DE69937756T2

DE69937756T2 - Menschliches Prostasin-ähnliches Protein und dafür kodierende Nukleinsäure

Info

Publication number: DE69937756T2
Application number: DE69937756T
Authority: DE
Inventors: William I. Hillsborough Wood; Audrey San Francisco Goddard; Austin Belmont Gurney; Jean San Mateo Yuan; Kevin P. Darnestown Baker; Jian Princeton New Jersey Chen
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1998-04-23
Filing date: 1999-03-08
Publication date: 2008-12-04
Anticipated expiration: 2019-03-09
Also published as: PT1241251E; DK1241251T3; ATE380864T1; KR20040032927A; KR100515855B1; EP1241251A3; EP1241251A2; ES2298310T3; NZ528696A; DE69937756D1; EP1241251B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Identifikation und Isolation neuer DNA sowie die rekombinante Produktion neuer Polypeptide, die von dieser DNA kodiert werden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Extrazelluläre Proteine spielen eine wichtige Rolle in der Bildung, der Differenzierung und dem Erhalt multizellulärer Organismen. Das Schicksal vieler einzelner Zellen, z. B. Proliferation, Migration, Differenzierung oder Wechselwirkung mit anderen Zellen, wird typischerweise durch Information bestimmt, die von anderen Zellen und/oder der unmittelbaren Umwelt erhalten wurde. Diese Information wird oftmals durch sekretierte Polypeptide übertragen (z. B. mitogene Faktoren, Überlebensfaktoren, zytotoxische Faktoren, Differenzierungsfaktoren, Neuropeptide und Hormone), die wiederum von verschiedenen Zellrezeptoren oder membrangebundenen Proteinen erhalten und interpretiert werden. Diese sekretierten Polypeptide oder Signalmoleküle passieren normalerweise den zellulären Sekretionsweg, um ihren Wirkungsort in der extrazellulären Umwelt zu erreichen.
Sekretierte Proteine besitzen verschiedene gewerbliche Anwendungen, unter anderem Pharmazeutika, Diagnostika, Biosensoren und Bioreaktoren. Die meisten im Moment erhältlichen Protein-Arzneimittel, wie z. B. thrombolytische Mittel, Interferone, Interleukine, Erythropoietine, koloniestimulierende Faktoren und verschiedene andere Zytokine, sind sekretorische Proteine. Ihre Rezeptoren, bei denen es sich um Membranproteine handelt, besitzen ebenso Potential als therapeutische oder diagnostische Mittel. Es werden sowohl von der Industrie als auch von der akademischen Welt Anstrengungen unternommen, um neue, native, sekretierte Proteine zu identifizieren. Viele Anstrengungen haben als Fokus das Screening rekombinanter Säugetier-DNA-Bibliotheken, um die kodierenden Sequenzen für neue, sekretierte Proteine zu identifizieren. Beispiele für Screeningverfahren und -techniken werden in der Literatur beschrieben [siehe z. B. Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 7108–7113 (1996); US-Patent Nr. 5.536.637 ].
Membrangebundene Proteine und Rezeptoren können eine wichtige Rolle in der Bildung, der Differenzierung und dem Erhalt multizellulärer Organismen spielen. Die Bestimmung vieler einzelner Zellen, z. B. Proliferation, Migration, Differenzierung oder Wechselwirkung mit anderen Zellen, wird typischerweise durch Information bestimmt, die von anderen Zellen und/oder der unmittelbaren Umwelt erhalten wurde. Diese Information wird oftmals durch sekretierte Polypeptide übertragen (z. B. mitogene Faktoren, Überlebensfaktoren, zytotoxische Faktoren, Differenzierungsfaktoren, Neuropeptide und Hormone), die wiederum von verschiedenen Zellrezeptoren oder membrangebundenen Proteinen erhalten und interpretiert werden. Solche membrangebundenen Proteine und Zellrezeptoren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Zytokin-Rezeptoren, Rezeptor-Kinasen, Rezeptor-Phosphatasen, Rezeptoren, die in Zell-Zell-Wechselwirkungen involviert sind, sowie zelluläre Adhäsin-Moleküle, wie z. B. Selektine und Integrine. Die Übertragung von Signalen, die Zellwachstum und – differenzierung regulieren, wird z. B. teilweise durch Phosphorylierung verschiedener zellulärer Proteine reguliert. Protein-Tyrosin-Kinasen, Enzyme, die diesen Prozess katalysieren, können ebenfalls als Wachstumsfaktor-Rezeptoren fungieren. Beispiele umfassen den Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor und den Nerven-Wachstumsfaktor-Rezeptor.
Membrangebundene Proteine und Rezeptor-Moleküle besitzen verschiedene gewerbliche Anwendungsbereiche, unter anderem als pharmazeutische und diagnostische Mittel. Rezeptor-Immunoadhäsine z. B. können als therapeutische Mittel verwendet werden, um die Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung zu blockieren. Die membrangebundenen Proteine können auch zum Screening potentieller Peptid- oder Kleinmolekül-Inhibitoren der relevanten Rezeptor/Ligand-Wechselwirkung verwendet werden. Es werden sowohl von der Industrie als auch von der akademischen Welt Anstrengungen unternommen, um neue, native Rezeptorproteine zu identifizieren. Viele Anstrengungen haben als Fokus das Screening rekombinanter Säugetier-DNA- Bibliotheken, um die kodierenden Sequenzen für neue Rezeptorproteine zu identifizieren.
Hierin beschreiben die Erfinder die Identifikation sowie die Charakterisierung von neuen sekretierten sowie von Transmembran-Polypeptiden und neuen Nucleinsäuren, die für diese Polypeptide kodieren.
PRO351
Prostasin ist eine neue menschliche Serin-Proteinase, die aus menschlicher Samenflüssigkeit gereinigt wurde. Die immunohistochemische Lokalisierung zeigt, dass Prostasin in Epithelzellen und Gängen der Prostata vorhanden ist. Die cDNA für Prostasin wurde kloniert und charakterisiert. Eine Southern-Blot-Analyse, und zwar nach einer Umkehrtranskriptions-Polymerasekettenreaktion, zeigt, dass Prostasin-mRNA in Prostata-, Leber-, Speicheldrüsen-, Nieren-, Lungen-, Pankreas-, Kolon-, Bronchien-Zellen, in proximalen tubulären Nierenzellen sowie in Prostatakarzinom-LNCaP-Zellen exprimiert wird. Die zelluläre Lokalisierung von Prostasin-mRNA wurde in Epithelzellen der menschlichen Prostata mittels In-situ-Hybridisierungs-Histochemie identifiziert [siehe z. B. Yu et al., J. Biol. Chem. 269 (29), 18843–18848 (1994); sowie Yu et al., J. Biol. Chem. 270 (22), 13483–3489 (1994)].
Daher sind Prostasin und damit verwandte Moleküle besonders für Studium, Diagnose und Behandlung medizinischer Zustände der Prostata von Interesse. Prostasin und verwandte Moleküle werden weiters in Yu et al., Genomics 32 (3), 334–340 (1996), beschrieben. Hierin beschreiben die Erfinder die Identifikation sowie die Charakterisierung neuer Polypeptide mit einer Homologie zu Prostasin, hierin als PRO351-Polypeptide bezeichnet.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
PRO351
Die Anmelder haben einen cDNA-Klon identifiziert, der für ein neues Polypeptid mit einer Sequenzähnlichkeit zu Prostasin kodiert, worin das Polypeptid in der vorliegenden Anmeldung als „PRO351" bezeichnet wird.
In einer Ausführungsform, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäure-Molekül bereit, umfassend DNA, die für ein PRO351-Polypeptid kodiert. In einem Aspekt umfasst die isolierte Nucleinsäure DNA, die für das PRO351-Polypeptid mit den Aminosäureresten 1 bis 571 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) kodiert oder zu solch einer kodierenden Nucleinsäuresequenz komplementär ist, und bleibt unter zumindest moderaten und gegebenenfalls hohen Stringenz-Bedingungen stabil an diese gebunden. In einem anderen Aspekt umfasst die isolierte Nucleinsäure DNA, die für das PRO351-Polypeptid mit Aminosäureresten von etwa 16 bis 571 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) kodiert oder zu solch einer kodierenden Nucleinsäuresequenz komplementär ist, und bleibt unter zumindest moderaten und gegebenenfalls hohen Stringenz-Bedingungen stabil an diese gebunden. Die isolierte Nucleinsäuresequenz kann das cDNA-Insert des DNA40571-1315-Vektors umfassen, der am 21. April 1998 als ATCC 209784 hinterlegt wurde, wobei dieses die für PRO351 kodierende Nucleotidsequenz umfasst.
In einer anderen Ausführungsform, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die Erfindung isoliertes PRO351-Polypeptid bereit. Insbesondere stellt die Erfindung isoliertes Nativsequenz-PRO351-Polypeptid bereit, das in einer Ausführungsform eine Aminosäuresequenz umfasst, welche die Reste 1 bis 571 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) umfasst. In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein isoliertes PRO351-Polypeptid ohne die Signalsequenz bereit, wobei dieses eine Aminosäuresequenz umfasst, welche die Reste von etwa 16 bis 571 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) umfasst. Das PRO351-Polypeptid wird gegebenenfalls erhalten oder ist erhältlich, indem das vom cDNA-Insert des DNA40571-1315-Vektors, der am 21. April 1998 als ATCC 209784 hinterlegt wurde, kodierte Polypeptid exprimiert wird.
Zusätzliche Ausführungsformen
In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die Erfindung Vektoren bereit, welche DNA umfassen, die für beliebige der oben oder unten stehend beschriebenen Polypeptide kodieren. Es wird ebenfalls eine Wirtszelle bereitgestellt, die einen beliebigen solchen Vektor umfasst. Die Wirtszellen können z. B. CHO-Zellen, E.-coli-Zellen oder Hefe-Zellen sein. Ein Verfahren zur Herstellung beliebiger der oben oder unten stehend beschriebenen Polypeptide wird weiters bereitgestellt und umfasst das Züchten von Wirtszellen unter Bedingungen, die für die Expression des gewünschten Polypeptids geeignet sind, sowie die Gewinnung des gewünschten Polypeptids aus der Zellkultur.
In anderen Ausführungsformen, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die Erfindung chimäre Moleküle bereit, umfassend beliebige der oben oder unten stehend beschriebenen Polypeptide, die an ein heterologes Polypeptid oder eine Aminosäuresequenz fusioniert sind. Ein Beispiel eines solchen chimären Moleküls umfasst beliebige der oben oder unten stehend beschriebenen Polypeptide, die an eine Epitopmarkierungssequenz oder eine Fc-Region eines Immunglobulins fusioniert sind.
In anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung einen Antikörper bereit, wie in den Ansprüchen definiert. Gegebenenfalls handelt es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 1) einer Nativsequenz-PRO351-cDNA, worin Seq.-ID Nr. 1 ein Klon ist, der hierin als „UNQ308" und/oder „DNA40571-1315" bezeichnet wird.
2 zeigt die Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2), die von der kodierenden Sequenz von Seq.-ID Nr. 1, gezeigt in 1, abstammt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
I. Definitionen
Die Ausdrücke „PRO-Polypeptid" und „PRO" beziehen sich bei Verwendung hierin und wenn sie sofort von einer numerischen Benennung gefolgt werden, auf verschiedene Polypeptide, worin sich die vollständige Benennung (d. h. PRO/Nummer) auf spezifische Polypeptidsequenzen bezieht, wie hierin beschrieben. Die Ausdrücke „PRO/Nummer-Polypeptid" und „PRO/Nummer" umfassen bei Verwendung hierin Nativsequenz-Polypeptide und Polypeptid-Varianten (die hierin weiters definiert sind). Die hierin beschriebenen PRO-Polypeptide können aus einer Reihe an Quellen isoliert werden, wie z. B. aus menschlichen Gewebstypen oder aus einer anderen Quelle, oder sie können mittels Rekombinations- oder Syntheseverfahren hergestellt werden.
Ein „Nativsequenz-PRO-Polypeptid" umfasst ein Polypeptid mit derselben Aminosäuresequenz wie das entsprechende, aus der Natur stammende PRO-Polypeptid. Solche Nativsequenz-PRO-Polypeptide können aus der Natur isoliert werden oder können mittels Rekombinations- oder Syntheseverfahren hergestellt werden. Der Ausdruck „Nativsequenz-PRO-Polypeptid" umfasst spezifisch natürlich vorkommende, trunkierte oder sekretierte Formen des spezifischen PRO-Polypeptids (z. B. eine extrazelluläre Domänensequenz), natürlich auftretende Variantenformen (z. B. alternativ, gespleißte Formen) sowie natürlich auftretende Allel-Varianten des Polypeptids. In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung handelt es sich bei dem Nativsequenz-PRO351-Polypeptid um ein reifes oder Volllängen-Nativsequenz-PRO351-Polypeptid, umfassend die Aminosäuren 1 bis 571 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2).
Die „extrazelluläre Domäne" oder „ECD" eines PRO-Polypeptids bezieht sich auf eine Form des PRO-Polypeptids, die im Wesentlichen frei von Transmembran- oder zytoplasmatischen Domänen ist. Für gewöhnlich wird eine PRO-Polypeptid-ECD weniger als 1% derartige Transmembran- und/oder zytoplasmatische Domänen aufweisen und wird vorzugsweise weniger als 0,5% derartige Domänen aufweisen. Es versteht sich, dass jegliche für die PRO-Polypeptide der vorliegenden Erfindung identifizierte Transmembrandomänen gemäß Kriterien identifiziert werden, die auf dem Gebiet der Erfindung zur Identifizierung dieses Typs einer hydrophoben Domäne routinemäßig angewendet werden. Die genauen Begrenzungen einer Transmembrandomäne können variieren, jedoch höchstwahrscheinlich um nicht mehr als ungefähr 5 Aminosäuren an beiden Enden der anfänglich identifizierten Domäne. Gegebenenfalls kann eine extrazelluläre Domäne eines PRO-Polypeptids ungefähr 5 oder weniger Aminosäuren der beiden Enden der anfänglich identifizierten Transmembrandomäne enthalten.
Unter „PRO-Polypeptidvariante" wird ein oben oder unten definiertes aktives PRO-Polypeptid verstanden, das zumindest ungefähr 80% Aminosäuresequenzidentität mit der hierin offenbarten Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz voller Länge aufweist. Derartige PRO-Polypeptidvarianten umfassen beispielsweise PRO-Polypeptide, worin ein oder mehrere Aminosäurereste am N- oder C-Terminus der nativen Aminosäuresequenz voller Länge addiert oder deletiert sind. Für gewöhnlich wird eine PRO-Polypeptidvariante zumindest ungefähr 80% Aminosäuresequenzidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 85% Aminosäuresequenzidentität und noch bevorzugter zumindest ungefähr 90% Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest ungefähr 91% Aminosäuresequenzidentität, sogar noch bevorzugter zumindest ungefähr 92% Aminosäuresequenzidentität, sogar noch bevorzugter zumindest, ungefähr 93% Aminosäuresequenzidentität, sogar noch bevorzugter zumindest ungefähr 94% Aminosäuresequenzidentität, sogar noch bevorzugter zumindest ungefähr 95% Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest ungefähr 96% Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest ungefähr 97% Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest ungefähr 98% Aminosäuresequenzidentität und insbesondere bevorzugt zumindest ungefähr 99% Aminosäure sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz der hierin offenbarten nativen Aminosäuresequenz voller Länge aufweisen.
„Prozent (%) Aminosäuresequenzidentität" bezüglich der hierin identifizierten PRO-Polypeptidsequenzen ist als prozentueller Anteil an Aminosäureresten in einer Kandidatsequenz definiert, der mit den Aminosäureresten in der speziellen PRO-Polypeptidsequenz identisch ist, und zwar nach Angleichung der Sequenzen und Einführung von Lücken, die erforderlichenfalls notwendig ist, um die maximale prozentuelle Sequenzidentität zu erzielen, wobei jegliche konservative Substitutionen als Teil der Sequenzidentität unberücksichtigt bleiben. Eine Angleichung zum Zwecke der Ermittlung der prozentuellen Aminosäuresequenzidentität kann auf verschiedene Weisen erzielt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung gebräuchlich sind, beispielsweise die Verwendung von öffentlich erhältlicher Computersoftware, wie z. B. BLAST-, BLAST-2-, ALIGN- oder Megalign-Software (DNASTAR). Das bevorzugte Angleichungs-Softwareprogramm ist BLAST. Der Fachkundige auf dem Gebiet der Erfindung kann die geeigneten Parameter zur Messung der Angleichung ermitteln, einschließlich jeglicher Algorithmen, die zur Erzielung der maximalen Angleichung über die volle Länge von zu vergleichenden Sequenzen notwendig sind. Die hierin verwendeten %-Werte der Identität sind unter Verwendung des WU-BLAST-2-Computerprogramms (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460–480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/README.html) erzeugt worden. Die meisten der WUBLAST-2-Suchparameter wurden auf die Vorgabewerte gesetzt. Die einstellbaren Parameter wurden auf die folgenden Werte gesetzt: Overlap span = 1, overlap fraction = 0,125, word threshold (T) = 11 und scoring matrix = BLOSUM62. Die HSP-S- und HSP-S2-Parameter, die dynamische, von BLAST-2 verwendete Werte sind, werden von Programm selbst festgelegt, und zwar in Abhängigkeit von der Zusammensetzung der Sequenz von Interesse und der Zusammensetzung der Datenbank, gegen die die Sequenz durchsucht wird. Jedoch können die Werte eingestellt werden, um die Empfindlichkeit zu erhöhen. Der Wert für die% Sequenzidentität wird als Anteil übereinstimmender identischer Reste, geteilt durch die Gesamtzahl von Resten in der angeglichenen Region, ermittelt.
„Prozentuelle (%) Nucleinsäuresequenzidentität” in Bezug auf hierin identifizierte, für PRO kodierende Nucleinsäuresequenzen ist als prozentueller Anteil an Nucleotiden in einer Kandidatsequenz definiert, der mit den Nucleotiden in der PRO-Nucleinsäuresequenz von Interesse identisch ist, und zwar nach Angleichung der Sequenzen und Einführung von Lücken, die erforderlichenfalls zur Erzielung der maximalen prozentuellen Sequenzidentität notwenig ist. Eine Angleichung zum Zwecke der Ermittlung der prozentuellen Aminosäuresequenzidentität kann auf verschiedene Weisen erzielt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung gebräuchlich sind, beispielsweise die Verwendung von öffentlich erhältlicher Computersoftware, wie z. B. BLAST-, BLAST-2-, ALIGN- oder Megalign-Software(DNASTAR). Der Fachkundige auf dem Gebiet der Erfindung kann die geeigneten Parameter zur Messung der Angleichung ermitteln, einschließlich jeglicher Algorithmen, die zur Erzielung der maximalen Angleichung über die volle Länge von zu vergleichenden Sequenzen notwendig sind. Die hierin verwendeten Identitätswerte wurden vom BLASTN-Modul des auf Vorgabeparameter eingestellten WU-BLAST-2 erzeugt, wobei „overlap span" und „overlap fraction" auf 1 bzw. 0,125 eingestellt waren.
Der Ausdruck „Positive" im Zusammenhang mit dem wie oben beschrieben durchgeführten Sequenzvergleich umfasst Reste in den verglichenen Sequenzen, die nicht identisch sind, jedoch ähnliche Eigenschaften aufweisen (z. B. als Ergebnis konservativer Substitutionen). Der %-Wert an Positiven wird als Anteil der in der BLOSUM-62-Matrix mit einem positiven Wert bewerteten Reste, geteilt durch die Gesamtzahl an Resten in der angeglichenen Region, wie oben definiert ermittelt.
Der Ausdruck „epitopmarkiert" bezieht sich bei Verwendung hierin auf ein chimäres Polypeptid, das ein PRO-Polypeptid oder eine Domänensequenz davon umfasst, das/die an ein „Markerpolypeptid" fusioniert ist. Das Markerpolypeptid weist eine ausreichende Anzahl von Resten auf, um ein Epitop bereitzustellen, gegen das ein Antikörper hergestellt werden kann, oder das mit irgendeinem anderen Mittel identifiziert werden kann, ist jedoch ausreichend kurz, so dass es die Aktivität des PRO-Polypeptids von Interesse nicht stört. Das Markerpolypeptid ist vorzugsweise ziemlich einzigartig, so dass der Antikörper nicht wesentlich mit anderen Epitopen kreuz reagiert. Geeignete Markerpolypeptide weisen im Allgemeinen zumindest sechs Aminosäurereste und üblicherweise zwischen ungefähr 8 und ungefähr 50 Aminosäurereste (vorzugsweise zwischen ungefähr 10 bis ungefähr 20 Reste) auf.
Unter „isoliert" wird bei Verwendung zur Beschreibung der hierin offenbarten verschiedenen Polypeptide ein Polypeptid verstanden, das identifiziert und aus einer Komponente seiner natürlichen Umgebung abgetrennt und/oder gewonnen worden ist. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die typischerweise diagnostische oder therapeutische Verwendungen für das Polypeptid stören würden, und können Enzyme, Hormone und andere proteinartige oder nicht proteinartige Gelöststoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Polypeptid gereinigt, und zwar (1) auf ein Ausmaß, das ausreicht, um zumindest 15 Reste der N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz bei Verwendung eines Zentrifugenröhrchen-Sequenzierers („spinning cup sequenator”) zu erhalten, oder (2) bis zur Homogenität mittels SDS-PAGE unter nicht reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau oder, vorzugsweise, Silberfärbung. Ein isoliertes Polypeptid umfasst ein Polypeptid in situ in rekombinanten Zellen, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des PRO-Polypeptids nicht vorhanden sein wird. Für gewöhnlich wird jedoch ein isoliertes Polypeptid durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
Eine für ein „isoliertes" PRO-Polypeptid kodierende Nucleinsäure ist ein Nucleinsäuremolekül, das identifiziert und von zumindest einem verunreinigenden Nucleinsäuremolekül abgetrennt ist, mit dem es für gewöhnlich in der natürlichen Quelle der PRO-Polypeptid-Nucleinsäure assoziiert ist. Ein isoliertes PRO-Polypeptid-Nucleinsäuremolekül liegt in einer anderen Form oder in einem anderen Milieu als in der Natur vor. Isolierte PRO-Polypeptid-Nucleinsäuremoleküle unterscheiden sich daher vom speziellen PRO-Polypeptid-Nucleinsäuremolekül, wie es in natürlichen Zellen vorliegt. Jedoch umfasst ein isoliertes PRO-Polypeptid-Nucleinsäuremolekül PRO-Polypeptid-Nucleinsäuremoleküle, die in Zellen enthalten sind, die für gewöhnlich das PRO-Polypeptid exprimieren, wo sich beispielsweise das Nucleinsäuremolekül an einem Chromosomenort befindet, der sich von dem natürlicher Zellen unterscheidet.
Der Ausdruck „Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die zur Expression einer operabel gebundenen kodierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig sind. Die für Prokaryoten geeigneten Kontrollsequenzen umfassen beispielsweise einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz und eine Ribosombindungsstelle. Eukaryotische Zellen setzen bekannterweise Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer ein.
Eine Nucleinsäure ist „operabel gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung zu einer weiteren Nucleinsäuresequenz gesetzt wird. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder für einen Sekretionsleader operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als ein Präprotein exprimiert wird, das sich an der Sekretion des Polypeptids beteiligt; ein Promotor oder Enhancer ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosombindungsstelle ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass die Translation erleichtert wird. Im Allgemeinen bedeutet „operabel gebunden", dass die verbundenen DNA-Sequenzen zusammenhängend und im Falle eines Sekretionsleaders zusammenhängend und in Lesephase sind. Jedoch müssen Enhancer nicht zusammenhängend sein. Die Bindung wird durch Ligation an zweckdienlichen Restriktionsstellen erzielt. Falls derartige Stellen nicht vorhanden sind, werden die synthetischen Oligonucleotidadaptoren oder Linker gemäß herkömmlicher Praxis verwendet.
Der Ausdruck „Antikörper" wird in weitesten Sinne verwendet und umfasst im Speziellen einzelne monoklonale Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper (einschließlich Agonisten-, Antagonisten- und neutralisierende Antikörper) und Anti-PRO-Polypeptid-Antikörperzusammensetzungen mit polyepitopischer Spezifität. Der Ausdruck „monoklonaler Antikörper" bezieht sich bei Verwendung hierin auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten wurde, d. h. die einzelnen, die Population umfassenden Antikörper sind identisch mit Aus nahme von möglichen natürlich vorkommenden Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können.
„Aktiv" oder „Aktivität" bezieht sich zu den Zwecken hierin auf (eine) Form(en) eines Polypeptids, welche die biologischen und/oder immunologischen Aktivitäten des speziellen nativen oder natürlich vorkommenden PRO-Polypeptids beibehält/beibehalten.
„Behandlung" oder „behandeln" bezieht sich auf therapeutische Behandlung sowie prophylaktische oder vorbeugende Maßnahmen. Jene, die einer Behandlung bedürfen, umfassen jene, bei denen die Störung bereits vorliegt, sowie jene, die für die Störung anfällig sind, oder jene, bei denen die Störung zu verhindern ist.
„Säugetier" zum Zwecke der Behandlung bezieht sich auf jegliches als Säugetier klassifiziertes Tier, einschließlich Menschen, Haus- und Nutztiere und Zoo- oder Sporttiere, wie z. B. Schafe, Hunde, Pferde, Katzen, Rinder und dergleichen. Vorzugsweise ist das Säugetier hierin ein Mensch.
Wie hierin verwendet, umfassen „Träger" pharmazeutisch annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren, die für die damit exponierte Zelle oder das damit exponierte Säugetier bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch sind. Häufig ist der physiologisch annehmbare Träger eine wässrige pH-gepufferte Lösung. Beispiele physiologisch annehmbarer Träger umfassen Puffer, wie z. B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien, einschließlich Ascorbinsäure; niedermolekulare (weniger als ungefähr 10 Reste) Polypeptide; Proteine, wie z. B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile, Polymere, wie z. B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z. B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner, wie z. B. EDTA; Zuckeralkohole, wie z. B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie z. B. Natrium; und/oder nichtionische Tenside, wie z. B. TWEEN^TM, Polyethylenglykol (PEG) und PLURONICS^TM.
Der Ausdruck „Agonist" wird verwendet, um sich auf Peptid- oder Nicht-Peptid-Analoga der nativen PRO-Polypeptide (wobei sich natives PRO-Polypeptid auf Pro-PRO-Polypeptid, Prä-PRO-Polypeptid, Präpro-PRO-Polypeptid oder reifes PRO-Polypeptid bezieht) der vorliegenden Erfindung und auf Antikörper zu beziehen, die solche nativen PRO-Polypeptide spezifisch binden, und zwar unter der Voraussetzung, dass sie zumindest eine biologische Aktivität eines nativen PRO-Polypeptids beibehalten. Vorzugsweise behalten die Agonisten der vorliegenden Erfindung die qualitativen Bindungserkennungseigenschaften und Rezeptoraktivierungseigenschaften des nativen PRO-Polypeptids bei.
