluye el uso de marcadores radioactivos
como ATP marcado con P^{32}, biotinilización o marcaje
enzimático. Sambrook et al., supra proporciona las
condiciones de hibridación, incluyendo una moderada y alta
astringen-
cia.
cia.
Las secuencias identificadas mediante dichos
procedimientos de cribado de bibliotecas pueden compararse y
alinearse con otras secuencias conocidas depositadas en bancos de
datos públicos disponibles como el GenBank u otros bancos de datos
de secuencias privadas. La identidad de la secuencia (tanto a nivel
de aminoácidos como de nucleótidos) dentro de regiones definidas o
a lo largo de la totalidad de la secuencia puede determinarse
mediante el alineamiento de secuencia usando programas de ordenador
como BLAST, ALIGN, ADNstar e INHERIT que emplean diversos
algoritmos para medir la homología.
El cribado de bibliotecas seleccionadas de ADNc
o genómicas permite la obtención de ácidos nucleicos que tienen una
secuencia codificante para la proteína usando la secuencia de
aminoácidos deducida descrita en la presente invención por primera
vez, y si es necesario, usando procedimientos convencionales de
extensión de cebador como se describe en Sambrook et al.,
supra, para detectar precursores e intermediarios en el
procesamiento del ARNm que no han sido inversamente transcritos en
ADNc.
Las células huésped se transfectan o transforman
con vectores de expresión o clonación descritos en la presente
invención para la producción del polipéptido PRO y se cultivan en
medio de cultivo convencional modificado para que sea más apropiado
para la inducción de promotores, la selección de transformantes, o
la amplificación de los genes que codifican para las secuencias
deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como medio,
temperatura, pH y demás, pueden ser seleccionados por el experto en
la materia. En general, los principios, protocolos, y técnicas
prácticas, para maximizar la productividad de las células pueden
encontrarse en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Aproach, M
Butler, ed (IRL Press, 1991) y Sambrook et al.,
supra.
Los procedimientos de transfección son conocidos
por el experto en la materia, por ejemplo, el procedimiento del
CaPO_{4} y la electroporación. La transformación se realiza usando
técnicas estándar apropiadas para las células dependiendo de la
célula huésped utilizada. El tratamiento con calcio empleando
cloruro cálcico, como se describe en Sambrook et al.,
supra, o la electroporación, generalmente se usan en
procariotas u otras células que contienen barreras importantes como
las paredes celulares. La infección con Agrobacterium
tumefaciens se utiliza para la transformación de ciertas células
de plantas, como se describe por Shaw et al., Gene, 23:315
(1983) y la patente internacional WO 89/05859 publicada el 29 de
Junio de 1989. Para células mamíferas sin tales paredes celulares,
puede emplearse el procedimiento de la precipitación con fosfato
cálcico de Graham y van der Eb, Virology,
52:456-457 (1978). Se han descrito aspectos
generales de las transformaciones de sistemas de célula huésped de
mamífero en la patente US 4.399.216. Las transformaciones en
levaduras se llevan a cabo típicamente según el procedimiento de
Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) y Hsiao et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Sin embargo,
pueden usarse también otros procedimientos para introducir ADN en
las células, tales como la microinyección nuclear, la
electroporación, la fusión de protoplastos bacterianos con células
intactas o policationes, por ejemplo, polibrene o poliornitina. Para
diversas técnicas de transformación de células de mamífero, ver
Keown et al., Methods in Enzymology
185:527-537 (1990) y Mansour et al., Nature
336:348-352 (1988).
Entre las células huésped adecuadas para clonar
o expresar el ADN en vectores se incluyen procariotas, levaduras o
células eucariotas superiores. Entre los procariotas apropiados se
incluyen, aunque no están limitados a ellos, eubacterias, tales
como organismos Gram-negativos o
Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriáceas
como E. coli. Se encuentran disponibles públicamente varias
cepas de E. coli tales como la cepa E. coli K12 MM294
(ATCC 31, 446); E. coli X1776 (ATCC 31, 537); la cepa E.
coli W3110 (ATCC 27,325) y K5 772 (ATCC 53,635). Entre otras
células huésped procariotas adecuadas se incluyen enterobacteriáceas
tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli,
Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por
ejemplo Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo
Serratia marcescans, y Shigella, así como
Bacilli talescomo B. subtilis y B.
licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrito
en DD 266,710 publicado el 12 de Abril de 1989), Pseudomonas
tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Se
encuentran públicamente disponibles varias cepas de E. coli
tales como la cepa E. coli K12 MM294 (ATCC 31, 446); E.
coli X1776 (ATCC 31, 537); la cepa E. coli W3110 (ATCC
27,325) y K5 772(ATCC 53,635). Estos ejemplos son
ilustrativos más que limitantes. La cepa W3110 es un huésped
particularmente preferido o un huésped parental porque es una cepa
común para la generación de productos de ADN recombinante.
Preferentemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de
enzimas proteolíticos. Por ejemplo, la cepa W3110 puede modificarse
para causar una mutación genética en los genes que codifican para
proteínas endógenas del huésped; los ejemplos de tales huéspedes
incluyen la cepa E. coli W3110 1A2, la cual tiene el
genotipo completo tonA; la cepa E. coli W3110 9E4,
que presenta el genotipo completo tonA ptr3; la cepa E.
coli W3110 27C7 (ATCC 55,244) que tiene el genotipo completo
tonA ptr3 ptr3phoA E15 (argF-lac)169 degP
ompT kan^{1}; la cepa E. coli W3110 37D6 que tiene el
genotipo completo tonA ptr3phoA E15
(argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG
kan^{1}; la cepa E. coli W3110 40B4 que es la cepa
37D6 con una mutación por deleción degP no resistente a
canamicina; y una cepa E. coli que presenta una proteasa
periplásmica mutada descrita en la patente US 4.946.783 publicada
el 7 de Agosto de 1990. Alternativamente, están disponibles
procedimientos de clonación in vitro, por ejemplo, PCR u
otras reacciones de las polimerasas de ácidos nucleicos.
Además de los procariotas, son huéspedes
adecuados para la clonación o la expresión de vectores que
codifican el polipéptido PRO, microbios eucariotas, tales como
hongos filamentosos o levaduras. El Saccharomyces cerevisiae
es un microorganismo huésped eucariota inferior que se usa
comúnmente. Entre otros se incluyen Schizosaccharomyce pombe
(Beach y Nurse, Nature, 290: 140[1981]; patente EP nº 139,383
publicado el 2 de Mayo de 1985); huéspedes Kluyveromyces
(patente US 4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology,
9:968-975 (1991)) tales como, por ejemplo, K
lactis (MW98-8C,CBC683, CBS4574; Louvencort
et al., J Bacteriol., 737 [1983]), K. fragilis (ATCC
12,424) K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii
(ATCC 24,178), K. waltii, (ATCC 56,500), K.
drosophilarium (ATCC 36,906; Van den Berg et al.,
bio/Technology, 8: 135 (1990)), K. thermotolerans y K.
marxianus; yarrowia (patente EP nº 402.226); Pichia
pastoris (patente EP nº 183.070; Sreekrishna et al., J.
Basic Microbiol., 28: 265-278 [1988]); Candida;
Tricoderma reesia (patente EP nº 244.234); Neurospora
crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
76:5259-5263[1979]); Schwanniomyces
tales como Schwanniomyces occidentalis (patente EP nº 394.538
publicado el 31 de Octubre de 1990); y hongos filamentosos tales
como por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Totypocladium
(patente internacional WO 91/00357 publicada el 10 de Enero de
1991), y huéspedes Aspergillus tales como A. nidulans
(Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commn.,
112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene,
26:205-221; Yelton et al., Proc. Natl. Acad.
USA, 81: 1470-1474 [1984] y A. niger (Kelly y
Hynes EMBO J., 4: 475-479 [1985]). Son adecuadas en
la presente invención levaduras metilotroficas e incluyen aunque no
se limitan a ellas, levaduras capaces de crecer en metanol
seleccionadas de los géneros Hansenula, candida, Kloeckera,
Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, y Rhodotorula. Puede
encontrarse una lista de especies específicas que son ejemplos de
esta clase de levaduras en C. Anthony, The Biochemistry of
Methylotrophs, 269 (1982).
Las células huésped adecuadas para la expresión
de polipéptidos PRO glicosilados se derivan de organismos
multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen
células de insectos como Drosophila S2 y Spodoptera
Sf9, así como células de plantas. Entre los ejemplos de líneas
celulares huésped de mamífero se incluyen las células de ovario de
hámster chino (CHO) y las células COS. Ejemplos más específicos
incluyen la línea de riñón de mono transformada por SV40
(COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón
embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para crecer en
cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59
(1977); células de ovario de hámster chino deficientes en DHFR (CHO,
Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));
células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod.,
23:243-251 (1980)); células humanas de pulmón
(W138,ATCC CCL 75); células humanas de hígado (Hep G2, HB 8065); y
células de tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51). La
selección de la célula huésped adecuada se tomar según el criterio
del experto en la materia.
El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN
genómico) que codifica un polipéptido PRO deseado puede ser
insertado en un vector replicable para clonación (amplificación del
ADN) o para expresión. Varios vectores están disponibles
públicamente. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un
plásmido, un cósmido, una partícula viral, o un fago. La secuencia
del ácido nucleico apropiada puede insertarse en el vector mediante
diversos procedimientos. En general, el ADN se inserta en un
sitio(s) apropiado reconocido por un enzima de restricción
usando técnicas conocidas en la materia. Los componentes de los
vectores generalmente incluyen, aunque no están limitados a ello,
una o más secuencias señal, un origen de replicación, uno o más
genes marcadores, un elemento intensificador, un promotor, y una
secuencia de finalización de la transcripción. La construcción de
vectores adecuados que contengan uno o más de estos componentes
requiere técnicas de ligación estándar conocidas por el experto en
la materia.
El polipéptido PRO de interés puede producirse
mediante recombinación no sólo directamente, sino también como un
polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, el cual puede
ser una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un lugar
específico de corte en el extremo N-terminal de la
proteína madura o el polipéptido. En general, la secuencia señal
puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN
del polipéptido PRO que se inserta en el vector. La secuencia señal
puede ser una secuencia señal procariota, por ejemplo, del grupo de
la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, lpp, o líderes de endotoxina
II termoestables. Para la secreción en levaduras la secuencia señal
puede ser por ejemplo, la del líder de invertasa de levadura, el
líder factor alfa (incluidos los líderes de los factores \alpha de
Saccharomyces y Kluyveromyces, este último descrito en la
patente US 5.010.182), el líder ácido fosfatasa, la secuencia líder
de la glucoamilasa de C. Albicans (patente EP nº 362.176
publicada el 4 de Abril de 1990) o la señal descrita en la patente
internacional WO 90/13646 publicada el 15 de Noviembre de 1990. En
la expresión en células de mamífero, pueden usarse secuencias señal
de mamíferos para dirigir la secreción de la proteína, tales como
las secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie
o de especies relacionadas, así como líderes secretores virales.
Tanto los vectores de expresión como los de
clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite
al vector replicarse en una o más células huésped seleccionadas.
Tales secuencias son bien conocidas para diversas bacterias,
levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es
adecuado para muchas bacterias Gram-negativas, el
origen del plásmido \mu es adecuado para levaduras, y varios
orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles
para vectores de clonación en células de mamíferos.
Los vectores de clonación y expresión contienen
típicamente un gen de selección, también llamado marcador de
selección. Los genes de selección típicos codifican para proteínas
que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por
ejemplo ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina (b)
complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suplementan
nutrientes críticos no disponibles en un medio complejo, por
ejemplo, el gen que codifica por la D-alanina
racemasa para Bacilli.
Un ejemplo de marcadores seleccionables
adecuados para células mamíferas son aquellos que permiten la
identificación de células competentes que llevan el ácido nucleico
del polipéptido PRO, como la DHFR o la timidina quinasa. Una célula
huésped apropiada cuando se emplea la DHFR salvaje es la línea
celular CHO deficiente en DHFR, preparada y propagada como se
describe por Urlaub et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA
77:4216 (1980). El gen trp1 presente en el plásmido de
levadura YRp7 es un gen de selección adecuado para ser usado en
levadura [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman
et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al.,
Gene,10:157 (1980)]. El gen trp1 proporciona un marcador de
selección para una cepa mutante de levadura a la que le falta la
habilidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC Nº 44076 o
PEP4-1 [Jones, Genetics,85:12 (1977)].
Los vectores de expresión y clonación
habitualmente contienen un promotor unido operativamente a la
secuencia de ácido nucleico del polipéptido PRO para dirigir la
síntesis del ARNm. Se conocen promotores reconocidos por una
variedad de potenciales células huésped. Los promotores adecuados
para ser usados en huéspedes procariotas incluyen los sistemas de
promotores de la \beta-lactamasa y la lactosa
[Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et
al., Nature, 281:544 (1979)], la fosfatasa alcalina, un sistema
de promotor del triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res.,
8:4057 (1980); patente EP nº 36.776], y promotores híbridos como el
promotor tac [deBoer u col., Proc Natl. Acad. Sci. USA,
80:21-25 (1983)]. Los promotores para uso en
sistemas bacterianos también contendrán una secuencia
Shine-Dalgarno (S. D.) unida operativamente al ADN
que codifica por el polipéptido PRO deseado.
Entre los ejemplos de secuencias promotoras
adecuadas para ser usadas en huéspedes de levadura se incluyen los
promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa
[Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otros
enzimas glicolíticos [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:
149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tales como la
enolasa, la gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, la hexoquinasa, la piruvato decarboxilasa, la
fosfofructoquinasa, la
glucosa-6-fosfato isomerasa, la
3-fosfoglicerato mutasa, la piruvato quinasa, la
triosafosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa y la
glucoquinasa.
Otros promotores de levaduras, promotores
inducibles con la ventaja adicional de tener la transcripción
controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones
promotoras de la alcohol deshidrogenasa 2, el isocitocromo C, la
fosfatasa ácida, las enzimas degradadoras asociadas con el
metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, la
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa
y galactosa. En la patente EP nº 73.657 se describen vectores
adecuados y promotores para ser usados en la expresión en
levaduras.
La transcripción del polipéptido PRO a partir de
vectores en células huésped mamíferas se controla, por ejemplo,
mediante promotores obtenidos a partir de genomas de virus como el
virus del polioma, el virus de la viruela aviar (patente inglesa UK
2.211.504 publicada el 5 de julio de 1989), el adenovirus (como el
adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma
aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis
B, y el virus del simio 40 (SV40), a partir de promotores
heterólogos de mamíferos, por ejemplo, el promotor de la actina o
un promotor de inmunoglobulina, y a partir de promotores de choque
térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con el
sistema de célula huésped.
La transcripción de un ADN que codifica para el
polipéptido PRO deseado en eucariotas superiores puede
incrementarse insertando una secuencia intensificadora en el vector.
Los intensificadores son elementos del ADN que actúan en cis,
habitualmente de aproximadamente 10 a 300 pb, que actúan sobre un
promotor para aumentar su transcripción. Actualmente se conocen
muchas secuencias intensificadoras de genes mamíferos (globina,
elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e
insulina). Típicamente, sin embargo, se usará un intensificador de
un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el
intensificador SV40 en el sitio tardío del origen de replicación
(pb 100-270), el intensificador del promotor
temprano del citomegalovirus, el intensificador del polioma en el
sitio tardío del origen de replicación, e intensificadores de
adenovirus. El intensificador puede empalmarse en el vector en la
posición 5' o 3' de la secuencia codificante del polipéptido PRO,
pero es preferible que esté localizado en el sitio 5' del
promotor.
Los vectores de expresión usados en células
huésped eucariotas (de levaduras, hongos, insectos, plantas,
animales, humanos o células nucleadas de otros organismos
multicelulares) contendrán también secuencias necesarias para la
terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm.
