DE69824979T2

DE69824979T2 - PRO243 Polypeptide und dafür kodierende Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE69824979T2
Application number: DE69824979T
Authority: DE
Inventors: Kevin P. Darnestown Baker; Jian Princetown Chen; Audrey San Francisco Goddard; Austin L. Belmont Gurney; William I. Hillsborough Wood; Jean San Mateo Yuan
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1997-12-03
Filing date: 1998-12-01
Publication date: 2005-08-25
Anticipated expiration: 2018-12-02
Also published as: ZA9811071B; ATE270675T1; DE69824979D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Identifizierung und Isolierung neuer DNA und die rekombinante Produktion neuer Polypeptide, die von dieser DNA kodiert werden.
Hintergrund der Erfindung
Extrazelluläre Proteine spielen eine bedeutende Rolle bei der Bildung, Differenzierung und Erhaltung mehrzelliger Organismen. Das Schicksal vieler einzelner Zellen, z.B. die Vermehrung, Migration, Differenzierung oder Wechselwirkung mit anderen Zellen, wird typischerweise von Informationen bestimmt, die von anderen Zellen und/oder der unmittelbaren Umgebung erhalten werden. Diese Informationen werden häufig von sekretierten Polypeptiden übertragen (beispielsweise von mitogenen Faktoren, Überlebensfaktoren, zytotoxischen Faktoren, Differenzierungsfaktoren, Neuropeptiden und Hormonen), die wiederum von verschiedenartigen Zellrezeptoren oder membrangebundenen Proteinen empfangen und interpretiert werden. Diese sekretierten Polypeptide oder Signalmoleküle strömen normalerweise durch den zellulären Sekretionsweg, um ihren Wirkungsort in der extrazellulären Umgebung zu erreichen.
Sekretierte Proteine weisen verschiedene gewerbliche Anwendungen auf, einschließlich Pharmazeutika, Diagnostika, Biosensoren und Bioreaktoren. Die meisten zurzeit erhältlichen Proteinarzneimittel, wie z.B. thrombolytische Mittel, Interferone, Interleukine, Erythropoietine, koloniestimulierende Faktoren und verschiedene andere Cytokine, sind sekretorische Proteine. Ihre Rezeptoren, die Membranproteine sind, weisen ebenfalls ein Potenzial als therapeutische oder diagnostische Mittel auf. Industrie sowie Universitäten bemühen sich, neue native sekretierte Proteine zu identifizieren. Zahlreiche Bemühungen konzentrieren sich auf das Screening von rekombinanten Säugetier-DNA-Bibliotheken, um die kodierenden Sequenzen für neue sekretierte Proteine zu identifizieren. Beispiele von Screeningverfahren und Techni ken werden in der Literatur beschrieben (siehe beispielsweise Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 7108-7113 (1996); US-Patent Nr. 5.536.637)).
Membrangebundene Proteine und Rezeptoren können eine wichtige Rolle bei der Bildung, Differenzierung und Erhaltung mehrzelliger Organismen spielen. Das Schicksal vieler einzelner Zellen, z.B. die Vermehrung, Migration, Differenzierung oder Wechselwirkung mit anderen Zellen, wird typischerweise von Informationen bestimmt, die von anderen Zellen und/oder der unmittelbaren Umgebung erhalten werden. Diese Informationen werden häufig von sekretierten Polypeptiden übertragen (beispielsweise von mitogenen Faktoren, Überlebensfaktoren, zytotoxischen Faktoren, Differenzierungsfaktoren, Neuropeptiden und Hormonen), die wiederum von verschiedenartigen Zellrezeptoren oder membrangebundenen Proteinen empfangen und interpretiert werden. Solche membrangebundenen Proteine und Zellrezeptoren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Cytokinrezeptoren, Rezeptorkinasen, Rezeptorphosphatasen, an Zell-Zell-Wechselwirkungen beteiligte Rezeptoren und zelluläre Adhäsinmoleküle, wie z.B. Selectine und Integrine. Beispielsweise wird die Übertragung von Signalen, welche Zellwachstum und -differenzierung regulieren, teilweise von der Phosphorylierung verschiedener Zellproteine reguliert. Protein-Tyrosinkinasen, Enzyme, die diesen Prozess katalysieren, können auch als Wachstumsfaktorrezeptoren fungieren. Beispiele umfassen Fibroblastenwachstumsfaktor-Rezeptor und Nervenwachstumsfaktor-Rezeptor.
Membrangebundene Proteine und Rezeptormoleküle haben verschiedene gewerbliche Anwendungen, einschließlich als pharmazeutische und diagnostische Mittel. Rezeptorimmunoadhäsine beispielsweise können als therapeutische Mittel eingesetzt werden, um die Rezeptor-Liganden-Wechselwirkung zu blockieren. Die membrangebundenen Proteine können weiters zum Screening möglicher Peptid- oder Kleinmolekül-Inhibitoren der relevanten Rezeptor/Liganden-Wechselwirkung eingesetzt werden. Es werden von Industrie sowie Universitäten Anstrengungen unternommen, neue native Rezeptorproteine zu identifizieren. Zahlreiche Bemühungen konzentrie ren sich auf das Screening von rekombinanten Säugetier-DNA-Bibliotheken, um die kodierenden Sequenzen für neue Rezeptorproteine zu identifizieren.
Die Erfinder beschreiben hierin die Identifizierung und Charakterisierung neuer sekretierter Polypeptide und Transmembranpolypeptide und neuer Nucleinsäuren, die für diese Polypeptide kodieren.
PRO243
Chordin (Xenopus, Xchd) ist ein löslicher Faktor, der vom Spemann-Organisator sekretiert wird, welcher starke Dorsalisierungsaktivität aufweist (Sasai et al., Cell 79, 779–90 (1994); Sasai et al., Nature 376, 333–36 (1995)). Weitere Dorsalisierungsfaktoren, die vom Organisator sekretiert werden, sind Noggin (Smith und Harlan, Cell 70, 829–840 (1992); Lamb et al., Science 262, 713–718 (1993)) und Follistatin (Hemmanti-Brivanlou et al., Cell 77, 283–295 (1994)). Chordin teilt primitives Ektoderm in neurale und nichtneurale Domänen und löst Notochord- und Muskelbildung durch Dorsalisierung des Mesoderms aus. Das geschieht dadurch, dass es als Antagonist der ventralisierenden BMP-4-Signale fungiert. Diese Inhibition wird durch direkte Bindung von Chordin an BMP-4 im extrazellulären Raum vermittelt, wodurch eine BMP-4-Rezeptoraktivierung durch BMP-4 verhindert wird (Piccolo et al., Develop. Biol. 182, 5–20 (1996)).
BMP-4 wird mit einem Gradienten von der ventralen Seite des Embryos exprimiert, während Chordin mit einem Gradienten exprimiert wird, der komplementär zu jenem von BMP-4 ist. Chordin wirkt BMP-4 entgegen, um das untere Ende des BMP-4-Gradienten zu bilden. So stellt das Gleichgewicht zwischen dem Signal von Chordin und anderen vom Organisator stammenden Faktoren auf der einen Seite und dem BMP-Signal auf der anderen Seite das ektodermale Keimblatt mit seinen dorsalen-ventralen Positionsinformationen bereit. Chordin kann auch an der dorsalen-ventralen Strukturierung des Zentralnervensystems mitwirken (Sasai et al., Cell 79, 779–90 (1994)). Es induziert auch ausschließlich vorderes Nervengewebe (Vorderhirntyp), wodurch der neurale Typ anteriorisiert wird (Sasai et al., Cell 79, 779–90 (1997)). In Anbetracht seiner Rolle bei neuronaler Induktion und Strukturierung kann sich Chordin bei der Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen und Nervenschäden, beispielsweise aufgrund von Traumata oder nach Chemotherapie, als nützlich erweisen.
Die Erfinder beschreiben hierin die Identifizierung und Charakterisierung neuer Polypeptide, die Homologie zum Chordin-Protein aufweisen, worin diese Polypeptide hierin als PRO243-Polypeptide bezeichnet werden.
Zusammenfassung der Erfindung
PRO243
Die Anmelder haben einen cDNA-Klon (DNA35917-1207) identifiziert, der für ein neues Polypeptid kodiert, das in der vorliegenden Anmeldung als „PRO243" bezeichnet wird.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das zumindest 80 % Sequenzidentität mit (a) einem DNA-Molekül, das für ein PRO243-Polypeptid kodiert, welches die Aminosäuresequenz 24 bis 954 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) umfasst, oder (b) dem Komplement des DNA-Moleküls von (a) aufweist. Die Sequenzidentität beträgt vorzugsweise etwa 85 %, noch bevorzugter etwa 90 %, insbesondere etwa 95 %. In einem Aspekt weist die isolierte Nucleinsäure zumindest etwa 80 %, vorzugsweise zumindest etwa 85 %, noch bevorzugter zumindest etwa 90 % und insbesondere zumindest etwa 95 % Sequenzidentität mit einem Polypeptid mit den Aminosäureresten 1 bis 954 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) auf. Vorzugsweise findet sich der höchste Grad an Sequenzidentität innerhalb der vier (4) konservierten Cysteincluster (Aminosäuren 51 bis 125; Aminosäuren 705 bis 761; Aminosäuren 784 bis 849; und Aminosäuren 897 bis 931) aus 2 (Seq.-ID Nr. 2). In einer weiteren Ausführungsform umfasst das isolierte Nucleinsäuremolekül DNA, die für ein PRO243-Polypeptid mit den Aminosäureresten 24 bis 954 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) kodiert oder komplementär zu solch einer kodierenden Nucleinsäuresequenz ist, und bleibt unter zumindest mäßigen und gegebenenfalls sehr stringenten Bedingungen stabil daran gebunden. In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Nucleinsäure des Proteins voller Länge des Klons DNA35917-1207 bereit, die unter der ATCC-Zugriffsnummer ATCC 209508 hinterlegt ist, alternativ dazu die Kodierungssequenz des Klons DNA35917-1207, die unter der ATCC-Zugriffsnummer ATCC 209508 hinterlegt ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein isoliertes PRO243-Polypeptid bereit. Genauer gesagt stellt die Erfindung eine isoliertes Nativsequenz-PRO243-Polypeptid bereit, das in einer Ausführungsform eine Aminosäuresequenz enthält, die die Reste 24 bis 954 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) umfasst. Insbesondere sind native PRO243-Polypeptide mit oder ohne nativer Signalsequenz (Aminosäuren 1 bis 23 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2)) und mit oder ohne das Initiationsmethionin inkludiert. Alternativ dazu stellt die Erfindung ein PRO243-Polypeptid bereit, für das die Nucleinsäure kodiert, die unter der Zugangsnummer ATCC 209508 hinterlegt ist.
Weitere Ausführungsformen
In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung stellt die Erfindung Vektoren bereit, welche DNA umfassen, die für beliebige der oben und unten beschriebenen Polypeptide kodieren. Eine Wirtszelle, die einen beliebigen derartigen Vektor umfasst, wird ebenfalls bereitgestellt. Beispielswiese können die Wirtszellen CHO-Zellen, E. coli oder Hefe sein. Weiters wird ein Verfahren zur Produktion beliebiger der oben oder unten beschriebenen Polypeptide bereitgestellt und umfasst das Kultivieren von Wirtszellen unter Bedingungen, die zur Expression des gewünschten Polypeptids geeignet sind, und das Gewinnen des gewünschten Polypeptids aus der Zellkultur.
In anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung chimäre Moleküle bereit, die beliebige der oben oder unten beschriebenen Polypeptide umfassen, die an ein heterologes Polypeptid oder an eine heterologe Aminosäuresequenz fusioniert sind. Ein Beispiel eines solchen chimären Moleküls umfasst ein beliebiges der oben oder unten beschriebenen Polypeptide, das an eine Epitopmarkierungssequenz oder an eine Fc-Region eines Immunglobulins fusioniert ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung einen Antikörper bereit, der spezifisch an ein beliebiges der oben oder unten beschriebenen Polypeptide bindet. Gegebenenfalls ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper.
In noch weiteren Ausführungsformen stellt die Erfindung Oligonucleotidsonden bereit, die zur Isolierung von genomischen und cDNA-Nucleotidsequenzen zweckdienlich sind, worin diese Sonden von einer beliebigen der oben oder unten beschriebenen Nucleotidsequenzen hergeleitet sein können.
Kurzbeschreibung der Abbildungen
1 zeigt eine Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 1) einer Nativsequenz-PRO243-cDNA, worin Seq.-ID Nr. 1 ein Klon ist, der hierin als „UNQ217" und/oder „DNA35917-1207" bezeichnet wird.
2 zeigt die von der kodierenden Sequenz der in 1 dargestellten Seq.-ID Nr. 1 hergeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2).
3 zeigt die Anordnung der genomischen Klone in der THPO-Region eines menschlichen Chromosoms 3g27-q28.
4a–b zeigt die Expression von PRO243 in menschlichem adultem und fötalem Gewebe. 4a ist ein Northern-Blot von menschlichem adultem und fötalem Gewebe, das an eine menschliche Chordin-cDNA- (PRO243-) Sonde hybridisiert ist. Der untere Abschnitt zeigt eine Actin-Kontrolle. 4b ist eine Darstellung der menschlichen Chordin- (PRO243-) cDNA mit den Positionen der Codons, die für die dargestellten konservierten Cysteinblöcke kodieren. Die Ausdehnung der verwendeten Sonde ist durch die durchgehende Linie dargestellt.
5 zeigt PRO243 bei In-situ-Hybridisierung von menschlichem adultem Gewebe, wobei es ein positives Signal in der Spaltlinie des sich entwickelnden Synovialgelenks zwischen dem Femurkopf und dem Azetabulum abgibt.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
I. Definitionen
Die Ausdrücke „PRO-Polypeptid" und „PRO" beziehen sich bei Verwendung hierin und wenn sich ihnen eine Zahlenbezeichnung unmittelbar anschließt auf verschiedene Polypeptide, worin sich die vollständige Bezeichnung (d.h. PRO/Zahl) auf hierin beschriebene spezielle Polypeptidsequenzen bezieht. Die Ausdrücke „PRO/Zahl-Polypeptid" und „PRO/Zahl" umfassen bei Verwendung hierin Nativsequenzpolypeptide und Polypeptidvarianten (die hierin weitergehend definiert sind). Die hierin beschriebenen PRO-Polypeptide können aus einer Vielzahl von Quellen isoliert werden, wie z.B. aus menschlichen Gewebetypen oder aus einer anderen Quelle, oder sie können durch rekombinante oder synthetische Verfahren hergestellt werden.
Ein „Nativsequenz-PRO-Polypeptid" umfasst ein Polypeptid mit derselben Aminosäuresequenz wie das entsprechende aus der Natur stammende PRO-Polypeptid. Derartige Nativsequenz-PRO-Polypeptide können aus der Natur isoliert werden oder können durch rekombinante oder synthetische Hilfsmittel hergestellt werden. Der Ausdruck „Nativsequenz-PRO-Polypeptid" umfasst im Speziellen natürlich auftretende trunkierte oder sekretierte Formen des speziellen PRO-Polypeptids (z.B. eine Sequenz der extrazellulären Domäne), natürlich auftretende Variantenformen (z.B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich auftretende allelische Varianten des Poly peptids. In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung ist das Nativsequenz-PRO243 ein reifes Nativsequenzpolypeptid oder ein Nativsequenzpolypeptid voller Länge, das die Aminosäuren 24 bis 954 der 2 (Seq.-ID Nr. 2) umfasst, mit oder ohne N-terminale Signalsequenz (Reste 1 bis etwa 23) und mit oder ohne Initiationsmethionin an Position 1.
Die „extrazelluläre Domäne" oder „ECD" des PRO-Polypeptids bezieht sich auf eine Form des PRO-Polypeptids, die im Wesentlichen frei von Transmembran- oder Zytoplasma-Domänen ist. Für gewöhnlich wird eine PRO-Polypeptid-ECD weniger als 1 % derartiger Transmembran- und/oder Zytoplasma-Domänen aufweisen und wird vorzugsweise weniger als 0,5 % derartiger Domänen aufweisen. Es versteht sich, dass jegliche für die PRO-Polypeptide der vorliegenden Erfindung identifizierten Transmembrandomänen nach Kriterien identifiziert werden, die auf dem Gebiet der Erfindung routinemäßig zur Identifizierung solcher Typen von hydrophoben Domänen eingesetzt werden. Die genauen Begrenzungen einer Transmembranregion können variieren, jedoch höchstwahrscheinlich um nicht mehr als ungefähr 5 Aminosäuren an beiden Enden der anfänglich identifizierten Domäne.
Unter „PRO-Polypeptidvariante" wird ein oben oder unten definiertes aktives PRO-Polypeptid verstanden, das zumindest 80 % Aminosäuresequenzidentität mit der hierin offenbarten Nativsequenz-PRO-Polypeptid-Sequenz voller Länge aufweist. Solche PRO-Polypeptidvarianten umfassen beispielsweise PRO-Polypeptide, worin ein der mehrere Aminosäurereste am N- oder C-Terminus der nativen Aminosäuresequenz voller Länge addiert oder deletiert sind. Für gewöhnlich wird eine PRO-Polypeptidvariante zumindest ungefähr 80 % Aminosäuresequenzidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 85 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest ungefähr 90 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest ungefähr 95 % Aminosäuresequenzidentität und insbesondere bevorzugt zumindest ungefähr 99 % Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz der hierin offenbarten nativen Aminosäuresequenz voller Länge aufweisen.
In Bezug auf PRO243-Varianten bezeichnet der Ausdruck „PRO243-Variante" ein wie unten definiertes aktives PRO243 mit zumindest etwa 80 % Aminosäuresequenzidentität mit (a) einem DNA-Molekül, das für ein PRO243-Polypeptid kodiert, mit oder ohne nativer Signalsequenz, oder (b) dem Komplement des DNA-Moleküls von (a). In einer besonderen Ausführungsform weist die PRO243-Variante zumindest etwa 80 % Aminosäuresequenzhomologie mit dem PRO243 mit einer in 2 für ein Nativsequenz-PRO243 voller Länge gezeigten abgeleiteten Aminosäuresequenz auf. Solche PRO243-Varianten umfassen beispielsweise PRO243-Polypeptide, woein eine oder mehrere Aminosäurereste am N- oder C-Terminus der Sequenz in 2 (Seq.-ID Nr. 2) addiert oder deletiert sind. Vorzugsweise beträgt die Nucleinsäure- oder Aminosäuresequenzidentität zumindest etwa 85 %, bevorzugter zumindest etwa 90 % und insbesondere zumindest etwa 95 %.
„Prozentuelle (%) Aminosäuresequenzidentität" bezüglich der hierin identifizierten PRO-Polypeptidsequenzen ist als derjenige prozentuelle Anteil an Aminosäureresten in einer Kandidatsequenz definiert, der mit den Aminosäureresten in der speziellen PRO-Polypeptidsequenz identisch ist, und zwar erforderlichenfalls nach Angleichung der Sequenzen und Einführung von Lücken, um die maximale prozentuelle Sequenzidentität zu erzielen, wobei jegliche konservative Substitutionen als Teil der Sequenzidentität unberücksichtigt bleiben. Die Angleichung zum Zwecke der Ermittlung der prozentuellen Aminosäuresequenzidentität kann auf verschiedene Weisen erzielt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, beispielsweise unter Verwendung öffentlich erhältlicher Computersoftware, wie z.B. BLAST-, BLAST-2-, ALIGN- oder Megalign- (DNASTAR-) Software. Das bevorzugte Angleichungssoftwareprogramm ist BLAST. Der Fachkundige auf dem Gebiet der Erfindung kann die geeigneten Parameter zur Messung der Angleichung ermitteln, einschließlich jeglicher Algorithmen, die zur Erzielung maximaler Angleichung über die volle Länge der verglichenen Sequenzen erforderlich sind.
„Prozentuelle (%) Nucleinsäureidentität" bezüglich der hierin identifizierten, für PRO kodierenden Nucleinsäuresequenzen ist als derjenige prozentuelle Anteil von Nu cleotiden in einer Kandidatsequenz definiert, der mit den Nucleotiden in der PRO-Nucleinsäuresequenz von Interesse identisch ist, und zwar erforderlichenfalls nach Angleichung der Sequenzen und Einführung von Lücken, um die maximale prozentuelle Sequenzidentität zu erzielen. Die Angleichung zum Zwecke der Ermittlung der prozentuellen Nucleinsäuresequenzidentität kann auf verschiedene Weisen erzielt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, beispielsweise unter Verwendung öffentlich erhältlicher Computersoftware, wie z.B. BLAST-, BLAST-2-, ALIGN- oder Megalign- (DNASTAR-) Software. Der Fachkundige auf dem Gebiet der Erfindung kann die geeigneten Parameter zur Messung der Angleichung ermitteln, einschließlich jeglicher Algorithmen, die zur Erzielung maximaler Angleichung über die volle Länge der verglichenen Sequenzen erforderlich sind.
Unter „isoliert" wird bei Verwendung zur Beschreibung der verschiedenen hierin offenbarten Polypeptide ein Polypeptid verstanden, das aus einer Komponente seiner natürlichen Umgebung identifiziert und abgetrennt und/oder gewonnen worden ist. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die typischerweise diagnostische oder therapeutische Verwendungen für das Polypeptid stören würden und können Enzyme, Hormone und andere proteinartige oder nicht proteinartige Gelöststoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Polypeptid gereinigt, und zwar (1) auf ein Ausmaß, das zur Erlangung von zumindest 15 Resten N-terminaler oder interner Aminosäuresequenz unter Verwendung eines Zentrifugenbechersequenzieres ausreicht, oder (2) bis zur Homogenität mittels SDS-PAGE unter nicht reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau oder vorzugsweise Silberfärbung. Ein isoliertes Polypeptid umfasst ein Polypeptid in situ in rekombinanten Zellen, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des PRO-Polypeptids nicht vorhanden sein wird. Für gewöhnlich wird das isolierte Polypeptid durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
Eine „isolierte", für PRO-Polypeptid kodierende Nucleinsäure ist ein Nucleinsäuremolekül, das identifiziert und von zumindest einem verunreinigenden Nucleinsäuremole kül abgetrennt ist, mit dem es für gewöhnlich in der natürlichen Quelle der PRO-Polypeptidnucleinsäure assoziiert ist. Ein isoliertes PRO-Polypeptidnucleinsäuremolekül liegt in einer anderen Form oder in einem anderen Milieu als in der Natur vor. Isolierte PRO-Polypeptidnucleinsäuremoleküle unterscheiden sich daher vom speziellen PRO-Polypeptidnucleinsäuremolekül, wie es in natürlichen Zellen existiert. Jedoch umfasst ein isoliertes PRO-Polypeptidnucleinsäuremolekül PRO-Polypeptidnucleinsäuremoleküle, die in Zellen enthalten sind, die für gewöhnlich das PRO-Polypeptid exprimieren, wo beispielsweise das Nucleinsäuremolekül sich in einer Stelle im Chromosom befindet, die sich von der natürlicher Zellen unterscheidet.
Der Ausdruck „Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die für die Expression einer operabel gebundenen kodierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig sind. Die Kontrollsequenzen, die beispielsweise für Prokaryoten geeignet sind, umfassen einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, und eine Ribosombindungsstelle. Eukaryotische Zellen setzen bekanntermaßen Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer ein.
Eine Nucleinsäure ist „operabel gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung zu einer weiteren Nucleinsäuresequenz gesetzt wird. Beispielsweise ist DNA für eine Prä-Sequenz oder einen Sekretionsleader operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als ein Prä-Protein exprimiert wird, das sich an der Sekretion des Polypeptids beteiligt; ein Promotor oder Enhancer ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosombindungsstelle ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass die Translation erleichtert wird. Im Allgemeinen bedeutet „operabel gebunden", dass die miteinander verbundenen DNA-Sequenzen zusammenhängend sind und im Falle eines Sekretionsleaders zusammenhängend sind und sich in Lesephase befinden. Jedoch müssen Enhancer nicht zusammenhängend sein. Die Bindung wird durch Ligation an zweckdienlichen Restriktionsstellen erzielt. Falls solche Stellen nicht vorhanden sind, werden die synthetischen Oligonucleotidadaptoren oder Linker gemäß herkömmlicher Praxis verwendet.
Der Ausdruck „Antikörper" wird im weitesten Sinne verwendet und umfasst im Speziellen einzelne monoklonale Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper (einschließlich Agonist-, Antagonist- und neutralisierende Antikörper) und Anti-PRO-Polypeptid-Antikörperzusammensetzungen mit polyepitopischer Spezifität. Der Ausdruck „monoklonaler Antikörper" bezieht sich bei Verwendung hierin auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten wird, d.h. die einzelnen die Population umfassenden Antikörper sind identisch mit der Ausnahme von möglichen natürlich auftretenden Mutationen, die in geringfügigen Mengen vorhanden sein können.
„Aktiv" oder „Aktivität" bezieht sich für die Zwecke hierin auf (eine) Formen) des PRO-Polypeptids, welche biologische und/oder immunologische Aktivitäten des speziellen nativen oder natürlich auftretenden PRO-Polypeptids beibehält bzw. beibehalten. In Bezug auf PRO243 ist eine bevorzugte Aktivität die Fähigkeit, an beispielsweise ein Chordin zu binden und dessen Aktivität zu beeinflussen, beispielsweise zu blockieren oder modulieren, worin die Aktivität vorzugsweise die Regulierung der Notochord- und Muskelbildung einschließt.
„Behandlung" oder „behandeln" bezieht sich auf therapeutische Behandlung sowie prophylaktische oder präventive Maßnahmen. Jene, die der Behandlung bedürfen, umfassen jene, welche die Störung bereits aufweisen, sowie jene, die für die Störung anfällig sind, oder jene, bei denen die Störung zu verhindern ist.
„Säugetier" zum Zwecke der Behandlung bezieht sich auf jegliches Tier, das als Säugetier klassifiziert ist, einschließlich Menschen, Haus- und Nutztieren und Zoo- oder Sporttieren oder Heimtieren, wie z.B. Schaf, Hunde, Pferde, Katzen, Rinder und dergleichen. Vorzugsweise ist das Säugetier hierin ein Mensch.