Der Ausdruck „Antagonist" wird verwendet, um sich auf ein Molekül zu beziehen, das eine biologische Aktivität eines nativen PRO-Polypeptids der vorliegenden Erfindung hemmt, worin sich natives PRO-Polypeptid auf Pro-PRO-Polypeptid, Prä-PRO-Polypeptid, Präpro-PRO-Polypeptid oder reifes PRO-Polypeptid bezieht. Vorzugsweise hemmen die Antagonisten hierin die Bindung eines nativen PRO-Polypeptids der vorliegenden Erfindung an einen Bindungspartner. Ein PRO-Polypeptid-„Antagonist” ist ein Molekül, das eine PRO-Antagonist-Effektorfunktion verhindert oder diese stört (z. B. ein Molekül, das die Bindung und/oder Aktivierung eines PRO-Polypeptid-Rezeptors durch PRO-Polypeptid verhindert oder diese stört). Solche Moleküle können auf ihre Fähigkeit hin gescreent werden, die PRO-Polypeptid-Rezeptoraktivierung kompetitiv zu hemmen, indem beispielsweise die Bindung des nativen PRO-Polypeptids in Gegenwart und Abwesenheit des Test-Antagonistenmoleküls gemessen wird. Ein Antagonist der Erfindung umfasst außerdem ein Antisense-Polynucleotid gegen das PRO-Polypeptid-Gen, wobei das Antisense-Polynucleotid die Transkription oder Translation des PRO-Polypeptid-Gens blockiert, wodurch seine Expression und biologische Aktivität gehemmt wird.
Die „Stringenz" von Hybridisierungsreaktionen ist vom Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung leicht zu bestimmen und ist im Allgemeinen eine empirische Berechnung, die von der Sondenlänge, Waschtemperatur und Salzkonzentration abhängt. Im Allgemeinen erfordern längere Sonden höhere Temperaturen für die richtige Anellierung, während kürzere Sonden niedrigere Temperaturen benötigen. Die Hybridisie rung hängt im Allgemeinen von der Fähigkeit denaturierter DNA zur Reanellierung ab, wenn komplementäre Stränge in einer Umgebung unter ihrer Schmelztemperatur vorhanden sind. Je höher der Grad an gewünschter Homologie zwischen der Sonde und der hybridisierbaren Sequenz, desto höher die jeweilige Temperatur, die verwendet werden kann. Als Ergebnis folgt, dass höhere jeweilige Temperaturen dazu tendieren, die Reaktionsbedingungen stringenter zu machen, während niedrigere Temperaturen dies weniger tun. Für weitere Einzelheiten und Erläuterungen von Stringenz und Hybridisierungsreaktionen siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995).
„Stringente Bedingungen" bedeutet (1) den Einsatz niedriger Ionenstärke und hoher Temperatur zum Waschen, beispielsweise 0,015 Natriumchlorid/0,0015 M Natriumcitrat/0,1% Natriumdodecylsulfat bei 50°C, oder (2) den Einsatz eines Denaturierungsmittels, wie z. B. Formamid, während der Hybridisierung, beispielsweise 50 Vol.-% Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 nM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C. Ein weiteres Beispiel ist die Verwendung von 50% Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6/8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt-Lösung, beschallte Lachsspermien-DNA (50 μg/ml), 0,1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42°C mit Waschungen bei 42°C in 0,2 × SSC und 0,1% SDS. Noch ein weiteres Beispiel ist die Hybridisierung unter Verwendung eines Puffers von 10% Dextransulfat, 2 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat) und 50% Formamid bei 55°C, gefolgt von einem hoch stringenten Waschvorgang, bestehend aus EDTA enthaltendem 0,1 × SSC bei 55°C.
„Mäßig stringente Bedingungen" werden in Sambrook et al., s. o., beschrieben und, umfassen die Verwendung einer Waschlösung und Hybridisierungsbedingungen (z. B. Temperatur, Ionenstärke und % SDS), die weniger stringent als die oben beschriebenen sind. Ein Beispiel von mäßig stringenten Bedingungen ist eine Bedingung wie z. B. die Inkubation über Nacht bei 37°C in einer Lösung, umfassend: 20% Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10% Dextransulfat und 20 mg/ml denaturierte gescherte Lachsspermien-DNA, gefolgt vom Waschen der Filter in 1 × SSC bei ungefähr 37–50°C. Der Fachkundige wird erkennen, wie Temperatur, Ionenstärke usw. erforderlichenfalls einzustellen sind, um Faktoren, wie z. B. der Sondenlänge und dergleichen, Rechnung zu tragen.
„Southern-Analyse" oder „Southern-Blotting" ist ein Verfahren, mit dem die Gegenwart von DNA-Sequenzen in einem Restriktionsendonucleaseverdau von DNA oder einer DNA enthaltenden Zusammensetzung durch Hybridisierung an ein bekanntes, markiertes Oligonucleotid oder DNA-Fragment bestätigt wird. Die Southern-Analyse umfasst typischerweise die elektrophoretische Trennung von DNA-Verdauungen an Agarosegelen, die Denaturierung der DNA nach elektrophoretischer Trennung und den Transfer der DNA auf Nitrozellulose, Nylon oder auf einen anderen geeigneten Membranträger zur Analyse mit einer radioaktiv markierten, biotinylierten oder enzymmarkierten Sonde, wie in den Abschnitten 9.37–9.52 von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989), beschrieben wird.
„Northern-Analyse" oder „Northern-Blotting" ist ein Verfahren, dass zur Identifizierung von RNA-Sequenzen verwendet wird, die an eine bekannte Sonde, wie z. B. an ein Oligonucleotid, DNA-Fragment, eine cDNA oder ein Fragment davon oder an ein RNA-Fragment, hybridisieren. Die Sonde ist mit einem Radioisotop, wie z. B. ³²P, oder mittels Biotinylierung oder mit einem Enzym markiert. Die zu analysierende RNA wird üblicherweise an einem Agarosegel oder Polyacrylamidgel elektrophoretisch getrennt, auf Nitrozellulose, Nylon oder auf eine andere geeignete Membran transferiert und mit der Sonde hybridisiert, und zwar unter Verwendung von Standardtechniken, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind, wie z. B. jenen, die in den Abschnitten 7.39–7.52 von Sambrook et al., s. o., beschrieben werden.
Wie hierin verwendet, bezeichnet „Immunoadhäsin" antikörperartige Moleküle, welche die Bindungsspezifität eines heterologen Proteins (eines „Adhäsins") mit der Effektorfunktion von Immunglobulin-Konstantdomänen vereinigen. Strukturell umfassen Immunoadhäsine eine Fusion einer Aminosäuresequenz mit der gewünschten Bin dungsspezifität, die nicht die Antigenerkennungs- und Bindungsstelle eines Antikörpers ist (d. h. sie ist „heterolog"), mit einer Immunglobulin-Konstantdomänensequenz. Der Adhäsin-Abschnitt eines Immunoadhäsinmoleküls ist typischerweise eine zusammenhängende Aminosäuresequenz, die zumindest die Bindungsstelle eines Rezeptors oder eines Liganden umfasst. Die Immunglobulin-Konstantdomänensequenz im Immunoadhäsin kann von jedem Immunglobulin, wie z. B. von IgG-1-, IgG-2-, IgG-3- oder IgG-4-Subtypen, IgA (einschließlich IgA-1 und IgA-2), IgE, IgD oder IgM, erlangt werden.
„Chronische" Verabreichung bezieht sich auf die Verabreichung des/der Mittel(s) auf kontinuierliche Weise im Gegensatz zu einer akuten Weise, so dass die anfängliche therapeutische Wirkung (Aktivität) für einen verlängerten Zeitraum aufrechterhalten wird. „Periodische" Verabreichung ist eine Behandlung, die nicht fortlaufend ohne Unterbrechung erfolgt, sondern zyklischer Natur ist.
Verabreichung „in Kombination mit" einem oder mehreren weiteren therapeutischen Mitteln umfasst simultane (gleichzeitige) und aufeinander folgende Verabreichung in beliebiger Reihenfolge.
Der Ausdruck „Expressionsvektor" wird verwendet, um einen Vektor zu definieren, in dem eine für ein PRO-Polypeptid hierin kodierende Nucleinsäure operabel an Kontrollsequenzen gebunden ist, die fähig sind, seine Expression in einer geeigneten Wirtszelle zu bewirken. Vektoren tragen für gewöhnlich eine Replikationsstelle (obgleich sie nicht notwendig ist, wo eine chromosomale Integration auftritt). Expressionsvektoren umfassen außerdem Markersequenzen, die fähig sind, für die phänotypische Selektion in transformierten Zellen zu sorgen. Beispielsweise wird E. coli typischerweise unter Verwendung von pBR322 transformiert, einem Plasmid, das aus einer E.-coli-Spezies stammt (Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und stellt folglich ein einfaches Mittel zur Identifizierung transformierter Zellen zum Zwecke der Klonierung oder Expression bereit. Expressionsvektoren werden gegebenenfalls Sequenzen enthalten, die zur Kontrolle der Transkription und Translation zweckdienlich sind, z. B. Promotoren und Shine-Dalgarno-Sequenzen (für Prokaryoten) oder Promotoren und Enhancer (für Säugetierzellen). Die Promotoren können, müssen aber nicht, induzierbar sein; es sind sogar leistungsfähige konstitutive Promotoren, wie z. B. der CMV-Promotor für Säugetierwirte, gefunden worden, um LHR ohne Wirtszelltoxizität zu produzieren. Obgleich es denkbar ist, dass Expressionsvektoren keine die Expression kontrollierenden, replikativen Sequenzen oder Selektionsgene enthalten müssen, kann ihr Fehlen die Identifizierung von Hybridtransformanten und die Erzielung einer Hybridimmunglobulinexpression in hohem Ausmaß behindern.
Der Ausdruck „Lipopolysaccharid" oder „LPS" wird hierin als Synonym für "Endotoxin" verwendet. Lipopolysaccharide (LPS) sind charakteristische Komponenten der äußeren Membran von Gram-positiven Bakterien, z. B. Escherichia coli. Sie bestehen aus einem Polysaccharid-Teil und einem Fett, das Lipid A genannt wird. Das Polysaccharid, das unter den Bakterienspezies variiert, ist aus der O-spezifischen Kette (aus wiederholenden Einheiten von drei bis acht Zuckern aufgebaut) und dem zweiteiligen Kern aufgebaut. Lipid A umfasst praktisch immer zwei durch Phosphat modifizierte Glucosaminzucker und eine variable Anzahl von Fettsäuren. Für weitere Informationen siehe beispielsweise Rietschel und Brade, Scientific American, 54–61 (August 1992).
Der Ausdruck „septischer Schock" wird hierin im weitesten Sinne verwendet und umfasst alle Definitionen, die in Bone, Ann. Intern. Med. 114, 332–333 (1991), offenbart sind. Im Speziellen beginnt der septische Schock mit einer systemischen Reaktion auf Infektion, ein Syndrom, das Sepsis genannt wird. Wenn dieses Syndrom in Hypotonie und Organversagen resultiert, wird er septischer Schock genannt. Septischer Schock kann durch Gram-positive Organismen und Pilze ausgelöst werden, sowie, durch Endotoxin enthaltende Gram-positive Organismen. Demgemäß ist die vorliegende Definition nicht auf „Endotoxinschock" eingeschränkt.
Die Ausdrücke „Genamplifikation" und „Genduplikation" werden wechselseitig verwendet und beziehen sich auf einen Prozess, durch den mehrfache Kopien eines Gens oder Genfragments in einer bestimmten Zellen oder Zelllinie gebildet werden.
Die duplizierte Region (ein Abschnitt amplifizierter DNA) wird häufig als „Amplicon" bezeichnet. Üblicherweise erhöht sich die Menge an produzierter Messenger-RNA (mRNA), d. h. das Ausmaß der Genexpression, ebenfalls im Verhältnis zur Anzahl der vom jeweiligen exprimierten Gen hergestellten Kopien.
„Tumor" bezieht sich bei Verwendung hierin auf jede(s) neoplastische Zellwachstum und Vermehrung, ob bös- oder gutartig, und auf alle präkanzerösen und kanzerösen Zellen und Gewebe. Die Ausdrücke „Krebs" und „kanzerös" beziehen sich auf oder beschreiben den physiologischen Zustand in Säugetieren, der typischerweise durch unreguliertes Zellwachstum gekennzeichnet ist. Beispiele von Krebs umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Karzinom, Lymphom, Blastom, Sarkom und Leukämie. Speziellere Beispiele derartiger Krebsformen umfassen Brustkrebs, Prostatakrebs, Darmkrebs, Plattenepithelkarzinom, kleinzelliges Lungenkarzinom, nicht kleinzelliges Lungenkarzinom, Magen-Darm-Krebs, Pankreaskrebs, Glioblastom, Zervixkarzinom, Eierstockkrebs, Leberkrebs, Blasenkrebs, Hepatom, kolorektales Karzinom, Endometriumkarzinom, Speicheldrüsenkarzinom, Nierenkrebs, Vulvakarzinom, Schilddrüsenkrebs, Leberkrebs und verschiedene Arten von Kopf- und Nackenkrebs.
Der Ausdruck „zytotoxisches Mittel" bezieht sich bei Verwendung hierin auf eine Substanz, welche die Funktion von Zellen hemmt oder verhindert und/oder die Zerstörung von Zellen bewirkt. Der Ausdruck umfasst radioaktive Isotope (z. B. I131, I125, Y90 und Re186), chemotherapeutische Mittel und Toxine, wie z. B. enzymatisch aktive Toxine bakteriellen, pilzlichen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs oder Fragmente davon.
Ein „chemotherapeutisches Mittel" ist eine chemische Verbindung, die zur Krebsbehandlung zweckdienlich ist. Beispiele chemotherapeutischer Mittel umfassen Adriamycin, Doxorubicin, Epirubicin, 5-Fluoruracil, Cytosinarabinosid („Ara-C"), Cyclophosphamid, Thiotepa, Busulfan, Cytoxin, Taxoide, z. B. Paclitaxel (Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) und Doxetaxel (Taxotere, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France), Toxotere, Methotrexat, Cisplatin, Melphalan, Vinblastin, Bleomycin, Etoposid, Ifosfamid, Mitomycin C, Mitoxantron, Vincristin, Vinorelbin, Car boplatin, Teniposid, Daunomycin, Carminomycin, Aminopterin, Dactinomycin, Mitomycine, Esperamicine (siehe US-Patent Nr. 4.675.187 ), Melphalan und andere verwandte Stickstoffsenfgase. Ebenfalls in dieser Definition umfasst sind hormonelle Mittel, die wirken, um die Hormonwirkung auf Tumoren zu regulieren oder zu hemmen, wie z. B. Tamoxifen und Onapriston.
Ein „wachstumshemmendes Mittel" bezieht sich bei Verwendung hierin auf eine Verbindung oder Zusammensetzung, die das Wachstum einer Zelle, insbesondere einer Krebszelle hemmt und die irgendeines der hierin identifizierten Gene entweder in vitro oder in vivo überexprimiert. Folglich ist das wachstumshemmende Mittel eines, das den prozentuellen Anteil an Zellen, die derartige Gene in der S-Phase überexprimieren, signifikant vermindert. Beispiele wachstumshemmender Mittel umfassen Mittel, welche die Abfolge des Zellzyklus blockieren (an einer Stelle, die nicht die S-Phase ist), wie z. B. Mittel, die G1-Stillstand und M-Phasen-Stillstand auslösen. Klassische M-Phasen-Blocker umfassen die Vincas-(Vincristin und Vinblastin), Taxol- und Topo-II-Inhibitoren, wie z. B. Doxorubicin, Epirubicin, Daunorubicin, Etoposid und Bleomycin. Jene Mittel, die G1 zum Stillstand bringen, erstrecken sich in den S-Phasen-Stillstand, beispielsweise DNA-alkylierende Mittel, wie z. B. Tamoxifen, Prednison, Dacarbazin, Mechlorethamin, Cisplatin, Methotrexat, 5-Fluoruracil und Ara-C. Weitere Informationen finden sich in The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn und Israel (Hrsg.), Kapitel 1, mit dem Titel „Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" von Murakami et al., WB Saunders, Philadelphia (1995), insbesondere S. 13.
„Doxorubicin" ist ein Anthracyclin-Antibiotikum.
Der Ausdruck „Zytokin" ist ein allgemeiner Ausdruck für Proteine, die von einer Zellpopulation freigesetzt werden, die an einer anderen Zelle als intrazelluläre Vermittler wirken. Beispiele solcher Zytokine sind Lymphokine, Monokine und herkömmliche Polypeptidhormone. Unter den Zytokinen umfasst sind Wachstumshormon, wie z. B. menschliches Wachstumshormon, menschliches N-Methionyl-Wachstumshormon und Rinderwachstumshormon; Parathyroidhormon; Thyroxin; Insulin; Proinsulin; Re laxin; Prorelaxin; und dergleichen. Wie hierin verwendet, umfasst der Ausdruck Zytokin Proteine aus natürlichen Quellen oder aus rekombinanter Zellkultur und biologisch aktive Äquivalente der Nativsequenz-Zytokine.
„Native Antikörper" und „native Immunglobuline" sind üblicherweise heterotetramere Glykoproteine von ungefähr 150.000 Dalton, die aus zwei identischen Leicht-(L-)Ketten und zwei identischen Schwer-(H-)Ketten zusammengesetzt sind. Jede Leichtkette ist durch eine kovalente Disulfidbindung an die Schwerkette gebunden, während die Anzahl an Disulfidbindungen unter den Schwerketten verschiedener Immunglobulintypen variiert. Jede Schwer- und Leichtkette weist auch in regelmäßigen Abständen Interketten-Disulfidbrücken auf. Jede Schwerkette weist an einem der Enden eine variable Domäne (VH), gefolgt von einer Anzahl von konstanten Domänen auf. Jede Leichtkette weist eine variable Domäne an einem der Enden (VL) und eine konstante Domäne an ihrem anderen Ende auf; die konstante Domäne der Leichtkette ist an der ersten konstanten Domäne der Schwerkette ausgerichtet, und die variable Leichtkettendomäne ist an der variablen Domäne der Schwerkette ausgerichtet. Von bestimmten Aminosäuren wird angenommen, dass sie eine Schnittstelle zwischen den variablen Leicht- und Schwerkettendomänen bildet.
Der Ausdruck „variabel" bezieht sich auf die Tatsache, dass gewisse Abschnitte der variablen Domänen sich hinsichtlich ihrer Sequenz unter Antikörpern stark unterscheiden und für die Bindung und Spezifität jedes einzelnen Antikörpers für sein spezielles Antigen verwendet werden. Jedoch ist die Variabilität nicht gleichmäßig über die variablen Domänen von Antikörpern verteilt. Sie ist in drei Segmenten konzentriert, die Complementary-determining-regions (CDRs) oder hypervariable Regionen in den variablen Leichtketten- sowie Schwerkettendomänen genannt werden. Die stärker konservierten Abschnitte variabler Domänen werden Gerüst (FR) genannt. Die variablen Domänen nativer Schwer- und Leichtketten umfassen jeweils vier FR-Regionen, die größtenteils eine β-Faltblattstruktur einnehmen, die durch drei CDRs verbunden sind, die Schleifen bilden, welche die β-Faltblattstruktur verbinden und in manchen Fällen einen Teil davon bilden. Die CDRs in jeder Kette werden durch die FR-Regionen nahe beieinander gehalten und tragen mit den CDRs der an deren Kette zur Bildung der Antigenbindungsstelle von Antikörpern bei (siehe Kabat et al., NIH-Publ. Nr. 91-3242, Bd. 1, S. 647–669 (1991)). Die konstanten Domänen sind nicht direkt an der Bindung eines Antikörpers an ein Antigen beteiligt, zeigen jedoch verschiedene Effektorfunktionen, wie z. B. die Teilnahme des Antikörpers an der antikörperabhängigen Zelltoxizität.
„Antikörperfragmente" umfassen einen Abschnitt eines intakten Antikörpers, vorzugsweise die antigenbindende oder variable Region des intakten Antikörpers. Beispiele von Antikörperfragmenten umfassen Fab-, Fab'-, F(ab')2- und Fv-Fragmente; Diabodies; lineare Antikörper (Zapata et al., Protein Eng. 8(10), 1057–1062 (1995)); Einzelketten-Antikörpermoleküle und multispezifische Antikörper, die aus Antikörperfragmenten gebildet werden.
Der Papainverdau von Antikörpern produziert zwei identische antigenbindende Fragmente, die „Fab"-Fragmente genannt werden, wobei jedes eine einzelne Antigenbindungsstelle aufweist, und ein „Fc"-Restfragment, eine Bezeichnung, welche die Fähigkeit widerspiegelt, leicht zu kristallisieren. Die Pepsinbehandlung liefert ein F(ab')2-Fragment, das zwei antigenkombinierende Stellen aufweist und nach wie vor zur Antigenvernetzung fähig ist.
„Fv" ist das minimale Antikörperfragment, das eine vollständige Antigenerkennungs- und Bindungsstelle enthält. Diese Region besteht aus einem Dimer einer variablen Schwer- und einer variablen Leichtkettendomäne in enger, nicht-kovalenter Verbindung. Es ist diese Konfiguration, in der die drei CDRs jeder variablen Domäne wechselwirken, um eine Antigenbindungsstelle an der Oberfläche des VH-VL-Dimers zu definieren. Zusammen verleihen die sechs CDRs dem Antikörper die Antigenbindungsspezifität. Jedoch hat sogar eine einzelne variable Domäne (oder die Hälfte eines Fv, das nur drei für ein Antigen spezifische CDRs umfasst) die Fähigkeit, Antigen zu erkennen und zu binden, obgleich bei einer niedrigeren Affinität als die gesamte Bindungsstelle.
Das Fab-Fragment enthält außerdem die konstante Domäne der Leichtkette und die erste konstante Domäne (CH1) der Schwerkette. Fab-Fragmente unterscheiden sich von Fab-Fragmenten durch die Hinzufügung einiger Reste am Carboxyterminus der Schwerketten-CH1-Domäne, einschließlich eines oder mehrerer Cysteinreste aus der Antikörper-Gelenkregion. Fab'-SH ist hierin die Bezeichnung für Fab', in dem der/die Cysteinrest(e) der konstanten Domänen eine freie Thiolgruppe trägt. F(ab')2-Antikörperfragmente wurden ursprünglich als Paare von Fab'-Fragmenten produziert, zwischen denen sich Gelenk-Cysteine befinden. Andere chemische Kopplungen von Antikörperfragmenten sind ebenfalls bekannt.
Die „Leichtketten" von Antikörpern (Immunglobulinen) aus jeglicher Vertebratenspezies können einer von zwei klar zu unterscheidenden Typen, die Kappa und Lambda genannt werden, auf Basis der Aminosäuresequenzen ihrer konstanten Domänen zugeordnet werden.
In Abhängigkeit von der Aminosäuresequenz der konstanten Domäne ihrer Schwerketten können Immunglobuline verschiedenen Klassen zugeordnet werden. Es gibt fünf Hauptklassen von Immunglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, und mehrere dieser Klassen können in Unterklassen (Isotypen) weiter unterteilt werden, z. B. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA und IgA2.
„Einzelketten-Fv"- oder „sFv"-Antikörperfragmente umfassen die VH- und VL-Domänen des Antikörpers, worin diese Domänen in einer einzigen Polypeptidkette vorliegen. Vorzugsweise umfasst das Fv-Polypeptid weiters einen Polypeptidlinker zwischen den VH- und VL-Domänen, der es dem sFv ermöglicht, die gewünschte Struktur für die Antigenbindung auszubilden. Für einen Überblick über sFv siehe Pluckthun in The Pharmacology of Monoklonal Antibodies, Bd. 113, Rosenburg und Moore (Hrsg.), Springer-Verlag, New York, S. 269–315 (1994).
Der Ausdruck „Diabodies" bezieht sich auf kleine Antikörperfragmente mit zwei Antigenbindungsstellen, wobei diese Fragmente eine variable Schwerkettendomäne (VH) umfassen, die mit einer variablen Leichtkettendomäne (VL) in derselben Poly peptidkette verbunden ist (VH-VL). Durch Verwendung eines Linkers, der zu kurz ist, um eine Paarung zwischen den beiden Domänen an derselben Kette zu ermöglichen, sind die Domänen gezwungen, sich mit komplementären Domänen einer anderen Kette zu paaren und zwei Antigenbindungsstellen zu erzeugen. Diabodies werden beispielsweise in EP 404.097 ; WO 93/11161 und Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444–6448 (1993), vollständiger beschrieben.
Ein „isolierter" Antikörper ist einer, der identifiziert und von einer Komponente seiner natürlichen Umgebung abgetrennt und/oder gewonnen worden ist. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die üblicherweise die diagnostischen oder therapeutischen Verwendungen für den Antikörper stören, und können Enzyme, Hormone und andere proteinartige und nicht proteinartige Gelöststoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird der Antikörper gereinigt, und zwar (1) auf ein mittels Lowry-Verfahren bestimmtes Ausmaß von mehr als 95 Gew.-% Antikörper und insbesondere mehr als 99 Gew.-%, (2) auf ein Ausmaß, das ausreicht, um zumindest 15 Reste der N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz unter Verwendung eines Zentrifugenröhrchen-Sequenzierers zu erlangen, oder (3) bis zur Homogenität mittels SDS-PAGE unter reduzierenden oder nicht reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau oder, vorzugsweise, Silberfärbung. Ein isolierter Antikörper umfasst den Antikörper in situ in rekombinanten Zellen, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des Antikörpers fehlen wird. Für gewöhnlich wird jedoch ein isolierter Antikörper durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
Der Ausdruck „Marker" bezieht sich bei Verwendung hierin auf eine nachweisbare Verbindung oder Zusammensetzung, die direkt oder indirekt an den Antikörper konjugiert ist, so dass ein „markierter" Antikörper erhalten wird. Der Marker kann selbst nachweisbar sein (z. B. Radioisotopmarker oder Fluoreszenzmarker) oder kann, im Falle eines enzymatischen Markers, eine nachweisbare chemische Veränderung einer Substratverbindung oder Zusammensetzung katalysieren.
Unter „Festphase" wird eine nicht-wässrige Matrix verstanden, an die der Antikörper der vorliegenden Erfindung anhaften kann. Beispiele von hierin vorgesehenen Festphasen umfassen jene, die teilweise oder völlig aus Glas gebildet werden (z. B. Controlled-pore-Glas), Polysaccharide (z. B. Agarose), Polyacrylamide, Polystyrol, Polyvinylalkohol und Silikone. In gewissen Ausführungsformen, in Abhängigkeit vom Zusammenhang, kann die Festphase den Napf einer Testplatte umfassen; in anderen ist sie eine Reinigungssäule (z. B. eine Affinitätschromatographiesäule). Dieser Ausdruck umfasst auch eine diskontinuierliche Festphase getrennter Teilchen, wie z. B. jene, die im US-Patent Nr. 4.275.149 beschrieben sind.
