DE69932644T2

DE69932644T2 - Menschliches Protein mit in vitro antiproliferativer Aktivität.

Info

Publication number: DE69932644T2
Application number: DE69932644T
Authority: DE
Inventors: William I. Hillsborough Wood; Audrey San Francisco Goddard; Austin Belmont Gurney; Jean San Mateo Yuan; Kevin P. Darnestown Baker; Jian Princeton Chen
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1998-04-15
Filing date: 1999-03-08
Publication date: 2007-08-09
Anticipated expiration: 2019-03-09
Also published as: ES2269560T3; EP1241179B1; EP1241179A3; DK1241179T3; PT1241179E; EP1241179A2; DE69932644D1; ATE335005T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die Identifizierung und Isolation von DNA sowie die rekombinante Produktion von Polypeptiden, für die diese DNA kodiert.
Hintergrund der Erfindung
Extrazelluläre Proteine spielen eine bedeutende Rolle bei der Bildung, Differenzierung und Erhaltung mehrzelliger Organismen. Das Schicksal vieler einzelner Zellen, z.B. Vermehrung, Migration, Differenzierung oder Wechselwirkung mit anderen Zellen, wird typischerweise von Informationen bestimmt, die von anderen Zellen und/oder der unmittelbaren Umgebung erhalten werden. Diese Informationen werden oft von sekretierten Polypeptiden übertragen (beispielsweise von mitogenen Faktoren, Überlebensfaktoren, zytotoxischen Faktoren, Differenzierungsfaktoren, Neuropeptiden und Hormonen), die ihrerseits von diversen Zellrezeptoren und membrangebundenen Proteinen erhalten und interpretiert werden. Diese sekretierten Polypeptide oder Signalmoleküle durchlaufen normalerweise den zellulären Sekretionsweg, um ihren Wirkungsort in der extrazellulären Umgebung zu erreichen.
Sekretierte Proteine haben verschiedene industrielle Anwendungen, einschließlich Pharmazeutika, Diagnostika, Biosensoren und Bioreaktoren. Die meisten derzeit verfügbaren Proteinarzneimittel, wie z.B. Thrombolysemittel, Interferone, Interleukine, Erythropoietine, koloniestimulierende Faktoren und verschiedene andere Zytokine, sind sekretorische Proteine. Ihre Rezeptoren, die Membranproteine sind, haben ebenfalls ein Potential als therapeutische oder diagnostische Mittel. Es werden sowohl von der Industrie als auch von den Universitäten Anstrengungen unternommen, neue native, sekretierte Proteine zu identifizieren. Viele Anstrengungen konzentrieren sich auf das Screening von rekombinanten Säugetier-DNA-Bibliotheken, um die kodierenden Sequenzen für neue sekretierte Proteine zu identifizieren. Beispiele von Screeningverfahren und Techniken sind in der Literatur beschrieben (siehe bei spielsweise Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 7108–7113 (1996); US-Patent Nr. 5.536.637).
Membrangebundene Proteine und Rezeptoren können eine wichtige Rolle bei der Bildung, Differenzierung und Erhaltung mehrzelliger Organismen spielen. Das Schicksal vieler einzelner Zellen, z.B. Vermehrung, Migration, Differenzierung oder Wechselwirkung mit anderen Zellen, wird typischerweise von Informationen bestimmt, die von anderen Zellen und/oder der unmittelbaren Umgebung erhalten werden. Diese Informationen werden häufig durch sekretierte Polypeptide (beispielsweise mitogene Faktoren, Überlebensfaktoren, zytotoxische Faktoren, Differenzierungsfaktoren, Neuropeptide und Hormone) übertragen, die ihrerseits von verschiedenen Zellrezeptoren oder membrangebundenen Proteinen erhalten und interpretiert werden. Derartige membrangebundene Proteine umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Zytokinrezeptoren, Rezeptorkinasen, Rezeptorphosphatasen, an der Zell-Zell-Wechselwirkung beteiligte Rezeptoren und zelluläre Adhäsinmoleküle, wie z.B. Selektine und Integrine. Beispielsweise wird die Übertragung von Signalen, die Zellwachstum und Differenzierung regulieren, teilweise durch Phosphorylierung verschiedener Zellproteine reguliert. Protein-Tyrosinkinasen, Enzyme, die diesen Prozess katalysieren, können ebenfalls als Wachstumsfaktorrezeptoren wirken. Beispiele umfassen Fibroblastenwachstumsfaktorrezeptor und Nervenwachstumsfaktorrezeptor.
Membrangebundene Proteine und Rezeptormoleküle haben verschiedene industrielle Anwendungen, einschließlich als pharmazeutische und diagnostische Mittel. Rezeptorimmunoadhäsine beispielsweise können als therapeutische Mittel eingesetzt werden, um die Rezeptor-Liganden-Wechselwirkung zu blockieren. Die membrangebundenen Proteine können auch zum Screening potentieller Peptid- oder Kleinmolekül-Inhibitoren der maßgeblichen Rezeptor/Ligand-Wechselwirkung eingesetzt werden. Es werden sowohl von der Industrie als auch von Universitäten Anstrengungen unternommen, neue native Rezeptorproteine zu identifizieren. Viele Anstrengungen konzentrieren sich auf das Screening von rekombinanten Säugetier- DNA-Bibliotheken, um die kodierenden Sequenzen für neue Rezeptorproteine zu identifizieren.
Hierin beschreiben die Erfinder die Identifizierung und Charakterisierung von sekretierten und Transmembranpolypeptiden sowie von Nucleinsäuren, die für diese Polypeptide kodieren.
PRO181
Bei der Drosophila hängt die dorsal-ventrale Polarität der Nährkammer von der Lokalisierung des Oozyten-Nucleus und der Gurken-RNA zu der dorsal-anterioren Ecke der Oozyte ab. Gurkenprotein agiert wahrscheinlich als Ligand für den Drosophila-EGF-Rezeptor (torpedo/DER), der in den somatischen Follikelzellen, welche die Oozyte umegben, exprimiert wird. Cornichon ist ein Gen, das in der Keimbahn für dorsal-ventrale Signale erforderlich ist (Roth et al., Cell 81, 967–978 (1995)). Cornichon, Gurken und Torpedo fungieren auch bei einem früheren Signalvorkommnis, welches das Schicksal posteriorer Follikelzellen bestimmt und die anterior-posteriore Polarität der Nährkammer spezifiziert. Mutationen in einem jeden dieser Gene verhindern die Bildung eines korrekt polarisierten Mikrotubus-Zytoskeletts, das für die korrekte Lokalisierung der anterioren und posterioren Determinanten Bicoid und Oskar sowie für die asymmetrische Positionierung des Oozyten-Nucleus erforderlich ist. Es ist daher klar, dass das Cornichon-Genprodukt eine wichtige Rolle in der frühen Entwicklung spielt. Hierin beschreiben die Erfinder die Identifikation und Charakterisierung eines Polypeptids, das mit dem Cornichon-Protein homolog ist und hierin als PRO181 bezeichnet wird.
WO 99/10363, WO 99/50405, WO 99/43802 und WO 99/33979 berichten alle von der Identifikation einer Nucleinsäure, die für ein Polypeptid kodiert, das Homologie mit dem Cornichon-Protein aufweist.
Zusammenfassung der Erfindung
PRO181
Die Anmelder haben einen cDNA-Klon identifiziert, welcher für ein Polypeptid kodiert, das Homologie mit dem Cornichon-Protein aufweist, wobei das Polypeptid in der vorliegenden Erfindung als „PRO181" bezeichnet wird.
