DE69929914T2

DE69929914T2 - Gen das in Tumoren amplifiziert ist und damit zusammenhängende Materiale und Verfahren

Info

Publication number: DE69929914T2
Application number: DE69929914T
Authority: DE
Inventors: David Belmont Botstein; Luc San Francisco Desnoyers; Napoleone San Francisco FERRARA
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1999-02-12
Filing date: 1999-12-01
Publication date: 2006-10-19
Anticipated expiration: 2019-12-02
Also published as: EP1277833A2; KR100468975B1; ES2259058T3; ATE318303T1; KR20040071681A; DE69929914D1; DK1277833T3; PT1277833E; CA2407803A1; EP1277833B1; EP1277833A3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die Identifikation und Isolation von neuer DNA und die rekombinante Produktion neuer Polypeptide.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Extrazelluläre Proteine spielen wichtige Rollen bei u.a. der Bildung, Differenzierung und Erhaltung multizellulärer Organismen. Die Bestimmung zahlreicher einzelner Zellen, z.B. Proliferation, Migration, Differenzierung oder Wechselwirkung mit anderen Zellen, ist typischerweise durch Information gesteuert, die aus anderen Zellen und/oder aus der unmittelbaren Umgebung erhalten wird. Diese Information wird häufig von sekretierten Polypeptiden (beispielsweise von mitogenen Faktoren, Überlebensfaktoren, zytotoxischen Faktoren, Differenzierungsfaktoren, Neuropeptiden und Hormonen) übertragen, die wiederum von verschiedenen Zellrezeptoren oder membrangebundenen Proteinen erhalten und interpretiert werden. Diese sekretierten Polypeptide oder signalisierenden Moleküle durchwandern normalerweise den zellulären Sekretionsstoffwechselweg, um ihre Wirkungsstelle in der extrazellulären Umgebung zu erreichen.
Sekretierte Proteine haben verschiedene gewerbliche Anwendungsgebiete, einschließlich als Pharmazeutika, Diagnostika, Biosensoren und Bioreaktoren. Die meisten Proteinwirkstoffe, die zur Zeit erhältlich sind, wie z.B. thrombolytische Mittel, Interferone, Interleukine, Erythroproteine, koloniestimulierende Faktoren und verschiedene andere Cytokine, sind Sekretionsproteine. Ihre Rezeptoren, die Membranproteine sind, haben auch Potential als therapeutische oder diagnostische Mittel. Sowohl die Industrie als auch die Forschung unternahmen Bemühungen, neue native sekretierte Proteine zu identifizierten. Zahlreiche Bemühungen fokussierten sich auf das Screenen von rekombinanten Säugetier-DNA-Bibliotheken, um die Kodiersequenzen für neue sekretierte Proteine zu identifizieren. Beispiele für Screeningverfahren und -techniken werden in der Literatur beschrieben [siehe beispielsweise Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 7108-7113 (1996); US-Patent Nr. 5.536.637].
Membran-gebundene Proteine und Rezeptoren können wichtige Rollen bei u.a. der Bildung, Differenzierung und Erhaltung multizellulärer Organismen spielen. Die Bestimmung zahlreicher einzelner Zellen, z.B. Proliferation, Migration, Differenzierung oder Wechselwirkung mit anderen Zellen, ist typischerweise durch Information gesteuert, die aus anderen Zellen und/oder aus der unmittelbaren Umgebung erhalten wird. Diese Information wird häufig von sekretierten Polypeptiden (beispielsweise von mitogenen Faktoren, Überlebensfaktoren, zytotoxischen Faktoren, Differenzierungsfaktoren, Neuropeptiden und Hormonen) übertragen, die wiederum von verschiedenen Zellrezeptoren oder membrangebundenen Proteinen erhalten und interpretiert werden. Solche membrangebundenen Proteine und Zellrezeptoren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Zytokinrezeptoren, Rezeptorkinasen, Rezeptorphosphatasen, Rezeptoren, die in Zell-Zell-Wechselwirkungen eingebunden sind, und zelluläre Adhäsinmoleküle wie Selektine und Integrine. Beispielsweise wird Transduktion von Signalen, die Zellwachstum und -differenzierung regulieren, teilweise durch Phosphorylierung verschiedener zellulärer Proteine reguliert. Proteintyrosinkinasen, Enzyme, die diesen Vorgang katalysieren, können ebenfalls als Wachstumsfaktorrezeptoren wirken. Beispielsweise umfassen Fibroblastenwachstumsfaktorrezeptor und Nervenwachstumsfaktorrezeptor.
Membrangebundene Proteine und Rezeptormoleküle haben mehrere verschiedene gewerbliche Anwendungsgebiete, einschließlich als pharmazeutische und diagnostische Mittel. Rezeptorimmunoadhäsine beispielsweise können als therapeutische Mittel verwendet werden, um Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen zu blockieren. Die membrangebundenen Proteine können auch zum Screenen von potenziellen Peptid- oder niedermolekularen Inhibitoren der relevanten Rezeptor-Liganden-Wechselwirkung verwendet werden.
Sowohl Industrie als auch Forschung haben Bemühungen angestrengt, um neue native Rezeptor- oder membrangebundene Proteine zu identifizieren. Zahlreiche Bemühungen fokussierten sich auf das Screenen von rekombinanten Säugetier-DNA-Bibliotheken zur Identifikation der Kodiersequenzen für neue Rezeptor- oder membrangebundene Proteine.
PRO 539
Die Entwicklung multizellulärer Organismen hängt, zumindest teilweise, von Mechanismen ab, die Positionsinformation an Strukturzellen, -gewebe oder -organe spezifizieren, richten oder aufrechterhalten. Verschiedene sekretierte signalgebende Moleküle, wie Mitglieder der transformierenden Wachstumsfaktor-β- (TGF-β-), Wnt-, Fibroblastenwachstumsfaktoren- und Hedgehog-Familien, wurden mit der Strukturierungsaktivität verschiedener Zellen und Strukturen in Drosophila sowie in Wirbeltieren assoziiert. Perrimon, Cell 80, 517-520 (1995).
Costal-2 ist ein neues Kinesin-verwandtes Protein im Hedgehog-Signalstoffstoffwechselweg. Hedgehog (Hh) wurde zuerst als ein Segment-Polaritätsgen durch einen genetischen Screen in Drosophila melanogaster identifiziert, Nusslein-Volhard et al., Roux. Arch. Dev. Biol. 193, 267-282 (1984), das zahlreiche verschiedene Funktionen in der Entwicklung spielt. Perrimon, s.o. Obwohl nur ein Drosophila-Hh-Gen bisher identifiziert wurde, wurden bereits drei Säugetier-Hh-Homologe isoliert: Sonic Hh (SHh), Desert Hh (DHh) und Indian Hh (IHh), Echelard et al., Cell 75, 1417-1430 (1993); Riddle et al., Cell 75, 1401-1416 (1993). SHh wird in hohen Konzentrationen im Notochord und der Bodenplatte von Wirbeltier-Embryonen im Entwicklungsstadium exprimiert. In-vitro-Explantattests sowie ektopische Expression von SHh in transgenen Tieren zeigen, dass SHh eine zentrale Rolle in der Ausformung des Neuralrohrs spielt, Echelard et al., s.o., Krauss et al., Cell 75, 1432-1444 (1993), Riddle et al., Cell 75, 1401-1416 (1993), Roelink et al., Cell 81, 445-455 (1995). In-vitro-Explantattests sowie ektopische Expression von SHh in transgenen Tieren zeigen, dass SHh eine zentrale Rolle in der Ausformung des Neuralrohrs spielt, Echelard et al. (1993), s.o.; Ericson et al., Cell 81, 747-756 (1995); Marti et al., Nature 375, 322-325 (1995); Roelink et al. (1995), s.o.; Hynes et al., Neuron 19, 15-26 (1997). Hh spielt auch bei der Entwicklung von Gliedmaßen (Krauss et al., Cell 75, 1431-1444 (1993); Laufer et al., Cell 79, 993-1003 (1994)), von Somiten (Fan & Tessier-Lavigne, Cell 79, 1175-1186 (1994); Johnson et al., Cell 79, 1165-1173 (1994)), Lungen (Bellusci et al., Develop. 124, 53-63 (1997)) und Haut (Oro et al., Science 276, 817-812 (1997)) eine Rolle. In ähnlicher Weise sind IHh und DHh in Knochen-, Intestinal- und Keimzellentwicklung eingebunden, Apelqvist et al., Curr. Biol. 7, 801-804 (1997); Bellusci et al., Dev. Suppl. 124, 53-63 (1997); Bitgood et al., Curr. Biol. 6, 298-304 (1996); Roberts et al., Development 121, 3163-3174 (1995). SHh-Knockout-Mäuse untermauerten die Theorie, dass SHh für jeden Aspekt der Entwicklung von Wirbeltieren maßgeblich ist, Chiang et al., Nature 383, 407-413 (1996). Diese Mäuse zeigen Mängeln in den Mittellinienstrukturen wie der Chorda dorsalis und der Bodenplatte, Abwesenheit von ventralen Zelltypen im Neuralrohr, Abwesenheit von distalen Gliedmaßenstrukturen, Zyklopie und Abwesenheit der Wirbelsäule und der meisten Rippen.
Es wird angenommen, dass an der Zelloberfläche die Hh-Signale durch das 12-Transmembrandomänenprotein Patched (Ptch) (Hooper & Scott, Cell 59, 751-765 (1989); Nakano et al., Nature 341, 508-513 (1989)) und den G-Protein-gebundenen ähnlichen Rezeptor Smoothened (Smo) (Alcedo et al., Cell 86, 221-232 (1996); van den Heuvel & Ingham, Nature 382, 547-551 (1996)) weitergegeben werden. Sowohl genetische als auch biochemische Beweise unterstützen ein Rezeptormodell, in dem Ptch und Smo Teil eines Mehrfachkomponenten-Rezeptorkomplexes sind, Chen & Struhl, Cell 87, 553-563 (1996); Marigo et al., Nature 384, 176-179 (1996); Stone et al., Nature 384, 129-134 (1996). Bei Bindung von Hh an Ptch wird die normale Inhibierungswirkung von Ptch auf Smo gemindert, was ermöglicht, dass Smo das Hh-Signal über die Plasmamembran transduziert. Ein Verlust von Funktionsmutationen im Ptch-Gen wurde in Patienten mit dem Basalzellnävus-Syndrom (BCNS), einer Erbkrankheit, die durch multiple Basalzellenkarzinome (BCC) charakterisiert ist, identifiziert. Disfunktionelle Ptch-Genmutationen wurden auch mit einem hohen Prozentsatz sporadischer Basalzellenkarzinomtumoren assoziiert, Chidambaram et al., Cancer Research 56, 4599-4601 (1996); Gailani et al., Nature Genet. 14, 78-81 (1996); Hahn et al., Cell 85, 841-851 (1996); Johnson et al., Science 272, 1668-1671 (1996); Unden et al., Cancer Res. 56, 4562-4565 (1996); Wicking et al., Am. J. Hum. Genet. 60, 21-26 (1997). Es wird angenommen, dass der Verlust von Ptch-Funktion eine unkontrollierte Smo-Signalgebung in Basalzellenkarzinom auslöst. In ähnlicher Weise wurden aktivierende Smo-Mutationen in sporadischen BCC-Tumoren identifiziert (Xie et al., Nature 391, 90-92 (1998)), was die Rolle von Smo als die signalgebende Untereinheit im Rezeptorkomplex für SHh unterstreicht. Der exakte Mechanismus jedoch, durch den Ptch Smo-Aktivität kontrolliert, muss dennoch erst geklärt werden, und die Signalgebungsmechanismen, durch die das Hh-Signal vom Rezeptor auf Stromab-Targets übertragen wird, müssen auch noch aufgeklärt werden. Genetische epistatische Analyse in Drosophila identifizierte mehrere Segment-Polaritätsgene, die als Komponenten des Hh-Signaltransduktionsstoffwechselweges zu funktionieren scheinen, Ingham, Curr. Opin. Genet. Dev. 5, 492-498 (1995); Perrimon, s.o. Diese umfassen ein Kinesin-ähnliches Molekül, Costal-2 (Cos-2) (Robbins et al., Cell 90, 225-234 (1997); Sisson et al., Cell 90, 234-245 (1997)), ein Protein, das als fused bezeichnet wird (Preat et al., Genetics 135, 1047-1062 (1990); Therond et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4224-4228 (1996)), ein neues Molekül mit unbekannter Funktion, bezeichnet als Suppressor of fused bezeichnet wird (Pham et al., Genetics 140, 587-598 (1995); Preat, Genetics 132, 725-736 (1992)) und ein Zinkfingerprotein Ci. (Alexandre et al., Genes Dev. 10, 2003-2013 (1996); Dominguez et al., Science 272, 1621-1625 (1996); Orenic et al., Genes Dev. 4, 1053-1067 (1990)). Zusätzliche Elemente, die in Hh-Signalgebung eingebunden sind, umfassen den Transkriptionsfaktor CBP (Akimaru et al., Nature 386, 735-738 (1997)), den negativen Regulator slimb (Jiang & Struhl, Nature 391, 493-496 (1998)) und das SHh-Reaktionselement COUP-TFII (Krishnan et al., Science 278, 1947-1950 (1997)).
Mutanten in Cos-2 sind im Embryonalstadium letal und präsentieren einen Phänotyp, der Hh-Überexpression ähnlich ist, einschließlich Duplikationen der zentralen Komponente von jedem Segment und jeder Expansionsdomäne von Hh-reaktiven Genen. Dahingegen zeigen mutierte Embryonen für fused und Ci einen Phänotyp, der Hh-Funktionsverlust ähnlich ist, einschließlich Deletion des posterioren Teils von jedem Segment und Ersetzung einer Spiegelbild-artigen Duplikation des anterioren Teils oder von jedem Segment und Ersetzung einer Spiegelbild-Duplikation des anterioren Teils, Busson et al., Roux, Arch. Dev. Biol. 197, 221-230 (1988). Molekulare Charakterisierung von Ci lässt darauf schließen, dass es ein Transkriptionsfaktor ist, der Hh-reaktive Gene wie Wingless und Dpp direkt aktiviert, Alexandre et al. (1996), s.o., Dominguez et al. (1996), s.o. In ähnlicher Weise zeigt molekulare Analyse von fused, dass es strukturell mit Serinthreoninkinasen verwandt ist und dass sowohl eine intak te N-terminale Kinasedomäne als auch eine C-terminale Regulationsregion für seine korrekte Funktion erforderlich sind, Preat et al., Nature 347, 87-89 (1990); Robbins et al. (1997), s.o.; Therond et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4224-4228 (1996). In Übereinstimmung mit den vermutlichen entgegengesetzten Funktionen von Cos-2 und fused werden fused-Mutationen durch Cos-2-Mutanten und auch durch Suppressor-of-fused-Mutanten unterdrückt, Preat et al., Genetics 135, 1047-1062 (1993). Während jedoch fused-Nullmutationen und N-terminale Kinasedomänenmutationen vollständig durch Suppressor-of-fused-Mutationen unterdrückt werden können, präsentieren C-Terminus-Mutationen von fused einen stärkeren Cos-2-Phänotyp vor einem Suppressor-of-fused-Hintergrund. Dies lässt darauf schließen, dass die fused-Kinasedomäne als ein konstitutiver Aktivator von SHh-Signalgebung wirken kann, wenn Suppressor-of-fused nicht vorhanden ist. Jüngste Studien zeigten, dass das 92-kDa-Drosophila-fused, Cos-2 und Ci in einem mit Multiproteinkomplex assoziierten Mikrotubulus vorhanden sind und dass Hh-Signalgebung zur Dissoziation dieses Komplexes von Mikrotubuli führt, Robbins et al., Cell 90, 225-234 (1997); Sisson et al., Cell 90, 234-245 (1997). Sowohl fused als auch Cos-2 werden in Reaktion auf Hh-Behandlung phosphoryliert, Robbins et al., s.o.; Therond et al., Genetics 142, 1181-1198 (1996), doch Kinase(n), die für dies Aktivität(en) verantwortlich ist/sind, gilt es noch zu charakterisieren. Bis heute sind die einzigen bekannten Wirbeltier-Homologe für diese Komponenten Mitglieder der Gli-Proteinfamilie (z.B. Gli-1, Gli-2 und Gli-3). Diese sind vermutliche Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren, die strukturell mit Ci verwandt sind. Unter diesen wurde für Gli-1 gezeigt, dass es ein vermutlicher Mediator des SHh-Signals ist (Hynes et al., Neuron 15, 35-44 (1995); Lee et al., Development 124, 2537-2552 (1997); Alexandre et al., Genes Dev. 10, 2003-2013 (1996)), was darauf schließen lässt, dass der Mechanismus von Genaktivierung in Reaktion auf Hh von Zweiflüglern hin zu Wirbeltieren erhalten werden kann. Um zu bestimmen, ob andere Signalgebungskomponenten in der Hh-Kaskade im Laufe der Evolution erhalten wurden, und um die Funktion von fused in der Hh-Signalgebunskaskade auf biochemischer Ebene zu untersuchen, isolierten und charakterisierten die Anmelder die menschliche fused-cDNA. Gewebeverteilung bei der Maus weist darauf hin, dass fused in SHh-reaktiven Geweben exprimiert wird. Biochemische Studien zeigen, dass fused eine funktionelle Kinase ist. Funktionelle Stu dien liefern den Beweis, dass fused ein Aktivator von Gli ist und dass eine dominante negative Form von fused in der Lage ist, SHh-Signalgebung in Xenopus-Embryonen zu blockieren. Zusammen zeigen diese Daten, dass sowohl Cos-2 als auch fused direkt in Hh-Signalgebung eingebunden sind.
Weitere Information in Bezug auf Costal-2-Protein sind in Simpson et al., Dev. Biol. 122, 201-209 (1987); Grau et al., Dev. Biol. 122, 186-200 (1987); Preat et al., Genetics 135, 1047-1062 (1993); Sisson et al., Cell 90, 235-245 (1997); und Robbins et al., Cell 90, 225-234 (1997), zu finden.
Die Anmelder identifizieren und beschreiben hierin eine cDNA, die für ein menschliches Costal-2-Homologpolypeptid kodiert, das hierin als PRO539 bezeichnet wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
PRO539
Ein cDNA-Klon (DNA 47656-1561) wurde identifiziert, der Homologie zur für Costal-2-Protein kodierenden Nucleinsäure aufweist und für ein neues Polypeptid kodiert, das in der vorliegenden Anmeldung als "PRO539" bezeichnet wird.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung wie in den Ansprüchen definiert ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das DNA umfasst, die für ein PRO539-Polypeptid kodiert.
In einem Aspekt umfasst die isolierte Nucleinsäure DNA mit zumindest etwa 80 % Sequenzidentität, vorzugsweise zumindest etwa 85 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 90 % Sequenzidentität, und am meisten bevorzugt zumindest etwa 95 % Sequenzidentität, mit dem DNA-Molekül aus 1 (Seq.-ID Nr. 1).
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das DNA mit zumindest etwa 80 % Sequenzidentität, vorzugsweise zumindest etwa 85 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 90 % Sequenzidentität, und am meisten bevorzugt zumindest etwa 95 % Sequenzidentität; zu (a) einem DNA-Molekül, das für dasselbe reife Polypeptid kodiert, für das die menschliche Protein-cDNA mit der ATCC-Zugriffs-Nr. 203661 (DNA 47465-1561) kodiert, oder (b) zum Komplement des Nucleinsäuremoleküls aus (a) umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Nucleinsäure eine DNA, die für dasselbe reife Polypeptid kodiert, für das die menschliche Protein-cDNA mit der ATCC-Zugriffs-Nr. 203661 (DNA 47465-1561) kodiert.
In wiederum einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das DNA umfasst, die für ein Polypeptid mit zumindest etwa 80 % Sequenzidentität, vorzugsweise zumindest etwa 85 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 90 % Sequenzidentität, und am meisten bevorzugt zumindest etwa 95 % Sequenzidentität, zur Sequenz der Aminosäurereste 1 bis etwa 830 (Grenzen eingeschlossen) aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) kodiert.
In einem spezifischen Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das DNA umfasst, die für ein PRO539-Polypeptid kodiert, mit oder ohne Starter-Methionin, bereit oder ist zu solch einem kodierenden Nucleinsäuremolekül komplementär.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, isoliertes PRO539-Polypeptid bereit, für das jede beliebige der hierin zuvor definierten isolierten Nucleinsäuresequenzen kodiert.
In einem spezifischen Aspekt stellt die Erfindung isoliertes Nativsequenz-PRO539-Polypeptid bereit, das in manchen Ausführungsformen eine Aminosäuresequenz umfasst, die die Reste 1 bis etwa 830 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) umfasst.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes PRO539-Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz mit zumindest etwa 80 % Sequenzidentität, vorzugsweise zumindest etwa 85 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 90 % Se quenzidentität, und am meisten bevorzugt zumindest etwa 95 % Sequenzidentität, zur Sequenz der Aminosäurereste 1 bis etwa 830 (Grenzen eingeschlossen) aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) umfasst.
Die Erfindung kann Verwendung bei der Identifikation von Agonisten oder Antagonisten eines nativen PRO539-Polypeptids durch Kontaktieren des nativen PRO539-Polypeptids mit einem Kandidaten-Molekül und Beobachten einer biologischen Aktivität, die durch das Polypeptid vermittelt wird, finden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die biologische Aktivität entweder Bindung an Mikrotubuli oder die Fähigkeit, mit fused und Cubitus interruptus Komplexe zu bilden.
Die Erfindung kann Verwendung in einer Zusammensetzung finden, die ein PRO539-Polypeptid oder einen wie hierin zuvor definierten Agonisten oder Antagonisten in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Die Erfindung kann Verwendung bei der Entwicklung von Antagonisten gegen und Agonisten zur Förderung von PRO539-Modulation von Hedgehog-Signalgebung finden. Insbesondere bei der Entwicklung von einem Antagonisten zu Wirbeltier-PRO539, der das normale Funktionieren von PRO539 im SH-Signalstoffstoffwechselweg blockiert, unterbindet, inhibiert und/oder neutralisiert, einschließlich kleiner bioorganischer Moleküle sowie Antisense-Nucleotide.
Die Erfindung kann Verwendung in einem Verfahren zum Screenen oder Testen auf die Identifikation von Molekülen finden, die die PRO539-Modulation von Hedgehog-Signalgebung verändern. Vorzugsweise unterbinden die Moleküle entweder eine Wechselwirkung von PRO539 mit seinen assoziativen, komplexbildenden Proteinen (wie fused oder Cubitus interruptus), oder sie unterbinden oder inhibieren die Dissoziation von Komplexen. Der Test umfasst die Inkubation eines Gemisches, das PRO539 und ein Substrat umfasst, mit einem Kandidaten-Molekül sowie die Detektion der Fähigkeit des Kandidaten-Moleküls, PRO539-Hedgehog-Signalgebung zu modulieren. Die gescreenten Moleküle sind vorzugsweise niedermolekulare Wirkstoffkandidaten.
Die Erfindung kann Verwendung in einem Diagnoseverfahren finden, um zu bestimmen, ob eine bestimmte Störung durch Hedgehog-Signalgebung moduliert wird, umfassend:

(a) das Kultivieren von Testzellen oder -gewebe;
(b) das Verabreichen einer Verbindung, die PRO539-modulierte Hedgehog-Signalgebung inhibieren kann; und
(c) das Bestimmen, ob Hedgehog-Signalgebung moduliert wird.