Dichas secuencias están disponibles comúnmente en las regiones no
traducidas en 5' y ocasionalmente en 3' de ADNs o ADNcs eucarióticos
o virales. Estas regiones contienen segmentos nucleotídicos
transcritos como fragmentos poliadenilados en la región no
traducida del ARNm que codifica para los polipéptidos PRO.
Se describen todavía otros procedimientos,
vectores y células huésped adecuadas para ser adaptadas a la
síntesis de polipéptidos PRO en cultivo de células de vertebrados
recombinantes en Gething et al., Nature
293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature,
281:40-46 (1979); patente EP nº 117.060; y patente
EP nº 117.058.
La amplificación génica y/o la expresión pueden
medirse directamente en una muestra, por ejemplo, mediante
transferencia de Southern convencional o transferencia de Northern
para cuantificar la transcripción del ARNm [Thomas, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], transferencia
de puntos (análisis de ADN), o hibridación in situ, usando
una sonda adecuada marcada, basada en las secuencias proporcionadas
en la presente invención. Alternativamente, pueden usarse
anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluidos
dúplex de ADN, de ARN y dúplex híbridos de ADN-ARN o
ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez pueden estar
marcados y el ensayo puede llevarse a cabo en donde el dúplex esté
unido a una superficie, por lo que una vez se ha formado el dúplex
en la superficie, puede detectarse la presencia del anticuerpo unido
al dúplex.
La expresión génica puede medirse de forma
alternativa mediante procedimientos inmunológicos, tales como
tinción inmunohistoquímica de las células o secciones de tejido y
ensayos del cultivo celular o de los fluidos corporales, para
cuantificar directamente la expresión del producto del gen. Los
anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o ensayos
sobre fluidos de la muestra pueden ser tanto monoclonales como
policlonales y pueden prepararse en cualquier animal. Es conveniente
que los anticuerpos puedan preparase contra la secuencia nativa del
polipéptido PRO o contra un péptido sintético basado en las
secuencias de ADN proporcionadas en la presente invención o contra
una secuencia exógena fusionada al ADN del polipéptido PRO y que
codifique por un epitopo del anticuerpo
específico.
específico.
Las formas del polipéptido PRO pueden ser
recuperadas del medio de cultivo o de los lisados de las células
huésped. Si están unidos a membrana, pueden liberarse de la membrana
mediante una solución de detergente adecuada (por ejemplo,
Tritón-X 100) o por ruptura enzimática. Las células
empleadas en la expresión del polipéptido PRO pueden romperse a
través de diversos mecanismos físicos o químicos como ciclos de
congelación y descongelación, sonicación, ruptura mecánica o
agentes que lisan las células.
Puede resultar deseable purificar los
polipéptido PROs a partir de proteínas celulares recombinantes o
polipéptidos. Los siguientes procedimientos son ejemplos de
procedimientos de purificación adecuados: por fraccionamiento o por
columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de
fase reversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de
intercambio catiónico como DEAE; cromatoenfoque;
SDS-PAGE; precipitación con persulfato amónico;
filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex
G-75; columnas de proteína A Sepharose para
eliminar contaminantes como IgG; y columnas quelantes de metales
para unirse a las formas epitopo-etiqueta del
polipéptido PRO. Pueden usarse diversos procedimientos de
purificación de proteínas, procedimientos conocidos en el área y
descritos por ejemplo en Deutscher, Methods in Enzymology, 182
(1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice,
Springer-Verlag, New York (1982). El/Los
paso(s) de purificación dependerán, por ejemplo, de la
naturaleza del proceso de producción usado y en particular del
polipéptido PRO sintetizado.
Las secuencias de nucleótidos (o sus
complementarias) que codifican para los polipéptidos PRO de la
presente invención tienen diversas aplicaciones en el área de la
biología molecular, incluyendo usos como sondas de hibridación, en
mapeo cromosómico y génico y en la generación de ARN y ADN
antisentido. El ácido nucleico que codifica para el polipéptido PRO
puede también ser útil para la preparación de polipéptidos PRO
mediante las técnicas recombinantes descritas en la presente
invención.
La secuencia nativa de longitud completa del
ácido nucleico que codifica para el polipéptido PRO o porciones de
la misma, pueden usarse como sondas sobre una biblioteca de ADNc
para aislar el gen del polipéptido PRO completo o para aislar
incluso otros genes (por ejemplo, aquellos que codifican para
variantes naturales del polipéptido PRO o polipéptidos PRO de otras
especies) que tienen una identidad de secuencia con las secuencias
nucleicas del polipéptido PRO. Opcionalmente, la longitud de las
sondas podrá ser de aproximadamente 20 a 50 bases. Las sondas de
hibridación pueden derivarse de la secuencia de nucleótidos de
cualquiera de las moléculas de ADN descritas en la presente
invención o a partir de secuencias genómicas incluyendo promotores,
elementos intensificadores e intrones de la secuencia de ADN nativa
que codifica para el polipéptido PRO. A modo de ejemplo, un
procedimiento de cribado comprenderá el aislamiento de la región
codificante del gen del polipéptido PRO usando la secuencia de ADN
conocida para sintetizar una sonda seleccionada de unas 40 bases.
Las sondas de hibridación pueden marcarse con diversos marcadores,
incluyendo radionucleótidos como P^{32} o S^{35}, o marcadores
enzimáticos tales como fosfatasa alcalina acoplada con la sonda vía
sistemas de acoplamiento avidina/biotina. Las sondas marcadas que
tienen una secuencia complementaria a la del gen del polipéptido
PRO específico de la presente invención pueden usarse para analizar
bibliotecas de ADNc humano, ADN genómico o ARNm para determinar a
qué miembros de dichas bibliotecas hibrida la sonda. Las técnicas de
hibridación se describen en más detalle más adelante en la sección
de
Ejemplos.
Ejemplos.
Los EST descritos en la aplicación presente
pueden ser usados de forma similar como sondas, utilizando los
procedimientos descritos en la presente invención.
Las sondas pueden usarse también en técnicas de
PCR para generar un banco de secuencias para la identificación de
secuencias íntimamente relacionadas con el polipéptido PRO.
Las secuencias que codifican para el polipéptido
PRO pueden usarse también para construir sondas de hibridación que
permitan mapear el gen que codifica para ese polipéptido PRO y para
el análisis genético de individuos con desórdenes genéticos. Las
secuencias de nucleótidos proporcionadas en la presente invención
pueden ser mapeadas en un cromosoma y a regiones específicas de un
cromosoma usando técnicas conocidas como la hibridación in
situ, el análisis de ligamiento contra marcadores cromosómicos
conocidos, y el análisis de hibridación con biblio-
tecas.
tecas.
Cuando la secuencia codificante para el
polipéptido PRO codifica una proteína que se une a otra proteína,
el polipéptido PRO puede usarse en ensayos para identificar sus
ligandos. De forma similar, se pueden identificar inhibidores de la
unión receptor/ligando. Las proteínas implicadas en dichas
interacciones de unión pueden usarse también para la búsqueda de
péptidos o pequeñas moléculas inhibidoras o agonistas de la
interacción de unión. Los ensayos de cribado pueden usarse para
encontrar compuestos líderes que imitan la actividad biológica del
polipéptido PRO nativo o de un ligando del polipéptido PRO. Dichos
ensayos de cribado incluirán ensayos susceptibles de analizar
bibliotecas químicas a gran escala, haciéndolos particularmente
adecuados para la identificación de pequeñas moléculas candidatas a
fármacos. Las pequeñas moléculas contempladas incluyen compuestos
sintéticos orgánicos o inorgánicos. Los ensayos pueden realizarse en
diversos formatos, incluyendo ensayos de unión
proteína-proteína, ensayos de análisis bioquímico,
inmunoensayos y ensayos basados en células, que están bien
caracterizados en el área.
Los ácidos nucleicos que codifican para el
polipéptido PRO o sus formas modificadas pueden usarse también para
generar tanto animales transgénicos como animales "knock out",
los cuales, a su vez, son útiles en el desarrollo y análisis de
reactivos útiles terapéuticamente. Un animal transgénico (por
ejemplo, un ratón o una rata) es un animal que presenta células que
contienen un transgén, el cual se introdujo en el animal o en un
ancestro del animal en un estadio prenatal, por ejemplo, estadio
embrional. Un transgén es un ADN que se ha integrado en el genoma
de una célula a partir de la cual se desarrolla el animal
transgénico. En una realización, el ADNc que codifica para el
polipéptido PRO de interés puede usarse para clonar el ADN genómico
que codifica para el polipéptido PRO según técnicas establecidas y
las secuencias genómicas serán usadas para generar los animales
transgénicos que contienen células que expresan el ADN que codifica
para el polipéptido PRO. Los procedimientos para generar animales
transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas,
han llegado a ser convencionales dentro del área, por ejemplo en las
patentes US 4.736.866 y 4.870.009. Determinadas células podrían ser
diana para la incorporación del transgén que codifica para el
polipéptido PRO mediante intensificadores específicos de tejido.
Los animales transgénicos que incluyen una copia del transgén que
codifica para el polipéptido PRO, introducido en la línea germinal
del animal en un estadio embrional, pueden usarse para examinar el
efecto del aumento de la expresión del ADN que codifica para el
polipéptido PRO. Dichos animales pueden usarse como animales de
análisis para reactivos que confieran protección frente, a por
ejemplo, condiciones patológicas asociadas con su sobreexpresión. En
concordancia con esta faceta de la invención, un animal es tratado
con el reactivo de forma que una reducción de la incidencia de la
condición patológica, comparado con animales no tratados que llevan
el transgén, indicaría un potencial terapéutico de la intervención
para la condición patológica.
Alternativamente, pueden usarse homólogos
no-humanos de los polipéptidos PRO para construir un
animal "knock out" para el polipéptido PRO el cual presenta un
gen, que codifica para el polipéptido PRO de interés, defectivo o
alterado como resultado de la recombinación homóloga entre el gen
endógeno que codifica para el polipéptido PRO y el ADN genómico
alterado que codifica para el polipéptido PRO introducido en una
célula embrional del animal. Por ejemplo, el ADNc que codifica para
el polipéptido PRO puede usarse para clonar el ADN genómico que
codifica para el polipéptido PRO según técnicas establecidas. Una
porción del ADN genómico que codifica para el polipéptido PRO puede
ser eliminada o reemplazada por otro gen, como por un gen que
codifique para un marcador seleccionable que puede utilizarse para
monitorizar la integración. Típicamente se incluyen en el vector
varias kilobases de secuencia de ADN flanqueante no modificada
(tanto en el extremo 5' como en el 3') [ver por ejemplo Thomas and
Capecchi, Cell 51:503 (1987) para la descripción de vectores de
recombinación homóloga]. El vector se introduce en una línea de
célula madre embrional (por ejemplo, por electroporación) y se
seleccionan aquellas células en las que el ADN introducido se ha
recombinado homologamente con el ADN endógeno [ver por ejemplo, Li
et al., Cell, 69:915 (1992)]. Las células seleccionadas se
inyectan en un blastocito del animal (por ejemplo, un ratón o una
rata) para formar quimeras de agregación [ver por ejemplo, Bradley,
in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A practical Approach,
E.J. Robertson, ed (IRL, Oxford, 1987), pp.
113-152]. Un embrión quimérico puede entonces
implantarse en un animal adoptivo que sea una hembra pseudopreñada
adecuada y el embrión se llevará a término para generar el animal
"knock out". La progenie que porta el ADN recombinado
homólogamente en sus células germinales puede identificarse mediante
técnicas estándar y puede usarse para cruzarse con animales en los
que todas las células del animal contienen el ADN recombinado
homólogamente. Los animales knockout pueden ser caracterizados por
ejemplo, para su capacidad para defenderse de ciertas condiciones
patológicas y para el desarrollo de condiciones patológicas debido a
la ausencia del polipéptido PRO.
En el caso de que se utilice la administración
in vivo de un polipéptido PRO, las dosis normales pueden
variar entre 10 ng/kg y 100 mg/kg de peso corporal de un mamífero o
más por día, preferentemente de 1 \mug/kg/día a 10 mg/kg/día,
dependiendo de la vía de administración. En la literatura se provee
de una guía sobre dosis particulares y procedimientos de
administración; ver, por ejemplo, las patentes US nº 4.657.760, nº
5.206.344 y nº 5.225.212. Es de esperar, que diferentes
formulaciones serán efectivas para diferentes compuestos de
tratamiento y diferentes desórdenes, que la administración que tiene
como objetivo un órgano o tejido, por ejemplo, puede necesitar ser
administrada de manera diferente a la de otro órgano o tejido.
En el caso de que se desee la administración
sostenida de un polipéptido PRO en una formulación con
características de liberación adecuadas para el tratamiento de
cualquier enfermedad o desorden que requiere la administración del
polipéptido PRO, se puede contemplar la microencapsulación del
polipéptido PRO. La microencapsulación de proteínas recombinantes
para liberación sostenida se ha realizado con éxito con la hormona
del crecimiento humana (rhGH, el interferón-(rhIFN-), la
interleucina-2 y MN rgp120. Johnson et al.,
Nat. Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed.
Ther., 27: 1221-1223(1993); Hora et
al., Bio/Technology, 8:755-758 (1990); Cleland,
"Desing and Production of single Inmunization Vaccines Using
Polylactide Plyglycolide Microsphere Systems." en Vaccine
Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell y Newman, eds,
(Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462; las
patentes internacionales WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399, y
patente US 5,654.010.
Las formulaciones de liberación sostenida de
estas proteínas se desarrollaron usando el polímero de ácido
poli-láctico-coglicólico (PLGA)
debido a su biocompatibilidad y al rango amplio de propiedades
biodegradables. Los productos de degradación del PLGA, los ácidos
láctico y glicólico, pueden ser rápidamente aclarados del cuerpo
humano. Además la degradabilidad de este polímero puede ajustarse
desde meses hasta años dependiendo de su peso molecular y su
composición. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from
lactide/glycolide polymer", en: M. Chasin y R. Langer (Eds.),
Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New
York, 1990, pp. 1-41.
Por ejemplo, para una formulación que pueda
proveer una dosis de aproximadamente 80 g/kg/día en mamíferos con
un peso corporal máximo de 85 kg, la mayor dosis sería
aproximadamente de 6,8 mg del polipéptido PRO por día. Para
conseguir este nivel de dosis, se necesita una formulación de
liberación sostenida que contenga un máximo posible de carga de
proteína (15-20% peso/peso de polipéptido PRO) con
la menor liberación inicial posible (<20%). También es deseable
una liberación continuada (orden cero) del polipéptido PRO a partir
de micropartículas durante 1-2 semanas. Además la
proteína encapsulada que va a ser liberada debe mantener su
integridad y estabilidad durante todo el período de liberación
deseado.
Los polipéptidos PRO363 de la presente invención
que poseen una actividad biológica relacionada con la de la
proteína CD24 pueden emplearse tanto in vivo con propósitos
terapéuticos como in vitro. Los expertos en la materia
sabrán bien como emplear los polipéptidos PRO363 de la presente
invención para tales propósitos.
Los compuestos de la presente invención pueden
ser formulados de acuerdo con procedimientos conocidos para
preparar composiciones farmacéuticamente útiles, a través de las
cuales el polipéptido PRO se combina en adición con un vehículo
farmacéuticamente aceptable. Se describen vehículos adecuados y sus
formulaciones, inclusive de otras proteínas humanas, por ejemplo,
albúmina sérica humana en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical
Sciences, 16th ed., 1980 Mack Publishing Co., editada por Oslo et
al., la descripción de la cual se incorpora en la presente
invención por referencia.
