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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die Identifikation
und Isolation von neuer DNA und die rekombinante Produktion neuer
Polypeptide.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Extrazelluläre Proteine
spielen wichtige Rollen bei u.a. der Bildung, Differenzierung und
Erhaltung multizellulärer
Organismen. Die Bestimmung zahlreicher einzelner Zellen, z.B. Proliferation,
Migration, Differenzierung oder Wechselwirkung mit anderen Zellen,
ist typischerweise durch Information gesteuert, die aus anderen
Zellen und/oder aus der unmittelbaren Umgebung erhalten wird. Diese
Information wird häufig
von sekretierten Polypeptiden (beispielsweise von mitogenen Faktoren, Überlebensfaktoren,
zytotoxischen Faktoren, Differenzierungsfaktoren, Neuropeptiden
und Hormonen) übertragen,
die wiederum von verschiedenen Zellrezeptoren oder membrangebundenen
Proteinen erhalten und interpretiert werden. Diese sekretierten
Polypeptide oder signalisierenden Moleküle durchwandern normalerweise
den zellulären
Sekretionsstoffwechselweg, um ihre Wirkungsstelle in der extrazellulären Umgebung
zu erreichen.
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Sekretierte
Proteine haben verschiedene gewerbliche Anwendungsgebiete, einschließlich als
Pharmazeutika, Diagnostika, Biosensoren und Bioreaktoren. Die meisten
Proteinwirkstoffe, die zur Zeit erhältlich sind, wie z.B. thrombolytische
Mittel, Interferone, Interleukine, Erythroproteine, koloniestimulierende
Faktoren und verschiedene andere Cytokine, sind Sekretionsproteine.
Ihre Rezeptoren, die Membranproteine sind, haben auch Potential
als therapeutische oder diagnostische Mittel. Sowohl die Industrie
als auch die Forschung unternahmen Bemühungen, neue native sekretierte
Proteine zu identifizierten. Zahlreiche Bemühungen fokussierten sich auf
das Screenen von rekombinanten Säugetier-DNA-Bibliotheken,
um die Kodiersequenzen für neue
sekretierte Proteine zu identifizieren. Beispiele für Screeningverfahren
und -techniken werden in der Literatur beschrieben [siehe beispielsweise
Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 7108-7113 (1996); US-Patent Nr.
5.536.637].
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Membran-gebundene
Proteine und Rezeptoren können
wichtige Rollen bei u.a. der Bildung, Differenzierung und Erhaltung
multizellulärer
Organismen spielen. Die Bestimmung zahlreicher einzelner Zellen,
z.B. Proliferation, Migration, Differenzierung oder Wechselwirkung
mit anderen Zellen, ist typischerweise durch Information gesteuert,
die aus anderen Zellen und/oder aus der unmittelbaren Umgebung erhalten
wird. Diese Information wird häufig
von sekretierten Polypeptiden (beispielsweise von mitogenen Faktoren, Überlebensfaktoren,
zytotoxischen Faktoren, Differenzierungsfaktoren, Neuropeptiden
und Hormonen) übertragen,
die wiederum von verschiedenen Zellrezeptoren oder membrangebundenen
Proteinen erhalten und interpretiert werden. Solche membrangebundenen
Proteine und Zellrezeptoren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf,
Zytokinrezeptoren, Rezeptorkinasen, Rezeptorphosphatasen, Rezeptoren,
die in Zell-Zell-Wechselwirkungen eingebunden sind, und zelluläre Adhäsinmoleküle wie Selektine
und Integrine. Beispielsweise wird Transduktion von Signalen, die
Zellwachstum und -differenzierung regulieren, teilweise durch Phosphorylierung
verschiedener zellulärer
Proteine reguliert. Proteintyrosinkinasen, Enzyme, die diesen Vorgang
katalysieren, können
ebenfalls als Wachstumsfaktorrezeptoren wirken. Beispielsweise umfassen
Fibroblastenwachstumsfaktorrezeptor und Nervenwachstumsfaktorrezeptor.
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Membrangebundene
Proteine und Rezeptormoleküle
haben mehrere verschiedene gewerbliche Anwendungsgebiete, einschließlich als
pharmazeutische und diagnostische Mittel. Rezeptorimmunoadhäsine beispielsweise
können
als therapeutische Mittel verwendet werden, um Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen
zu blockieren. Die membrangebundenen Proteine können auch zum Screenen von
potenziellen Peptid- oder
niedermolekularen Inhibitoren der relevanten Rezeptor-Liganden-Wechselwirkung
verwendet werden.
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Sowohl
Industrie als auch Forschung haben Bemühungen angestrengt, um neue
native Rezeptor- oder membrangebundene Proteine zu identifizieren.
Zahlreiche Bemühungen
fokussierten sich auf das Screenen von rekombinanten Säugetier-DNA-Bibliotheken zur
Identifikation der Kodiersequenzen für neue Rezeptor- oder membrangebundene
Proteine.
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PRO1800
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Hep27-Protein
wird im Nucleus von menschlichen Hepatoblastomzellen (HepG2-Zellen) synthetisiert und
akkumuliert, nachdem Wachstum durch Butyratbehandlung angehalten
wurde (Gabrielli et al., Eur. J. Biochem. 232, 473-477 (1995)).
Die Synthese von Hep27 wird in Zellen inhibiert, die, freigesetzt
aus der Butyratblockierung, DNA-Synthese wieder aufgenommen haben.
Die Hep27-Proteinsequenz zeigt signifikante Homologie zur bekannten
kurzkettigen Alkoholdehydrogenase- (SCAD) Proteinfamilie, und es
wurde vorgeschlagen, dass Hep27 ein neues Mitglied der SCAD-Proteinfamilie ist.
In Übereinstimmung
mit seiner Kernanordnung weist Hep27 eine Region auf, die jener
der zweiteiligen, auf den Kern zielenden Sequenz ähnlich ist,
und Hep27-mRNA-Expression und -Proteinsynthese lassen auf die Existenz
einer Regulierung auf posttranskriptionaler Ebene schließen.
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Die
Erfinder beschreiben hierin die Identifikation und Charakterisierung
neuer Polypeptide, die Homologie zu Hep27-Protein aufweisen und
hierin als PRO1800-Polypeptide
bezeichnet werden.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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PRO1800
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Ein
cDNA-Klon (DNA 35672-2508) wurde identifiziert, der zur Nucleinsäure, die
für Hep27-Protein
kodiert, Homologie aufweist und für ein neues Polypeptid, das
in der vorliegenden Anmeldung als "PRO1800" bezeichnet wird, kodiert.
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In
einer Ausführungsform
stellt die Erfindung wie in den Ansprüchen definiert ein isoliertes
Nucleinsäuremolekül bereit,
das DNA umfasst, die für
ein PRO1800-Polypeptid
kodiert.
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In
einem Aspekt, wie in den Ansprüchen
definiert, betrifft die Erfindung einen Vektor, der ein isoliertes Nucleinsäuremolekül umfasst,
das (a) DNA umfasst, die für
ein Po lypeptid kodiert, das zumindest 97 % bzw. 99 % Sequenzidentität mit der
Sequenz der Aminosäurereste
1 bis 278, Grenzen eingeschlossen, oder 16 bis 278, Grenzen eingeschlossen,
aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) oder (b) das Komplement der
DNA aus (a) umfasst.
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In
einem spezifischen Aspekt stellt die Erfindung einen Vektor, der
ein isoliertes Nucleinsäuremolekül umfasst,
bereit, das DNA umfasst, die für
ein PRO1800-Polypeptid kodiert, mit oder ohne die N-terminate Signalsequenz
und/oder das initiierende Methionin, oder die zu solch einem kodierenden
Nucleinsäuremolekül komplementär ist. Das
Signalpeptid wurde vorläufig
als eines identifiziert, das sich von Aminosäureposition 1 bis etwa zu Aminosäureposition
15 in der Sequenz aus 2 (Seq.-ID Nr.2) erstreckt.
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In
einer anderen Ausführungsform
stellt die Erfindung wie in den Ansprüchen definiert isoliertes PRO1800-Polypeptid
bereit, für
das jede beliebige der hierin zuvor definierten isolierten Nucleinsäuresequenzen
kodiert.
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In
einem spezifischen Aspekt stellt die Erfindung isoliertes Nativsequenz-PRO1800-Polypeptid bereit, das
in bestimmten Ausführungsformen
eine Aminosäuresequenz
umfasst, die die Reste 1 oder 16 bis 278 aus 2 (Seq.-ID
Nr. 2) umfasst.
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In
einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes PRO1800-Polypeptid,
umfassend eine Aminosäuresequenz
mit zumindest 97 % bzw. 99 % Sequenzidentität mit der Sequenz der Aminosäurereste von
1 bis 278, Grenzen eingeschlossen, oder 16 bis 278, Grenzen eingeschlossen,
aus 2 (Seq.-ID Nr. 2).
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In
wiederum einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes
PRO1800-Polypeptid,
umfassend die Sequenz der Aminosäurereste
1 oder etwa 16 bis etwa 278, Grenzen eingeschlossen, aus 2 (Seq.-ID
Nr. 2).
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Zusätzliche
Ausführungsformen
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In
anderen Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung werden auch Wirtszellen bereitgestellt,
die die Vektoren der Erfindung umfassen. Beispielsweise können die
Wirtszellen CHO-Zellen, E. coli oder Hefe sein. Weiters wird ein
Verfahren zur Herstellung eines jeden beliebigen der hierin beschriebenen
Polypeptide bereitgestellt und umfasst das Kultivieren von Wirtszellen
unter Bedingungen, die zur Expression des erwünschten Polypeptids geeignet
sind, und die Gewinnung des erwünschten
Polypeptids aus der Zellkultur.
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In
anderen Ausführungsformen
stellt die Erfindung Hybridmoleküle
bereit, die jedes beliebige der hierin beschriebenen Polypeptide,
fusioniert an ein heterologes Polypeptid oder Aminosäuresequenz,
umfassen. Beispiele für
solche Hybridmoleküle
umfassen jedes der hierin beschriebenen Polypeptide, fusioniert
an eine Epitopmarkierungssequenz oder eine Fc-Region eines Immunglobulins.
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In
anderen Aspekten umfasst das isolierte Nucleinsäuremolekül eine Nucleotidsequenz mit
zumindest 99 % Sequenzidentität
mit (a) einem DNA-Molekül,
das die Kodiersequenz für
eine PRO-Polypeptid-cDNA voller Länge, wie in 1 (Seq.-ID
Nr. 1) offenbart, oder die Kodiersequenz eines PRO-Polypeptids,
dem das Signalpeptid fehlt, wie in 1 (Seq.-ID
Nr. 1) offenbart, oder (b) dem Komplement des DNA-Moleküls aus (a).
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In
einer anderen Ausführungsform
stellt die Erfindung isoliertes PRO-Polypeptid bereit, für das jede beliebige
der hierin zuvor definierten isolierten Nucleinsäuresequenzen kodiert.
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In
einem bestimmten Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes PRO-Polypeptid,
umfassend eine Aminosäuresequenz
mit zumindest 97 % Sequenzidentität bzw. 99 % Sequenzidentität mit einem
PRO-Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz
voller Länge
wie hierin offenbart oder einer Aminosäuresequenz, der das Signalpeptid,
wie hierin offenbart, fehlt.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes PRO-Polypeptid,
umfassend eine Aminosäuresequenz
mit zumindest 97 % Sequenzidentität bzw. 99 % Sequenzidentität mit der
Volllängen-
oder reifen Aminosäuresequenz,
für die
die menschliche Protein-cDNA kodiert, die bei der ATCC unter der
Zugriffsnummer 203538 hinterlegt ist.
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In
einem spezifischen Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes PRO-Polypeptid
ohne die N-terminale Signalsequenz und/oder das initiierende Methionin
bereit, für
das eine Nucleotidsequenz kodiert, die für eine Aminosäuresequenz
wie hierin zuvor beschrieben kodiert. Verfahren zur Herstellung
derselben werden hierin ebenfalls beschrieben, worin solche Verfahren
das Kultivieren einer Wirtszelle, die einen Vektor umfasst, der das
geeignete kodierende Nucleinsäuremolekül umfasst,
unter zur Expression des PRO-Polypeptids geeigneten Bedingungen
und das Gewinnen des PRO-Polypeptids aus der Zellkultur umfassen.
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Auch
hierin offenbart wird eine Zusammensetzung, die ein PRO-Polypeptid
oder einen Agonisten oder Antagonisten eines PRO-Polypeptids wie
hierin beschrieben oder einen Anti-PRO-Antikörper in Kombination mit einem
Träger
umfasst. Gegebenenfalls ist der Träger ein pharmazeutisch annehmbarer
Träger.
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Auch
hierin offenbart wird die Verwendung eines PRO-Polypeptids oder
eines Agonisten oder Antagonisten davon wie hierin beschrieben oder
eines Anti-PRO-Antikörpers zur
Herstellung eines Medikaments, das zur Behandlung eines Leidens
nützlich
ist, das auf das PRO-Polypeptid, einen Agonisten oder Antagonisten davon
oder einen Anti-PRO-Antikörper
reagiert.
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KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
eine Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 1) einer Nativsequenz-PRO1800-cDNA, worin Seq.-ID Nr.
1 ein Klon ist, der hierin als "DNA35672-2508" bezeichnet wird.
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2 zeigt
die Aminosäuresequenz
(Seq.-ID Nr. 2), die von der Kodiersequenz aus der in 1 gezeigten
Seq.-ID Nr. 1 abgeleitet ist.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Definitionen
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Die
Bezeichnungen "PRO-Polypeptid" und "PRO" wie hierin verwendet,
und sofern ihr unmittelbar eine Nummernkennzeichnung folgt, beziehen
sich auf verschiedene Polypeptide, wobei sich die vollständige Bezeichnung
(d.h. PRO/Nummer) auf spezifische Polypeptidsequenzen wie hierin
beschrieben beziehen. Die Bezeichnungen "PRO/Nummer-Polypeptid" und "PRO/Nummer", worin die Bezeichnung "Nummer" hierin als eine
tatsächliche
numerische Benennung bereitgestellt wird, umfassen Nativsequenzpolypeptide
und Polypeptidvarianten (die hierin noch näher definiert werden). Die
hierin beschriebenen PRO-Polypeptide können aus zahlreichen verschiedenen
Quellen isoliert werden, wie z.B. aus menschlichen Gewebetypen oder
aus einer anderen Quelle, oder können
durch Rekombinations- oder Syntheseverfahren hergestellt werden.
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Ein "Nativsequenz-PRO-Polypeptid" umfasst ein Polypeptid
mit derselben Aminosäuresequenz
wie das entsprechende, aus der Natur gewonnene PRO-Polypeptid. Solche
Nativsequenz-PRO-Polypeptide können
aus natürlichen
Quellen isoliert werden oder können
mittels Rekombinations- oder Syntheseverfahren hergestellt werden.
Die Bezeichnung "Nativsequenz-PRO-Polypeptid" umfasst insbesondere
natürlich
vorkommende, trunkierte oder sekretierte Formen des spezifischen
PRO-Polypeptids (z.B. eine extrazelluläre Domänensequenz), natürlich vorkommende
Varianten (z.B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich vorkommende
Allelvarianten des Polypeptids. In verschiedenen Ausführungsformen
der Erfindung sind die hierin offenbarten Nativsequenz-PRO-Polypeptide
reife oder Volllängen-Nativsequenz-Polypeptide,
welche die in den beiliegenden Figuren gezeigten Volllängen-Aminosäuresequenzen
umfassen. Start- und Stoppcodons sind in den Figuren fettgedruckt
und unterstrichen. Während
jedoch die PRO-Polypeptide, die in den beiliegenden Figuren offenbart
sind, als mit Methioninresten beginnend dargestellt sind, die hierin
als Amino säureposition
1 in den Figuren bezeichnet sind, ist es ebenso denkbar und möglich, dass
andere Methioninreste entweder stromauf oder stromab von der Aminosäureposition
1 in den Figuren als die Start-Aminosäurereste für die PRO-Polypeptide verwendet
werden.
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Die "extrazelluläre Domäne" eines PRO-Polypeptids
oder "ECD" bezieht sich auf
eine Form des PRO-Polypeptids, das im Wesentlichen frei von den
transmembranen und zytoplasmatischen Domänen ist. Normalerweise weist
eine PRO-Polypeptid-ECD
weniger als etwa 1 % solcher Transmembran- und/oder zytoplasmatischen
Domänen
und vorzugsweise weniger als 0,5 % solcher Domänen auf. Es gilt zu verstehen,
dass jede transmembrane Domäne,
die für
die PRO-Polypeptide der vorliegenden Erfindung identifiziert werden, gemäß auf dem
Gebiet der Erfindung routinemäßig eingesetzten
Kriterien zur Identifikation dieses Typs hydrophober Domänen identifiziert
werden. Die exakten Grenzen einer transmembranen Domäne können variieren, jedoch
sehr wahrscheinlich nicht um mehr als etwa 5 Aminosäuren an
jedem Ende der Domäne,
wie anfangs hierin definiert wurde. Gegebenenfalls kann daher eine
extrazelluläre
Domäne
eines PRO-Polypeptids etwa 5 oder weniger Aminosäuren an jeder Seite der Grenze
zwischen transmembraner Domäne
und extrazellulärer Domänen wie
in den Beispielen oder der Beschreibung identifiziert enthalten,
und solche Polypeptide, mit oder ohne das assoziierte Signalpeptid,
und Nucleinsäuren,
die für
sie kodieren, werden in der vorliegenden Erfindung bedacht.
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Der
ungefähre
Ort der "Signalpeptide" der verschiedenen
hierin offenbarten PRO-Polypeptide
ist in der vorliegenden Beschreibung und/oder den beiliegenden Figuren
gezeigt. Es gilt jedoch anzumerken, dass die C-terminate Grenze
eines Signalpeptids variieren kann, jedoch sehr wahrscheinlich um
nicht mehr als etwa 5 Aminosäuren
an jeder Seite der C-terminalen Signalpeptidgrenze, wie anfänglich hierin
identifiziert, worin die C-terminale Grenze des Signalpeptids gemäß auf dem
Gebiet der Erfindung zur Identifikation dieses Typs von Aminosäuresequenzelement
routinemäßig eingesetzten
Kriterien identifiziert werden kann (z.B. Nielsen et al., Prot.
Eng. 10, 1-6 (1997), und von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14,
4683-4690 (1986)). Darüber
hinaus ist auch anerkannt, dass in manchen Fällen Spaltung einer Signalsequenz
von einem sekretierten Polypeptid nicht gänzlich gleichförmig stattfindet,
was zu mehr als einer sekretierten Spezies führt. Diese Polypeptide, bei denen
das Signalpeptid innerhalb von nicht mehr als etwa 5 Aminosäuren an
jeder Seite der C-terminalen Grenze des Signalpeptids wie hierin
identifiziert gespaltet wird, und die für sie kodierenden Polynucleotide
werden von der vorliegenden Erfindung behandelt.
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"PRO-Polypeptidvariante" bezeichnet ein aktives
PRO-Polypeptid wie zuvor oder nachstehend definiert mit zumindest
97 % Aminosäuresequenzidentität mit einer
Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz
wie hierin offenbart oder zumindest 99 % Aminosäuresequenzidentität mit einer
PRO-Polypeptidsequenz, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart.
Solche PRO-Polypeptidvarianten umfassen beispielsweise PRO-Polypeptide,
worin ein oder mehrere Aminosäurereste
am N- oder C-Terminus
der nativen Volllängen-Aminosäuresequenz
addiert oder deletiert werden.
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"Prozent- (%) Aminosäuresequenzidentität" in Bezug auf die
hierin identifizierten PRO-Polypeptidsequenzen ist als der Prozentsatz
an Aminosäureresten
in einer Kandidatensequenz definiert, die mit den Aminosäureresten
in der spezifischen PRO-Polypeptidsequenz nach Abgleichen der Sequenzen
und Einführen von
Lücken,
sofern zur Erreichung maximaler prozentueller Sequenzidentität erforderlich,
und ohne Berücksichtigung
irgendwelcher konservativer Substitutionen als Teil der Sequenzidentität identisch
sind. Abgleichen zum Zwecke der Bestimmung der prozentuellen Aminosäuresequenzidentität kann auf
verschiedene Arten erreicht werden, die innerhalb des Gebiets der
Erfindung liegen, beispielsweise unter Verwendung von allgemein erhältlichen
Computerprogrammen wie z.B. BLAST-, BLAST-2-, ALIGN- oder Megalign-Software
(DNASTAR). Fachleute können
geeignete Parameter zur Messung von Abgleichung bestimmen, einschließlich sämtlicher Algorithmen,
die erforderlich sind, um maximale Abgleichung über die volle Länge der
zu vergleichenden Sequenzen zu erreichen. Für die vorliegenden Zwecke jedoch
werden Aminosäuresequenzidentitätswerte
unter Verwendung des Computerprogramms zum Sequenzvergleich ALIGN-2
ermittelt, worin der vollständige
Quellcode für
das ALIGN-2-Programm nachstehend in Tabelle 1 bereitgestellt ist.
Das ALIGN-2- Computerprogramm
zum Sequenzvergleich wurde von Genentech, Inc., entworfen, und der
in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigte Quellcode wurde mit Benutzerunterlagen
im U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, eingereicht, wo
er unter der U.S.-Copyright-Registrierungsnummer TXU510087 registriert
ist. Das ALIGN-2-Programm
ist über
Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornien, öffentlich
erhältlich
oder kann aus dem in der nachstehenden Tabelle 1 bereitgestellten
Quellcode kompiliert werden. Das ALIGN-2-Programm sollte zur Verwendung
auf einem UNIX-Betriebssystem, vorzugsweise digital UNIX V4.0D,
kompiliert werden. Alle Sequenzvergleichsparameter sind durch das
ALIGN-2-Programm festgesetzt und variieren nicht.
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In
Situationen, in denen ALIGN-2 zum Aminosäuresequenzvergleich verwendet
wird, wird die % Aminosäuresequenzidentität einer
bestimmten Aminosäuresequenz
A zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B (was alternativ
auch als eine bestimmte Aminosäuresequenz
A beschrieben werden kann, die eine bestimmte % Aminosäuresequenzidentität zu, mit
oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz
B hat oder umfasst) wie folgt berechnet:
100 mal den Bruch
X/Y
worin X die Anzahl an Aminosäureresten ist, die durch das
Sequenzabgleichungsprogramm ALIGN-2 in dieser Abgleichung des Programms
von A und B als identische Übereinstimmungen
verzeichnet wurden, und Y die Gesamtanzahl an Aminosäureresten
in B ist. Es wird verstanden werden, dass, sofern die Länge der
Aminosäuresequenz
A mit der Länge
der Aminosäuresequenz
B nicht übereinstimmt,
die Aminosäuresequenzidentität von A
zu B nicht gleich der % Aminosäuresequenzidentität von B
zu A ist. Als Beispiele für
% Aminosäuresequenzidentität-Berechnungen
unter Verwendung dieses Verfahrens zeigen Tabelle 2 und 3, wie die
% Aminosäuresequenzidentität der Aminosäuresequenz,
die als "Vergleichsprotein" bezeichnet wird,
zur Aminosäuresequenz,
die als "PRO" bezeichnet wird,
berechnet wird, worin "PRO" für die Aminosäuresequenz
eines hypothetischen PRO-Polypeptids von Interesse steht, "Vergleichsprotein" für die Aminosäuresequenz
eines Polypeptids steht, mit dem das "PRO"-Polypeptid
von Interesse verglichen wird, und "X", "Y" und "Z" jeweils verschiedene
hypothetische Aminosäurereste
darstellen.
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Außer spezifisch
anders festgehalten, werden alle hierin verwendeten % Aminosäuresequenzidentitätswerte
wie im unmittelbar vorangehenden Absatz beschrieben unter Verwendung
des ALIGN-2-Computerprogramms erhalten. % Aminosäuresequenzidentitätswerte
können
jedoch auch wie nachstehend beschrieben unter Verwendung des WU-BLAST-2-Computerprogramms
(Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996)) erhalten
werden. Die meisten der WU-BLAST-2-Suchparameter sind auf Standardwerte
eingestellt. Jene, die nicht auf Standardwerte eingestellt sind,
d.h. die veränderbaren
Parameter, werden mit den folgenden Werten eingestellt: overlap
span = 1, overlap fraction = 0,125, word threshold (T) = 11 und
scoring matrix = BLOSUM62. Wird WU-BLAST-2 verwendet, so wird ein
% Aminosäure-Sequenzidentitätswert durch Teilen
(a) der Anzahl an übereinstimmenden
identischen Aminosäureresten
zwischen der Aminosäuresequenz des
PRO-Polypeptids
von Interesse mit einer Sequenz, die aus dem nativen PRO-Polypeptid
abgeleitet ist, und der Vergleichs-Aminosäuresequenz von Interesse (d.h.
die Sequenz, mit der das PRO-Polypeptid von Interesse verglichen
wird, die eine PRO-Polypeptidvariante
sein kann) wie durch WU-BLAST-2 bestimmt durch (b) die Gesamtzahl
an Aminosäureresten
des PRO-Polypeptids von Interesse bestimmt. Beispielsweise ist in der
Feststellung "ein
Polypeptid, das die Aminosäuresequenz
A umfasst, die zumindest 80 % Aminosäuresequenzidentität mit der
Aminosäuresequenz
B aufweist" die
Aminosäuresequenz
A die Vergleichs-Aminosäuresequenz
von Interesse, und die Aminosäuresequenz
B ist die Aminosäuresequenz
des PRO-Polypeptids
von Interesse.
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Prozent
Aminosäuresequenzidentität kann auch
unter Verwendung des Sequenzvergleichprogramms NCBI-BLAST2 (Altschul
et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402 (1997)) bestimmt werden.
Das NCBI-BLAST2-Sequenzvergleichprogramm kann von der Adresse http://www.ncbi.nlm.nig.gov
heruntergeladen werden. NCBI-BLAST2 verwendet mehrere Suchparameter,
worin alle diese Suchparameter auf Standardwerte eingestellt sind,
einschließlich
beispielsweise unmask = yes, strand = all, ex pected occurrences
= 10, minimum low complexity length = 15/5, multi-pass e-value =
0,01, constant for multi-pass = 25, dropoff for final gapped alignment
= 25 und scoring matrix = BLOSUM62.
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In
Situationen, in denen NCBI-BLAST2 für Aminosäuresequenzvergleiche verwendet
wird, wird die % Aminosäuresequenzidentität einer
bestimmten Aminosäuresequenz
A zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B (was alternativ
auch als eine bestimmte Aminosäuresequenz
A beschrieben werden kann, die eine bestimmte % Aminosäuresequenzidentität zu, mit
oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz
B hat oder umfasst) wie folgt berechnet:
100 mal den Bruch
X/Y
worin X für
die Anzahl an Aminosäureresten
steht, die als identische Übereinstimmungen
des Sequenzabgleichungsprogramms NCBI-BLAST2 in der Programmabgleichung
von A und B verzeichnet werden, und worin Y für die Gesamtzahl an Aminosäureresten
in B steht. Es wird verständlich
sein, dass, sofern die Länge
von Aminosäuresequenz
A nicht der Länge
von Aminosäuresequenz
B entspricht, die % Aminosäuresequenzidentität von A
zu B nicht gleich der % Aminosäuresequenzidentität von B
zu A ist.
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"PRO-Polynucleotidvariante" oder "PRO-Nucleinsäuresequenzvariante" bezeichnet ein Nucleinsäuremolekül, das für ein aktives
PRO-Polypeptid wie nachstehend definiert kodiert und das zumindest
99 % Nucleinsäuresequenzidentität mit einer
Nucleinsäuresequenz
aufweist, die für
eine Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz
wie hierin offenbart oder eine Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz,
der das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, kodiert.
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Varianten
umfassen keine native Nucleotidsequenz.
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"Prozent (%) Nucleinsäuresequenzidentität" in Bezug auf hierin
identifizierte PRO-kodierende
Nulceinsäuresequenzen
ist als der Prozentsatz an Nucleotiden in einer Kandidatensequenz
definiert, die mit den Nucleotiden in der PRO-Nucleinsäuresequenz
von Interesse, nach Abgleichen der Sequenzen und Einführen von Lücken, sofern
zur Erreichung maximaler Prozent-Sequenzidentität erforderlich, identisch sind.
Abgleichung zum Zweck der Bestimmung von Prozent-Nucleinsäuresequenzidentität kann auf
verschiedene Weisen erreicht werden, die in den Bereich des Gebiets
der Erfindung fallen, beispielsweise unter Verwendung öffentlich erhältlicher
Computersoftware wie BLAST, BLAST-2, ALIGN oder Megalign-Software
(DNASTAR). Für
die Zwecke hierin jedoch werden % Nucleinsäuresequenzidentitätswerte
unter Verwendung des Sequenzvergleich-Computerprogramm ALIGN-2 ermittelt,
worin der vollständige
Quellcode für
das ALIGN-2-Programm nachstehend in Tabelle 1 bereitgestellt ist.
Das ALIGN-2-Sequenzvergleich-Computerprogramm wurde von Genentech,
Inc., entwickelt, und der nachstehend in Tabelle 1 gezeigte Quellcode
wurde mit Benutzerunterlagen im U.S. Copyright Office, Washington
D.C., 20559, eingereicht, wo er unter der U.S.-Copyright-Registrierungsnummer
TXU510087 registriert ist. Das ALIGN-2-Programm ist über Genentech,
Inc., South San Francisco, Kalifornien, öffentlich erhältlich oder
kann aus dem in der nachstehenden Tabelle 1 bereitgestellten Quellcode
kompiliert werden. Das ALIGN-2-Programm
sollte zur Verwendung auf einem UNIX-Betriebssystem, vorzugsweise
digital UNIX V4.0D, kompiliert werden. Alle Sequenzvergleichsparameter
sind durch das ALIGN-2-Programm festgesetzt und variieren nicht.
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In
Situationen, in denen ALIGN-2 zum Nucleinsäuresequenzvergleich verwendet
wird, wird die % Nucleinsäuresequenzidentität einer
bestimmten Nucleinsäuresequenz
C zu, mit oder gegen eine bestimmte Nucleinsäuresequenz D (was alternativ
auch als eine bestimmte Nucleinsäuresequenz
C beschrieben werden kann, die eine bestimmte % Nucleinsäuresequenzidentität zu, mit
oder gegen eine bestimmte Nucleinsäuresequenz D hat oder umfasst)
wie folgt berechnet:
100 mal den Bruch W/Z
worin W die
Anzahl an Nucleotiden ist, die als identische Übereinstimmungen durch das
Sequenzabgleichungsprogramm ALIGN-2 in der Programmabgleichung von
C und D verzeichnet sind, und worin Z die Gesamtzahl an Nucleotiden
in D ist. Es wird verstanden werden, dass, sofern die Länge von
Nucleinsäuresequenz
C nicht der Länge
von Nucleinsäuresequenz
D entspricht, die % Nucleinsäuresequenzidentität von C zu
D nicht gleich der % Nucleinsäuresequenzidentität von D
zu C ist. Als Beispiele für
% Nucleinsäuresequenzidentitäts-Berechnungen
zeigen die Tabellen 4 und 5, wie die % Nucleinsäuresequenzidentität der Nucleinsäuresequenz,
die als "Vergleichs-DNA" bezeichnet wird,
zur Nucleinsäuresequenz,
die als "PRO-DNA" bezeichnet ist,
berechnet wird, worin "PRO-DNA" eine hypothetische
PRO-kodierende Nucleinsäuresequenz
von Interesse darstellt, "Vergleichs-DNA" die Nucleotidsequenz
eines Nucleinsäuremoleküls darstellt,
mit dem das "PRO-DNA"-Nucleinsäuremolekül von Interesse
verglichen wird, und "N", "L" und "V" jeweils
verschiedene hypothetische Nucleotide darstellen.
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Außer spezifisch
anders festgehalten, werden alle hierin verwendeten % Nucleinsäuresequenzidentitätswerte
wie im unmittelbar vorangehenden Absatz beschrieben unter Verwendung
des ALIGN-2-Computerprogramms erhalten. % Nucleinsäuresequenzidentitätswerte
können
jedoch auch wie nachstehend beschrieben unter Verwendung des WU-BLAST-2-Computerprogramms
(Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996)) erhalten
werden. Die meisten der WU-BLAST-2-Suchparameter sind auf Standardwerte
eingestellt. Jene, die nicht auf Standardwerte eingestellt sind,
d.h. die veränderbaren
Parameter, werden mit den folgenden Werten eingestellt: overlap
span = 1, overlap fraction = 0,125, word threshold (T) = 11 und
scoring matrix = BLOSUM62. Wird WU-BLAST-2 verwendet, so wird ein
% Nucleinsäure-Sequenzidentitätswert durch Teilen
(a) der Anzahl an übereinstimmenden
identischen Nucleotiden zwischen der Nucleinsäuresequenz des PRO-Polypeptid-kodierenden Nucleinsäuremoleküls von Interesse
mit einer Sequenz, die aus der Nativsequenz-PRO-Polypeptid-kodierenden
Nucleinsäure
abgeleitet ist, und dem Vergleichs-Nucleinsäuremolekül von Interesse (d.h. die Sequenz,
mit der das PRO-Polypeptid-kodierende
Nucleinsäuremolekül von Interesse verglichen
wird, die eine PRO-Polynucleotidvariante sein kann) wie durch WU-BLAST-2
bestimmt durch (b) die Gesamtzahl an Nucleotiden des PRO-Polypeptid-kodierenden
Nucleinsäuremoleküls von Interesse
bestimmt. Beispielsweise ist in der Feststellung "ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das eine
Nucleinsäuresequenz
A umfasst, die zumindest 80 % Nucleinsäuresequenzidentität mit der
Nucleinsäuresequenz
B aufweist" die
Nucleinsäuresequenz
A das Vergleichs-Nucleinsäuremolekül von Interesse,
und die Nucleinsäuresequenz
B ist die Nucleinsäuresequenz
des PRO-Polypeptid-kodierenden Nucleinsäuremoleküls von Interesse.
