ES2333880T3 - Polipeptidos y acidos nucleicos que los codifican. - Google Patents
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Abstract
Ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido PRO245, o el complemento del mismo, en el que el polipéptido: (i) comprende los aminoácidos 1 a 312 de la figura 2 (SEC ID No. 64) o una forma madura de la misma; (ii) comprende una forma truncada o secretada de forma natural, una forma de variante natural o una variante alélica natural del polipéptido de la figura 2 (SEC ID No. 64) e inhibe la proliferación del crecimiento de células endoteliales estimulada por VEGF, con la condición de que el polipéptido no consista en los aminoácidos 1-288 ó 21-288 de la figura 2 (SEC ID No. 64); (iii) tiene por lo menos un 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la figura 2 (SEC ID No. 64) e inhibe la proliferación del crecimiento de células endoteliales estimulada por VEGF, en el que dicha identidad de secuencia se determina sobre la longitud completa de dicha secuencia, con la condición de que el polipéptido no consista en los aminoácidos 1-288 ó 21-288 de la figura 2 (SEC ID No. 64); o (iv) tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la figura 2 (SEC ID No. 64) e inhibe la proliferación del crecimiento de células endoteliales estimulada por VEGF, en el que dicha identidad de secuencia se determina sobre la longitud completa de dicha secuencia.
Description
Polipéptidos y ácidos nucleicos que los
codifican.
La presente invención se refiere de modo general
a la identificación y aislamiento de ADN novedoso y a la producción
recombinante de polipéptidos novedosos codificados por ese ADN.
Las proteínas extracelulares y transmembrana
juegan importantes papeles en la información, diferenciación y
mantenimiento de los organismos pluricelulares. El destino de muchas
células individuales, por ejemplo, proliferación, migración,
diferenciación o interacción con otras células, normalmente está
dirigido por la información recibida desde otras células y/o en el
entorno inmediato. Esta información a menudo la transmiten
polipéptidos de secreción (por ejemplo, factores mitogénicos,
factores de supervivencia, factores citotóxicos, factores de
diferenciación, neuropéptidos u hormonas) que son, a su vez,
recibidos e interpretados por diversos receptores celulares o
proteínas transmembrana. Estos polipéptidos de secreción o moléculas
de señalización pasan a través de la ruta de secreción celular para
alcanzar su lugar de acción en el entorno extracelular, normalmente
en una proteína receptora transmembrana.
Las proteínas de secreción tienen varias
aplicaciones industriales, incluyendo su uso como productos
farmacéuticos, de diagnóstico, biosensores y bioreactores. De hecho,
la mayoría de fármacos proteicos disponibles en el presente, como
agentes trombolíticos, interferones, interleucinas, eritropoyetinas,
factores de estimulación de colonias y otras varias citoquininas,
son proteínas de secreción. Sus receptores, que son proteínas
transmembrana, tienen además un potencial como agentes terapéuticos
o de diagnóstico. Los receptores inmunoadhesinas, por ejemplo, se
pueden emplear como agentes terapéuticos para bloquear la
interacción receptor/ligando. Las proteínas transmembrana se pueden
también emplear para la selección de péptidos potenciales o pequeñas
moléculas inhibidoras de la interacción receptor/ligando
pertinente. Tales proteínas transmembrana y receptores celulares,
incluyen, pero no se limitan a, citoquininas, receptores, receptor
quinasas, receptor fosfatasas, receptores implicados en las
interacciones célula-célula y moléculas de adhesión
celular como selectinas e integrinas. La transducción de señales
que regulan el crecimiento y la diferenciación celular está regulada
en parte por la fosforilación de varias proteínas celulares. Las
proteína tirosina quinasas, enzimas que catalizan ese proceso,
pueden actuar además como receptores de factores de crecimiento.
Algunos ejemplos incluyen el receptor del factor de crecimiento de
fibroblastos y el receptor del factor de crecimiento nervioso.
Se están realizando esfuerzos tanto a nivel
industrial como académico para identificar proteínas de secreción
receptoras transmembrana nativas, nuevas. Muchos de los esfuerzos se
están centrando en la selección de genotecas de ADN recombinante de
mamíferos para identificar las secuencias codificantes de proteínas
de secreción y transmembrana novedosas. Algunos ejemplos de
procedimientos y técnicas de selección están descritos en la
bibliografía [ver por ejemplo, Klein y col., Proc. Nati. Acad.
Sci., 93: 7108-7113 (1996)]; Patente de
EE.UU. Nº 5.536.637].
En la presente memoria descriptiva nosotros
describimos la identificación y caracterización de polipéptidos de
secreción y transmembrana novedosos y ácidos nucleicos novedosos que
codifican esos polipéptidos.
Algunas de las proteínas más importantes
implicadas en la regulación y modulación de los procesos celulares
descritos anteriormente son las enzimas que regulan los niveles de
fosforilación de proteína en la célula. Por ejemplo, se sabe que la
transducción de señales que regulan el crecimiento y la
diferenciación celular se regula, por lo menos en parte, mediante
la fosforilación y desfosforilación de varias proteínas celulares.
Las enzimas que catalizan estos procesos incluyen las proteínas
quinasas, que actúan fosforilando varias proteínas celulares, y las
proteínas fosfatasas, que actúan eliminando los residuos de fosfato
de varias proteínas celulares. De este modo, el equilibrio del
nivel de la fosforilación de proteínas en la célula está mediado por
las actividades relativas de estos dos tipos de enzimas.
Aunque se han identificado muchas enzimas
proteína quinasa, el papel fisiológico jugado por muchas de estas
proteínas catalíticas aún debe elucidarse. Sin embargo, es bien
conocido, que un conjunto de las proteínas quinasas conocidas
actúan fosforilando residuos de tirosina en proteínas, conduciendo
de este modo a una variedad de efectos diferentes. Quizás, de
manera más importante, ha habido un gran interés en las proteínas
tirosina quinasa, ya que el descubrimiento de que muchos productos
oncogenes y factores de crecimiento poseen actividad intrínseca de
proteínas tirosina quinasa. Por tanto, existe la necesidad de
identificar nuevos miembros de la familia de proteínas tirosina
quinasa.
Dada la importancia fisiológica de las proteínas
quinasas, se están realizando esfuerzos por parte de la industria y
los científicos para identificar nuevas proteínas quinasas nativas.
Muchos de estos esfuerzos se centran en el cribado de bibliotecas
de ADN recombinante de mamífero para identificar las secuencias
codificantes para nuevas proteínas quinasas. En la presente
invención se describe la identificación y caracterización de
polipéptidos nuevos que presentan homología a proteínas tirosina
quinasa, denominadas en la presente invención como polipéptidos
PRO245.
Los solicitantes han identificado un clon de
ADNc que codifica un nuevo polipéptido, en el que el polipéptido se
denomina en la presente solicitud como "PRO245".
En una realización, la presente invención
proporciona una molécula de ácido nucleico aislada tal como se
define en las reivindicaciones que comprende un ADN que codifica un
polipéptido PRO245. En un aspecto, el ácido nucleico aislado
comprende el ADN que codifica el polipéptido PRO245 que tiene los
residuos de aminoácidos 1 a 312 de la Figura 2 (SEC. ID Nº 64), o
es complementario a dicha secuencia de ácido nucleico codificante,
y permanece unido de manera estable al mismo bajo condiciones por lo
menos de moderada astringencia, y opcionalmente, de alta
astringencia.
En otra realización, la presente invención
proporciona un polipéptido PRO245 aislado tal como se define en las
reivindicaciones. En particular, la presente invención proporciona
un polipéptido PRO245 de secuencia nativa aislada, que en una
realización, incluye una secuencia de aminoácidos que comprende los
residuos 1 a 312 de la Figura 2 (SEC ID. Nº 64).
En otras realizaciones de la presente invención,
la invención proporciona vectores tal como se definen en las
reivindicaciones. También se proporciona una célula huésped que
comprende cualquiera de dichos vectores. A modo de ejemplo, las
células huésped puedes ser células CHO, E. coli o levaduras.
Se proporciona además un procedimiento para producir cualquiera de
los polipéptidos descritos anterior o posteriormente, tal como se
define en las reivindicaciones y comprende el cultivo de células
huésped en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido
deseado y la recuperación del polipéptido deseado a partir del
cultivo celular.
En otras realizaciones, la presente invención
proporciona moléculas quiméricas tal como se definen en las
reivindicaciones. Un ejemplo de dicha molécula quimérica comprende
cualquiera de los polipéptidos descritos anterior o posteriormente
fusionados a una secuencia de epítopo etiqueta o una región Fc de
una inmunoglobulina.
En otra realización, la presente invención
proporciona un anticuerpo tal como se define en las
reivindicaciones, que se une específicamente a cualquiera de los
polipéptidos descritos anterior o posteriormente. Opcionalmente, el
anticuerpo en un anticuerpo monoclonal.
La Figura 1 muestra una secuencia de nucleótidos
(SEC ID. Nº 63) de un ADNc de PRO245 de secuencia nativa, en la que
la SEC ID. Nº 63 es un clon denominado en la presente invención como
"UNQ219" y/o "DNA35638-1141".
La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos
(SEC ID. Nº 64) derivada de la secuencia codificante de la SEC ID.
Nº 63 mostrada en las Figuras 1.
Los términos "polipéptido PRO" y "PRO"
se usan en la presente memoria descriptiva y cuando están
inmediatamente seguidos de una denominación numérica se refiere a
varios polipéptidos, en el que la denominación completa (es decir,
PRO/número) se refiere a secuencias polipeptídicas específicas como
se describe en la presente memoria descriptiva. Los términos
"polipéptido PRO/número" y "PRO/número" como se usan en la
presente memoria descriptiva engloban polipéptidos de secuencia
nativa y variantes polipeptídicas (que se definen con más detalle
en la presente memoria descriptiva). Los polipéptidos PRO descritos
en la presente memoria descriptiva se pueden aislar de varias
fuentes, como a partir de tipos de tejidos humanos o de otra fuente,
o preparados con procedimientos sintéticos recombinantes.
Un "polipéptido PRO de secuencia nativa"
comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos
que el polipéptido PRO correspondiente natural. Tales polipéptidos
PRO de secuencia nativa se pueden aislar a partir de la naturaleza
o se pueden producir por medios sintéticos recombinantes. El término
"polipéptido PRO de secuencia nativa" engloba específicamente
formas truncadas naturales o de secreción del polipéptido PRO
específico (por ejemplo, formas de ayuste alternativas) y variantes
alélicas naturales del polipéptido. En una realización de la
invención, el polipéptido PRO245 de secuencia nativa es un
polipéptido PRO245 de secuencia nativa maduro o de longitud
completa que comprende los aminoácidos 1 a 312 de la Figura 2 (SEC
ID Nº 64).
"Variante del polipéptido PRO" quiere decir
un polipéptido PRO activo como se define anteriormente o a
continuación que tiene al menos aproximadamente el 80% de identidad
de secuencia de aminoácidos con la secuencia del polipéptido PRO de
secuencia nativa de longitud completa como se describe en la
presente memoria descriptiva. Tales variantes del polipéptido PRO
incluyen, por ejemplo, polipéptidos PRO en los que se añaden, o
eliminan uno o más residuos aminoacídicos, en el extremo amino (N) o
carboxilo (C) terminal de la secuencia de aminoácidos nativa de
longitud completa. Habitualmente, una variante de polipéptido PRO
tendrá al menos aproximadamente un 80% por ciento de identidad de
secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 90% de identidad de secuencia de aminoácidos e
incluso más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% de
identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de
aminoácidos de la secuencia de aminoácidos nativa de longitud
completa como se describe en la presente memoria descriptiva.
El "porcentaje (%) de identidad de secuencia
de aminoácidos" respecto a las secuencias polipeptídicas PRO
identificadas en la presente memoria descriptiva se define como el
porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que
son idénticos a los residuos aminoacídicos de la secuencia
polipeptídica PRO específica, después de alinear las secuencias e
introducir espacios de disparidad, si fuera necesario, para lograr
el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar
ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de
secuencia. El alineamiento para propósitos de determinación del
porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede lograr
de varios modos accesibles para los expertos en la materia, por
ejemplo, usando programas informáticos disponibles públicamente como
los programas BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTAR). El programa de
alineamiento preferido es BLAST. Los expertos en la materia pueden
determinar los parámetros apropiados para la medida del
alineamiento, incluyendo cualquier algoritmo que se necesite para
lograr un alineamiento máximo en toda la longitud de las secuencias
que se están comparando.
El "porcentaje (%) de identidad de secuencia
de nucleótidos" respecto a las secuencias de nucleótidos que
codifican los PRO identificadas en la presente memoria descriptiva
se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia
candidata que son idénticos a los nucleótidos de la secuencia de
aminoácidos PRO de interés, después de alinear las secuencias e
introducir espacios de disparidad, si fuera necesario, para lograr
el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar
ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de
secuencia. El alineamiento para propósitos de determinación del
porcentaje de identidad de secuencia de nucleótidos se puede lograr
de varios modos accesibles a los expertos en la materia, por
ejemplo, usando programas informáticos disponibles públicamente
como los programas BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTAR). El programa
de alineamiento preferido es BLAST. Los expertos en la materia
pueden determinar los parámetros apropiados para la medida del
alineamiento, incluyendo cualquier algoritmo que se necesite para
lograr un alineamiento máximo en toda la longitud de las secuencias
que se están comparando.
"Aislado", cuando se usa para describir los
varios polipéptidos descritos en la presente memoria descriptiva,
quiere decir que se ha identificado y separado y/o recuperado de un
componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de
su entorno natural son materiales que típicamente puede interferir
con el diagnóstico o usos terapéuticos del polipéptido, y que
pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos o no
proteicos. En las realizaciones preferidas, el polipéptido se
purificará (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15
residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o
interna usando un secuenciador spinning cup (de taza
giratoria), o (2) para homogenizar con SDS-PAGE (gel
de poliacrilamida con SDS) en condiciones no reductoras o
reductoras usando Azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de
plata. El polipéptido aislado incluye polipéptido in situ en
las células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno
natural del polipéptido PRO no estará presente. Habitualmente, sin
embargo, el polipéptido aislado se preparará al menos con una etapa
de purificación.
Un ácido nucleico polipeptídico PRO
"aislado" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y
separa de al menos una molécula nucleotídica contaminante con la
que está normalmente asociada en la fuente natural del ácido
nucleico polipeptídico PRO. Una molécula de ácido nucleico
polipeptídico PRO aislado es distinta de la forma o entorno en el
que se encuentra en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico
polipeptídico PRO aislado se distinguen, por lo tanto, de la
molécula de ácido nucleico polipeptídico PRO específica que existe
en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido
nucleico polipeptídico PRO aislado incluye moléculas de ácido
nucleico polipeptídico PRO contenidas en células que normalmente
expresan el polipéptido PRO donde, por ejemplo, la molécula de
ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de la
de las células naturales.
El "análisis Southern" o "transferencia
Southern" es un procedimiento por el que se confirma la presencia
de secuencias de ADN en una digestión con endonucleasas de
restricción de ADN o una composición que contiene ADN mediante la
hibridación con un oligonucleótido o un fragmento de ADN etiquetado
conocido. Los análisis Southern típicamente implican una separación
electroforética de las digestiones de ADN en geles de agarosa, la
desnaturalización del ADN tras la separación electroforética, y la
transferencia del ADN a una membrana soporte de nitrocelulosa,
nailon o de otro material adecuado para analizarla con una sonda
etiquetada con un enzima, biotinizada o etiquetada radiactivamente
como se describe en las secciones 9.37-9.52 de
Sambrook y col., "Molecular cloning: A Laboratory
Manual" (Clonación molecular: Manual de laboratorio) (New
York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
El "análisis Northern" o "transferencia
Northern" es un procedimiento usado para identificar secuencias
de ARN que hibridan con una sonda conocida como un oligonucleótido,
un fragmento de ADN, ADNc o sus fragmentos, un fragmento de ARN. La
sonda está etiquetada con un isótopo radiactivo como P^{32}, o por
biotinización, o con un enzima. El ARN que se va a analizar
normalmente se separa electroforéticamente en un gel de agarosa o
poliacrilamida, se transfiere a una membrana de nitrocelulosa,
nailon o de otro material adecuado y se hibrida con una sonda,
usando técnicas habituales muy conocidas como las que se describen
en las secciones 7.39-7.52 de Sambrook y col.,
supra.
El término "secuencias control" se refiere
a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia
codificante unidas operativamente en un organismo hospedador
particular. Las secuencias control adecuadas para procariotas, por
ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia
operadora, y un sitio de unión a ribosomas. Se sabe que las células
eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y
potenciadores.
Un ácido nucleico está "unido
operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con
otra secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, ADN para una
presecuencia o una secuencia guía de secreción se une operativamente
al ADN que codifica un polipéptido si se expresa como una
preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un
promotor o un potenciador se une operativamente a una secuencia
codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un
sitio de unión a ribosomas se une operativamente a una secuencia
codificante si se sitúa de modo que facilite la traducción.
Generalmente, "unido operativamente" significa que las
secuencias de ADN que se están uniendo son contiguas, y en el caso
de las secuencias guías de secreción, contiguas y en pauta de
lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos.
La unión se realiza mediante ligación en sitios de restricción
convenientes. Si tales sitios no existen, se usan adaptadores
oligonucleotídicos sintéticos o ADN de enlace según la práctica
convencional.
El término "anticuerpo" se usa en el
sentido más amplio y abarca específicamente anticuerpos monoclonales
anti-polipéptido PRO únicos (incluyendo anticuerpos
agonistas, antagonistas y neutralizantes) y composiciones de
anticuerpos anti-polipéptido PRO con especificad
poliepitópica. El término "anticuerpo monoclonal" como se usa
en la presente memoria descriptiva se refiere a un anticuerpo
obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente
homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la
población son idénticos salvo por posibles mutaciones naturales que
puedan estar en cantidades minoritarias.
"Activo" o "actividad" para los
propósitos de la presente memoria descriptiva se refieren a formas
del polipéptido PRO que mantienen las actividades biológicas y/o
inmunológicas del polipéptido nativo específico o natural.
"Tratamiento" o "el tratamiento" se
refiere tanto al tratamiento médico como a las medidas preventivas o
profilácticas. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen a los que
ya tienen el trastorno, como a los propensos a tenerlo, en los que
hay que prevenir el desorden.
"Mamífero" para los propósitos del
tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero,
incluyendo a los humanos, animales domésticos y de granja, y
animales de zoo, de deportes o de compañía, como ovejas, perros,
caballos, gatos, vacas y similares. Preferiblemente, el mamífero de
la presente memoria descriptiva en un humano.