Las dosis y concentraciones deseadas de fármaco
de las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden
variar dependiendo del uso particular pensado. Por ejemplo, en el
tratamiento de la trombosis venosa profunda o de la enfermedad
vascular periférica, se prefieren típicamente dosis en bolo con
administraciones subsecuentes con el objetivo de mantener un nivel
sanguíneo aproximadamente constante, preferentemente en el orden de
unos
3 \mug/ml.
3 \mug/ml.
Sin embargo, para usarse en conexión con las
instalaciones de asistencia médica de emergencia en donde la
capacidad de infusión generalmente no está disponible y debido a la
naturaleza generalmente crítica de la enfermedad subyacente (por
ejemplo, embolismo, infarto), generalmente será deseable
proporcionar unas dosis iniciales mayores, tales como un bolo
intravenoso.
La presente invención proporciona además
anticuerpos anti-polipéptido PRO. Se incluyen
ejemplos de anticuerpos que incluyen anticuerpos policlonales,
monoclonales, humanizados, bioespecíficos, y heteroconjugados.
Los anticuerpos contra el polipéptido PRO puede
comprender anticuerpos policlonales. El experto en la materia
conoce procedimientos para la preparación de anticuerpos
policlonales. Los anticuerpos policlonales pueden desarrollarse en
un mamífero, por ejemplo, mediante la administración de una o más
inyecciones de un agente inmunizante, y si se desea un adyuvante.
Típicamente, el agente inmunizante y/o el adyuvante se inyectarán
en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o
intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir al
polipéptido PRO o a una proteína suya de fusión. Puede ser útil
conjugar el agente inmunizante con una proteína que se conozca como
inmunogénica en el mamífero que va a ser inmunizado. Entre los
ejemplos de dichas proteínas inmunogénicas se incluyen, aunque no
están limitados a ellos, la hemocianina de lapa, la albúmina
sérica, la tiroglobulina bovina y el inhibidor de la tripsina de
soja. Entre los ejemplos de adyuvantes que pueden ser utilizados se
incluyen el adyuvante completo de Freund y el adyuvante
MPL-TDM (monofosforil lípido A, trehalosa sintética
dicorinomicolato). El protocolo de inmunización puede ser
seleccionado por los expertos en la materia.
Los anticuerpos contra el polipéptido PRO pueden
ser Alternativamente anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos
monoclonales pueden prepararse usando los procedimientos de
hibridoma, tales como aquellos descritos por Kohler y Milstein,
Nature, 256:495 (1975). En un procedimiento de hibridoma, un ratón,
un hámster u otro animal huésped adecuado, se inmuniza típicamente
con un agente inmunizante para obtener linfocitos que produzcan o
sean capaces de producir anticuerpos que se unan específicamente al
agente inmunizante. De manera alternativa, los linfocitos pueden
ser inmunizados in vitro.
Típicamente, el agente inmunizante incluirá el
polipéptido PRO de interés o una proteína de fusión del mismo.
Generalmente, se usan o bien linfocitos de sangre periférica
("PBLs") si se desean células de origen humano, o células de
bazo o células de nódulos linfáticos si se desean fuentes de
mamíferos no humanos. Los linfocitos entonces se fusionan con una
línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado,
como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma [Goding,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press,
(1986) pp. 59-103]. Habitualmente las líneas
celulares inmortalizadas son células de mamífero transformadas,
particularmente células de mieloma de roedores, de origen bovino y
de origen humano. Habitualmente se usan líneas celulares de mieloma
de rata o ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en
medios de cultivo adecuados que preferentemente contienen una o más
sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las
células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si a las células
parentales les falta el enzima hipoxantina guanina fosforibosil
transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo de los hibridomas
incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina, y timidina
("medio HAT"), substancias que impiden el crecimiento de
células deficientes en HGPRT.
Las líneas celulares inmortalizadas preferidas
son aquellas que se fusionan eficientemente, que sostienen niveles
estables elevados de expresión del anticuerpo por las células
seleccionadas productoras de anticuerpo, y que son sensibles a
medios tales como el medio HAT. Las líneas de mieloma murino se
encuentran entre las células inmortalizadas más preferidas, las
cuales pueden obtenerse, por ejemplo, del Salk Institute Cell
Distribution Center, San Diego, California y de la American Type
Culture Collection, Rockville, Maryland. También se han descrito
para la producción de anticuerpos monoclonales humanos las líneas
celulares de mieloma humano y de heteromieloma
ratón-humano [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984);
Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques
and Applications, Marcel Dekker, Inc, New York, (1987) pp.
51-63].
El medio de cultivo en el que se cultivan las
células de hibridoma puede ser analizado para determinar la
presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el
polipéptido PRO de interés. Preferentemente, la especificidad de
unión de anticuerpos monoclonales producidos por las células de
hibridoma se determina por inmunoprecipitación o mediante un ensayo
de unión in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RIA) o un
ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas (ELISA). Dichas técnicas y
ensayos son conocidas en el área. La afinidad de unión del
anticuerpo monoclonal puede ser determinada, por ejemplo, mediante
el análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem.,
107:220 (1980).
Después de que las células de hibridoma deseadas
hayan sido identificadas, los clones pueden subclonarse mediante
procedimientos de dilución limitante y crecimiento según
procedimientos estándar [Goding, supra]. El medio adecuado
para este propósito incluye, por ejemplo, medios como el Dulbecco's
Modified Eagle's Medium y el RPMI-1640.
Alternativamente, las células de hibridoma pueden crecer in
vivo en forma de ascites en un mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones pueden ser aislados o purificados a partir del medio de
cultivo o del fluido de los ascitas mediante procedimientos
convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como,
proteína-A-Sepharose, cromatografía
en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía
de afinidad.
Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse
también mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como los
descritos en la patente US 4.816.567. El ADN que codifica para los
anticuerpos monoclonales de la invención puede aislarse fácilmente
y secuenciarse usando procedimientos convencionales (por ejemplo,
usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse
específicamente a los genes que codifican para las cadenas pesada y
ligera de los anticuerpos murinos). Las células de hibridoma de la
invención sirven como fuente preferente de dicho ADN. Una vez
aislado, el ADN puede incorporarse en vectores de expresión, los
cuales son entonces transfectados en células huésped como las
células de simio COS, las células de ovario de hámster chino (CHO),
o células de mieloma que de lo contrario no producirían la proteína
inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos
monoclonales en las células huésped recombinantes. El ADN puede
modificarse también, por ejemplo, substituyendo la secuencia
codificante para los dominios constantes humanos de las cadenas
pesada y ligera en lugar de las secuencias murinas homólogas
[patente US nº 4.816.567; Morrison et al., supra] o
por la unión covalente de toda o parte de la secuencia codificante
para un polipéptido no inmunoglobulina a la secuencia codificante
para la inmunoglobulina. Dicho polipéptido no inmunoglobulina puede
sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo de la
invención, o puede ser sustituido por los dominios variables de un
sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo de la invención
para crear un anticuerpo quimérico bivalente.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos
monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos
monovalentes son bien conocidos en el área. Por ejemplo, un
procedimiento implica la expresión recombinante de una cadena
ligera de la inmunoglobulina y una cadena pesada modificada. La
cadena pesada se trunca generalmente en cualquier punto de la
región Fc para prevenir la unión de la cadena pesada.
Alternativamente, los residuos de cisteína relevantes se sustituyen
por otro residuo aminoácido o se delecionan para prevenir la
unión.
También son adecuados procedimientos in
vitro para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de
los anticuerpos para producir fragmentos de los mismos,
particularmente fragmentos Fab, puede conseguirse usando técnicas
de rutina conocidas en el área.
Los anticuerpos anti-polipéptido
PRO de la invención pueden además comprender anticuerpos humanizados
o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos
no-humanos (por ejemplo, murinos) son
inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o sus
fragmentos (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab)_{2} u
otras subsecuencias de anticuerpos de unión a antígeno) que
contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no
humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas
humanas (anticuerpo receptor) en las cuales se substituyen residuos
de una región determinante complementaria (CDR) del receptor por
residuos de un CDR de especies no humanas (anticuerpo donador) como
ratón, rata o conejo que tengan la especificidad, afinidad y
capacidad deseadas. En algunos casos, se reemplazan residuos de la
región de entrecruzamiento Fv de la inmunoglobulina humana por los
residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados
pueden comprender también residuos que no se encuentran ni en el
anticuerpo receptor ni en el CDR importado o en secuencias de la
región de entrecruzamiento. En general el anticuerpo humanizado
comprenderá substancialmente todos o por lo menos un, y típicamente
dos, dominios variables, en el cual todas o substancialmente todas
las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no
humana y todas o substancialmente todas las regiones FR son las de
una secuencia de consenso de una inmunoglobulina humana. El
anticuerpo humanizado, óptimamente también comprenderá por lo menos
una porción de una región constante de una inmunoglobulina (Fc),
típicamente aquella de una inmunoglobulina humana [Jones et
al., Nature,321: 522-525 (1986); Riechmann et
al., Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta,
Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)].
Son bien conocidos de la técnica procedimientos
para humanizar anticuerpos no humanos. Generalmente, un anticuerpo
humanizado tiene un o más residuos aminoácidos introducidos en él a
partir de una fuente que no es humana. Estos residuos aminoácidos
no-humanos se denominan con frecuencia residuos
"de importación", que típicamente se obtienen de un dominio
variable "de importación". La humanización puede ser realizada
esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores
[Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986);
Riechmann et al., Nature,332:323-327 (1988);
Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536
(1988)], substituyendo CDRs de roedor o secuencias CDR por las
secuencias correspondientes a un anticuerpo humano. Por
consiguiente, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos
quiméricos (patente US 4.816.567), en donde substancialmente menos
de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la
secuencia correspondiente de una especie no-humana.
En la práctica los anticuerpos humanizados son típicamente
anticuerpos humanos en los que algunos residuos CDR y posiblemente
algunos residuos FR se substituyen por residuos de sitios análogos
en anticuerpos de roedores.
Los anticuerpos humanos pueden producirse
también usando diversas técnicas conocidas en el área, incluyendo
bibliotecas de expresión en fagos [Hoogenboom y Winter, J. Mol.
Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581
(1991)]. Las técnicas de Cole et al. y Boerner et al.
están también disponibles para la preparación de anticuerpos
monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and
Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985) y Boerner et al.,
J Inmunol., 147(1):86-95 (1991)].
Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos
monoclonales, preferentemente humanos o humanizados que tienen
especificidad de unión para por lo menos dos antígenos diferentes.
En el caso presente, una de las especificidades de unión es por el
polipéptido PRO, y la otra es por cualquier otro antígeno,
preferentemente por una proteína de superficie celular o un
receptor o una subunidad de receptor.
Son conocidos de la técnica procedimientos para
construir anticuerpos biespecíficos. Tradicionalmente, la
producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se ha basado en
la coexpresión de 2 parejas de inmunoglobulina de cadena
pesada/cadena ligera, en donde las dos cadenas pesadas tienen
especificidades diferentes [Milstein y Cuello, Nature,
305:537-539 (1983)]. Debido a la aleatoria variedad
de cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas, estos
hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez
moléculas de anticuerpo diferentes, de los cuales sólo una tiene la
estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula
correcta habitualmente se consigue mediante etapas de cromatografía
de afinidad. Se describen procedimientos similares en la patente
internacional WO 93/08829 publicada el 13 de Mayo de 1993 y en
Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659
(1991).
Se pueden fusionar dominios variables de
anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de
combinación antígeno-anticuerpo) con secuencias de
dominios constantes de inmunoglobulinas. La fusión preferentemente
se produce con un dominio constante de cadena pesada de
inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de la bisagra, y
las regiones CH2 y CH3. Se prefiere que la primera región constante
de cadena pesada (CH1) contenga el sitio necesario para la unión
de la cadena ligera presente en por lo menos una de las fusiones.
Los ADNs que codifican para las fusiones de cadena pesada de la
inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de la
inmunoglobulina se insertan en vectores de expresión separados, y
son co-transfectados en un organismo huésped
adecuado. Para más detalles sobre la generación de diacuerpos, ver,
por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210
(1986).
Los anticuerpos heteroconjugados también se
encuentran comprendidos dentro del alcance de la presente
invención. Los anticuerpos heteroconjugados se componen de dos
anticuerpos unidos covalentemente. Tales anticuerpos, por ejemplo,
han sido propuestos para dirigir células del sistema inmune hacia
células no deseadas [patente US 4.676.980], y para el tratamiento
de la infección por VIH [patentes internacionales WO nº 91/00360; WO
nº 92/2000373; patente EP nº 03089]. Se contempla que los
anticuerpos puedan prepararse in vitro usando procedimientos
conocidos en la química sintética de proteínas, incluyendo aquellos
que implican agentes de unión. Por ejemplo, las inmunotoxinas
pueden construirse usando una reacción de intercambio de disulfuro o
formando un enlace tioéter. Entre los ejemplos de reactivos
adecuados para este propósito se incluyen el iminotiolato y el
metil-4-mercaptobutirimidato y
aquellos descritos, por ejemplo en la patente US nº 4.676.980.
Los anticuerpos anti-polipéptido
PRO de la invención tienen diversas utilidades. Por ejemplo, los
anticuerpos anti-polipéptido PRO pueden usarse en
ensayos de diagnóstico para un polipéptido PRO, por ejemplo,
detectando su expresión en células, tejidos o sueros específicos.
Pueden usarse diversas técnicas de diagnóstico conocidas en el
área, tales como los ensayos de unión competitiva, ensayos de
sándwich directos o indirectos y ensayos de inmunoprecipitación
realizados tanto en fases heterogéneas como homogéneas [Zola,
Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc.
(1987) pp. 147-158]. Los anticuerpos usados en los
ensayos de diagnóstico pueden marcarse con una fracción detectable.
La fracción detectable debería ser capaz de producir, directa o
indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la fracción
detectable puede ser un radioisótopo, como H^{3}, C^{14},
P^{32}, S^{35}, o I^{125}, un compuesto fluorescente o
quimioluminiscente, como el isotiocianato de fluoresceína, la
rodamina o la luciferina, o bien un enzima como la fosfatasa
alcalina, la beta-galactosidasa o la peroxidasa de
rábano. Puede emplearse cualquier procedimiento conocido en el área
para conjugar el anticuerpo con la fracción detectable, incluyendo
aquellos procedimientos descritos por Hunter et al., Nature,
144: 945 (1962); David et al., Biochemistry,13: 1014 (1974);
Pain et al., J. Immunol. Meth., 40: 219 (1981); y Nygren, J.
Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982).
Los anticuerpos anti-polipéptido
PRO pueden ser útiles también para la purificación por afinidad del
polipéptido PRO a partir de cultivos celulares recombinantes o
fuentes naturales. En este proceso, los anticuerpos contra el
polipéptido PRO están inmovilizados sobre un soporte adecuado, como
Sephadex o papel de filtro, usando procedimientos bien conocidos en
el área. El anticuerpo inmovilizado se pone entonces en contacto con
una muestra que contenga el polipéptido PRO a purificar, y a partir
de entonces se lava el soporte con un solvente adecuado que
eliminará substancialmente todo el material en la muestra excepto el
polipéptido PRO, el cuál está unido al anticuerpo inmovilizado.
Finalmente, el soporte se lava con otro solvente apropiado que
liberará el polipéptido PRO del anticuer-
po.
po.