-
Prozent
Nucleinsäuresequenzidentität kann auch
unter Verwendung des Sequenzvergleichprogramms NCBI-BLAST2 (Altschul
et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402 (1997)) bestimmt werden. Das NCBI-BLAST2-Sequenzvergleichprogramm
kann von der Adresse http://www.ncbi.nlm.nih:gov heruntergeladen werden.
NCBI-BLAST2 verwendet
mehrere Suchparameter, worin alle diese Suchparameter auf Standardwerte
eingestellt sind, einschließlich
beispielsweise unmask = yes, strand = all, expected occurrences
= 10, minimum low complexity length = 15/5, multi-pass e-value = 0,01, constant
for multi-pass = 25, dropoff for final gapped alignment = 25 und
scoring matrix = BLOSUM62.
-
In
Situationen, in denen NCBI-BLAST2 für Sequenzvergleiche verwendet
wird, wird die % Nucleinsäuresequenzidentität einer
bestimmten Nucleinsäuresequenz
C zu, mit oder gegen eine bestimmte Nucleinsäuresequenz D (was alternativ
auch als eine bestimmte Nucleinsäuresequenz
C beschrieben werden kann, die eine bestimmte % Nucleinsäuresequenzidentität zu, mit
oder gegen eine bestimmte Nucleinsäuresequenz D hat oder umfasst)
wie folgt berechnet:
100 mal den Bruch W/Z
worin W für die Anzahl
an Nucleotiden steht, die als identische Übereinstimmungen durch das
Sequenzabgleichprogramm NCBI-BLAST2 in der Programmabgleichung von
C und D verzeichnet wurden, und worin Z für die Gesamtzahl an Nucleotiden
in D steht. Es wird verstanden werden, dass, sofern die Länge von
Nucleinsäuresequenz
C nicht gleich der Länge
von Nucleinsäuresequenz
D ist, die % Nucleinsäuresequenzidentität von C
zu D nicht der % Nucleinsäuresequenzidentität von D
zu C entspricht.
-
In
anderen Ausführungsformen
sind PRO-Polynucleotidvarianten Nucleinsäuremoleküle, die für ein aktives PRO-Polypeptid
kodieren und die in der Lage sind, sich, vorzugsweise unter stringenten
Hybridisierungs- und Waschbedingungen, an Nucleotidsequenzen zu
hybridisieren, die für
ein Volllängen-PRO-Polypeptid
wie hierin offenbart kodieren. PRO-Polypeptidvarianten können jene
sein, für
die eine PRO-Polynucleotidvariante
kodiert.
-
"Isoliert", sofern verwendet,
um die verschiedenen, hierin offenbarten Polypeptide zu beschreiben,
bezeichnet ein Polypeptid, das identifiziert und getrennt und/oder
aus einer Komponente aus seiner natürlichen Umgebung gewonnen wurde.
Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die
typischerweise diagnostische oder therapeutische Verwendungen für das Polypeptid
stören
würden
und können
Enzyme, Hormone und andere proteinhältige oder nicht-proteinhältige Gelöststoffe
einbinden. In bevorzugten Ausführungsformen
wird das Polypeptid (1) bis zu einem ausreichenden Grad gereinigt,
um zumindest 15 Reste von N-terminaler oder innerer Aminosäuresequenz
durch Verwendung eines Zentrifugenröhrchensequenzierers zu erhalten,
oder (2) durch SDS-PAGE unter nichtreduzierenden oder reduzierenden
Bedingungen mittels Coomassie-Blau- oder, vorzugsweise Silberfärbung bis
zur Homogenität
gereinigt. Isoliertes Polypeptid schließt Polypeptid in situ innerhalb
rekombinanter Zellen ein, da zumindest eine Komponente der natürlichen
Umgebung des PRO-Polypeptids nicht vorhanden ist. Üblicherweise
wird isoliertes Polypeptid durch zumindest einen Reinigungsschritt
hergestellt.
-
Eine
für "isoliertes" PRO-Polypeptid kodierende
Nucleinsäure
oder eine für
ein anderes Polypeptid kodierende Nucleinsäure ist ein Nucleinsäuremolekül, das aus
zumindest einem verunreinigenden Nucleinsäuremolekül identifiziert und getrennt
wird, mit dem es normalerweise in der natürlichen Quelle der für das Polypeptid
kodierenden Nucleinsäure
assoziiert ist. Ein für
isoliertes Polypeptid kodierendes Nucleinsäuremolekül liegt in einer anderen Form
oder Beschaffenheit vor als es in der Natur zu finden ist. Für isoliertes
Polypeptid kodierende Nucleinsäuremoleküle werden
daher von dem für
spezifisches Polypeptid kodierendes Nucleinsäuremolekül, wie es in natürlichen
Zellen existiert, unterschieden. Ein für isoliertes Polypeptid kodierendes Nucleinsäuremolekül schließt jedoch
für Polypeptid
kodierende Nucleinsäuremoleküle ein,
die in Zellen enthalten sind, welche üblicherweise das Polypeptid
exprimieren, wobei sich beispielsweise das Nucleinsäuremolekül an einer
anderen chromosomalen Stelle befindet als in natürlichen Zellen.
-
Die
Bezeichnung "Kontrollsequenzen" bezieht sich auf
DNA-Sequenzen, die zur Expression einer operabel gebundenen Kodiersequenz
in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die Kontrollsequenzen,
die beispielsweise für
Prokaryoten geeignet sind, schließen einen Promotor, gegebenenfalls
eine Operatorsequenz, und eine Ribosombindungsstelle ein. Eukaryotische
Zellen sind bekannt dafür,
Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer zu vetwenden.
-
Nucleinsäure ist "operabel gebunden" wenn sie in eine
funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz
gebracht wird. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operabel
an DNA für
ein Polypeptid gebunden, wenn sie als ein Präprotein exprimiert wird, das
an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt; ein Promotor oder ein
Enhancer ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn er die
Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosombindungsstelle
ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn sie so positioniert
ist, dass sie Translation unterstützt. Im Allgemeinen bedeutet "operabel gebunden", dass die DNA-Sequenzen,
die verbunden sind, zusammenhängend
sind und, im Fall eines Sekretionsleaders, zusammenhängend und
in Lesephase sind. Enhancer müssen
jedoch nicht zusammenhängend
sein. Bindung erfolgt durch Ligation an passenden Restriktionsstellen.
Bestehen solche Stellen nicht, so werden die synthetischen Oligonucleotidadaptoren
oder Linker gemäß herkömmlichen
Praktiken verwendet.
-
Die
Bezeichnung "Antikörper" wird im weitesten
Sinn verwendet und deckt insbesondere beispielsweise einzelne monoklonale
Anti-PRO-Antikörper
(einschließlich
Agonisten, Antagonisten und neutralisierender Antikörper), Anti-PRO-Antikörperzusammensetzungen
mit polyepitopischer Spezifität,
einkettige Anti-PRO-Antikörper
und Fragmente von Anti-PRO-Antikörpern
ab (siehe unten). Die Bezeichnung "monoklo naler Antikörper" wie hierin verwendet bezieht sich auf
einen Antikörper,
der aus einer Population von im wesentlichen homogenen Antikörpern gewonnen
wurde, d.h. dass die einzelnen Antikörper, aus denen die Population besteht,
identisch sind, unter Ausnahme möglicher,
natürlich
vorkommender Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können.
-
"Stringenz" von Hybridisierungsreaktionen
können
Fachleute leicht bestimmen und beruht im Allgemeinen auf einer empirischen
Berechnung, die von Sondenlänge,
Waschtemperatur und Salzkonzentration abhängt. Im Allgemeinen erfordern
längere
Sonden höhere
Temperaturen für
korrektes Anellieren, während kürzere Sonden
niedrigere Temperaturen erfordern. Hybridisierung im Allgemeinen
hängt von
der Fähigkeit denaturierter
DNA ab, neuerlich zu anellieren, wenn komplementäre Stränge in einer Umgebung unter
ihrer Schmelztemperatur vorhanden sind. Je höher der Grad an erwünschter
Homogenität
zwischen der Sonde und der hybridisierbaren Sequenz ist, desto höher ist
auch die relative Temperatur, die verwendet werden kann. Als Resultat
folgt, dass höhere
relative Temperaturen dazu neigen würden, die Reaktionsbedingungen
stringenter zu gestalten, während
niedrigere Temperaturen dies weniger verlangen würden. Für zusätzliche Details und Erklärungen zur
Stringenz von Hybridisierungsreaktionen siehe Ausubel et al., Current
Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995).
-
"Stringente Bedingungen" oder "Bedingungen hoher
Stringenz" wie hierin
definiert können
als jene Bedingungen identifiziert werden, die: (1) geringe Ionenstärke und
hohe Temperaturen für
das Waschen verwenden, beispielsweise 0,015 M Natriumchlorid/0,0015
M Natriumcitrat/0,1 % Natriumdodecylsulfat bei 50 °C; (2) während der
Hybridisierung ein denaturierendes Mittel verwenden, wie beispielsweise
Formamid, z.B. 50 Vol.-% Formamid mit 0,1 % Rinderserumalbumin/0,1
% Ficoll/0,1 % Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei
pH 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bei 42 °C; oder (3)
50 % Formamid, 5 × SSC
(0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH
6,8), 0,1 % Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardts Lösung, beschallte
Lachssperma-DNA (50 μg/ml),
0,1 % SDS und 10 % Dextransulfat bei 42 °C, mit Waschschritten bei 42 °C in 0,2 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat)
und 50 % Formamid bei 55 °C, gefolgt
von einem Waschschritt bei hoher Stringenz bestehend aus 0,1 × SSC, das
EDTA enthält,
bei 55 °C, verwenden.
-
"Moderat stringente
Bedingungen" können wie
von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New
York: Cold Spring Harbor Press (1989), beschrieben definiert werden
und schließen
die Verwendung von Waschlösung
und Hybridisierungsbedingungen (z.B. Temperatur, Ionenstärke und
% SDS) ein, die weniger stringent sind als jene, die zuvor beschrieben
wurden. Ein Beispiel für
moderat stringente Bedingungen ist Übernacht-Inkubation bei 37 °C in einer
Lösung,
umfassend: 20 Formamid, 5 × SSC
(150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH
7,6), 5 × Denhardts
Lösung,
10 % Dextransulfat und 20 mg/ml denaturierte gescherte Lachssperma-DNA;
gefolgt von Waschen der Filter in 1 × SSC bei etwa 37-50 °C. Fachleute
werden erkennen, wie Temperatur, Ionenstärke usw. nach Erfordernis einzustellen
sind, um Faktoren wie Sondenlänge
und dergleichen anzupassen.
-
Die
Bezeichnung "epitopmarkiert", wenn hierin verwendet,
bezieht sich auf ein Hybridpolypeptid, das ein an ein "Markierungs-Polypeptid" fusioniertes PRO-Polypeptid
umfasst. Das Markierungs-Polypeptid weist genug Reste auf, um ein
Epitop bereitzustellen, gegen das ein Antikörper hergestellt werden kann,
ist jedoch auch ausreichend kurz, dass es die Aktivität des Polypeptids,
an das es fusioniert ist, nicht stört. Das Markierungs-Polypeptid
ist vorzugsweise auch eher einmalig, sodass der Antikörper mit
anderen Epitopen im Wesentlichen nicht kreuzreagiert. Geeignete
Markierungs-Polypeptide haben im Allgemeinen zumindest sechs Aminosäurenreste
und üblicherweise
zwischen etwa 8 und 50 Aminosäurereste
(vorzugsweise zwischen etwa 10 und 20 Aminosäurereste).
-
Wie
hierin verwendet bezieht sich die Bezeichnung "Immunoadhäsin" auf antikörperähnliche Moleküle, die
die Bindungsspezifität
eines heterologen Proteins (eines "Adhäsins") mit den Effektorfunktionen
von konstanten Immunglobulindomänen
kombinieren. Strukturell gesehen umfassen die Immunoadhäsine eine Fusion
zwischen ei ner Aminosäuresequenz
mit der erwünschten
Bindungsspezifität,
die sich von der Antigenerkennungs- und -bindungsstelle eines Antikörpers unterscheidet
(d.h. "heterolog" ist), und einer
Immunglobulin-Konstantdomänensequenz.
Der Adhäsinteil
eines Immunoadhäsinmoleküls ist typischerweise
eine zusammenhängende
Aminosäuresequenz,
die zumindest die Bindungsstelle eines Rezeptors oder eines Liganden
umfasst. Die Immunglobulin-Konstantdomänensequenz im Immunoadhäsin kann
aus einem Immunglobulin wie z.B. IgG-1-, IgG-2-, IgG-3- oder IgG-4-Subtypen,
IgA (einschließlich
IgA-1 und IgA-2), IgE, IgD oder IgM erhalten werden.
-
"Aktiv" oder "Aktivität" für die Zwecke
hierin bezieht sich auf Form(en) eines PRO-Polypeptids, das eine biologische und/oder
eine immunologische Aktivität
von nativem oder natürlich
auftretendem PRO in sich trägt,
worin sich "biologische" Aktivität auf eine
biologische Funktion (entweder inhibitorisch oder stimulatorisch)
bezieht, die durch ein natives oder natürlich vorkommendes PRO verursacht
wird und nicht die Fähigkeit ist,
die Produktion eines Antikörpers
gegen ein antigenes Epitop zu induzieren, das von einem nativen
oder natürlich
vorkommenden PRO aufgewiesen wird, und eine "immunologische" Aktivität bezieht sich auf die Fähigkeit,
die Produktion eines Antikörpers
gegen ein antigenes Epitop zu induzieren, das von einem nativen oder
natürlich
vorkommenden PRO aufgewiesen wird.
-
Die
Bezeichnung "Antagonist" wird im weitesten
Sinne verwendet und schließt
jedes beliebige Molekül ein,
das eine biologische Aktivität
eines nativen, hierin offenbarten PRO-Polypeptids teilweise oder
gänzlich blockiert,
hemmt oder neutralisiert. Auf ähnliche
Weise wird die Bezeichnung "Agonist" im weitesten Sinn
verwendet und schließt
jedes beliebige Molekül
ein, das eine biologische Aktivität eines hierin offenbarten,
nativen PRO-Polypeptids nachahmt. Geeignete Agonisten- oder Antagonistenmoleküle umfassen
insbesondere Agonisten- oder Antagonistenantikörper oder Antikörperfragmente,
Fragmente oder Aminosäuresequenzvarianten von
nativen PRO-Polypeptiden, Peptiden, Antisense-Oligonucleotiden,
kleinen organischen Molekülen
usw. Verfahren zur Identifikation von Agonisten oder Antagonisten
eines PRO-Polypeptids können
das Kontaktieren eines PRO-Polypeptids mit einem Kandidatenagonisten-
oder -antagonistenmolekül
und das Messen einer nachweisbaren Veränderung einer oder mehrerer
biologischer Aktivitäten,
die normalerweise mit dem PRO-Polypeptid assoziiert werden, umfassen.
-
"Behandlung" bezieht sich sowohl
auf therapeutische Behandlung als auch auf prophylaktische oder präventive
Maßnahmen,
worin das Ziel die Prävention
oder Verlangsamung (Abschwächung)
des betreffenden pathologischen Leidens oder der Störung ist.
Jene, die solch einer Behandlung bedürfen, schließen jene
ein, die bereits erkrankt sind, als auch jene, die eine Neigung
zeigen, diese Erkrankung zu erleiden, oder jene, in denen es die
Erkrankung zu unterbinden gilt.
-
"Chronische" Verabreichung bezieht
sich im Gegensatz zu einem akuten Modus auf die Verabreichung des
Mittels/der Mittel auf kontinuierliche Weise, um die anfängliche
therapeutische Wirkung (Aktivität) über eine
längere
Zeitspanne aufrechtzuerhalten. "Diskontinuierliche" Verabreichung ist
eine Behandlung, die nicht in Serie ohne Unterbrechung erfolgt,
sondern eher auf zyklische Weise durchgeführt wird.
-
"Säugetier" für
die Zwecke der Behandlung bezieht sich auf jedes beliebige Tier,
das als Säugetier klassifiziert
ist, einschließlich
Mensch, Haus- und Nutztiere, Zoo-, Sport- und Haustiere, wie beispielsweise Hunde,
Katzen, Rinder, Pferde, Schafe, Schweine, Ziegen, Kaninchen usw.
Vorzugsweise ist das Säugetier ein
Mensch.
-
Verabreichung "in Kombination mit" einem oder mehreren
therapeutischen Mitteln schließt
simultane (gleichzeitige) und aufeinander folgende Verabreichung
in jeder beliebigen Reihenfolge ein.
-
"Träger" wie hierin verwendet
schließen
pharmazeutisch annehmbare Träger,
Exzipienten oder Stabilisatoren ein, die gegenüber der Zelle oder dem Säugetier,
die/das ihnen ausgesetzt wird, bei den verwendeten Dosierungen und
Konzentrationen nichttoxisch sind. Häufig ist der physiologisch
annehmbare Träger
eine wässrige,
pH-gepufferte Lösung. Beispiele
für physiologisch
annehmbare Träger
umfassen Puffer wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische
Säuren;
Antioxidanzien einschließlich
Ascorbinsäure;
niedermolekulares Polypeptid (mit weniger als etwa 10 Resten); Proteine,
wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile
Polymere wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie z.B. Glycin, Glutamin,
Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und
andere Kohlenhydrate einschließlich
Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie z.B. EDTA; Zuckeralkohole
wie z.B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen wie z.B. Natrium;
und/oder nichtionische Tenside wie z.B. TWEENTM,
Polyethylenglykol (PEG) und PLURONICSTM.
-
"Antikörperfragmente" umfassen einen Abschnitt
eines intakten Antikörpers,
vorzugsweise die Antigenbindungs- oder variable Region des intakten
Antikörpers.
Beispiele für
Antikörperfragmente
umfassen Fab-, Fab'-,
F(ab')2-
und Fv-Fragmente; Diabodies; lineare Antikörper (Zapata et al., Protein
Eng. 8(10), 1057-1062 (1995)); einkettige Antikörpermoleküle; und multispezifische Antikörper, gebildet
aus Antikörperfragmenten.
-
Papainverdau
von Antikörpern
produziert zwei identische Antigenbindungsfragmente, genannt "Fab"-Fragmente, jeweils
mit einer einzelnen Antigen-Bindungsstelle und einem verbleibenden "Fc"-Fragment, eine Bezeichnung,
die die Fähigkeit
widerspiegelt, leicht zu kristallisieren. Pepsinbehandlung ergibt
ein F(ab')2-Fragment, das zwei Antigen-kombinierende
Stellen aufweist und dennoch zur Vernetzung von Antigen in der Lage
ist.
-
"Fv" ist das minimale
Antikörperfragment,
das eine vollständige
Antigenerkennungs- und
-bindungsstelle aufweist. Diese Region besteht aus einem Dimer einer
variablen Schwer- und einer variablen Leichtkettendomäne in enger,
nicht-kovalenter Assoziation. In dieser Konfiguration erfolgt eine
Wechselwirkung zwischen den drei CDRs jeder variablen Domäne zur Definition
einer Antigen-Bindungsstelle an der Oberfläche des VH-VL-Dimers. Gemeinsam verleihen die sechs CDRs
dem Antikörper
Antigen-Bindungsspezifität.
Jedoch weist sogar eine einzelne variable Domäne (oder die Hälfte eines
Fv, das nur drei CDRs umfasst, die für ein Antigen spezifisch sind)
die Fähigkeit
auf, Antigen zu erkennen und zu binden, dies jedoch bei einer geringeren Affinität als die
gesamte Bindungsstelle.
-
Das
Fab-Fragment enthält
auch die konstante Domäne
der leichten Kette und die erste konstante Domäne (CH1) der schweren Kette.
Fab-Fragmente unterscheiden sich von Fab'-Fragmenten durch die Addition einiger
weniger Reste am Carboxy-Terminus
der Schwerketten-CH1-Domäne,
einschließlich
eines oder mehrerer Cysteine aus der Antikörper-Gelenksregion. Fab'-SH ist hierin die
Bezeichnung für
Fab', in dem der/die Cysteinrest(e)
der konstanten Domänen
eine freie Thiolgruppe aufweist/aufweisen. F(ab')2-Antikörperfragmente
wurden ursprünglich
als Paare von Fab'-Fragmenten
produziert, die Gelenks-Cysteine zwischen sich aufwiesen. Auch andere
chemische Bindungen sind für
Antikörperfragmente
bekannt.
-
Die "leichten Ketten" von Antikörpern (Immunglobulinen)
aus jeder beliebigen Wirbeltierspezies können einem oder zwei eindeutig
unterscheidbaren Typen, genannt kappa und lambda, basierend auf
den Aminosäuresequenzen
ihrer konstanten Domänen
zugeordnet werden.
-
Je
nach Aminosäuresequenz
der konstanten Domäne
ihrer schweren Ketten können
Immunglobuline verschiedenen Klassen zugeordnet werden. Es gibt
fünf Hauptklassen
von Immunglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, und mehrere von
diesen können
weiters in Unterklassen (Isotypen) unterteilt werden, z.B.: IgG1, IgG2,
IgG3, IgG4, IgA und IgA2.
-
"Einkettige Fv"- oder "sFv"-Antikörperfragmente
umfassen die VH- und VL-Domänen des
Antikörpers, worin
diese Domänen
in einer einzigen Polypeptidkette vorhanden sind. Vorzugsweise umfasst
das Fv-Polypeptid weiters einen Polypeptidlinker zwischen den VH- und VL-Domänen, was
dem sFv die Möglichkeit
gibt, die erwünschte
Struktur für
Antigenbindung zu bilden. Einen Überblick
zum Thema sFv liefert Pluckthun in The Parmacology of Monoclonal
Antibodies, Bd. 113, Rosenburg & Moore
(Hrsg.), Springer-Verlag, New York, 269-315 (1994).
-
Die
Bezeichnung "Diabodies" bezieht sich auf
kleine Antikörperfragmente
mit zwei Antigen-Bindungsstellen, worin die Fragmente eine variable
Schwerkettendomäne
(V
H) verbunden mit einer variablen Leichtkettendomäne (V
L) in derselben Polypeptid kette (V
H-V
L) umfassen. Unter
Verwendung eines Linkers, der zu kurz ist, um Paarung zwischen den
zwei Domänen
an derselben Kette zu ermöglichen,
werden die Domänen
gezwungen, mit den komplementären
Domänen
einer anderen Kette Paare zu bilden und zwei Antigen-Bindungsstellen
zu schaffen. Diabodies werden ausführlicher beispielsweise in
der
EP 404.097 ; der WO 93/11161;
und in Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448
(1993), beschrieben.
-
Ein "isolierter" Antikörper ist
einer, der aus einer Komponente seiner natürlichen Umgebung identifiziert
und getrennt und/oder gewonnen wurde. Verunreinigende Komponenten
seiner natürlichen
Umgebung sind Materialien, die diagnostische oder therapeutische
Verwendungen für
den Antikörper
stören
würden
und können
Enzyme, Hormone und andere proteinhältige oder nicht-proteinhältige Gelöststoffe
einbinden. In bevorzugten Ausführungsformen
wird der Antikörper
(1) zu einer Reinheit von über
95 Gew.-% des Antikörpers, bestimmt
durch das Lowry-Verfahren, und am meisten bevorzugt zu einer Reinheit
von über
99 Gew.-%, (2) zu einem ausreichenden Grad, um zumindest 15 Reste
von N-terminaler oder innerer Aminosäuresequenz mittels eines Zentrifugenröhrchensequenzierers
zu erhalten, oder (3) bis zur Homogenität mittels SDS-PAGE unter reduzierenden
oder nichtreduzierenden Bedingungen mittels Coomassie-Blau- oder,
vorzugsweise, Silberfärbung
gereinigt. Isolierter Antikörper
schließt
den Antikörper
in situ innerhalb rekombinanter Zellen ein, da zumindest eine Komponente
der natürlichen
Umgebung des Antikörpers
nicht vorhanden ist. Üblicherweise wird
ein isolierter Antikörper
jedoch durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
-
Das
Wort "Markierung", sofern hierin verwendet,
bezieht sich auf eine nachweisbare Verbindung oder Zusammensetzung,
die direkt oder indirekt an den Antikörper konjugiert ist, um einen "markierten" Antikörper zu
bilden. Die Markierung kann durch sich selbst nachweisbar sein (z.B.
Radioisotopmarkierungen oder fluoreszierende Markierungen) oder
kann, im Fall einer enzymatischen Markierung, chemische Änderung
einer Substratverbindung oder -zusammensetzung katalysieren, die
wiederum nachweisbar ist.
-
Unter "Festphase" wird eine nichtwässrige Matrix
verstanden, an die der Antikörper
der vorliegenden Erfindung anhaften kann. Beispiele für Festphasen,
die hierzu gehören,
schließen
jene ein, die teilweise oder vollständig aus Glas (z.B. Controlled
Pore Glass), Polysacchariden (z.B. Agarose), Polyacrylamiden, Polystyrol,
Polyvinylalkohol und Silikonen gebildet sind. In bestimmten Ausführungsformen,
je nach Kontext, kann die Festphase den Well einer Testplatte umfassen,
in anderen ist sie eine Reinigungssäule (z.B. eine Affinitätschromatographiesäule). Diese
Bezeichnung umfasst auch eine diskontinuierliche Festphase aus einzelnen Teilchen,
wie z.B. jene, die um US-Patent Nr. 4.275.149 beschrieben werden.
-
Ein "Liposom" ist ein kleines
Vesikel, das sich aus verschiedenen Typen an Lipiden, Phospholipiden und/oder
Tensid zusammensetzt und zur Zufuhr eines Wirkstoffs (wie z.B. eines
PRO-Polypeptids oder Antikörpers
dazu) zu einem Säugetier
nützlich
ist. Die Komponenten des Liposoms sind üblicherweise in einer zweischichtigen
Formation angeordnet, ähnlich
der Lipidanordnung biologischer Membranen.
-
Ein "kleines Molekül" ist hierin als ein
Molekül
definiert, das ein Molekulargewicht von unter etwa 500 Da aufweist. Tabelle
1
Tabelle
1 (Fortsetzung)
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1 (Fortsetzung)
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1 (Fortsetzung)
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1 (Fortsetzung)
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1 (Fortsetzung)
Tabelle
2
% Aminosäuresequenzidentität =
(die
Anzahl identisch übereinstimmender
Aminosäurereste
zwischen den zwei Polypeptidsequenzen wie durch ALIGN-2 bestimmt)
dividiert durch (die Gesamtzahl an Aminosäureresten des PRO-Polypeptids)
=
5 dividiert durch 15 = 33,3 % Tabelle
3
% Aminosäuresequenzidentität =
(die
Anzahl identisch übereinstimmender
Aminosäurereste
zwischen den zwei Polypeptidsequenzen wie durch ALIGN-2 bestimmt)
dividiert durch (die Gesamtzahl an Aminosäureresten des PRO-Polypeptids)
=
5 dividiert durch 10 = 50 % Tabelle
4
Nucleinsäuresequenzidentität =
(die
Anzahl identisch übereinstimmender
Nucleotide zwischen den zwei Nucleinsäuresequenzen wie durch ALIGN-2
bestimmt) dividiert durch (die Gesamtzahl an Nucleotiden der PRO-DNA-Nucleinsäuresequenz)
6
dividiert durch 14 = 42,9 Tabelle
5
Nucleinsäuresequenzidentität =
(die
Anzahl identisch übereinstimmender
Nucleotide zwischen den zwei Nucleinsäuresequenzen wie durch ALIGN-2
bestimmt) dividiert durch (die Gesamtzahl an Nucleotiden der PRO-DNA-Nucleinsäuresequenz)=
4
dividiert durch 12 = 33,3 %
-
II. Zusammensetzungen
und Verfahren der Erfindung
-
A. Volllängen-PRO-Polvpeptide
-
Die
vorliegende Erfindung stellt neu identifizierte und isolierte Nucleotidsequenzen
bereit, die für
Polypeptide kodieren, die in der vorliegenden Anmeldung als PRO-Polypeptid bezeichnet
werden. Insbesondere wurden cDNAs, die für verschiedene PRO-Polypeptide
kodieren, identifiziert und isoliert, wie näher in den nachstehenden Beispiele
offenbart wird. Es gilt anzumerken, dass Proteine, die in getrennten
Expressionsdurchgängen
produziert wurden, unterschiedliche PRO-Nummern verliehen bekommen
können,
dass jedoch die UNQ-Nummer für
jede bestimmte DNA und das kodierte Protein einmalig ist und nicht
geändert
wird. Zur einfachen und verständlichen
Darstellung werden in der vorliegenden Beschreibung das Protein,
für das
die hierin offenbarten nativen Volllängen-Nucleinsäuremoleküle kodieren,
sowie weitere native Homologe und Varianten, die in der obigen Definition
von PRO eingebunden sind, als "PRO/Nummer" bezeichnet, und
zwar unabhängig
von ihrem Ursprung oder der Art der Herstellung.
-
Wie
in den Beispielen nachstehend offenbart, wurden verschiedene cDNA-Klone
bei der ATCC hinterlegt. Die tatsächlichen Nucleotidsequenzen
dieser Klone können
von Fachleuten durch Sequenzieren des hinterlegten Klons mittels
Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung Standard sind, leicht
bestimmt werden. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz kann aus der Nucleotidsequenz
mittels Standardverfahren bestimmt werden. Für die hierin beschriebenen
PRO-Polypeptide und die kodierenden Nucleinsäuren konnten die Anmelder das
identifizieren, was als der Leseraster angenommen wird, wie er am
besten mit der zu dem Zeitpunkt zur Verfügung stehenden Sequenzinformation
identifizierbar war.
-
1. Volllängen-PRO1800-Polypeptide
-
Unter
Verwendung des WU-BLAST2-Sequenzabgleich-Computerprogramms wurde
erkannt, dass ein Teil des Volllängen-Nativsequenz-PRO1800
(gezeigt in 2 und Seq.-ID Nr. 2) bestimmte
Aminosäuresequenzidentität mit dem
menschlichen Hep27- Protein
(HE27_HUMAN) aufweist. Folglich wird nun angenommen, dass das in
der vorliegenden Anmeldung offenbarte PRO1800 ein neu identifiziertes
Hep27-Homolog ist und eine für
dieses Protein typische Aktivität
aufweist.
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B. PRO-Polypeptidvarianten
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Zusätzlich zu
den hierin beschriebenen Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptiden
wird erwogen, dass PRO-Varianten hergestellt werden können. PRO-Varianten
können
durch Einführen
geeigneter Nucleotidänderungen
in die PRO-DNA und/oder durch Synthese des erwünschten PRO-Polypeptids hergestellt
werden. Fachleuten wird bekannt sein, dass Aminosäurenänderungen
posttranslationale Prozesse des PRO verändern können, beispielsweise Änderung
der Anzahl oder Position von Glykosylierungsstellen oder Ändern der
Membranverankerungs-Eigenschaften.
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Variationen
im nativen Volllängensequenz-PRO
oder in verschiedenen Domänen
des hierin beschriebenen PRO können
gemacht werden, beispielsweise unter Verwendung aller Verfahren
und Richtlinien für konservative
und nicht-konservative Mutationen, die beispielsweise im US-Patent
Nr. 5.364.934 beschrieben werden. Variationen können eine Substitution, Deletion
oder Insertion von einem oder mehrerer Codons sein, die für das PRO
kodieren, die im Vergleich mit dem Nativsequenz-PRO zu einer Änderung
der Aminosäuresequenz
des PRO führen.
Gegebenenfalls erfolgt diese Variation durch Substitution von zumindest
einer Aminosäure
mit jeder anderen Aminosäure
in einer oder mehreren Domänen
des PRO. Hilfestellung bei der Bestimmung, welcher Aminosäurerest
insertiert, substituiert oder deletiert werden kann, ohne die erwünschte Aktivität negativ
zu beeinflussen, kann durch Vergleichen der Sequenz des PRO mit
jener von homologen bekannten Proteinmolekülen und durch Minimieren der
Anzahl an Aminosäuresequenzänderungen
in Regionen hoher Homologie gefunden werden. Aminosäuresubstitutionen
können
durch Ersetzen einer Aminosäure
durch eine andere Aminosäure
mit ähnlichen
strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften, beispielsweise
durch Ersetzen eines Leucins mit einem Serin, d.h. durch konservative
Aminosäureersetzungen,
entstehen. Insertionen oder Deletionen können gegebenenfalls im Bereich
von etwa 1 bis 5 Aminosäuren
liegen.
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Die
zugelassene Variation kann durch systematisches Durchführen von
Insertionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren in
die Sequenz und Testen der resultierenden Varianten auf Aktivität, die die Volllängen- oder
reife native Sequenz zeigt, bestimmt werden.
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PRO-Polypeptidfragmente
werden hierin bereitgestellt. Solche Fragmente können am N-Terminus oder C-Terminus
trunkiert sein, oder ihnen können,
beispielsweise im Vergleich zu einem Volllängennativprotein, innen gelegene
Reste fehlen. Bestimmten Fragmenten fehlen Aminosäurereste,
die für
eine erwünschte biologische
Aktivität
des PRO-Polypeptids nicht essenziell sind.
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PRO-Fragmente
können
durch jede beliebige Anzahl an herkömmlichen Verfahren hergestellt
werden. Erwünschte
Peptidfragmente können
chemisch synthetisiert werden. Ein alternativer Ansatz umfasst die
Bildung von PRO-Fragmenten durch enzymatischen Verdau, z.B. durch
Behandlung des Proteins mit einem Enzym, das bekannt dafür ist, Proteine
an Stellen zu spalten, die durch bestimmte Aminosäurereste
definiert sind, oder durch Verdau der DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen
und Isolieren des erwünschten
Fragments. Wiederum ein anderes, nützliches Verfahren umfasst
das Isolieren und Amplifizieren eines DNA-Fragments, das für ein erwünschtes
Polypeptidfragment kodiert, durch Polymerasekettenreaktion (PCR).
Oligonucleotide, die die erwünschten
Termini des DNA-Fragments definieren, werden an den 5'- und 3'-Primern in der PCR verwendet. Vorzugsweise
teilen PRO-Polypeptidfragmente zumindest eine biologische und/oder
immunologische Aktivität
mit dem hierin offenbarten PRO-Polypeptid.
