ES2298310T3 - Proteina de tipo prostasina humana y acidos nucleicos que la codifican. - Google Patents
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Abstract
Ácido nucleico aislado que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2, o el complemento de la misma, en el que dicha identidad en la secuencia se determina sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan.
Description
Proteína de tipo prostasina humana y ácidos
nucleicos que la codifican.
La presente invención hace referencia en general
a la identificación y aislamiento de un nuevo ADN y a la producción
recombinante de polipéptidos nuevos codificados por dicho ADN.
Las proteínas extracelulares juegan un papel
importante en la formación, diferenciación y mantenimiento de
organismos multicelulares. El destino de muchas células
individuales, por ejemplo, su proliferación, migración,
diferenciación o interacción con otras células está gobernado
generalmente por la información recibida de otras células y/o el
entorno inmediato. Esta información, a menudo se transmite por
polipéptidos secretados (por ejemplo, factores mitogénicos,
factores de supervivencia, factores citotóxicos, factores de
diferenciación, neuropéptidos y hormonas) que, a su vez, son
recibidos e interpretados por diversos receptores celulares o
proteínas unidas a membrana. Estos polipéptidos secretados o
moléculas de señalización tras su secreción por la célula de forma
específica alcanzan su sitio de acción en el entorno
extracelular.
Las proteínas secretadas tienen diversas
aplicaciones industriales, incluyendo las farmacéuticas,
diagnósticas, los biosensores y los bioreactores. La mayoría de
fármacos proteicos disponibles en la actualidad, como los agentes
trombolíticos, los interferones, las interleucinas, las
eritropoyetinas, los factores estimulantes de la formación de
colonias y diversas otras citocinas, son proteínas de secreción. Sus
receptores, que son proteínas de membrana, también tienen un
potencial como agentes terapéuticos o diagnósticos. Se han realizado
numerosos esfuerzos, tanto en la industria como en el ámbito
académico para identificar nuevas proteínas de secreción. Muchos de
los esfuerzos se han concentrado en el rastreo de bibliotecas de ADN
recombinante de mamífero para identificar secuencias codificantes
de nuevas proteínas secretadas. En la literatura se describen
diversos ejemplos de procedimientos y técnicas de rastreo [véase por
ejemplo, Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,
93:7108-7113 (1996); patente americana U.S.
5.536.637)].
Las proteínas unidas a membrana y los receptores
pueden desempeñar una importante función en la formación,
diferenciación y mantenimiento de los organismos multicelulares. El
destino de muchas células individuales, por ejemplo, su
proliferación, migración, o interacción con otras células está
gobernado en general por la información recibida de otras células
y/o el entorno inmediato. Esta información, a menudo se transmite
por polipéptidos secretados (por ejemplo, factores mitogénicos,
factores de supervivencia, factores citotóxicos, factores de
diferenciación, neuropéptidos y hormonas) que, a su vez, son
recibidos e interpretados por diversos receptores celulares o
proteínas unidas a membrana. Dichas proteínas unidas a membrana y
receptores celulares incluyen, pero no se limitan a, los receptores
de citocinas, los receptores quinasas, los receptores fosfatasas,
los receptores implicados en las interacciones
célula-célula y las moléculas de adhesión como las
selectinas e integrinas. Por ejemplo, la transducción de señales
que regulan el crecimiento y la diferenciación celular está
regulada en parte por la fosforilación de diversas proteínas
celulares. Las protein-tirosina quinasas, enzimas
que catalizan dicho proceso, también pueden actuar como receptores
de factores de crecimiento. Se incluyen como ejemplos el receptor
del factor de crecimiento de fibroblastos y el factor de crecimiento
nervioso.
Las proteínas unidas a membrana y las moléculas
de receptor tienen diversas aplicaciones industriales, por ejemplo,
como agentes farmacéuticos y diagnósticos. Los receptores
inmunoadhesinas, por ejemplo, pueden utilizarse como agentes
terapéuticos para bloquear la interacción con el
receptor-ligando. Las proteínas unidas a membrana
también pueden utilizarse para el rastreo de inhibidores potenciales
de moléculas pequeñas o de péptidos de la interacción relevante
receptor/ligando. Se han realizado esfuerzos tanto en la
investigación industrial como académica para identificar nuevas
proteínas receptoras nativas. Muchos esfuerzos se han centrado en
el rastreo de bibliotecas de ADN recombinantes para identificar las
secuencias codificantes de nuevas proteínas receptoras.
En la presente invención se describe la
identificación y la caracterización de nuevos polipéptidos de
secreción y transmembrana, así como los nuevos ácidos nucleicos que
los codifican.
La prostasina es una nueva serina proteinasa
humana purificada de fluido seminal humano. La localización
inmunohistoquímica revela que la prostasina está presente en células
epiteliales y conductos de la glándula prostática. El ADNc para
prostasina se ha clonado y caracterizado. El análisis de
transferencia Southern, después de una reacción en cadena de la
polimerasa de transcripción inversa, indica que el ARNm de
prostasina se expresa en la próstata, el hígado, las glándulas
salivares, el riñón, el pulmón, el páncreas, el colon, los
bronquios, células tubulares proximales renales y células LNCaP de
carcinoma de próstata. La localización celular del ARNm de
prostasina se identificó en células epiteliales de la glándula
prostática humana mediante histoquímica de hibridación in
situ. [Véase, por ejemplo, Yu et al., J. Biol. Chem.
(1994) 269(29):18843-18848, y Yu et
al., J. Biol. Chem. (1994) 270 (22):
13483-13489].
13483-13489].
\newpage
De este modo, la prostasina, y las moléculas
relacionadas con la misma, son de interés, particularmente para el
estudio, diagnóstico y tratamiento de condiciones médicas que
implican a la próstata. La prostasina y las moléculas relacionadas
se describen adicionalmente en Yu et al., Genomics (1996)
32(3):334-340. En la presente invención se
describe la identificación y caracterización de nuevos polipéptidos
que tienen homología con la prostasina, designada en la presente
invención como polipéptidos PRO351.
Los solicitantes han identificado un clon de
ADNc que codifica un nuevo polipéptido que tiene una similitud de
secuencia con la prostasina, donde el polipéptido se designa en la
presente solicitud como "PRO351".
En una realización, tal y como se define en las
reivindicaciones, la presente invención proporciona una molécula de
ácido nucleico aislada que comprende ADN que codifica un polipéptido
PRO351. En un aspecto, el ácido nucleico aislado comprende ADN que
codifica el polipéptido PRO351 que tiene los residuos de aminoácidos
1 a 571 de la figura 2 (SEC ID No: 2) o es complementario a dicha
secuencia de ácidos nucleicos codificante, y permanece unida de
forma estable a la misma en condiciones por lo menos moderadas y,
opcionalmente, de elevada astringencia. En otro aspecto, el ácido
nucleico aislado comprende ADN que codifica el polipéptido PRO351
que tiene los residuos de aminoácidos de aproximadamente 16 a 571 de
la figura 2 (SEC ID No: 2) o es complementario a dicha secuencia de
ácidos nucleicos codificante, y permanece unida de forma estable a
la misma en condiciones por lo menos moderadas y, opcionalmente, de
elevada astringencia. La secuencia de ácidos nucleicos aislada
puede comprender el inserto de ADNc del vector
DNA40571-1315 depositado el 21 de abril de 1998 como
ATCC 209784 que incluye la secuencia de nucleótidos que codifica
PRO351.
En otra realización, tal y como se define en las
reivindicaciones, la presente invención proporciona un polipéptido
PRO351 aislado. En particular, la presente invención proporciona una
secuencia nativa de polipéptido PRO351 aislado que, en una
realización, incluye una secuencia de aminoácidos que comprende los
residuos 1 a 571 de la figura 2 (SEC ID No: 2). En otra
realización, la presente invención proporciona un polipéptido
PRO351 aislado carente de secuencia señal, que incluye una secuencia
de aminoácidos que comprende los residuos de aproximadamente 16 a
571 de la figura 2 (SEC ID No: 2). Opcionalmente, el polipéptido
PRO351 se obtiene o es obtenible mediante la expresión del
polipéptido codificado por el inserto de ADNc del vector
DNA40571-1315 depositado el 21 de abril de 1998
como ATCC 209784.
En otras realizaciones de la presente invención,
tal y como se define en las reivindicaciones, la presente invención
proporciona vectores que comprenden ADN que codifica cualquiera de
los polipéptidos descritos anterior y posteriormente. También se
proporciona una célula huésped que comprende cualquiera de dichos
vectores. A modo de ejemplo, las células huésped pueden ser células
CHOI, E. Coli o levadura. También se proporciona un
procedimiento para producir cualquiera de los polipéptidos descritos
anterior y posteriormente y comprende el cultivo de células huésped
en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido deseado y
la recuperación del polipéptido del seado del cultivo celular.
En otras realizaciones, tal y como se define en
las reivindicaciones, la presente invención proporciona moléculas
quiméricas que comprenden cualquiera de los polipéptidos descritos
anterior y posteriormente fusionados a un polipéptido o secuencia
de aminoácidos heterólogos. Un ejemplo de dicha molécula quimérica
comprende cualquiera de los polipéptidos descritos anterior y
posteriormente fusionados a una secuencia etiqueta con epítopo o
una región Fc de una inmunoglobulina.
En otra realización, la presente invención
proporciona un anticuerpo tal y como se define en las
reivindicaciones. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal.
La figura 1 muestra una secuencia de nucleótidos
(SEC ID No: 1) de un ADNc de secuencia nativa de PRO351, en la que
la SEC ID No: 1 es un clon designado en la presente invención como
"UNQ308" y/o "DNA40571-1315".
La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos
(SEC ID No: 2) derivada de la secuencia codificante de SEC ID No: 1
mostrada en la figura 1.
Los términos "polipéptido PRO" y
"PRO", tal como se usan aquí, y cuando van seguidos
inmediatamente por una designación numérica se refieren a varios
polipéptidos, en donde la designación completa (es decir,
PRO/número) se refiere a secuencias polipeptídicas específicas como
se describe aquí. Los términos "PRO/número polipéptido" y
"PRO número" tal como se usan aquí comprenden secuencias
polipeptídicas nativas y variantes polipeptídicas (que se definen
con más en profundidad más adelante). Los polipéptidos PRO descritos
aquí pueden aislarse de una variedad de fuentes, tales como tejidos
humanos o de otra fuente o preparados mediante métodos de
recombinación o sintéticos.
Una "secuencia nativa de un polipéptido
PRO" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de
aminoácidos que el correspondiente polipéptido PRO natural. Dicha
secuencia nativa de polipéptidos PRO puede aislarse a partir de la
naturaleza o puede producirse mediante métodos recombinantes o
sintéticos. El término "secuencia nativa de polipéptido PRO"
comprende específicamente las formas truncadas naturales o las
formas secretadas de un polipéptido PRO específico (por ejemplo, una
secuencia de un dominio extracelular), formas variantes naturales
(por ejemplo, formas procedentes de ayuste alternativo) y variantes
alélicas del polipéptido naturales. En varias realizaciones de la
presente invención, una secuencia nativa del polipéptido PRO351 es
una secuencia nativa de polipéptido PRO351 maduro o de longitud
completa que comprende los aminoácidos 1 a 571 de la figura 2 (SEC
ID No: 2).
El "dominio extracelular" del polipéptido
PRO o "ECD" se refiere a una forma del polipéptido PRO que
esencialmente está libre de los dominios transmembrana y
citoplasmático. Ordinariamente, un ECD de un polipéptido PRO tendrá
menos de un 1% de dichos dominios transmembrana y/o citoplasmáticos
y preferentemente, tendrá menos de un 0,5% de dichos dominios.
Deberá entenderse que cualquier dominio transmembrana identificado
para los polipéptidos PRO de la presente invención se identifican
según lo acordado con el criterio rutinariamente empleado en la
materia para identificar ese tipo de dominio hidrofóbico. Los
límites exactos de un dominio transmembrana pueden variar pero no
más de alrededor de 5 aminoácidos en cualquier extremo del dominio
como inicialmente se identificó. Opcionalmente, por tanto, un
dominio extracelular de un polipéptido PRO puede contener alrededor
de 5 o menos aminoácidos en cada uno de los extremos del dominio
transmembrana como inicialmente se identificó.
"Variante de un polipéptido PRO" significa
un polipéptido PRO activo como se definió anteriormente o más
adelante que tiene al menos un 80% de identidad en la secuencia de
aminoácidos con la secuencia nativa de longitud completa del
polipéptido PRO, tal como se describe aquí. Dichas variantes de
polipéptido PRO incluyen, por ejemplo, polipéptidos PRO en donde
uno o más residuos de aminoácidos se añaden o eliminan, en el
extremo N- o C- terminal de la secuencia de aminoácidos nativa de
longitud completa. Ordinariamente, una variante de un polipéptido
PRO tendrá al menos un 80% de identidad de secuencia de aminoácidos,
preferentemente al menos un 85% de identidad de secuencia de
aminoácidos, e incluso más preferiblemente al menos alrededor de un
90% de identidad de secuencia de aminoácidos, incluso más
preferentemente al menos un 91% de identidad de secuencia de
aminoácidos, incluso más preferentemente al menos alrededor de un
93% de identidad de secuencia de aminoácidos, incluso más
preferentemente al menos alrededor de un 94% de identidad de
secuencia de aminoácidos, incluso más preferentemente al menos
alrededor de un 95% de identidad de secuencia de aminoácidos,
todavía más preferentemente al menos alrededor de un 96% de
identidad de secuencia de aminoácidos, todavía más preferentemente
al menos alrededor de un 97% de identidad de secuencia de
aminoácidos, todavía más preferentemente al menos alrededor de un
98% de identidad de secuencia de aminoácidos, y más preferentemente
al menos alrededor de un 99% de identidad de secuencia de
aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la secuencia de
aminoácidos nativa de longitud completa tal y como se describe
aquí.
El "Porcentaje (%) de identidad de secuencia
de aminoácidos" con respecto a las secuencias del polipéptido
PRO identificadas aquí, se define como el porcentaje de residuos de
aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los
residuos de aminoácidos en la secuencia específica del polipéptido
PRO, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si
fuera necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad
de secuencia, y sin considerar ninguna substitución conservadora
como parte de la identidad de secuencia. Se pueden realizar
alineamientos con el objetivo de determinar el porcentaje de
identidad en la secuencia de aminoácidos de maneras diversas que
están dentro del ámbito de la materia, por ejemplo, usando programas
disponibles públicamente tales como los programas BLAST,
BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). El programa de
alineamiento preferido es el BLAST. Los expertos en la materia
pueden determinar los parámetros adecuados para medir el
alineamiento, incluyendo cualquier algoritmo necesario para
conseguir el máximo alineamiento a lo largo de la totalidad de las
secuencias que están comparándose. Los valores de % de identidad
usados aquí se han generado con el programa de ordenador
WU-BLAST-2 (Altschul et al.,
Methods in Enzymology 266:460-480 (1996);
http://blast.wustl/edu/blast/README.html). La mayoría de los
parámetros de búsqueda del
WU-BLAST-2 se ajustan a los valores
por defecto. Los parámetros ajustables se ajustan con los valores
siguientes: tramo de solapamiento=1, fracción de solapamiento=0,125
valor umbral(T)=11 y puntuación de matriz = BLOSUM62. Los
parámetros HSP S y HSP S2, que son valores dinámicos usados por el
BLAST-2, los establece el propio programa
dependiendo de la composición de la secuencia de interés y de la
composición del banco de datos con el que se está comparando la
secuencia. Sin embargo, los valores pueden ajustarse para aumentar
la sensibilidad. Un valor en % de identidad de secuencia se
determina por la fracción de residuos idénticos dividido por el
número total de residuos en la región alineada.
"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de
nucleótidos" con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos
que codifican PRO e identificadas aquí se define como el porcentaje
de nucleótidos que en una secuencia candidata son idénticos a los
nucleótidos en las secuencia de ácidos nucleicos del PRO de interés,
después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es
necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de
secuencia. Pueden realizarse alineamientos con el propósito de
determinar el porcentaje de identidad de una secuencia nucléica de
diversas maneras, que se hallan dentro del ámbito de la materia, por
ejemplo, usando programas disponibles públicamente como los
programas BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign
(DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar los
parámetros adecuados para medir el alineamiento, incluyendo
cualquier algoritmo necesario para conseguir el máximo alineamiento
a lo largo de la totalidad de las secuencias que están comparándose.
Los valores de identidad usados aquí se generan mediante el módulo
BLASTN del WU-BLAST-2 fijado a los
parámetros por defecto, con tramo de solapamiento y fracción de
solapamiento fijados a 1 y 0,125 respectivamente.
El término "positivos", en el contexto de
la comparación de secuencias realizado tal y como se describe
arriba, incluye residuos en las secuencias comparadas que no son
idénticos pero tienen propiedades similares (por ejemplo, como
resultado de substituciones conservadoras). El valor de % de
positivos se determina a través de la fracción de residuos que
puntúan un valor positivo en la matriz BLOSUM 62 dividido por el
número total de residuos en la región alineada, tal como se define
anteriormente.
El término epítopo etiquetado se refiere aquí a
un polipéptido quimérico que comprende el polipéptido PRO, o un
dominio de su secuencia, fusionado con un "polipéptido
etiqueta". El polipéptido etiqueta tiene suficientes residuos
para proporcionar un epítopo contra el que se puede generar un
anticuerpo, o que puede ser identificado por algún otro agente,
pero es suficientemente corto como para no interferir en la
actividad del polipéptido PRO de interés. El polipéptido etiqueta
preferentemente es bastante único de forma que el anticuerpo no
reacciona substancialmente de forma cruzada con otros epítopos. Los
polipéptidos etiqueta apropiados generalmente tienen al menos seis
residuos de aminoácidos y usualmente alrededor de entre 8 y 50
residuos de aminoácidos (preferentemente entre 10 y 20
residuos).
"Aislado", cuando se usa para describir
varios polipéptidos usados aquí, significa aquel polipéptido que ha
sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su
entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno
natural son materiales que habitualmente interferirían con los usos
diagnósticos o terapéuticos del polipéptido, y pueden incluir
enzimas, hormonas, y otros solutos de naturaleza proteica o no
proteica. En las realizaciones preferidas, el polipéptido será
purificado (1) en un grado suficiente para obtener al menos 15
residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o
interna mediante el uso de un secuenciador de spinning cup,
o(2) a homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo
condiciones no reductoras o reductoras usando azul de Comassie o,
preferentemente, tinción con plata. El aislamiento del polipéptido
incluye el polipéptido aislado en células recombinantes, en los que
al menos un componente del entorno natural del polipéptido PRO no
estará presente. Habitualmente, sin embargo, el polipéptido aislado
se preparará mediante al menos una etapa de purificación.
Un ácido nucleico que codifica para un
polipéptido PRO "aislado" es una molécula de ácido nucleico
que se identifica y separa de al menos una molécula contaminante de
ácido nucleico con la cual está asociado habitualmente en la fuente
natural del ácido nucleico del polipéptido PRO. Una molécula de
ácido nucleico de un polipéptido PRO aislado es aquella cuya forma
es distinta de la que se encuentra en la naturaleza. Las moléculas
de ácido nucleico para un polipéptido PRO aislado se distinguen, por
tanto, de la molécula de ácido nucleico del polipéptido PRO
específico ya que existe en células naturales. Sin embargo, una
molécula de ácido nucleico para un polipéptido PRO incluye
moléculas de ácido nucleico para el polipéptido PRO contenidas en
las células que ordinariamente expresan el polipéptido PRO en donde,
por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se encuentra en una
localización cromosómica diferente de la de las células
naturales.
El término "secuencias control" hace
referencia a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una
secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped
particular. Las secuencias control que son adecuadas para
procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una
secuencia operadora, y un sitio de unión al ribosoma. Las células
eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación e
intensificadores.
El ácido nucleico está "unido
operativamente" cuando está situado en una relación funcional
con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una
presecuencia o un líder secretor está unido operativamente al ADN
correspondiente a un polipéptido si se expresa como una preproteína
que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o un
intensificador está unido operativamente a una secuencia codificante
si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión
al ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante
si está situado de manera que facilite la traducción. Generalmente
"unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que
están unidas son contiguas, y, en el caso de un líder secretor,
contiguo y en la misma pauta de lectura. Sin embargo, los
intensificadores no tienen porqué ser contiguos. La unión se
consigue mediante ligación en dianas de restricción adecuadas. Si
tales dianas no existen, se usan adaptadores o enlazadores de
oligonucleótidos sintéticos según prácticas convencionales.
El término "anticuerpo" se usa en el
sentido más amplio de la palabra y abarca específicamente
anticuerpos monoclonales contra un solo polipéptido PRO (incluyendo
agonistas, antagonistas y anticuerpos de neutralización) y
composiciones de anticuerpos anti-polipéptido PRO
con especificidad poliepitópica. El término "anticuerpo
monoclonal" tal y como se usa aquí se refiere a un anticuerpo
obtenido de una población de anticuerpos substancialmente
homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la
población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales
que puedan estar presentes en cantidades inferiores.
"Activo" o "actividad" para los
objetivos de esta invención se refiere a forma(s) del
polipéptido PRO que retienen la actividad biológica y/o
inmunológica del polipéptido PRO nativo o natural.
"Tratamiento" se refiere tanto al
tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o
preventivas. Aquellos con necesidad de tratamiento incluyen los que
ya presentan el trastorno, como los propensos a padecerlo.
"Mamífero" para los propósitos de
tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero,
incluyendo humanos, animales domésticos, de granja y del zoo, de
competición deportiva o mascotas tales como ovejas, perros,
caballos, gatos, vacas, y similar. Preferentemente, el mamífero aquí
es un humano.
"Vehículos", tal y como se usa aquí,
incluye los vehículos, excipientes o estabilizantes
farmacéuticamente aceptables que no son tóxicos para la célula o el
mamífero que se está exponiendo al mismo a las dosis y
concentraciones empleadas. A menudo, el vehículo fisiológicamente
aceptable es una solución acuosa tamponada. Entre los ejemplos de
vehículos fisiológicamente aceptables se incluyen tampones como el
fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo
ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de 10
residuos); proteínas, como albúmina sérica, gelatina o
inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como la
polivinilpirrolidona; aminoácidos como la glicina, la glutamina, la
asparraguina, la arginina o la lisina; monosacáridos, disacáridos y
otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas;
agentes quelantes como el EDTA; alcoholes de azúcares como el
manitol o el sorbitol; iones que forman sales como el sodio; y /o
tensoactivos no iónicos como el TWEEN,^{TM} el polietilenglicol
(PEG) y el PLURONICS^{TM}.
El término "agonista" se usa para referirse
a análogos peptídicos y no peptídicos de los polipéptidos PRO
nativos (en donde polipéptido PRO nativo se refiere a un
pro-polipéptido PRO, un
pre-polipéptido PRO, un
prepro-polipéptido PRO o un polipéptido PRO maduro)
de la presente invención y a los anticuerpos que específicamente se
unen a dichos polipéptidos PRO nativos; debido a que retienen al
menos una actividad biológica de un polipéptido PRO nativo.
Preferentemente, los agonistas de la presente invención retienen las
propiedades cualitativas de reconocimiento de unión y las
propiedades de activación del receptor del polipéptido PRO
nativo.