Zusätzliche Ausführungsformen
In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung stellt die Erfindung Vektoren bereit, die DNA umfassen, die für jedes der hierin beschriebenen Polypeptide kodiert. Wirtszellen, die einen solchen Vektor umfassen, werden auch bereitgestellt. Beispielsweise können die Wirtszellen CHO-Zellen, E. coli oder Hefe sein. Weiters wird ein Verfahren zur Herstellung eines jeden beliebigen der hierin beschriebenen Polypeptide bereitgestellt und umfasst das Kultivieren von Wirtszellen unter Bedingungen, die zur Expression des erwünschten Polypeptids geeignet sind, und die Gewinnung des erwünschten Polypeptids aus der Zellkultur.
In anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung Hybridmoleküle bereit, die jedes beliebige der hierin beschriebenen Polypeptide, fusioniert an ein heterologes Polypeptid oder Aminosäuresequenz, umfassen. Beispiele für solche Hybridmoleküle umfassen jedes der hierin beschriebenen Polypeptide, fusioniert an eine Epitopmarkierungssequenz oder eine Fc-Region eines Immunglobulins.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung einen Antikörper bereit, der sich spezifisch an eines der zuvor oder nachstehend beschriebenen Polypeptide bindet. Gegebenenfalls ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper, humanisierter Antikörper, ein Antikörperfragment oder ein einkettiger Antikörper.
In wiederum einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung Oligonucleotidsonden bereit, die zum Isolieren genomischer und cDNA-Nucleotidsequenzen oder als Antisense-Sonden nützlich sind, worin diese Sonden von jeder beliebigen der zuvor oder nachstehend beschriebenen Nucleotidsequenzen abgeleitet sein können.
In anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein PRO-Polypeptid kodiert.
In einem Aspekt umfasst das isolierte Nucleinsäuremolekül eine Nucleotidsequenz mit zumindest etwa 80 % Sequenzidentität, vorzugsweise zumindest etwa 81 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 82 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 83 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 84 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 85 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 86 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 87 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 88 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 89 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 90 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 91 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 92 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 93 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 94 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 95 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 96 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 97 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 98 % Sequenzidentität und wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 99 % Sequenzidentität mit (a) einem DNA-Molekül, das für ein PRO-Polypeptid mit einer Volllängen-Aminosäuresequenz wie hierin offenbart, mit einer Aminosäuresequenz, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, mit einer extrazellulären Domäne eines transmembranen Proteins, mit oder ohne Signalpeptid, wie hierin offenbart oder mit jedem beliebigen, anderen, spezifisch definierten Fragment der Volllängen-Aminosäuresequenz wie hierin offenbart kodiert, oder (b) mit dem Komplement des DNA-Moleküls aus (a).
In anderen Aspekten umfasst das isolierte Nucleinsäuremolekül eine Nucleotidsequenz mit zumindest etwa 80 % Sequenzidentität, vorzugsweise zumindest etwa 81 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 82 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 83 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 84 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 85 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 86 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 87 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 88 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 89 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 90 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 91 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 92 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 93 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 94 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 95 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 96 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 97 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 98 % Sequenzidentität und wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 99 % Sequenzidentität mit (a) einem DNA-Molekül, das die Kodiersequenz für eine PRO-Polypeptid-cDNA voller Länge wie hierin offenbart umfasst, der Kodiersequenz eines PRO-Polypeptids, dem das Signalpeptid wie hierin offenbart fehlt, der Kodiersequenz einer extrazellulären Domäne eines transmembranen PRO-Polypeptids, mit oder ohne Signalpeptid, wie hierin offenbart, oder der Kodiersequenz jedes anderen, spezifisch definierten Fragments der Aminosäuresequenz voller Länge wie hierin offenbart oder (b) mit dem Komplement des DNA-Moleküls aus (a).
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das eine Nucleotidsequenz mit zumindest etwa 80 % Sequenzidentität, vorzugsweise zumindest etwa 81 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 82 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 83 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 84 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 85 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 86 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 87 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 88 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 89 % Sequenzidentität, wie derum noch bevorzugter zumindest etwa 90 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 91 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 92 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 93 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 94 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 95 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 96 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 97 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 98 % Sequenzidentität und wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 99 % Sequenzidentität mit (a) einem DNA-Molekül, das für dasselbe reife Polypeptid kodiert, für das jede beliebige menschliche Protein-cDNA, hinterlegt mit der ATCC wie hierin offenbart, kodiert, oder (b) mit dem Komplement des DNA-Moleküls aus (a) umfasst.
Ein anderer Aspekt der Erfindung stellt ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein PRO-Polypeptid kodiert, das entweder eine deletierte oder inaktivierte Transmembrandomäne aufweist, oder ist zu solch einer kodierenden Nucleotidsequenz komplementär, worin die Transmembrandomäne(n) von solch einem Polypeptid hierin offenbart ist/sind. Daher werden lösliche extrazelluläre Domänen der hierin beschriebenen PRO-Polypeptide erwogen.
Eine andere Ausführungsform betrifft Fragmente einer Kodiersequenz für PRO-Polypeptid, oder das Komplement davon, die beispielsweise als Hybridisierungssonden, für kodierende Fragmente eines PRO-Polypeptids, das gegebenenfalls für ein Polypeptid kodieren kann, das eine Bindungsstelle für einen Anti-PRO-Antikörper umfasst, oder als Antisense-Oligonucleotidsonden Verwendung finden können. Solche Nucleinsäurefragmente haben üblicherweise eine Länge von etwa 20 Nucleotiden, vorzugsweise eine Länge von etwa 30 Nucleotiden, vorzugsweise eine Länge von etwa 40 Nucleotiden, vorzugsweise eine Länge von etwa 50 Nucleotiden, vorzugsweise eine Länge von etwa 60 Nucleotiden, vorzugsweise eine Länge von etwa 70 Nucleotiden, vorzugsweise eine Länge von etwa 80 Nucleotiden, vorzugsweise eine Länge von etwa 90 Nucleotiden, vorzugsweise eine Länge von etwa 100 Nucleotiden, vorzugsweise eine Länge von etwa 110 Nucleotiden, vorzugsweise eine Län ge von etwa 120 Nucleotiden, vorzugsweise eine Länge von etwa 130 Nucleotiden, vorzugsweise eine Länge von etwa 140 Nucleotiden, vorzugsweise eine Länge von etwa 150 Nucleotiden, vorzugsweise eine Länge von etwa 160 Nucleotiden, vorzugsweise eine Länge von etwa 170 Nucleotiden, vorzugsweise eine Länge von etwa 180 Nucleotiden, vorzugsweise eine Länge von etwa 190 Nucleotiden, vorzugsweise eine Länge von etwa 200 Nucleotiden, vorzugsweise eine Länge von etwa 250 Nucleotiden, vorzugsweise eine Länge von etwa 300 Nucleotiden, vorzugsweise eine Länge von etwa 350 Nucleotiden, vorzugsweise eine Länge von etwa 400 Nucleotiden, vorzugsweise eine Länge von etwa 450 Nucleotiden, vorzugsweise eine Länge von etwa 500 Nucleotiden, vorzugsweise eine Länge von etwa 600 Nucleotiden, vorzugsweise eine Länge von etwa 700 Nucleotiden, vorzugsweise eine Länge von etwa 800 Nucleotiden, noch bevorzugter eine Länge von etwa 900 Nucleotiden, noch bevorzugter eine Länge von etwa 1000 Nucleotiden, worin in diesem Zusammenhang die Bezeichnung "etwa" die genannte Nucleotidsequenzlänge plus oder minus 10 % der Bezugslänge bedeutet. Es gilt anzumerken, dass neue Fragmente einer für PRO-Polypeptid kodierenden Nucleotidsequenz routinemäßig durch Abgleichen der für PRO-Polypeptid kodierenden Nucleotidsequenz mit anderen bekannten Nucleotidsequenzen unter Verwendung von jeder beliebigen Anzahl von bekannten Sequenzabgleichprogrammen und Bestimmen, welche(s) für PRO-Polypeptid kodierende Nucleotidsequenzfragment(e) neu ist/sind, bestimmt werden können. Hierin werden alle solche für PRO-Polypeptid kodierenden Nucleotidsequenz erwogen. Auch werden die PRO-Polypeptidfragmente in Betracht gezogen, für die diese Nucleotidmolekülfragmente kodieren, vorzugsweise jene PRO-Polypeptidfragmente, die eine Bindungsstelle für einen Anti-PRO-Antikörper umfassen.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung isoliertes PRO-Polypeptid bereit, für das jede beliebige der hierin zuvor definierten isolierten Nucleinsäuresequenzen kodiert.
In einem bestimmten Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes PRO-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit zumindest etwa 80 % Sequenzidentität, vorzugsweise zumindest etwa 81 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 82 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 83 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 84 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 85 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 86 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 87 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 88 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 89 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 90 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 91 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 92 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 93 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 94 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 95 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 96 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 97 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 98 % Sequenzidentität und wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 99 % Sequenzidentität mit einem PRO-Polypeptid, das eine Volllängen-Aminosäuresequenz wie hierin offenbart, eine Aminosäuresequenz, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, eine extrazelluläre Domäne eines transmembranen Proteins, mit oder ohne Signalpeptid, wie hierin offenbart oder jedes beliebige andere spezifisch definierte Fragment der Volllängen-Aminosäuresequenz wie hierin offenbart aufweist.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes PRO-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit zumindest etwa 80 % Sequenzidentität, vorzugsweise zumindest etwa 81 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 82 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 83 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 84 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 85 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 86 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 87 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 88 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 89 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 90 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 91 % Sequenzidentität, wiederum noch be vorzugter zumindest etwa 92 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 93 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 94 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 95 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 96 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 97 % Sequenzidentität, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 98 % Sequenzidentität und wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 99 % Sequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz, für die jede beliebige der in der ATCC hinterlegten menschlichen Protein-cDNAs wie hierin offenbart kodiert.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes PRO-Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die zumindest etwa 80 % Positive, vorzugsweise zumindest etwa 81 % Positive, noch bevorzugter zumindest etwa 82 % Positive, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 83 % Positive, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 84 % Positive, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 85 % Positive, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 86 % Positive, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 87 % Positive, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 88 % Positive, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 89 % Positive, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 90 % Positive, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 91 % Positive, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 92 % Positive, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 93 % Positive, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 94 % Positive, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 95 % Positive, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 96 % Positive, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 97 % Positive, wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 98 % Positive, und wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 99 % Positive, aufweist, wenn sie mit der Aminosäuresequenz von PRO-Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz voller Länge, wie hierin offenbart, einer Aminosäuresequenz, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, einer extrazellulären Domäne eines Transmembranproteins, mit oder ohne Signalpeptid, wie hierin offenbart, oder mit jedem anderen spezifisch definierten Fragment der Aminosäuresequenz voller Länge wie hierin offenbart verglichen wird.
In einem spezifischen Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes PRO-Polypeptid ohne die N-terminale Signalsequenz und/oder das initiierende Methionin bereit, für das eine Nucleotidsequenz kodiert, die für eine Aminosäuresequenz wie hierin zuvor beschrieben kodiert. Verfahren zur Herstellung derselben werden hierin ebenfalls beschrieben, worin solche Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle, die einen Vektor umfasst, der das geeignete kodierende Nucleinsäuremolekül umfasst, unter zur Expression des PRO-Polypeptids geeigneten Bedingungen und das Gewinnen des PRO-Polypeptids aus der Zellkultur umfassen.
Ein anderer Aspekt der Erfindung stellt ein isoliertes PRO-Polypeptid bereit, das entweder eine deletierte Transmembrandomäne aufweist oder eine deaktivierte Transmembrandomäne aufweist. Verfahren zur Bildung dieses PRO-Polypeptids sind hierin ebenfalls beschrieben, worin solche Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle, die einen Vektor umfasst, der das geeignete kodierende Nucleinsäuremolekül umfasst, unter zur Expression des PRO-Polypeptids geeigneten Bedingungen und das Gewinnen des PRO-Polypeptid aus der Zellkultur umfassen.
Die Erfindung kann in einem Verfahren zur Identifikation von Agonisten oder Antagonisten zu einem PRO-Polypeptid Verwendung finden, das das Kontaktieren des PRO-Polypeptids mit einem Kandidaten-Molekül und das Beobachten einer biologischen Aktivität, die durch das PRO-Polypeptid vermittelt wird, umfasst. Vorzugsweise ist das PRO-Polypeptid ein natives PRO-Polypeptid.
Die Erfindung kann in einer Substanzzusammensetzung Verwendung finden, die ein PRO-Polypeptid oder einen Agonisten oder Antagonisten eines PRO-Polypeptids wie hierin beschrieben oder einen Anti-PRO-Antikörper in Kombination mit einem Träger umfasst. Gegebenenfalls ist der Träger ein pharmazeutisch annehmbarer Träger.
Die vorliegende Erfindung kann bei der Verwendung eines PRO-Polypeptids oder eines Agonisten oder Antagonisten davon, wie hierin zuvor beschrieben, oder eines Anti-PRO-Antikörpers zur Herstellung eines Medikaments zum Einsatz kommen, das zur Behandlung eines Leidens nützlich ist, das auf das PRO-Polypeptid, einen Agonisten oder Antagonisten hiervon oder einen Anti-PRO-Antikörper reaktiv ist.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 1) einer Nativsequenz-PRO539-cDNA, worin Seq.-ID Nr. 1 ein Klon ist, der hierin als "DNA47465-1561" bezeichnet wird.
2 zeigt die Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2), die von der Kodiersequenz aus der in 1 gezeigten Seq.-ID Nr. 1 abgeleitet ist.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Definitionen
Die Bezeichnungen "PRO-Polypeptid" und "PRO" wie hierin verwendet, und sofern ihr unmittelbar eine Nummernkennzeichnung folgt, beziehen sich auf verschiedene Polypeptide, wobei sich die vollständige Bezeichnung (d.h. PRO/Nummer) auf spezifische Polypeptidsequenzen wie hierin beschrieben beziehen. Die Bezeichnungen "PRO/Nummer-Polypeptid" und "PRO/Nummer", worin die Bezeichnung "Nummer" hierin als eine tatsächliche numerische Benennung bereitgestellt wird, umfassen Nativsequenzpolypeptide und Polypeptidvarianten (die hierin noch näher definiert werden). Die hierin beschriebenen PRO-Polypeptide können aus zahlreichen verschiedenen Quellen isoliert werden, wie z.B. aus menschlichen Gewebetypen oder aus einer anderen Quelle, oder können durch Rekombinations- oder Syntheseverfahren hergestellt werden.
Ein "Nativsequenz-PRO-Polypeptid" umfasst ein Polypeptid mit derselben Aminosäuresequenz wie das entsprechende, aus der Natur gewonnene PRO-Polypeptid. Solche Nativsequenz-PRO-Polypeptide können aus natürlichen Quellen isoliert werden oder können mittels Rekombinations- oder Syntheseverfahren hergestellt werden. Die Bezeichnung "Nativsequenz-PRO-Polypeptid" umfasst insbesondere natürlich vorkommende, trunkierte oder sekretierte Formen des spezifischen PRO-Polypeptids (z.B. eine extrazelluläre Domänensequenz), natürlich vorkommende Varianten (z.B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich vorkommende Allelvarianten des Polypeptids. In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung sind die hierin offenbarten Nativsequenz-PRO-Polypeptide reife oder Volllängen-Nativsequenz-Polypeptide, welche die in den beiliegenden Figuren gezeigten Volllängen-Aminosäuresequenzen umfassen. Start- und Stoppcodons sind in den Figuren fettgedruckt und unterstrichen. Während jedoch die PRO-Polypeptide, die in den beiliegenden Figuren offenbart sind, als mit Methioninresten beginnend dargestellt sind, die hierin als Aminosäureposition 1 in den Figuren bezeichnet sind, ist es ebenso denkbar und möglich, dass andere Methioninreste entweder stromauf oder stromab von der Aminosäureposition 1 in den Figuren als die Start-Aminosäurereste für die PRO-Polypeptide verwendet werden.
Das PRO-Polypeptid-"extrazelluläre Domäne" oder "ECD" bezieht sich auf eine Form des PRO-Polypeptids, das im Wesentlichen frei von den transmembranen und zytoplasmatischen Domänen ist. Normalerweise weist eine PRO-Polypeptid-ECD weniger als etwa 1 % solcher Transmembran- und/oder zytoplasmatischen Domänen und vorzugsweise weniger als 0,5 % solcher Domänen auf. Es gilt zu verstehen, dass jede transmembrane Domäne, die für die PRO-Polypeptide der vorliegenden Erfindung identifiziert werden, gemäß auf dem Gebiet der Erfindung routinemäßig eingesetzten Kriterien zur Identifikation dieses Typs hydrophober Domänen identifiziert werden. Die exakten Grenzen einer transmembranen Domäne können variieren, jedoch sehr wahrscheinlich nicht um mehr als etwa 5 Aminosäuren an jedem Ende der Domäne, wie anfangs hierin definiert wurde. Gegebenenfalls kann daher eine extrazelluläre Domäne eines PRO-Polypeptids etwa 5 oder weniger Aminosäuren an jeder Seite der Grenze zwischen transmembraner Domäne und extrazellulärer Domänen wie in den Beispielen oder der Beschreibung identifiziert enthalten, und solche Polypeptide, mit oder ohne das assoziierte Signalpeptid, und Nucleinsäuren, die für sie kodieren, werden in der vorliegenden Erfindung bedacht.
Der ungefähre Ort der "Signalpeptide" der verschiedenen hierin offenbarten PRO-Polypeptide ist in der vorliegenden Beschreibung und/oder den beiliegenden Figuren gezeigt. Es gilt jedoch anzumerken, dass die C-terminale Grenze eines Signalpeptids variieren kann, jedoch sehr wahrscheinlich um nicht mehr als etwa 5 Aminosäuren an jeder Seite der C-terminalen Signalpeptidgrenze, wie anfänglich hierin identifiziert, worin die C-terminale Grenze des Signalpeptids gemäß auf dem Gebiet der Erfindung zur Identifikation dieses Typs von Aminosäuresequenzelement routinemäßig eingesetzten Kriterien identifiziert werden kann (z.B. Nielsen et al., Prot. Eng. 10, 1-6 (1997), und von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14, 4683-4690 (1986)). Darüber hinaus ist auch anerkannt, dass in manchen Fällen Spaltung einer Signalsequenz von einem sekretierten Polypeptid nicht gänzlich gleichförmig stattfindet, was zu mehr als einer sekretierten Spezies führt. Diese Polypeptide, bei denen das Signalpeptid innerhalb von nicht mehr als etwa 5 Aminosäuren an jeder Seite der C-terminalen Grenze des Signalpeptids wie hierin identifiziert gespaltet wird, und die für sie kodierenden Polynucleotide werden von der vorliegenden Erfindung behandelt.
"PRO-Polypeptidvariante" bezeichnet ein aktives PRO-Polypeptid wie zuvor oder nachstehend definiert mit zumindest etwa 80 % Aminosäuresequenzidentität mit einer Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz wie hierin offenbart, einer PRO-Polypeptidsequenz, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, einer extrazellulären Domäne eines PRO-Polypeptids, mit oder ohne Signalpeptid, wie hierin offenbart oder jedem anderen Fragment einer Volllängen-PRO-Polypeptidsequenz wie hierin offenbart. Solche PRO-Polypeptidvarianten umfassen beispielsweise PRO-Polypeptide, worin ein oder mehrere Aminosäurereste am N- oder C-Terminus der nativen Volllängen-Aminosäuresequenz addiert oder deletiert werden. Üblicherweise hat eine PRO-Polypeptidvariante zumindest etwa 80 % Aminosäuresequenzidentität, vorzugsweise zumindest etwa 81 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 82 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 83 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 84 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 85 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 86 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 87 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevor zugter zumindest etwa 88 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 89 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 90 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 91 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 92 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 93 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 94 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 95 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 96 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 97 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 98 % Aminosäuresequenzidentität und am meisten bevorzugt zumindest etwa 99 % Aminosäuresequenzidentität mit einer Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz wie hierin offenbart, einer PRO-Polypeptidsequenz, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, einer extrazellulären Domäne eines PRO-Polypeptids, mit oder ohne das Signalpeptid, wie hierin offenbart oder mit jedem anderen, spezifisch definierten Fragment einer Volllängen-PRO-Polypeptidsequenz wie hierin offenbart. Üblicherweise weisen PRO-Polypeptidvarianten eine Länge von zumindest etwa 10 Aminosäuren, oft zumindest eine Länge von etwa 20 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 30 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 40 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 50 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 60 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 70 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 80 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 90 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 100 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 150 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 200 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 300 Aminosäuren oder mehr, auf.
"Prozent- (%) Aminosäuresequenzidentität" in Bezug auf die hierin identifizierten PRO-Polypeptidsequenzen ist als der Prozentsatz an Aminosäureresten in einer Kandidatensequenz definiert, die mit den Aminosäureresten in der spezifischen PRO-Polypeptidsequenz nach Abgleichen der Sequenzen und Einführen von Lücken, sofern zur Erreichung maximaler prozentueller Sequenzidentität erforderlich, und ohne Berücksichtigung irgendwelcher konservativer Substitutionen als Teil der Sequenzidentität identisch sind. Abgleichen zum Zwecke der Bestimmung der prozentuellen Aminosäuresequenzidentität kann auf verschiedene Arten erreicht werden, die innerhalb des Gebiets der Erfindung liegen, beispielsweise unter Verwendung von allgemein erhältlichen Computerprogrammen wie z.B. BLAST-, BLAST-2-, ALIGN- oder Megalign-Software (DNASTAR). Fachleute können geeignete Parameter zur Messung von Abgleichung bestimmen, einschließlich sämtlicher Algorithmen, die erforderlich sind, um maximale Abgleichung über die volle Länge der zu vergleichenden Sequenzen zu erreichen. Für die vorliegenden Zwecke jedoch werden % Aminosäuresequenzidentitätswerte unter Verwendung des Computerprogramms zum Sequenzvergleich ALIGN-2 ermittelt, worin der vollständige Quellcode für das ALIGN-2-Programm nachstehend in Tabelle 1 bereitgestellt ist. Das ALIGN-2-Computerprogramm zum Sequenzvergleich wurde von Genentech, Inc., entworfen, und der in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigte Quellcode wurde mit Benutzerunterlagen im U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, eingereicht, wo er unter der U.S.-Copyright-Registrierungsnummer TXU510087 registriert ist. Das ALIGN-2-Programm ist über Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornien, öffentlich erhältlich oder kann aus dem in der nachstehenden Tabelle 1 bereitgestellten Quellcode kompiliert werden. Das ALIGN-2-Programm sollte zur Verwendung auf einem UNIX-Betriebssystem, vorzugsweise digital UNIX V4.0D, kompiliert werden. Alle Sequenzvergleichsparameter sind durch das ALIGN-2-Programm festgesetzt und variieren nicht.
In Situationen, in denen ALIGN-2 zum Aminosäuresequenzvergleich verwendet wird, wird die % Aminosäuresequenzidentität einer bestimmten Aminosäuresequenz A zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B (was alternativ auch als eine bestimmte Aminosäuresequenz A beschrieben werden kann, die eine bestimmte % Aminosäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B hat oder umfasst) wie folgt berechnet:
100 mal den Bruch X/Y
worin X die Anzahl an Aminosäureresten ist, die durch das Sequenzabgleichungsprogramm ALIGN-2 in dieser Abgleichung des Programms von A und B als identische Übereinstimmungen verzeichnet wurden, und Y die Gesamtanzahl an Aminosäureresten in B ist. Es wird verstanden werden, dass, sofern die Länge der Aminosäuresequenz A mit der Länge der Aminosäuresequenz B nicht übereinstimmt, die % Aminosäuresequenzidentität von A zu B nicht gleich der % Aminosäuresequenzidentität von B zu A ist. Als Beispiele für % Aminosäuresequenzidentität-Berechnungen unter Verwendung dieses Verfahrens zeigen Tabelle 2 und 3, wie die % Aminosäuresequenzidentität der Aminosäuresequenz, die als "Vergleichsprotein" bezeichnet wird, zur Aminosäuresequenz, die als "PRO" bezeichnet wird, berechnet wird, worin "PRO" für die Aminosäuresequenz eines hypothetischen PRO-Polypeptids von Interesse steht, "Vergleichsprotein" für die Aminosäuresequenz eines Polypeptids steht, mit dem das "PRO"-Polypeptid von Interesse verglichen wird, und "X", "Y" und "Z" jeweils verschiedene hypothetische Aminosäurereste darstellen.
Außer spezifisch anders festgehalten, werden alle hierin verwendeten % Aminosäuresequenzidentitätswerte wie im unmittelbar vorangehenden Absatz beschrieben unter Verwendung des ALIGN-2-Computerprogramms erhalten. % Aminosäuresequenzidentitätswerte können jedoch auch wie nachstehend beschrieben unter Verwendung des WU-BLAST-2-Computerprogramms (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996)) erhalten werden. Die meisten der WU-BLAST-2-Suchparameter sind auf Standardwerte eingestellt. Jene, die nicht auf Standardwerte eingestellt sind, d.h. die veränderbaren Parameter, werden mit den folgenden Werten eingestellt: overlap span = 1, overlap fraction = 0,125, word threshold (T) = 11 und scoring matrix = BLOSUM62. Wird WU-BLAST-2 verwendet, so wird ein % Aminosäure-Sequenzidentitätswert durch Teilen (a) der Anzahl an übereinstimmenden identischen Aminosäureresten zwischen der Aminosäuresequenz des PRO-Polypeptids von Interesse mit einer Sequenz, die aus dem nativen PRO-Polypeptid abgeleitet ist, und der Vergleichs-Aminosäuresequenz von Interesse (d.h. die Sequenz, mit der das PRO-Polypeptid von Interesse verglichen wird, die eine PRO-Polypeptidvariante sein kann) wie durch WU-BLAST-2 bestimmt durch (b) die Gesamtzahl an Aminosäureresten des PRO-Polypeptids von Interesse bestimmt. Bei spielsweise ist in der Feststellung "ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz A umfasst, die zumindest 80 % Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz B aufweist" die Aminosäuresequenz A die Vergleichs-Aminosäuresequenz von Interesse, und die Aminosäuresequenz B ist die Aminosäuresequenz des PRO-Polypeptids von Interesse.
Prozent Aminosäuresequenzidentität kann auch unter Verwendung des Sequenzvergleichprogramms NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402 (1997)) bestimmt werden. Das NCBI-BLAST2-Sequenzvergleichprogramm kann von der Adresse http://www.ncbi.nlm.nig.gov heruntergeladen werden. NCBI-BLAST2 verwendet mehrere Suchparameter, worin alle diese Suchparameter auf Standardwerte eingestellt sind, einschließlich beispielsweise unmask = yes, strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity length = 15/5, multi-pass evalue = 0,01, constant for multi-pass = 25, dropoff for final gapped alignment = 25 und scoring matrix = BLOSUM62.
In Situationen, in denen NCBI-BLAST2 für Aminosäuresequenzvergleiche verwendet wird, wird die % Aminosäuresequenzidentität einer bestimmten Aminosäuresequenz A zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B (was alternativ auch als eine bestimmte Aminosäuresequenz A beschrieben werden kann, die eine bestimmte % Aminosäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B hat oder umfasst) wie folgt berechnet:
100 mal den Bruch X/Y
worin X für die Anzahl an Aminosäureresten steht, die als identische Übereinstimmungen des Sequenzabgleichungsprogramms NCBI-BLAST2 in der Programmabgleichung von A und B verzeichnet werden, und worin Y für die Gesamtzahl an Aminosäureresten in B steht. Es wird verständlich sein, dass, sofern die Länge von Aminosäuresequenz A nicht der Länge von Aminosäuresequenz B entspricht, die % Aminosäuresequenzidentität von A zu B nicht gleich der % Aminosäuresequenzidentität von B zu A ist.
"PRO-Polynucleotidvariante" oder "PRO-Nucleinsäuresequenzvariante" bezeichnet ein Nucleinsäuremolekül, das für ein aktives PRO-Polypeptid wie nachstehend definiert kodiert und das zumindest etwa 80 % Nucleinsäuresequenzidentität mit einer Nucleinsäuresequenz aufweist, die für eine Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz wie hierin offenbart, eine Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, eine extrazelluläre Domäne eines PRO-Polypeptids, mit oder ohne Signalpeptid, wie hierin offenbart oder jedes andere Fragment einer Volllängenpeptidsequenz wie hierin offenbart kodiert. Üblicherweise hat eine PRO-Polynucleotidvariante zumindest etwa 80 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 81 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 82 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 83 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 84 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 85 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 86 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 87 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 88 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 89 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 90 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 91 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 92 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 93 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 94 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 95 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 96 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 97 % Nucleinsäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 98 % Nucleinsäuresequenzidentität und wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 99 % Nucleinsäuresequenzidentität mit einer Nucleinsäuresequenz, die für eine Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz wie hierin offenbart, eine Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, eine extrazelluläre Domäne eines PRO-Polypeptids, mit oder ohne das Signalpeptid, wie hierin offenbart oder jedes andere Fragment einer Volllängen-PRO-Polypeptidsequenz wie hierin offenbart kodiert. Varianten umfassen nicht die native Nucleotidsequenz.
Üblicherweise weisen PRO-Polynucleotidvarianten eine Länge von zumindest etwa 30 Nucleotiden, oft zumindest eine Länge von zumindest etwa 60 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 90 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 120 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 150 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 180 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 210 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 240 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 270 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 300 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 450 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 600 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 900 Nucleotiden, oder mehr auf.
"Prozent (%) Nucleinsäuresequenzidentität" in Bezug auf hierin identifizierte PRO-kodierende Nulceinsäuresequenzen ist als der Prozentsatz an Nucleotiden in einer Kandidatensequenz definiert, die mit den Nucleotiden in der PRO-Nucleinsäuresequenz von Interesse, nach Abgleichen der Sequenzen und Einführen von Lücken, sofern zur Erreichung maximaler Prozent-Sequenzidentität erforderlich, identisch sind. Abgleichung zum Zweck der Bestimmung von Prozent-Nucleinsäuresequenzidentität kann auf verschiedene Weisen erreicht werden, die in den Bereich des Gebiets der Erfindung fallen, beispielsweise unter Verwendung öffentlich erhältlicher Computersoftware wie BLAST, BLAST-2, ALIGN oder Megalign-Software (DNASTAR). Für die Zwecke hierin jedoch werden % Nucleinsäuresequenzidentitätswerte unter Verwendung des Sequenzvergleich-Computerprogramm ALIGN-2 ermittelt, worin der vollständige Quellcode für das ALIGN-2-Programm nachstehend in Tabelle 1 bereitgestellt ist. Das ALIGN-2-Sequenzvergleich-Computerprogramm wurde von Genentech, Inc., entwickelt, und der nachstehend in Tabelle 1 gezeigte Quellcode wurde mit Benutzerunterlagen im U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, eingereicht, wo er unter der U.S.-Copyright-Registrierungsnummer TXU510087 registriert ist. Das ALIGN-2-Programm ist über Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornien, öffentlich erhältlich oder kann aus dem in der nachstehenden Tabelle 1 bereitgestellten Quellcode kompiliert werden. Das ALIGN-2-Programm sollte zur Verwendung auf einem UNIX-Betriebssystem, vorzugsweise di gital UNIX V4.0D, kompiliert werden. Alle Sequenzvergleichsparameter sind durch das ALIGN-2-Programm festgesetzt und variieren nicht.