"Vehículos" como se usa en la presente
memoria descriptiva incluyen vehículos farmacéuticamente aceptables,
excipientes, o estabilizantes que no sean tóxicos para la célula o
mamífero expuesto a las dosis y concentraciones empleadas. A menudo
el vehículo fisiológicamente aceptable, es una solución acuosa
tamponada. Algunos ejemplos de vehículos fisiológicamente
aceptables incluyen tampones como fosfato, citrato, y otros ácidos
orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos
de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos);
proteínas, como seroalbúmina, gelatina, o inmunoglobulinas;
polímeros hidrófilo como polivinilpirrolidona; aminoácidos como
glicina, glutamina, asparragina, arginina o lisina; monosacáridos,
disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o
dextranos; agentes quelantes como EDTA; polioles como manitol o
sorbitol; contraiones formadores de sal como sodio; y/o
tensioactivos no iónicos como TWEEN^{TM}, polietilenglicol (PEG) y
PLURONICS^{TM}.
El término "agonista" se usa para hacer
referencia a análogos peptídicos y no peptídicos de los polipéptidos
PRO nativos (donde polipéptido PRO nativo se refiere a
propolipéptido PRO, prepolipéptido PRO, prepropolipéptido PRO o
polipéptido PRO maduro) de la presente invención y a anticuerpos que
se unen específicamente a tales polipéptidos PRO nativos, con la
condición de que mantengan al menos una actividad biológica del
polipéptido PRO maduro. Preferiblemente, los agonistas de la
presente invención mantienen las propiedades de reconocimiento de
unión cualitativas y las propiedades de activación del receptor del
polipéptido PRO maduro.
El término "antagonista" se usa para hacer
referencia a una molécula que inhibe una actividad biológica del
polipéptido PRO maduro de la presente invención en la que
polipéptido PRO maduro se refiere a propolipéptido PRO,
prepolipéptido PRO, prepropolipéptido PRO o polipéptido PRO maduro.
Preferiblemente, los antagonistas en la presente memoria
descriptiva inhiben la unión de un polipéptido PRO maduro de la
presente invención. Un polipéptido PRO "antagonista" es una
molécula que evita o interfiere con una función efectora antagonista
PRO (por ejemplo, una molécula que evita o interfiere con la unión
y/o la activación de un receptor del polipéptido PRO por un
polipéptido PRO). Tales moléculas se pueden seleccionar por su
capacidad de inhibir completamente la activación del receptor del
polipéptido PRO controlando la unión de un polipéptido PRO en
presencia y ausencia de la molécula antagonista de prueba, por
ejemplo. Un antagonista de la invención además engloba un
polinucleótido antisentido contra el gen del polipéptido PRO, tal
polinucleótido antisentido bloquea la transcripción o traducción
del gen del polipéptido PRO, inhibiendo por lo tanto su expresión y
actividad biológica.
"Condiciones restrictivas" quiere decir (1)
el empleo de soluciones de baja concentración iónica y alta
temperatura para los lavados, por ejemplo, cloruro de sodio 0,015 M;
citrato de sodio 0,0015 M; 0,1% de dodecilsulfato de sodio a 50ºC,
o (2) el empleo durante la hibridación de un agente
desnaturalizante, como formamida, por ejemplo, 50% de formamida
(v/v) con 0,1% de seroalbúmina bovina; 0,1% de Ficol; 1% de
polivinilpirrolidona; tampón de pirofosfato de sodio 50 nM a pH 6,5
con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42ºC. Otro
ejemplo es usar 50% de formamida, SSC 5X (NaCl 0,75 M, citrato de
sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH6/8), 0,1% de pirofosfato
de sodio, solución de Denhardt 5X, ADN de esperma de salmón
sometido a sonicación (50 \mug/ml), 0,1% de SDS y 10% de sulfato
de dextrano a 42ºC, con lavados a 42ºC en SSC 0,2X y 0,1% de SDS.
Aún otro ejemplo es la hibridación usando un tampón con 10% de
sulfato de dextrano, SSC 2X (cloruro de sodio/citrato de sodio) y
50% de formamida a 55ºC, seguido de un lavado altamente restrictivo
constituido por SSC 0,1X que contenga EDTA a 55ºC.
Las "condiciones moderadamente
restrictivas" se describen en Sambrook y col., supra e
incluyen el uso de una solución de lavado y condiciones de
hibridación (por ejemplo, temperatura, concentración iónica y % de
SDS) menos restrictivas que las descritas anteriormente. Un ejemplo
de condiciones moderadamente restrictivas es una condición como la
incubación durante toda la noche a 37ºC en una solución que
comprenda: 20% de formamida, SSC 5X (NaCl 0,75 M, citrato de
trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), solución de
Denhardt 5X, 10% de sulfato de dextrano, y 20 mg/ml de ADN de
esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, seguida con un
lavado del filtro en SSC 1X a 37-50ºC. Los expertos
en la materia sabrán cómo ajustar la temperatura, concentración
iónica, etc., como sea necesario para acomodar factores tales como
longitud de la sonda y similares.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona secuencias de
nucleótidos identificadas y aisladas recientemente que codifican
polipéptidos a los en la presente solicitud se hace referencia como
PRO245. En particular, los Solicitantes han identificado y aislado
ADNc que codifica un polipéptido PRO245, tal como se describe con
más detalle en los siguientes ejemplos. Usando los programas
informáticos de alineación de secuencias BLAST y FastA, los
Solicitantes descubrieron que una parte de la secuencia de
aminoácidos del polipéptido PRO245 tiene un 60% de identidad de
aminoácidos con la proteína c-myb humana. Por
consiguiente, actualmente se cree que el polipéptido PRO245
descrito en la presente solicitud puede ser un miembro identificado
recientemente de la familia de proteínas transmembrana tirosina
quinasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Además de los polipéptidos PRO de secuencia
nativa de longitud completa descritos en la presente memoria
descriptiva, se contempla que se puedan preparar variantes del
polipéptido PRO. Se pueden preparar variantes del polipéptido PRO
introduciendo los cambios nucleotídicos apropiados en el ADN del
polipéptido PRO, o sintetizando el polipéptido PRO deseado. Los
expertos en la materia apreciarán que los cambios aminoacídicos
pueden alterar los procesos postraduccionales de los polipéptidos
PRO, como cambios del número o posición de sitios de glicosilación o
alteraciones las características de anclaje a la membrana.
Las variaciones de los polipéptidos PRO de
secuencia nativa de longitud completa o en varios dominios de los
polipéptidos PRO, descritos en la presente memoria descriptiva, se
pueden realizar, por ejemplo, usando cualquiera de las técnicas y
orientaciones para mutaciones conservativas y no conservativas
expuestas, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. Nº 5.364.934. Las
variaciones pueden ser sustitución, deleción o inserción de uno o
más codones que codifican el polipéptido PRO que tengan como
resultado el cambio de la secuencia de aminoácidos del polipéptido
PRO en comparación con el polipéptido PRO de secuencia nativa.
Opcionalmente la variación es por la sustitución de al menos un
aminoácido con cualquier otro aminoácido en uno o más dominios del
polipéptido PRO. La orientación para determinar que aminoácido se
puede introducir, sustituir o deleccionar sin afectar adversamente
la actividad deseada se puede encontrar comparando la secuencia del
polipéptido PRO con la de moléculas proteicas conocidas homólogas y
minimizando el número de cambios en la secuencia de aminoácidos
hechos en regiones de alta homología. Las sustituciones
aminoacídicas pueden resultar de remplazar un aminoácido con otro
que tenga características estructurales y químicas similares, como
el reemplazo de una leucina con una serina, es decir, reemplazos
aminoacídicos conservativos. Las inserciones y deleciones pueden
estar opcionalmente en el intervalo de 1 a 5 aminoácidos. La
variación permitida se pude determinar realizando inserciones,
deleciones o sustituciones sistemáticas de aminoácidos en la
secuencia y probando la actividad de las variantes resultantes en el
ensayo in vitro descritos en los siguientes Ejemplos.
Las variaciones se pueden realizar usando
procedimientos conocidos en la técnica como mutagénesis mediada por
oligonucleótidos (dirigida), sustitución sistemática de alaninas y
mutagénesis por PCR. La mutagénesis dirigida [Carter y col.,
Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller y col.,
Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)], mutagénesis con
caete [Wells y col., Gene, 34: 315 (1985)],
mutagénesis por selección de restricción [Wells y col., Philos.
Trans R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)] u otras
técnicas conocidas se pueden realizar sobre el ADN clonado para
producir el ADN variante del polipéptido PRO.
El análisis de aminoácidos de sustitución
sistemática se puede también emplear para identificar uno o más
aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los
aminoácidos de sustitución sistemática preferidos están los
aminoácidos neutros, relativamente pequeños. Tales aminoácidos
incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es
típicamente un aminoácido de sustitución sistemática preferido entre
este grupo ya que elimina la cadena lateral más allá del carbono
beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena
principal de la variante. La alanina se prefiere además típicamente
porque es el aminoácido más común. Además, se encuentra
frecuentemente tanto en posiciones protegidas y expuestas
[Creighton, The Proteins, (W. H. Freeman y Cía., N.Y.);
Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)]. Si la
sustitución de alanina no produce cantidades adecuadas de variante,
se puede usar un aminoácido isostérico.
\vskip1.000000\baselineskip
Las modificaciones covalentes de los
polipéptidos PRO están incluidas en el alcance de esta invención.
Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar los
residuos aminoacídicos diana del polipéptido PRO con un agente
derivatizante orgánico que sea capaz de reaccionar con las cadenas
laterales seleccionadas o los residuos N-terminal o
C-terminal del polipéptido PRO. La Es útil la
derivatización con agentes bifuncionales, por ejemplo para
reticular (crosslinking) un polipéptido PRO a una matriz o
superficie de soporte insoluble en agua para usar en el
procedimiento para purificar anticuerpos
anti-polipéptido PRO, y viceversa. Los agentes de
reticulación comúnmente utilizados incluyen por ejemplo,
1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano;
glutaraldehído; ésteres de N-hidroxisuccinimida,
por ejemplo, ésteres con ácido 4-acidosalicílico,
imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de
disuccinimidilo como
3,3'-ditiobis(succinidimilpropionato),
maleimidas bifuncionales como
bis-N-maleimido-1,8-octano
y agentes como
metil-3-[(p-acidofenil)ditio]propioimidato.
Otras modificaciones incluyen la desaminación de
residuos glutaminilo y asparraginilo hasta los correspondientes
residuos glutamilo y aspartilo, respectivamente, hidroxilación de
prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de
serilo o treonilo, metilación de los grupos
\alpha-amino de las cadenas laterales de lisina,
arginina e histidina [T. E. Creighton, "Proteins: Structure and
Molecular Properties" (Proteínas: Estructura y Propiedades
Moleculares) Freeman y Cía., San Francisco, págs
79-86 (1983)].
Otro tipo de modificación covalente de los
polipéptidos PRO incluidos en el alcance de esta invención
comprende la alteración del patrón de glicosilación nativo del
polipéptido. "La alteración del patrón de glicosilación
nativo" está diseñada para los propósitos de la presente memoria
descriptiva para significar eliminar uno o más residuos glucídicos
encontrados en la secuencia nativa del polipéptido PRO, y/o añadir
uno o más sitios de glicosilación que no estén presentes en el
polipéptido PRO de secuencia nativa.
La adición de sitios de glicosilación al
polipéptido PRO se puede lograr alterando la secuencia de
aminoácidos. La alteración se puede realizar, por ejemplo, añadiendo
o sustituyendo uno o más residuos de serinas o treoninas al
polipéptido PRO de secuencia nativa (para sitios de enlace
O-glucosídico). La secuencia de aminoácidos del
polipéptido PRO se puede alterar opcionalmente a través de cambios a
nivel del ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el
polipéptido PRO en bases preseleccionadas ya que esos codones
generados se traducirán en los aminoácidos deseados.
Otros medios de aumentar el número de residuos
glucosídicos en el polipéptido PRO es por unión química o
enzimática de glucósidos al polipéptido. Tales procedimientos se
describen en la técnica, por ejemplo, en el documento WO87/05330
publicado el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC
Crit. Rev. Biochem., págs 259-306 (1981).
La eliminación de residuos glucosídicos
presentes en el polipéptido PRO se puede conseguir químicamente o
enzimáticamente o por sustitución mutacional de codones que
codifiquen residuos aminoacídicos que sirvan de diana de
glicosilación. Las técnicas de desgliosilación química se conocen en
la técnica y se describen por ejemplo, en Hakimuddin y col.,
Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987) y en Edge y
col., Anal. Biochem., 118: 131 (1981). El corte
enzimático de los residuos glucídicos de polipéptidos se puede
lograr usando una variedad de endoglicosidasas y exoglicosidasas
como se describe en Thotakura y col., Meth. Enzymol.,
138: 350 (1987).
Otro tipo de modificación covalente de los
polipéptidos PRO de la invención comprende la unión del polipéptido
PRO a una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo,
polietilenglicol, polipropilenglicol, o polioxialquilenos, en la
manera expuesta en las Patentes de EE.UU. Nº 4.640.835, 4.496.689,
4.301.144, 4.670.417, 4.791.192, o 4.179.337.
Los polipéptidos PRO de la presente invención se
pueden modificar además de modo que formen una molécula quimérica
que comprenda un polipéptido PRO fusionado a otra secuencia
polipeptídica o aminoacídica heteróloga. En una realización, tal
molécula quimérica comprende una fusión del polipéptido PRO con un
polipéptido etiqueta que proporciona un epítopo al que un
anticuerpo antietiqueta se puede unir selectivamente. La etiqueta
epítopo se coloca generalmente en los extremos amino terminal o
carboxilo terminal del polipéptido PRO. La presencia de tales
formas etiquetadas con epítopo posibilita que el polipéptido PRO sea
fácilmente purificado mediante purificación por afinidad usando un
anticuerpo antietiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se una
a la etiqueta epítopo. En una realización alternativa, la molécula
quimérica puede comprender una fusión del polipéptido PRO con una
inmunoglobina o una región particular de una inmunoglobina. Para una
forma bivalente de la molécula quimérica, tal fusión puede ser con
la región Fc de una molécula de IgG.
Varios polipéptidos etiqueta y sus respectivos
anticuerpos son muy conocidos en la técnica. Algunos ejemplos
incluyen polihistinida (poli-His) o
polihistidinglicina (Poli-His-Gly);
el polipéptido etiqueta HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 [Field
y col., Mol. Cell. Biol., 8: 2159-2165
(1988)]; la etiqueta Myc-c y sus anticuerpos 8F9,
3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 [Evan y col., Moecular and Cellular
Biology, 5: 3610-3616 (1985)].; y la
etiqueta glicoproteína D del virus Herpes Simple (gD) y su
anticuerpo [Paborsky y col., Protein Engineering,
3(6): 547-553 (1990)] Otros
polipéptidos etiqueta incluyen el péptido Flag [Hopp y col.,
Biotechnology, 6: 1204-1210 (1988)];
el péptido epítopo KT3 [Martin y col., Science, 225:
192-194 (1992)]; un péptido epítopo de
\alpha-tubulina [Skinner y col., J. Biol.
Chem., 266: 15163-15166 (1991)] y la
etiqueta peptídica del la proteína de gen 1o del T7
[Lutz-Freyermuth y col., Proc. Nati. Acad. Sci.
EE.UU. 87: 6393-6397 (1990)].
En WO99/14328, de la que se deriva la presente
solicitud, se proporciona una descripción más detallada de la
modificación de otro polipéptido PRO317.
\vskip1.000000\baselineskip
La siguiente descripción describe principalmente
la producción de polipéptidos PRO cultivando células transformadas
o transfectadas con un vector que contiene el ácido nucleico del
polipéptido PRO deseado. Se contempla, por supuesto, que se puedan
emplear procedimientos alternativos, muy conocidos en la técnica,
para preparar el polipéptido PRO. Por ejemplo, la secuencia del
polipéptido PRO, o sus porciones, se pueden producir por síntesis
peptídica directa usando técnicas en fase sólida [ver por ejemplo,
Stewart y col., Solid-Phase Peptide
Synthesis, W. H. Freeman y Cía., San Francisco, CA (1969);
Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:
2149-2154 (1963)]. La síntesis de proteínas in
vitro se puede realizar usando técnicas manuales o automáticas.
La síntesis automática se puede lograr, por ejemplo, usando un
sintetizador peptídico de Applied Biosystems (Foster City, CA)
usando las instrucciones del fabricante. Varias porciones del
polipéptido PRO deseado e pueden sintetizar químicamente por
separado y combinar usando procedimientos químicos o enzimáticos
para producir el polipéptido PRO de longitud completa.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN que codifica los polipéptidos PRO se
puede obtener de una genoteca de ADNc preparada a partir de un
tejido que se crea que posee el ARNm del polipéptido PRO deseado a
un nivel detectable. Por consiguiente, el ADN del polipéptido PRO
humano se puede obtener convenientemente de una genoteca de ADNc
preparada a partir de un tejido humano, como se describe en los
Ejemplos. El gen que codifica el polipéptido PRO se puede obtener
además a partir de genotecas genómicas o por síntesis de
oligonucleótidos.
Las genotecas se pueden investigar con sondas
(como los anticuerpos frente al polipéptido PRO deseado u
oligonucleótidos de la menos aproximadamente 20-80
pares de bases) diseñados para identificar el gen de interés o la
proteína que codifica. La investigación de la genoteca de ADNc o
genómica con la sonda seleccionada se puede llevar a cabo usando
procedimientos habituales, como se describe en Sambrook y col.,
"Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Clonación
molecular: Manual de laboratorio) (New York: Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo para aislar el gen
que codifica el polipéptido PRO deseado es usar la metodología de
la PCR [Sambrook y col., supra; Dieffenbach y col., "PCR
Primer: A Laboratory Manual" (Cebador de PCR: Manual de
laboratorio; New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1995)].
Los siguientes Ejemplos describen técnicas para
investigar una genoteca de ADNc. Las secuencias de oligonucleótidos
seleccionadas como sondas deben tener suficiente longitud y ser lo
suficientemente precisas para minimizar los falsos positivos. El
oligonucleótido se etiqueta preferiblemente de modo que se pueda
detectar un vez hibridado al ADN en la genoteca que se está
investigando. Los procedimientos de etiquetado son muy conocidos en
la técnica, e incluyen el uso de etiquetas radiactivas como ATP
etiquetado con P^{32}, biotinización o etiquetado enzimático. Las
condiciones de hibridación, incluyendo condiciones moderadamente
restrictivas y muy restrictivas, se proporcionan en Sambrook y col.,
supra.