El término "antagonista" se usa aquí para
referirse a una molécula que inhibe una actividad biológica de un
polipéptido PRO nativo de la presente invención en donde el
polipéptido PRO nativo se refiere a un
pro-polipéptido PRO, un
pre-polipéptido PRO, un
prepro-polipéptido PRO o un polipéptido PRO maduro.
Preferentemente, los antagonistas aquí inhiben la unión de un
polipéptido PRO nativo de la presente invención a una pareja de
unión. Un "antagonista" del polipéptido PRO es una molécula
que previene, o interfiere con, una función efectora antagonista PRO
(por ejemplo, una molécula que previene o interfiere con la unión
y/o activación del polipéptido PRO a un receptor del polipéptido
PRO.). Dichas moléculas pueden ser cribadas por su capacidad para
inhibir competitivamente la activación del receptor del polipéptido
PRO mediante la monitorización de la unión de un polipéptido PRO
nativo en presencia y ausencia de la molécula antagonista a
analizar. Un antagonista de la invención incluye también un
polinucleótido antisentido contra el gen del polipéptido PRO,
polinucleótido antisentido que bloquea la transcripción o
traducción del gen del polipéptido PRO, de ese modo inhibe su
expresión y su actividad biológica.
La "astringencia" de las reacciones de
hibridación se determina fácilmente por los expertos en la materia
y generalmente es un cálculo empírico que depende de la longitud de
la sonda, la temperatura de lavado, y la concentración de sales. En
general las sondas más largas requieren temperaturas más altas para
que la hibridación sea adecuada, mientras que las sondas más cortas
necesitan temperaturas más bajas. La hibridación generalmente
depende de la capacidad del ADN desnaturalizado para rehibridarse
cuando las cadenas complementarias están presentes en un entorno
por debajo de sus temperaturas de fusión. Cuanto mayor es el grado
de homología deseado entre la sonda y la secuencia a hibridar,
mayor es la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado,
se deriva que temperaturas relativas más altas tenderían a hacer las
condiciones de reacción más astringentes, mientras que temperaturas
más bajas lo serían menos. Para detalles y explicaciones sobre la
astringencia de las reacciones de hibridación, véase Ausubel et
al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience
Publishers, (1995).
"Condiciones de astringencia" significa (1)
emplear fuerzas iónicas bajas y temperaturas altas para el lavado,
por ejemplo cloruro sódico 0,015M/citrato sódico 0,0015M/ dodecil
sulfato sódico 0,1% a 50ºC, o (2) emplear un agente
desnaturalizante durante la hibridación, como por ejemplo formamida
al 50% (vol/vol) con albúmina sérica bovina al 0,1%/Ficoll al
0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/ tampón de fosfato sódico 50 nM a
pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC. Otro
ejemplo es usar formamida al 50%, 5X de SSC (NaCl 0,75M, citrato
sódico 0,075M), fosfato sódico 50 mM (pH 6/8), pirofosfato sódico al
0,1%, solución Denhart 5X, ADN de esperma de salmón sonicado (50
\mug/ml), SDS al 0,1%, y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC en SSC
2X y SDS al 0,1%. Otro ejemplo más de hibridación usa un tampón de
sulfato de dextrano al 10%, SSC 2X (cloruro sódico/citrato sódico)
y formamida al 50% a 55ºC, seguido de un lavado a alta astringencia
que consiste en SSC 0,1X conteniendo EDTA a 55ºC.
"Condiciones moderadamente astringentes" se
describen en Sambrook et al., supra, e incluye el uso
de una solución de lavado y de condiciones de hibridación (por
ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos astringentes
que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones
moderadamente astringentes es una incubación durante la noche a
37ºC en una solución compuesta por: formamida al 20%, SSC 5X (150 mM
de NaCl, 15mM de citrato trisódico), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6),
solución Denhart 5X, sulfato de dextrano al 10% y 20 mg/ml de ADN
de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, seguido de un
lavado de los filtros en SSC 1X a aproximadamente
37-50ºC. El personal capacitado reconocerá como
ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc., como sea necesario
para adaptarse a factores como la longitud de la sonda y
similares.
El "análisis de Southern" o la
"transferencia de Southern" es un método por el cual la
presencia de secuencias de ADN en un ADN digerido con enzimas de
restricción o una composición que contenga ADN se confirma por
hibridación a un oligonucleótido marcado o a un fragmento de ADN
conocidos. El análisis de Southern implica habitualmente la
separación electroforética del ADN digerido en geles de agarosa, la
desnaturalización del ADN después de la separación electroforética
y la transferencia del ADN a un soporte de membrana de
nitrocelulosa, nylon o cualquier otro soporte adecuado para el
análisis con una sonda marcada radioactivamente, biotinilada o
marcada enzimáticamente como se describe en las secciones
9.37-9.52 de Sambrook et al., Molecular
Cloning: A laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989).
El "análisis de Northern" o la
"transferencia de Northern" es un método usado para identificar
secuencias de ARN que hibridan a una sonda conocida como un
oligonucleótido, un fragmento de ADN, un fragmento de su ADNc o un
fragmento de ARN. La sonda se marca con un radioisótopo como
P^{32}, o por biotinilización o enzimáticamente. El ARN que va a
analizarse habitualmente se separa electroforéticamente en gel de
agarosa o poliacrilamida, transferido a una membrana de
nitrocelulosa, nylon, o cualquier otra membrana adecuada, e
hibridada con la sonda, usando técnicas estándar bien conocidas en
la técnica como las descritas en las secciones
7.39-7.52 de Sambrook et al.,
supra.
Tal y como se usa aquí, el término
"inmunoadhesina" designa moléculas tipo anticuerpo que combinan
la unión específica a una proteína heteróloga (una "adhesina")
con las funciones efectoras de los dominios constantes de una
inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden
una fusión entre una secuencia de aminoácidos con la especificidad
de unión deseada que no es otra que los sitios de reconocimiento del
antígeno y el sitio de unión de un anticuerpo (es decir, es
"heteróloga"), y la secuencia de un dominio constante de
inmunoglobulina. La región adhesina de una molécula de
inmunoadhesina habitualmente es una secuencia de aminoácidos
contigua que comprende al menos el sitio de unión de un receptor o
un ligando. La secuencia del dominio constante de inmunoglobulina
en la inmunoadhesina puede obtenerse a partir de cualquier
inmunoglobulina como los subtipos IgG-1,
IgG-2, IgG-3, o
IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e
IgA-2), IgE, IgD o IgM.
El término administración "crónica" se
refiere a la administración del agente(s) de modo continuo
contrariamente a un modo agudo, para mantener el efecto terapéutico
inicial (actividad) durante un periodo de tiempo prolongado.
Administración "intermitente" es aquel tratamiento que no se
realiza consecutivamente sin interrupción, sino que tiene una
naturaleza cíclica.
La administración "en combinación con" uno
o más agentes terapéuticos incluye la administración simultánea
(concurrente) y consecutiva en cualquier orden.
El término "vector de expresión" se usa
para definir un vector, en el cual un ácido nucleico que codifica
para el polipéptido PRO está unido operativamente a secuencias
control capaces de afectar su expresión en una célula huésped
adecuada. Los vectores habitualmente llevan un sitio de replicación
(aunque éste no es necesario si se produce integración
cromosómica). Los vectores de expresión también incluyen secuencias
marcadoras que son capaces de proporcionar una selección fenotípica
en las células transformadas. Por ejemplo E. coli
habitualmente se transforma con PBR322, un plásmido derivado de una
especie de E. coli (Bolivar, et al., Gene
2:95[1977]). El PBR322 contiene genes que codifican para
resistencia a ampicilina y tetraciclina y por tanto proporciona un
método sencillo para identificar las células transformadas para
objetivos de clonación o expresión. Los vectores de expresión
óptimamente también contendrán secuencias útiles para el control de
la transcripción y la traducción, por ejemplo, promotores y
secuencias Shine-Dalgarno (para procariotas) o
promotores e intensificadores (para células mamíferas). Los
promotores pueden ser, pero no necesariamente, inducibles; incluso
promotores fuertes constitutivos como el promotor del CMV para
huéspedes mamíferos se ha observado que produce el LHR sin
toxicidad para la célula huésped. Aunque es posible que los vectores
de expresión no necesiten contener ningún control de expresión,
secuencias replicativas o genes de selección, su ausencia puede
dificultar la identificación de transformantes híbridos y el logro
de niveles de expresión elevados de la inmunoglobulina híbrida.
El término "lipopolisacárido" o "LPS"
se usa aquí como sinónimo de endotoxina. Los lipopolisacáridos
(LPS) son componentes característicos de la membrana exteARN de
bacterias Gram-negativas,por ejemplo, Escherichia
coli. Consisten en una parte de polisacárido y una lipídica
denominada lípido A. El polisacárido, que varía de una especie
bacteriana a otra, está compuesto por una cadena específica O
(constituida a base de unidades repetidas de tres a ocho azúcares)
y el núcleo de dos partes. El lípido A virtualmente siempre incluye
dos azúcares de glucosamina modificados por un fosfato y un número
variable de ácidos grasos. Para más información véase, por ejemplo,
Rietschel and Brade, Scientific American Agosto
1992,54-61.
El término "choque séptico" se usa aquí en
el sentido más amplio, incluyendo algunas definiciones descritas en
Bone, Ann. Intern. Med. 114, 332-333 (1991).
Específicamente, el choque séptico comienza con una respuesta
sistémica a la infección, un síndrome llamado sepsis. Cuando este
síndrome resulta en hipotensión y disfunción orgánica, se denomina
choque séptico. El choque séptico puede ser iniciado por organismos
Gram-positivos y hongos, así como por organismos
Gram-negativos que contengan endotoxina. Por
consiguiente, la definición indicada no se limita al "choque por
endotoxina".
Las frases "amplificación génica" y
"duplicación génica" son intercambiables y se refieren a un
proceso por el cual en una célula o línea celular particular se
forman múltiples copias de un gen o de fragmentos de un gen. La
región duplicada (un tramo de ADN amplificado) se denomina
frecuentemente como "amplicón". Habitualmente la cantidad de
ARN mensajero (ARNm) producido, es decir, el nivel de expresión
génica, también aumenta en proporción con el número de copias
hechas del gen particular expresado.
"Tumor" tal y como se usa aquí, se refiere
a todo crecimiento y proliferación celular neoplásico, tanto
maligno o benigno, y a todas las células y tejidos
pre-cancerosos y cancerosos. Los términos
"cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la
condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza habitualmente
por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer
incluyen, aunque no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma,
sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de dichos cánceres
incluyen el cáncer de mama, de próstata, de colon, el carcinoma de
las células espinales, el cáncer de pulmón de células pequeñas, el
cáncer de pulmón de células no pequeñas, el cáncer
gastrointestinal, el cáncer de páncreas, el glioblastoma, el cáncer
de cérvix, el cáncer de ovarios, el cáncer hepático, el cáncer de
vejiga, el hepatoma, el cáncer colorectal, el carcinoma de
endometrio, el carcinoma de glándulas salivares, el cáncer de riñón,
el cáncer de vulva, el cáncer de tiroides, el carcinoma hepático, y
varios tipos de cáncer de cabeza y cuello.
El término "agente citotóxico" tal y como
se usa aquí se refiere a una sustancia que inhibe o previene la
función de las células y/o que causa destrucción celular. El término
incluye isótopos radioactivos (por ejemplo, I^{131}, I^{125},
Y^{90}, y Re^{186}), agentes quimioterapéuticos, y toxinas como
toxinas activas enzimáticamente de origen bacteriano, fúngico, de
plantas o animales, o sus fragmentos.
Un "agente quimioterapéutico" es un
compuesto químico útil para el tratamiento del cáncer. Entre los
ejemplos de agentes quimioterapéuticos se incluyen adriamicina,
doxorrubicina, epirrubicina, 5-fluorouracil,
arabinósido de citosina ("Ara-C"),
ciclofosfamida, tiotepa, busulfan, taxoides, por ejemplo, paclitaxel
(Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton,
NJ) y doxetaxel (Taxotere®, Rhone-Poulenc Rorer,
Antony, France), taxotere, metotrexato, cisplatino, melfalan,
vinblastina, bleomicina, etopósido, ifosmamida, mitomicina C,
mitoxantrone, vincristina, vinorelbina, carboplatino, tenipósido,
daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina,
mitomicinas, esperamicinas (véase patente americana US 4.675.187),
melfalan y otras mostazas nitrogenadas relacionadas. También se
incluyen en esta definición agentes hormonales que regulan o inhiben
la acción de hormonas sobre tumores como tamoxifeno y
onapristona.
Un "agente inhibidor del crecimiento"
cuando se usa aquí se refiere a un compuesto o composición que
inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula
cancerosa que sobreexprese cualquiera de los genes identificados
aquí, tanto in vitro como in vivo. Por tanto, el
agente inhibidor del crecimiento es aquel que reduce
significativamente el porcentaje de células que sobreexpresan dichos
genes en fase S. Entre los ejemplos de inhibidores del crecimiento
se incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo (en otra
fase distinta de la fase S), como aquellos agentes que inducen la
quiescencia celular en fase G1 y M. Entre los agentes que
clásicamente bloquean la fase M se incluyen las vincas (vincristina
y vinblastina), el taxol, e inhibidores de la topo II como la
doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etopósido, y
bleomicina. Aquellos agentes que producen quiescéncia en G1 también
producen quiescéncia en fase S, por ejemplo agentes alquilantes del
ADN como tamoxifeno,prednisona, dacarbazida, mecloretamina,
cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y
ara-C. Puede encontrarse información adicional en
The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo
1, titulado "Cell cycle regulation, oncogens and antineoplastic
drugs " por Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia,
1995), especialmente pag 13.
La "doxorrubicina" es un antibiótico
antraciclina.
El término "citoquina" es un término
genérico para proteínas liberadas por una población celular que
actúa sobre otras células como mediadores intercelulares. Entre los
ejemplos de citoquinas están las linfoquinas, las monoquinas, y las
hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citoquinas se
incluyen hormonas de crecimiento como la hormona del crecimiento
humana, la hormona del crecimiento humana
N-metionil, la hormona del crecimiento bovina, la
hormona paratiroidea, la tiroxina, la insulina, la proinsulina, la
relaxina, la prorelaxina y similares. Tal y como se usa aquí el
término citoquina incluye proteínas de origen natural u obtenidas a
partir de cultivos celulares recombinantes con una actividad
biológica equivalente a las de las citoquinas nativas.
"Anticuerpos nativos" e "inmunoglobulinas
nativas" son glicoproteínas heterotetraméricas de alrededor de
150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y
dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a
una cadena pesada mediante un enlace covalente disulfuro, mientras
el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de
diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y
ligera también tiene puentes disulfuro intracatenarios espaciados
regularmente. Cada cadena pesada tiene en su extremo un dominio
variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada
cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un
dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la
cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena
pesada, y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con
dominio variable de la cadena pesada. Se considera que los residuos
de aminoácidos particulares forman una superficie entre los
dominios variables de las cadenas ligera y pesada.
El término "variable" se refiere al hecho
de que ciertas porciones de los dominios variables difieren
extensamente en secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y
en la especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno.
Sin embargo, la variabilidad no está distribuida regularmente por
todos los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en 3
segmentos denominados regiones determinantes de complementariedad
(CDRs) o regiones hipervariables tanto en los dominios variables de
la cadena ligera y la cadena pesada. Las regiones de los dominios
variables más altamente conservadas se denominan regiones de
entramado (FR). Cada uno de los dominios variables de las cadenas
ligera y pesada nativas comprende cuatro regiones FR, que adoptan
una configuración de hoja beta, conectadas por 3 CDRs, los cuales
forman bucles de conexión, y en algunos casos forman parte de la
estructura hoja beta. Los 3 CDRs en cada cadena están unidos en
proximidad con las regiones FR y, con los CDRs de la otra cadena,
contribuyen a la formación del sitio de unión del antígeno de los
anticuerpos (véase Kabat y col, NIH Publ. Nº91-3242,
Vol I páginas 647-669 (1991)). Los dominios
constantes no están implicados directamente en la unión del
anticuerpo al antígeno, pero muestran diversas funciones efectoras,
como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular
dependiente del anticuerpo.
Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden
fracciones de un anticuerpo intacto, preferentemente las regiones
de unión al antígeno o las región variables del anticuerpo intacto.
Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo se incluyen los
fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; "diabodies",
anticuerpos lineales (Zapata et al., Protein Eng.
8(10): 1057-1062 [1995]); moléculas de
anticuerpos de cadena simple; y anticuerpos multiespecíficos
formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
La digestión con papaína de los anticuerpos
produce dos fragmentos idénticos de unión a antígeno, llamados
fragmentos "Fab", cada uno con un sitio simple de unión a
antígeno, y un fragmento residual "Fc", una designación que
refleja la capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con
pepsina da lugar a un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios
de combinación de antígeno y que todavía es capaz de unirse al
antígeno.
El fragmento "Fv" es el fragmento mínimo
que contiene un sitio de reconocimiento del antígeno y de unión
completa. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable
de cadena pesada y otro de cadena ligera en estrecha asociación no
covalente. Es en esta configuración que las tres CDRs de cada
dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión
antígeno-anticuerpo en la superficie del dímero
VH-VL. Colectivamente, las seis CDRs confieren la
especificidad de unión del anticuerpo al antígeno. Sin embargo,
incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende
solo tres CDRs específicas para un antígeno) tienen la capacidad de
reconocer y unirse al antígeno, aunque con menor afinidad que el
sitio de unión completo.
El fragmento Fab también contiene el dominio
constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1)
de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos
Fab' por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxilo
del dominio CH1 de la cadena pesada incluyendo una o más cisteínas
de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la
designación usada aquí para Fab' en el cual el/los residuo(s)
de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre.
Los fragmentos F(ab')2 de un anticuerpo originalmente se
produjeron como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas
bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos
químicos de fragmentos de anticuerpos.
Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos
(inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden
asignarse a uno de los dos tipos claramente diferenciados, llamados
kappa y lambda, basados en las secuencias aminoacídicas de sus
dominios constantes.
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del
dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas
pueden asignarse a diferentes clases. Hay 5 clases fundamentales de
inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, y varias de ellas
pueden ser divididas en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1,
IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2.
Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena
simple" o "sFv" comprenden los dominios VH y VL del
anticuerpo, en donde dichos dominios se presentan en una cadena
polipeptídica simple. Preferentemente, el polipéptido Fv comprende
además un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL que
permite al sFv formar la estructura deseada para la unión del
antígeno. Para una revisión sobre sFv, véase Pluckthun en The
Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore
eds., Springer-Verlag, New York, pp
269-315 (1994).
El término "diabodies" se refiere a
pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión del
antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena
pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL)
en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Mediante
el uso de un enlazador demasiado corto para permitir la unión entre
los dos dominios en la misma cadena, los dominios están forzados a
unirse con los dominios complementarios de otras cadenas y crear
dos sitios de unión de antígeno. Los "diabodies" se describen
en mayor profundidad en, por ejemplo, la patente europea 404.097; la
patente mundial WO93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).
Un anticuerpo "aislado" es aquel que ha
sido identificado y separado o recuperado a partir de un componente
de su entorno natural. Son componentes contaminantes de su entorno
natural materiales que interferirían en el uso diagnóstico o
terapéutico del anticuerpo, y puede incluir enzimas, hormonas, y
otros solutos de naturaleza proteica o no proteica. En
realizaciones preferentes, el anticuerpo podrá ser purificado (1) a
más de un 95% en peso de anticuerpo determinado por el método de
Lowry, y más preferentemente a más del 99% en peso, (2) a un grado
suficiente para obtener al menos 15 residuos del extremo
N-terminal o de la secuencia de aminoácidos interna
mediante el uso de un secuenciador de spinning cup o, (3) a
homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones
reductoras o no reductoras usando azul de Comassie o,
preferentemente, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye
el anticuerpo localizado dentro de las células recombinantes en el
que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no
estará presente. Ordinariamente, sin embargo, el anticuerpo aislado
se preparará mediante una etapa de purificación.
La palabra "marca" cuando se usa aquí se
refiere a un compuesto o composición detectable que está conjugado
directa o indirectamente con el anticuerpo para generar un
anticuerpo "marcado". El marcaje puede detectarse por sí mismo
(por ejemplo, marcajes radioactivos o fluorescentes) o, en el caso
del marcaje enzimático, puede catalizar una alteración química de
un compuesto o composición substrato que es detectable.
Como "fase sólida" se entiende una matriz
no acuosa a la cual puede adherirse el anticuerpo de la presente
invención. Los ejemplos de fases sólidas incluyen aquellos formados
parcialmente o en su totalidad por vidrio (por ejemplo, vidrio de
poro controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa),
poliacrilamidas, poliestireno, alcohol polivinílico y siliconas. En
ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida
puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras es una
purificación por columna (por ejemplo, una columna de cromatografía
de afinidad). Este término incluye también una fase sólida
discontinua de partículas discretas, como las descritas en la
patente americana U.S. 4.275.149.
Un "liposoma" es una pequeña vesícula
compuesta por varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensoactivos
que es útil para la vehiculización de un fármaco a un mamífero. Los
componentes del liposoma se disponen comúnmente en formación de
bicapa, similar a la disposición de las membranas biológicas.
La presente invención proporciona secuencias de
nucleótidos recientemente identificadas y aisladas que codifican
polipéptidos a los que se hace referencia en la presente invención
como PRO351. En particular, los Solicitantes han identificado y
aislado el ADNc que codifica un polipéptido PRO351, tal y como se
describe con mayor detalle en los ejemplos mostrados a
continuación. El análisis de la secuencia de aminoácidos del
polipéptido PRO351 de longitud completa usando los programas
informáticos de alineamiento de secuencias BLAST y FastA sugiere
que varias partes del polipéptido PRO351 poseen una similitud de
secuencia significativa con la proteína prostasina, indicando de
este modo que PRO351 puede ser una proteína de prostasina nueva. Más
específicamente, un análisis de la base de datos Dayhoff (versión
35.45 SwissProt35) evidenció una similitud de secuencia
significativa entre la secuencia de aminoácidos de PRO351 y las
siguientes secuencias Dayhoff "AC003965_1", "CELC07G1_7",
"GEN12917", "HEPS_HUMAN", "GEN14584",
"MCT6_MOUSE", "HSU75329_1", "PLMN_ERIEU",
"TRYB_HUMAN" y
"P_W22987". Por consiguiente, se cree actualmente que el polipéptido PRO351 descrito en la presente solicitud es un miembro identificado recientemente de la familia de prostasina y posee propiedades y actividades típicas de la familia de prostasina.
"P_W22987". Por consiguiente, se cree actualmente que el polipéptido PRO351 descrito en la presente solicitud es un miembro identificado recientemente de la familia de prostasina y posee propiedades y actividades típicas de la familia de prostasina.
Además de la secuencia nativa de longitud
completa de los polipéptidos PRO descritos aquí, se contempla que
pueden prepararse variantes del polipéptido PRO. Las variantes del
polipéptido PRO pueden prepararse mediante la introducción de
cambios adecuados en el ADN del polipéptido PRO, o mediante síntesis
del polipéptido PRO deseado. Los expertos en la materia apreciarán
que los cambios de aminoácidos pueden alterar procesos
post-traduccionales de los polipéptidos PRO, tales
como la modificación del número o la posición de sitios de
glicosilación o la alteración de las características de anclaje a
la membrana.