Hierin wird ein isoliertes Nucleinsäuremolekül offenbart, das DNA umfasst, welche für ein PRO181-Polypeptid kodiert. In einem Aspekt umfasst die isolierte Nucleinsäure DNA, die für das PRO181-Polypeptid kodiert, welches die Aminosäurereste 1 bis 144 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) aufweist, oder ist komplementär zu dieser kodierenden Nucleinsäuresequenz und bleibt unter zumindest moderaten und gegebenenfalls unter hohen Stringenzbedingungen stabil an diese gebunden. In anderen Aspekten umfasst die isolierte Nucleinsäure DNA, die für das PRO181-Polypeptid kodiert, welches die Aminosäurereste etwa 21 bis 144 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) oder Aminosäure etwa 1 oder etwa 21 bis X aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) aufweist, wobei X jede Aminosäure von 52 bis 61 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) ist, oder ist komplementär zu dieser kodierenden Nucleinsäuresequenz und bleibt unter zumindest moderaten und gegebenenfalls unter hoher Stringenzbedingungen stabil an diese gebunden. Die isolierte Nucleinsäuresequenz kann ein cDNA-Insert des DNA23330-1390-Vektors umfassen, der am 14. April 1998 als unter der Zugriffsnr. ATCC 209775 hinterlegt wurde, der die für PRO181 kodierende Nucleotidsequenz inkludiert.
In einem Aspekt stellt die Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, ein isoliertes PRO181-Polypeptid zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren bereit. Weiters werden verwandte Aspekte der Erfindung ebenso in den Ansprüchen definiert. Im Besonderen betrifft die Erfindung isoliertes Nativsequenz-PRO181-Polypeptid, das in einer Ausführungsform eine Aminosäuresequenz inkludiert, welche die Reste 1 bis 144 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) umfasst. Zusätzliche Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen PRO181-Polypeptide, welche die Aminosäuren von etwa 21 bis 144 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) oder Aminosäure 1 oder etwa 21 bis X aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) umfassen, wobei X jede Aminosäure von 52 bis 61 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) ist. Gegebenenfalls wird das PRO181-Polypeptid durch Expression des Polypeptids, für welches das cDNA-Insert des DNA23330-1390-Vektors kodiert, der am 14. April 1998 unter der Zugriffsnr. ATCC 209775 hinterlegt wurde, erhalten oder kann so erhalten werden.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 1) einer Nativsequenz-PRO181-cDNA, wobei Seq.-ID Nr. 1 ein Klon ist, der hierin als „UNQ155" und/oder „DNA23330-1390" bezeichnet wird.
2 zeigt die Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2), die von der kodierenden Sequenz von Seq.-ID Nr. 1, dargestellt in 1, abstammt.
3 zeigt eine EST-Nucleotidsequenz, die hierin als DNA13242 (Seq.-ID Nr. 3) bezeichnet wird.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
I. Definitionen
Die Ausdrücke „PRO-Polypeptid" und „PRO" beziehen sich bei Verwendung hierin und wenn unmittelbar von einer numerischen Bezeichnung gefolgt auf verschiedene Polypeptide, worin die vollständige Bezeichnung (d.h. PRO/Zahl) sich auf spezielle hierin beschriebene Polypeptidsequenzen bezieht. Die Ausdrücke „PRO/Zahl-Polypeptid" und „PRO/Zahl" umfassen bei Verwendung hierin Nativsequenz-Polypeptide und Polypeptidvarianten (die hierin weitergehend definiert werden). Die hierin beschriebenen PRO-Polypeptide können aus einer Vielzahl von Quellen isoliert werden, wie z.B. aus menschlichen Gewebetypen oder aus einer anderen Quelle, oder können durch rekombinante oder synthetische Verfahren hergestellt werden.
Ein „Nativsequenz-PRO-Polypeptid" umfasst ein Polypeptid mit derselben Aminosäuresequenz wie das entsprechende, aus der Natur stammende PRO-Polypeptid. Derartige Nativsequenz-PRO-Polypeptide können aus der Natur isoliert oder durch rekombinante oder synthetische Mittel hergestellt werden. Der Ausdruck „Nativsequenz-PRO-Polypeptid" umfasst im Speziellen natürlich vorkommende trunkierte oder sekretierte Formen des speziellen PRO-Polypeptids (z.B. eine extrazelluläre Domänensequenz), natürlich auftretende Variantenformen (z.B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich auftretende allelische Varianten des Polypeptids. In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung ist das Nativsequenz-PRO181-Polypeptid ein reifes oder Volllängen-Nativsequenz-PRO181-Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 144 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) umfasst.
Die „extrazelluläre Domäne" oder „ECD" eines PRO-Polypeptids bezieht sich auf eine Form des PRO-Polypeptids, die im Wesentlichen frei von Transmembran- oder zytoplasmatischen Domänen ist. Für gewöhnlich wird eine PRO-Polypeptid-ECD weniger als 1% derartige Transmembran- und/oder zytoplasmatische Domänen aufweisen und wird vorzugsweise weniger als 0,5% derartige Domänen aufweisen. Es versteht sich, dass jegliche für die PRO-Polypeptide der vorliegenden Erfindung identifizierte Transmembrandomänen gemäß Kriterien identifiziert werden, die auf dem Gebiet der Erfindung zur Identifizierung dieses Typs einer hydrophoben Domäne routinemäßig angewendet werden. Die genauen Begrenzungen einer Transmembrandomäne können variieren, jedoch höchstwahrscheinlich um nicht mehr als ungefähr 5 Aminosäuren an beiden Enden der anfänglich identifizierten Domäne. Gegebenenfalls kann eine extrazelluläre Domäne eines PRO-Polypeptids ungefähr 5 oder weniger Aminosäuren der beiden Enden der anfänglich identifizierten Transmembrandomäne enthalten.
Unter „PRO-Polypeptidvariante" wird ein oben oder unten definiertes aktives PRO-Polypeptid verstanden, das zumindest ungefähr 80% Aminosäuresequenzidentität mit der hierin offenbarten Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz voller Länge aufweist. Derartige PRO-Polypeptidvarianten umfassen beispielsweise PRO-Polypeptide, worin ein oder mehrere Aminosäurereste am N- oder C-Terminus der nativen A minosäuresequenz voller Länge addiert oder deletiert sind. Für gewöhnlich wird eine PRO-Polypeptidvariante zumindest ungefähr 80% Aminosäuresequenzidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 85% Aminosäuresequenzidentität und noch bevorzugter zumindest ungefähr 90% Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest ungefähr 91% Aminosäuresequenzidentität, sogar noch bevorzugter zumindest ungefähr 92% Aminosäuresequenzidentität, sogar noch bevorzugter zumindest ungefähr 93% Aminosäuresequenzidentität, sogar noch bevorzugter zumindest ungefähr 94% Aminosäuresequenzidentität, sogar noch bevorzugter zumindest ungefähr 95% Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest ungefähr 96% Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest ungefähr 97% Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest ungefähr 98% Aminosäuresequenzidentität und insbesondere bevorzugt zumindest ungefähr 99% Aminosäuresequenzidentität, mit der Aminosäuresequenz der hierin offenbarten nativen Aminosäuresequenz voller Länge aufweisen.
„Prozent (%) Aminosäuresequenzidentität" bezüglich der hierin identifizierten PRO-Polypeptidsequenzen ist als prozentueller Anteil an Aminosäureresten in einer Kandidatsequenz definiert, der mit den Aminosäureresten in der speziellen PRO-Polypeptidsequenz identisch ist, und zwar nach Angleichung der Sequenzen und Einführung von Lücken, die erforderlichenfalls notwendig ist, um die maximale prozentuelle Sequenzidentität zu erzielen, wobei jegliche konservative Substitutionen als Teil der Sequenzidentität unberücksichtigt bleiben. Eine Angleichung zum Zwecke der Ermittlung der prozentuellen Aminosäuresequenzidentität kann auf verschiedene Weisen erzielt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung gebräuchlich sind, beispielsweise die Verwendung von öffentlich erhältlicher Computersoftware, wie z.B. BLAST-, BLAST-2-, ALIGN- oder Megalign-Software (DNASTAR). Das bevorzugte Angleichungs-Softwareprogramm ist BLAST. Der Fachkundige auf dem Gebiet der Erfindung kann die geeigneten Parameter zur Messung der Angleichung ermitteln, einschließlich jeglicher Algorithmen, die zur Erzielung der maximalen Angleichung über die volle Länge von zu vergleichenden Sequenzen notwendig sind. Die hierin verwendeten%-Werte der Identität sind unter Verwendung des WU-BLAST-2-Computerprogramms (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460–480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/README.html) erzeugt worden. Die meisten der WU-BLAST-2-Suchparameter wurden auf die Vorgabewerte gesetzt. Die einstellbaren Parameter wurden auf die folgenden Werte gesetzt: Overlap span = 1, overlap fraction = 0,125, word threshold (T) = 11 und scoring matrix = BLOSUM62. Die HSP-S- und HSP-S2-Parameter, die dynamische, von BLAST-2 verwendete Werte sind, werden von Programm selbst festgelegt, und zwar in Abhängigkeit von der Zusammensetzung der Sequenz von Interesse und der Zusammensetzung der Datenbank, gegen die die Sequenz durchsucht wird. Jedoch können die Werte eingestellt werden, um die Empfindlichkeit zu erhöhen. Der Wert für die% Sequenzidentität wird als Anteil übereinstimmender identischer Reste, geteilt durch die Gesamtzahl von Resten in der angeglichenen Region, ermittelt.