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In
besonderen Ausführungsformen
sind konservative Substitutionen in Tabelle 6 unter der Überschrift "Bevorzugte Substitutionen" gezeigt. Resultieren
solche Substitutionen in einer Veränderung der biologischen Aktivität, so werden
mehr substanzielle Veränderungen,
die in Tabelle 6 als "Beispielhafte
Substitutionen" bezeichnet
sind oder wie nachstehend unter Verweis auf Aminosäureklassen
noch näher
beschrieben wird, eingeführt
und die Produkte gescreent. Tabelle
6
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Wesentliche
Modifikationen in Funktion oder immunologischer Identität des PRO-Polypeptids erfolgen durch
Selektieren von Substitutionen, die sich in ihrer Wirkung auf die
Aufrechterhaltung (a) der Struktur der Polypeptidhauptkette im Bereich
der Substitution, beispielsweise in Form einer Faltblatt- oder Helixkonformation,
(b) der Ladung oder Hydrophobizität des Moleküls an der Target-Stelle oder
(c) des Volumens der Seitenkette signifikant unterscheiden. Natürlich vorkommende
Reste werden auf Grundlage gemeinsamer Seitenketteneigenschaften
in die folgenden Gruppen aufgeteilt:
- (1) hydrophob:
Norleucin, met, ala, val, leu, ile;
- (2) neutral hydrophil: cys, ser, thr;
- (3) sauer: asp, glu;
- (4) basisch: asn, gln, his, lys, arg;
- (5) Reste, die Kettenausrichtung beeinflussen: gly, pro; und
- (6) aromatisch: trp, tyr, phe.
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Nicht-konservative
Substitutionen erfordern den Austausch eine Mitglieds einer dieser
Klassen gegen eine andere Klasse. Solche substituierten Reste können auch
in die konservativen Substitutionsstellen oder, noch bevorzugter,
in die verbleibenden (nicht-konservierten) Stellen eingeführt werden.
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Die
Variationen können
unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren, wie
beispielsweise Oligonucleotid-vermittelte (ortsgerichtete) Mutagenese,
Alaninscanning und PCR-Mutagenese, gebildet werden. Ortsgerichtete
Mutagenese [Carter et al., Nucl. Acids Res. 13, 4331 (1986); Zoller
et al., Nucl. Acids Res. 10, 6487 (1987)], Kassettenmutagenese [Wells
et al., Gene 34, 315 (1985)], Restriktionsselektionsmutagenese [Wells
et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317, 415 (1986)] oder
andere bekannte Verfahren können
an der klonierten DNA durchgeführt
werden, um die PRO-DNA-Variante zu bilden.
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Scanning-Aminosäureanalyse
kann auch verwendet werden, um eine oder mehrere Aminosäuren gemeinsam
mit einer zusammenhängenden
Sequenz zu identifizieren. Zu den bevorzugten Scanning-Aminosäuren zählen relativ
kleine, neutrale Aminosäuren.
Solche Aminosäuren
schließen
Alanin, Glycin, Serin und Cystein ein. Alanin ist typischerweise
eine bevorzugte Scanning-Aminosäure
in dieser Gruppe, da es die Seitenkette über den beta-Kohlenstoff hinaus
eliminiert und weniger wahrscheinlich die Hauptkettenkonformation
der Variante verändert
[Cunningham & Wells,
Science 244, 1081-1085 (1989)]. Typischerweise wird ebenso Alanin bevorzugt,
da es die häufigste
Aminosäure
ist. Weiters wird es häufig
sowohl an verborgenen als auch an freiliegenden Positionen gefunden
[Creighton, The Proteins (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol. 150,
1 (1976)]. Ergibt Alaninsubstitution keine adäquaten Mengen an Varianten,
so kann eine isoterische Aminosäure
verwendet werden.
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C. Modifikationen von
PRO
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Kovalente
Modifikationen von PRO sind in den Schutzumfang dieser Erfindung
eingebunden. Ein Typ von kovalenter Modifikation umfasst das Umsetzen
gerichteter Aminosäurereste
eines PRO-Polypeptids mit einem organischen derivatisierenden Mittel,
das in der Lage ist, mit ausgewählten
Seitenketten oder den N- oder C-terminalen
Resten des PRO zu reagieren. Derivatisierung mit bifunktionellen
Mitteln ist nützlich,
beispielsweise zum Vernetzen von PRO mit einer wasserunlöslichen
Trägermatrix
oder -oberfläche
zur Verwendung im Verfahren zur Reinigung von Anti-PRO-Antikörpern und
umgekehrt. Üblicherweise
verwendete Vernetzer umfassen z.B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan,
Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Ester mit
4-Azidosalicylsäure,
homobifunktionelle Imidoester, einschließlich Disuccinimidylester, wie
z.B. 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat),
bifunktionelle Maleinimide wie z.B. Bis-N-maleinimido-1,8-octan,
und Mittel wie z.B. Methyl-3-[p-azidophenyl)dithio]propioimidat.
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Andere
Modifikationen umfassen Deamidierung von Glutaminyl- und Asparaginylresten
zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten, Hydroxylierung
von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxygruppen von Seryl-
oder Threonylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin-
und Histidin-Seitenketten
[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H.
Freeman & Co.,
San Francisco, 79-86 (1983)], Acetylierung des N-terminalen Amins
und Amidierung jeder beliebigen C-terminalen Carboxygruppe.
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Eine
andere Art kovalenter Modifikation des PRO-Polypeptids, die in den
Schutzumfang dieser Erfindung fällt,
umfasst das Ändern
des nativen Glykosylierungsmusters des Polypeptids. "Ändern des nativen Glykosylierungsmusters" bedeutet für die vorliegenden
Zwecke die Deletion von einer oder mehreren Kohlenhydratgruppierungen,
die in Nativsequenz-PRO zu finden sind (entweder durch Entfernen
der zugrundeliegenden Glykosylierungsstelle oder durch Deletion
der Glykosylierung durch chemische und/oder enzymatische Mittel),
und/oder das Addieren einer oder mehrerer Glykosylierungsstellen,
die im Nativsequenz-PRO nicht zu finden sind. Darüber hinaus
bindet diese Bezeichnung auch qualitative Änderungen an der Glykosylierung
der nativen Proteine ein, einschließlich einer Änderung
der Beschaffenheit und der Anteile der verschiedenen vorhandenen
Kohlenhydratgruppierungen.
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Das
Hinzufügen
von Glykosylierungsstellen zum PRO-Polypeptid kann durch Ändern der
Aminosäuresequenz
erfolgen. Die Änderung
kann beispielsweise durch die Addition von oder die Substitution
durch einen oder mehrere Serin- oder Threoninreste zum oder am Nativsequenz-PRO
(für O-gebundene
Glykosylierungsstellen) durchgeführt
werden. Die PRO-Aminosäuresequenz
kann gegebenenfalls durch Änderungen
auf DNA-Niveau geändert
werden, insbesondere durch Mutation der DNA, die für das PRO-Polypeptid
kodiert, an präselektierten
Basen, sodass Codons gebildet werden, die zu den erwünschten
Aminosäuren
translatieren.
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Ein
anderes Mittel zur Steigerung der. Anzahl an Kohlenhydratgruppierungen
am PRO-Polypeptid ist chemisches oder enzymatisches Binden von Glykosiden
an das Polypeptid. Solche Verfahren werden auf dem Gebiet der Erfindung,
z.B. in der WO 87/05330, veröffentlicht
am 11. September 1987, und in Aplin & Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem.,
259-306 (1981), beschrieben.
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Das
Entfernen von Kohlenhydratgruppierungen, die am PRO-Polypeptid vorhanden
sind, kann chemisch oder enzymatisch oder durch Mutationssubstitutionen
von Codons, die für
Aminosäurereste
kodieren, die als Targets für
Glykosylierung dienen, durchgeführt
werden. Chemische Deglykosylierungsverfahren sind auf dem Gebiet
der Erfindung bekannt und werden beispielsweise von Hakimuddin et
al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987), und von Edge et al.,
Anal. Biochem. 118, 131 (1981), beschrieben. Enzymatische Spaltung
von Kohlenhydratgruppierungen an Polypepti den kann durch die Verwendung
einer Vielzahl an Endo- und Exo-Glykosidasen erreicht werden, wie
von Thotakura et al. in: Meth. Enzymol. 138, 350 (1987), beschrieben
wird.
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Eine
andere Art von kovalenter Modifikation von PRO umfasst das Binden
des PRO-Polypeptids
an eines einer Vielzahl nicht-proteinhältiger Polymere, z.B. Polyethylenglykol
(PEG), Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, auf die Art und
Weise, die in den US-Patenten Nr. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144;
4.670.417; 4.791.192 oder 4.179.337 beschrieben wird.
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Das
PRO der vorliegenden Erfindung kann auch auf eine Weise modifiziert
werden, dass ein Hybridmolekül
gebildet wird, das PRO, fusioniert an ein anderes, heterologes Polypeptid
oder eine andere, heterologe Aminosäuresequenz, umfasst.
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In
einer Ausführungsform
umfasst solch ein Hybridmolekül
eine Fusion des PRO mit einem Markierungspolypeptid, das ein Epitop
bereitstellt, an das sich ein Anti-Markierungs-Antikörper selektiv binden kann. Die
Epitopmarkierung wird im Allgemeinen an den Amino- oder Carboxyterminus
des PRO platziert. Die Gegenwart solcher Epitop-markierten Formen
des PRO kann unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Markierungs-Polypeptid
nachgewiesen werden. Die Bereitstellung der Epitopmarkierung ermöglicht es
somit auch, dass das PRO leicht mittels Aftinitätsreinigung unter Verwendung
eines Anti-Markierungs-Antikörpers oder
eines anderen Typs von Affinitätsmatrize,
die sich an die Epitopmarkierung bindet, gereinigt werden kann. Verschiedene
Markierungspolypeptide und ihre jeweiligen Antikörper sind auf dem Gebiet der
Erfindung bekannt. Beispiele umfassen Poly-Histidin- (poly-his-)
oder Poly-Histidin-Glycin- (poly-his-gly-) Markierungen; das flu-HA-Markierungspolypeptid
und seinen Antikörper
12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159-2165 (1988)]; die
c-myc-Markierung und die Antikörper
8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 und 9E10 hierzu [Evan et al., Molecular and
Cellular Biology 5, 3610-3616 (1985)]; und die Herpes-Simplex-Virus-Glykoprotein-D-
(-gD-) Markierung und ihren Antikörper [Paborsky et al., Protein
Engineering 3(6), 547-553 (1990)]. Andere Markierungspolypeptide
umfassen das Flag-Peptid [Hopp et al., BioTechnology 6, 1204-1210
(1988)]; das KT3-Epitoppeptid [Martin et al., Science 255, 192-194
(1992)]; ein α-Tubulinepitoppeptid
[Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163-15166 (1991)]; und die
T7-Gen-10-Proteinpeptidmarkierung [Lutz-Freyermuth et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 87, 6393-6397 (1990)].
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In
einer alternativen Ausführungsform
kann das Hybridmolekül
eine Fusion des PRO mit einem Immunglobulin oder einer bestimmten
Region eines Immunglobulins umfassen. Für eine zweiwertige Form des Hybridmoleküls (auch
als ein "Immunoadhäsin" bezeichnet) könnte solch
eine Fusion zur Fc-Region eines IgG-Moleküls gebildet sein. Die Ig-Fusionen
umfassen vorzugsweise die Substitution einer löslichen Form (deletierte oder
inaktivierte Transmembrandomäne)
eines PRO-Polypeptids anstelle von zumindest einer variablen Region
innerhalb eines Ig-Moleküls.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Immunglobulinfusion
die Gelenks-, CH2- und CH3- oder die Gelenks-, CH1-, CH2- und CH3-Regionen
eines IgG1-Moleküls. Für weitere
Information zur Herstellung von Immunglobulinfusionen siehe auch
US-Patent Nr. 5.428.130, ausgegeben am 27. Juni 1995.
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D. Herstellung von PRO
-
Die
nachstehende Beschreibung betrifft vorrangig die Herstellung von
PRO durch Kultivieren von Zellen, die mit einem PRO-Nucleinsäure-hältigen Vektor
transformiert oder transfiziert sind. Natürlich wird erwogen, dass alternative
Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, zur Herstellung
von PRO verwendet werden können.
Beispielsweise kann die PRO-Sequenz oder Teile davon durch direkte
Peptidsynthese unter Verwendung von Festphasenverfahren hergestellt
werden [siehe z.B. Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis,
W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem.
Soc. 85, 2149-2154 (1963)]. In-vitro-Proteinsynthese kann unter
Verwendung manueller oder automatisierter Verfahren durchgeführt werden.
Automatisierte Synthese kann beispielsweise unter Verwendung eines
Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) gemäß den Anweisungen
des Herstellers erfolgen. Verschiedene Teile des PRO können separat
chemisch synthetisiert und mittels chemischer oder enzymatischer
Verfahren kombiniert werden, um das Volllängen-PRO zu bilden.
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1. Isolation
von für
PRO kodierender DNA
-
DNA,
die für
PRO kodiert, kann aus einer cDNA-Bibliothek gewonnen werden, die
aus Gewebe hergestellt wird, von dem angenommen wird, dass es die
PRO-mRNA aufweist und diese auf einem nachweisbaren Niveau exprimiert.
Demgemäß kann menschliche
PRO-DNA leicht aus einer cDNA-Bibliothek gewonnen werden, die aus
menschlichem Gewebe hergestellt wird, wie es auch in den Beispielen
beschrieben ist. Das für
PRO kodierende Gen kann auch aus einer genomischen Bibliothek oder
mittels bekannter synthetischer Verfahren (z.B. automatisierter
Nucleinsäuresynthese)
gewonnen werden.
-
Bibliotheken
können
mit Sonden (wie Antikörpern
gegen das PRO oder Oligonucleotide mit zumindest etwa 20-80 Basen)
gescreent werden, deren Zweck es ist, das Gen von Interesse oder
das durch dieses Gen kodierte Protein zu identifizieren. Screening
der cDNA oder der genomischen Bibliothek mit der ausgewählten Sonde
kann unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt werden,
die z.B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), beschrieben sind.
Ein alternatives Mittel zum Isolieren des für PRO kodierenden Gens ist
die Verwendung der PCR-Methode [Sambrook et al., s.o.; Dieffenbach
et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press
(1995))].
-
Die
nachstehenden Beispiele beschreiben Verfahren zum Screenen einer
cDNA-Bibliothek.
Die als Sonden ausgewählten
Oligonucleotidsequenzen sollten eine ausreichende Länge aufweisen
und ausreichend eindeutig sein, sodass falsche Positive minimiert
werden. Das Oligonucleotid ist vorzugsweise so markiert, dass es
durch Hybridisierung an DNA in der zu screenenden Bibliothek nachgewiesen
werden kann. Markierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung
bekannt und umfassen die Verwendung von radioaktiven Markierungen
wie z.B. von 32P-markiertem ATP, Biotinylierung
oder Enzymmarkierung. Hybridisierungsbedingungen, einschließlich moderater
Stringenz und hoher Stringenz, sind in Sambrook et al., s.o., beschrieben.
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Sequenzen,
die in solchen Bibliotheks-Screening-Verfahren identifiziert werden,
können
mit anderen bekannten Sequenzen, die in öffentlichen Datenbanken wie
z.B. GenBank oder anderen privaten Sequenzdatenbanken hinterlegt
und zugänglich
sind, verglichen und abgeglichen werden. Sequenzidentität (entweder
auf Niveau der Aminosäuren
oder der Nucleotide) innerhalb definierter Regionen des Moleküls oder über die
gesamte Volllängensequenz
hinweg kann mittels auf dem Gebiet bekannter Verfahren und wie hierin
beschrieben bestimmt werden.
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Nucleinsäure mit
Protein-kodierender Sequenz kann durch Screenen ausgewählter cDNA
oder genomischer Bibliotheken unter Verwendung der hierin zum ersten
Mal offenbarten, abgeleiteten Aminosäuresequenz und, sofern erforderlich,
unter Verwendung herkömmlicher
Primerextensionsverfahren wie in Sambrook et al., s.o., beschrieben,
um Vorläufer
und Verarbeitungs-Zwischenprodukte von mRNA zu detektieren, die eventuell
nicht in cDNA revers-transkribiert worden sind, gewonnen werden.
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2. Selektion
und Transformation von Wirtszellen
-
Wirtszellen
werden mit Expressions- oder Kloniervektoren, die hierin zur PRO-Produktion beschrieben werden,
transfiziert oder transformiert und in herkömmlichem Nährmedium kultiviert, das zum
Induzieren von Promotoren, zur Selektion von Transformanten oder
Amplifikation der Gene, die für
die erwünschten
Sequenzen kodieren, geeignet modifiziert ist. Die Kulturbedingungen,
wie z.B. Medium, Temperatur, pH und dergleichen, können von
Fachleuten ohne übermäßiges Experimentieren
ausgewählt
werden. Im Allgemeinen können
Prinzipien, Arbeitsvorschriften und praktische Techniken zur Maximierung
der Produktivität
von Zellkulturen in Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach,
M. Butler (Hrsg.), IRL Press (1991), und in Sambrook et al., s.o.,
gefunden werden.
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Verfahren
zur eukaryotischen Zelltransfektion und prokaryotischen Zelltransformation
sind durchschnittlichen Fachleuten bekannt, z.B. CaCl2-Verfahren,
CaPO4-Verfahren, Liposom-vermitteltes Verfahren und
Elektroporation. Je nach verwendeten Wirtszel len erfolgt die Transformation
unter Verwendung von Standardverfahren, die für die entsprechenden Zellen
geeignet sind. Die Calciumbehandlung mittels Calciumchlorid, wie
in Sambrook et al., s.o., beschrieben, oder Elektroporation wird
im Allgemeinen für
Prokaryoten verwendet. Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird
zur Transformation bestimmter Pflanzenzellen verwendet, wie Shaw
et al., Gene 23, 315 (1983), und die WO 89/05859, veröffentlicht
am 29. Juni 1989, beschreiben. Für
Säugetierzellen
ohne solche Zellwände
kann das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren
von Graham & van
der Eb, Virology 52, 456-457 (1978), verwendet werden. Allgemeine
Aspekte von Säugetierzellen-Wirtssystemtransfektionen
werden im US-Patent Nr. 4.399.216 beschrieben. Transformationen
in Hefe werden typischerweise gemäß dem Verfahren von Van Solingen
et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. (USA) 76, 3829 (1979), durchgeführt. Es können jedoch auch andere Verfahren
zum Einführen von
DNA in Zellen, wie beispielsweise Kernmikroinjektion, Elektroporation,
bakterielle Protoplastenfusion mit intakten Zellen, oder Polykationen,
z.B. Polybren, Polyornithin, verwendet werden. Für verschiedene Verfahren zur
Transformation von Säugetierzellen
siehe Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527-537 (1990), und Mansour
et al., Nature 336, 348-352 (1988).
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Geeignete
Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren der DNA in die bzw. den
Vektoren hierin schließen
Prokaryoten-, Hefe-, oder höhere
Eukaryotenzellen ein. Geeignete Prokaryoten umfassen, sind jedoch nicht
beschränkt
auf, Eubakterien, wie z.B. gram-negative oder gram-positive Organismen,
beispielsweise Enterobacteriaceae wie z.B. E. coli. Verschiedene
E.-coli-Stämme
sind öffentlich
erhältlich,
wie z.B. E.-coli-K12-Stamm MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC
31.537); E.-coli-Stamm
W3110 (ATCC 27.325) und K5 772 (ATCC 53.635). Andere geeignete prokaryotische
Wirtszellen umfassen Enterobacteriaceae wie Escherichia, z.B. E.
coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, z.B.
Salmonella typhimurium, Serratia, z.B. Serratia marcescans, und
Shigella sowie Bacilli wie z.B. B. subtilis und B. licheniformis
(z.B. B. licheniformis 41P, offenbart in
DD 266.710 , veröffentlicht am 12. April 1989),
Pseudomonas, wie z.B. P. aeruginosa, und Streptomyces. Diese Beispiele
stellen eine Veranschaulichung und keine Einschränkung dar. Stamm W3110 ist
ein besonders bevorzugter Wirt oder Ausgangswirt, da er ein üblicher
Wirtstamm für
Fermentationen von Rekombinations-DNA-Produkten ist. Vorzugswei-
se sekretiert die Wirtszelle minimale Mengen an proteolytischen
Enzymen. Beispielsweise kann Stamm W3110 modifiziert werden, um
in den Genen, die für
die zum Wirt endogenen Proteine kodieren, eine genetische Mutation
zu bewirken, wobei Beispiele für solche
Wirte E. coli-W3110-Stamm 1A2, der den vollständigen Genotyp tonA aufweist;
E.-coli-W3110-Stamm 9E4, der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 aufweist;
E.-coli-W3110-Stamm 27C7 (ATCC 55.244), der den vollständigen Genotyp
tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan
r aufweist;
E.-coli-W3110-Stamm 37D6,
der den vollständigen
Genotyp tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7ilvG kan
r aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 40B4, der
Stamm 37D6 mit einer nicht Kanamycin-resistenten degP-Deletionsmutation ist;
und ein E.-coli-Stamm
mit mutierter periplasmatischer Protease, offenbart im US-Patent
Nr. 4.946.783, ausgegeben am 7. August 1990, sind. Alternativ dazu
sind In-vitro-Klonierverfahren,
z.B. PCR oder andere Nucleinsäure-Polymerasereaktionen,
geeignet.
-
Zusätzlich zu
Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben wie beispielsweise Fadenpilze
oder Hefe geeignete Klonier- oder Expressionswirte für PRO-kodierende
Vektoren. Saccharomyces cerevisiae ist ein. üblicherweise verwendeter, nieder-eukaryotischer
Wirtsmikroorganismus. Andere umfassen Schizosaccharomyces pombe
(Beach & Nurse,
Nature 290, 140 (1981);
EP 139.383 ,
veröffentlicht
am 2. Mai 1985); Kluyveromyces-Wirte (US-Patent Nr. 4.943.529; Fleer
et al., Bio/Technology 9, 968-975
(1991)) wie z.B. K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt
et al., J. Bacteriol. 154(2), 737-742 (1983)), K. fragilis (ATCC 12.424),
K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii
(ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al.,
Bio/Technology 8, 135 (1990)), K. thermotolerans und K. marxianus;
yarrowia (
EP 402.226 );
Pichia pastoris (
EP 183.070 ;
Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265-278 (1988)); Candida;
Trichoderma reesia (
EP 244.234 );
Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5339-5363
(1979)); Schwanniomyces wie z.B. Schwanniomyces occidentalis (
EP 394.538 , veröffentlicht
am 31. Oktober 1990); und Fadenpilze wie z.B. Neurospora, Penicillium,
Tolypocladium (WO 91/00357, veröffentlicht
am 10. Januar 1991) und Aspergillus-Wirte wie z.B. A. nidulans (Ballance
et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284-289 (1983); Tilburn
et al., Gene 26, 205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 81, 1470-1474 (1984)) und A. niger (Kelly & Hynes, EMBO J.
4, 475-479 (1985)). Methylotrophe Hefen sind hierin geeignet und
umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Hefe, die in der Lage
ist, auf Methanol zu wachsen, ausgewählt aus den Gattungen von Hansenula,
Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis und Rhodotorula.
Eine Liste spezifischer Spezies, die für diese Klasse von Hefe beispielhaft
sind, ist in C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269
(1982), zu finden.
-
Geeignete
Wirtszellen für
die Expression glykosylierter PRO werden von multizellulären Organismen abgeleitet.
Beispiele für
Wirbellosenzellen umfassen Insektenzellen wie z.B. Drosophila S2
und Spodoptera Sf9 sowie Pflanzenzellen. Beispiele für nützliche
Säugetierwirtszelllinien
umfassen Chinahamster-Eierstock- (CHO-) und COS-Zellen. Spezifischere Beispiele umfassen
Affennieren-CV1-Linie, transformiert durch SV40 (COS-7, ATCC CRL
1651); menschliche embryonale Nierenlinie (293 oder 293-Zellen,
subkloniert zum Wachstum in Suspensionskultur, Graham et al., J.
Gen Virol. 36, 59 (1977)); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO,
Urlaub & Chasin,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertolizellen
(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243-251 (1980)); menschliche Lungenzellen
(W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065);
und Maus-Brusttumor (MMT 060562, ATCC CCL51). Es wird erachtet,
dass die Auswahl der geeigneten Wirtszelle in den Bereich der Erfindung
fällt.
-
3. Auswahl
und Verwendung eines replizierbaren Vektors
-
Die
Nucleinsäure
(z.B. cDNA oder genomische DNA), die für PRO kodiert, kann zum Klonieren
(Amplifikation der DNA) oder zur Expression in einen replizierbaren
Vektor insertiert werden. Verschiedene Vektoren sind öffentlich
erhältlich.
Der Vektor kann beispielsweise in Form eines Plasmids, Cosmids,
viralen Partikels oder Phagen vorliegen. Die geeignete Nucleinsäuresequenz
kann in den Vektor mittels zahlreicher verschiedener Verfahren insertiert
werden. Im Allgemeinen wird DNA in (eine) geeignete Restriktionsendonucleasestelle(n)
mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren insertiert.
Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht beschränkt auf,
eine oder mehrere Signalsequenzen, einen Replikationsursprung, ein
oder mehrere Markergene, ein Enhancer-Element, einen Promotor und
eine Transkriptionsterminationssequenz. Bei der Konstruktion geeigneter
Vektoren, die eine oder mehrere dieser Komponenten enthalten, werden
herkömmliche
Ligationsverfahren eingesetzt, die Fachleuten bekannt sind.
-
Das
PRO kann rekombinant nicht nur direkt, sondern auch als ein Fusionspolypeptid
mit einem heterologen Polypeptid hergestellt werden, das eine Signalsequenz
oder ein anderes Polypeptid mit einer spezifischen Spaltungsstelle
am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids sein kann. Im
Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors oder
kann ein Teil der für
PRO kodierenden DNA sein, die in den Vektor insertiert wird. Die
Signalsequenz kann eine prokaryotische Signalsequenz, ausgewählt beispielsweise
aus der aus alkalischer Phosphatase, Penicillinase, Ipp oder wärmestabilen
Enterotoxin-II-Leadern bestehenden Gruppe, sein. Zur Hefesekretion
kann die Signalsequenz z.B. der Hefe-Invertaseleader, Alpha-Faktorleader
(einschließlich
Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktorleader, wobei
Letzterer im US-Patent Nr. 5.010.182 beschrieben wird) oder saure
Phosphataseleader, der C.-albicans-Glucoamylaseleader (
EP 362.179 , veröffentlicht am 4. April 1990)
oder das in der WO 90/13646, veröffentlicht
am 15. November 1990, beschriebene Signal sein. Zur Säugetierzellexpression
können
Säugetiersignalsequenzen
verwendet werden, um Sekretion des Proteins zu steuern, wie beispielsweise
Signalsequenzen aus sekretierten Polypeptiden derselben oder einer
verwandten Spezies sowie virale Sekretionsleader.
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Sowohl
Expressions- als auch Kloniervektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz,
die es ermöglicht,
dass sich der Vektor in einer oder mehreren der sekretierten Wirtszellen
repliziert. Solche Sequenzen sind für zahlreiche verschiedene Bakterien,
Hefen und Viren bekannt. Der Replikationsursprung aus dem Plasmid pBR322
ist für
die meisten gram-negativen Bakterien geeignet, der 2μ-Plasmidursprung
ist für
Hefe geeignet, und verschiedene virale Ursprünge (SV40, Polyoma, Adenovirus,
VSV oder BPV) sind für
Kloniervektoren in Säugetierzellen
nützlich.
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Expressions-
und Kloniervektoren enthalten typischerweise ein Selektionsgen,
das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Typische Selektionsgene
kodieren für
Proteine, die (a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen
Toxinen, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin,
verleihen, (b) auxotrophe Mängel
beheben oder (c) essenzielle Nährstoffe,
die aus komplexem Medium nicht erhältlich sind, z.B. das für D-Alaninracemase
für Bacilli
kodierende Gen, zuführen.
-
Ein
Beispiel für
geeignete selektierbare Marker für
Säugetierzellen
sind jene, die die Identifikation von Zellen ermöglichen, die in der Lage sind,
die für
PRO kodierende Nucleinsäure
aufzunehmen, wie z.B. DHFR oder Thymidinkinase. Eine geeignete Wirtszelle
ist, sofern Wildtyp-DHFR verwendet wird, die CHO-Zelllinie, der
DHFR-Aktivität fehlt
und die wie von Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216
(1980), beschrieben hergestellt und vermehrt wird. Ein geeignetes
Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trp1-Gen, das im Hefeplasmid
YRp7 vorhanden ist [Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman
et al., Gene 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)].
Das trp1-Gen liefert einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm,
dem die Fähigkeit
fehlt, in Tryptophan zu wachsen, beispielsweise ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1
[Jones, Genetics 85, 12 (1977)].
-
Expressions-
und Kloniervektoren enthalten üblicherweise
einen Promotor, der operabel an die für PRO kodierende Nucleinsäuresequenz
gebunden ist, um mRNA-Synthese
zu steuern. Promotoren, die durch zahlreiche verschiedene potenzielle
Wirtszellen erkannt werden, sind bekannt. Promotoren, die zur Verwendung
mit prokaryotischen Wirten geeignet sind, umfassen die β-Lactamase-
und Lactose-Promotorsysteme [Chang
et al., Nature 275, 615 (1978); Goeddel et al., Nature 281, 544
(1979)], alkalische Phosphatase, ein Tryptophan- (trp-) Promotorsystem
[Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980);
EP 36.776 ] und Hybridpromotoren wie
z.B. den tac-Promotor [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
80, 21-25 (1983)]. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen
enthalten auch eine Shine- Dalgarno-
(S.D.-) Sequenz, die operabel an die für PRO kodierende DNA gebunden
ist.
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Beispiele
für geeignete
Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren
für 3-Phosphoglyceratkinase
[Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)] oder andere glykolytische Enzyme
[Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland, Biochemistry
17, 4900 (1978)] wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase,
Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase,
3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase,
Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
-
Andere
Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren sind und den zusätzlichen
Vorteil haben, dass ihre Transkription durch Wachstumsbedingungen
gesteuert wird, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom
C, saure Phosphatase, degradative Enzyme, die mit Stickstoffmetabolismus
assoziiert sind, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase
und Enzyme, die für
Maltose- und Galactoseverwendung verantwortlich sind. Geeignete
Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei Hefeexpression werden
näher in
EP 73.657 beschrieben.
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PRO-Transkription
aus Vektoren in Säugetier-Wirtszellen
wird beispielsweise durch Promotoren gesteuert, die aus den Genomen
von Viren wie z.B. Polyomavirus, Geflügelpockenvirus (
UK 2.211.504 , veröffentlicht am 5. Juli 1989),
Adenovirus (wie z.B. Adenovirus 2), Rinderpapillomavirus, Vogel-Sarkomvirus,
Zytomegalie-Virus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und Affenvirus
40 (SV40), aus heterologen Säugetierpromotoren,
z.B. dem Actinpromotor oder einem Immunglobulinpromotor, und aus
Hitzeschock-Promotoren gewonnen werden, vorausgesetzt, solche Promotoren
sind mit den Wirtszellsystemen kompatibel.
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Transkription
einer DNA, die für
das PRO kodiert, durch höhere
Eukaryoten kann durch Insertieren einer Enhancersequenz in den Vektor
gesteigert werden. Enhancer sind cis-wirkende Elemente von DNA, üblicherweise
etwa mit 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor so wirken, dass seine
Transkription gesteigert wird. Zahlreiche Enhancersequenzen sind
aus Säugetiergenen
bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise
wird jedoch ein Enhancer aus einem eukaryotischen Zellvirus verwendet.
Beispiele umfassen den SV40-Enhancer an der späten Seite des Replikationsursprungs
(bpp 100-270), den frühen Zytomegalie-Virus-Promotorenhancer,
den Polyoma-Enhancer an der späten
Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer. Der Enhancer
kann in den Vektor an einer Position 5' oder 3' zur PRO-Kodiersequenz gespleißt werden,
wird jedoch vorzugsweise an einer Stelle 5' vom Promotor angeordnet.
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Expressionsvektoren,
die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-,
Tier-, Mensch- oder kernhaltige Zellen aus anderen multizellulären Organismen)
verwendet werden, enthalten auch Sequenzen, die zum Abschluss von
Transkription und zur Stabilisierung der mRNA erforderlich sind.
Solche Sequenzen sind üblicherweise
aus den untranslatierten 5'-,
und gegebenenfalls 3'-,
Regionen eukaryotischer oder viraler DNAs oder cDNAs erhältlich.
Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte
Fragmente im untranslatierten Abschnitt der für PRO kodierenden mRNA transkribiert
werden.
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Weitere
Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Adaption an die Synthese
von PRO in rekombinanter Wirbeltierzellkultur geeignet sind, werden
in Gething et al., Nature 293, 620-625 (1981); Mantei et al., Nature
281, 40-46 (1979);
EP 117.060 ;
und
EP 117.058 beschrieben.
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4. Detektion von Genamplifikation/expression
-
Genamplifikation
und/oder -expression kann basierend auf den hierin bereitgestellten
Sequenzen in einer Probe direkt gemessen werden, z.B. durch herkömmliches
Southern-Blotting, Northern-Blotting zur Quantifizierung der Transkription
von mRNA [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201-5205 (1980)], Dot-Blotting
(DNA-Analyse) oder
In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer geeigneten markierten
Sonde. Alternativ dazu können
Antikörper
verwendet werden, die spezifische Dupli ces, einschließlich DNA-Duplices, RNA-Duplices
und DNA-RNA-Hybridduplices oder DNA-Proteinduplices, erkennen. Die
Antikörper
wiederum können
markiert sein, und der Test kann durchgeführt werden, wenn der Duplex
an eine Oberfläche
gebunden ist, sodass bei Bildung von Duplex an der Oberfläche die
Gegenwart von Antikörper,
der an den Duplex gebunden ist, nachgewiesen werden kann.
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Genexpression
kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren, wie beispielsweise
immunhistochemisches Färben
von Zellen oder Gewebeschnitten und Tests von Zellkultur oder Körperflüssigkeiten,
gemessen werden, um die Expression von Genprodukt direkt zu quantifizieren.