„Träger" umfassen bei Verwendung hierin pharmazeutisch annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren, die für die Zelle oder das Säugetier, die damit exponiert werden, bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch sind. Häufig ist der physiologisch annehmbare Träger eine wässrige pH-gepufferte Lösung. Beispiele physiologisch annehmbarer Träger umfassen Puffer, wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien, einschließlich Ascorbinsäure; niedermolekulare (weniger als ungefähr 10 Reste) Polypeptide; Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, wie z.B. Glucose, Mannose oder Dextrine; chelatierende Mittel, wie z.B. EDTA; Zuckeralkohole, wie z.B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie z.B. Natrium; und/oder nichtionische Tenside, wie z.B. Tween^TM, Polyethylenglykol (PEG) und PLURONICS^TM.
Der Ausdruck „Agonist" wird verwendet, um sich auf Peptid- und Nichtpeptid-Analoga der nativen PRO-Polypeptide (wobei sich natives PRO-Polypeptid auf Pro-PRO-Polypeptid, Prä-PRO-Polypeptid, Präpro-PRO-Polypeptid oder reifes PRO-Polypeptid bezieht) der vorliegenden Erfindung und auf Antikörper zu beziehen, die solche nativen PRO-Polypeptide spezifisch unter der Voraussetzung binden, dass sie zumindest eine biologische Aktivität eines nativen PRO-Polypeptids beibehalten. Vorzugsweise behalten die Agonisten der vorliegenden Erfindung die qualitativen Bindungserkennungseigenschaften und Rezeptoraktivierungseigenschaften des nativen PRO-Polypeptids bei.
Der Ausdruck „Antagonist" wird verwendet, um sich auf ein Molekül zu beziehen, das eine biologische Aktivität eines nativen PRO-Polypeptids der vorliegenden Erfindung hemmt, worin sich natives PRO-Polypeptid auf Pro-PRO-Polypeptid, Prä-PRO-Polypeptid, Präpro-PRO-Polypeptid oder reifes PRO-Polypeptid bezieht. Vorzugsweise hemmen die Antagonisten hierin die Bindung eines nativen PRO-Polypeptids der vorliegenden Erfindung an einen Bindungspartner. Ein PRO-Polypeptid-„Antagonist" ist ein Molekül, das eine PRO-Antagonist-Effektorfunktion verhindert oder diese stört (z.B. ein Molekül, das die Bindung und/oder Aktivierung eines PRO-Polypeptid-Rezeptors durch PRO-Polypeptid verhindert oder stört). Solche Moleküle können auf ih re Fähigkeit hin gescreent werden, die PRO-Polypeptid-Rezeptoraktivierung kompetitiv zu hemmen, indem beispielsweise die Bindung von nativem PRO-Polypeptid in Gegenwart oder Abwesenheit des Test-Antagonist-Moleküls gemessen wird. Ein Antagonist der vorliegenden Erfindung umfasst weiters ein Antisense-Polynucleotid gegen das PRO-Polypeptid-Gen, wobei das Antisenset-Polynucleotid die Transkription oder Translation des PRO-Polypeptid-Gens blockiert, wodurch seine Expression und biologische Aktivität gehemmt wird.
Unter „stringenten Bedingungen" wird (1) der Einsatz niedriger Ionenstärke und hoher Temperatur für das Waschen verstanden, beispielsweise 0,015 M Natriumchlorid/0,0015 M Natriumcitrat/0,1 % Natriumdodecylsulfat bei 50 °C, oder (2) der Einsatz eines Denaturierungsmittels, wie z.B. Formamid, während der Hybridisierung, beispielsweise 50 Vol.-% Formamid mit 0,1 % Rinderserumalbumin/0,1 % Ficoll/0,1 % Polyvinylpyrrolidon/50 nM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bei 42 °C. Ein weiteres Beispiel ist die Verwendung von 50 % Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6/8), 0,1 % Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt-Lösung, beschallte Lachsspermien-DNA (50 μg/ml), 0,1 % SDS und 10 % Dextransulfat bei 42 °C mit Waschungen bei 42 °C in 0,2 × SSC und 0,1 % SDS. Ein wiederum anderes Beispiel ist Hybridisierung unter Verwendung eines Puffers von 10 % Dextransulfat, 2 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat) und 50 % Formamid bei 55 °C, gefolgt von einem Waschvorgang hoher Stringenz bestehend aus EDTA enthaltendem 0,1 × SSC bei 55 °C.
„Mäßig stringente Bedingungen" werden in Sambrook et al., s.o., beschrieben und umfassen die Verwendung einer Waschlösung und von Hybridisierungsbedingungen (z.B. Temperatur, Ionenstärke und % SDS), die weniger stringent als die oben beschriebenen sind. Ein Beispiel mäßig stringenter Bedingungen ist eine Bedingung wie z.B. Inkubation über Nacht bei 37 °C in einer Lösung, die das Folgende enthält: 20 % Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10 % Dextransulfat und 20 mg/ml denatu rierte abgeschnittene Lachsspermien-DNA, gefolgt vom Waschen der Filter in 1 × SSC bei ungefähr 37–50 °C. Der geübte Fachmann wird erkennen, wie die Temperatur, Ionenstärke usw. wie benötigt einzustellen sind, um Faktoren, wie z.B. Sondenlänge und dergleichen, Rechnung zu tragen.
„Southern-Analyse" oder „Southern-Blotting" ist ein Verfahren, mit dem die Gegenwart von DNA-Sequenzen in einem Restriktionsendonucleaseverdau von DNA oder einer DNA enthaltenden Zusammensetzung durch Hybridisierung an ein bekanntes markiertes Oligonucleotid oder DNA-Fragment bestätigt wird. Die Southern-Analyse umfasst typischerweise die elektrophoretische Trennung von DNA-Verdauungen an Agarosegelen, Denaturierung der DNA nach elektrophoretischer Trennung und Transfer der DNA auf Nitrozellulose, Nylon oder einen anderen geeigneten Membranträger zur Analyse mit einer radiomarkierten, biotinylierten oder Enzymmarkierten Sonde, wie in Abschnitten 9.37–9.52 von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989), beschrieben wird.
„Northern-Analyse" oder „Northern-Blotting" ist ein Verfahren, das zur Identifizierung von RNA-Sequenzen verwendet wird, die an eine bekannte Sonde, wie z.B. an ein Oligonucleotid, DNA-Fragment, eine cDNA oder ein Fragment davon oder ein RNA-Fragment, hybridisieren. Die Sonde ist mit einem Radioisotop, wie z.B. ³²P, oder durch Biotinylierung oder mit einem Enzym markiert. Die zu analysierende RNA wird üblicherweise elektrophoretisch an einem Agarose- oder Polyacrylamidgel getrennt, auf Nitrozellulose, Nylon oder eine andere geeignete Membran übertragen und mit der Sonde unter Verwendung von Standardtechniken hybridisiert, die auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannt sind, wie z.B. jene, die in den Abschnitten 7.39–7.52 von Sambrook et al., s.o., beschrieben sind.
II. Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung
PRO-243-Polypeptide voller Länge
Die vorliegende Erfindung stellt neu identifizierte und isolierte Nucleotidsequenzen bereit, die für Polypeptide kodieren, die in der vorliegenden Anmeldung als PRO243 bezeichnet werden. Im Speziellen haben die Anmelder cDNA identifiziert und isoliert, die für ein PRO243-Polypeptid kodiert, wie in den unten stehenden Beispielen ausführlicher offenbart wird. Unter Verwendung von BLAST-, BLAST-2- und FastA-Sequenzangleichungscomputerprogrammen fanden die Anmelder, dass ein Nativsequenz-PRO243 voller Länge (dargestellt in 2 und Seq.-ID Nr. 2) 50 % Aminosäuresequenzidentität mit Chordin vom Afrikanischen Krallenfrosch und Xenopus und 77 % Homologie mit Ratten-Chordin aufweist. Demgemäß wird derzeit angenommen, dass PRO243, das in der vorliegenden Anmeldung offenbart ist, ein neu identifiziertes Mitglied der Chordinproteinfamilie ist und die Fähigkeit besitzen könnte, die Notochord- und Muskelbildung durch Dorsalisierung des Mesoderms zu beeinflussen.
PRO-Polypeptidvarianten
Zusätzlich zu den hierin beschriebenen Nativsequenz-PRO-Polypeptiden voller Länge ist vorgesehen, dass PRO-Polypeptidvarianten hergestellt werden können. PRO-Polypeptidvarianten können durch Einführen geeigneter Nucleotidänderungen in die PRO-Polypeptid-DNA oder durch Synthese des gewünschten PRO-Polypeptids herstellt werden. Fachkundige auf dem Gebiet der Erfindung werden anerkennen, dass Aminosäureänderungen posttranslationelle Prozesse der PRO-Polypeptide verändern könnten, wie z.B. die Änderung der Anzahl oder Position von Glykosylierungsstellen oder Verändern der Membranverankerungseigenschaften.
Variationen in den Nativsequenz-PRO-Polypeptiden voller Länge oder in verschiedenen Domänen der hierin beschriebenen PRO-Polypeptide können vorgenommen werden, indem beispielsweise irgendeine derjenigen Techniken und Richtlinien für konservative und nicht-konservative Mutationen verwendet wird, die beispielsweise im US-Patent Nr. 5.364.934 dargelegt sind. Variationen können eine Substitution, Deletion oder Insertion von einem oder mehreren Codons sein, die für das PRO-Polypeptid kodieren, was in einer Änderung der Aminosäuresequenz des PRO-Polypeptids im Vergleich zum Nativsequenz-PRO-Polypeptid resultiert. Gegebenenfalls erfolgt die Variation durch Substitution von zumindest einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure in einer oder mehreren Domänen des PRO-Polypeptids. Hinweise zur Feststellung, welcher Aminosäurerest insertiert, substituiert oder deletiert werden kann, ohne die gewünschte Aktivität zu beeinflussen, können gefunden werden, indem die Sequenz des PRO-Polypeptids mit jener von homologen bekannten Proteinmolekülen verglichen und die Anzahl vorgenommener Aminosäuresequenzänderungen in Regionen hoher Homologie minimiert wird. Aminosäuresubstitutionen können das Ergebnis des Ersetzens einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften sein, wie z.B. der Ersatz eines Leucins durch ein Serin, d.h. konservative Aminosäureersetzungen. Insertionen oder Deletionen können gegebenenfalls im Bereich von 1 bis 5 Aminosäuren liegen. Die erlaubte Variation kann ermittelt werden, indem systematisch Insertionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren oder der Sequenz vorgenommen und die resultierenden Varianten auf Aktivität im in den unten stehenden Beispielen beschriebenen In-vitro-Test getestet werden.
In bestimmten Ausführungsformen sind konservative Substitutionen von Interesse in Tabelle 1 unter dem Titel bevorzugter Substitutionen gezeigt. Falls solche Substitutionen in einer Änderung der biologischen Aktivität resultieren, dann können substanziellere Änderungen, die in Tabelle 1 als beispielhafte Substitutionen bezeichnet sind oder wie sie unten in Bezug auf Aminosäureklassen weitergehend beschrieben sind, eingeführt und die Produkte gescreent werden.
Tabelle 1
Substantielle Modifizierungen der Funktion oder immunologischen Identität des PRO-Polypeptids werden erzielt, indem Substitutionen gewählt werden, die sich in ihrer Wirkung auf die Erhaltung (a) der Struktur des Polypeptidgerüsts im Bereich der Substitution, beispielsweise als Faltblatt- oder Helixstruktur, (b) der Ladung oder Hydrophobizität des Moleküls an der Zielstelle oder (c) der Sperrigkeit der Seitenkette signifikant unterscheiden. Natürlich auftretende Reste werden auf Basis gemeinsamer Seitenketteneigenschaften in Gruppen unterteilt:

(1) hydrophob: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) neutral-hydrophil: Cys, Ser, Thr;
(3) sauer: Asp, Glu;
(4) basisch: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
(5) Reste, welche die Kettenausrichtung beeinflussen: Gly, Pro; und
(6) aromatisch: Trp, Tyr, Phe.

Nichtkonservative Substitutionen bedingen das Austauschen eines Mitglieds einer dieser Klassen durch eine andere Klasse. Derartige substituierte Reste können auch in die konservativen Substitutionsstellen oder bevorzugter in die verbleibenden (nicht konservierten) Stellen eingeführt werden.
Die Variationen können unter Anwendung von Verfahren gemacht werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie z.B. Oligonucleotid-vermittelte (ortsgerichtete) Mutagenese, Alanin-Scanning und PCR-Mutagenese. Ortsgerichtete Mutagenese (Carter et al., Nucl. Acids Res. 13, 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10, 6487 (1987)), Kassettenmutagenese (Wells et al., Gene 34, 315 (1985)), Restriktionsselektionsmutagenese (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317, 415 (1986)) oder andere bekannte Techniken können an der klonierten DNA durchgeführt werden, um die gewünschte PRO-Polypeptidvarianten-DNA herzustellen.
Scanning-Aminosäureanalyse kann außerdem eingesetzt werden, um ein oder mehrere Aminosäuren entlang der zusammenhängenden Sequenz zu identifizieren. Unter den bevorzugten Scanning-Aminosäuren sind relativ kleine, neutrale Aminosäuren. Solche Aminosäuren umfassen Alanin, Glycin, Serin und Cystein. Alanin ist typischerweise eine bevorzugte Scanning-Aminosäure unter dieser Gruppe, da sie die über den Beta-Kohlenstoff hinausgehende Seitenkette eliminiert und mit geringerer Wahrscheinlichkeit die Hauptkettenkonformation der Variante verändert. Alanin ist typischerweise ebenfalls bevorzugt, das es die am häufigsten vorkommende Aminosäure ist. Weiters findet sie sich häufig in verborgenen sowie exponierten Positionen (Creighton, The Proteins, W.H. Freeman & Co., N.Y.; Chothia, J. Mol. Biol. 150, 1 (1976)). Falls die Alanin-Substitution keine adäquaten Mengen der Variante liefert, kann eine isoterische Aminosäure verwendet werden.
Modifizierungen von PRO-Polypeptiden
Kovalente Modifizierungen von PRO-Polypeptiden sind im Schutzumfang der Erfindung enthalten. Ein Typ kovalenter Modifizierung umfasst das Umsetzen von Ziel-Aminosäureresten des PRO-Polypeptids mit einem organischen Derivatisierungsmittel, das zur Reaktion mit ausgewählten Seitenketten oder mit den N- oder C-terminalen Resten des PRO-Polypeptids fähig ist. Die Derivatisierung mit bifunktionellen Reagenzien ist beispielsweise zur Vernetzung eines PRO-Polypeptids mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder Oberfläche zur Verwendung im Verfahren zur Reinigung von Anti-PRO-Polypeptid-Antikörpern und umgekehrt zweckdienlich. Häufig verwendete Vernetzungsmittel umfassen beispielsweise 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, wie z.B. Ester der 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, einschließlich Disuccinimidylester wie z.B. 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), bifunktionelle Maleinimide, wie z.B. Bis-N-maleinimido-1,8-octan, und Reagenzien, wie z.B. Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat.
Andere Modifizierungen umfassen die Desamidierung von Glutaminyl- und Asparaginylresten zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten, die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxygruppen von Seryl- oder Threonylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidinseitenketten [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79–86 (1983)), Acetylierung des N-terminalen Amins und Amidierung jeglicher C-terminalen Carboxygruppe.
Ein weiterer Typ kovalenter Modifizierung der PRO-Polypeptide, der im Schutzumfang der Erfindung enthalten ist, umfasst die Veränderung des nativen Glykosylierungsmusters des Polypeptids. Unter „Verändern des nativen Glykosylierungsmus ters" wird für die Zwecke hierin das Deletieren von einem oder mehreren Kohlenhydratgruppierungen in einem Nativsequenz-PRO-Polypeptid und/oder das Addieren von einer oder mehreren, im Nativsequenz-PRO-Polypeptid nicht vorhandenen Glykosylierungsstellen und/oder die Veränderung des Verhältnisses und/oder der Zusammensetzung der an die Glykosylierungsstelle(n) gebundenen Zuckerreste verstanden.
Die Addition von Glykosylierungsstellen an das PRO-Polypeptid kann durch Ändern der Aminosäuresequenz erzielt werden. Die Änderung kann beispielsweise durch Addition von oder Substitution durch einen oder mehrere Serin- oder Threoninreste am Nativsequenz-PRO-Polypeptid vorgenommen werden (für O-glykosylierte Stellen). Die PRO-Polypeptid-Aminosäuresequenz kann gegebenenfalls durch Änderungen auf DNA-Ebene verändert werden, insbesondere durch Mutieren der für das PRO-Polypeptid kodierenden DNA an vorgewählten Basen, so dass Codons erzeugt werden, die in die gewünschten Aminosäuren translatiert werden.
Ein weiteres Mittel zur Erhöhung der Anzahl von Kohlenhydratgruppierungen am PRO-Polypeptid ist die chemische oder enzymatische Kopplung von Glykosiden an das Polypeptid. Solche Verfahren werden auf dem Gebiet der Erfindung beschrieben, z.B. in WO 87/05330, veröffentlicht am 11. September 1987, und in Aplin und Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., S. 259–306 (1981).
Die Entfernung von am PRO-Polypeptid vorhandenen Kohlenhydratgruppierungen kann chemisch oder enzymatisch erzielt werden oder durch Mutationssubstitution von Codons, die für Aminosäurereste kodieren, die als Glykosylierungsziele dienen. Chemische Deglykosylierungstechniken sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden beispielsweise von Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987), und von Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981), beschrieben. Die enzymatische Spaltung von Kohlenhydratgruppierungen an Polypeptiden kann durch Verwendung einer Vielzahl von Endo- und Exo-Glykosidasen wie von Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138, 350 (1987), beschrieben, erzielt werden.
Ein weiterer Typ kovalenter Modifizierung von PRO-Polypeptiden der Erfindung umfasst die Bindung des PRO-Polypeptids an eines einer Vielzahl von nicht-proteinartigen Polymeren, z.B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylenen auf eine Weise, die in den US-Patenten Nr. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 oder 4.179.337 dargelegt ist.
Die PRO-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch auf eine Weise modifiziert werden, die ein chimäres Molekül liefert, das ein PRO-Polypeptid umfasst, das an ein(e) weitere(s), heterologe(s) Polypeptid oder Aminosäuresequenz fusioniert ist. In einer Ausführungsform umfasst ein derartiges chimäres Molekül eine Fusion des PRO-Polypeptids mit einem Markerpolypeptid, das ein Epitop bereitstellt, an das ein Anti-Marker-Antikörper selektiv binden kann. Die Epitopmarkierung wird im Allgemeinen am Amino- oder Carboxyterminus des PRO-Polypeptids platziert. Die Gegenwart derartiger epitopmarkierter Formen des PRO-Polypeptids kann unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Markerpolypeptid detektiert werden. Außerdem ermöglicht die Bereitstellung der Epitopmarkierung die einfache Reinigung des PRO-Polypeptids mittels Affinitätsreinigung unter Verwendung eines Anti-Marker-Antikörpers oder einer anderen Art von Affinitätsmatrix, die an den Epitopmarker bindet. In einer alternativen Ausführungsform kann das chimäre Molekül eine Fusion des PRO-Polypeptids mit einem Immunglobulin oder einer bestimmten Region eines Immunglobulins umfassen. Bei einer zweiwertigen Form des chimären Moleküls könnte solch eine Fusion an der Fc-Region eines IgG-Moleküls stattfinden.
Verschiedene Markierungspolypeptide und ihre entsprechenden Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannt. Beispiele umfassen Polyhistidin- (poly-his-) oder Poly-Histidin-Glycin- (poly-his-gly-) Marker; das flu-HA-Markerpolypeptid und seinen Antikörper 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159–2165 (1988)); den c-myc-Marker und die 8F9-, 3C7-, 6E10-, B7- und 9E10-Antikörper dagegen (Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5, 3610-3616 (1985)); und den Herpex-simplex-Virus-Glycoprotein-D- (gD-) Marker und seinen Antikörper (Paborsky et al., Protein Engineering 3(6), 547–553 (1990)). Andere Markerpolypeptide umfassen das Flag-Peptid (Hopp et al., BioTechnology 6, 1204-1210 (1988)); das KT3-Epitop-Peptid (Martin et al., Science 255, 192–194 (1993)); ein α-Tubulin-Epitop-Peptid (Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163–15166 (1991)); und den T7-Gen-10-Protein-Peptidmarker (Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6393-6397 (1990)).
Herstellung von PRO-Polypeptiden
Die unten stehende Beschreibung betrifft in erster Linie die Produktion von PRO-Polypeptiden durch Kultivieren von Zellen, die mit einem die gewünschte PRO-Polypeptidnucleinsäure enthaltenden Vektor transformiert oder transfiziert sind. Es ist selbstverständlich vorgesehen, dass alternative Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, eingesetzt werden können, um das PRO-Polypeptid herzustellen. Beispielsweise können die PRO-Polypeptidsequenz oder Abschnitte davon mittels direkter Peptidsynthese unter Verwendung von Festphasentechniken hergestellt werden (siehe z.B. Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149–2154 (1963)). Die In-vitro-Proteinsynthese kann unter Verwendung manueller oder automatisierter Techniken durchgeführt werden. Automatisierte Synthese kann beispielsweise unter Verwendung eines Applied-Biosynthesis-Peptid-Synthesizers (Foster System, CA) nach den Anleitungen des Herstellers erzielt werden. Verschiedene Abschnitte des gewünschten PRO-Polypeptids können gesondert chemisch synthetisiert und unter Verwendung chemischer oder enzymatischer Verfahren kombiniert werden, um das PRO-Polypeptid voller Länge herzustellen.
A. Isolierung von für PRO-Polypeptide kodierender DNA
Für PRO-Polypeptide kodierende DNA kann aus einer cDNA-Bibliothek erhalten werden, die aus Gewebe hergestellt wurde, von dem angenommen wird, dass es die gewünschte PRO-Polypeptid-mRNA besitzt, und um diese in einem nachweisbaren Ausmaß zu exprimieren. Demgemäß kann menschliche PRO-Polypeptid-DNA be quem aus einer aus menschlichem Gewebe erhaltenen cDNA-Bibliothek erhalten werden, wie beispielsweise in den Beispielen beschrieben wird. Das für PRO-Polypeptid kodierende Gen kann auch aus einer genomischen Bibliothek oder mittels Oligonucleotidsynthese erhalten werden.
Bibliotheken können mit Sonden (wie z.B. Antikörpern gegen das gewünschte PRO-Polypeptid oder Oligonucleotide mit zumindest ungefähr 20–80 Basenpaaren) gescreent werden, die konstruiert sind, um das Gen von Interesse oder von ihm kodiertes Protein zu identifizieren. Das Screening der cDNA- oder genomischen Bibliothek mit der gewählten Sonde kann unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt werden, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989), beschrieben sind. Ein alternatives Mittel zur Isolierung des für das gewünschte PRO-Polypeptid kodierenden Gens ist die Verwendung des PCR-Verfahrens (Sambrook et al., s.o.; Dieffenbach et al., PCR-Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1995)).
Die unten stehenden Beispiele beschreiben Techniken zum Screening einer cDNA-Bibliothek. Die als Sonden gewählten Oligonucleotidsequenzen sollten ausreichend lang und ausreichend eindeutig sein, so dass falsche positive Ergebnisse minimiert werden. Das Oligonucleotid wird vorzugsweise markiert, so dass es bei Hybridisierung an DNA in der gescreenten Bibliothek detektiert werden kann. Markierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannt und umfassen die Verwendung von radioaktiven Markern, wie z.B. ³²P-markiertes ATP, Biotinylierung und Enzymmarkierung. Hybridisierungsbedingungen, einschließlich mäßiger und hoher Stringenz, werden in Sambrook et al., s.o., bereitgestellt.
In solchen Bibliothek-Screeningverfahren identifizierte Sequenzen können mit anderen bekannten Sequenzen, die in öffentlichen Datenbanken, wie z.B. GenBank, oder in privaten Sequenzdatenbanken hinterlegt und verfügbar sind, verglichen und an diese angeglichen werden. Sequenzidentität (entweder auf Aminosäure- oder auf Nucleotid-Ebene) in definierten Regionen des Moleküls oder über die Sequenz voller Länge hinweg kann durch Sequenzangleichung unter Verwendung von Computersoftwareprogrammen, wie z.B. BLAST, ALIGN, DNAstar und INHERIT, ermittelt werden, die verschiedene Algorithmen einsetzen, um Homologie zu messen.
Nucleinsäure, die eine für Protein kodierende Sequenz aufweist, kann durch Screening ausgewählter cDNA- oder genomischer Bibliotheken unter Verwendung der hierin erstmals offenbarten, abgeleiteten Aminosäuresequenz und, falls erforderlich, unter Verwendung herkömmlicher Primerextensionsverfahren, wie sie in Sambrook et al., s.o., beschrieben werden, um Vorläufer und Prozessierungszwischenprodukte der mRNA zu detektieren, die möglicherweise nicht rückwärts in cDNA transkribiert worden ist, erhalten werden.
B. Wahl und Transformation von Wirtszellen
Wirtszellen werden mit hierin zur PRO-Polypeptid-Produktion beschriebenen Expressions- oder Klonierungsvektoren transfiziert oder transformiert und in herkömmlichen Nährmedien kultiviert, die in geeigneter Weise zur Induktion von Promotoren, Selektion von Transformanten oder Amplifikation der für die gewünschten Sequenzen kodierenden Gene modifiziert worden sind. Die Kultivierungsbedingungen, wie z.B. Medium, Temperatur, pH und dergleichen, können vom geübten Fachmann ohne übermäßiges Experimentieren gewählt werden. Im Allgemeinen finden sich Prinzipien, Protokolle und praktische Techniken zur Maximierung der Produktivität von Zellkulturen in Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler (Hrsg.), IRL Press (1991), und in Sambrook et al., s.o.
Verfahren der Transfektion sind dem gewöhnlich Fachkundigen bekannt, beispielsweise CaPO₄ und Elektroporation. In Abhängigkeit von der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt, die für diese Zellen geeignet sind. Die Calciumbehandlung unter Einsatz von Calciumchlorid, wie sie in Sambrook et al., s.o., beschrieben wird, oder Elektroporation wird im Allgemeinen für Prokaryoten oder andere Zellen verwendet, die wesentliche Zellwandbarrieren aufweisen. Die Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transformation gewisser Pflanzenzellen verwendet, wie sie in Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und WO 89/05859, veröffentlicht am 29. Juni 1989, beschrieben wird. Für Säugetierzellen ohne derartige Zellwände kann das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren von Graham und van der Eb, Virology 52, 456–457 (1978), eingesetzt werden. Allgemeine Aspekte von Säugetierwirtszellsystem-Transformationen sind im US-Patent Nr. 4.399.216 beschrieben worden. Transformationen in Hefe werden typischerweise nach dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3829 (1979), durchgeführt. Jedoch können andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen, wie z.B. durch Kern-Mikroinjektion, Elektroporation, Bakterienprotoplastenfusion mit intakten Zellen oder Polykationen, z.B. Polybren, Polyornithin, ebenfalls verwendet werden. Zu den verschiedenen Techniken zum Transformieren von Säugetierzellen siehe Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527–537 (1990), und Mansour et al., Nature 336, 348–352 (1988).