In Situationen, in denen ALIGN-2 zum Nucleinsäuresequenzvergleich verwendet wird, wird die % Nucleinsäuresequenzidentität einer bestimmten Nucleinsäuresequenz C zu, mit oder gegen eine bestimmte Nucleinsäuresequenz D (was alternativ auch als eine bestimmte Nucleinsäuresequenz C beschrieben werden kann, die eine bestimmte % Nucleinsäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine bestimmte Nucleinsäuresequenz D hat oder umfasst) wie folgt berechnet:
100 mal den Bruch W/Z
worin W die Anzahl an Nucleotiden ist, die als identische Übereinstimmungen durch das Sequenzabgleichungsprogramm ALIGN-2 in der Programmabgleichung von C und D verzeichnet sind, und worin Z die Gesamtzahl an Nucleotiden in D ist. Es wird verstanden werden, dass, sofern die Länge von Nucleinsäuresequenz C nicht der Länge von Nucleinsäuresequenz D entspricht, die % Nucleinsäuresequenzidentität von C zu D nicht gleich der % Nucleinsäuresequenzidentität von D zu C ist. Als Beispiele für % Nucleinsäuresequenzidentitäts-Berechnungen zeigen die Tabellen 4 und 5, wie die % Nucleinsäuresequenzidentität der Nucleinsäuresequenz, die als "Vergleichs-DNA" bezeichnet wird, zur Nucleinsäuresequenz, die als "PRO-DNA" bezeichnet ist, berechnet wird, worin "PRO-DNA" eine hypothetische PRO-kodierende Nucleinsäuresequenz von Interesse darstellt, "Vergleichs-DNA" die Nucleotidsequenz eines Nucleinsäuremoleküls darstellt, mit dem das "PRO-DNA"-Nucleinsäuremolekül von Interesse verglichen wird, und "N", "L" und "V" jeweils verschiedene hypothetische Nucleotide darstellen.
Außer spezifisch anders festgehalten, werden alle hierin verwendeten % Nucleinsäuresequenzidentitätswerte wie im unmittelbar vorangehenden Absatz beschrieben unter Verwendung des ALIGN-2-Computerprogramms erhalten. % Nucleinsäuresequenzidentitätswerte können jedoch auch wie nachstehend beschrieben unter Verwendung des WU-BLAST-2-Computerprogramms (Altschul et al., Methods in Enzy mology 266, 460-480 (1996)) erhalten werden. Die meisten der WU-BLAST-2-Suchparameter sind auf Standardwerte eingestellt. Jene, die nicht auf Standardwerte eingestellt sind, d.h. die veränderbaren Parameter, werden mit den folgenden Werten eingestellt: overlap span = 1, overlap fraction = 0,125, word threshold (T) = 11 und scoring matrix = BLOSUM62. Wird WU-BLAST-2 verwendet, so wird ein % Nucleinsäure-Sequenzidentitätswert durch Teilen (a) der Anzahl an übereinstimmenden identischen Nucleotiden zwischen der Nucleinsäuresequenz des PRO-Polypeptid-kodierenden Nucleinsäuremoleküls von Interesse mit einer Sequenz, die aus der Nativsequenz-PRO-Polypeptid-kodierenden Nucleinsäure abgeleitet ist, und dem Vergleichs-Nucleinsäuremolekül von Interesse (d.h. die Sequenz, mit der das PRO-Polypeptid-kodierende Nucleinsäuremolekül von Interesse verglichen wird, die eine PRO-Polynucleotidvariante sein kann) wie durch WU-BLAST-2 bestimmt durch (b) die Gesamtzahl an Nucleotiden des PRO-Polypeptid-kodierenden Nucleinsäuremoleküls von Interesse bestimmt. Beispielsweise ist in der Feststellung "ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das eine Nucleinsäuresequenz A umfasst, die zumindest 80 % Nucleinsäuresequenzidentität mit der Nucleinsäuresequenz B aufweist" die Nucleinsäuresequenz A das Vergleichs-Nucleinsäuremolekül von Interesse, und die Nucleinsäuresequenz B ist die Nucleinsäuresequenz des PRO-Polypeptid-kodierenden Nucleinsäuremoleküls von Interesse.
Prozent Nucleinsäuresequenzidentität kann auch unter Verwendung des Sequenzvergleichprogramms NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402 (1997)) bestimmt werden. Das NCBI-BLAST2-Sequenzvergleichprogramm kann von der Adresse http://www.ncbi.nlm.nih.gov heruntergeladen werden. NCBI-BLAST2 verwendet mehrere Suchparameter, worin alle diese Suchparameter auf Standardwerte eingestellt sind, einschließlich beispielsweise unmask = yes, strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity length = 15/5, multi-pass evalue = 0,01, constant for multi-pass = 25, dropoff for final gapped alignment = 25 und scoring matrix = BLOSUM62.
In Situationen, in denen NCBI-BLAST2 für Sequenzvergleiche verwendet wird, wird die % Nucleinsäuresequenzidentität einer bestimmten Nucleinsäuresequenz C zu, mit oder gegen eine bestimmte Nucleinsäuresequenz D (was alternativ auch als eine bestimmte Nucleinsäuresequenz C beschrieben werden kann, die eine bestimmte % Nucleinsäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine bestimmte Nucleinsäuresequenz D hat oder umfasst) wie folgt berechnet:
100 mal den Bruch W/Z
worin W für die Anzahl an Nucleotiden steht, die als identische Übereinstimmungen durch das Sequenzabgleichprogramm NCBI-BLAST2 in der Programmabgleichung von C und D verzeichnet wurden, und worin Z für die Gesamtzahl an Nucleotiden in D steht. Es wird verstanden werden, dass, sofern die Länge von Nucleinsäuresequenz C nicht gleich der Länge von Nucleinsäuresequenz D ist, die % Nucleinsäuresequenzidentität von C zu D nicht der % Nucleinsäuresequenzidentität von D zu C entspricht.
In anderen Ausführungsformen sind PRO-Polynucleotidvarianten Nucleinsäuremoleküle, die für ein aktives PRO-Polypeptid kodieren und die in der Lage sind, sich, vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen, an Nucleotidsequenzen zu hybridisieren, die für ein Volllängen-PRO-Polypeptid wie hierin offenbart kodieren. PRO-Polypeptidvarianten können jene sein, für die eine PRO-Polynucleotidvariante kodiert.
Die Bezeichnung "Positive" im Zusammenhang mit Sequenzvergleich, der wie zuvor beschrieben durchgeführt wird, schließt Reste in den verglichenen Sequenzen ein, die nicht identisch sind, jedoch ähnliche Eigenschaften aufweisen (z.B. als eine Folge von konservativen Substitutionen, siehe nachstehende Tabelle 6). Für die Zwecke hierin wird der %-Wert von Positiven durch Teilen (a) der Anzahl an Aminosäureresten, die einen positiven Wert zwischen der PRO-Polypeptid-Aminosäuresequenz von Interesse mit einer Sequenz, die aus der nativen PRO-Polypeptidsequenz abgeleitet ist, und der Vergleichs-Aminosäuresequenz von Interesse (d.h. der Aminosäuresequenz, mit der die PRO-Polypeptidsequenz verglichen wird) wie in der BLOSUM26- Matrix von WU-BLAST-2 bestimmt verzeichnen, durch (b) die Gesamtzahl an Aminosäureresten des PRO-Polypeptids von Interesse bestimmt.
Außer spezifisch anders festgehalten, wird der %-Wert von Positiven wie im unmittelbar vorangehenden Absatz beschrieben berechnet. Im Zusammenhang mit Aminosäuresequenzidentität binden jedoch Vergleiche, die wie oben für ALIGN-2 und NCBI-BLAST2 beschrieben durchgeführt wurden, nicht nur Aminosäurereste in den verglichenen Sequenzen ein, die identisch sind, sondern auch jene, die ähnliche Eigenschaften aufweisen. Aminosäurereste, die einen positiven Wert zu einem Aminosäurerest von Interesse verzeichnen, sind jene, die entweder mit dem Aminosäurerest von Interesse identisch sind oder eine bevorzugte Substitution (wie nachstehend in Tabelle 6 definiert) des Aminosäurerests von Interesse sind.
Für Aminosäuresequenzvergleiche unter Verwendung von ALIGN-2 oder NCBI-BLAST2 wird der %-Wert von Positiven einer bestimmten Aminosäuresequenz A zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B (was alternativ auch als eine bestimmte Aminosäuresequenz A beschrieben werden kann, die einen bestimmten % Positive zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B hat oder umfasst) wie folgt berechnet:
100 mal den Bruch X/Y
worin X für die Anzahl an Aminosäureresten steht, die einen positiven Wert wie zuvor definiert durch das Sequenzabgleichprogramm ALIGN-2 oder NCBI-BLAST2 in der Programmabgleichung von A und B verzeichnen, und worin Y für die Gesamtzahl an Aminosäureresten in B steht. Es wird verstanden werden, dass, sofern die Länge von Aminosäuresequenz A nicht der Länge von Aminosäuresequenz B entspricht, die % Positive von A zu B nicht gleich den % Positiven von B zu A sind.
"Isoliert", sofern verwendet, um die verschiedenen, hierin offenbarten Polypeptide zu beschreiben, bezeichnet ein Polypeptid, das identifiziert und getrennt und/oder aus einer Komponente aus seiner natürlichen Umgebung gewonnen wurde. Verunreini gende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die typischerweise diagnostische oder therapeutische Verwendungen für das Polypeptid stören würden und können Enzyme, Hormone und andere proteinhältige oder nicht-proteinhältige Gelöststoffe einbinden. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Polypeptid (1) bis zu einem ausreichenden Grad gereinigt, um zumindest 15 Reste von N-terminaler oder innerer Aminosäuresequenz durch Verwendung eines Zentrifugenröhrchensequenzierers zu erhalten, oder (2) durch SDS-PAGE unter nichtreduzierenden oder reduzierenden Bedingungen mittels Coomassie-Blau- oder, vorzugsweise Silberfärbung bis zur Homogenität gereinigt. Isoliertes Polypeptid schließt Polypeptid in situ innerhalb rekombinanter Zellen ein, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des PRO-Polypeptids nicht vorhanden ist. Üblicherweise wird isoliertes Polypeptid durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
Eine für "isoliertes" PRO-Polypeptid kodierende Nucleinsäure oder eine für ein anderes Polypeptid kodierende Nucleinsäure ist ein Nucleinsäuremolekül, das aus zumindest einem verunreinigenden Nucleinsäuremolekül identifiziert und getrennt wird, mit dem es normalerweise in der natürlichen Quelle der für das Polypeptid kodierenden Nucleinsäure assoziiert ist. Ein für isoliertes Polypeptid kodierendes Nucleinsäuremolekül liegt in einer anderen Form oder Beschaffenheit vor als es in der Natur zu finden ist. Für isoliertes Polypeptid kodierende Nucleinsäuremoleküle werden daher von dem für spezifisches Polypeptid kodierendes Nucleinsäuremolekül, wie es in natürlichen Zellen existiert, unterschieden. Ein für isoliertes Polypeptid kodierendes Nucleinsäuremolekül schließt jedoch für Polypeptid kodierende Nucleinsäuremoleküle ein, die in Zellen enthalten sind, welche üblicherweise das Polypeptid exprimieren, wobei sich beispielsweise das Nucleinsäuremolekül an einer anderen chromosomalen Stelle befindet als in natürlichen Zellen.
Die Bezeichnung "Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die zur Expression einer operabel gebundenen Kodiersequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die Kontrollsequenzen, die beispielsweise für Prokaryoten geeignet sind, schließen einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, und eine Ribosombindungsstelle ein. Eukaryotische Zellen sind bekannt dafür, Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer zu verwenden.
Nucleinsäure ist "operabel gebunden" wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gebracht wird. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als ein Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt; ein Promotor oder ein Enhancer ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosombindungsstelle ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass sie Translation unterstützt. Im Allgemeinen bedeutet "operabel gebunden", dass die DNA-Sequenzen, die verbunden sind, zusammenhängend sind und, im Fall eines Sekretionsleaders, zusammenhängend und in Lesephase sind. Enhancer müssen jedoch nicht zusammenhängend sein. Bindung erfolgt durch Ligation an passenden Restriktionsstellen. Bestehen solche Stellen nicht, so werden die synthetischen Oligonucleotidadaptoren oder Linker gemäß herkömmlichen Praktiken verwendet.
Die Bezeichnung "Antikörper" wird im weitesten Sinn verwendet und deckt insbesondere beispielsweise einzelne monoklonale Anti-PRO-Antikörper (einschließlich Agonisten, Antagonisten und neutralisierender Antikörper), Anti-PRO-Antikörperzusammensetzungen mit polyepitopischer Spezifität, einkettige Anti-PRO-Antikörper und Fragmente von Anti-PRO-Antikörpern ab (siehe unten). Die Bezeichnung "monoklonaler Antikörper" wie hierin verwendet bezieht sich auf einen Antikörper, der aus einer Population von im wesentlichen homogenen Antikörpern gewonnen wurde, d.h. dass die einzelnen Antikörper, aus denen die Population besteht, identisch sind, unter Ausnahme möglicher, natürlich vorkommender Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können.
"Stringenz" von Hybridisierungsreaktionen können Fachleute leicht bestimmen und beruht im Allgemeinen auf einer empirischen Berechnung, die von Sondenlänge, Waschtemperatur und Salzkonzentration abhängt. Im Allgemeinen erfordern längere Sonden höhere Temperaturen für korrektes Anellieren, während kürzere Sonden niedrigere Temperaturen erfordern. Hybridisierung im Allgemeinen hängt von der Fähigkeit denaturierter DNA ab, neuerlich zu anellieren, wenn komplementäre Stränge in einer Umgebung unter ihrer Schmelztemperatur vorhanden sind. Je höher der Grad an erwünschter Homogenität zwischen der Sonde und der hybridisierbaren Sequenz ist, desto höher ist auch die relative Temperatur, die verwendet werden kann. Als Resultat folgt, dass höhere relative Temperaturen dazu neigen würden, die Reaktionsbedingungen stringenter zu gestalten, während niedrigere Temperaturen dies weniger verlangen würden. Für zusätzliche Details und Erklärungen zur Stringenz von Hybridisierungsreaktionen siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995).
"Stringente Bedingungen" oder "Bedingungen hoher Stringenz" wie hierin definiert können als jene Bedingungen identifiziert werden, die: (1) geringe Ionenstärke und hohe Temperaturen für das Waschen verwenden, beispielsweise 0,015 M Natriumchlorid/0,0015 M Natriumcitrat/0,1 % Natriumdodecylsulfat bei 50 °C; (2) während der Hybridisierung ein denaturierendes Mittel verwenden, wie beispielsweise Formamid, z. B. 50 Vol.-% Formamid mit 0,1 % Rinderserumalbumin/0,1 % Ficoll/0,1 % Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bei 42 °C; oder (3) 50 % Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1 % Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardts Lösung, beschallte Lachssperma-DNA (50 μg/ml), 0,1 SDS und 10 % Dextransulfat bei 42 °C, mit Waschschritten bei 42 °C in 0,2 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat) und 50 % Formamid bei 55 °C, gefolgt von einem Waschschritt bei hoher Stringenz bestehend aus 0,1 × SSC, das EDTA enthält, bei 55 °C, verwenden.
"Moderat stringente Bedingungen" können wie von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press (1989), beschrieben definiert werden und schließen die Verwendung von Waschlösung und Hybridisierungsbedingungen (z.B. Temperatur, Ionenstärke und % SDS) ein, die weniger stringent sind als jene, die zuvor beschrieben wurden. Ein Beispiel für moderat stringente Bedingungen ist Übernacht-Inkubation bei 37 °C in einer Lösung, umfassend: 20 % Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardts Lösung, 10 % Dextransulfat und 20 mg/ml denaturierte gescherte Lachssperma-DNA; gefolgt von Waschen der Filter in 1 × SSC bei etwa 37-50 °C. Fachleute werden erkennen, wie Temperatur, Ionenstärke usw. nach Erfordernis einzustellen sind, um Faktoren wie Sondenlänge und dergleichen anzupassen.
Die Bezeichnung "epitopmarkiert", wenn hierin verwendet, bezieht sich auf ein Hybridpolypeptid, das ein an ein "Markierungs-Polypeptid" fusioniertes PRO-Polypeptid umfasst. Das Markierungs-Polypeptid weist genug Reste auf, um ein Epitop bereitzustellen, gegen das ein Antikörper hergestellt werden kann, ist jedoch auch ausreichend kurz, dass es die Aktivität des Polypeptids, an das es fusioniert ist, nicht stört. Das Markierungs-Polypeptid ist vorzugsweise auch eher einmalig, sodass der Antikörper mit anderen Epitopen im Wesentlichen nicht kreuzreagiert. Geeignete Markierungs-Polypeptide haben im Allgemeinen zumindest sechs Aminosäurenreste und üblicherweise zwischen etwa 8 und 50 Aminosäurereste (vorzugsweise zwischen etwa 10 und 20 Aminosäurereste).
Wie hierin verwendet bezieht sich die Bezeichnung "Immunoadhäsin" auf antikörperähnliche Moleküle, die die Bindungsspezifität eines heterologen Proteins (eines "Adhäsins") mit den Effektorfunktionen von konstanten Immunglobulindomänen kombinieren. Strukturell gesehen umfassen die Immunoadhäsine eine Fusion zwischen einer Aminosäuresequenz mit der erwünschten Bindungsspezifität, die sich von der Antigenerkennungs- und -bindungsstelle eines Antikörpers unterscheidet (d.h. "heterolog" ist), und einer Immunglobulin-Konstantdomänensequenz. Der Adhäsinteil eines Immunoadhäsinmoleküls ist typischerweise eine zusammenhängende Aminosäuresequenz, die zumindest die Bindungsstelle eines Rezeptors oder eines Liganden umfasst. Die Immunglobulin-Konstantdomänensequenz im Immunoadhäsin kann aus einem Immunglobulin wie z.B. IgG-1-, IgG-2-, IgG-3- oder IgG-4-Subtypen, IgA (einschließlich IgA-1 und IgA-2), IgE, IgD oder IgM erhalten werden.
"Aktiv" oder "Aktivität" für die Zwecke hierin bezieht sich auf Form(en) eines PRO-Polypeptids, das eine biologische und/oder eine immunologische Aktivität von nativem oder natürlich auftretendem PRO in sich trägt, worin sich "biologische" Aktivität auf eine biologische Funktion (entweder inhibitorisch oder stimulatorisch) bezieht, die durch ein natives oder natürlich vorkommendes PRO verursacht wird und nicht die Fähigkeit ist, die Produktion eines Antikörpers gegen ein antigenes Epitop zu induzieren, das von einem nativen oder natürlich vorkommenden PRO aufgewiesen wird, und eine "immunologische" Aktivität bezieht sich auf die Fähigkeit, die Produktion eines Antikörpers gegen ein antigenes Epitop zu induzieren, das von einem nativen oder natürlich vorkommenden PRO aufgewiesen wird.
Die Bezeichnung "Antagonist" wird im weitesten Sinne verwendet und schließt jedes beliebige Molekül ein, das eine biologische Aktivität eines nativen, hierin offenbarten PRO-Polypeptids teilweise oder gänzlich blockiert, hemmt oder neutralisiert. Auf ähnliche Weise wird die Bezeichnung "Agonist" im weitesten Sinn verwendet und schließt jedes beliebige Molekül ein, das eine biologische Aktivität eines hierin offenbarten, nativen PRO-Polypeptids nachahmt. Geeignete Agonisten- oder Antagonistenmoleküle umfassen insbesondere Agonisten- oder Antagonistenantikörper oder Antikörperfragmente, Fragmente oder Aminosäuresequenzvarianten von nativen PRO-Polypeptiden, Peptiden, Antisense-Oligonucleotiden, kleinen organischen Molekülen usw. Verfahren zur Identifikation von Agonisten oder Antagonisten eines PRO-Polypeptids können das Kontaktieren eines PRO-Polypeptids mit einem Kandidatenagonisten- oder -antagonistenmolekül und das Messen einer nachweisbaren Veränderung einer oder mehrerer biologischer Aktivitäten, die normalerweise mit dem PRO-Polypeptid assoziiert werden, umfassen.
"Behandlung" bezieht sich sowohl auf therapeutische Behandlung als auch auf prophylaktische oder präventive Maßnahmen, worin das Ziel die Prävention oder Verlangsamung (Abschwächung) des betreffenden pathologischen Leidens oder der Störung ist. Jene, die solch einer Behandlung bedürfen, schließen jene ein, die bereits erkrankt sind, als auch jene, die eine Neigung zeigen, diese Erkrankung zu erleiden, oder jene, in denen es die Erkrankung zu unterbinden gilt.
"Chronische" Verabreichung bezieht sich im Gegensatz zu einem akuten Modus auf die Verabreichung des Mittels/der Mittel auf kontinuierliche Weise, um die anfängliche therapeutische Wirkung (Aktivität) über eine längere Zeitspanne aufrechtzuerhalten. "Diskontinuierliche" Verabreichung ist eine Behandlung, die nicht in Serie ohne Unterbrechung erfolgt, sondern eher auf zyklische Weise durchgeführt wird.
"Säugetier" für die Zwecke der Behandlung bezieht sich auf jedes beliebige Tier, das als Säugetier klassifiziert ist, einschließlich Mensch, Haus- und Nutztiere, Zoo-, Sport- und Haustiere, wie beispielsweise Hunde, Katzen, Rinder, Pferde, Schafe, Schweine, Ziegen, Kaninchen usw. Vorzugsweise ist das Säugetier ein Mensch.
Verabreichung "in Kombination mit" einem oder mehreren therapeutischen Mitteln schließt simultane (gleichzeitige) und aufeinander folgende Verabreichung in jeder beliebigen Reihenfolge ein.
"Träger" wie hierin verwendet schließen pharmazeutisch annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren ein, die gegenüber der Zelle oder dem Säugetier, die/das ihnen ausgesetzt wird, bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nichttoxisch sind. Häufig ist der physiologisch annehmbare Träger eine wässrige, pH-gepufferte Lösung. Beispiele für physiologisch annehmbare Träger umfassen Puffer wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidanzien einschließlich Ascorbinsäure; niedermolekulares Polypeptid (mit weniger als etwa 10 Resten); Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie z.B. EDTA; Zuckeralkohole wie z.B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen wie z.B. Natrium; und/oder nichtionische Tenside wie z.B. TWEEN^TM, Polyethylenglykol (PEG) und PLURONICS^TM.
"Antikörperfragmente" umfassen einen Abschnitt eines intakten Antikörpers, vorzugsweise die Antigenbindungs- oder variable Region des intakten Antikörpers. Beispiele für Antikörperfragmente umfassen Fab-, Fab'-, F(ab')₂- und Fv-Fragmente; Diabodies; lineare Antikörper (Zapata et al., Protein Eng. 8(10), 1057-1062 (1995)); einkettige Antikörpermoleküle; und multispezifische Antikörper, gebildet aus Antikörperfragmenten.
Papainverdau von Antikörpern produziert zwei identische Antigenbindungsfragmente, genannt "Fab"-Fragmente, jeweils mit einer einzelnen Antigen-Bindungsstelle und einem verbleibenden "Fc"-Fragment, eine Bezeichnung, die die Fähigkeit widerspiegelt, leicht zu kristallisieren. Pepsinbehandlung ergibt ein F(ab')₂-Fragment, das zwei Antigen-kombinierende Stellen aufweist und dennoch zur Vernetzung von Antigen in der Lage ist.
"Fv" ist das minimale Antikörperfragment, das eine vollständige Antigenerkennungs- und -bindungsstelle aufweist. Diese Region besteht aus einem Dimer einer variablen Schwer- und einer variablen Leichtkettendomäne in enger, nicht-kovalenter Assoziation. In dieser Konfiguration erfolgt eine Wechselwirkung zwischen den drei CDRs jeder variablen Domäne zur Definition einer Antigen-Bindungsstelle an der Oberfläche des V_H-V_L-Dimers. Gemeinsam verleihen die sechs CDRs dem Antikörper Antigen-Bindungsspezifität. Jedoch weist sogar eine einzelne variable Domäne (oder die Hälfte eines Fv, das nur drei CDRs umfasst, die für ein Antigen spezifisch sind) die Fähigkeit auf, Antigen zu erkennen und zu binden, dies jedoch bei einer geringeren Affinität als die gesamte Bindungsstelle.
Das Fab-Fragment enthält auch die konstante Domäne der leichten Kette und die erste konstante Domäne (CH1) der schweren Kette. Fab-Fragmente unterscheiden sich von Fab'-Fragmenten durch die Addition einiger weniger Reste am Carboxy-Terminus der Schwerketten-CH1-Domäne, einschließlich eines oder mehrerer Cysteine aus der Antikörper-Gelenksregion. Fab'-SH ist hierin die Bezeichnung für Fab', in dem der/die Cysteinrest(e) der konstanten Domänen eine freie Thiolgruppe aufweist/aufweisen. F(ab')₂-Antikörperfragmente wurden ursprünglich als Paare von Fab'-Fragmenten produziert, die Gelenks-Cysteine zwischen sich aufwiesen. Auch andere chemische Bindungen sind für Antikörperfragmente bekannt.
Die "leichten Ketten" von Antikörpern (Immunglobulinen) aus jeder beliebigen Wirbeltierspezies können einem oder zwei eindeutig unterscheidbaren Typen, genannt kappa und lambda, basierend auf den Aminosäuresequenzen ihrer konstanten Domänen zugeordnet werden.
Je nach Aminosäuresequenz der konstanten Domäne ihrer schweren Ketten können Immunglobuline verschiedenen Klassen zugeordnet werden. Es gibt fünf Hauptklassen von Immunglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, und mehrere von diesen können weiters in Unterklassen (Isotypen) unterteilt werden, z.B.: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA und IgA2.
"Einkettige Fv"- oder "sFv"-Antikörperfragmente umfassen die V_H- und V_L-Domänen des Antikörpers, worin diese Domänen in einer einzigen Polypeptidkette vorhanden sind. Vorzugsweise umfasst das Fv-Polypeptid weiters einen Polypeptidlinker zwischen den V_H- und V_L-Domänen, was dem sFv die Möglichkeit gibt, die erwünschte Struktur für Antigenbindung zu bilden. Einen Überblick zum Thema sFv liefert Pluckthun in The Parmacology of Monoclonal Antibodies, Bd. 113, Rosenburg & Moore (Hrsg.), Springer-Verlag, New York, 269-315 (1994).
Die Bezeichnung "Diabodies" bezieht sich auf kleine Antikörperfragmente mit zwei Antigen-Bindungsstellen, worin die Fragmente eine variable Schwerkettendomäne (V_H) verbunden mit einer variablen Leichtkettendomäne (V_L) in derselben Polypeptidkette (V_H-V_L) umfassen. Unter Verwendung eines Linkers, der zu kurz ist, um Paarung zwischen den zwei Domänen an derselben Kette zu ermöglichen, werden die Domänen gezwungen, mit den komplementären Domänen einer anderen Kette Paare zu bilden und zwei Antigen-Bindungsstellen zu schaffen. Diabodies werden ausführlicher beispielsweise in der EP 404.097 ; der WO 93/11161; und in Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448 (1993), beschrieben.
Ein "isolierter" Antikörper ist einer, der aus einer Komponente seiner natürlichen Umgebung identifiziert und getrennt und/oder gewonnen wurde. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die diagnostische oder the rapeutische Verwendungen für den Antikörper stören würden und können Enzyme, Hormone und andere proteinhältige oder nicht-proteinhältige Gelöststoffe einbinden. In bevorzugten Ausführungsformen wird der Antikörper (1) zu einer Reinheit von über 95 Gew.-% des Antikörpers, bestimmt durch das Lowry-Verfahren, und am meisten bevorzugt zu einer Reinheit von über 99 Gew.-%, (2) zu einem ausreichenden Grad, um zumindest 15 Reste von N-terminaler oder innerer Aminosäuresequenz mittels eines Zentrifugenröhrchensequenzierers zu erhalten, oder (3) bis zur Homogenität mittels SDS-PAGE unter reduzierenden oder nichtreduzierenden Bedingungen mittels Coomassie-Blau- oder, vorzugsweise, Silberfärbung gereinigt. Isolierter Antikörper schließt den Antikörper in situ innerhalb rekombinanter Zellen ein, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des Antikörpers nicht vorhanden ist. Üblicherweise wird ein isolierter Antikörper jedoch durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
Das Wort "Markierung", sofern hierin verwendet, bezieht sich auf eine nachweisbare Verbindung oder Zusammensetzung, die direkt oder indirekt an den Antikörper konjugiert ist, um einen "markierten" Antikörper zu bilden. Die Markierung kann durch sich selbst nachweisbar sein (z.B. Radioisotopmarkierungen oder fluoreszierende Markierungen) oder kann, im Fall einer enzymatischen Markierung, chemische Änderung einer Substratverbindung oder -zusammensetzung katalysieren, die wiederum nachweisbar ist.
Unter "Festphase" wird eine nichtwässrige Matrix verstanden, an die der Antikörper der vorliegenden Erfindung anhaften kann. Beispiele für Festphasen, die hierzu gehören, schließen jene ein, die teilweise oder vollständig aus Glas (z.B. Controlled Pore Glass), Polysacchariden (z.B. Agarose), Polyacrylamiden, Polystyrol, Polyvinylalkohol und Silikonen gebildet sind. In bestimmten Ausführungsformen, je nach Kontext, kann die Festphase den Well einer Testplatte umfassen, in anderen ist sie eine Reinigungssäule (z.B. eine Affinitätschromatographiesäule). Diese Bezeichnung umfasst auch eine diskontinuierliche Festphase aus einzelnen Teilchen, wie z.B. jene, die um US-Patent Nr. 4.275.149 beschrieben werden.
Ein "Liposom" ist ein kleines Vesikel, das sich aus verschiedenen Typen an Lipiden, Phospholipiden und/oder Tensid zusammensetzt und zur Zufuhr eines Wirkstoffs (wie z.B. eines PRO-Polypeptids oder Antikörpers dazu) zu einem Säugetier nützlich ist. Die Komponenten des Liposoms sind üblicherweise in einer zweischichtigen Formation angeordnet, ähnlich der Lipidanordnung biologischer Membranen.
Ein "kleines Molekül" ist hierin als ein Molekül definiert, das ein Molekulargewicht von unter etwa 500 Da aufweist. Tabelle 1
Tabelle 1 (Fortsetzung)
Tabelle 1 (Fortsetzung)
Tabelle 1 (Fortsetzung)
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Tabelle 1 (Fortsetzung)
Tabelle 1 (Fortsetzung)
Tabelle 1 (Fortsetzung)
Tabelle 1 (Fortsetzung)
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Tabelle 1 (Fortsetzung)
Tabelle 1 (Fortsetzung)
Tabelle 1 (Fortsetzung)
Tabelle 1 (Fortsetzung)
Tabelle 1 (Fortsetzung)
Tabelle 1 (Fortsetzung)
Tabelle 2
% Aminosäuresequenzidentität = (die Anzahl identisch übereinstimmender Aminosäurereste zwischen den zwei Polypeptidsequenzen wie durch ALIGN-2 bestimmt) dividiert durch (die Gesamtzahl an Aminosäureresten des PRO-Polypeptids) = 5 dividiert durch 15 = 33,3 Tabelle 3
% Aminosäuresequenzidentität = (die Anzahl identisch übereinstimmender Aminosäurereste zwischen den zwei Polypeptidsequenzen wie durch ALIGN-2 bestimmt) dividiert durch (die Gesamtzahl an Aminosäureresten des PRO-Polypeptids) = 5 dividiert durch 10 = 50 % Tabelle 4
Nucleinsäuresequenzidentität = (die Anzahl identisch übereinstimmender Nucleotide zwischen den zwei Nucleinsäuresequenzen wie durch ALIGN-2 bestimmt) dividiert durch (die Gesamtzahl an Nucleotiden der PRO-DNA-Nucleinsäuresequenz) = 6 dividiert durch 14 = 42,9 % Tabelle 5
% Nucleinsäuresequenzidentität = (die Anzahl identisch übereinstimmender Nucleotide zwischen den zwei Nucleinsäuresequenzen wie durch ALIGN-2 bestimmt) dividiert durch (die Gesamtzahl an Nucleotiden der PRO-DNA-Nucleinsäuresequenz) = 4 dividiert durch 12 = 33,3 %
II. Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung
A. Volllängen-PRO-Polypeptide
Die vorliegende Erfindung stellt neu identifizierte und isolierte Nucleotidsequenzen bereit, die für Polypeptide kodieren, die in der vorliegenden Anmeldung als PRO-Polypeptid bezeichnet werden. Insbesondere wurden cDNAs, die für verschiedene PRO-Polypeptide kodieren, identifiziert und isoliert, wie näher in den nachstehenden Beispiele offenbart wird. Es gilt anzumerken, dass Proteine, die in getrennten Expressionsdurchgängen produziert wurden, unterschiedliche PRO-Nummern verliehen bekommen können, dass jedoch die UNQ-Nummer für jede bestimmte DNA und das kodierte Protein einmalig ist und nicht geändert wird. Zur einfachen und verständlichen Darstellung werden in der vorliegenden Beschreibung das Protein, für das die hierin offenbarten nativen Volllängen-Nucleinsäuremoleküle kodieren, sowie weitere native Homologe und Varianten, die in der obigen Definition von PRO eingebunden sind, als "PRO/Nummer" bezeichnet, und zwar unabhängig von ihrem Ursprung oder der Art der Herstellung.
Wie in den Beispielen nachstehend offenbart, wurden verschiedene cDNA-Klone bei der ATCC hinterlegt. Die tatsächlichen Nucleotidsequenzen dieser Klone können von Fachleuten durch Sequenzieren des hinterlegten Klons mittels Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung Standard sind, leicht bestimmt werden. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz kann aus der Nucleotidsequenz mittels Standardverfahren bestimmt werden. Für die hierin beschriebenen PRO-Polypeptide und die kodierenden Nucleinsäuren konnten die Anmelder das identifizieren, was als der Leseraster angenommen wird, wie er am besten mit der zu dem Zeitpunkt zur Verfügung stehenden Sequenzinformation identifizierbar war.
Volllängen-PRO539-Polypeptide
Unter Verwendung des WU-BLAST2-Sequenzabgleich-Computerprogramms wurde erkannt, dass ein Teil des Nativsequenz-PRO539 voller Länge (gezeigt in 2 und Seq.-ID Nr. 2) eine gewisse Aminosäuresequenzidentität mit einem Teil eines Kinesin-verwandten Proteins aus Drosophila melanogaster (AF019250_1) aufweist. Folglich wird zur Zeit angenommen, dass das in der vorliegenden Anmeldung offenbarte PRO539 ein neu identifiziertes Mitglied der Hedgehog-Signalstoffstoffwechselweg-Proteinfamilie ist und Aktivität besitzt, die für das Drosophila-Costal-2-Protein typisch ist.
B. PRO-Polypeptidvarianten
Zusätzlich zu den hierin beschriebenen Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptiden wird erwogen, dass PRO-Varianten hergestellt werden können. PRO-Varianten können durch Einführen geeigneter Nucleotidänderungen in die PRO-DNA und/oder durch Synthese des erwünschten PRO-Polypeptids hergestellt werden. Fachleuten wird bekannt sein, dass Aminosäurenänderungen posttranslationale Prozesse des PRO verändern können, beispielsweise Änderung der Anzahl oder Position von Glykosylierungsstellen oder Ändern der Membranverankerungs-Eigenschaften.
Variationen im nativen Volllängensequenz-PRO oder in verschiedenen Domänen des hierin beschriebenen PRO können gemacht werden, beispielsweise unter Verwendung aller Verfahren und Richtlinien für konservative und nicht-konservative Mutationen, die beispielsweise im US-Patent Nr. 5.364.934 beschrieben werden. Variationen können eine Substitution, Deletion oder Insertion von einem oder mehrerer Codons sein, die für das PRO kodieren, die im Vergleich mit dem Nativsequenz-PRO zu einer Änderung der Aminosäuresequenz des PRO führen. Gegebenenfalls erfolgt diese Variation durch Substitution von zumindest einer Aminosäure mit jeder anderen Aminosäure in einer oder mehreren Domänen des PRO. Hilfestellung bei der Bestimmung, welcher Aminosäurerest insertiert, substituiert oder deletiert werden kann, ohne die erwünschte Aktivität negativ zu beeinflussen, kann durch Vergleichen der Sequenz des PRO mit jener von homologen bekannten Proteinmolekülen und durch Minimieren der Anzahl an Aminosäuresequenzänderungen in Regionen hoher Homologie gefunden werden. Aminosäuresubstitutionen können durch Ersetzen einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften, beispielsweise durch Ersetzen eines Leucins mit einem Serin, d.h. durch konservative Aminosäureersetzungen, entstehen. Insertionen oder Deletionen können gegebenenfalls im Bereich von etwa 1 bis 5 Aminosäuren liegen. Die zugelassene Variation kann durch systematisches Durchführen von Insertionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren in die Sequenz und Testen der resultierenden Varianten auf Aktivität, die die Volllängen- oder reife native Sequenz zeigt, bestimmt werden.
PRO-Polypeptidfragmente werden hierin bereitgestellt. Solche Fragmente können am N-Terminus oder C-Terminus trunkiert sein, oder ihnen können, beispielsweise im Vergleich zu einem Volllängennativprotein, innen gelegene Reste fehlen. Bestimmten Fragmenten fehlen Aminosäurereste, die für eine erwünschte biologische Aktivität des PRO-Polypeptids nicht essenziell sind.
PRO-Fragmente können durch jede beliebige Anzahl an herkömmlichen Verfahren hergestellt werden. Erwünschte Peptidfragmente können chemisch synthetisiert werden. Ein alternativer Ansatz umfasst die Bildung von PRO-Fragmenten durch enzymatischen Verdau, z.B. durch Behandlung des Proteins mit einem Enzym, das bekannt dafür ist, Proteine an Stellen zu spalten, die durch bestimmte Aminosäurereste definiert sind, oder durch Verdau der DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen und Isolieren des erwünschten Fragments. Wiederum ein anderes, nützliches Verfahren umfasst das Isolieren und Amplifizieren eines DNA-Fragments, das für ein erwünschtes Polypeptidfragment kodiert, durch Polymerasekettenreaktion (PCR). Oligonucleotide, die die erwünschten Termini des DNA-Fragments definieren, werden an den 5'- und 3'-Primern in der PCR verwendet. Vorzugsweise teilen PRO-Polypeptidfragmente zumindest eine biologische und/oder immunologische Aktivität mit dem hierin offenbarten PRO-Polypeptid.
In besonderen Ausführungsformen sind konservative Substitutionen in Tabelle 6 unter der Überschrift "Bevorzugte Substitutionen" gezeigt. Resultieren solche Substitutionen in einer Veränderung der biologischen Aktivität, so werden mehr substanzielle Veränderungen, die in Tabelle 6 als "Beispielhafte Substitutionen" bezeichnet sind oder wie nachstehend unter Verweis auf Aminosäureklassen noch näher beschrieben wird, eingeführt und die Produkte gescreent.
Tabelle 6
Wesentliche Modifikationen in Funktion oder immunologischer Identität des PRO-Polypeptids erfolgen durch Selektieren von Substitutionen, die sich in ihrer Wirkung auf die Aufrechterhaltung (a) der Struktur der Polypeptidhauptkette im Bereich der Substitution, beispielsweise in Form einer Faltblatt- oder Helixkonformation, (b) der Ladung oder Hydrophobizität des Moleküls an der Target-Stelle oder (c) des Volumens der Seitenkette signifikant unterscheiden. Natürlich vorkommende Reste werden auf Grundlage gemeinsamer Seitenketteneigenschaften in die folgenden Gruppen aufgeteilt:

(1) hydrophob: Norleucin, met, ala, val, leu, ile;
(2) neutral hydrophil: cys, ser, thr;
(3) sauer: asp, glu;
(4) basisch: asn, gln, his, lys, arg;
(5) Reste, die Kettenausrichtung beeinflussen: gly, pro; und
(6) aromatisch: trp, tyr, phe.

Nicht-konservative Substitutionen erfordern den Austausch eine Mitglieds einer dieser Klassen gegen eine andere Klasse. Solche substituierten Reste können auch in die konservativen Substitutionsstellen oder, noch bevorzugter, in die verbleibenden (nicht-konservierten) Stellen eingeführt werden.
Die Variationen können unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren, wie beispielsweise Oligonucleotid-vermittelte (ortsgerichtete) Mutagenese, Alaninscanning und PCR-Mutagenese, gebildet werden. Ortsgerichtete Mutagenese [Carter et al., Nucl. Acids Res. 13, 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10, 6487 (1987)], Kassettenmutagenese [Wells et al., Gene 34, 315 (1985)], Restriktionsselektionsmutagenese [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317, 415 (1986)] oder andere bekannte Verfahren können an der klonierten DNA durchgeführt werden, um die PRO-DNA-Variante zu bilden.
Scanning-Aminosäureanalyse kann auch verwendet werden, um eine oder mehrere Aminosäuren gemeinsam mit einer zusammenhängenden Sequenz zu identifizieren. Zu den bevorzugten Scanning-Aminosäuren zählen relativ kleine, neutrale Aminosäuren. Solche Aminosäuren schließen Alanin, Glycin, Serin und Cystein ein. Alanin ist typischerweise eine bevorzugte Scanning-Aminosäure in dieser Gruppe, da es die Seitenkette über den beta-Kohlenstoff hinaus eliminiert und weniger wahrscheinlich die Hauptkettenkonformation der Variante verändert [Cunningham & Wells, Science 244, 1081-1085 (1989)]. Typischerweise wird ebenso Alanin bevorzugt, da es die häufigste Aminosäure ist. Weiters wird es häufig sowohl an verborgenen als auch an freiliegenden Positionen gefunden [Creighton, The Proteins (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol. 150, 1 (1976)]. Ergibt Alaninsubstitution keine adäquaten Mengen an Varianten, so kann eine isoterische Aminosäure verwendet werden.
C. Modifikationen von PRO
Kovalente Modifikationen von PRO sind in den Schutzumfang dieser Erfindung eingebunden. Ein Typ von kovalenter Modifikation umfasst das Umsetzen gerichteter Aminosäurereste eines PRO-Polypeptids mit einem organischen derivatisierenden Mittel, das in der Lage ist, mit ausgewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten des PRO zu reagieren. Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist nützlich, beispielsweise zum Vernetzen von PRO mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder -oberfläche zur Verwendung im Verfahren zur Reinigung von Anti-PRO-Antikörpern und umgekehrt. Üblicherweise verwendete Vernetzer umfassen z.B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, einschließlich Disuccinimidylester, wie z.B. 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), bifunktionelle Maleinimide wie z.B. Bis-N-maleinimido-1,8-octan, und Mittel wie z.B. Methyl-3-[p-azidophenyl)dithio]propioimidat.
Andere Modifikationen umfassen Deamidierung von Glutaminyl- und Asparaginylresten zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten, Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxygruppen von Seryl- oder Threonylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 79-86 (1983)], Acetylierung des N-terminalen Amins und Amidierung jeder beliebigen C-terminalen Carboxygruppe.
Eine andere Art kovalenter Modifikation des PRO-Polypeptids, die in den Schutzumfang dieser Erfindung fällt, umfasst das Ändern des nativen Glykosylierungsmusters des Polypeptids. "Ändern des nativen Glykosylierungsmusters" bedeutet für die vorliegenden Zwecke die Deletion von einer oder mehreren Kohlenhydratgruppierungen, die in Nativsequenz-PRO zu finden sind (entweder durch Entfernen der zugrundeliegenden Glykosylierungsstelle oder durch Deletion der Glykosylierung durch chemische und/oder enzymatische Mittel), und/oder das Addieren einer oder mehrerer Glykosylierungsstellen, die im Nativsequenz-PRO nicht zu finden sind. Darüber hinaus bindet diese Bezeichnung auch qualitative Änderungen an der Glykosylierung der nativen Proteine ein, einschließlich einer Änderung der Beschaffenheit und der Anteile der verschiedenen vorhandenen Kohlenhydratgruppierungen.
Das Hinzufügen von Glykosylierungsstellen zum PRO-Polypeptid kann durch Ändern der Aminosäuresequenz erfolgen. Die Änderung kann beispielsweise durch die Addition von oder die Substitution durch einen oder mehrere Serin- oder Threoninreste zum oder am Nativsequenz-PRO (für O-gebundene Glykosylierungsstellen) durchgeführt werden. Die PRO-Aminosäuresequenz kann gegebenenfalls durch Änderungen auf DNA-Niveau geändert werden, insbesondere durch Mutation der DNA, die für das PRO-Polypeptid kodiert, an präselektierten Basen, sodass Codons gebildet werden, die zu den erwünschten Aminosäuren translatieren.
Ein anderes Mittel zur Steigerung der Anzahl an Kohlenhydratgruppierungen am PRO-Polypeptid ist chemisches oder enzymatisches Binden von Glykosiden an das Polypeptid. Solche Verfahren werden auf dem Gebiet der Erfindung, z.B. in der WO 87/05330, veröffentlicht am 11. September 1987, und in Aplin & Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 259-306 (1981), beschrieben.
Das Entfernen von Kohlenhydratgruppierungen, die am PRO-Polypeptid vorhanden sind, kann chemisch oder enzymatisch oder durch Mutationssubstitutionen von Codons, die für Aminosäurereste kodieren, die als Targets für Glykosylierung dienen, durchgeführt werden. Chemische Deglykosylierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden beispielsweise von Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987), und von Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981), beschrieben. Enzymatische Spaltung von Kohlenhydratgruppierungen an Polypepti den kann durch die Verwendung einer Vielzahl an Endo- und Exo-Glykosidasen erreicht werden, wie von Thotakura et al. in: Meth. Enzymol. 138, 350 (1987), beschrieben wird.
Eine andere Art von kovalenter Modifikation von PRO umfasst das Binden des PRO-Polypeptids an eines einer Vielzahl nicht-proteinhältiger Polymere, z.B. Polyethylenglykol (PEG), Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, auf die Art und Weise, die in den US-Patenten Nr. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 oder 4.179.337 beschrieben wird.
Das PRO der vorliegenden Erfindung kann auch auf eine Weise modifiziert werden, dass ein Hybridmolekül gebildet wird, das PRO, fusioniert an ein anderes, heterologes Polypeptid oder eine andere, heterologe Aminosäuresequenz, umfasst.
In einer Ausführungsform umfasst solch ein Hybridmolekül eine Fusion des PRO mit einem Markierungspolypeptid, das ein Epitop bereitstellt, an das sich ein Anti-Markierungs-Antikörper selektiv binden kann. Die Epitopmarkierung wird im Allgemeinen an den Amino- oder Carboxyterminus des PRO platziert. Die Gegenwart solcher Epitop-markierten Formen des PRO kann unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Markierungs-Polypeptid nachgewiesen werden. Die Bereitstellung der Epitopmarkierung ermöglicht es somit auch, dass das PRO leicht mittels Affinitätsreinigung unter Verwendung eines Anti-Markierungs-Antikörpers oder eines anderen Typs von Affinitätsmatrize, die sich an die Epitopmarkierung bindet, gereinigt werden kann. Verschiedene Markierungspolypeptide und ihre jeweiligen Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Beispiele umfassen Poly-Histidin- (poly-his-) oder Poly-Histidin-Glycin- (poly-his-gly-) Markierungen; das flu-HA-Markierungspolypeptid und seinen Antikörper 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159-2165 (1988)]; die c-myc-Markierung und die Antikörper 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 und 9E10 hierzu [Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5, 3610-3616 (1985)]; und die Herpes-Simplex-Virus-Glykoprotein-D- (-gD-) Markierung und ihren Antikörper [Paborsky et al., Protein Engineering 3(6), 547-553 (1990)]. Andere Markierungspolypeptide umfassen das Flag-Peptid [Hopp et al., BioTechnology 6, 1204-1210 (1988)]; das KT3-Epitoppeptid [Martin et al., Science 255, 192-194 (1992)]; ein α-Tubulinepitoppeptid [Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163-15166 (1991)); und die T7-Gen-10-Proteinpeptidmarkierung [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6393-6397 (1990)].
In einer alternativen Ausführungsform kann das Hybridmolekül eine Fusion des PRO mit einem Immunglobulin oder einer bestimmten Region eines Immunglobulins umfassen. Für eine zweiwertige Form des Hybridmoleküls (auch als ein "Immunoadhäsin" bezeichnet) könnte solch eine Fusion zur Fc-Region eines IgG-Moleküls gebildet sein. Die Ig-Fusionen umfassen vorzugsweise die Substitution einer löslichen Form (deletierte oder inaktivierte Transmembrandomäne) eines PRO-Polypeptids anstelle von zumindest einer variablen Region innerhalb eines Ig-Moleküls. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Immunglobulinfusion die Gelenks-, CH2- und CH3- oder die Gelenks-, CH1-, CH2- und CH3-Regionen eines IgG1-Moleküls. Für weitere Information zur Herstellung von Immunglobulinfusionen siehe auch US-Patent Nr. 5.428.130, ausgegeben am 27. Juni 1995.
D. Herstellung von PRO
Die nachstehende Beschreibung betrifft vorrangig die Herstellung von PRO durch Kultivieren von Zellen, die mit einem PRO-Nucleinsäure-hältigen Vektor transformiert oder transfiziert sind. Natürlich wird erwogen, dass alternative Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, zur Herstellung von PRO verwendet werden können. Beispielsweise kann die PRO-Sequenz oder Teile davon durch direkte Peptidsynthese unter Verwendung von Festphasenverfahren hergestellt werden [siehe z.B. Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963)]. In-vitro-Proteinsynthese kann unter Verwendung manueller oder automatisierter Verfahren durchgeführt werden. Automatisierte Synthese kann beispielsweise unter Verwendung eines Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers erfolgen. Verschiedene Teile des PRO können separat chemisch synthetisiert und mittels chemischer oder enzymatischer Verfahren kombiniert werden, um das Volllängen-PRO zu bilden.
1. Isolation von für PRO kodierender DNA
DNA, die für PRO kodiert, kann aus einer cDNA-Bibliothek gewonnen werden, die aus Gewebe hergestellt wird, von dem angenommen wird, dass es die PRO-mRNA aufweist und diese auf einem nachweisbaren Niveau exprimiert. Demgemäß kann menschliche PRO-DNA leicht aus einer cDNA-Bibliothek gewonnen werden, die aus menschlichem Gewebe hergestellt wird, wie es auch in den Beispielen beschrieben ist. Das für PRO kodierende Gen kann auch aus einer genomischen Bibliothek oder mittels bekannter synthetischer Verfahren (z.B. automatisierter Nucleinsäuresynthese) gewonnen werden.
Bibliotheken können mit Sonden (wie Antikörpern gegen das PRO oder Oligonucleotide mit zumindest etwa 20-80 Basen) gescreent werden, deren Zweck es ist, das Gen von Interesse oder das durch dieses Gen kodierte Protein zu identifizieren. Screening der cDNA oder der genomischen Bibliothek mit der ausgewählten Sonde kann unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt werden, die z.B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), beschrieben sind. Ein alternatives Mittel zum Isolieren des für PRO kodierenden Gens ist die Verwendung der PCR-Methode [Sambrook et al., s.o.; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1995))].
Die nachstehenden Beispiele beschreiben Verfahren zum Screenen einer cDNA-Bibliothek. Die als Sonden ausgewählten Oligonucleotidsequenzen sollten eine ausreichende Länge aufweisen und ausreichend eindeutig sein, sodass falsche Positive minimiert werden. Das Oligonucleotid ist vorzugsweise so markiert, dass es durch Hybridisierung an DNA in der zu screenenden Bibliothek nachgewiesen werden kann. Markierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen die Verwendung von radioaktiven Markierungen wie z.B. von ³²P-markiertem ATP, Biotinylierung oder Enzymmarkierung. Hybridisierungsbedingungen, einschließlich moderater Stringenz und hoher Stringenz, sind in Sambrook et al., s.o., beschrieben.
Sequenzen, die in solchen Bibliotheks-Screening-Verfahren identifiziert werden, können mit anderen bekannten Sequenzen, die in öffentlichen Datenbanken wie z.B. GenBank oder anderen privaten Sequenzdatenbanken hinterlegt und zugänglich sind, verglichen und abgeglichen werden. Sequenzidentität (entweder auf Niveau der Aminosäuren oder der Nucleotide) innerhalb definierter Regionen des Moleküls oder über die gesamte Volllängensequenz hinweg kann mittels auf dem Gebiet bekannter Verfahren und wie hierin beschrieben bestimmt werden.
Nucleinsäure mit Protein-kodierender Sequenz kann durch Screenen ausgewählter cDNA oder genomischer Bibliotheken unter Verwendung der hierin zum ersten Mal offenbarten, abgeleiteten Aminosäuresequenz und, sofern erforderlich, unter Verwendung herkömmlicher Primerextensionsverfahren wie in Sambrook et al., s.o., beschrieben, um Vorläufer und Verarbeitungs-Zwischenprodukte von mRNA zu detektieren, die eventuell nicht in cDNA revers-transkribiert worden sind, gewonnen werden.
2. Selektion und Transformation von Wirtszellen
Wirtszellen werden mit Expressions- oder Kloniervektoren, die hierin zur PRO-Produktion beschrieben werden, transfiziert oder transformiert und in herkömmlichem Nährmedium kultiviert, das zum Induzieren von Promotoren, zur Selektion von Transformanten oder Amplifikation der Gene, die für die erwünschten Sequenzen kodieren, geeignet modifiziert ist. Die Kulturbedingungen, wie z.B. Medium, Temperatur, pH und dergleichen, können von Fachleuten ohne übermäßiges Experimentieren ausgewählt werden. Im Allgemeinen können Prinzipien, Arbeitsvorschriften und praktische Techniken zur Maximierung der Produktivität von Zellkulturen in Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler (Hrsg.), IRL Press (1991), und in Sambrook et al., s.o., gefunden werden.
Verfahren zur eukaryotischen Zelltransfektion und prokaryotischen Zelltransformation sind durchschnittlichen Fachleuten bekannt, z.B. CaCl₂-Verfahren, CaPO₄-Verfahren, Liposom-vermitteltes Verfahren und Elektroporation. Je nach verwendeten Wirtszel len erfolgt die Transformation unter Verwendung von Standardverfahren, die für die entsprechenden Zellen geeignet sind. Die Calciumbehandlung mittels Calciumchlorid, wie in Sambrook et al., s.o., beschrieben, oder Elektroporation wird im Allgemeinen für Prokaryoten verwendet. Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transformation bestimmter Pflanzenzellen verwendet, wie Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und die WO 89/05859, veröffentlicht am 29. Juni 1989, beschreiben. Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände kann das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren von Graham & van der Eb, Virology 52, 456-457 (1978), verwendet werden. Allgemeine Aspekte von Säugetierzellen-Wirtssystemtransfektionen werden im US-Patent Nr. 4.399.216 beschrieben. Transformationen in Hefe werden typischerweise gemäß dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76, 3829 (1979), durchgeführt. Es können jedoch auch andere Verfahren zum Einführen von DNA in Zellen, wie beispielsweise Kernmikroinjektion, Elektroporation, bakterielle Protoplastenfusion mit intakten Zellen, oder Polykationen, z.B. Polybren, Polyornithin, verwendet werden. Für verschiedene Verfahren zur Transformation von Säugetierzellen siehe Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527-537 (1990), und Mansour et al., Nature 336, 348-352 (1988).
Geeignete Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren der DNA in die bzw. den Vektoren hierin schließen Prokaryoten-, Hefe-, oder höhere Eukaryotenzellen ein. Geeignete Prokaryoten umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Eubakterien, wie z.B. gram-negative oder gram-positive Organismen, beispielsweise Enterobacteriaceae wie z.B. E. coli. Verschiedene E.-coli-Stämme sind öffentlich erhältlich, wie z.B. E.-coli-K12-Stamm MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); E.-coli-Stamm W3110 (ATCC 27.325) und K5 772 (ATCC 53.635). Andere geeignete prokaryotische Wirtszellen umfassen Enterobacteriaceae wie Escherichia, z.B. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, z.B. Salmonella typhimurium, Serratia, z.B. Serratia marcescans, und Shigella sowie Bacilli wie z.B. B. subtilis und B. licheniformis (z.B. B. licheniformis 41P, offenbart in DD 266.710, veröffentlicht am 12. April 1989), Pseudomonas, wie z.B. P. aeruginosa, und Streptomyces. Diese Beispiele stellen eine Veranschaulichung und keine Einschränkung dar. Stamm W3110 ist ein besonders bevorzugter Wirt oder Ausgangswirt, da er ein üblicher Wirtstamm für Fermentationen von Rekombinations-DNA-Produkten ist. Vorzugsweise sekretiert die Wirtszelle minimale Mengen an proteolytischen Enzymen. Beispielsweise kann Stamm W3110 modifiziert werden, um in den Genen, die für die zum Wirt endogenen Proteine kodieren, eine genetische Mutation zu bewirken, wobei Beispiele für solche Wirte E. coli-W3110-Stamm 1A2, der den vollständigen Genotyp tonA aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 9E4, der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 27C7 (ATCC 55.244), der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan^r aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 37D6, der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7ilvG kan^r aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 40B4, der Stamm 37D6 mit einer nicht Kanamycin-resistenten degP-Deletionsmutation ist; und ein E.-coli-Stamm mit mutierter periplasmatischer Protease, offenbart im US-Patent Nr. 4.946.783, ausgegeben am 7. August 1990, sind. Alternativ dazu sind In-vitro-Klonierverfahren, z.B. PCR oder andere Nucleinsäure-Polymerasereaktionen, geeignet.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben wie beispielsweise Fadenpilze oder Hefe geeignete Klonier- oder Expressionswirte für PRO-kodierende Vektoren. Saccharomyces cerevisiae ist ein üblicherweise verwendeter, niedereukaryotischer Wirtsmikroorganismus. Andere umfassen Schizosaccharomyces pombe (Beach & Nurse, Nature 290, 140 (1981); EP 139.383 , veröffentlicht am 2. Mai 1985); Kluyveromyces-Wirte (US-Patent Nr. 4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology 9, 968-975 (1991)) wie z.B. K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154(2), 737-742 (1983)), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology 8, 135 (1990)), K. thermotolerans und K. marxianus; yarrowia ( EP 402.226 ); Pichia pastoris ( EP 183.070 ; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265-278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia ( EP 244.234 ); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5339-5363 (1979)); Schwanniomyces wie z.B. Schwanniomyces occidentalis ( EP 394.538 , veröffentlicht am 31. Oktober 1990); und Fadenpilze wie z.B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, veröffentlicht am 10. Januar 1991) und Aspergillus-Wirte wie z.B. A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284-289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470-1474 (1984)) und A. niger (Kelly & Hynes, EMBO J. 4, 475-479 (1985)). Methylotrophe Hefen sind hierin geeignet und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Hefe, die in der Lage ist, auf Methanol zu wachsen, ausgewählt aus den Gattungen von Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis und Rhodotorula. Eine Liste spezifischer Spezies, die für diese Klasse von Hefe beispielhaft sind, ist in C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982), zu finden.
Geeignete Wirtszellen für die Expression glykosylierter PRO werden von multizellulären Organismen abgeleitet. Beispiele für Wirbellosenzellen umfassen Insektenzellen wie z.B. Drosophila S2 und Spodoptera Sf9 sowie Pflanzenzellen. Beispiele für nützliche Säugetierwirtszelllinien umfassen Chinahamster-Eierstock- (CHO-) und COS-Zellen. Spezifischere Beispiele umfassen Affennieren-CV1-Linie, transformiert durch SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche embryonale Nierenlinie (293 oder 293-Zellen, subkloniert zum Wachstum in Suspensionskultur, Graham et al., J. Gen Virol. 36, 59 (1977)); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub & Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243-251 (1980)); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); und Maus-Brusttumor (MMT 060562, ATCC CCL51). Es wird erachtet, dass die Auswahl der geeigneten Wirtszelle in den Bereich der Erfindung fällt.
3. Auswahl und Verwendung eines replizierbaren Vektors
Die Nucleinsäure (z.B. cDNA oder genomische DNA), die für PRO kodiert, kann zum Klonieren (Amplifikation der DNA) oder zur Expression in einen replizierbaren Vektor insertiert werden. Verschiedene Vektoren sind öffentlich erhältlich. Der Vektor kann beispielsweise in Form eines Plasmids, Cosmids, viralen Partikels oder Phagen vorliegen. Die geeignete Nucleinsäuresequenz kann in den Vektor mittels zahlreicher verschiedener Verfahren insertiert werden. Im Allgemeinen wird DNA in (eine) geeignete Restriktionsendonucleasestelle(n) mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren insertiert. Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht beschränkt auf, eine oder mehrere Signalsequenzen, einen Replikationsursprung, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancer-Element, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz. Bei der Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere dieser Komponenten enthalten, werden herkömmliche Ligationsverfahren eingesetzt, die Fachleuten bekannt sind.
Das PRO kann rekombinant nicht nur direkt, sondern auch als ein Fusionspolypeptid mit einem heterologen Polypeptid hergestellt werden, das eine Signalsequenz oder ein anderes Polypeptid mit einer spezifischen Spaltungsstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids sein kann. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors oder kann ein Teil der für PRO kodierenden DNA sein, die in den Vektor insertiert wird. Die Signalsequenz kann eine prokaryotische Signalsequenz, ausgewählt beispielsweise aus der aus alkalischer Phosphatase, Penicillinase, Ipp oder wärmestabilen Enterotoxin-II-Leadern bestehenden Gruppe, sein. Zur Hefesekretion kann die Signalsequenz z.B. der Hefe-Invertaselqeader, Alpha-Faktorleader (einschließlich Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktorleader, wobei Letzterer im US-Patent Nr. 5.010.182 beschrieben wird) oder saure Phosphataseleader, der C.-albicans-Glucoamylaseleader ( EP 362.179 , veröffentlicht am 4. April 1990) oder das in der WO 90/13646, veröffentlicht am 15. November 1990, beschriebene Signal sein. Zur Säugetierzellexpression können Säugetiersignalsequenzen verwendet werden, um Sekretion des Proteins zu steuern, wie beispielsweise Signalsequenzen aus sekretierten Polypeptiden derselben oder einer verwandten Spezies sowie virale Sekretionsleader.
Sowohl Expressions- als auch Kloniervektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es ermöglicht, dass sich der Vektor in einer oder mehreren der sekretierten Wirtszellen repliziert. Solche Sequenzen sind für zahlreiche verschiedene Bakterien, Hefen und Viren bekannt. Der Replikationsursprung aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten gram-negativen Bakterien geeignet, der 2μ-Plasmidursprung ist für Hefe geeignet, und verschiedene virale Ursprünge (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für Kloniervektoren in Säugetierzellen nützlich.
Expressions- und Kloniervektoren enthalten typischerweise ein Selektionsgen, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, verleihen, (b) auxotrophe Mängel beheben oder (c) essenzielle Nährstoffe, die aus komplexem Medium nicht erhältlich sind, z.B. das für D-Alaninracemase für Bacilli kodierende Gen, zuführen.
Ein Beispiel für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind jene, die die Identifikation von Zellen ermöglichen, die in der Lage sind, die für PRO kodierende Nucleinsäure aufzunehmen, wie z.B. DHFR oder Thymidinkinase. Eine geeignete Wirtszelle ist, sofern Wildtyp-DHFR verwendet wird, die CHO-Zelllinie, der DHFR-Aktivität fehlt und die wie von Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), beschrieben hergestellt und vermehrt wird. Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trp1-Gen, das im Hefeplasmid YRp7 vorhanden ist [Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)]. Das trp1-Gen liefert einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, beispielsweise ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 [Jones, Genetics 85, 12 (1977)].
Expressions- und Kloniervektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der operabel an die für PRO kodierende Nucleinsäuresequenz gebunden ist, um mRNA-Synthese zu steuern. Promotoren, die durch zahlreiche verschiedene potenzielle Wirtszellen erkannt werden, sind bekannt. Promotoren, die zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignet sind, umfassen die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme [Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)], alkalische Phosphatase, ein Tryptophan- (trp-) Promotorsystem [Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP 36.776 ] und Hybridpromotoren wie z.B. den tac-Promotor [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25 (1983)]. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten auch eine Shine- Dalgarno- (S.D.-) Sequenz, die operabel an die für PRO kodierende DNA gebunden ist.
Beispiele für geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase [Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)] oder andere glykolytische Enzyme [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)] wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren sind und den zusätzlichen Vorteil haben, dass ihre Transkription durch Wachstumsbedingungen gesteuert wird, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, degradative Enzyme, die mit Stickstoffmetabolismus assoziiert sind, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für Maltose- und Galactoseverwendung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei Hefeexpression werden näher in EP 73.657 beschrieben.
PRO-Transkription aus Vektoren in Säugetier-Wirtszellen wird beispielsweise durch Promotoren gesteuert, die aus den Genomen von Viren wie z.B. Polyomavirus, Geflügelpockenvirus ( UK 2.211.504 , veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie z.B. Adenovirus 2), Rinderpapillomavirus, Vogel-Sarkomvirus, Zytomegalie-Virus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und Affenvirus 40 (SV40), aus heterologen Säugetierpromotoren, z.B. dem Actinpromotor oder einem Immunglobulinpromotor, und aus Hitzeschock-Promotoren gewonnen werden, vorausgesetzt, solche Promotoren sind mit den Wirtszellsystemen kompatibel.
Transkription einer DNA, die für das PRO kodiert, durch höhere Eukaryoten kann durch Insertieren einer Enhancersequenz in den Vektor gesteigert werden. Enhancer sind cis-wirkende Elemente von DNA, üblicherweise etwa mit 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor so wirken, dass seine Transkription gesteigert wird. Zahlreiche Enhancersequenzen sind aus Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise wird jedoch ein Enhancer aus einem eukaryotischen Zellvirus verwendet. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer an der späten Seite des Replikationsursprungs (bpp 100-270), den frühen Zytomegalie-Virus-Promotorenhancer, den Polyoma-Enhancer an der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer. Der Enhancer kann in den Vektor an einer Position 5' oder 3' zur PRO-Kodiersequenz gespleißt werden, wird jedoch vorzugsweise an einer Stelle 5' vom Promotor angeordnet.
Expressionsvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-, Tier-, Mensch- oder kernhaltige Zellen aus anderen multizellulären Organismen) verwendet werden, enthalten auch Sequenzen, die zum Abschluss von Transkription und zur Stabilisierung der mRNA erforderlich sind. Solche Sequenzen sind üblicherweise aus den untranslatierten 5'-, und gegebenenfalls 3'-, Regionen eukaryotischer oder viraler DNAs oder cDNAs erhältlich. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente im untranslatierten Abschnitt der für PRO kodierenden mRNA transkribiert werden.
Weitere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Adaption an die Synthese von PRO in rekombinanter Wirbeltierzellkultur geeignet sind, werden in Gething et al., Nature 293, 620-625 (1981); Mantei et al., Nature 281, 40-46 (1979); EP 117.060 ; und EP 117.058 beschrieben.
4. Detektion von Genamplifikation/expression
Genamplifikation und/oder -expression kann basierend auf den hierin bereitgestellten Sequenzen in einer Probe direkt gemessen werden, z.B. durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting zur Quantifizierung der Transkription von mRNA [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201-5205 (1980)], Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer geeigneten markierten Sonde. Alternativ dazu können Antikörper verwendet werden, die spezifische Dupli ces, einschließlich DNA-Duplices, RNA-Duplices und DNA-RNA-Hybridduplices oder DNA-Proteinduplices, erkennen. Die Antikörper wiederum können markiert sein, und der Test kann durchgeführt werden, wenn der Duplex an eine Oberfläche gebunden ist, sodass bei Bildung von Duplex an der Oberfläche die Gegenwart von Antikörper, der an den Duplex gebunden ist, nachgewiesen werden kann.
Genexpression kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren, wie beispielsweise immunhistochemisches Färben von Zellen oder Gewebeschnitten und Tests von Zellkultur oder Körperflüssigkeiten, gemessen werden, um die Expression von Genprodukt direkt zu quantifizieren. Antikörper, die für immunhistochemisches Färben und/oder Testen von Probenflüssigkeiten nützlich sind, können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in jedem beliebigen Säugetier hergestellt werden. Auf einfache Weise können die Antikörper gegen ein Nativsequenz-PRO-Polypeptid oder gegen ein synthetisches Peptid, basierend auf den hierin bereitgestellten DNA-Sequenzen, oder gegen exogene Sequenz, fusioniert an PRO-DNA und für ein spezifisches Antikörperepitop kodierend, hergestellt werden.
5. Reinigung von Polypeptid
Formen von PRO können aus Kulturmedium oder aus Wirtszelllysaten gewonnen werden. Sofern membrangebunden, kann es unter Verwendung einer geeigneten Tensidlösung (z.B. Triton-X 100) oder durch enzymatische Spaltung aus der Membran freigesetzt werden. Zellen, die zur Expression von PRO verwendet werden, können mittels verschiedener physikalischer oder chemischer Mittel, wie z.B. Gefrier-Auftau-Zyklieren, Beschallung, mechanischer Aufbruch oder Zelllysemittel, aufgeschlossen werden.
Es kann erwünscht sein, PRO aus rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu reinigen. Die folgenden Verfahren sind Beispiele für geeignete Reinigungsverfahren: Fraktionierung an einer Ionenaustauschsäule; Ethanolfällung; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie an Siliciumdioxid oder an einem Kationenaustauschharz wie z.B. DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatfällung; Gel filtration unter Verwendung von beispielsweise Sephadex G-75; Protein-A-Sepharose-Säulen zur Entfernung von Verunreinigungen wie IgG; und Metallchelator-Säulen zur Bindung von Epitop-markierten Formen des PRO. Verschiedene Verfahren von Proteinreinigung können verwendet werden, und solche Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und beispielsweise in Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982), beschrieben. Der/Die ausgewählte(n) Reinigungsschritt(e) hängen beispielsweise von der Beschaffenheit des verwendeten Herstellungsverfahrens und dem bestimmten hergestellten PRO ab.
E. Verwendung von PRO
Nucleotidsequenzen (oder ihr Komplement), die für PRO kodieren, haben verschiedene Anwendungsbereiche auf dem Gebiet der Molekularbiologie, einschließlich Verwendungen als Hybridisierungssonden, beim Chromosom- und Genkartieren und bei der Bildung von Antisense-RNA und -DNA. PRO-Nucleinsäure ist auch zur Herstellung von PRO-Polypeptiden durch die hierin beschriebenen Rekombinationsverfahren nützlich.
Das Volllängen-Nativsequenz-PRO-Gen oder Teile davon können als Hybridisierungssonden für eine cDNA-Bibliothek zur Isolierung der Volllängen-PRO-cDNA oder zur Isolierung wiederum anderer cDNAs (beispielsweise jener, die für natürlich vorkommende Varianten von PRO oder für PRO aus anderen Spezies kodieren), die eine erwünschte Sequenzidentität zur hierin offenbarten nativen PRO-Sequenz aufweisen, verwendet werden. Gegebenenfalls beträgt die Länge der Sonden etwa 20 bis etwa 50 Basen. Die Hybridisierungssonden können von zumindest teilweise neuen Regionen der nativen Volllängen-Nucleotidsequenz abgeleitet sein, worin jene Regionen ohne übermäßiges Experimentieren bestimmt werden können, oder von genomischen Sequenzen einschließlich Promotoren, Enhancerelementen und Intronen von Nativsequenz-PRO. Ein Screening-Verfahren umfasst beispielsweise das Isolieren der Kodierregion des PRO-Gens unter Verwendung der bekannten DNA-Sequenz, um eine selektierte Sonde von etwa 40 Basen zu synthetisieren. Hybridi sierungssonden können durch zahlreiche verschiedene Markierungen markiert werden, einschließlich Radionucleotide wie z.B. ³²P oder ³⁵S oder enzymatische Markierungen wie z.B. alkalische Phosphatase, gebunden an die Sonde über Avidin/Biotin-Bindungssysteme. Markierte Sonden mit einer Sequenz, die zu jener des PRO-Gens der vorliegenden Erfindung komplementär ist, können zum Screenen von Bibliotheken menschlicher cDNA, genomischer DNA oder mRNA verwendet werden, um zu bestimmen, an welche Mitglieder solcher Bibliotheken die Sonde hybridisiert. Hybridisierungsverfahren sind in den nachstehenden Beispielen näher beschrieben.
Jede beliebige EST-Sequenz, die in der vorliegenden Anmeldung offenbart ist, kann demähnlich unter Einsatz der hierin offenbarten als Sonde verwendet werden.
Andere nützliche Fragmente der PRO-Nucleinsäuren sind Antisense- oder Sense-Oligonucleotide, umfassend eine einzelsträngige Nucleinsäuresequenz (entweder RNA oder DNA), die in der Lage sind, an PRO-mRNA- (Sense) oder PRO-DNA- (Antisense) Sequenzen zu binden. Antisense- oder Sense-Oligonucleotide gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen ein Fragment der Kodierregion von PRO-DNA. Solch ein Fragment umfasst im Allgemeinen zumindest etwa 14 Nucleotide, vorzugsweise von etwa 14 bis 30 Nucleotide. Die Fähigkeit, ein Antisense- oder ein Sense-Oligonucleotid auf Grundlage einer cDNA-Sequenz, die für ein bestimmtes Protein kodiert, abzuleiten, wird beispielsweise in Stein & Cohen (Cancer Res. 48, 2659 (1988)) und in van der Krol et al. (BioTechniques 6, 958 (1988)) beschrieben.
Bindung von Antisense- oder Sense-Oligonucleotiden an Target-Nucleinsäuresequenzen führt zur Bildung von Duplices, die Transkription oder Translation der Targetsequenz durch ein oder mehrere Mittel blockieren, einschließlich gesteigerten Abbaus der Duplices, frühzeitiger Termination von Transkription oder Translation, oder durch andere Mittel. Somit können die Antisense-Oligonucleotide verwendet werden, um Expression von PRO-Proteinen zu blockieren. Antisense- und Sense-Oligonucleotide umfassen weiters Oligonucleotide mit modifizierten Zucker-Phosphodiester-Hauptketten (oder mit anderen Zuckerbindungen, wie jene, die in der WO 91/06629 beschrieben sind), worin solche Zuckerbindungen gegenüber endogenen Nucleasen resistent sind. Solche Oligonucleotide mit resistenten Zuckerbindungen sind in vivo stabil (d.h. sind in der Lage, gegen enzymatischen Abbau resistent zu sein), behalten jedoch Sequenzspezifität bei, um in der Lage zu sein, Target-Nucleotidsequenzen zu binden.
Andere Beispiele für Sense- oder Antisense-Oligonucleotide umfassen jene Oligonucleotide, die kovalent an organische Gruppierungen, wie jene, die in der WO 90/10048 beschrieben sind, und andere Gruppierungen, die Affinität des Oligonucleotids gegenüber einer Target-Nucleinsäuresequenz steigern, wie z.B. Poly-(L-Lysin), gebunden sind. Darüber hinaus können interkalierende Agenzien, wie z.B. Ellipticin, und alkylierende Mittel oder Metallkomplexe an Sense- oder Antisense-Oligonucleotide gebunden werden, um Bindungsspezifitäten des Antisense- oder Sense-Oligonucleotids für die Target-Nucleotidsequenz zu modifizieren.
Antisense- oder Sense-Oligonucleotide können mittels jedes beliebigen Gentransferverfahrens in eine Zelle eingeführt werden, die die Target-Nucleinsäuresequenz enthält, einschließlich beispielsweise CaPO₄-vermittelte DNA-Transfektion, Elektroporation oder unter Verwendung von Gentransfervektoren wie z.B. Epstein-Barr-Virus. In einem bevorzugten Verfahren wird ein Antisense- oder Sense-Oligonucleotid in einen geeigneten retroviralen Vektor insertiert. Eine Zelle, die die Target-Nucleinsäuresequenz enthält, wird entweder in vivo oder ex vivo mit dem rekombinanten retroviralen Vektor kontaktiert. Geeignete retrovirale Vektoren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, jene, die aus dem Maus-Retrovirus M-MuLV, aus N2 (ein Retrovirus, das aus M-MuLV abgeleitet ist) oder aus den Doppelkopievektoren, die als DCT5A, DCT5B und DCT5C bezeichnet sind (siehe die WO 90/13641), abgeleitet sind.
Sense- oder Antisense-Oligonucleotide können auch in eine Zelle, die die Target-Nucleotidsequenz enthält, durch Bildung eines Konjugats mit einem Ligandenbindungsmolekül wie in der WO 91/04753 beschrieben eingeführt werden. Geeignete Ligandenbindungsmoleküle umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Zelloberflächenrezeptoren, Wachstumsfaktoren, andere Cytokine oder andere Liganden, die sich an Zelloberflächenrezeptoren binden. Vorzugsweise stört die Konjugation des Ligandenbindungsmoleküls die Fähigkeit des Ligandenbindungsmoleküls, sich an sein entsprechendes Molekül oder seinen entsprechenden Rezeptor zu binden oder den Eintritt von Sense- oder Antisense-Oligonucleotid oder seiner konjugierten Version in die Zelle zu blockieren, nicht wesentlich.
Alternativ dazu kann ein Sense- oder ein Antisense-Oligonucleotid in eine Zelle, die die Target-Nucleinsäuresequenz enthält, durch Bildung eines Oligonucleotid-Lipid-Komplexes wie in der WO 90/10448 beschrieben eingeführt werden. Der Sense- oder Antisense-Oligonucleotid-Lipid-Komplex wird vorzugsweise innerhalb der Zelle durch eine endogene Lipase dissoziiert.
Antisense- oder Sense-RNA- oder -DNA-Moleküle weisen im Allgemeinen zumindest eine Länge von etwa 5 Basen, etwa 10 Basen, etwa 15 Basen, etwa 20 Basen, etwa 25 Basen, etwa 30 Basen, etwa 35 Basen, etwa 40 Basen, etwa 45 Basen, etwa 50 Basen, etwa 55 Basen, etwa 60 Basen, etwa 65 Basen, etwa 70 Basen, etwa 75 Basen, etwa 80 Basen, etwa 85 Basen, etwa 90 Basen, etwa 95 Basen, etwa 100 Basen oder mehr auf.
Die Sonden können auch in PCR-Verfahren verwendet werden, um einen Pool an Sequenzen zur Identifikation von nah verwandten PRO-Kodiersequenzen zu bilden.
Nucleotidsequenzen, die für ein PRO kodieren, können auch verwendet werden, um Hybridisierungssonden zum Kartieren des Gens, das für das PRO kodiert, und zur genetischen Analyse von Personen mit genetischen Erkrankungen zu konstruieren. Die hierin bereitgestellten Nucleotidsequenzen können unter Verwendung bekannter Verfahren, wie z.B. In-situ-Hybridisierung, Bindungsanalyse gegen bekannte chromosomale Marker und Hybridisierungs-Screenen mit Bibliotheken, zu einem Chromosom und spezifischen Regionen eines Chromosoms kartiert werden.
Kodieren die Kodiersequenzen für PRO für ein Protein, das sich an ein anderes Protein bindet (beispielsweise, wenn das PRO ein Rezeptor ist), so kann das PRO in Tests zur Identifikation der anderen Proteine oder Moleküle verwendet werden, die in die Bindungswechselwirkung involviert sind. Mittels solcher Verfahren können Inhibitoren der Rezeptor/Liganden-Bindungswechselwirkung identifiziert werden. Proteine, die in solche Bindungswechselwirkungen eingebunden sind, können auch verwendet werden, um auf Peptid oder niedermolekulare Inhibitoren oder Agonisten der Bindungswechselwirkung zu screenen. Das Rezeptor-PRO kann auch verwendet werden, um korrelative(n) Liganden zu isolieren. Screening-Tests können entworfen werden, um Leitverbindungen zu finden, die die biologische Aktivität eines nativen PRO oder eines Rezeptors für PRO nachahmen. Solche Screening-Tests umfassen Tests, die zu High-Throughput-Screening von chemischen Bibliotheken zugänglich sind, was sie besonders geeignet zur Identifikation von niedermolekularen Wirkstoffkandidaten macht. In Betracht gezogene kleine Moleküle schließen synthetische organische oder anorganische Verbindungen ein. Die Tests können in zahlreichen verschiedenen Formaten durchgeführt werden, einschließlich Protein-Protein-Bindungstests, biochemische Screening-Tests, Immuntests und zellbasierte Tests, die auf dem Gebiet der Erfindung gut beschrieben sind.