„Prozentuelle (%) Nucleinsäuresequenzidentität" in Bezug auf hierin identifizierte, für PRO kodierende Nucleinsäuresequenzen ist als prozentueller Anteil an Nucleotiden in einer Kandidatsequenz definiert, der mit den Nucleotiden in der PRO-Nucleinsäuresequenz von Interesse identisch ist, und zwar nach Angleichung der Sequenzen und Einführung von Lücken, die erforderlichenfalls zur Erzielung der maximalen prozentuellen Sequenzidentität notwenig ist. Eine Angleichung zum Zwecke der Ermittlung der prozentuellen Aminosäuresequenzidentität kann auf verschiedene Weisen erzielt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung gebräuchlich sind, beispielsweise die Verwendung von öffentlich erhältlicher Computersoftware, wie z.B. BLAST-, BLAST-2-, ALIGN- oder Megalign-Software (DNASTAR). Der Fachkundige auf dem Gebiet der Erfindung kann die geeigneten Parameter zur Messung der Angleichung ermitteln, einschließlich jeglicher Algorithmen, die zur Erzielung der maximalen Angleichung über die volle Länge von zu vergleichenden Sequenzen notwendig sind. Die hierin verwendeten Identitätswerte wurden vom BLASTN-Modul des auf Vorgabeparameter eingestellten WU-BLAST-2 erzeugt, wobei „overlap span" und „overlap fraction" auf 1 bzw. 0,125 eingestellt waren.
Der Ausdruck „Positive" im Zusammenhang mit dem wie oben beschrieben durchgeführten Sequenzvergleich umfasst Reste in den verglichenen Sequenzen, die nicht identisch sind, jedoch ähnliche Eigenschaften aufweisen (z.B. als Ergebnis kon servativer Substitutionen). Der%-Wert an Positiven wird als Anteil der in der BLOSUM-62-Matrix mit einem positiven Wert bewerteten Reste, geteilt durch die Gesamtzahl an Resten in der angeglichenen Region, wie oben definiert ermittelt.
Der Ausdruck „epitopmarkiert" bezieht sich bei Verwendung hierin auf ein chimäres Polypeptid, das ein PRO-Polypeptid oder eine Domänensequenz davon umfasst, das/die an ein „Markerpolypeptid" fusioniert ist. Das Markerpolypeptid weist eine ausreichende Anzahl von Resten auf, um ein Epitop bereitzustellen, gegen das ein Antikörper hergestellt werden kann, oder das mit irgendeinem anderen Mittel identifiziert werden kann, ist jedoch ausreichend kurz, so dass es die Aktivität des PRO-Polypeptids von Interesse nicht stört. Das Markerpolypeptid ist vorzugsweise ziemlich einzigartig, so dass der Antikörper nicht wesentlich mit anderen Epitopen kreuzreagiert. Geeignete Markerpolypeptide weisen im Allgemeinen zumindest sechs Aminosäurereste und üblicherweise zwischen ungefähr 8 und ungefähr 50 Aminosäurereste (vorzugsweise zwischen ungefähr 10 bis ungefähr 20 Reste) auf.
Unter „isoliert" wird bei Verwendung zur Beschreibung der hierin offenbarten verschiedenen Polypeptide ein Polypeptid verstanden, das identifiziert und aus einer Komponente seiner natürlichen Umgebung abgetrennt und/oder gewonnen worden ist. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die typischerweise diagnostische oder therapeutische Verwendungen für das Polypeptid stören würden, und können Enzyme, Hormone und andere proteinartige oder nicht proteinartige Gelöststoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Polypeptid gereinigt, und zwar (1) auf ein Ausmaß, das ausreicht, um zumindest 15 Reste der N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz bei Verwendung eines Zentrifugenröhrchen-Sequenzierers („spinning cup sequenator") zu erhalten, oder (2) bis zur Homogenität mittels SDS-PAGE unter nicht reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau oder, vorzugsweise, Silberfärbung. Ein isoliertes Polypeptid umfasst ein Polypeptid in situ in rekombinanten Zellen, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des PRO-Polypeptids nicht vorhanden sein wird. Für gewöhnlich wird jedoch ein isoliertes Polypeptid durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
Eine für ein „isoliertes" PRO-Polypeptid" kodierende Nucleinsäure ist ein Nucleinsäuremolekül, das identifiziert und von zumindest einem verunreinigenden Nucleinsäuremolekül abgetrennt ist, mit dem es für gewöhnlich in der natürlichen Quelle der PRO-Polypeptid-Nucleinsäure assoziiert ist. Ein isoliertes PRO-Polypeptid-Nucleinsäuremolekül liegt in einer anderen Form oder in einem anderen Milieu als in der Natur vor. Isolierte PRO-Polypeptid-Nucleinsäuremoleküle unterscheiden sich daher vom speziellen PRO-Polypeptid-Nucleinsäuremolekül, wie es in natürlichen Zellen vorliegt. Jedoch umfasst ein isoliertes PRO-Polypeptid-Nucleinsäuremolekül PRO-Polypeptid-Nucleinsäuremoleküle, die in Zellen enthalten sind, die für gewöhnlich das PRO-Polypeptid exprimieren, wo sich beispielsweise das Nucleinsäuremolekül an einem Chromosomenort befindet, der sich von dem natürlicher Zellen unterscheidet.
Der Ausdruck „Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die zur Expression einer operabel gebundenen kodierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig sind. Die für Prokaryoten geeigneten Kontrollsequenzen umfassen beispielsweise einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz und eine Ribosombindungsstelle. Eukaryotische Zellen setzen bekannterweise Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer ein.
Eine Nucleinsäure ist „operabel gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung zu einer weiteren Nucleinsäuresequenz gesetzt wird. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder für einen Sekretionsleader operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als ein Präprotein exprimiert wird, das sich an der Sekretion des Polypeptids beteiligt; ein Promotor oder Enhancer ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosombindungsstelle ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass die Translation erleichtert wird. Im Allgemeinen bedeutet „operabel gebunden", dass die verbundenen DNA-Sequenzen zusammenhängend und im Falle eines Sekretionsleaders zusammenhängend und in Lesephase sind. Jedoch müssen Enhancer nicht zusammenhängend sein. Die Bindung wird durch Ligation an zweckdienlichen Restriktionsstellen erzielt. Falls derartige Stellen nicht vorhanden sind, werden die synthetischen Oligonucleotidadaptoren oder Linker gemäß herkömmlicher Praxis verwendet.
Der Ausdruck „Antikörper" wird in weitesten Sinne verwendet und umfasst im Speziellen einzelne monoklonale Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper (einschließlich Agonisten-, Antagonisten- und neutralisierende Antikörper) und Anti-PRO-Polypeptid-Antikörperzusammensetzungen mit polyepitopischer Spezifität. Der Ausdruck „monoklonaler Antikörper" bezieht sich bei Verwendung hierin auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten wurde, d.h. die einzelnen, die Population umfassenden Antikörper sind identisch mit Ausnahme von möglichen natürlich vorkommenden Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können.
„Aktiv" oder „Aktivität" bezieht sich zu den Zwecken hierin auf (eine) Form(en) eines PRO-Polypeptids, welche die biologischen und/oder immunologischen Aktivitäten des speziellen nativen oder natürlich vorkommenden PRO-Polypeptids beibehält/beibehalten.