Geeignete Wirtszellen zur Klonierung oder Expression von DNA in den Vektoren hierin umfassen Prokaryoten, Hefe oder höhere eukaryotische Zellen. Geeignete Prokaryoten umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Eubakterien, wie z.B. Gram-positive oder Gram-negative Organismen, beispielsweise Enterobacteriaceae, wie z.B. E. coli. Verschiedene E.-coli-Stämme sind öffentlich erhältlich, wie z.B. E.-coli-K12-Stamm MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); E.-coli-Stamm W3110 (ATC 27.325) und K5 722 (ATCC 53.635). Andere geeignete prokaryotische Wirtszellen umfassen Enterobacteriaceae, wie z.B. Escherichia, z.B. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, z.B. Salmonella typhimurium, Serratia, z.B. Serratia marcescans, und Shigella, sowie Bacilli, wie z.B. B. subtilis und B. licheniformis (z.B. B. licheniformis 41P, offenbart in DD 266.710 , veröffentlicht am 12. April 1989), Pseudomonas, wie z.B. P. aeruginosa, und Streptomyces. Verschiedene E.-coli-Stämme sind öffentlich erhältlich, wie z.B. E.-coli-K12-Stamm MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); E.-coli-Stamm W3110 (ATCC 27.325); und K5 772 (ATCC 53.635). Diese Beispiele sind illustrativ und nicht einschränkend. Stamm W3110 ist ein besonders bevorzugter Wirt oder Elternwirt, da er ein häufiger Wirtsstamm für rekombinante DNA-Produktfermentationen ist. Vorzugsweise sekretiert die Wirtszelle minimale Mengen an proteolytischen Enzymen. Beispielsweise kann Stamm W3110 modifiziert werden, um eine genetische Mutation in den Genen zu bewirken, die für Proteine kodieren, die dem Wirt fremd sind, wobei Beispiele solcher Wirte die folgenden umfassen: E. coli W3110, Stamm 1A2, der den vollständigen Genotyp tonA aufweist; E. coli W3110, Stamm 9E4, der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 aufweist; E. coli W3110, Stamm 27C7 (ATCC 55.244), der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan^r aufweist; E. coli W3110, Stamm 37D6, der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan^r aufweist; E. coli W3110, Stamm 40B4, bei dem es sich um Stamm 37D6 mit einer Nicht-Kanamycinresistenten depP-Deletionsmutation handelt; und ein E.-coli-Stamm mit einer mutierten periplasmatischen Protease, offenbart im US-Patent Nr. 4.946.783, erteilt am 7. August 1990. Alternativ dazu sind In-vitro-Klonierungsverfahren, z.B. PCR- oder andere Nucleinsäurepolymerasereaktionen, geeignet.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroorganismen, wie z.B. Fadenpilze oder Hefe, geeignete Klonierungs- oder Expressionswirte für für PRO-Polypeptid-kodierende Vektoren. Saccharomyces cerevisiae ist ein häufig verwendeter niederer eukaryotischer Wirtsorganismus. Andere umfassen Schizosaccharomyces pombe (Beach und Nurse, Nature 290, 140 (1981); EP 139.383 , veröffentlicht am 2. Mai 1985); Kluyveromyces-Wirte (US-Patent Nr. 4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology 9, 968–975 (1991)), wie z.B. K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 737 (1983)); K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology 8, 135 (1990)), K. thermotolerans und K. marxianus; Yarrowia ( EP 402.226 ); Pichia pastoris ( EP 1833070 ; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265–278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia ( EP 244.234 ); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259–5263 (1979)); Schwanniomyces, wie z.B. Schwanniomyces occidentalis ( EP 394.538 , veröffentlicht am 31. Oktober 1990); und Fadenpilze, wie z.B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, veröffentlicht am 10. Jänner 1991) und Aspergillus-Wirte, wie z.B. A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284–289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205–221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470–1474 (1984)) und A. niger (Kelly und Hynes, EMBO J. 4, 475–479 (1985)). Methylotrophe Hefen sind hierin geeignet und umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Hefen, die zum Wachstum auf Methanol fähig sind, ausgewählt aus den Gattungen Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis und Rhodotorula. Eine Liste spezieller Spezies, die für diese Klasse von Hefen beispielgebend ist, findet sich in C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs 269 (1982).
Geeignete Wirtszellen zur Expression glykosylierter PRO-Polypeptide stammen von mehrzelligen Organismen. Beispiele von Invertebratenzellen umfassen Insektenzellen, wie z.B. Drosophila S2 und Spodoptera Sf9, sowie Pflanzenzellen. Beispiele zweckdienlicher Säugetierwirtszelllinien umfassen Chinahamster-Eierstock- (CHO-) und COS-Zellen. Speziellere Beispiele umfassen Affennieren-CV1-Linie, transformiert durch SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche Urnierenlinie (293 oder 293-Zellen, subkloniert zum Wachstum in Suspensionskultur, Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); und Maus-Mammatumor (MMT 060562, ATCC CCL 51). Die Wahl der geeigneten Wirtszelle wird als innerhalb der Fachkenntnis auf dem Gebiet der Erfindung befindlich erachtet.
C. Wahl und Verwendung eines replizierbaren Vektors
Die für ein gewünschtes PRO-Polypeptid kodierende Nucleinsäure (z.B. cDNA oder genomische DNA) kann in einen replizierbaren Vektor zur Klonierung (Amplifikation der DNA) oder Expression insertiert werden. Es sind verschiedene Vektoren öffentlich erhältlich. Der Vektor kann beispielsweise in Form eines Plasmids, Cosmids, Virusteilchens oder Phagen vorliegen. Die geeignete Nucleinsäuresequenz kann durch eine Vielzahl von Verfahren in den Vektor insertiert werden. Im Allgemeinen wird DNA unter Verwendung von Techniken, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, in (eine) geeignete Restriktionsendonucleasestelle(n) insertiert. Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, eine oder mehrere Signalsequenzen, einen Replikationsstartpunkt, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancerelement, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz. Die Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere dieser Komponenten enthalten, setzt Standardligationstechniken ein, die dem geübten Fachmann bekannt sind.
Das PRO-Polypeptid von Interesse kann rekombinant nicht nur direkt produziert werden, sondern auch als ein Fusionspolypeptid mit einem heterologen Polypeptid, das eine Signalsequenz oder ein anderes Polypeptid sein kann, das eine spezifische Spaltstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids aufweist. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein oder kann ein Abschnitt der PRO-Polypeptid-DNA sein, die in den Vektor insertiert wird. Die Signalsequenz kann eine prokaryotische Signalsequenz sein, die beispielsweise aus der Gruppe der Alkalischen-Phosphatase-, Penicillinase-, Ipp- oder hitzestabilen Enterotoxin-II-Leader gewählt ist. Für die Hefesekretion kann die Signalsequenz z.B. der Hefeinvertase-Leader, Alpha-Faktor-Leader (einschließlich Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktor-Leader, wobei der letztere im US-Patent Nr. 5.010.182 beschrieben ist) oder Saure-Phosphatase-Leader, der C.-albicans-Glucoamylase-Leader ( EP 362.179 , veröffentlicht am 4. April 1990) oder das in WO 90/13646, veröffentlicht am 15. November 1990, beschriebene Signal sein. Bei der Säugetierzellexpression können Säugetier-Signalsequenzen verwendet werden, um die Sekretion des Proteins zu steuern, wie z.B. Signalsequenzen aus sekretierten Polypeptiden derselben oder einer verwandten Spezies, sowie virale Sekretionsleader.
Sowohl Expressions- als auch Klonierungsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, in einer oder mehreren gewählten Wirtszellen zu replizieren. Solche Sequenzen sind für eine Vielzahl von Bakterien, Hefen und Viren bekannt. Der Replikationsstartpunkt aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten Gram-negativen Bakterien geeignet, der 2μ-Plasmid-Startpunkt ist für Hefe geeignet, und verschiedene Virus-Startpunkte (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für Klonierungsvektoren in Säugetierzellen zweckdienlich.
Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten typischerweise ein Selektionsgen, das auch selektierbarer Marker genannt wird. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegen Antibiotika oder andere Toxine, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, verleihen, (b) auxotrophe Defizienzen komplementieren oder (c) kritische Nährstoffe bereitstellen, die aus komplexen Medien nicht verfügbar sind, z.B. das für D-Alanin-Racemase kodierende Gen für Bacilli.
Ein Beispiel für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind jene, welche die Identifizierung von Zellen ermöglichen, die zur Aufnahme der PRO-Polypeptidnucleinsäure kompetent sind, z.B. DHFR oder Thymidinkinase. Eine geeignete Wirtszelle bei Einsatz von DHFR der Wildform ist die hinsichtlich DHFR-Aktivität defiziente CHO-Zelllinie, die wie von Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), beschrieben hergestellt und vermehrt wird. Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das im Hefeplasmid YRp7 vorhandene trp1-Gen (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)). Das trp1-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm bereit, dem die Fähigkeit zum Wachstum auf Tryptophan fehlt, beispielsweise ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics 85, 12 (1977)).
Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der operabel an die PRO-Polypeptidnucleinsäuresequenz gebunden ist, um die mRNA-Synthese zu steuern. Von einer Vielzahl möglicher Wirtszellen erkannte Promotoren sind wohl bekannt. Zur Verwendung in prokaryotischen Wirten geeignete Promotoren umfassen die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)), Alkalische Phosphatase, ein Tryptophan- (trp-) Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP 36.776 ) und Hybridpromotoren, wie z.B. den tac-Promotor (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 (1983)). Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten außerdem eine Shine-Dalgarno-(S.D.-) Sequenz, die operabel an die DNA gebunden ist, die für das gewünschte PRO-Polypeptid kodiert.
Beispiele geeigneter Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phopshoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)), wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phopshatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phopshoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil der durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription sind, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, Saure Phosphatase, mit dem Stickstoffstoffwechsel verbundenen Abbauenzyme, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefeexpression werden in EP 73.657 ausführlicher beschrieben.
Die PRO-Polypeptid-Transkription aus Vektoren wird in Säugetierzellen beispielsweise durch Promotoren kontrolliert, die aus den Genomen von Viren, wie z.B. Polyomavirus, Geflügelpockenvirus ( UK 2.211.504 , veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie z.B. Adenovirus 2), Rinder-Papillomavirus, Vogel-Sarkomvirus, Cytomegalie-Virus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und Simian-Virus 40 (SV40), aus heterologen Säugetier-Promotoren wie z.B. dem Actin-Promotor oder einem Im munglobulin-Promotor und aus Hitzeschock-Promotoren unter der Voraussetzung erhalten werden, dass derartige Promotoren mit den Wirtszellsystemen kompatibel sind.
Die Transkription einer für das gewünschte PRO-Polypeptid kodierenden DNA durch höhere Eukaryoten kann durch Insertion einer Enhancersequenz in den Vektor erhöht werden. Enhancer sind cis-wirkende DNA-Elemente, die üblicherweise ungefähr 10 bis 300 bp aufweisen und an einem Promotor wirken, um seine Transkription zu erhöhen. Viele Enhancersequenzen sind nun aus Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise wird man jedoch einen Enhancer aus einem eukaryotischen Zellvirus verwenden. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer an der späten Seite des Replikationsstartpunkts (bp 100–270), den frühen Cytomegalie-Virus-Promotor-Enhancer, den Polyoma-Enhancer an der späten Seite des Replikationsstartpunkts und Adenovirus-Enhancer. Der Enhancer kann an einer Position 5' oder 3' der für das PRO-Polypeptid kodierenden Sequenz in den Vektor gespleißt werden, befindet sich jedoch vorzugsweise an einer Stelle 5' des Promotors.
In eukaryotischen Wirtszellen (Hefe, Pilze, Insekt, Pflanze, Tier, Mensch oder kernhaltige Zellen aus anderen mehrzelligen Organismen) verwendete Expressionsvektoren werden weiters Sequenzen enthalten, die zur Termination der Transkription und zur Stabilisierung der mRNA notwendig sind. Solche Sequenzen sind üblicherweise von den 5'- und gelegentlich von den 3'-untranslatierten Regionen eukaryotischer oder viraler DNAs oder cDNAs erhältlich. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente im untranslatierten Abschnitt der für PRO-Polypeptide kodierenden mRNA transkribiert werden.
Weitere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Adaptierung an die Synthese von PRO-Polypeptiden in rekombinanter Vertebratenzellkultur geeignet sind, werden in Gething et al., Nature 293, 620–625 (1981); Mantei et al., Nature 281, 40–46 (1979); EP 117.060 und EP 117.058 beschrieben.
D. Detektieren der Genamplifikation/expression
Genamplifikation und/oder -expression kann in einer Probe direkt gemessen werden, beispielsweise durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting zur Quantifizierung der Transkription von mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201–5202 (1980)), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer geeignet markierten Sonde auf Basis der hierin bereitgestellten Sequenzen. Alternativ dazu können Antikörper eingesetzt werden, die spezifische Duplexe, einschließlich DNA-Duplexe, RNA-Duplexe und DNA-RNA-Hybridduplexe oder DNA-Protein-Duplexe, erkennen können. Die Antikörper können ihrerseits markiert sein, und der Test kann durchgeführt werden, wo der Duplex an eine Oberfläche gebunden ist, so dass bei der Bildung des Duplex an der Oberfläche die Gegenwart des an den Duplex gebundenen Antikörpers detektiert werden kann.
Genexpression kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren gemessen werden, wie z.B. durch immunhistochemische Färbung von Zellen oder Gewebeschnitten und Testen von Zellkultur und Körperflüssigkeiten, um die Expression des Genprodukts direkt zu quantifizieren. Für die immunhistochemische Färbung und/oder für den Test von Probenflüssigkeiten geeignete Antikörper können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in einem beliebigen Tier hergestellt werden. Zweckdienlicherweise können die Antikörper gegen ein Nativsequenz-PRO-Polypeptid oder gegen ein synthetisches Peptid auf Basis der hierin bereitgestellten DNA-Sequenzen oder gegen eine exogene Sequenz hergestellt werden, die an eine PRO-Polypeptid-DNA fusioniert ist und für ein spezifisches Antikörperepitop kodiert.
E. Reinigung des Polypeptids
Formen von PRO-Polypeptiden können aus Kulturmedium oder aus Wirtszelllysaten gewonnen werden. Falls es membrangebunden ist, kann es unter Verwendung einer geeigneten Tensidlösung (z.B. Triton-X 100) oder durch enzymatische Spaltung von der Membran freigesetzt werden. Bei der Expression von PRO-Polypeptiden eingesetzte Zellen können durch verschiedene physikalische oder chemische Mittel, wie z.B. Einfrier-Auftau-Zyklen, Beschallung, mechanisches Aufbrechen oder Zelllysemittel, aufgebrochen werden.
Es kann wünschenswert sein, PRO-Polypeptide von rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu reinigen. Die folgenden Verfahren sind beispielgebend für geeignete Reinigungsverfahren: durch Fraktionierung an einer Ionentauschersäule; Ethanolpräzipitation; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie an Silica oder an einem Kationentauscherharz, wie z.B. DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatpräzipitation; Gelfiltration, beispielsweise unter Verwendung von Sephadex G-75; Protein-A-Sepharose-Säulen, um Verunreinigungen, wie z.B. IgG, zu entfernen; und metallchelatierende Säulen, um Epitop-markierte Formen des PRO-Polypeptids zu binden. Verschiedene Verfahren der Proteinreinigung können eingesetzt werden, und derartige Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und beispielsweise in Deutscher, Methods in Enzymology 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982), beschrieben. Der/die ausgewählte(n) Reinigungsschritt(e) hängt/hängen beispielsweise von der Art des verwendeten Produktionsprozesses und des speziellen produzierten PRO-Polypeptids ab.
Verwendungen für PRO-Polypeptide
Nucleotidsequenzen (oder ihr Komplement), die für die PRO-Polypeptide der vorliegenden Erfindung kodieren, bieten verschiedene Anwendungen auf dem Gebiet der Molekularbiologie, einschließlich Verwendungen als Hybridisierungssonden, bei der Chromosomen- und Genkartierung und bei der Erzeugung von Antisense-RNA und – DNA. Für PRO-Polypeptide kodierende Nucleinsäure ist auch zur Herstellung von PRO-Polypeptiden durch hierin beschriebene Rekombinationstechniken zweckdienlich.
Die für Nativsequenz-PRO-Polypeptid voller Länge kodierende Nucleinsäure oder Abschnitte davon können als Hybridisierungssonden für eine cDNA-Bibliothek verwendet werden, um das PRO-Polypeptid-Gen voller Länge zu isolieren oder um weitere Gene zu isolieren (beispielsweise jene, die für natürlich auftretende Varianten des PRO-Polypeptids oder für PRO-Polypeptide aus einer anderen Spezies kodieren), die eine gewünschte Sequenzidentität mit PRO-Polypeptid-Nucleinsäuresequenzen aufweisen. Gegebenenfalls wird die Länge der Sonden ungefähr 20 bis ungefähr 50 Basen betragen. Die Hybridisierungssonden können von der Nucleotidsequenz beliebiger hierin offenbarter DNA-Moleküle oder von genomischen Sequenzen hergeleitet sein, einschließlich von Promotoren, Enhancer-Elementen und Introns der für Nativsequenz-PRO-Polypeptid kodierenden DNA. Beispielhaft wird ein Screeningverfahren das Isolieren der kodierenden Region des PRO-Polypeptid-Gens unter Verwendung der bekannten DNA-Sequenz umfassen, um eine gewählte Sonde von ungefähr 40 Basen zu synthetisieren. Hybridisierungssonden können mit einer Vielzahl von Markern markiert werden, einschließlich Radionucleotiden, wie z.B. ³²P oder oder enzymatischen Markern, wie z.B. Alkalische Phosphatase, die über Avidin/Biotin-Kopplungssysteme an die Sonde gekoppelt ist. Markierte Sonden mit einer Sequenz, die zu jener des spezifischen PRO-Polypeptid-Gens der vorliegenden Erfindung komplementär ist, können verwendet werden, um Bibliotheken menschlicher cDNA, genomischer DNA oder mRNA zu screenen, um zu ermitteln, an welche Elemente derartiger Bibliotheken die Sonde hybridisiert. Hybridisierungstechniken werden in den unten stehenden Beispielen ausführlicher beschrieben.
Die in der vorliegenden Anmeldung offenbarten ESTs können auf ähnliche Weise als Sonden eingesetzt werden, wobei die hierin offenbarten Verfahren verwendet werden.
Die Sonden können auch in PCR-Techniken eingesetzt werden, um einen Pool von Sequenzen zur Identifizierung nahe verwandter PRO-Polypeptidsequenzen zu erzeugen.
Für ein PRO-Polypeptid kodierende Nucleotidsequenzen können auch verwendet werden, um Hybridisierungssonden zur Kartierung des Gens zu konstruieren, das für dieses PRO-Polypeptid kodiert, und zur genetischen Analyse von Individuen mit genetischen Störungen verwendet werden. Die hierin bereitgestellten Nucleotidsequenzen können an ein Chromosom und an spezifische Regionen eines Chromosoms auf der Karte dargestellt werden, und zwar unter Verwendung bekannter Techniken, wie z.B. In-situ-Hybridisierung, Bindungsanalyse gegen bekannte chromosomale Marker und Hybridisierungsscreening mit Bibliotheken.
Wenn die kodierende Sequenz für das PRO-Polypeptid für ein Protein kodiert, das an ein anderes Protein bindet, kann das PRO-Polypeptid in Tests verwendet werden, um seine Liganden zu identifizieren. Auf ähnliche Weise können Inhibitoren der Rezeptor/Liganden-Bindungswechselwirkung identifiziert werden. An solchen Bindungswechselwirkungen beteiligte Proteine können außerdem verwendet werden, um auf Peptide oder kleine Molekülinhibitoren oder Agonisten der Bindungswechselwirkung zu screenen. Screeningtests können so ausgelegt sein, um die Führungsverbindungen zu finden, die die biologische Aktivität eines nativen PRO-Polypeptids oder eines Liganden für das PRO-Polypeptid nachahmen. Solche Screeningtests umfassen Tests, die für High-throughput-Screening chemischer Bibliotheken zugänglich sind, was diese besonders zweckdienlich zur Identifizierung kleiner Kandidat-Arzneimittelmoleküle macht. Vorgesehene kleine Moleküle umfassen synthetische organische oder anorganische Verbindungen. Die Tests können in einer Vielzahl von Formaten durchgeführt werden, einschließlich Protein-Protein-Bindungstests, biochemischer Screeningtests, Immuntests und auf Zellen basierender Tests, die auf dem Gebiet der Erfindung alle gut charakterisiert sind.
Nucleinsäuren, die für ein PRO-Polypeptid oder seine modifizierten Formen kodieren, können ebenfalls verwendet werden, um entweder transgene Tiere oder „Knock-out"-Tiere zu erzeugen, die ihrerseits bei Entwicklung und Screening therapeutisch zweckdienlicher Reagenzien zweckdienlich sind. Ein transgenes Tier (z.B. eine Maus oder Ratte) ist ein Tier, das Zellen aufweist, die ein Transgen enthalten, wobei das Transgen in einem vorgeburtlichen, z.B. in einem embryonalen Stadium, in das Tier oder in einen Vorfahren des Tiers eingeführt worden ist. Ein Transgen ist eine DNA, die in das Genom einer Zelle integriert ist, aus der sich ein transgenes Tier entwickelt. In einer Ausführungsform kann für ein PRO-Polypeptid von Interesse kodierende cDNA verwendet werden, um für das PRO-Polypeptid kodierende genomische DNA nach etablierten Techniken zu klonieren, und die genomischen Sequenzen können verwendet werden, um transgene Tiere zu erzeugen, die Zellen enthalten, die für das PRO-Polypeptid kodierende DNA exprimieren. Verfahren zur Erzeugung transgener Tiere, insbesondere von Tieren wie z.B. Mäusen oder Ratten, sind auf dem Gebiet der Erfindung zur Routine geworden und werden beispielsweise in den US-Patenten Nr. 4.736.866 und 4.870.009 beschrieben. Typischerweise wird für die PRO-Polypeptid-Transgeninkorporation mit gewebespezifischen Enhancern auf bestimmte Zellen abgezielt. Transgene Tiere, die eine Kopie eines für ein PRO-Polypeptid kodierenden Transgens umfassen, die in die Keimbahn des Tieres in einem embryonalen Stadium eingeführt wurde, können verwendet werden, um die Wirkung erhöhter Expression von für das PRO-Polypeptid kodierender DNA zu untersuchen. Solche Tiere können als Testtiere für Reagenzien verwendet werden, von denen angenommen wird, dass sie beispielsweise Schutz vor pathologischen Konditionen verleihen, die mit ihrer Überexpression verbunden sind. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung wird ein Tier mit dem Reagens behandelt, und ein vermindertes Auftreten der pathologischen Kondition im Vergleich zu unbehandelten, das Transgen tragenden Tieren würde eine mögliche therapeutische Intervention für das pathologische Leiden anzeigen.
Alternativ dazu können nichtmenschliche Homologe von PRO-Polypeptiden verwendet werden, um ein PRO-Polypeptid-„Knock-out"-Tier zu konstruieren, das ein defektes oder verändertes, für das PRO-Polypeptid von Interesse kodierendes Gen als Ergebnis homologer Rekombination zwischen dem endogenen, für das PRO-Polypeptid kodierenden Gen und der in eine embryonale Zelle des Tiers eingeführten, veränderten, für das PRO-Polypeptid kodierenden genomischen DNA aufweist. Beispielsweise kann für ein PRO-Polypeptid kodierende cDNA verwendet werden, um für das PRO-Polypeptid kodierende genomische DNA nach etablierten Techniken zu klonieren. Ein Abschnitt der für ein PRO-Polypeptid kodierenden genomischen DNA kann deletiert oder durch ein anderes Gen, wie z.B. ein für einen selektierbaren Marker, der zur Feststellung der Integration verwendet werden kann, kodierendes Gen, ersetzt werden. Typischerweise werden mehrere Kilobasen unveränderter flankierender DNA (am 5'- sowie am 3'-Ende) in den Vektor aufgenommen (siehe z.B. Thomas und Capecchi, Cell 51, 503 (1987), für eine Beschreibung von Vektoren für homologe Rekombination). Der Vektor wird in eine embryonale Stammzelllinie eingeführt (z.B. durch Elektroporation), und es werden diejenigen Zellen gewählt, bei denen die eingeführte DNA mit der endogenen DNA homolog rekombiniert hat (siehe z.B. Li et al., Cell 69, 915 (1992)). Die gewählten Zellen werden dann in eine Blastozyte eines Tieres (z.B. Maus oder Ratte) injiziert, um Aggregationschimären zu bilden (siehe z.B. Bradley, in: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson (Hrsg.), IRL, Oxford, S. 113–152 (1987)). Ein chimärer Embryo kann dann in ein geeignetes pseudoschwangeres weibliches Ziehtier implantiert und der Embryo ausgetragen werden, um ein „Knock-out"-Tier zu erzeugen. Nachkommen, welche die homolog rekombinierte DNA in ihren Keimzellen tragen, können mittels Standardtechniken identifiziert und verwendet werden, um Tiere zu züchten, bei denen alle Zellen des Tieres die homolog rekombinierte DNA enthalten. Knockout-Tiere können beispielsweise auf ihre Fähigkeit hin charakterisiert werden, sich gegen gewisse pathologische Leiden zu verteidigen, und hinsichtlich ihrer Entwicklung pathologischer Leiden aufgrund des Fehlens des PRO-Polypeptids.