Ein „Liposom" ist ein kleines Vesikel, das sich aus verschiedenen Lipidtypen, Phospholipiden und/oder Tensid zusammensetzt und zur Abgabe eines Medikaments an ein Säugetier zweckdienlich ist. Die Komponenten des Liposoms sind üblicherweise in einer Doppelschicht angeordnet, ähnlich zur Lipidanordnung biologischer Membranen.
II. Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung
PRO351-Polypeptide voller Länge
Die vorliegende Erfindung stellt neu identifizierte und isolierte Nucleotidsequenzen bereit, die für Polypeptide kodieren, die in der vorliegenden Anwendung abs PRO351 bezeichnet werden. Die Anmelder haben insbesondere cDNA identifiziert und isoliert, die für ein PRO351-Polypeptid kodiert, wie ausführlicher in den unten stehenden Beispielen offenbart wird. Die Analyse der Aminosäuresequenz des PRO351-Polypeptids voller Länge unter Verwendung von BLAST- und FastA-Sequenzanordnungs-Computerprogrammen zeigt, dass verschiedene Abschnitte des PRO351-Polypeptids eine signifikante Sequenzähnlichkeit mit dem Prostasin-Protein besitzen, wodurch gezeigt wird, dass PRO351 ein neues Prostasin-Protein sein könnte. Genauer gesagt, zeigte eine Analyse der Dayhoff-Datenbank (Version 35.45 SwissProt 35) eine signifikante Sequenzähnlichkeit zwischen der PRO351-Aminosäuresequenz und den folgenden Dayhoff-Sequenzen „AC003965_1", „CELC07G1_7", „GEN12917", „HEPS_HUMAN", „GEN14584", „MCT6_MOUSE", „HSU75329_1", „PLMN_ERIEU", „TRYB_HUMAN" und „P_W22987". Dementsprechend wird momentan angenommen, dass es sich bei dem PRO351-Polypeptid, das in der vorliegenden Anwendung offenbart ist, um ein neu identifiziertes Mitglied der Prostasin-Familie handelt und dass dieses Eigenschaften und Aktivitäten aufweist, die für die Prostasin-Familie typisch sind.
Zusätzlich zu den hierin beschriebenen Nativsequenz-PRO-Polypeptiden voller Länge wird erwogen, dass PRO-Polypeptidvarianten hergestellt werden können. PRO-Polypeptidvarianten können durch Einführung geeigneter Nucleotidänderungen in die PRO-Polypeptid-DNA oder durch Synthese des gewünschten PRO-Polypeptids hergestellt werden. Der Fachkundige auf dem Gebiet der Erfindung wird anerkennen, dass Aminosäureänderungen posttranslationelle Prozessierungen der PRO-Polypeptide verändern können, wie z. B. das Verändern der Anzahl und Position von Glykosylierungsstellen oder das Verändern der Membranverankerungseigenschaften.
Variationen in der nativen Sequenz der PRO-Polypeptide voller Länge oder in verschiedenen Domänen der hierin beschriebenen PRO-Polypeptide können beispielsweise unter Verwendung jeglicher Techniken und Richtlinien für konservative oder nicht konservative Mutationen vorgenommen werden, die beispielsweise im US-Patent Nr. 5.364.934 dargelegt sind. Variationen können eine Substitution, Deletion oder Insertion eines oder mehrerer für das PRO-Polypeptid kodierender Codons sein, die in einer Änderung der Aminosäuresequenz des PRO-Polypeptids im Vergleich zum Nativsequenz-PRO-Polypeptid resultiert. Gegebenenfalls erfolgt die Variation durch Substitution von zumindest einer Aminosäure durch eine beliebige andere Aminosäure in einer oder mehreren Domänen des PRO-Polypeptids. Richtlinien zur Ermittlung des Aminosäurerests, der insertiert, substituiert oder deletiert werden kann, ohne die gewünschte Aktivität nachteilig zu beeinflussen, können durch Vergleichen der Sequenz des PRO-Polypeptids mit der homologer bekannter Proteinmoleküle und Minimierung der Anzahl vorgenommener Aminosäuresequenzänderungen in Regionen hoher Homologie gefunden werden. Aminosäuresubstitutionen können das Ergebnis des Ersetzens einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften sein, wie z. B. das Ersetzen eines Leucins durch ein Serin, d. h. konservative Aminosäureersetzungen. Insertionen oder Deletionen können gegebenenfalls im Bereich von 1 bis 5 Aminosäuren liegen. Die erlaubte Variation kann durch systematisches Vornehmen von Insertionen, Deletionen und Substitutionen von Aminosäuren in der Sequenz und Testen der resultierenden Varianten auf Aktivität im in den unten stehenden Beispielen beschriebenen In-vitro-Test ermittelt werden.
In speziellen Ausführungsformen sind konservative Substitutionen von Interesse in Tabelle 1 unter dem Titel bevorzugter Substitutionen dargestellt. Falls derartige Substitutionen in einer Änderung der biologischen Aktivität resultieren, werden substantiellere Änderungen, die in Tabelle 1 als beispielhafte Substitutionen bezeichnet sind oder wie sie unten in Bezug auf Aminosäureklassen weitergehend beschrieben sind, eingeführt und die Produkte gescreent.
Tabelle 1
Substantielle Modifizierungen der Funktion oder immunologischen Identität des PRO-Polypeptids werden durch Wählen von Substitutionen erzielt, die sich in ihrer Wirkung signifikant unterscheiden, und zwar auf die Erhaltung (a) der Struktur des Polypeptidgerüsts im Bereich der Substitution, beispielsweise als Faltblatt- oder Helix-Konformation, (b) der Ladung oder Hydrophobizität des Moleküls an der Zielstelle oder (c) der Sperrigkeit der Seitenkette. Natürlich vorkommende Reste werden auf Basis gemeinsamer Seitenketteneigenschaften in Gruppen unterteilt:

(1) Hydrophob: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) neutral-hydrophil: Cys, Ser, Thr;
(3) sauer: Asp, Glu;
(4) basisch: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
(5) Reste, welche die Kettenausrichtung beeinflussen: Gly, Pro; und
(6) aromatisch: Trp, Tyr, Phe.

Nicht konservative Substitutionen bedingen den Austausch eines Elements einer dieser Klassen durch eine andere Klasse. Derartige substituierte Reste können auch in die konservativen Substitutionsstellen, bevorzugter in die verbleibenden (nicht konservierten) Stellen, eingeführt werden.
Die Varianten können unter Verwendung von Verfahren hergestellt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie z. B. Oligonucleotid-vermittelte (ortsgerichtete) Mutagenese, Alanin-Scanning und PCR-Mutagenese. Ortsgerichtete Mutagenese (Carter et al., Nucl. Acids Res. 13, 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10, 6487 (1987)), Kassettenmutagenese (Wells et al., Gene 34, 315 (1985)), Restriktionsselektionsmutagenese (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317, 415 (1986)), und andere bekannte Techniken können an klonierter DNA durchgeführt werden, um die gewünschte PRO-Polypeptid-Varianten-DNA herzustellen.
Scanning-Aminosäureanalyse kann ebenfalls eingesetzt werden, um eine oder mehrere Aminosäuren entlang einer zusammenhängenden Sequenz zu identifizieren. Unter den bevorzugten Scanning-Aminosäuren befinden sich relativ kleine, neutrale Aminosäuren. Solche Aminsäuren umfassen Alanin, Glycin, Serin und Cystein. Alanin ist typischerweise eine bevorzugte Scanning-Aminosäure unter dieser Gruppe, da sie die über den Beta-Kohlenstoff hinausgehende Seitenkette eliminiert und mit geringerer Wahrscheinlichkeit die Hauptkettenkonformation der Variante verändert. Alanin wird außerdem typischerweise bevorzugt, da sie die häufigste Aminosäure ist. Weiters findet sie sich häufig sowohl in verborgenen, als auch in exponierten Positionen (Creighton, The Proteins, W. H. Freeman & Co., N. Y.; Chothia, J. Mol. Biol. 150, 1 (1976)). Falls die Alaninsubstitution keine adäquaten Mengen der Variante liefert, kann eine isosterische Aminosäure verwendet werden.
Modifizierungen von PRO-Polypeptiden
Kovalente Modifizierungen von PRO-Polypeptiden sind im Schutzumfang dieser Erfindung enthalten. Eine der kovalenten Modifizierungsarten umfasst das Umsetzen von Aminosäure-Zielresten des PRO-Polypeptids mit einem organischen Derivatisierungsmittel, das fähig ist, mit gewählten Seitenketten oder mit den N- oder C-terminalen Resten des PRO-Polypeptids zu reagieren. Derivatisierungen mit bifunktionellen Mitteln sind beispielsweise zur Vernetzung eins PRO-Polypeptids mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder Oberfläche zur Verwendung im Verfahren zur Reinigung von Anti-PRO-Polypeptid-Antikörpern und umgekehrt zweckdienlich. Häufig verwendete Vernetzungsmittel umfassen z. B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, einschließlich Disuccinimidylester, wie. z. B. 3,3-Dithiobis(succinimidylpropionat), bifunktionelle Maleinimide, wie z. B. Bis-N-Maleinimido-1,8-octan, und Mittel, wie z. B. Methyl-3-[(p-azidophenyl)-dithio]propioimidat.
Andere Modifizierungen umfassen die Desamidierung von Glutaminyl- und Asparaginylresten zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten, Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxygruppen von Seryl- und Threonylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidinseitenketten [T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79–86 (1983)), Acetylierung des N-terminalen Amins und Amidierung jeglicher C-terminalen Carboxygruppe.
Ein weiterer Typ der kovalenten Modifizierung der PRO-Polypeptide, der im Schutzumfang dieser Erfindung enthalten ist, umfasst die Veränderung des nativen Glykosylierungsmusters des Polypeptids. Unter „Verändern des nativen Glykosylierungsmusters" wird zu den Zwecken hierin das Deletieren eines oder mehrerer Kohlenhydratreste verstanden, die sich in einem Nativsequenz-PRO-Polypeptid finden, und/oder das Anfügen einer oder mehrerer Glykosylierungsstellen, die im Nativsequenz-PRO-Polypeptid nicht vorhanden sind, und/oder das Verändern des Verhältnisses und/oder der Zusammensetzung der an die Glykosylierungsstelle(n) gebundenen Zuckerreste.
Das Anfügen von Glykosylierungsstellen an das PRO-Polypeptid kann durch Ändern der Aminosäuresequenz erreicht werden. Die Änderung kann beispielsweise durch Addition oder Substitution von einem oder mehreren Serin- oder Threoninresten im Nativsequenz-PRO-Polypeptid erzielt werden (für O-gebundene Glykosylierungsstellen). Die PRO-Polypeptidaminosäuresequenz kann gegebenenfalls über Veränderungen auf der DNA-Ebene geändert werden, insbesondere durch Mutieren der für das PRO-Polypeptid kodierenden DNA an vorgewählten Basen, so dass Codons erzeugt werden, die in die gewünschten Aminosäuren translatiert werden.
Ein anderes Mittel zur Erhöhung der Anzahl von Kohlenhydratgruppierungen am PRO-Polypeptid ist die chemische oder enzymatische Kopplung von Glykosiden an das Polypeptid. Derartige Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung beschrieben, z. B. in WO 87/05330 , veröffentlicht am 11. September 1987, und in Aplin und Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., S. 259–306 (1981).
Die Entfernung von am PRO-Polypeptid vorhandenen Kohlenhydratgruppierungen kann chemisch oder enzymatisch oder durch Mutationssubstitution von Codons erzielt werden, die für Aminosäurereste kodieren, die als Glykosylierungsziele dienen. Chemische Deglykosylierungsstechniken sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden beispielsweise von Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987), und von Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981), beschrieben. Die enzymatische Spaltung von Kohlenhydratgruppierungen auf Polypeptiden kann durch Verwendung einer Vielzahl von Endo- und Exo-Glycosidasen erzielt werden, wie von Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138, 350 (1987), beschrieben wird.
Ein weiterer Typ der kovalenten Modifizierung von PRO-Polypeptiden der Erfindung umfasst das Binden des PRO-Polypeptids an eine Vielzahl von nicht-proteinartigen Polymeren, wie z. B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene auf eine Weise, wie sie in den US-Patenten Nr. 4.640.835 ; 4.496.689 ; 4.301.144 ; 4.670.417 ; 4.791.192 oder 4.179.337 beschrieben wird.
Die PRO-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auf eine Weise modifiziert werden, dass ein chimäres Molekül gebildet wird, das ein PRO-Polypeptid umfasst, das an ein(e) andere(s), heterologe(s) Polypeptid oder Aminosäuresequenz fusioniert ist. In einer der Ausführungsformen umfasst ein derartiges chimäres Molekül eine Fusion des PRO-Polypeptids mit einem Markerpolypeptid, das ein Epitop bereitstellt, an das ein Anti-Marker-Antikörper selektiv binden kann. Der Epitopmarker wird im Allgemeinen an den Amino- oder Carboxyterminus des PRO-Polypeptids angefügt. Die Gegenwart derartiger epitopmarkierter Formen des PRO-Polypeptids kann unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Markerpolypeptid nachgewiesen werden. Außerdem ermöglicht die Bereitstellung des Epitopmarkers die einfache Reinigung des PRO-Polypeptids mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung eines Anti-Marker-Antikörpers oder einer anderen Art von Affinitätsmatrix, die an den Epitopmarker bindet. In einer alternativen Ausführungsform kann das chimäre Molekül eine Fusion des PRO-Polypeptids mit einem Immunglobulin oder einer speziellen Region eines Immunglobulins umfassen. Für eine zweiwertige Form des chimären Moleküls könnte eine derartige Fusion mit der Fc-Region eines IgG-Moleküls erfolgen.
Verschiedene Markerpolypeptide und ihre entsprechenden Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. Beispiele umfassen Poly-Histidin-(Poly-His-) o der Poly-Histidin-Glycin-(Poly-His-Gly-)Marker; das flu-HA-Markerpolypeptid und seinen Antikörper 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159–2165 (1988)); den cmyc-Marker und die 8F9-, 3C7-, 6E10-. G4-, B7- und 9E10-Antikörper dagegen (Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5, 3610–3616 (1985)); und den Herpes-Simplex-Virus-Glykoprotein-D-(gD-)Marker und sein Antikörper (Paborsky et al., Protein Engineering 3(6), 547–553 (1990)). Andere Markerpolypeptide umfassen das Flag-Peptid (Hopp et al., BioTechnology 6, 1204–1210 (1988)); das KT3-Epitop-Peptid (Martin et al., Science 255, 192–194 (1992)); ein α-Tubulin-Epitop-Peptid (Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163–15166 (1991)); und den T7-Gen-10-Protein-Peptidmarker (Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6393–6397 (1990)).
Herstellung von PRO-Polypeptiden
Die unten stehende Beschreibung betrifft die Herstellung von PRO-Polypeptiden durch Kultivieren von Zellen, die mit einem die gewünschte PRO-Polypeptidnucleinsäure enthaltenden Vektor transformiert oder transfiziert sind. Es ist selbstverständlich vorgesehen, dass alternative Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind, eingesetzt werden können, um das PRO-Polypeptid herzustellen. Beispielsweise können die PRO-Polypeptidsequenz oder Abschnitte davon durch direkte Peptidsynthese unter Verwendung von Festphasentechniken hergestellt werden (siehe z. B. Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149–2154 (1963)). Eine In-vitro-Proteinsynthese kann unter Verwendung manueller Techniken oder automatisiert durchgeführt werden. Eine automatisierte Synthese kann beispielsweise unter Verwendung eines Peptid-Synthesizers von Applied Biosystems (Foster City, CA), nach den Anleitungen des Herstellers erzielt werden. Verschiedene Abschnitte des gewünschten PRO-Polypeptids können gesondert chemisch hergestellt und unter Verwendung chemischer oder enzymatischer Verfahren kombiniert werden, um das PRO-Polypeptid voller Länge zu erlangen.
A. Isolierung von DNA, die für PRO-Polypeptide kodiert
Für PRO-Polypeptide kodierende DNA kann aus einer cDNA-Bibliothek erhalten werden, die aus Gewebe hergestellt worden ist, von dem angenommen wird, dass es die gewünschte PRO-Polypeptid-mRNA besitzt und diese in einem nachweisbaren Ausmaß exprimiert. Demgemäß kann menschliche PRO-Polypeptid-DNA leicht aus einer aus menschlichem Gewebe hergestellten cDNA-Bibliothek erhalten werden, wie z. B. in den Beispielen beschrieben wird. Das für das PRO-Polypeptid kodierende Gen kann auch aus einer Genombibliothek oder mittels Oligonucleotidsynthese erhalten werden.
Bibliotheken können mit Sonden (wie z. B. Antikörper gegen das gewünschte PRO-Polypeptid oder Oligonucleotide einer Länge von zumindest 20–80 Basen) gescreent werden, die zur Identifizierung des Gens von Interesse oder des von ihm kodierten Proteins konstruiert sind. Das Screening der cDNA- oder Genombibliothek mit der gewählten Sonde kann unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt werden, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989), beschrieben sind. Ein alternatives Mittel zur Isolierung des für das gewünschte PRO-Polypeptid kodierenden Gens ist die Verwendung von PCR-Verfahren (Sambrook et al., s. o.; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1995)).
Die unten stehenden Beispiele beschreiben Techniken zum Screenen einer cDNA-Bibliothek. Die als Sonden gewählten Oligonucleotidsequenzen sollten eine ausreichende Länge aufweisen und ausreichend eindeutig sein, so dass falsch-positive Ergebnisse minimiert werden. Das Oligonucleotid ist vorzugsweise markiert, so dass es bei Hybridisierung an DNA in der gescreenten Bibliothek nachgewiesen werden kann. Markierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt und umfassen die Verwendung von radioaktiven Markern, wie z. B. ³²P-markiertes ATP, Biotinylierung oder Enzymmarkierung. Hybridisierungsbedingungen, einschließlich mäßiger Stringenz und hoher Stringenz werden in Sambrook et al., s. o., bereitgestellt.
Bei derartigen Screeningverfahren identifizierte Sequenzen können verglichen und an andere bekannte Sequenzen angeglichen werden, die in öffentlichen Datenbanken, wie z. B. GenBank, oder anderen privaten Sequenzdatenbanken hinterlegt und verfügbar sind. Eine Sequenzidentität (entweder auf Aminosäure- oder auf Nucleotidebene) innerhalb von definierten Regionen des Moleküls oder über die volle Länge der Sequenz kann durch Sequenzangleichung unter Verwendung von Computersoftwareprogrammen, wie z. B. BLAST, ALIGN, DNAstar und INHERIT, ermittelt werden, die verschiedene Algorithmen einsetzen, um eine Homologie zu messen.
Nucleinsäure, die eine für Protein kodierende Sequenz aufweist, kann durch Screenen gewählter cDNA- oder Genombibliotheken erlangt werden, und zwar unter Verwendung der hierin erstmals offenbarten, abgeleiteten Aminosäuresequenzen und, falls notwendig, unter Verwendung herkömmlicher Primerextensionsverfahren, wie sie in Sambrook et al., s. o., beschrieben werden, um Vorläufer und Prozessierungszwischenprodukte von mRNA nachzuweisen, die möglicherweise nicht in cDNA revers-transkribiert worden ist.
B. Selektion und Transformation von Wirtszellen
Wirtszellen werden mit Expressions- oder Klonierungsvektoren, die hierin für die PRO-Polypeptid-Produktion beschrieben werden, transfiziert oder transformiert und in herkömmlichen Nährmedien kultiviert, die in geeigneter Weise zur Induktion von Promotoren, Selektieren von Transformanten oder Amplifizieren von für die gewünschten Sequenzen kodierenden Genen modifiziert wurden. Die Kulturbedingungen, wie z. B. Medium, Temperatur, pH und dergleichen, können vom Fachkundigen ohne übermäßiges Experimentieren gewählt werden. Im Allgemeinen finden sich Prinzipien, Protokolle und praktische Techniken zur Maximierung der Produktivität von Zellkulturen in Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler (Hrsg.), IRL Press (1991), und Sambrook et al., s. o. Transfektionsverfahren sind dem Durchschnittsfachmann bekannt, beispielsweise CaPO₄ und Elektroporation. In Abhängigkeit von der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt, die für solche Zellen geeignet sind. Die Calciumchlorid einsetzende Calciumbehandlung, wie sie in Sambrook et al., s. o., beschrieben wird, oder die Elektroporation wird im Allgemeinen für Prokaryoten oder andere Zellen verwendet, die wesentliche Zellwandbarrieren enthalten. Die Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transformation gewisser Pflanzenzellen verwendet, wie sie von Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und in WO 89/05859 , veröffentlicht am 29. Juni 1989, beschrieben wird. Für Säugetierzellen ohne derartige Zellwände kann das Calciumphosphatpräzipitationsverfahren von Graham und van der Eb, Virology 52, 456–457 (1978), eingesetzt werden. Allgemeine Aspekte von Säugetierwirtszellsystem-Transformationen sind im US-Patent Nr. 4.399.216 beschrieben worden. Transformationen in Hefe werden typischerweise nach dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3829 (1979), durchgeführt. Jedoch können andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen, wie z. B. durch Kern-Mikroinjektion, Elektroporation, Bakterienprotoplastenfusion mit intakten Zellen, oder Polykationen, z. B. Polybren, Polyornithin, ebenfalls verwendet werden. Über verschiedene Techniken zur Transformation von Säugetierzellen siehe Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527–537 (1990), und Mansour et al., Nature 336, 348–352 (1988).
Geeignete Wirtszellen zum Klonieren und Exprimieren der DNA in die Vektoren hierin umfassen Prokaryoten-, Hefe- oder höhere Eukaryotenzellen. Geeignete Prokaryoten umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Eubakterien, wie z. B. Gramnegative oder Gram-positive Organismen, beispielsweise Enterobacteriaceae, wie z. B. E. coli. Es sind verschiedene E.-coli-Stämme öffentlich erhältlich, wie z. B. E.-coli-K12-Stamm MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); E.-coli-Stamm W3110 (ATCC 27.325) und K5 772 (ATCC 53.635). Andere geeignete prokaryotische Wirtszellen umfassen Enterobacteriaceae, wie z. B. Escherichia, wie z. B. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, z. B. Salmonella typhimurium, Serratia, z. B. Serratia marcescans, und Shigella, sowie Bacilli, wie z. B. B. sub tilis und B. licheniformis (z. B. B. licheniformis 41 P, offenbart in DD 266.710 , veröffentlicht am 12. April 1989), Pseudomonas, wie z. B. P. aeruginosa, und Streptomyces. Verschiedene E.-coli-Stämme sind öffentlich erhältlich, wie z. B. E.-coli-K12-Stamm MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); E.-coli-Stamm W3110 (ATCC 27.325); und K5 772 (ATCC 53.635). Diese Beispiele sind illustrativ und nicht einschränkend. Stamm W3110 ist ein insbesondere bevorzugter Wirt oder Elternwirt, da er ein häufiger Wirtsstamm für rekombinante DNA-Produktfermentationen ist. Vorzugsweise sekretiert die Wirtszelle minimale Mengen an proteolytischen Enzymen. Beispielsweise kann Stamm W3110 dahingehend modifiziert werden, dass eine genetische Mutation in denjenigen Genen bewirkt wird, die für Proteine kodieren, die für den Wirt endogen sind, wobei derartige Wirte die Folgenden umfassen: den E.-coli-W3110-Stamm 1A2, der den vollständigen Genotyp tonA aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 9E4, der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 27C7 (ATCC 55.244), der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan^r aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 37D6, der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7ilvG kan^r aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 40B4, der Stamm 37D6 mit einer nicht-kanamycinresistenten degP-Deletionsmutation ist; und ein E.-coli-Stamm mit einer im US-Patent Nr. 4.946.783 , erteilt am 7. August 1990, offenbarten, mutierten periplasmatischen Protease. Alternativ dazu sind In-vitro-Klonierungsverfahren, z. B. PCR oder andere Nucleinsäurepolymerasereaktionen, geeignet.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroorganismen, wie z. B. Fadenpilze oder Hefe, geeignete Klonierungs- oder Expressionswirte für PRO-Polypeptidkodierende Vektoren. Saccharomyces cerevisiae ist ein häufig verwendeter niederer eukaryotischer Wirtsorganismus. Andere umfassen Schizosaccharomyces pombe (Beach und Nurse, Nature 290, 140 (1981); EP 139.383 , veröffentlicht am 2. Mai 1985); Kluyveromyces-Wirte ( US-Patent Nr. 4.943.529 ; Fleer et al., Bio/Technology 9, 968–975 (1991)), wie z. B. K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 737 (1983)), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology 8, 135 (1990)), K. thermotolerans und K. marxianus; yarrowia ( EP 402.226 ); Pichia pastoris ( EP 183.070 ; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265–278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia ( EP 244.234 ); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259–5263 (1979)); Schwanniomyces, wie z. B. Schwanniomyces occidentalis ( EP 394.538 , veröffentlicht am 31. Oktober 1990); und Fadenpilze, wie z. B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium ( WO 91/00357 , veröffentlicht am 10. Jänner 1991), und Aspergillus-Wirte, wie z. B. A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284–289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205–221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470–1474 (1984)) und A. niger (Kelly und Hynes, EMBO J. 4, 475–479 (1985)). Methylotrophe Hefen sind hierin geeignet und umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Hefe, die zum Wachstum auf Methanol fähig und aus den aus Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis und Rhodotorula bestehenden Gattungen gewählt sind. Eine Liste von speziellen Spezies, die für diese Klasse von Hefen exemplarisch ist, findet sich in C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs 269 (1982).
Geeignete Wirtszellen zur Expression von glykosylierten PRO-Polypeptiden stammen aus mehrzelligen Organismen. Beispiele von Invertebratenzellen umfassen Insektenzellen, wie z. B. Drosophila S2 und Spodoptera Sf9, sowie Pflanzenzellen. Beispiele zweckdienlicher Säugetierwirtszelllinien umfassen Chinahamster-Eierstock-(CHO-) und COS-Zellen. Speziellere Beispiele umfassen die durch SV40 transformierte Affennieren-CV1-Linie (COS-7, ATCC CRL 1651); die menschliche Urnierenlinie (293 oder zum Wachstum in Suspensionskultur subklonierte 293-Zellen, Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); und Maus-Mammatumor (MMT 060562, ATCC CCL51). Die Wahl der geeigneten Wirtszelle wird als innerhalb des Gebiets der Erfindung befindlich erachtet.
C. Auswahl und Verwendung eines replizierbaren Vektors
Die für ein gewünschtes PRO-Polypeptid kodierende Nucleinsäure (z. B. cDNA oder genomische DNA) kann für die Klonierung (Amplifikation der DNA) oder für die Expression in einen replizierbaren Vektor insertiert werden. Es sind verschiedene Vektoren öffentlich erhältlich. Der Vektor kann beispielsweise in Form eines Plasmids, Cosmids, Virusteilchens oder Phagen vorliegen. Die geeignete Nucleinsäuresequenz kann durch eine Vielfalt von Verfahren in den Vektor insertiert werden. Im Allgemeinen wird DNA in (eine) geeignete Restriktionsendonucleasestelle(n) unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Techniken insertiert. Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, eine oder mehrere Signalsequenzen, einen Replikationsstartpunkt, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancerelement, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz. Die Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere dieser Komponenten enthalten, setzt standardmäßige Ligationstechniken ein, die dem Fachkundigen bekannt sind.