Se ofrecen los siguientes ejemplos con
propósitos únicamente ilustrativos, y no se pretende de ningún modo
limitar el ámbito de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos
Los reactivos disponibles comercialmente a los
que se hace referencia en los ejemplos se utilizaron siguiendo las
instrucciones del fabricante a menos que se indique lo contrario. La
fuente de las células identificadas en los siguientes ejemplos, y a
lo largo de toda la especificación, por número de acceso ATCC es la
American Type Culture Collection, Rockville, Maryland.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Las secuencias del dominio extracelular (ECD)
(incluidas las secuencias correspondientes al péptido señal de
secreción, si existía) de aproximadamente 950 proteínas conocidas
secretadas procedentes del banco de datos público
Swiss-Prot se utilizaron para la búsqueda de bancos
de datos EST. Los bancos de datos EST, incluyeron los bancos de
datos públicos (por ejemplo, Dayhoff, GenBank), y bancos de datos en
propiedad (por ejemplo, LIFESEC^{TM}, Incyte Pharmaceuticals,
Palo Alto, CA). La búsqueda se realizó mediante el programa
informático BLAST o BLAST2 (Altxchul y Gish, Methods in Enzymology
266: 460-480 (1996)) comparando las secuencias de
proteína ECD con secuencias EST en 6 pautas de traducción. Estas
comparaciones con una puntuación en el Blast de 70 (o en algunos
casos 90) o mayor, que no codificaban para proteínas conocidas, se
agruparon y combinaron en secuencias de ADN consenso con el
programa "phrap" (Phil Gree, University of Washington, Seattle,
WA; (http://bozeman.mbt.washington.edu/
phrap.docs/phrap.html).
Mediante esta búsqueda por homología del dominio
extracelular, se ensamblaron secuencias consenso de ADN en relación
a otras secuencias EST identificadas mediante Phrap. Además, las
secuencias de ADN consenso obtenidas, fueron a menudo (pero no
siempre) ampliadas con ciclos repetidos de BLAST y phrap para
aumentar la secuencia consenso tanto como era posible en las
fuentes de secuencias EST descritas más arriba.
En base a las secuencias consenso obtenidas tal
como se ha descrito, se sintetizaron oligonucleótidos y se
utilizaron por PCR para la identificación de una biblioteca de ADNc
que contenía la secuencia de interés y como sondas para el
aislamiento de un clon con la secuencia codificante completa de un
polipéptido PRO. Los cebadores para la PCR, sentido de la
traducción (.f) y antisentido (.r), por lo general de 20 a 30
nucleótidos, se diseñaron frecuentemente para generar un producto
de PCR con un tamaño de 100-1000 bp. La secuencia
consenso es mayor que 1-1.5 kpb. Con el fin de
cribar algunas bibliotecas para un clon de secuencia completa, el
ADN de las bibliotecas se sometió a amplificación por PCR, tal como
Ausubel et al., en Current Protocols in Molecular Biology,
con el par de cebadores de PCR. Una biblioteca positiva se utilizó a
continuación para el aislamiento de clones codificantes para el gen
de interés mediante un oligonucleótido sonda y uno de los pares de
cebadores.
Las bibliotecas de ADNc utilizadas para el
aislamiento de clones de ADNc se contruyeron mediante procedimientos
estándares con reactivos disponibles comercialmente como los que
facilita la firma Invitrogen, San Diego, CA. El ADNc se cebó con un
oligo dT que contenía una diana NotI, unida con adaptadores romos
SalI tratados con quinasas, se digirió con NotI, se separó por
tamaño en electroforesis en gel y se clonó en una orientación
determinada en un vector de clonado adecuado (como por ejemplo pRKB
o pRKD; pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene lugares
Sfil; Holmes et al., Science, 253: 1278-1280
(1991))en las dianas únicas XhoI y NotI.
\newpage
Ejemplo
2
El ARNm se aisló a partir de un tejido humano de
interés mediante los reactivos y protocolos de Invitrogen, San
Diego, CA (Fast Track 2). Este ARN se utilizó para generar una
biblioteca de ADNc oligodT en el vector pRK5D con los reactivos y
protocolos de Life Technologies, Gathersburg, MD (Super Script
Plasmid System). En este procedimineto, el ADNc de doble cadena
mayor de 1000 bp, se separó por tamaño y el que estaba unido a
SalI/NotI se clonó en un vector digerido con XhoI/NotI. pRK5D es un
vector de clonación que tienen un lugar de inicio de la
transcripción sp6 seguido por una diana de restricción SfiI
precedido de las dianas de clonación XhoI/NotI.
Una biblioteca de ADNc secundaria se generó para
representar de manera preferencial los extremos 5' de los clones de
ADNc. El ARN Sp6 se generó de una biblioteca primaria (descrita más
arriba) y ese ARN se utilizó para generar una biblioteca de ADNc
cebada aleatoriamente en el vector pSST-AMY.0 con
los reactivos y protocolos de Life Technologies (Super Script
Plasmid System, a los que se ha hecho referencia más arriba). En
este procedimiento, el ADNc de doble cadena se separó por tamaño de
500-1000 bp., se unió a adaptadores romos NotI, con
SfiI y se clonó en un vector digerido por SfiI/NotI.
pSST-AMY.0 es un vector de clonación que tienen el
promotor de la alcohol deshidrogenasa de levadura precedido por
dianas de clonación de ADNc y la secuencia de la amilasa de ratón
(la secuencia madura sin la señal de secreción) seguida por el
terminador de la alcohol deshidrogenasa de levadura después de las
dianas de clonación. Por tanto los ADNcs clonados en ese vector,
fusionados en la misma pauta de lectura con la secuencia de la
amilasa, permitirán la secreción de la amilasa de las colonias de
levaduras convenientemente transfectadas.
El ADN de la biblioteca descrito en el párrafo 2
más arriba, se enfrió en hielo y se añadieron bacterias
electrocompetentes DH10B (Life Technologies, 20 ml). La bacteria y
la mezcla del vector se electroporaron según recomendaciones del
fabricante). A continuación, se añadió medio SOC (Life Technologies,
1 ml) y la mezcla se incubó a 37ºC durante 30 min. Los
transformantes se plaquearon en 20 placas de LB estándares de 150
mm, que contenían ampicilina y se incubaron durante 16 horas (37ºC).
Se aislaron las colonias positivas y se aisló el ADN de los clones
del bacteriano con protocolos estándares, por ejemplo, gradiente de
CsCl. Con el ADN purificado se procedió según los protocolos de
levadura que siguen.
Los procedimientos de levadura se separaron en
tres categorías: (1) Transformación de levadura con el plásmido
combinado con el vector de ADNc, (2) Detección y aislamiento de
clones de levadura que secretaban amilasa; (3) amplificación por
PCR del inserto directamente de la colonia de levadura y
purificación del ADN para secuenciación y análisis posteriores.
La cepa de levadura utilizada fue
HD56-5A (ATCC-90785). Esta cepa
tiene el fenotipo siguiente: MAT alfa, ura3-52,
leu2-3, leu2-112,
his3-11, his3-15, MAL^{+},
SUC^{+}, GAL^{+}. Se suelen emplear de manera preferente,
mutantes de levadura que tienen mecanismos
post-traduccionales deficientes. Estos mutantes
pueden tener alelos deficientes translocados sec71, sec72, sec62,
siendo el sec71 truncado el más preferente. De forma alternativa,
los antagonistas (incluyendo nucleótidos antisentido y/o ligandos)
que interfieren con la acción normal de estos genes, otras
proteínas implicadas en el mecanismo
post-traduccional (por ejemplo, SEC61p, SEC72p,
SEC62p, SEC63p, TDJ1p o SSA1p-4p) o la formación de
complejos de esas proteínas pueden emplearse en combinación con la
levadura que expresa la amilasa.
La transformación se realizó basándose en el
protocolo descrito por Gietz et al., Nucl. Acid. Res.,
20:1425 (1992). Las células transformadas se inocularon del
agar a un medio complejo de caldo YEPD (100 ml) y se crecieron toda
la noche a 30ºC. El caldo de YEPD se preparó tal como está descrito
en Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring
Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 207 (1994). El cultivo de
toda la noche se diluyó hasta 2 x 10^{6} células/ml
(aproximadamente DO_{600}=0,1) en caldo de YEPD (500 ml) y se
dejó crecer hasta 1 X 10^{7} células/ml (aproximadamente
DO_{600}=0,4-0,5).
A continuación, las células se recogieron y se
prepararon para la transformación transfiriéndolas a botellas para
el rotor GS3 y se centrifugaron en el rotor GS3 durante 5 min a 5000
rpm, el sobrenadante se descartó y a continuación el precipitado se
resuspendió en agua estéril, y se centrifugó otra vez en tubos
falcon de 50 ml a 3500 rpm en una centrífuga Beckman
GS-6KR. El sobrenadante se descartó y las células se
lavaron subsiguientemente con LiAc/TE (10 ml, 10 mM
Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5, 100 mM
Li_{2}OOCCH_{3}), y se resuspendieron en LiAc/TE (2,5 ml).
La transformación se realizó por la mezcla en
tubos de microcentrífuga de las células preparadas (100 \mul),
con ADN de esperma de salmón de cadena sencilla desnaturalizado
recientemente (Lofstrand Labs, Gaithersburg, MD)y el ADN
transformante (1 \mug, vol < 10 \mul). Las mezcla se mezcló
brevemente en el vórtex y se añadió a continuación, PEG/TE al 40%
(600 ml, 40% polietilen-glicol-4000,
10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM
Li_{2}OOCCH_{3}, pH 7,5). La mezcla se agitó cuidadosamente en
un vaso de reacción centrifugado en una microfuga a 12000 rpm
durante 5-10 segundos, se decantó y resuspendió en
TE (500 \mul, 10 mM Tris-ClH, 1 mM EDTA, pH 7,5)
seguido por centrifugación. Las células se diluyeron en TE (1 ml) y
las alícuotas (200 \mul) se propagaron en un medio selectivo
previamente preparado en placas de 150 mm (VWR).
De forma alternativa, a pesar de las múltiples
pequeñas reacciones, la transformación se realizó como una reacción
simple a gran escala en la que las cantidades de reactivos se
añadieron proporcionalmente.
El medio selectivo utilizado fue un agar de
dextrosa completamente sintético sin uracilo
(SCD-Ura) preparado como se ha descrito en Kaiser
et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press,
Cold Spring Harbor, NY, p. 208-210 (1994). Los
transformantes se crecieron a 30ºC durante 2-3
días.
La detección de las colonias que secretaban
amilasa se realizó por inclusión de almidón rojo en el medio
selectivo de crecimiento. El almidón se combinó con el colorante
rojo (Reactive Red-120, Sigma) como en el
procedimiento descrito por Biely et al., Anal. Biochem. 172:
176-179 (1988). El almidón combinado se incorporó a
las placas de agar SCD-Ura a una concentración final
de 0,15% (w/v) y se tamponó con fosfato de potasio hasta un pH de
7,0 (50-100 mM de concentración final).
Las colonias positivas se picaron y se sembraron
en un medio selectivo fresco (en placas de 150 mm) con el fin de
obtener colonias aisladas identificables. Las colonias sencillas
aisladas positivas para la secreción de la amilasa se detectaron
por incorporación directa de almidón rojo en el agar
SCD-Ura tamponado. Las colonias positivas se
determinaron mediante su capacidad para romper el almidón resultando
en un halo claro rodeando las colonias positivas, visualizable de
manera directa.
Cuando se aislaba una colonia positiva, una
pequeña parte se picaba con un asa de siembra y se diluía en agua
estéril (30 \mul) en una placa de 96 pocillos. Las colonias
positivas, en ese punto, se congelaban y guardaban para un análisis
posterior o se amplificaban inmediatamente. Una alícuota de células
(5 \mul) se utilizó como molde para la reacción de PCR en un
volumen de 25 \mul que contenía 0.5 \mul Klentaq (Clontech,
Palo Alto, CA); 4,0 \mul 10 mM dNTPs (Perkin
Elmer-Cetus); 2,5 \mul tampón Kentaq (Clontech);
0,25 \mul oligo de sentido 5' 1; 0,25 \mul oligo
anti-sentido 2; 12,5 \mul agua destilada. La
secuencia del oligonucleótido 1 sentido fue:
5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT-3' | (SEC ID. NO:6) |
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia del oligonucleótido reverso 2
fue:
5'-CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT-3'
(SEC ID nº 7). Se llevó a cabo PCR de la manera siguiente:
Las regiones subrayadas de los oligonucleótidos
anillaron con las regiones promotoras de ADH y de la amilasa,
respectivamente, y amplificaron una región de 307 bp del vector
pSST-AMY.0 cuando el inserto no estaba presente. De
forma frecuente, los primeros 18 nucleótidos del extremo
5'-terminal de esos oligonucleótidos, contenía
lugares de hibridación para los cebadores de secuenciación. Por
tanto, el producto de la reacción de PCR de un vector vacío fue de
343 pb. Sin embargo, la secuencia señal fusionada con el ADNc
resultó en secuencias largas de nucleótidos.
A continuación de la PCR, una alícuota de la
reacción (5 \mul) se examinó por electroforesis en gel de agarosa
al 1% en tampón Tris-Borato-EDTA
(TBE) tal como se describió en Sambrook et al., supra.
Los clones resultantes, en un único producto de PCR mayor que 400
pb, se analizaron por secuenciación después de la purificación con
un equipo de columnas 96 Qiaquick PCR (Qiagen Inc., Chtsworth.
CA).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se obtuvo una secuencia consenso en relación a
una variedad de secuencias EST tal como se ha descrito en el
Ejemplo 1, más arriba, donde la secuencia consenso obtenida se
denomina ADN42798. En base a la secuencia DNA42698, se sintetizaron
los oligonucleótidos: 1) para identificar por PCR una biblioteca de
ADNc que contenía la secuencia de interés, y 2) para usar como
sondas para el aislamiento de un clon de secuencia completa de la
secuencia codificante de PRO363.
Se sintetizó un par de cebadores de PCR
(directos y reversos):
cebador de PCR directo (42828.fl):
5'-CCAGTGCACAGCAGGCAACGAAGC-3' | (SEC ID nº 3) |
\vskip1.000000\baselineskip
cebador de PCR reverso (42828.r1):
5'-ACTAGGCTGTATGCCTGGGTGGGC-3' | (SEC ID nº 4) |
Además, se construyó un oligonucleótido
sintético sonda de hibridación a partir de la secuencia de consenso
DNA42828, que presentaba la secuencia de nucleótidos siguiente:
sonda de hibridación (42828.pl)
5'-GTATGTACAAAGCATCGGCATGGTTGCAGGAGCAGTGACAGGC-3' | (SEC ID nº 5). |
Con el fin de cribar varias bibliotecas para
obtener una fuente de clones de longitud completa, se cribó ADN de
las bibliotecas mediante amplificación por PCR con la pareja de
cebadores de PCR identificada anteriormente. A continuación, se
utilizó una biblioteca positiva para aislar clones codificantes del
gen PRO363 utilizando el oligonucleótido sonda y uno de los
cebadores de PCR. Se aisló ARN para la construcción de las
bibliotecas de ADNc a partir de tejido renal fetal humano
(LIB227).
La secuenciación de ADN de los clones aislados
tal como se ha descrito anteriormente proporcionó la secuencia de
ADN de longitud completa de PRO363 [en la presente invención se
denomina UNQ318 (DNA45419-1252)] (SEC ID nº 1) y la
secuencia de proteína derivada de PRO363.8l
La secuencia de nucleótidos completa de UNQ318
(DNA45419-1252) se muestra en la figura 1 (SEC ID nº
1). El clon UNQ318 (DNA45419-1252) contiene un
único marco de lectura abierta con un sitio de inicio traduccional
aparente en las posiciones nucleótidas 190 a 192 y que termina en el
codón de parada en las posiciones nucleótidas
1.309-1.311 (figura 1). El precursor polipéptido
predicho presenta una longitud de 373 aminoácidos (figura 2). La
proteína PRO363 de longitud completa mostrada en la figura 2
presenta un peso molecular estimado de aproximadamente 41.281
daltons y un pI de aproximadamente 8,33. Existe un dominio
transmembranal en los aminoácidos 221 a 254 de la secuencia de
aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEC ID nº 2). El polipéptido
PR0363 también presenta por lo menos dos dominios de proteína P0 de
mielina entre aproximadamente los aminoácidos 15 y 56 y entre
aproximadamente los aminoácidos 87 y 116. El clon UNQ318
(DNA45419-1252) ha sido depositado en la ATCC el 5
de febrero de 1998 y ha sido asignado el nº de depósito ATCC
209616.