Antikörper,
die für
immunhistochemisches Färben
und/oder Testen von Probenflüssigkeiten
nützlich
sind, können
entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in jedem beliebigen Säugetier
hergestellt werden. Auf einfache Weise können die Antikörper gegen
ein Nativsequenz-PRO-Polypeptid
oder gegen ein synthetisches Peptid, basierend auf den hierin bereitgestellten
DNA-Sequenzen, oder gegen exogene Sequenz, fusioniert an PRO-DNA und für ein spezifisches
Antikörperepitop
kodierend, hergestellt werden.
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5. Reinigung
von Polypeptid
-
Formen
von PRO können
aus Kulturmedium oder aus Wirtszelllysaten gewonnen werden. Sofern membrangebunden,
kann es unter Verwendung einer geeigneten Tensidlösung (z.B.
Triton-X 100) oder durch enzymatische Spaltung aus der Membran freigesetzt
werden. Zellen, die zur Expression von PRO verwendet werden, können mittels
verschiedener physikalischer oder chemischer Mittel, wie z.B. Gefrier-Auftau-Zyklieren,
Beschallung, mechanischer Aufbruch oder Zelllysemittel, aufgeschlossen
werden.
-
Es
kann erwünscht
sein, PRO aus rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu reinigen.
Die folgenden Verfahren sind Beispiele für geeignete Reinigungsverfahren:
Fraktionierung an einer Ionenaustauschsäule; Ethanolfällung; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie
an Siliciumdioxid oder an einem Kationenaustauschharz wie z.B. DEAE;
Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatfällung; Gel filtration unter Verwendung
von beispielsweise Sephadex G-75; Protein-A-Sepharose-Säulen zur Entfernung von Verunreinigungen
wie IgG; und Metallchelator-Säulen
zur Bindung von Epitop-markierten Formen des PRO. Verschiedene Verfahren
von Proteinreinigung können
verwendet werden, und solche Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung
bekannt und beispielsweise in Deutscher, Methods in Enzymology,
182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice,
Springer-Verlag, New York (1982), beschrieben. Der/Die ausgewählte(n) Reinigungsschritt(e)
hängen
beispielsweise von der Beschaffenheit des verwendeten Herstellungsverfahrens und
dem bestimmten hergestellten PRO ab.
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E. Verwendung von PRO
-
Nucleotidsequenzen
(oder ihr Komplement), die für
PRO kodieren, haben verschiedene Anwendungsbereiche auf dem Gebiet
der Molekularbiologie, einschließlich Verwendungen als Hybridisierungssonden, beim
Chromosom- und Genkartieren und bei der Bildung von Antisense-RNA
und -DNA. PRO-Nucleinsäure ist
auch zur Herstellung von PRO-Polypeptiden durch die hierin beschriebenen
Rekombinationsverfahren nützlich.
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Das
Volllängen-Nativsequenz-PRO-Gen
oder Teile davon können
als Hybridisierungssonden für
eine cDNA-Bibliothek zur Isolierung der Volllängen-PRO-cDNA oder zur Isolierung
wiederum anderer cDNAs (beispielsweise jener, die für natürlich vorkommende
Varianten von PRO oder für
PRO aus anderen Spezies kodieren), die eine erwünschte Sequenzidentität zur hierin
offenbarten nativen PRO-Sequenz aufweisen, verwendet werden. Gegebenenfalls
beträgt
die Länge
der Sonden etwa 20 bis etwa 50 Basen. Die Hybridisierungssonden
können
von zumindest teilweise neuen Regionen der nativen Volllängen-Nucleotidsequenz
abgeleitet sein, worin jene Regionen ohne übermäßiges Experimentieren bestimmt
werden können,
oder von genomischen Sequenzen einschließlich Promotoren, Enhancerelementen
und Intronen von Nativsequenz-PRO. Ein Screening-Verfahren umfasst
beispielsweise das Isolieren der Kodierregion des PRO-Gens unter
Verwendung der bekannten DNA-Sequenz,
um eine selektierte Sonde von etwa 40 Basen zu synthetisieren. Hybridi sierungssonden
können
durch zahlreiche verschiedene Markierungen markiert werden, einschließlich Radionucleotide
wie z.B. 32P oder 35S
oder enzymatische Markierungen wie z.B. alkalische Phosphatase,
gebunden an die Sonde über
Avidin/Biotin-Bindungssysteme.
Markierte Sonden mit einer Sequenz, die zu jener des PRO-Gens der
vorliegenden Erfindung komplementär ist, können zum Screenen von Bibliotheken
menschlicher cDNA, genomischer DNA oder mRNA verwendet werden, um
zu bestimmen, an welche Mitglieder solcher Bibliotheken die Sonde
hybridisiert. Hybridisierungsverfahren sind in den nachstehenden
Beispielen näher
beschrieben.
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Jede
beliebige EST-Sequenz, die in der vorliegenden Anmeldung offenbart
ist, kann demähnlich
unter Einsatz der hierin offenbarten als Sonde verwendet werden.
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Andere
nützliche
Fragmente der PRO-Nucleinsäuren
sind Antisense- oder Sense-Oligonucleotide, umfassend
eine einzelsträngige
Nucleinsäuresequenz
(entweder RNA oder DNA), die in der Lage sind, an PRO-mRNA- (Sense)
oder PRO-DNA- (Antisense) Sequenzen zu binden. Antisense- oder Sense-Oligonucleotide
gemäß der vorliegenden
Erfindung umfassen ein Fragment der Kodierregion von PRO-DNA. Solch
ein Fragment umfasst im Allgemeinen zumindest etwa 14 Nucleotide,
vorzugsweise von etwa 14 bis 30 Nucleotide. Die Fähigkeit,
ein Antisense- oder ein Sense-Oligonucleotid auf Grundlage einer
cDNA-Sequenz, die für ein
bestimmtes Protein kodiert, abzuleiten, wird beispielsweise in Stein & Cohen (Cancer
Res. 48, 2659 (1988)) und in van der Krol et al. (BioTechniques
6, 958 (1988)) beschrieben.
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Bindung
von Antisense- oder Sense-Oligonucleotiden an Target-Nucleinsäuresequenzen
führt zur
Bildung von Duplices, die Transkription oder Translation der Targetsequenz
durch ein oder mehrere Mittel blockieren, einschließlich gesteigerten
Abbaus der Duplices, frühzeitiger
Termination von Transkription oder Translation, oder durch andere
Mittel. Somit können
die Antisense-Oligonucleotide verwendet werden, um Expression von
PRO-Proteinen zu blockieren. Antisense- und Sense-Oligonucleotide umfassen
weiters Oligonucleotide mit modifizierten Zucker-Phosphodiester-Hauptketten (oder mit
anderen Zuckerbindungen, wie jene, die in der WO 91/06629 beschrieben
sind), worin solche Zuckerbindungen gegenüber endoge nen Nucleasen resistent
sind. Solche Oligonucleotide mit resistenten Zuckerbindungen sind
in vivo stabil (d.h. sind in der Lage, gegen enzymatischen Abbau
resistent zu sein), behalten jedoch Sequenzspezifität bei, um
in der Lage zu sein, Target-Nucleotidsequenzen
zu binden.
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Andere
Beispiele für
Sense- oder Antisense-Oligonucleotide umfassen jene Oligonucleotide,
die kovalent an organische Gruppierungen, wie jene, die in der WO
90/10048 beschrieben sind, und andere Gruppierungen, die Affinität des Oligonucleotids
gegenüber
einer Target-Nucleinsäuresequenz
steigern, wie z.B. Poly-(L-Lysin),
gebunden sind. Darüber
hinaus können
interkalierende Agenzien, wie z.B. Ellipticin, und alkylierende
Mittel oder Metallkomplexe an Sense- oder Antisense-Oligonucleotide gebunden
werden, um Bindungsspezifitäten
des Antisense- oder Sense-Oligonucleotids für die Target-Nucleotidsequenz
zu modifizieren.
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Antisense-
oder Sense-Oligonucleotide können
mittels jedes beliebigen Gentransferverfahrens in eine Zelle eingeführt werden,
die die Target-Nucleinsäuresequenz
enthält,
einschließlich
beispielsweise CaPO4-vermittelte DNA-Transfektion,
Elektroporation oder unter Verwendung von Gentransfervektoren wie z.B.
Epstein-Barr-Virus. In einem bevorzugten Verfahren wird ein Antisense-
oder Sense-Oligonucleotid in einen geeigneten retroviralen Vektor
insertiert. Eine Zelle, die die Target-Nucleinsäuresequenz enthält, wird
entweder in vivo oder ex vivo mit dem rekombinanten retroviralen
Vektor kontaktiert. Geeignete retrovirale Vektoren umfassen, sind
jedoch nicht beschränkt
auf, jene, die aus dem Maus-Retrovirus M-MuLV, aus N2 (ein Retrovirus,
das aus M-MuLV abgeleitet ist) oder aus den Doppelkopievektoren,
die als DCT5A, DCT5B und DCT5C bezeichnet sind (siehe die WO 90/13641),
abgeleitet sind.
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Sense-
oder Antisense-Oligonucleotide können
auch in eine Zelle, die die Target-Nucleotidsequenz enthält, durch
Bildung eines Konjugats mit einem Ligandenbindungsmolekül wie in
der WO 91/04753 beschrieben eingeführt werden. Geeignete Ligandenbindungsmoleküle umfassen,
sind jedoch nicht beschränkt
auf, Zelloberflächenrezeptoren,
Wachstumsfaktoren, andere Cytokine oder andere Liganden, die sich
an Zelloberflächenrezeptoren
binden. Vorzugsweise stört
die Konjugation des Ligandenbindungsmoleküls die Fähigkeit des Ligandenbindungsmoleküls, sich
an sein entsprechendes Molekül
oder seinen entsprechenden Rezeptor zu binden oder den Eintritt
von Sense- oder Antisense-Oligonucleotid oder seiner konjugierten
Version in die Zelle zu blockieren, nicht wesentlich.
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Alternativ
dazu kann ein Sense- oder ein Antisense-Oligonucleotid in eine Zelle,
die die Target-Nucleinsäuresequenz
enthält,
durch Bildung eines Oligonucleotid-Lipid-Komplexes wie in der WO 90/10448 beschrieben
eingeführt
werden. Der Sense- oder Antisense-Oligonucleotid-Lipid-Komplex wird
vorzugsweise innerhalb der Zelle durch eine endogene Lipase dissoziiert.
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Antisense-
oder Sense-RNA- oder -DNA-Moleküle
weisen im Allgemeinen zumindest eine Länge von etwa 5 Basen, etwa
10 Basen, etwa 15 Basen, etwa 20 Basen, etwa 25 Basen, etwa 30 Basen,
etwa 35 Basen, etwa 40 Basen, etwa 45 Basen, etwa 50 Basen, etwa
55 Basen, etwa 60 Basen, etwa 65 Basen, etwa 70 Basen, etwa 75 Basen,
etwa 80 Basen, etwa 85 Basen, etwa 90 Basen, etwa 95 Basen, etwa
100 Basen oder mehr auf.
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Die
Sonden können
auch in PCR-Verfahren verwendet werden, um einen Pool an Sequenzen
zur Identifikation von nah verwandten PRO-Kodiersequenzen zu bilden.
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Nucleotidsequenzen,
die für
ein PRO kodieren, können
auch verwendet werden, um Hybridisierungssonden zum Kartieren des
Gens, das für
das PRO kodiert, und zur genetischen Analyse von Personen mit genetischen
Erkrankungen zu konstruieren. Die hierin bereitgestellten Nucleotidsequenzen
können
unter Verwendung bekannter Verfahren, wie z.B. In-situ-Hybridisierung,
Bindungsanalyse gegen bekannte chromosomale Marker und Hybridisierungs-Screenen
mit Bibliotheken, zu einem Chromosom und spezifischen Regionen eines
Chromosoms kartiert werden.
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Kodieren
die Kodiersequenzen für
PRO für
ein Protein, das sich an ein anderes Protein bindet (beispielsweise,
wenn das PRO ein Rezeptor ist), so kann das PRO in Tests zur Identifikation
der anderen Proteine oder Moleküle
verwendet werden, die in die Bindungswechselwirkung involviert sind.
Mittels solcher Verfahren können
Inhibitoren der Rezeptor/Liganden-Bindungswechselwirkung identifiziert
werden. Proteine, die in solche Bindungswechselwirkungen eingebunden
sind, können
auch verwendet werden, um auf Peptid oder niedermolekulare Inhibitoren
oder Agonisten der Bindungswechselwirkung zu screenen. Das Rezeptor-PRO
kann auch verwendet werden, um korrelative(n) Liganden zu isolieren.
Screening-Tests können
entworfen werden, um Leitverbindungen zu finden, die die biologische
Aktivität
eines nativen PRO oder eines Rezeptors für PRO nachahmen. Solche Screening-Tests
umfassen Tests, die zu High-Throughput-Screening von chemischen
Bibliotheken zugänglich
sind, was sie besonders geeignet zur Identifikation von niedermolekularen
Wirkstoffkandidaten macht. In Betracht gezogene kleine Moleküle schließen synthetische
organische oder anorganische Verbindungen ein. Die Tests können in
zahlreichen verschiedenen Formaten durchgeführt werden, einschließlich Protein-Protein-Bindungstests, biochemische
Screening-Tests, Immuntests und zellbasierte Tests, die auf dem
Gebiet der Erfindung gut beschrieben sind.
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Nucleinsäuren, die
für PRO
oder seine modifizierten Formen kodieren, können auch verwendet werden,
um entweder transgene Tiere oder "Knock-out"-Tiere zu bilden, die wiederum nützlich für die Entwicklung und
das Screenen von therapeutisch nützlichen
Reagenzien sind. Ein transgenes Tier (z.B. eine Maus oder eine Ratte)
ist ein Tier, das Zellen aufweist, die ein Transgen enthalten, wobei
dieses Transgen in das Tier oder in einen Vorfahren des Tiers in
einem pränatalen,
z.B. einem embryonalen, Stadium eingeführt wurde. Ein Transgen ist
eine DNA, die in das Genom einer Zelle integriert ist, aus der sich
ein transgenes Tier entwickelt. In einer Ausführungsform kann cDNA, die für PRO kodiert,
verwendet werden, um genomische DNA, die für PRO kodiert, gemäß bekannter
Verfahren und die zur Bildung von transgenen Tieren verwendeten
genomischen Sequenzen zu klonieren, wobei diese Tiere Zellen enthalten,
welche DNA, die für
PRO kodiert, exprimieren.
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Verfahren
zur Bildung von transgenen Tieren, insbesondere von Tieren wie Mäusen oder
Ratten, sind auf dem Gebiet der Erfindung bereits Routine und werden
bei spielsweise in den US-Patenten Nr. 4.736.866 und 4.870.009 beschrieben.
Typischerweise würden
bestimmte Zellen zur PRO-Transgen-Inkorporation mit gewebespezifischen
Enhancern als Target dienen. Transgene Tiere, die eine Kopie eines
für PRO
kodierenden Transgens enthalten, das in die Keimlinie des Tieres
in einem embryonalen Stadium eingeführt wurde, können verwendet
werden, um die Wirkung von gesteigerter Expression von für PRO kodierender
DNA zu untersuchen. Solche Tiere können als Testtiere für Reagenzien
verwendet werden, von denen angenommen wird, dass sie Schutz vor
beispielsweise pathologischen Leiden, die mit seiner Überexpression
assoziiert sind, verleihen. Gemäß diesem
Aspekt der Erfindung wird ein Tier mit dem Reagens behandelt, und
eine reduzierte Häufigkeit
des pathologischen Leidens im Vergleich zu nicht behandelten Tieren,
die das Transgen in sich tragen, würde auf eine mögliche therapeutische
Wirkung bezüglich
des pathologischen Leidens hinweisen.
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Alternativ
dazu können
nicht-menschliche Homologe von PRO verwendet werden, um ein PRO"Knock-out"-Tier zu konstruieren,
das ein defektes oder verändertes,
für PRO
kodierendes Gen als ein Resultat homologer Rekombination zwischen
dem endogenen, für
PRO kodierenden Gen und geänderter
genomischer, für
PRO kodierender DNA, eingeführt
in einen embryonalen Stammzelle des Tiers, aufweist. Beispielsweise
kann für
PRO kodierende cDNA verwendet werden, um für PRO kodierende genomische
DNA gemäß den bekannten
Verfahren zu klonieren. Ein Abschnitt der genomischen, für PRO kodierenden
DNA kann deletiert oder durch ein anderes Gen ersetzt werden, wie
beispielsweise durch ein Gen, das für einen selektierbaren Marker
kodiert, der verwendet werden kann, um Integration zu überwachen.
Typischerweise werden mehrere kb unveränderter flankierender DNA (sowohl
an den 5'- als auch 3'-Enden) in den Vektor
eingebunden [siehe z.B. Thomas & Capecchi,
Cell 51, 503 (1987), für
eine Beschreibung homologer Rekombinationsvektoren]. Der Vektor
wird in eine embryonale Stammzellenlinie (z.B. durch Elektroporation)
eingeführt,
und Zellen, in denen sich die eingeführte DNA mit der endogenen
DNA homolog rekombiniert hat, werden ausgewählt [siehe z.B. Li et al.,
Cell 69, 915 (1992)]. Die ausgewählten
Zellen werden dann in eine Blastozyste eines Tiers (z.B. einer Maus
oder Ratte) injiziert, um Aggrergationschimären zu bilden [siehe z.B. Bradley in:
Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach,
E. J. Robertson (Hrsg.) (IRL, Oxford, 1987), 113-152]. Ein Hybridembryo
kann dann in ein geeignetes, scheinschwangeres weibliches Ammentier
implantiert und ausgetragen werden, um ein "Knock-out"-Tier zu schaffen. Nachkommenschaft,
die die homolog rekombinierte DNA in ihren Keimzellen trägt, kann
mittels Standardverfahren identifiziert werden und kann verwendet
werden, um Tiere zu züchten,
in denen alle Zellen des Tiers die homolog rekombinierte DNA enthalten. Knockout-Tiere
können
beispielsweise aufgrund ihrer Fähigkeit,
Abwehr gegen bestimmte pathologische Leiden aufzubauen, sowie aufgrund
ihrer Entwicklung pathologischer Leiden wegen des fehlenden PRO-Polypeptids
charakterisiert werden.
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Nucleinsäure, die
für die
PRO-Polypeptide kodiert, kann auch bei Gentherapie eingesetzt werden.
Bei Gentherapieanwendungen werden Gene in Zellen eingeführt, um
In-vivo-Synthese eines therapeutisch wirksamen genetischen Produkts,
beispielsweise zum Ersatz eines defekten Gens, zu erreichen. "Gentherapie" schließt sowohl
herkömmliche
Gentherapie ein, in der eine langanhaltende Wirkung durch eine einzelne
Behandlung erreicht wird, als auch die Verabreichung von gentherapeutischen
Mitteln, die einmalige oder wiederholte Verabreichung einer therapeutisch
wirksamen DNA oder mRNA umfasst. Antisense-RNAs und -DNAs können als
therapeutische Agenzien zum Blockieren der Expression bestimmter
Gene in vivo verwendet werden. Es konnte bereits gezeigt werden,
dass kurze Antisense-Oligonucleotide
in Zellen eingeführt
werden können,
wo sie trotz geringer intrazellulärer Konzentrationen, die durch
ihre eingeschränkte
Aufnahme durch die Zellmembran verursacht wird, als Inhibitoren
wirken (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4143-4146
(1986)). Die Oligonucleotide können
modifiziert werden, um ihre Aufnahme zu steigern, z.B. durch Substituieren
ihrer negativ geladenen Phosphodiestergruppen durch ungeladene Gruppen.
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Es
gibt zahlreiche verschiedene Verfahren, die zum Einführen von
Nucleinsäuren
in lebensfähige
Zellen verfügbar
sind. Die Verfahren variieren je nachdem, ob die Nucleinsäure in vitro
in kultivierte Zellen oder in vivo in die Zellen des beabsichtigten
Wirts transferiert werden. Verfahren, die für den Transfer von Nucleinsäure in Säuge tierzellen
in vitro geeignet sind, umfassen die Verwendung von Liposomen, Elektroporation,
Mikroinjektion, Zellfusion, DEAE-Dextran, das Calciumphosphat-Fällungsverfahren usw. Die zur
Zeit bevorzugten In-vivo-Gentransferverfahren umfassen Transfektion über vitale
(typischerweise retrovirale) Vektoren und virale Hüll-protein-Liposomen-vermittelte
Transfektion (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993)). In
manchen Situationen ist es wünschenswert,
die Nucleinsäurequelle
mit einem Mittel bereitzustellen, das auf die Targetzellen gerichtet
ist, wie beispielsweise mit einem Antikörper, der für ein Zelloberflächenmembranprotein
oder für
die Targetzelle spezifisch ist, mit einem Liganden für einen
Rezeptor auf der Targetzelle usw. Werden Liposomen verwendet, so
können
Proteine, die sich an ein mit Endozytose assoziiertes Zelloberflächenmembranprotein
binden, zum Targeting und/oder zur Erleichterung der Aufnahme verwendet
werden, z.B. Capsidproteine oder Fragmente davon, die für einen
bestimmten Zelltyp tropisch sind, Antikörper für Proteine, die beim Zyklieren
Internalisierung erfahren, oder Proteine, die auf intrazelluläre Lokalisierung
gerichtet sind und intrazelluläre
Halbwertszeit verlängern.
Das Verfahren zu Rezeptor-vermittelter Endozytose wird beispielsweise
von Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); und von Wagner
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990), beschrieben.
Ein Überblick
zu Genmarkierungs- und Gentherapie-Arbeitsvorschriften wird in Anderson
et al., Science 256, 808-813 (1992), geliefert.
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Die
hierin beschriebenen PRO-Polypeptide können auch als Molekulargewichtsmarker
im Rahmen von Elektrophorese eingesetzt werden, und die isolierten
Nucleinsäuresequenzen
können
zur rekombinanten Expression jener Marker verwendet werden.
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Die
hierin beschriebenen, für
die PRO-Polypeptide kodierenden Nucleinsäuremoleküle oder Fragmente davon sind
zur Chromosomenidentifikation nützlich.
In dieser Hinsicht besteht ein permanenter Bedarf daran, neue Chromosomenmarker
zu identifizieren, da, basierend auf aktuellen Sequenzdaten, relativ
wenig Chromosommarkierungs-Reagenzien bis heute erhältlich sind.
Jedes PRO-Nucleinsäuremolekül der vorliegenden
Erfindung kann als ein Chromosomenmarker verwendet werden.
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Die
PRO-Polypeptide und Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden
Erfindung können
auch zur Gewebetypisierung verwendet werden, worin die PRO-Polypeptide
der vorliegenden Erfindung in einem Gewebe differenziell im Vergleich
zu einem anderen exprimiert werden können. PRO-Nucleinsäuremoleküle finden
Verwendung bei der Herstellung von Sonden für PCR, Northern-Analyse, Southern-Analyse
und Western-Analyse.
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Die
hierin beschriebenen PRO-Polypeptide können auch als therapeutische
Mittel verwendet werden. Die PRO-Polypeptide der vorliegenden Erfindung
können
gemäß bekannten
Verfahren zur Herstellung pharmazeutisch nützlicher Zusammensetzungen
formuliert werden, wobei das PRO-Produkt hiervon in einer Beimischung
mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägervehikel kombiniert wird.
Therapeutische Formulierungen werden zur Lagerung durch Vermischen
des aktiven Bestandteils mit dem erwünschten Reinheitsgrad mit optionalen
physiologisch annehmbaren Trägern,
Exzipienten oder Stabilisatoren (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage,
A. Osol (Hrsg.) (1980)) in Form von lyophilisierten Formulierungen
oder wässrigen
Lösungen
hergestellt. Annehmbare Träger,
Exzipienten oder Stabilisatoren sind für Rezipienten bei den verwendeten
Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer
wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidanzien
einschließlich
Ascorbinsäure;
niedermolekulare Polypeptide (mit weniger als etwa 10 Resten); Proteine
wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile
Polymere wie z.B. Polyvinylpyrrolidon, Aminosäuren wie z.B. Glycin, Glutamin,
Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und
andere Kohlenhydrate einschließlich
Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie EDTA; Zuckeralkohole
wie z.B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen wie beispielsweise
Natrium; und/oder nichtionische Tenside wie TWEENTM,
PLURONICSTM oder PEG.
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Die
zur In-vivo-Verabreichung zu verwendenden Formulierungen müssen steril
sein. Dies wird leicht mittels Filtration durch sterile Filtrationsmembranen
vor oder nach Gefriertrocknung und Wiederherstellung erreicht.
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Therapeutische
Zusammensetzungen hierin werden im Allgemeinen in einen Behälter mit
einer sterilen Zugangsöffnung,
beispielsweise in einen intravenösen
Lösungsbeutel
oder eine Phiole mit einem Septum, das mit einer subkutanen Injektionsnadel
durchstochen werden kann, gegeben.
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Die
Art der Verabreichung entspricht bekannten Verfahren, z.B. Injektion
oder Infusion auf intravenösem,
intraperitonealem, intrazerebralem, intramuskulärem, intraokularem, intraarteriellem
oder intraläsionalem Weg,
topische Verabreichung oder mittels eines Retardsystems.
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Dosierungen
und erwünschte
Wirkstoffkonzentrationen pharmazeutischer Zusammensetzungen der vorliegenden
Erfindung können
je nach bestimmter beabsichtigter Verwendung variieren. Die Festlegung
der geeigneten Dosierung oder Art der Verabreichung fällt in den
Wissensbereich eines gewöhnlichen
Arztes. Tierexperimente liefern verlässliche Bezugswerte für die Bestimmung
wirksamer Dosen zur Behandlung von Menschen. Die Umrechnung von
wirksamen Dosen zwischen verschiedenen Spezies kann gemäß den Prinzipien, die
von J. Mordenti und W. Chappell, "The use of interspecies scaling in toxicokinetics", in: Toxicokinetics
and New Drug Development, Yacobi et al. (Hrsg.), Pergamon Press,
New York, 42-96 (1989), festgelegt wurden, erfolgen.
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Wird
In-vivo-Verabreichung eines PRO-Polypeptids oder eines Agonisten
oder Antagonisten davon verwendet, so können normale Dosierungsmengen
von etwa 10 ng/kg bis zu 100 mg/kg Säugetierkörpergewicht oder mehr pro Tag,
vorzugsweise von etwa 1 μg/kg/Tag
bis zu 10 mg/kg/Tag, je nach Art der Verabreichung variieren. Leitfäden zu den
bestimmten Dosierungen und Verabreichungsverfahren werden in der
Literatur bereitgestellt; siehe z.B. die US-Patente Nr. 4.657.760;
5.206.344 oder 5.225.212. Es wird vorausgesetzt, dass verschiedene
Formulierungen für
verschiedene Behandlungsverbindungen und verschiedene Erkrankungen
wirksam sind, dass die Verabreichung, die beispielsweise für ein Organ
oder Gewebe bestimmt ist, eine andere Art der Verabreichung erforderlich
machen kann als die Verabreichung an ein anderes Organ oder Gewebe.
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Ist
Retard-Verabreichung eines PRO-Polypeptids in einer Formulierung
mit Freisetzungseigenschaften erwünscht, die zur Behandlung jeder
beliebigen Erkrankung oder jedes beliebigen Leidens geeignet sind, die
oder das Verabreichung des PRO-Polypeptids
erfordert, so wird Mikroeinkapselung des PRO-Polypeptids erwogen.
Mikroeinkapselung von rekombinanten Proteinen für verzögerte Freisetzung wurde mit
menschlichem Wachstumshormon (rhGH), Interferon- (rhIFN-), Interleukin-2
und MN rgp120 bereits erfolgreich durchgeführt. Johnson et al., Nat. Med.
2, 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther. 27, 1221-1223 (1993); Hora
et al., Bio/Technology 8, 755-758 (1990); Cleland, "Design and Production
of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide
Microsphere Systems",
in: Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell & Newman (Hrsg.),
Plenum Press: New York, 439-462 (1995); WO 97/03692, WO 96/40072,
WO 96/07399; und das US-Patent Nr. 5.654.010.
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Die
Retard-Formulierungen dieser Proteine wurden unter Verwendung von
Poly-Milch-Coglykolsäure- (PLGA-)
Polymer aufgrund seiner Biokompatibilität und seinen umfassenden biologisch
abbaubaren Eigenschaften entwickelt. Die Abbauprodukte von PLGA,
Milch- und Glykolsäuren,
können
im menschlichen Körper rasch
entsorgt werden. Darüber
hinaus kann die Abbaubarkeit dieses Polymers je nach seinem Molekulargewicht
und seiner Zusammensetzung von Monaten bis hin zu Jahren eingestellt
werden. Lewis, "Controlled
release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer", in: M. Chasin & R. Langer (Hrsg.),
Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems, Marcel Dekker,
New York, 1-41 (1990).
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Diese
Erfindung umfasst Verfahren zum Screenen von Verbindungen, um jene
zu identifizieren, die das PRO-Polypeptid nachahmen (Agonisten)
oder die Wirkung des PRO-Polypeptids unterbinden (Antagonisten).
Screeningtests für
Antagonisten-Wirkstoffkandidaten
werden entworfen, um Verbindungen zu identifizieren, die sich an
die PRO-Polypeptide binden oder mit ihnen Komplexe bilden, für die die
hierin identifizierten Gene kodieren, oder die sonst die Wechselwirkung
der kodierten Polypeptide mit anderen zellulären Proteinen stören. Solche
Screeningtests umfassen Tests, die für High-Throughput-Screenen
von chemischen Bibliotheken zugänglich sind,
wodurch sie sich besonders gut zur Identifikation niedermolekularer
Wirkstoffkandidaten eignen.
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Die
Tests können
in zahlreichen verschiedenen Formaten durchgeführt werden, einschließlich Protein-Protein-Bindungstests,
biochemischer Screeningtests, Immuntests und zellbasierter Tests,
die auf dem Gebiet der Erfindung eingehend beschrieben sind.
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Alle
Tests für
Antagonisten gleichen sich darin, dass sie das Kontaktieren des
Wirkstoffkandidaten mit einem PRO-Polypeptid, für das eine hierin identifizierte
Nucleinsäure
kodiert, unter Bedingungen und eine ausreichende Zeit lang erfordert,
um diese zwei Komponenten in Wechselwirkung zu setzen.
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Bei
Bindungstests manifestiert sich die Wechselwirkung in Form einer
Bindung, und der gebildete Komplex kann im Reaktionsgemisch isoliert
oder nachgewiesen werden. In einer bestimmten Ausführungsform
wird das durch das hierin identifizierte Gen kodierte PRO-Polypeptid
oder der Wirkstoffkandidat an einer festen Phase, z.B. einer Mikrotiterplatte,
durch kovalente oder nicht-kovalente Bindungen immobilisiert. Nicht-kovalente
Bindung erfolgt im Allgemeinen durch Beschichten der festen Oberfläche mit
einer Lösung
des PRO-Polypeptids und Trocknen. Alternativ dazu kann ein immobilisierter
Antikörper,
z.B. ein monoklonaler Antikörper,
der für
das zu immobilisierende PRO-Polypeptid spezifisch ist, verwendet
werden, um es an einer festen Oberfläche zu verankern. Der Test
wird durch Zusetzen der nicht-immobilisierten Komponente, die mit
einer nachweisbaren Markierung markiert werden kann, zur immobilisierten
Komponente, z.B. der beschichteten Oberfläche, die die verankerte Komponente
aufweist, durchgeführt.
Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, werden die nicht umgesetzten
Komponenten z.B. durch Waschen entfernt, und die an der festen Oberfläche verankerten
Komplexe werden nachgewiesen. Trägt
die ursprünglich
nicht-immobilisierte Komponente eine nachweisbare Markierung, so
weist die Detektion von an der Oberfläche immobilisierter Markierung
darauf hin, dass Komplexbildung stattgefunden hatte. Trägt die ursprünglich nicht-immobilisierte
Komponente keine Markierung, kann Komplexbildung beispielsweise
durch Verwendung ei nes markierten Antikörpers, der den immobilisierten
Komplex spezifisch bindet, nachgewiesen werden.
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Zeigt
die Kandidatenverbindung mit einem bestimmten PRO-Polypeptid, für das das
hierin identifizierte Gen kodiert, Wechselwirkung, bindet sich jedoch
nicht daran, so kann ihre Wechselwirkung mit diesem Polypeptid mittels
zur Detektion von Protein-Protein-Wechselwirkungen
bekannter Verfahren getestet werden. Solche Tests umfassen herkömmliche
Ansätze,
wie z.B. Vernetzung, Co-Immunfällung
und Co-Reinigung
mittels Gradienten oder chromatographischer Säulen. Darüber hinaus können Protein-Protein-Wechselwirkungen unter
Verwendung eines auf Hefe basierenden genetischen Systems beobachtet
werden, das von Fields & Mitarbeitern
(Fields & Song,
Nature (London) 340, 245-246 (1989)); Chien et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)), beschrieben wurde, wie von
Chevray & Nathans,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991), offenbart. Zahlreiche
Transkriptionsaktivatoren, wie z.B. Hefe GAL4, bestehen aus zwei
physikalisch getrennten modularen Domänen, wobei die eine als die
DNA-Bindungsdomäne
und die andere als die Transkriptions-Aktivierungsdomäne agiert.
Das in den obigen Veröffentlichungen
beschriebene Hefeexpressionssystem (im Allgemeinen als das "Zweihybridsystem" bezeichnet) profitiert
von dieser Eigenschaft und verwendet zwei Hybridproteine, eines,
in dem das Targetprotein an die DNA-Bindungsdomäne von GAL4 fusioniert ist,
und ein zweites, in dem Kandidaten-Aktivierungsproteine an die Aktivierungsdomäne fusioniert
sind. Die Expression von einem GAL1-lacZ-Reportergen unter der Kontrolle
eines GAL4-aktivierten Promotors hängt von der Wiederherstellung
von GAL4-Aktivität über Protein-Protein-Wechselwirkung
ab. Kolonien, die wechselwirkende Polypeptide enthalten, werden
mit einem chromogenen Substrat für β-Galactosidase
nachgewiesen. Ein vollständiges
Set (MATCHMAKERTM) zur Identifikation von
Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen zwei spezifischen Proteinen
unter Verwendung des Zweihybridverfahrens ist im Handel bei Clontech
erhältlich.