Das PRO-Polypeptid von Interesse kann rekombinant nicht nur direkt, sondern auch als Fusionspolypeptid mit einem heterologen Polypeptid produziert werden, das eine Signalsequenz oder ein anderes Polypeptid mit einer spezifischen Spaltstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids sein kann. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein oder kann Teil der in den Vektor insertierten PRO-Polypeptid-DNA sein. Die Signalsequenz kann eine prokaryotische Signalsequenz sein, die beispielsweise aus der Gruppe der Alkalischen Phosphatase-, Penicillinase-, Ipp- oder hitzestabilen Enterotoxin-II-Leader gewählt ist. Für die Hefesekretion kann die Signalsequenz z. B. der Hefe-Invertase-Leader, Alpha-Faktor-Leader (einschließlich Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktor-Leader, wobei letzterer im US-Patent Nr. 5.010.182 beschrieben wird) oder Saure-Phosphatase-Leader, der C.-albicans-Glucoamylase-Leader ( EP 362.179 , veröffentlicht am 4. April 1990) oder das in WO 90/13646 (veröffentlicht am 15. November 1990) beschriebene Signal sein. Bei der Säugetierzellenexpression können Säugetier-Signalsequenzen verwendet werden, um die Sekretion des Proteins zu steuern, wie z. B. Signalse quenzen aus sekretierten Polypeptiden derselben oder einer verwandten Spezies, sowie virale Sekretionsleader.
Expressions- sowie Klonierungsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, in einer oder mehreren gewählten Wirtszellen zu replizieren. Derartige Sequenzen sind für eine Vielzahl von Bakterien, Hefen und Viren wohlbekannt. Der Replikationsstartpunkt aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten Gram-negativen Bakterien geeignet, der 2μ-Plasmid-Startpunkt ist für Hefe geeignet, und verschiedene virale Startpunkte (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für die Klonierung von Vektoren in Säugetierzellen zweckdienlich.
Expressions- und Klonierungsvektoren werden typischerweise ein Selektionsgen enthalten, das auch selektierbarer Marker genannt wird. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegen Antibiotika oder andere Toxine, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin verleihen, (b) auxotrophe Defekte komplementieren oder (c) entscheidende Nährstoffe bereitstellen, die aus komplexen Medien nicht verfügbar sind, z. B. das für D-Alanin-Racemase kodierende Gen für Bacilli.
Ein Beispiel geeigneter selektierbarer Marker für Säugetierzellen sind jene, die die Identifizierung von Zellen ermöglichen, die zur Aufnahme der PRO-Polypeptid-Nucleinsäure kompetent sind, wie z. B. DHFR oder Thymidinkinase. Eine geeignete Wirtszelle beim Einsatz von DHFR der Wildform ist die hinsichtlich DHFR-Aktivität defekte CHO-Zelllinie, die wie von Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), beschrieben vermehrt wird. Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das im Hefeplasmid YRp7 vorliegende trp1-Gen (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)). Das trp1-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm bereit, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, beispielsweise ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics 85, 12 (1977)).
Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der operabel an die PRO-Polypeptid-Nucleinsäuresequenz gebunden ist, um die mRNA-Synthese zu steuern. Promotoren, die von einer Vielzahl von möglichen Wirtszellen erkannt werden, sind wohlbekannt. Zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten zweckdienliche Promotoren umfassen die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)), Alkalische Phosphatase, ein Tryptophan-(trp-)Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP 36.776 ) und Hybridpromotoren, wie z. B. den tac-Promotor (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 (1983)). Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen werden außerdem eine Shine-Dalgarno-(S. D.-)Sequenz enthalten, die operabel an die für das gewünschte PRO-Polypeptid kodierende DNA gebunden ist.
Beispiele geeigneter Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) oder für andere glykolytische Enzyme (Ness et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)), wie z. B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil der durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription sind, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, Saure Phosphatase, Abbauenzyme, die mit dem Stickstoffmetabolismus zusammenhängen, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefeexpression werden in EP 73.657 weitergehend beschrieben.
Die PRO-Polypeptid-Transkription aus Vektoren in Säugetier-Wirtszellen wird beispielsweise durch Promotoren kontrolliert, die aus den Genomen von Viren erlangt werden, wie z. B. aus Polyomavirus, Geflügelpockenvirus (UK 2.211.504, veröffent licht am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie z. B. Adenovirus 2), Rinder-Papillomavirus, Vogel-Sarkomvirus, Cytomegalovirus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und Simi-an-Virus 40 (SV 40), aus heterologen Säugetier-Promotoren, z. B. dem Actinpromotor oder einem Immunglobulinpromotor, und aus Hitzeschockpromotoren, unter der Voraussetzung, dass derartige Promotoren mit den Wirtszellsystemen kompatibel sind.
Die Transkription einer für das gewünschte PRO-Polypeptid kodierenden DNA durch höhere Eukaryoten kann durch Insertieren einer Enhancersequenz in den Vektor gesteigert werden. Enhancer sind cis-wirkende DNA-Elemente, die üblicherweise eine Länge von 10 bis 300 bp aufweisen, die an einem Promotor wirken, um dessen Transkription zu erhöhen. Es sind zahlreiche Enhancersequenzen aus Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise wird man jedoch einen Enhancer aus einem Virus einer eukaryotischen Zelle verwenden. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer an der späten Seite des Replikationsstartpunkts (bp 100–270), den frühen Cytomegalovirus-Promotor-Enhancer, den Polyoma-Enhancer an der späten Seite des Replikationsstartpunkts und Adenovirus-Enhancer. Der Enhancer kann an einer Position 5' oder 3' der für das PRO-Polypeptid kodierenden Sequenz in den Vektor gespleißt werden, befindet sich jedoch vorzugsweise an einer Stelle 5' des Promotors.
In eukaryotischen Wirtszellen (Hefe, Pilze, Insekten, Pflanzen, Tiere, Mensch oder kernhaltige Zellen aus anderen mehrzelligen Organismen) verwendete Expressionsvektoren werden außerdem Sequenzen enthalten, die zur Termination der Transkription und zur Stabilisierung der mRNA notwendig sind. Derartige Sequenzen sind allgemein aus den 5'- und gelegentlich 3'-untranslatierten Regionen eukaryotischer oder viraler DNAs oder cDNAs erhältlich. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente im untranslatierten Abschnitt der für PRO-Polypeptide kodierenden mRNA transkribiert werden.
Weitere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Adaptierung für die Synthese von PRO-Polypeptiden in rekombinanter Vertebratenzellkultur geeignet sind, werden in Gething et al., Nature 293, 620–625 (1981); Mantei et al., Nature 281, 40–46 (1979); EP 117.060 ; und EP 117.058 beschrieben.
D. Nachweisen der Genamplifikation/Genexpression
Die Genamplifikation und/oder Genexpression kann in einer Probe direkt, beispielsweise durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting zur Quantifizierung der Transkription von mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201–5205 (1980)), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung, gemessen werden, und zwar unter Verwendung einer geeignet markierten Sonde auf Basis der hierin bereitgestellten Sequenzen. Alternativ dazu können Antikörper eingesetzt werden, die spezifische Duplexe, einschließlich DNA-Duplexe, RNA-Duplexe und DNA-RNA-Hybrid-Duplexe oder DNA-Protein-Duplexe, erkennen können. Die Antikörper wiederum können markiert sein, und der Test kann durchgeführt werden, wo der Duplex an einer Oberfläche gebildet wird, so dass bei der Bildung des Duplex an der Oberfläche die Gegenwart von an den Duplex gebundenem Antikörper nachgewiesen werden kann.
Die Genexpression kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren wie z. B. durch immunhistochemische Färbung von Zellen oder Gewebeschnitten und Testen von Zellkultur- und Körperflüssigkeiten gemessen werden, um die Expression eines Genprodukts direkt zu quantifizieren. Für die immunhistochemische Färbung und/oder das Testen von Probenflüssigkeiten zweckdienliche Antikörper können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in jeglichem Säugetier hergestellt werden. Zweckdienlicherweise können Antikörper gegen ein Nativsequenz-PRO-Polypeptid oder gegen ein synthetisches Polypeptid auf Basis der hierin bereitgestellten DNA-Sequenzen oder gegen eine exogene Sequenz, die an eine PRO-Polypeptid-DNA fusioniert ist und für ein spezifisches Antikörperepitop kodiert, hergestellt werden.
E. Polypeptidreinigung
Es können Formen von PRO-Polypeptiden aus Kulturmedium oder aus Wirtszelllysaten gewonnen werden. Falls es membrangebunden ist, kann es unter Verwendung einer geeigneten Tensidlösung (z. B. Triton-X 100) oder durch enzymatische Spaltung aus der Membran freigesetzt werden. Bei der Expression von PRO-Polypeptiden eingesetzte Zellen können durch verschiedene physikalische oder chemische Mittel aufgebrochen werden, wie z. B. durch Einfrier-Auftau-Zyklen, Beschallung, mechanischen Aufschluss oder durch Zelllysemittel.
Es kann wünschenswert sein, PRO-Polypeptide von rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu reinigen. Die folgenden Verfahren sind beispielhaft für geeignete Reinigungsverfahren: mittels Fraktionierung an einer Ionentauschersäule; Ethanolpräzipitation; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie an Silika oder an Kationentauscherharz, wie z. B. DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatpräzipitation; Gelfiltration, beispielsweise unter Verwendung von Sephadex G-75; Protein-A-Sepharose-Säulen zur Entfernung von Verunreinigungen, wie z. B. IgG; und metallchelatierende Säulen zur Bindung epitopmarkierter Formen des PRO-Polypeptids. Es können verschiedene Proteinreinigungsverfahren eingesetzt werden, und derartige Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und beispielsweise in Deutscher, Methods in Enzymology 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982), beschrieben. Die gewählten Reinigungsschritte werden beispielsweise von der Art des verwendeten Produktionsverfahrens und des speziell produzierten PRO-Polypeptids abhängen.
Verwendungen für PRO-Polypeptide
Nucleotidsequenzen (oder ihre Komplemente), die für die PRO-Polypeptide der vorliegenden Erfindung kodieren, haben verschiedene Anwendungen auf dem Gebiet der Molekularbiologie, einschließlich Verwendungen als Hybridisierungssonden, bei der Chromosom- und Gen-Kartierung und bei der Erzeugung von Antisense-RNA und -DNA. Für PRO-Polypeptid kodierende Nucleinsäure wird außerdem zur Her stellung von PRO-Polypeptiden durch die hierin beschriebenen Rekombinationstechniken zweckdienlich sein.
Die für Nativsequenz-PRO-Polypeptid voller Länge kodierende Nucleinsäure oder Abschnitte davon können als Hybridisierungssonden für eine cDNA-Bibliothek verwendet werden, um das PRO-Polypeptid-Gen voller Länge zu isolieren oder um noch weitere Gene zu isolieren (z. B. jene, die für natürlich vorkommende Varianten der PRO-Polypeptid-Nucleinsäuresequenzen kodieren), die eine gewünschte Sequenzidentität mit PRO-Polypeptid-Nucleinsäuresequenzen aufweisen. Gegebenenfalls wird die Länge der Sonden ungefähr 20 bis ungefähr 30 Basen betragen. Die Hybridisierungssonden können von der Nucleotidsequenz eines jeglichen hierin offenbarten DNA-Moleküls oder von Genomsequenzen, einschließlich Promotoren, Enhancerelementen und Introns der für Nativsequenz-PRO-Polypeptid kodierenden DNA, hergeleitet werden. Beispielhaft wird ein Screeningverfahren das Isolieren der kodierenden Region des PRO-Polypeptidgens unter Verwendung der bekannten DNA-Sequenz zur Synthese einer gewählten Sonde von ungefähr 40 Basen umfassen. Hybridisierungssonden können mit einer Vielzahl von Markern markiert werden, einschließlich mit Radionukliden, wie z. B. ³²P oder ³⁵S, oder mit enzymatischen Markern, wie z. B. Alkalischer Phosphatase, die über Avidin/Biotin-Kopplungssysteme an die Sonde gekoppelt sind. Markierte Sonden, die eine Sequenz aufweisen, die zu jener des speziellen PRO-Polypeptidgens der vorliegenden Erfindung komplementär ist, können verwendet werden, um Bibliotheken menschlicher cDNA, genomischer DNA oder mRNA zu screenen, um zu ermitteln, an welche Elemente derartiger Bibliotheken die Sonde hybridisiert. Hybridisierungstechniken werden in den unten stehenden Beispielen ausführlicher beschrieben.
Die in der vorliegenden Anmeldung offenbarten ESTs können auf ähnliche Weise unter Verwendung der hierin offenbarten Verfahren als Sonden eingesetzt werden.
Die Sonden können außerdem in PCR-Techniken eingesetzt werden, um einen Pool von Sequenzen zur Identifizierung nahe verwandter PRO-Polypeptidsequenzen zu erzeugen.
Für ein PRO-Polypeptid kodierende Nucleotidsequenzen können außerdem verwendet werden, um Hybridisierungssonden zur Kartierung des Gens zu konstruieren, das für dieses PRO-Polypeptid kodiert, und zur genetischen Analyse von Individuen mit genetischen Störungen. Die hierin bereitgestellten Nucleotidsequenzen können an ein Chromosom und an spezielle Regionen eines Chromosoms kartiert werden, und zwar unter Verwendung bekannter Techniken, wie z. B. In-situ-Hybridisierung, Bindungsanalyse gegen bekannte Chromosomenmarker und Hybridisierungsscreening mit Bibliotheken.
Wenn die kodierende Sequenz für das PRO-Polypeptid für ein Protein kodiert, das an ein anderes Protein bindet, kann das PRO-Polypeptid in Tests zur Identifizierung seiner Liganden verwendet werden. Gleichermaßen können Inhibitoren der Rezeptor/Liganden-Bindungswechselwirkung identifiziert werden. An derartigen Bindungswechselwirkungen beteiligte Proteine können außerdem verwendet werden, um auf Peptid- oder Kleinmolekül-Inhibitoren oder Agonisten der Bindungswechselwirkung zu screenen. Es können Screeningtests konstruiert werden, um Leitverbindungen aufzufinden, welche die biologische Aktivität eines nativen PRO-Polypeptids oder eines Liganden für das PRO-Polypeptid nachahmen. Derartige Screeningtests werden Tests umfassen, die dem High-throughput-Screening chemischer Bibliotheken zugänglich sind, was sie insbesondere zur Identifizierung von Kleinmolekül-Medikamentkandidaten geeignet macht. Vorgesehene Kleinmoleküle umfassen synthetische organische oder anorganische Verbindungen. Die Tests können in einer Vielzahl von Ausführungen durchgeführt werden und umfassen Protein-Protein-Bindungstests, biochemische Screeningtests, Immuntests und auf Zellen basierende Tests, die alle auf dem Gebiet der Erfindung gut charakterisiert sind.
Nucleinsäuren, die für ein PRO-Polypeptid oder seine modifizierten Formen kodieren, können außerdem verwendet werden, um entweder transgene Tiere oder „Knock-out"-Tiere zu erzeugen, die ihrerseits bei der Entwicklung und beim Screening von therapeutisch zweckdienlichen Reagenzien zweckdienlich sind. Ein transgenes Tier (z. B. eine Maus oder Ratte) ist ein Tier mit Zellen, die ein Transgen enthalten, wobei das Transgen in einem pränatalen, z. B. embryonalen, Stadium in das Tier oder in einen Vorfahren des Tiers eingeführt worden ist. Ein Transgen ist eine DNA, die in das Genom einer Zelle integriert ist, aus der sich ein transgenes Tier entwickelt. In einer ihrer Ausführungsformen kann die für ein PRO-Polypeptid kodierende cDNA verwendet werden, um für das PRO-Polypeptid kodierende, genomische DNA nach etablierten Techniken zu klonieren, wobei die genomischen Sequenzen verwendet werden, um transgene Tiere zu erzeugen, die Zellen enthalten, die für das PRO-Polypeptide kodierende DNA exprimieren. Verfahren zur Erzeugung von transgenen Tieren, insbesondere Tieren wie Mäusen oder Ratten, sind auf dem Gebiet der Erfindung gebräuchlich geworden und werden beispielsweise in den US-Patenten Nr. 4.736.866 und 4.870.009 beschrieben. Typischerweise würde man für die PRO-Polypeptid-Transgen-Inkorporation mit gewebespezifischen Enhancern auf bestimmte Zellen abzielen. Transgene Tiere, die eine im Embryonalstadium in die Keimbahn des Tiers eingeführte Kopie des für ein PRO-Polypeptid kodierenden Transgens umfassen, können verwendet werden, um die Wirkung einer erhöhten Expression der für das PRO-Polypeptid kodierenden DNA zu untersuchen. Solche Tiere können als Testtiere für Reagenzien verwendet werden, von denen angenommen wird, dass sie Schutz, beispielsweise vor pathologischen Zuständen, verleihen, die mit seiner Überexpression zusammenhängen. Nach diesem Aspekt der Erfindung wird ein Tier mit dem Reagens behandelt, und ein vermindertes Auftreten des pathologischen Zustands im Vergleich zu unbehandelten, das Transgen tragenden Tieren würde die Möglichkeit einer therapeutischen Intervention für den pathologischen Zustand anzeigen.
Alternativ dazu können nicht-menschliche Homologe der PRO-Polypeptide verwendet werden, um ein PRO-Polypeptid-„knock-out”-Tier zu konstruieren, das ein defektes oder verändertes, für das PRO-Polypeptid von Interesse kodierendes Gen aufweist, und zwar als Resultat der homologen Rekombination zwischen dem endogenen, für das PRO-Polypeptid kodierenden Gen und der veränderten genomischen, für das PRO-Polypeptid kodierenden DNA, die in eine embryonale Zelle des Tiers eingeführt worden ist. Beispielsweise kann für ein PRO-Polypeptid kodierende cDNA verwendet werden, um für das PRO-Polypeptid kodierende genomische DNA nach etablierten Techniken zu klonieren. Ein Abschnitt der für ein PRO-Polypeptid ko dierenden genomischen DNA kann deletiert oder durch ein anderes Gen, wie z. B. durch ein für einen selektierbaren Marker kodierendes Gen, ersetzt werden, das zur Beobachtung der Integration verwendet werden kann. Typischerweise sind mehrere Kilobasen unveränderte flankierende DNA (sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende) im Vektor enthalten (siehe z. B. Thomas und Capecchi, Cell 51, 503 (1987), für eine Beschreibung von homologen Rekombinationsvektoren). Der Vektor wird in eine embryonale Stammzelllinie (z. B. durch Elektroporation) eingeführt, und es werden Zellen ausgewählt, in denen die eingeführte DNA homolog mit endogener DNA rekombiniert hat (siehe Li et al., Cell 69, 915 (1992)). Die gewählten Zellen werden dann in eine Blastozyte eines Tiers (z. B. einer Maus oder Ratte) injiziert, um Aggregationschimären zu bilden (siehe z. B. Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson (Hrsg.), IRL, Oxford, S. 113–152 (1987)). Ein chimärer Embryo kann dann in ein geeignetes pseudoträchtiges weibliches Ziehtier implantiert und der Embryo geboren werden, um ein „Knock-out"-Tier zu erzeugen. Nachkommen, welche die homolog rekombinierte DNA in ihren Keimzellen tragen, können mittels Standardtechniken identifiziert und verwendet werden, um Tiere zu züchten, in denen alle Zellen der Tiere die homolog rekombinierte DNA enthalten. Knock-out-Tiere können beispielsweise auf ihre Fähigkeit hin charakterisiert werden, sich gegen bestimmte pathologische Zustände zu verteidigen und pathologische Zustände aufgrund des Fehlens des PRO-Polypeptids zu entwickeln.
Wenn eine In-vivo-Verabreichung eines PRO-Polypeptids eingesetzt wird, können normale Dosismengen von ungefähr 10 ng/kg bis zu 100 mg/kg Säugetier-Körpergewicht oder mehr pro Tag, vorzugsweise von ungefähr 1 μg/kg/Tag bis 10 mg/kg/Tag, in Abhängigkeit vom Verabreichungsweg variieren. Richtlinien über bestimmte Dosierungen und Abgabeverfahren werden in der Literatur bereitgestellt; siehe beispielsweise US-Patente Nr. 4.657.760 ; 5.206.344 ; oder 5.225.212 . Es wird erwartet, dass unterschiedliche Formulierungen für unterschiedliche Behandlungsverbindungen und unterschiedliche Störungen wirksam sein werden und dass die auf ein Organ oder Gewebe abzielende Verabreichung beispielsweise die Abgabe auf eine Weise erfordern wird, die sich von der eines anderen Organs oder Gewebes unterscheidet.
Wo eine Retard-Verabreichung eines PRO-Polypeptids in einer Formulierung mit für die Behandlung einer beliebigen Krankheit oder Störung geeigneten Freisetzungseigenschaften erwünscht ist, wird die Mikroverkapselung des PRO-Polypeptids erwogen. Die Mikroverkapselung rekombinanter Proteine für nachhaltige Freisetzung ist mit menschlichem Wachstumshormon (rhGH), Interferon (rhIFN), Interleukin 2 und MN rgp120 erfolgreich durchgeführt worden. Johnson et al., Nat. Med. 2, 795–799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther. 27, 1221–1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology 8, 755–758 (1990); Cleland, Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems, in: Powell und Newman (Hrsg.), Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Plenum Press, New York, S. 439–462 (1995); WO 97/03692 , WO 96/40072 , WO 96/07399 ; und US-Patent Nr. 5.654.010 .
Die Retard-Formulierungen dieser Proteine wurden unter Verwendung von Poly-Milchsäure-Coglycolsäure-(PLGA-)Polymer aufgrund seiner Bioverträglichkeit und breiten Palette von biologisch abbaubaren Eigenschaften entwickelt. Die Abbauprodukte von PLGA, Milch- und Glycolsäure können schnell aus dem menschlichen Körper ausgeschieden werden. Darüber hinaus kann die Abbaubarkeit dieses Polymers in Abhängigkeit von seinem Molekulargewicht und seiner Zusammensetzung auf Monate bis Jahre eingestellt werden. Lewis, Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer, in: M. Chasin und R. Langer (Hrsg.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, New York, S. 1–41 (1990).
Beispielsweise wäre für eine Formulierung, die eine Dosierung von ungefähr 80 g/kg/Tag in Säugetieren mit einem Maximalkörpergewicht von 85 kg bereitstellen kann, die höchste Dosierung ungefähr 6,8 mg des PRO-Polypeptids pro Tag. Um dieses Dosierungsausmaß zu erzielen, ist eine nachhaltig freisetzende Formulierung notwendig, die eine maximal mögliche Proteinbeladung (15–20 Gew.-% PRO-Polypeptid) mit dem niedrigstmöglichen Anfangs-Burst (<20%) enthält. Eine kontinuierliche (nullter Ordnung) Freisetzung des PRO-Polypeptids aus Mikroteilchen für 1–2 Wochen ist ebenfalls wünschenswert. Außerdem sollte das verkapselte, freizu setzende Protein seine Integrität und Stabilität über den gewünschten Freisetzungszeitraum beibehalten.
PRO531-Polypeptide der vorliegenden Erfindung, die eine biologische Aktivität besitzen, die mit jener des Prostasin-Proteins verwandt ist, können sowohl in vivo für therapeutische Zwecke als auch in vitro angewandt werden. Dem Fachmann ist wohlbekannt, wie die PRO351-Polypeptide der vorliegenden Erfindung für solche Zwecke zu verwenden sind.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können nach bekannten Verfahren formuliert werden, um pharmazeutisch zweckdienliche Zusammensetzungen herzustellen, wobei das PRO-Polypeptid hiervon in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägervehikel kombiniert wird. Geeignete Trägervehikel und ihre Formulierung, einschließlich anderer menschlicher Proteine, z. B. menschliches Serumalbumin, werden beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences, Oslo et al. (Hrsg.), 16. Aufl., Mack Publishing Co. (1980), beschrieben, wobei die darin enthaltenen Offenbarungen hiermit durch Verweis aufgenommen sind.
Dosierungen und gewünschte Medikamentkonzentrationen von pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in Abhängigkeit von der speziell vorgesehenen Verwendung variieren. Beispielsweise sind bei der Behandlung der Thrombose tiefer Venen oder peripheren Gefäßkrankheit „Bolus"-Dosierungen typischerweise bevorzugt, wobei nachträgliche Verabreichungen folgen, um einen annähernd konstanten Blutspiegel, vorzugsweise in der Größenordnung von ungefähr 3 μg/ml, zu erhalten.
Jedoch wird es zur Verwendung in Verbindung mit medizinischen Notfallseinrichtungen, wo eine Infusionsmöglichkeit im Allgemeinen nicht besteht, und aufgrund des allgemein kritischen Charakters der zugrunde liegenden Krankheit (z. B. Embolie, Infarkt) im Allgemeinen wünschenswert sein, etwas höhere Anfangsdosen, wie z. B. als intravenösen Bolus, bereitzustellen.
Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper
Die vorliegende Erfindung stellt weiters Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper bereit. Beispielhafte Antikörper umfassen polyklonale, monoklonale, humanisierte, bispezifische und heterokonjugierte Antikörper.
A. Polyklonale Antikörper
Die Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper können polyklonale Antikörper umfassen. Verfahren zur Herstellung polyklonaler Antikörper sind dem Fachmann bekannt. Polyklonale Antikörper können in einem Säugetier, beispielsweise durch eine oder mehrere Injektionen eines immunisierenden Mittels und, falls erwünscht, eines Adjuvans hergestellt werden. Typischerweise wird das immunisierende Mittel und/oder Adjuvans durch mehrfache subkutane oder intraperitoneale Injektionen in das Säugetier injiziert. Das immunisierende Mittel kann das PRO-Polypeptid oder ein Fusionsprotein davon umfassen. Es kann zweckdienlich sein, das immunisierende Mittel an ein Protein zu konjugieren, das im immunisierten Tier bekanntermaßen immunogen ist. Beispiele solcher immunogener Proteine umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Keyhole-Limpet-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyroglobulin und Sojabohnen-Trypsininhibitor. Beispiel von Adjuvantien, die eingesetzt werden können, umfassen Freundsches komplettes Adjuvans und MPL-TDM-Adjuvans (Monophosphoryl-Lipid A, synthetisches Trehalose-Dicorynomycolat). Das Immunisierungsprotokoll kann vom Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung ohne übermäßiges Experimentieren gewählt werden.
B. Monoklononale Antikörper
Die Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper können alternativ dazu monoklonale Antikörper sein. Monoklonale Antikörper können unter Verwendung von Hybridomverfahren, wie z. B. jenen, die von Kohler und Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschrieben werden, hergestellt werden. In einem Hybridomverfahren wird eine Maus, ein Hamster oder ein anderes geeignetes Wirtstier typischerweise mit einem immunisierenden Mittel immunisiert, um Lymphozyten hervorzubringen, die Antikörper produzieren oder zur Produktion von Antikörpern fähig sind, die spezifisch an das immunisierende Mittel binden. Alternativ dazu können die Lymphozyten in vitro immunisiert werden.