Nucleinsäuren, die für PRO oder seine modifizierten Formen kodieren, können auch verwendet werden, um entweder nicht-menschliche transgene Tiere oder nicht-menschliche "Knock-out"-Tiere zu bilden, die wiederum nützlich für die Entwicklung und das Screenen von therapeutisch nützlichen Reagenzien sind. Ein nicht-menschliches transgenes Tier (z.B. eine Maus oder eine Ratte) ist ein Tier, das Zellen aufweist, die ein Transgen enthalten, wobei dieses Transgen in das Tier oder in einen Vorfahren des Tiers in einem pränatalen, z.B. einem embryonalen, Stadium eingeführt wurde. Ein Transgen ist eine DNA, die in das Genom einer Zelle integriert ist, aus der sich ein transgenes Tier entwickelt. In einer Ausführungsform kann cDNA, die für PRO kodiert, verwendet werden, um genomische DNA, die für PRO kodiert, gemäß bekannten Verfahren und die zur Bildung von nicht-menschlichen transgenen Tieren verwendeten genomischen Sequenzen zu klonieren, wobei diese Tiere Zellen enthalten, welche DNA, die für PRO kodiert, exprimieren. Verfahren zur Bildung von nicht-menschlichen transgenen Tieren, insbesondere von Tieren wie Mäusen oder Ratten, sind auf dem Gebiet der Erfindung bereits Routine und werden beispielsweise in den US-Patenten Nr. 4.736.866 und 4.870.009 beschrieben. Typischerweise würden bestimmte Zellen zur PRO-Transgen-Inkorporation mit gewebespezifischen Enhancern als Target dienen. Nicht-menschliche transgene Tiere, die eine Kopie eines für PRO kodierenden Transgens enthalten, das in die Keimlinie des Tieres in einem embryonalen Stadium eingeführt wurde, können verwendet werden, um die Wirkung von gesteigerter Expression von für PRO kodierender DNA zu untersuchen. Solche Tiere können als Testtiere für Reagenzien verwendet werden, von denen angenommen wird, dass sie Schutz vor beispielsweise pathologischen Leiden, die mit seiner Überexpression assoziiert sind, verleihen. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung wird ein Tier mit dem Reagens behandelt, und eine reduzierte Häufigkeit des pathologischen Leidens im Vergleich zu nicht behandelten Tieren, die das Transgen in sich tragen, würde auf eine mögliche therapeutische Wirkung bezüglich des pathologischen Leidens hinweisen.
Alternativ dazu können nicht-menschliche Homologe von PRO verwendet werden, um ein nicht-menschliches PRO-"Knock-out"-Tier zu konstruieren, das ein defektes oder verändertes, für PRO kodierendes Gen als ein Resultat homologer Rekombination zwischen dem endogenen, für PRO kodierenden Gen und geänderter genomischer, für PRO kodierender DNA, eingeführt in einen embryonalen Stammzelle des Tiers, aufweist. Beispielsweise kann für PRO kodierende cDNA verwendet werden, um für PRO kodierende genomische DNA gemäß den bekannten Verfahren zu klonieren. Ein Abschnitt der genomischen, für PRO kodierenden DNA kann deletiert oder durch ein anderes Gen ersetzt werden, wie beispielsweise durch ein Gen, das für einen selektierbaren Marker kodiert, der verwendet werden kann, um Integration zu überwachen. Typischerweise werden mehrere kb unveränderter flankierender DNA (sowohl an den 5'- als auch 3'-Enden) in den Vektor eingebunden [siehe z.B. Thomas & Capecchi, Cell 51, 503 (1987), für eine Beschreibung homologer Rekombinationsvektoren]. Der Vektor wird in eine nicht-menschliche embryonale Stammzellenlinie (z.B. durch Elektroporation) eingeführt, und Zellen, in denen sich die eingeführte DNA mit der endogenen DNA homolog rekombiniert hat, werden ausgewählt [siehe z.B. Li et al., Cell 69, 915 (1992)]. Die ausgewählten Zellen werden dann in eine Blastozyste eines nicht-menschlichen Tiers (z.B. einer Maus oder Ratte) injiziert, um Aggregationschimären zu bilden [siehe z.B. Bradley in: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson (Hrsg.) (IRL, Oxford, 1987), 113-152]. Ein nicht-menschlicher Hybridembryo kann dann in ein geeignetes, scheinschwangeres weibliches Ammentier implantiert und ausgetragen werden, um ein "Knock-out"-Tier zu schaffen. Nachkommenschaft, die die homolog rekombinierte DNA in ihren Keimzellen trägt, kann mittels Standardverfahren identifiziert werden und kann verwendet werden, um Tiere zu züchten, in denen alle Zellen des Tiers die homolog rekombinierte DNA enthalten. Knockout-Tiere können beispielsweise aufgrund ihrer Fähigkeit, Abwehr gegen bestimmte pathologische Leiden aufzubauen, sowie aufgrund ihrer Entwicklung pathologischer Leiden wegen des fehlenden PRO-Polypeptids charakterisiert werden.
Nucleinsäure, die für die PRO-Polypeptide kodiert, kann auch bei Gentherapie eingesetzt werden. Bei Gentherapieanwendungen werden Gene in Zellen eingeführt, um In-vivo-Synthese eines therapeutisch wirksamen genetischen Produkts, beispielsweise zum Ersatz eines defekten Gens, zu erreichen. "Gentherapie" schließt sowohl herkömmliche Gentherapie ein, in der eine langanhaltende Wirkung durch eine einzelne Behandlung erreicht wird, als auch die Verabreichung von gentherapeutischen Mitteln, die einmalige oder wiederholte Verabreichung einer therapeutisch wirksamen DNA oder mRNA umfasst. Antisense-RNAs und -DNAs können als therapeutische Agenzien zum Blockieren der Expression bestimmter Gene in vivo verwendet werden. Es konnte bereits gezeigt werden, dass kurze Antisense-Oligonucleotide in Zellen eingeführt werden können, wo sie trotz geringer intrazellulärer Konzentrationen, die durch ihre eingeschränkte Aufnahme durch die Zellmembran verursacht wird, als Inhibitoren wirken (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4143-4146 (1986)). Die Oligonucleotide können modifiziert werden, um ihre Aufnahme zu steigern, z.B. durch Substituieren ihrer negativ geladenen Phosphodiestergruppen durch ungeladene Gruppen.
Es gibt zahlreiche verschiedene Verfahren, die zum Einführen von Nucleinsäuren in lebensfähige Zellen verfügbar sind. Die Verfahren variieren je nachdem, ob die Nucleinsäure in vitro in kultivierte Zellen oder in vivo in die Zellen des beabsichtigten Wirts transferiert werden. Verfahren, die für den Transfer von Nucleinsäure in Säugetierzellen in vitro geeignet sind, umfassen die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Mikroinjektion, Zellfusion, DEAE-Dextran, das Calciumphosphat-Fällungsverfahren usw. Die zur Zeit bevorzugten In-vivo-Gentransferverfahren umfassen Transfektion über virale (typischerweise retrovirale) Vektoren und virale Hüllprotein-Liposomen-vermittelte Transfektion (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993)). In manchen Situationen ist es wünschenswert, die Nucleinsäurequelle mit einem Mittel bereitzustellen, das auf die Targetzellen gerichtet ist, wie beispielsweise mit einem Antikörper, der für ein Zelloberflächenmembranprotein oder für die Targetzelle spezifisch ist, mit einem Liganden für einen Rezeptor auf der Targetzelle usw. Werden Liposomen verwendet, so können Proteine, die sich an ein mit Endozytose assoziiertes Zelloberflächenmembranprotein binden, zum Targeting und/oder zur Erleichterung der Aufnahme verwendet werden, z.B. Capsidproteine oder Fragmente davon, die für einen bestimmten Zelltyp tropisch sind, Antikörper für Proteine, die beim Zyklieren Internalisierung erfahren, oder Proteine, die auf intrazelluläre Lokalisierung gerichtet sind und intrazelluläre Halbwertszeit verlängern. Das Verfahren zu Rezeptor-vermittelter Endozytose wird beispielsweise von Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); und von Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990), beschrieben. Ein Überblick zu Genmarkierungs- und Gentherapie-Arbeitsvorschriften wird in Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992), geliefert.
Die hierin beschriebenen PRO-Polypeptide können auch als Molekulargewichtsmarker im Rahmen von Elektrophorese eingesetzt werden, und die isolierten Nucleinsäuresequenzen können zur rekombinanten Expression jener Marker verwendet werden.
Die hierin beschriebenen, für die PRO-Polypeptide kodierenden Nucleinsäuremoleküle oder Fragmente davon sind zur Chromosomenidentifikation nützlich. In dieser Hinsicht besteht ein permanenter Bedarf daran, neue Chromosomenmarker zu identifizieren, da, basierend auf aktuellen Sequenzdaten, relativ wenig Chromosommarkierungs-Reagenzien bis heute erhältlich sind. Jedes PRO-Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung kann als ein Chromosomenmarker verwendet werden.
Die PRO-Polypeptide und Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung können auch zur Gewebetypisierung verwendet werden, worin die PRO-Polypeptide der vorliegenden Erfindung in einem Gewebe differenziell im Vergleich zu einem anderen exprimiert werden können. PRO-Nucleinsäuremoleküle finden Verwendung bei der Herstellung von Sonden für PCR, Northern-Analyse, Southern-Analyse und Western-Analyse.
Die hierin beschriebenen PRO-Polypeptide können auch als therapeutische Mittel verwendet werden. Die PRO-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können gemäß bekannten Verfahren zur Herstellung pharmazeutisch nützlicher Zusammensetzungen formuliert werden, wobei das PRO-Produkt hiervon in einer Beimischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägervehikel kombiniert wird. Therapeutische Formulierungen werden zur Lagerung durch Vermischen des aktiven Bestandteils mit dem erwünschten Reinheitsgrad mit optionalen physiologisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, A. Osol (Hrsg.) (1980)) in Form von lyophilisierten Formulierungen oder wässrigen Lösungen hergestellt. Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für Rezipienten bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidanzien einschließlich Ascorbinsäure; niedermolekulare Polypeptide (mit weniger als etwa 10 Resten); Proteine wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie z.B. Polyvinylpyrrolidon, Aminosäuren wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie EDTA; Zuckeralkohole wie z.B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen wie beispielsweise Natrium; und/oder nichtionische Tenside wie TWEEN^TM, PLURONICS^TM oder PEG.
Die zur In-vivo-Verabreichung zu verwendenden Formulierungen müssen steril sein. Dies wird leicht mittels Filtration durch sterile Filtrationsmembranen vor oder nach Gefriertrocknung und Wiederherstellung erreicht.
Therapeutische Zusammensetzungen hierin werden im Allgemeinen in einen Behälter mit einer sterilen Zugangsöffnung, beispielsweise in einen intravenösen Lösungsbeutel oder eine Phiole mit einem Septum, das mit einer subkutanen Injektionsnadel durchstochen werden kann, gegeben.
Die Art der Verabreichung entspricht bekannten Verfahren, z.B. Injektion oder Infusion auf intravenösem, intraperitonealem, intrazerebralem, intramuskulärem, intraokularem, intraarteriellem oder intraläsionalem Weg, topische Verabreichung oder mittels eines Retardsystems.
Dosierungen und erwünschte Wirkstoffkonzentrationen pharmazeutischer Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können je nach bestimmter beabsichtigter Verwendung variieren. Die Festlegung der geeigneten Dosierung oder Art der Verabreichung fällt in den Wissensbereich eines gewöhnlichen Arztes. Tierexperimente liefern verlässliche Bezugswerte für die Bestimmung wirksamer Dosen zur Behandlung von Menschen. Die Umrechnung von wirksamen Dosen zwischen verschiedenen Spezies kann gemäß den Prinzipien, die von J. Mordenti und W. Chappell, "The use of interspecies scaling in toxicokinetics", in: Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al. (Hrsg.), Pergamon Press, New York, 42-96 (1989), festgelegt wurden, erfolgen.
Wird In-vivo-Verabreichung eines PRO-Polypeptids oder eines Agonisten oder Antagonisten davon verwendet, so können normale Dosierungsmengen von etwa 10 ng/kg bis zu 100 mg/kg Säugetierkörpergewicht oder mehr pro Tag, vorzugsweise von etwa 1 μg/kg/Tag bis zu 10 mg/kg/Tag, je nach Art der Verabreichung variieren. Leitfäden zu den bestimmten Dosierungen und Verabreichungsverfahren werden in der Literatur bereitgestellt; siehe z.B. die US-Patente Nr. 4.657.760; 5.206.344 oder 5.225.212. Es wird vorausgesetzt, dass verschiedene Formulierungen für verschiedene Behandlungsverbindungen und verschiedene Erkrankungen wirksam sind, dass die Verabreichung, die beispielsweise für ein Organ oder Gewebe bestimmt ist, eine andere Art der Verabreichung erforderlich machen kann als die Verabreichung an ein anderes Organ oder Gewebe.
Ist Retard-Verabreichung eines PRO-Polypeptids in einer Formulierung mit Freisetzungseigenschaften erwünscht, die zur Behandlung jeder beliebigen Erkrankung oder jedes beliebigen Leidens geeignet sind, die oder das Verabreichung des PRO-Polypeptids erfordert, so wird Mikroeinkapselung des PRO-Polypeptids erwogen. Mikroeinkapselung von rekombinanten Proteinen für verzögerte Freisetzung wurde mit menschlichem Wachstumshormon (rhGH), Interferon- (rhIFN-), Interleukin-2 und MN rgp120 bereits erfolgreich durchgeführt. Johnson et al., Nat. Med. 2, 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther. 27, 1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology 8, 755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems", in: Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell & Newman (Hrsg.), Plenum Press: New York, 439-462 (1995); WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; und das US-Patent Nr. 5.654.010.
Die Retard-Formulierungen dieser Proteine wurden unter Verwendung von Poly-Milch-Coglykolsäure- (PLGA-) Polymer aufgrund seiner Biokompatibilität und seinen umfassenden biologisch abbaubaren Eigenschaften entwickelt. Die Abbauprodukte von PLGA, Milch- und Glykolsäuren, können im menschlichen Körper rasch entsorgt werden. Darüber hinaus kann die Abbaubarkeit dieses Polymers je nach seinem Molekulargewicht und seiner Zusammensetzung von Monaten bis hin zu Jahren eingestellt werden. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer", in: M. Chasin & R. Langer (Hrsg.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, New York, 1-41 (1990).
Diese Erfindung umfasst Verfahren zum Screenen von Verbindungen, um jene zu identifizieren, die das PRO-Polypeptid nachahmen (Agonisten) oder die Wirkung des PRO-Polypeptids unterbinden (Antagonisten). Screeningtests für Antagonisten-Wirkstoffkandidaten werden entworfen, um Verbindungen zu identifizieren, die sich an die PRO-Polypeptide binden oder mit ihnen Komplexe bilden, für die die hierin identifizierten Gene kodieren, oder die sonst die Wechselwirkung der kodierten Polypeptide mit anderen zellulären Proteinen stören. Solche Screeningtests umfassen Tests, die für High-Throughput-Screenen von chemischen Bibliotheken zugänglich sind, wodurch sie sich besonders gut zur Identifikation niedermolekularer Wirkstoffkandidaten eignen.
Die Tests können in zahlreichen verschiedenen Formaten durchgeführt werden, einschließlich Protein-Protein-Bindungstests, biochemischer Screeningtests, Immuntests und zellbasierter Tests, die auf dem Gebiet der Erfindung eingehend beschrieben sind.
Alle Tests für Antagonisten gleichen sich darin, dass sie das Kontaktieren des Wirkstoffkandidaten mit einem PRO-Polypeptid, für das eine hierin identifizierte Nucleinsäure kodiert, unter Bedingungen und eine ausreichende Zeit lang erfordert, um diese zwei Komponenten in Wechselwirkung zu setzen.
Bei Bindungstests manifestiert sich die Wechselwirkung in Form einer Bindung, und der gebildete Komplex kann im Reaktionsgemisch isoliert oder nachgewiesen werden. In einer bestimmten Ausführungsform wird das durch das hierin identifizierte Gen kodierte PRO-Polypeptid oder der Wirkstoffkandidat an einer festen Phase, z.B. einer Mikrotiterplatte, durch kovalente oder nicht-kovalente Bindungen immobilisiert. Nicht-kovalente Bindung erfolgt im Allgemeinen durch Beschichten der festen Oberfläche mit einer Lösung des PRO-Polypeptids und Trocknen. Alternativ dazu kann ein immobilisierter Antikörper, z.B. ein monoklonaler Antikörper, der für das zu immobilisierende PRO-Polypeptid spezifisch ist, verwendet werden, um es an einer festen Oberfläche zu verankern. Der Test wird durch Zusetzen der nicht-immobilisierten Komponente, die mit einer nachweisbaren Markierung markiert werden kann, zur immobilisierten Komponente, z.B. der beschichteten Oberfläche, die die verankerte Komponente aufweist, durchgeführt. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, werden die nicht umgesetzten Komponenten z.B. durch Waschen entfernt, und die an der festen Oberfläche verankerten Komplexe werden nachgewiesen. Trägt die ursprünglich nicht-immobilisierte Komponente eine nachweisbare Markierung, so weist die Detektion von an der Oberfläche immobilisierter Markierung darauf hin, dass Komplexbildung stattgefunden hatte. Trägt die ursprünglich nicht-immobilisierte Komponente keine Markierung, kann Komplexbildung beispielsweise durch Verwendung ei nes markierten Antikörpers, der den immobilisierten Komplex spezifisch bindet, nachgewiesen werden.
Zeigt die Kandidatenverbindung mit einem bestimmten PRO-Polypeptid, für das das hierin identifizierte Gen kodiert, Wechselwirkung, bindet sich jedoch nicht daran, so kann ihre Wechselwirkung mit diesem Polypeptid mittels zur Detektion von Protein-Protein-Wechselwirkungen bekannter Verfahren getestet werden. Solche Tests umfassen herkömmliche Ansätze, wie z.B. Vernetzung, Co-Immunfällung und Co-Reinigung mittels Gradienten oder chromatographischer Säulen. Darüber hinaus können Protein-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung eines auf Hefe basierenden genetischen Systems beobachtet werden, das von Fields & Mitarbeitern (Fields & Song, Nature (London) 340, 245-246 (1989)); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)), beschrieben wurde, wie von Chevray & Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991), offenbart. Zahlreiche Transkriptionsaktivatoren, wie z.B. Hefe GAL4, bestehen aus zwei physikalisch getrennten modularen Domänen, wobei die eine als die DNA-Bindungsdomäne und die andere als die Transkriptions-Aktivierungsdomäne agiert. Das in den obigen Veröffentlichungen beschriebene Hefeexpressionssystem (im Allgemeinen als das "Zweihybridsystem" bezeichnet) profitiert von dieser Eigenschaft und verwendet zwei Hybridproteine, eines, in dem das Targetprotein an die DNA-Bindungsdomäne von GAL4 fusioniert ist, und ein zweites; in dem Kandidaten-Aktivierungsproteine an die Aktivierungsdomäne fusioniert sind. Die Expression von einem GAL1-IacZ-Reportergen unter der Kontrolle eines GAL4-aktivierten Promotors hängt von der Wiederherstellung von GAL4-Aktivität über Protein-Protein-Wechselwirkung ab. Kolonien, die wechselwirkende Polypeptide enthalten, werden mit einem chromogenen Substrat für β-Galactosidase nachgewiesen. Ein vollständiges Set (MATCHMAKER^TM) zur Identifikation von Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen zwei spezifischen Proteinen unter Verwendung des Zweihybridverfahrens ist im Handel bei Clontech erhältlich. Dieses System kann auch ausgedehnt werden, um Proteindomänen zu kartieren, die in spezifische Protein-Wechselwirkungen involviert sind, sowie Aminosäurereste, die für diese Wechselwirkungen maßgeblich sind, genau zu lokalisieren.
Verbindungen, die Wechselwirkungen eines Gens, das für ein hierin identifiziertes PRO-Polypeptid kodiert, und anderer intra- oder extrazellulärer Komponenten stören, können wie folgt getestet werden: üblicherweise wird ein Reaktionsgemisch hergestellt, das das Produkt des Gens und der intra- oder extrazellulären Komponente unter solchen Bedingungen und über eine bestimmte Zeitspanne hinweg enthält, die Wechselwirkung und Bindung der zwei Produkte ermöglicht. Um die Fähigkeit einer Kandidatenverbindung zu testen, Bindung zu hemmen, wird die Reaktion in Abwesenheit und in Gegenwart der Testverbindung durchgeführt. Weiters kann ein Placebo zu einem dritten Reaktionsgemisch zugesetzt werden, das als positive Kontrolle dient. Die Bindung (Komplexbildung) zwischen der Testverbindung und der intra- oder extrazellulären Komponente, die im Gemisch vorhanden sind, wird wie zuvor beschrieben beobachtet. Die Bildung eines Komplexes in der/den Kontrollreaktion(en), jedoch nicht im Reaktionsgemisch, das die Testverbindung enthält, weist darauf hin, dass die Testverbindung die Wechselwirkung der Testverbindung und ihres Reaktionspartners stört.
Um auf Antagonisten zu testen, kann das PRO-Polypeptid gemeinsam mit der auf eine bestimmte Aktivität zu screenenden Verbindung zu einer Zelle zugesetzt werden, und die Fähigkeit der Verbindung, die Aktivität von Interesse in Gegenwart des PRO-Polypetpids zu hemmen, weist darauf hin, dass die Verbindung ein Antagonist gegenüber dem PRO-Polypeptid ist. Alternativ dazu können Antagonisten durch Kombinieren des PRO-Polypeptids und eines potenziellen Antagonisten mit membrangebundenen PRO-Polypeptidrezeptoren oder rekombinanten Rezeptoren unter für einen Konkurrenzhemmungstest geeigneten Bedingungen nachgewiesen werden. Das PRO-Polypeptid kann markiert werden, beispielsweise durch Radioaktivität, sodass die Anzahl an PRO-Polypeptidmolekülen, die an den Rezeptor gebunden sind, verwendet werden kann, um die Wirksamkeit des potenziellen Antagonisten zu bestimmen. Das für den Rezeptor kodierende Gen kann durch zahlreiche verschiedene Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, beispielsweise durch Liganden-Panning und FACS-Sortieren, identifiziert werden. Coligan et al., Current Protocols in Immun. 1(2), Kapitel 5 (1991). Vorzugsweise wird Expressionsklonieren verwendet, wobei polyadenylierte RNA aus einer Zelle hergestellt wird, die auf ein PRO-Polypeptid reagiert, und eine cDNA-Bibliothek, die aus dieser RNA hergestellt wird, in Pools aufgeteilt und verwendet wird, um COS-Zellen oder andere Zellen zu transfizieren, die auf das PRO-Polypeptid nicht reagieren. Transfizierte Zellen, die auf Glasobjektträgern gezüchtet werden, werden markiertem PRO-Polypeptid ausgesetzt. Das PRO-Polypetpid kann durch zahlreiche verschiedene Mittel markiert sein, einschließlich Iodierung oder Einschluss einer Erkennungsstelle für eine ortsspezifische Proteinkinase. Nach Fixierung und Inkubation werden die Objektträger autoradiographischer Analyse unterzogen. Positive Pools werden identifiziert, und Sub-Pools werden unter Verwendung eines interaktiven Sub-Pooling- und Re-Screening-Verfahrens hergestellt und neu transfiziert, was schließlich einen einzelnen Klon ergibt, der für den mutmaßlichen Rezeptor kodiert.
Als ein alternativer Ansatz für Rezeptoridentifikation kann markiertes PRO-Polypeptid mittels Photoaffinität mit Zellmembran oder mit Extraktpräparaten, die das Rezeptormolekül exprimieren, verbunden werden. Vernetztes Material wird durch PAGE aufgelöst, und ein Röntgenfilm wird damit belichtet. Der markierte Komplex, der den Rezeptor enthält, kann ausgeschnitten, in Peptidfragmente aufgelöst und Proteinmikrosequenzieren unterzogen werden. Die mittels Mikrosequenzierens gewonnene Aminosäuresequenz würde dann verwendet werden, um eine Reihe von degenerierten Oligonucleotid-Sonden zu entwerfen, um eine cDNA-Bibliothek zu screenen und hierdruch das für den mutmaßlichen Rezeptor kodierende Gen zu identifizieren.
In einem anderen Test für Antagonisten werden Säugetierzellen oder ein Membranpräparat, das den Rezeptor exprimiert, mit markiertem PRO-Polypeptid in Gegenwart der Kandidatenverbindung inkubiert. Die Fähigkeit der Verbindung, diese Wechselwirkung zu fördern oder zu blockieren, kann dann gemessen werden.
Spezifischere Beispiele für potenzielle Antagonisten umfassen ein Oligonucleotid, das sich an die Fusionen von Immunglobulin mit PRO-Polypeptid bindet, und insbesondere Antikörper einschließlich, ohne dadurch eine Einschränkung darzustellen, poly- und monoklonaler Antikörper und Antikörperfragmente, einkettiger Antikörper, anti-idiotypischer Antikörper und chimärer oder humanisierter Versionen solcher An tikörper oder Fragmente sowie menschlicher Antikörper und Antikörperfragmente. Alternativ dazu kann ein potentieller Antagonist ein nahe verwandtes Protein, beispielsweise eine mutierte Form des PRO-Polypeptids, das den Rezeptor erkennt, jedoch keine Wirkung verleiht, sein und dabei die Wirkung des PRO-Polypeptids kompetitiv hemmen.
Ein anderer potenzieller PRO-Polypeptidantagonist ist ein Antisense-RNA- oder -DNA-Konstrukt, hergestellt unter Verwendung von Antisense-Technologie, worin z.B. ein Antisense-RNA- oder -DNA-Molekül so wirkt, dass es die Translation von mRNA durch Hybridisieren an Target-mRNA und Unterbinden von Proteintranslation blockiert. Antisense-Technologie kann verwendet werden, um Genexpression durch Tripelhelix-Bildung oder durch Antisense-DNA oder -RNA zu steuern, wobei beide Verfahren auf Bindung eines Polynucleotids an DNA oder RNA basieren. Beispielsweise wird der 5'-Kodierabschnitt der Polynucleotidsequenz, die für die reifen PRO-Polypeptide hierin kodiert, verwendet, um ein Antisense-RNA-Oligonucleotid mit einer Länge von etwa 10 bis 40 Basenpaare zu entwerfen. Ein DNA-Oligonucleotid wird so entworfen, dass es komplementär zu einer Region des Gens ist, das in Transkription eingebunden ist (Tripelhelix – siehe Lee et al., Nucl. Acids. Res. 6, 3073 (1979); Cooney et al., Science 241, 456 (1988); Dervan et al., Science 251, 1360 (1991)), wodurch Transkription und die Produktion des PRO-Polypeptids unterbunden werden. Das Antisense-RNA-Oligonucleotid hybridisiert an die mRNA in vivo und blockiert Translation des mRNA-Moleküls zum PRO-Polypeptid (Antisense – Okano, Neurochem. 56, 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press: Boca Raton, FL (1988)). Die zuvor beschriebenen Oligonucleotide können auch Zellen zugeführt werden, sodass die Antisense-RNA oder -DNA in vivo exprimiert werden kann, um Produktion des PRO-Polypeptids zu hemmen. Wird Antisense-DNA verwendet, so werden Oligodesoxyribonucleotide, die von der Translationsstartstelle, z.B. zwischen den Positionen von etwa –10 und +10 der Targetgen-Nucleotidsequenz, abstammen, bevorzugt.
Potenzielle Antagonisten umfassen kleine Moleküle, die sich an die aktive Stelle, die Rezeptorbindungsstelle oder den Wachstumsfaktor oder eine andere relevante Bin dungsstelle des PRO-Polypeptids binden, wodurch die normale biologische Aktivität des PRO-Polypeptids blockiert wird. Beispiele für kleine Moleküle umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, kleine Peptide oder peptidähnliche Moleküle, vorzugsweise lösliche Peptide, und synthetische, organische oder anorganische Nichtpeptidyl-Verbindungen.
Ribozyme sind enzymatische RNA-Moleküle, die in der Lage sind, die spezifische Spaltung von RNA zu katalysieren. Ribozyme wirken durch sequenzspezifische Hybridisierung an die komplementäre Target-RNA, gefolgt von endonucleolytischer Spaltung. Spezifische Ribozym-Spaltungsstellen innerhalb eines potenziellen RNA-Targets können durch bekannte Verfahren identifiziert werden. Für nähere Details siehe z.B. Rossi, Current Biology 5, 469-471 (1994), und die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/33551 (veröffentlicht am 18. September 1997).
Nucleinsäuremoleküle in Tripelhelix-Formation, die verwendet werden, um Transkription zu hemmen, sollten einzelsträngig und aus Desoxynucleotiden zusammengesetzt sein. Die Basenzusammensetzung dieser Oligonucleotide ist so bestimmt, dass sie Tripelhelix-Formation gemäß den Hoogsteen-Basenpaarungsregeln fördert, die im Allgemeinen relativ große Abschnitte mit Purinen oder Pyrimidinen an einem Strang eines Duplex erfordern. Für nähere Details siehe z.B. die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/33551, s.o.
Diese kleinen Moleküle können durch einen oder mehrere der Screeningtests, die hierin erläutert werden, und/oder durch irgendein anderes Screeningverfahren, das Fachleuten bekannt ist, identifiziert werden.
F. Anti-PRO-Antikörper
Die vorliegende Erfindung stellt weiters Anti-PRO-Antikörper bereit. Beispiele für solche Antikörper schließen polyklonale, monoklonale, humanisierte, bispezifische und heterokonjugierte Antikörper ein.
1. Polyklonale Antikörper
Die Anti-PRO-Antikörper können polyklonale Antikörper umfassen. Verfahren zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern sind Fachleuten bekannt. Polyklonale Antikörper können in einem Säugetier, beispielsweise durch eine oder mehrere Injektionen eines immunisierenden Mittels und, sofern erwünscht, eines Adjuvans, gezüchtet werden. Typischerweise wird das immunisierende Mittel und/oder das Adjuvans dem Säugetier durch multiple subkutane oder intraperitoneale Injektionen injiziert. Das immunisierende Mittel kann das PRO-Polypeptid oder ein Fusionsprotein davon umfassen. Es kann nützlich sein, das immunisierende Mittel an ein Protein zu konjugieren, das dafür bekannt ist, im zu immunisierenden Tier immunogen zu sein. Beispiele für solche immunogenen Proteine umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyroglobulin und Sojabohnentrypsininhibitor. Beispiele für Adjuvanzien, die verwendet werden können, umfassen komplettes Freundsches Adjuvans und MPL-TDM-Adjuvans (Monophosphoryl-Lipid A, synthetisches Trehalosedicorynomycolat). Die Arbeitsvorschrift zur Immunisierung kann von Fachleuten ohne übermäßiges Experimentieren ausgewählt werden.
2. Monoklonale Antikörper
Die Anti-PRO-Antikörper können alternativ zu polyklonalen Antikörpern monoklonale Antikörper sein. Monoklonale Antikörper können unter Verwendung von Hybridomverfahren, wie beispielsweise jenen, die von Kohler & Milstein, Nature 356, 495 (1975), beschrieben werden, hergestellt werden. In einem Hybridomverfahren wird eine Maus, ein Hamster oder ein anderes geeignetes Wirttier typischerweise mit ei nem immunisierenden Mittel immunisiert, um Lymphozyten hervorzubringen, die Antikörper produzieren oder zu produzieren in der Lage sind, die sich spezifisch an das immunisierende Mittel binden. Alternativ dazu können die Lymphozyten in vitro immunisiert werden.
Das immunisierende Mittel umfasst typischerweise das PRO-Polypeptid oder ein Fusionsprotein davon. Im Allgemeinen werden entweder Lymphozyten des peripheren Bluts ("PBLs"), sofern Zellen menschlichen Ursprungs erwünscht sind, oder Milzzellen oder Lymphknotenzellen verwendet, sofern nicht-menschliche Säugetierquellen erwünscht sind. Die Lymphozyten werden dann mit einer sich unbegrenzt vermehrenden Zelllinie unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels, wie z.B. Polyethylenglykol, fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 59-103 (1986)]. Sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind üblicherweise transformierte Säugetierzellen, insbesondere Myelomzellen von Nagetieren, Rindern und Menschen. Üblicherweise werden Ratten- oder Mausmyelomzelllinien verwendet. Die Hybridomzellen können in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert werden, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben der nicht fusionierten, sich unbegrenzt vermehrenden Zellen hemmen. Fehlt beispielsweise den Ausgangszellen das Enzym Hypoxanthinguaninphosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT), so umfasst das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin ("HAT-Medium"), Substanzen, die das Wachstum von HGPRT-defizienten Zellen unterbindet.
Bevorzugte, sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind jene, die wirksam fusionieren, die stabile hochgradige Expression von Antikörper durch die ausgewählten, Antikörper produzierenden Zellen fördern und die auf ein Medium wie beispielsweise HAT-Medium empfindlich sind. Noch bevorzugtere, sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind Maus-Myelomlinien, die beispielsweise beim Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien, und bei der American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, erhalten werden können. Menschliche Myelom- und Maus-Mensch-Heteromyelomzelllinien wurden auch für die Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern beschrieben [Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, 51-63 (1987)].
Das Kulturmedium, in dem die Hybridomzellen kultiviert werden, kann dann auf die Gegenwart von monoklonalen Antikörpern, die gegen PRO gerichtet sind, getestet werden. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität von monoklonalen Antikörpern, die durch die Hybridomzellen produziert werden, durch Immunfällung oder durch einen In-vitro-Bindungstest, wie beispielsweise Radioimmuntest (RIA) oder enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA), bestimmt. Solche Verfahren und Tests sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann beispielsweise durch die Scatchard-Analyse von Munson & Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt werden.
Nachdem die erwünschten Hybridomzellen identifiziert wurden, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und mittels herkömmlicher Verfahren gezüchtet werden [Goding, s.o.]. Geeignete Kulturmedien für diesen Zweck umfassen beispielsweise Dulbecco's Modified Eagle's Medium und RPMI-1640-Medium. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in vivo als Aszites in einem Säugetier gezüchtet werden.
Die monoklonalen Antikörper, die durch die Subklone sekretiert werden, können aus dem Kulturmedium oder der Ascitesflüssigkeit durch herkömmliche Immunglobulinreinigungsverfahren, wie beispielsweise Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie, isoliert oder gereinigt werden.
Die monoklonalen Antikörper können auch durch DNA-Rekombinationsverfahren, wie jenen, die im US-Patent Nr. 4.816.567 beschrieben werden, hergestellt werden. DNA, die für die monoklonalen Antikörper der Erfindung kodiert, kann leicht isoliert und unter Verwendung herkömmlicher Verfahren (z.B. unter Verwendung von Oligonucleotidsonden, die in der Lage sind, sich spezifisch an Gene zu binden, die für die schweren und leichten Ketten von Maus-Antikörper kodieren) sequenziert werden. Die Hybridomzellen der Erfindung dienen als eine bevorzugte Quelle für solche DNA. Nachdem sie isoliert wurde, kann die DNA in Expressionsvektoren platziert werden, die dann in Wirtszellen wie beispielsweise Affen-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstock- (CHO-) Zellen oder Myelomzellen transfiziert werden, die sonst kein Immunglobulinprotein produzieren, um die Synthese von monoklonalen Antikörpern in den rekombinanten Wirtszellen zu erreichen. Die DNA kann auch beispielsweise durch Substituieren der Kodiersequenz für menschliche Schwer- und Leichtketten-Konstantdomänen anstelle der homologen Maus-Sequenzen [US-Patent Nr. 4.816.567; Morrison et al., s.o.] oder durch kovalentes Binden der gesamten oder eines Teils der Kodiersequenz für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid an die Immunglobulin-Kodiersequenz modifiziert werden. Solch ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid kann anstelle der konstanten Domänen eines Antikörpers der Erfindung oder anstelle der variablen Domänen einer Antigen-Bindungsstelle eines Antikörpers der Erfindung eingesetzt werden, um einen zweiwertigen Hybridantikörper zu bilden.
Die Antikörper können einwertige Antikörper sein. Verfahren zur Herstellung einwertiger Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Beispielsweise umfasst ein Verfahren rekombinante Expression von Immunglobulin-Leichtkette und modifizierter Schwerkette. Die Schwerkette ist im Allgemeinen an einem beliebigen Punkt in der Fc-Region trunkiert, sodass Schwerketten-Vernetzung unterbunden wird. Alternativ dazu werden die relevanten Cysteinreste durch einen anderen Aminosäurerest substituiert oder werden deletiert, um Vernetzung zu unterbinden.
In-vitro-Verfahren sind auch zur Herstellung einwertiger Antikörper geeignet. Verdau von Antikörpern zur Produktion von Fragmenten davon, vorzugsweise Fab-Fragmenten, kann gemäß herkömmlichen Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, durchgeführt werden.
3. Menschliche und humanisierte Antikörper
Die Anti-PRO-Antikörper der Erfindung können weiters humanisierte Antikörper oder menschliche Antikörper umfassen. Humanisierte Formen von nicht-menschlichen (z.B. Maus-) Antikörpern sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z.B. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere Antigen-bindende Subsequenzen von Antikörpern), die eine Mindest-Sequenz, abgeleitet aus nicht-menschlichem Immunglobulin, enthalten. Humanisierte Antikörper umfassen menschliche Immunglobuline (Akzeptorantikörper), in denen Reste aus einer kom plementaritätsbestimmenden Region (CDR) des Akzeptors durch Reste aus einer CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Donorantikörper) wie Maus, Ratte oder Kaninchen mit der erwünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt werden. In manchen Fällen werden Fv-Gerüstreste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Humanisierte Antikörper können auch Reste umfassen, die weder im Akzeptorantikörper noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen zu finden sind. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen die gesamte von zumindest einer, und typischerweise zwei, variablen Domänen, in denen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen jenen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulin-Consensussequenz sind. Die humanisierten Antikörper umfassen im besten Fall auch zumindest einen Abschnitt einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jenen eines menschlichen Immunglobulins [Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596 (1992)].
Verfahren zur Humanisierung nicht-menschlicher Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste auf, die in ihn aus einer Quelle eingeführt wurden, die nicht-menschlich ist. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden oft als "Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise aus einer variablen "Import"-Domäne genommen werden. Humanisierung kann im Wesentlichen gemäß dem Verfahren von Winter und Mitarbeiter [Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988)] durch Substituieren von Nagetier-CDRs- oder -CDR-Sequenzen anstelle der entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durchgeführt werden. Demgemäß sind solche "humanisierten" Antikörper Hybridantikörper (US-Patent Nr. 4.816.567), worin wesentlich weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch die entsprechende Sequenz aus einer nicht-menschlichen Spezies substituiert wurde. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche Antikörper, in denen manche CDR-Reste und möglicherweise manche FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen in Nagetierantikörpern ersetzt sind.
Menschliche Antikörper können auch unter Verwendung verschiedener Techniken, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, einschließlich Phagendisplay-Bibliotheken [Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)] hergestellt werden. Die Verfahren von Cole et al. und Boerner et al. sind auch zur Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern geeignet [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, S. 77 (1985), und Boerner et al., J. Immunol. 147(1), 86-95 (1991)]. Demähnlich können menschliche Antikörper durch Einführen menschlicher Immunglobulinloci in transgene Tiere, z.B. Mäuse, in denen die endogenen Immunglobulingene teilweise oder vollständig deaktiviert wurden, hergestellt werden. Bei Provokation wird menschliche Antikörperproduktion beobachtet, die jener in allen Aspekten sehr stark ähnlich ist, die in Menschen selbst beobachtet wurde, einschließlich Genneuanordnung, Anordnung und Antikörperrepertoire. Dieser Ansatz wird beispielsweise in den US-Patenten Nr. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016 und den folgenden wissenschaftlichen Publikationen beschrieben: Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368, 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 65-93 (1995).
4. Bispezifische Antikörper
Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise menschliche oder humanisierte, Antikörper, die Bindungsspezifitäten für zumindest zwei verschiedene Antigene aufweisen. Im vorliegenden Fall ist eine der Bindungsspezifitäten für das PRO, die andere ist für jedes beliebige andere Antigen, und vorzugsweise für ein(en) Zelloberflächen-Protein oder -Rezeptor oder eine Rezeptoruntereinheit.
Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Herkömmlicherweise basiert die Produktion von bispezifischen Antikörpern auf der Co-Expression von zwei Immunglobulin-Schwerketten/Leichtketten-Paaren, worin die zwei schweren Ketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen [Milstein & Cuello, Nature 305, 537-539 (1983)]. Aufgrund der zufälligen Auswahl an Immunglobulinschwer- und -leichtketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein potenzielles Gemisch von zehn verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten Moleküls erfolgt üblicherweise durch Affinitätschromatographieschritte. Ähnliche Verfahren sind in der WO 93/08829, veröffentlicht am 13. Mai 1993, und in Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655-3659 (1991), offenbart.
Variable Antikörperdomänen mit den erwünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Kombinationsstellen) können an Immunglobulinkonstantdomänen-Sequenzen fusioniert werden. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer Immunglobulin-Schwerkettenkonstantdomäne, umfassend zumindest einen Teil der Gelenks-, CH2- und CH3-Regionen. Es wird bevorzugt, dass die erste Schwerketten-Konstantregion (CH1) die Stelle enthält, die für Leichtkettenbindung, vorhanden in zumindest einer der Fusionen, erforderlich ist. DNAs, die für die Immunglobulin-Schwerkettenfusionen und, sofern erwünscht, für die Immunglobulin-Leichtkette kodieren, werden in getrennte Expressionsvektoren insertiert und werden in geeignete Wirtsorganismen co-transfiziert. Für nähere Details zur Herstellung von bispezifischen Antikörpern siehe beispielsweise Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
Gemäß einem anderen Ansatz, der in der WO 96/27011 beschrieben wird, kann die Grenzfläche zwischen einem Paar von Antikörpermolekülen bearbeitet werden, um den Prozentsatz an Heterodimeren, die aus rekombinanter Zellkultur gewonnen werden, zu maximieren. Die bevorzugte Grenzfläche umfasst zumindest einen Teil der CH3-Region einer konstanten Antikörperdomäne. In diesem Verfahren werden eine oder mehr kurze Aminosäureseitenketten von der Grenzfläche des ersten Antikörpermoleküls durch längere Seitenketten (z.B. Tyrosin oder Tryptophan) ersetzt. Kompensations-"Hohlräume" von identischer oder ähnlicher Größe wie die lange(n) Seitenkette(n) werden an der Grenzfläche des zweiten Antikörpermoleküls durch Ersetzen der langen Aminosäureseitenketten durch kürzere (z.B. Alanin oder Threonin) geschaffen. Dies liefert einen Mechanismus zur Steigerung der Ausbeute des Heterodimers im Vergleich zu unerwünschten Endprodukten wie beispielsweise Homodimeren.
Bispezifische Antikörper können als Volllängenantikörper oder Antikörperfragmente (z.B. bispezifische F(ab')₂-Antikörper) hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper aus Antikörperfragmenten wurden in der Literatur bereits beschrieben. Beispielsweise können bispezifische Antikörper unter Verwendung chemischer Bindung hergestellt werden. Brennan et al., Science 229, 81 (1985), beschreiben ein Verfahren, worin intakte Antikörper proteolytisch gespaltet werden, um F(ab')₂-Fragmente zu bilden. Diese Fragmente werden in Gegenwart des Dithiol-Komplexbildners Natriumarsenit reduziert, um vicinale Dithiole zu stabilisieren und intermolekulare Disulfidbildung zu unterbinden. Die gebildeten Fab'-Fragmente werden dann zu Thionitrobenzoat- (TNB-) Derivaten umgesetzt. Eines der Fab'-TNB-Derivate wird dann zum Fab'-Thiol durch Reduktion mit Mercaptoethylamin rekonvertiert und mit einer äquimolaren Menge des anderen Fab'-TNB-Derivats vermischt, um den bispezifischen Antikörper zu bilden. Die produzierten bispezifischen Antikörper können als Mittel für die selektive Immobilisierung von Enzymen verwendet werden.
Fab'-Fragmente können direkt aus E. coli gewonnen und chemisch gebunden werden, um bispezifische Antikörper zu bilden. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217-225 (1992), beschreiben die Produktion eines vollständig humanisierten bispezifischen F(ab')₂-Antikörper-Moleküls. Jedes Fab'-Fragment wurde separat aus E. coli sekretiert und gerichteter chemischer Bindung in vitro unterzogen, um den bispezifischen Antikörper zu bilden. Der so gebildete bispezifische Antikörper war in der Lage, sich an Zellen zu binden, die den ErbB2-Rezeptor überexprimierten, sowie an normale menschliche T-Zellen, und konnte die lytische Aktivität menschlicher zytotoxischer Lymphozyten gegen menschliche Brusttumortargets steigern.
Verschiedene Techniken zur Herstellung und Isolation bispezifischer Antikörperfragmente direkt aus rekombinanten Zellkulturen wurden auch beschrieben. Beispielsweise wurden bispezifische Antikörper unter Verwendung von Leucin-Zipper hergestellt. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5), 1547-1553 (1992). Die Leucin-Zipper-Peptide aus den Fos- und Jun-Proteinen wurden an die Fab'-Abschnitte von zwei verschiedenen Antikörpern durch Genfusion gebunden. Die Antikörper-Homodimere wurden an der Gelenksregion reduziert, um Monomere zu bilden, und dann reoxidiert, um die Antikörper-Heterodimere zu bilden. Dieses Verfahren kann auch zur Herstellung von Antikörper-Homodimeren verwendet werden. Die von Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448 (1993), beschriebene "Diabody"-Technologie stellt einen alternativen Mechanismus zur Herstellung bispezifischer Antikörperfragmente bereit. Die Fragmente umfassen eine variable Schwerkettendomäne (V_H), die über einen Linker an eine variable Leichtkettendomäne (V_L) gebunden ist, der zu kurz ist, um Paarung zwischen den zwei Domänen an derselben Kette zu ermöglichen. Demgemäß werden die V_H- und V_L-Domänen eines Fragments gezwungen, Paare mit den komplementären V_L- und V_H-Domänen eines anderen Fragments zu bilden, wodurch zwei Antigen-Bindungsstellen gebildet werden. Auch eine andere Vorgehensweise zur Herstellung bispezifischer Antikörperfragmente durch die Verwendung von einkettigen Fv- (sFv-) Dimeren wurde bereits beschrieben. Siehe Gruber et al., J. Immunol. 152, 5368 (1994).
Antikörper mit mehr als zwei Wertigkeiten werden ebenfalls erwogen. Beispielsweise können trispezifische Antikörper hergestellt werden. Tutt et al., J. Immunol. 147, 60 (1991).
Beispielhafte bispezifische Antikörper können sich an zwei verschiedene Epitope an einem gegebenen PRO-Polypeptid der vorliegenden Erfindung binden. Alternativ dazu kann ein Anti-PRO-Polypeptidarm mit einem Arm kombiniert werden, der sich an ein Trigger-Molekül an einem Leukozyten wie beispielsweise ein T-Zellrezeptormolekul (z.B. CD2, CD3, CD28 oder B7) oder Fc-Rezeptoren für IgG (FcγR), wie z.B. FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) und FcγRIII (CD16), bindet, sodass zelluläre Abwehrmechanismen auf die Zelle fokussiert werden, die das bestimmte PRO-Polypeptid exprimiert. Bispezifische Antikörper können auch verwendet werden, um zytotoxische Mittel zu Zellen lokalisieren, die ein bestimmtes PRO-Polypeptid exprimieren. Diese Antikörper besitzen einen PRO-Bindungsarm und einen Arm, der ein zytotoxisches Mittel oder einen Radionuclidchelatbildner bindet, wie z.B. EOTUBE, DPTA, DOTA oder TETA. Ein anderer bispezifischer Antikörper von Interesse bindet das PRO-Polypeptid und bindet weiters Gewebefaktor (tissue factor, TF).
5. Heterokonjugierte Antikörper
Heterokonjugierte Antikörper liegen auch im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Heterokonjugierte Antikörper setzen sich aus zwei kovalent gebundenen Antikörpern zusammen. Solche Antikörper wurden beispielsweise vorgeschlagen, um Immunsystemzellen auf unerwünschte Zellen zu richten [US-Patent Nr. 4.676.980] sowie zur Behandlung von HIV-Infektion [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089 ]. Es wird erwogen, dass die Antikörper in vitro unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet der synthetischen Proteinchemie bekannt sind, hergestellt werden können, einschließlich jener, die Vernetzungsmittel einbinden. Beispielsweise können Immunotoxine unter Verwendung einer Disulfid-Austauschreaktion oder durch Bildung einer Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele für geeignete Reagenzien für diesen Zweck umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat sowie jene Reagenzien, die beispielsweise im US-Patent Nr. 4.676.980 offenbart sind.
6. Effektorfunktionsbearbeitung
Es kann wünschenswert sein, den Antikörper der Erfindung hinsichtlich der Effektorfunktion zu modifizieren, um z.B. die Wirksamkeit des Antikörpers bei der Behandlung von Krebs zu steigern. Beispielsweise können ein oder mehrere Cysteinreste in die Fc-Region eingeführt werden, wodurch die Bildung von Disulfidbindungen zwischen den Ketten in dieser Region ermöglicht wird. Der so gebildete homodimere Antikörper kann verbesserte Internalisierungsfähigkeit und/oder gesteigertes komplementvermitteltes Zelltöten und antikörpervermittelte zelluläre Zytotoxizität (ADCC) aufweisen. Siehe Caron et al., J. Exp. Med. 176, 1191-1195 (1992), und Shopes, J. Immunol. 148, 2918-2922 (1992). Homodimere Antikörper mit gesteigerter Anti-Tumor-Aktivität können auch unter Verwendung heterobifunktioneller Vernetzer hergestellt werden, wie in Wolff et al., Cancer Research 53, 2560-2565 (1993), beschrieben wird. Alternativ dazu kann ein Antikörper so bearbeitet werden, dass er duale Fc-Regionen aufweist und dadurch über gesteigerte Komplementlyse- und ADCC-Fähigkeiten verfügen kann. Siehe Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3, 219-230 (1989).
7. Immunkonjugate
Die Erfindung betrifft auch Immunkonjugate, die einen Antikörper umfassen, der an ein zytotoxisches Mittel wie beispielsweise ein chemotherapeutisches Mittel, Toxin (z.B. ein enzymatisch aktives Toxin oder ein Toxin bakteriellen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs oder auch von Pilzen oder Fragmente davon) oder an ein radioaktives Isotop (d.h. ein Radiokonjugat) konjugiert ist.
Chemotherapeutische Mittel, die zur Herstellung solcher Immunkonjugate nützlich sind, wurden oben beschrieben. Enzymatisch aktive Toxine und Fragmente davon, die verwendet werden können, umfassen Diphtherie-A-Kette, nichtbindende aktive Fragmente von Diphtherietoxin, Exotoxin-A-Kette (aus Pseudomonas aeruginosa), Ricin-A-Kette, Abrin-A-Kette, Modeccin-A-Kette, alpha-Sarcin, Aleurites-fordii-Proteine, Dianthin-Proteine, Phytolaca-americana-Proteine (PAPI, PAPII und PAP S); Momordica-charantia-Inhibitor, Curcin, Crotin, Sapaonaria-officinalis-Inhibitor, Gelonin, Mitogellin, Restrictocin, Phenomycin, Enomycin und die Tricothecene. Zahlreiche verschiedene Radionuclide sind zur Herstellung von radiokonjugierten Antikörpern erhältlich. Beispiele umfassen ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y und ¹⁸⁶Re. Konjugate des Antikörpers und des zytotoxischen Mittels werden unter Verwendung zahlreicher verschiedener bifunktioneller Proteinbindungsmittel wie z.B. N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionat (SPDP), Iminothiolan (IT), bifunktionellen Derivaten von Imidoestern (wie z.B. Dimethyladipimidat-HCl), aktiver Ester (wie z.B. Disuccinimidylsuberat), Aldehyden (wie Glutaraldehyd), Bisazido-Verbindungen (wie z.B. Bis(p-azidobenzoyl)hexandiamin), Bisdiazonium-Derivaten (wie z.B. Bis(p-diazoniumbenzoyl)ethylendiamin), Diisocyanaten (wie Toluol-2,6-diisocyanat) und bis-aktiven Fluorverbindungen (wie z.B. 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol) hergestellt. Beispielsweise kann ein Ricinimmunotoxin wie in Vitetta et al., Science 238, 1098 (1987), beschrieben hergestellt werden. C-14-markierte 1-Isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylentriaminpentaessigsäure (MX-DTPA) ist ein beispielhafter Chelatbildner zur Konjugation von Radionucleotid an den Antikörper. Siehe die WO 94/11026.
In einer anderen Ausführungsform kann der Antikörper an einen "Rezeptor" (wie Streptavidin) zur Verwendung bei Tumor-Pretargeting konjugiert werden, worin das Antikörper-Rezeptor-Konjugat dem Patienten verabreicht wird, gefolgt von der Entfernung ungebundenen Konjugats aus dem Blutkreislauf unter Verwendung eines Klärungsmittels und der anschließenden Verabreichung eines "Liganden" (z.B. Avidin), der an ein zytotoxisches Mittel (z.B. ein Radionucleotid) konjugiert ist.
8. Immunoliposomen
Die hierin offenbarten Antikörper können auch als Immunoliposomen formuliert werden. Liposomen, die den Antikörper enthalten, werden durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren hergestellt, wie sie beispielsweise in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030 (1980); und den US-Patenten Nr. 4.485.045 und 4.544.545 beschrieben wer den. Liposomen mit gesteigerter Zirkulationsdauer sind im US-Patent Nr. 5.013.556 offenbart.
Besonders nützliche Liposomen können durch das Umkehrphasenverdampfungsverfahren mit einer Lipidzusammensetzung, die Phosphatidylcholin, Cholesterin und PEG-derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (PEG-PE) umfasst, hergestellt werden. Liposomen werden durch Filter von definierter Porengröße filtriert, um Liposomen mit dem erwünschten Durchmesser zu ergeben. Fab'-Fragmente des Antikörpers der vorliegenden Erfindung können an die Liposomen wie in Martin et al., J. Biol. Chem. 257, 286-288 (1982), beschrieben mittels einer Disulfid-Austauschreaktion konjugiert werden. Ein chemotherapeutisches Mittel (wie beispielsweise Doxorubicin) ist gegebenenfalls im Liposom enthalten. Siehe Gabizon et al., J. National Cancer. Inst. 81(19), 1484 (1989).
9. Pharmazeutische Zusammensetzungen von Antikörpern
Antikörper, die sich spezifisch an ein hierin identifizierters PRO-Polypeptid binden, sowie andere Moleküle, die durch die zuvor offenbarten Screeningtests identifiziert wurden, können zur Behandlung von verschiedenen Erkrankungen in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden.
Ist das PRO-Polypeptid intrazellulär und werden ganze Antikörper als Inhibitoren verwendet, werden internalisierende Antikörper bevorzugt. Es können jedoch auch Lipofektionen oder Liposomen verwendet werden, um den Antikörper oder ein Antikörperfragment in Zellen bereitzustellen. Werden Antikörperfragmente verwendet, so wird das kleinste Inhibitionsfragment, das sich spezifisch an die Bindungsdomäne des Targetproteins bindet, bevorzugt. Beispielsweise können auf Grundlage der Sequenzen der variablen Regionen eines Antikörpers Peptidmoleküle entworfen werden, die die Fähigkeit beibehalten, die Target-Proteinsequenz zu binden. Solche Peptide können chemisch synthetisiert und/oder durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden. Siehe z.B. Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993). Die Formulierung hierin kann auch mehr als nur eine aktive Ver bindung als für die bestimmte zu behandelnde Indikation erforderlich ist enthalten, vorzugsweise jene mit komplementären Aktivitäten, die sich gegenseitig nicht negativ beeinflussen. Alternativ oder zusätzlich dazu kann die Zusammensetzung ein Mittel umfassen, das ihre Funktion steigert, wie beispielsweise ein zytotoxisches Mittel, ein chemotherapeutisches Mittel oder ein wachstumshemmendes Mittel. Solche Moleküle sind geeigneterweise in Kombination vorhanden, und dies in Mengen, die für die beabsichtigten Zwecke wirksam sind.
Die aktiven Bestandteile können auch in Mikrokapseln eingekapselt werden, beispielsweise durch Koazervierungsverfahren oder durch Grenzflächenpolymerisation, z.B. in Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln, in kolloidale Wirkstoffzufuhrsysteme (z.B. Liposome, Albuminmikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanopartikeln und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen. Solche Verfahren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, s.o., offenbart.
Die Formulierungen, die zur In-vivo-Verabreichung verwendet werden, müssen steril sein. Dies kann leicht mittels Filtration durch sterile Filtermembranen erreicht werden.
Es können Retardpräparate hergestellt werden. Geeignete Beispiele für Retardpräparate umfassen semipermeable Matrizen von festen hydrophoben Polymeren, die den Antikörper enthalten, wobei die Matrizen in Form von Formstücken, z.B. Filmen oder Mikrokapseln, vorliegen. Beispiele für Retard-Matrizen umfassen Polyester, Hydrogele (z.B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide (US-Patent Nr. 3.773.919), Copolymere von L-Glutaminsäure und ☐-Ethyl-L-glutamat, nicht abbaubares Ethylenvinylacetat, abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere wie z.B. LUPRON DEPOT^TM (injizierbare Mikrokügelchen, zusammengesetzt aus Milch-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat) und Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure. Während Polymere wie z.B. Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure die Freisetzung von Molekülen über eine Zeitspanne von 100 Tagen ermöglichen, setzen bestimmte Hydrogele Proteine über kürzere Zeitspannen hinweg frei. Verbleiben eingekapselte Antikörper über eine längere Zeit im Körper, so kön nen sie als ein Resultat von Aussetzung gegenüber Feuchtigkeit bei 37 °C denaturieren oder aggregieren, was zu einem Verlust von biologischer Aktivität und möglichen Veränderungen der Immunogenität führen kann. Je nach vorliegendem Mechanismus können rationale Vorgehensweisen zur Stabilisierung entwickelt werden. Stellt der Aggregationsmechanismus beispielsweise intermolekulare S-S-Bindungsbildung durch Thiodisulfidaustausch dar, so kann Stabilisierung durch Modifikation von Sulfhydrylresten, Lyophilisierung aus sauren Lösungen, Steuerung des Feuchtigkeitsgehalts, Verwendung geeigneter Additive und Entwicklung spezifischer Polymermatrizenzusammensetzungen erreicht werden.
G. Verwendungen für Anti-PRO-Antikörper
Die Anti-PRO-Antikörper der Erfindung haben verschiedene Einsatzbereiche. Beispielsweise können Anti-PRO-Antikörper in Diagnosetests für PRO, z.B. zur Detektion seiner Expression in spezifischen Zellen, Geweben oder Serum, verwendet werden. Verschiedene Diagnosetestverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, können verwendet werden, wie beispielsweise Konkurrenzbindungstests, direkte oder indirekte Sandwichtests und Immunfällungstests, die entweder in heterogenen oder in homogenen Phasen durchgeführt werden [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., 147-158 (1987)]. Die in Diagnosetests verwendeten Antikörper können mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert werden. Die nachweisbare Gruppierung sollte in der Lage sein, entweder direkt oder indirekt ein nachweisbares Signal abzugeben. Beispielsweise kann die nachweisbare Gruppierung ein Radioisotop, wie z.B. ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S oder ¹²⁵I, eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Verbindung, wie z.B. Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin, oder ein Enzym, wie z.B. alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder Meerrettichperoxidase, sein. Jedes beliebige Verfahren, das auf dem Gebiet der Erfindung zur Konjugation des Antikörpers an die nachweisbare Gruppierung bekannt ist, kann verwendet werden, einschließlich jener Verfahren, die von Hunter et al., Nature 144, 945 (1962); David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981); und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982), beschrieben werden.
Anti-PRO-Antikörper sind auch zur Affinitätsreinigung von PRO aus rekombinanter Zellkultur oder natürlichen Quellen nützlich. In diesem Verfahren werden die Antikörper gegen PRO an einem geeigneten Träger, wie z.B. Sephadexharz oder Filterpapier, unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren immobilisiert. Der immobilisierte Antikörper wird dann mit einer Probe kontaktiert, die das zu reinigende PRO enthält, und hiernach wird der Träger mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen, das im Wesentlichen das gesamte Material in der Probe unter Ausnahme des PRO, das an den immobilisierten Antikörper gebunden ist, entfernt. Schließlich wird der Träger mit einem anderen geeigneten Lösungsmittel gewaschen, der das PRO vom Antikörper freisetzt.
Die folgenden Beispiele werden ausschließlich als Veranschaulichung bereitgestellt und sollen den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung in keiner Weise einschränken.
BEISPIELE
Im Handel erhältliche Reagenzien, auf die in den Beispielen verwiesen wird, wurden, außer anders angemerkt; gemäß den Vorschriften der Hersteller verwendet. Die Quelle jener Zellen, die in den folgenden Beispielen und in der gesamten Beschreibung durch ATCC-Zugriffsnummern identifiziert werden, ist die American Type Culture Collection, Manassas, VA.
BEISPIEL 1: Screening von extrazellulärer Domänenhomologie zur Identifikation neuer Polypeptide und von cDNA, die dafür kodiert
Die extrazellulären Domänen- (ECD-) Sequenzen (einschließlich der Sekretionssignalsequenz, sofern vorhanden) aus etwa 950 bekannten sekretierten Proteinen aus der öffentlich zugänglichen Swiss-Prot-Datenbank wurden verwendet, um EST-Datenbasen zu durchsuchen. Die EST-Datenbanken umfassten öffentliche Datenbanken (z.B. Dayhoff, GenBank) und private Datenbanken (z.B. LIFESEQ^TM, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA). Die Suche wurde unter Verwendung des Compu terprogramms BLAST oder BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996)) in Form eines Vergleichs der ECD-Proteinsequenzen mit einer 6-Raster-Translation der EST-Sequenzen durchgeführt. Diese Vergleiche mit einem BLAST-Score von 70 (oder in manchen Fällen von 90) oder mehr, die nicht für bekannte Proteine kodierten, wurden gruppiert und mit dem Programm "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, WA) zu Consensus-DNA-Sequenzen angeordnet.
Unter Verwendung dieses Homologie-Screens der extrazellulären Domänen wurden Consensus-DNA-Sequenzen in Bezug auf die anderen identifizierten EST-Sequenzen unter Verwendung von phrap angeordnet. Weiters wurden die erhaltenen Consensus-DNA-Sequenzen häufig (jedoch nicht immer) mittels Wiederholungszyklen von BLAST oder BLAST-2 und phrap verlängert, um die Consensus-Sequenz so weit wie möglich unter Verwendung der Quellen von zuvor erläuterten EST-Sequenzen zu verlängern.
Auf Grundlage der wie zuvor beschrieben erhaltenen Consensus-Sequenzen wurden Oligonucleotide anschließend synthetisiert und verwendet, um mittels PCR eine cDNA-Bibliothek zu identifizieren, die die Sequenz von Interesse enthielt, und wurden auch als Sonden eingesetzt, um einen Klon der Volllängen-Kodiersequenz für ein PRO-Polypeptid zu isolieren. Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Primer weisen im Allgemeinen 20 bis 30 Nucleotide auf und sind oft so beschaffen, dass sie ein PCR-Produkt mit einer Länge von etwa 100-1.000 bp ergeben. Die Sondensequenzen weisen typischerweise eine Länge von 40-55 bp auf. In manchen Fällen werden zusätzliche Oligonucleotide synthetisiert, wenn die Consensussequenz länger als etwa 1-1,5 kbp ist. Um mehrere Bibliotheken auf einen Volllängenklon zu screenen, wurde DNA aus den Bibliotheken durch PCR-Amplifikation, wie von Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, beschrieben, mit dem PCR-Primerpaar gescreent. Eine positive Bibliothek wurde dann verwendet, um unter Verwendung des Sonden-Oligonucleotids und eines der Primerpaare Klone zu isolieren, die für das Gen von Interesse kodieren.
Die cDNA-Bibliotheken, die zur Isolation der cDNA-Klone verwendet wurden, wurden mittels herkömmlicher Verfahren unter Verwendung von im Handel erhältlichen Reagenzien wie jenen von Invitrogen, San Diego, CA, konstruiert. Die cDNA wurde mit Oligo-dT, das eine NotI-Stelle enthielt, geprimt, mit dem Blunt-Ende an hemikinasierte SalI-Adaptoren gebunden, mit NotI gespaltet, auf geeignete Weise durch Gelelektrophorese klassiert und in einer definierten Ausrichtung in einen geeigneten Kloniervektor (wie z.B. pRKB oder pRKD; pRK5B ist ein Vorläufer von pRK5D, der die SfiI-Stelle nicht enthält; siehe Holmes et al., Science 253, 1278-1280 (1991)) in den einmaligen XhoI- und NotI-Stellen kloniert.
BEISPIEL 2: Isolierung von cDNA-Klonen durch Amylase-Screening
1. Herstellung von Oligo-dT-geprimter cDNA-Bibliothek
mRNA wurde aus einem menschlichen Gewebe von Interesse unter Verwendung von Reagenzien und Arbeitsvorschriften von Invitrogen, San Diego, CA, (Fast Track 2) isoliert. Diese RNA wurde verwendet, um eine Oligo-dT-geprimte cDNA-Bibliothek im Vektor pRK5D unter Verwendung von Reagenzien und Arbeitsvorschriften von Life Technologies, Gaithersburg, MD, (Super Script Plasmid System) zu bilden. In diesem Verfahren wurde die doppelsträngige cDNA zu einer Größe von mehr als 1.000 bp dimensioniert, und die SalI/NotI-gebundene cDNA wurde in XhoI/NotI-gespalteten Vektor kloniert. pRK5D ist ein Kloniervektor, der eine sp6-Transkriptionsstartstelle aufweist, gefolgt von einer SfiI-Restriktionsenzymstelle, die den XhoI/NotI-cDNA-Klonierstellen vorangeht.
2. Herstellung von zufällig geprimter cDNA-Bibliothek
Es wurde eine Sekundär-cDNA-Bibliothek gebildet, die vorzugsweise die 5'-Enden der primären cDNA-Klone aufweisen sollte. Sp6-RNA wurde aus der Primärbibliothek (zuvor beschrieben) gebildet, und diese RNA wurde verwendet, um eine zufällig geprimte cDNA-Bibliothek im Vektor pSST-AMY.0 unter Verwendung von Reagenzien und Arbeitsvorschriften von Life Technologies (Super Script Plasmid System, s.o.) herzustellen. In diesem Verfahren wurde die doppelsträngige cDNA auf 500- 1.000 bp dimensioniert, mit dem Blunt-Ende über Linker an NotI-Adaptoren gebunden, mit SfiI gespaltet und in SfiI/NotI-gespalteten Vektor kloniert. pSST-AMY.0 ist ein Kloniervektor, der einen Hefealkohol-Dehydrogenasepromotor aufweist, der den cDNA-Klonierstellen und der Maus-Amylasesequenz (der reifen Sequenz ohne das Sekretionssignal) vorangeht, gefolgt von dem Hefealkohol-Dehydrogenaseterminator nach den Klonierstellen. Somit führen cDNAs, die in diesen Vektor kloniert wurden und in Raster mit Amylasesequenz fusioniert sind, zur Sekretion von Amylase aus auf geeignete Weise transfizierten Hefekolonien.
3. Transformation und Detektion
DNA aus der in Absatz 2 oben beschriebenen Bibliothek wurde auf Eis gekühlt, der elektrokompetente DH10B-Bakterien (Life Technologies, 20 ml) zugesetzt wurden. Die Bakterien und das Vektorgemisch wurden dann gemäß der Empfehlung des Herstellers Elektrophorese unterzogen. Daraufhin wurde SOC-Medium (Life Technologies, 1 ml) zugesetzt, und das Gemisch wurde bei 37 °C 30 Minuten lang inkubiert. Die Transformanten wurden auf 20 Standard-150-mm-LB-Platten, die Ampicillin enthielten, ausplattiert und 16 Stunden lang (37 °C) inkubiert. Positive Kolonien wurden von den Platten abgeschabt, und die DNA wurde aus dem bakteriellen Pellet unter Befolgung von Standard-Arbeitsvorschriften, z.B. CsCl-Gradienten, isoliert. Die gereinigte DNA wurde dann für die nachstehenden Hefe-Arbeitsvorschriften weiterverwendet.
Die Hefeverfahren wurden in drei Kategorien aufgeteilt: (1) Transformation von Hefe mit dem Plasmid/cDNA-Kombinationsvektor; (2) Detektion und Isolation von Hefeklonen, die Amylase sekretieren; und (3) PCR-Amplifikation des Inserts direkt aus der Hefekolonie und Reinigung der DNA zur Sequenzierung und näheren Analyse.
Der verwendete Hefestamm war HD56-5A (ATCC-90785). Dieser Stamm weist den folgenden Genotyp auf: MAT alpha, ura3-52, leu2-3, leu2-112, his3-11, his3-15, MAL⁺, SUC⁺, GAL⁺. Vorzugsweise können Hefemutanten verwendet werden, die defiziente, posttranslationale Stoffwechselwege aufweisen. Solche Mutanten können Translokations-defiziente Allele in sec71, sec72, sec62 aufweisen, wobei trunkierte sec71 am meisten bevorzugt ist. Alternativ dazu können auch Antagonisten (einschließlich Antisense-Nucleotide und/oder Liganden), die die normalen Aktivitäten dieser Gene stören, andere Proteine, die in diesen posttranslationalen Stoffwechselweg eingebunden sind (z.B. SEC61p, SEC72p, SEC62p, SEC63p, TDJ1p oder SSA1p-4p), oder die Komplexformation dieser Proteine vorzugsweise in Kombination mit der Amylase-exprimierenden Hefe verwendet werden.
Transformation erfolgte auf Grundlage der Arbeitsvorschrift, die von Gietz et al., Nucl. Acid. Res. 20, 1425 (1992), beschrieben wird. Transformierte Zellen wurden dann aus Agar in komplexes YEPD-Nährmedium (100 ml) inokuliert und über Nacht bei 30 °C wachsen gelassen. Das YEPD-Nährmedium wurde wie in Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 207 (1994), beschrieben hergestellt. Die Übernacht-Kultur wurde dann auf etwa 2 × 10⁶ Zellen/ml (etwa OD₆₀₀ = 0,1) in frischem YEPD-Nährmedium (500 ml) verdünnt und neuerlich auf 1 × 10⁷ Zellen/ml (etwa OD₆₀₀ = 0,4-0,5) wachsen gelassen.
Die Zellen wurden dann geerntet und durch Transfer in GS3-Rotorflaschen in einem Sorval-GS3-Rotor auf Transformation bei 5.000 U/min 5 Minuten lang vorbereitet, der Überstand wurde verworfen und dann in sterilem Wasser resuspendiert und wiederum in 50-ml-Falconröhrchen bei 3.500 U/min in einer Beckman-GS-6KR-Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und die Zellen wurden dann mit LiAc/TE (10 ml, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5, 100 mM Li₂OOCCH₃) gewaschen und in LiAc/TE (2,5 ml) resuspendiert.
Transformation fand durch Vermischen der vorbereiteten Zellen (100 μl) mit frisch denaturierter, einzelsträngiger Lachshoden-DNA (Lofstrand Labs, Gaithersburg, MD) und transformierender DNA (1 μg, Vol. < 10 μl) in Mikrozentrifugenröhrchen statt. Das Gemisch wurde kurz durch Verwirbeln vermischt, dann wurde 40%iges PEG/TE (600 μl, 40 % Polyethylenglykol-4000, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM Li₂OOCCH₃, pH 7,5) zugesetzt. Dieses Gemisch wurde leicht vermischt und bei 30 °C unter Schütteln 30 Minuten lang inkubiert. Die Zellen wurden dann bei 42 °C 15 Minuten lang einem Hitzeschock unterzogen, und das Reaktionsgefäß wurde in einer Mikrozentrifuge bei 12.000 U/min 5-10 Sekunden lang zentrifugiert, dekantiert und in TE (500 μl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) resuspendiert, woraufhin neuerliches Zentrifugieren folgte. Die Zellen wurden dann in TE (1 ml) verdünnt, und Aliquoten (200 μl) wurden auf das selektive Medium verteilt, das davor in 150-mm-Wachstumsplatten (VWR) vorbereitet wurde.
Alternativ dazu wurde anstelle von zahlreichen kleinen Reaktionen die Transformation unter Verwendung einer einzigen, großtechnischen Reaktion durchgeführt, worin Reagensmengen demgemäß angepasst wurden.
Das verwendete selektive Medium war ein synthetischer kompletter Dextroseagar, dem Uracil fehlte (SCD-Ura), hergestellt gemäß der Beschreibung von Kaiser et al. in: Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 208-210 (1994). Transformanten wurden bei 30 °C 2-3 Tage lang gezüchtet.
Die Detektion von Kolonien, die Amylase sekretierten, erfolgte durch Einbinden von roter Stärke in das selektive Wachstumsmedium. Stärke wurde an den roten Farbstoff (Reactive Red-120, Sigma) durch das Verfahren, das von Biely et al. in: Anal. Biochem. 172, 176-179 (1988), beschrieben wird, gebunden. Die gebundene Stärke wurde in die SCD-Ura-Agarplatten bei einer Endkonzentration von 0,15 % (Gew./Vol.) inkorporiert und wurde mit Kaliumphosphat auf einen pH von 7,0 gepuffert (50-100 mM Endkonzentration).
Die positiven Kolonien wurden aussortiert und über frischem selektivem Medium (auf 150-mm-Platten) ausgestrichen, um gut isolierte und identifizierbare einzelne Kolonien zu erhalten. Gut isolierte einzelne Kolonien, die bezüglich Amylasesekretion positiv waren, wurden durch direkte Inkorporation von roter Stärke in gepufferten SCD-Ura-Agar detektiert. Positive Kolonien wurden durch ihre Fähigkeit bestimmt, Stärke abzubauen, was zu einem klaren Lichthof um die positive Kolonie herum, der direkt sichtbar gemacht werden kann, führt.
4. Isolierung von DNA durch PCR-Amplifikation
Wurde eine positive Kolonie isoliert, so wurde ein Teil davon mit einem Zahnstocher aufgenommen und in sterilem Wasser (30 μl) in einer 96-Well-Platte verdünnt. Zu diesem Zeitpunkt wurden die positiven Kolonien entweder gefroren und zur weiteren Analyse gelagert oder sofort amplifiziert. Eine Aliquote von Zellen (5 μl) wurde als eine Matrize für die PCR-Reaktion in einem 25-μl-Volumen verwendet, das 0,5 μl Klentaq (Clontech, Palo Alto, CA); 4,0 μl 10 mM dNTP's (Perkin Elmer-Cetus); 2,5 μl Kentaq-Puffer (Clontech); 0,25 μl Vorwärts-Oligo 1; 0,25 μl Rückwärts-Oligo 2; und 12,5 μl destilliertes Wasser enthielt. Die Sequenz von Vorwärts-Oligonucleotid 1 lautete:
5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT-3'
(Seq.-ID Nr. 3)
Die Sequenz von Rückwärts-Oligonucleotid 2 lautete:
5'-CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT-3'
(Seq.-ID Nr. 4)
PCR wurde wie folgt durchgeführt:
Die unterstrichenen Regionen der Oligonucleotide anellierten an die ADH-Promotorregion bzw. die Amylaseregion und amplifizierten eine 307-bp-Region aus Vektor pSST-AMY.0, wenn kein Insert vorhanden war. Typischerweise enthielten die ersten 18 Nucleotide des 5'-Endes dieser Oligonucleotide Anellierungsstellen für die Sequenzierungsprimer. Somit betrug das Gesamtprodukt der PCR-Reaktion von einem leeren Vektor 343 bp. An Signalsequenz fusionierte cDNA resultierte jedoch in erheblich längeren Nucleotidsequenzen.
Nach der PCR wurde eine Aliquote der Reaktion (5 μl) durch Agarosegel-Elektrophorese in einem 1 %igen Agarosegel unter Verwendung eines Tris-Borat-EDTA- (TBE-) Puffersystem wie von Sambrook et al., s.o., beschrieben untersucht. Klone, die in einem einzelnen starken PCR-Produkt resultierten, das größer als 400 bp war, wurden nach Reinigung mit einer 96-Qiaquick-PCR-Reinigungssäule (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) weiter durch DNA-Sequenzieren analysiert.
BEISPIEL 3: Isolierung von cDNA-Klonen unter Verwendung von Signalalgorithmusanalyse
Verschiedene für Polypeptid kodierende Nucleinsäuresequenzen wurden durch Anwenden eines geschützten Signalsequenzfindungs-Algorithmus, entwickelt von Genentech, Inc., (South San Francisco, CA) an ESTs sowie gruppierten und angeordneten EST-Fragmenten aus öffentlichen (z.B. GenBank) und/oder privaten (LIFESEQ^®, Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA) Datenbanken identifiziert. Der Signalsequenzalgorithmus berechnet einen Sekretionssignalwert auf Grundlage der Eigenschaft der DNA-Nucleotide, die das erste und gegebenenfalls das zweite Methionincodon (ATG) am 5'-Ende der untersuchten Sequenz oder des untersuchten Sequenzfragments umgeben. Die Nucleotide, die an das erste ATG anschließen, müssen für zumindest 35 eindeutige Aminosäuren ohne jegliche Stoppcodons kodieren. Weist das erste ATG die erforderlichen Aminosäuren auf, so wird das zweite nicht untersucht. Wird keines der beiden den Anforderungen gerecht, so wird die Kandidatensequenz nicht bewertet. Um zu bestimmen, ob die EST-Sequenz eine authentische Signalsequenz enthält, werden die DNA und die entsprechenden Aminosäuresequenzen, die das ATG-Codon umgeben, unter Verwendung eines Sets von sieben Sensoren (Evaluationsparameter), die für ihre Assoziation mit Sekretionssig nalen bekannt sind, bewertet. Die Verwendung dieses Algorithmus führte zur Identifikation zahlreicher, für Polypeptid kodierender Nucleinsäuresequenzen.
BEISPIEL 4: Isolierung von cDNA-Klonen, die für menschliches PRO539 kodieren
Eine Consensus-DNA-Sequenz wurde in Bezug auf andere EST-Sequenzen unter Verwendung von phrap wie in Beispiel 1 beschrieben assembliert. Diese Consensus-Sequenz wird hierin als DNA41882 bezeichnet. Basierend auf der gezeigten DNA41882-Consensus-Sequenz wurden Oligonucleotide synthetisiert: 1) um durch PCR eine cDNA-Bibliothek zu identifizieren, die die Sequenz von Interesse enthält, und 2) zur Verwendung als Sonden, um einen Klon der Kodiersequenz voller Länge für PRO539 zu isolieren.
RNA zur Konstruktion der cDNA-Bibliotheken wurde aus menschlichem fötalem Nierengewebe isoliert. DNA-Sequenzieren der wie zuvor beschrieben isolierten Klone ergab die DNA-Sequenz voller Länge für PRO539 (hierin bezeichnet als DNA47465-1561 (1, Seq.-ID Nr. 1) und die abgeleitete Proteinsequenz für PRO539.
Die gesamte Nucleotidsequenz von DNA47465-1561 ist in 1 (Seq.-ID Nr. 1) gezeigt. Klon DNA47465-1561 enthält einen einzelnen offenen Leseraster mit einer eindeutigen Translationsstartstelle an Nucleotidpositionen 186-188 und endet mit dem Stoppcodon an Nucleotidpositionen 2676-2678 (1). Der vorhergesagte Polypeptidvorläufer ist 830 Aminosäuren lang (2). Das in 2 gezeigte PRO539-Protein voller Länge hat ein geschätztes Molekulargewicht von etwa 95.029 Da und einen pI von etwa 8,26. Analyse der in 2 gezeigten PRO539-Sequenz voller Länge (Seq.-ID Nr. 2) beweist die Gegenwart der folgenden Elemente: Leucinzipperstruktursequenzen von etwa Aminosäure 557 bis etwa Aminosäure 578 und von etwa Aminosäure 794 bis etwa Aminosäure 815, potenzielle N-Glykosylierungsstellen von etwa Aminosäure 133 bis etwa Aminosäure 136 und von etwa Aminosäure 383 bis etwa Aminosäure 386 und eine Kinesin-verwandte, superspiralisierte Protein-Kif-4-α-Helixdomäne von etwa Aminosäure 231 bis etwa Aminosäure 672. Der Klon DNA47465-1561 wurde bei der ATCC am 9. Februar 1999 hinterlegt und bekam die ATCC-Hinterlegungs-Nr. 203661 zugeteilt.
Eine Analyse der Dayhoff-Datenbank (Version 35.45 SwissProt 35) unter Verwendung einer WU-BLAST2-Sequenzabgleichanalyse der in 2 gezeigten Volllängensequenz (Seq.-ID Nr. 2) bewies die Homologie zwischen der PRO539-Aminosäuresequenz und den folgenden Dayhoff-Sequenzen: AF019250_1, KIF4-MOUSE, TRHY_HUMAN, A56514, G02520, MYSP_HUMAN, AF041382_1, A45592, HS125H2_1 und HS6802_2.
BEISPIEL 5: Genamplifikation
Dieses Beispiel zeigt, dass die für PRO539 kodierenden Gene im Genom bestimmter menschlicher Lungen-, Dickdarm- und/oder Brustkrebsarten und/oder -zelllinien amplifiziert werden. Amplifikation ist mit der Überexpression des Genprodukts assoziiert, was darauf hinweist, dass die Polypeptide nützliche Targets für therapeutische Eingriffe bei bestimmten Krebserkrankungen wie Dickdarm-, Lungen-, Brustkrebs und anderen Krebsarten und zur diagnostischen Bestimmung der Gegenwart dieser Krebsarten sind. Therapeutische Mittel können die Form von Antagonisten von PRO539-Polypeptid, beispielsweise die Form von Maus-Mensch-chimären, humanisierten oder menschlichen Antikörpern gegen ein PRO539-Polypeptid, annehmen.
Das Ausgangsmaterial für den Screen war genomische DNA, isoliert aus zahlreichen verschiedenen Karzinomen. Die DNA wurde präzise, z.B. mittels Fluorimetrie, quantifiziert. Als eine Negativkontrolle wurde DNA aus den Zellen von zehn normalen gesunden Personen isoliert, die gesammelt und als Testkontrolle für die Genkopie in gesunden Personen verwendet wurde (nicht dargestellt). Der 5'-Nucleasetest (TaqMan^TM beispielsweise) und quantitative Echtzeit-PCR (beispielsweise ABI Prizm 7700 Sequence Detection System^TM (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA)) wurden verwendet, um Gene zu finden, die sich in bestimmten Krebsarten potenziell amplifizierten. Die Resultate wurden verwendet, um zu bestimmen, ob die für PRO539 kodierende DNA in einem der primären Lungen- oder Dickdarmkarzinome oder einer der Dickdarmkrebszelllinien oder Brustkrebszelllinien, die gescreent wurden, im Übermaß vorhanden war. Die primären Lungenkarzinome wurden aus Personen mit Tumoren des in Tabelle 7 angegeben Typs und Stadiums gewonnen. Eine Erklärung der zur Bezeichnung der Primärtumoren, die in Tabelle 7 angeführt sind, und der Primärtumoren und -Zelllinien, die in diesem Beispiel erwähnt werden, verwendeten Abkürzungen ist nachstehend bereitgestellt.
Die Resultate des TaqMan^TM sind in delta- (Δ-) Ct-Einheiten angegeben. Eine Einheit entspricht 1 PCR-Zyklus oder etwa einer 2fachen Amplifikation in Bezug auf den Normalwert, zwei Einheiten entsprechen einer 4fachen, drei Einheiten einer 8fachen Amplifikation usw. Die Quantifizierung erfolgte unter Verwendung von Primern und einer fluoreszierenden TaqMan^TM-Sonde, die aus dem für PRO539 kodierenden Gen abgeleitet wurde. Regionen von PRO539, die sehr wahrscheinlich einmalige Nucleinsäuresequenzen enthalten und die am wenigsten wahrscheinlich ausgespleißte Intronen aufweisen, werden für die Primer- und Sondenderivatisierung bevorzugt, z.B. untranslatierte 3'-Regionen. Die Sequenzen für die Primer und Sonden (vorwärts, rückwärts und Sonde), die für die PRO539-Genamplifikations-Analyse verwendet wurden, waren die Folgenden:
PRO539 (DNA 47465-1561)