„Behandlung" oder „behandeln" bezieht sich auf therapeutische Behandlung sowie prophylaktische oder vorbeugende Maßnahmen. Jene, die einer Behandlung bedürfen, umfassen jene, bei denen die Störung bereits vorliegt, sowie jene, die für die Störung anfällig sind, oder jene, bei denen die Störung zu verhindern ist.
„Säugetier" zum Zwecke der Behandlung bezieht sich auf jegliches als Säugetier klassifiziertes Tier, einschließlich Menschen, domestizierte und Nutztiere und Zoo-, Sport- oder Haustiere, wie z.B. Schafe, Hunde, Pferde, Katzen, Rinder und dergleichen. Vorzugsweise ist das Säugetier hierin ein Mensch.
Wie hierin verwendet, umfassen „Träger" pharmazeutisch annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren, die für die damit exponierte Zelle oder das damit exponierte Säugetier bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch sind. Häufig ist der physiologisch annehmbare Träger eine wässrige pH- gepufferte Lösung. Beispiele physiologisch annehmbarer Träger umfassen Puffer, wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien, einschließlich Ascorbinsäure; niedermolekulare (weniger als ungefähr 10 Reste) Polypeptide; Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner, wie z.B. EDTA; Zuckeralkohole, wie z.B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie z.B. Natrium; und/oder nichtionische Tenside, wie z.B. TWEEN^TM, Polyethylenglykol (PEG) und PLURONICS^TM.
Der Ausdruck „Agonist" wird verwendet, um sich auf Peptid- oder Nicht-Peptid-Analoga der nativen PRO-Polypeptide (wobei sich natives PRO-Polypeptid auf Pro-PRO-Polypeptid, Prä-PRO-Polypeptid, Präpro-PRO-Polypeptid oder reifes PRO-Polypeptid bezieht) der vorliegenden Erfindung und auf Antikörper zu beziehen, die solche nativen PRO-Polypeptide spezifisch binden, und zwar unter der Voraussetzung, dass sie zumindest eine biologische Aktivität eines nativen PRO-Polypeptids beibehalten. Vorzugsweise behalten die Agonisten der vorliegenden Erfindung die qualitativen Bindungserkennungseigenschaften und Rezeptoraktivierungseigenschaften des nativen PRO-Polypeptids bei.
Der Ausdruck „Antagonist" wird verwendet, um sich auf ein Molekül zu beziehen, das eine biologische Aktivität eines nativen PRO-Polypeptids der vorliegenden Erfindung hemmt, worin sich natives PRO-Polypeptid auf Pro-PRO-Polypeptid, Prä-PRO-Polypeptid, Präpro-PRO-Polypeptid oder reifes PRO-Polypeptid bezieht. Vorzugsweise hemmen die Antagonisten hierin die Bindung eines nativen PRO-Polypeptids der vorliegenden Erfindung an einen Bindungspartner. Ein PRO-Polypeptid-„Antagonist" ist ein Molekül, das eine PRO-Antagonist-Effektorfunktion verhindert oder diese stört (z.B. ein Molekül, das die Bindung und/oder Aktivierung eines PRO-Polypeptid-Rezeptors durch PRO-Polypeptid verhindert oder diese stört). Solche Moleküle können auf ihre Fähigkeit hin gescreent werden, die PRO-Polypeptid-Rezeptoraktivierung kompetitiv zu hemmen, indem beispielsweise die Bindung des nativen PRO- Polypeptids in Gegenwart und Abwesenheit des Test-Antagonistenmoleküls gemessen wird. Ein Antagonist der Erfindung umfasst außerdem ein Antisense-Polynucleotid gegen das PRO-Polypeptid-Gen, wobei das Antisense-Polynucleotid die Transkription oder Translation des PRO-Polypeptid-Gens blockiert, wodurch seine Expression und biologische Aktivität gehemmt wird.
Die „Stringenz" von Hybridisierungsreaktionen ist vom Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung leicht zu bestimmen und ist im Allgemeinen eine empirische Berechnung, die von der Sondenlänge, Waschtemperatur und Salzkonzentration abhängt. Im Allgemeinen erfordern längere Sonden höhere Temperaturen für die richtige Anellierung, während kürzere Sonden niedrigere Temperaturen benötigen. Die Hybridisierung hängt im Allgemeinen von der Fähigkeit denaturierter DNA zur Reanellierung ab, wenn komplementäre Stränge in einer Umgebung unter ihrer Schmelztemperatur vorhanden sind. Je höher der Grad an gewünschter Homologie zwischen der Sonde und der hybridisierbaren Sequenz, desto höher die jeweilige Temperatur, die verwendet werden kann. Als Ergebnis folgt, dass höhere jeweilige Temperaturen dazu tendieren, die Reaktionsbedingungen stringenter zu machen, während niedrigere Temperaturen dies weniger tun. Für weitere Einzelheiten und Erläuterungen von Stringenz und Hybridisierungsreaktionen siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995).
„Stringente Bedingungen" bedeutet (1) den Einsatz niedriger Ionenstärke und hoher Temperatur zum Waschen, beispielsweise 0,015 Natriumchlorid/0,0015 M Natriumcitrat/0,1% Natriumdodecylsulfat bei 50°C, oder (2) den Einsatz eines Denaturierungsmittels, wie z.B. Formamid, während der Hybridisierung, beispielsweise 50 Vol.-% Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 nM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C. Ein weiteres Beispiel ist die Verwendung von 50% Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6/8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt-Lösung, beschallte Lachsspermien-DNA (50 μg/ml), 0,1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42°C mit Waschungen bei 42°C in 0,2 × SSC und 0,1% SDS. Noch ein weiteres Beispiel ist die Hybridisierung unter Verwendung eines Puffers von 10% Dextransulfat, 2 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat) und 50% Formamid bei 55°C, gefolgt von einem hoch stringenten Waschvorgang, bestehend aus EDTA enthaltendem 0,1 × SSC bei 55°C.
„Mäßig stringente Bedingungen" werden in Sambrook et al., s.o., beschrieben und umfassen die Verwendung einer Waschlösung und Hybridisierungsbedingungen (z.B. Temperatur, Ionenstärke und% SDS), die weniger stringent als die oben beschriebenen sind. Ein Beispiel von mäßig stringenten Bedingungen ist eine Bedingung wie z.B. die Inkubation über Nacht bei 37°C in einer Lösung, umfassend: 20 Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10% Dextransulfat und 20 mg/ml denaturierte gescherte Lachsspermien-DNA, gefolgt vom Waschen der Filter in 1 × SSC bei ungefähr 37–50°C. Der Fachkundige wird erkennen, wie Temperatur, Ionenstärke usw. erforderlichenfalls einzustellen sind, um Faktoren, wie z.B. der Sondenlänge und dergleichen, Rechnung zu tragen.
„Southern-Analyse" oder „Southern-Blotting" ist ein Verfahren, mit dem die Gegenwart von DNA-Sequenzen in einem Restriktionsendonucleaseverdau von DNA oder einer DNA enthaltenden Zusammensetzung durch Hybridisierung an ein bekanntes, markiertes Oligonucleotid oder DNA-Fragment bestätigt wird. Die Southern-Analyse umfasst typischerweise die elektrophoretische Trennung von DNA-Verdauungen an Agarosegelen, die Denaturierung der DNA nach elektrophoretischer Trennung und den Transfer der DNA auf Nitrozellulose, Nylon oder auf einen anderen geeigneten Membranträger zur Analyse mit einer radioaktiv markierten, biotinylierten oder enzymmarkierten Sonde, wie in den Abschnitten 9.37–9.52 von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989), beschrieben wird.