Las secuencias identificadas en tales
procedimientos de investigación de librerías se pueden comparar y
alinear con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en
bases de datos públicas como GenBank u otras bases de datos de
secuencias privadas. La identificación de la secuencia (a nivel
aminoacídico o nucleotídico) dentro de las regiones definidas de la
molécula o por toda la longitud de la secuencia se puede determinar
a través de un alineamiento de secuencias usando un programa
informático como BLAST, ALIGN, DNAstar e INHERIT que emplea varios
algoritmos para medir la homología.
El ácido nucleico que tiene la secuencia que
codifica la proteína se puede obtener investigando la genoteca de
ADNc o genómica usando la secuencia de aminoácidos deducida descrita
en la presente memoria descriptiva por primera vez y, si fuera
necesario, usando procedimientos de extensión con cebador
convencionales que se describen en Sambrook y col., supra,
para detectar precursores e intermediarios de procesamiento del ARNm
que puedan no haber sido retrotranscritos a ADNc.
\newpage
Las células huésped se transfectan o transforman
con los vectores de expresión o de clonación descritos en la
presente memoria descriptiva para la producción de polipéptido PRO y
se cultivan en medios nutricionales convencionales modificados como
sea apropiado para inducir a los promotores, seleccionar
transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias
deseadas. Los expertos en la materia pueden seleccionar las
condiciones de cultivo, como medios, temperatura, pH y similares,
sin excesiva experiencia. En general, en "Mammalian Cell
Biotechnology a Practical Approach" (Biotecnología con
células de mamífero: Enfoque práctico), M. Butler, ed. (IRL Press,
1991) y en Sambrook y col., supra, se pueden encontrar los
principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la
productividad de los cultivos celulares.
Los expertos habituales en la materia conocen
muy bien los procedimientos de transfección, por ejemplo,
CaPO_{4} y electroporación. Dependiendo de la célula huésped que
se use, la transformación se realiza usando técnicas habituales
apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio, que emplea
cloruro de calcio, como se describe en Sambrook y col.,
supra, o la electroporación se usa generalmente para
procariotas u otras células que contienen paredes celulares barrera
considerables. La infección con Agrobacterium tumefaciens se
usa para la transformación de ciertas células vegetales, como se
escribe en Shaw y col., Gene, 23: 315 (1983) y en el
documento WO89/05859 publicado el 29 de junio de 1989. Para las
células de mamífero sin tales paredes celulares, se puede emplear
el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio de Graham y
van der Eb., Virology, 53: 456-457
(1978). Se han descrito los aspectos generales de las
transformaciones de sistemas de células huésped de mamífero en la
Patente de EE.UU. Nº 4.339.216. Las transformaciones en levadura se
llevan a cabo típicamente según el procedimiento de Van Solingen y
col., J. Bact., 130: 946 (1977) y Hsiao y col.,
Proc. Nati. Acad. Sci. (EEUU), 76: 3829 (1979). Sin
embargo, también se pueden emplear otros procedimientos para
introducir ADN en las células, como por microinyección nuclear,
electroporación, fusión de protoplastos bacterianos con células
intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina. Para
varias técnicas de transformación de células de mamífero, ver Keown
y col., Methods in Enzimology, 185:
527-537 (1990) y Mansour y col., Nature,
336: 348-352 (1988).
Las células huésped adecuadas para clonar o
expresar el ADN de los vectores en la presente memoria descriptiva
incluyen procariotas, levaduras o células eucariotas superiores. Los
procariotas adecuados incluyen pero no se limitan a eubacterias,
como organismos Gram negativos o Gram positivos, por ejemplo
Enterobacterias como E. coli. Varias cepas de E. coli
son disponibles públicamente, como la cepa de E. coli K12
MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.357); cepa de
E. coli W3110 (ATCC 53.325) y K5 772 (ATCC 53.635). Otras
células huésped procariotas adecuadas incluyen enterobacterias como
Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia,
Kleibsella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella
typhymurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescens, y
Sighella, así como Bacilos como, B. subtillis y B.
licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P
descrito en DD 266.710 publicado el 12 de abril de 1989),
Pseudomonas como P. aureginosa, y Streptomyces.
Varias cepas de E. coli son disponibles públicamente, como
la cepa de E. coli K12 MM294 (ATCC 31.446); E. coli
X1776 (ATCC 31.357); cepa de E. coli W3110 (ATCC 53.325) y K5
772 (ATCC 53.635). Estos ejemplos son ilustrativos más que
limitantes. La cepa W3110 es una célula huésped o célula parenteral
preferida particularmente porque es una cepa huésped común para
fermentaciones con productos de ADN recombinante. Preferiblemente,
la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas
proteolíticos. Por ejemplo la cepa W3110 se puede modificar para
realizar una mutación genética en los genes que codifican proteínas
endógenas de la huésped., con ejemplos de tales huésped que
incluyen E. coli W3110 cepa 1A2, que tiene el genotipo
completo tonA; E. coli W3110 cepa 9E4, que tiene el genotipo
completo tonA ptr3, E. coli W3110 cepa 27C7 (ATCC 55.244),
que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15
(argF-lac) 169 degP ompT karl; E. coli W3110
cepa 37D6 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo tonA
ptr3phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG
kan^{r}; E. coli W3110 cepa 40B4 que es la cepa 37D6 con una
mutación por deleción degP sin resistencia a kanamicina; y
una cepa de E. coli que tiene una proteasa periplásmica
mutante descrita en la Patente de EE.UU. Nº 4.946.783 publicada el 7
de agosto de 1990. Alternativamente, son adecuados otros
procedimientos in vitro de clonación, por ejemplo PCR u otras
reacciones con polimerasa de ácido nucleico.
Además de los procariotas, los microorganismos
eucariotas como hongos filamentosos o las levaduras son adecuados
como hospedadores de clonación o expresión de vectores que codifican
el polipéptido PRO. Saccharomyces cerevisiae es un
microorganismo hospedador eucariota inferior usado comúnmente.
Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse,
Nature, 290: 140 [1981]; (documento EP139.383
publicado el 2 de mayo de 1985); Hospedadores de
Kluiveromyces (Patente de EE.UU. Nº 4.943.529; Fleer y col.,
Bio/Technology, 9:968-975 (1991))
como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C,
CBS683, CBS4574; Louvencourt y col., J. Bacteriol.,
737 [1993]), K. fragilis (ATCC 12.244), K.
bulgaricus (ATCC16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178),
K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophylarum (ATCC
36.906; Van dern Berg y col., Bio/Technollogy, 8: 135
(1990)); K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia
(documento EP402.226) Pichia pastoris (documento EP183.070;
Sreekrishna y col., J. Basic Microbiol., 28:
265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia
(documento EP244.234); Neurospora crassa (Case y col.,
Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU., 76:
5259-5263 [1979]; Schwanniomyces como
Schwanniomyces occidentalis (documento EP394.538 publicado el
31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos como, por ejemplo
Neurospora, Penicillium, Tolyplocadium (WO91/00357 publicada
el 10 de enero de 1991), y hospedadores aspergillus como A.
nidulans (Ballance y col., Biochem. Biophys. Res.
Commun., 112: 284-289 [1983]); Tiburn y
col., Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton
y col., Proc. Nati. Acad. Sci EEUU, 81:
1470-1474 [1984]) y A. niger (Kelly ye Hynes,
EMBO J. 4: 475-479 [1985]. Las
levaduras metilotróficas son adecuadas en la presente memoria
descriptiva pero no se limitan a, una levadura capaz de crecer en
metanol selecionada entre los géneros constituidos por Hansenula,
Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis y
Rhodotorula. Se puede encontrar una lista de especies
específicas que son ejemplos de esta clase de levaduras en C.
Anthony, "The Biochemistry of Methylotrophs" (Bioquímica de los
Metilótrofos), 269 (1982).
Las células huésped adecuadas para la expresión
de polipéptidos PRO glicosilados se derivan de organismos
pluricelulares. Algunos ejemplos de células de invertebrado incluyen
células de insecto como Drosophyla S2 y Spodoptera Sf9, así como
células vegetales. Algunos ejemplos de células huésped de mamífero
útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) y células
COS. Ejemplos más específicos incluyen línea de riñón de mono CV1
transformada con el SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651);
línea de riñón embrionario humano (células 293 ó 293 subclonadas
para un crecimiento en cultivos en suspensión, Graham y col., J.
Gen Virol., 36: 59 (1977)); células de hámster
chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci.
EE.UU., 77: 4216 (1980)); células de Sertoli de ratón
(YM4, Mather Biol Reprod., 23: 243-251
(1980)); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células
hepáticas (Hep G2, HB 8065); y células de tumor mamario de ratón
(MMT 060562, ATCC CCL51). Se supone que la selección de la célula
huésped apropiada depende de la experiencia en la materia.
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El ácido nucleico (por ejemplo ADNc o ADN
genómico) que codifica un polipéptido PRO deseado se puede
introducir en un vector replicativo para clonación (amplificación
del ADN) o para expresión. Hay varios vectores públicamente
disponibles. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de
plásmido, cósmido, partícula viral o fago. La secuencia de
nucleótidos apropiada se puede introducir en el vector mediante
varios procedimientos. En general, el ADN se introduce en
un(os) sitio(s) de una endonucleasa de restricción
apropiado usando las técnicas conocidas en la materia. Los
componentes del vector incluyen generalmente, pero no se limitan a,
una o más secuencias señal, un origen de replicación, uno o más
genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una
secuencia de terminación de la transcripción. La construcción de
vectores adecuados que contengan uno o más de estos componentes
emplea técnicas de ligación habituales que los expertos en la
materia conocen.
El polipéptido PRO de interés se puede producir
de modo recombinante no sólo directamente, sino además como un
polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser
una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de corte
específico en el extremo N terminal de la proteína madura o del
polipéptido. En general, la secuencia señal puede ser un componente
del vector, o puede ser parte del ADN del polipéptido PRO que se
introduce en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia
señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de la
secuencias guía de la fosfatasa alcalina, la penicilasa, la 1pp, o
la enterotoxina termoestable II. Para la secreción en levaduras la
secuencia señal, por ejemplo, la secuencia guía de la invertasa de
levadura, la secuencia guía del factor alfa (incluyendo los factores
\alpha de Saccharomyces y Kluiveromyces, descrito
el último en la Patente de EE.UU. Nº 5.010.182), o la secuencia guía
de la fosfatasa ácida, la secuencia guía de la glucoamilasa de
C. albicans (documento EP362.179 publicado el 4 de abril de
1990), o la secuencia señal descrita en el documento WO90/13646
publicado el 15 de noviembre de 1990. En la expresión de células de
mamífero, se pueden usar secuencias señal para dirigir la secreción
de la proteína, como secuencias señal de polipéptidos de secreción
de la misma especie o relacionadas, así como secuencias guía de
secreción virales.
Tanto los vectores de expresión como los de
clonación contienen una secuencia de nucleótidos que hace que el
vector se pueda replicar en una o más células huésped seleccionadas.
Tales secuencias son muy conocidas para una variedad de bacterias,
levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es
adecuado para la mayoría de las bacterias gram negativas, el origen
del plásmido de 2 \mum es adecuado para levaduras y varios
orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles
para vectores de clonación en células de mamífero.
Los vectores de expresión y clonación contendrán
típicamente un gen de selección, también denominado marcador de
selección. Los genes de selección típicos codifican proteínas que
(a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por
ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b)
complementan diferencias auxotróficas, o (c) proporcionan
nutrientes críticos no disponibles en los medios complejos, por
ejemplo el gen que codifica la D-alanina racemasa
para Bacilos.
Un ejemplo de marcadores de selección adecuados
para células de mamífero son aquellos que posibilitan la
identificación de las células competentes para llevar el ácido
nucleico del polipéptido PRO, como DHFR o timidina quinasa. Una
célula huésped apropiada cuando se emplea un DHFR silvestre es la
línea celular CHO deficiente en actividad DHFR, preparada y
propagada como se describe en Urlaub y col., Proc. Nati. Acad.
Sci. EE.UU., 77: 4216 (1980). Un gen de selección
adecuado para usar en levaduras es el gen trp1 presente en el
plásmido de levaduras YRp7 [Stinchcomb y col., Nature,
282: 39 (1979); Kingsman y col., Gene, 7: 141
(1979; Tschemper y col., Genes, 10: 157 (1980)]. El
gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante
de levadura que carezca de la capacidad de crecer en triptófano, por
ejemplo ATCC Nº 44076 o PEP4-1 [Jones,
Genetics, 85: 12 (1977)].
Los vectores de expresión y clonación contienen
normalmente un promotor unido operativamente a la secuencia de
nucleótidos del polipéptido PRO para dirigir la síntesis del ARNm.
Los promotores reconocidos por una variedad de células huésped
potenciales son muy conocidos. Los promotores adecuados para usar
con hospedadores procariotas incluyen los sistemas promotores de la
\beta-lactamasa y de la lactosa [Chang y col.,
Nature, 275: 615 (1978); Goeddel y col.,
Nature, 281: 544 (1979)], fosfatasa alcalina, un
sistema promotor triptófano (trp), [Goedel, Nucleic Acid
Res., 8: 4057 (1980); documento EP36.776], y promotores
híbridos como el promotor tac [deBoer y col., Proc. Nati. Acad.
Sci. EE.UU., 80: 21-25 (1983)]. Los
promotores para usar en sistemas bacterianos también contendrán una
secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) unida
operativamente al ADN que codifica el polipéptido PRO deseado.
Algunos ejemplos de secuencias promotoras
adecuadas para usar con células huésped de levadura incluyen los
promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa
[Hitzeman y col., J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)], u
otros enzimas glucolíticos [Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg.
7: 149 (1968)]; Holland, Biochemistry, 17: 4900
(1978), como la enolasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa,
fosfofructoquinasa,
glucosa-6-fosfato isomerasa,
3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa,
triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.
Otros promotores de levadura, que son promotores
inducibles que tienen la ventaja adicional de tener controlada la
transcripción mediante condiciones de crecimiento, son las regiones
promotoras para la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C,
fosfatasa ácida, enzimas de degradación asociadas al metabolismo del
nitrógeno, metalotioneína,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de la
maltosa y la galactosa. Los vectores y promotores adecuados para el
uso en expresión en levaduras se describen con más detalle en el
documento EP73.657.
La transcripción del polipéptido PRO a partir de
vectores en células huésped de mamífero está controlada, por
ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus como el
virus del polioma o el virus de la viruela aviar (documento
UK2.211.504 publicado el 5 de julio de 1989), adenovirus (como
Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar,
citomegalovirus, retrovirus a, virus de la hepatitis B y virus del
simio 40 (SV40), de promotores de mamífero heterólogos, por
ejemplo, el promotor de la actina o un promotor de una
inmunoglobulina, y promotores de choque térmico, siempre que tales
promotores sean compatibles con los sistemas de la célula
huésped.
La transcripción de un ADN que codifique el
polipéptido PRO deseado en eucariotas superiores se puede
incrementar introduciendo una secuencia potenciadora en el vector.
Los potenciadores son elementos que actúan en cis, normalmente de
aproximadamente 10 a 300 pb, que actúan sobre un promotor para
aumentar su transcripción. Muchas secuencias potenciadoras se
conocen muy bien actualmente para genes de mamíferos (globina,
elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e
insulina). Típicamente, sin embargo, se usará un potenciador de un
virus celular eucariota. Algunos ejemplos incluyen el potenciador
del SV40 en el extremo tardío del origen de replicación (pb
100-270), el potenciador del promotor temprano del
citomegalovirus, el potenciador del polioma o en el extremo tardío
del origen de replicación, y potenciadores de adenovirus. El
potenciador se puede cortar y desplazar a la posición 5' ó 3' de la
secuencia que codifica el polipéptido PRO, pero se localiza
preferiblemente en el sitio 5' del promotor.
Los vectores de expresión usados en células
huésped eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales,
humanas o células nucleadas de otro organismo pluricelulares)
contendrán además secuencias necesarias para la terminación de la
transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias son
comúnmente disponibles en el extremo 5' y, ocasionalmente del 3',
regiones no traducidas de ADNs o ADNcs eucariotas o virales. Estas
regiones contienen segmentos nucleotídicos transcritos como
fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que
codifica los polipéptidos PRO.
Aún otros procedimientos, vectores y células
huésped adecuadas para la adaptación para la síntesis de
polipéptidos PRO en cultivos celulares de vertebrado recombinantes
se describen en Gething y col., Nature, 293:
620-625 (1981); Mantei y col., Nature,
281: 40-46 (1979); documentos EP117.060 y
EP117.058.
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La amplificación y/o expresión génica se puede
medir directamente en una muestra, por ejemplo, con una
transferencia Southern convencional, transferencia Northern para
cuantificar la transcripción del ARNm [Thomas, Proc. Nati. Acad.
Sci. EE.UU., 77: 5201-5205 (1980)],
transferencia en mancha (análisis de ADN), o hibridación in
situ, usando una sonda etiquetada apropiadamente, en base a las
secuencias proporcionadas en la presente memoria descriptiva.
Alternativamente, se pueden usar anticuerpos que reconozcan cadenas
dobles específicas incluyendo cadenas dobles de ADN, cadenas dobles
de ARN y cadenas dobles híbridas de ADN-ARN o
cadenas dobles de ADN-proteína. Los anticuerpos a su
vez se pueden etiquetar y el ensayo se lleva a cabo cuando la
cadena doble está unida a la superficie, de modo que tras la
formación de la cadena doble en la superficie, se puede detectar la
presencia de anticuerpos unidos a la cadena doble.
La expresión génica, alternativamente, se puede
medir mediante procedimientos inmunológicos, como tinciones
inmunohistoquímicas de células cortes de tejidos y análisis de
cultivos celulares o fluidos sanguíneos, para cuantificar
directamente la expresión del producto del gen. Los anticuerpos
útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o análisis de muestras
de fluidos pueden ser monoclonales o policlonales y se pueden
preparar en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos
se pueden preparar contra un polipéptido PRO de secuencia nativa o
contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN
proporcionadas en la presente memoria descriptiva o contra
secuencias exógenas fusionadas al ADN de un polipéptido PRO y que
codifican un epítopo para un anticuerpo específico.
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Las formas de polipéptidos PRO se pueden
recuperar del medio de cultivo o de los lisados de las células
huésped. Si están unidos a la membrana, se pueden liberar de la
membrana usando una solución detergente adecuada (por ejemplo
Triton-X 100) o por corte enzimático. Las células
empleadas en la expresión de los polipéptidos PRO se pueden romper
por varios procedimientos físicos o químicos, como ciclos de
congelación-descongelación, sonicación, ruptura
mecánica, o agentes de lisis celular.