El análisis de la secuencia de aminoácidos del
polipéptido PRO363 de longitud completa sugiere que presenta una
similitud de secuencia significativa con la proteína de superficie
celular HCAR, indicando de esta manera que PRO363 podría ser un
nuevo homólogo de HCAR. Más específicamente, un análisis de la base
de datos Dayhoff (versión 35.45, SwissProt 35) ha puesto de
manifiesto homología significativa entre la secuencia de
aminoácidos de PRO363 y las secuencias de Dayhoff siguientes,
HS46KDA_1, HSU90716_1, MMCARH_1, MMCARHOM_1, MMU90715_1, A33_HUMAN,
P_W14146, P_W14158, A42632 y B42632.
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Ejemplo
4
El procedimiento siguiente describe la
utiliación de una secuencia de nucleótidos codificante de un
polipéptido PRO como sonda de hibridación.
El ADN que comprende la secuencia codificante
para el polipéptido PRO de interés tal como se ha descrito, puede
emplearse como sonda o como material de base para la preparación de
sondas que permitan la búsqueda de ADNs homólogos (como los que
codifican para variantes del polipéptido PRO presentes en la
población natural) en bibliotecas de ADNc de tejido humano o de
bibliotecas genómicas de tejido humano.
La hibridación y el lavado de los filtros que
contienen la biblioteca de ADNs se realizó bajo condiciones de alta
astringencia tal como se detalla a continuación. Una sonda marcada,
derivada del ácido nucleico codificante para el polipéptido PRO, se
hibrida con un filtro en formamida al 50%, SSX 5X, SDS 0,1%, 0,1%
pirofosfato sódico, fosfato sódico 50 mM, pH 6,8, solución de
Denhardts 2X, y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC durante 20 horas.
El lavado de los filtros se realiza en una solución acuosa de SSC
0,1 X y SDS 0,1% a 42ºC.
Los ADN que tienen una identidad de secuencia
deseada con la secuencia nativa codificante para el polipéptido
PRO, puede a continuación ser identificada con técnicas estándares
conocidas en este campo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
El presente ejemplo ilustra la preparación de
una forma no glicosilada de un polipéptido PRO deseado por
expresión recombinante en E. coli.
La secuencia de ADN codificante para el
polipéptido PRO deseado se amplifica inicialmente con los cebadores
de PCR seleccionados. Los cebadores deben contener lugares de
restricción para enzimas que corresponden con los lugares de
restricción presentes en el vector de expresión seleccionado. Pueden
emplearse una variedad de vectores de expresión. Un ejemplo es el
vector disponible pBR322 (derivado de E. coli; ver Bolivar
et al., Gene, 2:95 (1977)), que contiene genes
para la resistencia a la ampicilina y la tetraciclina. Este vector,
se digiere con enzimas de restricción y se desfosforila. Las
secuencias de PCR amplificadas se ligan al vector. El vector
preferentemente incluye secuencias que codifican para un gen de
resistencia a los antibióticos, un promotor trp, un segmentos
poli-His (incluyendo los primeros seis codones STII,
secuencia poli-His, y lugares de digestión por
enteroquinasa), la región codificante para el polipéptido específico
PRO, un terminador transcripcional de lambda y un gen argU.
La mezcla de ligación se utiliza a continuación
para transformar una cepa de E.coli seleccionada con los
procedimientos descritos en Sambrook et al., supra.
Los transformantes se identifican por su habilidad para crecer en
placas de LB y se seleccionan las colonias resistentes a los
antibióticos. El ADN del plásmido puede aislarse y confirmarse por
análisis de restricción y secuenciación.
Los clones seleccionados pueden crecer toda la
noche en medio de cultivo líquido como caldo LB suplementado con
antibióticos. El cultivo de toda una noche puede subsecuentemente
utilizarse para el inóculo de un cultivo a gran escala. A
continuación, se crecen las células hasta la densidad óptica
deseada, tiempo durante el cual se activa el promotor.
Después del cultivo durante algunas horas, las
células se recogen por centrifugación. El precipitado celular
obtenido por centrifugación se solubiliza con varios agentes
conocidos en la materia, y el polipéptido PRO solubilizado puede a
continuación ser purificado con una columna de quelación de metales
en condiciones que permiten la unión fuerte de la proteína.
En la solicitud de patente europea nº
99912321.9, el polipéptido PRO se expresaba en E. coli en
una forma unida a un fragmento poli-His según el
procedimiento que sigue a continuación. El ADN codificante para los
polipéptidos PRO se amplificó primero los cebadores seleccionados
para la PCR. Los cebadores contenían lugares para enzimas de
restricción que corresponden a los lugares de restricción presentes
en el vector de expresión, y otras secuencias útiles que
proporcionan un lugar eficiente de inicio de la traducción,
purificación rápida en una columna de quelación de metales, y
digestión proteolítica con enteroquinasa. Las secuencias
amplificadas por PCR y unidas a secuencias poly-His
se ligaron después con un vector de expresión que se utilizó para
transformar un huésped E. coli derivado de la cepa 52 (W3110
fuhA(tonA) Ion galE
rpoHts(htpRTS)clpP(lacip). Los transformantes
se crecieron primero en LB que contenía 50 mg/ml de carbenicilina a
30ºC con agitación hasta una O.D. de 600 desde 3-5.
Los cultivos se diluyeron entre 50-100 veces en
medio CRPA (preparado por mezcla de 3,57
g(NH_{4})_{2}SO_{4}, 0.71 g de citrato sódico
2H_{2}O, 1.07 g KCl, extracto de levadura de Difco 5.36 g,
Sheffield Hycase SF 5,36 g en 500 ml de agua al mismo tiempo que 110
mM MPOS, PH 7,3, glucosa 0,55% (w/v) y MgSO_{4} 7 mM) y se
crecieron durante 20-30 horas aproximadamente a 30ºC
en agitación. Se tomaron muestras para verificar su expresión por
análisis en SDS-PAGE, y el conjunto del cultivo se
centrifugó y se obtuvo un precipitado celular. El precipitado
celular se congeló hasta su purificación y replegado.
La pasta de E. coli procedente de
fermentaciones de 0.5 a 1 L. (6-10 g de
precipitado), se resuspendió en 10 volúmenes (w/v) de guanidina 7
M, tampón Tris 20 mM, PH 8. Se añadieron sulfito sódico sólido y
tetrationto sódico, para unas concentraciones finales de 0.1 M y
0.01, respectivamente y la solución se dejó en agitación magnética
durante toda la noche a 4ºC. Este paso resulta en desnaturalización
de la proteína, con los residuos cisteínas bloqueados por
sulfitolización. La solución se centrifugó a 40.000 rpm en una
Ultracentrífuga Beckman durante 30 min. El sobrenadante se diluyó
con 3-5 volúmenes de tampón de la columna quelante
de metales (guanidina 6 M, 20 ml Qiagen Ni-NTA
columna quelante de metales equilibrada en el tampón 53. La columna
se lavó con tampón adicional que contenía imidazol 50 mM. Las
fracciones que contenían la proteína deseada se precipitaron y
almacenaron a 4ºC. La concentración de proteína se estimó por su
absorbancia a 280 nm con el coeficiente de extinción calculado en
base a su secuencia de aminoácidos.
Las proteínas se replegaron por dilución de la
muestra lentamente en tampón de replegado preparado fresco que
consistía en: Tris 20 mM, pH 8.6, NaCl 0.3 M, urea 2.5 M, cisteína 5
mM, glicina 20 mM y EDTA 1 mM. Los volúmenes de replegado se
escogieron de manera que la concentración final de la proteína
estuviera entre 50 y 100 microgramos/ml. La solución de replegado
se dejó en agitación magnética cuidadosa durante
12-36 horas a 4ºC. La reacción de replegado se
enfrió por la adición de TFA a una concentración final de 0.4% (pH
de aproximadamente 3). Antes de una purificación ulterior de la
proteína, la solución se filtró a través de un filtro de 0.22
micras y se añadió acetonitrilo hasta una concentración final de
2-10%. La proteína replegada se cromatrografió en
una columna de fase reversa Poros R1/H con un tampón móvil de 0.1%
TFA con elución en un gradiente de acetonitrilo de 10 a 80%.
Alícuotas de fracciones con una absorbancia A280 se analizaron en
geles de poliacrilamida SDS y las fracciones conteniendo proteína
replegada homogénea se precipitaron. En general, las especias
replegadas adecuadamente de la mayoría de las proteínas, se eluyeron
a concentraciones menores de acetonitrilo ya que esas especies son
las más compactas con su hidrofobicidad interior tapada por la
interacción con la resina de fase reversa. Las especies agregadas se
eluyeron habitualmente a altas concentraciones de acetonitrilo.
Además para resolver las formas de proteínas no plegadas
completamente de la forma plegada, el paso de la fase reversa
también extrae la endotoxina de las muestras.
Las fracciones que contenían las proteínas PRO
replegadas deseadas se precipitaron y el acetonitrilo se extrajo
con evaporación de nitrógeno cuidadosamente directamente sobre la
solución. Las proteínas se fomularon en Hepes 20 mM, pH 6.8 cloruro
de sodio 0.14 M y manitol al 4% por diálisis o por filtración en gel
mediante resina Superfina G25 (Pharmacia) equilibrada en el tampón
formulado y filtrado de manera estéril.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
glicosilada de un polipéptido PRO deseado, mediante la expresión
recombinante en células de mamíferos.
El vector pRK5 (ver la EP 307, 247, publicada el
15 de Marzo, 1989), se empleó como vector de expresión. De manera
opcional, el ADN codificante para el polipéptido PRO se ligó a pRK5
con enzimas de restricción seleccionadas para permitir la inserción
del ADN del polipéptido PRO por los procedimientos de ligación
descritos en Sambrook et al., supra. El vector
resultante se denominó pRK5-polipéptido PRO.
En otra realización, las células huéspedes
seleccionadas pueden ser las células 293. Las células 293 humanas
(ATCC CCL 1573) se crecen en confluencia en placas de cultivo de
tejidos en un medio tal como DMEM suplementado con suero bovino
fetal y opcionalmente con componentes nutritivos y/o antibióticos.
Unos 10 \mug de ADN de pRK5-polipéptido PRO se
mezclan con 1 \mug de ADN codificante para el gen VA ARN
[Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)] y se disuelven en
500 \mul de Tris-HCl 1 mM, 0,1 mM EDTA, 0,227 M
CaCl_{2}. A esta mezcla se añaden, en gotas, 500 \mul de HEPES
50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, 1,5 mM NaPO_{4} y se deja progresar
un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se
resuspende y se añade a las células 293 dejándose durante cuatro
horas a 37ºC. El medio de cultivo se aspira y se añaden 2 ml de
glicerol al 20% en PBS durante 30 segundos. Las células 293 se
lavan con medio de cultivo libre de suero, se añade medio fresco y
las células se incuban durante 5 días.
Aproximadamente 24 horas después de las
transfecciones, el medio de cultivo se extrae y se substituye por
medio de cultivo solo o por medio que contiene 200
\muCi/ml^{35}S-cisteína y 200
\muCi/ml^{35}S-metionina. Después de 12 horas
de incubación, el medio condicionante se recoge, concentra en un
filtro en centrifugación, y se carga en un gel de SDS 15%. El gel
procesado se seca y se expone por un período de tiempo que permita
revelar la presencia del polipéptido PRO. Los cultivos que contienen
las células transfectadas pueden someterse a una incubación
adicional (en medio libre de suero), analizándose el medio en
bioensayos seleccionados.
En una técnica alternativa, el polipéptido PRO
puede introducirse en las células 293 de forma transitoria
utilizando el procedimiento del dextrano de sulfato descrito por
Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981).
Las células 293 se crecen a una densidad máxima en un frasco de
cultivo centrifugador y se añaden 700 \mug de ADN de
pRK5-polipéptido PRO. Las células se concentran en
el frasco centrifugador y se lavan con PBS. El precipitado de
ADN-dextrano se incuba con el sedimento celular
durante cuatro horas. Las células se tratan a continuación con
glicerol al 20% durante 90 segundos, se lavan con el medio de
cultivo de tejidos y se re-introducen en el frasco
centrifugador que contiene medio de cultivo, 5 \mug/ml de insulina
bovina y 0,1 \mug/ml de transferrina bovina. Al cabo de cuatro
días, el medio condicionado se centrifuga y se filtra para eliminar
las células y los restos celulares. La muestra que contenía el
polipéptido PRO puede entonces concentrarse y purificarse mediante
cualquier procedimiento, como la diálisis y/o la cromatografía por
columna.
En otra realización, los polipéptidos PRO pueden
expresarse en células CHO. El ADN de
pRK5-polipéptido PRO puede transfectarse en células
CHO utilizando reactivos como el CaPO_{4} o el
dextrano-DEAE. Tal como se describió más arriba,
los cultivos celulares pueden incubarse y el medio reemplazarse con
medio de cultivo (solo) o con medio que contenga un marcador
radioactivo como la metionina-S^{35}. Después de
determinar la presencia del polipéptido PRO, el medio de cultivo
puede reemplazarse con medio sin suero. Preferentemente, los
cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días y luego se
cosecha el medio condicionado. El medio que contenía el polipéptido
PRO expresado pueden a continuación concentrarse y purificarse
mediante cualquier procedimiento seleccionado.
El polipéptido PRO etiquetado epitópicamente
también puede expresarse en células huésped CHO. El polipéptido PRO
puede subclonarse en otro vector distinto al pRK5. A continuación,
mediante PCR se fusiona en la misma pauta de lectura el inserto del
subclón con una etiqueta epitópicamente seleccionada como un
poli-his en el vector de expresión en Baculovirus.
El inserto polipéptido PRO-etiquetado con
poli-His se subclona a continuación en un vector
dirigido de SV40 que contiene un marcador de selección como el DHFR
para la selección de clones estables. Por último, las células CHO
se pueden transfectar (tal como se describió anteriormente) con el
vector dirigido por SV40. El marcaje se puede realizar, tal como se
describió anteriormente, para verificar la expresión. El medio de
cultivo que contenía el polipéptido PRO etiquetado con
poli-His se concentra a continuación y se purifica
mediante cualquier procedimiento seleccionado, como por ejemplo la
cromatografía de afinidad con
Ni^{2+}-quelato.
La expresión estable en células CHO se realiza
utilizando el procedimiento siguiente. Las proteínas se expresaron
como una construcción IgG (inmunoadhesina), en la que las secuencias
codificantes de la forma soluble (por ejemplo, dominios
extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionan con una
región constante de IgGI que contenga la bisagra, los dominios CH2
y CH3 y/o una forma etiquetada con un poli-His.
Después de la amplificación, los ADNs
respectivos se subclonan en un vector de expresión en CHO utilizando
técnicas estándares, tal como se describió en Ausubel et
al., Current Protocols of Molecular Biology, Unidad 3.16, John
Wiley y Sons (1997). Se construyeron vectores de expresión en CHO
con dianas de restricción compatibles en 5' y 3' del ADN de interés
para permitir el barajamiento adecuado de los ADNcs. El vector
utilizado para la expresión en CHO se describe por Lucas et
al., Nucl. Acids. Res. 24:9 (1774-1779, (1996))
y utiliza el intensificador de la transcripción del promotor
temprano de SV40 para dirigir la expresión del ADNc de interés y la
dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresión de DHFR permite la
selección para el mantenimiento estable del plásmido tras la
transfección.