„Northern-Analyse" oder „Northern-Blotting" ist ein Verfahren, dass zur Identifizierung von RNA-Sequenzen verwendet wird, die an eine bekannte Sonde, wie z.B. an ein Oligonucleotid, DNA-Fragment, eine cDNA oder ein Fragment davon oder an ein RNA-Fragment, hybridisieren. Die Sonde ist mit einem Radioisotop, wie z.B. ³²P, o der mittels Biotinylierung oder mit einem Enzym markiert. Die zu analysierende RNA wird üblicherweise an einem Agarosegel oder Polyacrylamidgel elektrophoretisch getrennt, auf Nitrozellulose, Nylon oder auf eine andere geeignete Membran transferiert und mit der Sonde hybridisiert, und zwar unter Verwendung von Standardtechniken, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind, wie z.B. jenen, die in den Abschnitten 7.39–7.52 von Sambrook et al., s.o., beschrieben werden.
Wie hierin verwendet, bezeichnet „Immunoadhäsin" antikörperartige Moleküle, welche die Bindungsspezifität eines heterologen Proteins (eines „Adhäsins") mit der Effektorfunktion von Immunglobulin-Konstantdomänen vereinigen. Strukturell umfassen Immunoadhäsine eine Fusion einer Aminosäuresequenz mit der gewünschten Bindungsspezifität, die nicht die Antigenerkennungs- und Bindungsstelle eines Antikörpers ist (d.h. sie ist „heterolog"), mit einer Immunglobulin-Konstantdomänensequenz. Der Adhäsin-Abschnitt eines Immunoadhäsinmoleküls ist typischerweise eine zusammenhängende Aminosäuresequenz, die zumindest die Bindungsstelle eines Rezeptors oder eines Liganden umfasst. Die Immunglobulin-Konstantdomänensequenz im Immunoadhäsin kann von jedem Immunglobulin, wie z.B. von IgG-1-, IgG-2-, IgG-3- oder IgG-4-Subtypen, IgA (einschließlich IgA-1 und IgA-2), IgE, IgD oder IgM, erlangt werden.
„Chronische" Verabreichung bezieht sich auf die Verabreichung des/der Mittel(s) auf kontinuierliche Weise im Gegensatz zu einer akuten Weise, so dass die anfängliche therapeutische Wirkung (Aktivität) für einen verlängerten Zeitraum aufrechterhalten wird. „Periodische" Verabreichung ist eine Behandlung, die nicht fortlaufend ohne Unterbrechung erfolgt, sondern zyklischer Natur ist.
Verabreichung „in Kombination mit" einem oder mehreren weiteren therapeutischen Mitteln umfasst simultane (gleichzeitige) und aufeinander folgende Verabreichung in beliebiger Reihenfolge.
Der Ausdruck „Expressionsvektor" wird verwendet, um einen Vektor zu definieren, in dem eine für ein PRO-Polypeptid hierin kodierende Nucleinsäure operabel an Kon trollsequenzen gebunden ist, die fähig sind, seine Expression in einer geeigneten Wirtszelle zu bewirken. Vektoren tragen für gewöhnlich eine Replikationsstelle (obgleich sie nicht notwendig ist, wo eine chromosomale Integration auftritt). Expressionsvektoren umfassen außerdem Markersequenzen, die fähig sind, für die phänotypische Selektion in transformierten Zellen zu sorgen. Beispielsweise wird E. coli typischerweise unter Verwendung von pBR322 transformiert, einem Plasmid, das aus einer E.-coli-Spezies stammt (Bolivar et al., Gene 2, 95 [1977]). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und stellt folglich ein einfaches Mittel zur Identifizierung transformierter Zellen zum Zwecke der Klonierung oder Expression bereit. Expressionsvektoren werden optimalerweise Sequenzen enthalten, die zur Kontrolle der Transkription und Translation zweckdienlich sind, z.B. Promotoren und Shine-Dalgarno-Sequenzen (für Prokaryoten) oder Promotoren und Enhancer (für Säugetierzellen). Die Promotoren können, müssen aber nicht, induzierbar sein; es sind sogar leistungsfähige konstitutive Promotoren, wie z.B. der CMV-Promotor für Säugetierwirte, gefunden worden, um LHR ohne Wirtszelltoxizität zu produzieren. Obgleich es denkbar ist, dass Expressionsvektoren keine die Expression kontrollierenden, replikativen Sequenzen oder Selektionsgene enthalten müssen, kann ihr Fehlen die Identifizierung von Hybridtransformanten und die Erzielung einer Hybridimmunglobulinexpression in hohem Ausmaß behindern.
Der Ausdruck „Lipopolysaccharid" oder „LPS" wird hierin als Synonym für „Endotoxin" verwendet. Lipopolysaccharide (LPS) sind charakteristische Komponenten der äußeren Membran von Gram-negativen Bakterien, z.B. Escherichia coli. Sie bestehen aus einem Polysaccharid-Teil und einem Fett, das Lipid A genannt wird. Das Polysaccharid, das unter den Bakterienspezies variiert, ist aus der O-spezifischen Kette (aus wiederholenden Einheiten von drei bis acht Zuckern aufgebaut) und dem zweiteiligen Kern aufgebaut. Lipid A umfasst praktisch immer zwei durch Phosphat modifizierte Glucosaminzucker und eine variable Anzahl von Fettsäuren. Für weitere Informationen siehe beispielsweise Rietschel und Brade, Scientific American, 54–61 (August 1992).
Der Ausdruck „septischer Schock" wird hierin im weitesten Sinne verwendet und umfasst alle Definitionen, die in Bone, Ann. Intern. Med. 114, 332–333 (1991), offenbart sind. Im Speziellen beginnt der septische Schock mit einer systemischen Reaktion auf Infektion, ein Syndrom, das Sepsis genannt wird. Wenn dieses Syndrom in Hypotonie und Organversagen resultiert, wird er septischer Schock genannt. Septischer Schock kann durch Gram-positive Organismen und Pilze ausgelöst werden, sowie durch Endotoxin enthaltende Gram-negative Organismen. Demgemäß ist die vorliegende Definition nicht auf „Endotoxinschock" eingeschränkt.
Die Ausdrücke „Genamplifikation" und „Genduplikation" werden wechselseitig verwendet und beziehen sich auf einen Prozess, durch den mehrfache Kopien eines Gens oder Genfragments in einer bestimmten Zellen oder Zelllinie gebildet werden. Die duplizierte Region (ein Abschnitt amplifizierter DNA) wird häufig als „Amplicon" bezeichnet. Üblicherweise erhöht sich die Menge an produzierter Messenger-RNA (mRNA), d.h. das Ausmaß der Genexpression, ebenfalls im Verhältnis zur Anzahl der vom jeweiligen exprimierten Gen hergestellten Kopien.
„Tumor" bezieht sich bei Verwendung hierin auf jede(s) neoplastische Zellwachstum und Vermehrung, ob bös- oder gutartig, und auf alle präkanzerösen und kanzerösen Zellen und Gewebe. Die Ausdrücke „Krebs" und „kanzerös" beziehen sich auf oder beschreiben den physiologischen Zustand in Säugetieren, der typischerweise durch unreguliertes Zellwachstum gekennzeichnet ist. Beispiele von Krebs umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Karzinom, Lymphom, Blastom, Sarkom und Leukämie. Speziellere Beispiele derartiger Krebsformen umfassen Brustkrebs, Prostatakrebs, Darmkrebs, Plattenepithelkarzinom, kleinzelliges Lungenkarzinom, nicht kleinzelliges Lungenkarzinom, Magen-Darm-Krebs, Pankreaskrebs, Glioblastom, Zervixkarzinom, Eierstockkrebs, Leberkrebs, Blasenkrebs, Hepatom, kolorektales Karzinom, Endometriumkarzinom, Speicheldrüsenkarzinom, Nierenkrebs, Vulvakarzinom, Schilddrüsenkrebs, Leberkrebs und verschiedene Arten von Kopf- und Nackenkrebs.
Der Ausdruck „zytotoxisches Mittel" bezieht sich bei Verwendung hierin auf eine Substanz, welche die Funktion von Zellen hemmt oder verhindert und/oder die Zer störung von Zellen bewirkt. Der Ausdruck umfasst radioaktive Isotope (z.B. I131, I125, Y90 und Re186), chemotherapeutische Mittel und Toxine, wie z.B. enzymatisch aktive Toxine bakteriellen, pilzlichen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs oder Fragmente davon.