Das immunisierende Mittel wird typischerweise das PRO-Polypeptid von Interesse oder ein Fusionsprotein davon umfassen. Im Allgemeinen werden entweder Peripherblut-Lymphozyten („PBLs") verwendet, falls Zellen menschlichen Ursprungs erwünscht sind, oder Milzzellen oder Lymphknotenzellen, falls nicht-menschliche Säugetierquellen erwünscht sind. Die Lymphozyten werden dann mit einer immortalisierten Zelllinie unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels, wie z. B. Polyethylenglykol, fusioniert, um eine Hybridomzelle auszubilden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, S. 59–103 (1986)). Immortalisierte Zelllinien sind üblicherweise transformierte Säugetierzellen, insbesondere vom Nager, Rinder oder Menschen stammende Myelomzellen. Üblicherweise werden Ratten- oder Maus-Myelomzelllinien eingesetzt. Die Hybridomzellen können in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert werden, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben der unfusionierten, immortalisierten Zellen hemmen. Wenn beispielsweise den Elternzellen das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT) fehlt, umfasst das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium), wobei diese Substanzen das Wachstum von HGPRT-defekten Zellen verhindern.
Bevorzugte immortalisierte Zelllinien sind jene, die effizient fusionieren, eine stabile, hohe Antikörperexpression durch die gewählten, Antikörper produzierenden Zellen fördern und gegen ein Medium, wie z. B. das HAT-Medium, empfindlich sind. Bevorzugtere immortalisierte Zelllinien sind Maus-Myelomlinien, die beispielsweise vom Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien, und der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, erhalten werden können. Menschliche Myelom- und Maus-Mensch-Heteromyelomzelllinien sind außerdem für die Produktion von menschlichen monoklonalen Antikörpern beschrieben worden (Kozbor, J. Immu nol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker Inc., New York, S. 51–63 (1987)).
Das Kulturmedium, in dem die Hybridomzellen kultiviert werden, kann dann auf die Gegenwart von gegen das PRO-Polypeptid von Interesse gerichteten monoklonalen Antikörpern getestet werden. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität der von den Hybridomzellen gebildeten monoklonalen Antikörper mittels Immunpräzipitation oder durch einen In-vitro-Bindungstest, wie z. B. den Radioimmuntest (RIA) oder Enzyme-linked-immunoabsorbent-assay (ELISA), bestimmt. Derartige Techniken und Tests sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann beispielsweise mit der Scatchard-Analyse von Munson und Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt werden.
Nachdem die gewünschten Hybridomzellen identifiziert worden sind, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und mittels Standardverfahren gezüchtet werden (Goding, s. o.). Geeignete Kulturmedien zu diesem Zweck umfassen beispielsweise Dulbecco's Modified Eagle's Medium und RPMI-1640-Medium. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in vivo als Aszites in einem Säugetier gezüchtet werden.
Die von den Subklonen sekretierten monoklonalen Antikörper können aus dem Kulturmedium oder aus der Aszitesflüssigkeit durch herkömmliche Immunglobulinreinigungsverfahren, wie z. B. Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie isoliert oder gereinigt werden.
Die monoklonalen Antikörper können auch durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden, wie z. B. durch jene, die im US-Patent Nr. 4.816.567 beschrieben sind. Für die monoklonalen Antikörper der Erfindung kodierende DNA kann unter Verwendung herkömmlicher Verfahren (z. B. durch Verwendung von Oligonucleotidsonden, die zur spezifischen Bindung an Gene fähig sind, die für die Schwer- und Leichtketten von Maus-Antikörpern kodieren) leicht isoliert und sequenziert werden.
Die Hybridomzellen der Erfindung dienen als bevorzugte Quelle derartiger DNA. Wenn sie einmal isoliert ist, kann die DNA in Expressionsvektoren eingebaut werden, die dann in Wirtszellen wie z. B. Simian-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstock-(CHO-)Zellen oder Myelomzellen transfiziert werden, die ansonsten kein Immunglobulinprotein produzieren, um die Synthese monoklonaler Antikörper in den rekombinanten Wirtszellen zu erlangen. Die DNA kann auch modifiziert werden, beispielsweise durch Substituieren von Maus-Sequenzen durch die homologe kodierende Sequenz für konstante menschliche Schwer- und Leichtketten-Domänen ( US-Patent Nr. 4.816.567 ; Morrison et al., s. o.) oder durch kovalentes Binden der gesamten oder eines Teils der kodierenden Sequenz für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid an die für Immunglobulin kodierende Sequenz. Die konstanten Domänen eines Antikörpers der Erfindung können durch ein derartiges Nicht-Immunglobulin-Polypeptid substituiert werden, oder es können die variablen Domänen einer der Antigen-kombinierenden Stellen eines Antikörpers der Erfindung substituiert werden, um einen chimären, zweiwertigen Antikörper zu erzeugen.
Die Antikörper können einwertige Antikörper sein. Verfahren zur Herstellung einwertiger Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. Beispielsweise umfasst eines der Verfahren die rekombinante Expression der Immunglobulin-Leichtkette und der modifizierten Schwerkette. Die Schwerkette ist im Allgemeinen an einer beliebigen Position in der Fc-Region trunkiert, so dass eine Schwerkettenvernetzung verhindert wird. Alternativ dazu werden die maßgeblichen Cysteinreste durch einen anderen Aminosäurerest substituiert, oder sie werden deletiert, so dass eine Vernetzung verhindert wird.
In-vitro-Verfahren sind ebenfalls zur Herstellung einwertiger Antikörper geeignet. Der Verdau von Antikörpern, um Fragmente davon, insbesondere Fab-Fragmente, zu produzieren, kann durch Verwenden von Routinetechniken erzielt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind.
C. Humanisierte Antikörper
Die Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper der Erfindung können außerdem humanisierte Antikörper oder menschliche Antikörper umfassen. Humanisierte Formen nicht-menschlicher (z. B. Maus-)Antikörper sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z. B. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere antigenbindende Untersequenzen von Antikörpern), die eine von nicht-menschlichem Immunglobulin stammende Minimalsequenz enthalten. Humanisierte Antikörper umfassen menschliche Immunglobuline (Empfängerantikörper), in denen Reste aus einer Complementary-determining-region (CDR) des Empfängers durch Reste aus einer CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Spenderantikörper), wie z. B. Maus, Ratte oder Kaninchen, mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In manchen Fällen werden Fv-Gerüstreste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Humanisierte Antikörper können außerdem Reste umfassen, die sich weder im Empfängerantikörper, noch in den importierten CDR- oder Gerüstresten finden. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von zumindest einer und typischerweise zwei variablen Domänen, in denen alle oder im Wesentlichen alle CDR-Regionen denen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulin-Konsensussequenz sind. Der humanisierte Antikörper umfasst gegebenenfalls zumindest einen Abschnitt einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jenen eines menschlichen Immunglobulins (Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593–596 (1992)).
Verfahren zur Humanisierung nicht-menschlicher Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste auf, die in diesen aus einer nicht-menschlichen Quelle eingeführt worden sind. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden häufig als „Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise einer variablen „Import"-Domäne entnommen sind. Die Humanisierung kann im Wesentlichen nach dem Verfahren von Winter und Mitarbeitern (Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534–1536 (1988)) durch Substituieren der Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durch entsprechende Nager-CDRs oder -CDR-Sequenzen durchgeführt werden. Demgemäß sind derartige „humanisierte" Antikörper chimäre Antikörper ( US-Patent Nr. 4.816.567 ), worin im Wesentlichen weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch die entsprechende Sequenz aus einer nicht-menschlichen Spezies substituiert worden ist. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche Antikörper, in denen einige CDR-Reste und möglicherweise einige FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen in Nager-Antikörpern substituiert sind.
Menschliche Antikörper können außerdem unter Verwendung von verschiedenen, auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Techniken hergestellt werden, einschließlich Phagen-Display-Bibliotheken (Hoogenboom und Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)). Die Techniken von Cole et al. und Boerner et al. sind zur Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern ebenfalls verfügbar (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, S. 77 (1985), und Boerner et al., J. Immunol. 147(1), 86–95 (1991)).
D. Bispezifische Antikörper
Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise menschliche oder humanisierte Antikörper, die Bindungsspezifitäten für zumindest zwei verschiedene Antigene aufweisen. Im vorliegenden Fall ist eine der Bindungsspezifitäten für das PRO-Polypeptid, die andere ist für ein beliebiges anderes Antigen und vorzugsweise für ein Zelloberflächenprotein oder einen Rezeptor oder eine Rezeptoruntereinheit.
Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Herkömmlicherweise basiert die rekombinante Produktion bispezifischer Antikörper auf der Coexpression von zwei Immunglobulin-Schwerketten/Leichtketten-Paaren, wobei die beiden Schwerketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen (Milstein und Cuello, Nature 305, 537–539 (1983)). Wegen der statistischen Verteilung von Immunglobulin-Schwer- und -Leichtketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein mögliches Gemisch von zehn verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten Moleküls wird üblicherweise durch affinitätschromatographische Schritte erzielt. Ähnliche Verfahren sind in WO 93/08829 , veröffentlicht am 13. Mai 1993, und in Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655–3659 (1991), offenbart.
Variable Antikörperdomänen mit den gewünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-kombinierenden Stellen) können an Sequenzen konstanter Immunglobulindomänen fusioniert werden. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer konstanten Immunglobulin-Schwerkettendomäne, die zumindest einen Abschnitt der Gelenk-, CH2- und CH3-Regionen umfasst. Es wird bevorzugt, dass die erste konstante Schwerkettenregion (CH1), welche die für die Leichtkettenbindung notwendige Stelle enthält, in zumindest einer der Fusionen vorhanden ist. DNAs, die für die Immunglobulin-Schwerketten-Fusionen und, falls erwünscht, Immunglobulin-Leichtkette kodieren, werden in gesonderte Expressionsvektoren insertiert und in einen geeigneten Wirtsorganismus cotransfiziert. Für weitere Einzelheiten der Erzeugung bispezifischer Antikörper siehe beispielsweise Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
E. Heterokonjugat-Antikörper
Heterokonjugat-Antikörper sind im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung ebenfalls enthalten. Heterokonjugat-Antikörper sind aus zwei kovalent verbundenen Antikörpern zusammengesetzt. Derartige Antikörper sind beispielsweise zum Abzielen von Immunsystemzellen auf unerwünschte Zellen ( US-Patent Nr. 4.676.980 ) und zur Behandlung der HIV-Infektion ( WO 91/00360 ; WO 92/200373 ; EP 03089 ) vorgeschlagen worden. Es ist vorgesehen, dass die Antikörper in vitro unter Verwendung bekannter Verfahren der synthetischen Proteinchemie, einschließlich jener, die Vernetzungsmittel umfassen, hergestellt werden können. Beispielsweise können Immunotoxine unter Verwendung einer Disulfid-Austauschreaktion oder durch Bildung einer Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele geeigneter Reagenzien zu die sem Zweck umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat und jene, die beispielsweise im US-Patent Nr. 4.676.980 offenbart sind.
Verwendungen für Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper
Die Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper der Erfindung weisen verschiedene Verwendungen auf. Beispielsweise können Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper in diagnostischen Tests für ein PRO-Polypeptid, z. B. zum Nachweis seiner Expression in speziellen Zellen, Geweben oder Serum, verwendet werden. Es können verschiedene diagnostische Testtechniken, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, verwendet werden, wie z. B. kompetitive Bindungstests, direkte oder indirekte Sandwichtests und Immunpräzipitationstests, die entweder in heterogenen oder in homogenen Phasen durchgeführt werden (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press Inc., S. 147–158 (1987)). Die in den diagnostischen Tests verwendeten Antikörper können mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert sein. Die nachweisbare Gruppierung sollte fähig sein, entweder direkt oder indirekt ein nachweisbares Signal zu produzieren. Beispielsweise kann die nachweisbare Gruppierung ein Radioisotop, wie z. B. ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S oder ¹²⁵I, eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Verbindung, wie z. B. Fluorescein-Isothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin, oder ein Enzym, wie z. B. Alkalische Phosphatase, Beta-Galactosidase oder Meerrettich-Peroxidase, sein. Jegliches auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren zum Konjugieren des Antikörpers an die nachweisbare Gruppierung kann eingesetzt werden, einschließlich jener Verfahren, die von Hunter et al., Nature 144, 945 (1962); David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981); und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982), beschrieben sind.
Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper sind außerdem für die Affinitätsreinigung des PRO-Polypeptids aus rekombinanter Zellkultur oder natürlichen Quellen zweckdienlich. Bei diesem Verfahren werden die gegen das PRO-Polypeptid hergestellten Antikörper auf einem geeigneten Träger wie z. B. Sephadex-Harz oder Filterpapier unter Verwendung von Verfahren immobilisiert, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind. Der immobilisierte Antikörper wird dann mit einer das zu reinigende PRO-Polypeptid enthaltenden Probe kontaktiert, worauf der Träger mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen wird, der im Wesentlichen das gesamte Material in der Probe mit Ausnahme des PRO-Polypeptids, das an den immobilisierten Antikörper gebunden ist, entfernt. Schließlich wird der Träger mit einem weiteren geeigneten Lösungsmittel gewaschen, welches das PRO-Polypeptid vom Antikörper freisetzt.
Die folgenden Beispiele werden ausschließlich zu illustrativen Zwecken bereitgestellt und beabsichtigen nicht, den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken.
BEISPIELE
Im Handel erhältliche Reagenzien, auf die in den Beispielen Bezug genommen wird, wurden, falls nicht anders angegeben, nach den Anleitungen der Hersteller verwendet. Die Quelle jener Zellen, die in den folgenden Beispielen und in der gesamten Patentschrift mit ATCC-Zugangsnummern bezeichnet sind, ist die American Type Culture Collection, Rockville, Maryland.
BEISPIEL 1: Homologie-Screening extrazellulärer Domänen zur Identifizierung neuer Polypeptide und der dafür kodierenden cDNA
Die Sequenzen (einschließlich der Sekretionssignalsequenz, falls vorhanden) extrazellulärer Domänen (ECD) von ungefähr 950 bekannten sekretierten Proteinen aus der öffentlichen Swiss-Prot-Datenbank wurden verwendet, um EST-Datenbanken zu durchsuchen. Die EST-Datenbanken umfassten öffentliche Datenbanken (z. B. Dayhoff, GenBank) und geschützte Datenbanken (z. B. LIFESEQ^TM, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA). Die Suche wurde unter Verwendung des Computerprogramms BLAST oder BLAST2 (Altschul und Gish, Methods in Enzymology 266, 460–480 (1996)) als Vergleich der ECD-Proteinsequenzen mit einer 6-Rahmen-Translation der EST-Sequenzen durchgeführt. Jene Vergleiche mit einer Blast-Bewertung von 70 (oder in manchen Fällen 90) oder höher, die nicht für bekannte Protein kodierten, wurden angesammelt und mit dem Programm „phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, WA; (http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/phrap.html)) in Konsensus-DNA-Sequenzen assembliert.
Unter Verwendung dieses Homologie-Screenings extrazellulärer Domänen wurden Konsensus-DNA-Sequenzen bezüglich der anderen identifizierten EST-Sequenzen unter Verwendung von phrap assembliert. Zusätzlich wurden die erhaltenen Konsensus-DNA-Sequenzen häufig (jedoch nicht immer) unter Verwendung wiederholter BLAST-Zyklen und phrap verlängert, um die Konsensussequenz so weit wie möglich zu verlängern, wobei die oben erörterten Quellen von EST-Sequenzen verwendet wurden.
Auf Basis der wie oben beschrieben erhaltenen Konsensussequenzen wurden dann Oligonucleotide synthetisiert und verwendet, um mittels PCR eine die Sequenz von Interesse enthaltende cDNA-Bibliothek zu identifizieren, und zur Verwendung als Sonden, um einen Klon der kodierenden Sequenz für ein PRO-Polypeptid voller Länge zu isolieren, verwendet. Vorwärts- (.f-) und reverse (.r-) PCR-Primer liegen im Allgemeinen im Bereich von 20 bis 30 Nucleotiden und sind häufig so konstruiert, dass sie ein PCR-Produkt von ungefähr 100–1000 bp Länge liefern. Die Sonden- (.p-) Sequenzen weisen typischerweise ein Länge von 40–55 bp auf. In manchen Fällen werden zusätzliche Oligonucleotide synthetisiert, wenn die Konsensussequenz größer als ungefähr 1–1,5 kbp ist. Um mehrere Bibliotheken auf einen Klon voller Länge zu screenen, wurde DNA aus den Bibliotheken mittels PCR-Amplifikation gemäß Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, mit dem PCR-Primerpaar gescreent. Eine positive Bibliothek wurde dann verwendet, um für das Gen von Interesse kodierende Klone unter Verwendung des Sonden-Oligonucleotids und eines der Primerpaare zu isolieren.
Die zur Isolierung der cDNA-Klone verwendeten cDNA-Bibliotheken wurden mittels Standardtechniken unter Verwendung von im Handel erhältlichen Reagenzien, wie z. B. jenen von Invitrogen, San Diego, CA, konstruiert. Die cDNA wurde mit Oligo-dT geprimt, das eine NotI-Stelle enthielt, mit Hemikinase behandelten Stumpf → SalI-Adaptoren ligiert, mit NotI gespalten, mittels Gelelektrophorese in geeigneter Weise nach Größe aufgetrennt und in einer definierten Ausrichtung in einen geeigneten Klonierungsvektor (wie z. B. pRKB oder pRKD; pRK5B ist ein Vorläufer von pRK5D, der die SfiI-Stelle nicht enthält; siehe Holmes et al., Science 253, 1278–1280 (1991)) in die einzigartigen XhoI- und NotI-Stellen kloniert.
BEISPIEL 2: Isolierung von cDNA-Klonen mittels Amylase-Screening
1. Herstellung der Oligo-dT-geprimten cDNA-Bibliothek
mRNA wurde aus menschlichem Gewebe von Interesse unter Verwendung von Reagenzien und Protokollen von Invitrogen, San Diego, CA, (Fast Track 2) isoliert. Diese RNA wurde verwendet, um eine Oligo-dT-geprimte cDNA-Bibliothek im Vektor pRK5D unter Verwendung von Reagenzien und Protokollen von Life Technologies, Gaithersburg, MD, (Super Script Plasmid System) zu erzeugen. Bei diesem Verfahren wurde doppelsträngige cDNA auf eine Größe von mehr als 1.000 bp klassiert und die SalI/NotI-verbundene cDNA in den XhoI/NotI-gespaltenen Vektor kloniert. pRK5D ist ein Klonierungsvektor, der eine sp6-Transkriptionsinitiationsstelle, gefolgt von einer SfiI-Restriktionsenzymstelle aufweist, die den XhoI/NotI-cDNA-Klonierungsstellen vorausgeht.
2. Herstellung der zufallsgeprimten cDNA-Bibliothek
Es wurde eine sekundäre cDNA-Bibliothek erzeugt, um bevorzugt die 5'-Enden der primären cDNA-Klone darzustellen. Sp6-DNA wurde aus der Primärbibliothek (oben beschrieben) erzeugt und diese RNA verwendet, um eine zufallsgeprimte cDNA-Bibliothek in den Vektor ASST-AMY.0 unter Verwendung von Reagenzien und Protokollen von Life Technologies (Super Script Plasmid System, oben zitiert) zu erzeugen. Bei diesem Verfahren wurde doppelsträngige cDNA auf eine Größe von 500–1.000 bp klassiert, mit Stumpf → NotI-Adaptoren verbunden, mit SfiI gespalten und in den mit SfiI/NotI-gespaltenen Vektor kloniert. ASST-AMY.0 ist ein Klonierungsvektor, der einen den cDNA-Klonierungsstellen vorausgehenden Alkoholdehydrogenase-Promotor und die Maus-Amylasesequenz aufweist (die reife Sequenz ohne Sekretionssignal), gefolgt vom Hefe-Alkoholdehydrogenase-Terminator im Anschluss an die Klonierungsstellen. Folglich werden die in diesen Vektor klonierten cDNAs, die mit der Amylasesequenz In-frame fusioniert sind, die Sekretion von Amylase aus geeignet transfizierten Hefekolonien bewirken.
3. Transformation und Nachweis
DNA aus der im obigen Abschnitt 2 beschriebenen Bibliothek wurde auf Eis gekühlt, worauf elektrokompetente DH10B-Bakterien (Life Technologies, 20 ml) zugegeben wurden. Bakterien und Vektorgemisch wurden dann wie vom Hersteller empfohlen der Elektroporation unterzogen. Anschließend wurde SOC-Medium (Life Technologies, 1 ml) zugegeben und das Gemisch bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert. Die Transformanten wurden dann auf 20 standardmäßige, Ampicillin enthaltende 150-mm-LB-Platten ausplattiert und 16 Stunden lang (37°C) inkubiert. Positive Kolonien wurden von den Platten abgeschabt und die DNA aus dem Bakterienpellet unter Verwendung von Standardprotokollen, z. B. mittels CsCl-Gradienten, isoliert. Die gereinigte DNA wurde dann nach den unten stehenden Hefeprotokollen weiterverarbeitet.
Die Hefeverfahren wurden in drei Kategorien unterteilt: (1) Transformation von Hefe mit dem kombinierten Plasmid/DNA-Vektor; (2) Nachweis und Isolierung von Amylase sekretierenden Hefeklonen; und (3) PCR-Amplifikation des Inserts direkt aus der Hefekolonie und Reinigung der DNA zur Sequenzierung und weiteren Analyse.
Der verwendete Hefestamm war HD56-5A (ATCC 90785). Dieser Stamm weist den folgenden Genotyp auf: MAT alpha, ura3-52, leu2-3, leu2-112, his3-11, his3-15, MAL⁺, SUC⁺, GAL⁺. Vorzugsweise können Hefemutanten eingesetzt werden, die defekte post-translationelle Wege aufweisen. Derartige Mutanten können translokationsdefekte Allele in sec71, sec72, sec62 aufweisen, wobei trunkiertes sec71 insbesondere bevorzugt ist. Alternativ dazu können Antagonisten (einschließlich Anti sense-Nucleotide und/oder Liganden), welche die normale Funktion dieser stören, andere mit diesem Post-Translationsweg in Zusammenhang gebrachte Proteine (z. B. SEC61p, SEC72p, SEC62p, SEC63p, TDJ1p oder SSA1p-4p) oder die Komplexbildung dieser Proteine ebenfalls vorzugsweise in Kombination mit der Amylase exprimierenden Hefe eingesetzt werden.
Die Transformation wurde auf Basis des von Gietz et al., Nucl. Acid. Res. 20, 1425 (1992), dargelegten Protokolls durchgeführt. Die transformierten Zellen wurden dann aus Agar in komplexe YEPD-Medium-Kulturlösung (100 ml) inokuliert und über Nacht bei 30°C gezüchtet. Die YEPD-Kulturlösung wurde wie von Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 207 (1994), beschrieben hergestellt. Die Übernachtkultur wurde dann auf ungefähr 2 × 10⁶ Zellen/ml (ungefähre OD₆₀₀ = 0,1) in frische YEPD-Kulturlösung (500 ml) verdünnt und nochmals auf 1 × 10⁷ Zellen/ml (ungefähre OD₆₀₀ = 0,4–0,5) gezüchtet.
Die Zellen wurden dann geerntet und zur Transformation vorbereitet, und zwar durch Transfer in GS3-Rotorflaschen in einem Sorval-GS3-Rotor bei 5.000 U/min für 5 Minuten, Verwerfen des Überstands und anschließende Resuspension in sterilem Wasser und nochmalige Zentrifugation in 50-ml-Falcon-Röhrchen bei 3.500 U/min in einer Beckman-GS-6KR-Zentrifuge. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen anschließend mit LiAc/TE (10 ml, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5, 100 mM Li₂OOCCH₃) gewaschen und in LiAc/TE (2,5 ml) resuspendiert.
Die Transformation erfolgte durch Mischen der präparierten Zellen (100 μl) mit frisch denaturierter einzelsträngiger Lachshoden-DNA (Lofstrand Labs, Gaithersburg, MD) und transformierender DNA (1 μg, Vol. < 10 μl) in Mirozentrifugenröhrchen. Das Gemisch wurde durch Vortexen kurz vermischt, worauf 40% PEG/TE (600 μl, 40% Polyethylenglykol-4000, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM Li₂OOCCH₃ pH 7,5) zugegeben wurden. Das Gemisch wurde sanft vermischt und bei 30°C unter Schwenken 30 Minuten lang inkubiert. Die Zellen wurden dann einem Hitzeschock bei 42°C für 15 Minuten unterzogen und das Reaktionsgefäß in einer Mikrozentrifuge bei 12.000 U/min 5–10 Sekunden lang zentrifugiert, dekantiert und in TE (500 μl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5) resuspendiert, gefolgt von nochmaliger Zentrifugation. Die Zellen wurden dann in TE (1 ml) verdünnt und Aliquoten (200 μl) auf Selektivmedium ausgestrichen, das vorher in 150-mm-Wachstumsplatten (VWR) hergestellt worden war.
Alternativ dazu wurde die Transformation anstelle von mehreren kleinen Reaktionen unter Verwendung einer einzigen Reaktion im großen Maßstab durchgeführt, worin die Reagensmengen entsprechend erhöht wurden.
Das verwendete Selektivmedium war ein synthetischer vollständiger Dextrose-Agar, dem Uracil fehlte (SCD-Ura) und der wie in Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. S. 208–210 (1994), beschrieben hergestellt wurde. Die Transformanten wurden bei 30°C 2–3 Tage lang gezüchtet.
Der Nachweis von Amylase sekretierenden Kolonien wurde durchgeführt, indem rote Stärke in das Selektivwachstumsmedium aufgenommen wurde. Die Stärke wurde an den roten Farbstoff (Reactive Red-120, Sigma) nach dem von Biely et al., Anal. Biochem. 172, 176–179 (1988), beschriebenen Verfahren gekoppelt. Die gekoppelte Stärke wurde in SCD-Ura-Agarplatten in einer Endkonzentration von 0,15% (Gew./Vol.) inkorporiert und war mit Kaliumphosphat auf einen pH von 7,0 (50–100 mM Endkonzentration) gepuffert.
Die positiven Kolonien wurden entnommen und auf frisches Selektivmedium (auf 150-mm-Platten) ausgestrichen, um gut isolierte und identifizierbare Einzelkolonien zu erhalten. Gut isolierte, für Amylasesekretion positive Einzelkolonien wurden durch direkte Inkorporation von roter Stärke in gepufferten SCD-Ura-Agar nachgewiesen. Positive Kolonien wurden aufgrund ihrer Fähigkeit festgestellt, Stärke abzubauen, was in einem direkt sichtbaren, durchsichtigen Halo um die positive Kolonie herum resultierte.