vorwärts 5'-TCCCACCACTTACTTCCATGAA-3' (Seq.-ID Nr. 5)
Sonde 5'-CTGTGGTACCCAATTGCCGCCTTGT-3' (Seq.-ID Nr. 6)
rückwärts 5'-ATTGTCCTGAGATTCGAGCAAGA-3' (Seq.-ID Nr. 7)

Die 5'-Nucleasetestreaktion ist ein auf PCR basiertes Fluoreszenz-Verfahren, die von der 5'-Exonucleaseaktivität von Taq-DNA-Polymeraseenzym profitiert, um Amplifikation in Echtzeit zu beobachten. Zwei Oligonucleotidprimer werden verwendet, um ein Amplikon zu schaffen, das für eine PCR-Reaktion typisch ist. Ein drittes Oligonucleotid, oder eine Sonde, wird entworfen, um Nucleotidsequenz zu detektieren, die zwischen den zwei PCR-Primern liegt. Die Sonde ist durch Taq-DNA-Polymeraseenzym nicht verlängerbar und ist mit einem Reporter-Fluoreszenzfarbstoff und einem Quencher-Fluoreszenzfarbstoff markiert. Jede beliebige Laser-induzierte Emission aus dem Reporterfarbstoff wird durch den Quenching-Farbstoff gequencht, wenn die zwei Farbstoffe an der Sonde eng beieinander angeordnet sind. Während der Amplifikationsreaktion spaltet das Taq-DNA-Polymeraseenzym die Sonde in einer Matrizen-abhängigen Weise. Die resultierenden Sondenfragmente dissoziieren in Lösung, und Signale aus dem freigesetzten Reporterfarbstoff sind frei von Quenching-Effekten des zweiten Fluorophors. Für jedes neue synthetisierte Molekül wird ein Molekül des Reporterfarbstoffs freigesetzt, und Detektion des nicht gequenchten Reporterfarbstoffs liefert die Grundlage für eine quantitative Interpretation der Daten.
Das 5'-Nucleaseverfahren wird an einer quantitativen Echtzeit-PCR-Vorrichtung wie beispielsweise der ABI Prism 7700TM Sequence Detection durchgeführt. Das System besteht aus einem Thermocycler, einem Laser, einer ladungsgekoppelten (CCD) Kamera und einem Computer. Das System amplifiziert Proben in einem 96-Well-Format an einem Thermocycler. Während der Amplifikation wird laserinduziertes, fluoreszierendes Signal in Echtzeit durch Glasfaserkabeln für alle 96 Wells gesammelt und an der CCD detektiert. Das System umfasst Software zum Betreiben des Instruments sowie zur Datenanalyse.
5'-Nucleasetestdaten werden anfänglich als Ct, also als Schwellenzyklus, ausgedrückt. Dieser ist als der Zyklus definiert, bei dem sich das Reportersignal über dem Hintergrundpegel von Fluoreszenz akkumuliert. Die ΔCt-Werte werden als quantitative Messung der relativen Anzahl an Ausgangskopien einer bestimmten Targetsequenz in einer Nucleinsäurenprobe verwendet, wenn Krebs-DNA-Resultate mit Resultaten für normale menschliche DNA verglichen werden.
Tabelle 7 beschreibt das Stadium, T-Stadium und N-Stadium, von verschiedenen Primärtumoren, die verwendet wurden, um die PRO539-Verbindungen der Erfindung zu screenen.
Tabelle 7 Profile von primären Lungen- und Dickdarmtumoren
DNA-Herstellung
DNA wurde aus kultivierten Zelllinien, Primärtumoren und normalem menschlichem Blut hergestellt. Die Isolierung wurde unter Verwendung eines Reinigungssets, Puffersets und von Protease, alles von Qiagen, unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers und der nachstehenden Beschreibung durchgeführt.
Zellkulturlyse:
Zellen wurden gewaschen und bei einer Konzentration von 7,5 × 10⁸ pro Spitze trypsiniert und durch Zentrifugieren bei 1.000 U/min 5 Minuten lang bei 4 °C pelletiert, woraufhin es wiederum mit ½ Volumen der PBS-Rezentrifugierung gewaschen wurde. Die Pellets wurden ein drittes Mal gewaschen, die suspendierten Zellen wurden gesammelt und 2× mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann in 10 ml PBS suspendiert. Puffer C1 wurde bei 4 °C äquilibriert. Qiagen-Protease Nr. 19155 wurde in 6,25 ml kaltes, doppelt destilliertes H₂O zu einer Endkonzentration von 20 mg/ml verdünnt und bei 4 °C äquilibriert. 10 ml von G2-Puffer wurden durch Verdünnen von Qiagen-RNase-A-Stammlösung (100 mg/ml) zu einer Endkonzentration von 200 μg/ml hergestellt.
Puffer C1 (10 ml, 4 °C) und ddH₂O (40 ml, 4 °C) wurden dann zu den 10 ml Zellsuspension zugesetzt, durch Umkehren vermischt und auf Eis 10 Minuten lang inkubiert. Die Zellnuclei wurden durch Zentrifugieren in einem Beckman-Ausschwingrotor bei 2.500 U/min bei 4 °C 15 Minuten lang pelletiert. Der Überstand wurde verworfen, und die Nuclei wurden mit einem Verwirbler in 2 ml Puffer C1 (bei 4 °C) und 6 ml ddH₂O suspendiert, gefolgt von einer zweiten Zentrifugation bei 4 °C bei 2.500 U/min 15 Minuten lang. Die Nuclei wurden dann in den restlichen Puffer unter Verwendung von 200 μl pro Spitze resuspendiert. G2-Puffer (10 ml) wurden zu den suspendierten Nuclei unter sanftem Verwirbeln zugesetzt. Während das Zusetzen von Puffer abgeschlossen wurde, wurde 30 Sekunden lang heftiges Verwirbeln eingesetzt. Qiagen-Protease (200 μl, hergestellt wie zuvor angegeben) wurden zugesetzt und bei 50 °C 60 Minuten lang inkubiert. Inkubation und Zentrifugation wurden wiederholt, bis die Lysate klar waren (z.B. Inkubation für zusätzliche 30-60 Minuten, Pelletieren bei 3.000 × g 10 min lang bei 4 °C).
Herstellung und Lyse fester menschlicher Tumorproben:
Tumorproben wurden gewogen, in konische 50-ml-Röhrchen platziert und auf Eis gehalten. Die Verarbeitung war auf nicht mehr als 250 mg Gewebe pro Präparat (1 Spitze/Präparat) eingeschränkt. Die Proteaselösung wurde durch Verdünnung in 6,25 ml kaltes ddH₂O zu einer Endkonzentration von 20 mg/ml frisch hergestellt und bei 4 °C gelagert. G2-Puffer (20 ml) wurde durch Verdünnung von DNase A zu einer Endkonzentration von 200 mg/ml (aus 100 mg/ml Stammlösung) hergestellt. Das Tumorgewebe wurde in 19 ml G2-Puffer 60 Sekunden lang unter Verwendung der großen Spitze des Polytron in einer Laminarströmungs-TC-Abzug homogenisiert, um Inhalation von Aerosolen zu vermeiden, und wurde bei Raumtemperatur gehalten. Zwischen den Proben wurde das Polytron durch Zentrifugieren 2 × 30 Sekunden lang jeweils in 2 l ddH₂O, gefolgt von G2-Puffer (50 ml), gereinigt. War Gewebe stets an der Generatorspitze vorhanden, so wurde die Vorrichtung auseinandergenommen und gereinigt.
Qiagen-Protease (hergestellt wie zuvor angegeben, 1,0 ml) wurde zugesetzt, gefolgt von Verwirbeln und Inkubation bei 50 °C 3 Stunden lang. Die Inkubation und Zentrifugation wurden solange wiederholt, bis die Lysate klar waren (z.B. Inkubieren für zusätzliche 30-60 Minuten, Pelletieren bei 3.000 × g 10 min lang, 4 °C).
Herstellung und Lyse von menschlichem Blut:
Gesunden freiwilligen Spendern wurde unter Verwendung herkömmlicher Arbeitsvorschriften für infektiöses Agens Blut abgenommen und in 10-ml-Proben pro Spitze citriert. Qiagen-Protease wurde durch Verdünnen in 6,25 ml kaltes ddH₂O zu einer Endkonzentration von 20 mg/ml frisch hergestellt und bei 4 °C gelagert. G2-Puffer wurde durch Verdünnen von RNase A zu einer Endkonzentration von 200 μg/ml aus 100 mg/ml Stammlösung hergestellt. Das Blut (10 ml) wurde in ein konisches 50-ml- Röhrchen platziert, und 10 ml C1-Puffer und 30 ml ddH₂O (beides davor auf 4 °C äquilibriert) wurden zugesetzt, und die Komponenten wurden durch Umkehren vermischt und 10 Minuten lang auf Eis gehalten. Die Nuclei wurden mit einem Beckman-Ausschwingrotor bei 2.500 U/min bei 4 °C 15 Minuten lang pelletiert, und der Überstand wurde verworfen. Mit einer Zentrifuge wurden die Nuclei in 2 ml C1-Puffer (4 °C) und 6 ml ddH₂O (4 °C) suspendiert. Zentrifugieren wurde wiederholt, bis das Pellet weiß war. Die Nuclei wurden dann in den restlichen Puffer unter Verwendung einer 200-μl-Spitze suspendiert. G2-Puffer (10 ml) wurden zu den suspendierten Nuclei unter sanftem Zentrifugieren zugesetzt, woraufhin heftiges Zentrifugieren für 30 Sekunden folgte. Qiagen-Protease wurde zugesetzt (200 μl) und bei 50 °C 60 Minuten lang inkubiert. Inkubation und Zentrifugation wurden so lange wiederholt, bis die Lysate klar waren (z.B. Inkubieren für zusätzliche 30-60 Minuten, Pelletieren bei 3.000 × g 10 min lang, 4 °C).
Reinigung geklärter Lysate:
(1) Isolieren der genomischen DNA:
Genomische DNA wurde mit 10 ml QBT-Puffer (1 Probe pro Maxi-Spitzen-Präparat) äquilibriert. QF-Elutionspuffer wurde bei 50 °C äquilibriert. Die Proben wurden 30 Sekunden lang zentrifugiert, dann auf äquilibrierte Spitzen geladen und durch die Schwerkraft abgetropft. Die Spitzen wurden mit 2 × 15 ml QC-Puffer gewaschen. Die DNA wurde in 30 ml silanisierte, im Autoklav behandelte 30-ml-Corex-Röhrchen mit 15 ml QF-Puffer (50 °C) eluiert. Isopropanol (10,5 ml) wurde jeder Probe zugesetzt, die Röhrchen wurden mit Paraffin bedeckt und durch wiederholtes Umdrehen durchgemischt, bis die DNA ausfiel. Proben wurden durch Zentrifugation im SS-34-Rotor bei 15.000 U/min 10 Minuten lang bei 4 °C pelletiert. Die Pellet-Platzierung wurde markiert und der Überstand verworfen, und 10 ml 70 % Ethanol (4 °C) wurden zugesetzt. Die Proben wurden erneut durch Zentrifugieren im SS-34-Rotor bei 10.000 U/min 10 min lang bei 4 °C pelletiert. Die Pelletplatzierung wurde markiert und der Überstand verworfen. Die Röhrchen wurden dann an ihrer Seite an einem Trocken ständer platziert und 10 Minuten lang bei 37 °C getrocknet, wobei darauf geachtet wurde, dass die Proben nicht zu stark getrocknet wurden.
Nach dem Trocknen wurden die Pellets in 1,0 ml TE (pH 8,5) aufgelöst und bei 50 °C 1-2 Stunden lang ruhen gelassen. Die Proben wurden über Nacht auf 4 °C gehalten, wobei sich das Auflösen fortsetzte. Die DNA-Lösung wurde dann auf 1,5-ml-Röhrchen mit einer 26-Gauge-Nadel auf einer Tuberculinspritze übertragen. Die Übertragung wurde 5× wiederholt, um die DNA zu scheren. Die Proben wurden dann bei 50 °C 1-2 Stunden lang ruhen gelassen.
(2) Quantifizierung von genomischer DNA und Vorbereitung von Genamplifikationstests:
Die DNA-Konzentrationen in jedem Röhrchen wurden mittels Standard-A₂₆₀,A₂₈₀-Spektralphotometrie bei einer 1:20-Verdünnung (5 μl DNA + 95 μl ddH₂O) unter Verwendung der 0,1-ml-Quarzküvetten im Spektralphotometer DU640 von Beckman quantifiziert. A₂₆₀/A₂₈₀-Verhältnisse lagen im Bereich von 1,8-1,9. Jede DNA-Probe wurde dann weiter zu etwa 200 ng/ml in TE (pH 8,5) verdünnt. War das ursprüngliche Material hochkonzentriert (etwa 700 ng/μl), so wurde das Material bei 50 °C mehrere Stunden lang ruhen gelassen, bis es resuspendiert wurde.
Fluorimetrische DNA-Quantifizierung wurde dann am verdünnten Material (20-600 ng/ml) unter Verwendung der Anweisungen des Herstellers mit den nachstehenden Modifikationen durchgeführt. Dies erfolgte durch 15-minütiges Erwärmenlassen eines Hoeffer-DyNA-Quant-200-Fluorimeters. Die Farbstoffarbeitslösung von Hoechst (Nr. H33258, 10 μl, hergestellt innerhalb von 12 Stunden vor Verwendung) wurde in 100 ml 1 × TNE-Puffer verdünnt. Eine 2-ml-Küvette wurde mit der Fluorimeterlösung gefüllt, in die Maschine gegeben, und die Maschine wurde auf 0 eingestellt. pGEM 3Zf(+) (2 μl, Charge Nr. 360851026) wurde zu 2 ml Fluorimeterlösung zugesetzt und bei 200 Einheiten kalibriert. Zusätzliche 2 μl von pGEM-3Zf(+)-DNA wurden dann getestet und die Ablesung bei 400 +/– 10 Einheiten bestätigt. Jede Probe wurde dann zumindest in dreifacher Ausführung abgelesen. Wurde erkannt, dass die Werte von 3 Proben in einem Bereich von 10 % beieinander lagen, wurde ihr Mittelwert genommen, und dieser Wert wurde als der Quantifizierungswert verwendet.
Die mittels Fluorimetrie bestimmte Konzentration wurde dann verwendet, um jede Probe auf 10 ng/μl in ddH₂O zu verdünnen. Dies erfolgte gleichzeitig an allen Matrizenproben für einen einzelnen TaqMan-Plattentest und mit ausreichend Material, um 500-1.000 Tests durchzuführen. Die Proben wurden in dreifacher Ausführung mit TaqMan^TM-Primern und sowohl mit B-Actin- als auch mit GAPDH-Sonden an einer einzelnen Platte mit normaler menschlicher DNA und Nicht-Matrizen-Kontrollen getestet. Die verdünnten Proben wurden verwendet, vorausgesetzt, dass der CT-Wert normaler menschlicher DNA, subtrahiert von Test-DNA, +/– 1 Ct betrug. Die verdünnte, Chargen-qualifizierte genomische DNA wurde in 1,0-ml-Aliquoten bei –80 °C gelagert. Aliquoten, die in weiterer Folge in Genamplifikationstests zu verwenden waren, wurden bei 4 °C gelagert. Jede 1-ml-Aliquote ist ausreichend für 8-9 Platten oder für 64 Tests.
Genamplifikationstest:
Die PRO539-Verbindungen der Erfindung wurden in den folgenden Primärtumoren gescreent, und die resultierenden ΔCt-Werte über oder gleich 1,0 sind nachstehend in Tabelle 8 dargestellt. Tabelle 8 (ΔCt-Werte in Lungen- und Dickdarm-Primärtumormodellen)