Ein „chemotherapeutisches Mittel" ist eine chemische Verbindung, die zur Krebsbehandlung zweckdienlich ist. Beispiele chemotherapeutischer Mittel umfassen Adriamycin, Doxorubicin, Epirubicin, 5-Fluoruracil, Cytosinarabinosid („Ara-C"), Cyclophosphamid, Thiotepa, Busulfan, Cytoxin, Taxoide, z.B. Paclitaxel (Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) und Doxetaxel (Taxotere, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France), Toxotere, Methotrexat, Cisplatin, Melphalan, Vinblastin, Bleomycin, Etoposid, Ifosfamid, Mitomycin C, Mitoxantron, Vincristin, Vinorelbin, Carboplatin, Teniposid, Daunomycin, Carminomycin, Aminopterin, Dactinomycin, Mitomycine, Esperamicine (siehe US-Patent Nr. 4.675.187), Melphalan und andere verwandte Stickstoffsenfgase. Ebenfalls in dieser Definition umfasst sind hormonelle Mittel, die wirken, um die Hormonwirkung auf Tumoren zu regulieren oder zu hemmen, wie z.B. Tamoxifen und Onapriston.
Ein „wachstumshemmendes Mittel" bezieht sich bei Verwendung hierin auf eine Verbindung oder Zusammensetzung, die das Wachstum einer Zelle, insbesondere einer Krebszelle hemmt und die irgendeines der hierin identifizierten Gene entweder in vitro oder in vivo überexprimiert. Folglich ist das wachstumshemmende Mittel eines, das den prozentuellen Anteil an Zellen, die derartige Gene in der S-Phase überexprimieren, signifikant vermindert. Beispiele wachstumshemmender Mittel umfassen Mittel, welche die Abfolge des Zellzyklus blockieren (an einer Stelle, die nicht die S-Phase ist), wie z.B. Mittel, die G1-Stillstand und M-Phasen-Stillstand auslösen. Klassische M-Phasen-Blocker umfassen die Vincas- (Vincristin und Vinblastin), Taxol- und Topo-II-Inhibitoren, wie z.B. Doxorubicin, Epirubicin, Daunorubicin, Etoposid und Bleomycin. Jene Mittel, die G1 zum Stillstand bringen, erstrecken sich auch in den S-Phasen-Stillstand, beispielsweise DNA-alkylierende Mittel, wie z.B. Tamoxifen, Prednison, Dacarbazin, Mechlorethamin, Cisplatin, Methotrexat, 5-Fluoruracil und Ara-C. Weitere Informationen finden sich in The Molecular Basis of Cancer, Mendel sohn und Israel (Hrsg.), Kapitel 1, mit dem Titel „Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" von Murakami et al., WB Saunders, Philadelphia (1995), insbesondere S. 13.
„Doxorubicin" ist ein Anthracyclin-Antibiotikum.
Der Ausdruck „Zytokin" ist ein allgemeiner Ausdruck für Proteine, die von einer Zellpopulation freigesetzt werden, die an einer anderen Zelle als intrazelluläre Vermittler wirken. Beispiele solcher Zytokine sind Lymphokine, Monokine und herkömmliche Polypeptidhormone. Unter den Zytokinen umfasst sind Wachstumshormon, wie z.B. menschliches Wachstumshormon, menschliches N-Methionyl-Wachstumshormon und Rinderwachstumshormon; Parathyroidhormon; Thyroxin; Insulin; Proinsulin; Relaxin; Prorelaxin; und dergleichen. Wie hierin verwendet, umfasst der Ausdruck Zytokin Proteine aus natürlichen Quellen oder aus rekombinanter Zellkultur und biologisch aktive Äquivalente der Nativsequenz-Zytokine.
„Native Antikörper" und „native Immunglobuline" sind üblicherweise heterotetramere Glykoproteine von ungefähr 150.000 Dalton, die aus zwei identischen Leicht- (L-) Ketten und zwei identischen Schwer- (H-) Ketten zusammengesetzt sind. Jede Leichtkette ist durch eine kovalente Disulfidbindung an die Schwerkette gebunden, während die Anzahl an Disulfidbindungen unter den Schwerketten verschiedener Immunglobulintypen variiert. Jede Schwer- und Leichtkette weist auch in regelmäßigen Abständen Interketten-Disulfidbrücken auf. Jede Schwerkette weist an einem der Enden eine variable Domäne (VH), gefolgt von einer Anzahl von konstanten Domänen auf. Jede Leichtkette weist eine variable Domäne an einem der Enden (VL) und eine konstante Domäne an ihrem anderen Ende auf; die konstante Domäne der Leichtkette ist an der ersten konstanten Domäne der Schwerkette ausgerichtet, und die variable Leichtkettendomäne ist an der variablen Domäne der Schwerkette ausgerichtet. Von bestimmten Aminosäureresten wird angenommen, dass sie eine Schnittstelle zwischen den variablen Leicht- und Schwerkettendomänen bilden.
Der Ausdruck „variabel" bezieht sich auf die Tatsache, dass gewisse Abschnitte der variablen Domänen sich hinsichtlich ihrer Sequenz unter Antikörpern stark unterscheiden und für die Bindung und Spezifität jedes einzelnen Antikörpers für sein spezielles Antigen verwendet werden. Jedoch ist die Variabilität nicht gleichmäßig über die variablen Domänen von Antikörpern verteilt. Sie ist in drei Segmenten konzentriert, die Complementary-determining-regions (CDRs) oder hypervariable Regionen in den variablen Leichtketten- sowie Schwerkettendomänen genannt werden. Die stärker konservierten Abschnitte variabler Domänen werden Gerüst (FR) genannt. Die variablen Domänen nativer Schwer- und Leichtketten umfassen jeweils vier FR-Regionen, die größtenteils eine β-Faltblattstruktur einnehmen, die durch drei CDRs verbunden sind, die Schleifen bilden, welche die β-Faltblattstruktur verbinden und in manchen Fällen einen Teil davon bilden. Die CDRs in jeder Kette werden durch die FR-Regionen nahe beieinander gehalten und tragen mit den CDRs der anderen Kette zur Bildung der Antigenbindungsstelle von Antikörpern bei (siehe Kabat et al., NIH-Publ. Nr. 91-3242, Bd. 1, S. 647–669 (1991)). Die konstanten Domänen sind nicht direkt an der Bindung eines Antikörpers an ein Antigen beteiligt, zeigen jedoch verschiedene Effektorfunktionen, wie z.B. die Teilnahme des Antikörpers an der antikörperabhängigen Zelltoxizität.
„Antikörperfragmente" umfassen einen Abschnitt eines intakten Antikörpers, vorzugsweise die antigenbindende oder variable Region des intakten Antikörpers. Beispiele von Antikörperfragmenten umfassen Fab-, Fab'-, F(ab')2- und Fv-Fragmente; Diabodies; lineare Antikörper (Zapata et al., Protein Eng. 8(10), 1057–1062 [1995]); Einzelketten-Antikörpermoleküle und multispezifische Antikörper, die aus Antikörperfragmenten gebildet werden.
Der Papainverdau von Antikörpern produziert zwei identische antigenbindende Fragmente, die „Fab"-Fragmente genannt werden, wobei jedes eine einzelne Antigenbindungsstelle aufweist, und ein „Fc"-Restfragment, eine Bezeichnung, welche die Fähigkeit widerspiegelt, leicht zu kristallisieren. Die Pepsinbehandlung liefert ein F(ab')2-Fragment, das zwei antigenkombinierende Stellen aufweist und nach wie vor zur Antigenvernetzung fähig ist.
„Fv" ist das minimale Antikörperfragment, das eine vollständige Antigenerkennungs- und Bindungsstelle enthält. Diese Region besteht aus einem Dimer einer variablen Schwer- und einer variablen Leichtkettendomäne in enger, nicht-kovalenter Verbindung. Es ist diese Konfiguration, in der die drei CDRs jeder variablen Domäne Wechselwirken, um eine Antigenbindungsstelle an der Oberfläche des VH-VL-Dimers zu definieren. Zusammen verleihen die sechs CDRs dem Antikörper die Antigenbindungsspezifität. Jedoch hat sogar eine einzelne variable Domäne (oder die Hälfte eines Fv, das nur drei für ein Antigen spezifische CDRs umfasst) die Fähigkeit, Antigen zu erkennen und zu binden, obgleich bei einer niedrigeren Affinität als die gesamte Bindungsstelle.