Puede desearse purificar los polipéptidos PRO a
partir de proteínas o polipéptidos celulares recombinantes. Los
siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de
purificación adecuados. Por fraccionamiento en una columna de
intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa;
cromatografía en una resina de sílice o de intercambio catiónico
como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE (gel de
poliacrilamida con SDS); precipitación con sulfato de amonio;
usando filtración por gel, por ejemplo, Sephadex
G-75; columnas de Proteína
A-Sepharose para eliminar los contaminantes como
IgG; y columnas de quelantes metálicos para unir las formas
etiquetadas con epítopos del polipéptido PRO. Se pueden varios
procedimientos de purificación de proteínas como procedimientos muy
conocidos en la técnica y descritos por ejemplo en Deutscher,
"Methods in Enzimology" (Procedimientos en
enzimología), 182 (1990); Alcances, "Protein Purification:
Principles and Practice" (Purificación de proteínas:
Principios y práctica), Springer-Verlag, New York
(1982). Las etapas de purificación seleccionadas dependerán, por
ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción usado y el
polipéptido PRO particular producido.
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Las secuencias de nucleótidos (o sus
complementarias) que codifican los polipéptidos PRO de la presente
invención, tienen varias aplicaciones en la técnica de la biología
molecular, incluyendo uso en sondas de hibridación, en mapeo
cromosómico y génico y en la generación de ARN y ADN antisentido. El
ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO será además útil
para la preparación de polipéptidos PRO mediante las técnicas
recombinantes descritas en la presente memoria descriptiva.
El ácido nucleico que codifica el polipéptido
PRO de secuencia nativa de longitud completa o sus porciones, se
pueden usar como sondas de hibridación para genotecas de ADNc para
aislar el gel del polipéptido PRO de longitud completa o para
aislar aún otros genes (por ejemplo, los que codifican variantes
naturales del polipéptido PRO o de los polipéptidos PRO de otras
especies) que tengan una identidad de secuencia deseada con las
secuencias de nucleótidos del polipéptido PRO. Opcionalmente, la
longitud de las sondas será de aproximadamente 20 a 50 bases. Las
sondas de hibridación se pueden derivar de secuencias de nucleótidos
de cualquiera de las moléculas de ADN descritas en la presente
memoria descriptiva o de secuencias genómicas incluyendo promotores,
elementos potenciadores e intrones del ADN que codifica el
polipéptido PRO de secuencia nativa. A modo de ejemplo, un
procedimiento de selección comprenderá el aislamiento de la región
codificante del gen del polipéptido PRO usando la secuencia de ADN
conocida para sintetizar una sonda seleccionada de aproximadamente
40 bases. Las sondas de hibridación se pueden etiquetar con una
variedad de etiquetas, incluyendo radionucleótidos como P^{32} o
S^{35}, o etiquetas enzimáticas como la fosfatasa alcalina unida
a la sonda vía sistemas de unión avidina/biotina. Se pueden usar
sondas etiquetadas que tengan una secuencia complementaria a la del
gen del polipéptido PRO específico de la presente invención para
investigar genotecas de ADNc, ADN genómico o ARNm humanas para
identificar con que miembros de tales genotecas hibrida la sonda.
Las técnicas de hibridación se describen con más detalle en os
siguientes Ejemplos.
Las TSE descritas en la presente solicitud se
pueden emplear de modo similar como sondas, usando los
procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva.
Las sondas se pueden emplear en técnicas de PCR
para generar un grupo de secuencias para identificar secuencias de
polipéptido PRO estrechamente relacionadas.
Las secuencias de nucleótidos que codifican un
polipéptido PRO se pueden usar además para construir sondas de
hibridación para el mapeo del gen que codifica es polipéptido PRO y
para el análisis genético de individuos con alteraciones genéticas.
Las secuencias de nucleótidos proporcionadas en la presente memoria
descriptiva se pueden usar para el mapeo de un cromosoma y regiones
específicas del cromosoma usando técnicas conocidas como la
hibridación in situ, análisis de unión frente marcadores
cromosómicos conocidos e investigación de genotecas por
hibridación.
Los polipéptidos PRO se pueden usar en análisis
para identificar sus ligandos. De modo similar, se pueden
identificar los inhibidores de la interacción de unión
receptor/ligando. Las proteínas implicadas en tal interacción de
unión se pueden usar además para investigar péptidos o pequeñas
moléculas inhibidoras o agonistas de la interacción de unión. Los
análisis de investigación se pueden diseñar para encontrar
compuestos guía que mimeticen la actividad biológica del
polipéptido PRO nativo o un ligando para el polipéptido PRO. Tales
análisis de investigación incluirán análisis preparadas para
investigaciones de alto rendimiento de genotecas químicas,
haciéndolos particularmente adecuados para identificar candidatos
farmacológicos de molecularmente pequeños. Las moléculas pequeñas
contempladas incluyen compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos.
Los análisis se pueden realizar de varias formas, incluyendo
análisis de unión proteína-proteína, análisis de
investigación bioquímica, inmunoanálisis y análisis celulares,
caracterizados en la técnica.
Los ácidos nucleicos que codifican un
polipéptido PRO o sus formas modificadas se pueden usar además para
generar animales transgénicos o animales "knock out"
(sin un determinado gen) que a su vez, son útiles en el desarrollo
e investigación terapéutica de reactivos útiles. Un animal
transgénico (por ejemplo, un ratón o una rata) es un animal que
tiene células que contienen un transgen, dicho transgen fue
introducido en el animal o un ancestro del animal en una etapa
prenatal, por ejemplo, en una etapa embrionaria. Un transgen es un
ADN que se integra en el genoma de una célula a partir de la que se
desarrolla un animal. En una realización, el ADNc que codifica un
polipéptido PRO de interés se puede utilizar para clonar ADN
genómico que codifique el polipéptido PRO según con las técnicas
establecidas y las secuencias genómicas usadas para generar los
animales transgénicos que contienen las células que expresan el ADN
que codifica el polipéptido PRO. Los procedimientos para generar
animales transgénicos, particularmente animales como ratones o
ratas, se han convertido en convencionales en la técnica y se
describen, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. N 4.736.866 y
4.870.009. Típicamente, las células individuales serán las dianas
para la incorporación de un transgen del polipéptido PRO con
potenciadores específicas de tejido. Los animales transgénicos que
incluyen una copia de un transgen que codifica un polipéptido PRO
introducido en la línea germinal del animal en una etapa embrionaria
se pueden usar para examinar el efecto de la expresión aumentada
del ADN que codifica el polipéptido PRO. Tales animales se pueden
usar como animales de prueba para reactivos que se crea que
confieren protección frente, por ejemplo, a estados patológicos
asociados con su sobreexpresión. Según esta faceta de la invención,
un animal se trata con el reactivo y una incidencia reducida del
estado patológico en comparación con los animales sin tratar que
lleven el transgen, indicaría una intervención terapéutica potencial
del estado patológico.
Alternativamente, se pueden usar homólogos no
humanos de los polipéptidos PRO para construir un animal
"knock out" para el polipéptido PRO que tiene un gen
defectuoso o alterado que codifica el polipéptidos PRO de interés
como resultado de una recombinación homóloga entre el gen endógeno
que codifica el polipéptidos PRO y un ADN genómico alterado que
codifica el polipéptidos PRO introducido en una célula embrionaria
del animal. Por ejemplo, ADNc que codifique un polipéptidos PRO que
se use para clonar ADN genómico que codifica el polipéptidos PRO
según las técnicas establecidas. Se puede eliminar o reemplazar una
porción del ADN genómico que codifica un polipéptido PRO con otro
gen como un gen que codifique un marcador de selección que se usa
para controlar la integración. Típicamente, se incluyen en el vector
varias quilobases de ADN sin alterar flanqueante (tanto en el
extremo 5' como en el 3') [ver, por ejemplo, Thomas y Capecchi,
Cell, 51: 503 (1987) para una descripción de vectores
de recombinación homóloga]. El vector se introduce en una línea
celular troncal embrionaria (por ejemplo por electroporación) y se
seleccionan las células en las que se introdujo el ADN y ha
recombinado homólogamente con el ADN endógeno [ver por ejemplo, Li y
col., Cell, 69: 915 (1992)]. Las células
seleccionadas se inyectan entonces en un blastocisto de un animal
(por ejemplo, ratón o rata) para formar quimeras de agregación [ver
por ejemplo, Bradley, en "Teratocarcinomas and Embrionyc Stem
Cells: A Practical Approach", (Teratocarcinomas y células
troncales embrionarias: Un enfoque práctico), E. J. Robertson, ed.
(IRL, Oxford, 1987), págs 113-125]. Un embrión
quimérico se puede después implantar en un animal receptor hembra
pseudoembarazada adecuada y el embrión llevado a término para crear
un animal "knock out". La descendencia que porta el ADN
recombinado homólogamente en sus células germinales se puede
identificar mediante técnicas habituales y se puede usar para criar
animales que contengan en todas sus células el ADN recombinado
homólogamente. Los animales "knock out" se pueden
caracterizar por ejemplo, por su capacidad de defenderse
frente
ciertos estados patológicos y por su desarrollo de estados patológicos debido a la ausencia del polipéptido PRO.
ciertos estados patológicos y por su desarrollo de estados patológicos debido a la ausencia del polipéptido PRO.
Debido a que el polipéptido PRO245 y el ácido
nucleico que lo codifica poseen homología de secuencias con una
proteína transmembrana tirosina quinasa y su ácido nucleico
codificante, se pueden utilizar sondas basadas en la secuencia de
nucleótidos de PRO245 para identificar otras proteínas transmembrana
tirosina quinasa. Las formas solubles del polipéptido PRO245 se
pueden utilizar como antagonistas de la actividad de PRO245 unido a
membrana tanto in vitro como in vivo. Los polipéptidos
PRO245 se pueden utilizar en ensayos de cribado diseñados para
identificar agonistas o antagonistas del polipéptido PRO245 nativo,
en el que dichos ensayos pueden tomar la forma de cualquier ensayo
de unión convencional de tipo celular o bioquímico. Además, el
polipéptido PRO2245 puede servir como un marcador molecular para los
tejidos en los que el polipéptido se expresa específicamente.
Las dosis y administración de PRO317, agonista
de PRO317 o antagonista de PRO317 en una composición farmacéutica se
describen en WO99/14328.
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La presente invención proporciona adicionalmente
anticuerpos anti polipéptido PRO. Alguno ejemplos de anticuerpos
incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados,
biespecíficos, y heteroconjugados.
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Los anticuerpos anti polipéptido PRO pueden
comprender anticuerpos policlonales. Los expertos en la materia
conocen los procedimientos para preparar anticuerpos policlonales.
Los anticuerpos policlonales se pueden producir en un mamífero, por
ejemplo mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y,
si se desea, un adyuvante. Típicamente el agente inmunizante y/o
adyuvante se inyectará en el mamífero mediante múltiples
inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante
puede incluir el polipéptido PRO o una de sus proteínas de fusión.
Puede ser útil conjugar el agente inmunizante a una proteína que se
sepa que es inmunogénica en el mamífero que se está inmunizando.
Algunos ejemplos de tales proteínas inmunogénicas incluyen, pero no
se limitan a, hemocianina de lapa californiana, seroalbúmina,
tiroglobulina bovina, e inhibidor de tripsina de semilla de soja.
Algunos ejemplos de adyuvantes que se pueden emplear incluyen
adyuvante completo de Freund y adyuvante MPL-TDM
(Monofosforil Lípido A, dicorinomicolato de trealosa sintético). Un
experto en la materia sin demasiada experiencia puede seleccionar el
protocolo de inmunización.
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Los anticuerpos anti polipéptido PRO pueden,
alternativamente, ser anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos
monoclonales se pueden preparar usando procedimientos de formación
de hibridomas, como los que se describen en Kohler y Milstein,
Nature, 256: 495 (1975). En un procedimiento de
formación de hibridomas, un ratón, hámster u otro animal hospedador
apropiado, se inmuniza típicamente con un agente inmunizante para
obtener linfocitos que produzcan o sean capaces de producir
anticuerpos que se unan activamente al agente inmunizante.
Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in
vitro.
El agente inmunizante incluirá típicamente el
polipéptido PRO de interés o una de sus proteínas de fusión.
Generalmente, se usan linfocitos de sangre periférica ("PBLs")
si se desean células de origen humano, o se usan células de bazo o
células de ganglios linfoides si se desean fuentes mamíferas no
humanas. Los linfocitos se fusionan entonces con una línea
inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, como
polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma [Goding,
"Monoclonal Antibodies: Principles and Practice"
(Anticuerpos monoclonales: Principios y práctica), Academic Press,
(1986) págs 59-103]. Las líneas celulares
inmortalizadas son normalmente células de mamífero transformadas,
particularmente células de mieloma de origen murino, bovino o
humano. Normalmente, se emplean líneas celulares de mieloma de rata
o ratón. Las células de hibridoma se cultivan en un medio de
cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o más sustancias
que inhiben el crecimiento o la supervivencia de células
inmortalizadas sin fusionar. Por ejemplo, si las células
parenterales carecen del enzima hipoxantina guanina fosforibosil
transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas
típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio
HAT"), cuyas sustancias evitan el crecimiento de células
deficientes en HGPRT.
Las líneas celulares inmortalizadas preferidas
son las que se fusionan eficazmente, soportan los altos y estables
niveles de expresión de anticuerpo de las células que producen el
anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio como el medio
HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son líneas
de mieloma murino, que se pueden obtener por ejemplo, del Salk
Institue Cell Distribution Center (Centro de distribución
celular del Instituo Salk), San Diego, California y del American
Type Culture Collection (Colección de cultivos tipo
estadounidense), Rockville, Maryland. Se ha descrito también a las
líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma
murino-humano para la producción de anticuerpos
monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol., 133: 3001
(1984); Brodeur y col., "Monoclonal Antibody Production
Techniques and Applications" (Técnicas y aplicaciones de la
producción de anticuerpos monoclonales), Marcel Dekker, Inc., New
York, (1987) págs 51-63].
Se puede analizar el medio de cultivo en el que
se cultivan las células de hibridoma para ver la presencia de
anticuerpos monoclonales dirigidos contra el polipéptido PRO de
interés. Preferiblemente, la especificidad de unión los anticuerpos
monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina
mediante inmunoprecipitación o mediante análisis de unión in
vitro, como radioinmunoanálisis (RIA) o análisis de
inmunoabsorción ligada a enzima (ELISA). Tales técnicas son
análisis conocidos en la técnica. La afinidad de unión del
anticuerpo monoclonal puede determinarse por ejemplo, mediante el
análisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem.,
107: 220 (1980).
Después de identificar las células de hibridoma,
los clones se pueden subclonar mediante procedimientos de dilución
limitante y se pueden crecer mediante procedimientos habituales
[Goding, supra]. Los medios de cultivo adecuados para este
propósito incluyen, por ejemplo, Medio Eagle modificado de Dulbecco
y medio RPMI-1640. Alternativamente las células de
hibridoma se pueden crecer in vivo como una ascitis en un
mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones se pueden aislar o purificar a partir de medios de
cultivo o del fluido de la ascitis mediante procedimientos de
purificación con inmunoglobulinas convencionales, por ejemplo,
Proteína A-Sepharose, cromatografía con
hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de
afinidad.
Los anticuerpos monoclonales se pueden realizar
además por procedimientos de ADN recombinante, como los descritos
en la Patente de EE.UU. Nº 4.816.567. El ADN que codifica los
anticuerpos monoclonales de la infección se puede aislar y
secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por
ejemplo usando sondas oligonucleotídicas capaces de unirse
específicamente a los genes que codifican las cadenas pesada y
ligera de los anticuerpos murinos). Las células de hibridoma de la
invención sirven como fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado,
el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que se transfectan
en células huésped como células COS de simio, células de ovario de
hámster chino (CHO), o células de mieloma que de otro modo no
producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de
anticuerpos monoclonales en las células huésped. El ADN también se
puede modificar por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante
de los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera humanas
en lugar de las secuencias murinas homólogas [Patente de EE.UU. Nº
4.816.567; Morrison y col., supra] o mediante unión covalente
a toda la secuencia codificante de la inmunoglobulina o parte de la
secuencia codificante de un polipéptido no inmunoglobulina. Tal
polipéptido no inmunoglobulina se puede sustituir por los dominios
constantes de un anticuerpo de la invención, o se pueden sustituir
por los dominios variables de un sitio de combinación con el
antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo
bivalente quimérico.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos
monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos
monovalentes son muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, un
procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera
de la inmunoglobulina y una cadena pesada modificada. La cadena
pesada se trunca generalmente en cualquier punto de la región Fc
para evitar la reticulación (crosslinking) de la cadena
pesada. Alternativamente, los residuos pertinentes de cisteína se
sustituyen con otro residuo aminoacídico o se eliminan para evitar
la reticulación (crosslinking).
Los procedimientos in vitro son también
adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de
anticuerpos para producir sus fragmentos, particularmente,
fragmentos Fab, se puede lograr usando técnicas habituales conocidas
en la técnica.
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Los anticuerpos anti polipéptido PRO de la
invención pueden comprender adicionalmente anticuerpos humanizados
o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no
humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas,
cadenas de inmunoglobulinas o sus fragmentos (como Fv, Fab, Fab',
F(ab)_{2} u otras subsecuencias de anticuerpos de
unión a antígenos) que contienen secuencias mínimas derivadas de una
inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen
inmunoglobulinas humanas (anticuerpo del receptor) en las que
residuos de una región determinante complementaria (CDR) del
receptor se reemplazan con residuos de una CDR de especies no
humanas (anticuerpo del donante) como ratón, rata o conejo que
tengan la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos
ejemplos, los residuos de la estructura Fv de la inmunoglobulina
humana se reemplazan con los residuos correspondientes no humanos.
Los anticuerpos humanizados pueden comprender además residuos que
no se encuentran ni en el anticuerpo del receptor ni en la CDR o
secuencias estructurales importadas. En general, el anticuerpo
humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos un, y
típicamente dos, dominios variables, en los que todas o
sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una
inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las
regiones FR son las de una secuencia de una inmunoglobulina humana
consenso. El anticuerpo humanizado óptimamente comprenderá demás al
menos una porción de una región constante de una inmunoglobulina
(Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana [Jones y col.,
Nature, 321: 522-525 (1986);
Riechmann y col., Nature, 332: 323-329
(1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:
593-596 (1992)].