Las variaciones en la secuencia de longitud
completa de los polipéptidos PRO o en varios dominios de los
polipéptidos PRO descritas aquí, pueden realizarse, por ejemplo,
usando cualquiera de las técnicas y pautas sobre mutaciones
conservativas y no conservativas marcadas, por ejemplo, en la
patente americana U.S. 5.364.934. Las variaciones pueden ser
substituciones, deleciones, o inserciones de un o más codones que
codifican para el polipéptido PRO que resulten en un cambio de
secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO comparado con la
secuencia nativa del polipéptido PRO. Opcionalmente, la variación
es por substitución de al menos un aminoácido por otro aminoácido
en un o más dominios del polipéptido PRO. La pauta para determinar
qué residuo aminoacídico puede ser insertado, substituido, o
eliminado sin afectar adversamente la actividad deseada puede
encontrarse comparando la secuencia del polipéptido PRO con la de
moléculas proteicas homólogas conocidas y minimizando el número de
cambios en la secuencia de aminoácidos en regiones con alta
homología. Las substituciones aminoacídicas pueden ser el resultado
de reemplazar un aminoácido por otro que muestre similitud
estructural y/o de propiedades químicas, como la substitución de
una leucina por una serina, es decir, substituciones conservativas.
Las inserciones o deleciones opcionalmente pueden estar en el rango
de 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida puede determinarse
haciendo inserciones, deleciones o substituciones de aminoácidos en
la secuencia sistemáticamente, y analizando las variaciones de
actividad resultantes en el ensayo in vitro descrito
más adelante en los Ejemplos.
En realizaciones particulares, las
substituciones conservativas de interés se muestran en la Tabla 1
bajo el título de substituciones preferentes. Si tales
substituciones resultan en un cambio en la actividad biológica,
entonces se introducen cambios más substanciales, denominados en la
Tabla 1 substituciones ejemplares, o como se describe
posteriormente en referencia a clase de aminoácidos, y se analizarán
los productos.
Se llevan a cabo modificaciones substanciales en
la función o en la identidad inmunológica del polipéptido PRO
mediante la selección de substituciones que difieren
significativamente en su efecto de mantener (a) la estructura del
esqueleto del polipéptido en la técnica de substitución, por
ejemplo, con una conformación de hélice u hoja, (b) la carga de
hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de
la cadena lateral. Los residuos que se producen de forma natural se
dividen en grupos basados en propiedades comunes de la cadena
lateral:
- (1)
- hidrofóbico: norleucina, met, ala, val, leu, ile;
- (2)
- hidrofílico neutro: cys,ser,thr:
- (3)
- acídico: asp, glu;
- (4)
- básico: asn, gln, his, lys, arg;
- (5)
- residuos que influencian en la orientación de la cadena: gly, pro; y
- (6)
- aromáticos: trp, tyr, phe.
Las substituciones no conservativas implicarán
el cambio de un miembro de estas clases por otro de otra clase.
Tales residuos substituidos pueden introducirse en los sitios de
substitución conservativos, o más preferentemente, en los sitios
remanentes (no conservativos).
Las variaciones pueden realizarse usando métodos
conocidos en la técnica tales como la mutagénesis mediada por
oligonucleótidos (dirigida), el rastreo de alanina y la mutagénesis
por PCR. La mutagénesis dirigida [Carter et al., Nucl. Acids
Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res.,10:6487
(1987)], la mutagénesis de casete [Wells et al., Gene, 34:
315(1985)], la mutagénesis de selección por restricción
[Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415
(1986)] u otras técnicas conocidas pueden ser utilizadas sobre el
ADN clonado para producir la variante de ADN del polipéptido PRO
deseado.
El análisis de rastreo de aminoácidos puede
emplearse también para identificar un o más aminoácidos a lo largo
de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos preferidos para el
rastreo están los aminoácidos neutros, relativamente pequeños.
Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La
alanina es uno de los aminoácido de rastreo preferidos entre este
grupo ya que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y
es menos probable que altere la conformación de la cadena principal
en la variante. También se prefiere habitualmente la alanina porque
es el aminoácido más común. Además, se encuentra frecuentemente
tanto en posiciones escondidas como en las expuestas [Creghton, The
Proteins, (W. H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol.,
150: 1 (1976)]. Si la sustitución por alanina no rinde suficiente
cantidad de variante, se puede utilizar un aminoácido
isotérico.
Dentro del ámbito de esta invención se incluyen
modificaciones covalentes de los polipéptidos PRO. Un tipo de
modificación covalente incluye la reacción de los residuos de
aminoácidos diana del polipéptido PRO con un agente orgánico
derivatizante que es capaz de reaccionar con cadenas laterales
seleccionadas o con los residuos N- o C- terminales del polipéptido
PRO. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por
ejemplo, para la unión del polipéptido PRO a una matriz de soporte
insoluble en agua o a una superficie para purificar anticuerpos
anti-polipéptido PRO y viceversa. Los agentes de
unión comúnmente más usados incluyen, por ejemplo,
1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano,
glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por
ejemplo, ésteres con el ácido 4-azidosalicílico,
imidoésteres homobifuncionales, incluidos disuccinimidil ésteres
tales como el
3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato),
maleimidas bifuncionales como
bis-N-maleimido-1,8-octano
y agentes tales como el
metil-3-[p-azidobenil)-dithio]propioimidato.
Otras modificaciones incluyen la desamidación de
residuos glutaminil y asparaginil a los correspondientes residuos
glutamil y aspartil, respectivamente, la hidroxilación de prolina y
lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos seril o
treonil, la metilación de los grupos \alpha-amino
de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina [T.E.
Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H.
Freeman & Co., San Francisco, páginas 79-86
(1983)], la acetilación de la amina N-terminal y la
amidación de cualquier grupo carboxilo
C-terminal.
Otro tipo de modificación covalente de los
polipéptidos PRO incluida dentro del ámbito de esta invención
comprende la alteración del patrón de glicosilación nativo del
polipéptido. "La alteración del patrón de glicosilación"
significa aquí, de cara a los objetivos previstos, la eliminación de
un o más grupos carbohidrato que se encuentran en una secuencia
nativa del polipéptido PRO, y/o la adición de un o más sitios de
glicosilación que están presentes en la secuencia del polipéptido
PRO nativa, y/o la alteración del ratio y/o composición de los
residuos de azúcar unidos al sitio(s) de glicosilación.
La adición de sitios de glicosilación al
polipéptido PRO puede conseguirse alterando la secuencia de
aminoácidos. Esta alteración puede lograrse, por ejemplo, mediante
la adición de, o la sustitución por, un o más residuos de serinas o
treoninas a la secuencia nativa del polipéptido PRO (para lugares de
O-glicosilación). La secuencia de aminoácidos del
polipéptido PRO puede ser alterada opcionalmente a través de cambios
a nivel de ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el
polipéptido PRO en bases preseleccionadas de tal modo que los
codones que se generen se traduzcan en los aminoácidos deseados.
El acoplamiento químico o enzimático de
glicósidos al polipéptido constituye otro mecanismo para incrementar
el número de grupos carbohidrato en el polipéptido del polipéptido
PRO. Estos métodos están descritos en la materia, por ejemplo, en
la patente internacional WO87/05330 publicada el 11 de Septiembre de
1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp 259- 306
(1981).
La eliminación de grupos carbohidrato presentes
en el polipéptido PRO puede conseguirse químicamente o
enzimáticamente o mediante substitución mutacional de codones que
codifican para residuos de aminoácidos que sirven como dianas de
glicosilación. Las técnicas de deglicosilación química se conocen
en la técnica y se describen, por ejemplo, por Hakimuddin et
al., Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987) y por Edge et
al., Anal. Biochem., 118: 131 (1981). La ruptura enzimática de
los grupos carbohidrato en los polipéptidos puede lograrse usando
distintas endo- y exo-glicosidasas como describe
Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138: 350 (1987).
Otro tipo de modificación covalente de los
polipéptidos PRO de la invención comprende la unión del polipéptido
PRO a uno de los diversos polímeros no proteicos, por ejemplo,
polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, tal y
como se indica en las patentes americanas U.S. 4.640.835; 4.496.689;
4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ó 4.179.337.
Los polipéptidos PRO de la presente invención
pueden ser modificados también para formar una molécula quimérica
que comprenda el polipéptido PRO unido a otro polipéptido heterólogo
o a una secuencia de aminoácidos. En una realización tal molécula
quimérica comprende una fusión del polipéptido PRO con un
polipéptido etiqueta que proporciona un epítopo al cual un
anticuerpo anti-etiqueta puede unirse de forma
selectiva. El epítopo etiqueta generalmente se sitúa en el extremo
amino o carboxil del polipéptido PRO. La presencia de dichas formas
epítopo-etiqueta del polipéptido PRO pueden
detectarse usando un anticuerpo anti-polipéptido
etiqueta. También la provisión del epítopo etiqueta permite al
polipéptido PRO estar listo para ser purificado fácilmente por
afinidad usando un anticuerpo anti-etiqueta u otro
tipo de matriz de afinidad que se una al epítopo etiqueta.
Alternativamente, la molécula quimera puede comprender una fusión
del polipéptido PRO con una inmunoglobulina o una región
particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la
molécula quimérica, dicha fusión podría ser a la región Fc o a una
molécula IgG.
Son bien conocidos en la técnica varios
polipéptidos etiqueta y sus respectivos anticuerpos. Los ejemplos
incluyen etiquetas de poli-histidina
(poli-his) o
poli-histidina-glicina; el
polipéptido etiqueta flu HA y su anticuerpo 12CA5 [Fleid et
al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; la
etiqueta c-myc y sus anticuerpos, el 8F9, el 3C7,
el 6E10, el G4, el B7 y el 9E10 [Evan et al., Molecular and
Cellular Biology,5:3610-3616 (1985)] y la etiqueta
de la glicoproteína D del virus del herpes simple (gD) y su
anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering,
3(6): 547-553 (1990)]. Otros polipéptidos
etiqueta incluyen el péptido Flag [Hoop et al.,
Biotechnology, 6: 1204-1210 (1988)]; el péptido del
epítopo KT3 [Martin et al., Science,
225:192-194 (1992)]; el péptido de un epítopo de
\alpha-tubulina [Skinner et al., J. Biol.
Chem., 266:15163-15166 (1991)] y el péptido etiqueta
de la proteína 10 del gen T7. [Lutz-Freyermuth
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:
6393-9397 (1990).
La descripción indicada posteriormente se
refiere principalmente a la producción de polipéptidos PRO mediante
el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector
que contiene el ácido nucleico correspondiente al polipéptido PRO
deseado. Por supuesto, se contempla que se puedan utilizar métodos
alternativos para preparar el polipéptido PRO, bien conocidos en la
técnica. Por ejemplo, la secuencia del polipéptido PRO o fracciones
del mismo, pueden producirse mediante síntesis peptídica directa
usando técnicas de fase sólida [véase, por ejemplo Stewart et
al., Solid-Phas Peptide Synthesis, W.H. Freeman
Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc.,
85:2149-2154 (1963)]. La síntesis proteica in
vitro puede realizarse usando técnicas manuales o mediante
automatización. La síntesis automática puede conseguirse, por
ejemplo, usando un Sintetizador de Péptidos de Applied Biosystems
(Foster City, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se
pueden sintetizar químicamente varias porciones del polipéptido PRO
deseado separadamente y combinarlas usando métodos químicos o
enzimáticos para producir el polipéptido PRO completo.
El ADN que codifica para el polipéptido PRO
puede obtenerse de una biblioteca de ADNc preparada a partir de un
tejido que se considera que posee el ARN, del polipéptido PRO y que
lo expresa en un nivel detectable. Por consiguiente, el ADN del
polipéptido PRO humano puede ser obtenido adecuadamente a partir de
una biblioteca de ADNc preparada de un tejido humano, tal y como
se describe en los Ejemplos. El gen que codifica para el
polipéptido PRO puede obtenerse también a partir de una biblioteca
genómica o mediante síntesis con oligonucleótidos.
Las bibliotecas pueden ser cribadas con sondas
(como anticuerpos anti-polipéptido PRO deseado u
oligonucleótidos de alrededor de 20-80 bases)
diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína
codificada por el mismo. El cribado de una biblioteca de ADNc o
genómica con la sonda seleccionada puede realizarse utilizando
procedimientos estándar, como los descritos en Sambrook et
al., Molecular Cloning: A laboratory Manual (New York: Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Otro medio alternativo para
aislar el gen que codifica para el polipéptido PRO deseado consiste
en usar la metodología del PCR [Sambrook et al.,
supra: Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory
Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
Los Ejemplos mostrados posteriormente describen
técnicas para el cribado de bibliotecas de ADNc. Las secuencias de
oligonucleótidos seleccionadas como sondas deben ser de longitud
suficiente y suficientemente específicas como para minimizar falsos
positivos. Preferentemente el oligonucleótido se marca de tal forma
que tras la hibridación al ADN puede ser detectado en la biblioteca
que se está cribando. Los métodos de marcaje son bien conocidos en
la técnica, e incluye el uso de marcadores radioactivos como ATP
marcado con P^{32}, biotinilización o marcaje enzimático.
Sambrook et al., supra proporciona las condiciones de
hibridación, incluyendo una moderada y alta astringencia.
Las secuencias identificadas mediante dichos
métodos de cribado de bibliotecas pueden compararse y alinearse con
otras secuencias conocidas depositadas en bancos de datos públicos
disponibles como el GenBank u otros bancos de datos de secuencias
privadas. La identidad de la secuencia (tanto a nivel de aminoácidos
como de nucleótidos) dentro de regiones definidas o a lo largo de
la totalidad de la secuencia puede determinarse mediante el
alineamiento de secuencia usando programas de ordenador como BLAST,
ALIGN, DNAstar e INHERIT que emplean diversos algoritmos para medir
la homología.
El cribado de bibliotecas seleccionadas de ADNc
o genómicas permite la obtención de ácidos nucleicos que tienen una
secuencia codificante para la proteína usando la secuencia de
aminoácidos deducida descrita aquí por primera vez, y si es
necesario, usando procedimientos convencionales de extensión de
cebador como se describe en Sambrook et al., supra,
para detectar precursores e intermediarios en el procesamiento del
ARNm que no han sido inversamente transcritos en ADNc.
Las células huésped se transfectan o transforman
con vectores de expresión o clonación descritos aquí para la
producción del polipéptido PRO y se cultivan en medio de cultivo
convencional modificado para que sea más apropiado para la
inducción de promotores, la selección de transformantes, o la
amplificación de los genes que codifican para las secuencias
deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como medio, temperatura,
pH y demás, pueden ser seleccionados por el experto en la materia.
En general, los principios, protocolos, y técnicas prácticas, para
maximizar la productividad de las células pueden encontrarse en
Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Aproach, M Butler, ed
(IRL Press, 1991) y Sambrook et al., supra.
Los métodos de transfección son conocidos por el
experto en la materia, por ejemplo, el método del CaPO_{4} y la
electroporación. La transformación se realiza usando técnicas
estándar apropiadas para las células dependiendo de la célula
huésped utilizada. El tratamiento con calcio empleando cloruro
cálcico, como se describe en Sambrook et al., supra,
o la electroporación, generalmente se usan en procariotas u otras
células que contienen barreras importantes como las paredes
celulares. La infección con Agrobacterium tumefaciens se
utiliza para la transformación de ciertas células de plantas, como
se describe por Shaw et al., Gene,23:315 (1983) y la patente
internacional WO 89/05859 publicada el 29 de Junio de 1989. Para
células mamíferas sin tales paredes celulares, puede emplearse el
método de la precipitación con fosfato cálcico de Graham y van der
Eb, Virology,52:456-457 (1978). Se han descrito
aspectos generales de las transformaciones de sistemas de célula
huésped de mamífero en la patente americana U.S. 4.399.216. Las
transformaciones en levaduras se llevan a cabo habitualmente según
el método de Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) y
Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979).
Sin embargo, pueden usarse también otros métodos para introducir
ADN en las células, tales como la microinyección nuclear, la
electroporación, la fusión de protoplastos bacterianos con células
intactas o policationes, por ejemplo, polibrene o poliornitina. Para
diversas técnicas de transformación de células de mamífero, véase
Keown et al., Methods in
Enzymology,185:527-537 (1990) y Mansour et
al., Nature,336:348-352 (1988).
Entre las células huésped adecuadas para clonar
o expresar el ADN en vectores se incluyen procariotas, levaduras o
células eucariotas superiores. Entre los procariotas apropiados se
incluyen, aunque no están limitados a ellos, eubacterias, tales
como organismos Gram-negativos o
Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriáceas
como E. coli. Se encuentran disponibles públicamente varias
cepas de E. coli tales como la cepa E. coliK12 MM294
(ATCC 31, 446); E. coliX1776 (ATCC 31, 537); la cepa E.
coli W3110 (ATCC 27,325) y K5 772(ATCC 53,635). Otras
células huésped procariotas adecuadas incluyen Enterobacteriáceas
como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter,
Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo
Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo Serratia
marcescans, y Shigella, así como Bacilli tales como
B. subtilis y B. Licheniformis (por ejemplo, B.
Licheniformis41P descrito en DD 266,710 publicado el 12 de
Abril de 1989), Pseudomonas tales como P. Aeruginosa,
y Streptomyces. Se encuentran públicamente disponibles
varias cepas de E. coli tales como la cepa E. coliK12
MM294 (ATCC 31, 446); E. coliX1776 (ATCC 31, 537); la cepa
E. coli W3110 (ATCC 27,325) y K5 772(ATCC 53,635).
Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes. La cepa W3110
es un huésped particularmente preferido o un huésped parental porque
es una cepa común para la generación de productos de ADN
recombinante. Preferentemente, la célula huésped secreta cantidades
mínimas de enzimas proteolíticos. Por ejemplo, la cepa W3110 puede
modificarse para causar una mutación genética en los genes que
codifican para proteínas endógenas del huésped; los ejemplos de
tales huéspedes incluyen la cepa E. coli W3110 1A2, la cual
tiene el genotipo completo tonA; la cepa E. coli
W3110 9E4, que presenta el genotipo completo tonA ptr3; la
cepa E. coli W3110 27C7 (ATCC 55,244) que tiene el genotipo
completo tonA ptr3 ptr3phoA E15
(argF-lac)169 degP ompT kan^{1}; la
cepa E. coli W3110 37D6 que tiene el genotipo completo
tonA ptr3phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT
rbs7 ilvG kan^{1}; la cepa E. coli W3110 40B4 que es
la cepa 37D6 con una mutación por deleción degP no resistente
a kanamicina; y una cepa E. coli que presenta una proteasa
periplásmica mutada descrita en la patente americana U.S. 4.946.783
publicada el 7 de Agosto de 1990. Alternativamente, están
disponibles métodos de clonación in vitro, por ejemplo, PCR
u otras reacciones de las polimerasas de ácidos nucleicos.
Junto a procariotas, microbios eucariotas tales
como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes adecuados para
clonación o expresión de vectores que codifican para el polipéptido
PRO. El Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo
huésped eucariota inferior que se usa comúnmente. Otros incluyen
Schizosaccharomyce pombe (Beach y Nurse, Nature, 290:
140[1981]; patente europea EP 139,383 publicado el 2 de Mayo
de 1985); huéspedes Kluyveromyces (patente americana U.S.
4.943.529;Fleer et al., Bio/Technology,
9:968-975 (1991)) tales como, por ejemplo, K
lactis (MW98-8C,CBC683, CBS4574; Louvencort
et al., J Bacteriol., 737 [1983]), K. fragilis (ATCC
12,424) K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii
(ATCC 24,178), K. waltii,(ATCC 56,500), K.
drosophilarium (ATCC 36,906; Van den Berg et al.,
bio/Technology, 8: 135 (1990)), K. thermotolerans y K.
marxianus; yarrowia (patente europea EP 402.226); Pichia
pastoris (patente europea EP 183.070; Sreekrishna et
al., J. Basic Microbiol.,28: 265-278 [1988]);
Candida; Tricoderma reesia (patente europea EP 244.234);
Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 76:5259-5263[1979]);
Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis
(patente europea EP 394.538 publicado el 31 de Octubre de 1990); y
hongos filamentosos tales como por ejemplo, Neurospora,
Penicillium, Totypocladium (patente internacional WO 91/00357
publicada el 10 de Enero de 1991), y huéspedes Aspergillus
tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem.
Biophys. Res. Commn., 112:284-289 [1983]; Tilburn
et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton
et al., Proc. Natl. Acad. USA, 81: 1470-1474
[1984] y A. niger (Kelly y Hynes EMBO J., 4:
475-479 [1985]). Son adecuadas aquí levaduras
metilotroficas e incluyen aunque no se limitan a ellas, levaduras
capaces de crecer en metanol seleccionadas de los géneros
Hansenula, candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis,
y Rhodotorula. Puede encontrarse una lista de especies
específicas que son ejemplos de esta clase de levaduras en C.
Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).
Las células huésped adecuadas para la expresión
de polipéptidos PRO glicosilados se derivan de organismos
multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen
células de insectos como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como
células de plantas. Entre los ejemplos de líneas celulares huésped
de mamífero se incluyen las células de ovario de hámster chino
(CHO) y las células COS. Ejemplos más específicos incluyen la línea
de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC
CRL 1651); la línea de riñón embrionario humano (293 o células 293
subclonadas para crecer en cultivo en suspensión, Graham et
al., J. Gen. Virol., 36:59 (1977); células de ovario de hámster
chino deficientes en DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4,
Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células
humanas de pulmón (W138,ATCC CCL 75); células humanas de hígado
(Hep G2, HB 8065); y células de tumor mamario de ratón (MMT 060562,
ATCC CCL51). La selección de la célula huésped adecuada se tomar
según el criterio del experto en la materia.
El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN
genómico) que codifica un polipéptido PRO deseado puede ser
insertado en un vector replicable para clonación (amplificación del
ADN) o para expresión. Varios vectores están disponibles
públicamente. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un
plásmido, un cósmido, una partícula viral, o un fago. La secuencia
del ácido nucleico apropiada puede insertarse en el vector mediante
diversos procedimientos. En general, el ADN se inserta en un
sitio(s) apropiado reconocido por un enzima de restricción
usando técnicas conocidas en la materia. Los componentes de los
vectores generalmente incluyen, aunque no están limitados a ello,
una o más secuencias señal, un origen de replicación, uno o más
genes marcadores, un elemento intensificador, un promotor, y una
secuencia de finalización de la transcripción. La construcción de
vectores adecuados que contengan uno o más de estos componentes
requiere técnicas de ligación estándar conocidas por el experto en
la materia.
El polipéptido PRO de interés puede producirse
mediante recombinación no sólo directamente, sino también como un
polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, el cual puede
ser una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un lugar
específico de corte en el extremo N-terminal de la
proteína madura o el polipéptido. En general, la secuencia señal
puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN
del polipéptido PRO que se inserta en el vector. La secuencia señal
puede ser una secuencia señal procariota, por ejemplo, del grupo de
la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, lpp, o líderes de endotoxina
II termoestables. Para la secreción en levaduras la secuencia señal
puede ser por ejemplo, la del líder de invertasa de levadura, el
líder factor alfa (incluidos los líderes de los factores \alpha de
Saccharomyces y Kluyveromyces,este último descrito en la
patente americana U.S. 5.010.182), el líder ácido fosfatasa, la
secuencia líder de la glucoamilasa de C. Albicans (patente
europea EP 362.176 publicada el 4 de Abril de 1990) o la señal
descrita en la patente internacional WO 90/13646 publicada el 15 de
Noviembre de 1990. En la expresión en células de mamífero, pueden
usarse secuencias señal de mamíferos para dirigir la secreción de la
proteína, tales como las secuencias señal de polipéptidos
secretados de la misma especie o de especies relacionadas, así como
líderes secretores virales.