Wenn eine In-vivo-Verabreichung eines PRO-Polypeptids eingesetzt wird, können normale Dosismengen von ungefähr 10 ng/kg bis zu 100 mg/kg Säugetier-Körpergewicht oder mehr pro Tag variieren und betragen vorzugsweise von ungefähr 1 μg/kg/Tag bis 10 mg/kg/Tag in Abhängigkeit vom Verabreichungsweg. Richtlinien bezüglich spezieller Dosierungen und Abgabeverfahren werden in der Literatur bereitgestellt: siehe beispielsweise US-Patente Nr. 4.657.760; 5.206.344; oder 5.225.212. Es wird erwartet, dass unterschiedliche Formulierungen für unterschiedliche Behandlungsverbindungen und unterschiedliche Störungen wirksam sein werden und dass die eine Verabreichung, die beispielsweise auf ein Organ oder Gewebe abzielt, eine Abgabe auf eine Weise erforderlich macht, die sich von derjenigen an ein anderes Organ oder Gewebe unterscheidet.
Wo eine Retard-Verabreichung eines PRO-Polypeptids in einer Formulierung mit Freisetzungseigenschaften zur Behandlung einer beliebigen Krankheit oder Störung erwünscht ist, die eine Verabreichung des PRO-Polypeptids erfordert, ist die Mikroeinkapselung des PRO-Polypeptids vorgesehen. Die Mikroeinkapselung rekombinanter Proteine für verzögerte Freisetzung ist mit menschlichem Wachstumshormon (rhGH), Interferon- (rhlFN-), Interleukin-2 und MN rgp120 erfolgreich durchgeführt worden. Johnson et al., Nat. Med. 2, 795–799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther. 27, 1221–1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology 8, 755–758 (1990); Cleland, „Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems", in: Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell und Newman (Hrsg.), Plenum Press, New York, S. 439–462 (1995); WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; und US-Patent Nr. 5.654.010.
Die Retard-Formulierungen dieser Proteine wurden unter Verwendung von Poly-Milchsäure-Coglykolsäure- (PLGA-) Polymer entwickelt, und zwar aufgrund seiner Biokompatibilität und breiten Vielfalt von bioabbaubaren Eigenschaften. Die Abbauprodukte von PLGA, Milch- und Glycolsäure können im menschlichen Körper rasch eliminiert werden. Darüber hinaus kann die Abbaubarkeit dieses Polymers in Abhängigkeit von seinem Molekulargewicht und seiner Zusammensetzung von Monaten bis zu Jahren eingestellt werden. Lewis, „Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer", in: M. Chasin und R. Langer (Hrsg.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, New York, S. 1–41 (1990).
Beispielsweise wäre für eine Formulierung, die eine Dosierung von ungefähr 80 g/kg/Tag in Säugetieren mit einem maximalen Körpergewicht von 85 kg bereitstellen kann, die höchste Dosierung ungefähr 6,8 mg des PRO-Polypeptids pro Tag. Um dieses Dosierungsausmaß zu erzielen, ist eine Retard-Formulierung erforderlich, die eine maximal mögliche Proteinbeladung (15–20 Gew.-% PRO-Polypeptid) mit der minimal möglichen anfänglichen Freisetzung (< 20 %) enthält. Eine kontinuierliche Freisetzung (nullter Ordnung) des PRO-Polypeptids aus den Mikropartikeln für 1–2 Wochen ist ebenfalls wünschenswert. Außerdem sollte das freizusetzende Protein seine Integrität und Stabilität über den gewünschten Freisetzungszeitraum beibehalten.
Chordin ist ein Kandidat-Gen für Dysmorphie-Syndrom, das als Cornelia-de-Lange-Syndrom (CDL) bekannt ist, das durch ausgeprägte Gesichtseigenschaften (niedriger vorderer Haaransatz, Synophrys, breite Nasenöffnungen („antenerted nares"), Oberkiefer-Prognathie, langes Philtrum, „Karpfen"-Mund), pränatale und postnatale Wachstumsverzögerung, geistige Unterentwicklung und häufig, jedoch nicht immer, durch Arm-Anomalien charakterisiert ist. Es bestehen auch seltene Fälle, wo CDL in Verbindung mit Thrombozytopenie vorkommt. Das Gen für CDL ist durch Bindung an 3q26.3 (OMIM Nr. 122470) kartiert worden. Die Beteiligung von Xchd an früher Xenopus-Strukturierung und Nervensystementwicklung macht CHD zu einem faszinierenden Kandidat-Gen. CHD wird auf der Karte an die geeignete Region am Chromosom 3 abgebildet. Es liegt sehr nahe an THPO, und Deletionen, die THPO sowie CHD umfassen, könnten in seltenen Fällen in Thrombozytopenie und Entwicklungsanomalien resultieren. Die In-situ-Analyse von CD offenbarte, dass nahezu alle adulten Gewebe CHD nicht exprimieren, wobei das einzige positive Signal in der Spaltlinie des sich entwickelnden Synovialgelenks beobachtet wurde, das sich zwischen dem Femurkopf und Azetabulum (Hüftgelenk) bildet, was CHD bei der Entwicklung und vermutlich Wachstum von Röhrenknochen impliziert. Eine solche Funktion könnte, wenn sie gestört ist, in Wachstumsverzögerung resultieren.
Die aus der cDNA vorhergesagte menschliche CHD-Aminosäuresequenz ist zu 50 % identisch (und zu 66 % konserviert) mit Xchd. Alle 40 Cysteine in den 4 cysteinreichen Domänen sind konserviert. Diese cysteinreichen Domänen sind ähnlich jenen, die in Thrombospondin, Procollagen und von-Willebrand-Faktor festgestellt wurden. P. Bornstein, FASEB J. 6, 3290–3299 (1992); L. Hunt und W. Barker, Biochem. Biophys. Res. Commun. 144, 876–882 (1987).
Der menschliche CHD-Locus (genomisches PRO243) umfasst 23 Exons in 9,6 kb genomischer DNA. Das Initiationsmethionin befindet sich in Exon 1 und das Stoppcodon in Exon 23. Eine CpG-Insel befindet sich am 5'-Ende des Gens, beginnend etwa an 100 bp vor 5' von Exon 1, reicht durch das erste Exon und endet innerhalb des ersten Introns. Die THPO- und CHD-Loci sind Kopf an Kopf angeordnet, wobei etwa 2,2 kb ihre Transkriptionsinitiationsstellen trennen. Auf Proteinebene ist PRO243 zu 51 % identisch mit Xenopus-Chordin (Xchd). Alle vierzig Cysteine in dem einen Amino-Terminus und drei carboxyterminale cysteinreiche Cluster sind konserviert.
PRO243 ist ein Aminosäurepolypeptid von 954 Aminosäuren mit einer Signalsequenz an den Resten 1 bis etwa 23. Es gibt 4 Cysteincluster: (1) Reste etwa 51 bis etwa 125; (2) Reste etwa 705 bis etwa 761; (3) Reste etwa 784 bis 849; und (4) Reste etwa 897 bis etwa 931. Es gibt mögliche Leucin-Zipper an den Resten etwa 315 bis etwa 396 und N-Glykosylierungsstellen an den Resten 217, 351, 365 und 434.
Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper
Die vorliegende Erfindung stellt weiters Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper bereit. Beispielhafte Antikörper umfassen polyklonale, monoklonale, humanisierte, bispezifische und Heterokonjugat-Antikörper.
A. Polyklonale Antikörper
Die Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper können polyklonale Antikörper umfassen. Verfahren zur Herstellung polyklonaler Antikörper sind dem Fachkundigen bekannt. Polyklonale Antikörper können in einem Säugetier, beispielsweise durch eine oder mehrere Injektionen eines immunisierenden Mittels und, falls erwünscht, eines Adjuvans, hergestellt werden. Typischerweise wird das immunisierende Mittel und/oder Adjuvans durch mehrere subkutane oder intraperitoneale Injektionen in das Säuge tier injiziert. Das immunisierende Mittel kann das PRO-Polypeptid oder ein Fusionsprotein davon umfassen. Es kann zweckdienlich sein, das immunisierende Mittel an ein Protein zu konjugieren, von dem bekannt ist, dass es im zu immunisiert werdenden Säugetier immunogen ist. Beispiele solcher immunogener Proteine umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Keyhole-Limpet-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyroglobulin und Sojabohnentrypsininhibitor. Beispiel von Adjuvantien, die eingesetzt werden können, umfassen Freundsches komplettes Adjuvans und MPL-TDM-Adjuvans (Monophosphoryl-Lipid A, synthetisches Trehalosedicorynomycolat). Das Immunisierungsprotokoll kann von Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung ohne übermäßiges Experimentieren gewählt werden.
B. Monoklonale Antikörper
Die Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper können alternativ dazu monoklonale Antikörper sein. Monoklonale Antikörper können unter Verwendung von Hybridomverfahren hergestellt werden, wie z.B. jenen, die von Kohler und Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschrieben werden. In einem Hybridomverfahren wird eine Maus, ein Hamster oder ein anderes geeignetes Wirtstier typischerweise mit einem immunisierenden Mittel immunisiert, um Lymphozyten hervorzubringen, die Antikörper produzieren oder dazu in der Lage sind, die spezifisch an das immunisierende Mittel binden. Alternativ dazu können die Lymphozyten in vitro immunisiert werden.
Das immunisierende Mittel umfasst typischerweise das PRO-Polypeptid von Interesse oder ein Fusionsprotein davon. Im Allgemeinen werden entweder Peripherblutlymphozyten („PBLs") verwendet, falls Zellen menschlichen Ursprungs erwünscht sind, oder es werden Milzzellen oder Lymphknotenzellen verwendet, falls nichtmenschliche Säugetierquellen erwünscht sind. Die Lymphozyten werden dann mit einer immortalisierten Zelllinie unter Verwendung geeigneter Fusionierungsmittel, wie z.B. Polyethylenglykol, fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, S. 59–103 (1986)). Immortalisierte Zelllinien sind üblicherweise transformierte Säugetierzellen, insbeson dere Myelomzellen, die aus einem Nager, Rind oder Menschen stammen. Üblicherweise werden Ratten- oder Maus-Myelomzelllinien eingesetzt. Die Hybridomzellen können in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet werden, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben nicht fusionierter immortalisierter Zellen hemmen. Beispielsweise wird das Kulturmedium für die Hybridome, falls den elterlichen Zellen das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT) fehlt, typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin („HAT-Medium") enthalten, wobei diese Substanzen das Wachstum HGPRT-defizienter Zellen verhindern.
Bevorzugte immortalisierte Zelllinien sind jene, die effizient fusionieren, die eine stabile Expression des Antikörpers durch die selektierten antikörperproduzierenden Zellen im hohen Ausmaß fördern und gegen ein Medium, wie z.B. HAT-Medium, empfindlich sind. Bevorzugtere immortalisierte Zelllinien sind Maus-Myelomlinien, die beispielsweise vom Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien, und von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, erhalten werden können. Menschliche Myelom- und Maus-Human-Myelomzelllinien sind ebenfalls zur Produktion menschlicher monoklonaler Antikörper beschrieben worden (Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker Inc., New York, S. 51–63 (1987)).
Das Kulturmedium, in dem die Hybridomzellen kultiviert werden, kann dann auf die Gegenwart von gegen das PRO-Polypeptid von Interesse gerichteten monoklonalen Antikörpern getestet werden. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität der durch die Hybridomzellen gebildeten monoklonalen Antikörper mittels Immunpräzipitation oder durch einen In-vitro-Bindungstest, wie z.B. den Radioimmuntest (RIA) oder Enzymelinked-immunoabsorbent-assay (ELISA), ermittelt. Derartige Techniken und Tests sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann beispielsweise durch die Scatchard-Analyse von Munson und Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980), ermittelt werden.
Nachdem die gewünschten Hybridomzellen identifiziert worden sind, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und mittels Standardverfahren gezüchtet werden (Goding, s.o.). Geeignete Kulturmedien zu diesem Zweck umfassen beispielsweise Dulbecco's Modified Eagle's Medium und RPMI-1640-Medium. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in vivo in Aszites in einem Säugetier gezüchtet werden.
Die von den Subklonen sekretierten monoklonalen Antikörper können aus dem Kulturmedium oder aus der Aszitesflüssigkeit mit herkömmlichen Immunglobulinreinigungsverfahren, wie z.B. Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie, isoliert oder gereinigt werden.
Die monoklonalen Antikörper können auch durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt werden, wie z.B. durch jene, die im US-Patent Nr. 4.816.567 beschrieben werden. Für die monoklonalen Antikörper der Erfindung kodierende DNA kann unter Verwendung von Standardverfahren (z.B. durch Verwendung von Oligonucleotidsonden, die zur spezifischen Bindung an Gene fähig sind, die für die Schwer- und Leicht-Ketten von Maus-Antikörpern kodieren) leicht isoliert und sequenziert werden. Die Hybridomzellen der Erfindung dienen als bevorzugte Quelle derartiger DNA. Wenn einmal isoliert, kann die DNA in Expressionsvektoren eingebaut werden, die dann in Wirtszellen, wie z.B. Affen-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstock- (CHO-) Zellen oder Myelomzellen, transfiziert werden, die ansonsten kein Immunglobulinprotein produzieren, um die Synthese monoklonaler Antikörper in den rekombinanten Wirtszellen zu erlangen. Die DNA kann auch modifiziert werden, beispielsweise durch Substitution der homologen Maussequenzen durch die kodierende Sequenz für menschliche konstante Schwer- und Leichtketten-Domänen (US-Patent Nr. 4.816.567; Morrison et al., s.o.), oder durch kovalente Bindung der gesamten oder eines Abschnitts der kodierenden Sequenz für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid an die für Immunglobulin kodierende Sequenz. Die konstanten Domänen eines Antikörpers der Erfindung oder die variablen Domänen einer antigenkombinierenden Stelle eines Antikörpers der Erfindung können durch ein derartiges Nicht-Immunglobulin-Polypetid substituiert werden, um einen chimären zweiwertigen Antikörper zu erzeugen.
Die Antikörper können einwertige Antikörper sein. Verfahren zur Herstellung einwertiger Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannt. Beispielsweise umfasst eines der Verfahren die rekombinante Expression der Immunglobulin-Leichtkette und modifizierten Schwerkette. Die Schwerkette ist im Allgemeinen an irgendeinem Punkt der Fc-Region trunkiert, so dass die Schwerkettenvernetzung verhindert wird. Alternativ dazu werden die relevanten Cysteinreste durch einen anderen Aminosäurerest substituiert oder werden deletiert, so dass die Vernetzung verhindert wird.
In-vitro-Verfahren sind zur Herstellung einwertiger Antikörper ebenfalls geeignet. Die Verdauung von Antikörpern zur Herstellung von Fragmenten davon, insbesondere zur Herstellung von Fab-Fragmenten, kann unter Verwendung routinemäßiger Techniken erzielt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind.
C. Humanisierte Antikörper
Die Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper der Erfindung können außerdem humanisierte Antikörper oder menschliche Antikörper umfassen. Humanisierte Formen nichtmenschlicher (z.B. Maus-) Antikörper sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z.B. Fv, Fab, Fab', F(ab)'₂ oder antigenbindende Untersequenzen von Antikörpern), die eine von einem nicht-menschlichen Immunglobulin hergeleitete Minimalsequenz enthalten. Humanisierte Antikörper umfassen menschliche Immunglobuline (Empfängerantikörper), bei denen Reste aus einer Complementary-determining-region (CDR) des Empfängers durch Reste einer CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Spenderantikörper), wie z.B. Maus, Ratte oder Kaninchen, mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In manchen Fällen werden Fv-Gerüstreste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Humanisierte Antikörper können auch Reste umfassen, die sich weder im Empfängerantikörper noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen finden. Im Allgemeinen wird der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von zumindest einer und typischerweise zwei variablen Domänen umfassen, bei denen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen jenen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen jene einer menschlichen Konsensussequenz sind. Der humanisierte Antikörper wird bestenfalls auch zumindest einen Teil einer Immunglobulin-Konstantregion (Fc), typischerweise jene eines menschlichen Immunglobulins, umfassen (Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593–596 (1992)).
Verfahren zur Humanisierung nicht menschlicher Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper eine oder mehrere Aminosäurereste auf, die in diesen aus einer nicht-menschlichen Quelle eingeführt worden sind. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden häufig als „Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise einer variablen „Import"-Domäne entnommen sind. Die Humanisierung kann im Wesentlichen nach dem Verfahren von Winter und Mitarbeitern (Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–327 (1988); Verhoyen et al., Science 239, 1534–1536 (1988)) durch Substituieren der Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durch die entsprechenden Nager-CDRs oder -CDR-Sequenzen durchgeführt werden. Demgemäß sind derartige „humanisierte" Antikörper chimäre Antikörper (US-Patent Nr. 4.816.567), worin im Wesentlichen weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch die entsprechende Sequenz aus einer nicht-menschlichen Spezies substituiert worden ist. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche Antikörper, bei denen manche CDR-Reste und möglicherweise manche FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen in Nager-Antikörpern substituiert sind.
Menschliche Antikörper können auch unter Verwendung verschiedener Techniken hergestellt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, einschließlich Phagen-Display-Bibliotheken (Hoogenboom und Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)). Die Techniken von Cole et al. und Boerner et al. sind ebenfalls zur Herstellung menschlicher monoklonaler Antikörper verfügbar (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, S. 77 (1985), und Boerner et al., J. Immunol. 147(1), 86–95 (1991)).
D. Bispezifische Antikörper
Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise menschliche oder humanisierte, Antikörper, die Bindungsspezifitäten für zumindest zwei verschiedene Antigene aufweisen. Im vorliegenden Fall richtet sich eine der Bindungsspezifitäten gegen das PRO-Polypeptid, die andere gegen irgendein anderes Antigen und vorzugsweise gegen ein Zelloberflächenprotein oder einen Rezeptor oder eine Rezeptoruntereinheit.
Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Herkömmlicherweise basiert die rekombinante Herstellung bispezifischer Antikörper auf der Coexpression von zwei Immunglobulin-Schwerketten/Leichtketten-Paaren, wobei die beiden Schwerketten verschiedene Spezifitäten aufweisen (Milstein und Cuello, Nature 305, 537-539 (1983)). Wegen der zufälligen Auswahl von Immunglobulin-Schwer- und -Leichtketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein mögliches Gemisch von zehn verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eine die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten Moleküls wird üblicherweise durch affinitätschromatographische Schritte erzielt. Ähnliche Verfahren sind in WO 93/08829, veröffentlicht am 13. Mai 1993, und in Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655–3659 (1991), offenbart.
Variable Antikörperdomänen mit der gewünschten Bindungsspezifität (Antikörper-Antigen-kombinierende Stellen) können an konstante Immunglobulindomänensequen zen fusioniert werden. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer konstanten Immunglobulin-Schwerkettendomäne, die zumindest einen Abschnitt der Gelenk-, CH2- und CH3-Regionen umfasst. Es wird bevorzugt, dass die erste konstante Schwerkettenregion (CH1), welche die zur Leichtkettenbindung notwendige Stelle enthält, in zumindest einer der Fusionen vorhanden ist. Für die Immunglobulin-Schwerkettenfusionen und, falls erwünscht, für die Immunglobulin-Leichtkette kodierende DNAs werden in gesonderte Expressionsvektoren insertiert und in einen geeigneten Wirtsorganismus cotransfiziert. Für weitere Einzelheiten der Erzeugung bispezifischer Antikörper siehe beispielsweise Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
E. Heterokonjugat-Antikörper
Heterokonjugat-Antikörper liegen ebenfalls im Schutzumfang der Erfindung. Heterokonjugat-Antikörper sind aus zwei kovalent verbundenen Antikörpern zusammengesetzt. Solche Antikörper sind beispielsweise vorgeschlagen worden, um Immunsystemzellen auf unerwünschte Zellen abzuzielen (US-Patent Nr. 4.676.980), und zur Behandlung von HIV-Infektion (WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089 ). Es ist vorgesehen, dass die Antikörper in vitro unter Verwendung bekannter Techniken der synthetischen Proteinchemie, einschließlich jener, die Vernetzungsmittel umfassen, hergestellt werden können. Beispielsweise können Immunotoxine konstruiert werden, indem eine Disulfidaustauschreaktion verwendet oder indem eine Thioetherbindung gebildet wird. Beispiele geeigneter Reagenzien zu diesem Zweck umfassen Iminothiolate und Methyl-4-mercaptobutyrimidat und jene, die beispielsweise im US-Patent Nr. 4.676.980 offenbart sind.
Verwendungen für Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper
Die Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper der Erfindung haben verschiedene Verwendungsmöglichkeiten. Beispielsweise können Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper in Diagnosetests für ein PRO-Polypeptid verwendet werden, z.B. zur Detektion seiner Expression in speziellen Zellen, Geweben oder im Serum. Verschiedene Diagnosetest techniken, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, können verwendet werden, wie z.B. kompetitive Bindungstests, direkte oder indirekte Sandwichtests und Immunpräzipitationstests, die entweder in heterogenen oder in homogenen Phasen durchgeführt werden (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press Inc., S. 147–158 (1987)). Die in den Diagnosetests verwendeten Antikörper können mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert sein. Die nachweisbare Gruppierung sollte fähig sein, entweder direkt oder indirekt ein nachweisbares Signal zu produzieren. Beispielsweise kann die nachweisbare Gruppierung ein Radioisotop, wie z.B. ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S oder ¹²⁵I, eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Verbindung, wie z.B. Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin, oder ein Enzym, wie z.B. Alkalische Phosphatase, Beta-Galactosidase oder Meerrettichperoxidase, sein. Es kann jegliches Verfahren auf dem Gebiet der Erfindung zur Konjugation des Antikörpers an die nachweisbare Gruppierung eingesetzt werden, einschließlich jener Verfahren, die von Hunter et al., Nature 144, 945 (1962); David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981); und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982), beschrieben werden.
Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper sind außerdem für die Affinitätsreinigung des PRO-Polypeptids aus rekombinanter Zellkultur oder natürlichen Quellen zweckdienlich. In diesem Verfahren werden die Antikörper gegen das PRO-Polypeptid unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannt sind, an einen geeigneten Träger, wie z.B. Sephadex-Harz oder Filterpapier, immobilisiert. Der immobilisierte Antikörper wird dann mit einer das zu reinigende PRO-Polypeptid enthaltenden Probe kontaktiert und der Träger danach mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen, das im Wesentlichen das gesamte Material in der Probe mit Ausnahme des an den immobilisierten Antikörper gebundenen PRO-Polypeptids entfernt. Schließlich wird der Träger mit einem anderen geeigneten Lösungsmittel gewaschen, welches das PRO-Polypeptid vom Antikörper freisetzt.
Chordin (CHD) ist ein Kandidat-Gen für Dysmorphie-Syndrom, das als Cornelia-de-Lange-Syndrom (CDL) bekannt ist, das durch ausgeprägte Gesichtseigenschaften (niedriger vorderer Haaransatz, Synophrys, breite Nasenöffnungen („antenerted nares"), Oberkiefer-Prognathie, langes Philtrum, „Karpfen"-Mund), pränatale und postnatale Wachstumsverzögerung, geistige Unterentwicklung und häufig, jedoch nicht immer, durch Arm-Anomalien charakterisiert ist. Es bestehen auch seltene Fälle, wo CDL in Verbindung mit Thrombozytopenie vorkommt. Das Gen für CDL ist durch Bindung an 3q26.3 (OMIM Nr. 122470) kartiert worden. Die Beteiligung von Xchd (Xenopus-Chordin) an früher Xenopus-Strukturierung und Nervensystementwicklung macht CHD zu einem faszinierenden Kandidat-Gen. CHD wird auf der Karte an die geeignete Region am Chromosom 3 abgebildet. Es liegt sehr nahe an THPO, und Deletionen, die THPO sowie CHD umfassen, könnten in seltenen Fällen von Thrombozytopenie und Entwicklungsanomalien resultieren. Die In-situ-Analyse von CD offenbarte, dass nahezu alle adulten Gewebe CHD nicht exprimieren, wobei das einzige positive Signal in der Spaltlinie des sich entwickelnden Synovialgelenks beobachtet wurde, das sich zwischen dem Femurkopf und Azetabulum (Hüftgelenk) bildet, was CHD bei der Entwicklung und vermutlich Wachstum von Röhrenknochen impliziert. Eine solche Funktion könnte, wenn sie gestört ist, in Wachstumsverzögerung resultieren.
Die aus der cDNA vorhergesagte menschliche CHD-Aminosäuresequenz ist zu 50 identisch (und zu 66 % konserviert) mit Xchd. Alle 40 Cysteine in den 4 cysteinreichen Domänen sind konserviert. Diese cysteinreichen Domänen sind ähnlich jenen, die in Thrombospondin, Procollagen und von-Willebrand-Faktor festgestellt wurden. P. Bornstein, FASEB J. 6, 3290–3299 (1992); L. Hunt und W. Barker, Biochem. Biophys. Res. Commun. 144, 876–882 (1987).
Antikörper gegen PRO243-Chordin können hergestellt werden, welche das Polypeptid unter Bedingungen binden, die durch Überexpression von PRO243 gekennzeichnet sind.
Die folgenden Beispiele dienen ausschließlich der Illustration und beabsichtigen in keiner Weise die Einschränkung des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung.
Alle in der vorliegenden Erfindung Anmeldung zitierten Patente und Literaturstellen sind hiermit in ihrer Gesamtheit durch Verweis aufgenommen.
BEISPIELE
Im Handel erhältliche Reagenzien, auf die in den Beispielen Bezug genommen wird, wurden, wenn nicht anders angegeben, nach den Anleitungen der Hersteller verwendet. Die Quelle jener Zellen, die in den folgenden Beispielen und in der gesamten Anmeldung durch ATCC-Zugriffsnummern gekennzeichnet sind, ist die American Type Culture Collection, Rockville, Maryland.
Beispiel 1: Homologie-Screening extrazellulärer Domänen zur Identifizierung neuer Polypeptide und dafür kodierender cDNA
Die Sequenzen extrazellulärer Domänen (ECD-Sequenzen) (einschließlich der Sekretionssignalsequenz, falls vorhanden) von ungefähr 950 bekannten sekretierten Proteinen aus der öffentlichen Swiss-Prot-Datenbank wurden verwendet, um EST-Datenbanken zu screenen. Die EST-Datenbanken umfassten öffentliche Datenbanken (z.B. Dayhoff, GenBank) und geschützte Datenbanken (z.B. LEFESEQ^TM, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA). Die Suche wurde unter Verwendung des Computerprogramms BLAST oder BLAST2 (Altschul und Gish, Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996)) als Vergleich der ECD-Proteinsequenzen mit einer 6-Rahmen-Translation der EST-Sequenzen durchgeführt. Jene Vergleiche mit einer Blast-Bewertung von 70 (oder in manchen Fällen 90) oder höher, die nicht für bekannte Proteine kodierten, wurden angehäuft und mit dem Programm „phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, WA; http:\\bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docslphrap.html) in Konsensus-DNA-Sequenzen assembliert.