4. Isolierung von DNA mittels PCR-Amplifikation
Wenn eine positive Kolonie isoliert war, wurde ein Teil von ihr mittels Zahnstocher entnommen und in sterilem Wasser (30 μl) in eine 96-Napf-Platte verdünnt. Zu diesem Zeitpunkt wurden die positiven Kolonien entweder eingefroren und für die anschließende Analyse gelagert oder sofort amplifiziert. Eine Aliquote von Zellen (5 μl) wurde als Templat für die PCR-Reaktion verwendet, und zwar in einem Volumen von 25 μl, das Folgendes enthielt: 0,5 μl Klentaq (Clontech, Palo Alto, CA); 4,0 μl 10 mM dNTPs (Perkin Elmer-Cetus); 2,5 μl Klentaq-Puffer (Clontech); 0,25 μl Vorwärts-Oligo 1; 0,25 μl reverses Oligo 2; 12,5 μl destilliertes Wasser. Die Sequenz des Vorwärts-Oligonucleotids 1 war:
Die Sequenz des reversen Oligonucleotids 2 war:

Die PCR wurde dann wie folgt durchgeführt:

a.		Denaturieren	92°C, 5 Minuten

b.	3 Zyklen von:	Denaturieren	92°C, 30 Sekunden
		Anellieren	59°C, 30 Sekunden
		Extendieren	72°C, 60 Sekunden

c.	3 Zyklen von:	Denaturieren	92°C, 30 Sekunden
		Anellieren	57°C, 30 Sekunden
		Extendieren	72°C, 60 Sekunden

d.	25 Zyklen von:	Denaturieren	92°C, 30 Sekunden
		Anellieren	55°C, 30 Sekunden
		Extendieren	72°C, 60 Sekunden

e.		Halten	4°C

Die unterstrichenen Regionen anellierten an die ADH-Promotorregion bzw. Amylaseregion und amplifizierten eine 307-bp-Region des Vektors pSST-AMY.0, wenn kein Insert vorhanden war. Typischerweise enthielten die ersten 18 Nucleotide des 5'-Endes dieser Oligonucleotide Anellierungsstellen für die Sequenzierungsprimer. Folglich war das Gesamtprodukt der PCR-Reaktion aus einem leeren Vektor 343 bp lang. Jedoch lieferte die Signalsequenz-fusionierte cDNA beträchtlich längere Nucleotidsequenzen.
Im Anschuss an die PCR wurde eine Aliquote der Reaktion (5 μl) mittels Agarosegelelektrophorese in einem 1%igen Agarosegel unter Verwendung eines Tris-Borat-EDTA-(TBE-)Puffersystems wie von Sambrook et al., s. o., beschrieben untersucht. Klone, die ein einziges starkes PCR-Produkt einer Größe von mehr als 400 bp lieferten, wurden mittels DNA-Sequenzierung nach Reinigung mit einer 96-Qiaquick-PCR-Aufreinigungssäule (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) weiter analysiert.
BEISPIEL 3: Isolierung von cDNA-Klonen, die für menschliches PRO351 kodieren
Eine Konsensussequenz wurde bezüglich einer Reihe von EST-Sequenzen erhalten, wie in Beispiel 1 oben stehend beschrieben, worin die erhaltene Konsensussequenz hierin DNA35950 genannt wird. Basierend auf der DNA35950-Konsensussequenz. wurden Oligonucleotide synthetisiert: 1) um mittels PCR eine cDNA-Bibliothek zu identifizieren, welche die Sequenz von Interesse enthielt, sowie 2) zur Verwendung als Sonden, um einen Klon der für PRO351 kodierenden Sequenz voller Länge zu isolieren.
Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Primer wurden synthetisiert:
Zusätzlich dazu wurde eine synthetische Oligonucleotid-Hybridisierungssonde aus der DNA35950-Konsensussequenz konstruiert, welche die folgende Nucleotidsequenz aufwies:
Hybridisierungssonde
Um mehrere Bibliotheken auf eine Quelle eines Klons voller Länge zu screenen, wurde DNA aus den Bibliotheken mittels PCR-Amplifikation mit einem der oben identifizierten PCR-Primer-Paare gescreent. Eine positive Bibliothek wurde anschließend verwendet, um unter Verwendung des Sonden-Oligonucleotids und eines der PCR-Primer Klone zu isolieren, die für das PRO351-Gen kodierten. RNA zur Konstruktion der cDNA-Bibliotheken wurde aus menschlichem fötalem Lebergewebe isoliert (LIB230).
Die DNA-Sequenzierung der wie oben stehend beschrieben isolierten Klone ergab die DNA-Sequenz voller Länge für PRO351 [hierin als UNQ308 (DNA 40571-1315) benannt] (Seq.-ID Nr. 1) sowie die abstammende Proteinsequenz für PRO351.
Die gesamte Nucleotidsequenz von UNQ308 (DNA 40571-1315) ist in 1 (Seq.-ID Nr. 1) dargestellt. Klon UNQ308 (DNA 40571-1315) enthält zwei offene Leseraster mit einer sichtbaren Translationsinitiationsstelle an den Nucleotidpositionen 189–191 sowie einen zweiten offenen Leseraster, der an Nucleotid 470 beginnt, wobei die zwei offenen Leseraster an den Stoppcodons an den Nucleotidpositionen 363–365 bzw. 2009–2011 enden (1). Der prognostizierte Polypeptid-Vorläufer ist 571 Aminosäuren lang (2). Wichtige Regionen der Aminosäuresequenz von PRO351 umfassen das Signalpeptid, Regionen mit einer Sequenzähnlichkeit mit Serinproteasen der Trypsin-Familie, zwei N-Glykosylierungsstellen sowie drei Kringle-Domänen. Klon UNQ308 (DNA 40571-1315) wurde bei der ATCC unter der ATCC-Hinterlegungsnr. 209784 hinterlegt.
BEISPIEL 4: Verwendung von für PRO-Polypeptid kodierender Nucleinsäure als Hybridisierungssonden
Das folgende Verfahren beschreibt die Verwendung einer Nucleotidsequenz, die für ein PRO-Polypeptid kodiert, als eine Hybridisierungssonde.
DNA, welche die kodierende Sequenz eines PRO-Polypeptids von Interesse umfasst, wie hierin offenbart, kann als eine Sonde oder als Basis verwendet werden, aus der Sonden zum Screening auf homologe DNAs hergestellt werden (wie z. B. jene, die für natürlich auftretende Varianten des PRO-Polypeptids kodieren), und zwar in menschlichen Gewebs-cDNA-Biliotheken oder menschlichen genomischen Gewebs-Bibliotheken.
Die Hybridisierung und das Waschen von Filtern, die eine der Bibliotheks-DNAs enthalten, wird unter den folgenden Bedingungen hoher Stringenz durchgeführt. Die Hybridisierung einer radiomarkierten, für ein PRO-Polypeptid kodierenden und von einer Nucleinsäure abstammenden Sonde an die Filter wird in einer Lösung von 50% Formamid, 5 × SSC, 0,1% SDS, 0,1% Natriumpyrophosphat, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 2 × Denhardt-Lösung und 10% Dextransulfat bei 42°C 20 Stunden lang durchgeführt. Das Waschen der Filter wird in einer wässrigen Lösung aus 0,1 × SSC und 0,1% SDS bei 42°C durchgeführt.
DNAs mit einer gewünschten Sequenzidentität mit der DNA, die für Nativsequenz-PRO-Polypeptid voller Länge kodiert, können anschließend unter Verwendung von Standardverfahren, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, identifiziert werden.
BEISPIEL 5: Expression von PRO-Polypeptiden in E. coli
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung einer unglykosylierten Form eines gewünschten PRO-Polypeptids durch rekombinante Expression in E. coli.
Die DNA-Sequenz, die für das gewünsche PRO-Polypeptid kodiert, wird anfänglich unter Verwendung der ausgewählten PCR-Primer amplifiziert. Die Primer sollten Restriktionsenzymstellen enthalten, die den Restriktionsenzymstellen auf dem ausgewählten Expressionsvektor entsprechen. Es kann eine Reihe an Expressionsvektoren verwendet werden. Ein Beispiel eines geeigneten Vektors ist pBR322 (stammt von E. coli ab; siehe Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)), der Gene für Ampicillin- und Tetrazyklin-Resistenz enthält. Der Vektor wird mit Restriktionsenzym verdaut und dephosphoryliert. Die PCR-amplifizierten Sequenzen werden anschließend in den Vektor ligiert. Der Vektor umfasst vorzugsweise Sequenzen, die für ein Antibiotika-Resistenzgen kodieren, einen trp-Promotor, einen Polyhis-Leader (umfassend die ersten sechs STII-Codons, Polyhis-Sequenz und Enterokinase-Spaltstelle), die spezifische für das PRO-Polypeptid kodierende Region, den λ-Transkriptionsterminator und ein argU-Gen.
Das Ligationsgemisch wird anschließend verwendet, um einen ausgewählten E.-coli-Stamm unter Verwendung der in Sambrook et al., s. o., beschriebenen Verfahren zu transformieren. Die Transformanten werden durch ihre Fähigkeit, auf LB-Platten zu wachsen, identifiziert, und anschließend werden antibiotikaresistente Kolonien selektiert. Plasmid-DNA kann mittels Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung isoliert und bestätigt werden.
Selektierte Klone können über Nacht in Flüssigkulturmedium, wie z. B. LB-Brühe, die mit Antibiotika ergänzt wurde, gezüchtet werden. Die Übernacht-Kultur kann anschließend verwendet werden, um eine Kultur in größerem Maßstab zu beimpfen. Anschließend werden die Zellen bis zu einer gewünschten optischen Dichte gezüchtet, während der Expressionspromotor angeschaltet wird.
Nach dem Züchten der Zellen für mehrere weitere Stunden können die Zellen durch Zentrifugierung geerntet werden. Das mittels Zentrifugierung erhaltene Zellpellet kann unter Verwendung verschiedener nach dem Stand der Technik bekannter Mittel solubilisiert werden, und das solubilisierte PRO-Polypeptid kann anschließend unter Verwendung einer Metallchelatsäule unter Bedingungen, die eine enge Bindung des Proteins ermöglichen, gereinigt werden.
In der EP-Anmeldung Nr. 99912321.9 wurden Polypeptide in E. coli unter Verwendung des folgenden Verfahrens in einer poly-His-markierten Form exprimiert. Die DNA, die für das PRO-Polypeptid kodierte, wurde anfänglich unter Verwendung selektierter PCR-Primer amplifiziert. Die Primer enthielten Restriktionsenzymstellen, die den Restriktionsenzymstellen auf dem ausgewählten Expressionsvektor entsprechen, sowie andere nützliche Sequenzen, die für eine wirksame und verlässliche Translationsinitiation, eine schnelle Reinigung auf einer Metallchelatsäule und eine proteolytische Entfernung mit Enterokinase sorgen. Die PCR-amplifizierten poly-His-markierten Sequenzen wurden anschließend in einen Expressionsvektor ligiert, der verwendet wurde, um einen E.-coli-Wirt basierend auf Stamm 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq) zu transformieren. Transformanten wurden zuerst in LB, enthaltend 50 mg/ml Carbenicillin, bei 30°C unter Schütteln gezüchtet, bis eine O. D. 600 von 3–5 erreicht wurde. Kulturen wurden anschließend 50- bis 100fach in CRAP-Medium verdünnt (hergestellt durch Mischen von 3,57 g (NH₄)₂SO₄, 0,71 g Natriumcitrat 2H₂O, 1,07 g KCl, 5,36 g Difco-Hefe-Extrakt, 5,36 g Sheffield-Hycase-SF in 500 ml Wasser sowie 110 mM MPOS, pH 7,3, 0,55% (Gew./Vol.) Glukose und 7 mM MgSO₄) und für etwa 20–30 Stunden bei 30°C unter Schütteln wachsen gelassen. Proben wurden entfernt, um die Expression mittels SDS-PAGE-Analyse zu verifizieren, und die Massenkultur wird zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Zellpellets wurden bis zur Reinigung und Umfaltung gefroren.
E.-coli-Paste aus 0,5- bis 1-l-Fermentationen (6–10 g Pellets) wurde in 10 Volumeneinheiten (Gew./Vol.) in 7 M Guanidin, 20 mM Tris-Puffer, pH 8, resuspendiert. Festes Natriumsulfit und Natriumtetrathiosulfat wird hinzugefügt, um Endkonzentrationen von 0,1 M bzw. 0,02 M zu ergeben, und die Lösung wurde über Nacht bei 4°C gerührt. Dieser Schritt führt zu einem denaturierten Protein, bei dem alle Cystein-Reste mittels Sulfitolisierung blockiert waren. Die Lösung wurde bei 40.000 U/min in einer Beckman-Ultrazentrifuge 30 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 3–5 Volumeneinheiten Metallchelatsäulen-Puffer verdünnt (6 M Guanidin, 20 mM Tris, pH 7,4) und zur Klärung durch 0,22-μm-Filter filtriert. Der geklärte Extrakt wurde auf eine 5-ml-Qiagen-Ni-NTA-Metallchelatsäule geladen, die im Metallchelatsäulen-Puffer äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit zusätzlichem Puffer, enthaltend 50 mM Imidazol (Calbiochem, Utrol-Reinheit), pH 7,4, gewaschen. Das Protein wurde mit Puffer, enthaltend 250 mM Imidazol, eluiert. Fraktionen, die das gewünschte Protein enthielten, wurden gepoolt und bei 4°C gelagert. Die Proteinkonzentration wurde durch seine Extinktion bei 280 nm unter Verwendung des berechneten Extinktionskoeffizienten, basierend auf seiner Aminosäuresequenz, geschätzt.
Die Proteine wurden durch langsames Verdünnen von Probe in frisch hergestellten Umfaltungspuffer umgefaltet, wobei dieser aus Folgendem bestand: 20 mM Tris, pH 8,6, 0,3 M NaCl, 2,5 M Harnstoff, 5 mM Cystein, 20 mM Glycin und 1 mM EDTA. Umfaltungsvolumeneinheiten wurden so ausgewählt, dass die Endproteinkonzentration zwischen 50 und 100 Mikrogramm/ml lag. Die Umfaltungslösung wurde bei 4°C 12–36 Stunden lang leicht gerührt. Die Umfaltungsreaktion wurde durch die Addition von TFA bis zu einer Endkonzentration von 0,4% (pH von etwa 3) gequencht. Vor der weiteren Reinigung des Proteins wurde die Lösung durch einen 0,22-μm-Filter filtriert, und Acetonitril wurde bis zu einer Endkonzentration von 2–10% hinzugefügt. Das umgefaltete Protein wurde auf einer Poros-R1/H-Umkehrphasen-Säule unter Verwendung eines mobilen Puffers von 0,1% TFA mit der Elution mit einem Gradienten an Acetonitril aus 10 bis 80% chromatographiert. Aliquote Anteile von Fraktionen mit A280-Extinktion wurden auf SDS-Polyacrylamidgelen analysiert, und Fraktionen, die homogenes umgefaltetes Protein enthielten, wurden gepoolt. Allgemein werden die korrekt umgefalteten Spezies der meisten Proteine bei den niedrigsten Konzentrationen von Acetonitril eluiert, da jene Spezies die kompaktesten sind, da ihr hydrophobes Inneres von einer Wechselwirkung mit dem Umkehrphasen-Harz abgeschirmt ist. Aggregierte Spezies werden normalerweise in höheren Acetonitrilkonzentrationen eluiert. Zusätzlich zum Lösen fehlgefalteter Proteinformen von der gewünschten Form entfernt der Umkehrphasen-Schritt auch Endotoxin aus den Proben.
Fraktionen, welche die gewünschten gefalteten PRO-Proteine enthielten, wurden gepoolt, und das Acetonitril wurde unter Verwendung eines leichten Stickstoffstrahls, der auf die Lösung gerichtet war, entfernt. Proteine wurden in 20 mM Hepes, pH 6,8, mit 0,14 M Natriumchlorid und 4% Mannit mittels Dialyse oder Gelfiltration unter Verwendung von G25-Superfine-Harzen (Pharmacia), äquilibriert im Formulierungspuffer, formuliert und sterilfriltriert.
BEISPIEL 6: Expression von PRO-Polypeptiden in Säugetierzellen
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung einer glykosylierten Form eines gewünschten PRO-Polypeptids mittels rekombinanter Expression in Säugetierzellen.
Der Vektor, pRK5 (siehe EP 307.247 , veröffentlicht am 15. März 1989), wird als Expressionsvektor verwendet. Gegebenenfalls wird die für das PRO-Polypeptid kodierende DNA mit ausgewählten Restriktionsenzymen in pRK5 ligiert, um die Insertion der PRO-Polypeptid-DNA unter Verwendung von Ligationsverfahren, wie sie in Sambrook et al., s. o., beschrieben werden, zu ermöglichen. Der resultierende Vektor wird pRK5-PRO-Polypeptid genannt.
In einer Ausführungsform können die selektierten Wirtszellen 293-Zellen sein. Menschliche 293-Zellen (ATCC CCL 1573) werden bis zur Konfluenz in Gewebekulturplatten in Medium, wie z. B. DMEM, ergänzt mit fötalem Kälberserum und gegebenenfalls Nährstoffkomponenten und/oder Antibiotika, gezüchtet. Etwa 10 μg pRK5-PRO-Polypeptid-DNA wird mit etwa 1 μg DNA, kodierend für das VA-RNA-Gen, gemischt [Thimmappaya et al., Cell 31, 543 (1982)] und in 500 μl 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl₂ aufgelöst. Zu diesem Gemisch werden tropfenweise 500 μl 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO₄ hinzugefügt, und es wird bei 25°C 10 Minuten lang die Bildung eines Präzipitats ermöglicht. Das Präzipitat wird suspendiert und zu den 293-Zellen hinzugefügt, und es wird ihm ermöglicht, sich bei 37°C über eine Zeitspanne von etwa 4 Stunden abzusetzen. Das Kulturmedium wird abgesaugt, und 2 ml 20% Glycerin in PBS werden 30 Sekunden lang hinzugefügt. Die 293-Zellen werden anschließend mit serumfreiem Medium gewaschen, frisches Medium wird hinzugefügt, und die Zellen werden für etwa 5 Tage inkubiert.
Etwa 24 Stunden nach den Transfektionen wird das Kulturmedium entfernt und mit (nur) Kulturmedium oder Kulturmedium, das 200 μCi/ml ³⁵S-Cystein und 200 μCi/ml ³⁵S-Methionin enthält, ersetzt. Nach einer Inkubation von 12 Stunden wird das konditionierte Medium gesammelt, auf einem Spinfilter konzentriert und auf ein 15% SDS-Gel geladen. Das verarbeitete Gel kann getrocknet werden und für eine ausgewählte Zeitspanne einem Film ausgesetzt werden, um die Gegenwart von PRO-Polypeptid zu zeigen. Die Kulturen, die transfizierte Zellen enthalten, können einer weiteren Inkubation unterzogen werden (in serumfreiem Medium), und das Medium wird in ausgewählten Biotests getestet.
In einem Alternativverfahren kann PRO-Polypeptid vorübergehend unter Verwendung des Dextransulfat-Verfahrens, das von Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 12, 7575 (1981), beschrieben wird, in 293-Zellen eingeführt werden. 293-Zellen werden in einer Spinner-Flasche auf Maximaldichte gezüchtet, und 700 μg pRK5-PRO-Polypeptid-DNA werden hinzugefügt. Die Zellen werden zuerst mittels Zentrifugierung aus der Spinner-Flasche konzentriert und mit PBS gewaschen. Das DNA-Dextran-Präzipitat wird auf dem Zellpellet für eine Zeitspanne von vier Stunden inkubiert. Die Zellen werden mit 20% Glycerin 90 Sekunden lang behandelt, mit Gewebskultur-Medium gewaschen und erneut in die Spinner-Flaschen, die Gewebskultur-Medium, 5 μg/ml Rinder-Insulin und 0,1 μg/ml Rinder-Transferrin enthalten, eingeführt. Nach etwa vier Tagen wird das konditionierte Medium zentrifugiert und filtriert, um Zellen und Trümmer zu entfernen. Anschließend kann die exprimiertes PRO-Polypeptid enthaltende Probe konzentriert und durch ein beliebiges ausgewähltes Verfahren, wie z. B. Dialyse und/oder Säulen-Chromatographie, gereinigt werden.
In einer anderen Ausführungsform können PRO-Polypeptide in CHO-Zellen exprimiert werden. Das pRK5-PRO-Polypeptid kann unter Verwendung bekannter Reagenzien, wie z. B. CaPO₄ oder DEAE-Dextran, in CHO-Zellen transfiziert werden. Wie oben stehend beschrieben, können die Zellkulturen inkubiert werden und das Medium mit (nur) Kulturmedium oder mit Medium, das eine Radiomarkierung, wie z. B. ³⁵S-Methionin, enthält, ersetzt werden. Nach der Bestimmung der Gegenwart von PRO-Polypeptid kann das Kulturmedium mit serumfreiem Medium ersetzt werden. Die Kulturen werden vorzugsweise für etwa 6 Tage inkubiert, und anschließend wird das konditionierte Medium geerntet. Das Medium, welches das exprimierte PRO-Polypeptid enthält, kann anschließend konzentriert und durch ein beliebiges ausgewähltes Verfahren gereinigt werden.
Epitopmarkiertes PRO-Polypeptid kann auch in Wirts-CHO-Zellen exprimiert werden. Das PRO-Polypeptid kann aus dem pRK5-Vektor subkloniert werden. Das Subklon-Insert kann einer PCR unterzogen werden, um im Rahmen mit einer ausgewählten Epitopmarkierung, wie z. B. einer poly-his-Markierung, in einen Baculovirus-Expressionsvektor zu fusionieren. Das poly-his-markierte PRO-Polypeptid-Insert kann anschließend zur Selektion stabiler Klone in einen SV40-gesteuerten Vektor subkloniert werden, der einen Selektionsmarker, wie z. B. DHFR, enthält. Schließlich können die CHO-Zellen (wie oben stehend beschrieben) mit dem SV40-gesteuerten Vektor transfiziert werden. Die Markierung kann, wie oben stehend beschrieben, durchgeführt werden, um die Expression zu verifizieren. Das Kulturmedium, welches das exprimierte poly-his-markierte PRO-Polypeptid enthält, kann anschließend konzentriert und durch ein beliebiges ausgewähltes Verfahren, wie z. B. durch Ni²⁺-Chelat-Affinitätschromatographie, gereinigt werden.
In EP 99912321.9 wurde die stabile Expression in CHO-Zellen unter Verwendung von folgendem Verfahren durchgeführt. Die Proteine wurden als ein IgG-Konstrukt (Immunoadhäsin) exprimiert, in dem die kodierenden Sequenzen für die löslichen Formen (z. B. extrazelluläre Domänen) der jeweiligen Proteine an eine konstante IgG1-Regionssequenz fusioniert waren, welche die Gelenk-, CH2- und CH2-Domänen enthielt, und/oder eine poly-His-markierte Form aufwiesen.
Nach der PCR-Amplifikation wurden die jeweiligen DNAs unter Verwendung von Standardverfahren, wie von Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997), beschrieben, in einen CHO-Expressionsvektor subkloniert. CHO-Expressionsvektoren werden so konstruiert, dass sie kompatible Restriktionsstellen 5' und 3' von der DNA von Interesse aufweisen, um das praktische Shuttling von cDNAs zu ermöglichen. Der in der Expression in CHO-Zellen verwendete Vektor ist einer, wie er in Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24, 9, 1774–1779 (1996), beschrieben wurde, und verwendet den frühen SV40-Promotor/Enhancer zur Steuerung der Expression der cDNA von Interesse sowie von Dihydrofolatreductase (DHFR). Die DHFR-Expression ermöglicht die Selektion bezüglich eines stablen Erhalts des Plasmids nach der Transfektion.
Zwölf Mikrogramm der gewünschten Plasmid-DNA wurden in etwa 10 Millionen CHO-Zellen unter Verwendung von im Handel erhältlichen Transfektionsreagenzien Superfect^® (Quiagen), Dosper^® oder Fugene^® (Boehringer Mannheim) eingeführt. Die Zellen wurden wachsen gelassen wie in Lucas et al., s. o., beschrieben. Etwa 3 × 10^–7 Zellen werden in einer Ampulle zum weiteren Wachstum und zur Produktion, wie unten stehend beschrieben, gefroren.
Die Ampullen, welche die Plasmid-DNA enthielten, wurden durch Platzieren in einem Wasserbad aufgetaut und durch Vortexen gemischt. Der Inhalt wurde in ein Zentrifugenröhrchen pipettiert, das 10 ml Medium enthielt, und bei 1000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt, und die Zellen wurden in 10 ml selektivem Medium (0,2-μm-filtriertem PS20 mit 5% 0,2-μm-diafiltriertem fötalem Rinderserum) resuspendiert. Die Zellen wurden anschließend in einen 100-ml-Spinner aliquotiert, der 90 ml selektives Medium enthielt. Nach 1–2 Tagen wurden die Zellen in einen 250-ml-Spinner transferiert, der mit 150 ml selektivem Wachstums medium gefüllt war, und bei 37°C inkubiert. Nach weiteren 2–3 Tagen wurden 250-ml-, 500-ml- und 2000-ml-Spinner mit 3 × 10⁵ Zellen/ml beimpft. Das Zellmedium wurde mittels Zentrifugierung und Resuspension in Produktionsmedium mit frischem Medium ausgetauscht. Obwohl jedes beliebige CHO-Medium verwendet werden kann, wurde tatsächlich ein Produktionsmedium verwendet, das im US-Patent Nr. 5.122.469 , ausgegeben am 16. Juni 1992, beschrieben wurde. 3-l-Produktions-Spinner werden mit 1,2 × 10⁶ Zellen/ml beimpft. An Tag 0 wurde der pH der Zellanzahl bestimmt. An Tag 1 wurde dem Spinner eine Probe entnommen, und es wurde mit dem Besprengen mit filtrierter Luft begonnen. An Tag 2 wurde dem Spinner eine Probe entnommen, die Temperatur wurde auf 33°C geändert, und 30 ml 500-g/l-Glukose und 0,6 ml 10-%-Antischaummittel (z. B. 35% Polydimethylsiloxanemulsion, Dow-Corning-365-Emulsion medizinischer Reinheit) wurden zugesetzt. Während der Produktion wurde der pH je nach Notwendigkeit angepasst, um ihn bei etwa 7,2 zu halten. Nach 10 Tagen, oder bis die Lebensfähigkeit unter 70% abfiel, wurde die Zellkultur mittels Zentrifugierung und Filtrieren durch einen 0,22-μm-Filter geerntet. Das Filtrat wurde entweder bei 4°C gelagert oder sofort zur Reinigung auf Säulen geladen.