Tanto los vectores de expresión como los de
clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite
al vector replicarse en una o más células huésped seleccionadas.
Tales secuencias son bien conocidas para diversas bacterias,
levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es
adecuado para muchas bacterias Gram-negativas, el
origen del plásmido \mu es adecuado para levaduras, y varios
orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles
para vectores de clonación en células de mamíferos.
Los vectores de clonación y expresión contienen
habitualmente un gen de selección, también llamado marcador de
selección. Los genes de selección típicos codifican para proteínas
que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por
ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina (b)
complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suplementan
nutrientes críticos no disponibles en un medio complejo, por
ejemplo, el gen que codifica por la D-alanina
racemasa para Bacilli.
Un ejemplo de marcadores seleccionables
adecuados para células mamíferas son aquellos que permiten la
identificación de células competentes que llevan el ácido nucleico
del polipéptido PRO, como la DHFR o la timidina quinasa. Una célula
huésped apropiada cuando se emplea la DHFR salvaje es la línea
celular CHO deficiente en DHFR, preparada y propagada como se
describe por Urlaub et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA
77:4216 (1980). El gen trp1 presente en el plásmido de
levadura YRp7 es un gen de selección adecuado para ser usado en
levadura [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman
et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene,
10:157 (1980)]. El gen trp1 proporciona un marcador de
selección para una cepa mutante de levadura a la que le falta la
habilidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC Nº 44076 o
PEP4-1 [Jones Genetics,85:12 (1977)].
Los vectores de expresión y clonación
habitualmente contienen un promotor unido operativamente a la
secuencia de ácido nucleico del polipéptido PRO para dirigir la
síntesis del ARNm. Se conocen promotores reconocidos por una
variedad de potenciales células huésped. Los promotores adecuados
para ser usados en huéspedes procariotas incluyen los sistemas de
promotores de la \beta-lactamasa y la lactosa
[Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et
al., Nature, 281:544 (1979)], la fosfatasa alcalina, un sistema
de promotor del triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res.,
8:4057 (1980); patente europea EP 36.776], y promotores híbridos
como el promotor tac [deBoer u col., Proc Natl. Acad. Sci. USA,
80:21-25 (1983)]. Los promotores para uso en
sistemas bacterianos también contendrán una secuencia
Shine-Dalgarno (S. D.) unida operativamente al ADN
que codifica por el polipéptido PRO
deseado.
deseado.
Entre los ejemplos de secuencias promotoras
adecuadas para ser usadas en huéspedes de levadura se incluyen los
promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa
[Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otros
enzimas glicolíticos [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:
149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tales como la
enolasa, la gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, la hexoquinasa, la piruvato decarboxilasa, la
fosfofructoquinasa, la
glucosa-6-fosfato isomerasa, la
3-fosfoglicerato mutasa, la piruvato quinasa, la
triosafosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa y la
glucoquinasa.
Otros promotores de levaduras, promotores
inducibles con la ventaja adicional de tener la transcripción
controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones
promotoras de la alcohol deshidrogenasa 2, el isocitocromo C, la
fosfatasa ácida, las enzimas de degradación asociadas con el
metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, la
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa
y galactosa. En la patente europea EP 73.657 se describen vectores
adecuados y promotores para ser usados en la expresión en
levaduras.
La transcripción del polipéptido PRO a partir de
vectores en células huésped mamíferas se controla, por ejemplo,
mediante promotores obtenidos a partir de genomas de virus como el
virus del polioma, el virus de la viruela aviar (patente inglesa UK
2.211.504 publicada el 5 de julio de 1989), el adenovirus (como el
adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma
aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis
B, y el virus del simio 40 (SV40), a partir de promotores
heterólogos de mamíferos, por ejemplo, el promotor de la actina o
un promotor de inmunoglobulina, y a partir de promotores de choque
térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con el
sistema de célula huésped.
La transcripción de un ADN que codifica para el
polipéptido PRO deseado en eucariotas superiores puede
incrementarse insertando una secuencia intensificadora en el vector.
Los intensificadores son elementos del ADN que actúan en cis,
habitualmente de alrededor de 10 a 300 pb, que actúan sobre un
promotor para aumentar su transcripción. Actualmente se conocen
muchas secuencias intensificadoras de genes mamíferos (globina,
elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e
insulina). Habitualmente, sin embargo, se usará un intensificador de
un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el
intensificador SV40 en el sitio tardío del origen de replicación
(pb 100-270), el intensificador del promotor
temprano del citomegalovirus, el intensificador del polioma en el
sitio tardío del origen de replicación, e intensificadores de
adenovirus. El intensificador puede empalmarse en el vector en la
posición 5' o 3' de la secuencia codificante del polipéptido PRO,
pero es preferible que esté localizado en el sitio 5' del
promotor.
Los vectores de expresión usados en células
huésped eucariotas (de levaduras, hongos, insectos, plantas,
animales, humanos o células nucleadas de otros organismos
multicelulares) contendrán también secuencias necesarias para la
terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm.
Dichas secuencias están disponibles comúnmente en las regiones no
traducidas en 5' y ocasionalmente en 3' de ADNs o ADNcs eucarióticos
o virales. Estas regiones contienen segmentos nucleotídicos
transcritos como fragmentos poliadenilados en la región no
traducida del ARNm que codifica para los polipéptidos PRO.
Incluso se describen otros métodos, vectores y
células huésped adecuadas para ser adaptadas a la síntesis de
polipéptidos PRO en cultivo de células de vertebrados recombinantes
en Gething et al., Nature, 293:620-625
(1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46
(1979); patente europea EP 117.060; y patente europea EP117.058.
La amplificación génica y/o la expresión pueden
medirse directamente en una muestra, por ejemplo, mediante
transferencia de Southern convencional o transferencia de Northern
para cuantificar la transcripción del ARNm [Thomas, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], transferencia
de puntos (análisis de ADN), o hibridación in situ, usando
una sonda adecuada marcada, basada en las secuencias proporcionadas
aquí. Alternativamente, pueden usarse anticuerpos que pueden
reconocer dúplex específicos, incluidos dúplex de ADN, de ARN y
dúplex híbridos de ADN-ARN o
ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez pueden estar
marcados y el ensayo puede llevarse a cabo en donde el dúplex esté
unido a una superficie, por lo que una vez se ha formado el dúplex
en la superficie, puede detectarse la presencia del anticuerpo unido
al dúplex.
La expresión génica puede medirse de forma
alternativa mediante métodos inmunológicos, tales como tinción
inmunohistoquímica de las células o secciones de tejido y ensayos
del cultivo celular o de los fluidos corporales, para cuantificar
directamente la expresión del producto del gen. Los anticuerpos
útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o ensayos sobre fluidos
de la muestra pueden ser tanto monoclonales como policlonales y
pueden prepararse en cualquier animal. Es conveniente que los
anticuerpos puedan preparase contra la secuencia nativa del
polipéptido PRO o contra un péptido sintético basado en las
secuencias de ADN proporcionadas aquí o contra una secuencia
exógena fusionada al ADN del polipéptido PRO y que codifique por un
epitopo del anticuerpo específico.
Las formas del polipéptido PRO pueden ser
recuperadas del medio de cultivo o de los lisados de las células
huésped. Si están unidos a membrana, pueden liberarse de la membrana
mediante una solución de detergente adecuada (por ejemplo,
Tritón-X 100) o por ruptura enzimática. Las células
empleadas en la expresión del polipéptido PRO pueden romperse a
través de diversos mecanismos físicos o químicos como ciclos de
congelación y descongelación, sonicación, ruptura mecánica o
agentes que lisan las células.
Puede desearse purificar los polipéptido PROs a
partir de proteínas celulares recombinantes o polipéptidos. Los
siguientes métodos son ejemplos de procedimientos de purificación
adecuados: por fraccionamiento o por columna de intercambio iónico;
precipitación con etanol; HPLC de fase reversa; cromatografía sobre
sílice o sobre una resina de intercambio catiónico como DEAE;
cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con
persulfato amónico; filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex
G-75; columnas de proteína A Sepharose para eliminar
contaminantes como IgG; y columnas quelantes de metales para unirse
a las formas epitopo-etiqueta del polipéptido PRO.
Pueden usarse diversos métodos de purificación de proteínas, métodos
conocidos en la técnica y descritos por ejemplo en Deutscher,
Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification:
Principles and Practice, Springer-Verlag, New York
(1982). El/Los paso(s) de purificación dependerán, por
ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción usado y en
particular del polipéptido PRO sintetizado.
Las secuencias de nucleótidos (o sus
complementarias) que codifican para los polipéptidos PRO de la
presente invención tienen diversas aplicaciones en la técnica de la
biología molecular, incluyendo usos como sondas de hibridación, en
mapeo cromosómico y génico y en la generación de ARN antisentido y
ADN. El ácido nucleico que codifica para el polipéptido PRO puede
también ser útil para la preparación de polipéptidos PRO mediante
las técnicas recombinantes descritas aquí.
La secuencia nativa de longitud completa del
ácido nucleico que codifica para el polipéptido PRO o porciones de
la misma, pueden usarse como sondas sobre una biblioteca de ADNc
para aislar el gen del polipéptido PRO completo o para aislar
incluso otros genes (por ejemplo, aquellos que codifican para
variantes naturales del polipéptido PRO o polipéptidos PRO de otras
especies) que tienen una identidad de secuencia con las secuencias
nucléicas del polipéptido PRO. Opcionalmente, la longitud de las
sondas podrá ser de alrededor de 20 a 50 bases. Las sondas de
hibridación pueden derivarse de la secuencia de nucleótidos de
cualquiera de las moléculas de ADN descritas aquí o a partir de
secuencias genómicas incluyendo promotores, elementos
intensificadores e intrones de la secuencia de ADN nativa que
codifica para el polipéptido PRO. A modo de ejemplo, un método de
cribado comprenderá el aislamiento de la región codificante del gen
del polipéptido PRO usando la secuencia de ADN conocida para
sintetizar una sonda seleccionada de unas 40 bases. Las sondas de
hibridación pueden marcarse con diversos marcadores, incluyendo
radionucleótidos como P^{32} o S^{35}, o marcadores enzimáticos
tales como fosfatasa alcalina acoplada con la sonda vía sistemas de
acoplamiento avidina/biotina. Las sondas marcadas que tienen una
secuencia complementaria a la del gen del polipéptido PRO específico
de la presente invención pueden usarse para analizar bibliotecas de
ADNc humano, ADN genómico o ARNm para determinar a qué miembros de
dichas bibliotecas se hibrida la sonda. Las técnicas de hibridación
se describen en más detalle más adelante en la sección de
Ejemplos.
Los ESTs descritos en la aplicación presente
pueden ser usados de forma similar como sondas, utilizando los
métodos descritos aquí.
Las sondas pueden usarse también en técnicas de
PCR para generar un banco de secuencias para la identificación de
secuencias íntimamente relacionadas con el polipéptido PRO.
Las secuencias que codifican para el polipéptido
PRO pueden usarse también para construir sondas de hibridación que
permitan mapear el gen que codifica para ese polipéptido PRO y para
el análisis genético de individuos con desórdenes genéticos. Las
secuencias de nucleótidos proporcionadas aquí pueden ser mapeadas
en un cromosoma y a regiones específicas de un cromosoma usando
técnicas conocidas como la hibridación in situ, el análisis
de ligamiento contra marcadores cromosómicos conocidos, y el
análisis de hibridación con bibliotecas.
Cuando la secuencia codificante para el
polipéptido PRO codifica una proteína que se une a otra proteína,
el polipéptido PRO puede usarse en ensayos para identificar sus
ligandos. De forma similar, se pueden identificar inhibidores de la
unión receptor/ligando. Las proteínas implicadas en dichas
interacciones de unión pueden usarse también para la búsqueda de
péptidos o pequeñas moléculas inhibidoras o agonistas de la
interacción de unión. Los ensayos de cribado pueden usarse para
encontrar compuestos líderes que imitan la actividad biológica del
polipéptido PRO nativo o de un ligando del polipéptido PRO. Dichos
ensayos de cribado incluirán ensayos susceptibles de analizar
bibliotecas químicas a gran escala, haciéndolos particularmente
adecuados para la identificación de pequeñas moléculas candidatas a
fármacos. Las pequeñas moléculas contempladas incluyen compuestos
sintéticos orgánicos o inorgánicos. Los ensayos pueden realizarse en
diversos formatos, incluyendo ensayos de unión
proteína-proteína, ensayos de análisis bioquímico,
inmunoensayos y ensayos basados en células, que están bien
caracterizados en la técnica.
Los ácidos nucleicos que codifican para el
polipéptido PRO o sus formas modificadas pueden usarse también para
generar tanto animales transgénicos como animales "knock out",
los cuales, a su vez, son útiles en el desarrollo y análisis de
reactivos útiles terapéuticamente. Un animal transgénico (por
ejemplo, un ratón o una rata) es un animal que presenta células que
contienen un transgén, el cual se introdujo en el animal o en un
ancestro del animal en un estadio prenatal, por ejemplo, estadio
embrional. Un transgen es un ADN que se ha integrado en el genoma
de una célula a partir de la cual se desarrolla el animal
transgénico. En una realización, el ADNc que codifica para el
polipéptido PRO de interés puede usarse para clonar el ADN genómico
que codifica para el polipéptido PRO según técnicas establecidas y
las secuencias genómicas serán usadas para generar los animales
transgénicos que contienen células que expresan el ADN que codifica
para el polipéptido PRO. Los métodos para generar animales
transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas,
han llegado a ser convencionales dentro dla técnica, por ejemplo en
las patentes americanas U.S. 4.736.866 y 4.870.009. Determinadas
células podrían ser diana para la incorporación del transgen que
codifica para el polipéptido PRO mediante intensificadores
específicos de tejido. Los animales transgénicos que incluyen una
copia del transgen que codifica para el polipéptido PRO, introducido
en la línea germinal del animal en un estadio embrional, pueden
usarse para examinar el efecto del aumento de la expresión del ADN
que codifica para el polipéptido PRO. Dichos animales pueden usarse
como animales de análisis para reactivos que confieran protección
frente, a por ejemplo, condiciones patológicas asociadas con su
sobreexpresión. En concordancia con esta faceta de la invención, un
animal es tratado con el reactivo de forma que una reducción de la
incidencia de la condición patológica, comparado con animales no
tratados que llevan el transgen, indicaría un potencial terapéutico
de la intervención para la condición patológica.
Alternativamente, pueden usarse homólogos
no-humanos de los polipéptidos PRO para construir un
animal "knock out" para el polipéptido PRO el cual presenta un
gen, que codifica para el polipéptido PRO de interés, defectivo o
alterado como resultado de la recombinación homóloga entre el gen
endógeno que codifica para el polipéptido PRO y el ADN genómico
alterado que codifica para el polipéptido PRO introducido en una
célula embrional del animal. Por ejemplo, el ADNc que codifica para
el polipéptido PRO puede usarse para clonar el ADN genómico que
codifica para el polipéptido PRO según técnicas establecidas. Una
parte del ADN genómico que codifica para el polipéptido PRO puede
ser eliminada o reemplazada por otro gen, como por un gen que
codifique para un marcador seleccionable que puede utilizarse para
monitorizar la integración. Habitualmente se incluyen en el vector
varias kilobases de secuencia de ADN flanqueante no modificada
(tanto en el extremo 5' como en el 3') [véase por ejemplo, Thomas
and Capecchi, Cell,51:503 (1987) para la descripción de vectores de
recombinación homóloga]. El vector se introduce en una línea de
célula madre embrional (por ejemplo, por electroporación) y se
seleccionan aquellas células en las que el ADN introducido se ha
recombinado de forma homóloga con el ADN endógeno [véase por
ejemplo, Li et al., Cell, 69:915 (1992)]. Las células
seleccionadas se inyectan en un blastocito del animal (por ejemplo,
un ratón o una rata) para formar quimeras de agregación [véase por
ejemplo, Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A
practical Approach, E.J. Robertson,ed (IRL, Oxford, 1987), pp.
113-152]. Un embrión quimérico puede entonces
implantarse en un animal adoptivo que sea una hembra pseudopreñada
adecuada y el embrión se llevará a término para generar el animal
"knock out". La progenie que porta el ADN recombinado de forma
homóloga en sus células germinales puede identificarse mediante
técnicas estándar y puede usarse para cruzarse con animales en los
que todas las células del animal contienen el ADN recombinado de
forma homóloga. Los animales knockout pueden ser caracterizados por
ejemplo, para su capacidad para defenderse de ciertas condiciones
patológicas y para el desarrollo de condiciones patológicas debido
a la ausencia del polipéptido PRO.
Cuando se emplea la administración in
vivo de un polipéptido PRO, las dosis normales pueden variar
entre 10 ng/kg y 100 mg/kg de peso corporal de un mamífero o más por
día, preferentemente de 1 \mug/kg/día a 10 mg/kg/día, dependiendo
de la vía de administración. En la literatura se provee de una guía
sobre dosis particulares y métodos de administración; véase, por
ejemplo, las patentes americanas U.S. 4.657.760; 5.206.344; ó
5.225.212. Es de esperar, que diferentes formulaciones serán
efectivas para diferentes compuestos de tratamiento y diferentes
desórdenes, que la administración que tiene como objetivo un órgano
o tejido, por ejemplo, puede necesitar ser administrada de manera
diferente a la de otro órgano o tejido.
Donde se desee la administración sostenida de un
polipéptido PRO en una formulación con características de
liberación adecuadas para el tratamiento de cualquier enfermedad o
desorden que requiere la administración del polipéptido PRO, se
puede contemplar la microencapsulación del polipéptido PRO. La
microencapsulación de proteínas recombinantes para liberación
sostenida se ha realizado con éxito con la hormona del crecimiento
humana (rhGH, el interferón-(rhIFN-), la
interleucina-2 y MN rgp120. Johnson et al.,
Nat. Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed.
Ther., 27: 1221-1223(1993); Hora et
al., Bio/Technology, 8:755-758 (1990); Cleland,
"Desing and Production of single Inmunization Vaccines Using
Polylactide Plyglycolide Microsphere Systems". en Vaccine
Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell y Newman, eds,
(Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462; las
patentes internacionales WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399, y
patente americana U.S. 5,654.010.
Las formulaciones de liberación sostenida de
estas proteínas se desarrollaron usando el polímero de ácido
poli-láctico-coglicólico (PLGA)
debido a su biocompatibilidad y al rango amplio de propiedades
biodegradables. Los productos de degradación del PLGA, los ácidos
láctico y glicólico, pueden ser rápidamente aclarados del cuerpo
humano. Además la degradabilidad de este polímero puede ajustarse
desde meses hasta años dependiendo de su peso molecular y su
composición. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from
lactide/glycolide polymer", en: M. Chasin
y R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990, pp. 1-41.
y R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990, pp. 1-41.
Por ejemplo, para una formulación que pueda
proveer una dosis de aproximadamente 80 g/kg/día en mamíferos con
un peso corporal máximo de 85 kg, la mayor dosis sería
aproximadamente de 6,8 mg del polipéptido PRO por día. Para
conseguir este nivel de dosis, se necesita una formulación de
liberación sostenida que contenga un máximo posible de carga de
proteína (15-20% peso/peso de polipéptido PRO) con
la menor liberación inicial posible (<20%). También es deseable
una liberación continuada (orden cero) del polipéptido PRO a partir
de micropartículas durante 1-2 semanas. Además la
proteína encapsulada que va a ser liberada debe mantener su
integridad y estabilidad durante todo el período de liberación
deseado.
Los polipéptidos PRO351 de la presente invención
que poseen actividad biológica relacionada con la de la proteína
prostasina se pueden utilizar tanto in vivo para fines
terapéuticos como in vitro. Los expertos en la materia
sabrán cómo utilizar los polipéptidos PRO351 de la presente
invención para tales fines.
Los compuestos de la presente invención pueden
ser formulados de acuerdo con métodos conocidos para preparar
composiciones farmacéuticamente útiles, a través de las cuales el
polipéptido PRO se combina en adición con un vehículo
farmacéuticamente aceptable. Se describen vehículos adecuados y sus
formulaciones, inclusive de otras proteínas humanas, por ejemplo,
albúmina sérica humana en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical
Sciences, 16th ed., 1980 Mack Publishing Co., editada por Oslo et
al., la descripción de la cual se incorpora aquí por
referencia.
Las dosis y concentraciones deseadas de fármaco
de las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden
variar dependiendo del uso particular pensado. Por ejemplo, en el
tratamiento de la trombosis venosa profunda o de la enfermedad
vascular periférica, se prefieren habitualmente dosis en bolo con
administraciones subsecuentes con el
objetivo de mantener un nivel sanguíneo aproximadamente constante, preferentemente en el orden de unos 3 \mug/ml.
objetivo de mantener un nivel sanguíneo aproximadamente constante, preferentemente en el orden de unos 3 \mug/ml.
Sin embargo, para usarse en conexión con las
instalaciones de asistencia médica de emergencia en donde la
capacidad de infusión generalmente no está disponible y debido a la
naturaleza generalmente crítica de la enfermedad subyacente (por
ejemplo, embolismo, infarto), generalmente será deseable
proporcionar unas dosis iniciales mayores, tales como un bolo
intravenoso.
La presente invención proporciona además
anticuerpos anti-polipéptido PRO. Se incluyen
ejemplos de anticuerpos que incluyen anticuerpos policlonales,
monoclonales, humanizados, bioespecíficos, y heteroconjugados.
Los anticuerpos anti-polipéptido
PRO puede comprender anticuerpos policlonales. El personal experto
en la materia conoce métodos para la preparación de anticuerpos
policlonales. Los anticuerpos policlonales pueden desarrollarse en
un mamífero, por ejemplo, mediante la administración de una o más
inyecciones de un agente inmunizante, y si se desea un adyuvante.
Habitualmente, el agente inmunizante y/o el adyuvante se inyectarán
en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o
intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir al
polipéptido PRO o a una proteína suya de fusión. Puede ser útil
conjugar el agente inmunizante con una proteína que se conozca como
inmunogénica en el mamífero que va a ser inmunizado. Entre los
ejemplos de dichas proteínas inmunogénicas se incluyen, aunque no
están limitados a ellos, la hemocianina de lapa, la albúmina
sérica, la tiroglobulina bovina y el inhibidor de la tripsina de
soja. Entre los ejemplos de adyuvantes que pueden ser utilizados se
incluyen el adyuvante completo de Freund y el adyuvante
MPL-TDM (monofosforil lípido A, trehalosa sintética
dicorinomicolato). El protocolo de inmunización puede ser
seleccionado por los expertos en la materia sin demasiada
experimentación.
Los anticuerpos anti-polipéptido
PRO pueden ser alternativamente anticuerpos monoclonales. Los
anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando los métodos de
hibridoma, tales como aquellos descritos por Kohler y Milstein,
Nature,256:495 (1975). En un método de hibridoma, un ratón, un
hámster u otro animal huésped adecuado, se inmuniza habitualmente
con un agente inmunizante para obtener linfocitos que produzcan o
sean capaces de producir anticuerpos que se unan específicamente al
agente inmunizante. De manera alternativa, los linfocitos pueden
ser inmunizados in vitro.
Habitualmente, el agente inmunizante incluirá el
polipéptido PRO de interés o una proteína de fusión del mismo.