Dieses System kann auch ausgedehnt werden, um Proteindomänen zu kartieren,
die in spezifische Protein-Wechselwirkungen involviert sind, sowie
Aminosäurereste,
die für
diese Wechselwirkungen maßgeblich
sind, genau zu lokalisieren.
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Verbindungen,
die Wechselwirkungen eines Gens, das für ein hierin identifiziertes
PRO-Polypeptid kodiert, und anderer intra- oder extrazellulärer Komponenten
stören,
können
wie folgt getestet werden: üblicherweise
wird ein Reaktionsgemisch hergestellt, das das Produkt des Gens
und der intra- oder extrazellulären Komponente
unter solchen Bedingungen und über
eine bestimmte Zeitspanne hinweg enthält, die Wechselwirkung und
Bindung der zwei Produkte ermöglicht.
Um die Fähigkeit
einer Kandidatenverbindung zu testen, Bindung zu hemmen, wird die
Reaktion in Abwesenheit und in Gegenwart der Testverbindung durchgeführt. Weiters
kann ein Placebo zu einem dritten Reaktionsgemisch zugesetzt werden,
das als positive Kontrolle dient. Die Bindung (Komplexbildung) zwischen
der Testverbindung und der intra- oder extrazellulären Komponente,
die im Gemisch vorhanden sind, wird wie zuvor beschrieben beobachtet.
Die Bildung eines Komplexes in der/den Kontrollreaktion(en), jedoch
nicht im Reaktionsgemisch, das die Testverbindung enthält, weist
darauf hin, dass die Testverbindung die Wechselwirkung der Testverbindung
und ihres Reaktionspartners stört.
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Um
auf Antagonisten zu testen, kann das PRO-Polypeptid gemeinsam mit
der auf eine bestimmte Aktivität
zu screenenden Verbindung zu einer Zelle zugesetzt werden, und die
Fähigkeit
der Verbindung, die Aktivität
von Interesse in Gegenwart des PRO-Polypetpids zu hemmen, weist
darauf hin, dass die Verbindung ein Antagonist gegenüber dem
PRO-Polypeptid ist. Alternativ dazu können Antagonisten durch Kombinieren
des PRO-Polypeptids und eines potenziellen Antagonisten mit membrangebundenen
PRO-Polypeptidrezeptoren oder rekombinanten Rezeptoren unter für einen
Konkurrenzhemmungstest geeigneten Bedingungen nachgewiesen werden.
Das PRO-Polypeptid kann markiert werden, beispielsweise durch Radioaktivität, sodass
die Anzahl an PRO-Polypeptidmolekülen, die an den Rezeptor gebunden
sind, verwendet werden kann, um die Wirksamkeit des potenziellen
Antagonisten zu bestimmen. Das für
den Rezeptor kodierende Gen kann durch zahlreiche verschiedene Verfahren,
die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, beispielsweise durch
Liganden-Panning und FACS-Sortieren, identifiziert werden. Coligan
et al., Current Protocols in Immun. 1(2), Kapitel 5 (1991). Vorzugsweise
wird Expressionsklonieren verwendet, wobei polyadenylierte RNA aus
einer Zelle hergestellt wird, die auf ein PRO-Polypeptid reagiert,
und eine cDNA-Bibliothek, die aus dieser RNA hergestellt wird, in
Pools aufgeteilt und verwendet wird, um COS-Zellen oder andere Zellen
zu transfizieren, die auf das PRO-Polypeptid nicht reagieren. Transfizierte
Zellen, die auf Glasobjektträgern
gezüchtet
werden, werden markiertem PRO-Polypeptid
ausgesetzt. Das PRO-Polypetpid kann durch zahlreiche verschiedene Mittel
markiert sein, einschließlich
Iodierung oder Einschluss einer Erkennungsstelle für eine ortsspezifische Proteinkinase.
Nach Fixierung und Inkubation werden die Objektträger autoradiogtaphischer
Analyse unterzogen. Positive Pools werden identifiziert, und Sub-Pools
werden unter Verwendung eines interaktiven Sub-Pooling- und Re-Screening-Verfahrens
hergestellt und neu transfiziert, was schließlich einen einzelnen Klon
ergibt, der für
den mutmaßlichen
Rezeptor kodiert.
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Als
ein alternativer Ansatz für
Rezeptoridentifikation kann markiertes PRO-Polypeptid mittels Photoaffinität mit Zellmembran
oder mit Extraktpräparaten,
die das Rezeptormolekül
exprimieren, verbunden werden. Vernetztes Material wird durch PAGE
aufgelöst,
und ein Röntgenfilm
wird damit belichtet. Der markierte Komplex, der den Rezeptor enthält, kann
ausgeschnitten, in Peptidfragmente aufgelöst und Proteinmikrosequenzieren
unterzogen werden. Die mittels Mikrosequenzierens gewonnene Aminosäuresequenz
würde dann
verwendet werden, um eine Reihe von degenerierten Oligonucleotid-Sonden
zu entwerfen, um eine cDNA-Bibliothek zu screenen und hierdruch
das für
den mutmaßlichen
Rezeptor kodierende Gen zu identifizieren.
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In
einem anderen Test für
Antagonisten werden Säugetierzellen
oder ein Membranpräparat,
das den Rezeptor exprimiert, mit markiertem PRO-Polypeptid in Gegenwart
der Kandidatenverbindung inkubiert. Die Fähigkeit der Verbindung, diese
Wechselwirkung zu fördern
oder zu blockieren, kann dann gemessen werden.
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Spezifischere
Beispiele für
potenzielle Antagonisten umfassen ein Oligonucleotid, das sich an
die Fusionen von Immunglobulin mit PRO-Polypeptid bindet, und insbesondere
Antikörper
einschließlich,
ohne dadurch eine Einschränkung
darzustellen, poly- und monoklonaler Antikörper und Antikörperfragmente,
einkettiger Antikörper,
anti-idiotypischer Antikörper
und chimärer
oder humanisierter Versionen solcher An tikörper oder Fragmente sowie menschlicher
Antikörper
und Antikörperfragmente.
Alternativ dazu kann ein potentieller Antagonist ein nahe verwandtes
Protein, beispielsweise eine mutierte Form des PRO-Polypeptids,
das den Rezeptor erkennt, jedoch keine Wirkung verleiht, sein und
dabei die Wirkung des PRO-Polypeptids kompetitiv hemmen.
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Ein
anderer potenzieller PRO-Polypeptidantagonist ist ein Antisense-RNA-
oder -DNA-Konstrukt, hergestellt unter Verwendung von Antisense-Technologie,
worin z.B. ein Antisense-RNA- oder -DNA-Molekül so wirkt, dass es die Translation
von mRNA durch Hybridisieren an Target-mRNA und Unterbinden von
Proteintranslation blockiert. Antisense-Technologie kann verwendet
werden, um Genexpression durch Tripelhelix-Bildung oder durch Antisense-DNA
oder -RNA zu steuern, wobei beide Verfahren auf Bindung eines Polynucleotids
an DNA oder RNA basieren. Beispielsweise wird der 5'-Kodierabschnitt
der Polynucleotidsequenz, die für die
reifen PRO-Polypeptide
hierin kodiert, verwendet, um ein Antisense-RNA-Oligonucleotid mit
einer Länge von
etwa 10 bis 40 Basenpaare zu entwerfen. Ein DNA-Oligonucleotid wird
so entworfen, dass es komplementär
zu einer Region des Gens ist, das in Transkription eingebunden ist
(Tripelhelix – siehe
Lee et al., Nucl. Acids. Res. 6, 3073 (1979); Cooney et al., Science
241, 456 (1988); Dervan et al., Science 251, 1360 (1991)), wodurch
Transkription und die Produktion des PRO-Polypeptids unterbunden
werden. Das Antisense-RNA-Oligonucleotid hybridisiert an die mRNA
in vivo und blockiert Translation des mRNA-Moleküls zum PRO-Polypeptid (Antisense – Okano,
Neurochem. 56, 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors
of Gene Expression, CRC Press: Boca Raton, FL (1988)). Die zuvor
beschriebenen Oligonucleotide können
auch Zellen zugeführt
werden, sodass die Antisense-RNA oder -DNA in vivo exprimiert werden
kann, um Produktion des PRO-Polypeptids zu hemmen. Wird Antisense-DNA
verwendet, so werden Oligodesoxyribonucleotide, die von der Translationsstartstelle,
z.B. zwischen den Positionen von etwa –10 und +10 der Targetgen-Nucleotidsequenz,
abstammen, bevorzugt.
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Potenzielle
Antagonisten umfassen kleine Moleküle, die sich an die aktive
Stelle, die Rezeptorbindungsstelle oder den Wachstumsfaktor oder
eine andere relevante Bin dungsstelle des PRO-Polypeptids binden,
wodurch die normale biologische Aktivität des PRO-Polypeptids blockiert
wird. Beispiele für
kleine Moleküle
umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, kleine Peptide oder
peptidähnliche
Moleküle,
vorzugsweise lösliche
Peptide, und synthetische, organische oder anorganische Nichtpeptidyl-Verbindungen.
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Ribozyme
sind enzymatische RNA-Moleküle,
die in der Lage sind, die spezifische Spaltung von RNA zu katalysieren.
Ribozyme wirken durch sequenzspezifische Hybridisierung an die komplementäre Target-RNA,
gefolgt von endonucleolytischer Spaltung. Spezifische Ribozym-Spaltungsstellen
innerhalb eines potenziellen RNA-Targets
können
durch bekannte Verfahren identifiziert werden. Für nähere Details siehe z.B. Rossi,
Current Biology 5, 469-471 (1994), und die PCT-Veröffentlichung
Nr. WO 97/33551 (veröffentlicht
am 18. September 1997).
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Nucleinsäuremoleküle in Tripelhelix-Formation,
die verwendet werden, um Transkription zu hemmen, sollten einzelsträngig und
aus Desoxynucleotiden zusammengesetzt sein. Die Basenzusammensetzung
dieser Oligonucleotide ist so bestimmt, dass sie Tripelhelix-Formation
gemäß den Hoogsteen-Basenpaarungsregeln
fördert,
die im Allgemeinen relativ große
Abschnitte mit Purinen oder Pyrimidinen an einem Strang eines Duplex
erfordern. Für
nähere
Details siehe z.B. die PCT-Veröffentlichung
Nr. WO 97/33551, s.o.
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Diese
kleinen Moleküle
können
durch einen oder mehrere der Screeningtests, die hierin erläutert werden,
und/oder durch irgendein anderes Screeningverfahren, das Fachleuten
bekannt ist, identifiziert werden.
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F. Anti-PRO-Antikörper
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiters Anti-PRO-Antikörper bereit.
Beispiele für
solche Antikörper schließen polyklonale,
monoklonale, humanisierte, bispezifische und heterokonjugierte Antikörper ein.
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1. Polyklonale
Antikörper
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Die
Anti-PRO-Antikörper
können
polyklonale Antikörper
umfassen. Verfahren zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern sind
Fachleuten bekannt. Polyklonale Antikörper können in einem Säugetier,
beispielsweise durch eine oder mehrere Injektionen eines immunisierenden
Mittels und, sofern erwünscht,
eines Adjuvans, gezüchtet
werden. Typischerweise wird das immunisierende Mittel und/oder das
Adjuvans dem Säugetier
durch multiple subkutane oder intraperitoneale Injektionen injiziert.
Das immunisierende Mittel kann das PRO-Polypeptid oder ein Fusionsprotein
davon umfassen. Es kann nützlich
sein, das immunisierende Mittel an ein Protein zu konjugieren, das
dafür bekannt
ist, im zu immunisierenden Tier immunogen zu sein. Beispiele für solche
immunogenen Proteine umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf,
Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin,
Serumalbumin, Rinderthyroglobulin und Sojabohnentrypsininhibitor.
Beispiele für
Adjuvanzien, die verwendet werden können, umfassen komplettes Freundsches
Adjuvans und MPL-TDM-Adjuvans (Monophosphoryl-Lipid A, synthetisches
Trehalosedicorynomycolat). Die Arbeitsvorschrift zur Immunisierung kann
von Fachleuten ohne übermäßiges Experimentieren
ausgewählt
werden.
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2. Monoklonale
Antikörper
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Die
Anti-PRO-Antikörper
können
alternativ zu polyklonalen Antikörpern
monoklonale Antikörper
sein. Monoklonale Antikörper
können
unter Verwendung von Hybridomverfahren, wie beispielsweise jenen,
die von Kohler & Milstein,
Nature 356, 495 (1975), beschrieben werden, hergestellt werden.
In einem Hybridomverfahren wird eine Maus, ein Hamster oder ein
anderes geeignetes Wirttier typischerweise mit einem immunisierenden
Mittel immunisiert, um Lymphozyten hervorzubringen, die Antikörper produzieren
oder zu produzieren in der Lage sind, die sich spezifisch an das
immunisierende Mittel binden. Alternativ dazu können die Lymphozyten in vitro
immunisiert werden.
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Das
immunisierende Mittel umfasst typischerweise das PRO-Polypeptid
oder ein Fusionsprotein davon. Im Allgemeinen werden entweder Lymphozyten
des peripheren Bluts ("PBLs"), sofern Zellen
menschlichen Ursprungs erwünscht
sind, oder Milzzellen oder Lymphknotenzellen verwendet, sofern nicht-menschliche Säugetierquellen
erwünscht
sind. Die Lymphozyten werden dann mit einer sich unbegrenzt vermehrenden Zelllinie
unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels, wie z.B. Polyethylenglykol,
fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden [Goding, Monoclonal
Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 59-103 (1986)].
Sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind üblicherweise transformierte
Säugetierzellen,
insbesondere Myelomzellen von Nagetieren, Rindern und Menschen. Üblicherweise
werden Ratten- oder Mausmyelomzelllinien verwendet. Die Hybridomzellen
können
in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert werden, das vorzugsweise
eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben
der nicht fusionierten, sich unbegrenzt vermehrenden Zellen hemmen.
Fehlt beispielsweise den Ausgangszellen das Enzym Hypoxanthinguaninphosphoribosyltransferase
(HGPRT oder HPRT), so umfasst das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise
Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin ("HAT-Medium"), Substanzen, die das Wachstum von
HGPRT-defizienten
Zellen unterbindet.
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Bevorzugte,
sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind jene, die wirksam fusionieren,
die stabile hochgradige Expression von Antikörper durch die ausgewählten, Antikörper produzierenden
Zellen fördern und
die auf ein Medium wie beispielsweise HAT-Medium empfindlich sind.
Noch bevorzugtere, sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind Maus-Myelomlinien,
die beispielsweise beim Salk Institute Cell Distribution Center, San
Diego, Kalifornien, und bei der American Type Culture Collection,
Manassas, Virginia, erhalten werden können. Menschliche Myelom- und
Maus-Mensch-Heteromyelomzelllinien
wurden auch für
die Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern beschrieben
[Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal
Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker,
Inc., New York, 51-63 (1987)].
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Das
Kulturmedium, in dem die Hybridomzellen kultiviert werden, kann
dann auf die Gegenwart von monoklonalen Antikörpern, die gegen PRO gerichtet
sind, getestet werden. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität von monoklonalen
Antikörpern,
die durch die Hybridomzellen produziert werden, durch Immunfällung oder
durch einen In-vitro-Bindungstest, wie beispielsweise Radioimmuntest
(RIA) oder enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA), bestimmt.
Solche Verfahren und Tests sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
Die Bindungsaffinität
des monoklonalen Antikörpers
kann beispielsweise durch die Scatchard-Analyse von Munson & Pollard, Anal.
Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt werden.
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Nachdem
die erwünschten
Hybridomzellen identifiziert wurden, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren
subkloniert und mittels herkömmlicher
Verfahren gezüchtet
werden [Goding, s.o.]. Geeignete Kulturmedien für diesen Zweck umfassen beispielsweise
Dulbecco's Modified
Eagle's Medium und
RPMI-1640-Medium. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in
vivo als Aszites in einem Säugetier
gezüchtet werden.
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Die
monoklonalen Antikörper,
die durch die Subklone sekretiert werden, können aus dem Kulturmedium oder
der Ascitesflüssigkeit
durch herkömmliche
Immunglobulinreinigungsverfahren, wie beispielsweise Protein-A-Sepharose,
Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie,
isoliert oder gereinigt werden.
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Die
monoklonalen Antikörper
können
auch durch DNA-Rekombinationsverfahren, wie jenen, die im US-Patent
Nr. 4.816.567 beschrieben werden, hergestellt werden. DNA, die für die monoklonalen
Antikörper der
Erfindung kodiert, kann leicht isoliert und unter Verwendung herkömmlicher
Verfahren (z.B. unter Verwendung von Oligonucleotidsonden, die in
der Lage sind, sich spezifisch an Gene zu binden, die für die schweren und
leichten Ketten von Maus-Antikörper
kodieren) sequenzierf werden. Die Hybridomzellen der Erfindung dienen
als eine bevorzugte Quelle für
solche DNA. Nachdem sie isoliert wurde, kann die DNA in Expressionsvektoren
platziert werden, die dann in Wirtszellen wie beispielsweise Affen-COS-Zellen,
Chinahamster- Eierstock- (CHO-)
Zellen oder Myelomzellen transfiziert werden, die sonst kein Immunglobulinprotein
produzieren, um die Synthese von monoklonalen Antikörpern in
den rekombinanten Wirtszellen zu erreichen. Die DNA kann auch beispielsweise
durch Substituieren der Kodiersequenz für menschliche Schwer- und Leichtketten-Konstantdomänen anstelle
der homologen Maus-Sequenzen [US-Patent Nr. 4.816.567; Morrison
et al., s.o.] oder durch kovalentes Binden der gesamten oder eines
Teils der Kodiersequenz für
ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid an die Immunglobulin-Kodiersequenz
modifiziert werden. Solch ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid kann anstelle
der konstanten Domänen
eines Antikörpers
der Erfindung oder anstelle der variablen Domänen einer Antigen-Bindungsstelle
eines Antikörpers
der Erfindung eingesetzt werden, um einen zweiwertigen Hybridantikörper zu
bilden.
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Die
Antikörper
können
einwertige Antikörper
sein. Verfahren zur Herstellung einwertiger Antikörper sind
auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Beispielsweise umfasst ein
Verfahren rekombinante Expression von Immunglobulin-Leichtkette
und modifizierter Schwerkette. Die Schwerkette ist im Allgemeinen
an einem beliebigen Punkt in der Fc-Region trunkiert, sodass Schwerketten-Vernetzung
unterbunden wird. Alternativ dazu werden die relevanten Cysteinreste
durch einen anderen Aminosäurerest
substituiert oder werden deletiert, um Vernetzung zu unterbinden.
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In-vitro-Verfahren
sind auch zur Herstellung einwertiger Antikörper geeignet. Verdau von Antikörpern zur
Produktion von Fragmenten davon, vorzugsweise Fab-Fragmenten, kann
gemäß herkömmlichen
Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, durchgeführt werden.
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3. Menschliche
und humanisierte Antikörper
-
Die
Anti-PRO-Antikörper
der Erfindung können
weiters humanisierte Antikörper
oder menschliche Antikörper
umfassen. Humanisierte Formen von nicht-menschlichen (z.B. Maus-)
Antikörpern
sind chimäre
Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z.B.
Fv, Fab, Fab', F(ab')2 oder
andere Antigen-bindende Subsequenzen von Antikörpern), die eine Mindest-Sequenz,
abgeleitet aus nicht- menschlichem Immunglobulin,
enthalten. Humanisierte Antikörper
umfassen menschliche Immunglobuline (Akzeptorantikörper), in
denen Reste aus einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR)
des Akzeptors durch Reste aus einer CDR einer nicht-menschlichen
Spezies (Donorantikörper)
wie Maus, Ratte oder Kaninchen mit der erwünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt
werden. In manchen Fällen
werden Fv-Gerüstreste
des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche
Reste ersetzt. Humanisierte Antikörper können auch Reste umfassen, die
weder im Akzeptorantikörper
noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen zu finden sind.
Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen die gesamte
von zumindest einer, und typischerweise zwei, variablen Domänen, in
denen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen jenen eines nicht-menschlichen
Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der
FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulin-Consensussequenz
sind. Die humanisierten Antikörper
umfassen im besten Fall auch zumindest einen Abschnitt einer konstanten
Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jenen eines menschlichen
Immunglobulins [Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Riechmann
et al., Nature 332, 323-329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct.
Biol. 2, 593-596 (1992)].
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Verfahren
zur Humanisierung nicht-menschlicher Antikörper sind auf dem Gebiet der
Erfindung bekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen
oder mehrere Aminosäurereste
auf, die in ihn aus einer Quelle eingeführt wurden, die nicht-menschlich
ist. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden oft als "Import"-Reste bezeichnet,
die typischerweise aus einer variablen "Import"-Domäne
genommen werden. Humanisierung kann im Wesentlichen gemäß dem Verfahren
von Winter und Mitarbeiter [Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986);
Riechmann et al., Nature 332, 323-327 (1988); Verhoeyen et al.,
Science 239, 1534-1536 (1988)] durch Substituieren von Nagetier-CDRs-
oder -CDR-Sequenzen anstelle der entsprechenden Sequenzen eines
menschlichen Antikörpers
durchgeführt
werden. Demgemäß sind solche "humanisierten" Antikörper Hybridantikörper (US-Patent
Nr. 4.816.567), worin wesentlich weniger als eine intakte menschliche
variable Domäne
durch die entsprechende Sequenz aus einer nicht-menschlichen Spezies
substituiert wurde. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise
menschliche Antikörper,
in denen manche CDR-Reste und möglicherweise
manche FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen in Nagetierantikörpern ersetzt
sind.
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Menschliche
Antikörper
können
auch unter Verwendung verschiedener Techniken, die auf dem Gebiet der
Erfindung bekannt sind, einschließlich Phagendisplay-Bibliotheken [Hoogenboom & Winter, J. Mol.
Biol. 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)]
hergestellt werden. Die Verfahren von Cole et al. und Boerner et
al. sind auch zur Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern geeignet
[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.
Liss, S. 77 (1985), und Boerner et al., J. Immunol. 147(1), 86-95
(1991)]. In ähnlicher
Weise können
menschliche Antikörper
durch Einführen
menschlicher Immunglobulinloci in transgene Tiere, z.B. Mäuse, in
denen die endogenen Immunglobulingene teilweise oder vollständig deaktiviert
wurden, hergestellt werden. Bei Provokation wird menschliche Antikörperproduktion
beobachtet, die jener in allen Aspekten sehr stark ähnlich ist,
die in Menschen selbst beobachtet wurde, einschließlich Genneuanordnung,
Anordnung und Antikörperrepertoire.
Dieser Ansatz wird beispielsweise in den US-Patenten Nr. 5.545.807;
5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016 und den folgenden
wissenschaftlichen Publikationen beschrieben: Marks et al., Bio/Technology
10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368, 856-859 (1994);
Morrison, Nature 368, 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology
14, 845-851 (1996);
Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg & Huszar, Intern.
Rev. Immunol. 13, 65-93 (1995).
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4. Bispezifische
Antikörper
-
Bispezifische
Antikörper
sind monoklonale, vorzugsweise menschliche oder humanisierte, Antikörper, die
Bindungsspezifitäten
für zumindest
zwei verschiedene Antigene aufweisen. Im vorliegenden Fall ist eine der
Bindungsspezifitäten
für das
PRO, die andere ist für
jedes beliebige andere Antigen, und vorzugsweise für ein(en)
Zelloberflächen-Protein
oder -Rezeptor oder eine Rezeptoruntereinheit.
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Verfahren
zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind auf dem Gebiet der
Erfindung bekannt. Herkömmlicherweise
basiert die Produktion von bispezifischen Antikörpern auf der Co-Expression
von zwei Immunglobulin-Schwerketten/Leichtketten-Paaren, worin die zwei schweren Ketten
unterschiedliche Spezifitäten aufweisen
[Milstein & Cuello,
Nature 305, 537-539 (1983)]. Aufgrund der zufälligen Auswahl an Immunglobulinschwer-
und -leichtketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein potenzielles
Gemisch von zehn verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die
korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten
Moleküls
erfolgt üblicherweise
durch Affinitätschromatographieschritte. Ähnliche
Verfahren sind in der WO 93/08829, veröffentlicht am 13. Mai 1993,
und in Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655-3659 (1991), offenbart.
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Variable
Antikörperdomänen mit
den erwünschten
Bindungsspezifitäten
(Antikörper-Antigen-Kombinationsstellen)
können
an Immunglobulinkonstantdomänen-Sequenzen
fusioniert werden. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer Immunglobulin-Schwerkettenkonstantdomäne, umfassend
zumindest einen Teil der Gelenks-, CH2- und CH3-Regionen. Es wird bevorzugt,
dass die erste Schwerketten-Konstantregion (CH1) die Stelle enthält, die
für Leichtkettenbindung,
vorhanden in zumindest einer der Fusionen, erforderlich ist. DNAs, die
für die
Immunglobulin-Schwerkettenfusionen und, sofern erwünscht, für die Immunglobulin-Leichtkette
kodieren, werden in getrennte Expressionsvektoren insertiert und
werden in geeignete Wirtsorganismen cotransfiziert. Für nähere Details
zur Herstellung von bispezifischen Antikörpern siehe beispielsweise
Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
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Gemäß einem
anderen Ansatz, der in der WO 96/27011 beschrieben wird, kann die
Grenzfläche
zwischen einem Paar von Antikörpermolekülen bearbeitet
werden, um den Prozentsatz an Heterodimeren, die aus rekombinanter
Zellkultur gewonnen werden, zu maximieren. Die bevorzugte Grenzfläche umfasst
zumindest einen Teil der CH3-Region einer konstanten Antikörperdomäne. In diesem
Verfahren werden eine oder mehr kurze Aminosäureseitenketten von der Grenzfläche des
ersten Antikörpermoleküls durch
längere
Seitenketten (z.B. Tyrosin oder Tryptophan) ersetzt. Kompensations-"Hohlräume" von identischer
oder ähnlicher Größe wie die
lange(n) Seitenkette(n) werden an der Grenzfläche des zweiten Antikörpermoleküls durch
Ersetzen der langen Aminosäureseitenketten
durch kürzere
(z.B. Alanin oder Threonin) geschaffen. Dies liefert einen Mechanismus
zur Steigerung der Ausbeute des Heterodimers im Vergleich zu unerwünschten
Endprodukten wie beispielsweise Homodimeren.
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Bispezifische
Antikörper
können
als Volllängenantikörper oder
Antikörperfragmente
(z.B. bispezifische F(ab')2-Antikörper)
hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper aus
Antikörperfragmenten
wurden in der Literatur bereits beschrieben. Beispielsweise können bispezifische
Antikörper
unter Verwendung chemischer Bindung hergestellt werden. Brennan
et al., Science 229, 81 (1985), beschreiben ein Verfahren, worin
intakte Antikörper
proteolytisch gespaltet werden, um F(ab')2-Fragmente
zu bilden. Diese Fragmente werden in Gegenwart des Dithiol-Komplexbildners Natriumarsenit
reduziert, um vicinale Dithiole zu stabilisieren und intermolekulare
Disulfidbildung zu unterbinden. Die gebildeten Fab'-Fragmente werden
dann zu Thionitrobenzoat- (TNB-) Derivaten umgesetzt. Eines der
Fab'-TNB-Derivate
wird dann zum Fab'-Thiol durch
Reduktion mit Mercaptoethylamin rekonvertiert und mit einer äquimolaren
Menge des anderen Fab'-TNB-Derivats
vermischt, um den bispezifischen Antikörper zu bilden. Die produzierten
bispezifischen Antikörper
können
als Mittel für
die selektive Immobilisierung von Enzymen verwendet werden.
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Fab'-Fragmente können direkt
aus E. coli gewonnen und chemisch gebunden werden, um bispezifische
Antikörper
zu bilden. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217-225 (1992), beschreiben
die Produktion eines vollständig
humanisierten bispezifischen F(ab')2-Antikörper-Moleküls. Jedes
Fab'-Fragment wurde
separat aus E. coli sekretiert und gerichteter chemischer Bindung
in vitro unterzogen, um den bispezifischen Antikörper zu bilden. Der so gebildete
bispezifische Antikörper
war in der Lage, sich an Zellen zu binden, die den ErbB2-Rezeptor überexprimierten,
sowie an normale menschliche T-Zellen, und konnte die lytische Aktivität menschlicher
zytotoxischer Lymphozyten gegen menschliche Brusttumortargets steigern.
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Verschiedene
Techniken zur Herstellung und Isolation bispezifischer Antikörperfragmente
direkt aus rekombinanten Zellkulturen wurden auch beschrieben. Beispielsweise
wurden bispezifische Antikörper
unter Verwendung von Leucin-Zipper hergestellt. Kostelny et al.,
J. Immunol. 148(5), 1547-1553 (1992). Die Leucin-Zipper-Peptide aus den Fos-
und Jun-Proteinen wurden an die Fab'-Abschnitte von zwei verschiedenen Antikörpern durch
Genfusion gebunden. Die Antikörper-Homodimere
wurden an der Gelenksregion reduziert, um Monomere zu bilden, und
dann reoxidiert, um die Antikörper-Heterodimere
zu bilden. Dieses Verfahren kann auch zur Herstellung von Antikörper-Homodimeren
verwendet werden. Die von Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90, 6444-6448 (1993), beschriebene "Diabody"-Technologie
stellt einen alternativen Mechanismus zur Herstellung bispezifischer
Antikörperfragmente
bereit. Die Fragmente umfassen eine variable Schwerkettendomäne (VH), die über
einen Linker an eine variable Leichtkettendomäne (VL)
gebunden ist, der zu kurz ist, um Paarung zwischen den zwei Domänen an derselben
Kette zu ermöglichen.
Demgemäß werden die
VH- und VL-Domänen eines
Fragments gezwungen, Paare mit den komplementären VL-
und VH-Domänen eines anderen Fragments
zu bilden, wodurch zwei Antigen-Bindungsstellen gebildet werden.
Auch eine andere Vorgehensweise zur Herstellung bispezifischer Antikörperfragmente
durch die Verwendung von einkettigen Fv- (sFv-) Dimeren wurde bereits
beschrieben. Siehe Gruber et al., J. Immunol. 152, 5368 (1994).
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Antikörper mit
mehr als zwei Wertigkeiten werden ebenfalls erwogen. Beispielsweise
können
trispezifische Antikörper
hergestellt werden. Tutt et al., J. Immunol. 147, 60 (1991).
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Beispielhafte
bispezifische Antikörper
können
sich an zwei verschiedene Epitope an einem gegebenen PRO-Polypeptid
der vorliegenden Erfindung binden. Alternativ dazu kann ein Anti-PRO-Polypeptidarm
mit einem Arm kombiniert werden, der sich an ein Trigger-Molekül an einem
Leukozyten wie beispielsweise ein T-Zellrezeptormolekül (z.B. CD2, CD3, CD28 oder
B7) oder Fc-Rezeptoren für
IgG (FcγR),
wie z.B. FcγRI (CD64),
FcγRII (CD32)
und FcγRIII
(CD16), bindet, sodass zelluläre
Abwehrmechanismen auf die Zelle fokussiert werden, die das bestimmte PRO-Polypeptid
exprimiert. Bispezifische Antikörper
können
auch verwendet werden, um zytotoxische Mittel zu Zellen lokalisieren,
die ein bestimmtes PRO-Polypeptid
exprimieren. Diese Antikörper
besitzen einen PRO-Bindungsarm und einen Arm, der ein zytotoxisches
Mittel oder einen Radionuclidchelatbildner bindet, wie z.B. EOTUBE,
DPTA, DOTA oder TETA. Ein anderer bispezifischer Antikörper von Interesse
bindet das PRO-Polypeptid und bindet weiters Gewebefaktor (tissue
factor, TF).
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5. Heterokonjugierte
Antikörper
-
Heterokonjugierte
Antikörper
liegen auch im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Heterokonjugierte
Antikörper
setzen sich aus zwei kovalent gebundenen Antikörpern zusammen. Solche Antikörper wurden
beispielsweise vorgeschlagen, um Immunsystemzellen auf unerwünschte Zellen
zu richten [US-Patent Nr. 4.676.980] sowie zur Behandlung von HIV-Infektion
[WO 91/00360; WO 92/200373;
EP
03089 ]. Es wird erwogen, dass die Antikörper in vitro unter Verwendung
von Verfahren, die auf dem Gebiet der synthetischen Proteinchemie
bekannt sind, hergestellt werden können, einschließlich jener,
die Vernetzungsmittel einbinden. Beispielsweise können Immunotoxine
unter Verwendung einer Disulfid-Austauschreaktion oder durch Bildung einer
Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele für geeignete Reagenzien für diesen
Zweck umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat sowie
jene Reagenzien, die beispielsweise im US-Patent Nr. 4.676.980 offenbart
sind.
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6. Effektorfunktionsbearbeitung
-
Es
kann wünschenswert
sein, den Antikörper
der Erfindung hinsichtlich der Effektorfunktion zu modifizieren,
um z.B. die Wirksamkeit des Antikörpers bei der Behandlung von
Krebs zu steigern. Beispielsweise können ein oder mehrere Cysteinreste
in die Fc-Region eingeführt
werden, wodurch die Bildung von Disulfidbindungen zwischen den Ketten
in dieser Region ermöglicht
wird. Der so gebildete homodimere Antikörper kann verbesserte Internalisierungsfähigkeit
und/oder gesteigertes komplementvermitteltes Zelltöten und
antikörpervermittelte
zelluläre
Zytotoxizität
(ADCC) aufweisen. Siehe Caron et al., J. Exp. Med. 176, 1191-1195 (1992),
und Shopes, J. Immunol. 148, 2918-2922 (1992). Homodimere Antikörper mit
gesteigerter Anti-Tumor-Aktivität können auch
unter Verwendung heterobifunktioneller Vernetzer hergestellt werden,
wie in Wolff et al., Cancer Research 53, 2560-2565 (1993), beschrieben
wird. Alternativ dazu kann ein Antikörper so bearbeitet werden,
dass er duale Fc-Regionen aufweist und dadurch über gesteigerte Komplementlyse-
und ADCC-Fähigkeiten
verfügen
kann. Siehe Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3, 219-230
(1989).