Das Fab-Fragment enthält außerdem die konstante Domäne der Leichtkette und die erste konstante Domäne (CH1) der Schwerkette. Fab-Fragmente unterscheiden sich von Fab-Fragmenten durch die Hinzufügung einiger Reste am Carboxyterminus der Schwerketten-CH1-Domäne, einschließlich eines oder mehrerer Cysteine aus der Antikörper-Gelenkregion. Fab'-SH ist hierin die Bezeichnung für Fab', in dem der/die Cysteinrest(e) der konstanten Domänen eine freie Thiolgruppe trägt. F(ab')2-Antikörperfragmente wurden ursprünglich als Paare von Fab'-Fragmenten produziert, zwischen denen sich Gelenk-Cysteine befinden. Andere chemische Kopplungen von Antikörperfragmenten sind ebenfalls bekannt.
Die „Leichtketten" von Antikörpern (Immunglobulinen) aus jeglicher Vertebratenspezies können einer von zwei klar zu unterscheidenden Typen, die Kappa und Lambda genannt werden, auf Basis der Aminosäuresequenzen ihrer konstanten Domänen zugeordnet werden.
In Abhängigkeit von der Aminosäuresequenz der konstanten Domäne ihrer Schwerketten können Immunglobuline verschiedenen Klassen zugeordnet werden. Es gibt fünf Hauptklassen von Immunglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, und mehrere dieser Klassen können in Unterklassen (Isotypen) weiter unterteilt werden, z.B. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA und IgA2.
„Einzelketten-Fv"- oder „sFv"-Antikörperfragmente umfassen die VH- und VL-Domänen des Antikörpers, worin diese Domänen in einer einzigen Polypeptidkette vorliegen. Vorzugsweise umfasst das Fv-Polypeptid weiters einen Polypeptidlinker zwischen den VH- und VL-Domänen, der es dem sFv ermöglicht, die gewünschte Struktur für die Antigenbindung auszubilden. Für einen Überblick über sFv siehe Pluckthun in The Pharmacology of Monoklonal Antibodies, Bd. 113, Rosenburg und Moore (Hrsg.), Springer-Verlag, New York, S. 269–315 (1994).
Der Ausdruck „Diabodies" bezieht sich auf kleine Antikörperfragmente mit zwei Antigenbindungsstellen, wobei diese Fragmente eine variable Schwerkettendomäne (VH) umfassen, die mit einer variablen Leichtkettendomäne (VL) in derselben Polypeptidkette verbunden ist (VH-VL). Durch Verwendung eines Linkers, der zu kurz ist, um eine Paarung zwischen den beiden Domänen an derselben Kette zu ermöglichen, sind die Domänen gezwungen, sich mit komplementären Domänen einer anderen Kette zu paaren und zwei Antigenbindungsstellen zu erzeugen. Diabodies werden beispielsweise in EP 404.097 ; WO 93/11161 und Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444–6448 (1993), vollständiger beschrieben.
Ein „isolierter" Antikörper ist einer, der identifiziert und von einer Komponente seiner natürlichen Umgebung abgetrennt und/oder gewonnen worden ist. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die die diagnostischen oder therapeutischen Verwendungen für den Antikörper stören würden und können Enzyme, Hormone und andere proteinartige und nicht proteinartige Gelöststoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird der Antikörper gereinigt, und zwar (1) auf ein mittels Lowry-Verfahren bestimmtes Ausmaß von mehr als 95 Gew.-% Antikörper und insbesondere mehr als 99 Gew.-%, (2) auf ein Ausmaß, das ausreicht, um zumindest 15 Reste der N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz unter Verwendung eines Zentrifugenröhrchen-Sequenzierers zu erlangen, oder (3) bis zur Homogenität mittels SDS-PAGE unter reduzierenden oder nicht reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau oder, vorzugsweise, Silberfärbung. Ein isolierter Antikörper umfasst den Antikörper in situ in rekombinanten Zellen, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des Antikörpers feh len wird. Für gewöhnlich wird jedoch ein isolierter Antikörper durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
Der Ausdruck „Marken" bezieht sich bei Verwendung hierin auf eine nachweisbare Verbindung oder Zusammensetzung, die direkt oder indirekt an den Antikörper konjugiert ist, so dass ein „markierter" Antikörper erhalten wird. Der Marker kann selbst nachweisbar sein (z.B. Radioisotopmarker oder Fluoreszenzmarker) oder kann, im Falle eines enzymatischen Markers, eine nachweisbare chemische Veränderung einer Substratverbindung oder Zusammensetzung katalysieren.
Unter „Festphase" wird eine nicht-wässrige Matrix verstanden, an die der Antikörper der vorliegenden Erfindung anhaften kann. Beispiele von hierin vorgesehenen Festphasen umfassen jene, die teilweise oder völlig aus Glas gebildet werden (z.B. Controlled-pore-Glas), Polysaccharide (z.B. Agarose), Polyacrylamide, Polystyrol, Polyvinylalkohol und Silikone. In gewissen Ausführungsformen, in Abhängigkeit vom Zusammenhang, kann die Festphase den Napf einer Testplatte umfassen; in anderen ist sie eine Reinigungssäule (z.B. eine Affinitätschromatographiesäule). Dieser Ausdruck umfasst auch eine diskontinuierliche Festphase getrennter Teilchen, wie z.B. jene, die im US-Patent Nr. 4.275.149 beschrieben sind.
Ein „Liposom" ist ein kleines Vesikel, das sich aus verschiedenen Lipidtypen, Phospholipiden und/oder Tensid zusammensetzt und zur Abgabe eines Medikaments an ein Säugetier zweckdienlich ist. Die Komponenten des Liposoms sind üblicherweise in einer Doppelschicht angeordnet, ähnlich zur Lipidanordnung biologischer Membranen.
II. Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung
PRO181-Polypeptide voller Länge
Die Anmelder haben für Polypeptide kodierende Nucleotidsequenzen identifiziert und isoliert, die in der vorliegenden Erfindung als PRO181 bezeichnet werden. Im Be sonderen haben die Anmelder für ein PRO181-Polypeptid kodierende cDNA identifiziert und isoliert, wie ausführlicher in den untenstehenden Beispielen offenbart wird. Unter Verwendung der Sequenzabgleich-Computerprogramme BLAST und FastA haben die Anmelder herausgefunden, dass das PRO181-Polypeptid eine signifikante Ähnlichkeit mit dem Cornichon-Protein aufweist. Dementsprechend wird zur Zeit davon ausgegangen, dass das in der vorliegenden Anwendung offenbarte PRO181-Polypeptid ein Cornichon-Homolog ist.
PRO-Polypeptidvarianten
Zusätzlich zu den hierin beschriebenen Nativsequenz-PRO-Polypeptiden voller Länge wird erwogen, dass PRO-Polypeptidvarianten hergestellt werden können. PRO-Polypeptidvarianten können durch Einführung geeigneter Nucleotidänderungen in die PRO-Polypeptid-DNA oder durch Synthese des gewünschten PRO-Polypeptids hergestellt werden. Der Fachkundige auf dem Gebiet der Erfindung wird anerkennen, dass Aminosäureänderungen posttranslationelle Prozessierungen der PRO-Polypeptide verändern können, wie z.B. das Verändern der Anzahl und Position von Glykosylierungsstellen oder das Verändern der Membranverankerungseigenschaften.