Se introdujeron 12 \mug del ADN plasmídico
deseado en aproximadamente 10 millones de células CHO utilizando
reactivos de transfección disponibles comercialmente Superfect®
(Quiagen), Dosper® o Fugene® (Boehringer Mannheim). Las células se
crecieron tal como se describe en Lucas et al., supra.
Aproximadamente, 3x10^{7} células se congelaron en una ampolla
para el posterior crecimiento producción tal como se describe más
adelante.
Las ampollas que contenían el ADN del plásmido
se descongelaron colocándolas en un baño y se mezclaron con el
vórtex. Los contenidos se pipetearon en un tubo de centrífuga que
contenía 10 ml de medio y se centrifugaron a 1000 rpm durante 5
minutos. El sobrenadante se aspiró y las células se resuspendieron
en 10 ml de medio selectivo (filtrado con un filtro PS20 de 0,2
\mum con suero bovino fetal al 5% filtrado con un filtro de 0,2
\mum). Las células se alicuotaron en tubos de centrifugación de
100 ml que contenían 90 ml de medio selectivo. Al cabo de
1-2 días, las células se transfirieron a un frasco
de 250 ml que se rellenó con 150 ml de medio selectivo y se incubó
a 37ºC. Al cabo de 2-3 días, se sembraron frascos de
cultivo centrifugadores de 250, 500 y 2000 ml con 3x10^{5}
células/ml. El medio celular se cambió por medio fresco mediante
centrifugación y resuspensión en medio de producción. Aunque puede
utilizarse cualquier tipo de medio para CHO, se utilizó un medio de
producción descrito en la patente US 5.122.469, publicada el 16 de
junio de 1992. Un frasco de cultivo centrifugador de 3 l se sembró
con 1,2 x10^{6} células/ml. El día 0, se determinó el número de
células y el pH. El día 1, se obtuvo una muestra del cultivo y se
inició la introducción de aire filtrado. El día 2, se obtuvo una
muestra del cultivo, la temperatura se desplazó a 33ºC, y se
añadieron 30 ml de una solución de glucosa 500 g/l y 0,6 ml de
antiespumante al 10% (por ejemplo, emulsión de polidimetilsiloxano
al 35%, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion). Durante la
producción, se ajustó el pH para mantenerlo a aproximadamente 7,2.
Al cabo de 10 días, o hasta que la viabilidad descendiera por debajo
del 70%, el cultivo celular se cosechó mediante centrifugación y se
filtró con un filtro de 0,22 \mum. El filtrado se guardó a 4ºC o
se cargó inmediatamente en columnas para su purificación.
Para las construcciones etiquetadas con
poli-His, las proteínas se purificaron utilizando
una columna Ni-NTA (Quiagen). Después de la
purificación, se añadió imidazol al medio condicionado a una
concentración de 5 mM. El medio condicionado se pasó por una
columna de 6 ml N9-NTA equilibrada con Hepes 20 mM,
pH 7,4, tampón que contenía NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a una
velocidad de flujo de 4-5 ml/min a 4ºC. Después del
cargado, la columna se lavó con tampón de equilibrado adicional y
la proteína se eluyó con tampón de equilibrado que contenía
imidazol 0,25 mM. La proteína altamente purificada se desaló a
continuación en un tampón de almacenamiento que contenía Hepes 10
mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna G25
Superfine de 25 ml de Pharmacia y se guardó a -80ºC.
Las construcciones de inmunoadhesina (que
contienen Fc) se purificaron del medio condicionado de la manera
siguiente. El medio condicionado se cargó en una columna de Proteína
A de 5 ml (Pharmacia) que se había equilibrado con tampón fosfato
Na 20 mM, pH 6,8. Después de cargarse, la columna se lavó
extensamente con tampón de equilibrio antes de la elución con ácido
cítrico, pH 3,5. La proteína eluída se neutralizó inmediatamente
recogiendo alícuotas de 1 ml en tubos que contenían 275 \mul de
tampón Tris 1 M, pH 9. A continuación, se desaló la proteína
altamente neutralizada en tampón de almacenamiento, tal como se
describió anteriormente para las proteínas etiquetadas
poli-His. La homogeneidad se valoró en geles de
acrilamida-SDS y por secuenciación
N-terminal mediante degradación de Edman.
Los siguientes polipéptidos PRO se expresaron en
células CHO transitoriamente:
- PRO363.
Los polipéptidos PRO siguientes se expresaron de
forma estable en células COS:
- PRO363.
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Los polipéptidos PRO siguientes se expresaron
establemente con éxito en células CHO:
- PRO363.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
El procedimiento siguiente describe la expresión
recombinante de un polipéptido PRO deseado en levaduras.
En primer lugar, los vectores de expresión en
levaduras se construyeron para la producción o la secreción
intracelular de polipéptidos PRO a partir de un promotor ADH2/GAPDH.
El DNA que codifica un polipéptido PRO deseado, una secuencia de
péptido señal y el promotor se insertaron en dianas de restricción
adecuadas en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión
intracelular del polipéptido PRO. El DNA que codifica el
polipéptido PRO puede clonarse en el plásmido seleccionado, junto
con el DNA que codifica el promotor ADH2/GAPDH, la secuencia
líder/señal secretora del factor alfa de levaduras y las secuencias
engarces (si fuera necesario) para la expresión del polipéptido
PRO.
Las células de levaduras, tal como la cepa de
levadura AB110, pueden transformarse a continuación con los
plásmidos de expresión descritos anteriormente y cultivarse en
medios de fermentación seleccionados. Los sobrenadantes de
levaduras transformadas pueden analizarse mediante precipitación con
ácido tricloroacético al 10% y separarse mediante
SDS-PAGE, seguido de la tinción de los geles con
Coomassie azul.
El polipéptido PRO recombinantes puede aislarse
a continuación y purificarse eliminando las células de levadura del
medio de fermentación mediante centrifugación y luego concentrar el
medio utilizando cartuchos de filtros seleccionados. El concentrado
que contiene el polipéptido PRO puede purificarse posteriormente
utilizando columnas de resinas cromatográficas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
El procedimiento siguiente describe la expresión
recombinante de polipéptidos PRO en células de insecto infectadas
por baculovirus.
El polipéptido PRO deseado se fusiona cadena
arriba de una etiqueta epitópica en un vector de expresión de
baculovirus. Dicha etiqueta epitópica incluye las etiquetas
poli-his y las etiquetas de inmunoglobulinas (como
las regiones Fc de IgG). Se pueden utilizar diversos plásmidos,
incluyendo plásmidos derivados de los comercialmente disponibles
como el pVL1393 (Novagen). En resumen, el polipéptido PRO o la
porción deseada del polipéptido PRO (como la secuencia codificante
del dominio extracelular de una proteína transmembrana) se
amplifica mediante PCR con cebadores complementarios en las regiones
5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar dianas de restricción
enzimática. El producto se digiere a continuación con las enzimas de
restricción seleccionadas y se subclonan en el vector de
expresión.
El baculovirus recombinante se genera mediante
co-transfección del plásmido anterior y el ADN del
virus
BaculoGold^{TM} (Pharmigen) en células Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) con lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Al cabo de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se cosechan y utilizan para amplificaciones posteriores. La infección viral y la expresión de proteínas se realizan tal como se describe en O'Reilly et al., Baculovirus expression vectors: A laboratory manual, Oxford Universtiy Press (1994).
BaculoGold^{TM} (Pharmigen) en células Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) con lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Al cabo de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se cosechan y utilizan para amplificaciones posteriores. La infección viral y la expresión de proteínas se realizan tal como se describe en O'Reilly et al., Baculovirus expression vectors: A laboratory manual, Oxford Universtiy Press (1994).
Luego, se purifica el polipéptido
PRO-etiquetado con poli-His
expresado, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad con
quelato-Ni-^{2+} de la manera
siguiente. Se preparan los extractos de las células Sf9 infectadas
con virus recombinantes, tal como se describe por Rupert et
al., Nature, 362:175-179 (1993). En resumen,
las células Sf9 se lavan, se resuspenden en tampón de sonicación (25
ml de Hepes, pH 79; MgCl2 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; glicerol al 10%,
EDTA 0,1 mM; glicerol al 10%; NP-40 al 0,1%; KCl 0,4
M) y se sonican dos veces durante 20 s en hielo. Los sonicados se
aclaran mediante centrifugación y a continuación se diluye el
sobrenadante 50 veces en tampón de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300
mM, glicerol al 10%, pH 7,8) y se filtra a través de un filtro de
0,45 \mum. Se prepara una columna de agarosa
Ni^{2+}-NTA (disponible comercialmente de Quiagen)
con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua y se
equilibra con 25 ml de tampón de carga. El extracto celular
filtrado se carga en la columna a una velocidad de flujo de 0,5 ml
por minuto. La columna se lava hasta alcanzar una A_{280} basal
con tampón de carga, en dicho punto la fracción se inicia la
recolecta de fracciones. A continuación, la columna se lava con un
tampón de lavado secundario (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol
al 10%, pH 6,0), que eluye específicamente la proteína unida.
Después de alcanzar de nuevo la A_{280} basal, se hace pasar por
la columna un gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en el tampón de
lavado secundario. Se recogen fracciones de 1 ml y se analizan por
SDS-PAGE y tinción con plata o transferencia de
western con Ni^{2+}-NTA conjugado con fosfatasa
alcalina (Qiagen). Las fracciones que contenían el polipéptido PRO
etiquetado con His-10 se recogen, agrupan y se
dializan contra tampón de carga.
Alternativamente, la purificación del
polipéptido PRO etiquetado con IgG (o etiquetado con Fc) puede
llevarse a cabo utilizando técnicas de cromatografía conocidas,
incluyendo, por ejemplo, cromatografía de columna de proteína A o
de proteína G. Se expresó con éxito PRO363 en células de insecto Sf9
infectadas por baculovirus. Aunque la expresión de hecho se llevó a
cabo a una escala de 0,5 a 2 litros, puede escalarse con facilidad
para preparaciones más grandes (por ejemplo de 8 litros). Las
proteínas se expresaron en forma de un constructo de IgG
(inmunoadhesina) en el que la región extracelular de la proteína se
fusionó con una secuencia de región constante de IgG1 que contenía
los dominios bisagra CH2 y CH3 y/o en formas etiquetadas con
poli-His.
Para la expresión en células Sf9 en baculovirus,
después de la amplificación por PCR, las secuencias codificantes
respectivas en el vector de expresión de baculovirus (pb.PH.IgG para
fusiones proteicas con IgG y pb.PH.His.c para fusiones proteicas
etiquetadas con poli-His) y el vector y el DNA del
baculovirus Baculogold® (Pharmigen) se cotransfectaron en 10^{5}
células de Spodoptera frugiperda (Sf9) (ATCC CRL 1711), utilizando
Lipofectin (Gibco BRL). Los plásmidos pb.PH.His y pb.PH.IgG son
modificaciones del vector pVL1393, vector de expresión de
baculovirus ampliamente disponible comercialmente (Pharmigen), con
regiones poliengarce modificadas para incluir las secuencias
etiquetas His o Fc. Las células se crecieron en medio Hink
TNM-FH suplementado con FBS al 10% (Hyclone). Las
células se incubaron durante 5 días a 28ºC. El sobrenadante se
cosechó y se utilizó para la amplificación viral infectando células
Sf9 en medio Hink TNM-FH suplementado con FBS al 10%
a una multiplicidad de infección (MOI) de 10. Las células se
incubaron durante 30 días a 28ºC. El sobrenadante se cosechó y la
expresión de las construcciones en el vector de expresión de
baculovirus se determinó mediante unión del lote de 1 ml de
sobrenadante con 25 ml de bolas de Ni-NTA (Qiagen)
para las proteínas etiquetadas con histidina o bolas de
Proteína-A Sepharose CL-4B
(Pharmacia) para proteínas etiquetadas con IgG seguido por el
análisis de SDS-PAGE, comparándolo con una
concentración conocida de una proteína estándar teñida con de azul
de Coomassie.
El sobrenadante de la primera amplificación
viral se utilizó para infectar un cultivo en frascos centrifugadores
(500 ml) de células Sf9 crecidas en medio ESF-921
(Sistemas de expresión LLC) a una MOI aproximada de 0,1. Las
células se incubaron durante 3 días a 28ºC. El sobrenadante se
cosechó y filtró. Se repitieron los análisis de unión de lote y de
SDS-PAGE, tantas veces como fue necesario, hasta
confirmar la expresión de cultivo.
El medio condicionado de las células
transfectadas (0,5 a 3 l) se cosechó mediante centrifugación para
eliminar las células y se filtró con un filtros de 0,22 \mum. Para
las construcciones etiquetadas con poli-His, la
proteína se purificó con una columna Ni-NTA
(Qiagen). Antes de la purificación, se añadió imidazol al medio
condicionado a una concentración de 5 mM. El medio condicionado se
bombeó en una columna Ni-NTA de 6 ml equilibrada
con Hepes 20 mM, pH 7,4, y un tampón que contenía NaCl 0,3 M e
imidazol 5 mM a una velocidad de flujo de 4-5
ml/min a 4ºC. Después de cargar, la columna se lavó con tampón de
equilibrio adicional y se eluyó la proteína con el tampón de
equilibrio que contenía imidazol 0,25M. La proteína altamente
purificada se desaló a continuación en un tampón de almacenamiento
con Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8, con una
columna G25 Superfine de 25 ml (Pharmacia) y se almacenó a
-80ºC.
Las construcciones de inmunoadhesina (que
contenían Fc) de proteínas se purificaron del medio condicionado de
la manera siguiente. El medio condicionado se hizo pasara por una
columna de Proteína A de 5 ml (Pharmacia) que se había equilibrado
en tampón fosfato Na 20 mM, pH 6,8. Después de cargar, la columna se
lavó extensamente con el tampón de equilibrio antes de la elución
con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluída se neutralizó
inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en los tubos con 275 ml
de tampón Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada se
desaló en tampón de almacenamiento tal como se describió para las
proteínas etiquetadas con poli-His. Se verificó la
homogeneidad de las proteínas mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida (PEG) y secuenciación aminoacídica
N-terminal mediante degradación de Edman.
Se expresó con éxito PRO363 en células de
insecto Hi5 infectadas por baculovirus. Aunque la expresión de
hecho se llevó a cabo a una escala de 0,5 a 2 litros, puede
escalarse con facilidad para preparaciones más grandes (por ejemplo
de 8 litros).
Para la expresión de células de insecto Hi5
infectadas con baculovirus, el DNA codificante del polipéptido PRO
se puede amplificar con sistemas adecuados, como la Pfu
(Stratagene), o fusionarse cadena arriba (5' de) de etiqueta
epitópica contenida en un vector de expresión de baculovirus. Dichas
etiquetas epitópicas incluyen las etiquetas
poli-his y las etiquetas de inmunoglobulina (como
las regiones Fc de IgG). Se pueden utilizar diversos plásmidos,
incluyendo los derivados de plásmidos disponibles comercialmente
como el pVL1393 (Novagen). En resumen, el polipéptido PRO o la
porción deseada del polipéptido PRO (como la secuencia codificante
del dominio extracelular de una proteína transmembrana) se
amplifica mediante PCR con los cebadores complementarios con las
regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar dianas de enzimas
de restricción flanqueantes (seleccionadas). A continuación, se
digiere el producto con las enzimas de restricción seleccionadas y
se subclona en el vector de expresión. Por ejemplo, los derivados
de pVL1393 pueden incluir la región Fc de la IgG humana (pb.PH.IgG)
o una etiqueta histidina (pb.PH.His) cadena abajo (3' de) de la
secuencia NOMBRE. Preferentemente, la construcción del vector se
secuencia para su verificación.