Für die poly-His-markierten Konstrukte wurden die Proteine unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule (Qiagen) gereinigt. Vor der Reinigung wurde Imidazol zum konditionierten Medium bis zu einer Konzentration von 5 mM hinzugefügt. Das konditionierte Medium wurde auf eine 6-ml-Ni-NTA-Säule, die in 20 mM Hepes-Puffer, pH 7,4, enthaltend 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol, äquilibriert worden war, bei einer Durchflussrate von 4–5 ml/min bei 4°C gepumpt. Nach dem Beladen wurde die Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen, und das Protein wurde mit Äquilibrierungspuffer, enthaltend 0,25 M Imidazol, eluiert. Das hochgradig gereinigte Protein wurde anschließend mit einer 25-ml-G25-Superfine-Säule (Pharmacia) in einen Lagerungspuffer entsalzt, der 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4% Mannit, pH 6,8, enthielt, und bei –80°C gelagert.
Immunoadhäsin-Konstrukte (Fc-hältig) wurden folgendermaßen aus dem konditionierten Medium gereinigt. Das konditionierte Medium wurde auf eine 5-ml-Protein-A-Säule (Pharmacia) gepumpt, die in 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH 6,8, äquilibriert worden war. Nach dem Beladen wurde die Säule ausgiebig mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, bevor eine Eluierung mit 100 mM Zitronensäure, pH 3,5, durchgeführt wurde. Das eluierte Protein wurde sofort durch Sammeln von 1-ml-Fraktionen in Röhrchen, die 275 μl 1 M Tris-Puffer, pH 9, enthielten, neutralisiert. Das hochgradig gereinigte Protein wurde anschließend, wie oben stehend für die poly-His-markierten Proteine beschrieben, in Lagerungspuffer entsalzt. Die Homogenität wurde durch SDS-Polyacrylamidgele sowie durch N-terminale Aminosäuresequenzierung durch Edman-Abbau untersucht.
BEISPIEL 7: Expression von PRO-Polypeptiden in Hefe
Das folgende Verfahren beschreibt die rekombinante Expression eines gewünschten PRO-Polypeptids in Hefe.
Zuerst werden Hefe-Expressionsvektoren zur intrazellulären Produktion oder Sekretion von PRO-Polypeptiden aus dem ADH2/GAPDH-Promotor konstruiert. DNA, die für ein gewünschtes PRO-Polypeptid kodiert, ein ausgewähltes Signalpeptid und der Promotor werden in geeignete Restriktionsenzymstellen in dem ausgewählten Plasmid insertiert, um die intrazelluläre Expression des PRO-Polypeptids zu steuern. Zur Sekretion kann DNA, die für das PRO-Polypeptid kodiert, zur Expression des PRO-Polypeptids in das ausgewählte Plasmid kloniert werden, und zwar zusammen mit DNA, die für den ADH2/GAPDH-Promotor, die Hefe-α-Faktor-Sekretionssignal/Leadersequenz und Linkersequenzen (falls benötigt) kodiert.
Hefe-Zellen, wie z. B. der Hefe-Stamm AB110, kann anschließend mit den oben beschriebenen Expressionsplasmiden transformiert werden und in ausgewählten Fermentationsmedien gezüchtet werden. Die transformierten Hefe-Überstände können durch Präzipitation mit 10% Trichloressigsäure und Trennung mittels SDS-PAGE analysiert werden, gefolgt von einer Färbung der Gele mit Coomassie-Blau-Färbung.
Rekombinantes PRO-Polypeptid kann anschließend durch Entfernen der Hefe-Zellen aus dem Fermentationsmedium durch Zentrifugieren und anschließendes Konzentrieren des Mediums unter Verwendung ausgewählter Kartuschenfilter isoliert und gereinigt werden. Das Konzentrat, welches das PRO-Polypeptid enthält, kann unter Verwendung ausgewählter Säulenchromatographie-Harze weiter gereinigt werden.
BEISPIEL 8: Expression von PRO-Polypeptiden in Baculovirus-infizierten Insektenzellen
Das folgende Verfahren beschreibt die rekombinante Expression von PRO-Polypeptiden in Baculovirus-infizierten Insektenzellen.
Das gewünschte PRO-Polypeptid wird stromauf einer Epitopmarkierung, die in einem Baculovirus-Expressionsvektor enthalten ist, fusioniert. Solche Epitopmarkierungen umfassen poly-his-Markierungen und Immunglobulin-Markierungen (wie Fc-Regionen von IgG). Eine Reihe von Plasmiden kann verwendet werden, unter anderem Plasmide, die von im Handel erhältlichen Plasmiden abstammen, wie z. B. pVL1393 (Novagen). Kurz gesagt, wird das PRO-Polypeptid oder der gewünschte Abschnitt des PRO-Polypeptids (wie z. B. die Sequenz, die für die extrazelluläre Domäne eines Transmembranproteins kodiert) mittels PCR mit Primern, die komplementär zu den 5'- und 3'-Regionen sind, amplifiziert. Der 5'-Primer kann flankierende (ausgewählte) Restriktionsenzymstellen inkorporieren. Das Produkt wird anschließend mit diesen selektierten Restriktionsenzymen verdaut und in den Expressionsvektor subkloniert.
Rekombinantes Baculovirus wird durch Co-Transfektion des oben genannten Plasmids und BaculoGold^TM-Virus-DNA (Pharmingen) in Spodoptera-frugiperda-Zellen („Sf9") (ATCC CRL 1711) unter Verwendung von Lipofectin (im Handel bei GIBCO-BRL erhältlich) erzeugt. Nach einer Inkubation von 4–5 Tagen bei 28°C werden die freigesetzten Viren geerntet und für weitere Amplifikationen verwendet. Die virale Infektion und Protein-Expression wird wie von O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford University Press, Oxford (1994), beschrieben durchgeführt.
Exprimierte poly-his-markierte PRO-Polypeptide können anschließend gereinigt werden, z. B. folgendermaßen durch Ni²⁺-Chelat-Affinitätschromatographie. Extrakte werden aus rekombinanten virusinfizierten Sf9-Zellen hergestellt, wie von Rupert et al., Nature 362, 175–179 (1993), beschrieben. Kurz gesagt, werden Sf9-Zellen gewaschen, in Beschallungspuffer resuspendiert (25 ml Hepes, pH 7,9; 12,5 mM MgCl₂; 0,1 mM EDTA; 10% Glycerin; 0,1% NP-40; 0,4 M KCl) und zwei Mal für 20 Sekunden auf Eis beschallt. Die beschallten Zellen werden mittels Zentrifugierung geklärt, und der Überstand wird 50fach in Ladungspuffer verdünnt (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10% Glycerin, pH 7,8) und durch einen 0,45-μm-Filter filtriert. Eine Ni²⁺-NTA-Agarose-Säule (im Handel bei Qiagen erhältlich) wird mit einem Bettvolumen von 5 ml hergestellt, mit 25 ml Wasser gewaschen und mit 25 ml Ladungspuffer äquilibriert. Der filtrierte Zellextrakt wird mit 0,5 ml pro Minute auf die Säule geladen. Die Säule wird bis auf Grundlinen-A₂₈₀ mit Ladungspuffer gewaschen, ein Zeitpunkt, bei dem mit dem Sammeln der Fraktion begonnen wird. Als Nächstes wird die Säule mit einem sekundären Waschpuffer gewaschen (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10% Glycerin, pH 6,0), wodurch nichtspezifisch gebundenes Protein eluiert wird. Nach dem erneuten Erreichen der A₂₈₀-Grundlive wird die Säule mit einem 0-bis-500-mM-Imidazolgradienten im sekundären Waschpuffer entwickelt. Ein-ml-Fraktionen werden gesammelt und mittels SDS-PAGE und Silberfärbung oder Western-Blotting mit Ni²⁺-NTA, an alkalische Phosphatase konjugiert (Qiagen), analysiert. Fraktionen, die das eluierte His₁₀-markierte PRO-Polypeptid enthalten, werden gepoolt und gegen Ladungspuffer dialysiert.
Alternativ dazu kann die Reinigung des IgG-markierten (oder Fc-markierten) PRO-Polypeptids unter Verwendung bekannter Chromatographieverfahren, unter anderem z. B. Protein-A- oder Protein-G-Säulenchromatographie, durchgeführt werden.
In der EP-Anmeldung Nr. 99912321.9 wurden Polypeptide erfolgreich in Baculovirus-infizierten Sf9-Insektenzellen exprimiert. Während die Expression tatsächlich in einem 0,5- bis 2-l-Maßstab durchgeführt wurde, kann sie jedoch leicht in einem größeren Maßstab für größere Präparatmengen (z. B. 8 l) durchgeführt werden. Die Proteine wurden als ein IgG-Konstrukt (Immunoadhäsin) exprimiert, in dem die extrazelluläre Proteinregion an eine konstante IgG1-Regionssequenz fusioniert war, welche die Gelenk-, CH2- und CH3-Domänen enthielt, und/oder in poly-His-markierten Formen.
Zur Expression in Baculovirus-infizierten Sf9-Zellen wurden, nach der PCR-Amplifikation, die jeweiligen kodierenden Sequenzen in einen Baculovirus-Expressionsvektor subkloniert (pb.PH.IgG für IgG-Fusionen und pb.PH.His.c für poly-His-markierte Proteine), und der Vektor und Baculogold^®-Baculovirus-DNA (Pharmingen) wurden unter Verwendung von Lipofectin (GIBCO-BRL) in 105 Spodoptera-frugiperda-Zellen („Sf9") (ATCC CRL 1711) co-transfiziert. pb.PH.IgG und pb.PH.His sind Modifizierungen des im Handel erhältlichen Baculovirus-Expressionsvektors pVL1393 (Pharmingen), wobei modifizierte Polylinkerregionen die His- oder Fc-Markersequenzen enthalten. Die Zellen wurden in mit 10% FBS (Hyclone) ergänztem Hink-TNM-FH-Medium gezüchtet. Die Zellen wurden 5 Tage lang bei 28°C inkubiert. Der Überstand wurde geerntet und anschließend für die erste Virusamplifikation durch Infizieren von Sf9-Zellen in mit 10% FBS ergänztem Hink-TNM-FH-Medium bei einer ungefähren Infektionsmultiplizität (MOI) von 10 verwendet. Die Zellen wurden 3 Tage lang bei 28°C inkubiert. Der Überstand wurde geerntet, und die Expression der Konstrukte im Baculovirus-Expressionsvektor wurde durch Chargenbindung von 1 ml Überstand an 25 ml Ni-NTA-Perlen (QIAGEN) für Histidin-markierte Proteine oder Protein-A-Sepharose-CL-4B-Perlen (Pharmacia) für IgG-markierte Proteine, gefolgt von SDS-PAGE-Analyse im Vergleich zu einer bekannten Konzentration von Proteinstandard mittels Coomassie-Blau-Färbung bestimmt.
Der Überstand der ersten Virusamplifikation wurde verwendet, um eine Spinner-Kultur (500 ml) von in ESF-921-Medium (Expression Systems LLC) gezüchteten Sf9-Zellen bei einer ungefähren MOI von 0,1 zu infizieren. Die Zellen wurden 3 Tage lang bei 28°C inkubiert. Der Überstand wurde geerntet und filtriert. Die Chargenbindung und SDS-PAGE-Analyse wurden wie erforderlich wiederholt, bis die Expression der Spinner-Kultur bestätigt war.
Das konditionierte Medium aus den transfizierten Zellen (0,5 bis 3 l) wurde mittels Zentrifugation geerntet, um die Zellen zu entfernen, und durch 0,22-μm-Filter filtriert. Für die poly-His-markierten Konstrukte wurde das Proteinkonstrukt unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule (Qiagen) gereinigt. Vor der Reinigung wurde dem konditionierten Medium Imidazol auf eine Konzentration von 5 mM zugegeben. Das konditionierte Medium wurde bei einer Flussrate von 4–5 ml/min bei 4°C auf eine 6-ml-Ni-NTA-Säule gepumpt, die in 20 mM Hepes-Puffer, pH 7,4, äquilibriert war, der 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol enthielt. Nach der Beladung wurde die Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen und das Protein mit 0,25 M Imidazol enthaltendem Äquilibrierungspuffer eluiert. Das hochgereinigte Protein wurde anschließend mit einer 25-ml-G25-Superfine-Säule (Pharmacia) in Aufbewahrungspuffer entsalzt, der 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4% Mannit, pH 6,8, enthielt, und bei –80°C gelagert.
Immunoadhäsin-(Fc enthaltende) Konstrukte von Proteinen wurden aus dem konditionierten Medium wie folgt gereinigt. Das konditionierte Medium wurde auf eine 5-ml-Protein-A-Säule (Pharmacia) gepumpt, die in 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH 6,8, äquilibriert worden war. Nach der Beladung wurde die Säule ausgiebig mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, bevor sie mit 100 mM Zitronensäure, pH 3,5, eluiert wurde. Das eluierte Protein wurde sofort neutralisiert, indem 1-ml-Fraktionen in Röhrchen aufgefangen wurden, die 275 ml 1 M Tris-Puffer, pH 9, enthielten. Das hochgereinigte Protein wurde anschließend wie oben für die poly-His-markierten Proteine beschrieben in Aufbewahrungspuffer entsalzt. Die Homogenität der Proteine wurde mittels SDS-Polyacrylamid-(PEG-)Elektrophorese und N-terminale Aminosäuresequenzierung mittels Edman-Abbau verifiziert.
In der EP-Anmeldung Nr. 99912321.9 wurden PRO-Polypeptide in Baculovirus-infizierten His-Insektenzellen exprimiert. Obgleich die Expression tatsächlich in ei nem Maßstab von 0,5–2 l durchgeführt wurde, kann sie leicht in einem größeren Maßstab (z. B. 8 l) durchgeführt werden.
Zur Expression in Baculovirus-infizierten Hi5-Insektenzellen kann die für das PRO-Polypeptid kodierende DNA mit geeigneten Systemen, wie z. B. Pfu (Stratagene), amplifiziert oder stromauf (5') eines im Baculovirus-Expressionsvektor enthaltenen Epitopmarkers fusioniert werden. Derartige Epitopmarker umfassen poly-his-Marker und Immunglobulin-Marker (wie z. B. Fc-Regionen von IgG). Es kann eine Vielzahl von Plasmiden eingesetzt werden, einschließlich Plasmide, die sich von im Handel erhältlichen Plasmiden, wie z. B. pVL1393 (Novagen), herleiten. Zusammenfassend wird das PRO-Polypeptid oder der gewünschte Abschnitt des PRO-Polypeptids (wie z. B. die für die extrazelluläre Domäne eines Transmembranproteins kodierende Sequenz) mittels PCR mit Primern amplifiziert, die zu den 5'- und 3'-Regionen komplementär sind. Der 5'-Primer kann flankierende (gewählte) Restriktionsenzymstellen enthalten. Das Produkt wird dann mit diesen gewählten Restriktionsenzymen verdaut und in den Expressionsvektor subkloniert. Beispielsweise können Abkömmlinge von pVL1393 die Fc-Region von menschlichem IgG (pb.PH.IgG) oder einen 8-Histidin-(pB.PH.His) Marker stromab (3') der NAME-Sequenz umfassen. Vorzugsweise wird das Vektorkonstrukt zur Bestätigung sequenziert.
Hi5-Zellen werden auf eine Konfluenz von 50% unter den Bedingungen von 27°C, kein CO₂, NO pen/strep gezüchtet. Für jede 150-mm-Platte werden 30 μg des pIE-basierten, das PRO-Polypeptid enthaltenden Vektors mit 1 ml Ex-Cell-Medium vermischt (Medium: Ex-Cell 401 + 1/100 L-Glu JRH Biosciences Nr. 14401-78P (Anmerkung: dieses Medium ist lichtempfindlich)), und in einem gesonderten Röhrchen werden 100 μl CellFectin (CellFECTIN (GibcoBRL Nr. 10362-010) (zur Durchmischung gevortext)) mit 1 ml Ex-Cell-Medium gemischt. Die beiden Lösungen werden vereinigt und bei Raumtemperatur 15 Minuten lang inkubiert. 8 ml Ex-Cell-Medium werden zu den 2 ml des DNA/CellFECTIN-Gemisches zugegeben, und dieses Gemisch wird auf Hi5-Zellen überschichtet, die einmal mit Ex-Cell-Medium gewaschen worden waren. Die Platte wird dann im Dunkeln 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das DNA/CellFECTIN-Gemisch wird dann abgesaugt und die Zellen einmal mit Ex-Cell gewaschen, um überschüssiges CellFECTIN zu entfernen. 30 ml frisches Ex-Cell-Medium werden den Zellen zugegeben und die Zellen 3 Tage lang bei 28°C inkubiert. Der Überstand wird geerntet, und die Expression des PRO-Polypeptids im Baculovirus-Expressionsvektor kann durch Chargenbindung von 1 ml Überstand an 25 ml Ni-NTA-Perlen (QIAGEN) für Histidin-markierte Proteine oder Protein-A-Sepharose-CL-4B-Perlen (Pharmacia) für IgG-markierte Proteine, gefolgt von SDS-PAGE-Analyse im Vergleich zu einer bekannten Konzentration von Proteinstandard mittels Coomassie-Blau-Färbung, bestimmt werden.
Das konditionierte Medium aus den transfizierten Zellen (0,5 bis 3 l) wird mittels Zentrifugation zur Entfernung der Zellen geerntet und durch 0,22-μm-Filter filtriert. Für die poly-his-markierten Konstrukte wird das das PRO-Polypeptid umfassende Protein unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule (Qiagen) gereinigt. Vor der Reinigung wird dem konditionierten Medium Imidazol auf eine Konzentration von 5 mM zugegeben. Das konditionierte Medium wird bei einer Flussrate von 4–5 ml/min bei 4°C auf eine 6-ml-Ni-NTA-Säule gepumpt, die in 20 mM Hepes-Puffer, pH 7,4, äquilibriert war, der 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol enthielt. Nach der Beladung wurde die Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen und das Protein mit 0,25 M Imidazol enthaltendem Äquilibrierungspuffer eluiert. Das hochgereinigte Protein wird anschließend mit einer 25-ml-G25-Superfine-Säule (Pharmacia) in Aufbewahrungspuffer entsalzt, der 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4% Mannit, pH 6,8, enthielt, und bei –80°C gelagert.
Immunoadhäsin- (Fc enthaltende) Konstrukte von Proteinen werden aus dem konditionierten Medium wie folgt gereinigt. Das konditionierte Medium wird auf eine 5-ml-Protein-A-Säule (Pharmacia) gepumpt, die in 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH 6,8, äquilibriert worden war. Nach der Beladung wird die Säule ausgiebig mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, bevor sie mit 100 mM Zitronensäure, pH 3,5, eluiert wird. Das eluierte Protein wird sofort neutralisiert, indem 1-ml-Fraktionen in Röhrchen aufgefangen wurden, die 275 ml 1 M Tris-Puffer, pH 9, enthalten. Das hochgereinigte Protein wird anschließend wie oben für die poly-His-markierten Proteine beschrieben in Aufbewahrungspuffer entsalzt. Die Homogenität des PRO-Polypeptids kann mittels SDS-Polyacrylamidgelen und durch N-terminale Aminosäuresequenzierung mittels Edman-Abbau oder andere analytische Verfahren wie gewünscht und notwendig beurteilt werden.
BEISPIEL 9: Herstellung von Antikörpern, die an PRO-Polypeptide binden
Dieses Beispiel illustriert die Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch an ein PRO-Polypeptid binden können.
Techniken zur Herstellung monoklonaler Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden beispielsweise in Goding, s. o., beschrieben. Immunogene, die eingesetzt werden können, umfassen gereinigtes PRO-Polypeptid, das PRO-Polypeptid enthaltende Fusionsproteine und Zellen, die rekombinantes PRO-Polypeptid an der Zelloberfläche exprimieren. Die Auswahl des Immunogens kann vom Fachmann ohne übermäßiges Experimentieren getroffen werden.
Mäuse, wie z. B. Balb/c, werden mit dem in komplettem Freundschen Adjuvans emulgierten und subkutan oder intraperitoneal in einer Menge von 1–100 Mikrogramm injizierten PRO-Polypeptid-Immunogen immunisiert. Alternativ dazu wird das Immunogen in MPL-TDM-Adjuvans (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) emulgiert und in die Hinterpfoten des Tiers injiziert. Die immunisierten Mäuse werden dann 10 bis 12 Tage später mit zusätzlichem, im gewählten Adjuvans emulgiertem Immunogen geboostet. Danach können die Mäuse außerdem für mehrere Wochen mit zusätzlichen Immunisierungsinjektionen geboostet werden. Serumproben können aus den Mäusen regelmäßig durch retro-orbitale Blutabnahme für das Testen in ELISA-Tests zum Nachweis von Anti-PRO-Polypeptid-Antikörpern entnommen werden.
Nachdem ein geeigneter Antikörpertiter nachgewiesen worden ist, können die für Antikörper „positiven" Tiere mit einer letzten intravenösen Injektion von PRO-Polypeptid injiziert werden. Drei bis vier Tage später werden die Mäuse getötet und die Milzzellen gewonnen. Die Milzzellen werden dann an eine gewählte Maus-Myelom-Zelllinie, wie z. B. P3X63AgU.1, die von ATCC (Nr. CRL 1597) erhältlich ist, fusioniert (unter Verwendung von 35% Polyethylenglykol). Die Fusionen erzeugen Hybridomzellen, die dann in 96-Napf-Gewebekulturplatten ausplattiert werden können, die HAT-Medium (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) enthalten, um die Vermehrung von nicht fusionierten Zellen, Myelom-Hybriden und Milzzellen-Hybriden zu hemmen.
Die Hybridomzellen werden in einem ELISA-Test auf Reaktivität gegen das PRO-Polypeptid gescreent. Die Ermittlung „positiver" Hybridomzellen, welche die gewünschten monoklonalen Antikörper gegen das PRO-Polypeptid sekretieren, ist auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
Die positiven Hybridomzellen können intraperitoneal in syngenetische Balb/c-Mäuse injiziert werden, um Aszites zu produzieren, welche die monoklonalen Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper enthalten. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in Gewebekulturflaschen oder Rollerflaschen gezüchtet werden. Die Reinigung der in den Aszites produzierten monoklonalen Antikörper kann unter Verwendung von Ammonsulfatpräzipitation, gefolgt von Gelausschlusschromatographie erzielt werden. Alternativ dazu kann Affinitätschromatographie auf Basis der Bindung von Antikörper an Protein A oder Protein G eingesetzt werden.
BEISPIEL 10: Chimäre PRO-Polypeptide
PRO-Polypeptide können als chimäre Proteine mit einer oder mehreren zusätzlichen, angefügten Polypeptiddomänen exprimiert werden, um die Proteinreinigung zu erleichtern. Derartige die Reinigung erleichternde Domänen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, metallchelatierende Peptide, wie z. B. Histidin-Tryptophan-Module, die eine Reinigung an immobilisierte Metalle ermöglichen, Protein-A-Domänen, die eine Reinigung an immobilisiertem Immunglobulin ermöglichen, und die im FLAGS^TM-Extension/Affinitätsreinigungssystem (Immunex Corp., Seattle, WA) eingesetzte Domäne. Die Aufnahme einer spaltbaren Linkersequenz, wie z. B. Faktor XA oder Enterokinase (Invitrogen, San Diego, CA), zwischen der Reinigungsdomäne und der PRO-Polypeptidsequenz kann zweckdienlich sein, um die Expression von für das PRO-Polypeptid kodierender DNA zu erleichtern.
BEISPIEL 11: Reinigung von PRO-Polypeptiden unter Verwendung spezifischer Antikörper
Native oder rekombinante PRO-Polypeptide können durch eine Vielzahl von Standardtechniken auf dem Gebiet der Proteinreinigung gereinigt werden. Beispielsweise wird Pro-PRO-Polypeptid, reifes PRO-Polypeptid oder Prä-PRO-Polypeptid mittels Immunoaffinitätschromatographie unter Verwendung von für das PRO-Polypeptid von Interesse spezifischen Antikörpern gereinigt. Allgemein wird eine Immunoaffinitätssäule konstruiert, indem der Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper kovalent an ein aktiviertes Chromatographieharz gebunden wird.
Polyklonale Immunglobuline werden aus Immunseren entweder durch Präzipitation mit Ammoniumsulfat oder durch Reinigung an immobilisiertem Protein A (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) hergestellt. Desgleichen werden monoklonale Antikörper aus Maus-Aszitesflüssigkeit durch Ammoniumsulfatpräzipitation oder Chromatographie an immobilisiertem Protein A hergestellt. Teilweise gereinigtes Immunglobulin wird kovalent an ein Chromatographieharz, wie z. B. CnBr-aktivierte SEPHAROSE^TM (Pharmacia LKB Biotechnology), gebunden. Der Antikörper wird an das Harz gekoppelt, das Harz wird blockiert und das derivatisierte Harz nach den Anleitungen des Herstellers gewaschen.
Eine derartige Immunoaffinitätssäule wird bei der Reinigung eines PRO-Polypeptids eingesetzt, indem eine Fraktion aus Zellen hergestellt wird, die PRO-Polypeptid in löslicher Form enthält. Dieses Präparat wird erlangt, indem die ganze Zelle oder eine subzelluläre Fraktion solubilisiert wird, die über Differentialzentrifugation durch Zugabe von Tensid erlangt wurde oder durch andere, auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren erlangt wurde. Alternativ dazu kann lösliches PRO-Polypeptid, das eine Signalsequenz enthält, in brauchbarer Menge in das Medium sekretiert werden, in dem die Zellen gezüchtet werden.
Ein Präparat, das lösliches PRO-Polypeptid enthält, wird über die Immunoaffinitätssäule geschickt und die Säule unter Bedingungen gewaschen, die eine bevorzugte Absorption des PRO-Polypeptids ermöglichen (z. B. Puffer hoher Ionenstärke in Gegenwart von Tensid). Danach wird die Säule unter Bedingungen eluiert, welche die Antikörper/PRO-Polypeptid-Bindung zerstören (z. B. ein Puffer mit niedrigem pH-Wert, wie z. B. ungefähr pH 2–3, oder eine hohe Konzentration eines Chaotrops, wie z. B. Harnstoff oder Thiocyanat-Ion), und das PRO-Polypeptid wird aufgefangen.
BEISPIEL 12: Medikamenten-Screening
Diese Erfindung ist insbesondere für das Screenen von Verbindungen durch Verwendung von PRO-Polypeptiden oder Bindungsfragmenten davon in beliebigen einer Vielzahl von Medikament-Screeningtechniken zweckdienlich. Das in einem derartigen Test eingesetzte PRO-Polypeptid oder Fragment kann entweder frei in Lösung, an einen festen Träger fixiert, an einer Zelloberfläche oder intrazellulär vorliegen. Eines der Verfahren des Medikamenten-Screenings setzt eukaryotische oder prokaryotische Wirtszellen ein, die stabil mit rekombinanten Nucleinsäuren transformiert sind, die das PRO-Polypeptid oder Fragment exprimieren. Medikamente werden gegen solche transformierten Zellen in kompetitiven Bindungstests gescreent. Solche Zellen können entweder in lebensfähiger oder fixierter Form für Standardbindungstests verwendet werden. Man kann beispielsweise die Bildung von Komplexen zwischen PRO-Polypeptid oder einem Fragment und dem getesteten Mittel messen. Alternativ dazu kann man die Verminderung der Komplexbildung zwischen dem PRO-Polypeptid und seiner Zielzelle oder seinen Zielrezeptoren untersuchen, die vom getesteten Mittel verursacht wird.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung Screeningverfahren für Medikamente oder jegliche andere Mittel bereit, die eine PRO-Polypeptid-assoziierte Krankheit oder Störung beeinflussen können. Diese Verfahren umfassen das Kontaktieren eines derartigen Mittels mit einem PRO-Polypeptid oder einem Fragment davon und das Testen (i) auf das Vorliegen eines Komplexes zwischen dem Mittel und dem PRO-Polypeptid oder Fragment oder (ii) auf das Vorliegen eines Komplexes zwischen dem PRO- Polypeptid oder Fragment und den Zellen, und zwar mittels Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind. In derartigen kompetitiven Bindungstests ist das PRO-Polypeptid oder Fragment typischerweise markiert. Nach geeigneter Inkubation wird freies PRO-Polypeptid oder Fragment vom in gebundener Form vorliegenden abgetrennt, und die Menge an freiem oder gebundenem Marker ist ein Maß für die Fähigkeit des jeweiligen Mittels, an PRO-Polypeptid zu binden oder den PRO-Polypeptid/Zell-Komplex zu stören.