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7. Immunkonjugate
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Die
Erfindung betrifft auch Immunkonjugate, die einen Antikörper umfassen,
der an ein zytotoxisches Mittel wie beispielsweise ein chemotherapeutisches
Mittel, Toxin (z.B. ein enzymatisch aktives Toxin oder ein Toxin
bakteriellen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs oder auch von
Pilzen oder Fragmente davon) oder an ein radioaktives Isotop (d.h.
ein Radiokonjugat) konjugiert ist.
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Chemotherapeutische
Mittel, die zur Herstellung solcher Immunkonjugate nützlich sind,
wurden oben beschrieben. Enzymatisch aktive Toxine und Fragmente
davon, die verwendet werden können,
umfassen Diphtherie-A-Kette, nichtbindende aktive Fragmente von
Diphtherietoxin, Exotoxin-A-Kette (aus Pseudomonas aeruginosa),
Ricin-A-Kette, Abrin-A-Kette, Modeccin-A-Kette, alpha-Sarcin, Aleurites-fordii-Proteine, Dianthin-Proteine,
Phytolaca-americana-Proteine (PAPI, PAPII und PAPS), Momordica-charantia-Inhibitor, Curcin,
Crotin, Sapaonaria-officinalis-Inhibitor, GeIonin, Mitogellin, Restrictocin,
Phenomycin, Enomycin und die Tricothecene. Zahlreiche verschiedene
Radionuclide sind zur Herstellung von radiokonjugierten Antikörpern erhältlich.
Beispiele umfassen 212Bi, 131I, 131In, 90Y und 186Re. Konjugate des Antikörpers und
des zytotoxischen Mittels werden unter Verwendung zahlreicher verschiedener
bifunktioneller Proteinbindungsmittel wie z.B. N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionat
(SPDP), Iminothiolan (IT), bifunktionellen Derivaten von Imidoestern
(wie z.B. Dimethyladipimidat-HCl), aktiver Ester (wie z.B. Disuccinimidylsuberat),
Aldehyden (wie Glutaraldehyd), Bisazido-Verbindungen (wie z.B. Bis(p- azidobenzoyl)hexandiamin),
Bisdiazonium-Derivaten (wie z.B. Bis(p-diazoniumbenzoyl)ethylendiamin),
Diisocyanaten (wie Toluol-2,6-diisocyanat) und bis-aktiven Fluorverbindungen
(wie z.B. 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol) hergestellt. Beispielsweise
kann ein Ricinimmunotoxin wie in Vitetta et al., Science 238, 1098
(1987), beschrieben hergestellt werden. C-14-markierte 1-Isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylen-triaminpentaessigsäure (MX-DTPA)
ist ein beispielhafter Chelatbildner zur Konjugation von Radionucleotid
an den Antikörper.
Siehe die WO 94/11026.
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In
einer anderen Ausführungsform
kann der Antikörper
an einen "Rezeptor" (wie Streptavidin)
zur Verwendung bei Tumor-Pretargeting konjugiert werden, worin das
Antikörper-Rezeptor-Konjugat
dem Patienten verabreicht wird, gefolgt von der Entfernung ungebundenen
Konjugats aus dem Blutkreislauf unter Verwendung eines Klärungsmittels
und der anschließenden
Verabreichung eines "Liganden" (z.B. Avidin), der
an ein zytotoxisches Mittel (z.B. ein Radionucleotid) konjugiert
ist.
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8. Immunoliposomen
-
Die
hierin offenbarten Antikörper
können
auch als Immunoliposomen formuliert werden. Liposomen, die den Antikörper enthalten,
werden durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren hergestellt,
wie sie beispielsweise in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 82, 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77,
4030 (1980); und den US-Patenten Nr. 4.485.045 und 4.544.545 beschrieben
werden. Liposomen mit gesteigerter Zirkulationsdauer sind im US-Patent
Nr. 5.013.556 offenbart.
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Besonders
nützliche
Liposomen können
durch das Umkehrphasenverdampfungsverfahren mit einer Lipidzusammensetzung,
die Phosphatidylcholin, Cholesterin und PEG-derivatisiertes Phosphatidylethanolamin
(PEG-PE) umfasst, hergestellt werden. Liposomen werden durch Filter
von definierter Porengröße filtriert, um
Liposomen mit dem erwünschten
Durchmesser zu ergeben. Fab'-Fragmente
des Antikörpers
der vorliegenden Erfindung können
an die Liposomen wie in Martin et al., J. Biol. Chem. 257, 286-288
(1982), beschrieben mittels einer Disulfid-Austauschreaktion konjugiert werden.
Ein chemotherapeutisches Mittel (wie beispielsweise Doxorubicin)
ist gegebenenfalls im Liposom enthalten. Siehe Gabizon et al., J.
National Cancer Inst. 81(19), 1484 (1989).
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9. Pharmazeutische
Zusammensetzungen von Antikörpern
-
Antikörper, die
sich spezifisch an ein hierin identifizierters PRO-Polypeptid binden,
sowie andere Moleküle,
die durch die zuvor offenbarten Screeningtests identifiziert wurden,
können
zur Behandlung von verschiedenen Erkrankungen in Form von pharmazeutischen
Zusammensetzungen verabreicht werden.
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Ist
das PRO-Polypeptid intrazellulär
und werden ganze Antikörper
als Inhibitoren verwendet, werden internalisierende Antikörper bevorzugt.
Es können
jedoch auch Lipofektionen oder Liposomen verwendet werden, um den
Antikörper
oder ein Antikörperfragment
in Zellen bereitzustellen. Werden Antikörperfragmente verwendet, so
wird das kleinste Inhibitionsfragment, das sich spezifisch an die
Bindungsdomäne
des Targetproteins bindet, bevorzugt. Beispielsweise können auf
Grundlage der Sequenzen der variablen Regionen eines Antikörpers Peptidmoleküle entworfen
werden, die die Fähigkeit
beibehalten, die Target-Proteinsequenz zu binden. Solche Peptide
können
chemisch synthetisiert und/oder durch DNA-Rekombinationsverfahren
hergestellt werden. Siehe z.B. Marasco et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 90, 7889-7893 (1993). Die Formulierung hierin kann auch
mehr als nur eine aktive Verbindung als für die bestimmte zu behandelnde
Indikation erforderlich ist enthalten, vorzugsweise jene mit komplementären Aktivitäten, die
sich gegenseitig nicht negativ beeinflussen. Alternativ oder zusätzlich dazu
kann die Zusammensetzung ein Mittel umfassen, das ihre Funktion steigert,
wie beispielsweise ein zytotoxcisches Mittel, ein chemotherapeutisches
Mittel oder ein wachstumshemmendes Mittel. Solche Moleküle sind
geeigneterweise in Kombination vorhanden, und dies in Mengen, die für die beabsichtigten
Zwecke wirksam sind.
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Die
aktiven Bestandteile können
auch in Mikrokapseln eingekapselt werden, beispielsweise durch Koazervierungsverfahren
oder durch Grenzflächenpolymerisation, z.B.
in Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln,
in kolloidale Wirkstoffzufuhrsysteme (z.B. Liposome, Albuminmikrokügelchen,
Mikroemulsionen, Nanopartikeln und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen. Solche
Verfahren sind in Remington's
Pharmaceutical Sciences, s.o., offenbart.
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Die
Formulierungen, die zur In-vivo-Verabreichung verwendet werden,
müssen
steril sein. Dies kann leicht mittels Filtration durch sterile Filtermembranen
erreicht werden.
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Es
können
Retardpräparate
hergestellt werden. Geeignete Beispiele für Retardpräparate umfassen semipermeable
Matrizen von festen hydrophoben Polymeren, die den Antikörper enthalten,
wobei die Matrizen in Form von Formstücken, z.B. Filmen oder Mikrokapseln,
vorliegen. Beispiele für
Retard-Matrizen umfassen Polyester, Hydrogele (z.B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat)
oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide (US-Patent Nr. 3.773.919),
Copolymere von L-Glutaminsäure
und γ-Ethyl-L-glutamat,
nicht abbaubares Ethylenvinylacetat, abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere
wie z.B. LUPRON DEPOTTM (injizierbare Mikrokügelchen, zusammengesetzt
aus Milch-Glykolsäure-Copolymer
und Leuprolidacetat) und Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure. Während Polymere wie z.B. Ethylenvinylacetat
und Milchsäure-Glykolsäure die
Freisetzung von Molekülen über eine
Zeitspanne von 100 Tagen ermöglichen,
setzen bestimmte Hydrogele Proteine über kürzere Zeitspannen hinweg frei.
Verbleiben eingekapselte Antikörper über eine
längere
Zeit im Körper,
so können
sie als ein Resultat von Aussetzung gegenüber Feuchtigkeit bei 37 °C denaturieren
oder aggregieren, was zu einem Verlust von biologischer Aktivität und möglichen
Veränderungen
der Immunogenität
führen
kann. Je nach vorliegendem Mechanismus können rationale Vorgehensweisen
zur Stabilisierung entwickelt werden. Stellt der Aggregationsmechanismus
beispielsweise intermolekulare S-S-Bindungsbildung durch Thiodisulfidaustausch dar,
so kann Stabilisierung durch Modifikation von Sulfhydrylresten,
Lyophilisierung aus sauren Lösungen, Steuerung
des Feuchtigkeitsgehalts, Verwendung geeigneter Additive und Entwicklung
spezifischer Polymermatrizenzusammensetzungen erreicht werden.
-
G. Verwendungen für Anti-PRO-Antikörper
-
Die
Anti-PRO-Antikörper
der Erfindung haben verschiedene Einsatzbereiche. Beispielsweise
können Anti-PRO-Antikörper in
Diagnosetests für
PRO, z.B. zur Detektion seiner Expression in spezifischen Zellen, Geweben
oder Serum, verwendet werden: Verschiedene Diagnosetestverfahren,
die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, können verwendet werden, wie
beispielsweise Konkurrenzbindungstests, direkte oder indirekte Sandwichtests
und Immunfällungstests,
die entweder in heterogenen oder in homogenen Phasen durchgeführt werden
[Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press,
Inc., 147-158 (1987)]. Die in Diagnosetests verwendeten Antikörper können mit
einer nachweisbaren Gruppierung markiert werden. Die nachweisbare
Gruppierung sollte in der Lage sein, entweder direkt oder indirekt
ein nachweisbares Signal abzugeben. Beispielsweise kann die nachweisbare
Gruppierung ein Radioisotop, wie z.B. 3H, 14C, 32P, 35S oder 125I, eine
fluoreszierende oder chemilumineszierende Verbindung, wie z.B. Fluoresceinisothiocyanat,
Rhodamin oder Luciferin, oder ein Enzym, wie z.B. alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder
Meerrettichperoxidase, sein. Jedes beliebige Verfahren, das auf
dem Gebiet der Erfindung zur Konjugation des Antikörpers an
die nachweisbare Gruppierung bekannt ist, kann verwendet werden,
einschließlich
jener Verfahren, die von Hunter et al., Nature 144, 945 (1962);
David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol.
Meth. 40, 219 (1981); und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30,
407 (1982), beschrieben werden.
-
Anti-PRO-Antikörper sind
auch zur Affinitätsreinigung
von PRO aus rekombinanter Zellkultur oder natürlichen Quellen nützlich.
In diesem Verfahren werden die Antikörper gegen PRO an einem geeigneten
Träger,
wie z.B. Sephadexharz oder Filterpapier, unter Verwendung von auf
dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren immobilisiert. Der
immobilisierte Antikörper
wird dann mit einer Probe kontaktiert, die das zu reinigende PRO
enthält,
und hiernach wird der Träger
mit einem geeigneten Lösungsmittel
gewaschen, das im Wesentlichen das gesamte Material in der Probe
unter Ausnahme des PRO, das an den immobilisierten Antikörper gebunden
ist, ent fernt. Schließlich
wird der Träger
mit einem anderen geeigneten Lösungsmittel
gewaschen, der das PRO vom Antikörper
freisetzt.
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Die
folgenden Beispiele werden ausschließlich als Veranschaulichung
bereitgestellt und sollen den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung
in keiner Weise einschränken.
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BEISPIELE
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Im
Handel erhältliche
Reagenzien, auf die in den Beispielen verwiesen wird, wurden, außer anders
angemerkt, gemäß den Vorschriften
der Hersteller verwendet. Die Quelle jener Zellen, die in den folgenden
Beispielen und in der gesamten Beschreibung durch ATCC-Zugriffsnummern
identifiziert werden, ist die American Type Culture Collection,
Manassas, VA.
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BEISPIEL 1: Screening
von extrazellulärer
Domänenhomologie
zur Identifikation neuer Polypeptide und von cDNA, die dafür kodiert
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Die
extrazellulären
Domänen-
(ECD-) Sequenzen (einschließlich
der Sekretionssignalsequenz, sofern vorhanden) aus etwa 950 bekannten
sekretierten Proteinen aus der öffentlich
zugänglichen
Swiss-Prot-Datenbank wurden verwendet, um EST-Datenbasen zu durchsuchen. Die EST-Datenbanken
umfassten öffentliche Datenbanken
(z.B. Dayhoff, GenBank) und private Datenbanken (z.B. LIFESEQTM, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA).
Die Suche wurde unter Verwendung des Computerprogramms BLAST oder
BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996))
in Form eines Vergleichs der ECD-Proteinsequenzen mit einer 6-Raster-Translation
der EST-Sequenzen durchgeführt.
Diese Vergleiche mit einem BLAST-Score von 70 (oder in manchen Fällen von
90) oder mehr, die nicht für
bekannte Proteine kodierten, wurden gruppiert und mit dem Programm "phrap" (Phil Green, University
of Washington, Seattle, WA) zu Consensus-DNA-Sequenzen angeordnet.
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Unter
Verwendung dieses Homologie-Screens der extrazellulären Domänen wurden
Consensus-DNA-Sequenzen in Bezug auf die anderen identifizierten
EST-Sequenzen unter
Verwendung von phrap angeordnet. Weiters wurden die erhaltenen Consensus-DNA-Sequenzen
häufig
(jedoch nicht immer) mittels Wiederholungszyklen von BLAST oder
BLAST-2 und phrap verlängert,
um die Consensus-Sequenz so weit wie möglich unter Verwendung der
Quellen von zuvor erläuterten
EST-Sequenzen zu
verlängern.
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Auf
Grundlage der wie zuvor beschrieben erhaltenen Consensus-Sequenzen
wurden Oligonucleotide anschließend
synthetisiert und verwendet, um mittels PCR eine cDNA-Bibliothek
zu identifizieren, die die Sequenz von Interesse enthielt, und wurden
auch als Sonden eingesetzt, um einen Klon der Volllängen-Kodiersequenz
für ein
PRO-Polypeptid zu isolieren. Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Primer weisen im Allgemeinen
20 bis 30 Nucleotide auf und sind oft so beschaffen, dass sie ein
PCR-Produkt mit
einer Länge
von etwa 100-1.000 bp ergeben. Die Sondensequenzen weisen typischerweise
eine Länge
von 40-55 bp auf. In manchen Fällen
werden zusätzliche
Oligonucleotide synthetisiert, wenn die Consensussequenz länger als
etwa 1-1,5 kbp ist. Um mehrere Bibliotheken auf einen Volllängenklon
zu screenen, wurde DNA aus den Bibliotheken durch PCR-Amplifikation,
wie von Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology,
beschrieben, mit dem PCR-Primerpaar gescreent. Eine positive Bibliothek
wurde dann verwendet, um unter Verwendung des Sonden-Oligonucleotids und
eines der Primerpaare Klone zu isolieren, die für das Gen von Interesse kodieren.
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Die
cDNA-Bibliotheken, die zur Isolation der cDNA-Klone verwendet wurden,
wurden mittels herkömmlicher
Verfahren unter Verwendung von im Handel erhältlichen Reagenzien wie jenen
von Invitrogen, San Diego, CA, konstruiert. Die cDNA wurde mit Oligo-dT,
das eine NotI-Stelle enthielt, geprimt, mit dem Blunt-Ende an hemikinasierte
Sall-Adaptoren gebunden, mit NotI gespaltet, auf geeignete Weise
durch Gelelektrophorese klassiert und in einer definierten Ausrichtung
in einen geeigneten Kloniervektor (wie z.B. pRKB oder pRKD; pRK5B
ist ein Vorläufer
von pRK5D, der die SfiI-Stelle nicht enthält; siehe Holmes et al., Science 253,
1278-1280 (1991)) in den einmaligen XhoI- und NotI-Stellen kloniert.
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BEISPIEL 2: Isolierung
von cDNA-Klonen durch Amylase-Screening
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1. Herstellung von Oligo-dT-geprimter
cDNA-Bibliothek
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mRNA
wurde aus einem menschlichen Gewebe von Interesse unter Verwendung
von Reagenzien und Arbeitsvorschriften von Invitrogen, San Diego,
CA, (Fast Track 2) isoliert. Diese RNA wurde verwendet, um eine
Oligo-dT-geprimte cDNA-Bibliothek
im Vektor pRK5D unter Verwendung von Reagenzien und Arbeitsvorschriften
von Life Technologies, Gaithersburg, MD, (Super Script Plasmid System)
zu bilden. In diesem Verfahren wurde die doppelsträngige cDNA
zu einer Größe von mehr
als 1.000 bp dimensioniert, und die SalI/NotI-gebundene cDNA wurde
in XhoI/NotI-gespalteten
Vektor kloniert. pRK5D ist ein Kloniervektor, der eine sp6-Transkriptionsstartstelle
aufweist, gefolgt von einer SfiI-Restriktionsenzymstelle, die den
XhoI/NotI-cDNA-Klonierstellen vorangeht.
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2. Herstellung
von zufällig
geprimter cDNA-Bibliothek
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Es
wurde eine Sekundär-cDNA-Bibliothek
gebildet, die vorzugsweise die 5'-Enden
der primären
cDNA-Klone aufweisen sollte. Sp6-RNA wurde aus der Primärbibliothek
(zuvor beschrieben) gebildet, und diese RNA wurde verwendet, um
eine zufällig
geprimte cDNA-Bibliothek im Vektor pSST-AMY.0 unter Verwendung von
Reagenzien und Arbeitsvorschriften von Life Technologies (Super
Script Plasmid System, s.o.) herzustellen. In diesem Verfahren wurde
die doppelsträngige
cDNA auf 500-1.000
bp dimensioniert, mit dem Blunt-Ende über Linker an NotI-Adaptoren
gebunden, mit SfiI gespaltet und in SfiI/NotI-gespalteten Vektor
kloniert. pSST-AMY.0 ist ein Kloniervektor, der einen Hefealkohol-Dehydrogenasepromotor
aufweist, der den cDNA-Klonierstellen und der Maus-Amylasesequenz
(der reifen Sequenz ohne das Sekretionssignal) vorangeht, gefolgt
von dem Hefealkohol-Dehydrogenaseterminator nach den Klonierstellen.
Somit führen
cDNAs, die in diesen Vektor kloniert wurden und in Raster mit Amylasesequenz
fusioniert sind, zur Sekretion von Amylase aus auf geeignete Weise
transfizierten Hefekolonien.
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3. Transformation und
Detektion
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DNA
aus der in Absatz 2 oben beschriebenen Bibliothek wurde auf Eis
gekühlt,
der elektrokompetente DH10B-Bakterien (Life Technologies, 20 ml)
zugesetzt wurden. Die Bakterien und das Vektorgemisch wurden dann
gemäß der Empfehlung
des Herstellers Elektrophorese unterzogen. Daraufhin wurde SOC-Medium
(Life Technologies, 1 ml) zugesetzt, und das Gemisch wurde bei 37 °C 30 Minuten
lang inkubiert. Die Transformanten wurden auf 20 Standard-150-mm-LB-Platten,
die Ampicillin enthielten, ausplattiert und 16 Stunden lang (37 °C) inkubiert.
Positive Kolonien wurden von den Platten abgeschabt, und die DNA
wurde aus dem bakteriellen Pellet unter Befolgung von Standard-Arbeitsvorschriften,
z.B. CsCl-Gradienten, isoliert. Die gereinigte DNA wurde dann für die nachstehenden
Hefe-Arbeitsvorschriften weiterverwendet.
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Die
Hefeverfahren wurden in drei Kategorien aufgeteilt: (1) Transformation
von Hefe mit dem Plasmid/cDNA-Kombinationsvektor; (2) Detektion
und Isolation von Hefeklonen, die Amylase sekretieren; und (3) PCR-Amplifikation
des Inserts direkt aus der Hefekolonie und Reinigung der DNA zur
Sequenzierung und näheren
Analyse.
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Der
verwendete Hefestamm war HD56-5A (ATCC-90785). Dieser Stamm weist
den folgenden Genotyp auf: MAT alpha, ura3-52, leu2-3, leu2-112,
his3-11, his3-15, MAL+, SUC+,
GAL+. Vorzugsweise können Hefemutanten verwendet
werden, die defiziente, posttranslationale Stoffwechselwege aufweisen.
Solche Mutanten können
Translokations-defiziente Allele in sec71, sec72, sec62 aufweisen,
wobei trunkierte sec71 am meisten bevorzugt ist. Alternativ dazu
können
auch Antagonisten (einschließlich
Antisense-Nucleotide und/oder Liganden), die die normalen Aktivitäten dieser
Gene stören,
andere Proteine, die in diesen posttranslationalen Stoffwechselweg
eingebunden sind (z.B. SEC61p, SEC72p, SEC62p, SEC63p, TDJ1p oder SSA1p-4p),
oder die Komplexformation dieser Proteine vorzugsweise in Kombination
mit der Amylase-exprimierenden Hefe verwendet werden.
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Transformation
erfolgte auf Grundlage der Arbeitsvorschrift, die von Gietz et al.,
Nucl. Acid. Res. 20, 1425 (1992), beschrieben wird. Transformierte
Zellen wurden dann aus Agar in komplexes YEPD-Nährmedium (100 ml) inokuliert
und über
Nacht bei 30 °C
wachsen gelassen. Das YEPD-Nährmedium
wurde wie in Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring
Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 207 (1994), beschrieben hergestellt.
Die Übernacht-Kultur
wurde dann auf etwa 2 × 106 Zellen/ml (etwa OD600 =
0,1) in frischem YEPD-Nährmedium
(500 ml) verdünnt
und neuerlich auf 1 × 107 Zellen/ml (etwa OD600 =
0,4-0,5) wachsen gelassen.
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Die
Zellen wurden dann geerntet und durch Transfer in GS3-Rotorflaschen
in einem Sorval-GS3-Rotor auf Transformation bei 5.000 U/min 5 Minuten
lang vorbereitet, der Überstand
wurde verworfen und dann in sterilem Wasser resuspendiert und wiederum
in 50-ml-Falconröhrchen
bei 3.500 U/min in einer Beckman-GS-6KR-Zentrifuge zentrifugiert.
Der Überstand
wurde verworfen, und die Zellen wurden dann mit Li-Ac/TE (10 ml, 10
mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5, 100 mM Li2OOCCH3) gewaschen und in LiAc/TE (2,5 ml) resuspendiert.
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Transformation
fand durch Vermischen der vorbereiteten Zellen (100 μl) mit frisch
denaturierter, einzelsträngiger
Lachshoden-DNA (Lofstrand Labs, Gaithersburg, MD) und transformierender
DNA (1 μg,
Vol. < 10 μl) in Mikrozentrifugenröhrchen statt.
Das Gemisch wurde kurz durch Verwirbeln vermischt, dann wurde 40%iges
PEG/TE (600 μl,
40 % Polyethylenglykol-4000, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM Li2OOCCH3, pH 7,5)
zugesetzt. Dieses Gemisch wurde leicht vermischt und bei 30 °C unter Schütteln 30
Minuten lang inkubiert. Die Zellen wurden dann bei 42 °C 15 Minuten
lang einem Hitzeschock unterzogen, und das Reaktionsgefäß wurde
in einer Mikrozentrifuge bei 12.000 U/min 5-10 Sekunden lang zentrifugiert,
dekantiert und in TE (500 μl,
10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) resuspendiert, woraufhin neuerliches
Zentrifugieren folgte. Die Zellen wurden dann in TE (1 ml) verdünnt, und
Aliquo ten (200 μl)
wurden auf das selektive Medium verteilt, das davor in 150-mm-Wachstumsplatten
(VWR) vorbereitet wurde.
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Alternativ
dazu wurde anstelle von zahlreichen kleinen Reaktionen die Transformation
unter Verwendung einer einzigen, großtechnischen Reaktion durchgeführt, worin
Reagensmengen demgemäß angepasst wurden.
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Das
verwendete selektive Medium war ein synthetischer kompletter Dextroseagar,
dem Uracil fehlte (SCD-Ura), hergestellt gemäß der Beschreibung von Kaiser
et al. in: Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press,
Cold Spring Harbor, NY, 208-210 (1994). Transformanten wurden bei
30 °C 2-3
Tage lang gezüchtet.
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Die
Detektion von Kolonien, die Amylase sekretierten, erfolgte durch
Einbinden von roter Stärke
in das selektive Wachstumsmedium. Stärke wurde an den roten Farbstoff
(Reactive Red-120, Sigma) durch das Verfahren, das von Biely et
al. in: Anal. Biochem. 172, 176-179 (1988), beschrieben wird, gebunden.
Die gebundene Stärke
wurde in die SCD-Ura-Agarplatten bei einer Endkonzentration von
0,15 (Gew./Vol.) inkorporiert und wurde mit Kaliumphosphat auf einen
pH von 7,0 gepuffert (50-100 mM Endkonzentration).
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Die
positiven Kolonien wurden aussortiert und über frischem selektivem Medium
(auf 150-mm-Platten) ausgestrichen, um gut isolierte und identifizierbare
einzelne Kolonien zu erhalten. Gut isolierte einzelne Kolonien,
die bezüglich
Amylasesekretion positiv waren, wurden durch direkte Inkorporation
von roter Stärke
in gepufferten SCD-Ura-Agar
detektiert. Positive Kolonien wurden durch ihre Fähigkeit
bestimmt, Stärke
abzubauen, was zu einem klaren Lichthof um die positive Kolonie
herum, der direkt sichtbar gemacht werden kann, führt.
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4. Isolierung
von DNA durch PCR-Amplifikation
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Wurde
eine positive Kolonie isoliert, so wurde ein Teil davon mit einem
Zahnstocher aufgenommen und in sterilem Wasser (30 μl) in einer
96-Well-Platte verdünnt.
Zu diesem Zeitpunkt wurden die positiven Kolonien entweder gefroren
und zur weiteren Analyse gelagert oder sofort amplifiziert. Eine
Aliquote von Zellen (5 μl)
wurde als eine Matrize für
die PCR-Reaktion in einem 25-μl-Volumen
verwendet, das 0,5 μl
Klentaq (Clontech, Palo Alto, CA); 4,0 μl 10 mM dNTP's (Perkin Elmer-Cetus); 2,5 μl Kentaq-Puffer
(Clontech); 0,25 μl Vorwärts-Oligo
1; 0,25 μl
Rückwärts-Oligo
2; und 12,5 μl
destilliertes Wasser enthielt. Die Sequenz von Vorwärts-Oligonucleotid
1 lautete:
5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT-3'
(Seq.-ID Nr.
25)
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Die
Sequenz von Rückwärts-Oligonucleotid
2 lautete:
5'-CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT-3'
(Seq.-ID Nr.
26)
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PCR
wurde wie folgt durchgeführt:
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Die
unterstrichenen Regionen der Oligonucleotide anellierten an die
ADH-Promotorregion
bzw. die Amylaseregion und amplifizierten eine 307-bp-Region aus
Vektor pSST-AMY.0, wenn kein Insert vorhanden war. Typischerweise
enthielten die ersten 18 Nucleotide des 5'-Endes dieser Oligonucleotide Anellierungsstellen
für die
Sequenzierungsprimer. Somit betrug das Gesamtprodukt der PCR-Reaktion
von ei nem leeren Vektor 343 bp. An Signalsequenz fusionierte cDNA
resultierte jedoch in erheblich längeren Nucleotidsequenzen.
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Nach
der PCR wurde eine Aliquote der Reaktion (5 μl) durch Agarosegel-Elektrophorese in
einem 1 %igen Agarosegel unter Verwendung eines Tris-Borat-EDTA- (TBE-) Puffersystem
wie von Sambrook et al., s.o., beschrieben untersucht. Klone, die
in einem einzelnen starken PCR-Produkt resultierten, das größer als 400
bp war, wurden nach Reinigung mit einer 96-Qiaquick-PCR-Reinigungssäule (Qiagen
Inc., Chatsworth, CA) weiter durch DNA-Sequenzieren analysiert.
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BEISPIEL 3: Isolierung
von cDNA-Klonen unter Verwendung von Signalalgorithmusanalyse
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Verschiedene
für Polypeptid
kodierende Nucleinsäuresequenzen
wurden durch Anwenden eines geschützten Signalsequenzfindungs-Algorithmus,
entwickelt von Genentech, Inc., (South San Francisco, CA) an ESTs
sowie gruppierten und angeordneten EST-Fragmenten aus öffentlichen
(z.B. GenBank) und/oder privaten (LIFESEQ®, Incyte
Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA) Datenbanken identifiziert.
Der Signalsequenzalgorithmus berechnet einen Sekretionssignalwert
auf Grundlage der Eigenschaft der DNA-Nucleotide, die das erste
und gegebenenfalls das zweite Methionincodon (ATG) am 5'-Ende der untersuchten
Sequenz oder des untersuchten Sequenzfragments umgeben. Die Nucleotide,
die an das erste ATG anschließen,
müssen
für zumindest
35 eindeutige Aminosäuren
ohne jegliche Stoppcodons kodieren. Weist das erste ATG die erforderlichen
Aminosäuren
auf, so wird das zweite nicht untersucht. Wird keines der beiden
den Anforderungen gerecht, so wird die Kandidatensequenz nicht bewertet.
Um zu bestimmen, ob die EST-Sequenz eine authentische Signalsequenz
enthält,
werden die DNA und die entsprechenden Aminosäuresequenzen, die das ATG-Codon
umgeben, unter Verwendung eines Sets von sieben Sensoren (Evaluationsparameter),
die für
ihre Assoziation mit Sekretionssignalen bekannt sind, bewertet.
Die Verwendung dieses Algorithmus führte zur Identifikation zahlreicher,
für Polypeptid
kodierender Nucleinsäuresequenzen.
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BEISPIEL 4: Isolierung
von cDNA-Klonen, die für
menschliches PRO1800 kodieren
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Eine
Consensus-DNA-Sequenz wurde in Bezug auf andere EST-Sequenzen unter
Verwendung von phrap, wie in Beispiel 1 zuvor beschrieben, assembliert.
Diese Consensus-Sequenz wird hierin als DNA30934 bezeichnet. Basierend
auf der DNA30934-Consensussequenz wurden Oligonucleotide synthetisiert:
1) um mittels PCR eine cDNA-Bibliothek zu identifizieren, die die
Sequenz von Interesse enthielt, und 2) zur Verwendung als Sonden,
um einen Klon einer Kodiersequenz voller Länge für PRO1800 zu isolieren.
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PCR-Primer
(vorwärts
und rückwärts) wurden
synthetisiert:
Vorwärts-PCR-Primer
(30934.f1) 5'-GCATAATGGATGTCACTGAGG-3' (Seq.-ID Nr. 3)
Rückwärts-PCR-Primer
(30934.r1) 5'-AGAACAATCCTGCTGAAAGCTAG-3' (Seq.-ID Nr. 4)
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Darüber hinaus
wurde eine synthetische Oligonucleotid-Hybridisierungssonde aus
der DNA30934-Consensus-Sequenz konstruiert, die die folgende Nucleotidsequenz
aufwies:
Hybridisierungssonde (30934.p1)
5'-GAAACGAGGAGGCGGCTCAGTGGTGATCGTGTCTTCCATAGCAGCC-3' (Seq.-ID Nr. 5).
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RNA
zur Konstruktion der cDNA-Biblioheken wurde aus menschlichem fötalem Lebergewebe
isoliert. DNA-Sequenzieren der wie zuvor beschrieben isolierten
Klone ergab die Volllängen-DNA-Sequenz
für PRO1800
(hierin als DNA35672-2508 [1, Seq.-ID
Nr. 1] bezeichnet); und die abgeleitete Proteinsequenz für PRO1800.
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Die
gesamte Nucleotidsequenz von DNA35672-2508 ist in 1 (Seq.-ID
Nr. 1) gezeigt. Klon DNA35672-2508 enthält einen einzelnen offenen
Leseraster mit einer eindeutigen Translationsstartstelle an Nucleotidpositionen
36-38 und endet mit dem Stoppcodon an Nucleotidpositionen 870-872
(1). Der vorhergesagte Polypeptidvorläufer ist
278 Aminosäuren
lang (2). Das in 2 gezeigte
PRO1800-Protein voller Länge
hat ein geschätztes
Molekulargewicht von etwa 29.537 Da und einen pl von etwa 8,97.
Analyse der in 2 gezeigten PRO1800-Sequenz
voller Länge
(Seq.-ID Nr. 2) beweist die Gegenwart der folgenden Elemente: ein
Signalpeptid von etwa Aminosäure
1 bis etwa Aminosäure
15, eine potenzielle N-Glykosylierungsstelle von etwa Aminosäure 183
bis etwa Aminosäure
186, potenzielle N-Myristolierungsstellen von etwa Aminosäure 43 bis
etwa Aminosäure
48, von etwa Aminosäure
80 bis etwa Aminosäure
85, von etwa Aminosäure
191 bis etwa Aminosäure
196, von etwa Aminosäure
213 bis etwa Aminosäure
218 und von etwa Aminosäure
272 bis etwa Aminosäure
277 und Mikrobodies-C-Terminus-Targetsignal von etwa Aminosäure 276 bis
etwa Aminosäure
278. Der Klon DNA35672-2508 wurde bei der ATCC am 15. Dezember 1998
hinterlegt und bekam die ATCC-Hinterlegungsnummer 203538 zugeteilt.