Generalmente, se usan o bien linfocitos de sangre periférica
("PBLs") si se desean células de origen humano, o células de
bazo o células de nódulos linfáticos si se desean fuentes de
mamíferos no humanos. Los linfocitos entonces se fusionan con una
línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado,
como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma [Goding,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press,
(1986) pp. 59-103]. Habitualmente las líneas
celulares inmortalizadas son células de mamífero transformadas,
particularmente células de mieloma de roedores, de origen bovino y
de origen humano. Habitualmente se usan líneas celulares de mieloma
de rata o ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en
medios de cultivo adecuados que preferentemente contienen una o más
sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las
células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si a las células
parentales les falta el enzima hipoxantina guanina fosforibosil
transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo de los hibridomas
incluirá habitualmente hipoxantina, aminopterina, y timidina
("medio HAT"), substancias que impiden el crecimiento de
células deficientes en HGPRT.
Las líneas celulares inmortalizadas preferidas
son aquellas que se fusionan eficientemente, que sostienen niveles
estables elevados de expresión del anticuerpo por las células
seleccionadas productoras de anticuerpo, y que son sensibles a
medios tales como el medio HAT. Las líneas de mieloma murino se
encuentran entre las células inmortalizadas más preferidas, las
cuales pueden obtenerse, por ejemplo, del Salk Institute Cell
Distribution Center, San Diego, California y de la American Type
Culture Collection, Rockville, Maryland. También se han descrito
para la producción de anticuerpos monoclonales humanos las líneas
celulares de mieloma humano y de heteromieloma
ratón-humano [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984);
Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques
and Applications, Marcel Dekker, Inc, New York, (1987) pp.
51-63].
El medio de cultivo en el que se cultivan las
células de hibridoma puede ser analizado para determinar la
presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el
polipéptido PRO de interés. Preferentemente, la especificidad de
unión de anticuerpos monoclonales producidos por las células de
hibridoma se determina por inmunoprecipitación o mediante un ensayo
de unión in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RIA) o un
ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas (ELISA). Dichas técnicas y
ensayos son conocidas en la técnica. La afinidad de unión del
anticuerpo monoclonal puede ser determinada, por ejemplo, mediante
el análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem.,
107:220 (1980).
Después de que las células de hibridoma deseadas
hayan sido identificadas, los clones pueden subclonarse mediante
procedimientos de dilución limitante y crecimiento según métodos
estándar [Goding, supra]. El medio adecuado para este
propósito incluye, por ejemplo, medios como el Dulbecco's Modified
Eagle's Medium y el RPMI-1640. Alternativamente,
las células de hibridoma pueden crecer in vivo como ascitas
en un mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones pueden ser aislados o purificados a partir del medio de
cultivo o del fluido de los ascitas mediante procedimientos
convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como,
proteína-A-Sepharose, cromatografía
en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía
de afinidad.
Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse
también mediante métodos de ADN recombinante, tales como los
descritos en la patente americana U.S. 4.816.567. El ADN que
codifica para los anticuerpos monoclonales de la invención puede
aislarse fácilmente y secuenciarse usando procedimientos
convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que
son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican para
las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos). Las
células de hibridoma de la invención sirven como fuente preferente
de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede incorporarse en vectores
de expresión, los cuales son entonces transfectados en células
huésped como las células de simio COS, las células de ovario de
hámster chino (CHO), o células de mieloma que de lo contrario no
producirían la proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis
de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El
ADN puede modificarse también, por ejemplo, substituyendo la
secuencia codificante para los dominios constantes humanos de las
cadenas pesada y ligera en lugar de las secuencias murinas
homólogas [patente americana U.S. 4.816.567; Morrison et al.,
supra] o por la unión covalente de toda o parte de la
secuencia codificante para un polipéptido no inmunoglobulina a la
secuencia codificante para la inmunoglobulina. Dicho polipéptido no
inmunoglobulina puede sustituirse por los dominios constantes de un
anticuerpo de la invención, o puede ser sustituido por los dominios
variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo
de la invención para crear un anticuerpo quimérico bivalente.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos
monovalentes. Los métodos para preparar anticuerpos monovalentes
son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un método implica la
expresión recombinante de una cadena ligera de la inmunoglobulina y
una cadena pesada modificada. La cadena pesada se trunca
generalmente en cualquier punto de la región Fc para prevenir la
unión de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos de
cisteína relevantes se sustituyen por otro residuo aminoacídico o
se eliminan para prevenir la unión.
También son adecuados métodos in vitro
para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de los
anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente
fragmentos Fab, puede conseguirse usando técnicas de rutina
conocidas en la técnica.
Los anticuerpos anti-polipéptido
PRO de la invención pueden además comprender anticuerpos humanizados
o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos
no-humanos (por ejemplo, murinos) son
inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o sus
fragmentos (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab)_{2} u
otras subsecuencias de anticuerpos de unión a antígeno) que
contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no
humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas
humanas (anticuerpo receptor) en las cuales se substituyen residuos
de una región determinante complementaria (CDR) del receptor por
residuos de un CDR de especies no humanas (anticuerpo donador) como
ratón, rata o conejo que tengan la especificidad, afinidad y
capacidad deseadas. En algunos casos, se reemplazan residuos de la
región de entrecruzamiento Fv de la inmunoglobulina humana por los
residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados
pueden comprender también residuos que no se encuentran ni en el
anticuerpo receptor ni en el CDR importado o en secuencias de la
región de entrecruzamiento. En general el anticuerpo humanizado
comprenderá substancialmente todos o al menos un, y habitualmente
dos, dominios variables, en el cual todas o substancialmente todas
las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no
humana y todas o substancialmente todas las regiones FR son las de
una secuencia de consenso de una inmunoglobulina humana. El
anticuerpo humanizado, óptimamente también comprenderá al menos una
parte de una región constante de una inmunoglobulina (Fc),
habitualmente aquella de una inmunoglobulina humana [Jones et
al., Nature,321: 522-525 (1986); Riechmann et
al., Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta,
Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)].
Se conocen bien en la técncia métodos para
humanizar anticuerpos no humanos. Generalmente, un anticuerpo
humanizado tiene un o más residuos de aminoácidos introducidos en él
a partir de una fuente que no es humana. Estos residuos de
aminoácidos no-humanos se denominan con frecuencia
como residuos "de importación", los cuales habitualmente son
tomados de un dominio variable "de importación". La
humanización puede ser realizada esencialmente siguiendo el método
de Winter y colaboradores [Jones et al., Nature,
321:522-525 (1986); Riechmann et al.,
Nature,332:323-327 (1988); Verhoeyen et al.,
Science, 239: 1534-1536 (1988)], substituyendo CDRs
de roedor o secuencias CDR por las secuencias correspondientes a un
anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos
"humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente americana
U.S. 4.816.567), en donde substancialmente menos de un dominio
variable humano intacto ha sido substituido por la secuencia
correspondiente de una especie no-humana. En la
práctica los anticuerpos humanizados son habitualmente anticuerpos
humanos en los que algunos residuos CDR y posiblemente algunos
residuos FR se substituyen por residuos de sitios análogos en
anticuerpos de roedores.
Los anticuerpos humanos pueden producirse
también usando diversas técnicas conocidas en la técnica,
incluyendo bibliotecas de expresión en fagos [Hoogenboom y Winter,
J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol.,
222:581 (1991)]. Las técnicas de Cole et al. y Boerner et
al. están también disponibles para la preparación de
anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985) y Boerner
et al., J Inmunol., 147(1):86-95
(1991)].
Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos
monoclonales, preferentemente humanos o humanizados que tienen
especificidad de unión para al menos dos antígenos diferentes. En el
caso presente, una de las especificidades de unión es por el
polipéptido PRO, y la otra es por cualquier otro antígeno,
preferentemente por una proteína de superficie celular o un
receptor o una subunidad de receptor.
Los métodos para hacer anticuerpos biespecíficos
son conocidos en la técnica. Tradicionalmente, la producción
recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la
co-expresión de 2 parejas de inmunoglobulina de
cadena pesada/cadena ligera, en donde las dos cadenas pesadas tienen
especificidades diferentes [Milstein y Cuello, Nature,
305:537-539 (1983)]. Debido a la aleatoria variedad
de cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas, estos
hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez
moléculas de anticuerpo diferentes, de los cuales sólo una tiene la
estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula
correcta habitualmente se consigue mediante etapas de cromatografía
de afinidad. Se describen procedimientos similares en la patente
internacional WO 93/08829 publicada el 13 de Mayo de 1993 y en
Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659
(1991).
Se pueden fusionar dominios variables de
anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de
combinación antígeno-anticuerpo) con secuencias de
dominios constantes de inmunoglobulinas. La fusión preferentemente
se produce con un dominio constante de cadena pesada de
inmunoglobulina, que comprende al menos parte de la bisagra, y las
regiones CH_{2} y CH_{3}. Se prefiere que la primera región
constante de cadena pesada (CH1) contenga el sitio necesario para
la unión de la cadena ligera presente en al menos una de las
fusiones. Los ADNs que codifican para las fusiones de cadena pesada
de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de la
inmunoglobulina se insertan en vectores de expresión separados, y
son co-transfectados en un organismo huésped
adecuado. Para más detalles sobre la generación de anticuerpos
biespecíficos, véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in
Enzymology, 121: 210 (1986).
Los anticuerpos heteroconjugados están también
dentro del ámbito de la presente invención. Los anticuerpos
heteroconjugados se componen de dos anticuerpos unidos
covalentemente. Tales anticuerpos, por ejemplo, han sido propuestos
para dirigir células del sistema inmune hacia células no deseadas
[patente americana U.S. 4.676.980], y para el tratamiento de la
infección por VIH [patentes internacionales WO 91/00360; WO
92/2000373; patente europea EP 03089]. Se contempla que los
anticuerpos puedan prepararse in vitro usando métodos
conocidos en la química sintética de proteínas, incluyendo aquellos
que implican agentes de unión. Por ejemplo, las inmunotoxinas
pueden construirse usando una reacción de intercambio de disulfuro o
formando un enlace tioéter. Entre los ejemplos de reactivos
adecuados para este propósito se incluyen el iminotiolato y el
metil-4-mercaptobutirimidato y
aquellos descritos, por ejemplo en la patente americana U.S.
4.676.980.
Los anticuerpos anti-polipéptido
PRO de la invención tienen diversas utilidades. Por ejemplo, los
anticuerpos anti-polipéptido PRO pueden usarse en
ensayos de diagnóstico para un polipéptido PRO, por ejemplo,
detectando su expresión en células, tejidos o sueros específicos.
Pueden usarse diversas técnicas de diagnóstico conocidas en la
técnica, tales como los ensayos de unión competitiva, ensayos de
sándwich directos o indirectos y ensayos de inmunoprecipitación
realizados tanto en fases heterogéneas como homogéneas [Zola,
Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc.
(1987) pp. 147-158]. Los anticuerpos usados en los
ensayos de diagnóstico pueden marcarse con una fracción detectable.
La fracción detectable debería ser capaz de producir, directa o
indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la fracción
detectable puede ser un radioisótopo, como H^{3}, C^{14},
P^{32}, S^{35}, o I^{125}, un compuesto fluorescente o
quimioluminiscente, como el isotiocianato de fluoresceína, la
rodamina o la luciferina, o bien un enzima como la fosfatasa
alcalina, la beta-galactosidasa o la peroxidasa de
rábano. Puede emplearse cualquier método conocido en la técnica para
conjugar el anticuerpo con la fracción detectable, incluyendo
aquellos métodos descritos por Hunter et al., Nature, 144:
945 (1962); David et al., Biochemistry,13: 1014 (1974); Pain
et al., J. Immunol. Meth., 40: 219 (1981); y Nygren, J.
Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982).
Los anticuerpos anti-polipéptido
PRO pueden ser útiles también para la purificación por afinidad del
polipéptido PRO a partir de cultivos celulares recombinantes o
fuentes naturales. En este proceso, los anticuerpos
anti-polipéptido PRO están inmovilizados sobre un
soporte adecuado, como Sephadex o papel de filtro, usando métodos
bien conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado se pone
entonces en contacto con una muestra que contenga el polipéptido
PRO a purificar, y a partir de entonces se lava el soporte con un
solvente adecuado que eliminará substancialmente todo el material
en la muestra excepto el polipéptido PRO, el cuál está unido al
anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro
solvente apropiado que liberará el polipéptido PRO del
anticuerpo.
Se ofrecen los siguientes ejemplos con
propósitos únicamente ilustrativos, y no se pretende de ningún modo
limitar el ámbito de la presente invención.
Los reactivos disponibles comercialmente
nombrados en los ejemplos se usan según las instrucciones del
fabricante a menos que se indique lo contrario. La fuente de las
células identificadas en los siguientes ejemplos, y a lo largo de
toda la especificación, por número de acceso ATCC es la American
Type Culture Collection, Rockville, Maryland.
Las secuencias del dominio extracelular (ECD)
(incluidas las secuencias correspondientes al péptido señal de
secreción, si existía) de alrededor de 950 proteínas conocidas
secretadas procedentes del banco de datos público
Swiss-Prot se utilizaron para la búsqueda de bancos
de datos EST. Los bancos de datos EST, incluyeron los bancos de
datos públicos (por ejemplo, Dayhoff, GenBank), y bancos de datos en
propiedad (por ejemplo, LIFESEC^{TM}, Incyte Pharmaceuticals,
Palo Alto, CA). La búsqueda se realizó mediante el programa
informático BLAST o BLAST2 (Altxchul y Gish, Methods in Enzymology
266: 460-480 (1996)) comparando las secuencias de
proteína ECD con secuencias EST en 6 pautas de traducción. Estas
comparaciones con una puntuación en el Blast de 70 (o en algunos
casos 90) o mayor, que no codificaban para proteínas conocidas, se
agruparon y combinaron en secuencias de ADN consenso con el
programa "phrap" (Phil Gree, University of Washington, Seattle,
WA;
(http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/phrap.
html).
html).
Mediante esta búsqueda por homología del dominio
extracelular, se ensamblaron secuencias consenso de ADN en relación
a otras secuencias EST identificadas mediante Phrap. Además, las
secuencias de ADN consenso obtenidas, fueron a menudo (pero no
siempre) ampliadas con ciclos repetidos de BLAST y phrap para
aumentar la secuencia consenso tanto como era posible en las
fuentes de secuencias EST descritas más arriba.
En base a las secuencias consenso obtenidas tal
como se ha descrito, se sintetizaron oligonucleótidos y se
utilizaron por PCR para la identificación de una biblioteca de ADNc
que contenía la secuencia de interés y como sondas para el
aislamiento de un clon con la secuencia codificante de longitud
completa de un polipéptido PRO. Los cebadores para la PCR, sentido
de la traducción (.f) y antisentido (.r), por lo general de 20 a 30
nucleótidos, se diseñaron frecuentemente para generar un producto de
PCR con un tamaño de 100-1000 bp. La secuencia
consenso es mayor que 1-1,5 kbp. Con el fin de
cribar algunas bibliotecas para un clon de secuencia de longitud
completa, el ADN de las bibliotecas se sometió a amplificación por
PCR, tal como Ausubel et al., en Current Protocols in
Molecular Biology, con el par de cebadores de PCR. Una biblioteca
positiva se utilizó a continuación para el aislamiento de clones
codificantes para el gen de interés mediante un oligonucleótido
sonda y uno de los pares de cebadores.
Las bibliotecas de ADNc utilizadas para el
aislamiento de clones de ADNc se construyeron mediante métodos
estándares con reactivos disponibles comercialmente como los que
facilita la firma Invitrogen, San Diego, CA. El ADNc se cebó con un
oligo dT que contenía una diana NotI, unida con adaptadores romos
SalI tratados con quinasas, se digirió con NotI, se separó por
tamaño en electroforesis en gel y se clonó en una orientación
determinada en un vector de clonado adecuado (como por ejemplo pRKB
o pRKD; pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene lugares
Sfil; Holmes et al., Science, 253: 1278-1280
(1991)) en las dianas únicas XhoI y NotI.
El ARNm se aisló de un tejido humano de interés
mediante los reactivos y protocolos de Invitrogen, San Diego, CA
(Fast Track 2). Este ARN se utilizó para generar una biblioteca de
ADNc oligodT en el vector pRK5D con los reactivos y protocolos de
Life Technologies, Gathersburg, MD (Super Script Plasmid System).
En este procedimiento, el ADNc de doble cadena mayor de 1000 bp, se
separó por tamaño y el que estaba unido a SalI/NotI se clonó en un
vector digerido con XhoI/NotI. pRK5D es un vector de clonación que
tienen un lugar de inicio de la transcripción sp6 seguido por una
diana de restricción SfiI precedido de las dianas de clonación
XhoI/NotI.
Una biblioteca de ADNc secundaria se generó para
representar de manera preferencial los extremos 5' de los clones de
ADNc. El ARN Sp6 se generó de una biblioteca primaria (descrita más
arriba) y ese ARN se utilizó para generar una biblioteca de ADNc
cebada aleatoriamente en el vector pSST-AMY.0 con
los reactivos y protocolos de Life Technologies (Super Script
Plasmid System, a los que se ha hecho referencia más arriba). En
este procedimiento, el ADNc de doble cadena se separó por tamaño de
500-1000 bp., se unió a adaptadores romos NotI, con
SfiI y se clonó en un vector digerido por SfiI/NotI.
pSST-AMY.0 es un vector de clonación que tienen el
promotor de la alcohol deshidrogenasa de levadura precedido por
dianas de clonación de ADNc y la secuencia de la amilasa de ratón
(la secuencia madura sin la señal de secreción) seguida por el
terminador de la alcohol deshidrogenasa de levadura después de las
dianas de clonación. Por tanto los ADNcs clonados en ese vector,
fusionados en la misma pauta de lectura con la secuencia de la
amilasa, permitirán la secreción de la amilasa de las colonias de
levaduras convenientemente transfectadas.
El ADN de la biblioteca descrito en el párrafo 2
más arriba, se enfrió en hielo y se añadieron bacterias
electrocompetentes DH10B (Life Technologies, 20 ml). La bacteria y
la mezcla del vector se electroporaron según recomendaciones del
fabricante). A continuación, se añadió medio SOC (Life Technologies,
1 ml) y la mezcla se incubó a 37ºC durante 30 min. Los
transformantes se plaquearon en 20 placas de LB estándares de 150
mm, que contenían ampicilina y se incubaron durante 16 horas (37ºC).
Se aislaron las colonias positivas y se aisló el ADN de los clones
del bacteriano con protocolos estándares, por ejemplo, gradiente de
CsCl. A continuación, el ADN purificado continuó según los
protocolos de levadura que siguen.
Los métodos de levadura se separaron en tres
categorías: (1) Transformación de levadura con el plásmido
combinado con el vector de ADNc, (2) Detección y aislamiento de
clones de levadura que secretaban amilasa; (3) amplificación por
PCR del inserto directamente de la colonia de levadura y
purificación del ADN para secuenciación y análisis posteriores.
La cepa de levadura utilizada fue
HD56-5ª (ATCC-90785). Esta cepa
tiene el fenotipo siguiente: MAT alfa, ura3-52,
leu2-3, leu2-112,
his3-11, his3-15, MAL^{+},
SUC^{+}, GAL^{+}. Se suelen emplear de manera preferente,
mutantes de levadura que tienen mecanismos
post-traduccionales deficientes. Estos mutantes
pueden tener alelos deficientes translocados sec71, sec72, sec62,
siendo el sec71 truncado el más preferente. De forma alternativa,
los antagonistas (incluyendo nucleótidos antisentido y/o ligandos)
que interfieren con la acción normal de estos genes, otras
proteínas implicadas en el mecanismo
post-traduccional (por ejemplo, SEC61p, SEC72p,
SEC62p, SEC63p, TDJ1p o SSA1p-4p) o la formación de
complejos de esas proteínas pueden emplearse en combinación con la
levadura que expresa la amilasa.
La transformación se realizó en base al
protocolo descrito por Gietz et al., Nucl. Acid. Res.,
20:1425 (1992). Las células transformadas se inocularon del agar a
un medio complejo de caldo YEPD (100 ml) y se crecieron toda la
noche a 30ºC. El caldo de YEPD se preparó tal como está descrito en
Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor
Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 207 (1994). El cultivo de toda la
noche se diluyó hasta 2 x 10^{6} células/ml (aproximadamente
OD_{600}=0,1) en caldo de YEPD (500 ml) y se dejó crecer hasta 1
X 10^{7} células/ml (aproximadamente
OD_{600}=0,4-0,5).
Las células se recogieron y prepararon para la
transformación transfiriéndolas a botellas para el rotor GS3 y se
centrifugaron en el rotor GS3 durante 5 min a 5000 rpm, el
sobrenadante se descartó y a continuación el precipitado se
resuspendió en agua estéril, y se centrifugó otra vez en tubos
falcon de 50 ml a 3500 rpm en una centrífuga Beckman
GS-6KR. El sobrenadante se descartó y las células se
lavaron posteriormente con LiAc/TE (10 ml, 10 mM
Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5, 100 mM
Li_{2}OOCCH_{3}), y se resuspendieron en LiAc/TE (2,5 ml).
La transformación se realizó por la mezcla en
tubos de microcentrífuga de las células preparadas (100 \mul),
con ADN de esperma de salmón de cadena sencilla desnaturalizado
recientemente (Lofstrand Labs, Gaithersburg, MD)y el ADN
transformante (1 \mug, vol < 10 \mul). Las mezcla se mezcló
brevemente mediante agitación vigorosa y se añadió a continuación,
PEG/TE al 40% (600 ml, 40%
polietilen-glicol-4000, 10 mM
Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM Li_{2}OOCCH_{3}, pH
7,5). La mezcla se agitó cuidadosamente en un vaso de reacción
centrifugado en una microfuga a 12000 rpm durante
5-10 segundos, se decantó y resuspendió en TE (500
\mul, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) seguido
por centrifugación. Las células se diluyeron en TE (1 ml) y las
alícuotas (200 \mul) se propagaron en un medio selectivo
previamente preparado en placas de 150 mm (VWR).
De forma alternativa, a pesar de las múltiples
pequeñas reacciones, la transformación se realizó como una reacción
simple a gran escala en la que las cantidades de reactivos se
añadieron proporcionalmente.
El medio selectivo utilizado fue un agar de
dextrosa completamente sintético sin uracilo
(SCD-Ura) preparado como se ha descrito en Kaiser
et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press,
Cold Spring Harbor, NY, p. 208-210 (1994). Los
transformantes se crecieron a 30ºC durante 2-3
días.
La detección de las colonias que secretaban
amilasa se realizó por inclusión de almidón rojo en el medio
selectivo de crecimiento. El almidón se combinó con el colorante
rojo (Reactive Red-120, Sigma) como en el
procedimiento descrito por Biely et al., Anal. Biochem. 172:
176-179 (1988). El almidón combinado se incorporó a
las placas de agar SCD-Ura a una concentración final
de 0,15% (p/v) y se tamponó con fosfato de potasio hasta un pH de
7,0 (50-100 mM de concentración final).
Las colonias positivas se picaron y se sembraron
en un medio selectivo fresco (en placas de 150 mm) con el fin de
obtener colonias aisladas identificables. Las colonias sencillas
aisladas positivas para la secreción de la amilasa se detectaron
por incorporación directa de almidón rojo en el agar
SCD-Ura tamponado. Las colonias positivas se
determinaron mediante su capacidad para romper el almidón resultando
en un halo claro rodeando las colonias positivas observadas.