Los procedimientos para humanizar anticuerpos no
humanos son muy conocidos en la técnica. Generalmente, un
anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoacídicos
introducidos en el de una fuente que no es humana. Estos residuos
aminoacídicos no humanos se refieren a menudo a residuos de
"importación", que se toman típicamente de un dominio variable
de "importación". La humanización se puede realizar
esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores
[Jones y col., Nature, 321: 522-525
(1986); Riechmann y col., Nature, 332:
323-327 (1988); Verhoeyen y col., Science,
239: 1534-1536 (1988)], sustituyendo CDR
murinas o secuencias CDR para las secuencias correspondientes de un
anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos
"humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de EE.UU. Nº
4.816.567), en los que sustancialmente, menos de un dominio
variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia
correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los
anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los
que algunos residuos CDR y posiblemente residuos FR están
sustituidos por residuos de sitios análogos de anticuerpos
murinos.
Los anticuerpos humanos se pueden producir
además usando varias técnicas conocidas en la técnica, incluyendo
genotecas de exposición a fagos [Hoogenboom y Winter, J. Mol.
Biol., 227: 381 (1991); Marks y col., J. Mol.
Biol., 222: 581 (1991). Están además disponibles las
técnicas de Cole y col., y Boerner y col., para la preparación de
anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col,. "Monoclonal
Antibodies and Cáncer Therapy" (Anticuerpos monoclonales y
terapia del cáncer), Alan R. Liss, pág 77 (1985) y Boerner y col.,
J. Immunol., 147(1): 86-95
(1991)].
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Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos
monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tienen
especificidades de unión por al menos dos antígenos diferentes. En
el caso que nos ocupa, una de las especificidades de unión es por
el polipéptido PRO, la otra es por cualquier otro antígeno, y
preferiblemente por una proteína de superficie celular o receptor o
subunidad receptora.
Los procedimientos para hacer anticuerpos
biespecíficos son conocidos en la técnica. Tradicionalmente, la
producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la
coexpresión de dos pares de cadenas
pesada-ligera/ligera-pesada de
inmunoglobulinas, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes
especificidades [Milstein y Cuello, Nature, 305:
537-539 (1983)]. Debido a la variedad aleatoria de
cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas
(quadromas), producen una mezcla potencial de diez moléculas de
anticuerpo distintas, de las que sólo una tiene la correcta
estructura biespecífica. La purificación de la molécula correcta se
logra normalmente por etapas de cromatografía de afinidad.
Procedimientos similares se describen en el documento WO93/08829,
publicado el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker y col., EMBO
J., 10: 3655-3659 (1991).
Los dominios variables del anticuerpo con las
especificidades de unión deseadas (sitios de combinación
anticuerpo-antígeno) se pueden fusionar a secuencias
del dominio constante de la inmunoglobulina. La fusión
preferiblemente es con un dominio constante de la cadena pesada de
una inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones
bisagra CH2 y CH3. Se prefiere que tengan la primera región
constante (CH1) de la cadena pesada que contiene el sitio necesario
para la unión de la cadena ligera presente en al menos una de las
fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de la cadena pesada
de la inmunoglobulina, si se desea, la cadena pesada de la
inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y
se cotransfectan en un organismo hospedador adecuado. Para detalles
adicionales para generar anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo,
Suresh y col., "Methods in Enzymology" (Procedimientos
en enzimología), 121: 210 (1986).
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Los anticuerpos heteroconjugados están además
dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos
heteroconjugados están compuestos por dos anticuerpos unidos
covalentemente. Se ha propuesto a tales anticuerpos, por ejemplo,
para hacer diana en células del sistema inmune para células no
deseadas [Patente de EE.UU. Nº 4.676.980], y para el tratamiento de
la infección del VIH [documentos WO91/00360; WO92/200373; EP03089].
Se contempla que los anticuerpos se puedan preparar in vitro
usando procedimientos conocidos en la química de proteínas
sintéticas, incluyendo las que implican agentes de reticulantes. Por
ejemplo, se pueden construir inmunotoxinas usando una reacción de
intercambio de sidulfuro o formando un enlace tioéter. Algunos
ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen
iminotiolato y metil-mercaptobutirimidato y los
descritos, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. Nº 4.676.980.
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Los anticuerpos anti polipéptido PRO de la
invención tienen varias utilidades. Por ejemplo los anticuerpos
anti polipéptido PRO se pueden usar en ensayos de diagnóstico para
un polipéptido PRO, por ejemplo para detectar la expresión en
células, tejidos específicos, o suero. Se pueden usar varias
técnicas de ensayo de diagnóstico conocidas en la técnica, como
ensayos de unión competitiva, ensayos bocadillo directos e
indirectos y ensayos de inmunoprecipitación realizados en fases
heterogéneas u homogéneas [Zola, "Monoclonal Antibodies: A
Manual of Techniques" (Anticuerpos monoclonales: Manual de
técnicas), CRC Press. Inc. (1987) págs 147-158]. Los
anticuerpos usados en los ensayos de diagnóstico se pueden
etiquetar con un residuo detectable. El residuo detectable debería
ser capaz de producir, directa o indirectamente, una señal
detectable. Por ejemplo, el residuo detectable puede ser un isótopo
radiactivo, como H^{3}, C^{14}, P^{32}, S^{35} o I^{125},
un compuesto fluorescente o quimiofluorescente, como fluoresceína
isotiocianato, rodamina, o luciferina, o un enzima, como fosfatasa
alcalina, beta-galactosidasa, o peroxidasa de rábano
picante. Se puede emplear cualquier procedimiento conocido en la
técnica para conjugar el anticuerpo al residuo detectable,
incluyendo los procedimientos descritos en Hunter y col.,
Nature, 144: 945 (1962); David y col.,
Biochemistry, 13: 1014 (1974); Pain y col., J.
Immunol. Meth., 40: 219 (1981); y Nygren, J. Histochem
and Cytochem., 30: 407 (1982).
Los anticuerpos anti polipéptido PRO son además
útiles para la purificación por afinidad de un polipéptido PRO a
partir de un cultivo de células recombinantes o de fuentes
naturales. En este proceso, los anticuerpos contra el polipéptido
PRO se inmovilizan en un soporte adecuado, como resina Sephadex o
papel de filtro, usando procedimientos muy conocidos en la técnica.
El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto entonces con una
muestra que contiene el polipéptido PRO que se va a purificar, una
vez purificado, se lava con un disolvente adecuado que eliminará
sustancialmente todo el material de la muestra salvo el polipéptido
PRO, que está unido al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el
soporte se lava con otro disolvente adecuado que liberará el
polipéptido PRO del anticuerpo.
Los siguientes ejemplos se ofrecen con
propósitos sólo ilustrativos, y no pretenden limitar el alcance de
la presente invención en ningún modo.
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Los reactivos disponibles comercialmente
mencionados en los ejemplos se usaron según las instrucciones del
fabricante a menos que se indique de otro modo. La fuente de las
células identificadas en los siguientes ejemplos, y en toda la
memoria descriptiva, mediante números de registro de adquisiciones
ATCC es la American Type Cultures Collection (Colección de cultivos
tipo estadounidense), Rockville Maryland.
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Se usaron las secuencias de los dominios
extracelulares (SCD) (incluyendo la secuencia señal de secreción,
si existiera) de aproximadamente 950 proteínas de secreción
conocidas de la base de datos pública Swiss-Prot
para buscar bases de datos de EST. Las bases de datos de EST
incluyeron bases de datos públicas (por ejemplo, Dayhoff, GenBank),
y bases de datos privadas (por ejemplo, LIFESEQ^{TM}, Incyte
Pharmaceutical, Palo Alto, CA). La búsqueda se realizó usando el
programa informático BLAST o BLAST2 (Altschul. y Gish, Methods in
Enzimology, 266: 460-80 (1996);
http://blast.wustl/edu/blast/README.html) como comparación de las
secuencias proteicas ECD hasta una traducción de 6 pautas de
lectura de las secuencias EST. Aquellas comparaciones que con un
Blast tuvieron un resultado de 70 (o 90 en algunos casos) o mayor y
que no codificaban proteínas conocidas se agruparon y reunieron en
secuencias de ADN consenso con el programa "phrap" (Phil Green,
Universidad de Washington, Seattle, WA;
(http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/phrap.html).
Usando esta investigación de homología de
dominios extracelulares, se reunieron secuencias de ADN consenso
relacionadas con las otras secuencias EST identificadas. Además, las
secuencias de ADN consenso obtenidas a menudo (pero no siempre) se
extendieron usando ciclos repetidos de BLAST y phrap para extender
la secuencia consenso tanto como fuera posible usando las fuentes
de secuencias EST descritas anteriormente.
En base a las secuencias consenso obtenidas como
se describe anteriormente, se sintetizaron después oligonucleótidos
y se usaron para identificar por PCR una genoteca de ADNc que
contenía la secuencia de interés y para usar como sondas para
aislar un clon de la secuencia codificante de longitud completa de
un polipéptido PRO. A menudo se diseñaron cebadores de PCR directos
(.f) y reversos (.r) generalmente en el intervalo de 20 a 30
nucleótidos para producir un producto de PCR de aproximadamente 100
a 1000 pb de longitud. Las secuencias sonda (.p) típicamente tienen
de 40 a 55 pb de longitud. En algunos casos se sintetizaron
oligonucleótidos adicionales cuando la secuencia consenso era mayor
de 1 a 1,5 kpb. Para investigar varias genotecas en busca de un
clon de longitud completa, el ADN de las genotecas se investigó
mediante amplificación con PCR, como en Ausbel y col.,
"Current Protocols in Molecular Biology" (Protocolos
actuales en biología molecular), con el par de cebadores de PCR.
Una genoteca positiva se usó entonces
para aislar clones que codificaran el gen de interés usando el oligonucleótido sonda y uno del par de cebadores.
para aislar clones que codificaran el gen de interés usando el oligonucleótido sonda y uno del par de cebadores.
Las genotecas de ADNc que se usaron para aislar
los clones de ADNc se construyeron mediante procedimientos
habituales usando reactivos disponibles comercialmente como los de
Invitrogen, San Diego, CA. El ADNc se cebó con un oligo dT que
contenía un sitio NotI, se ligó en romo con adaptadores SalI
semifosforilados, se cortó con NotI, y se determinó su tamaño
aproximadamente en una electroforesis en gel, y se clonó en un
sentido determinado en vector de clonación adecuado (como pRKB o
pRKD; pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene el sitio SfiI;
ver Holmes y col., Science, 253:
1278-1280 (1991)) en los sitios únicos XhoI y
NotI.
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Se ensambló una secuencia de ADN consenso en
relación a las otras secuencias EST identificadas tal como se
describe en el Ejemplo 1 anterior, donde la secuencia consenso se
denomina en la presente invención como DNA30954.
En base a la secuencia consenso DNA30954, se
sintetizaron oligonucleótidos para identificar mediante PCR una
genoteca de ADNc que contenía la secuencia de interés y para
utilizar como sondas para aislar un clon de la secuencia codificante
de longitud completa para PRO245.
Se sintetizaron una pareja de cebadores para PCR
(directo e inverso):
cebador para PCR directo
| 5'-ATCGTTGTGAAGTTAGTGCCCC-3' | (SEC ID Nº 65) |
\vskip1.000000\baselineskip
cebador para PCR inverso
| 5'-ACCTGCGATATCCAACAGAATTG-3' | (SEC ID Nº 66) |
Adicionalmente, se construyó una sonda de
hibridación de oligonucleótidos sintéticos a partir de la secuencia
consenso DNA30954 que tenía la siguiente secuencia de
nucleótidos:
Sonda de hibridación
| 5'-GGAAGAGGATACAGTCACTCTGGAAGTATTAGTGGCTCCAGCAGTTCC-3' | (SEC. ID N°. 67) |
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Con el fin de cribar varias genotecas por una
fuente de un clon de longitud completa, se cribó el ADN de las
genotecas mediante la amplificación por PCR con la pareja de
cebadores para PCR identificada anteriormente. A continuación, se
utilizó una genoteca positiva para aislar clones que codificaban el
gen de PRO245 utilizando la sonda de oligonucleótidos y uno de los
cebadores de PCR.
El ARN para la construcción de las genotecas de
ADNc se aisló de tejido de hígado fetal humano. La secuenciación
del ADN de los clones aislados tal como se describe anteriormente
produjo la secuencia de ADN de longitud completa para el PRO245
[denominado en la presente invención como UNQ219
(DNA35638-1141)] y la secuencia proteica derivada
para el PRO245.
La secuencia de nucleótidos completa de UNQ219
(DNA35638-1141) se muestra en la Figura 1 (SEC ID Nº
63). El clon UNQ219 (DNA35638-1141) contiene un
único marco de lectura abierto con un sitio de inicio de la
traducción aparente en las posiciones de nucleótidos
89-91 y que termina en el codón de parada en las
posiciones de nucleótidos 1025-1027 (figura 1; SEC
ID No. 63). El precursor del polipéptido previsto tiene 312
aminoácidos de longitud (Figura 2). El clon UNQ219
(DNA35638-1141) se ha depositado con la ATCC el 16
de septiembre de 1997 y se le asignó el número de deposito ATCC
209265.
El análisis de la secuencia de aminoácidos del
polipéptido PRO245 de longitud completa sugiere que una parte de la
misma posee un 60% de identidad de aminoácidos con la proteína
c-myb humana y, por tanto, puede ser un nuevo
miembro de la familia de receptores de proteínas transmembrana
tirosina quinasa.
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El siguiente procedimiento describe el uso de
una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PRO como
una sonda de hibridación.
El ADN que comprende la secuencia codificante de
un polipéptido PRO de interés como se describe en la presente
memoria descriptiva se puede emplear como una sonda o usar como base
a partir de la cual preparar sondas para buscar ADNs homólogos (como
los que codifican variantes naturales del polipéptido PRO) en
genotecas de ADNc de tejido humano o genotecas genómicas de tejido
humano.
La hibridación y los lavados de los filtros que
contienen el ADN de genotecas se realizan bajo las siguientes
condiciones altamente restrictivas. La hibridación de la sonda
derivada del ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO
etiquetada radiactivamente con los filtros se realiza en una
solución de 50% de formamida, SSS 5X, 0,1% de SDS, 0,1% de
pirofosfato de sodio, fosfato de sodio 50 mM, una solución acuosa de
SSC 0,1X y 0,1% de SDS a 42ºC.
Los ADNs que tienen una identidad de secuencia
deseada con el ADN que codifica el polipéptido PRO de secuencia
nativa de longitud completa se pueden identificar entonces usando
técnicas habituales conocidas en la técnica.
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Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
sin glicosilar de un polipéptido PRO por expresión recombinante en
E. coli.
La secuencia de ADN que codifica el polipéptido
PRO deseado se amplifica inicialmente usando cebadores de PCR
seleccionados. Los cebadores deben contener sitios de enzimas de
restricción que correspondan a los sitios de enzimas de restricción
del vector de expresión seleccionado. Se puede emplear una variedad
de vectores de expresión. Un ejemplo de un vector de expresión
adecuado es el pBR322 (derivado de E. coli; ver Bolivar y
col., Gene, 2: 95 (1997)) que contiene genes de
resistencia a ampicilina y tetraciclina. Se digiere el vector con
enzimas de restricción y se desfosforila. Las secuencias
amplificadas por PCR se ligan entonces en el vector. El vector
incluirá preferentemente secuencias que codifiquen un gen de
resistencia a un antibiótico, un promotor trp, y una secuencia guía
poliHis (incluyendo los primeros seis codones STII, secuencia
poliHis, y un sitio de corte de enteroquinasa), la región que
codifica el polipéptido PRO específico, el terminador
transcripcional lambda y un gen argU.
La mezcla de ligación se usa entonces para
transformar una cepa de E. coli seleccionada usando los
procedimientos descritos en Sambrook y col., supra. Los
transformantes se identifican por su capacidad de crecer en placas
LB y se seleccionan las colonias resistentes al antibiótico. El ADN
plasmídico se puede aislar y confirmar con análisis de restricción y
secuenciación de ADN.
Los clones seleccionados se pueden crecer toda
la noche en un medio de cultivo líquido como LB complementado con
antibióticos. El cultivo de toda la noche se puede usar después para
inocular un cultivo a escala mayor. Se crecen las células entonces
hasta alcanzar la densidad óptica deseada, durante la cual se induce
el promotor de expresión.
Después de cultivar las células durante varias
horas más, las células se recogen por centrifugación. El sedimento
celular obtenido en la centrifugación se puede solubilizar usando
varios agentes conocidos en la técnica, y el polipéptido PRO
solubilizado se puede entonces purificar usando una columna con un
quelante metálico en condiciones que permitan una fuerte unión de la
proteína.
En WO99/14328, se expresaron de manera
satisfactoria varios polipéptidos en E. coli en una forma
etiquetada con poli-His, usando el siguiente
procedimiento. El ADN que codifica el polipéptido se amplificó
inicialmente utilizando cebadores para PCR seleccionados. Los
cebadores contenían sitios para enzimas de restricción que
correspondían con los sitios para enzimas de restricción en el
vector de expresión seleccionado, y otras secuencias útiles que
proporcionan un inicio de la traducción fiable y eficaz, una rápida
purificación en una columna con un quelante metálico, y la
eliminación proeolítica con enteroquinasa. Las secuencias
etiquetadas con poli-His amplificadas por PCR se
ligaron a continuación en un vector de expresión, que se usó para
transformar un E. coli huésped basado en la cepa 52 (W3110
fuhA(tonA) lon galE rpoHts (htpRts) clpP(laclq)). Los
transformantes se desarrollaron en primer lugar en LB que contenía
50 mg/ml de carbenicilina a 30ºC con agitación hasta que se alcanzó
una DO_{600} de 3-5. Los cultivos se diluyeron a
continuación 50-100 veces en medios CRAP (preparados
mezclando 3,57 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,71 g de
citrato de sodio x 2H_{2}O, 1,07 g de KCl, 5,36 g de extracto de
levaduras de Difco, 5,36 g de Hycase (hidrolizado de caseína) SF de
Sheffield en 500 ml de agua, así como MPOS 110 mM, pH 7,3, 0,55%
(p/v) de glucosa y MgSO_{4} 7 mM) y se desarrollaron durante
aproximadamente 20-30 horas a 30ºC con agitación.
Las muestras se extrajeron para verificar la expresión por análisis
SDS-PAGE y el cultivo completo se centrifugó para
sedimentar las células. Los sedimentos celulares se congelaron hasta
la purificación y replegamiento.