Se cultivaron células Hi5 hasta una confluencia
del 50% bajo las condiciones siguientes: 27ºC, sin CO_{2} y sin
penicilina/estreptomicina. Para cada placa de 150 mm, 30 \mug del
vector derivado de pIE que contiene el polipéptido PRO se mezcla
con 1 ml de medio Ex-Cell (Medio:
Ex-Cell + 1/100 L-Glu JRH
Biosciences # 14401-78P (nota: este medio es
sensible a la luz), y en un tubo separado, 100 \mul de CellFectin
(CellFECTIN (GibcoBRL #10362-010) (agitar con ayuda
del vórtex hasta mezclado completo)), se mezclan con 1 ml de medio
Ex-Cell. Las dos soluciones se combinan y se incuban
durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añaden 8 ml de medio
ExCell a 2 ml de la mezcla de ADN/CellFECTIN y todo ello se dispone
sobre las células Hi5 previamente lavadas una vez con medio ExCell.
La placa se incuba en la oscuridad durante 1 hora a temperatura
ambiente. La mezcla de ADN/CellFECTIN se aspira, y las células se
lavan una vez con ExCell para eliminar el exceso de CellFECTIN. Se
añaden 30 ml de medio ExCell fresco y las células se incuban durante
3 días a 28ºC. El sobrenadante se cosecha y la expresión del
polipéptido PRO en el vector de expresión de baculovirus puede
determinarse mediante ensayos de unión de lote de 1 ml de
sobrenadante con 25 ml de bolas de Ni-NTA (Qiagen)
para las proteínas etiquetadas con histidina o bolas Proteína
A-Sepharose CL4B (Pharmacia) para proteínas
etiquetadas con IgG, seguido del análisis de
SDS-PAGE comparándolo con una concentración conocida
de una proteína estándar por tinción de azul de Coomassie.
El medio condicionado de las células
transfectadas (0,5 a 3 l) se cosechó mediante centrifugación para
eliminar las células y se filtró a través de un filtro de 0,22
\mum. Para las construcciones etiquetadas con
poli-His, la proteína que comprende el polipéptido
PRO se purifica utilizando una columna de Ni-NTA
(Qiagen). Antes de la purificación, se añade imidazol al medio
condicionado a una concentración de 5 mM. El medio condicionado se
bombea a la columna de nI-NTA de 6 ml equilibrada
con Hepes 20 mM, pH 7,4, tampón que contiene NaCl 0,3 M e imidazol
5 mM a una velocidad de flujo de 4-5 ml/min, a 4ºC.
Después de cargar, la columna se lava con tampón de equilibrio
adicional y se eluye la proteína con el mismo tampón que contiene
imidazol 0,25 M. La proteína altamente purificada se desala a
continuación en un tampón de almacenamiento que contiene Hepes 10
mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna de G25
Superfine de 25 ml (Pharmacia) y se almacena a -80ºC.
Las construcciones de inmunoadhesina (que
contienen Fc) de proteínas se purifican del medio condicionado de
la manera siguiente. El medio condicionado se bombea en una columna
de Proteína A de 5 ml (Pharmacia) que ha sido equilibrada con
tampón fosfato Na 20 mM, pH 6,8. Después de la carga, la columna se
lava extensamente con tampón de equilibrio antes de la elución con
ácido cítrico 100 mM, pH 5,3. La proteína eluída se neutraliza
inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contienen
275 ml de tampón Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada
se desala a continuación en tampón de almacenamiento tal como se
describió anteriormente para las proteínas etiquetadas con
poli-His. La homogeneidad del polipéptido PRO se
puede valorar mediante geles de poliacrilamida-SDS
y secuenciación aminoacídica N-terminal por
degradación de Edman y otros procedimientos analíticos, según se
requiera.
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Ejemplo
9
Este ejemplo muestra la preparación de
anticuerpos monoclonales que se pueden unir específicamente a un
polipéptido PRO.
Las técnicas para la producción de anticuerpos
monoclonales son conocidas en la materia y se describen, por
ejemplo, en Goding, supra. Los inmunoagentes que pueden
utilizarse incluyen el polipéptido PRO purificado, las proteínas de
fusión que contienen el polipéptido PRO y las células que expresan
el polipéptido PRO recombinante en la superficie celular. La
selección del inmunógeno puede realizarse por el experto en la
materia sin excesiva experimentación.
Se inmunizaron ratones Balb/c con el inmunógeno
polipéptido PRO emulsionado en adyuvante completo de Freund y se
inyectaron subcutáneamente o intraperitonealmente en una cantidad de
1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunógeno
se emulsionó en adyuvante MPL-TDM (Ribi
Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyectó en las
almohadillas de las patas traseras del animal. Los ratones
inmunizados se estimularon a continuación 10 a 12 días más tarde
con inmunógeno adicional emulsionado con adyuvante seleccionado.
Durante varias semanas después, también podían estimularse los
ratones con inyecciones de inmunización adicionales. Se obtuvieron
muestras de suero periódicamente de los ratones mediante sangrado
retro-orbital para analizar en ensayos ELISA para
detectar los anticuerpos anti-polipéptido PRO.
Después de haber detectado un anticuerpo
adecuado, los animales "positivos" para los anticuerpos pueden
ser inyectados con una inyección intravenosa de polipéptido PRO. De
tres a cuatro días más tarde, los ratones se sacrifican y se
obtienen las células del bazo. Las células del bazo se fusionan
(utilizando polietilén glicol al 35%) a una línea celular de
mieloma murino seleccionada, como por ejemplo P3X63AgU.1, disponible
del ATCC, CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que
pueden sembrarse en placas de cultivo de 96 pocillos con medio HAT
(hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación
de células no-fusionadas, híbridos de mieloma e
híbridos de células del bazo.
Las células de hibridomas se rastrearán en un
ensayo ELISA por su reactividad contra el polipéptido PRO. La
determinación de células de hibridoma "positivas" secretoras de
anticuerpos monoclonales deseados contra el polipéptido PRO se
halla dentro del ámbito de la materia.
Las células de hibridoma positivas pueden
inyectarse intraperitonealmente en ratones Balb/c para producir
ascitas que contengan anticuerpos anti-polipéptido
PRO. Alternativamente, las células de hibridoma pueden crecerse en
frascos de cultivo o botellas de cultivo giratorias. La purificación
de los anticuerpos monoclonales producidos en las ascitas puede
lograrse utilizando la precipitación con sulfato amónico, seguido de
cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, se puede
utilizar la cromatografía de afinidad mediante la unión del
anticuerpo a la proteína A o la proteína G.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Los polipéptidos PRO pueden expresarse como
proteínas quiméricas con uno o más dominios polipeptídicos
adicionales añadidos para facilitar la purificación de la proteína.
Dichos dominios facilitadores de la purificación incluyen, pero no
se limitan a, péptidos queladores de metales como los módulos
histidina-triptófano que permiten la purificación
sobre metales inmovilizados, los dominios de proteína A que permiten
la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada y el dominio
utilizado en el sistema de purificación por extensión/afinidad
FLAGS^{TM} (Immunex Corp., Seattle Wash.). La inclusión de una
secuencia de línker escindible como el Factor Xa o la enteroquinasa
(Invitrogen, San Diego Calif) entre el dominio de purificación y se
secuencia del polipéptido PRO puede ser de utilidad para facilitar
la expresión del ADN codificante del polipéptido PRO.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
Los polipéptidos PRO nativos o recombinantes
pueden purificarse mediante diversas técnicas estándares en la
materia relativas a la purificación de proteínas. Por ejemplo, el
pro-polipéptido PRO, el polipéptido PRO o el
pre-polipéptido PRO se purifican mediante
cromatografía de inmunoafinidad utilizando anticuerpos específicos
para el polipéptido PRO de interés. En general, una columna de
inmunoafinidad se construye mediante acoplamiento covalente del
anticuerpo anti-polipéptido PRO con una resina
cromatográfica activada.
Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a
partir del suero bien mediante precipitación con sulfato amónico o
mediante purificación sobre Proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB
Biotechnology, Piscataway, N.J.). Al igual que los anticuerpos
monoclonales se preparan de ascitas de ratones mediante
precipitación con persulfato amónico o cromatografía sobre Proteína
A inmovilizada. La inmunoglobulina parcialmente purificada se une
covalentemente a una resina cromatográfica como la SEPHAROSE^{TM}
activada por CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo se
acopla a la resina, la resina se bloquea y la resina derivada se
lava de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Se utiliza una columna de inmunoafinidad de
dicho tipo en la purificación del polipéptido PRO mediante
preparación de una fracción de células que contienen el polipéptido
PRO en una forma soluble. Esta preparación se deriva por
solubilización de las células completas o de una fracción subcelular
obtenida mediante centrifugación diferencial con adición de
detergente o por otros procedimientos bien conocidos en la materia.
Alternativamente, el polipéptido PRO contiene una secuencia señal
que puede secretarse en cantidad útil en el medio donde crecen las
células.
Una preparación que contiene el polipéptido PRO
soluble se pasa por la columna de afinidad, a continuación se lava
la columna en condiciones que permiten la absorbancia preferencial
del polipéptido PRO (por ejemplo, tampones de alta fuerza iónica en
presencia de detergente). A continuación, la columna se eluye en
condiciones tales que se rompe la unión anticuerpo/polipéptido PRO
(por ejemplo, un tampón con pH bajo de aproximadamente pH
2-3, o una concentración elevada de un agente
caotrópico como la urea o el ión tiocianato) y por último se recoge
el polipéptido PRO.
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Ejemplo
12
La invención es particularmente útil para el
cribado de compuestos utilizando polipéptidos PRO o mediante la
unión a un fragmento de éste con cualquiera de las técnicas de
búsqueda de fármacos. El polipéptido PRO o un fragmento de éste que
se utilice en dicho análisis puede hallarse en libre en solución,
fijado a un soporte sólido, adherido a la superficie celular o
localizado intracelularmente. Un procedimiento de cribado de
fármacos utiliza células eucariotas o procariotas que se
transforman establemente con los ácidos nucleicos recombinantes y
expresan el polipéptido PRO o sus fragmentos. Los fármacos se
seleccionan frente a dichas células transformadas en ensayos de
unión competitiva. Dichas células, bien en la forma viable o fija,
pueden utilizarse para ensayos de unión estándar. Se puede
cuantificar por ejemplo, la formación de complejos entre el
polipéptido PRO o un fragmento y el agente que se analiza.
Alternativamente, se puede examinar la disminución de la formación
del complejo entre el polipéptido PRO y su célula diana o sus
receptores diana que está causada pro el agente que se analiza.
En consecuencia, la presente invención
proporciona procedimientos de cribado de fármacos o cualquier otro
agente que pueda afectar a la enfermedad o trastorno asociado con el
polipéptido PRO. Estos procedimientos comprenden el contacto con
uno de dichos agentes que contengan el polipéptido PRO o un
fragmento de éste y el análisis de (i) la presencia de un complejo
entre el agente y el polipéptido PRO o su fragmento, o (ii) la
presencia de un complejo entre el polipéptido PRO o un fragmento de
éste y la célula, mediante procedimientos bien conocidos en la
materia. En dichos ensayos de unión competitiva, el polipéptido PRO
o un fragmento de éste se marca de modo característico. Después de
una incubación adecuada, el polipéptido PRO libre o un fragmento de
éste se separa de la forma unida y la cantidad de libre o de marcaje
no presente en el complejo es una medida de la capacidad del agente
determinado para unirse al polipéptido PRO o para interferir con el
complejo polipéptido PRO/célula.
Otra técnica para el cribado de fármacos
proporciona una selección de alto rendimiento para compuestos con
afinidad de unión adecuada por un polipéptido y se describe con
detalle en la patente internacional WO 84/03564, publicada el 13 de
septiembre de 1984. En resumen, grandes cantidades de compuestos de
pequeños péptidos distintos a analizar se sintetizan sobre un
sustrato sólido, como puntas o cualquier otra superficie. Tal como
se aplica para un polipéptido PRO, los compuestos peptídicos a
analizar se hacen reaccionar con el polipéptido PRO y se lavan. El
polipéptido PRO unido se detecta mediante procedimientos bien
conocidos en la materia. El polipéptido PRO purificado también
puede servir como recubrimientos de placas para utilizar en las
técnicas de cribado de fármacos mencionadas anteriormente. Además,
se pueden utilizar anticuerpos neutralizantes para capturar el
péptido e inmovilizarlo sobre el soporte sólido.
La presente invención también contempla la
utilización de ensayos de cribado competitivo de fármacos en los
que los anticuerpos neutralizantes capaces de unirse al polipéptido
PRO compiten específicamente con un compuesto de ensayo por la
unión con el polipéptido PRO o con fragmentos del mismo. De esta
manera, pueden utilizarse anticuerpos para detectar la presencia de
cualquier péptido que comparta uno o más determinantes antigénicos
con el polipéptido PRO.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
13
El objetivo del diseño racional de fármacos es
producir análogos estructurales del polipéptido activo
biológicamente de interés (es decir, un polipéptido PRO) o de
moléculas pequeñas con las que interaccionan, por ejemplo, los
agonistas, antagonistas o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos
puede utilizarse para generar fármacos que sean formas más activas
o estables del polipéptido PRO o que intensifiquen o interfieran
con la función del polipéptido PRO in vivo (Hodgson,
Bio/Technology, 9:19-21 (1991)).
En una aproximación, la estructura
tridimensional del polipéptido PRO, o de un complejo inhibidor del
polipéptido PRO, se determina mediante cristalografía de rayos X,
mediante modelado informático o, de forma más característica,
mediante una combinación de dos aproximaciones. Es necesario conocer
tanto la forma como las cargas del polipéptido PRO para comprender
la estructura y determinar los sitios activos de la molécula.
Aunque a veces, pero no muy frecuentemente, se puede obtener
información útil sobre la estructura del polipéptido PRO mediante
modelado basado en la estructura de proteínas homólogas. En ambos
casos, la información estructural relevante se utiliza para diseñar
moléculas de tipo polipéptido-PRO análogas o para
identificar inhibidores eficientes. Ejemplos útiles del diseño
racional de fármacos puede incluir moléculas con una actividad
mejorada o estabilidad, tal como se muestra por Braxton y Wells,
Biochemistry, 31:7796-7801 (1992) o que actúan como
inhibidores, o antagonistas de péptidos nativos tal como se muestra
por Athauda et al., J. Biochem., 113:742-746
(1993).
También es posible aislar un anticuerpo
específico de una diana, seleccionado mediante ensayo funcional,
tal como se describió anteriormente y a continuación resolver su
estructura cristalina. Esta aproximación, en principio, produce un
núcleo del fármaco, o farmacore, sobre el cual se pueden diseñar
otros fármacos. Es posible evitar la cristalografía de proteínas
generando anticuerpos anti-idiotipos
(anti-ids) contra una anticuerpo funcional, activo
farmacológicamente. Como una imagen en espejo de una imagen en el
espejo, el sitio de unión de los anti-ids se
esperaría que fuera un análogo del receptor original. El
anti-id podría utilizarse para identificar y aislar
péptidos a partir de bancos de péptidos producidos química o
biológicamente. Los péptidos aislados actuarían a continuación como
el farmacore.
En virtud de la presente invención, se pueden
obtener cantidades suficientes del polipéptido PRO para realizar
dichos estudios analíticos como la cristalografía por rayos X.
Además, el conocimiento de la secuencia de aminoácidos del
polipéptido PRO que se proporciona en la presente invención
facilitará una guía par los que utilicen técnicas de modelado
informático en lugar de o además de la cristalografía por rayos
X.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
14
En un esfuerzo por identificar los polipéptidos
PRO que actúan como potentes mitógenos para células de soporte del
oído interno que son progenitoras de células pilosas (relacionadas
con la regeneración de células pilosas auditivas), se sometieron a
ensayo diversos polipéptidos PRO en el ensayo siguiente.
Se prepararon alícuotas de la línea celular de
epitelio utricular de rata (células UEC-4) y se
introdujeron en placas de 96 pocillos a una densidad de 3.000
células/pocillo en 200 \mul de medio que contenía suero a 33ºC.