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Eine
Analyse der Dayhoff-Datenbank (Version 35.45 SwissProt 35) unter
Verwendung einer WU-BLAST2-Sequenzabgleichanalyse der in 2 gezeigten
Volllängensequenz
(Seq.-ID Nr. 2) bewies signifikante Homologie zwischen der PRO1800-Aminosäuresequenz
und den folgenden Dayhoff-Sequenzen: HE27_HUMAN, CELF36H9_1, CEF54F3_3,
A69621, AP000007_227, UCPA_ECOLI, F69868, Y4LA_RHISN, DHK2_STRVN
und DHG1_BACME.
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BEISPIEL 16: Genamplifikation
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Dieses
Beispiel zeigt, dass die für
PRO1800 kodierenden Gene im Genom bestimmter menschlicher Lungen-,
Dickdarm- und/oder Brustkrebsarten und/oder -zelllinien amplifiziert
werden. Amplifikation ist mit der Überexpression des Genprodukts
assoziiert, was darauf hinweist, dass die Polypeptide nützliche
Targets für therapeutische
Eingriffe bei bestimmten Krebserkrankungen wie Dickdarm-, Lungen-,
Brustkrebs und anderen Krebsarten und zur diagnostischen Bestimmung
der Gegenwart dieser Krebsarten sind. Therapeutische Mittel können die
Form von Antagonisten von PRO1800-Polypeptid, beispielsweise die
Form von Maus-Mensch-chimären,
humanisierten oder menschlichen Antikörpern gegen ein PRO1800-Polypeptid,
annehmen.
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Das
Ausgangsmaterial für
den Screen war genomische DNA, isoliert aus zahlreichen verschiedenen Karzinomen.
Die DNA wurde präzise,
z.B. mittels Fluorimetrie, quantifiziert. Als eine Negativkontrolle
wurde DNA aus den Zellen von zehn normalen ge sunden Personen isoliert,
die gesammelt und als Testkontrolle für die Genkopie in gesunden
Personen verwendet wurde (nicht dargestellt). Der 5'-Nucleasetest (TaqManTM beispielsweise) und quantitative Echtzeit-PCR
(beispielsweise ABI Prizm 7700 Sequence Detection SystemTM (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division,
Foster City, CA)) wurden verwendet, um Gene zu finden, die sich in
bestimmten Krebsarten potenziell amplifizierten. Die Resultate wurden
verwendet, um zu bestimmen, ob die für PRO1800 kodierende DNA in
einem der primären
Lungen- oder Dickdarmkarzinome
oder einer der Dickdarmkrebszelllinien oder Brustkrebszelllinien,
die gescreent wurden, im Übermaß vorhanden
war. Die primären
Lungenkarzinome wurden aus Personen mit Tumoren des in Tabelle 6
angegeben Typs und Stadiums gewonnen. Eine Erklärung der zur Bezeichnung der
Primärtumoren,
die in Tabelle 6 angeführt
sind, und der Primärtumoren
und -Zelllinien, die in diesem Beispiel erwähnt werden, verwendeten Abkürzungen
ist nachstehend bereitgestellt.
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Die
Resultate des TagManTM sind in delta- (Δ-) Ct-Einheiten
angegeben. Eine Einheit entspricht 1 PCR-Zyklus oder etwa einer
2fachen Amplifikation in Bezug auf den Normalwert, zwei Einheiten
entsprechen einer 4fachen, drei Einheiten einer 8fachen Amplifikation
usw. Die Quantifizierung erfolgte unter Verwendung von Primern und
einer fluoreszierenden TagManTM-Sonde, die
aus dem für
PRO1800 kodierenden Gen abgeleitet wurde. Regionen von PRO1800,
die sehr wahrscheinlich einmalige Nucleinsäuresequenzen enthalten und
die am wenigsten wahrscheinlich ausgespleißte Intronen aufweisen, werden
für die
Primer- und Sondenderivatisierung bevorzugt, z.B. untranslatierte
3'-Regionen. Die
Sequenzen für
die Primer und Sonden (vorwärts,
rückwärts und
Sonde), die für
die PRO1800-Genamplifikations-Analyse
verwendet wurden, waren die Folgenden:
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PRO1800 (DNA35672-2508)
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- vorwärts
5'-ACTCGGGATTCCTGCTGTT-3' (Seq.-ID Nr. 27)
- Sonde 5'-AGGCCTTTACCCAAGGCCACAAC-3' (Seq.-ID Nr. 28)
- rückwärts 5'-GGCCTGTCCTGTGTTCTCA-3' (Seq.-ID Nr. 29)
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Die
5'-Nucleasetestreaktion
ist ein auf PCR basiertes Fluoreszenz-Verfahren, die von der 5'-Exonucleaseaktivität von Taq-DNA-Polymeraseenzym
profitiert, um Amplifikation in Echtzeit zu beobachten. Zwei Oligonucleotidprimer
werden verwendet, um ein Amplikon zu schaffen, das für eine PCR-Reaktion
typisch ist. Ein drittes Oligonucleotid, oder eine Sonde, wird entworfen,
um Nucleotidsequenz zu detektieren, die zwischen den zwei PCR-Primern
liegt. Die Sonde ist durch Taq-DNA-Polymeraseenzym nicht verlängerbar
und ist mit einem Reporter-Fluoreszenzfarbstoff und einem Quencher-Fluoreszenzfarbstoff
markiert. Jede beliebige Laser-induzierte Emission aus dem Reporterfarbstoff
wird durch den Quenching-Farbstoff gequencht, wenn die zwei Farbstoffe
an der Sonde eng beieinander angeordnet sind. Während der Amplifikationsreaktion
spaltet das Taq-DNA-Polymeraseenzym die Sonde in einer Matrizenabhängigen Weise.
Die resultierenden Sondenfragmente dissoziieren in Lösung, und
Signale aus dem freigesetzten Reportertarbstoff sind frei von Quenching-Effekten
des zweiten Fluorophors. Für
jedes neue synthetisierte Molekül
wird ein Molekül
des Reporterfarbstoffs freigesetzt, und Detektion des nicht gequenchten
Reporterfarbstoffs liefert die Grundlage für eine quantitative Interpretation
der Daten.
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Das
5'-Nucleaseverfahren
wird an einer quantitativen Echtzeit-PCR-Vorrichtung wie beispielsweise der
ABI Prism 7700TM Sequence Detection durchgeführt. Das System besteht aus
einem Thermocycler, einem Laser, einer ladungsgekoppelten (CCD)
Kamera und einem Computer. Das System amplifiziert Proben in einem
96-Well-Format an
einem Thermocycler. Während
der Amplifikation wird laserinduziertes, fluoreszierendes Signal
in Echtzeit durch Glasfaserkabeln für alle 96 Wells gesammelt und
an der CCD detektiert. Das System umfasst Software zum Betreiben
des Instruments sowie zur Datenanalyse.
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5'-Nucleasetestdaten
werden anfänglich
als Ct, also als Schwellenzyklus, ausgedrückt. Dieser ist als der Zyklus
definiert, bei dem sich das Reportersignal über dem Hintergrundpegel von
Fluoreszenz akkumuliert. Die ΔCt-Werte
werden als quantitative Messung der relativen Anzahl an Ausgangskopien
einer bestimmten Targetsequenz in einer Nucleinsäurenprobe verwendet, wenn Krebs-DNA-Resultate
mit Resultaten für
normale menschliche DNA verglichen werden.
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Tabelle
6 beschreibt das Stadium, T-Stadium und N-Stadium, von verschiedenen
Primärtumoren,
die verwendet wurden, um die PRO1800-Verbindungen der Erfindung
zu screenen. Tabelle
6 Profile
von primären
Lungen- und Dickdarmtumoren
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DNA-Herstellung
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DNA
wurde aus kultivierten Zelllinien, Primärtumoren und normalem menschlichem
Blut hergestellt. Die Isolierung wurde unter Verwendung eines Reinigungssets,
Puffersets und von Protease, alles von Qiagen, unter Befolgung der
Anweisungen des Herstellers und der nachstehenden Beschreibung durchgeführt.
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Zellkulturlyse:
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Zellen
wurden gewaschen und bei einer Konzentration von 7,5 × 108 pro Spitze trypsiniert und durch Zentrifugieren
bei 1.000 U/min 5 Minuten lang bei 4 °C pelletiert, woraufhin es wiederum
mit ½ Volumen
der PBS-Rezentrifugierung gewaschen wurde. Die Pellets wurden ein
drittes Mal gewaschen, die suspendierten Zellen wurden gesammelt
und 2x mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann in 10 ml PBS suspendiert.
Puffer C1 wurde bei 4 °C äquilibriert.
Qiagen-Protease Nr. 19155 wurde in 6,25 ml kaltes, doppelt destilliertes
H2O zu einer Endkonzentration von 20 mg/ml
verdünnt
und bei 4 °C äquilibriert.
10 ml von G2-Puffer wurden durch Verdünnen von Qiagen-RNase-A-Stammlösung (100
mg/ml) zu einer Endkonzentration von 200 μg/ml hergestellt.
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Puffer
C1 (10 ml, 4 °C)
und ddH2O (40 ml, 4 °C) wurden dann zu den 10 ml
Zellsuspension zugesetzt, durch Umkehren vermischt und auf Eis 10
Minuten lang inkubiert. Die Zellnuclei wurden durch Zentrifugieren in
einem Beckman-Ausschwingrotor bei 2.500 U/min bei 4 °C 15 Minuten
lang pelletiert. Der Überstand
wurde verworfen, und die Nuclei wurden mit einem Verwirbler in 2
ml Puffer C1 (bei 4 °C)
und 6 ml ddH2O suspendiert, gefolgt von
einer zweiten Zentrifugation bei 4 °C bei 2.500 U/min 15 Minuten
lang. Die Nuclei wurden dann in den restlichen Puffer unter Verwendung
von 200 μl
pro Spitze resuspendiert. G2-Puffer (10 ml) wurden zu den suspendierten
Nuclei unter sanftem Verwirbeln zugesetzt. Während das Zusetzen von Puffer
abgeschlossen wurde, wurde 30 Sekunden lang heftiges Verwirbeln
eingesetzt. Qiagen-Protease
(200 μl,
hergestellt wie zuvor angegeben) wurden zugesetzt und bei 50 °C 60 Minuten
lang inkubiert. Inkubation und Zentrifugation wurden wiederholt,
bis die Lysate klar waren (z.B. Inkubation für zusätzliche 30-60 Minuten, Pelletieren
bei 3.000 × g 10
min lang bei 4 °C).
-
Herstellung und Lyse fester
menschlicher Tumorproben:
-
Tumorproben
wurden gewogen, in konische 50-ml-Röhrchen platziert und auf Eis
gehalten. Die Verarbeitung war auf nicht mehr als 250 mg Gewebe
pro Präparat
(1 Spitze/Präparat)
eingeschränkt.
Die Proteaselösung
wurde durch Verdünnung
in 6,25 ml kaltes ddH2O zu einer Endkonzentration
von 20 mg/ml frisch hergestellt und bei 4 °C gelagert. G2-Puffer (20 ml)
wurde durch Verdünnung
von DNase A zu einer Endkonzentration von 200 mg/ml (aus 100 mg/ml
Stammlösung)
hergestellt. Das Tumorgewebe wurde in 19 ml G2-Puffer 60 Sekunden
lang unter Verwendung der großen
Spitze des Polytron in einer Laminarströmungs-TC-Abzug homogenisiert,
um Inhalation von Aerosolen zu vermeiden, und wurde bei Raumtemperatur
gehalten. Zwischen den Proben wurde das Polytron durch Zentrifugieren
2 × 30
Sekunden lang jeweils in 2 l ddH2O, gefolgt von
G2-Puffer (50 ml), gereinigt. War Gewebe stets an der Generatorspitze
vorhanden, so wurde die Vorrichtung auseinandergenommen und gereinigt.
-
Qiagen-Protease
(hergestellt wie zuvor angegeben, 1,0 ml) wurde zugesetzt, gefolgt
von Verwirbeln und Inkubation bei 50 °C 3 Stunden lang. Die Inkubation
und Zentrifugation wurden solange wiederholt, bis die Lysate klar
waren (z.B. Inkubieren für
zusätzliche
30-60 Minuten, Pelletieren bei 3.000 × g 10 min lang, 4 °C).
-
Herstellung und Lyse von
menschlichem Blut:
-
Gesunden
freiwilligen Spendern wurde unter Verwendung herkömmlicher
Arbeitsvorschriften für
infektiöses
Agens Blut abgenommen und in 10-ml-Proben pro Spitze citriert. Qiagen-Protease
wurde durch Verdünnen
in 6,25 ml kaltes ddH2O zu einer Endkonzentration
von 20 mg/ml frisch hergestellt und bei 4 °C gelagert. G2-Puffer wurde
durch Verdünnen
von RNase A zu einer Endkonzentration von 200 μg/ml aus 100 mg/ml Stammlösung hergestellt.
Das Blut (10 ml) wurde in ein konisches 50-ml- Röhrchen
platziert, und 10 ml C1-Puffer und 30 ml ddH2O
(beides davor auf 4 °C äquilibriert)
wurden zugesetzt, und die Komponenten wurden durch Umkehren vermischt
und 10 Minuten lang auf Eis gehalten. Die Nuclei wurden mit einem
Beckman-Ausschwingrotor
bei 2.500 U/min bei 4 °C
15 Minuten lang pelletiert, und der Überstand wurde verworfen. Mit
einer Zentrifuge wurden die Nuclei in 2 ml C1-Puffer (4 °C) und 6
ml ddH2O (4 °C) suspendiert. Zentrifugieren
wurde wiederholt, bis das Pellet weiß war. Die Nuclei wurden dann
in den restlichen Puffer unter Verwendung einer 200-μl-Spitze
suspendiert. G2-Puffer (10 ml) wurden zu den suspendierten Nuclei
unter sanftem Zentrifugieren zugesetzt, woraufhin heftiges Zentrifugieren
für 30
Sekunden folgte. Qiagen-Protease wurde zugesetzt (200 μl) und bei
50 °C 60
Minuten lang inkubiert. Inkubation und Zentrifugation wurden so
lange wiederholt, bis die Lysate klar waren (z.B. Inkubieren für zusätzliche
30-60 Minuten, Pelletieren bei 3.000 × g 10 min lang, 4 °C).
-
Reinigung geklärter Lysate:
-
(1) Isolieren der genomischen
DNA:
-
Genomische
DNA wurde mit 10 ml QBT-Puffer (1 Probe pro Maxi-Spitzen-Präparat) äquilibriert. QF-Elutionspuffer
wurde bei 50 °C äquilibriert.
Die Proben wurden 30 Sekunden lang zentrifugiert, dann auf äquilibrierte
Spitzen geladen und durch die Schwerkraft abgetropft. Die Spitzen
wurden mit 2 × 15
ml QC-Puffer gewaschen. Die DNA wurde in 30 ml silanisierte, im
Autoklav behandelte 30-ml-Corex-Röhrchen mit 15 ml QF-Puffer
(50 °C)
eluiert. Isopropanol (10,5 ml) wurde jeder Probe zugesetzt, die
Röhrchen
wurden mit Paraffin bedeckt und durch wiederholtes Umdrehen durchgemischt,
bis die DNA ausfiel. Proben wurden durch Zentrifugation im SS-34-Rotor
bei 15.000 U/min 10 Minuten lang bei 4 °C pelletiert. Die Pellet-Platzierung
wurde markiert und der Überstand
verworfen, und 10 ml 70 % Ethanol (4 °C) wurden zugesetzt. Die Proben
wurden erneut durch Zentrifugieren im SS-34-Rotor bei 10.000 U/min
10 min lang bei 4 °C
pelletiert. Die Pelletplatzierung wurde markiert und der Überstand
verworfen. Die Röhrchen
wurden dann an ihrer Seite an einem Trocken ständer platziert und 10 Minuten
lang bei 37 °C
getrocknet, wobei darauf geachtet wurde, dass die Proben nicht zu
stark getrocknet wurden.
-
Nach
dem Trocknen wurden die Pellets in 1,0 ml TE (pH 8,5) aufgelöst und bei
50 °C 1-2
Stunden lang ruhen gelassen. Die Proben wurden über Nacht auf 4 °C gehalten,
wobei sich das Auflösen
fortsetzte. Die DNA-Lösung
wurde dann auf 1,5-ml-Röhrchen mit
einer 26-Gauge-Nadel auf einer Tuberculinspritze überfragen.
Die Übertragung
wurde 5 × wiederholt,
um die DNA zu scheren. Die Proben wurden dann bei 50 °C 1-2 Stunden
lang ruhen gelassen.
-
(2) Quantifizierung von
genomischer DNA und Vorbereitung von Genamplifikationstests:
-
Die
DNA-Konzentrationen in jedem Röhrchen
wurden mittels Standard-A260,A280-Spektralphotometrie bei
einer 1:20-Verdünnung
(5 μl DNA
+ 95 μl
ddH2O) unter Verwendung der 0,1-ml-Quarzküvetten im
Spektralphotometer DU640 von Beckman quantifiziert. A260/A280-Verhältnisse
lagen im Bereich von 1,8-1,9. Jede DNA-Probe wurde dann weiter zu
etwa 200 ng/ml in TE (pH 8,5) verdünnt. War das ursprüngliche
Material hochkonzentriert (etwa 700 ng/μl), so wurde das Material bei
50 °C mehrere
Stunden lang ruhen gelassen, bis es resuspendiert wurde.
-
Fluorimetrische
DNA-Quantifizierung wurde dann am verdünnten Material (20-600 ng/ml) unter
Verwendung der Anweisungen des Herstellers mit den nachstehenden
Modifikationen durchgeführt.
Dies erfolgte durch 15-minütiges
Erwärmenlassen
eines Hoefter-DyNA-Quant-200-Fluorimeters. Die Farbstoffarbeitslösung von
Hoechst (Nr. H33258, 10 μl,
hergestellt innerhalb von 12 Stunden vor Verwendung) wurde in 100
ml 1 × TNE-Puffer
verdünnt.
Eine 2-ml-Küvette
wurde mit der Fluorimeterlösung
gefüllt,
in die Maschine gegeben, und die Maschine wurde auf 0 eingestellt.
pGEM 3Zf(+) (2 μl,
Charge Nr. 360851026) wurde zu 2 ml Fluorimeterlösung zugesetzt und bei 200
Einheiten kalibriert. Zusätzliche
2 μl von
pGEM-3Zf(+)-DNA wurden dann getestet und die Ablesung bei 400 +/– 10 Einheiten
bestätigt.
Jede Probe wurde dann zumindest in dreifacher Ausführung abgelesen.
Wurde erkannt, dass die Werte von 3 Proben in einem Bereich von
10 % beieinander lagen, wurde ihr Mittelwert genommen, und dieser
Wert wurde als der Quantifizierungswert verwendet.
-
Die
mittels Fluorimetrie bestimmte Konzentration wurde dann verwendet,
um jede Probe auf 10 ng/μl in
ddH2O zu verdünnen. Dies erfolgte gleichzeitig
an allen Matrizenproben für
einen einzelnen TaqMan-Plattentest und mit ausreichend Material,
um 500-1.000 Tests durchzuführen.
Die Proben wurden in dreifacher Ausführung mit TaqManTM-Primern
und sowohl mit B-Actin- als auch mit GAPDH-Sonden an einer einzelnen Platte
mit normaler menschlicher DNA und Nicht-Matrizen-Kontrollen getestet.
Die verdünnten
Proben wurden verwendet, vorausgesetzt, dass der CT-Wert normaler
menschlicher DNA, subtrahiert von Test-DNA, +/– 1 Ct betrug. Die verdünnte, Chargen-qualifizierte
genomische DNA wurde in 1,0-ml-Aliquoten bei –80 °C gelagert. Aliquoten, die in
weiterer Folge in Genamplifikationstests zu verwenden waren, wurden
bei 4 °C
gelagert. Jede 1-ml-Aliquote ist ausreichend für 8-9 Platten oder für 64 Tests.
-
Genamplifikationstest:
-
Die
PRO1800-Verbindungen der Erfindung wurden in den folgenden Primärtumoren
gescreent, und die resultierenden ΔCt-Werte über oder gleich 1,0 sind nachstehend
in Tabelle 7 dargestellt. Tabelle
7 (ΔCt-Werte
in Lungen- und Dickdarm-Primärtumormodellen)
Primärtumor | PRO1800 |
LT11 | 1,65;
1,59; 1,03 |
LT12 | 1,34;
2,28; 2,03 |
LT13 | 1,27;
2,18 |
LT15 | 1,70;
2,23; 1,93 |
LT16 | 1,00;
1,05; 1,09 |
LT17 | 1,94;
1,63 |
LT18 | 1,12 |
LT19 | 2,51;
2,18 |
LT21 | 1,30 |
CT2 | 1,50 |
CT14 | 1,62 |
CT15 | 1,48;
1,08 |
CT5 | 1,10 |
CT11 | 1,20 |
Colo-320 | 1,16 |
(Kolontumor-Zelllinie) | |
-
BEISPIEL 22: Verwendung
von PRO als eine Hybridisierungssonde
-
Das
folgende Verfahren beschreibt die Verwendung einer für PRO kodierenden
Nucleotidsequenz als Hybridisierungssonde.
-
DNA,
die die Kodiersequenz von Volllängen-
oder reifem PRO wie hierin offenbart umfasst, wird als eine Sonde
zum Screenen auf homologe DNAs (wie jene, die für natürlich vorkommende Varianten
von PRO kodieren) in cDNA-Bibliotheken aus menschlichem Gewebe oder
genomischen Bibliotheken aus menschlichem Gewebe verwendet.
-
Hybridisieren
und Waschen von Filtern, die beide Bibliotheks-DNAs enthalten, erfolgt
unter den folgenden hochstringenten Bedingungen. Hybridisierung
von radioaktiv markierter, von PRO abgeleiteter Sonde an die Filter
erfolgt in einer Lösung
von 50 % Formamid, 5 × SSC,
0,1 % SDS, 0,1 % Natriumpyrophosphat, 50 mM Natriumphosphat, pH
6,8, 2 × Denhardts
Lösung
und 10 % Dextransulfat bei 42 °C
20 Stunden lang. Waschen der Filter erfolgt in einer wässrigen
Lösung
von 0,1 × SSC
und 0,1 % SDS bei 42 °C.
-
DNAs
mit einer erwünschten
Sequenzidentität
mit der DNA, die für
Volllängen-Nativsequenz-PRO
kodiert, kann dann unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren, die auf
dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, identifiziert werden.
-
BEISPIEL 23: Expression
von PRO in E. coli
-
Dieses
Beispiel veranschaulicht die Herstellung einer unglykosylierten
Form von PRO durch rekombinante Expression in E. coli.
-
Die
für PRO
kodierende DNA-Sequenz wird anfänglich
unter Verwendung von selektierten PCR-Primern amplifiziert. Die
Primer sollten Restriktionsenzymstellen enthalten, die den Restriktionsenzymstellen
am ausgewählten
Expressionsvektor entsprechen. Zahlreiche verschiedene Expressionsvektoren
können
verwendet werden. Ein Beispiel für
einen geeigneten Vektor ist pBR322 (abgeleitet von E. coli; siehe
Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)), der Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz
enthält.
Der Vektor wird mit Restriktionsenzym verdaut und dephosphoryliert.
Die PCR-amplifizierten
Sequenzen werden dann in den Vektor ligiert. Der Vektor umfasst
vorzugsweise Sequenzen, die für
ein antibiotisches Resistenzgen kodieren, einen trp-Promotor, einen Polyhis-Leader
(einschließlich
der ersten sechs STII-Codons, Poly-his-Sequenz und Enterokinase-Spaltungsstelle),
die PRO-Kodierregion, λ-Transkriptionsterminator
und ein argU-Gen.
-
Das
Ligationsgemisch wird dann verwendet, um einen ausgewählten E.-coli-Stamm
unter Verwendung der in Sambrook et al., s.o., beschriebenen Verfahren
zu transformieren. Transformanten werden durch ihrer Fähigkeit
identifiziert, auf LB-Platten zu wachsen, und antibiotische resistente
Kolonien werden dann ausgewählt.
Plasmid-DNA kann isoliert und durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzieren
bestätigt
werden.
-
Ausgewählte Klone
können über Nacht
in flüssigem
Kulturmedium wie beispielsweise LB-Nährmedium, ergänzt mit
Antibiotika, gezüchtet
werden. Die Übernacht-Kultur
kann in weiterer Folge verwendet werden, um eine Kultur größeren Ausmaßes zu i nokulieren.
Die Zellen werden dann bis zu einer erwünschten optischen Dichte gezüchtet, währenddessen
der Expressionspromotor aktiviert wird.
-
Nach
dem Kultivieren der Zellen über
mehrere weitere Stunden hinweg können
die Zellen durch Zentrifugation geerntet werden. Das durch die Zentrifugation
erhaltene Zellpellet kann unter Verwendung verschiedener, auf dem
Gebiet der Erfindung bekannter Mittel solubilisiert werden, und
das solubilisierte PRO-Protein kann dann unter Verwendung einer
Metallchelatbildnersäule
unter Bedingungen, die feste Bindung des Proteins ermöglichen,
gereinigt werden.
-
PRO
kann in E. coli in einer poly-His-markierten Form unter Verwendung
des folgenden Verfahrens exprimiert werden. Die für PRO kodierende
DNA wird anfänglich
unter Verwendung selektierter PCR-Primer amplifiziert. Die Primer
enthalten Restriktionsenzymstellen, die den Restriktionsenzymstellen
am ausgewählten
Expressionsvektor entsprechen, sowie andere nützliche Sequenzen, die für wirksame
und zuverlässige Translationsinitiation,
rasche Reinigung an einer Metallchelatbildungssäule und proteolytische Entfernung
mit Enterokinase sorgen. Die PCR-amplifizierten, poly-His-markierten Sequenzen
werden dann in einen Expressionsvektor ligiert, der verwendet wird,
um einen E.-coli-Wirt, basierend auf Stamm 52 (W3110 fuhA(tonA)
Ion galE rpoHts(htpRts) clpP(laclq)), zu transformieren. Transformanten
werden zuerst in LB, das 50 mg/ml Carbenicillin enthält, bei
30 °C unter
Schütteln
gezüchtet,
bis eine O.D.600 von 3-5 erreicht ist. Kulturen
werden dann 50- bis 100fach in CRAP-Medium (hergestellt durch Vermischen
von 3,57 g (NH4)2SO4, 0,71 g Natriumcitrat 2H2O,
1,07 g KCl, 5,36 g Difco Hefeextrakt, 5,36 g Sheffield-Hycase SF
in 500 ml Wasser sowie 110 mM MPOS, pH 7,3, 0,55 % (Gew./Vol.) Glucose
und 7 mM MgSO4) verdünnt und etwa 20-30 Stunden
lang bei 30 °C
unter Schütteln
gezüchtet.
Proben werden dann entnommen, um Expression durch SDS-PAGE-Analyse
zu überprüfen, und
der Hauptteil der Kultur wird zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren.
Zellpellets werden bis zur Reinigung und Neufaltung eingefroren.
-
E.-coli-Paste
aus 0,5- bis 1-1-Fermentationen (6-10 g Pellets) wird in 10 Volumina
(Gew./Vol.) in 7 M Guanidin, 20 mM Tris, pH 8 (Puffer) resuspendiert.
Festes Natri umsulfit und Natriumtetrathiosulfat werden zugesetzt,
um Endkonzentrationen von 0,1 M bzw. 0,02 M zu erreichen, und die
Lösung
wird über
Nacht bei 4 °C
gerührt.
Dieser Schritt führt
zu einem denaturierten Protein, in dem alle Cysteinreste durch Sulfitolisierung blockiert
sind. Die Lösung
wird bei 40.000 U/min in einer Beckman-Ultrazentrifuge 30 min lang zentrifugiert. Der Überstand
wird mit 3-5 Volumina Metallchelatsäulenpuffer (6 M Guanidin, 20
mM Tris, pH 7,4) verdünnt und
durch 0,22-μm-Filter
zur Klärung
filtriert. Der geklärte
Extrakt wird auf eine 5-ml-Qiagen-Ni-NTA-Metallchelatsäule geladen, die in Metallchelatsäulepuffer äquilibriert
wurde. Die Säule
wird mit zusätzlichem
Puffer gewaschen, der 50 mM Imidazol (Calbiochem, Utrol-Gütegrad), pH 7,4, enthält. Das
Protein wird mit Puffer, der 250 mM Imidazol enthält, eluiert.
Die das erwünschte
Protein enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und bei 4 °C gelagert.
Die Proteinkonzentration wird durch sein Absorptionsvermögen bei
280 nm unter Verwendung des berechneten Extinktionskoeffizienten
basierend auf seiner Aminosäuresequenz
geschätzt.
-
Die
Proteine werden durch Verdünnen
der Probe langsam in frisch hergestellten Neufaltungspuffer, der
aus 20 mM Tris, pH 8,6, 0,3 M NaCl, 2,5 M Harnstoff, 5 mM Cystein,
20 mM Glycin und 1 mM EDTA besteht, neu gefaltet. Neufaltungsvolumina
werden so ausgewählt,
dass die Endproteinkonzentration zwischen 50 und 100 μg/ml liegt.
Die Neufaltungslösung
wird sanft bei 4 °C
12-36 Stunden lang gerührt.
Die Neufaltungsreaktion wird durch den Zusatz von TFA zu einer Endkonzentration
von 0,4 % (pH etwa 3) gequencht. Vor weiterer Reinigung des Proteins
wird die Lösung
durch ein 0,22-μm-Filter
filtriert, und Acetonitril wird zur Erreichung einer 2-10%igen Endkonzentration
zugesetzt. Das neugefaltete Protein wird an einer Poros-R1/H-Umkehrphasensäule unter
Verwendung eines mobilen Puffers von 0,1 % TFA mittels Elution mit
einem Acetonitril-Gradienten von 10 bis 80 % chromatographiert.
Allquoten von Fraktionen mit A280-Absorption werden an SDS-Polyacrylamidgelen
analysiert, und Fraktionen, die homogenes neugefaltetes Protein
enthalten, werden gesammelt. Im Allgemeinen werden die korrekt gefalteten
Spezies der meisten Proteine bei den niedrigsten Konzentrationen von
Acetonitril eluiert, da diese Spezies mit ihrem hydrophoben Inneren
am kompaktesten und vor Wechselwirkung mit dem Umkehrphasenharz
geschützt
sind. Aggregierte Spezies werden üblicherweise bei höhe ren Acetonitrilkonzentrationen
eluiert. Zusätzlich
zum Auflösen
fehlgefalteter Formen von Proteinen aus der erwünschten Form entfernt der Umkehrphasenschritt
auch Endotoxin aus den Proben.
-
Fraktionen,
die das erwünschte
gefaltete PRO-Polypeptid enthalten, werden gesammelt, und das Acetonitril
wird unter Verwendung eines sanften Stickstoffstroms, der auf die
Lösung
gerichtet ist, entfernt. Proteine werden in 20 mM Hepes, pH 6,8,
mit 0,14 M Natriumchlorid und 4 % Mannit durch Dialyse oder durch
Gelfiltration unter Verwendung von G25-Superfine-Harzen (Pharmacia), äquilibriert
im Formulierungspuffer, formuliert und steril filtriert.
-
Zahlreiche
der in der
EP 99962992.6 (WO
00/36102), von der diese Anmeldung eine Teilanmeldung ist, offenbarten
PRO-Polypeptide wurden erfolgreich wie oben beschrieben exprimiert.
-
BEISPIEL 24: Expression
von PRO in Säugetierzellen
-
Dieses
Beispiel veranschaulicht die Herstellung einer potenziell glykosylierten
Form von PRO durch rekombinante Expression in Säugetierzellen.
-
Der
Vektor pRK5 (siehe die
EP 307.247 ,
veröffentlicht
am 15. März
1989) wird als der Expressionsvektor verwendet. Gegebenenfalls wird
die PRO-DNA in pRK5 mit ausgewählten
Restriktionsenzymen ligiert, um Insertion der PRO-DNA unter Verwendung
von Ligationsverfahren, wie sie in Sambrook et al., s.o., beschrieben
weiden, zu ermöglichen.
Der resultierende Vektor wird als pRK5-PRO bezeichnet.
-
In
einer Ausführungsform
können
die ausgewählten
Wirtszellen 293-Zellen sein. Menschliche 293-Zellen (ATCC CCL 1573)
werden bis zur Konfluenz in Gewebekulturplatten in Medium wie z.B.
DMEM, ergänzt mit
fötalem
Kälberserum
und gegebenenfalls Nährstoffkomponenten
und/oder Antibiotika, gezüchtet.
Etwa 10 μg
pRKS-PRO-DNA werden
mit etwa 1 μg
DNA, die für
das VA-RNA-Gen kodiert [Thimmappaya et al., Cell 31, 543 (1982)],
vermischt und in 500 μl
von 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl2 aufgelöst. Zu diesem Gemisch
werden 500 μl
von 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO4 zugetropft,
und ein Niederschlag wird 10 min lang bei 25 °C bilden gelassen. Der Niederschlag
wird suspendiert, zu den 293-Zellen zugesetzt und etwa vier Stunden
lang bei 37 °C
absetzen gelassen. Das Kulturmedium wird abgesaugt, und 2 ml von
20 % Glycerin in PBS werden 30 Sekunden lang zugesetzt. Die 293-Zellen
werden dann mit serumfreiem Medium gewaschen, frisches Medium wird
zugesetzt, und die Zellen werden etwa 5 Tage lang inkubiert.
-
Etwa
24 Stunden nach den Transfektionen wird das Kulturmedium entfernt
und durch Kulturmedium (alleine) oder Kulturmedium, das 200 μCi/ml 35S-Cystein und 200 μCi/ml 35S-Methionin
enthält,
ersetzt. Nach einer 12-stündigen
Inkubation wird das konditionierte Medium gesammelt, an einem Zentrifugenfilter
eingeengt und auf ein 15%iges SDS-Gel geladen. Das bearbeitete Gel
kann getrocknet werden, und ein Film kann damit eine ausgewählte Zeitspanne
lang belichtet werden, um die Gegenwart von PRO-Polypeptid aufzuzeigen.