Cuando se aislaba una colonia positiva, se
recogía una pequeña parte con un asa de siembra y se diluía en agua
estéril (30 \mul) en una placa de 96 pocillos. Las colonias
positivas, en ese punto, se congelaban y guardaban para un análisis
posterior o se amplificaban inmediatamente. Una alícuota de células
(5 \mul) se utilizó como plantilla para la reacción de PCR en un
volumen de 25 \mul que contenía 0.5 \mul Klentaq (Clontech,
Palo Alto, CA); 4,0 \mul 10 mM dNTPs (Perkin
Elmer-Cetus); 2,5 \mul tampón Kentaq (Clontech);
0,25 \mul oligo de sentido 5' 1; 0,25 \mul oligo
anti-sentido 2; 12,5 \mul agua destilada.
La secuencia del oligonucleótido directo 1
fue:
- 5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT-3'
- (SEC ID. NO:6)
La secuencia del oligonucleótido inverso 2
fue:
- 5'-CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT-3'
- (SEC ID. NO:7)
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación, la PCR se realizó como
sigue:
Las regiones subrayadas de los oligonucleótidos
anillaron con las regiones promotoras de ADH y de la amilasa,
respectivamente, y amplificaron una región de 307 bp del vector
pSST-AMY.0 cuando el inserto no estaba presente. De
forma frecuente, los primeros 18 nucleótidos del extremo 5'-
terminal de esos oligonucleótidos, contenía lugares de hibridación
para los cebadores de secuenciación. Por tanto, el producto de la
reacción de PCR de un vector vacío fue de 343 bp. Sin embargo, la
secuencia señal fusionada con el ADNc resultó en secuencias largas
de nucleótidos.
A continuación de la PCR, una alícuota de la
reacción (5 \mul) se examinó por electroforesis en gel de agarosa
al 1% en tampón Tris-Borato-EDTA
(TBE) tal como se describió en Sambrook et al., supra.
Los clones resultantes, en un único producto de PCR mayor que 400
bp, se analizaron por secuenciación después de la purificación con
un equipo de columnas 96 Qiaquick PCR (Qiagen Inc., Chatsworth.
CA).
Se obtuvo una secuencia de consenso en relación
a una variedad de secuencias EST tal como se ha descrito en el
Ejemplo 1 anterior, donde la secuencia de consenso obtenida se
designa en la presente invención como DNA35950. En base a la
secuencia de consenso DNA35950, se sintetizaron los
oligonucleótidos: 1) para identificar mediante PCR una biblioteca
de ADNc que contenía la secuencia de interés, y 2) para usar como
sondas para el aislamiento de un clon de la secuencia codificante
de longitud completa para PRO351.
Se sintetizaron los cebadores de PCR directo e
inverso:
Cebador PCR directo | 5'-CCTGTGCTGTGCCTCGAGCCTGAC-3' | (SEC. ID NO: 3) |
Cebador PCR INVERSO | 5'-GTGGGCAGCAGTTAGCACCGCCTC-3' | (SEC. ID NO: 4) |
De forma adicional, se construyó una sonda de
hibridación de oligonucleótido sintético a partir de la secuencia
de consenso DNA35950 que tenía la siguiente secuencia de
nucleótidos
Sonda de hibridación
5'-GGCTGGCATCATCAGCTTTGCATCAAGCTGTGCCCAGGAGGACGC-3' | (SEC ID. NO:5) |
Con el fin de cribar algunas bibliotecas como
fuente de clones de longitud completa, se cribó el ADN de las
bibliotecas mediante amplificación por PCR con una de las parejas de
cebadores de PCR identificadas anteriormente. A continuación, se
utilizó una biblioteca positiva para el aislamiento de clones que
codifican el gen de PRO351 utilizando el oligonucleótido como sonda
y uno de los cebadores de PCR. El ARN para la construcción de las
bibliotecas de ADNc se aisló de tejido humano fetal de hígado
(LIB230).
La secuenciación del ADN de los clones aislados
tal como se ha descrito anteriormente produjo la secuencia de ADN
de longitud completa para PRO351 [designado en la presente invención
como UNQ308 (DNA40571-1315)] (SEC ID NO: 1) y la
secuencia derivada de la proteína para PRO351.
La secuencia de nucleótidos completa de UNQ308
(DNA 40571-1315) se muestra en la Figura 1 (SEC ID
NO.1). El clon UNQ308 (DNA40571-1315) contiene dos
marcos de lectura abiertos con un lugar de inicio de la traducción
aparente en las posiciones de nucleótidos 189-191 y
un segundo marco de lectura abierto que empieza en el nucleótido
470, acabando los dos marcos de lectura abiertos en los codones de
parada en las posiciones de nucleótidos 363-365 y
2009-2011, respectivamente (figura 1). El precursor
polipeptídico previsto es de 571 aminoácidos de largo (Figura 2).
Las regiones importantes de la secuencia de aminoácidos de PRO351
incluyen el péptido señal, regiones que tienen similitud de
secuencia con serina proteasas de la familia de la tripsina, dos
sitios de N-glicosilación y tres dominios Kringle.
El clon UNQ308 (DNA40571-1315) se ha depositado en
la ATCC y se le asignó un número de depósito ATCC no. 209784.
El procedimiento siguiente describe el uso de
secuencias de nucleótidos codificantes para polipéptidos PRO como
sondas de hibridación.
El ADN que comprende la secuencia codificante
para el polipéptido PRO de interés tal como se ha descrito, puede
emplearse como sonda o como material de base para la preparación de
sondas que permitan la búsqueda de ADNs homólogos (como los que
codifican para variantes del polipéptido PRO presentes en la
población natural) en bibliotecas de ADNc de tejido humano o de
bibliotecas genómicas de tejido humano.
La hibridación y el lavado de los filtros que
contienen la biblioteca de ADNs se realizó bajo condiciones de alta
astringencia tal como se detalla a continuación. Una sonda marcada,
derivada del ácido nucleico codificante para el polipéptido PRO, se
hibrida con un filtro en formamida al 50%, SSX 5X, SDS 0,1%, 0,1%
pirofosfato sódico, fosfato sódico 50 mM, pH 6,8, solución de
Denhardts 2X, y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC durante 20 horas.
El lavado de los filtros se realiza en una solución acuosa de SSC
0,1 X y SDS 0,1% a 42ºC.
Los ADNs que tienen una identidad de secuencia
deseada con la secuencia nativa codificante para el polipéptido
PRO, puede a continuación ser identificada con técnicas estándares
conocidas en la técnica.
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
no glicosilada de un polipéptido PRO deseado por expresión
recombinante en E. coli.
La secuencia de ADN codificante para el
polipéptido PRO deseado se amplifica inicialmente con los cebadores
de PCR seleccionados. Los cebadores deben contener lugares de
restricción para enzimas que corresponden con los lugares de
restricción presentes en el vector de expresión seleccionado. Pueden
emplearse una variedad de vectores de expresión. Un ejemplo es el
vector disponible pBR322 (derivado de E. coli; véase Bolivar
et al., Gene, 2:95 (1977)), que contiene genes
para la resistencia a la ampicilina y la tetraciclina. Este vector,
se digiere con enzimas de restricción y se desfosforila. Las
secuencias de PCR amplificadas se ligan al vector. El vector
preferentemente incluye secuencias que codifican para un gen de
resistencia a los antibióticos, un promotor trp, un segmentos
poli-His (incluyendo los primeros seis codones STII,
secuencia poli-His, y lugares de digestión por
enteroquinasa), la región codificante para el polipéptido específico
PRO, un terminador transcripcional de lambda y un gen argU.
La mezcla de ligación se utiliza a continuación
para transformar una cepa de E. coli seleccionada con los
métodos descritos en Sambrook et al., supra. Los
transformantes se identifican por su habilidad para crecer en
placas de LB y se seleccionan las colonias resistentes a los
antibióticos. El ADN del plásmido puede aislarse y confirmarse por
análisis de restricción y secuenciación.
Los clones seleccionados pueden crecer toda la
noche en medio de cultivo líquido como caldo LB suplementado con
antibióticos. El cultivo de toda una noche puede posteriormente
utilizarse para el inóculo de un cultivo a gran escala. A
continuación, se crecen las células hasta la densidad óptica
deseada, tiempo durante el cual se activa el promotor.
Después del cultivo durante algunas horas, las
células se recogen por centrifugación. El precipitado celular
obtenido por centrifugación se solubiliza con varios agentes
conocidos en la técnica, y el polipéptido PRO solubilizado puede a
continuación ser purificado con una columna de quelación de metales
en condiciones que permiten la unión fuerte de la proteína.
En la solicitud de EP No. 99912321.9, el
polipéptido PRO se expresaba en E. coli en una forma unida a
un fragmento poli-His según el método que sigue a
continuación. El ADN codificante para los polipéptidos PRO se
amplificó primero los cebadores seleccionados para la PCR. Los
cebadores contenían lugares para enzimas de restricción que
corresponden a los lugares de restricción presentes en el vector de
expresión, y otras secuencias útiles que proporcionan un lugar
eficiente de inicio de la traducción, purificación rápida en una
columna de quelación de metales, y digestión proteolítica con
enteroquinasa. Las secuencias amplificadas por PCR y unidas a
secuencias poly-His se ligaron después con un vector
de expresión que se utilizó para transformar un huésped E.
coli derivado de la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE
rpoHts(htpRTS)clpP(lacip). Los transformantes
se crecieron primero en LB que contenía 50 mg/ml de carbenicilina a
30ºC con agitación hasta una D.O. de 600 desde 3-5.
Los cultivos se diluyeron entre 50-100 veces en
medio CRPA (preparado por mezcla de 3,57
g(NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,71 g de citrato sódico
2H_{2}O, 1,07 g KCl, extracto de levadura de Difco 5,36 g,
Sheffield Hycase SF 5,36 g en 500 ml de agua al mismo tiempo que
110 mM MPOS, PH 7,3, glucosa 0,55% (p/v) y MgSO_{4} 7 mM) y se
crecieron durante 20-30 horas aproximadamente a 30ºC
en agitación. Se tomaron muestras para verificar su expresión por
análisis en SDS-PAGE, y el conjunto del cultivo se
centrifugó y se obtuvo un precipitado celular. El precipitado
celular se congeló hasta su purificación y replegado.
La pasta de E. coli procedente de
fermentaciones de 0,5 a 1 L. (6-10 g de
precipitado), se resuspendió en 10 volúmenes (p/v) de guanidina 7
M, tampón Tris 20 mM, pH 8. Se añadieron sulfito sódico sólido y
tetrationto sódico, para unas concentraciones finales de 0,1 M y
0,01, respectivamente y la solución se dejó en agitación magnética
durante toda la noche a 4ºC. Este paso resulta en desnaturalización
de la proteína, con los residuos cisteínas bloqueados por
sulfitolización. La solución se centrifugó a 40.000 rpm en una
Ultracentrífuga Beckman durante 30 min. El sobrenadante se diluyó
con 3-5 volúmenes de tampón de la columna quelante
de metales (guanidina 6 M, 20 ml Qiagen Ni-NTA
columna quelante de metales equilibrada en el tampón 53. La columna
se lavó con tampón adicional que contenía imidazol 50 mM. Las
fracciones que contenían la proteína deseada se precipitaron y
almacenaron a 4ºC. La concentración de proteína se estimó por su
absorbancia a 280 nm con el coeficiente de extinción calculado en
base a su secuencia de aminoácidos.
Las proteínas se replegaron por dilución de la
muestra lentamente en tampón de replegado preparado fresco que
consistía en: Tris 20 mM, pH 8,6, NaCl 0,3 M, urea 2,5 M, cisteína 5
mM, glicina 20 mM y EDTA 1 mM. Los volúmenes de replegado se
escogieron de manera que la concentración final de la proteína
estuviera entre 50 y 100 microgramos/ml. La solución de replegado
se dejó en agitación magnética cuidadosa durante
12-36 horas a 4ºC. La reacción de replegado se
enfrió por la adición de TFA a una concentración final de 0,4% (pH
de aproximadamente 3). Antes de una purificación ulterior de la
proteína, la solución se filtró a través de un filtro de 0,22
micras y se añadió acetonitrilo hasta una concentración final de
2-10%. La proteína replegada se cromatografió en
una columna de fase reversa Poros R1/H con un tampón móvil de 0.1%
TFA con elución en un gradiente de acetonitrilo de 10 a 80%.
Alícuotas de fracciones con una absorbancia A280 se analizaron en
geles de poliacrilamida SDS y las fracciones conteniendo proteína
replegada homogénea se precipitaron. En general, las especias
replegadas adecuadamente de la mayoría de las proteínas, se eluyeron
a concentraciones menores de acetonitrilo ya que esas especies son
las más compactas con su hidrofobicidad interior tapada por la
interacción con la resina de fase reversa. Las especies agregadas se
eluyeron habitualmente a altas concentraciones de acetonitrilo.
Además para resolver las formas de proteínas no plegadas
completamente de la forma plegada, el paso de la fase reversa
también extrae la endotoxina de las muestras.
Las fracciones que contenían las proteínas PRO
replegadas deseadas se precipitaron y el acetonitrilo se extrajo
con evaporación de nitrógeno cuidadosamente directamente sobre la
solución. Las proteínas se formularon en Hepes 20 mM, pH 6,8 con
cloruro de sodio 0,14 M y manitol al 4% por diálisis o por
filtración en gel mediante resina Superfina G25 (Pharmacia)
equilibrada en el tampón formulado y filtrado de manera estéril.
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
glicosilada de un polipéptido PRO deseado, mediante la expresión
recombinante en células de mamíferos.
El vector pRK5 (véase la EP 307,247, publicada
el 15 de Marzo, 1989), se empleó como vector de expresión. De
manera opcional, el ADN codificante para el polipéptido PRO se ligó
a pRK5 con enzimas de restricción seleccionadas para permitir la
inserción del ADN del polipéptido PRO por los métodos de ligación
descritos en Sambrook et al., supra. El vector
resultante se denominó pRK5-polipéptido PRO.
En una realización, las células huéspedes
seleccionadas pueden ser las células 293. Las células 293 humanas
(ATCC CCL 1573) se crecen en confluencia en placas de cultivo de
tejidos en un medio tal como DMEM suplementado con suero bovino
fetal y opcionalmente con componentes nutritivos y/o antibióticos.
Unos 10 \mug de ADN de pRK5-polipéptido PRO se
mezclan con 1 \mug de ADN codificante para el gen VA ARN
[Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)] y se disuelven en
500 \mul de Tris-HCl 1 mM, 0,1 mM EDTA, 0,227 M
CaCl_{2}. A esta mezcla se añaden, en gotas, 500 \mul de HEPES
50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, 1,5 mM NaPO_{4} y se deja progresar
un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se
resuspende y se añade a las células 293 dejándose durante cuatro
horas a 37ºC. El medio de cultivo se aspira y se añaden 2 ml de
glicerol al 20% en PBS durante 30 segundos. Las células 293 se
lavan con medio de cultivo libre de suero, se añade medio fresco y
las células se incuban durante 5 días.
Aproximadamente 24 horas después de las
transfecciones, el medio de cultivo se extrae y se substituye por
medio de cultivo solo o por medio que contiene 200
\muCi/ml^{35}S-cisteína y 200
\muCi/ml^{35}S-metionina. Después de 12 horas
de incubación, el medio condicionante se recoge, concentra en un
filtro en centrifugación, y se carga en un gel de SDS 15%. El gel
procesado se seca y se expone por un período de tiempo que permita
revelar la presencia del polipéptido PRO. Los cultivos que contienen
las células transfectadas pueden someterse a una incubación
adicional (en medio libre de suero), analizándose el medio en
bioensayos seleccionados.
En una técnica alternativa, el polipéptido PRO
puede introducirse en las células 293 de forma transitoria
utilizando el procedimiento del dextrano de sulfato descrito por
Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981).
Las células 293 se crecen a una densidad máxima en un frasco de
cultivo centrifugador y se añaden 700 \mug de ADN de
pRK5-polipéptido PRO. Las células se concentran en
el frasco centrifugador y se lavan con PBS. El precipitado de
ADN-dextrano se incuba con el sedimento celular
durante cuatro horas. Las células se tratan a continuación con
glicerol al 20% durante 90 segundos, se lavan con el medio de
cultivo de tejidos y se re-introducen en el frasco
centrifugador que contiene medio de cultivo, 5 \mug/ml de insulina
bovina y 0,1 \mug/ml de transferrina bovina. Al cabo de cuatro
días, el medio condicionado se centrifuga y se filtra para eliminar
las células y los restos celulares. La muestra que contenía el
polipéptido PRO puede entonces concentrarse y purificarse mediante
cualquier procedimiento, como la diálisis y/o la cromatografía por
columna.
En otra realización, los polipéptidos PRO pueden
expresarse en células CHO. El ADN de
pRK5-polipéptido PRO puede transfectarse en células
CHO utilizando reactivos como el CaPO_{4} o el
dextrano-DEAE. Tal como se describió más arriba,
los cultivos celulares pueden incubarse y el medio reemplazarse con
medio de cultivo (solo) o con medio que contenga un marcador
radioactivo como la metionina-S35. Después de
determinar la presencia del polipéptido PRO, el medio de cultivo
puede reemplazarse con medio sin suero. Preferentemente, los
cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días y luego se
cosecha el medio condicionado. El medio que contenía el polipéptido
PRO expresado pueden a continuación concentrarse y purificarse
mediante cualquier procedimiento seleccionado.
El polipéptido PRO etiquetado epitópicamente
también puede expresarse en células huésped CHO. El polipéptido PRO
puede subclonarse en otro vector distinto al pRK5. A continuación,
mediante PCR se fusiona en la misma pauta de lectura el inserto del
subclón con una etiqueta epitópicamente seleccionada como un
poli-his en el vector de expresión en Baculovirus.
El inserto polipéptido PRO-etiquetado con
poli-His se subclona a continuación en un vector
dirigido de SV40 que contiene un marcador de selección como el DHFR
para la selección de clones estables. Por último, las células CHO
se pueden transfectar (tal como se describió anteriormente) con el
vector dirigido por SV40. El marcaje se puede realizar, tal como se
describió anteriormente, para verificar la expresión. El medio de
cultivo que contenía el polipéptido PRO etiquetado con
poli-His se concentra a continuación y se purifica
mediante cualquier procedimiento seleccionado, como por ejemplo la
cromatografía de afinidad con Ni^{2+}-quelato.
En EP 99912321.9, la expresión estable en
células CHO se realizó utilizando el procedimiento siguiente. Las
proteínas se expresaron como una construcción IgG (inmunoadhesina),
en la que las secuencias codificantes para las formas solubles (por
ejemplo, dominios extracelulares) de las proteínas respectivas se
fusionaron con una región constante de IgG1 que contenía la
bisagra, CH_{2} y los dominios de CH_{2} y/o una forma
etiquetada con un poli-His.
Después de la amplificación, los ADNs
respectivos se subclonan en un vector de expresión en CHO utilizando
técnicas estándares, tal como se describió en Ausubel et
al., Current Protocols of Molecular Biology, Unidad 3.16, John
Wiley y Sons (1997). Se construyeron vectores de expresión en CHO
con dianas de restricción compatibles en 5' y 3' del ADN de interés
para permitir el barajamiento adecuado de los ADNcs. El vector
utilizado para la expresión en CHO se describe por Lucas et
al., Nucl. Acids. Res. 24:9 (1774-1779, (1996))
y utiliza el intensificador de la transcripción del promotor
temprano de SV40 para dirigir la expresión del ADNc de interés y la
dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresión de DHFR permite la
selección para el mantenimiento estable del plásmido tras la
transfección.
Se introdujeron 12 \mug del ADN plasmídico
deseado en aproximadamente 10 millones de células CHO utilizando
reactivos de transfección disponibles comercialmente Superfect®
(Quiagen), Dosper® o Fugene® (Boehringer Mannheim). Las células se
crecieron tal como se describe en Lucas et al., supra.
Aproximadamente, 3x10^{7} células se congelaron en una ampolla
para el posterior crecimiento producción tal como se describe más
adelante.
Los viales que contenían el ADN del plásmido se
descongelaron colocándolas en un baño y se mezclaron mediante
agitación vigorosa. Los contenidos se pipetearon en un tubo de
centrífuga que contenía 10 ml de medio y se centrifugaron a 1000
rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se aspiró y las células se
resuspendieron en 10 ml de medio selectivo (filtrado con un filtro
PS20 de 0,2 \mum con suero bovino fetal al 5% filtrado con un
filtro de 0,2 \mum). Las células se pusieron en alícuotas en tubos
de centrifugación de 100 ml que contenían 90 ml de medio selectivo.
Al cabo de 1-2 días, las células se transfirieron a
un frasco de 250 ml que se rellenó con 150 ml de medio selectivo y
se incubó a 37ºC. Al cabo de 2-3 días, se sembraron
frascos de cultivo centrifugadores de 250, 500 y 2000 ml con
3x10^{5} células/ml. El medio celular se cambió por medio fresco
mediante centrifugación y resuspensión en medio de producción.
Aunque puede utilizarse cualquier tipo de medio para CHO, se
utilizó un medio de producción descrito en la patente americana U.S.
5.122.469, publicada el 16 de junio de 1992. Un frasco de cultivo
centrifugador de 3 l se sembró con 1,2 x106 células/ml. El día 0,
se determinó el número de células y el pH. El día 1, se obtuvo una
muestra del cultivo y se inició la introducción de aire filtrado.
El día 2, se obtuvo una muestra del cultivo, la temperatura se
desplazó a 33ºC, y se añadieron 30 ml de una solución de glucosa
500 g/l y 0,6 ml de antiespumante al 10% (por ejemplo, emulsión de
polidimetilsiloxano al 35%, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion).
Durante la producción, se ajustó el pH para mantenerlo a
aproximadamente 7,2. Al cabo de 10 días, o hasta que la viabilidad
descendiera por debajo del 70%, el cultivo celular se cosechó
mediante centrifugación y se filtró con un filtro de 0,22 \mum.
El filtrado se guardó a 4ºC o se cargó inmediatamente en columnas
para su purificación.
Para las construcciones etiquetadas con
poli-His, las proteínas se purificaron utilizando
una columna Ni-NTA (Quiagen). Después de la
purificación, se añadió imidazol al medio condicionado a una
concentración de 5 mM. El medio condicionado se pasó por una
columna de 6 ml N9-NTA equilibrada con Hepes 20 mM,
pH 7,4, tampón que contenía NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a una
velocidad de flujo de 4-5 ml/min a 4ºC. Después del
cargado, la columna se lavó con tampón de equilibrado adicional y
la proteína se eluyó con tampón de equilibrado que contenía
imidazol 0,25 mM. La proteína altamente purificada se desaló a
continuación en un tampón de almacenamiento que contenía Hepes 10
mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna G25
Superfine de 25 ml de Pharmacia y se guardó a -80ºC.
Las construcciones de inmunoadhesina (que
contienen Fc) se purificaron del medio condicionado de la manera
siguiente. El medio condicionado se cargó en una columna de Proteína
A de 5 ml (Pharmacia) que se había equilibrado con tampón fosfato
Na 20 mM, pH 6,8. Después de cargarse, la columna se lavó
extensamente con tampón de equilibrio antes de la elución con ácido
cítrico, pH 3,5. La proteína eluída se neutralizó inmediatamente
recogiendo alícuotas de 1 ml en tubos que contenían 275 \mul de
tampón Tris 1 M, pH 9. A continuación, se desaló la proteína
altamente neutralizada en tampón de almacenamiento, tal como se
describió anteriormente para las proteínas etiquetadas
poli-His. La homogeneidad se valoró en geles de
acrilamida-SDS y por secuenciación
N-terminal mediante degradación de Edman.