La masa de E. coli de 0,5 a 1 litro de
fermentaciones (6-10 g de sedimentos) se resuspendió
en 10 volúmenes (p/v) en un tampón de guanidina 7 M, Tris 20 mM, pH
8,0. Se añadieron sulfito de sodio sólido y tetrationato de sodio
para hacer unas concentraciones finales de 0,1 M y 0,02 M,
respectivamente, y la solución se agitó toda la noche a 4ºC. Este
paso tiene como resultado la desnaturalización de la proteína con
todos los residuos de cisteína bloqueados por sulfitolización. La
solución se centrifugó a 40.000 rpm en una ultracentrífuga Beckman
durante 30 minutos. El sobrenadante se diluyó con
3-5 volúmenes de tampón de la columna de quelante
metálico (guanidina 6 M, Tris 20 mM, pH 7,4) y se filtró a través de
filtros de 0,22 micrómetros para depurar. Dependiendo, el extracto
depurado se cargó en una columna con quelante metálico Qiagen de 5
mL equilibrada con tampón de columna con quelante metálico. La
columna se lavó con un tampón adicional que contiene imidazol 50 mM
(Calbiochem, Grado Utrol), pH 7,4. La proteína se eluyó con tampón
que contiene imidazol 250 mM. Se combinaron las fracciones que
contienen la proteína deseada y se almacenaron a 4ºC. La
concentración proteica se estimó por su absorbancia a 280 nm usando
el coeficiente de extinción calculado en base a su secuencia de
aminoácidos.
Las proteínas se replegaron diluyendo la muestra
lentamente en un tampón de replegamiento recién preparado compuesto
por Tris 20 mM, pH 8,6, NaCl 0,3 M, urea 2,5 M, cisteína 5 mM,
glicina 20 mM y EDTA 1 mM. Los volúmenes de replegamiento se
eligieron de modo que la concentración final de proteína fuera de 50
a 100 microgramos/ml. La solución de replegamiento se agitó
suavemente a 4ºC durante 12-36 horas. La reacción de
replegamiento se detuvo añadiendo TFA a una concentración final de
0,4% (pH de aproximadamente 3). Antes de una purificación adicional
de la proteína, se filtró la solución través de un filtro de 0,22
micrómetros y se añadió acetonitrilo a una concentración final de
2-10%. La proteína replegada se cromatografió en una
columna de fase inversa R1/H de Poros usando una fase móvil de 0,1%
de TFA con elución con un gradiente de acetonitrilo de 10 a 80%. Se
analizaron alícuotas de fracciones con una absorbancia a 280 nm en
geles de poliacrilamida con SDS y se combinaron las fracciones que
contenían proteína replegada homogénea. Generalmente, las especies
replegadas adecuadamente de la mayoría de las proteínas se eluyen a
las menores concentraciones de acetonitrilo ya que esas especies
son las más compactas con su interior hidrófobo protegido de la
interacción con la resina de la fase inversa. Las especies
agregadas se eluyen normalmente a mayores concentraciones de
acetonitrilo. Además de resolver las formas mal plegadas de
proteínas de la forma deseada, la etapa de la fase inversa elimina
la endotoxina de las muestras.
Las fracciones que contienen las proteínas
plegadas deseadas plegadas deseadas se agruparon y se eliminó el
acetonitrilo utilizando una corriente suave de nitrógeno dirigida a
la solución. Las proteínas se formularon en Hepes 20 mM, pH 6,8 con
cloruro de sodio 0,14 M y manitol 4% por diálisis o por filtración
en gel usando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en el
tampón de formulación y filtradas de forma esterilizada.
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Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
glicosilada de un polipéptido PRO deseado mediante expresión
recombinante en células de mamífero.
El vector, pRK5 (ver el documento EP307.247,
publicado en marzo de 1989), se emplea como el vector de expresión.
Opcionalmente el ADN que codifica el polipéptido PRO se liga en el
pRK5 con enzimas de restricción seleccionadas para permitir la
introducción del ADN de polipéptido PRO usando procedimientos de
ligación como los descritos en Sambrook y col., supra. El
vector resultante se llama pRK5-polipéptido PRO.
En una realización, las células huésped
seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC
CCL 1573) se crecen hasta que confluyen en placas de cultivos
tisulares como DMEM complementado con suero de ternera fetal y
opcionalmente, componentes nutricionales y/o antibióticos. Se
mezclan aproximadamente 10 \mug de ADN de
pRK5-polipéptido PRO con aproximadamente 1 \mug
del ADN que codifica el gen VA ARN [Thimmappaya y col.,
Cell, 31: 543 (1982)] y se disuelven en 500 \mul de
Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl_{2} 0,227. A
esta mezcla se añaden gota a gota, 500 \mul de HEPES 50 mM (pH
7,35), NaCl 280 mM, NaPO_{4} 1,5 mM y se deja que se forme un
precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se resuspende
y se añade a las células 293 y se deja que sedimenten durante
aproximadamente cuatro horas a 37 C. El medio de cultivo se aspira
y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 30 segundos. Las
células 293 se lavan entonces con medio sin suero, se añade medio
recién preparado y las células se incuban durante aproximadamente 5
días.
Aproximadamente 24 horas después de las
transfecciones, se elimina el medio de cultivo y se reemplaza con
medio de cultivo (sólo) o medio de cultivo con
cisteína-S^{35} 200 \muCi/ml y
metionina-S^{35} 200 \muCi/ml. Tras una
incubación de 12 horas, se recoge el medio acondicionado, se
concentra en un filtro de centrífuga, y se carga en un gel con 15%
de SDS. El gel procesado se puede secar y exponer a una película
durante un periodo tiempo para revelar la presencia de polipéptido
PRO. Los cultivos que contienen las células transfectadas pueden
continuar con la incubación (en medio sin suero) y el medio se
prueba en bioensayos seleccionados.
En una técnica alternativa, el polipéptido PRO
se puede introducir en células 293 temporalmente usando el
procedimiento del sulfato de dextrano descrito en Somparyrarc y
col., Proc. Nati. Acad. Sci., 12: 7575 (1981). Las
células 293 se crecen hasta una densidad óptica máxima en un
recipiente giratorio y se añaden 700 \mug de ADN de
pRK5-polipéptido PRO. Las células primero se
concentran en el recipiente giratorio por centrifugación y se lavan
con PBS. El precipitado ADN-dextrano se incuba sobre
el sedimento celular durante cuatro horas. Las células se tratan
con un 20% de glicerol durante 90 segundos, se lavan con medio de
cultivo tisular y se reintroducen en el recipiente giratorio que
contiene le medio de cultivo tisular, 5 \mug/ml de insulina
bovina y 0,1 \mug/ml de transferrina bovina. Después de
aproximadamente cuatro días, el medio acondicionado se puede
concentrar y purificar por cualquier procedimiento seleccionado,
como diálisis y/o columna cromatográfica.
En otra realización, los polipéptidos PRO se
pueden expresar en células CHO. El pRK5-polipéptido
PRO se puede transfectar en células CHO usando reactivos conocidos
como CaPO_{4} o DEAE-dextrano. Como se describe
anteriormente, los cultivos celulares se pueden incubar, y remplazar
el medio con medio de cultivo (sólo) o medio con un isótopo
radiactivo como metionina-S. Después de determinar
la presencia del polipéptido PRO, se puede reemplazar el medio de
cultivo con medio sin suero. Preferiblemente los cultivos se incuban
durante aproximadamente 6 días y entonces se concentran y purifican
por cualquier procedimiento seleccionado.
El polipéptido PRO etiquetado con un epítopo se
puede expresar además en células huésped CHO. El polipéptido PRO se
puede subclonar fuera del vector pRK5. El inserto del subclón se
puede someter a PCR para fusionarse en el marco de lectura con un
epítopo etiqueta seleccionado, tal como una etiqueta de
poli-His en un vector de expresión de Baculovirus.
El inserto del polipéptido PRO etiquetado con
poli-His se puede subclonar a continuación en un
vector dirigido por SV40 que contiene un marcador de selección, tal
como DHFR para seleccionar clones estables. Finalmente, las células
CHO se pueden transfectar (tal como se describe anteriormente) con
el vector dirigido por SV40. El marcado se puede realizar, tal como
se describe anteriormente, para verificar la expresión. A
continuación, el medio de cultivo que contiene el polipéptido PRO
expresado etiquetado con poli-His se puede
concentrar y purificar mediante cualquier procedimiento
seleccionado, mediante como por cromatografía de afinidad con
quilato-Ni^{2+} PRO245 se expresó de manera
satisfactoria en células CHO mediante un procedimiento de expresión
transitoria y un procedimiento de expresión estable.
La expresión estable en células CHO se realizó
usando el siguiente procedimiento. Las proteínas se expresaron como
una construcción IgG (inmunoadhesina), en la que las secuencias
codificantes de las formas solubles (por ejemplo, dominios
extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionaron a una
secuencia de una región constante IgG1 que contiene la región
bisagra, los dominios CH2 y CH2 y/o es una forma etiquetada con
poliHis.
Después de la amplificación por PCR, se
subclonaron los respectivos ADNs en un vector de expresión CHO
usando técnicas habituales como se describe en Ausubel y col.,
"Current Protocols in Molecular Biology" (Protocolos
actuales en biología molecular), Unidad 3.16, John Willey e hijos
(1997). Los vectores de expresión CHO se construyen de modo que
tengan sitios de restricción compatibles 5' y 3' del ADN de interés
para permitir el transporte conveniente de los ADNcs. El vector de
expresión usado en las células CHO es como se describe en Lucas y
col., Nucl. Acids Res., 24: 9
(1774-1779 (1996)), y usa el promotor/potenciador
temprano del SV40 para dirigir la expresión del ADNc de interés y
la dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresión de DHFR permite la
selección para un mantenimiento estable del plásmido después de la
transfección.
Se introdujeron doce microgramos del ADN
plasmídico deseado en aproximadamente 10 millones de células CHO
usando reactivos de transfección disponibles comercialmente
Superfect* (Quiangen), Dospei*, o Fugene* (Boehringer Mannheim). Las
células se crecieron como se describe en Lucas y col.,
supra. Se congelaron aproximadamente 3 x 10^{-7} células en
una ampolla para un crecimiento y producción adicional como se
describe a continuación.
Las ampollas que contienen el ADN plasmídico se
descongelaron colocándolas en una baño de agua y se mezclaron con
un vórtex. Se tomo con una pipeta el contenido y se transfirió a un
tubo de centrífuga que contenía 10 ml de medio y se centrifugó a
1000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se aspiró y las células
se resuspendieron en 10 ml de medio selectivo (PS20 filtrado con
por un filtro de 0,2 \mum con 5% de suero fetal bovino dializado
y filtrado con por un filtro de 0,2 \mum). Se alicuotaron entonces
las células en un recipiente giratorio de 100 ml que contenía 90 ml
de medio selectivo. Después de 1-2 días, las células
se transfirieron a un recipiente giratorio de 250 ml con 150 ml de
medio de crecimiento selectivo y se incubaron a 37ºC. Después de
otros 2-3 días, se sembraron 3 x 10^{5}
células/ml en recipientes giratorios de 250 ml, 500 ml y 2000 ml. El
medio celular se cambió por medio recién preparado por
centrifugación y resuspensión en el medio de producción. Aunque se
puede emplear un medio CHO adecuado, se usó en realidad un medio
descrito en la Patente de EE.UU. N° 5.122.469, publicada el 16 de
junio de 1992. Se sembraron 3 l del recipiente giratorio con 1,2 x
10^{6} células/ml. El día 0, se calculó el pH y el número de
células. El día 1, se tomó una muestra del recipiente giratorio y
se comenzó a burbujear con aire filtrado. El día 2, se tomó una
muestra del recipiente giratorio, se cambió la temperatura a 33ºC,
y se añadieron 30 ml de glucosa 500 g/l y 0,6 ml de antiespumante al
10% (por ejemplo, emulsión de polidimetilsiloxano al 35%, emulsión
de grado médico de Dow Corning 365). Durante toda la producción, se
ajustó el pH como fuese necesario para mantenerlo aproximadamente a
7,2. Después de 10 días, o hasta que la viabilidad descendió por de
bajo del 70%, se recogió el cultivo celular por centrifugación y se
filtró a través de un filtro de 0,22 \mum. El filtrado o se
almacenó a 4ºC o se cargó en columnas para su purificación.
Para las construcciones etiquetadas con poliHis,
se purificaron las proteínas usando una columna
Ni-NTA (Qiagen). Antes de la purificación, se
añadió el imidazol al medio acondicionado hasta una concentración de
5 mM. Los medios acondicionados se bombearon a una columna
Ni-NTA de 6 ml equilibrada con Hepes 20 mM, pH 7,4,
conteniendo el tampón NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a una velocidad de
flujo de 4-5 ml/min a 4ºC. Después de cargar, se
lavó la columna con tampón de equilibrado adicional y se eluyó la
proteína con tampón de equilibrado que contenía Hepes 10 mM, NaCl
0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna G25 Superfinde de 25
ml (Pharmacia) y se almacenó a -80ºC.
Las construcciones con inmunoadhesina (que
contienen Fc) fueron purificadas del medio acondicionado como se
describe a continuación. El medio acondicionado se bombeó sobre una
columna de Proteína A de 5 ml (Pharmacia) que se había equilibrado
con tampón fosfato de sodio 20 mM, pH 6,8. Después de cargar, se
lavó la columna abundantemente con tampón de equilibrado antes de
la elución con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluída se
neutralizó inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que
contienen 275 \mul de tampón Tris 1 M, pH 9. Se eliminaron las
sales de la solución con proteína altamente purificada en tampón de
almacenamiento como se describe anteriormente para las proteínas
poliHis. Se valoró la homogeneidad en geles de poliacrilamida con
SDS y por secuenciación del extremo amino terminal mediante
degradación de Edman.
El PRO2945 también se expresó transitoriamente
de manera satisfactoria en células COS.
\vskip1.000000\baselineskip
El siguiente procedimiento describe la expresión
recombinante de un polipéptido deseado en levaduras.
Primero, se construyeron los vectores de
expresión para la producción intracelular o secreción de los
polipéptidos PRO con el promotor ADH2/GAPDH. Se introducen el ADN
que codifica un polipéptido PRO deseado, un péptido señal
seleccionado y el promotor en los sitios de enzima de restricción
adecuados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión
intracelular del polipéptido PRO. Para la secreción, el ADN que
codifica el polipéptido PRO se puede clonar en el plásmido
seleccionado, junto con un ADN que codifique el promotor
ADH2/GAPDH, la secuencia guía/
señal de secreción del factor alfa, y secuencias adaptadoras, si fuera necesario, para la expresión del polipéptido PRO.
señal de secreción del factor alfa, y secuencias adaptadoras, si fuera necesario, para la expresión del polipéptido PRO.
Las células de levadura, como la cepa de
levadura AB110, se pueden transformar con los plásmidos de
expresión descritos anteriormente y se pueden cultivar en medios de
fermentación seleccionados. Se puede analizar el sobrenadante de
las células transformadas mediante precipitación con ácido
tricloroacético al 10% y por separación en un gel de poliacrilamida
con SDS (SDS-PAGE), seguida de la tinción de los
geles con colorante azul de Coomassie.
El polipéptido PRO recombinante se puede aislar
a continuación y purificar eliminando las células de levadura del
medio de fermentación por centrifugación y después concentrando el
medio usando filtros en cartucho. El concentrado que contiene el
polipéptido PRO se puede purificar adicionalmente usando resinas de
cromatografía en columna seleccionadas.
\vskip1.000000\baselineskip
El siguiente procedimiento describe la expresión
recombinante de polipéptidos PRO en células de insecto infectadas
con Baculovirus.
El polipéptido PRO deseado se fusiona en la
dirección 5' de una etiqueta epítopo contenida con un vector de
expresión de Baculovirus. Tal etiqueta epítopo incluye etiquetas
poliHis y etiquetas de inmunoglobulina (como regiones Fc o IgG). Se
pueden emplear una variedad de plásmidos, incluyendo plásmidos
derivados de plásmidos disponibles comercialmente como el pVL1393
(Novagen). Brevemente, el polipéptido PRO o la porción deseada del
polipéptido PRO (como la secuencia que codifica el dominio
extracelular de una proteína transmembrana) se amplifica por PCR
con cebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El cenador 5'
puede incorporar sitios de enzimas de restricción (seleccionados)
flanqueantes. El producto se digiere entonces con esas enzimas de
restricción y se subclona en el vector de expresión.
El baculovirus recombinante se genera
cotrasfectando el anterior plásmido y el ADN del virus
BaculoGold^{TM} (Pharmigen) en células de Spodoptera
frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) usando lipofectina
(comercialmente disponible en GIBCO-BRL). Después
de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus
liberados se recogen y se usan para amplificaciones adicionales. La
infección viral y la expresión de proteínas se realiza como se
describe en O'Reilley y col., "Baculovirus expression vectors: A
laboratory Manual" (Vectores de expresión de Baculovirus: Manual
de laboratorio), Oxford, Oxford University Press (1994).
El polipéptido PRO etiquetado con poliHis
expresado se puede entonces purificar, por ejemplo con cromatografía
de afinidad con quelato Ni^{2+} como se describe a continuación.
Se prepararan los extractos a partir de las células Sf9 infectadas
con el virus recombinante como se describe en Rupert y col.,
Nature, 362: 175-179 (1993).
Brevemente, se lavan las células Sf9, se resuspenden en un tampón de
sonicación (25 ml de Hepes, pH 7,9; MgCl_{2} 12,5 mM; EDTA 0,1
mM; 10% de glicerol; 0,1% de NP-40; KCl 0,4 M), y
se someten a sonicación dos veces durante 20 segundos en hielo. Los
sonicados se aclaran por centrifugación, y el sobrenadante se diluye
50 veces en tampón de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, 10% de
glicerol, pH 7,8) y se filtran a través de un filtro de 0,45 \mum
de diámetro. Se prepara una columna de agarosa con
Ni^{2+}-NTA (disponible comercialmente en Qiagen)
en un volumen de soporte de 5 ml, lavada con 25 ml de agua y
equilibrada con.25 ml de tampón de carga. El extracto celular
filtrado se carga en la columna a 0,5 ml por minuto. La columna se
lava hasta una base de referencia a A280 con tampón de carga, punto
en el cual comienza la recogida de fracciones. Después, se lava la
columna con un tampón de lavado secundario (fosfato 50 mM; NaCl 300
mM; 10% de glicerol, pH 6,0), que eluye las proteínas unidas no
específicamente. Después de alcanzar la base de referencia a
A_{280} de nuevo, se desarrolla la columna con un gradiente de
imidazol desde 9 a 500 mM en el tampón de lavado secundario. Se
recogen y analizan fracciones de un ml mediante un gel de
poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) y tinción con
plata o inmunotransferencia tipo Western con
Ni^{2+}-NTA conjugado a fosfatasa alcalina
(Qiagen). Se combinan las fracciones que contienen el polipéptido
PRO etiquetado con His_{10} y se dializan frente tampón de
carga.