Primärtumor PRO539

LT12 1,25

LT13 1,64, 1,08

LT15 1,78, 1,10

LT17 1,94, 1,01

LT19 1,16

LT21 1,32

CT3 1,17

CT10 1,16

CT12 1,19

CT15 1,03

CT11 1,12
BEISPIEL 6: Verwendung von PRO als eine Hybridisierungssonde
Das folgende Verfahren beschreibt die Verwendung einer für PRO kodierenden Nucleotidsequenz als Hybridisierungssonde.
DNA, die die Kodiersequenz von Volllängen- oder reifem PRO wie hierin offenbart umfasst, wird als eine Sonde zum Screenen auf homologe DNAs (wie jene, die für natürlich vorkommende Varianten von PRO kodieren) in cDNA-Bibliotheken aus menschlichem Gewebe oder genomischen Bibliotheken aus menschlichem Gewebe verwendet.
Hybridisieren und Waschen von Filtern, die beide Bibliotheks-DNAs enthalten, erfolgt unter den folgenden hochstringenten Bedingungen. Hybridisierung von radioaktiv markierter, von PRO abgeleiteter Sonde an die Filter erfolgt in einer Lösung von 50 % Formamid, 5× SSC, 0,1 % SDS, 0,1 % Natriumpyrophosphat, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 2× Denhardts Lösung und 10 % Dextransulfat bei 42 °C 20 Stun den lang. Waschen der Filter erfolgt in einer wässrigen Lösung von 0,1× SSC und 0,1 % SDS bei 42 °C.
DNAs mit einer erwünschten Sequenzidentität mit der DNA, die für Volllängen-Nativsequenz-PRO kodiert, kann dann unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, identifiziert werden.
BEISPIEL 7: Expression von PRO in E. coli
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung einer unglykosylierten Form von PRO durch rekombinante Expression in E. coli.
Die für PRO kodierende DNA-Sequenz wird anfänglich unter Verwendung von selektierten PCR-Primern amplifiziert. Die Primer sollten Restriktionsenzymstellen enthalten, die den Restriktionsenzymstellen am ausgewählten Expressionsvektor entsprechen. Zahlreiche verschiedene Expressionsvektoren können verwendet werden. Ein Beispiel für einen geeigneten Vektor ist pBR322 (abgeleitet von E. coli; siehe Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)), der Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz enthält. Der Vektor wird mit Restriktionsenzym verdaut und dephosphoryliert. Die PCR-amplifizierten Sequenzen werden dann in den Vektor ligiert. Der Vektor umfasst vorzugsweise Sequenzen, die für ein antibiotisches Resistenzgen kodieren, einen trp-Promotor, einen Polyhis-Leader (einschließlich der ersten sechs STII-Codons, Poly-his-Sequenz und Enterokinase-Spaltungsstelle), die PRO-Kodierregion, λ-Transkriptionsterminator und ein argU-Gen.
Das Ligationsgemisch wird dann verwendet, um einen ausgewählten E.-coli-Stamm unter Verwendung der in Sambrook et al., s.o., beschriebenen Verfahren zu transformieren. Transformanten werden durch ihrer Fähigkeit identifiziert, auf LB-Platten zu wachsen, und antibiotische resistente Kolonien werden dann ausgewählt. Plasmid-DNA kann isoliert und durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzieren bestätigt werden.
Ausgewählte Klone können über Nacht in flüssigem Kulturmedium wie beispielsweise LB-Nährmedium, ergänzt mit Antibiotika, gezüchtet werden. Die Übernacht-Kultur kann in weiterer Folge verwendet werden, um eine Kultur größeren Ausmaßes zu inokulieren. Die Zellen werden dann bis zu einer erwünschten optischen Dichte gezüchtet, währenddessen der Expressionspromotor aktiviert wird.
Nach dem Kultivieren der Zellen über mehrere weitere Stunden hinweg können die Zellen durch Zentrifugation geerntet werden. Das durch die Zentrifugation erhaltene Zellpellet kann unter Verwendung verschiedener, auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Mittel solubilisiert werden, und das solubilisierte PRO-Protein kann dann unter Verwendung einer Metallchelatbildnersäule unter Bedingungen, die feste Bindung des Proteins ermöglichen, gereinigt werden.
PRO kann in E. coli in einer poly-His-markierten Form unter Verwendung des folgenden Verfahrens exprimiert werden. Die für PRO kodierende DNA wird anfänglich unter Verwendung selektierter PCR-Primer amplifiziert. Die Primer enthalten Restriktionsenzymstellen, die den Restriktionsenzymstellen am ausgewählten Expressionsvektor entsprechen, sowie andere nützliche Sequenzen, die für wirksame und zuverlässige Translationsinitiation, rasche Reinigung an einer Metallchelatbildungssäule und proteolytische Entfernung mit Enterokinase sorgen. Die PCR-amplifizierten, poly-His-markierten Sequenzen werden dann in einen Expressionsvektor ligiert, der verwendet wird, um einen E.-coli-Wirt, basierend auf Stamm 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq)), zu transformieren. Transformanten werden zuerst in LB, das 50 mg/ml Carbenicillin enthält, bei 30 °C unter Schütteln gezüchtet, bis eine O.D.₆₀₀ von 3-5 erreicht ist. Kulturen werden dann 50- bis 100fach in CRAP-Medium (hergestellt durch Vermischen von 3,57 g (NH₄)₂SO₄, 0,71 g Natriumcitrat·2H₂O, 1,07 g KCl, 5,36 g Difco Hefeextrakt, 5,36 g Sheffield-Hycase SF in 500 ml Wasser sowie 110 mM MPOS, pH 7,3, 0,55 % (Gew./Vol.) Glucose und 7 mM MgSO₄) verdünnt und etwa 20-30 Stunden lang bei 30 °C unter Schütteln gezüchtet. Proben werden dann entnommen, um Expression durch SDS-PAGE-Analyse zu überprüfen, und der Hauptteil der Kultur wird zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Zellpellets werden bis zur Reinigung und Neufaltung eingefroren.
E.-coli-Paste aus 0,5- bis 1-l-Fermentationen (6-10 g Pellets) wird in 10 Volumina (Gew./Vol.) in 7 M Guanidin, 20 mM Tris, pH 8 (Puffer) resuspendiert. Festes Natriumsulfit und Natriumtetrathiosulfat werden zugesetzt, um Endkonzentrationen von 0,1 M bzw. 0,02 M zu erreichen, und die Lösung wird über Nacht bei 4 °C gerührt. Dieser Schritt führt zu einem denaturierten Protein, in dem alle Cysteinreste durch Sulfitolisierung blockiert sind. Die Lösung wird bei 40.000 U/min in einer Beckman-Ultrazentrifuge 30 min lang zentrifugiert. Der Überstand wird mit 3-5 Volumina Metallchelatsäulenpuffer (6 M Guanidin, 20 mM Tris, pH 7,4) verdünnt und durch 0,22-μm-Filter zur Klärung filtriert. Der geklärte Extrakt wird auf eine 5-ml-Qiagen-Ni-NTA-Metallchelatsäule geladen, die in Metallchelatsäulepuffer äquilibriert wurde. Die Säule wird mit zusätzlichem Puffer gewaschen, der 50 mM Imidazol (Calbiochem, Utrol-Gütegrad), pH 7,4, enthält. Das Protein wird mit Puffer, der 250 mM Imidazol enthält, eluiert. Die das erwünschte Protein enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und bei 4 °C gelagert. Die Proteinkonzentration wird durch sein Absorptionsvermögen bei 280 nm unter Verwendung des berechneten Extinktionskoeffizienten basierend auf seiner Aminosäuresequenz geschätzt.
Die Proteine werden durch Verdünnen der Probe langsam in frisch hergestellten Neufaltungspuffer, der aus 20 mM Tris, pH 8,6, 0,3 M NaCl, 2,5 M Harnstoff, 5 mM Cystein, 20 mM Glycin und 1 mM EDTA besteht, neu gefaltet. Neufaltungsvolumina werden so ausgewählt, dass die Endproteinkonzentration zwischen 50 und 100 μg/ml liegt. Die Neufaltungslösung wird sanft bei 4 °C 12-36 Stunden lang gerührt. Die Neufaltungsreaktion wird durch den Zusatz von TFA zu einer Endkonzentration von 0,4 % (pH etwa 3) gequencht. Vor weiterer Reinigung des Proteins wird die Lösung durch ein 0,22-μm-Filter filtriert, und Acetonitril wird zur Erreichung einer 2-10%igen Endkonzentration zugesetzt. Das neugefaltete Protein wird an einer Poros-R1/H-Umkehrphasensäule unter Verwendung eines mobilen Puffers von 0,1 % TFA mittels Elution mit einem Acetonitril-Gradienten von 10 bis 80 % chromatographiert. Aliquoten von Fraktionen mit A280-Absorption werden an SDS-Polyacrylamidgelen analysiert, und Fraktionen, die homogenes neugefaltetes Protein enthalten, werden gesammelt. Im Allgemeinen werden die korrekt gefalteten Spezies der meisten Proteine bei den niedrigsten Konzentrationen von Acetonitril eluiert, da diese Spezies mit ih rem hydrophoben Inneren am kompaktesten und vor Wechselwirkung mit dem Umkehrphasenharz geschützt sind. Aggregierte Spezies werden üblicherweise bei höheren Acetonitrilkonzentrationen eluiert. Zusätzlich zum Auflösen fehlgefalteter Formen von Proteinen aus der erwünschten Form entfernt der Umkehrphasenschritt auch Endotoxin aus den Proben.
Fraktionen, die das erwünschte gefaltete PRO-Polypeptid enthalten, werden gesammelt, und das Acetonitril wird unter Verwendung eines sanften Stickstoffstroms, der auf die Lösung gerichtet ist, entfernt. Proteine werden in 20 mM Hepes, pH 6,8. mit 0,14 M Natriumchlorid und 4 % Mannit durch Dialyse oder durch Gelfiltration unter Verwendung von G25-Superfine-Harzen (Pharmacia), äquilibriert im Formulierungspuffer, formuliert und steril filtriert.
Zahlreiche der in der EP 99962992.6 (WO 00/36102), von der diese Anmeldung eine Teilanmeldung ist, offenbarten PRO-Polypeptide wurden erfolgreich wie oben beschrieben exprimiert.
BEISPIEL 8: Expression von PRO in Säugetierzellen
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung einer potenziell glykosylierten Form von PRO durch rekombinante Expression in Säugetierzellen.
Der Vektor pRK5 (siehe die EP 307.247 , veröffentlicht am 15. März 1989) wird als der Expressionsvektor verwendet. Gegebenenfalls wird die PRO-DNA in pRK5 mit ausgewählten Restriktionsenzymen ligiert, um Insertion der PRO-DNA unter Verwendung von Ligationsverfahren, wie sie in Sambrook et al., s.o., beschrieben werden, zu ermöglichen. Der resultierende Vektor wird als pRK5-PRO bezeichnet.
In einer Ausführungsform können die ausgewählten Wirtszellen 293-Zellen sein. Menschliche 293-Zellen (ATCC CCL 1573) werden bis zur Konfluenz in Gewebekulturplatten in Medium wie z.B. DMEM, ergänzt mit fötalem Kälberserum und gegebenenfalls Nährstoffkomponenten und/oder Antibiotika, gezüchtet. Etwa 10 μg pRK5- PRO-DNA werden mit etwa 1 μg DNA, die für das VA-RNA-Gen kodiert [Thimmappaya et al., Cell 31, 543 (1982)], vermischt und in 500 μl von 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl₂ aufgelöst. Zu diesem Gemisch werden 500 μl von 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO₄ zugetropft, und ein Niederschlag wird 10 min lang bei 25 °C bilden gelassen. Der Niederschlag wird suspendiert, zu den 293-Zellen zugesetzt und etwa vier Stunden lang bei 37 °C absetzen gelassen. Das Kulturmedium wird abgesaugt, und 2 ml von 20 % Glycerin in PBS werden 30 Sekunden lang zugesetzt. Die 293-Zellen werden dann mit serumfreiem Medium gewaschen, frisches Medium wird zugesetzt, und die Zellen werden etwa 5 Tage lang inkubiert.
Etwa 24 Stunden nach den Transfektionen wird das Kulturmedium entfernt und durch Kulturmedium (alleine) oder Kulturmedium, das 200 μCi/ml ³⁵S-Cystein und 200 μCi/ml ³⁵S-Methionin enthält, ersetzt. Nach einer 12-stündigen Inkubation wird das konditionierte Medium gesammelt, an einem Zentrifugenfilter eingeengt und auf ein 15%iges SDS-Gel geladen. Das bearbeitete Gel kann getrocknet werden, und ein Film kann damit eine ausgewählte Zeitspanne lang belichtet werden, um die Gegenwart von PRO-Polypeptid aufzuzeigen. Die Kulturen, die transfizierte Zellen enthalten, können weiterer Inkubation (in serumfreiem Medium) unterzogen werden, und das Medium wird in ausgewählten Biotests getestet.
In einem alternativen Verfahren kann PRO in 293-Zellen unter Verwendung des Dextransulfatverfahrens, das von Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 12, 7575 (1981), beschrieben wird, vorübergehend eingeführt werden. 293-Zellen werden in einem Zentrifugenkolben bis zu maximaler Dichte gezüchtet, und 700 μg pRK5-PRO-DNA werden zugesetzt. Die Zellen werden zuerst aus dem Zentrifugenkolben durch Zentrifugieren eingeengt und mit PBS gewaschen. Das DNA-Dextran-Präzipitat wird am Zellpellet vier Stunden lang inkubiert. Die Zellen werden mit 20 % Glycerin 90 Sekunden lang behandelt, mit Gewebekulturmedium gewaschen und neuerlich in den Zentrifugenkolben, der Gewebekulturmedium, 5 μg/ml Rinderinsulin und 0,1 μg/ml Rindertransferrin enthält, eingeführt. Nach etwa vier Tagen wird das konditionierte Medium zentrifugiert und filtriert, um Zellen und Zelltrümmer zu entfernen.
Die Probe, die exprimiertes PRO enthält, kann dann eingeengt und mittels jedes beliebigen Verfahrens wie z.B. Dialyse und/oder Säulenchromatographie gereinigt werden.
In einer anderen Ausführungsform kann PRO in CHO-Zellen exprimiert werden. Das pRK5-PRO kann unter Verwendung bekannter Reagenzien wie beispielsweise CaPO₄ oder DEAE-Dextran in CHO-Zellen transfiziert werden. Wie zuvor beschrieben können die Zellkulturen inkubiert und das Medium durch Kulturmedium (alleine) oder Medium, das eine radioaktive Markierung wie z.B. ³⁵S-Methionin enthält, ersetzt werden. Nach Bestimmen der Gegenwart von PRO-Polypeptid kann das Kulturmedium durch serumfreies Medium ersetzt werden. Vorzugsweise werden die Kulturen etwa 6 Tage lang inkubiert, und dann wird das konditionierte Medium geerntet. Das das exprimierte PRO enthaltende Medium kann dann konzentriert und durch jedes ausgewählte Verfahren gereinigt werden.
Epitop-markiertes PRO kann auch in Wirts-CHO-Zellen exprimiert werden. Das PRO kann aus dem pRK5-Vektor subkloniert werden. Das Subklon-Insert kann PCR unterzogen werden, um in Raster mit einer ausgewählten Epitopmarkierung wie beispielsweise einer poly-his-Markierung in einen Baculovirus-Expressionsvektor zu fusionieren. Das poly-His-markierte PRO-Insert kann dann in einen SV40-gesteuerten Vektor subkloniert werden, der einen Selektionsmarker wie z.B. DHFR zur Selektion stabiler Klone enthält. Schließlich können die CHO-Zellen (wie zuvor beschrieben) mit dem SV40-gesteuerten Vektor transfiziert werden. Es kann eine Markierung wie zuvor beschrieben angebracht werden, um Expression zu überprüfen. Das Kulturmedium, das das exprimierte poly-His-markierte PRO enthält, kann dann eingeengt und durch jedes ausgewählte Verfahren wie z.B. durch Ni²⁺-Chelataffinitätschromatographie gereinigt werden.
PRO kann auch in CHO- und/oder COS-Zellen durch ein Verfahren zur vorübergehenden Expression oder in CHO-Zellen durch ein anderes Verfahren zur stabilen Expression exprimiert werden.
Stabile Expression in CHO-Zellen wird unter Verwendung des folgenden Verfahrens durchgeführt. Die Proteine werden als ein IgG-Konstrukt (Immunoadhäsin) exprimiert, in dem die Kodiersequenzen für die löslichen Formen (z.B. extrazelluläre Domänen) der jeweiligen Proteine an eine IgG1-Konstantregionensequenz, die die Gelenks-, CH2 und CH2-Domänen enthält und/oder eine poly-His-markierte Form ist, fusioniert werden.
Nach PCR-Amplifikation werden die jeweiligen DNAs in einem CHO-Expressionsvektor unter Verwendung herkömmlicher Verfahren wie in Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley & Sons (1997), beschrieben subkloniert. CHO-Expressionsvektoren werden so konstruiert, dass sie kompatible Restriktionsstellen 5' und 3' der DNA von Interesse aufweisen, um leichtes Verschieben von cDNAs zu ermöglichen. Der Vektor, der für Expression in CHO-Zellen verwendet wird, ist wie in Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24(9), 1774-1779 (1996), beschrieben und verwendet den frühen SV40-Promotor/Enhancer, um Expression der cDNA von Interesse und von Dihydrofolatreductase (DHFR) zu steuern. DHFR-Expression ermöglicht Selektion für stabile Aufrechterhaltung des Plasmids nach erfolgter Transfektion.
12 μg der erwünschten Plasmid-DNA werden in etwa 10 Millionen CHO-Zellen unter Verwendung von im Handel erhältlichen Transfektionsreagenzien Superfect^® (Qiagen), Dosper^® oder Fugene^® (Boehringer Mannheim) eingeführt. Die Zellen werden wie in Lucas et al., s.o., beschrieben gezüchtet. Etwa 3 × 10⁷ Zellen werde in einer Ampulle für weitere Züchtung und Herstellung wie nachstehend beschrieben eingefroren.
Die die Plasmid-DNA enthaltenden Ampullen werden durch Platzieren in ein Wasserbad aufgetaut und durch Verwirbeln vermischt. Die Inhalte werden in ein Zentrifugenröhrchen pipettiert, das 10 ml Medium enthält, und werden bei 1.000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt, und die Zellen werden in 10 ml selektivem Medium (0,2-μm-filtriertes PS20 mit 5 % 0,2-μm-diafiltriertes fötales Rinderserum) resuspendiert. Die Zellen werden dann in einer 100-ml-Zentrifuge, die 90 ml selektives Medium enthält, aliquotiert. Nach 1-2 Tagen werden die Zellen in eine 250-ml-Zentrifuge, gefüllt mit 150 ml selektivem Wachstumsmedium, übertragen und bei 37 °C inkubiert. Nach weiteren 2-3 Tagen werden 250-ml-, 500-ml- und 2.000-ml-Zentrifugen mit 3 × 10⁵ Zellen/ml beimpft. Das Zellmedium wird durch frisches Medium durch Zentrifugieren und Resuspension in Produktionsmedium ausgetauscht. Obwohl jedes geeignete CHO-Medium verwendet werden kann, kann hier ein Produktionsmedium, das im US-Patent Nr. 5.122.469, ausgegeben am 16. Juni 1992, beschrieben wird, verwendet werden. Eine 3-l-Produktionszentrifuge wird bei einer Konzentration von 1,2 × 10⁶ Zellen/ml beimpft. An Tag 0 wird der Zellanzahl-pH bestimmt. An Tag 1 werden der Zentrifuge Proben entnommen, und Hindurchperlenlassen von filtrierter Luft wird begonnen. An Tag 2 werden der Zentrifuge Proben entnommen, die Temperatur wird auf 33 °C geändert, und 30 ml von 500 g/l Glucose und 0,6 ml von 10%igem Antischaummittel (z.B. 35%ige Polydimethylsiloxanemulsion, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion) werden genommen. Im Laufe der Produktion wird der pH sofern erforderlich eingestellt, um ihn auf etwa 7,2 zu halten. Nach 10 Tagen, oder sobald die Lebensfähigkeit auf unter 70 % abgefallen ist, wird die Zellkultur durch Zentrifugieren und Filtrieren durch ein 0,22-μm-Filter geerntet. Das Filtrat wurde entweder bei 4 °C gelagert oder sofort auf Säulen zur Reinigung geladen.
Für die poly-His-markierten Konstrukte wurden die Proteine unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule (Qiagen) gereinigt. Vor der Reinigung wird Imidazol zu dem konditionierten Medium zu einer Konzentration von 5 mM zugesetzt. Das konditionierte Medium wird auf eine 6-ml-Ni-NTA-Säule, äquilibriert in 20 mM Hepes-Puffer, pH 7,4, der 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol enthält, bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 4-5 ml/min bei 4 °C gepumpt. Nach dem Laden wird die Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen, und das Protein wird mit Äquilibrierungspuffer, der 0,25 M Imidazol enthält, eluiert. Das hochgereinigte Protein wird daraufhin in einen Ladepuffer, der 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4 % Mannit, pH 6,8, enthält, mit einer 25-ml-G25-Superfine-Säule (Pharmacia) entsalzt und bei –80 °C gelagert.
(Fc-hältige) Immunoadhäsin-Konstrukte werden aus dem konditionierten Medium wie folgt gereinigt. Das konditionierte Medium wird auf eine 5-ml-Protein-A-Säule (Pharmacia) gepumpt, die in 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH 6,8, äquilibriert wurde. Nach dem Laden wird die Säule ausführlich mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, bevor mit 100 mM Zitronensäure, pH 3,5, eluiert wird. Das eluierte Protein wird unverzüglich durch Sammeln von 1-ml-Fraktionen in Röhrchen, die 275 μl von 1 M Tris-Puffer, pH 9, enthält, neutralisiert. Das hochgereinigte Protein wird daraufhin in Ladepuffer wie zuvor für die poly-His-markierten Proteine beschrieben entsalzt. Die Homogenität wird durch SDS-Polyacrylamidgele und durch Sequenzieren N-terminaler Aminosäuren durch Edman-Abbau bewertet.
Zahlreiche der PRO-Polypeptide, die in der EP 99962992.6 (WO 00/36102) offenbart sind, von der diese Anmeldung eine Teilanmeldung ist, wurden erfolgreich wie oben beschrieben exprimiert.
BEISPIEL 9: Expression von PRO in Hefe
Das folgende Verfahren beschreibt rekombinante Expression von PRO in Hefe.
Zuerst werden Hefe-Expressionsvektoren zur intrazellulären Produktion oder Sekretion von PRO aus dem ADH2/GAPDH-Promotor konstruiert. DNA, die für PRO und den Promotor kodiert, wird in geeignete Restriktionsenzymstellen im selektierten Plasmid insertiert, um intrazelluläre Expression von PRO zu steuern. Zur Sekretion kann für PRO kodierende DNA zusammen mit DNA, die für den ADH2/GAPDH-Promotor, ein natives PRO-Signalpeptid oder ein anderes Säugetier-Signalpeptid kodiert, oder beispielsweise einer Hefe-α-Faktor- oder -Invertase-Sekretionssignal/Leadersequenz und Linkersequenzen (sofern erforderlich) zur Expression von PRO in das selektierte Plasmid kloniert werden.
Hefezellen, wie z.B. Hefestamm AB110, können dann mit den zuvor beschriebenen Expressionsplasmiden transformiert und in ausgewähltem Fermentationsmedium kultiviert werden. Die Überstände transformierter Hefe können durch Fällen mit 10 % Trichloressigsäure und durch Trennen durch SDS-PAGE, gefolgt von Färben der Gele mit Coomassie-Blaufärbung, analysiert werden.
Rekombinantes PRO kann daraufhin isoliert und durch Entfernen der Hefezellen aus dem Fermentationsmedium durch Zentrifugieren und anschließendes Einengen des Mediums unter Verwendung ausgewählter Patronenfilter gereinigt werden. Das PRO-hältige Konzentrat kann weiters unter Verwendung ausgewählter Säulenchromatographieharze gereinigt werden.
Zahlreiche der PRO-Polypeptide, die in der EP 99962992.6 (WO 00/36102) offenbart sind, von der diese Anmeldung eine Teilanmeldung ist, wurden erfolgreich wie oben beschrieben exprimiert.
BEISPIEL 10: Expression von PRO in mit Baculovirus infizierten Insektenzellen
Das folgende Verfahren beschreibt rekombinante Expression von PRO in mit Baculovirus infizierten Insektenzellen.
Die für PRO kodierende Sequenz wird stromab einer Epitopmarkierung, die in einem Baculovirus-Expressionsvektor enthalten ist, fusioniert. Solche Epitop-Markierungen umfassen poly-His-Markierungen und Immunglobulinmarkierungen (wie Fc-Regionen von IgG). Zahlreiche verschiedene Plasmide können verwendet werden, einschließlich Plasmiden, die aus im Handel erhältlichen Plasmiden wie z.B. pVL1393 (Novagen) stammen. Kurz zusammengefasst wird die für PRO kodierende Sequenz oder der erwünschte Abschnitt der Kodiersequenz von PRO, wie z.B. die Sequenz, die für die extrazelluläre Domäne eines Transmembranproteins kodiert, oder die Sequenz, die für das reife Protein kodiert, sofern das Protein extrazellulär ist, durch PCR mit Primern, die zu den 5'- und 3'-Regionen komplementär sind, amplifiziert. Der 5'-Primer kann flankierende (selektierte) Restriktionsenzymstellen inkorporieren. Das Produkt wird dann mit jenen ausgewählten Restriktionsenzymen verdaut und in den Expressionsvektor subkloniert.
Rekombinantes Baculovirus wird durch Co-Transfektion des obigen Plasmids und BaculoGold^TM-Virus-DNA (Pharmingen) in Spodoptera-frugiperda- ("Sf9"-) Zellen (ATCC CRL 1711) unter Verwendung von Lipofectin (im Handel bei GIBCO-BRL erhältlich) hergestellt. Nach 4-5 Tagen Inkubation bei 28 °C werden die freigesetzten Viren geerntet und zur weiteren Amplifikation verwendet. Virale Infektion und Proteinexpression werden wie von O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994), beschrieben durchgeführt.
Exprimiertes poly-His-markiertes PRO kann dann, beispielsweise durch Ni²⁺-Chelataffinitätschromatographie, wie folgt gereinigt werden. Extrakte werden aus rekombinanten, virusinfizierten Sf9-Zellen wie von Rupert et al., Nature 362, 175-179 (1993), beschrieben hergestellt. Kurz zusammengefasst werden Sf9-Zellen gewaschen, in Beschallungspuffer (25 ml Hepes, pH 7,9; 12,5 mM MgCl₂; 0,1 mM EDTA; 10 % Glycerin, 0,1 % NP-40; 0,4 M KCl) resuspendiert und zweimal 20 Sekunden lang auf Eis beschallt. Die beschallten Produkte werden durch Zentrifugation geklärt, und der Überstand wird 50fach in Ladepuffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10 % Glycerin, pH 7,8) verdünnt und durch ein 0,45-μm-Filter filtriert. Eine Ni²⁺-NTA-Agarosesäule (im Handel bei Qiagen erhältlich) wird mit einem Bettvolumen von 5 ml hergestellt, mit 25 ml Wasser gewaschen und mit 25 ml Ladepuffer äquilibriert. Der filtrierte Zellextrakt wird auf die Säule bei 0,5 ml pro Minute geladen. Die Säule wird mit Ladepuffer zu A₂₈₀-Basislinie gewaschen, ein Punkt, an dem Fraktionssammlung gestartet wird. Als Nächstes wird die Säule mit einem sekundären Waschpuffer (50 mM Phosphat; 300 mM NaCl, 10 % Glycerin, pH 6,0) gewaschen, der nicht spezifisch gebundenes Protein eluiert. Nach neuerlichem Erreichen der A₂₈₀-Basislinie wird die Säule mit einem 0- bis 500-mM-Imidazolgradienten im sekundären Waschpuffer entwickelt. 1-ml-Fraktionen werden gesammelt und durch SDS-PAGE und Silberfärbung oder Western-Blot mit Ni²⁺-NTA konjugiert an alkalische Phosphatase (Qiagen) analysiert. Fraktionen, die das eluierte His₁₀-markierte PRO enthalten, werden gesammelt und gegen Ladepuffer dialysiert.
Alternativ dazu kann Reinigung des IgG-markierten (oder Fc-markierten) PRO unter Verwendung bekannter Chromatographieverfahren, einschließlich beispielsweise Protein-A- oder Protein-G-Säulenchromatographie, durchgeführt werden.
Zahlreiche der PRO-Polypeptide, die in der EP 99962992.6 (WO 00/36102) offenbart sind, von der diese Anmeldung eine Teilanmeldung ist, wurden erfolgreich wie oben beschrieben exprimiert.
BEISPIEL 11: Herstellung von Antikörpern, die PRO binden
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung monoklonaler Antikörper, die sich spezifisch an PRO binden können.
Verfahren zur Herstellung der monoklonalen Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden beispielsweise in Goding, s.o., beschrieben. Immunogene, die verwendet werden können, umfassen gereinigtes PRO, Fusionsproteine, die PRO enthalten, und Zellen, die rekombinantes PRO an der Zelloberfläche exprimieren. Die Auswahl des Immunogens können Fachleute ohne übermäßiges Experimentieren treffen.
Mäuse, wie z.B. Balb/c, werden mit dem PRO-Immunogen immunisiert, das in komplettem Freundschem Adjuvans emulgiert und subkutan oder intraperitoneal in einer Menge von 1 bis 100 μg injiziert wird. Alternativ dazu wird das Immunogen in MPL-TDM-Adjuvans (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) emulgiert und in die Fußballen der Hinterläufe der Tiere injiziert. Die immunisierten Mäuse werden dann 10 bis 12 Tage später mit zusätzlichem Immunogen, das im ausgewählten Adjuvans emulgiert ist, geboostet. Hiernach können die Mäuse auch für mehrere Wochen mit zusätzlichen Immunisierungsinjektionen geboostet werden. Serumproben können den Mäusen durch retroorbitale Blutabnahme zum Testen mittels ELISA-Tests zur Detektion von Anti-PRO-Antikörpern in periodisch Abständen entnommen werden.
Nachdem ein geeigneter Antikörpertiter nachgewiesen wurde, kann den Tieren mit "positiven" Antikörperwerten eine letzte intravenöse Injektion von PRO verabreicht werden. Drei oder vier Tage später werden die Mäuse getötet und die Milzzellen geerntet. Die Milzzellen werden dann an eine selektierte Mausmyelomzelllinie wie z.B. P3X63AgU.1, die bei der ATCC, Nr. CRL 1597, erhältlich ist, (unter Verwendung von 35 % Polyethylenglykol) fusioniert. Die Fusionen bilden Hybridomzellen, die dann in 96-Well-Gewebekulturplatten, welche HAT- (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) Medium enthalten, ausplattiert werden, um Proliferation von nicht-fusionierten Zellen, Myelomhybriden und Milzzellhybriden zu hemmen.
Die Hybridomzellen werden in einem ELISA auf Reaktivität gegen PRO gescreent. Bestimmung von "positiven" Hybridomzellen, die die erwünschten monoklonalen Antikörper gegen PRO sekretieren, liegt im Bereich der Erfindung.
Die positiven Hybridomzellen können intraperitoneal in syngenetische Balb/c-Mäuse injiziert werden, um Ascites zu produzieren, die die monoklonalen Anti-PRO-Antikörper enthalten. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in Gewebekulturkolben oder Rollflaschen gezüchtet werden. Reinigung der monoklonalen Antikörper, die in Ascites produziert werden, kann unter Verwendung von Ammoniumsulfatfällung, gefolgt von Gelausschlusschromatographie, erfolgen. Alternativ dazu kann Affinitätschromatographie basierend auf Bindung von Antikörper an Protein A oder Protein G verwendet werden.
BEISPIEL 12: Reinigung von PRO-Polypeptiden unter Verwendung spezifischer Antikörper
Native oder rekombinante PRO-Polypeptide können mittels zahlreicher verschiedener Verfahren zur Proteinreinigung, die auf dem Gebiet der Erfindung Standard sind, gereinigt werden. Beispielsweise wird pro-PRO-Polypeptid, reifes PRO-Polypeptid oder prä-PRO-Polypeptid mittels Immunaffinitätschromatographie unter Verwendung von Antikörpern, die für das PRO-Polypeptid von Interesse spezifisch sind, gereinigt.
Im Allgemeinen wird eine Immunaffinitätssäule durch kovalentes Binden des anti-PRO-Polypeptidantikörpers an ein aktiviertes Chromatographieharz konstruiert.
Polyklonale Immunglobuline werden aus Immunseren entweder durch Fällung mit Ammoniumsulfat oder durch Reinigung an immobilisiertem Protein A (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.) hergestellt. Demähnlich werden monoklonale Antikörper aus Maus-Ascitesflüssigkeit durch Ammoniumsulfatfällung oder durch Chromatographie an immobilisiertem Protein A hergestellt. Teilweise gereinigtes Immunglobulin wird kovalent an ein Chromatographieharz wie z.B. CnBr-aktivierte SEPHAROSE^TM (Pharmacia LKB Biotechnology) gebunden. Der Antikörper wird an das Harz gebunden, das Harz wird blockiert, und das Derivatharz wird gemäß den Anweisungen des Herstellers gewaschen.
Solch eine Immunaffinitätssäule wird zur Reinigung von PRO-Polypeptid durch Herstellung einer Fraktion von Zellen, die PRO-Polypeptid in einer löslichen Form enthält, verwendet. Dieses Präparat wird durch Solubilisierung der ganzen Zelle oder einer subzellulären Fraktion, die durch differenzielles Zentrifugieren durch den Zusatz von Detergens oder mittels anderer Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, erhalten wurde, abgeleitet. Alternativ dazu kann lösliches PRO-Polypeptid, das eine Signalsequenz enthält, in nützlicher Menge in das Medium sekretiert werden, in dem die Zellen gezüchtet werden.
Ein lösliches PRO-Polypeptid-hältiges Präparat wird über eine Immunaffinitätssäule geführt, und die Säule wird unter Bedingungen gewaschen, die die präferenzielle Absorption von PRO-Polypeptid ermöglichen (z.B. Puffer mit hoher Ionenstärke in Gegenwart von Detergens). Dann wird die Säule unter Bedingungen eluiert, die Antikörper/PRO-Polypeptid-Bindung aufbrechen (z.B. ein Puffer mit niedrigem pH wie etwa pH 2-3 oder eine hohe Konzentration eines Chaotrops wie z.B. Harnstoff oder Thiocyanation), und PRO-Polypeptid wird gesammelt.
BEISPIEL 13: Wirkstoff-Screenen
Diese Erfindung ist besonders nützlich zum Screenen von Verbindungen unter Verwendung von PRO-Polypeptiden oder Bindungsfragmenten davon im Rahmen eines von zahlreichen verschiedenen Screeningverfahren. Das PRO-Polypeptid oder -Fragment, das in solch einem Test verwendet wird, kann entweder frei in Lösung, fixiert an einen festen Träger, an einer Zelloberfläche getragen oder intrazellulär angeordnet sein. Ein Verfahren zum Wirkstoff-Screenen verwendet eukaryotische oder prokaryotische Wirtszellen, die mit rekombinanten Nucleinsäuren, die das PRO-Polypeptid oder -Fragment exprimieren, stabil transformiert sind. Wirkstoffe werden gegen solche transformierten Zellen in Konkurrenzbindungstests gescreent. Solche Zellen, entweder in lebensfähiger oder in fixierter Form, können für herkömmliche Bindungstests verwendet werden. Es kann beispielsweise die Bildung von Komplexen zwischen PRO-Polypeptid oder einem -Fragment und dem zu testenden Mittel gemessen werden. Alternativ dazu kann die Abnahme von Komplexbildung zwischen dem PRO-Polypeptid und seiner Targetzelle oder seinen Targetrezeptoren untersucht werden, die durch das zu testende Mittel verursacht wird.
Somit stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Screenen auf Wirkstoffe oder auf beliebige andere Mittel bereit, die mit PRO-Polypeptid assoziierte Erkrankungen oder Leiden beeinflussen können. Diese Verfahren umfassen das Kontaktieren solch eines Mittels mit einem PRO-Polypeptid oder Fragment davon und das Testen (I) auf die Gegenwart eines Komplexes zwischen dem Mittel und dem PRO-Polypeptid oder -Fragment oder (II) auf die Gegenwart eines Komplexes zwischen dem PRO-Polypeptid oder -Fragment und der Zelle mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren. In solchen Konkurrenzbindungstests wird das PRO-Polypeptid oder -Fragment typischerweise markiert. Nach geeigneter Inkubation wird freies PRO-Polypeptid oder -Fragment von dem, das in gebundener Form vorliegt, getrennt, und die Menge an freier oder nicht komplexierter Markierung stellt ein Maß für die Fähigkeit des bestimmten Mittels dar, sich an PRO-Polypeptid zu binden oder den PRO-Polypeptid/Zell-Komplex zu stören.
Ein anderes Verfahren zum Wirkstoff-Screenen sorgt für Screenen mit hohem Durchsatz von Verbindungen mit geeigneter Bindungsaffinität an ein Polypeptid und wird in der WO 84/03564, veröffentlicht am 13. September 1984, detailliert beschrieben. Kurz zusammengefasst wird eine große Anzahl an verschiedenen Testverbindungen kleiner Peptide an einem festen Substrat, wie z.B. an Kunststoffstiften oder einer anderen Oberfläche, synthetisiert. Nachdem sie auf ein PRO-Polypeptid aufgetragen wurden, werden Peptidtestverbindungen mit PRO-Polypeptid umgesetzt und gewaschen. Gebundenes PRO-Polypeptid wird mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren nachgewiesen. Gereinigtes PRO-Polypeptid kann zur Verwendung in den zuvor genannten Wirkstoff-Screening-Verfahren auch direkt auf Platten beschichtet werden. Darüber hinaus können nicht-neutralisierende Antikörper verwendet werden, um das Peptid einzufangen und es am festen Träger zu immobilisieren.
Diese Erfindung erwägt auch die Verwendung von kompetitiven Wirkstoff-Screeningtests, in denen neutralisierende Antikörper, die in der Lage sind, PRO-Polypeptid zu binden, spezifisch mit einer Testverbindung um Bindung an PRO-Polypeptid oder Fragmenten davon konkurrieren. Auf diese Weise können die Antikörper verwendet werden, um die Gegenwart jedes beliebigen Peptids nachzuweisen, das mit PRO-Polypeptid eine oder mehrere antigene Determinanten gemeinsam hat.
BEISPIEL 14: Rationales Wirkstoffdesign
Das Ziel von rationalem Wirkstoffdesign ist die Herstellung struktureller Analoga von biologisch aktivem Polypeptid von Interesse (z.B. von einem PRO-Polypeptid) oder von kleinen Molekülen, mit denen sie wechselwirken, z.B. Agonisten, Antagonisten oder Inhibitoren. Jedes dieser Beispiele kann verwendet werden, um Wirkstoffe zu entwerfen, die aktivere oder stabilere Formen des PRO-Polypeptids sind oder die die Funktion des PRO-Polypeptids in vivo verstärken oder stören (vgl. Hodgson, Bio/Technology 9, 19-21 (1991)).
In einem Ansatz wird die dreidimensionale Struktur des PRO-Polypeptids oder eines PRO-Polypeptid-Inhibitor-Komplexes durch Röntgenkristallographie, durch Computermodellierung oder, was am häufigsten vorkommt, durch eine Kombination der zwei Ansätze bestimmt. Sowohl die Form als auch die Ladungen des PRO-Polypeptids müssen bestimmt werden, um die Struktur erkennen zu können und um (eine) aktive Stelle(n) des Moleküls zu identifizieren. Weniger häufig können nützliche Informationen hinsichtlich der Struktur des PRO-Polypeptids durch Modellieren auf Grundlage der Struktur homologer Proteine gewonnen werden. In beiden Fällen wird relevante strukturelle Information verwendet, um analoge PRO-Polypeptid-ähnliche Moleküle zu entwerfen oder um wirksame Inhibitoren zu identifizieren. Nützliche Beispiele für rationales Wirkstoffdesign können Moleküle umfassen, die verbesserte Aktivität oder Stabilität aufweisen, wie von Braxton & Wells, Biochemistry 31, 7796-7801 (1992), gezeigt wird, oder die als Inhibitoren, Agonisten oder Antagonisten von nativen Peptiden wirken, wie von Athauda et al., J. Biochem. 113, 742-746 (1993), gezeigt wird.
Auch ist es möglich, einen Target-spezifischen Antikörper zu isolieren, der wie zuvor beschrieben durch funktionelle Tests selektiert wird, und dann seine Kristallstruktur aufzuklären. Dieser Ansatz ergibt im Prinzip ein Pharmakor, auf Grundlage dessen Wirkstoffdesign vollzogen werden kann. Es ist möglich, Proteinkristallographie ganz zu umgehen, indem anti-idiotypische Antikörper (anti-ids) zu einem funktionellen, pharmakologisch aktiven Antikörper gebildet werden. Es wird erwartet, dass, als ein Spiegelbild eines Spiegelbildes, die Bindungsstelle der anti-ids analog zu dem Originalrezeptor ist. Der anti-id könnte dann verwendet werden, um Peptide aus Banken chemisch oder biologisch hergestellter Peptide zu identifizieren und zu isolieren. Die isolierten Peptide würden dann als der Pharmakor wirken.
Durch die vorliegende Erfindung können ausreichende Mengen des PRO-Polypeptids verfügbar gemacht werden, um solche analytischen Studien wie z.B. Röntgenkristallographie durchzuführen. Darüber hinaus liefert die Kenntnis der hierin bereitgestellten PRO-Polypeptid-Aminosäuresequenz einen Leitfaden für jene, die Computermodellierungsverfahren anstelle von oder zusätzlich zu Röntgenkristallographie verwenden.
Hinterlegung von Material
Die folgenden Materialien wurden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA, (ATCC) hinterlegt:
Diese Hinterlegung erfolgte gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und den darunter gültigen Bestimmungen (Budapester Vertrag). Dies sichert die Erhaltung einer lebensfähigen Kultur der Hinterlegung 30 Jahre lang ab dem Zeitpunkt der Hinterlegung. Die Hinterlegungen werden von der ATCC gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages und gemäß einem Abkommen zwischen Genentech, Inc., und ATCC verfügbar gemacht, das permanente und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Kultur der Hinterlegung für die Öffentlichkeit bei Ausgabe des betreffenden US-Patents oder bei Offenlegung für die Öffentlichkeit entweder der US- oder einer ausländischen Patentanmeldung, je nachdem, was zuerst kommt, garantiert und das die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft für jemanden, der durch den Präsident des Patentamtes der Vereinigten Staaten hierzu gemäß 35 USC § 122 und den dazu gültigen Bestimmungen (einschließlich 37 CFR § 1.14 unter besonderem Verweis auf 886 OG 638) befugt ist, sicherstellt.
Der Abtretungsempfänger der vorliegenden Anmeldung hat sich einverstanden erklärt, dass, sofern eine Kultur der hinterlegten Materialien, die unter geeigneten Bedingungen kultiviert wurde, sterben oder verloren gehen oder zerstört werden sollte, die Materialien unverzüglich nach Benachrichtigung durch neue derselben Art ersetzt werden. Verfügbarkeit des hinterlegten Materials ist nicht als eine Lizenz zur Ausführung der Erfindung in Widerspruch mit den unter der Behörde einer beliebigen Regierung gemäß ihrer Patentgesetze garantierten Rechte zu verstehen.
Die obige schriftliche Beschreibung wird als ausreichend erachtet, um Fachleuten die Möglichkeit zu geben, die Erfindung durchzuführen. Die vorliegende Erfindung soll in ihrem Schutzumfang durch das hinterlegte Konstrukt nicht als eingeschränkt gelten, da die hinterlegte Ausführungsform einzig als Veranschaulichung bestimmter Aspekte der Erfindung zu verstehen ist, und anderer Konstrukte, die funktionell äquivalent sind, liegen ebenfalls im Schutzumfang dieser Erfindung, wie er in den Ansprüchen definiert ist. Die Hinterlegung des hierin offenbarten Materials stellt weder ein Eingeständnis dar, dass die hierin enthaltene schriftliche Beschreibung inadäquat sei, die praktische Durchführung irgendeines Aspektes der Erfindung, einschließlich der besten Ausführungsform davon, zu ermöglichen, noch ist sie als eine Einschränkung des Schutzumfangs der Ansprüche zu den spezifischen Veranschaulichungen, die sie darstellt, zu verstehen. Schließlich werden Fachleuten auf Grundlage der obigen Beschreibung verschiedene Modifikationen, zusätzlich zu jenen, die hierin gezeigt und beschrieben wurden, ersichtlich sein und liegen ebenfalls im Schutzumfang der beiliegenden Ansprüche.
Sequenzprotokoll

Claims

Isolierte Nucleinsäure mit einer Nucleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, die zumindest 80 % Aminosäuresequenzidentität mit der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) aufweist, worin die Sequenzidentität über die volle Länge der in 2 gezeigten Sequenz (Seq.-ID Nr. 2) bestimmt wird.
Isolierte Nucleinsäure mit zumindest 80 % Nucleinsäuresequenzidentität mit der in 1 gezeigten Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 1), worin die Sequenzidentität über die volle Länge der in 1 gezeigten Sequenz (Seq.-ID Nr. 1) bestimmt wird.
Isolierte Nucleinsäure mit zumindest 80 % Nucleinsäuresequenzidentität mit der Kodiersequenz voller Länge der in 1 gezeigten Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 1), worin die Sequenzidentität über die volle Länge der Kodiersequenz bestimmt wird.
Isolierte Nucleinsäure mit zumindest 80 % Nucleinsäuresequenzidentität mit der Kodiersequenz voller Länge der unter der ATCC-Zugriffsnummer 203661 hinterlegten DNA, worin die Sequenzidentität über die volle Länge der Kodiersequenz bestimmt wird.
Isolierte Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Ausmaß der Sequenzidentität zumindest 90 % beträgt.
Isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 5, worin das Ausmaß der Sequenzidentität zumindest 95 % beträgt.
Isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 6, die für die in 2 gezeigte Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) kodiert.
Isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 7, die die in 1 gezeigte Nucleinsäuresequenz (Seq.-ID Nr. 1) umfasst.
Vektor, der Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 8 umfasst.
Vektor nach Anspruch 9, operabel gebunden an Kontrollsequenzen, die von einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle erkannt werden.
Wirtszelle, umfassend einen Vektor nach Anspruch 9.
Wirtszelle nach Anspruch 11, worin die Zelle eine CHO-Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 11, worin die Zelle ein E. coli ist.
Wirtszelle nach Anspruch 11, worin die Zelle eine Hefezelle ist.
Verfahren zur Herstellung eines PRO-Polypeptids, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 11 unter Bedingungen, die für die Expression des PRO-Polypeptids geeignet sind, und das Gewinnen des PRO-Polypeptids aus der Zellkultur.
Isoliertes Polypeptid mit zumindest 80 % Aminosäuresequenzidentität mit der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2), worin die Sequenzidentität über die volle Länge der in 2 gezeigten Sequenz (Seq.-ID Nr. 2) bestimmt wird.
Isoliertes Polypeptid, das zumindest 80 % positive Resultate ergibt, wenn es mit der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) verglichen wird, worin die Sequenzidentität über die volle Länge der in 2 gezeigten Sequenz (Seq.-ID Nr. 2) bestimmt wird.
Isoliertes Polypeptid mit zumindest 80 % Aminosäuresequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz, für die die Kodiersequenz voller Länge der unter der ATCC-Zugriffsnummer 203661 hinterlegten DNA kodiert, worin die Sequenzidentität über die volle Länge der Aminosäuresequenz bestimmt wird.
Isoliertes Polypeptid nach einem der Ansprüche 16 bis 18, worin das Ausmaß der Sequenzidentität 90 % beträgt.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 19, worin das Ausmaß der Sequenzidentität 95 % beträgt.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 20, worin das Ausmaß der Sequenzidentität 99 % beträgt.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 16, das die in 2 gezeigte Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) umfasst.
Hybridmolekül, umfassend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 16 bis 22, fusioniert mit einer heterologen Aminosäuresequenz.
Hybridmolekül nach Anspruch 23, worin die heterologe Aminosäuresequenz eine Markierungs-Polypeptidsequenz ist.
Hybridmolekül nach Anspruch 23, worin die heterologe Aminosäuresequenz eine Fc-Region eines Immunglobulins ist.
Antikörper, der sich spezifisch an ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 16 bis 22 bindet.
Antikörper nach Anspruch 26, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper, ein humanisierter Antikörper oder ein einkettiger Antikörper ist.
In-vitro-Verfahren zur Diagnose von Krebs, umfassend die Detektion eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 16 bis 22 in einer Probe.
Verfahren nach Anspruch 28, das die immunologische Detektion des Polypeptids umfasst.
Verfahren nach Anspruch 29, worin die Probe ein Gewebeschnitt oder eine Körperflüssigkeitsprobe ist.
In-vitro-Verfahren zur Diagnose von Krebs, umfassend die Detektion von Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in einer Probe.
Verfahren nach Anspruch 31, worin die Nucleinsäure durch eines oder mehrere der Verfahren Southern-Blotting, Northern-Blotting, Dot-Blotting oder In-situ-Hybridisierung, 5'-Nucleasetest oder quantitative PCR nachgewiesen wird.