Unter Verwendung dieses Homologie-Screens extrazellulärer Domänen wurden Konsensus-DNA-Sequenzen relativ zu anderen identifizierten EST-Sequenzen unter Verwendung von phrap assembliert. Außerdem wurden die erhaltenen Konsensus-DNA-Sequenzen häufig (jedoch nicht immer) unter Verwendung wiederholter BLAST-Zyklen und phrap verlängert, um die Konsensussequenz unter Verwendung der oben erörterten Quellen von EST-Sequenzen so weit wie möglich zu verlängern.
Auf Basis der wie oben beschrieben erhaltenen Konsensussequenzen wurden dann Oligonucleotide synthetisiert und verwendet, um mittels PCR eine die Sequenz von Interesse enthaltende cDNA-Bibliothek zu identifizieren, und zur Verwendung als Sonden, um einen Klon der kodierenden Sequenz voller Länge für ein PRO-Polypeptid zu isolieren. Vorwärts- (.f-) und Rückwärts- (.r-) PCR-Primer liegen im Allgemeinen im Bereich von 20 bis 30 Nucleotiden und werden häufig konstruiert, um ein PCR-Produkt von ungefähr 100-1.000 bp Länge zu liefern. Die Sonden- (.p-) Sequenzen weisen typischerweise ein Länge von ungefähr 40–55 bp auf. In einigen Fällen werden zusätzliche Oligonucleotide synthetisiert, wenn die Konsensussequenz größer als etwa 1–1,5 kbp ist. Um mehrere Bibliotheken für einen Klon voller Länge zu screenen, wurde DNA aus den Bibliotheken mittels PCR-Amplifikation wie von Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, beschrieben mit dem PCR-Primerpaar gescreent. Eine positive Bibliothek wurde dann verwendet, um Klone, die für das Gen von Interesse kodieren, unter Verwendung des Sonden-Oligonucleotids und eines der Primerpaare zu isolieren.
Die zur Isolierung der cDNA-Klone verwendeten cDNA-Bibliotheken wurden mittels Standardverfahren konstruiert, wobei im Handel erhältliche Reagenzien, wie z.B. jene von Invitrogen, San Diego, CA, verwendet wurden. Die cDNA wurde mit einem eine Notl-Stelle enthaltenden Oligo-dT geprimt, mit dem stumpfen Ende an teilweise mit Kinase behandelten Sall-Adaptoren gebunden, mit Notl gespalten, mittels Gelelektrophorese in geeigneter Weise nach Größe aufgetrennt und in einer definierten Ausrichtung in einen geeigneten Klonierungsvektor (wie z.B. pRKB oder pRKD; pRK5B ist ein Vorläufer von pRK5D, der die Sfil-Stelle nicht enthält; siehe Holmes et al., Science 253, 1278–1280 (1991)) in die einzigartigen Xhol- und Notl-Stellen kloniert.
Beispiel 2: Isolierung von cDNA-Klonen durch Amylase-Screening
1. Herstellung der Oligo-dT-geprimten cDNA-Bibliothek
mRNA wurde aus einem menschlichen Gewebe von Interesse unter Verwendung von Reagenzien und Protokollen von Invitrogen, San Francisco, CA, (Fast Track 2) isoliert. Diese RNA wurde verwendet, um eine Oligo-dT-geprimte cDNA-Bibliothek in dem Vektor pRK5D unter Verwendung von Reagenzien und Protokollen von Life Technologies, Gaithersburg, MD, (Super Script Plasmid System) zu erzeugen. In diesem Verfahren wurde die doppelsträngige cDNA auf eine Größe von mehr als 1.000 bp eingestellt und die Sall/Notl-verbundene cDNA in den Xho/Notl-gespaltenen Vektor kloniert. pRK5D ist ein Klonierungsvektor, der eine sp6-Transkriptionsinitiationsstelle gefolgt von einer Sfil-Restriktionsenzymstelle aufweist, welche den Xhol/NotlcDNA-Klonierungsstellen vorausgehen.
2. Herstellung der zufallsgeprimten cDNA-Bibliothek
Eine sekundäre cDNA-Bibliothek wurde erzeugt, um vorzugsweise die 5'-Enden der primären cDNA-Klone zu verkörpern. Sp6-RNA wurde aus der Primärbibliothek (oben beschrieben) erzeugt, und diese RNA wurde verwendet, um eine zufallsgeprimte cDNA-Bibliothek im Vektor pSST-AMY.0 unter Verwendung von Reagenzien und Protokollen von Life Technologies (Super Script Plasmid System, oben zitiert) zu erzeugen. In diesem Verfahren wurde die doppelsträngige cDNA auf eine Größe von 500–1.000 bp eingestellt, mit dem stumpfen Ende an Notl-Adaptoren verbunden, mit Sfil gespalten und in den Sfil/Notl-gespaltenen Vektor kloniert. pSST-AMY.0 ist ein Klonierungsvektor, der einen Hefe-Alkoholdehydrogenase-Promotor aufweist, der den cDNA-Klonierungsstellen und der Maus-Amylasesequenz (der reifen Sequenz ohne dem Sekretionssignal) vorausgeht, gefolgt vom Hefe-Allkoholdehydrogenase- Terminator im Anschluss an die Klonierungsstellen. Folglich werden die in diesen Vektor klonierten cDNAs, die In-frame mit der Amylasesequenz fusioniert sind, die Sekretion von Amylase aus geeignet transfizierten Hefekolonien bewirken.
3. Transformation und Detektion
DNA aus der im obigen Absatz 2 beschriebenen Bibliothek wurde auf Eis gekühlt, und es wurden elektrokompetente DH10B-Bakterien (Life Technologies, 20 ml) zugegeben. Das Bakterien- und Vektorgemisch wurde dann wie vom Hersteller empfohlen der Elektroporation unterzogen. Anschließend wurde SOC-Medium (Life Technologies, 1 ml) zugegeben und das Gemisch bei 37 °C 30 Minuten lang inkubiert. Die Transformanten wurden dann auf 20 standardmäßigen 150-mm-LB-Platten ausplattiert, die Ampicillin enthielten, und 16 Stunden lang (37 °C) inkubiert. Positive Kolonien wurden von den Platten abgeschabt und die DNA aus dem Bakterienpellet unter Verwendung von Standardprotokollen, z.B. eines CsCI-Gradienten, isoliert. Die gereinigte DNA wurde dann für die unten stehenden Hefe-Protokolle verwendet.
Die Hefeverfahren wurden in drei Kategorien eingeteilt: (1) Transformation von Hefe mit dem kombinierten Plasmid/DNA-Vektor; (2) Detektion und Isolation von Amylase sekretierenden Hefeklonen; und (3) PCR-Amplifikation des Inserts direkt aus der Hefekolonie und Reinigung der DNA zur Sequenzierung und weiteren Analyse.
Der verwendete Hefestamm war HD56-5A (ATCC-90785). Dieser Stamm weist den folgenden Genotyp auf: MAT-Alpha, ura3-52, leu2-3, leu2-112, his3-11, his3-15, MAL⁺, SUC⁺, GAL⁺. Vorzugsweise können Hefemutanten eingesetzt werden, die defekte posttranslationelle Stoffwechselwege aufweisen. Solche Mutanten können translokationsdefekte Allele in sec71, sec72, sec62 aufweisen, wobei trunkiertes sec71 insbesondere bevorzugt ist. Alternativ dazu können Antagonisten (einschließlich Antisense-Nucleotiden und/oder Liganden), welche die normale Funktion dieser Gene stören, andere an diesem Posttranslations-Stoffwechselweg beteiligte Proteine (z.B. SEC61p, SEC72p, SEC62p, SEC63p, TDJ1p oder SSA1p-4p) oder die Kom plexbildung dieser Proteine ebenfalls vorzugsweise in Kombination mit der Amylaseexprimierenden Hefe eingesetzt werden.
Die Transformation wurde auf Basis des von Giezt et al., Nucl. Acid. Res. 20, 1425 (1992), dargelegten Protokolls durchgeführt. Transformierte Zellen wurden dann aus Agar in komplexe YEPD-Medium-Kulturlösung (100 ml) inokuliert und über Nacht bei 30 °C gezüchtet. Die YEPD-Kulturlösung wurde wie von Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 207 (1994), beschrieben hergestellt. Die Übernachtkultur wurde dann auf ungefähr 2 × 10⁶ Zellen/ml (ungefähre OD₆₀₀ = 0,1) in frische YEPD-Kulturlösung (500 ml) verdünnt und wiederum auf 1 × 10⁷ Zellen/ml (ungefähr OD₆₀₀ = 0,4–0,5) gezüchtet.
Die Zellen wurden dann geerntet und zur Transformation vorbereitet, und zwar durch Überführen in GS3-Rotorflaschen und Zentrifugieren in einem Sorval-GS3-Rotor bei 5.000 U/min 5 Minuten lang, wobei der Überstand verworfen wurde, Resuspension in sterilem Wasser und nochmalger Zentrifugation in 50-ml-Falcon-Röhrchen bei 3.500 U/min in einer Beckman GS-6KR-Zentrifuge. Die Überstand wurde verworfen, und die Zellen wurden anschließend mit LiAc/TE (10 ml, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5, 100 mM Li₂OOCCH₃) gewaschen und in LiAc/TE (2,5 ml) resuspendiert.
Die Transformation erfolgte durch Mischen der vorbereiteten Zellen (100 μl) mit frisch denaturierter einzelsträngiger Lachshoden-DNA (Lofstrand Labs, Gaithersburg, MD) und transformierender DNA (1 μg, Vol. < 10 μl) in Mikrozentrifugenröhrchen. Das Gemisch wurde durch Vortexen kurz gemischt, worauf 40 % PEG/TE (600 μl, 40 % Polyethylenglykol-4000, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM Li₂OOCCH₃, pH 7,5) zugegeben wurde. Das Gemisch wurde sanft gemischt und bei 30 °C unter Schwenken 30 Minuten lang inkubiert. Die Zellen wurden dann 15 Minuten lang bei 42 °C einem Hitzeschock unterworfen und das Reaktionsgefäß in einer Mikrozentrifuge bei 12.000 U/min 5–10 Sekunden lang zentrifugiert, dekantiert und in TE (500 μl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) resuspendiert, gefolgt von nochmaliger Zentrifugation. Die Zellen wurden dann in TE (1 ml) verdünnt, und Aliquoten (200 μl) wurden auf Selektivmedium ausgestrichen, das vorher in 150-mm-Wachstumsplatten (VWR) hergestellt worden war.
Alternativ dazu wurde anstelle von mehreren kleinen Reaktionen die Transformation unter Verwendung einer einzigen Reaktion im großen Maßstab durchgeführt, worin die Reagenzienmengen entsprechend erhöht wurden.
Das verwendete Selektivmedium war ein synthetischer vollständiger Dextroseagar, dem Uracil fehlte (SCD-Ura), das wie in Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 208–210 (1994), beschrieben hergestellt wurde. Die Transformanten wurden bei 30 °C 2–3 Tage lang gezüchtet.
Der Nachweis von Amylase sekretierenden Kolonien wurde durch Aufnahme von roter Stärke in das Selektivmedium durchgeführt. Die Stärke wurde nach dem von Biely et al., Anal. Biochem. 172, 176–179 (1988), beschriebenen Verfahren an den roten Farbstoff (Reactive Red-120, Sigma) gekoppelt. Die gekoppelte Stärke wurde in die SCD-Ura-Agarplatten in einer Endkonzentration von 0,15 % (Gew./Vol.) inkorporiert und mit Kaliumphosphat auf einen pH von 7,0 (5–100 mM Endkonzentration) gepuffert.
Die positiven Kolonien wurden entnommen und auf frisches Selektivmedium (auf 150-mm-Platten) ausgestrichen, um gut isolierte und identifizierbare Einzelkolonien zu erhalten. Gut isolierte Einzelkolonien, die für Amylasesekretion positiv waren, wurden durch direkte Inkorporation von roter Stärke in den gepufferten SCD-Ura-Agar nachgewiesen. Positive Kolonien wurden aufgrund ihrer Fähigkeit ermittelt, Stärke abzubauen, was in einem direkt sichtbarem hellen Ring um die positive Kolonie herum resultierte.
4. Isolierung von DNA mittels PCR-Amplifikation
Wenn eine positive Kolonie isoliert war, wurde ein Teil von ihr mit einem Zahnstocher entnommen und in sterilem Wasser (30 μl) in einer 96-Napf-Platte verdünnt. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Kolonien entweder eingefroren und für anschließende Analyse gelagert oder sofort amplifiziert. Eine Aliquote von Zellen (5 μl) wurde als Templat für die PCR-Reaktion verwendet, und zwar in einem Volumen von 25 μl, welches das Folgende enthielt: 0,5 μl Klentaq (Clonetech, Palo Alto, CA); 4,0 μl 10 mM dNTPs (Perkin Elmer-Cetus); 2,5 μl Klentaq-Puffer (Clontech); 0,25 μl Vorwärts-Oligo 1; 0,25 μl reverses Oligo 2; 12,5 μl destilliertes Wasser. Die Sequenz des Vorwärts-Oligonucleotids 1 war:
Die Sequenz des reversen Oligonucleotids 2 war:
Die PCR wurde wie folgt durchgeführt:
Die unterstrichenen Regionen der Oligonucleotide anellierten an die ADH-Promotorregion bzw. Amylaseregion und amplifizierten eine 307-bp-Region des Vektors pSST-AMY.0, wenn kein Insert vorhanden war. Typischerweise enthielten die ersten 18 Nucleotide des 5'-Endes dieser Oligonucleotide anellierende Stellen für die Sequenzierungsprimer. Folglich wies das Gesamtprodukt der PCR-Reaktion aus einem leeren Vektor 343 bp auf. Jedoch resultierte die Signalsequenz-fusionierte cDNA in beträchtlich längeren Nucleotidsequenzen.
Im Anschluss an die PCR wurde eine Aliquote der Reaktion (5 μl) mittels Agarosegelelektrophorese in einem 1%igen Agarosegel unter Verwendung eines Tris-Borat-EDTA- (TBE-) Puffersystems wie von Sambrook et al., s.o., beschrieben untersucht. Klone, die ein einziges ausgeprägtes PCR-Produkt einer Größe von mehr als 400 bp lieferten, wurden mittels DNA-Sequenzierung nach Reinigung mit einer 96-Qiaquick-Reinigungssäule (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) weiter analysiert.
Beispiel 3: Isolierung von für menschliches PRO243 kodierenden cDNA Klonen durch Genom-Walking
Einführung: Menschliches Thrombopoietin (THPO) ist ein glykosyliertes Hormon von 352 Aminosäuren, das aus zwei Domänen besteht. Die N-terminate Domäne, die 50 % Ähnlichkeit mit Erythropoietin aufweist, ist für die biologische Aktivität verantwortlich. Die C-terminale Region ist zur Sekretion erforderlich. Das Gen zur Thrombopoietin- (THPO-) wird auf der Karte an das menschliche Chromosom 3g27-q28 dargestellt, wobei die sechs Exons dieses Gens 7 kb umfassende Basenpaare von genomischer DNA überspannen (Gurney et al., Blood 85, 981–988 (1995)). Um zu bestimmen, ob für THPO-Homologe kodierende Gene vorhanden waren, die sich nahe des THPO befanden, wurden genomische DNA-Fragmente von dieser Region identifiziert und sequenziert. Drei P1-Klone und ein PAC-Klon (Genome Systems Inc., St. Louis, MO; Kat.-Nr. P1-2535 und PAC-6539), die den THPO-Locus umfassen, wurden isoliert, und eine 140-kb-Region wurde unter Verwendung der geordneten Shotgun-Strategie (Chen et al., Genomics 17, 651–656 (1993)), verbunden mit einem auf PCR basierenden Lückenfüllansatz, sequenziert. Eine Analyse zeigte, dass die Region reich an Genen ist, wobei vier zusätzliche Gene sehr nahe am THPO positioniert waren: das mit dem Tumornekrosefaktorrezeptor Typ 1 verbundene Protein 2 (TRAP2) und der Elongationsinitiationsfaktor Gamma (EIF4g), der Chloridkanal 2 (CLCN2) und die RNA-Polymerase-II-Untereinheit hRPB17. Während kein THPO-Homolog in der Region vorhanden war, wurden durch computergestützte Gendetektion (GRAIL) vier neue Gene (Xu et al., Gen. Engin. 16, 241–253 (1994)), die Gegenwart von CpG-Inseln (S. Cross A. und Bird, Curr. Opin. Genet. & Devel. 5, 109–314 (1995)) und Homologie zu bekannten Genen (detektiert durch WU-BLAST2.0) (Altschul und Gish, Methods Enzymol. 266, 46–480 (1996)) (http:\\blast.wustl.edu/blast/README.html) vorhergesagt.
P1- und PAC-Klone: Der anfängliche menschliche P1-Klon wurde aus einer genomischen P1-Bibliothek (Genome Systems Inc., St. Louis, MO; Kat.-Nr. P1-2535) isoliert, die mit PCR-Primern gescreent war, die für die genomische THPO-Sequenz entworfen waren (A.L. Gurney et al., Blood 85, 981–88 (1995)). PCR-Primer wurden aus den Endsequenzen hergestellt, die von diesem P1-Klon stammten, und dann zum Screenen von P1- und PAC-Bibliotheken verwendet (Genome Systems, Kat.-Nr. P1-2535 & PAC-6539), um überlappende Klone zu identifizieren.
Geordnete Shotgun-Stategie: Die geordnete Shotgun-Strategie (Ordered Shotgun Strategy, OSS) (Chen et al., Genomics 17, 651–656 (1993)) umfasst die Kartierung und Sequenzierung großer genomischer DNA-Klone mit einem hierarchischen Ansatz. Der P1- oder PAC-Klon wurde beschallt, und die Fragmente wurden in einen λ- Vektor (λ-Bluestar) subkloniert (Novagen, Inc., Madison, WI; Kat.-Nr 69242-3). Die λ-Subkloninserts wurden durch Long-Range-PCR isoliert (W. Barnes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2216–2220 (1994)), und die Enden wurden sequenziert. Die λ-Endsequenzen wurden überlappt, um eine teilweise Karte des ursprünglichen Klons zu schaffen. Diese λ-Klone mit überlappenden Endsequenzen wurden identifiziert, die Inserts wurden in einen Plasmidvektor (pUC9 oder pUC18) subkloniert, und die Enden des Plasmidsubklons wurden sequenziert und angeordnet, um eine zusammenhängende Sequenz zu schaffen. Diese gerichtete Sequenzierungsstrategie minimiert die erforderliche Redundanz und ermöglicht gleichzeitig das Scannen für und Konzentrieren auf Regionen von Interesse.
Um den THPO-Locus besser zu definieren und andere Gene zu suchen, die mit der Hämatopoietinfamilie in Zusammenhang stehen, wurden vier genomische Klone durch PCR-Screening von menschlichen P1- und PAC-Bibliotheken aus dieser Region isoliert (Genome System, Inc., Kat.-Nr. P1-2535 und PAC-6539). Die Größen der genomischen Fragmente waren wie folgt: P1.t umfasst 40 kb; P1.g umfasst 70 kb; P1.u umfasst 70 kb; und PAC.z umfasst 200 kb. Die Beziehungen zwischen diesen vier genomischen Klonen sind in 5 dargestellt. Etwa 80 % der 200 kb umfassenden genomischen DNA-Region wurden durch die geordnete Shotgun-Strategie (OSS) sequenziert (Chen et al., Genomics 17, 651–56 (1993)) und unter Verwendung eines AutoAssembler^TM (Applied Biosystems, Perkin Elmer, Foster City, CA, Kat.-Nr. 903227) zu Contigs angeordnet. Die vorläufige Anordnung dieser Contigs wurde durch manuelle Analyse bestimmt. Es gab 46 Contigs, und die Lücken wurden gefüllt. In Tabelle 2 sind die Anzahl und Größe der Lücken zusammengefasst. Tabelle 2 Zusammenfassung der Lücken in der 140-kb-Region

Lückengröße Anzahl

< 50bp 13

50 – 150 bp 7

150 – 300 bp 7

300 – 1000 bp 10

1000 – 5000 bp 7

> 5000 bp 2 (15.000 bp)
DNA-Sequenzierung: ABI-DYE-Primer^TM-Chemie (PE Applied Biosystems, Foster City, CA; Kat.-Nr. 402112) wurde verwendet, um die λ- und Plasmidsubklone am Ende zu sequenzieren. ABI-DYE-Terminator^TM-Chemie (PE Applied Biosystems, Foster City, CA; Kat.-Nr. 403044) wurde verwendet, um die PCR-Produkte mit ihren jeweiligen PCR-Primern zu sequenzieren. Die Sequenzen wurden mit einem ABI377-Instrument gesammelt. Für PCR-Primer über 1 kb wurden Walking-Primer verwendet. Die Sequenzen von Contigs, die durch die OSS-Strategie im AutoAssembler^TM (PE Applied Biosystems, Foster City, CA; Kat.-Nr. 903227) hergestellt wurden, und die Lückenfüllsequenzen-Trace-Files wurden zum Überlappen und Editing in einen Sequencher^TM (Gene Codes Corp., Ann. Arbor, MI) importiert.
Auf PCR basierende Lückenfüllstrategie: Primer wurden basierend auf dem 5'- und 3'-Ende, das für jedes Contig sequenziert wurde, entworfen, wobei repetitive und minderwertige Sequenzregionen vermieden wurden. Alle Primer wurden so entworfen, dass sie 19- bis 24-mere mit 50 – 70 % G/C-Gehalt waren. Oligos wurden synthetisiert und durch herkömmliche Verfahren gelgereinigt.
Da die Ausrichtung und Anordnung von Contigs unbekannt waren, wurden Permutationen der Primer in den Amplifikationsreaktionen eingesetzt. Zwei PCR-Sets wurden verwendet: erstens, das XL-PCR-Set (Perkin Elmer, Norwalk, CT; Kat.-Nr. N8080205) mit Verlängerungsdauern von etwa 10 min; und zweitens, das Taq-Poly merase-PCR-Set (Qiagen Inc., Valencia, CA, Kat.-Nr. 201223), das, wenn ein Schleifen oder beim XL-PCR-Set mehrere Produkte beobachtet wurden, unter hoch stringenten Bedingungen verwendet wurde. Das wichtigste PCR-Produkt jeder erfolgreichen Reaktion wurde aus einem 0,9 % niedrigschmelzenden Agarosegel extrahiert und mit dem Geneclean-DNA-Purification-Set vor der Sequenzierung gereinigt.
Analyse: Die Identifizierung und Charakterisierung von kodierenden Regionen wurden wie folgt durchgeführt. Zuerst wurden repetitive Sequenzen unter Verwendung eines RepeatMasker (A.F.A. Smit & P. Green, http:\\ftp.genome.washington.edu/RM/RM_details.html) maskiert, das DNA-Sequenzen in FastA-Format gegen eine Bibliothek von repetitiven Elementen screent und eine maskierte Anfragesequenz ausgibt. Nicht maskierte Wiederholungen wurden durch einen Vergleich mit der GenBank-Datenbank unter Verwendung von WU-BLAST identifiziert (S. Altschul & W. Gish, Methods Enzymol. 266, 460–480 (1996)) und manuell maskiert.

Als Nächstes wurden bekannte Gene aufgedeckt, indem die genomischen Regionen unter Verwendung des WUBLAST2.0-Algorithmus mit der Proteindatenbank von Genentech verglichen wurden und dann durch Anordnung der genomischen und cDNA-Sequenzen für jedes Gen unter Verwendung eines Needleman-Wunsch-Algorithmus (Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 443– (1970)) vermerkt wurden, um Regionen mit lokaler Identität zwischen Sequenzen zu finden, die sich ansonsten größtenteils unterscheiden. Die Strategie führt zur Detektion aller Exons der fünf bekannte Gene in der Region, THPO, TRAP2, elF4g, CLCN2 und hRPB187 (Tabelle 3). Tabelle 3 Zusammenfassung bekannter Gene in der analysierten 140 kb Region

Bekannte Gene	Kartenposition
Eukaryotischer Translationsinitiatonsfaktor 4γ	3q27-qter
Thrombopoietin	3q26-q27
Chloridkanal 2	3q26-qter
TNF-Rezeptor-assoziiertes Protein 2	vorher nicht kartiert
RNA-Polymerase-II-Untereinheit hRPB17	vorher nicht kartiert

Schließlich wurden neue Transkriptionseinheiten unter Verwendung verschiedener Ansätze vorhergesagt. CpG-Inseln (S. Cross & A. Bird, Curr. Opin. Genet. Dev. 5, 109–314 (1995)) wurden verwendet, um Promotorregionen zu definieren, und sie wurden als Cluster von Stellen identifiziert, die durch Enzyme gespalten waren, welche GC-reiche, 6- oder 8-mer palidrome Sequenzen erkannten. CpG-Inseln werden normalerweise mit Promotorregionen von Genen assoziiert. Eine WUBLAST2.0-Analyse von kurzen genomischen Regionen (10 – 20 kb) zeigt im Vergleich mit GenBank Übereinstimmungen mit ESTs. Die einzelnen EST-Sequenzen (oder wenn möglich, ihre Sequenz-Chromatogrammdateien) wurden gewonnen und mit einem Sequencher angeordnet, um eine theoretische cDNA-Sequenz bereitzustellen (hierin als DNA34415 bezeichnet). GRAIL2 (ApoCom Inc., Knoxville, TN, Befehlszeilenversion für DECα) wurde verwendet, um ein neues Exon vorherzusagen. Die fünf bekannten Gene in der Region dienten als interne Kontrolle für den Erfolg des GRAIL-Algorithmus.
Isolierung: Chordin-cDNA-Klone wurden aus einer Oligo-dT-geprimten menschlichen fötalen Lungenbibliothek isoliert. Menschliche fötale Lungen-PolyA⁺-RNA wurde von Clontech bezogen (Kat.-Nr. 6528-1, Chargennummer 43777), und 5 mg wurden verwendet, um eine cDNA-Bibliothek in pKR5B (Genentech, LIB26) herzustellen. Der 3'-Primer (pGACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT) Seq.-ID Nr. 3) und der 5'-Linker (pCGGACGCGTGGGGCCTGCGCACCCAGCT) (Seq.-ID Nr. 4) wurden entworfen, um Sall- und Notl-Restriktionsstellen einzuführen. Klone wurden mit Oligonucleotid-Sonden gescreent, die aus der möglichen menschlichen Chordin-cDNA-Sequenz (DNA34415) entworfen wurden, welche durch manuelles Zusammen-„spleißen" der vorgeschlagenen genomischen Exons des Gens abgeleitet wurde. PCR-Primer, welche die Sonden flankierten, wurden verwendet, um die Identität der cDNA-Klone vor der Sequenzierung zu bestätigen.