Alternativamente, la purificación del
polipéptido PRO etiquetado con IgG (o etiquetado con Fc) se puede
realizar usando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo, por
ejemplo, cromatografía en columna de proteína A o proteína G.
El PRO245 se expresó de manera satisfactoria en
células de insecto Sf9 o high5 infectadas con baculovirus. Mientras
que la expresión se realizó en realidad en una escala de
0,5-2 L, se puede aumentar fácilmente la escala
para preparaciones mayores (por ejemplo, 8 L). Se expresaron las
proteínas como una construcción de IgG (inmunoadhesina), en la que
la región extracelular de la proteína se fusionó con una secuencia
de región constante de IgG que contenía la región bisagra, los
dominios CH2 y CH3 y/o formas etiquetadas con
poli-His.
Después de la amplificación por PCR, se
subclonaron las secuencias codificantes respectivas en un vector de
expresión de Baculovirus (pb.PH.IgG para fusiones con IgG y
pb.PH.His para proteínas etiquetadas con poliHis), y se
cotransfectaron el vector y el ADN de baculovirus BaculoGold®
(Pharmigen) en células 105 de Spodoptera frugiperda
("Sf9") (ATCC CRL 1711), usando Lipofectina (Gibco BRL).
pb.PH.IgG y pb.PH.His son modificaciones del vector de expresión de
baculovirus pVL1393 (Pharmigen) disponible comercialmente, con
regiones del poliligador modificadas para incluir secuencias
etiqueta His o Fc. Se crecieron las células en medio
TNM-FH de Hink complementado con 10% de FBS (Suero
fetal bovino) (Hyclone). Se incubaron las células durante 5 días a
28ºC. Se recogió el sobrenadante y se usó posteriormente para la
primera amplificación viral infectando células Sf9 en medio
TNM-FH de Hink complementado con 10% de FBS (Suero
fetal bovino) a una multiplicidad de infección aproximada (MDI o MOI
por sus siglas en inglés) de 10. Se incubaron las células durante 3
días a 28ºC. Se recogió el sobrenadante y se determinó la expresión
de las construcciones en el vector de expresión de baculovirus por
unión en lote de 1 ml de sobrenadante a 25 ml de perlas de
Ni-NTA (QIAGEN) para proteínas etiquetadas con
histidina o perlas de Proteína A-Sepharose
CL-4B (Pharmacia) para proteínas etiquetadas con
IgG, seguido de un análisis en gel de poliacrilamida
(SDS-PAGE) comparando con una concentración conocida
de patrón de proteína por tinción con azul de Coomassie.
Se usó el sobrenadante de la primera
amplificación viral para infectar un cultivo giratorio (500 ml) de
células Sf9 crecidas en medio ESF-921 (Expression
Systems LLC) a una MDI de aproximada de 0,1. Se incubaron las
células durante 3 días a 28ºC. Se recogió y se filtró el
sobrenadante. Se repitió la unión en lote y el análisis en gel de
poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE), como fuera
necesario, hasta que se confirmó la expresión del cultivo
giratorio.
Se recogió el medio acondicionado para las
células transfectadas (0,5 a 3 l) por centrifugación para eliminar
las células y se filtró a través de filtros de 0,22 micrómetros.
Para las construcciones etiquetadas con poliHis, se purificó la
construcción de la proteína con una columna Ni-NTA
(Qiagen). Antes de la purificación, se añadió imidazol al medio
acondicionado a una concentración de 5 mM. Los medios acondicionados
se bombearon en una columna Ni-NTA de 6 ml
equilibrada con Hepes 20 mM, pH 7,4, tampón con NaCl 0,3 M e
imidazol 5 mM a una velocidad de flujo de 4-5 ml/m
a 4ºC. Después de cargar, se lavó la columna con tampón de
equilibrado adicional y se eluyó la proteína con tampón de
equilibrado con imidazol 0,25 M. Se eliminaron las sales de la
proteína altamente purificada y se guardó en un tampón de
equilibrado con Hepes 10 mM, NaCl y 4% de manitol, pH 6,8, con una
columna G25 Superfinde (Pharmacia) de 25 ml y se almacenó a
-80ºC.
Las construcciones con inmunoadhesina (que
contienen Fc) se purificaron del medio acondicionado como se
describe a continuación. Se bombeó el medio acondicionado en una
columna de Proteína A de 5 ml (Pharmacia) que había sido
equilibrada con tampón fosfato de sodio 20 mM, pH 6,8. Después de
cargar, la proteína se neutralizó abundantemente con tampón de
equilibrado antes de la elución con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La
proteína eluída se neutralizó inmediatamente recogiendo fracciones
de 1 ml en tubos con 275 ml de tampón Tris 1 M, pH 9.
Posteriormente se eliminaron las sales de la proteína altamente
purificada y se guardó en tampón de almacenamiento como se describe
anteriormente para las proteínas etiquetadas con poliHis. La
homogeneidad de las proteínas se verificó por electroforesis en gel
de poliacrilamida con SDS (EGP) y secuenciación del extremo amino
terminal mediante degradación de Edman.
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\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra la preparación de
anticuerpos monoclonales que se pueden unir específicamente a un
polipéptido PRO.
Las técnicas para producir los anticuerpos
monoclonales se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo,
en Goding, supra. Los inmunógenos que se pueden emplear
incluyen el polipéptido PRO purificado, proteínas de fusión que
contienen el polipéptido y células que expresan el polipéptido PRO
recombinante en la superficie celular. Los expertos en la materia
pueden realizar la selección del inmunógeno si una excesiva
experiencia.
Se inmunizan ratones, como Balb/c, con el
polipéptido PRO inmunógeno emulsionado en adyuvante de Freund
completo y se inyectan subcutáneamente o intraperiotonealmente en
una cantidad de 1-100 microgramos. Alternativamente,
el inmunógeno se emulsiona en adyuvante MPL-TDM
(Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyecta en el
animal en las almohadillas del pie trasero. Se estimula después a
los ratones inmunizados 10 a 12 días después con un inmunógeno
adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. A partir de
entonces, durante varias semanas, se pueden estimular además a los
ratones con inyecciones inmunizantes adicionales. Se pueden obtener
muestras de suero de los ratones periódicamente mediante tomas de
sangre retroorbitales para realizar ensayos de ELISA para detectar
anticuerpos anti polipéptido PRO.
Después de que se haya detectado una cantidad de
anticuerpos adecuada, se puede inyectar a los animales
"positivos" para los anticuerpos una inyección intravenosa
final de polipéptido PRO. Tres o cuatro días después, se sacrifica
a los ratones y se recogen células del bazo. Las células del bazo se
fusionan entonces (usando un 35% de polietilenglicol) a una línea
celular de mieloma murino como P3X63AgU.1, disponible en ATCC, N°
CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que pueden
proliferar en placas de cultivo tisular con 96 pocillos con medio
HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la
proliferación de las células no fusionadas, híbridos de mieloma, e
híbridos de células de bazo.
Las células de hibridoma se pueden analizar en
una ELISA para determinar la reactividad frente al polipéptido PRO.
La determinación de células de hibridoma "positivas" que
secreten los anticuerpos monoclonales deseados contra el polipéptido
PRO depende de la experiencia en la materia.
Las células de hibridoma positivas se pueden
inyectar intraperitonealmente en ratones Blab/c singénicos para
producir ascitis que contenga los anticuerpos monoclonales anti
polipéptido PRO. Alternativamente, las células de hibridoma se
pueden crecer en matraces o frascos de rosca de cultivo tisular. La
purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en la
ascitis se puede lograr a cabo usando precipitación con sulfato de
amonio, seguida de cromatografía de exclusión por gel.
Alternativamente, se puede emplear cromatografía de afinidad
basándose en la unión del anticuerpo a la proteína A o G.
\vskip1.000000\baselineskip
Los polipéptidos PRO se pueden expresar como
proteínas quiméricas con uno o más dominios polipeptídicos
adicionales añadidos para facilitar la purificación de la proteína.
Tales dominios de facilitación de purificación incluyen, pero no se
limitan a, péptidos quelantes metálicos como módulos de
histidina-triptófano que permiten la purificación
con metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la
purificación con inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio
utilizado en el sistema de purificación extensión/afinidad
FLAGS^{TM} (Immunex Corp., Seattle Wash.). La inclusión de una
secuencia de unión que se pueda cortar como Factor XA o
enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, Calif.) entre el dominio de
purificación y la secuencia del polipéptido PRO puede ser útil para
facilitar la expresión del ADN que codifica el polipéptido PRO.
\vskip1.000000\baselineskip
Los polipéptidos PRO recombinantes se pueden
purificar mediante una variedad de técnicas habituales en la
técnica de la purificación de proteínas. Por ejemplo, se purifica el
propolipéptido PRO, polipéptido PRO maduro, o prepolipéptido PRO
por cromatografía de afinidad usando anticuerpos específicos para el
polipéptido PRO de interés. En general, una columna de
inmunoafinidad se construye uniendo covalentemente el anticuerpo
anti polipéptido PRO a una resina cromatográfica activada.
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Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a
partir de precipitación sérica con sulfato de amonio o mediante
purificación en Proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB
Biotechnology, Piscataway, N.J.). Así mismo, los anticuerpos
monoclonales se preparan a partir de líquido de ascitis de ratón
mediante precipitación con sulfato de amonio o cromatografía sobre
Proteína A inmovilizada. Una proteína parcialmente purificada está
covalentemente unida a la resina cromatográfica como
SEPHAROSE^{TM} CnBr-activada (Pharmacia LKB
Biotechnology). El anticuerpo se une a la resina, se bloquea la
resina y la resina derivada se lava según las instrucciones del
fabricante.
Dicha columna de inmunoafinidad se utiliza en la
purificación de polipéptido PRO preparando una fracción de células
que contengan el polipéptido PRO en forma soluble. Esta preparación
se obtiene solubilizando todas las células o una fracción
subcelular obtenida vía centrifugación diferencial mediante la
adición de un detergente o mediante otros procedimientos muy
conocidos en la técnica. Alternativamente, el polipéptido PRO
soluble que contiene una secuencia señal se puede secretar en una
cantidad útil al medio en el que crecen las células.
Una preparación que contenga un polipéptido PRO
soluble se pasa a través de la columna de inmunoafinidad, y se lava
la columna en condiciones que permitan la absorción preferencial del
polipéptido PRO (por ejemplo, tampones de alta concentración iónica
en presencia de detergente). Entonces, se eluye la columna en
condiciones que alteren la unión anticuerpo/polipéptido PRO (por
ejemplo, un tampón de pH bajo de aproximadamente
2-3, o una mayor concentración de una agente
caotrópico como urea o ión tiocianato), y se recoge el polipéptido
PRO.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta invención es particularmente útil para
seleccionar compuestos usando polipéptidos PRO o sus fragmentos de
unión en cualquier variedad de técnicas de selección de fármacos. El
polipéptido o fragmento PRO empleado en tal prueba puede estar
libre en disolución, sin unir a un soporte sólido, suspendido en una
superficie celular, o localizado intracelularmente. Un
procedimiento de selección de fármacos utiliza células huésped
eucariotas o procariotas que se han transformado de modo estable con
ácidos nucleicos recombinantes que expresan el polipéptido o un
fragmento PRO. Los fármacos se seleccionan frente dichas células
transformadas en ensayos de unión competitivos. Tales células,
tanto en forma soluble como fija, se pueden usar para ensayos de
unión habituales. Se puede medir, por ejemplo, la formación de
complejos entre el polipéptido o un fragmento PRO y el agente que
se está probando. Alternativamente, se puede examinar la disminución
en la formación de complejos entre el polipéptido PRO y su célula
diana o receptores diana provocada por el agente que se está
probando.
Así, la presente invención proporciona
procedimientos para seleccionar fármacos o cualquier otro agente
que pueda afectar a enfermedades o desórdenes asociados al
polipéptido PRO. Estos procedimientos comprenden el contacto de tal
agente con un polipéptido PRO o uno de sus fragmentos y el ensayo de
(I) la presencia de un complejo entre el agente y el polipéptido o
un fragmento PRO, o (II) la presencia de un complejo entre el
polipéptido o un fragmento PRO y la célula, por procedimientos muy
conocidos en la técnica. En dichos ensayos de unión competitiva, el
polipéptido o el fragmento PRO está típicamente etiquetado. Después
de una incubación adecuada se separa la forma unida del polipéptido
o el fragmento PRO, y la cantidad de etiqueta libre o no unida a
complejo es una medida de la capacidad del agente particular de
unirse al polipéptido PRO o para interferir con el complejo
polipéptido PRO/célula.
Otra técnica para la selección de fármacos
proporciona un alto rendimiento de selección de compuestos que
tienen la adecuada afinidad de unión al polipéptido PRO y se
describe con detalle en el documento WO84/03564, publicado el 13 de
septiembre de 1984. Brevemente descrito, se sintetiza un gran número
de diferentes compuestos de prueba peptídica pequeños sobre un
sustrato sólido, como agujas de plástico u otra superficie. Como se
ha solicitado para un polipéptido PRO, los compuestos de prueba
peptídica se hacen reaccionar con polipéptidos PRO y se lavan. El
polipéptido PRO unido se detecta por procedimientos muy conocidos en
la técnica. El polipéptido PRO purificado se puede recubrir
directamente sobre placas para el uso en las técnicas de selección
de fármacos antes mencionado. Además, los anticuerpos no
neutralizantes se pueden usar para capturar el péptido e
inmovilizarlo en el soporte sólido.
Esta invención contempla el uso de ensayos de
selección de fármacos competitivos en los que los anticuerpos
neutralizantes capaces de unirse al polipéptido PRO específicamente
compitan con un compuesto de prueba en la unión al polipéptido PRO
o sus fragmentos. De este modo, los anticuerpos se pueden usar para
detectar la presencia de cualquier péptido que comparta uno o más
determinantes antigénicos con el polipéptido PRO.
\vskip1.000000\baselineskip
El objetivo del diseño de fármacos racionales es
producir análogos estructurales de polipéptidos biológicamente
activos de interés (es decir, un polipéptido PRO) o de pequeñas
moléculas con las que interactúan, por ejemplo, agonistas,
antagonistas o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos se puede
usar para modelar fármacos que sean más activos o formas estables
del polipéptido PRO o que potencien o interfieran con la función del
polipéptido PRO in vivo (c.f., Hodgson,
Bio/Technology, 9: 19-21 (1991)).
En un enfoque, la estructura tridimensional del
polipéptido PRO o de un complejo
inhibidor-polipéptido PRO, se determina por
cristalografía de rayos X, por modelado informático, o más
típicamente, mediante una combinación de los dos enfoques. Se deben
averiguar tanto la forma como las cargas del polipéptido PRO para
elucidar la estructura de la molécula y determinar su(s)
sitio(s) activo(s). Menos frecuentemente, se puede
lograr la información útil relacionada con la estructura del
polipéptido por modelado basándose en la estructura de proteínas
homólogas. En ambos casos, la información de la estructura relevante
se usa para diseñar moléculas análogas al polipéptido PRO o para
identificar inhibidores eficaces. Algunos ejemplos útiles del diseño
de fármacos racionales pueden incluir moléculas que mejoren la
actividad o la estabilidad como se muestra en Braxton y Wells,
Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992) o
que actúen como inhibidores, agonistas o antagonistas de péptidos
nativos como se muestra en Athauda y col., J. Biochem.,
113: 742-746 (1993).
Es también posible aislar un anticuerpo con una
diana específica, seleccionado por ensayo funcional, como se
describe anteriormente, y resolver entonces su estructura
cristalina. Este enfoque, en principio, produce un núcleo
farmacológico a partir del cual se puede basar el diseño de un
fármaco. Es posible englobar la cristalografía de proteínas
generando anticuerpos anti idiotipo (anti ids) frente a un
anticuerpo farmacológicamente activo, funcional. Como imagen
especular de una imagen especular, se podría esperar que el sitio de
unión de los anti ids fuera análogo del receptor original. El anti
id se podría usar entonces para identificar y aislar péptidos de
bancos de péptidos producidos química o biológicamente. Los péptidos
aislados actuarían así como núcleo farmacológico.
En virtud de la presente invención, puede haber
disponibles suficientes cantidades del polipéptido PRO para
realizar tales estudios analíticos como cristalografía de rayos X.
Además, el conocimiento de la secuencia de aminoácidos del
polipéptido PRO proporcionado en la presente memoria descriptiva
proporcionará una guía a los que empleen técnicas de modelado
informático en lugar de o junto con la cristalografía de rayos
X.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó la capacidad del polipéptido PRO245
para inhibir la proliferación de células endoteliales estimulada
por VEGF. Específicamente, se pusieron en placas células
endoteliales capilares corticales adrenales (ACE) bovinas (del
cultivo primario, 12-14 pases como máximo) en placas
de microtítulos de 96 pocillos (Amersham Life Science) a una
densidad de 500 células/pocillo por 100 \muL en DMEM bajo en
glucosa, suero de ternera al 10%, glutamina 2 mM, 1x pen/strept y
fungizona, complementado con 3 ng/ml de VEGF. Se pusieron controles
en placas de la misma manera, pero no se incluyó VEGF. Se añadió una
muestra a analizar del polipéptido PRO de interés en un volumen de
100 \muL para un volumen final de 200 \muL. Las células se
incubaron durante 6-7 días a 37ºC. El medio se
aspiró y se lavaron las células 1x con PBS. Se añadió una mezcla de
reacción de fosfatasa ácida (100 \muL, acetato de sodio 0,1 M, pH
5,5, Triton-100 al 0,1%, fosfato de
p-nitrofenilo 10 mM). Después de la incubación
durante 2 horas a 37ºC, se detuvo la reacción mediante la adición de
10 \muL de NaOH 1N. Se midió la DO en un lector de placas de
microtítulos a 405 nm. Los controles eran sin células, células
solas, células + FGF (5 ng/ml), células + VEGF (3 ng/ml), células +
VEGF (3 ng/ml) + TGF-\beta (1 ng/ml) y células +
VEGF (3 ng/ml) + LIF (5 ng/ml). (Se sabe que el
TGF-\beta a una concentración de 1 ng/ml bloquea
el 70-905 de la proliferación celular estimulada por
VEGF).