Die Kulturen, die transfizierte Zellen enthalten, können weiterer
Inkubation (in serumfreiem Medium) unterzogen werden, und das Medium
wird in ausgewählten
Biotests getestet.
-
In
einem alternativen Verfahren kann PRO in 293-Zellen unter Verwendung
des Dextransulfatverfahrens, das von Somparyrac et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. 12, 7575 (1981), beschrieben wird, vorübergehend
eingeführt
werden. 293-Zellen werden in einem Zentrifugenkolben bis zu maximaler
Dichte gezüchtet,
und 700 μg pRK5-PRO-DNA werden zugesetzt.
Die Zellen werden zuerst aus dem Zentrifugenkolben durch Zentrifugieren eingeengt
und mit PBS gewaschen. Das DNA-Dextran-Präzipitat wird am Zellpellet
vier Stunden lang inkubiert. Die Zellen werden mit 20 % Glycerin
90 Sekunden lang behandelt, mit Gewebekulturmedium gewaschen und neuerlich
in den Zentrifugenkolben, der Gewebekulturmedium, 5 μg/ml Rinderinsulin
und 0,1 μg/ml
Rindertransferrin enthält,
eingeführt.
Nach etwa vier Tagen wird das konditionierte Medium zentrifugiert
und filtriert, um Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Die Probe,
die exprimiertes PRO enthält,
kann dann eingeengt und mittels jedes be liebigen Verfahrens wie
z.B. Dialyse und/oder Säulenchromatographie
gereinigt werden.
-
In
einer anderen Ausführungsform
kann PRO in CHO-Zellen exprimiert werden. Das pRK5-PRO kann unter
Verwendung bekannter Reagenzien wie beispielsweise CaPO4 oder
DEAE-Dextran in CHO-Zellen transfiziert werden. Wie zuvor beschrieben
können
die Zellkulturen inkubiert und das Medium durch Kulturmedium (alleine)
oder Medium, das eine radioaktive Markierung wie z.B. 35S-Methionin
enthält,
ersetzt werden. Nach Bestimmen der Gegenwart von PRO-Polypeptid
kann das Kulturmedium durch serumfreies Medium ersetzt werden. Vorzugsweise
werden die Kulturen etwa 6 Tage lang inkubiert, und dann wird das
konditionierte Medium geerntet. Das das exprimierte PRO enthaltende
Medium kann dann konzentriert und durch jedes ausgewählte Verfahren
gereinigt werden.
-
Epitop-markiertes
PRO kann auch in Wirts-CHO-Zellen exprimiert werden. Das PRO kann
aus dem pRK5-Vektor subkloniert werden. Das Subklon-Insert kann
PCR unterzogen werden, um in Raster mit einer ausgewählten Epitopmarkierung
wie beispielsweise einer poly-his-Markierung in einen Baculovirus-Expressionsvektor
zu fusionieren. Das poly-His-markierte PRO-Insert kann dann in einen
SV40-gesteuerten Vektor subkloniert werden, der einen Selektionsmarker
wie z.B. DHFR zur Selektion stabiler Klone enthält. Schließlich können die CHO-Zellen (wie zuvor
beschrieben) mit dem SV40-gesteuerten Vektor transfiziert werden.
Es kann eine Markierung wie zuvor beschrieben angebracht werden,
um Expression zu überprüfen. Das
Kulturmedium, das das exprimierte poly-His-markierte PRO enthält, kann
dann eingeengt und durch jedes ausgewählte Verfahren wie z.B. durch
Ni2+-Chelataffinitätschromatographie gereinigt
werden.
-
PRO
kann auch in CHO- und/oder COS-Zellen durch ein Verfahren zur vorübergehenden
Expression oder in CHO-Zellen durch ein anderes Verfahren zur stabilen
Expression exprimiert werden.
-
Stabile
Expression in CHO-Zellen wird unter Verwendung des folgenden Verfahrens
durchgeführt.
Die Proteine werden als ein IgG-Konstrukt (Immunoadhäsin) exprimiert,
in dem die Kodiersequenzen für
die löslichen
Formen (z.B. extrazelluläre
Domänen}
der jeweiligen Proteine an eine IgG1-Konstantregionensequenz, die
die Gelenks-, CH2 und CH2-Domänen
enthält
und/oder eine poly-His-markierte Form ist, fusioniert werden.
-
Nach
PCR-Amplifikation werden die jeweiligen DNAs in einem CHO-Expressionsvektor
unter Verwendung herkömmlicher
Verfahren wie in Ausubel et al., Current Protocols of Molecular
Biology, Unit 3.16, John Wiley & Sons
(1997), beschrieben subkloniert. CHO-Expressionsvektoren werden
so konstruiert, dass sie kompatible Restriktionsstellen 5' und 3' der DNA von Interesse
aufweisen, um leichtes Verschieben von cDNAs zu ermöglichen.
Der Vektor, der für
Expression in CHO-Zellen verwendet wird, ist wie in Lucas et al.,
Nucl. Acids Res. 24(9), 1774-1779 (1996), beschrieben und verwendet
den frühen
SV40-Promotor/Enhancer, um Expression der cDNA von Interesse und
von Dihydrofolatreductase (DHFR) zu steuern. DHFR-Expression ermöglicht Selektion
für stabile
Aufrechterhaltung des Plasmids nach erfolgter Transfektion.
-
12 μg der erwünschten
Plasmid-DNA werden in etwa 10 Millionen CHO-Zellen unter Verwendung
von im Handel erhältlichen
Transfektionsreagenzien Superfect® (Qiagen),
Dosper® oder
Fugene® (Boehringer Mannheim)
eingeführt.
Die Zellen werden wie in Lucas et al., s.o., beschrieben gezüchtet. Etwa
3 × 107 Zellen werde in einer Ampulle für weitere
Züchtung
und Herstellung wie nachstehend beschrieben eingefroren.
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Die
die Plasmid-DNA enthaltenden Ampullen werden durch Platzieren in
ein Wasserbad aufgetaut und durch Verwirbeln vermischt. Die Inhalte
werden in ein Zentrifugenröhrchen
pipettiert, das 10 ml Medium enthält, und werden bei 1.000 U/min
5 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt, und
die Zellen werden in 10 ml selektivem Medium (0,2-μm-filtriertes
PS20 mit 5 % 0,2-μm-diafiltriertes
fötales Rinderserum) resuspendiert.
Die Zellen werden dann in einer 100-ml-Zentrifuge, die 90 ml selektives
Medium enthält,
aliquotiert. Nach 1-2 Tagen werden die Zellen in eine 250-ml-Zentrifuge,
gefüllt
mit 150 ml selektivem Wachstumsmedium, übertragen und bei 37 °C inkubiert.
Nach weiteren 2-3 Tagen werden 250-ml-, 500-ml- und 2.000-ml-Zentrifugen
mit 3 × 105 Zellen/ml beimpft. Das Zellmedium wird
durch frisches Medium durch Zentrifugieren und Resuspension in Produktionsmedium
ausgetauscht. Obwohl jedes geeignete CHO-Medium verwendet werden
kann, kann hier ein Produktionsmedium, das im US-Patent Nr. 5.122.469,
ausgegeben am 16. Juni 1992, beschrieben wird, verwendet werden.
Eine 3-I-Produktionszentrifuge wird bei einer Konzentration von
1,2 × 106 Zellen/ml beimpft. An Tag 0 wird der Zellanzahl-pH
bestimmt. An Tag 1 werden der Zentrifuge Proben entnommen, und Hindurchperlenlassen
von filtrierter Luft wird begonnen. An Tag 2 werden der Zentrifuge
Proben entnommen, die Temperatur wird auf 33 °C geändert, und 30 ml von 500 g/l
Glucose und 0,6 ml von 10%igem Antischaummittel (z.B. 35%ige Polydimethylsiloxanemulsion,
Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion) werden genommen. Im Laufe
der Produktion wird der pH sofern erforderlich eingestellt, um ihn
auf etwa 7,2 zu halten. Nach 10 Tagen, oder sobald die Lebensfähigkeit
auf unter 70 % abgefallen ist, wird die Zellkultur durch Zentrifugieren
und Filtrieren durch ein 0,22-μm-Filter
geerntet. Das Filtrat wurde entweder bei 4 °C gelagert oder sofort auf Säulen zur
Reinigung geladen.
-
Für die poly-His-markierten
Konstrukte wurden die Proteine unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule (Qiagen)
gereinigt. Vor der Reinigung wird Imidazol zu dem konditionierten
Medium zu einer Konzentration von 5 mM zugesetzt. Das konditionierte
Medium wird auf eine 6-ml-Ni-NTA-Säule, äquilibriert in 20 mM Hepes-Puffer,
pH 7,4, der 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol enthält, bei einer Durchflussgeschwindigkeit
von 4-5 ml/min bei 4 °C
gepumpt. Nach dem Laden wird die Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen,
und das Protein wird mit Äquilibrierungspuffer,
der 0,25 M Imidazol enthält,
eluiert. Das hochgereinigte Protein wird daraufhin in einen Ladepuffer,
der 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4 % Mannit, pH 6,8, enthält, mit
einer 25-ml-G25-Superfine-Säule
(Pharmacia) entsalzt und bei –80 °C gelagert.
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(Fc-hältige) Immunoadhäsin-Konstrukte
werden aus dem konditionierten Medium wie folgt gereinigt. Das konditionierte
Medium wird auf eine 5-ml-Protein-A-Säule (Pharmacia) gepumpt, die
in 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH 6,8, äquilibriert wurde. Nach dem
Laden wird die Säule
ausführlich
mit Äquilibrierungspuffer
gewaschen, bevor mit 100 mM Zitronensäure, pH 3,5, eluiert wird.
Das eluierte Protein wird unverzüglich
durch Sammeln von 1-ml-Fraktionen in Röhrchen, die 275 μl von 1 M
Tris-Puffer, pH 9, enthält,
neutralisiert. Das hochgereinigte Protein wird daraufhin in Ladepuffer
wie zuvor für
die poly-His-markierten Proteine beschrieben entsalzt. Die Homogenität wird durch
SDS-Polyacrylamidgele und durch Sequenzieren N-terminaler Aminosäuren durch
Edman-Abbau bewertet.
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Zahlreiche
der PRO-Polypeptide, die in der
EP
99962992.6 (WO 00/36102) offenbart sind, von der diese
Anmeldung eine Teilanmeldung ist, wurden erfolgreich wie oben beschrieben
exprimiert.
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BEISPIEL 25: Expression
von PRO in Hefe
-
Das
folgende Verfahren beschreibt rekombinante Expression von PRO in
Hefe.
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Zuerst
werden Hefe-Expressionsvektoren zur intrazellulären Produktion oder Sekretion
von PRO aus dem ADH2/GAPDH-Promotor konstruiert. DNA, die für PRO und
den Promotor kodiert, wird in geeignete Restriktionsenzymstellen
im selektierten Plasmid insertiert, um intrazelluläre Expression
von PRO zu steuern. Zur Sekretion kann für PRO kodierende DNA zusammen
mit DNA, die für
den ADH2/GAPDH-Promotor,
ein natives PRO-Signalpeptid oder ein anderes Säugetier-Signalpeptid kodiert,
oder beispielsweise einer Hefe-α-Faktor- oder
-Invertase-Sekretionssignal/Leadersequenz und Linkersequenzen (sofern
erforderlich) zur Expression von PRO in das selektierte Plasmid
kloniert werden.
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Hefezellen,
wie z.B. Hefestamm AB110, können
dann mit den zuvor beschriebenen Expressionsplasmiden transformiert
und in ausgewähltem
Fermentationsmedium kultiviert werden. Die Überstände transformierter Hefe können durch
Fällen
mit 10 Trichloressigsäure
und durch Trennen durch SDS-PAGE, gefolgt von Färben der Gele mit Coomassie-Blaufärbung, analysiert
werden. Rekombinantes PRO kann daraufhin isoliert und durch Entfernen
der Hefezellen aus dem Fermentationsmedium durch Zentrifugieren
und anschließendes Einengen
des Mediums unter Verwendung ausgewählter Patronenfilter gereinigt
werden. Das PRO-hältige Konzentrat
kann weiters unter Verwendung ausgewählter Säulenchromatographieharze gereinigt
werden.
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Zahlreiche
der PRO-Polypeptide, die in der
EP
99962992.6 (WO 00/36102) offenbart sind, von der diese
Anmeldung eine Teilanmeldung ist, wurden erfolgreich wie oben beschrieben
exprimiert.
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BEISPIEL 26: Expression
von PRO in mit Baculovirus infizierten Insektenzellen
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Das
folgende Verfahren beschreibt rekombinante Expression von PRO in
mit Baculovirus infizierten Insektenzellen.
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Die
für PRO
kodierende Sequenz wird stromab einer Epitopmarkierung, die in einem
Baculovirus-Expressionsvektor enthalten ist, fusioniert. Solche
Epitop-Markierungen umfassen poly-His-Markierungen und Immunglobulinmarkierungen
(wie Fc-Regionen von IgG). Zahlreiche verschiedene Plasmide können verwendet
werden, einschließlich
Plasmiden, die aus im Handel erhältlichen
Plasmiden wie z.B. pVL1393 (Novagen) stammen. Kurz zusammengefasst
wird die für
PRO kodierende Sequenz oder der erwünschte Abschnitt der Kodiersequenz
von PRO, wie z.B. die Sequenz, die für die extrazelluläre Domäne eines
Transmembranproteins kodiert, oder die Sequenz, die für das reife
Protein kodiert, sofern das Protein extrazellulär ist, durch PCR mit Primern,
die zu den 5'- und
3'-Regionen komplementär sind,
amplifiziert. Der 5'-Primer kann flankierende (selektierte)
Restriktionsenzymstellen inkorporieren. Das Produkt wird dann mit
jenen ausgewählten
Restriktionsenzymen verdaut und in den Expressionsvektor subkloniert.
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Rekombinantes
Baculovirus wird durch Co-Transfektion des obigen Plasmids und BaculoGoldTM-Virus-DNA (Pharmingen) in Spodoptera-frugiperda-
("Sf9"-) Zellen (ATCC CRL
1711) unter Verwendung von Lipofectin (im Handel bei GIBCO-BRL erhältlich)
hergestellt. Nach 4-5 Tagen Inkubation bei 28 °C werden die freigesetzten Viren
geerntet und zur weiteren Amplifikation verwendet. Virale Infektion
und Proteinexpression werden wie von O'Reilley et al., Baculovirus expression
vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994),
beschrieben durchgeführt.
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Exprimiertes
poly-His-markiertes PRO kann dann, beispielsweise durch Ni2+-Chelataffinitätschromatographie,
wie folgt gereinigt werden. Extrakte werden aus rekombinanten, virusinfizierten
Sf9-Zellen wie von Rupert et al., Nature 362, 175-179 (1993), beschrieben
hergestellt. Kurz zusammengefasst werden Sf9-Zellen gewaschen, in
Beschallungspuffer (25 ml Hepes, pH 7,9; 12,5 mM MgCl2;
0,1 mM EDTA; 10 % Glycerin, 0,1 % NP-40; 0,4 M KCl) resuspendiert
und zweimal 20 Sekunden lang auf Eis beschallt. Die beschallten
Produkte werden durch Zentrifugation geklärt, und der Überstand
wird 50fach in Ladepuffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10 % Glycerin,
pH 7,8) verdünnt
und durch ein 0,45-μm-Filter
filtriert. Eine Ni2+-NTA-Agarosesäule (im Handel bei Qiagen erhältlich)
wird mit einem Bettvolumen von 5 ml hergestellt, mit 25 ml Wasser
gewaschen und mit 25 ml Ladepuffer äquilibriert. Der filtrierte
Zellextrakt wird auf die Säule
bei 0,5 ml pro Minute geladen. Die Säule wird mit Ladepuffer zu
A280-Basislinie gewaschen, ein Punkt, an
dem Fraktionssammlung gestartet wird. Als Nächstes wird die Säule mit
einem sekundären
Waschpuffer (50 mM Phosphat; 300 mM NaCl, 10 % Glycerin, pH 6,0)
gewaschen, der nicht spezifisch gebundenes Protein eluiert. Nach
neuerlichem Erreichen der A280-Basislinie
wird die Säule
mit einem 0- bis 500-mM-Imidazolgradienten im sekundären Waschpuffer
entwickelt. 1-ml-Fraktionen werden gesammelt und durch SDS-PAGE
und Silberfärbung
oder Western-Blot mit Ni2+-NTA konjugiert
an alkalische Phosphatase (Qiagen) analysiert. Fraktionen, die das
eluierte His10-markierte PRO enthalten,
werden gesammelt und gegen Ladepuffer dialysiert.
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Alternativ
dazu kann Reinigung des IgG-markierten (oder Fc-markierten) PRO
unter Verwendung bekannter Chromatographieverfahren, einschließlich beispielsweise
Protein-A- oder Protein-G-Säulenchromatographie,
durchgeführt
werden.
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Zahlreiche
der PRO-Polypeptide, die in der
EP
99962992.6 (WO 00/36102) offenbart sind, von der diese
Anmeldung eine Teilanmeldung ist, wurden erfolgreich wie oben beschrieben
exprimiert.
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BEISPIEL 27: Herstellung
von Antikörpern,
die PRO binden
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Herstellung monoklonaler Antikörper, die
sich spezifisch an PRO binden können.
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Verfahren
zur Herstellung der monoklonalen Antikörper sind auf dem Gebiet der
Erfindung bekannt und werden beispielsweise in Goding, s.o., beschrieben.
Immunogene, die verwendet werden können, umfassen gereinigtes
PRO, Fusionsproteine, die PRO enthalten, und Zellen, die rekombinantes
PRO an der Zelloberfläche
exprimieren. Die Auswahl des Immunogens können Fachleute ohne übermäßiges Experimentieren treffen.
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Mäuse, wie
z.B. Balb/c, werden mit dem PRO-Immunogen immunisiert, das in komplettem
Freundschem Adjuvans emulgiert und subkutan oder intraperitoneal
in einer Menge von 1 bis 100 μg
injiziert wird. Alternativ dazu wird das Immunogen in MPL-TDM-Adjuvans (Ribi
Immunochemical Research, Hamilton, MT) emulgiert und in die Fußballen
der Hinterläufe
der Tiere injiziert. Die immunisierten Mäuse werden dann 10 bis 12 Tage
später
mit zusätzlichem
Immunogen, das im ausgewählten
Adjuvans emulgiert ist, geboostet. Hiernach können die Mäuse auch für mehrere Wochen mit zusätzlichen
Immunisierungsinjektionen geboostet werden. Serumproben können den
Mäusen
durch retroorbitale Blutabnahme zum Testen mittels ELISA-Tests zur Detektion
von Anti-PRO-Antikörpern
in periodisch Abständen
entnommen werden.
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Nachdem
ein geeigneter Antikörpertiter
nachgewiesen wurde, kann den Tieren mit "positiven" Antikörperwerten eine letzte intravenöse Injektion
von PRO verabreicht werden. Drei oder vier Tage später werden die
Mäuse getötet und
die Milzzellen geerntet. Die Milzzellen werden dann an eine selektierte
Mausmyelomzelllinie wie z.B. P3X63AgU.1, die bei der ATCC, Nr. CRL
1597, erhältlich
ist, (unter Verwendung von 35 % Polyethylenglykol) fusioniert. Die
Fusionen bilden Hybridomzellen, die dann in 96-Well-Gewebekulturplatten, welche
HAT- (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) Medium enthalten, ausplattiert
werden, um Proliferation von nicht-fusionierten Zellen, Myelomhybriden
und Milzzellhybriden zu hemmen.
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Die
Hybridomzellen werden in einem ELISA auf Reaktivität gegen
PRO gescreent. Bestimmung von "positiven" Hybridomzellen,
die die erwünschten
monoklonalen Antikörper
gegen PRO sekretieren, liegt im Bereich der Erfindung.
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Die
positiven Hybridomzellen können
intraperitoneal in syngenetische Balb/c-Mäuse injiziert werden, um Ascites
zu produzieren, die die monoklonalen Anti-PRO-Antikörper enthalten. Alternativ
dazu können
die Hybridomzellen in Gewebekulturkolben oder Rollflaschen gezüchtet werden.
Reinigung der monoklonalen Antikörper,
die in Ascites produziert werden, kann unter Verwendung von Ammoniumsulfatfällung, gefolgt
von Gelausschlusschromatographie, erfolgen. Alternativ dazu kann
Affinitätschromatographie
basierend auf Bindung von Antikörper
an Protein A oder Protein G verwendet werden.
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BEISPIEL 28: Reinigung
von PRO-Polypeptiden unter Verwendung spezifischer Antikörper
-
Native
oder rekombinante PRO-Polypeptide können mittels zahlreicher verschiedener
Verfahren zur Proteinreinigung, die auf dem Gebiet der Erfindung
Standard sind, gereinigt werden. Beispielsweise wird pro-PRO-Polypeptid,
reifes PRO-Polypeptid oder prä-PRO-Polypeptid
mittels Immunaffinitätschromatographie unter
Verwendung von Antikörpern,
die für
das PRO-Polypeptid von Interesse spezifisch sind, gereinigt.
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Im
Allgemeinen wird eine Immunaffinitätssäule durch kovalentes Binden
des anti-PRO-Polypeptidantikörpers an
ein aktiviertes Chromatographieharz konstruiert.
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Polyklonale
Immunglobuline werden aus Immunseren entweder durch Fällung mit
Ammoniumsulfat oder durch Reinigung an immobilisiertem Protein A
(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.) hergestellt. Demähnlich werden
monoklonale Antikörper
aus Maus-Ascitesflüssigkeit
durch Ammoniumsulfatfällung oder
durch Chromatographie an immobilisiertem Protein A hergestellt.
Teilweise gereinigtes Immunglobulin wird kovalent an ein Chromatographieharz
wie z.B. CnBr-aktivierte SEPHAROSETM (Pharmacia
LKB Biotechnology) gebunden. Der Antikörper wird an das Harz gebunden,
das Harz wird blockiert, und das Derivatharz wird gemäß den Anweisungen
des Herstellers gewaschen.
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Solch
eine Immunaffinitätssäule wird
zur Reinigung von PRO-Polypeptid durch Herstellung einer Fraktion
von Zellen, die PRO-Polypeptid in einer löslichen Form enthält, verwendet.
Dieses Präparat
wird durch Solubilisierung der ganzen Zelle oder einer subzellulären Fraktion,
die durch differenzielles Zentrifugieren durch den Zusatz von Detergens
oder mittels anderer Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung
bekannt sind, erhalten wurde, abgeleitet. Alternativ dazu kann lösliches
PRO-Polypeptid,
das eine Signalsequenz enthält,
in nützlicher
Menge in das Medium sekretiert werden, in dem die Zellen gezüchtet werden.
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Ein
lösliches
PRO-Polypeptid-hältiges
Präparat
wird über
eine Immunaffinitätssäule geführt, und
die Säule
wird unter Bedingungen gewaschen, die die präferenzielle Absorption von
PRO-Polypeptid ermöglichen (z.B.
Puffer mit hoher Ionenstärke
in Gegenwart von Detergens). Dann wird die Säule unter Bedingungen eluiert,
die Antikörper/PRO-Polypeptid-Bindung
aufbrechen (z.B. ein Puffer mit niedrigem pH wie etwa pH 2-3 oder
eine hohe Konzentration eines Chaotrops wie z.B. Harnstoff oder
Thiocyanation), und PRO-Polypeptid wird gesammelt.
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BEISPIEL 29: Wirkstoff-Screenen
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Diese
Erfindung ist besonders nützlich
zum Screenen von Verbindungen unter Verwendung von PRO-Polypeptiden
oder Bindungsfragmenten davon im Rahmen eines von zahlreichen verschiedenen
Screeningverfahren. Das PRO-Polypeptid oder -Fragment, das in solch
einem Test verwendet wird, kann entweder frei in Lösung, fixiert
an einen festen Träger,
an einer Zelloberfläche
getragen oder intrazellulär
angeordnet sein. Ein Verfahren zum Wirkstoff-Screenen verwendet
eukaryotische oder prokaryotische Wirtszellen, die mit rekombinanten
Nucleinsäuren,
die das PRO-Polypeptid
oder -Fragment exprimieren, stabil transformiert sind. Wirkstoffe
werden gegen solche transformierten Zellen in Konkurrenzbindungstests
gescreent. Solche Zellen, entweder in lebensfähiger oder in fixierter Form,
können
für herkömmliche
Bindungstests verwendet werden. Es kann beispielsweise die Bildung
von Komplexen zwischen PRO-Polypeptid oder einem -Fragment und dem zu
testenden Mittel gemessen werden. Alternativ dazu kann die Abnahme
von Komplexbildung zwischen dem PRO-Polypeptid und seiner Targetzelle
oder seinen Targetrezeptoren untersucht werden, die durch das zu
testende Mittel verursacht wird.
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Somit
stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Screenen auf Wirkstoffe
oder auf beliebige andere Mittel bereit, die mit PRO-Polypeptid
assoziierte Erkrankungen oder Leiden beeinflussen können. Diese Verfahren
umfassen das Kontaktieren solch eines Mittels mit einem PRO-Polypeptid
oder Fragment davon und das Testen (I) auf die Gegenwart eines Komplexes
zwischen dem Mittel und dem PRO-Polypeptid oder -Fragment oder (II)
auf die Gegenwart eines Komplexes zwischen dem PRO-Polypeptid oder -Fragment
und der Zelle mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren.
In solchen Konkurrenzbindungstests wird das PRO-Polypeptid oder
-Fragment typischerweise markiert. Nach geeigneter Inkubation wird
freies PRO-Polypeptid oder -Fragment von dem, das in gebundener
Form vorliegt, getrennt, und die Menge an freier oder nicht komplexierter
Markierung stellt ein Maß für die Fähigkeit
des bestimmten Mittels dar, sich an PRO-Polypeptid zu binden oder
den PRO-Polypeptid/Zell-Komplex zu stören.
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Ein
anderes Verfahren zum Wirkstoff-Screenen sorgt für Screenen mit hohem Durchsatz
von Verbindungen mit geeigneter Bindungsaffinität an ein Polypeptid und wird
in der WO 84/03564, veröffentlicht
am 13. September 1984, detailliert beschrieben. Kurz zusammengefasst
wird eine große
Anzahl an verschiedenen Testverbindungen kleiner Peptide an einem
festen Substrat, wie z.B. an Kunststoffstiften oder einer anderen Oberfläche, synthetisiert.
Nachdem sie auf ein PRO-Polypeptid aufgetragen wurden, werden Peptidtestverbindungen
mit PRO-Polypeptid umgesetzt und gewaschen. Gebundenes PRO-Polypeptid
wird mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren nachgewiesen.
Gereinigtes PRO-Polypeptid kann zur Verwendung in den zuvor genannten
Wirkstoff-Screening-Verfahren auch direkt auf Platten beschichtet
werden. Darüber
hinaus können
nicht-neutralisierende Antikörper
verwendet werden, um das Peptid einzufangen und es am festen Träger zu immobilisieren.
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Diese
Erfindung erwägt
auch die Verwendung von kompetitiven Wirkstoff-Screeningtests, in denen neutralisierende
Antikörper,
die in der Lage sind, PRO-Polypeptid
zu binden, spezifisch mit einer Testverbindung um Bindung an PRO-Polypeptid oder Fragmenten
davon konkurrieren. Auf diese Weise können die Antikörper verwendet
werden, um die Gegenwart jedes beliebigen Peptids nachzuweisen,
das mit PRO-Polypeptid eine oder mehrere antigene Determinanten
gemeinsam hat.
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BEISPIEL 30: Rationales
Wirkstoffdesign
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Das
Ziel von rationalem Wirkstoffdesign ist die Herstellung struktureller
Analoga von biologisch aktivem Polypeptid von Interesse (z.B. von
einem PRO-Polypeptid) oder von kleinen Molekülen, mit denen sie wechselwirken,
z.B. Agonisten, Antagonisten oder Inhibitoren. Jedes dieser Beispiele
kann verwendet werden, um Wirkstoffe zu entwerfen, die aktivere
oder stabilere Formen des PRO-Polypeptids sind oder die die Funktion
des PRO-Polypeptids in vivo verstärken oder stören (vgl.
Hodgson, Bio/Technology 9, 19-21 (1991)).
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In
einem Ansatz wird die dreidimensionale Struktur des PRO-Polypeptids
oder eines PRO-Polypeptid-Inhibitor-Komplexes durch Röntgenkristallographie,
durch Computermodellierung oder, was am häufigsten vorkommt, durch eine
Kombination der zwei Ansätze
bestimmt. Sowohl die Form als auch die Ladungen des PRO-Polypeptids müssen bestimmt
werden, um die Struktur erkennen zu können und um (eine) aktive Stelle(n)
des Moleküls
zu identifizieren. Weniger häufig
können
nützliche
Informationen hinsichtlich der Struktur des PRO-Polypeptids durch
Modellieren auf Grundlage der Struktur homologer Proteine gewonnen
werden. In beiden Fällen
wird relevante strukturelle Information verwendet, um analoge PRO-Polypeptid-ähnliche Moleküle zu entwerfen
oder um wirksame Inhibitoren zu identifizieren. Nützliche
Beispiele für
rationales Wirkstoffdesign können
Moleküle
umfassen, die verbesserte Aktivität oder Stabilität aufweisen,
wie von Braxton & Wells,
Biochemistry 31, 7796-7801 (1992), gezeigt wird, oder die als Inhibitoren,
Agonisten oder Antagonisten von nativen Peptiden wirken, wie von
Athauda et al., J. Biochem. 113, 742-746 (1993), gezeigt wird.
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Auch
ist es möglich,
einen Target-spezifischen Antikörper
zu isolieren, der wie zuvor beschrieben durch funktionelle Tests
selektiert wird, und dann seine Kristallstruktur aufzuklären. Dieser
Ansatz ergibt im Prinzip ein Pharmakor, auf Grundlage dessen Wirkstoffdesign
vollzogen werden kann. Es ist möglich,
Proteinkristallographie ganz zu umgehen, indem anti-idiotypische
Antikörper
(anti-ids) zu einem funktionellen, pharmakologisch aktiven Antikörper gebildet
werden. Es wird erwartet, dass, als ein Spiegelbild eines Spiegelbildes,
die Bindungsstelle der anti-ids analog zu dem Originalrezeptor ist.
Der anti-id könnte
dann verwendet werden, um Peptide aus Banken chemisch oder biologisch
hergestellter Peptide zu identifizieren und zu isolieren. Die isolierten
Peptide würden
dann als der Pharmakor wirken.
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Durch
die vorliegende Erfindung können
ausreichende Mengen des PRO-Polypeptids
verfügbar
gemacht werden, um solche analytischen Studien wie z.B. Röntgenkristallographie
durchzuführen.
Darüber
hinaus liefert die Kenntnis der hierin bereitgestellten PRO-Polypeptid-Aminosäuresequenz
einen Leitfaden für
jene, die Computermodellierungsverfahren anstelle von oder zusätzlich zu
Röntgenkristallographie
verwenden.
-
Hinterlegung von Material
-
Die
folgenden Materialien wurden bei der American Type Culture Collection,
12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA, (ATCC) hinterlegt:
-
Diese
Hinterlegung erfolgte gemäß den Vorschriften
des Budapester Vertrages über
die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen
für die
Zwecke von Patentverfahren und den darunter gültigen Bestimmungen (Budapester
Vertrag). Dies sichert die Erhaltung einer lebensfähigen Kultur
der Hinterlegung 30 Jahre lang ab dem Zeitpunkt der Hinterlegung.
Die Hinterlegungen werden von der ATCC gemäß den Bestimmungen des Budapester
Vertrages und gemäß einem
Abkommen zwischen Genentech, Inc., und ATCC verfügbar gemacht, das permanente
und uneingeschränkte
Verfügbarkeit
der Nachkommenschaft der Kultur der Hinterlegung für die Öffentlichkeit
bei Ausgabe des betreffenden US-Patents oder bei Offenlegung für die Öffentlichkeit
entweder der US- oder einer ausländischen
Patentanmeldung, je nachdem, was zuerst kommt, garantiert und das
die Verfügbarkeit
der Nachkommenschaft für
jemanden, der durch den Präsident des
Patentamtes der Vereinigten Staaten hierzu gemäß 35 USC § 122 und den dazu gültigen Bestimmungen (einschließlich 37
CFR § 1.14
unter besonderem Verweis auf 886 OG 638) befugt ist, sicherstellt.
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Der
Abtretungsempfänger
der vorliegenden Anmeldung hat sich einverstanden erklärt, dass,
sofern eine Kultur der hinterlegten Materialien, die unter geeigneten
Bedingungen kultiviert wurde, sterben oder verloren gehen oder zerstört werden
sollte, die Materialien unverzüglich
nach Benachrichtigung durch neue derselben Art ersetzt werden. Verfügbarkeit
des hinterlegten Materials ist nicht als eine Lizenz zur Ausführung der Erfindung
in Widerspruch mit den unter der Behörde einer beliebigen Regierung
gemäß ihrer
Patentgesetze garantierten Rechte zu verstehen.
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Die
obige schriftliche Beschreibung wird als ausreichend erachtet, um
Fachleuten die Möglichkeit
zu geben, die Erfindung durchzuführen.
Die vorliegende Erfindung soll in ihrem Schutzumfang durch das hinterlegte
Konstrukt nicht als eingeschränkt
gelten, da die hinterlegte Ausführungsform
einzig als Veranschaulichung bestimmter Aspekte der Erfindung zu
verstehen ist und zahlreiche Konstrukte, die funktionell äquivalent sind,
im Schutzumfang dieser Erfindung liegen. Die Hinterlegung des hierin
offenbarten Materials stellt weder ein Eingeständnis dar, dass die hierin
enthaltene schriftliche Beschreibung inadäquat sei, die praktische Durchführung irgendeines
Aspektes der Erfindung, einschließlich der besten Ausführungsform
davon, zu ermöglichen,
noch ist sie als eine Einschränkung
des Schutzumfangs der Ansprüche
zu den spezifischen Veranschaulichungen, die sie darstellt, zu verstehen. Sequenzprotokoll