El procedimiento siguiente describe la expresión
recombinante de un polipéptido PRO deseado en levaduras.
En primer lugar, los vectores de expresión en
levaduras se construyeron para la producción o la secreción
intracelular de polipéptidos PRO a partir de un promotor ADH2/GAPDH.
El ADN que codifica un polipéptido PRO deseado, una secuencia de
péptido señal y el promotor se insertaron en dianas de restricción
adecuadas en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión
intracelular del polipéptido PRO. El ADN que codifica el
polipéptido PRO puede clonarse en el plásmido seleccionado, junto
con el ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, la secuencia
líder/señal secretora del factor alfa de levaduras y las secuencias
enlazadoras (si fuera necesario) para la expresión del polipéptido
PRO.
Las células de levaduras, como la cepa de
levaduras AB110, pueden transformarse a continuación con los
plásmidos de expresión descritos anteriormente y cultivarse en
medios de fermentación seleccionados. Los sobrenadantes de
levaduras transformadas pueden analizarse mediante precipitación con
ácido tricloroacético al 10% y separarse mediante
SDS-PAGE, seguido de la tinción de los geles con
Coomassie azul.
El polipéptido PRO recombinante puede aislarse a
continuación y purificarse eliminando las células de levadura del
medio de fermentación mediante centrifugación y luego concentrar el
medio utilizando cartuchos de filtros seleccionados. El concentrado
que contiene el polipéptido PRO puede purificarse posteriormente
utilizando resinas de cromatografía en columna seleccionadas.
El procedimiento siguiente describe la expresión
recombinante de polipéptidos PRO en células de insecto infectadas
con Baculovirus.
El polipéptido PRO deseado se fusiona cadena
arriba de una etiqueta epitópica en un vector de expresión de
baculovirus. Dicha etiqueta epitópica incluye las etiquetas
poli-his y las etiquetas de inmunoglobulinas (como
las regiones Fc de IgG). Se pueden utilizar diversos plásmidos,
incluyendo plásmidos derivados de los comercialmente disponibles
como el pVL1393 (Novagen). En resumen, el polipéptido PRO o la parte
deseada del polipéptido PRO (como la secuencia codificante del
dominio extracelular de una proteína transmembrana) se amplifica
mediante PCR con cebadores complementarios en las regiones 5' y 3'.
El cebador 5' puede incorporar dianas de restricción enzimática. El
producto se digiere a continuación con las enzimas de restricción
seleccionadas y se subclonan en el vector de expresión.
El baculovirus recombinante se genera mediante
co-transfección del plásmido anterior y el ADN del
virus
BaculoGold^{TM} (Pharmigen) en células Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) con lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Al cabo de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se cosechan y utilizan para amplificaciones posteriores. La infección viral y la expresión de proteínas se realizan tal como se describe en O'Reilly et al., Baculovirus expression vectors: A laboratory manual, Oxford Universtiy Press (1994).
BaculoGold^{TM} (Pharmigen) en células Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) con lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Al cabo de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se cosechan y utilizan para amplificaciones posteriores. La infección viral y la expresión de proteínas se realizan tal como se describe en O'Reilly et al., Baculovirus expression vectors: A laboratory manual, Oxford Universtiy Press (1994).
A continuación, se purifica el polipéptido
PRO-etiquetado con poli-His
expresado, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad con
quelato-Ni-^{2+} de la manera
siguiente. Se preparan los extractos de las células Sf9 infectadas
con virus recombinantes, tal como se describe por Rupert et
al., Nature, 362:175-179 (1993). En resumen,
las células Sf9 se lavan, se resuspenden en tampón de sonicación (25
ml de Hepes, pH 79; MgCl_{2} 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; glicerol al
10%, EDTA 0,1 mM; glicerol al 10%; NP-40 al 0,1%;
KCl 0,4 M) y se sonican dos veces durante 20 s en hielo. Los
sonicados se aclaran mediante centrifugación y a continuación se
diluye el sobrenadante 50 veces en tampón de carga (fosfato 50 mM,
NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 7,8) y se filtra a través de un
filtro de 0,45 \mum. Se prepara una columna de agarosa
Ni^{2+}-NTA (disponible comercialmente de
Quiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua
y se equilibra con 25 ml de tampón de carga. El extracto celular
filtrado se carga en la columna a una velocidad de flujo de 0,5 ml
por minuto. La columna se lava hasta alcanzar una A_{280} basal
con tampón de carga, en dicho punto la fracción se inicia la
recolecta de fracciones. A continuación, la columna se lava con un
tampón de lavado secundario (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol
al 10%, pH 6,0), que eluye específicamente la proteína unida.
Después de alcanzar de nuevo la A_{280} basal, se hace pasar por
la columna un gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en el tampón de
lavado secundario. Se recogen fracciones de 1 ml y se analizan por
SDS-PAGE y tinción con plata o transferencia de
western con Ni2+-NTA conjugado con fosfatasa alcalina (Qiagen). Las
fracciones que contenían el polipéptido PRO etiquetado con
His-10 se recogen, agrupan y se dializan contra
tampón de carga.
Alternativamente, la purificación del
polipéptido PRO etiquetado con IgG (o con Fc) puede realizarse
utilizando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo por
ejemplo, cromatografía en columnas de Proteína A o G.
En la solicitud de patente europea EP
999.12321.9, los polipéptidos PRO se expresaron satisfactoriamente
en células de insecto Sf9 infectadas con baculovirus. Aunque la
expresión se realizó actualmente a una escala de
0,5-2 l, puede realizarse fácilmente a mayores
escalas (por ejemplo, 8 L). Las proteínas se expresaron como una
construcción IgG (inmunoadhesina), en la que la región extracelular
de la proteína se fusionó a una región constante de una IgG1 que
contenía la bisagra, dominios CH_{2} y CH_{3} y/o las formas
etiquetadas con poli-His.
Para la expresión en células Sf9 en baculovirus,
después de la amplificación por PCR, las secuencias codificantes
respectivas en el vector de expresión de baculovirus (pb.PH.IgG para
fusiones proteicas con IgG y pb.PH.His.c para fusiones proteicas
etiquetadas con poli-His) y el vector y el ADN del
baculovirus Baculogold® (Pharmigen) se cotransfectaron en 10^{5}
células de Spodoptera frugiperda (Sf9) (ATCC CRL 1711), utilizando
Lipofectin (Gibco BRL). Los plásmidos pb.PH.His y pb.PH.IgG son
modificaciones del vector pVL1393, vector de expresión de
baculovirus ampliamente disponible comercialmente (Pharmigen), con
regiones polienlazador modificadas para incluir las secuencias
etiquetas His o Fc. Las células se crecieron en medio Hink
TNM-FH suplementado con FBS al 10% (Hyclone). Las
células se incubaron durante 5 días a 28ºC. El sobrenadante se
cosechó y se utilizó para la amplificación viral infectando células
Sf9 en medio Hink TNM-FH suplementado con FBS al
10% a una multiplicidad de infección (MOI) de 10. Las células se
incubaron durante 30 días a 28ºC. El sobrenadante se cosechó y la
expresión de las construcciones en el vector de expresión de
baculovirus se determinó mediante unión del lote de 1 ml de
sobrenadante con 25 ml de bolas de Ni-NTA (Qiagen)
para las proteínas etiquetadas con histidina o bolas de
Proteína-A Sepharose CL-4B
(Pharmacia) para proteínas etiquetadas con IgG seguido por el
análisis de SDS-PAGE, comparándolo con una
concentración conocida de una proteína estándar teñida con de azul
de Coomassie.
El sobrenadante de la primera amplificación
viral se utilizó para infectar un cultivo en frascos centrifugadores
(500 ml) de células Sf9 crecidas en medio ESF-921
(Sistemas de expresión LLC) a una MOI aproximada de 0,1. Las
células se incubaron durante 3 días a 28ºC. El sobrenadante se
cosechó y filtró. Se repitieron los análisis de unión de lote y de
SDS-PAGE, tantas veces como fue necesario, hasta
confirmar la expresión de cultivo.
El medio condicionado de las células
transfectadas (0,5 a 3 l) se cosechó mediante centrifugación para
eliminar las células y se filtró con un filtros de 0,22 \mum. Para
las construcciones etiquetadas con poli-His, la
proteína se purificó con una columna Ni-NTA
(Qiagen). Antes de la purificación, se añadió imidazol al medio
condicionado a una concentración de 5 mM. El medio condicionado se
bombeó en una columna Ni-NTA de 6 ml equilibrada
con Hepes 20 mM, pH 7,4, y un tampón que contenía NaCl 0,3 M e
imidazol 5 mM a una velocidad de flujo de 4-5
ml/min a 4ºC. Después de cargar, la columna se lavó con tampón de
equilibrio adicional y se eluyó la proteína con el tampón de
equilibrio que contenía imidazol 0,25M. La proteína altamente
purificada se desaló a continuación en un tampón de almacenamiento
con Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8, con una
columna G25 Superfine de 25 ml (Pharmacia) y se almacenó a
-80ºC.
Las construcciones de inmunoadhesina (que
contenían Fc) de proteínas se purificaron del medio condicionado de
la manera siguiente. El medio condicionado se hizo pasara por una
columna de Proteína A de 5 ml (Pharmacia) que se había equilibrado
en tampón fosfato Na 20 mM, pH 6,8. Después de cargar, la columna se
lavó extensamente con el tampón de equilibrio antes de la elución
con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluída se neutralizó
inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en los tubos con 275 ml
de tampón Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada se
desaló en tampón de almacenamiento tal como se describió para las
proteínas etiquetadas con poli-His. Se verificó la
homogeneidad de las proteínas mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida (PEG) y secuenciación aminoacídica
N-terminal mediante degradación de Edman.
En la solicitud de EP 99912321.9, se expresaron
los polipéptidos PRO en células de insecto Hi5 infectadas con
baculovirus. Aunque la expresión se realizó en realidad en una
escala de 0,5-2 L, puede realizarse a mayor escala
para preparaciones más grandes (por ejemplo, 8 L).
Para la expresión de células de insecto Hi5
infectadas con baculovirus, el ADN codificante del polipéptido PRO
se puede amplificar con sistemas adecuados, como la Pfu
(Stratagene), o fusionarse cadena arriba (5' de) de etiqueta
epitópica contenida en un vector de expresión de baculovirus. Dichas
etiquetas epitópicas incluyen las etiquetas
poli-his y las etiquetas de inmunoglobulina (como
las regiones Fc de IgG). Se pueden utilizar diversos plásmidos,
incluyendo los derivados de plásmidos disponibles comercialmente
como el pVL1393 (Novagen). En resumen, el polipéptido PRO o la
parte deseada del polipéptido PRO (como la secuencia codificante del
dominio extracelular de una proteína transmembrana) se amplifica
mediante PCR con los cebadores complementarios con las regiones 5'
y 3'. El cebador 5' puede incorporar dianas de enzimas de
restricción flanqueantes (seleccionadas). A continuación, se
digiere el producto con las enzimas de restricción seleccionadas y
se subclona en el vector de expresión. Por ejemplo, los derivados
de pVL1393 pueden incluir la región Fc de la IgG humana (pb.PH.IgG)
o una etiqueta histidina (pb.PH.His) cadena abajo (3' de) de la
secuencia NOMBRE. Preferentemente, la construcción del vector se
secuencia para su
verificación.
verificación.
Las células Hi5 se desarrollan hasta una
confluencia del 50% en condiciones de, 27ºC, sin CO_{2}, sin
penicilina/estreptomicina. Para cada placa de 150 mm, 30 \mug del
vector derivado de pIE que contiene el polipéptido PRO se mezcla
con 1 ml de medio Ex-Cell (Medio:
Ex-Cell + 1/100 L-Glu JRH
Biosciences # 14401-78P (nota: este medio es
sensible a la luz), y en un tubo separado, 100 \mul de CellFectin
(CellFECTIN (GibcoBRL #10362-010) (agitar mediante
agitación vigorosa hasta mezclado completo)), se mezclan con 1 ml de
medio Ex-Cell. Las dos soluciones se combinan y se
incuban durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añaden 8 ml de
medio ExCell a 2 ml de la mezcla de ADN/CellFECTIN y todo ello se
dispone sobre las células Hi5 previamente lavadas una vez con medio
ExCell. La placa se incuba en la oscuridad durante 1 hora a
temperatura ambiente. La mezcla de ADN/CellFECTIN se aspira, y las
células se lavan una vez con ExCell para eliminar el exceso de
CellFECTIN. Se añaden 30 ml de medio ExCell fresco y las células se
incuban durante 3 días a 28ºC. El sobrenadante se cosecha y la
expresión del polipéptido PRO en el vector de expresión de
baculovirus puede determinarse mediante ensayos de unión de lote de
1 ml de sobrenadante con 25 ml de bolas de Ni-NTA
(Qiagen) para las proteínas etiquetadas con histidina o bolas
Proteína A-Sepharose CL4B (Pharmacia) para proteínas
etiquetadas con IgG, seguido del análisis de
SDS-PAGE comparándolo con una concentración conocida
de una proteína estándar por tinción de azul de Coomassie.
El medio condicionado de las células
transfectadas (0,5 a 3 l) se cosechó mediante centrifugación para
eliminar las células y se filtró a través de un filtro de 0,22
\mum. Para las construcciones etiquetadas con
poli-His, la proteína que comprende el polipéptido
PRO se purifica utilizando una columna de Ni-NTA
(Qiagen). Antes de la purificación, se añade imidazol al medio
condicionado a una concentración de 5 mM. El medio condicionado se
bombea a la columna de nI-NTA de 6 ml equilibrada
con Hepes 20 mM, pH 7,4, tampón que contiene NaCl 0,3 M e imidazol
5 mM a una velocidad de flujo de 4-5 ml/min, a 4ºC.
Después de cargar, la columna se lava con tampón de equilibrio
adicional y se eluye la proteína con el mismo tampón que contiene
imidazol 0,25 M. La proteína altamente purificada se desala a
continuación en un tampón de almacenamiento que contiene Hepes 10
mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna de G25
Superfine de 25 ml (Pharmacia) y se almacena a -80ºC.
Las construcciones de inmunoadhesina (que
contienen Fc) de proteínas se purifican del medio condicionado de
la manera siguiente. El medio condicionado se bombea en una columna
de Proteína A de 5 ml (Pharmacia) que ha sido equilibrada con
tampón fosfato Na 20 mM, pH 6,8. Después de la carga, la columna se
lava extensamente con tampón de equilibrio antes de la elución con
ácido cítrico 100 mM, pH 5,3. La proteína eluída se neutraliza
inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contienen
275 ml de tampón Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada
se desala a continuación en tampón de almacenamiento tal como se
describió anteriormente para las proteínas etiquetadas con
poli-His. La homogeneidad del polipéptido PRO se
puede valorar mediante geles de poliacrilamida-SDS
y secuenciación aminoacídica N-terminal por
degradación de Edman y otros procedimientos analíticos, según se
requiera.
Este ejemplo muestra la preparación de
anticuerpos monoclonales que se pueden unir específicamente a un
polipéptido PRO.
Las técnicas para la producción de anticuerpos
monoclonales son conocidas en la materia y se describen, por
ejemplo, en Goding, supra. Los inmunogenes que pueden
utilizarse incluyen el polipéptido PRO purificado, las proteínas de
fusión que contienen el polipéptido PRO y las células que expresan
el polipéptido PRO recombinante en la superficie celular. La
selección del inmunógeno puede realizarse por el experto en la
materia sin excesiva experimentación.
Se inmunizaron ratones Balb/c con el inmunógeno
polipéptido PRO emulsionado en adyuvante completo de Freund y se
inyectaron subcutáneamente o intraperitonealmente en una cantidad de
1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunógeno
se emulsionó en adyuvante MPL-TDM (Ribi
Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyectó en las
almohadillas de las patas traseras del animal. Los ratones
inmunizados se estimularon a continuación 10 a 12 días más tarde
con inmunógeno adicional emulsionado con adyuvante seleccionado.
Durante varias semanas después, también podían estimularse los
ratones con inyecciones de inmunización adicionales. Se obtuvieron
muestras de suero periódicamente de los ratones mediante sangrado
retro-orbital para analizar en ensayos ELISA para
detectar los anticuerpos anti-polipéptido PRO.
Después de haber detectado un anticuerpo
adecuado, los animales "positivos" para los anticuerpos pueden
ser inyectados con una inyección intravenosa de polipéptido PRO. De
tres a cuatro días más tarde, los ratones se sacrifican y se
obtienen las células del bazo. Las células del bazo se fusionan
(utilizando polietilén glicol al 35%) a una línea celular de
mieloma murino seleccionada, como por ejemplo P3X63AgU.1, disponible
del ATCC, CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que
pueden sembrarse en placas de cultivo de 96 pocillos con medio HAT
(hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación
de células no-fusionadas, híbridos de mieloma e
híbridos de células del bazo.
Las células de hibridomas se rastrearán en un
ensayo ELISA por su reactividad contra el polipéptido PRO. La
determinación de células de hibridoma "positivas" secretoras de
anticuerpos monoclonales deseados contra el polipéptido PRO se
halla dentro del ámbito de la materia.
Las células de hibridoma positivas pueden
inyectarse intraperitonealmente en ratones Balb/c para producir
ascitas que contengan anticuerpos anti-polipéptido
PRO. Alternativamente, las células de hibridoma pueden crecerse en
frascos de cultivo o botellas de cultivo giratorias. La purificación
de los anticuerpos monoclonales producidos en las ascitas puede
lograrse utilizando la precipitación con sulfato amónico, seguido de
cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, se puede
utilizar la cromatografía de afinidad mediante la unión del
anticuerpo a la proteína A o la proteína G.
Los polipéptidos PRO pueden expresarse como
proteínas quiméricas con uno o más dominios polipeptídicos
adicionales añadidos para facilitar la purificación de la proteína.
Dichos dominios facilitadores de la purificación incluyen, pero no
se limitan a, péptidos quelantes de metales como los módulos
histidina-triptófano que permiten la purificación
sobre metales inmovilizados, los dominios de proteína A que permiten
la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada y el dominio
utilizado en el sistema de purificación por extensión/ afinidad
FLAGS^{TM} (Immunex Corp., Seattle Wash.). La inclusión de una
secuencia de enlazador escindible como el Factor Xa o la
enteroquinasa (Invitrogen, San Diego Calif) entre el dominio de
purificación y se secuencia del polipéptido PRO puede ser de
utilidad para facilitar la expresión del ADN codificante del
polipéptido PRO.
Los polipéptidos PRO nativos o recombinantes
pueden purificarse mediante diversas técnicas estándares en la
materia relativas a la purificación de proteínas. Por ejemplo, el
pro-polipéptido PRO, el polipéptido PRO o el
pre-polipéptido PRO se purifican mediante
cromatografía de inmunoafinidad utilizando anticuerpos específicos
para el polipéptido PRO de interés. En general, una columna de
inmunoafinidad se construye mediante acoplamiento covalente del
anticuerpo anti-polipéptido PRO con una resina
cromatográfica activada.
Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a
partir del suero bien mediante precipitación con sulfato amónico o
mediante purificación sobre Proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB
Biotechnology, Piscataway, N.J.). Al igual que los anticuerpos
monoclonales se preparan de ascitas de ratones mediante
precipitación con persulfato amónico o cromatografía sobre Proteína
A inmovilizada. La inmunoglobulina parcialmente purificada se une
covalentemente a una resina cromatográfica como la SEPHAROSE^{TM}
activada por CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo se
acopla a la resina, la resina se bloquea y la resina derivada se
lava de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Se utiliza dicha columna de inmunoafinidad de
dicho tipo en la purificación del polipéptido PRO mediante
preparación de una fracción de células que contienen el polipéptido
PRO en una forma soluble. Esta preparación se deriva por
solubilización de las células completas o de una fracción subcelular
obtenida mediante centrifugación diferencial con adición de
detergente o por otros procedimientos bien conocidos en la técnica.
Alternativamente, el polipéptido PRO contiene una secuencia señal
que puede secretarse en cantidad útil en el medio donde crecen las
células.
Una preparación que contiene el polipéptido PRO
soluble se pasa por la columna de afinidad, a continuación se lava
la columna en condiciones que permiten la absorbancia preferencial
del polipéptido PRO (por ejemplo, tampones de alta fuerza iónica en
presencia de detergente). A continuación, la columna se eluye en
condiciones tales que se rompe la unión anticuerpo/polipéptido PRO
(por ejemplo, un tampón con pH bajo de aproximadamente pH
2-3, o una concentración elevada de un agente
caotrópico como la urea o el ión tiocianato) y por último se recoge
el polipéptido PRO.
La invención es particularmente útil para el
rastreo de compuestos utilizando polipéptidos PRO o mediante la
unión a un fragmento de éste con cualquiera de las técnicas de
búsqueda de fármacos. El polipéptido PRO o un fragmento de éste que
se utilice en dicho análisis puede hallarse en libre en solución,
fijado a un soporte sólido, adherido a la superficie celular o
localizado intracelularmente. Un procedimiento de rastreo de
fármacos utiliza células eucariotas o procariotas que se
transforman establemente con los ácidos nucleicos recombinantes y
expresan el polipéptido PRO o sus fragmentos. Los fármacos se
seleccionan frente a dichas células transformadas en ensayos de
unión competitiva. Dichas células, bien en la forma viable o fija,
pueden utilizarse para ensayos de unión estándar. Se puede
cuantificar por ejemplo, la formación de complejos entre el
polipéptido PRO o un fragmento y el agente que se analiza.
Alternativamente, se puede examinar la disminución de la formación
del complejo entre el polipéptido PRO y su célula diana o sus
receptores diana que está causada pro el agente que se analiza.
En consecuencia, la presente invención
proporciona procedimientos de rastreo de fármacos o cualquier otro
agente que pueda afectar a la enfermedad o trastorno asociado con el
polipéptido PRO. Estos procedimientos comprenden el contacto con
uno de dichos agentes que contengan el polipéptido PRO o un
fragmento de éste y el análisis de (i) la presencia de un complejo
entre el agente y el polipéptido PRO o su fragmento, o (ii) la
presencia de un complejo entre el polipéptido PRO o un fragmento de
éste y la célula, mediante procedimientos bien conocidos en la
técnica. En dichos ensayos de unión competitiva, el polipéptido PRO
o un fragmento de éste se marca de modo característico. Después de
una incubación adecuada, el polipéptido PRO libre o un fragmento de
éste se separa de la forma unida y la cantidad de libre o de marcaje
no presente en el complejo es una medida de la capacidad del agente
determinado para unirse al polipéptido PRO o para interferir con el
complejo polipéptido PRO/célula.
Otra técnica para el rastreo de fármacos
proporciona una selección de alto rendimiento para compuestos con
afinidad de unión adecuada por un polipéptido y se describe con
detalle en la patente internacional WO 84/03564, publicada el 13 de
septiembre de 1984. En resumen, grandes cantidades de compuestos de
pequeños péptidos distintos a analizar se sintetizan sobre un
sustrato sólido, como puntas o cualquier otra superficie. Tal como
se aplica para un polipéptido PRO, los compuestos peptídicos a
analizar se hacen reaccionar con el polipéptido PRO y se lavan. El
polipéptido PRO unido se detecta mediante procedimientos bien
conocidos en la técnica. El polipéptido PRO purificado también
puede servir como recubrimientos de placas para utilizar en las
técnicas de rastreo de fármacos mencionadas anteriormente. Además,
se pueden utilizar anticuerpos neutralizantes para capturar el
péptido e inmovilizarlo sobre el soporte
sólido.
sólido.