Eine weitere Technik zum Medikamenten-Screening stellt ein Hochdurchsatz-Screening für Verbindungen bereit, die eine geeignete Bindungsaffinität für ein Polypeptid aufweisen, und wird ausführlich in der am 13. September 1984 veröffentlichten WO 84/03564 beschrieben. Zusammenfassend dargelegt, wird eine große Anzahl verschiedener kleiner Peptidtestverbindungen an einem festen Substrat, wie z. B. an Kunststoffnadeln oder irgendwelchen anderen Oberflächen, synthetisiert. Auf ein PRO-Polypeptid angewendet, werden die Peptidtestverbindungen mit PRO-Polypeptid zur Reaktion gebracht und gewaschen. Gebundenes PRO-Polypeptid wird mit auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannten Verfahren nachgewiesen. Gereinigtes PRO-Polypeptid kann auch direkt auf Platten zur Verwendung in den oben genannten Medikamenten-Screeningtechniken beschichtet werden. Außerdem können nicht-neutralisierende Antikörper verwendet werden, um Peptid einzufangen und es am festen Träger zu immobilisieren.
Diese Erfindung erwägt auch die Verwendung kompetitiver Medikamenten-Screeningtests, in denen neutralisierende Antikörper, die zur Bindung von PRO-Polypeptid fähig sind, spezifisch mit einer Testverbindung um die Bindung an PRO-Polypeptid oder Fragmente davon konkurrieren. Auf diese Weise können die Antikörper verwendet werden, um das Vorliegen jeglichen Peptids nachzuweisen, das eine oder mehrere antigene Determinanten mit dem PRO-Polypeptid gemeinsam hat.
BEISPIEL 13: Rationales Arzneimittel-Design
Das Ziel von rationalem Arzneimittel-Design ist es, Strukturanaloga biologisch aktiver Polypeptide von Interesse (d. h. eines PRO-Polypeptids) oder von kleinen Molekülen herzustellen, mit denen sie Wechselwirken, z. B. Agonisten, Antagonisten oder Inhibitoren. Jedes dieser Beispiele kann verwendet werden, um Medikamente zu gestalten, die aktivere oder stabilere Formen des PRO-Polypeptids sind oder die die Funktion des PRO-Polypeptids in vivo steigern oder stören (vgl. Hodgson, Bio/Technology 9, 19–21 (1991)).
In einem der Ansätze wird die dreidimensionale Struktur des PRO-Polypeptids oder eines PRO-Polypeptid-Inhibitor-Komplexes mittels Röntgenstrahlenkristallographie, mittels Computermodellierung oder am typischsten mittels einer Kombination beider Ansätze bestimmt. Die Form sowie die Ladungen des PRO-Polypeptids müssen ermittelt sein, um die Struktur aufzuklären und die aktive(n) Stelle(n) des Moleküls zu bestimmen. Seltener können brauchbare Informationen bezüglich der Struktur des PRO-Polypeptids durch Modellierung auf Basis der Struktur homologer Proteine erlangt werden. In beiden Fällen werden maßgebliche Strukturinformationen verwendet, um analoge PRO-Polypeptid-artige Moleküle zu konstruieren oder um effiziente Inhibitoren zu identifizieren. Brauchbare Beispiele des rationalen Arzneimittel-Designs können Moleküle umfassen, die eine verbesserte Aktivität oder Stabilität aufweisen, wie von Braxton und Wells, Biochemistry 31, 7796–7801 (1992), gezeigt wurde, oder die als Inhibitoren, Agonisten, Antagonisten nativer Peptide wirken, wie von Athauda et al., J. Biochem. 113, 742–746 (1993), gezeigt wurde.
Es ist außerdem möglich, einen für das Ziel spezifischen Antikörper zu isolieren, der wie oben beschrieben durch einen Funktionstest selektiert wurde, und dann seine Kristallstruktur aufzuklären. Dieser Ansatz liefert im Prinzip ein Pharmakor, auf dem eine nachfolgende Medikamentkonstruktion basieren kann. Es ist möglich, die Proteinkristallographie gänzlich zu umgehen, indem Anti-Idiotyp-Antikörper (Anti-Ids) gegen einen funktionellen, pharmakologisch aktiven Antikörper erzeugt werden. Als Spiegelbild eines Spiegelbilds kann von der Bindungsstelle der Anti-Ids erwartet werden, dass sie ein Analogon des ursprünglichen Rezeptors ist. Der Anti-Id könnte dann verwendet werden, um Peptide aus Banken chemisch oder biologisch produzierter Peptide zu identifizieren und zu isolieren. Die isolierten Peptide würden dann als Pharmakor agieren.
Aufgrund der vorliegenden Erfindung können ausreichende Mengen des PRO-Polypeptids verfügbar gemacht werden, um derartige analytische Untersuchungen wie eine Röntgenstrahlenkristallographie durchzuführen. Außerdem stellt die Kenntnis der hierin bereitgestellten PRO-Polypeptid-Aminosäuresequenz eine Orientierung für jene bereit, die Computermodellierungstechniken anstelle der oder zusätzlich zur Röntgenstrahlenkristallographie einsetzen.
BEISPIEL 14: Gen-Amplifikation
Dieses Beispiel zeigt, dass Gene, die für verschiedene PRO-Polypeptide kodieren, im Genom gewisser menschlicher Krebsarten amplifiziert werden. Die Amplifikation ist mit der Überexpression des Genprodukts assoziiert, was zeigt, dass das PRO-Polypeptid ein nützliches Ziel für therapeutische Interventionen bei gewissen Krebsarten, wie z. B. Kolon-, Lungen- und andere Krebsarten, darstellt. Therapeutische Mittel können die Form von Antagonisten von für PRO-Polypeptide kodierenden Genen annehmen, z. B. murin-menschliche chimäre, humanisierte oder menschliche Antikörper gegen das PRO-Polypeptid.
Das Ausgangsmaterial für das Screening war genomische DNA, die aus einer Reihe von Krebsarten isoliert wurde. Die DNA wird genau, z. B. fluorometrisch, quantifiziert. Als negative Kontrolle wurde DNA aus den Zellen von zehn normalen, gesunden In dividuen isoliert, gepoolt und als Testkontrolle für die Genkopie bei gesunden Individuen (NorHu) verwendet.
Der 5'-Nuclease-Test (z. B. TaqMan^TM) sowie quantitative Echtzeit-PCR (z. B. ABI Prizm 7700 Sequence Detection System^TM (Perkin Elmer, Applied Biosystems Divisi on, Foster City, CA)) wurden verwendet, um Gene zu finden, die bei gewissen Krebsarten potentiell amplifiziert werden. Die Resultate wurden verwendet, um zu bestimmen, ob die für das PRO-Polypeptid kodierende DNA in etwaigen der gescreenten Lungen- und Kolon-Krebsarten überrepräsentiert sind. Das Resultat wurde in Delta-CT-Einheiten dargestellt. Eine Einheit entspricht 1 PCR-Zyklus oder etwa einer 2fachen Amplifikation im Verhältnis zum Normalwert, zwei Einheiten entsprechen dem 4fachen, 3 Einheiten dem 8fachen usw. Die Quantifizierung wurde unter Verwendung von Primern und einem Taqman^TM-Fluoreszenzstoff, der von dem für das PRO-Polypeptid kodierenden Gen abstammt, erhalten. Regionen des PRO-Polypeptids, die mit der größten Wahrscheinlichkeit einzigartige Nucleinsäuresequenzen enthalten und die mit der geringsten Wahrscheinlichkeit ausgespleißte Introns aufweisen, werden für die Primer-Ableitung bevorzugt, z. B. die untranslatierte 3'-Region.
Die 5'-Nuclease-Testreaktion ist ein fluoreszierendes PCR-basiertes Verfahren, das die 5'-Exonuclease-Aktivität von Taq-DNA-Polymerase-Enzym verwendet, um die Amplifikation in Echtzeit zu beobachten. Zwei Oligonucleotid-Primer werden für die Erzeugung eines Amplicons verwendet, das für eine PCR-Reaktion typisch ist. Ein drittes Oligonucleotid oder eine Sonde wird kreiert, um eine Nucleotidsequenz zu detektieren, die sich zwischen den zwei PCR-Primern befindet. Die Sonde ist mittels Taq-DNA-Polymerase-Enzym nicht verlängerbar und mit einem fluoreszierenden Reporter-Farbstoff und einem fluoreszierenden Quencher-Farbstoff markiert. Etwaige laserindizierte Emissionen des Reporter-Farbstoffs wird durch den Quench-Farbstoff gequencht, wenn sich die zwei Farbstoffe nahe beieinander befinden, wie dies auf der Sonde der Fall ist. Während der Amplifikationsreaktion wird die Sonde mit dem Taq-DNA-Polymerase-Enzym auf eine matrizenabhängige Art und Weise gespalten. Die resultierenden Sondenfragmente dissoziieren in Lösung, und das Signal des freigesetzten Reporter-Farbstoffs ist frei von der quenchenden Wirkung des zweiten Fluorophors. Ein Molekül des Reporter-Farbstoff wird für jedes neue synthetisierte Molekül freigesetzt, und die Detektion des nicht gequenchten Reporter-Farbstoffs stellt die Basis für die quantitative Interpretion der Daten dar.
Das 5'-Nuclease-Verfahren wird auf einer Vorrichtung zur quantitativen Echtzeit-PCR, z. B. der ABI Prism 7700^TM Sequence Detection, laufen gelassen. Das System besteht aus einem Thermocycler, einem Laser, einer ladungsgekoppelten Kameravorrichtung (CCD) und einem Computer. Das System amplifiziert Proben in einem 96-Well-Format auf einem Thermocycler. Während der Amplifikation wird das laser-induzierte fluoreszierende Signal in Echtzeit durch Glasfaserkabeln von allen 96 Wells gesammelt und an der CCD detektiert. Das System umfasst Software zum Betrieb des Instruments sowie zur Analyse der Daten.
5'-Nuclease-Testdaten werden anfänglich als Ct oder als Schwellenwert-Zyklus exprimiert. Dies wird als jener Zyklus definiert, bei dem es zu einer Akkumulation des Reporter-Signals über dem Fluoreszenz-Hintergrund-Ausmaß kommt. Die Ct-Werte werden als quantitative Messung der relativen Anzahl an Start-Kopien einer bestimmten Target-Sequenz in einer Nucleinsäureprobe verwendet.
Es wurde herausgefunden, dass Gene, die für die folgenden PRO-Polypeptide kodierten, in dem oben genannten Test amplifiziert wurden:
PRO351.
BEISPIEL 15: In-situ-Hybridisierung
Die In-situ-Hybridisierung ist eine leistungsfähige und vielseitige Technik zur Detektion und Lokalisierung von Nucleinsäuresequenzen in Zell- oder Gewebepräparaten. Sie kann beispielsweise zweckdienlich sein, um Orte der Genexpression zu identifizieren, die Gewebeverteilung der Transkription zu analysieren, Virusinfektion festzustellen und zu lokalisieren, Veränderungen der spezifischen mRNA-Synthese zu verfolgen und die Chromosomenkartierung zu unterstützen.
Die In-situ-Hybridisierung wurde nach einer optimierten Version des Protokolls von Lu und Gillet, Cell Vision 1, 169–176 (1994), unter Verwendung von PCR-erzeugten, ³³P-markierten Ribosonden durchgeführt. Zusammenfassend wurden in Formalin fi xierte, in Paraffin eingebettete menschliche Gewebe geschnitten, von Paraffin befreit, in Proteinase K (20 g/ml) 15 Minuten lang bei 37°C von Protein befreit und für die In-situ-Hybridisierung wie von Lu und Gillet, s. o., beschrieben weiterverarbeitet. Eine [³³P]UTP-markierte Antisense-Ribosonde wurde aus einem PCR-Produkt erzeugt und bei 55°C über Nacht hybridisiert. Die Objektträger wurden in Kodak NTB2-Nuclear-track-Emulsion eingetaucht und 4 Wochen lang exponiert.
Synthese der ³³P-Ribosonde
6,0 μl (125 mCi) ³³P-UTP (Amersham BF 1002, SA < 2.000 Ci/mmol) wurden mittels Speed-Vac getrocknet. Jedem ³³P-UTP enthaltendem Röhrchen wurden die folgenden Bestandteile zugegeben:
2,0 μl 5 × Transkriptionspuffer
1,0 μl DTT (100 mM)
2,0 μl NTP-Gemisch (2,5 mM: 10 μ; je 10 mM GTP, CTP & ATP + 10 μl H₂O)
1,0 μl UTP (50 μM)
1,0 μl Rnasin
1,0 μl DNA-Templat (1 μg)
1,0 μl H₂O
1,0 μl RNA-Polymerase (für PCR-Produkte T3 = AS, T7 = S, üblicherweise)
Die Röhrchen wurden bei 37°C eine Stunde lang inkubiert. 1,0 μl RQ1-DNase wurde zugegeben, gefolgt von Inkubation bei 37°C für 15 Minuten. Es wurden 90 μl TE (10 mM Tris pH 7,6/1 mM EDTA pH 8,0) zugegeben und das Gemisch auf DE81-Papier pipettiert. Die verbleibende Lösung wurde in eine Microcon-50-Ultrafiltrationseinheit gegeben und unter Verwendung von Programm 10 zentrifugiert (6 Minuten). Die Filtrationseinheit wurde über ein zweites Röhrchen invertiert und unter Verwendung von Programm 2 zentrifugiert (3 Minuten). Nach einer letzten Zentrifugation zur Gewinnung wurden 100 μl TE zugegeben. 1 μl des Endprodukts wurde auf DE81-Papier pipettiert und in 6 ml Biofluor II gezählt.
Die Sonde wurde an einem TBE/Harnstoff-Gel laufen gelassen. 1–3 μl der Sonde oder 5 μl RNA Mrk III wurden zu 3 μl Beladungspuffer zugegeben. Nach Erhitzen auf einem Heizblock bei 95°C für 3 Minuten wurde das Gel sofort auf Eis gegeben. Die Näpfe des Gels wurden gespült, die Probe aufgegeben und bei 180–250 V 45 Minuten lang laufen gelassen. Das Gel wurde in Saranfolie eingewickelt und einem XAR-Film mit einem Bildverstärkerschirm in einem Gefrierschrank bei –70°C für eine Stunde bis über Nacht exponiert.
³³P-Hybridisierung
A. Vorbehandlung von Gefrierschnitten
Die Objektträger wurden dem Gefrierschrank entnommen, auf Aluminiumschalen gegeben und bei Raumtemperatur 5 Minuten lang aufgetaut. Die Schalen wurden fünf Minuten lang bei 55°C in einen Inkubator gestellt, um die Kondensation zu vermindern. Die Objektträger wurden 10 Minuten lang in 4% Paraformaldehyd auf Eis in einem Abzug fixiert und in 0,5 × SSC 5 Minuten lang bei Raumtemperatur gewaschen (25 ml 20 × SSC + 975 ml SQ-H₂O). Nach der Proteinentfernung in 0,5 μg/ml Proteinase K für 10 Minuten bei 37°C (12,5 μl einer 10 mg/ml Stammlösung in 250 ml vorgewärmtem, RNase-freiem RNAse-Puffer) wurden die Schnitte in 0,5 × SSC 10 Minuten lang bei Raumtemperatur gewaschen. Die Schnitte wurden in 70%, 95%, 100% Ethanol für je 2 Minuten entwässert.
B. Vorbehandlung von in Paraffin eingebetteten Schnitten
Die Objektträger wurden vom Paraffin befreit, in SQ-H₂O gegeben und zweimal in 2 × SSC bei Raumtemperatur jeweils 5 Minuten lang gespült. Die Schnitte wurden von Protein befreit, und zwar in 20 μg/ml Proteinase K (500 μl einer 10 mg/ml Stammlösung in 250 ml RNase-freiem RNase-Puffer; 37°C, 15 Minuten) – menschlicher Embryo, oder 8 × Proteinase K (100 μl in 250 ml RNase-Puffer, 37°C, 30 Minuten) – Formalingewebe. Die anschließende Spülung in 0,5 × SSC und Entwässerung wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
C. Vorhybridisierung
Die Objektträger wurden in einer mit Box-Puffer- (4 × SSC, 50% Formamid) gesättigtem Filterpapier ausgekleideten Kunststoffbox ausgelegt. Das Gewebe wurde mit 50 μl Hybridisierungspuffer (3,75 g Dextransulfat + 6 ml SQ-H₂O) bedeckt, gevortext und in der Mikrowelle 2 Minuten lang mit gelockertem Deckel erhitzt. Nachdem Abkühlen auf Eis wurden 18,75 ml Formamid, 3,75 ml 20 × SSC und 9 ml SQ-H₂O zugegeben, das Gewebe gut gevortext und bei 42°C 1–4 Stunden lang inkubiert.
D. Hybridisierung
1,0 × 10⁶ cpm Sonde und 1,0 μl tRNA (50 mg/ml Stammlösung) je Objektträger wurden für 3 Minuten auf 95°C erhitzt. Die Objektträger wurden auf Eis gekühlt, und es wurden 48 μl Hybridisierungspuffer je Objektträger zugegeben. Nach dem Vortexen wurden 50 μl ³³P-Gemisch zu 50 μl der Vorhybridisierung auf dem Objektträger zugegeben. Die Objektträger wurden über Nacht bei 55°C inkubiert.
E. Waschungen
Das Waschen wurde für 2 × 10 Minuten mit 2 × SSC, EDTA bei Raumtemperatur (400 ml 20 × SSC + 16 ml 0,25 M EDTA, V_f = 4 l) durchgeführt, gefolgt von RNaseA-Behandlung bei 37°C für 30 Minuten (500 μl von 10 mg/ml in 250 ml Rnase-Puffer = 20 μg/ml). Die Objektträger wurden 2 × 10 Minuten mit 2 × SSC, EDTA bei Raumtemperatur gewaschen. Die Stringent-Waschbedingungen waren die Folgenden: 2 Stunden bei 55°C, 0,1 × SSC, EDTA (20 ml 20 × SSC + 16 ml EDTA, V_f = 4 l).
F. Oligonucleotide
Die In-situ-Analyse wurde an einer Vielzahl von in EP 99912321.9 offenbarten DNA-Sequenzen vorgenommen. Die für diese Analysen eingesetzten Oligonucleotide wurden von den in EP 99912321.9 offenbarten Nucleotidsequenzen hergeleitet und weisen allgemein eine Länge im Bereich von 40 bis 55 Nucleotiden auf.
Hinterlegung von Material
Die folgenden Materialien wurden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklaven Drive, Rockville, MD, USA (ATCC), hinterlegt:

Material ATCC-Hinterlegungsnr. Hinterlequngsdatum

DNA40571-1315 ATCC 209784 21. April 1998
Diese Hinterlegung wurde unter den Bestimmungen des „Budapest Treaty an the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and the Regulations thereunder" (Budapest-Übereinkommen) vorgenommen. Dies garantiert die Erhaltung einer lebensfähigen Kultur der Hinterlegung für 30 Jahre vom Datum der Hinterlegung. Die Hinterlegung wird von ATCC unter den Bedingungen des Budapest-Übereinkommens zur Verfügung gestellt und unterliegt einer Vereinbarung zwischen Genentech Inc. und ATCC, was die ständige und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Kultur der Hinterlegung für die Öffentlichkeit bei Erteilung des einschlägigen US-Patents oder bei Offenlegung jeglicher US- oder ausländischen Patentanmeldung gewährleistet, was auch immer als erstes eintrifft, und die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft für jemanden vom US-Bevollmächtigten für Patente und Warenzeichen bestimmten gewährleistet, der dazu gemäß 35 USC §122 und gemäß den Regeln des Bevollmächtigten dafür (einschließlich 37 CFR § 1,14 mit besonderer Bezugnahme auf 886 OG 638) berechtigt ist.
Der Abtretungsempfänger der vorliegenden Anmeldung hat zugestimmt, dass die Materialien, falls eine Kultur der hinterlegten Materialien bei Kultivierung unter geeigneten Bedingungen abstirbt, verloren geht oder zerstört werden sollte, bei Benachrichtigung unverzüglich durch andere derselben ersetzt werden. Die Verfügbarkeit der hinterlegten Materialien ist nicht als Erlaubnis auszulegen, die Erfindung entgegen der unter der Amtsgewalt einer beliebigen Regierung gemäß ihrer Patentrechte gewährten Rechte praktisch umzusetzen.
Die vorangehende schriftliche Beschreibung wird als ausreichend erachtet, einem Fachkundigen zu ermöglichen, die Erfindung in die Praxis umzusetzen. Die vorliegende Erfindung wird durch das hinterlegte Konstrukt in ihrem Umfang nicht eingeschränkt, da die hinterlegte Ausführungsform als einzelne Illustration gewisser Aspekte der Erfindung gedacht ist. Die Hinterlegung von Material hierin stellt kein Zugeständnis dar, dass die hierin enthaltende schriftliche Beschreibung unzulänglich ist, um die praktische Umsetzung irgendeines Aspekts der Erfindung, einschließlich der besten Ausführungsart davon, zu ermöglichen, noch ist sie dahingehend auszulegen, dass sie den Schutzumfang der Ansprüche auf die speziellen Illustrationen einschränkt, die sie verkörpert. In der Tat werden verschiedene Modifizierungen zusätzlich zu jenen, die hierin dargestellt und beschrieben sind, dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung aus der vorhergehenden Beschreibung offensichtlich und liegen im Schutzumfang der beigefügten Ansprüche.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte Nucleinsäure, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, die zumindest über 80% Sequenzidentität zur Aminosäuresequenz, die in 2 dargestellt ist, verfügt, oder das Komplement davon, worin die Sequenzidentität über die volle Länge der verglichenen Sequenzen bestimmt wird.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, worin das Ausmaß an Identität zumindest 90% beträgt.
Nucleinsäure nach Anspruch 2, worin das Ausmaß an Identität zumindest 95% beträgt.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, die für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz umfasst, die in 2 dargestellt ist.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, welche die für die in 1 dargestellte Sequenz kodierende Sequenz voller Länge umfasst, oder das Komplement davon.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, welche die Nucleotidsequenz, die in 1 dargestellt ist, umfasst, oder das Komplement davon.
Isolierte Nucleinsäure, die eine kodierende Sequenz voller Länge des Nucleinsäureinserts (DNA 40571-1315) umfasst, das in Zugriffsnummer ATCC 209784 enthalten ist.
Isolierte Nucleinsäure mit zumindest 80% Sequenzidentität zur kodierenden Nucleotidsequenz, die in 1 dargestellt ist, oder das Komplement davon, worin die Sequenzidentität über die volle Länge der verglichenen Sequenzen bestimmt wird.
Vektor, der die Nucleinsäure nach einem der vorangegangenen Ansprüche umfasst.
Vektor nach Anspruch 9, der operabel mit Kontrollsequenzen verbunden ist, die von einer Wirtszelle erkannt werden, die mit dem Vektor transformiert ist.
Wirtszelle, die den Vektor nach Anspruch 9 oder Anspruch 10 umfasst.
Wirtszelle nach Anspruch 11, worin die Zelle eine CHO-Zelle, ein E. coli oder eine Hefezelle ist.
Verfahren zur Herstellung eine Polypeptids, umfassend das Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 11 oder Anspruch 12 unter Bedingungen, die für die Expression des Polypeptids geeignet sind, und das Gewinnen des Polypeptids aus der Zellkultur.
Isoliertes Polypeptid mit zumindest 80% Sequenzidentität zur Aminosäuresequenz, die in 2 dargestellt ist, worin die Sequenzidentität über die volle Länge der verglichenen Sequenzen bestimmt wird.
Polypeptid nach Anspruch 14, das aus der Aminosäuresequenz besteht, die in 2 dargestellt ist.
Polypeptid nach Anspruch 14, das aus der extrazellulären Domäne der Aminosäuresequenz besteht, die in 2 dargestellt ist, die durch die Aminosäurereste von 16 bis 571 repräsentiert wird.
Isoliertes Polypeptid mit zumindest 80% Sequenzidentität zur Aminosäuresequenz, für welche die kodierende Sequenz voller Länge des Nucleinsäureinserts (DNA 40571-1315) kodiert, das in Zugriffsnummer ATCC 209784 enthalten ist, worin die Sequenzidentität über die volle Länge der Sequenzen bestimmt wird, die verglichen werden.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 17, das aus der Aminosäuresequenz besteht, für welche die kodierende Sequenz voller Länge des Nucleinsäureinserts (DNA 40571-1315) kodiert, das in Zugriffsnummer ATCC 209784 enthalten ist.
Polypeptid nach Anspruch 14 oder Anspruch 17, worin das Ausmaß an Identität zumindest 90% beträgt.
Polypeptid nach Anspruch 19, worin das Ausmaß an Identität zumindest 95% beträgt.
Chimäres Molekül, das ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 14 bis 20, fusioniert an eine heterologe Aminosäuresequenz, umfasst.
Chimäres Molekül nach Anspruch 21, worin die heterologe Aminosäuresequenz eine Epitopmarkierungssequenz ist.
Chimäres Molekül nach Anspruch 21, worin die heterologe Aminosäuresequenz eine Fc-Region eines Immunglobulins ist.
Antikörper, der sich spezifisch an das Polypeptid nach einem der Ansprüche 15, 16 und 18 bindet.
Antikörper nach Anspruch 24, worin der Antikörper ein humanisierter Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 24, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 26, worin der Antikörper ein chimärer Antikörper ist.
Verfahren zur Diagnose von Krebs, wobei das Verfahren das Testen einer Gewebsprobe auf Amplifikation eines Gens, das für ein Polypeptid kodiert, das über die Aminosäuresequenz aus 2 verfügt, und/oder auf Überexpression eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz von 2 umfasst, worin Amplifikation und/oder Überexpression zeigen, dass die Probe von kanzerösem Gewebe abstammt; und worin die Probe aus Lunge oder Colon stammt.
Verfahren nach Anspruch 28, worin die Probe aus Lunge stammt.