Die Oligonucleotid-Screening-Sonden waren wie folgt:
und die flankierenden Sonden waren wie folgt:
Beispiel 5: Northern-Blot und in-situ-RNA-Hybridisierungsanalyse von PRO243
Die Expression von PRO243-mRNA in menschlichen Geweben wurde durch eine Northern-Blot-Analyse untersucht. Menschliche PolyA+-RNA-Blots von menschlichem fötalem und adultem Gewebe (Clontech, Palo Alto, CA, Kat.-Nr. 7760-1 und 7756-1) wurden an eine ³²P-markierte cDNA-Fragmentsonde hybridisiert, die auf PRO243-cDNA voller Länge basierte. Blots wurden mit den Sonden in einem Hybridisierungspuffer (5X SSPE; 2X Denhardt-Lösung; 100 mg/ml denaturierte abgeschnittene Lachsspermien-DNA; 50 % Formamid; 2 % SDS) 60 Stunden lang bei 42 °C inkubiert. Die Blots wurden mehrere Male in 2X SSC; 0,05 % SDS 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gewaschen, gefolgt von einem 30-minütigem Waschvorgang hoher Stringenz in 0,1X SSC; 0,1 % SDS bei 50 °C und Autoradiographie. Die Blots wurden entwickelt, nachdem sie über Nacht einer Phosphorimager-Analyse (Fuji) ausgesetzt worden waren.
Wie in 4 zu sehen ist, wurden PRO243-mRNA-Transkripte detektiert. Eine Analyse des Expressionsmusters zeigte das stärkste Signal des erwartete 4,0-kb-Transkripts in adulter und fötaler Leber und ein sehr schwaches Signal in der adulten Niere. Fötales Gehirn, fötale Lunge und fötale Niere waren negativ, ebenso adultes Herz, adultes Gehirn, adulte Lunge und adultes Pankreas. Kleinere Transkripts wurden in Placenta (2,0 kb), adulten Skelettmuskeln (1,8 kb) und fötaler Leber (2,0 kb) beobachtet.
In-situ-Hybridisierung von adultem menschlichem Gewebe von PRO243 ergab ein positives Signal in der Spaltlinie des sich entwickelnden Synovialgelenks zwischen dem Femurkopf und dem Azetabulum. Alle anderen Gewebe waren negativ. Weitere Abschnitte von menschlichen fötalen Gesichtern, Köpfen, Extremitäten und Mäuseembryos wurden untersucht. Eine Expression in menschlichem fötalem Gewebe wurde neben sich entwickelnden Extremitäten- und Gesichtsknochen im perostealen Mesenchym beobachtet. Die Expression war äußerst spezifisch und befand sich oft neben Bereichen, die eine Vaskularisierung durchliefen. Eine Expression wurde auch in sich entwickelndem Schläfen- und Hinterhauptslappen des fötalen Gehirns beobachtet, sonst aber nirgends im Gehirn. Darüber hinaus wurde Expression in den Ganglien des sich entwickelnden Innenohrs entdeckt. In den Mäusegeweben mit den menschlichen Sonden wurde keine Expression beobachtet (siehe 5).
Die In-situ-Hybridisierung wurde nach einer optimierten Version des Protokolls von Lu und Gillett, Cell Vision 1, 169–176 (1994), unter Verwendung von PCR-erzeugten, ³³P-markierten Ribosonden durchgeführt. In Formalin fixierte, in Paraffin eingebettete menschliche fötale und adulte Gewebe wurden geschnitten, entparaffinisiert, 15 Minuten lang bei 37 °C in Proteinase K (20 mg/ml) von Protein befreit und für die Insitu-Hybridisierung wie von Lu und Gillett, s.o., beschrieben weiter verarbeitet. Eine [³³P]-UTP-markierte Antisense-Ribosonde wurde aus einem PCR-Produkt erzeugt und bei 55 °C über Nacht hybridisiert. Die Objektträger wurden in Kodak-NTB2-Nuclear-Track-Emulsion eingetaucht und 4 Wochen lang exponiert.
Beispiel 19: Verwendung von für PRO-Polypeptid kodierender Nucleinsäure als Hybridisierungssonden
Das folgende Verfahren beschreibt die Verwendung einer für ein PRO-Polypeptid kodierenden Nucleotidsequenz als Hybridisierungssonde.
DNA, die die kodierende Sequenz für ein hierin offenbartes PRO-Polypeptid von Interesse umfasst, kann als Sonde eingesetzt oder als eine Basis verwendet werden, von der aus Sonden hergestellt werden, um auf homologe DNAs (wie z.B. jene, die für natürlich auftretende Varianten des PRO-Polypeptids kodieren) in cDNA-Bibliotheken menschlicher Gewebe oder genomischen Bibliotheken menschlicher Gewebe zu screenen.
Die Hybridisierung und Waschung von Filtern, die eine der beiden Bibliotheks-DNAs enthalten, wird unter den folgenden hochstringenten Bedingungen durchgeführt. Die Hybridisierung der radioaktiv markierten, von der für PRO-Polypeptid kodierenden Nucleinsäure hergeleiteten Sonde an die Filter wird in einer Lösung von 50 % Formamid, 5 × SSC, 0,1 % SDS, 0,1 % Natriumpyrophosphat, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 2x Denhardt-Lösung und 10 % Dextransulfat bei 42 °C 20 Stunden lang durchgeführt. Das Waschen der Filter wird in einer wässrigen Lösung von 0,1x SSC und 0,1 % SDS bei 42 °C durchgeführt.
DNAs mit der gewünschten Sequenzidentität mit der für Nativsequenz-PRO-Polypeptid voller Länge kodierenden DNA können dann mit auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Standardverfahren identifiziert werden.
Beispiel 20: Expression von PRO-Polypeptiden in E. coli
Dieses Beispiel illustriert die Herstellung einer nicht glykosylierten Form eines gewünschten PRO-Polypeptids durch rekombinante Expression in E. coli.
Die für das gewünschte PRO-Polypeptid kodierende DNA-Sequenz wird zunächst unter Verwendung ausgewählter PCR-Primer amplifiziert. Die Primer sollten Restriktionsenzymstellen enthalten, die den Restriktionsenzymstellen am gewählten Expressionsvektor entsprechen. Es kann eine Vielzahl von Expressionsvektoren eingesetzt werden. Ein Beispiel eines geeigneten Vektors ist pBR322 (hergeleitet von E. coli; siehe Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)), der Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz enthält. Der Vektor wird mit Restriktionsenzym verdaut und dephosphoryliert. Die PCR-amplifizierten Sequenzen werden dann in den Vektor ligiert. Der Vektor wird vorzugsweise Sequenzen umfassen, die für ein Antibiotikum-Resistenz-Gen, einen trp-Promotor, einen polyhis-Leader (einschließlich der ersten sechs STII-Codons, polyhis-Sequenz und Enterokinase-Spaltstelle), die spezifische für PRO-Polypeptid kodierende Region, Lamda-Transkriptionsterminator und ein argU-Gen kodieren.
Das Ligationsgemisch wird dann verwendet, um einen ausgewählten E.-coli-Stamm unter Verwendung der in Sambrook et al., s.o., beschriebenen Verfahren zu transformieren. Transformanten werden aufgrund ihrer Fähigkeit identifiziert, auf LB-Platten zu wachsen, und Antibiotika-resistente Kolonien werden dann selektiert. Plasmid-DNA kann isoliert und mittels Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung bestätigt werden.
Selektierte Klone können über Nacht in Flüssigkulturmedium, wie z.B. mit Antibiotika ergänzter LB-Kulturlösung, gezüchtet werden. Die Übernachtkultur kann anschließend verwendet werden, um eine Kultur im größeren Maßstab zu inokulieren. Die Zellen werden dann auf die gewünschte optische Dichte gezüchtet, wobei der Expressionspromotor angeschaltet wird.
Nach dem Kultivieren der Zellen für mehrere weitere Stunden können die Zellen mittels Zentrifugation geerntet werden. Das durch Zentrifugation erhaltene Zellpellet kann unter Verwendung verschiedener Mittel, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, solubilisiert werden, und das solubilisierte PRO-Polypeptid kann dann un ter Verwendung einer metallchelatierenden Säule unter Bedingungen gereinigt werden, die eine feste Bindung des Proteins ermöglichen.
In der EP 1037979 A (98960440.0) wurde PRO241 erfolgreich in E. coli in einer poly-His-markierten Form unter Verwendung des folgenden Verfahrens exprimiert. Die für PRO241 kodierende DNA wurde zunächst unter Verwendung ausgewählter PCR-Primer amplifiziert. Die Primer enthielten Restriktionsenzymstellen, die den Restriktionsenzymstellen am ausgewählten Expressionsvektor entsprechen, und andere zweckdienliche Sequenzen, die für eine effiziente und verlässliche Translationsinitiation, schnelle Reinigung an einer metallchelatierenden Säule und proteolytische Entfernung mit Enterokinase sorgen. Die PCR-amplifizierten, poly-His-markierten Sequenzen wurden dann in einen Expressionsvektor ligiert, der verwendet wurde, um einen E.-coli-Wirt auf Basis von Stamm 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts(htpRts) clpP(laclq)) zu transformieren. Transformanten wurden zuerst in 50 mg/ml Carbenicillin enthaltendem LB bei 30 °C unter Schütteln gezüchtet, bis eine O.D.600 von 3–5 erreicht war. Die Kulturen wurden dann 50- bis 100fach in CRAP-Medium (hergestellt durch Mischen von 3,57 g (NH₄)₂SO₄, 0,71 g Natriumcitrat.2H₂O, 1,07 g KCl, 5,36 g Difco-Hefeextrakt, 5,36 g Sheffield-Hycase SF in 500 ml Wasser, sowie 110 mM MPOS, pH 7,3, 0,55 % (Gew./Vol.) Glucose und 7 mM MgSO₄) verdünnt und ungefähr 20–30 Stunden lang bei 30 °C unter Schütteln gezüchtet. Es wurden Proben entfernt, um die Expression mittels SDS-PAGE-Analyse zu verifizieren, und der Hauptteil der Kultur wird zentrifugiert, um die Zellen zu pelletisieren. Die Zellpellets wurden bis zur Reinigung und Neufaltung eingefroren.
E.-coli-Paste aus 0,5- bis 1-I-Fermentationen (6–10 g Pellets) wurden in 10 Volumenanteilen (Gew./Vol.) in 7 M Guanidin, 20 mM Tris-Puffer, pH 8, resuspendiert. Festes Natriumsulfit und Natriumtetrathionat werden zugegeben, um Endkonzentrationen von 0,1 M bzw. 0,02 M zu liefern, und die Lösung wurde über Nacht bei 4 °C gerührt. Dieser Schritt resultiert in einem denaturierten Protein, in dem alle Cysteinreste durch Sulfitolierung blockiert sind. Die Lösung wurde bei 40.000 U/min in einer Beckman Ultrazentrifuge 30 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 3–5 Volu menanteilen des Metallchelatsäulenpuffers (6 M Guanidin, 20 mM Tris, pH 7,4) verdünnt und zur Klärung durch ein 0,22-μm-Filter filtriert. Der geklärte Extrakt wurde auf eine 5-ml-Qiagen-Ni-NTA-Metallchelatsäule geladen, die im Metallchelatsäulenpuffer äquilibriert war. Die Säule wurde mit zusätzlichem, 50 mM Imidazol (Calbiochem, Utrol-Qualität), pH 7,4, enthaltendem Puffer gewaschen. Das Protein wurde mit 250 mM Imidazol enthaltendem Puffer eluiert. Die das gewünschte Protein enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und bei 4 °C gelagert. Die Proteinkonzentration wurde durch seine Absorption bei 280 nm unter Verwendung des berechneten Extinktionskoeffizienten auf Basis seiner Aminosäuresequenz abgeschätzt.
Die Proteine wurden durch langsames Verdünnen der Probe in frisch hergestelltem Neufaltungspuffer neu gefaltet, wobei der Puffer aus Folgendem bestand: 20 mM Tris, pH 8,6, 0,3 M NaCl, 2,5 M Harnstoff, 5 mM Cystein, 20 mM Glycin und 1 mM EDTA. Neufaltungsvolumina wurden so gewählt, dass die Proteinendkonzentration zwischen 50 und 100 Mikrogramm/ml lag. Die Neufaltungslösung wurde bei 4 °C 12–36 Stunden lang sanft gerührt. Die Neufaltungsreaktion wurde durch Zugabe von TFA auf eine Endkonzentration von 0,4 % (pH von ungefähr 3) gestoppt. Vor der weiteren Reinigung des Proteins wurde die Lösung durch ein 0,22-μm-Filter filtriert und Acetonitril auf eine Endkonzentration von 2–10 % zugegeben. Das neugefaltete Protein wurde an einer Poros-R1/H-Umkehrphasensäule unter Verwendung eines mobilen Puffers von 0,1 % TFA mit Elution mit einem Acetonitrilgradienten von 10 bis 80 % chromatodraphiert. Aliquoten der Fraktionen mit Absorption bei 280 nm wurden an SDS-Polyacrylamidgelen analysiert, und homogenes neugefaltetes Protein enthaltende Fraktionen wurden vereinigt. Im Allgemeinen eluieren die richtig neugefalteten Spezies der meisten Proteine bei den niedrigsten Acetonitrilkonzentrationen, da diese Spezies die kompaktesten sind, da ihre hydrophobe Innenseite von der Wechselwirkung mit dem Umkehrphasenharz abgeschirmt ist. Aggregierte Spezies eluierten für gewöhnlich bei höheren Acetonitrilkonzentrationen. Zusätzlich zur Abtrennung fehlgefalteter Proteinformen von der gewünschten Form entfernt der Umkehrphasenschritt auch Endotoxin aus den Proben.
Die das gewünschte gefaltete PRO241-Protein enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und das Acetonitril unter Verwendung eines leichten, gegen die Lösung gerichteten Stickstoffstroms entfernt. Die Proteine wurden durch Dialyse oder durch Gelfiltration unter Verwendung von in Formulierungspuffer äquilibrierten G25-Superfine-(Pharmacia) Harzen in 20 mM Hepes, pH 6,8, mit 0,14 M Natriumchlorid und 4 Mannit formuliert und sterilfiltriert.
Beispiel 21: Expression von PRO-Polypeptiden in Säugetierzellen
Dieses Beispiel illustriert die Herstellung einer glykosylierten Form eines gewünschten PRO-Polypeptids durch rekombinante Expression in Säugetierzellen.
Der Vektor, pRK5 (siehe EP 307.247 , veröffentlicht am 15. März 1989), wird als Expressionsvektor eingesetzt. Gegebenenfalls wird die für PRO-Polypeptid kodierende DNA mit ausgewählten Restriktionsenzymen in pRK5 ligiert, um die Insertion der PRO-Polypeptid-DNA unter Verwendung von Ligationsverfahren zu ermöglichen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., s.o., beschrieben sind. Der resultierende Vektor wird pRK5-PRO-Polypeptid genannt.
In einer Ausführungsform können die gewählten Wirtszellen 293-Zellen sein. Menschliche 293-Zellen (ATCC CCL 1573) werden in Gewebekulturplatten in Medium wie z.B. mit Fötalkälberserum und gegebenenfalls mit Nährstoffkomponenten und/oder Antibiotika ergänztem DMEM zur Konfluenz gezüchtet. Ungefähr 10 μg pRK5-PRO-Polypeptid-DNA werden mit ungefähr 1 μg der für das VA-RNA-Gen kodierenden DNA (Thimmappaya et al., Cell 31, 543 (1982)) gemischt und in 500 μl 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl₂ gelöst. Diesem Gemisch wird tropfenweise 500 μl 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO₄ zugegeben und die Bildung eines Präzipitats 10 Minuten lang bei 25 °C ermöglicht. Das Präzipitat wird suspendiert und den 293-Zellen zugegeben und ungefähr vier Stunden lang bei 37 °C absetzen gelassen. Das Kulturmedium wird abgesaugt, und es werden 2 ml 20 % Glycerin in PBS für 30 Sekunden zugegeben. Die 293-Zellen werden dann mit serumfreiem Medium gewaschen, frisches Medium wird zugesetzt, und die Zellen werden dann für ungefähr 5 Tage inkubiert.
Ungefähr 24 Stunden nach den Transfektionen wird das Kulturmedium entfernt und durch Kulturmedium (für sich alleine) oder 200 μCi/ml ³⁵S-Cystein und 200 μCi/ml Kulturmedium ersetzt. Nach einer 12-stündigen Inkubation wird das konditionierte Medium gesammelt, an einem Zentrifugenfilter konzentriert und auf ein 15%iges SDS-Gel aufgegeben. Das verarbeitete Gel kann getrocknet und für eine gewählte Zeitspanne einem Film exponiert werden, um die Gegenwart von PRO-Polypeptid zu zeigen. Die transfizierte Zellen enthaltenden Kulturen können einer weiteren Inkubation (in serumfreiem Medium) unterzogen und das Medium in ausgewählten Biotests getestet werden.
In einer alternativen Technik kann das PRO-Polypeptid unter Verwendung des von Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 12, 7575 (1981), beschriebenen Dextransulfatverfahrens vorübergehend in 293-Zellen eingeführt werden. 293-Zellen werden in einer Zentrifugenflasche auf maximale Dichte gezüchtet, und es werden 700 μg pRKS-PRO-Polypeptid-DNA zugegeben. Die Zellen werden zunächst durch Zentrifugation in der Zentrifugenflasche konzentriert und mit PBS gewaschen. Das DNA-Dextranpräzipitat wird am Zellpellet vier Stunden lang inkubiert. Die Zellen werden mit 20 % Glycerin 90 Sekunden lang behandelt, mit Gewebekulturmedium gewaschen und wieder in die Gewebekulturmedium, 5 μg/ml Rinderinsulin und 0,1 μg/ml Rindertransferrin enthaltende Zentrifugenflasche gegeben. Nach ungefähr vier Tagen wird das konditionierte Medium zentrifugiert und filtriert, um Zellen und Trümmer zu entfernen. Die das exprimierte PRO-Polypeptid enthaltende Probe kann dann durch irgendein gewähltes Verfahren, wie z.B. Dialyse und/oder Säulenchromatographie, konzentriert und gereinigt werden.
In einer weiteren Ausführungsform können PRO-Polypeptide in CHO-Zellen exprimiert werden. Das pRK5-PRO-Polypeptid kann unter Verwendung bekannter Reagenzien, wie z.B. CaPO₄ oder DEAE-Dextran, in CHO-Zellen transfiziert werden. Wie oben beschrieben können die Zellkulturen inkubiert und das Medium durch Kulturmedium (für sich alleine) oder Medium, das einen Radiomarker, wie z.B. ³⁵S-Methionin, enthält, ersetzt werden. Nach Ermittlung der Gegenwart des PRO-Polypeptids kann das Kulturmedium durch serumfreies Medium ersetzt werden. Vorzugsweise werden die Kulturen ungefähr 6 lang Tage inkubiert, worauf das konditionierte Medium geerntet wird. Das das exprimierte PRO-Polypeptid enthaltende Medium kann dann mit irgendeinem gewählten Verfahren konzentriert und gereinigt werden.
Epitopmarkiertes PRO-Polypeptid kann ebenfalls in CHO-Wirtszellen exprimiert werden. Das PRO-Polypeptid kann aus dem pRK5-Vektor heraus subkloniert werden. Das Subklon-Insert kann der PCR unterzogen werden, um In-frame mit einer gewählten Epitopmarkierung, wie z.B. einer poly-his-Markierung, in einen Baculovirus-Expressionsvektor fusioniert zu werden. Das poly-his-markierte PRO-Polypeptid-Insert kann dann in einen SV40-angetriebenen Vektor subkloniert werden, der einen Selektionsmarker, wie z.B. DHFR, zur Selektion stabiler Klone enthält. Schließlich können die CHO-Zellen mit dem SV40-angetriebenen Vektor (wie oben beschrieben) transfiziert werden. Es kann eine Markierung wie oben beschrieben durchgeführt werden, um die Expression zu verifizieren. Das das exprimierte poly-His-markierte PRO-Polypeptid enthaltende Kulturmedium kann dann mit irgendeinem gewählten Verfahren, wie z.B. Ni²⁺-Chelat-Affinitätschromatographie, konzentriert und gereinigt werden.
PRO241 wurde sowohl durch ein vorübergehendes als auch durch ein stabiles Expressionsverfahren erfolgreich in CHO-Zellen exprimiert. Zusätzlich wurde PRO243 erfolgreich vorübergehend in CHO-Zellen exprimiert.
Die stabile Expression in CHO-Zellen wurde unter Verwendung des folgenden Verfahrens durchgeführt. Die Proteine wurden als ein IgG-Konstrukt (Immunoadhäsin) exprimiert, bei dem die kodierenden Sequenzen für die löslichen Formen (z.B. extrazellulären Domänen) des entsprechenden Proteins an eine IgG1-Konstantregionse quenz fusioniert waren, welche die Gelenk-, CH2- und CH3-Domänen enthält und/oder eine poly-His-markierte Form ist.
Nach der PCR-Amplifikation wurden die entsprechenden DNAs in einen CHO-Expressionsvektor subkloniert, wobei Standardtechniken verwendet wurden, wie sie in Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Abschnitt 3.16, John Wiley and Sons (1997), beschrieben werden. CHO-Expressionsvektoren werden so konstruiert, dass sie kompatible Restriktionsstellen 5' und 3' der DNA von Interesse aufweisen, um das zweckmäßige Shuttling von cDNAs zu ermöglichen. Der zur Expression in CHO-Zellen verwendete Vektor ist der in Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24, 9, 1774–1779 (1996), beschriebene und verwendet den frühen SV40-Promotor/Enhancer, um die Expression der cDNA von Interesse anzutreiben, und Dihydrofolatreduktase (DHFR). Die DHFR-Expression erlaubt die Selektion auf stabile Erhaltung des Plasmids im Anschluss an die Transfektion.
Zwölf Mikrogramm der gewünschten Plasmid-DNA wurden in ungefähr 10 Millionen CHO-Zellen unter Verwendung der im Handel erhältlichen Transfektionsreagenzien Superfect^® (Qiagen), Dosper^® oder Fugene^® (Boehringer Mannheim) eingeführt. Die Zellen wurden wie in Lucas et al., s.o., beschrieben gezüchtet. Ungefähr 3 × 10⁷ Zellen werden in einer Ampulle für die unten beschriebene weitere Züchtung und Produktion eingefroren.
Die Plasmid-DNA enthaltenden Ampullen wurden in einem Wasserbad aufgetaut und durch Vortexen vermischt. Die Inhalte wurden in ein 10 ml Medium enthaltendes Zentrifugenröhrchen pipettiert und bei 1.000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und die Zellen in 10 ml Selektivmedium (0,2-μm-filtriertes PS20 mit 5 % 0,2-μm-diafiltriertem Fötalrinderserum) resuspendiert. Die Zellen wurden dann in einer 90 ml Selektivmedium enthaltenden 100-ml-Trennschleuder aliquotiert. Nach 1–2 Tagen wurden die Zellen in eine mit 150 ml Selektivwachstumsmedium gefüllte 250-ml-Trennschleuder überführt und bei 37 °C inkubiert. Nach weiteren 2–3 Tagen wurden eine 250-ml-, 500-ml- und 2.000-ml- Trennschleuder mit 3 × 10⁵ Zellen/ml inokuliert. Das Zellmedium wurde mittels Zentrifugation und Resuspension in Produktionsmedium durch frisches Medium ausgetauscht. Obgleich ein beliebiges geeignetes CHO-Medium eingesetzt werden kann, wurde tatsächlich ein im US-Patent Nr. 5.122.469 (erteilt am 16. Juni 1992) beschriebenes Produktionsmedium verwendet. Eine 3-I-Produktionstrennschleuder wird mit 1,2 × 10⁶ Zellen/ml inokuliert. Am Tag 0 wurden Zellzahl und pH bestimmt. Am Tag 1 wurde der Trennschleuder eine Probe entnommen, und es wurde die Belüftung mit filtrierter Luft begonnen. Am Tag 2 wurde der Trennschleuder eine Probe entnommen, die Temperatur auf 33 °C geändert und 30 ml Glucose (500 g/l) und 0,6 ml 10 % Antischaumlösung (z.B. 35 % Polydimethylsiloxan-Emulsion, Dow Corning 356 Medical Grade Emulsion) zugegeben. Während der gesamten Produktion wurde der pH wie benötigt eingestellt, um einen Wert von etwa 7,2 aufrechtzuerhalten. Nach 10 Tagen oder wenn die Lebensfähigkeit unter 70 % sank, wurde die Zellkultur mittels Zentrifugation und Filtrieren durch ein 0,22-μm-Filter geerntet. Das Filtrat wurde entweder bei 4 °C gelagert oder sofort zur Reinigung auf Säulen geladen.
Für die poly-His-markierten Konstrukte wurden die Proteine unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule (Qiagen) gereinigt. Vor der Reinigung wurde Imidazol der Kultur auf eine Konzentration von 5 mM zugegeben. Das konditionierte Medium wurde bei einer Flussrate von 4–5 ml/min bei 4 °C auf eine Ni-NTA-Säule von 6 ml gepumpt, die in 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol enthaltendem 20 mM Hepes-Puffer, pH 7,4, äquilibriert worden war. Nach der Beladung wurde die Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen und das Protein mit 0,25 M Imidazol enthaltendem Äquilibrierungspuffer eluiert. Das hochgereinigte Protein wurde anschließend mit einer G25-Superfine- (Pharmacia) Säule in 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4 % Mannit, pH 6,8, enthaltenden Lagerungspuffer entsalzt und bei –80 °C gelagert.