Tras reposar durante la noche, los cultivos se pasaron a medio libre
de suero a 37ºC y se añadieron las muestras de polipéptido PRO en
diversas diluciones. Tras una incubación de 24 horas, se añadió
^{3}H-timidina (1 \muCi/pocillo) a los cultivos
durante 24 horas adicionales. A continuación, se recolectaron las
células utilizando un recolector de células Tomtec. Debido a que
las células epiteliales se cultivan sobre un sustrato de
polilisina, se añadió tripsina (1 mg/ml) a los pocillos de cultivo
durante 30 minutos a 37ºC para levantar las células antes de la
recolección de células. Se contaron las CPM/pocillo con un contador
de gas matrix 9600 (Packard Instrument Company, Downers Grove, IL).
Se recogieron los datos de 3 pocillos de cultivo de cada uno de los
grupos experimentales y se expresaron como media \pm SEMN. Se
utilizó una prueba t no apareada de dos colar para los análisis
estadísticos, comparando con el grupo de control (tratamiento con
TGF-\alpha).
Los recuentos medios de CPM por lo menos 30%
superiores a los valores de control se consideran positivos para el
ensayo. Los polipéptidos PRO siguientes fueron positivos en este
ensayo: PRO363.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
15
La hibridación in situ es una técnica
potente y versátil para la detección y localización de secuencias
de ácido nucleico en las preparaciones celulares o de tejidos. Puede
ser útil, por ejemplo, para identificar sitios de expresión génica,
analizar la distribución en el tejido, identificar y localizar la
infección viral, seguir los cambios en la síntesis de ARNm
específico y con la ayuda del mapeo cromosómico.
La hibridación in situ se realizó según
la versión optimizada del protocolo de Lu y Gillet, Cell Vision
1:169-176 (1994), utilizando las ribosondas marcadas
con P^{32} generadas por PCR. En resumen, los tejidos humanos
incluidos en parafina, fijados en formalina se seccionaron,
desparafinaron, desproteinizaron en proteinasa K (20 g/ml) durante
15 minutos a 37ºC y se procesaron posteriormente para la hibridación
in situ tal como se describió por Lu y Gillet, supra. Una
ribosonda antisentido marcada con UTP-P^{32} se
generó de un producto de PCR y se hibridó a 55ºC durante la noche. A
continuación los portaobjetos con las hibridaciones se sumergieron
en la emulsión fotográfica Kodak NTB2 y se expusieron durante 4
semanas.
\vskip1.000000\baselineskip
6,0 \mul (125 mCi) de
UTP-P^{33} (Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/mmol)
se secaron con "speedvac". Se añadieron los siguientes
ingredientes a cada tubo que contenía el
UTP-P^{33} seco:
- 2,0 \mul de tampón de transcripción 5X
- 1,0 \mul de DTT (100 mM)
- 2,0 \mul de mezcla de NTP (2,5 mM: 10 \mul de cada GTP, CTP, TTP y ATP a 10 mM + 10 \mul de H_{2}O)
- 1,0 \mul de UTP (50 \muM)
- 1,0 de ARNsin
- 1,0 \mul de ADN molde (1 \mug)
- 1,0 \mul de H_{2}O
- 1,0 \mul de ARN polimerasa (para productos de PCR T3= antisentido, T7= sentido 5', generalmente)
Los tubos se incubaron a 37ºC durante 1 hora. Se
añadió 1,0 \mul de ADNsa RQ1, seguido de una incubación a 37ºC
durante 15 minutos. Se añadieron 90 \mul de TE (10 mM de Tris pH
7,6/EDTA 1 mM, pH 8,0) y la mezcla se pipeteó en papel DE81. La
solución restante se cargó en una unidad de ultrafiltración
Microcon-50 y se centrifugó utilizando el programa
10 (6 minutos). La unidad de filtración se invirtió sobre un segundo
tubo y se centrifugó con el programa 2 (3 minutos). En la última
recuperación, se añadieron 100 \mul de TE. Se pipeteó 1 \mul de
producto final sobre papel DE81 y se contaron en 6 ml de Biofluor
II.
La sonda se migró en un gel de TBE/urea. Se
añadieron 1-3 \mul de la sonda o 5 \mul de ARN
Mrk II a 3 \mul de tampón de carga. Se calentó la mezcla a 95ºC
en termobloque durante 3 min e inmediatamente después se colocó en
hielo. Se nivelaron los pocillos, se cargó la muestra y se migró a
180-250 voltios durante 45 minutos. El gel se
envolvió en saran-wrap y se expuso a una
película XAR con una pantalla intensificadora a -70ºC durante 1 h a
toda la
noche.
noche.
Los portas se sacaron del congelador, se
colocaron en bandejas de aluminio y se descongelaron a temperatura
ambiente durante 5 minutos. Las bandejas se colocaron en el
incubador a 55ºC durante 5 minutos para reducir la condensación.
Los portaobjetos se fijaron durante 10 minutos en paraformaldehído
al 4% en hielo en la campana de gases y se lavaron en 0,5XSSC
durante 5 minutos, a temperatura ambiente (25 ml de 20XSSC + 975 ml
de H_{2}O SQ). Después de desproteinizar con proteinasa K a 0,5
\mug/ml durante 10 minutos a 37ºC (12,5 \mul de solución madre
de proteinasa K en 250 ml de tampón sin ARNsa precalentado), las
secciones se lavaron en 0,5XSSC durante 10 minutos a temperatura
ambiente. Las secciones se deshidrataron en etanol al 70%, 95%,
100%, durante 2 min en cada baño.
Los portaobjetos se desparafinaron, se colocaron
en H_{2}O SQ y se lavaron dos veces con 2XSSC a temperatura
ambiente, durante 5 minutos cada vez. Las secciones de embriones
humanos se desproteinizaron con proteinasa K 20 \mug/ml (500
\mul de una solución madre de 10 mg/ml en 250 ml de tampón sin
ARNasa; 37ºC, 15 minutos), o 8X proteinasa K (100 \mul en 250 ml
de tampón sin ARNsa, 37ºC, 30 minutos) para tejidos en formalina. A
continuación, se realizaron lavados en 0,5XSSC y se deshidrataron
tal como se describió anteriormente.
Las preparaciones de los portaobjetos se
colocaron en una cajita de plástico con tampón Box (4XSSC,
formamida al 50%) - saturada con papel de filtro. El tejido se
recubrió con 50 \mul de tampón de hibridación (3,75 g de Dextrano
de sulfato + 6 ml de H_{2}O SQ), se mezcló con ayuda del vórtex y
se calentó en el microondas durante 2 minutos con la tapa
aflojada. Después de enfriar las cajas con los tejidos en hielo, se
añadieron 18,75 ml de formamida, 3,75 ml de 20XSSC y 9 ml de
H_{2}O SQ, se volvió a mezclar bien con el vórtex y se incubó a
42ºC durante 1-4 horas.
Un sonda de 1,0x10^{6} cpm y 1,0 \mul de
ARNt (50 mg/ml de solución madre) por porta se calentaron a 95ºC
durante 3 minutos. Los portas se enfriaron en hielo, y se añadieron
48 \mul de tampón de hibridación por porta. Después de mezclar
con el vórtex, se añadieron 50 \mul de P3 a 50 \mul de solución
de prehibridacicón sobre el porta. Y se incubaron durante toda la
noche a 55ºC.
Se realizaron dos lavados durante 10 minutos con
2XSSC, EDTA a temperatura ambiente (400 ml de 20XSSC + 16 ml de
EDTA 0,25 M, Vf= 4L), seguido de un tratamiento con ARNsa a 37ºC
durante 30 minutos (500 \mul de 10 mg/ml en 250 ml de tampón
ARNsa = 20 mg/ml). Los portas se lavaron 2x10 min con 2XSSC, EDTA a
temperatura ambiente. Las condiciones de astringencia del lavado
fueron las siguientes: 2 horas a 55ºC, 0,1 SSC, EDTA (20 ml de
20XSSC + 16 ml de EDTA, V_{f}=4 l).
El análisis in situ se realizó con
diversas secuencias de ADN descritas en la patente EP nº 99912321.9.
Los oligonucleótidos utilizados para estos análisis se derivaron de
secuencias de nucleótidos descritas en la patente europea
99912321.9 y por lo general tuvieron una longitud de 40 a 55
nucleótidos.
Los siguientes materiales se han depositado en
el American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, MD, USA (ATCC):
Este depósito se realizó de acuerdo con la
normativa del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento
Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos de
Procedimientos de Patentes y de la Regulación que se contempla
(Tratado de Budapest). Ello asegura el mantenimiento de un cultivo
viable del depósito durante 30 años desde la fecha del depósito.
Los depósitos estarán disponibles por el ATCC bajo los términos del
tratado de Budapest y sometidos a un acuerdo entre Genentech, Inc.
Y ATCC, que asegure la disponibilidad permanente y no restringida
de la progenie del cultivo del depósito para el público tras la
emisión de la patente americana pertinente o tras que sea accesible
al público cualquier patente americana o europea, que la preceda, y
asegure la disponibilidad de la progenie a uno determinado por el
de acuerdo con el 35\NAK122 y las normas del Comisionado de
Patentes y Marcas (incluyendo 37 CFR\NAK1,14 con la referencia
especial a 886 OG 638).
El beneficiario de la presente solicitud está de
acuerdo que si el cultivo de los materiales en depósito perece, se
pierde o se destruye cuando se cultiva en las condiciones adecuadas,
los materiales se reemplazarán en la mayor prontitud posible con
otro similar. La disponibilidad del material depositado no debe
considerarse como una licencia para practicar la invención en
contravención de los derechos garantizados bajo la autoridad de
cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes.
La especificación escrita en la presente
invención se considera suficiente para que un experto en la materia
ponga en práctica la invención. La presente invención no limita su
ámbito por la construcción depositada, ya que la realización
depositada se considera una ilustración de ciertos aspectos de la
invención y cualquier construcción que sea equivalente
funcionalmente se halla dentro del ámbito de la presente invención.
El depósito de materiales no constituye una admisión de que la
descripción en la presente invención descrita sea inadecuada para
permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención,
incluyendo el mejor modo de realización, tampoco debe considerarse
como limitante del ámbito de las reivindicaciones con las
ilustraciones específicas que se representan. Incluso, diversas
modificaciones de la invención, además de las en la presente
invención mostradas y descritas, serán evidentes a los expertos en
la materia a partir de la descripción presente y se hallan por
tanto dentro del ámbito de las reivindicaciones anexadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este
respecto.
- \bullet US 5536637 A [0003]
- \bullet WO 9013646 A [0098]
- \bullet US 4675187 A [0051]
- \bullet EP 36776 A [0102]
- \bullet EP 404097 A [0064]
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- \bullet GB 2211504 A [0105]
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[0239]
\bulletLU; GILLETT. Cell
Vision, 1994, vol. 1, 169-176 [0246]
Claims (26)
1. Ácido nucleico aislado, que:
- (i)
- comprende ADN codificante de un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos 80% con la secuencia de aminoácidos de la figura 2 (SEC ID nº 2), en la que dicho polipéptido es capaz de estimular la proliferación de las células de soporte utricular de rata,
- (ii)
- comprende ADN codificante de un polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de residuos 1 a 373 de la figura 2 (SEC ID nº 2),
- (iii)
- comprende ADN codificante de un polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de residuos 1 a X de la figura 2 (SEC ID nº 2), en la que X es cualquier residuo entre 216 y 225,
- (iv)
- presenta una identidad de secuencia de ácidos nucleicos de por lo menos 80% con la secuencia de ácidos nucleicos de la figura 1 (SEC ID nº 1) que codifica la secuencia de aminoácidos de la fig. 2 (SEC ID nº 2) y codifica un polipéptido capaz de estimular la proliferación de células de soporte utricular de rata,
- (v)
- comprende la secuencia codificante de longitud completa de la secuencia de ácidos nucleicos de la fig. 1 (SEC ID nº 1),
- (vi)
- comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la fig. 1 (SEC ID nº 1), o
- (vii)
- comprende la secuencia codificante de longitud completa de la inserción de ADNc (DNA45419-1252) depositada bajo el número de acceso nº ATCC209616.
2. Ácido nucleico según la reivindicación 1, en
el que el nivel de identidad de secuencias de aminoácidos es de por
lo menos 90%.
3. Ácido nucleico según la reivindicación 2, en
el que el nivel de identidad de secuencias de aminoácidos es de por
lo menos 95%.
4. Ácido nucleico según la reivindicación 3, en
el que el nivel de identidad de secuencias de aminoácidos es de por
lo menos 98%.
5. Ácido nucleico según la reivindicación 4, en
el que el nivel de identidad de secuencias de aminoácidos es de por
lo menos 99%.
6. Vector que comprende el ácido nucleico según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
7. Vector según la reivindicación 6, en el que
dicho ácido nucleico se encuentra operablemente ligado a secuencias
de control reconocidas por una célula huésped transformada con el
vector.
8. Célula huésped que comprende el vector según
la reivindicación 6 ó 7.
9. Célula huésped según la reivindicación 8, en
la que dicha célula es una célula CHO, una E. coli o una
célula de levadura.
10. Procedimiento para producir un polipéptido
que comprende cultivar la célula huésped según la reivindicación 8
ó 9 bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicho
polipéptido y recuperar dicho polipéptido a partir del cultivo
celular.
11. Polipéptido aislado, que:
- (i)
- presenta una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos 80% con la secuencia de aminoácidos de la figura 2 (SEC ID nº 2) y es capaz de estimular la proliferación de las células de soporte utricular de rata,
- (ii)
- presenta la secuencia de aminoácidos de residuos 1 a 373 de la figura 2 (SEC ID nº 2),
- (iii)
- presenta la secuencia de aminoácidos de residuos 1 a X de la figura 2 (SEC ID nº 2), en la que X es cualquier residuo entre 216 y 225,
\newpage
- (iv)
- presenta una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos 80% con la secuencia de aminoácidos codificante por la inserción de ADNc (DNA45419-1252) depositada bajo el número de acceso nº ATCC209616, y es capaz de estimular la proliferación de células de soporte utricular de rata, o
- (v)
- presenta la secuencia de aminoácidos codificada por la inserción de ADNc (DNA45419-1252) depositad abajo el número de acceso nº ATCC209616.
12. Polipéptido según la reivindicación 11,
parte (i), en el que el nivel de identidad es de por lo menos
90%.
13. Polipéptido según la reivindicación 12, en
el que el nivel de identidad es de por lo menos 95%.
14. Polipéptido según la reivindicación 13, en
el que el nivel de identidad es de por lo menos 98%.
15. Polipéptido según la reivindicación 14, en
el que el nivel de identidad es de por lo menos 99%.
16. Molécula quimérica que comprende un
polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15
fusionada con una secuencia de aminoácidos heteróloga.
17. Molécula quimérica según la reivindicación
16, en la que dicha secuencia de aminoácidos heteróloga es una
secuencia de etiqueta epítopo.
18. Molécula quimérica según la reivindicación
17, en la que dicha secuencia de aminoácidos heteróloga es una
región Fc de una inmunoglobulina.
19. Anticuerpo que se une específicamente a un
polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15.
20. Anticuerpo según la reivindicación 19, en el
que dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
21. Anticuerpo según la reivindicación 19, en el
que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
22. Anticuerpo según la reivindicación 21, en el
que dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico.
23. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 15, para la utilización en un procedimiento
de tratamiento médico.
24. Polipéptido según la reivindicación 23, para
la utilización en la regeneración de células pilosas auditivas.
25. Utilización in vitro del polipéptido
según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15 como mitógeno para
células de soporte del oído interno.
26. Utilización del polipéptido según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 15 en la preparación de un medicamento
para la regeneración de células pilosas auditivas.
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