Los resultados se evaluaron calculando el
porcentaje de inhibición de la proliferación celular estimulada con
VEGF (3 ng/ml), determinada midiendo la actividad de fosfatasa ácida
a DO 405 nm, (1) en relación a las células sin estimulación y (2)
en relación a la inhibición por TGF-\beta de
referencia de la actividad estimulada por VEGF. Los resultados, tal
como se muestran en la tabla 2 siguiente, son indicativos de la
utilidad del polipéptido PRO145 en la terapia contra el cáncer y,
específicamente, en la inhibición de la angiogénesis tumoral. Los
valores numéricos (inhibición relativa) mostrados en la tabla 2 se
determinan calculando el porcentaje de inhibición de la
proliferación estimulada por VEGF por parte del polipéptido PRO245
en relación a las células sin estimulación y, a continuación,
dividiendo ese porcentaje entre el porcentaje de inhibición obtenido
por TGF-\beta a 1 ng/ml que se sabe que bloquea el
70-90% de la proliferación celular estimulada por
VEGF.
La hibridación in situ es una técnica
poderosa y versátil para la detección y localización de secuencias
de ácido nucleico en preparaciones celulares o tisulares. Puede ser
útil, por ejemplo, para identificar sitios de expresión génica,
analizar la distribución tisular de la transcripción, identificar y
localizar una infección vírica, seguir cambios en la síntesis de un
ARN específico y como ayuda en el mapeo cromosómico.
Se realizó la hibridación in situ
siguiendo una versión optimizada del protocolo de Lu y Gillett,
Cell Vision 1: 169-176 (1994), usando
ribosondas etiquetadas con P^{33} generadas por PCR. Brevemente,
se cortaron los tejidos humanos fijados con formalina y embebidos
en parafina, se desparafinaron, se desproteinaron en proteinasa K
(20 g/ml) durante 15 minutos a 37ºC, y se procesaron posteriormente
para la hibridación in situ, tal como se describe en Lu y
Gillett, supra. Se generó una ribosonda no codificante
marcada con UTP [P^{33}] a partir de un producto de PCR y se
hibridó a 55ºC toda la noche. Se bañaron los portaobjetos en una
emulsión de seguimiento nuclear NTB2 y se expusieron durante 4
semanas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se secaron en una centrífuga de vacío 6,0 \mul
(125 mCi) de UTP-P^{33} (Amersham BF 1002,
SA<2000 Ci/mmol). A cada tubo con UTP-P^{33},
se agregaron los siguientes ingredientes:
2,0 \mul de tampón de transcripción 5X
1,0 \mul de DTT (100 mM)
2,0 \mul de mezcla de NTP (2,5 mM: 10 \mul
de cada, GTP, CTP y ATP 10 mM + 10 \mul de H_{2}O)
1,0 \mul de UTP (50 \muM)
1,0 \mul de ARNsina
1,0 \mul de molde de ADN (1 \mug)
1,0 \mul de H_{2}O
1,0 \mul de ARN polimerasa (para productos de
PCR T3 = AS, T7 = S, normalmente)
\vskip1.000000\baselineskip
Se incubaron los tubos a 37ºC durante una hora.
Se añadió 1,0 \mul de DNasa RQ1, seguido de una incubación a 37ºC
durante 15 minutos. Se añadieron 90 \mul de TE (Tris 10 mM pH 7,6;
EDTA 1 mM pH 8,0), y se transfirió la mezcla con una pipeta a un
papel DE81. La solución restante se cargó en una unidad de
ultracentrifugación Microcon-50, y se centrifugó
usando el programa 10 (6 minutos). La unidad de filtración se
invirtió en un segundo tubo y se centrifugó usando el programa 2 (3
minutos). Después del pulso de recuperación final, se añadieron 100
\mul de TE, se transfirió con una pipeta 1 \mul de producto
final a un papel DE81 y se realizó un recuento en 6 ml de Biofluor
II.
Se corrió la sonda en un gel de TBE/urea. Se
añadieron 1-3 \mul de la sonda o 5 \mul de RNA
Mrk III a 3 \mul del tampón de carga. Tras calentar a 95ºC
calentar el bloque durante tres minutos, el gel se colocó
inmediatamente en hielo. Se nivelaron los pocillos, se cargó la
muestra, y se corrió a 180-250 voltios durante 45
minutos. Se envolvió el gel con revestimiento de saran y se expuso a
una película XAR con una pantalla de intensificación al congelador a
-70ºC de una hora a toda la noche.
\vskip1.000000\baselineskip
Los portaobjetos se sacaron del congelador, se
colocaron en bandejas de aluminio y se descongelaron a temperatura
ambiente durante 5 minutos. Las bandejas se colocaron en un
incubador a 55ºC durante cinco minutos para reducir la
condensación. Los portaobjetos se fijaron durante 10 minutos en 4%
de paraformaldehído en hielo en la campana extractora de gases, y
se lavaron en SSS 0,5X durante 5 minutos, a temperatura ambiente
(25 ml de SSC 20X + 975 ml de H_{2}O SQ). Después de eliminar las
proteínas con 0,5 \mug/ml de proteinasa K durante 10 minutos a
37ºC (12,5 \mul de 10 mg/ml de solución madre en 250 ml de tampón
de ARNasa sin ARNasa precalentado), los cortes se lavaron con SSC
0,5X durante 10 minutos a temperatura ambiente. Los cortes se
deshidrataron en etanol al 70%, 95%, 100%, 2 minutos en cada
uno.
\vskip1.000000\baselineskip
Se eliminó la parafina de los portaobjetos, se
colocaron en H_{2}O SQ, y se aclararon dos veces en SSC 2X a
temperatura ambiente, durante 5 minutos cada vez. Se eliminaron las
proteínas de los cortes con 20 \mug/ml de proteinasa K (500
\mul de 10 mg/ml en 250 ml de tampón de ARNasa sin ARNasa, 37ºC,
15 minutos) para embrión humano, o proteinasa K 8X (100 \mul en
250 ml de tampón de ARNasa, 37ºC, 30 minutos) para tejidos con
formalina. Los aclarados posteriores en SSC 0,5X y la deshidratación
se realizaron como se describe anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon los portaobjetos en una caja de
plástico recubierta con tampón Box (SSC 4X, 50% de formamida) para
papel de filtro saturado. Se cubrió el tejido con 50 \mul de
tampón de hibridación (3,75 g de sulfato de dextrano + 6 ml de
H_{2}O SQ), se agitaron con un vórtex y se calentaron en el
microondas durante 2 minutos con la tapa aflojada. Tras enfriar en
hielo, se añadieron 18,75 ml de formamida, 3,75 ml de SSS 20X y 9 ml
de H_{2}O SQ, el tejido se agitó en el vórtex bien y se incubó a
42ºC durante 1-4 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se calentaron 1,0 x 10^{6} cpm de sonda y 1,0
de ARNt (50 mg/ml de solución madre) por portaobjetos a 95ºC durante
3 minutos. Los portaobjetos se enfriaron en hielo, y se añadieron 48
\mul de tampón de hibridación por portaobjetos. Después de agitar
con el vórtex, se añadieron 50 \mul de mezcla de P^{33} a 50
\mul de prehibridación en el portaobjetos. Los portaobjetos se
incubaron toda la noche a 55ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron 2 lavados de 10 minutos con SSS
2X, EDTA a temperatura ambiente (400 ml de SSC 20X + 16 ml de EDTA
0,25 M, Vf= 4 l), seguidos de un tratamiento con ARNasa A a 37ºC
durante 30 minutos (500 \mul de 10 mg/ml en 250 ml de tampón de
ARNasa= 20 \mug/ml), se lavaron los portaobjetos 2 veces durante
10 minutos con SSC 2X, EDTA a temperatura ambiente. Las condiciones
restrictivas de lavado fueron 2 horas a 55ºC, SSC 0,1X, EDTA (20 ml
de SSC 20X + 16 ml de EDTA, Vf= 4l).
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó el análisis in situ sobre la
secuencia de ADN descrita en la presente invención. Los
oligonucleótidos utilizados para este análisis fueron los
siguientes.
DNA35638-1141
(PRO245)
| p1 5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCGGGAAGATGGCGAGGAGGAG-3' | (SEC ID No. 358) |
| p2 5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGACCAAGGCCACAAACGGAAATC-3' | (SEC ID NO. 359) |
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó el análisis in situ sobre la
secuencia de ADN descrita en la presente invención. Los resultados
de este análisis son los siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se observó expresión en el endotelio que recubre
un subgrupo de vasos fetales y placentarios. La expresión
endotelial se confinó a estos bloques de tejido. También se observó
expresión en las células del trofoblasto intermedio de la placenta.
El resto de tejidos fueron negativos.
Tejidos fetales examinados (semanas
E12-E15) incluyen: placenta, cordón umbilical,
hígado, riñón, glándulas adrenales, tiroides, pulmones, corazón,
grandes vasos, esófago, estómago, intestino delgado, bazo, timo,
páncreas, cerebro, ojo, médula espinal, pared corporal, pelvis y
extremidad inferior.
Tejidos adultos examinados: hígado,
riñón, glándulas adrenales, miocardio, aorta, bazo, nódulo
linfático, páncreas, pulmón, piel, córtex cerebral (rm), hipocampo
(rm), cerebelo (rm), pene, ojo, vejiga, estómago, carcinoma
gástrico, colon, carcinoma colónico, tiroides (chimpancé),
paratiroides (chimpancé), ovario (chimpancé) y condrosarcoma, daño
hepático inducido por acetominofeno y cirrosis hepática.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes materiales se han depositado con
la American Type Culture Collection (Colección de cultivos tipo
estadounidense), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, EE.UU.
(ATCC):
Estos depósitos se realizaron bajo las
disposiciones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento
internacional del depósito de microorganismos para el propósito del
procedimiento de patente y las normativas conforme al mismo
(Tratado de Budapest). Esto garantiza el mantenimiento de un cultivo
viable del depósito durante 30 años desde la fecha del depósito. La
ATCC dispondrá de los depósitos bajo los términos del Tratado de
Budapest, y estarán sujetos a un acuerdo entre Genentech, Inc. y la
ATCC, que garantiza la disponibilidad permanente y sin
restricciones de la descendencia del cultivo del depósito al público
bajo la emisión de la patente de EE.UU. pertinente o bajo la puesta
pública de cualquiera de de las solicitudes de patente de EE.UU. o
extranjeras, lo que primero ocurra, y garantiza la disponibilidad de
la descendencia a uno determinado por los EE.UU. Se autoriza al
Comisario de patentes y marcas comerciales por la misma con arreglo
a la 35 USC \NAK 122 y las normas del Comisario según la misma
(incluyendo la 37 CFR \NAK 1.14 con una referencia particular a la
886 OG 638).
El cesionario de la presente solicitud ha
acordado que si un cultivo de los materiales en depósito muriera o
se perdiese o destruyera cuando se cultive bajo las condiciones
adecuadas, se reemplazara rápidamente los materiales bajo
notificación con otro igual. La disponibilidad del material
depositado no está construida como una licencia para practicar la
invención en contravención de los derechos concedidos por la
autoridad o por cualquier gobierno con arreglo a estas leyes sobre
patentes.
La memoria descriptiva anteriormente escrita se
considera suficiente para capacitar a cualquier experto en la
materia a practicar la invención. La presente invención no está
limitada en alcance por la construcción depositada, ya que la
realización depositada está diseñada como una simple ilustración de
ciertos aspectos de la invención y cualquiera de las construcciones
que sean funcionalmente equivalentes entran dentro del alcance de
esta invención. El depósito de material en la presente memoria
descriptiva no constituye una admisión de que la descripción
escrita en la presente memoria descriptiva contenida sea inadecuada
para capacitar la práctica de cualquier aspecto de la invención,
incluyendo el mejor modo de la misma, ni está construida como
limitación del alcance de las reivindicaciones de las ilustraciones
específicas que representa. Es más, varias modificaciones de la
invención además de las mostradas en la presente memoria descriptiva
serán aparentes para los expertos en la materia a partir de la
anterior descripción y entrarán dentro del alcance de las
reivindicaciones añadidas.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el
máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este
respecto.
- \bullet US 5536637 A [0004]
- \bullet GB 2211504 A [0070]
- \bullet US 5364934 A [0038]
- \bullet EP 117060 A [0073]
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Claims (28)
1. Ácido nucleico aislado que codifica un
polipéptido PRO245, o el complemento del mismo, en el que el
polipéptido:
(i) comprende los aminoácidos 1 a 312 de la
figura 2 (SEC ID No. 64) o una forma madura de la misma;
(ii) comprende una forma truncada o secretada de
forma natural, una forma de variante natural o una variante alélica
natural del polipéptido de la figura 2 (SEC ID No. 64) e inhibe la
proliferación del crecimiento de células endoteliales estimulada por
VEGF, con la condición de que el polipéptido no consista en los
aminoácidos 1-288 ó 21-288 de la
figura 2 (SEC ID No. 64);
(iii) tiene por lo menos un 80% de identidad en
la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la
figura 2 (SEC ID No. 64) e inhibe la proliferación del crecimiento
de células endoteliales estimulada por VEGF, en el que dicha
identidad de secuencia se determina sobre la longitud completa de
dicha secuencia, con la condición de que el polipéptido no consista
en los aminoácidos 1-288 ó 21-288 de
la figura 2 (SEC ID No. 64); o
(iv) tiene por lo menos un 95% de identidad en
la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la
figura 2 (SEC ID No. 64) e inhibe la proliferación del crecimiento
de células endoteliales estimulada por VEGF, en el que dicha
identidad de secuencia se determina sobre la longitud completa de
dicha secuencia.
2. Ácido nucleico según la reivindicación 1,
parte (iii), en el que el nivel de identidad es por lo menos del
85%.
3. Ácido nucleico según la reivindicación 1,
parte (iii), en el que el nivel de identidad es por lo menos del
90%.
4. Ácido nucleico según la reivindicación 1, en
el que dicha secuencia de nucleótidos comprende una secuencia de
nucleótidos que consiste en la secuencia codificante de longitud
completa de la secuencia mostrada en la figura 1 (SEC ID No. 63), o
el complemento de la misma.
5. Ácido nucleico según la reivindicación 1, en
el que dicha secuencia de nucleótidos comprende una secuencia de
nucleótidos que consiste en la secuencia mostrada en la figura 1
(SEC ID No. 63), o el complemento de la misma.
6. Ácido nucleico según la reivindicación 1, que
comprende la secuencia codificante para PRO245 de longitud completa
del ADN depositado bajo el número de acceso ATCC 209265.
7. Vector que comprende el ácido nucleico según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
8. Vector según la reivindicación 7, unido
operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula
huésped transformada con el vector.
9. Célula huésped que comprende el vector según
la reivindicación 7 o la reivindicación 8.
10. Célula huésped según la reivindicación 9, en
la que dicha célula es una célula CHO.
11. Célula huésped según la reivindicación 9, en
la que dicha célula es E. coli.
12. Célula huésped según la reivindicación 9, en
la que dicha célula es una célula de levadura.
13. Proceso para producir un polipéptido PRO245
que comprende el cultivo de la célula huésped según cualquiera de
las reivindicaciones 9 a 12, en condiciones adecuadas para la
expresión de dicho polipéptido PRO245 y la recuperación de dicho
polipéptido PRO245 a partir del cultivo celular.
14. Polipéptido PRO245 aislado, en el que dicho
polipéptido:
(i) comprende los aminoácidos 1 a 312 de la
figura 2 (SEC ID No. 64) o una forma madura de la misma;
(ii) comprende una forma truncada o secretada de
forma natural, una forma de variante natural o una variante alélica
natural del polipéptido de la figura 2 (SEC ID No. 64) e inhibe la
proliferación del crecimiento de células endoteliales estimulada por
VEGF, con la condición de que el polipéptido no consista en los
aminoácidos 1-288 ó 21-288 de la
figura 2 (SEC ID No. 64);
(iii) tiene por lo menos un 80% de identidad en
la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la
figura 2 (SEC ID No. 64) e inhibe la proliferación del crecimiento
de células endoteliales estimulada por VEGF, en el que dicha
identidad de secuencia se determina sobre la longitud completa de
dicha secuencia, con la condición de que el polipéptido no consista
en los aminoácidos 1-288 ó 21-288 de
la figura 2 (SEC ID No. 64);
(iv) tiene por lo menos un 80% de identidad en
la secuencia con la secuencia de aminoácidos de PRO245 codificada
por el nucléotido depositado bajo el número de acceso ATCC 209265 e
inhibe la proliferación del crecimiento de células endoteliales
estimulada por VEGF, en el que dicha identidad de secuencia se
determina sobre la longitud completa de dicha secuencia, con la
condición de que el polipéptido no consista en los aminoácidos
1-288 ó 21-288 de la figura 2 (SEC
ID No. 64); o
(v) tiene por lo menos un 95% de identidad en la
secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la
figura 2 (SEC ID No. 64) e inhibe la proliferación del crecimiento
de células endoteliales estimulada por VEGF, en el que dicha
identidad de secuencia se determina sobre la longitud completa de
dicha secuencia.
15. Polipéptido según la reivindicación 14,
parte (iii), en el que el nivel de identidad es por lo menos del
85%.
16. Polipéptido según la reivindicación 14,
parte (iii), en el que el nivel de identidad es por lo menos del
90%.
17. Molécula quimérica que comprende un
polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones
14-16, fusionado a una secuencia de aminoácidos
heteróloga.
18. Molécula quimérica según la reivindicación
17, en la que dicha secuencia de aminoácidos heteróloga es una
secuencia de un epítopo etiqueta.
19. Molécula quimérica según la reivindicación
17, en la que dicha secuencia de aminoácidos heteróloga es una
región Fc de una inmunoglobulina.
20. Anticuerpo que se une específicamente al
polipéptido PRO245 según la reivindicación 14, parte (i) o parte
(ii), con la condición de que el anticuerpo no es un anticuerpo que
se une a un polipéptido que consista en los aminoácidos
1-288 ó 21-288 de la figura 2 (SEC
ID No. 64).
21. Anticuerpo según la reivindicación 20, en el
que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
22. Anticuerpo que se une específicamente al
polipéptido PRO245 según la reivindicación 14, parte (i) o parte
(ii), que es un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un
anticuerpo biespecífico, o un anticuerpo heteroconjugado o tiene
especificidad poliepitópica.
23. Anticuerpo anti-PRO245
antagonista, que se une específicamente al polipéptido PRO245 según
la reivindicación 14, parte (i) o parte (ii), e inhibe la actividad
de dicho polipéptido de inhibir proliferación del crecimiento de
células endoteliales estimulada por VEGF.
24. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 14-16, para su uso en un método de
tratamiento.
25. Polipéptido según la reivindicación 24, para
su uso en la terapia contra el cáncer.
26. Polipéptido según la reivindicación 25, para
su uso en la inhibición de la angiogénesis tumoral.
27. Uso del polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 14-16 en la fabricación de un
medicamento para la terapia contra el cáncer.
28. Uso según la reivindicación 27, en el que el
medicamento es para la inhibición de la angiogénesis tumoral.
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