La presente invención también contempla la
utilización de ensayos de rastreo competitivo de fármacos en los
que los anticuerpos neutralizantes capaces de unirse al polipéptido
PRO compiten específicamente con un compuesto test por la unión con
el polipéptido PRO o con fragmentos del mismo. De esta manera,
pueden utilizarse anticuerpos para detectar la presencia de
cualquier péptido que comparta uno o más determinantes antigénicos
con el polipéptido PRO.
El objetivo del diseño racional de fármacos es
producir análogos estructurales del polipéptido activo
biológicamente de interés (es decir, un polipéptido PRO) o de
moléculas pequeñas con las que interaccionan, por ejemplo, los
agonistas, antagonistas o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos
puede utilizarse para generar fármacos que sean formas más activas
o estables del polipéptido PRO o que intensifiquen o interfieran
con la función del polipéptido PRO in vivo (Hodgson,
Bio/Technology, 9:19-21 (1991)).
En una estrategia, la estructura tridimensional
del polipéptido PRO, o de un complejo inhibidor del polipéptido
PRO, se determina mediante cristalografía de rayos X, mediante
modelado informático o, de forma más característica, mediante una
combinación de dos aproximaciones. Es necesario conocer tanto la
forma como las cargas del polipéptido PRO para comprender la
estructura y determinar los sitios activos de la molécula. Aunque a
veces, pero no muy frecuentemente, se puede obtener información útil
sobre la estructura del polipéptido PRO mediante modelado basado en
la estructura de proteínas homólogas. En ambos casos, la información
estructural relevante se utiliza para diseñar moléculas de tipo
polipéptido-PRO análogas o para identificar
inhibidores eficientes. Ejemplos útiles del diseño racional de
fármacos puede incluir moléculas con una actividad mejorada o
estabilidad, tal como se muestra por Braxton y Wells, Biochemistry,
31:7796-7801 (1992) o que actúan como inhibidores,
o antagonistas de péptidos nativos tal como se muestra por Athauda
et al., J. Biochem., 113:742-746 (1993).
También es posible aislar un anticuerpo
específico de una diana, seleccionado mediante ensayo funcional,
tal como se describió anteriormente y a continuación resolver su
estructura cristalina. Esta estrategia, en principio, produce un
precursor del fármaco ("farmacore") sobre el cual se pueden
diseñar posteriormente fármacos. Es posible evitar la
cristalografía de proteínas generando anticuerpos
anti-idiotípicos (anti-ids) contra
una anticuerpo funcional, activo farmacológicamente. Como una imagen
en espejo de una imagen en el espejo, el sitio de unión de los
anti-ids se esperaría que fuera un análogo del
receptor original. El anti-id podría utilizarse
para identificar y aislar péptidos a partir de bancos de péptidos
producidos química o biológicamente. Los péptidos aislados
actuarían a continuación como el precursor del fármaco.
En virtud de la presente invención, se pueden
obtener cantidades suficientes del polipéptido PRO para realizar
dichos estudios analíticos como la cristalografía por rayos X.
Además, el conocimiento de la secuencia de aminoácidos del
polipéptido PRO que se proporciona aquí facilitará una guía par los
que utilicen técnicas de modelado informático en lugar de o además
de la cristalografía por rayos X.
Este ejemplo muestra que los genes que codifican
varios polipéptidos PRO se amplifican en el genoma de ciertos
cánceres humanos. La amplificación está asociada con la
sobreexpresión del producto génico, indicando que el polipéptido
PRO es una diana útil para la intervención terapéutica en ciertos
cánceres, tales como colon, pulmón y otros cánceres. El agente
terapéutico puede tomar la forma de antagonistas de genes que
codifican el polipéptido PRO, por ejemplo, anticuerpos quiméricos
murino-humano, humanizado o humana contra el
polipéptido PRO.
El material de partida para el cribado fue ADN
genómico aislado de una serie de cánceres. El ADN se cuantifica de
manera exacta, por ejemplo, fluorométricamente. Como control
negativo, el ADN se aisló de las células de diez individuos sanos
normales que se agrupó y utilizó como controles de ensayo para la
copia de genes en individuos sanos (NorHu).
El ensayo con 5' nucleasa (por ejemplo,
TaqMan^{TM}) y la PCR cuantitativa a tiempo real (por ejemplo,
ABI Prizm 7700 Sequence Detection System^{TM} (Perkin Elmer,
Applied Biosystems Division, Foster City, CA)), se utilizaron para
encontrar genes potencialmente amplificados en ciertos cánceres. Los
resultados se utilizaron para determinar si el ADN que codifica el
polipéptido PRO está sobrerrepresentado en cualquiera de los
cánceres de pulmón y colon que se cribaron. El resultado se indicó
en unidades de Delta CT. Una unidad corresponde a 1 ciclo de PCR o
aproximadamente la amplificación de 2 veces en relación a lo normal,
dos unidades corresponde a 4 veces, 3 unidades a 8 veces y así
sucesivamente. La cuantificación se obtuvo utilizando cebadores y un
fluorescente Taqman^{TM} derivado del gen que codifica el
polipéptido PRO. Las regiones del polipéptido PRO que más
probablemente contienen las secuencias de ácidos nucleicos únicas y
que menos probablemente tienen intrones ayustados se prefieren para
la derivación del cebador, por ejemplo, región 3' no traducida.
La reacción de ensayo con 5' nucleasa es una
técnica fluorescente basada en PCR que utiliza la actividad de la
5' exonucleasa de la enzima Taq ADN polimerasa para monitorizar la
amplificación a tiempo real. Se utilizan dos cebadores de
oligonucleótidos para generar un amplicón típico de una reacción
PCR. Se diseña un tercer oligonucleótido, o sonda, para detectar
una secuencia de nucleótidos localizada entre los dos cebadores de
PCR. La sonda no es extendible mediante la enzima Taq ADN polimerasa
y se marca con un colorante fluorescente informador y un colorante
fluorescente desactivador. Cualquier emisión inducida por láser del
colorante informador se desactiva mediante el colorante
desactivador cuando los dos colorantes se localizan próximos ya que
están en la sonda. Durante la reacción de amplificación, la sonda
es dividida por la enzima Taq ADN polimerasa de forma dependiente
de la plantilla. Los fragmentos de la sonda resultante se disocian
en solución y la señal del colorante informador liberado está libre
del efecto desactivador del segundo fluoróforo. Se libera una
molécula de colorante informador para cada nueva molécula
sintetizada y la detección del colorante informador desactivado
proporciona la base para una interpretación cuantitativa de los
datos.
El procedimiento con 5' nucleasa se desarrolla
en un dispositivo de PCR cuantitativa a tiempo real tal como ABI
Prism 7700TM Sequence Detection. El sistema consiste en un
termociclador, un láser, una cámara de dispositivo de carga
acoplada (CCD) y un ordenador. El sistema amplifica muestras en un
formato de 96 pocillos en un termociclador. Durante la
amplificación, la señal fluorescente inducida por láser se recoge a
tiempo real a través de cables de fibra óptica para los 96 pocillos
y se detecta en el CCD. El sistema incluye software para
desarrollar el instrumento y para analizar los datos.
Los datos del ensayo con 5' nucleasa se expresan
inicialmente como Ct o el ciclo umbral. Esto se define como el
ciclo en el que la señal informadora se acumula por encima del
niveles base de fluorescencia. Los valores de Ct se utilizan como
medida cuantitativa del número relativo de copias iniciales de una
secuencia diana concreta en una muestra de ácido nucleico.
Se observó que los genes que codifican los
siguientes polipéptidos PRO se amplificaban en el ensayo anterior:
PRO351.
El efecto de varias concentraciones de
polipéptidos PRO se calculó dividiendo el número total de células
positivas para calceína a los 2-3 días de cultivo
por el número total de células marcada con DAPI-I a
los 2-3 días de cultivo. Por encima del 30% de
supervivencia se consideró positivo. Los polipéptidos PRO siguientes
fueron positivos en este ensayo: PRO617.
La Hibridación in situ es una técnica
potente y versátil para la detección y localización de secuencias
de ácido nucleico en las preparaciones celulares o de tejidos. Puede
ser útil, por ejemplo, para identificar sitios de expresión génica,
analizar la distribución en el tejido, identificar y localizar la
infección viral, seguir los cambios en la síntesis de ARNm
específico y con la ayuda del mapeo cromosómico.
La hibridación in situ se realizó según
la versión optimizada del protocolo de Lu y Gillet, Cell Vision
1:169-176 (1994), utilizando las ribosondas marcadas
con P^{32} generadas por PCR. En resumen, los tejidos humanos
incluidos en parafina, fijados en formalina se seccionaron,
desparafinaron, desproteinizaron en proteinasa K (20 g/ml) durante
15 minutos a 37ºC y se procesaron posteriormente para la hibridación
in situ tal como se describió por Lu y Gillet, supra.
Una ribosonda antisentido marcada con UTP-P^{32}
se generó de un producto de PCR y se hibridó a 55ºC durante la
noche. A continuación los portaobjetos con las hibridaciones se
sumergieron en la emulsión fotográfica Kodak NTB2 y se expusieron
durante 4 semanas.
- \quad
- 6,0 \mul (125 mCi) de UTP-P^{33} (Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/mmol) se secaron al vacío. A cada tubo que contenía el UTP-P^{33} secado se añadieron los siguientes ingredientes:
- \quad
- 2,0 \mul de tampón de transcripción 5X
- \quad
- 1,0 \mul de DTT (100 mM)
- \quad
- 2,0 \mul de mezcla de NTP (2,5 mM: 10 \mul de cada GTP, CTP, TTP y ATP a 10 mM + 10 \mul de H_{2}O)
- \quad
- 1,0 \mul de UTP (50 \muM)
- \quad
- 1,0 de ARNsin
- \quad
- 1,0 \mul de ADN plantilla (1 \mug)
- \quad
- 1,0 \mul de H_{2}O
- \quad
- 1,0 \mul de ARN polimerasa (para productos de PCR T3= antisentido, T7= sentido 5', generalmente).
Los tubos se incubaron a 37ºC durante 1 hora. Se
añadió 1,0 \mul de ADNsa RQ1, seguido de una incubación a 37ºC
durante 15 minutos. Se añadieron 90 \mul de TE (10 mM de Tris pH
7,6/EDTA 1 mM, pH 8,0) y la mezcla se pipeteó en papel DE81. La
solución restante se cargó en una unidad de ultrafiltración
Microcon-50 y se centrifugó utilizando el programa
10 (6 minutos). La unidad de filtración se invirtió sobre un segundo
tubo y se centrifugó con el programa 2 (3 minutos). En la última
recuperación, se añadieron 100 \mul de TE. Se pipeteó 1 \mul de
producto final sobre papel DE81 y se contaron en 6 ml de Biofluor
II.
La sonda se migró en un gel de TBE/urea. Se
añadieron 1-3 \mul de la sonda o 5 \mul de ARN
Mrk II a 3 \mul de tampón de carga. Se calentó la mezcla a 95ºC
en termobloque durante 3 min e inmediatamente después se colocó en
hielo. Se nivelaron los pocillos, se cargó la muestra y se migró a
180-250 voltios durante 45 minutos. El gel se
envolvió en saran-wrap y se expuso a una
película XAR con una pantalla intensificadora a -70ºC durante 1 h a
toda la noche.
Los portaobjetos se sacaron del congelador, se
colocaron en bandejas de aluminio y se descongelaron a temperatura
ambiente durante 5 minutos. Las bandejas se colocaron en el
incubador a 55ºC durante 5 minutos para reducir la condensación.
Los portaobjetos se fijaron durante 10 minutos en paraformaldehído
al 4% en hielo en la campana de gases y se lavaron en 0,5XSSC
durante 5 minutos, a temperatura ambiente (25 ml de 20XSSC + 975 ml
de H_{2}O SQ). Después de desproteinizar con proteinasa K a 0,5
\mug/ml durante 10 minutos a 37ºC (12,5 \mul de solución madre
de proteinasa K en 250 ml de tampón sin ARNsa precalentado), las
secciones se lavaron en 0,5XSSC durante 10 minutos a temperatura
ambiente. Las secciones se deshidrataron en etanol al 70%, 95%,
100%, durante 2 min en cada
baño.
baño.
Los portaobjetos se desparafinaron, se colocaron
en H_{2}O SQ y se lavaron dos veces con 2XSSC a temperatura
ambiente, durante 5 minutos cada vez. Las secciones de embriones
humanos se desproteinizaron con proteinasa K 20 \mug/ml (500
\mul de una solución madre de 10 mg/ml en 250 ml de tampón sin
ARNsa; 37ºC, 15 minutos), o 8X proteinasa K (100 \mul en 250 ml
de tampón sin ARNsa, 37ºC, 30 minutos) para tejidos en formalina. A
continuación, se realizaron lavados en 0,5XSSC y se deshidrataron
tal como se describió anteriormente.
Las preparaciones de los portaobjetos se
colocaron en una cajita de plástico con tampón Box (4XSSC,
formamida al 50%) - saturada con papel de filtro. El tejido se
recubrió con 50 \mul de tampón de hibridación (3,75 g de Dextrano
de sulfato + 6 ml de H_{2}O SQ), se mezcló mediante agitación
vigorosa y se calentó en el microondas durante 2 minutos con la
tapa aflojada. Después de enfriar las cajas con los tejidos en
hielo, se añadieron 18,75 ml de formamida, 3,75 ml de 20XSSC y 9 ml
de H_{2}O SQ, se volvió a mezclar bien mediante agitación
vigorosa y se incubó a 42ºC durante 1-4 horas.
Un sonda de 1,0x10^{6} cpm y 1,0 \mul de
ARNt (50 mg/ml de solución madre) por porta se calentaron a 95ºC
durante 3 minutos. Los portas se enfriaron en hielo, y se añadieron
48 \mul de tampón de hibridación por porta. Después de mezclar
mediante agitación vigorosa, se añadieron 50 \mul de P3 a 50
\mul de solución de prehibridacicón sobre el porta. Los
portaobjetos se incubaron durante toda la noche a 55ºC.
Se realizaron dos lavados durante 10 minutos con
2XSSC, EDTA a temperatura ambiente (400 ml de 20XSSC + 16 ml de
EDTA 0,25 M, Vf= 4L), seguido de un tratamiento con ARNsa a 37ºC
durante 30 minutos (500 \mul de 10 mg/ml en 250 ml de tampón
ARNsa = 20 mg/ml). Los portas se lavaron 2x10 min con 2XSSC, EDTA a
temperatura ambiente. Las condiciones de astringencia del lavado
fueron las siguientes: 2 horas a 55ºC, 0,1 SSC, EDTA (20 ml de
20XSSC + 16 ml de EDTA, V_{f}=4 l).
El análisis in situ se realizó con
diversas secuencias de ADN descritas en la patente europea EP
99912321.9. Los oligonucleótidos utilizados para estos análisis se
derivaron de secuencias de nucleótidos descritas en la patente
europea 99912321.9 y por lo general tuvieron una longitud de 40 a 55
nucleótidos.
Los siguientes materiales se han depositado en
el American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, MD, USA (ATCC):
Material | Número Dep. ATCC | Fecha del depósito |
DNA40571-1315 | ATCC 209784 | 21 de abril de 1998 |
Este depósito se realizó de acuerdo con la
normativa del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento
Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos de
Procedimientos de Patentes y de la Regulación que se contempla
(Tratado de Budapest). Ello asegura el mantenimiento de un cultivo
viable del depósito durante 30 años desde la fecha del depósito.
Los depósitos estarán disponibles por el ATCC bajo los términos del
tratado de Budapest y sometidos a un acuerdo entre Genentech, Inc.
Y ATCC, que asegure la disponibilidad permanente y no restringida
de la progenie del cultivo del depósito para el público tras la
emisión de la patente americana pertinente o tras que sea accesible
al público cualquier patente americana o europea, que la preceda, y
asegure la disponibilidad de la progenie a uno determinado por el
de acuerdo con el 35USC \NAK122 y las normas del Comisionado de
Patentes y Marcas (incluyendo 37 CFR\NAK1,14 con la referencia
especial a 886 OG 638).
El cesionario de la presente solicitud está de
acuerdo que si el cultivo de los materiales en depósito perece, se
pierde o se destruye cuando se cultiva en las condiciones adecuadas,
los materiales se reemplazarán en la mayor prontitud posible con
otro similar. La disponibilidad del material depositado no debe
considerarse como una licencia para practicar la invención en
contravención de los derechos garantizados bajo la autoridad de
cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes.
La memoria escrita en la presente invención se
considera suficiente para que un experto en la materia ponga en
práctica la invención. La presente invención no limita su ámbito por
la construcción depositada, ya que la realización depositada se
considera una ilustración de ciertos aspectos de la invención y
cualquier construcción que sea equivalente funcionalmente se halla
dentro del ámbito de la presente invención. El depósito de
materiales no constituye una admisión de que la descripción aquí
descrita sea inadecuada para permitir la práctica de cualquier
aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de realización,
tampoco debe considerarse como limitante del ámbito de las
reivindicaciones con las ilustraciones específicas que se
representan. Incluso, diversas modificaciones de la invención,
además de las aquí mostradas y descritas, serán evidentes a los
expertos en la materia a partir de la descripción presente y se
hallan por tanto dentro del ámbito de las reivindicaciones
anexadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante se muestra únicamente para conveniencia del lector. No
forma parte del documento de Patente Europea. Aunque se ha tenido
una gran precaución a la hora de recopilar las referencias, no se
pueden excluir errores u omisiones y la Oficina Europea de Patentes
declina cualquier responsabilidad al respecto.
\bullet US 5536637 A [0003]
\bullet US 4675187 A [0049]
\bullet EP 404097 A [0062]
\bullet WO 9311161 A [0062]
\bullet US 4275149 A [0065]
\bullet US 5364934 A [0069]
\bullet WO 8705330 A [0079]
\bullet US 4640835 A [0081]
\bullet US 4496689 A [0081]
\bullet US 4301144 A [0081]
\bullet US 4670417 A [0081]
\bullet US 4791192 A [0081]
\bullet US 4179337 A [0081]
\bullet WO 8905859 A [0091]
\bullet US 4399216 A [0091]
\bullet DD 266710 [0092]
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\bullet EP 402226 A [0093]
\bullet EP 183070 A [0093]
\bullet EP 244234 A [0093]
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\bullet WO 9100357 A [0093]
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1999-03-08
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<160> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm 000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm 000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm 000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2365
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 571
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgtgctgt gcctcgagcc tgac
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgggcagca gttagcaccg cctc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggctggcatc atcagctttg catcaagctg tgcccaggag gacgc
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtaaaacga cggccagtta aatagacctg caattattaa tct
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggaaacag ctatgaccac ctgcacaccat gcaaatccat t
\hfill41
Claims (29)
1. Ácido nucleico aislado que codifica una
secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad en
la secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura
2, o el complemento de la misma, en el que dicha identidad en la
secuencia se determina sobre la longitud completa de las secuencias
que se comparan.
2. Ácido nucleico según la reivindicación 1,
en el que el nivel de identidad es al menos del 90%.
3. Ácido nucleico según la reivindicación 2,
en el que el nivel de identidad es al menos del 95%.
4. Ácido nucleico según la reivindicación 1,
que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de
aminoácidos mostrada en la figura 2.
5. Ácido nucleico según la reivindicación 1,
que comprende la secuencia codificante de longitud completa de la
secuencia mostrada en la figura 1, o el complemento de la misma.
6. Ácido nucleico según la reivindicación 1,
que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1,
o el complemento de la misma.
7. Ácido nucleico aislado que comprende la
secuencia codificante de longitud completa del inserto de ácido
nucleico (DNA 40571-1315) correspondiente al número
de acceso ATCC 209784.
8. Ácido nucleico aislado que tiene al menos
un 80% de identidad en la secuencia con la secuencia de nucleótidos
codificante mostrada en la figura 1, o el complemento de la misma,
en el que dicha identidad en la secuencia se determina sobre la
longitud completa de las secuencias que se comparan.
9. Vector que comprende el ácido nucleico
según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
10. Vector según la reivindicación 9, unido
operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula
huésped transformada con el vector.
11. Célula huésped que comprende el vector
según la reivindicación 9 o la reivindicación 10.
12. Célula huésped según la reivindicación
11, en el que dicha célula es una célula CHO, una E. Coli o
una célula de levadura.
13. Proceso para la producción de un
polipéptido que comprende el cultivo de la célula huésped según la
reivindicación 11 o la reivindicación 12, en condiciones adecuadas
para la expresión de dicho polipéptido y la recuperación de dicho
polipéptido del cultivo celular.
14. Polipéptido aislado que tiene al menos un
80% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos
mostrada en la figura 2, en el que dicha identidad en la secuencia
se determina sobre la longitud completa de las secuencias que se
comparan.
15. Polipéptido según la reivindicación 14,
que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura
2.
16. Polipéptido según la reivindicación 14,
que consiste en el dominio extracelular de la secuencia de
aminoácidos mostrada en la figura 2, representada por los residuos
de aminoácidos 16 a 571.
17. Polipéptido aislado que tiene al menos un
80% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos
codificada por la secuencia codificante de longitud completa del
inserto de ácido nucleico (DNA 40571-1315)
correspondiente al número de acceso ATCC 209784, en el que dicha
identidad en la secuencia se determina sobre la longitud completa
de las secuencias que se comparan.
18. Polipéptido aislado según la
reivindicación 17, que consiste en la secuencia de aminoácidos
codificada por la secuencia codificante de longitud completa del
inserto de ácido nucleico (DNA 40571-1315)
correspondiente al número de acceso ATCC 209784.
19. Polipéptido según la reivindicación 14 o
la reivindicación 17, en el que el nivel de identidad es al menos
del 90%.
20. Polipéptido según la reivindicación 19,
en el que el nivel de identidad es al menos del 95%.
21. Molécula quimérica que comprende un
polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20,
fusionado con una secuencia de aminoácidos heteróloga.
22. Molécula quimérica según la
reivindicación 21, en la que dicha secuencia de aminoácidos
heteróloga es una secuencia etiqueta con epítopo.
23. Molécula quimérica según la
reivindicación 21, en la que dicha secuencia de aminoácidos
heteróloga es una región Fc de una inmunoglobulina.
24. Anticuerpo que se une específicamente al
polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 15, 16 y
18.
25. Anticuerpo según la reivindicación 24, en
el que dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
26. Anticuerpo según la reivindicación 24, en
el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
27. Anticuerpo según la reivindicación 26, en
el que dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico.
28. Procedimiento para diagnosticar el
cáncer, comprendiendo el procedimiento el ensayo de una muestra de
tejido para la amplificación de un gen que codifica un polipéptido
que tiene la secuencia de aminoácidos de la figura 2 y/o la
sobreexpresión de un polipéptido que tiene la secuencia de
aminoácidos de la figura 2, en el que la amplificación y/o
sobreexpresión es indicativa de que la muestra deriva de un tejido
canceroso, y en el que la muestra es de pulmón o colon.
29. Procedimiento según la reivindicación 28,
en el que la muestra es de pulmón.
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