Immunoadhäsin- (Fc enthaltende) Konstrukte wurden aus dem konditionierten Medium wie folgt gereinigt. Das konditionierte Medium wurde auf eine 5-ml-Protein-A-Säule (Pharmacia) gepumpt, die in 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,8, äquilibriert worden war. Nach der Beladung wurde die Säule vor der Elution mit 100 mM Zitronensäure, pH 3,5, eingehend mit Äquilibrierungspuffer gewaschen. Das eluierte Protein wurde sofort neutralisiert, indem 1-ml-Fraktionen in Röhrchen aufgefangen wurden, die 275 μl 1 M Tris-Puffer, pH 9, enthielten. Das hochgereinigte Protein wurde anschließend wie oben für die poly-His-markierten Proteine beschrieben in Lagerungspuffer entsalzt. Die Homogenität wurde mittels Polyacrylamidgelen und durch N-terminale Aminosäuresequenzierung mittels Edman-Abbaus beurteilt.
PRO243 wurde ebenfalls erfolgreich vorübergehend in COS-Zellen exprimiert.
Beispiel 22: Expression von PRO-Polypeptiden in Hefe
Das folgende Verfahren beschreibt die rekombinante Expression eines gewünschten PRO-Polypeptids in Hefe.
Zuerst werden Hefe-Expressionsvektoren zur intrazellulären Produktion oder Sekretion von PRO-Polypeptid aus dem ADH2/GAPDH-Promotor konstruiert. Für ein gewünschtes PRO-Polypeptid, ein gewähltes Signalpeptid und den Promotor kodierende DNA wurde in geeignete Restriktionsenzymstellen im gewählten Plasmid insertiert, um die intrazelluläre Expression des PRO-Polypeptids zu steuern. Zur Sekretion kann die für das PRO-Polypeptid kodierende DNA in das gewählte Plasmid gemeinsam mit der für den ADH2/GAPDH-Promotor, die Hefe-Alpha-Faktor-Sekretionssignal/Leadersequenz und Linkersequenzen (falls benötigt) kodierenden DNA zur Expression des PRO-Polypeptids kloniert werden.
Hefezellen, wie z.B. Hefestamm AB110, können dann mit den oben beschriebenen Expressionsplasmiden transformiert und in gewählten Fermentationsmedien gezüchtet werden. Die Überstände der transformierten Hefen können mittels Präzipitation mit 10 % Trichloressigsäure und Trennung mittels SDS-PAGE, gefolgt von der Färbung der Gele mit Coomassie-Blau-Farbstoff analysiert werden.
Rekombinantes PRO-Polypeptid kann anschließend isoliert und gereinigt werden, indem die Hefezellen vom Fermentationsmedium mittels Zentrifugation entfernt werden und das Medium unter Verwendung ausgewählter Kartuschenfilter konzentriert wird. Das das PRO-Polypeptid enthaltende Konzentrat kann unter Verwendung ausgewählter Säulenchromatographieharze weiter gereinigt werden.
Beispiel 23: Expression von PRO-Polypeptiden in Baculovirus-infizierten Insektenzellen
Das folgende Verfahren beschreibt die rekombinante Expression von PRO-Polypeptiden in Baculovirus-infizierten Insektenzellen.
Das gewünschte PRO-Polypeptid wird stromauf einer in einem Baculovirus-Expressionsvektor enthaltenen Epitopmarkierung fusioniert. Derartige Epitopmarkierungen umfassen poly-his-Markierungen und Immunglobulin-Markierungen (wie z.B. Fc-Regionen von IgG). Es kann eine Vielzahl von Plasmiden eingesetzt werden, einschließlich Plasmiden, die sich von im Handel erhältlichen Plasmiden, wie z.B. pVL1393 (Novagen), herleiten. Zusammenfassend wird das PRO-Polypeptid oder der gewünschte Abschnitt des PRO-Polypeptids (wie z.B. die für die extrazelluläre Domäne eines Transmembranproteins kodierende Sequenz) mittels PCR mit Primern amplifiziert, die zu den 5'- und 3'-Regionen komplementär sind. Der 5'-Primer kann flankierende (ausgewählte) Restriktionsenzymstellen inkorporieren. Das Produkt wird dann mit diesen ausgewählten Restriktionsenzymen verdaut und in den Expressionsvektor subkloniert.
Rekombinantes Baculovirus wird durch Cotransfizieren des obigen Plasmids und BaculoGold^TM-Virus-DNA (Pharmingen) in Spodoptera-frugiperda- („Sf9"-) Zellen (ATCC CRL 1711) unter Verwendung von Lipofectin (im Handel von GIBCO-BRL erhältlich) erzeugt. Nach 4–5 Tagen Inkubation bei 28 °C werden die freigesetzten Viren geerntet und für weitere Amplifikationen verwendet. Die Virusinfektion und Proteinexpression wird wie von O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford University Press, Oxford (1994), beschrieben durchgeführt.
Exprimiertes, poly-his-markiertes PRO-Polypeptid kann dann beispielsweise durch Ni²⁺-Chelat-Affinitätschromatographie wie folgt gereinigt werden. Extrakte werden aus rekombinanten virusinfizierten Sf9-Zellen wie von Rupert et al., Nature 362, 175–179 (1993), beschrieben hergestellt. Zusammenfassend werden Sf9-Zellen gewaschen, in Beschallungspuffer (25 ml Hepes, pH 7,9, 12,5 mM MgCl₂; 0,1 mM EDTA; 10 % Glycerin; 0,1 % NP-40; 0,4 M KCl) resuspendiert und zweimal 20 Sekunden lang auf Eis beschallt. Die beschallten Proben werden durch Zentrifugation geklärt und der Überstand 50fach in Beladungspuffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10 % Glycerin, pH 7,8) verdünnt und durch ein 0,45-μm-Filter filtriert. Eine Ni²⁺-NTA-Agarosesäule (im Handel von Qiagen erhältlich) wird mit einem Bettvolumen von 5 ml hergestellt, mit 25 ml Wasser gewaschen und mit 25 ml Beladungspuffer äquilibriert. Der filtrierte Zellextrakt wird mit 0,5 ml pro Minute auf die Säule geladen. Die Säule wird mit Beladungspuffer bis zum Erreichen der A₂₈₀-Basislinie gewaschen, wobei zu diesem Zeitpunkt das Auffangen der Fraktionen gestartet wird. Als Nächstes wird die Säule mit einem sekundären Waschpuffer (50 mM Phosphat; 300 mM NaCl, 10 % Glycerin, pH 6,0) gewaschen, der unspezifisch gebundenes Protein eluiert. Nachdem die A₂₈₀-Basislinie wieder erreicht worden ist, wird die Säule mit einem Imidazol-Gradienten von 0 bis 500 mM im sekundären Waschpuffer eluiert. Es werden 1-ml-Fraktionen gesammelt und mittels SDS-PAGE und Silberfärbung oder Western-Blot mit Ni²⁺-NTA-konjugierter Alkalischer Phosphatase (Qiagen) analysiert. Die das eluierte His₁₀-markierte PRO-Polypeptid enthaltende Fraktionen werden vereinigt und gegen Beladungspuffer dialysiert.
Alternativ dazu kann die Reinigung des IgG-markierten (oder Fc-markierten) PRO-Polypeptids unter Verwendung bekannter Chromatographietechniken, einschließlich beispielsweise Protein-A- oder Protein-G-Säulenchromatographie, durchgeführt werden. In der EP 1037979 A (98960440.0) wurden PRO241, PRO327 und PRO344 erfolgreich in Baculovirus-infizierten Sf9-Insektenzellen exprimiert. Obgleich die Ex pression tatsächlich in einem Maßstab von 0,5–2 l durchgeführt wurde, kann der Maßstab für größere Präparate (z.B. 8 l) leicht vergrößert werden. Die Proteine wurden als IgG-Konstrukt (Immunoadhäsin), in dem die extrazelluläre Proteinregion an eine die Gelenk-, CH2- und CH3-Domänen enthaltende IgG1-Konstantregionsequenz fusioniert war, und/oder in poly-His-markierten Formen exprimiert.
Zur Expression in Baculovirus-infizierten Sf9-Zellen wurden im Anschluss an die PCR-Amplifikation die entsprechenden kodierenden Sequenzen in einen Baculovirus-Expressionsvektor (pb.PH.IgG für IgG-Fusionen und pb.PH.His.c für poly-Hismarkierte Proteine) subkloniert, und der Vektor und Baculogold^®-Baculovirus-DNA (Pharmingen) wurden in 105 Spodoptera-frugiperda- („Sf9"-) Zellen (ATCC CRL 1711) unter Verwendung von Lipofectin (Gibco BRL) cotransfiziert. pb.PH.IgG und pb.PH.His sind Modifikationen des im Handel erhältlichen Baculovirus-Expressionsvektors pVL1393 (Pharmingen) mit modifizierten Polylinkerregionen, welche die His- und Fc-Markierungssequenzen enthalten. Die Zellen wurden in mit 10 % FBS (Hyclone) ergänztem Hink-TNM-FH-Medium gezüchtet. Die Zellen wurden 5 Tage lang bei 28 °C inkubiert. Der Überstand wurde geerntet und anschließend für die erste Virusamplifikation durch Infizieren von Sf9-Zellen in mit 10 % FBS ergänztem Hink-TNM-FH-Medium bei einer ungefähren Infektionsmultiplizität (MOI) von 10 verwendet. Die Zellen wurden 3 Tage lang bei 28 °C inkubiert. Der Überstand wurde geerntet, und die Expression der Konstrukte im Baculovirus-Expressionsvektor wurde mittels Chargenbindung von 1 ml Überstand an 25 ml Ni-NTA-Perlen (QIAGEN) für Histidin-markierte Proteine oder Protein-A-Sepharose-CL-4B-Perlen (Pharmacia) für IgG-markierte Proteine ermittelt, gefolgt von SDS-PAGE-Analyse, um eine bekannte Konzentration von Proteinstandard mittels Coomassie-Blau-Färbung zu vergleichen.
Der Überstand der ersten Virusamplifikation wurde verwendet, um eine Trennschleuder-Kultur (500 ml) von in ESF-921-Medium (Expression Systems LLC) gezüchteten Sf9-Zellen bei einer ungefähren MOI von 0,1 zu infizieren. Die Zellen wurden 3 Tage lang bei 28 °C inkubiert. Der Überstand wurde geerntet und filtriert. Die Chargenbin dung und SDS-PAGE-Analyse wurden wie erforderlich wiederholt, bis die Expression der Trennschleuder-Kultur bestätigt war.
Das konditionierte Medium aus den transfizierten Zellen (0,5 bis 3 l) wurde mittels Zentrifugation geerntet, um die Zellen zu entfernen, und durch 0,22-μm-Filter filtriert. Für die poly-His-markierten Konstrukte wurden die Proteinkonstrukte unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule (Qiagen) gereinigt. Vor der Reinigung wurde den konditionierten Medien Imidazol auf eine Konzentration von 5 mM zugegeben. Die konditionierten Medien wurden bei einer Flussrate von 4–5 ml/min bei 4 °C auf eine Ni-NTA-Säule von 6 ml gepumpt, die in 20 mM Hepes-Puffer, pH 7,4, äquilibriert war, der 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol enthielt. Nach der Beladung wurde die Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen und das Protein mit 0,25 M Imidazol enthaltendem Äquilibrierungspuffer eluiert. Das hochgereinigte Protein wurde anschließend mit einer G25-Superfine- (Pharmacia) Säule von 25 ml in einen 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4 % Mannit, pH 6,8, enthaltenden Lagerungspuffer entsalzt und bei –80 °C gelagert.
Immunoadhäsin- (Fc enthaltende) Konstrukte von Proteinen wurden aus den konditionierten Medien wie folgt gereinigt. Die konditionierten Medien wurden auf eine Protein-A-Säule (Pharmacia) von 5 ml gepumpt, die in 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,8, äquilibriert worden war. Nach der Beladung wurde die Säule vor der Elution mit 100 mM Zitronensäure, pH 3,5, eingehend mit Äquilibrierungspuffer gewaschen. Das eluierte Protein wurde sofort neutralisiert, indem 1-ml-Fraktionen in Röhrchen aufgefangen wurden, die 275 ml 1 M Tris-Puffer, pH 9, enthielten. Das hochgereinigte Protein wurde anschließend wie oben für die poly-His-markierten Proteine beschrieben in Lagerungspuffer entsalzt. Die Homogenität wurde mittels SDS-Polyacrylamidgel- (PEG) Elektrophorese und N-terminaler Aminosäuresequenzierung mittels Edman-Abbaus verifiziert.
PRO243 wurde erfolgreich in Baculovirus-infizierten Hi5-Insektenzellen exprimiert. Obgleich die Expression tatsächlich in einem Maßstab von 0,5–2 l durchgeführt wurde, kann der Maßstab für größere Herstellungen (z.B. 8 l) leicht vergrößert werden.
Zur Expression in Baculovirus-infizierten Hi5-Insektenzellen kann die für PRO-Polypeptid kodierende DNA mit geeigneten Systemen, wie z.B. Pfu (Stratagene), amplifiziert oder stromauf (5' von) einer in einem Baculovirus-Expressionsvektor enthaltenden Epitopmarkierung fusioniert werden. Derartige Epitopmarkierungen umfassen poly-his-Markierungen und Immunglobulin-Markierungen (wie z.B. Fc-Regionen von IgG). Es kann eine Vielzahl von Plasmiden eingesetzt werden, einschließlich Plasmiden, die sich von im Handel erhältlichen Plasmiden herleiten, wie z.B. pVL1393 (Novagen). Zusammenfassend wird das PRO-Polypeptid oder der gewünschte Abschnitt des PRO-Polypeptids (wie z.B. die für die extrazelluläre Domäne eines Transmembranproteins kodierende Sequenz) mittels PCR mit Primern amplifiziert, die zu den 5'- und 3'-Regionen komplementär sind. Der 5'-Primer kann flankierende (ausgewählte) Restriktionsenzymstellen einbauen. Das Produkt wird dann mit diesen ausgewählten Restriktionsenzymen verdaut und in den Expressionsvektor subkloniert. Zum Beispiel können die Derivate von pVL1393 die Fc-Region von menschlichem IgG (pb.PH.IgG) oder eine 8-Histidin- (pb.PH.His) Markierung stromab (3' von) der NAME-Sequenz umfassen. Vorzugsweise wird das Vektorkonstrukt zur Bestätigung sequenziert.
Hi5-Zellen wurden auf eine Konfluenz von 50 % unter den Bedingungen von 27 °C, kein CO₂, NO pen/strep gezüchtet. Für jede 150-mm-Platte werden 30 μg des PRO-Polypeptid enthaltenden, pIE-basierten Vektors mit 1 ml Ex-Cell-Medium (Medium: Ex-Cell 401 + 1/100 L-Glu JRH Biosciences Nr. 14401-78P (Anmerkung: dieses Medium ist lichtempfindlich)) gemischt, und in einem gesonderten Röhrchen werden 100 μl CellFectin (CellFECTIN (GibcoBRL Nr. 10362-010) (mittels Vortex gemischt)) mit 1 ml Ex-Cell-Medium gemischt. Die beiden Lösungen werden kombiniert und bei Raumtemperatur 15 Minuten lang inkubiert. 8 ml Ex-Cell-Medium werden den 2 ml des DNA/CellFECTIN-Gemisches zugegeben, und dieses wird auf Hi5-Zellen über schichtet, die ein Mal mit Ex-Cell-Medium gewaschen worden sind. Die Platte wird dann im Dunkeln 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das DNA/CellFECTIN-Gemisch wird dann abgesaugt, und die Zellen werden einmal mit Ex-Cell gewaschen, um überschüssiges CellFECTIN zu entfernen. 30 ml frisches Ex-Cell-Medium wird zugegeben, und die Zellen werden 3 Tage lang bei 28 °C inkubiert. Der Überstand wird geerntet, und die Expression des PRO-Polypeptids im Baculovirus-Expressionsvektor kann mittels Chargenbindung von 1 ml Überstand an 25 ml Ni-NTA-Perlen (QIAGEN) für Histidin-markierte Proteine oder Protein-A-Sepharose-CL-4B-Perlen (Pharmacia) für IgG-markierte Proteine bestimmt werden, gefolgt von SDS-PAGE-Analyse zum Vergleichen mit einer bekannten Konzentration von Proteinstandard mittels Coomassie-Blau-Färbung.
Das konditionierte Medium der transfizierten Zellen (0,5 bis 3 l) wird mittels Zentrifugation geerntet, um die Zellen zu entfernen, und durch 0,22-μm-Filter filtriert. Für die poly-His-markierten Konstrukte wird das das PRO-Polypeptid umfassende Protein unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule (Qiagen) gereinigt. Vor der Reinigung wird dem konditionierten Medium Imidazol zu einer Konzentration von 5 mM zugegeben. Das konditionierte Medium wird bei einer Flussrate von 4–5 ml/min bei 4 °C auf eine 6-ml-Ni-NTA-Säule gepumpt, die in 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol enthaltendem 20 mM Hepes-Puffer, pH 7,4, äquilibriert war. Nach der Beladung wurde die Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen und das Protein mit 0,25 M Imidazol enthaltendem Äquilibrierungspuffer eluiert. Das hochgereinigte Protein wird anschließend mit einer G25-Superfine- (Pharmacia) Säule in einen 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4 % Mannit, pH 6,8, enthaltenden Lagerungspuffer entsalzt und bei –80 °C gelagert.
Immunoadhäsin- (Fc enthaltende) Konstrukte von Proteinen werden aus dem konditionierten Medium wie folgt gereinigt. Das konditionierte Medium wird auf eine Protein-A-Säule (Pharmacia) von 5 ml gepumpt, die in 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,8, äquilibriert worden war. Nach der Beladung wird die Säule vor der Elution mit 100 mM Zitronensäure, pH 3,5, eingehend mit Äquilibrierungspuffer gewaschen. Das eluierte Protein wird sofort neutralisiert, indem 1-ml-Fraktionen in 275 ml 1 M Tris-Puffer, pH 9, enthaltende Röhrchen aufgefangen wurden. Das hochgereinigte Protein wird anschließend wie oben für poly-His-markierte Proteine beschrieben in einen Lagerungspuffer entsalzt. Die Homogenität des PRO-Polypeptids kann mittels Polyacrylamidgelen und durch N-terminale Aminosäuresequenzierung mittels Edman-Abbaus und anderen analytischen Verfahren wie gewünscht oder erforderlich ermittelt werden.
Beispiel 24: Herstellung von Antikörpern die an PRO-Polypeptide binden
Dieses Beispiel illustriert die Herstellung monoklonaler Antikörper, die spezifisch an ein PRO-Polypeptid binden können.
Techniken zur Herstellung monoklonaler Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden beispielsweise in Goding, s.o., beschrieben. Immunogene, die eingesetzt werden können, umfassen gereinigtes PRO-Polypeptid, das PRO-Polypeptid umfassende Fusionsproteine und Zellen, die das rekombinante PRO-Polypeptid an der Zelloberfläche exprimieren. Die Wahl des Immunogens kann vom Fachkundigen ohne übermäßiges Experimentieren getroffen werden.
Mäuse, wie z.B. Balb/c, werden mit dem in komplettem Freundschen Adjuvans emulgierten PRO-Polypeptid-Immunogen immunisiert und subkutan oder intraperitoneal in einer Menge von 1–100 Mikrogramm injiziert. Alternativ dazu wird das Immunogen in MPL-TDM-Adjuvans (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) emulgiert und in die Hinterpfoten des Tieres injiziert. Die immunisierten Mäuse werden dann 10 bis 20 Tage später mit weiterem, im gewählten Adjuvans emulgiertem Immunogen geboostet. Danach können die Mäuse für mehrere Wochen auch mit weiteren Immunisierungsinjektionen geboostet werden. Serumproben können aus den Mäusen in regelmäßigen Abständen mittels retroorbitaler Blutabnahme erhalten werden, und zwar für das Testen in ELISA-Tests, um Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper nachzuweisen.
Nachdem ein geeigneter Antikörpertiter nachgewiesen worden ist, können die für Antikörper „positiven" Tiere mit einer letzten intravenösen PRO-Polypeptid-Injektion injiziert werden. Drei bis vier Tage später werden die Mäuse getötet und die Milzzellen gewonnen. Die Milzzellen werden dann an eine gewählte Maus-Myelomzelllinie, wie z.B. P3X63AgU.1 (erhältlich von ATCC, Nr. CRL 1597), fusioniert (unter Verwendung von 35 % Polyethylenglykol). Die Fusionen erzeugen Hybridomzellen, die dann in 96-Napf-Gewebekulturplatten ausplattiert werden, die HAT-Medium (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) enthalten, um die Vermehrung von nicht fusionierten Zellen, Myelom-Hybriden und Milzzellen-Hybriden zu hemmen.
Die Hybridomzellen werden in einem ELISA-Test auf Reaktivität gegen das PRO-Polypeptid gescreent. Die Feststellung „positiver" Hybridomzellen, welche die gewünschten monoklonalen Antikörper gegen das PRO-Polypeptid sekretieren, ist auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
Die positiven Hybridomzellen können intraperitoneal in syngenetische Balb/c-Mäuse injiziert werden, um Aszites zu produzieren, welche die monoklonalen Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper enthalten. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in Gewebekulturflaschen oder in Rollflaschen gezüchtet werden. Die Reinigung der in den Aszites produzierten monoklonalen Antikörper kann unter Verwendung von Ammonsulfatpräzipitation, gefolgt von Gelausschlusschromatographie, erzielt werden. Alternativ dazu kann Affinitätschromatographie auf Basis der Bindung von Antikörper an Protein A oder Protein G eingesetzt werden.
Beispiel 25: Chimäre PRO-Polypeptide
PRO-Polypeptide können als chimäre Proteine mit einer oder mehreren zusätzlichen angefügten Polypeptiddomänen exprimiert werden, um die Proteinreinigung zu erleichtern. Derartige die Reinigung erleichternde Domänen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Metallchelatpeptide, wie z.B. Histidin-Tryptophan-Module, die eine Reinigung an immobilisierten Metallen ermöglichen, Protein-A-Domänen, die eine Reinigung an immobilisiertem Immunglobulin ermöglichen, und die im FLAGS^TM-Extensions/Affinitäts-Reinigungssystem (Immunex Corp., Seattle, WA) eingesetzte Domäne. Die Aufnahme einer spaltbaren Linkersequenz, wie z.B. Faktor XA oder Enterokinase (Invitrogen, San Diego, CA), zwischen der Reinigungsdomäne und der PRO-Polypeptidsequenz kann zweckdienlich sein, um die Expression von DNA zu erleichtern, die für das PRO-Polypeptid kodiert.
Beispiel 26: Reinigung von PRO-Polypeptiden unter Verwendung spezifischer Antikörper
Native oder rekombinante PRO-Polypeptide können mit einer Vielzahl von auf dem Gebiet der Proteinreinigung bekannten Standardtechniken gereinigt werden. Beispielsweise wird Pro-PRO-Polypeptid, reifes PRO-Polypeptid oder Prä-PRO-Polypeptid mittels Immunoaffinitätschromatographie unter Verwendung von für das PRO-Polypeptid von Interesse spezifischen Antikörpern gereinigt. Im Allgemeinen wird eine Immunoaffinitätssäule konstruiert, indem der Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper kovalent an ein aktiviertes Chromatographieharz gekoppelt wird.
Polyklonale Immunglobuline werden aus Immunseren entweder durch Präzipitation mit Ammoniumsulfat oder durch Reinigung an immobilisiertem Protein A (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) hergestellt. Auf ähnliche Weise werden monoklonale Antikörper aus Maus-Aszitesflüssigkeit durch Ammonsulfatpräzipitation oder Chromatographie an immobilisiertem Protein A hergestellt. Teilweise gereinigtes Immunglobulin wird kovalent an ein Chromatographieharz, wie z.B. CnBr-aktivierte SEPHAROSE^TM (Pharmacia LKB Biotechnology), gebunden. Der Antikörper wird an das Harz gebunden, das Harz wird blockiert und das derivatisierte Harz nach den Anleitungen des Herstellers gewaschen.
Eine derartige Immunoaffinitätssäule wird bei der Reinigung des PRO-Polypeptids eingesetzt, indem eine Fraktion aus Zellen hergestellt wird, die PRO-Polypeptid in ei ner löslichen Form enthält. Dieses Präparat wird durch Solubilisierung der ganzen Zellen oder einer subzellulären Fraktion über Differenzialzentrifugation durch Zugabe von Detergens oder mittels anderer Verfahren erlangt, die auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannt sind. Alternativ dazu kann ein lösliches PRO-Polypeptid, das eine Signalsequenz enthält, in zweckdienlicher Menge in das Medium, in dem die Zellen gezüchtet werden, sekretiert werden.
Ein Präparat, das lösliches PRO-Polypeptid enthält, wird über eine Immunoaffinitätssäule geschickt und die Säule unter Bedingungen gewaschen, welche die bevorzugte Adsorption von PRO-Polypeptid ermöglichen (z.B. Puffer hoher Ionenstärke in Gegenwart von Detergens). Anschließend wird die Säule unter Bedingungen eluiert, welche die Antikörper/PRO-Polypeptid-Bindung zerstören (z.B. Puffer mit niedrigem pH-Wert, wie z.B. ungefähr pH 2–3, oder eine hohe Konzentration eines Chaotrops, wie z.B. Harnstoff oder Thiocyanat-Ion), und das PRO-Polypeptid aufgefangen.
Beispiel 27: Arzneimittel-Screening
Die Erfindung ist insbesondere für das Screening von Verbindungen durch Verwenden von PRO-Polypeptiden oder Bindungsfragmenten davon in beliebigen einer Vielzahl von Arzneimittel-Screeningtechniken zweckdienlich. Das in einem solchen Test eingesetzte PRO-Polypeptid oder Fragment kann entweder in freier Lösung, an einen festen Träger gebunden, an einer Zelloberfläche aufliegend oder intrazellulär lokalisiert vorliegen. Eines der Arzneimittel-Screeningverfahren setzt eukaryotische oder prokaryotische Wirtszellen ein, die stabil mit rekombinanten Nucleinsäuren transfiziert sind, die das PRO-Polypeptid oder Fragment exprimieren. Arzneimittel werden gegen derartige transformierte Zellen in kompetitiven Bindungstests gescreent. Solche Zellen können entweder in lebensfähiger oder fixierter Form für standardmäßige Bindungstests verwendet werden. Man kann beispielsweise die Bildung von Komplexen zwischen PRO-Polypeptid oder einem Fragment und dem getesteten Mittel messen. Alternativ dazu kann man die vom getesteten Mittel verursachte Ver minderung der Komplexbildung zwischen dem PRO-Polypeptid und seiner Zielzelle oder seinen Zielrezeptoren untersuchen.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung Screeningverfahren für Arzneimittel oder beliebige andere Reagenzien bereit, die eine mit PRO-Polypeptid verbundene Krankheit oder Störung beeinflussen können. Diese Verfahren umfassen das Kontaktieren solch eines Mittels mit einem PRO-Polypeptid oder Fragment davon und das Testen (i) auf das Vorliegen eines Komplexes zwischen dem Mittel und dem PRO-Polypeptid oder Fragment oder (ii) auf das Vorliegen eines Komplexes zwischen dem PRO-Polypeptid oder Fragment und der Zelle mittels Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannt sind. In solchen kompetitiven Bindungstests ist das PRO-Polypeptid oder Fragment typischerweise markiert. Nach geeigneter Inkubation wird freies PRO-Polypeptid oder Fragment von jenem getrennt, das in gebundener Form vorliegt, und die Menge an freier oder nicht komplexierter Markierung ist ein Maß für die Fähigkeit des jeweiligen Mittels, an PRO-Polypeptid zu binden oder den PRO-Polypeptid/Zellkomplex zu stören.
Eine weitere Technik für das Arzneimittel-Screening stellt ein High-throughput-Screening für Verbindungen bereit, die eine passende Bindungsaffinität für ein Polypeptid aufweisen, und wird ausführlich in der am 3. September 1984 veröffentlichten WO 84/03564 beschrieben. Zusammenfassend wird eine große Anzahl von verschiedenen kleinen Peptid-Testverbindungen an einem festen Träger wie z.B. an Kunststoffstiften oder an irgendeiner anderen Oberfläche synthetisiert. Auf ein PRO-Polypeptid angewendet werden die Peptid-Testverbindungen mit PRO-Polypeptid umgesetzt und gewaschen. Gebundenes PRO-Polypeptid wird mittels Verfahren nachgewiesen, die auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannt sind. Gereinigtes PRO-Polypeptid kann zur Verwendung in den oben genannten Arzneimittel-Screeningtechniken auch direkt auf Platten beschichtet werden. Außerdem können nicht-neutralisierende Antikörper verwendet werden, um das Peptid einzufangen und am festen Träger zu immobilisieren.
Diese Erfindung beabsichtigt die Verwendung kompetitiver Arzneimittel-Screeningtests, bei denen neutralisierende Antikörper, die zur Bindung von PRO-Polypeptid fähig sind, spezifisch mit einer Testverbindung um die Bindung an PRO-Polypeptid oder Fragmenten davon konkurrieren. Auf diese Weise können die Antikörper verwendet werden, um die Gegenwart von irgendeinem Peptid nachzuweisen, das eine oder mehrere Antigendeterminanten mit PRO-Polypeptid gemeinsam hat.
Beispiel 28: Rationale Arzneimittelkonstruktion
Das Ziel der rationalen Arzneimittelkonstruktion ist die Produktion von Strukturanaloga biologisch aktiver Polypeptide von Interesse (z.B. eines PRO-Polypeptids) oder kleiner Moleküle, mit denen sie wechselwirken, z.B. Agonisten, Antagonisten oder Inhibitoren. Jedes dieser Beispiele kann verwendet werden, um Arzneimittel zu modellieren, die aktivere oder stabilere Formen des PRO-Polypeptid sind oder welche die Funktion des PRO-Polypeptids in vivo steigern oder stören (vgl. Hodgson, Bio/Technology 9, 19–21 (1991)).
In einem Ansatz wird die dreidimensionale Struktur des PRO-Polypeptids oder eines PRO-Polypeptid-Inhibitor-Komplexes mittels Röntgenkristallographie, mittels Computermodellierung oder am typischsten mittels einer Kombination der beiden Ansätze ermittelt. Die Form sowie Ladung des PRO-Polypeptids müssen bestimmt werden, um die Struktur aufzuklären und um (die) aktive Stelle(n) des Moleküls zu ermitteln. Weniger häufig können brauchbare Informationen bezüglich der Struktur des PRO-Polypeptids durch Modellierung auf Basis der Struktur homologer Proteine erlangt werden. In beiden Fällen wird die maßgebliche Strukturinformation verwendet, um analoge PRO-Polypeptid-ähnliche Moleküle zu konstruieren oder effiziente Inhibitoren zu identifizieren. Zweckdienliche Beispiele rationaler Arzneimittelkonstruktion können Moleküle umfassen, die verbesserte Aktivität oder Stabilität aufweisen, wie von Braxton und Wells, Biochemistry 31, 7796–7801 (1992), gezeigt werden konnte, oder die als Inhibitoren, Agonisten oder Antagonisten nativer Peptide wirken, wie von Athauda et al., J. Biochem. 113, 742–746 (1993), gezeigt werden konnte.
Es ist auch möglich, einen zielspezifischen Antikörper durch einen oben beschriebenen Funktionstest zu isolieren und dann seine Kristallstruktur aufzuklären. Dieser Ansatz liefert im Prinzip einen „Pharmacore", auf den eine anschließende Arzneimittelkonstruktion aufbauen kann. Es ist möglich, die Proteinkristallographie völlig zu umgehen, indem Anti-idiotypische Antikörper (Anti-ids) gegen einen funktionellen, pharmakologisch aktiven Antikörper erzeugt werden. Als Spiegelbild eines Spiegelbilds kann von der Bindungsstelle des Anti-ids erwartet werden, dass er ein Analogon des ursprünglichen Rezeptors ist. Der Anti-id könnten dann verwendet werden, um Peptide von Banken chemisch oder biologisch produzierter Peptide zu identifizieren oder zu isolieren. Die isolierten Peptide würden dann als der „Pharmacore" dienen.
Aufgrund der vorliegenden Erfindung können ausreichende Mengen des PRO-Polypeptids verfügbar gemacht werden, um solche analytische Untersuchungen wie die Röntgenkristallographie durchzuführen. Außerdem stellt die Kenntnis der hierin bereitgestellten Aminosäuresequenz des PRO-Polypeptids eine Orientierung für jene bereit, die Computermodellierungstechniken anstelle der oder zusätzlich zur Röntgenkristallographie einsetzen.
Beispiel 30: In-situ-Hybridisierung
In-situ-Hybridisierung ist eine leistungsfähige und vielseitige Technik zur Detektion und Lokalisierung von Nucleinsäuresequenzen in Zell- oder Gewebepräparaten. Sie kann zweckdienlich sein, um beispielsweise Orte der Genexpression zu identifizieren, die Gewebeverteilung der Transkription zu analysieren, Virusinfektion zu identifizieren und zu lokalisieren, Veränderungen der spezifischen mRNA-Synthese zu verfolgen und die Chromosomenkartierung zu unterstützen.
Die In-situ-Hybridisierung wurde nach einer optimierten Version des Protokolls von Lu und Gillett, Cell Vision 1, 169–176 (1994), unter Verwendung von PCR-erzeugten, ³³P-markierten Ribosonden durchgeführt. Zusammenfassend wurden in Formalin fixierte, in Paraffin eingebettete menschliche Gewebe geschnitten, entparaffinisiert, 15 Minuten lang bei 37 °C in Proteinase K (20 mg/ml) von Protein befreit und für die Insitu-Hybridisierung wie von Lu und Gillett, s.o., beschrieben weiter verarbeitet. Eine [³³P]-UTP-markierte Antisense-Ribosonde wurde aus einem PCR-Produkt erzeugt und bei 55 °C über Nacht hybridisiert. Die Objektträger wurden in Kodak-NTB2-Nuclear-Track-Emulsion eingetaucht und 4 Wochen lang exponiert.
³³P-Ribosonden-Synthese
6,0 μl (125 mCi) ³³P-UTP (Amersham BF 1002, SA < 2.000 Ci/mmol) wurden Speedvac-getrocknet. Jedem Röhrchen, das getrocknetes ³³P-UTP enthielt, wurden die folgenden Bestandteile zugegeben:
2,0 μl 5x Transkriptionspuffer
1,0 μl DTT (100 mM)
2,0 μl NTP-Gemisch (2,5 mM : 10 μ; jeweils 10 mM GTP, CTP und ATP + 10 μl H₂O)
1,0 μl UTP (50 μM)
1,0 μl Rnasin
1,0 μl DNA-Templat (1 μg)
1,0 μl H₂O
1,0 μl RNA-Polymerase (für PCR-Produkte T3 = AS, T7 = S, üblicherweise)
Die Röhrchen wurden bei 37 °C eine Stunde lang inkubiert. Es wurde 1,0 μl RQ1-DNase zugegeben, gefolgt von Inkubation bei 37 °C für 15 Minuten. 90 μl TE (10 mM Tris, pH 7,6/1 mM EDTA, pH 8,0) wurden zugegeben und das Gemisch auf DE81-Papier pipettiert. Die verbleibende Lösung wurde in eine Microcon-50-Ultrafiltrationseinheit gegeben und unter Verwendung von Programm 10 (6 Minuten) zentrifugiert. Die Filtrationseinheit wurde verkehrt auf ein zweites Röhrchen gegeben und unter Verwendung von Programm 2 (3 Minuten) zentrifugiert. Nach einer letzten Zen trifugation zur Gewinnung wurden 100 μl TE zugegeben. 1 μl des Endprodukts wurde auf DE81-Papier pipettiert und in 6 ml Biofluor II gezählt.
Die Sonde wurde an einem TBE/Harnstoff-Gel laufen gelassen. 1–3 μl der Sonde oder 5 μl RNA Mrk III wurden zu 3 μl Beladungspuffer zugegeben. Nach 3-minütigem Erwärmen auf 95 °C wurde das Gel sofort auf Eis gegeben. Die Näpfe des Gels wurden gespült, die Probe aufgeladen und bei 180–250 Volt 45 Minuten lang laufen gelassen. Das Gel wurde in Saranfolie eingewickelt und einem XAR-Film mit einer Verstärkungsfolie eine Stunde lang oder über Nacht bei –70 °C in einem Gefrierschrank exponiert.
³³P-Hybridisierung
A. Vorbehandlung gefrorener Schnitte
Die Objektträger wurden aus dem Gefrierschrank entfernt, auf Aluminiumschalen gegeben und bei Raumtemperatur 5 Minuten lang aufgetaut. Die Schalen wurden fünf Minuten lang bei 55 °C in einen Inkubator gestellt, um eine Kondensation zu vermindern. Die Objektträger wurden 10 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd auf Eis in einem Anzug fixiert und in 0,5 × SSC 5 Minuten lang bei Raumtemperatur gewaschen (25 ml 20 × SSC + 975 ml SQ-H₂O). Nach Proteinentfernung in 0,5 μg/ml Proteinase K 10 Minuten lang bei 37 °C (12,5 μl der Stammlösung von 10 mg/ml in 250 ml vorgewärmtem RNase-freiem RNase-Puffer) wurden die Schnitte in 0,5 × SSC 10 Minuten lang bei Raumtemperatur gewaschen. Die Schnitte wurden in 70 %, 95 %, 100 % Ethanol jeweils 2 Minuten lang entwässert.
B. Vorbehandlung von in Paraffin eingebetteten Schnitten
Die Objektträger wurden entparaffinisiert, in SQ-H₂O gegeben und zweimal in 2 × SSC bei Raumtemperatur je 5 Minuten lang gewaschen. Die Schnitte wurden in 20 μl/ml Proteinase K (500 μl von 10 mg/ml in 250 ml RNase-freiem RNase-Puffer; 37 °C, 15 Minuten) (menschlicher Embryo) oder 8 × Proteinase K (100 μl in 250 ml RNase-Puffer, 37 °C, 30 Minuten) (Formalin-Gewebe) von Protein befreit. Anschließendes Waschen in 0,5 × SSC und Entwässerung wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
C. Vorhybridisierung
Die Objektträger wurden in einer Kunststoffbox ausgelegt, die mit Box-Puffer- (4 × SSC, 50 % Formamid) gesättigtem Filterpapier ausgekleidet war. Das Gewebe wurde mit 50 μl Hybridisierungspuffer (3,75 g Dextransulfat + 6 ml SQ-H₂O) bedeckt, mittels Vortex gemischt und in der Mikrowelle 2 Minuten lang mit gelockerter Kappe erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Eis wurden 18,75 ml Formamid, 3,75 ml 20 × SSC und 9 ml SQ-H₂O zugegeben, das Gewebe wurde mittels Vortex gut gemischt und bei 42 °C 1–4 Stunden lang inkubiert.
D. Hybridisierung
1,0 × 10⁶ cpm Sonde und 1,0 μl tRNA (50 mg/ml Stammlösung) je Objektträger wurden 3 Minuten lang bei 95 °C erhitzt. Die Objektträger wurden auf Eis abgekühlt, und es wurden 48 μl Hybridisierungspuffer je Objektträger zugegeben. Nach dem Vortexen wurden 50 μl ³³P-Gemisch zu 50 μl der Vorhybridisierung am Objektträger zugegeben. Die Objektträger wurden über Nacht bei 55 °C inkubiert.
E. Waschungen
Das Waschen wurde 2 × 10 Minuten mit 2 × SSC, EDTA bei Raumtemperatur durchgeführt (400 ml 20 × SSC + 16 ml 0,25 M EDTA, V_f = 4 l), gefolgt von RNaseA-Behandlung bei 37 °C 30 Minuten lang (500 μl von 10 mg/ml in 250 ml Rnase-Puffer = 20 μg/ml). Die Objektträger wurden 2 × 10 Minuten mit 2 × SSC, EDTA bei Raumtemperatur gewaschen. Die Stringenz der Waschbedingungen war wie folgt: 2 Stunden bei 55 °C, 0,1 × SSC, EDTA (20 ml 20 × SSC + 16 ml EDTA, V_f = 4 l).
F. Oligonucleotide
Eine In-situ-Analyse wurde an verschiedenen hierin offenbarten DNA-Sequenzen durchgeführt. Die für diese Analysen verwendeten Oligonucleotide waren wie folgt.
DNA35917-1207 (PRO243)
G. Ergebnisse
Eine In-situ-Analyse wurde an verschiedenen hierin offenbarten DNA-Sequenzen durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Analysen waren wie folgt.
DNA35917-1207 (PRO243)
Das Cornelia-de-Lange-Syndrom (CDL) ist ein kongenitales Syndrom. D.h. es ist angeboren. CDL ist eine Störung, die eine Verzögerung der physikalischen, intellektuellen und sprachlichen Entwicklung verursacht. Die meisten Kinder mit CDL sind geistig unterentwickelt, wobei der Grad der geistigen Unterentwicklung von leicht bis schwer reicht. Angegeben werden IQs von 30 bis 85. Der Durchschnitt liegt bei 53. Die Kopf- und Gesichtseigenschaften umfassen geringe Kopfgröße, dünne Augenbrauen, die oft in der Mitte zusammengewachsen sind, lange Wimpern, kurze, nach oben gerichtete Nase, dünne, nach unten gezogene Lippen, tief angesetzte Ohren und hoher Gaumen oder Wolfsrachen. Weitere Merkmale können verzögerte Sprachentwicklung, die auch bei den leichtesten Fällen auftreten kann, Wachstumsverzögerung und kleiner Wuchs, tiefe Stimme, kleine Hände und Füße, eingekrümmter fünfter Finger, Vierfingerfurche und starke Körperbehaarung sein. Die Diagnose hängt von der Gegenwart einer Kombination aus diesen Merkmalen ab. Viele dieser Merkmale scheinen in unterschiedlichen Graden auf. In manchen Fällen sind diese Merkmale auch gar nicht vorhanden oder nur so leicht, dass sie nur erkannt werden, wenn sie von einem ausgebildeten Genetiker oder einer anderen, mit dem Syndrom vertrauten Person untersucht werden. Obwohl viel über CDL bekannt ist, lassen neuere Berichte vermuten, dass es noch viel zu lernen gibt.
In diese Untersuchung wurden weitere Abschnitte von menschlichen fötalen Gesichtern, Köpfen, Extremitäten und Mäuseembryos untersucht. In den Mäusegeweben war keine Expression erkennbar. Nur in den Antisensesonden trat Expression auf.
Eine Expression wurde neben sich entwickelnden Extremitäten- und Gesichtsknochen im perostealen Mesenchym beobachtet. Die Expression war äußerst spezifisch und befand sich oft neben Bereichen, die eine Vaskularisierung durchliefen. Die Verteilung stimmte mit den beobachteten Skelettanomalien des Cornelia-de-Lange-Syndroms überein. Eine Expression wurde auch in sich enwickelndem Schläfen- und Hinterhauptslappen des fötalen Gehirns beobachtet, sonst aber nirgends. Darüber hinaus wurde Expression in den Ganglien des sich entwickelnden Innenohrs entdeckt; die Bedeutung dieser Erkenntnis ist unklar.
Obwohl diese Daten keine funktionellen Informationen bereitstellen, stimmt die Verteilung mit den Stellen überein, von denen bekannt ist, dass sie von diesem Syndrom am stärksten betroffen sind.
Darüber hinaus wurde eine leichte Expression an der Spaltlinie des sich entwickelnden Synovialgelenks zwischen dem Femurkopf und dem Azetabulum (Hüftgelenk) beobachtet. Wenn dieses Expressionsmuster an anderen Gelenksbildungsstellen aufträte, könnte es die Gesichts- und Extremitätenanomalien des Cornelia-de-Lange-Syndroms erklären.
Beispiel 31: Aktivität von PRO243-mRNA in Xenopus-Oocyten
Um zu zeigen, dass der menschliche Chordin-Klon (DNA35917-1207), der für PRO243 kodiert, funktionell ist und auf eine Weise agiert, die durch die Xenopus-Chordin- und Drosophila-sog-Gene vorhergesagt werden, wurde supergeknäuelte Plasmid-DNA von DNA35917-1207 von Qiagen hergestellt und zur Injektion in einen Xenopus-laevis-Embryo verwendet. Die Mikroinjektion von Xenopus-Chordin-mRNA in ventrovegetale Blastomere induziert sekundäre (Zwillings-) Achsen (Sasai et al., Cell 79, 779–790 (1994)), und Drosophila-sog induziert ebenfalls eine sekundäre Achse, wenn auf der ventralen Seite des Xenopus-Embryos ektopisch exprimiert (Holley et al., Nature 376, 249–253 (1995) und Schmidt et al., Development 121, 4319–4328 (1995)). Die Fähigkeit von sog, in Xenopus-Oocyten zu funktionieren, lässt vermuten, dass die in dorsoventraler Strukturierung involvierten Prozesse während der Evolution konserviert wurden.
Verfahren
Manipulation von Xenopus-Embryos:
Adulten weiblichen Fröschen wurden vor ihrer Verwendung mit 200 I.E. Serum einer trächtigen Stute und in der Nacht vor der Injektion 800 I.E. menschliches Choriongonadotropin verabreicht. Am nächsten Morgen wurden frische Oocyten aus den weiblichen Fröschen herausgepresst, und durch Mischen der Oocyten mit zerkleinerten Testis von getöteten männlichen Fröschen wurde eine In-vitro-Fertilisation von Oocyten durchgeführt. Sich entwickelnde Embryos wurden gemäß Nieuwkoop und Faber, Normal Table of Xenopus laevis, N.-H. P. Co., Hrsg., Amsterdam (1967), gehalten und bereitgestellt.
Befruchtete Eier wurden mit 2 % Cystein (pH 7,8) 10 Minuten lang gereinigt, einmal mit destilliertem Wasser gewaschen und in 0,1 × MBS mit 5 % Ficoll transferiert. Befruchtete Einer wurden dann auf Injektionsplatten in 0,1 × MBS mit 5 % Ficoll platziert. In sich im zweizelligen Stadium befindliche Xenopus-Embryos wurden 200 pg pRK5, das Chordin der Wildform (DNA35917-1207) enthielt, oder 200 pg pRK5 ohne Insert als Kontrolle injiziert. Beimpfte Embryos wurden weitere 6 Stunden auf der Platte gelassen, wonach sie in 0,1 × MBS mit 50 mg/ml Gentamycin transferiert wurden, bis sie das Nieuwkoop-Stadium 37-38 erreichten.
Ergebnisse
Die Injektion von menschlicher Chordin-cDNA in einzelne Blastomere führte zur Ventralisierung der Kaulquappe. Die Ventralisierung der Kaulquappe ist an der Verkürzung und Knickung des Schwanzes und der Expansion der Zementdrüse erkennbar. Die Fähigkeit von menschlichem Chordin, in Xenopus als Ventralisierungsmittel zu agieren, zeigt, dass das durch DNA35917-1207 kodierte Protein funktionell ist und sich auf die dorsal-ventrale Strukturierung in Fröschen auswirkt, was vermuten lässt, dass die in der dorsal-ventralen Strukturierung involvierten Prozesse während der Evolution konserviert wurden, wobei Menschen, Fliegen und Frösche gemeinsame Mechanismen aufweisen.
Hinterlegung von Material
Die folgenden Materialien sind bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA, (ATCC) hinterlegt worden:
Diese Hinterlegung wurde unter den Bestimmungen des „Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and the Regulations thereunder" (Budapest-Übereinkommen) durchgeführt. Dies garantiert die Erhaltung einer lebensfähigen Kultur der Hinterlegung für 30 Jahre vom Datum der Hinterlegung. Die Hinterlegungen werden von ATCC unter den Bedingungen des Budapest-Übereinkommens zur Verfügung gestellt und unterliegen einer Vereinbarung zwischen Genentech Inc. und ATCC, was die ständige und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Kultur der Hinterlegung für die Öffentlichkeit bei Erteilung des einschlägigen US-Patents oder bei Offenlegung irgendeiner US- oder ausländischen Patentanmeldung gewährleistet, was auch immer als erstes eintrifft, und stellt die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft für jemanden, der vom US-Bevollmächtigten für Patente und Warenzeichen gemäß 35 USC § 122 und der dazu lautenden Regel des Bevollmächtigten dazu ermächtigt wird, sicher (einschließlich 37 CFR § 1.14 mit besonderer Bezugnahme auf 886 OG 638).
Der Abtretungsempfänger der vorliegenden Anmeldung hat zugestimmt, dass die Materialien, falls eine Kultur der hinterlegten Materialien bei Kultivierung unter geeigneten Bedingungen abstirbt, verloren geht oder zerstört werden sollte, bei Benachrichtigung unverzüglich durch andere derselben ersetzt werden. Die Verfügbarkeit der hinterlegten Materialien ist nicht als Erlaubnis auszulegen, die Erfindung entgegen der unter der Amtsgewalt einer beliebigen Regierung gemäß ihrer Patentrechte gewährten Rechte praktisch umzusetzen.
Die obige Beschreibung wird als hinreichend betrachtet, um Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung die Umsetzung der Erfindung zu ermöglichen. Der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung ist durch das hinterlegte Konstrukt nicht eingeschränkt, da die hinterlegte Ausführungsform lediglich als Veranschaulichung bestimmter Aspekte der Erfindung beabsichtigt ist. Die Hinterlegung von Material hierin stellt kein Eingeständnis dar, dass die hierin enthaltene Beschreibung die Umsetzung eines beliebigen Aspekts der Erfindung, einschließlich der bevorzugten Ausführungsform, nicht ermöglicht, noch dient sie zur Einschränkung des Schutzumfangs der Ansprüche auf die spezifischen Veranschaulichungen, die sie darstellt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte Nucleinsäure, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, welche zumindest 80 % Sequenzidentität mit der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) aufweist, oder deren Komplement, worin die Sequenzidentität über die volle Länge der verglichenen Sequenzen bestimmt wird.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, worin der Grad der Identität zumindest 90 % beträgt.
Nucleinsäure nach Anspruch 2, worin der Grad der Identität zumindest 95 % beträgt.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, die für ein Polypeptid kodiert, das die in 2 gezeigte Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) umfasst.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, worin die Nucleotidsequenz die Kodierungssequenz der in 1 gezeigten Sequenz (Seq.-ID Nr. 1), oder deren Komplements, in voller Länge umfasst.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, worin die Nucleotidsequenz die in 1 gezeigte Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 1) oder deren Komplement umfasst.
Isolierte Nucleinsäure mit zumindest 80 % Sequenzidentität mit einer Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das die in 2 gezeigte Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) umfasst, oder mit deren Komplement, worin die Sequenzidentität über die volle Länge der verglichenen Sequenzen bestimmt wird.
Isolierte Nucleinsäure, welche die Kodierungssequenz des Nucleinsäureinserts (DNA 35917-1207) mit der Zugriffsnummer ATCC 209508 in voller Länge umfasst.
Vektor, umfassend Nucleinsäure nach einem der vorangegangenen Ansprüche.
Vektor nach Anspruch 9, der mit Kontrollsequenzen operabel verbunden ist, die von einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle erkannt werden.
Wirtszelle, umfassend einen Vektor nach Anspruch 9 oder Anspruch 10.
Wirtszelle nach Anspruch 11, worin die Zelle eine CHO-Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 11, worin die Zelle E. coli ist.
Wirtszelle nach Anspruch 11, worin die Zelle eine Hefezelle ist.
Verfahren zur Produktion eines Polypeptids, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 11 bis 14 unter Bedingungen, die zur Expression des Polypeptids geeignet sind, und Gewinnen des Polypeptids aus der Zellkultur.
Isoliertes Polypeptid mit zumindest 80 % Sequenzidentität mit der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2), worin die Sequenzidentität über die volle Länge der verglichenen Sequenzen bestimmt wird.
Polypeptid nach Anspruch 16, das aus der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) besteht.
Isoliertes Polypeptid mit zumindest 80 % Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz, für welche die Kodierungssequenz voller Länge des Nucleinsäureinserts (DNA 35917-1207) mit der Zugriffsnummer ATCC 209508 kodiert, worin die Sequenzidentität über die volle Länge der verglichenen Sequenzen bestimmt wird.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 18, das aus der Aminosäuresequenz besteht, für welches die Kodierungssequenz voller Länge des Nucleinsäureinserts (DNA 35917-1207) mit der Zugriffsnummer ATCC 209508 kodiert.
Polypeptid nach Anspruch 16 oder 18, worin der Grad der Identität zumindest 90 % beträgt.
Polypeptid nach Anspruch 20, worin der Grad der Identität zumindest 95 % beträgt.
Chimäres Molekül, umfassend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 16 bis 21, das an eine heterologe Aminosäuresequenz fusioniert ist.
Chimäres Molekül nach Anspruch 22, worin die heterologe Aminosäuresequenz eine Epitopmarkierungssequenz ist.
Chimäres Molekül nach Anspruch 22, worin die heterologe Aminosäuresequenz eine Fc-Region eines Immunglobulins ist.