Variationen in den Nativsequenz PRO-Polypeptiden voller Länge oder in verschiedenen Domänen der hierin beschriebenen PRO-Polypeptide können beispielsweise unter Verwendung jeglicher Techniken und Richtlinien für konservative oder nicht konservative Mutationen vorgenommen werden, die beispielsweise im US-Patent Nr. 5.364.934 dargelegt sind. Variationen können eine Substitution, Deletion oder Insertion eines oder mehrerer für das PRO-Polypeptid kodierenden/kodierender Codons sein, die in einer Änderung der Aminosäuresequenz des PRO-Polypeptids im Vergleich zum Nativsequenz-PRO-Polypeptid resultiert. Gegebenenfalls erfolgt die Variation durch Substitution von zumindest einer Aminosäure durch eine beliebige andere Aminosäure in einer oder mehreren Domänen des PRO-Polypeptids. Richtlinien zur Ermittlung des Aminosäurerests, der insertiert, substituiert oder deletiert werden kann, ohne die gewünschte Aktivität nachteilig zu beeinflussen, können durch Ver gleichen der Sequenz des PRO-Polypeptids mit der homologer bekannter Proteinmoleküle und Minimierung der Anzahl vorgenommener Aminosäuresequenzänderungen in Regionen hoher Homologie gefunden werden. Aminosäuresubstitutionen können das Ergebnis des Ersetzens einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften sein, wie z.B. das Ersetzen eines Leucins durch ein Serin, d.h. konservative Aminosäureersetzungen. Insertionen oder Deletionen können gegebenenfalls im Bereich von 1 bis 5 Aminosäuren liegen. Die erlaubte Variation kann durch systematisches Vornehmen von Insertionen, Deletionen und Substitutionen von Aminosäuren in der Sequenz und Testen der resultierenden Varianten auf Aktivität im in den unten stehenden Beispielen beschriebenen In-vitro-Test ermittelt werden.
In speziellen Ausführungsformen sind konservative Substitutionen von Interesse in Tabelle 1 unter dem Titel bevorzugter Substitutionen dargestellt. Falls derartige Substitutionen in einer Änderung der biologischen Aktivität resultieren, werden substantiellere Änderungen, die in Tabelle 1 als beispielhafte Substitutionen bezeichnet sind oder wie sie unten in Bezug auf Aminosäureklassen weitergehend beschrieben sind, eingeführt und die Produkte gescreent. Tabelle 1
Substantielle Modifizierungen der Funktion oder immunologischen Identität des PRO-Polypeptids werden durch Wählen von Substitutionen erzielt, die sich in ihrer Wirkung signifikant unterscheiden, und zwar auf die Erhaltung (a) der Struktur des Polypeptidgerüsts im Bereich der Substitution, beispielsweise als Faltblatt- oder Helix-Konformation, (b) der Ladung oder Hydrophobizität des Moleküls an der Zielstelle oder (c) der Sperrigkeit der Seitenkette. Natürlich vorkommende Reste werden auf Basis gemeinsamer Seitenketteneigenschaften in Gruppen unterteilt:

(1) Hydrophob: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) neutral-hydrophil: Cys, Ser, Thr;
(3) sauer: Asp, Glu;
(4) basisch: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
(5) Reste, welche die Kettenausrichtung beeinflussen: Gly, Pro; und
(6) aromatisch: Trp, Tyr, Phe.

Nicht konservative Substitutionen bedingen den Austausch eines Elements einer dieser Klassen durch eine andere Klasse. Derartige substituierte Reste können auch in die konservativen Substitutionsstellen, bevorzugter in die verbleibenden (nicht konservierten) Stellen, eingeführt werden.
Die Varianten können unter Verwendung von Verfahren hergestellt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie z.B. Oligonucleotid-vermittelte (ortsgerichtete) Mutagenese, Alanin-Scanning und PCR-Mutagenese. Ortsgerichtete Mutagenese [Carter et al., Nucl. Acids Res. 13, 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10, 6487 (1987)], Kassettenmutagenese [Wells et al., Gene 34, 315 (1985)], Restriktionsselektionsmutagenese [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317, 415 (1986)], und andere bekannte Techniken können an klonierter DNA durchgeführt werden, um die gewünschte PRO-Polypeptid-Varianten-DNA herzustellen.
Scanning-Aminosäureanalyse kann ebenfalls eingesetzt werden, um eine oder mehrere Aminosäuren entlang einer zusammenhängenden Sequenz zu identifizieren. Unter den bevorzugten Scanning-Aminosäuren befinden sich relativ kleine, neutrale Aminosäuren. Solche Aminsäuren umfassen Alanin, Glycin, Serin und Cystein. Alanin ist typischerweise eine bevorzugte Scanning-Aminosäure unter dieser Gruppe, da sie die über den Beta-Kohlenstoff hinausgehende Seitenkette eliminiert und mit geringerer Wahrscheinlichkeit die Hauptkettenkonformation der Variante verändert. Alanin wird außerdem typischerweise bevorzugt, da sie die häufigste Aminosäure ist. Weiters findet sie sich häufig sowohl in verborgenen, als auch in exponierten Positionen [Creighton, The Proteins, W.H. Freeman & Co., N.Y.; Chothia, J. Mol. Biol. 150, 1 (1976)]. Falls die Alaninsubstitution keine adäquaten Mengen der Variante liefert, kann eine isosterische Aminosäure verwendet werden.
Modifizierungen von PRO-Polypeptiden
Kovalente Modifizierungen von PRO-Polypeptiden sind im Schutzumfang dieser Erfindung enthalten. Eine der kovalenten Modifizierungsarten umfasst das Umsetzen von Aminosäure-Zielresten des PRO-Polypeptids mit einem organischen Derivatisierungsmittel, das fähig ist, mit gewählten Seitenketten oder mit den N- oder C-terminalen Resten des PRO-Polypeptids zu reagieren. Derivatisierungen mit bifunktionellen Mitteln sind beispielsweise zur Vernetzung eines PRO-Polypeptids mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder Oberfläche zur Verwendung im Verfahren zur Reinigung von Anti-PRO-Polypeptid-Antikörpern und umgekehrt zweckdienlich. Häufig verwendete Vernetzungsmittel umfassen z.B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelie Imidoester, einschließlich Disuccinimidylester, wie. z.B. 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), bifunktionelle Maleinimide, wie z.B. Bis-N-Maleinimido-1,8-octan, und Mittel, wie z.B. Methyl-3-[(p-azidophenyl)-dithio]propioimidat.
Andere Modifizierungen umfassen die Desamidierung von Glutaminyl- und Asparaginylresten zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten, Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxygruppen von Seryl- und Threonylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidinseitenketten [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79–86 (1983)], Acetylierung des N-terminalen Amins und Amidierung jeglicher C-terminalen Carboxygruppe.
Ein weiterer Typ der kovalenten Modifizierung der PRO-Polypeptide, der im Schutzumfang dieser Erfindung enthalten ist, umfasst die Veränderung des nativen Glykosylierungsmusters des Polypeptids. Unter „Verändern des nativen Glykosylierungsmusters" wird zu den Zwecken hierin das Deletieren eines oder mehrerer Kohlenhydratreste verstanden, die sich in einem Nativsequenz-PRO-Polypeptid finden, und/oder das Anfügen einer oder mehrerer Glykosylierungsstellen, die im Nativsequenz-PRO-Polypeptid nicht vorhanden sind, und/oder das Verändern des Verhältnisses und/oder der Zusammensetzung der an die Glykosylierungsstelle(n) gebundenen Zuckerreste.
Das Hinzufügen von Glykosylierungsstellen an das PRO-Polypeptid kann durch Ändern der Aminosäuresequenz erreicht werden. Die Änderung kann beispielsweise durch Addition oder Substitution von einem oder mehreren Serin- oder Threoninresten im Nativsequenz-PRO-Polypeptid erzielt werden (für O-gebundene Glykosylierungsstellen). Die PRO-Polypeptidaminosäuresequenz kann gegebenenfalls über Veränderungen auf der DNA-Ebene geändert werden, insbesondere durch Mutieren der für das PRO-Polypeptid kodierenden DNA an vorgewählten Basen, so dass Codons erzeugt werden, die in die gewünschten Aminosäuren translatiert werden.
Ein anderes Mittel zur Erhöhung der Anzahl von Kohlenhydratgruppierungen am PRO-Polypeptid ist die chemische oder enzymatische Kopplung von Glykosiden an das Polypeptid. Derartige Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung beschrieben, z.B. in WO 87/05330, veröffentlicht am 11. September 1987, und in Aplin und Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., S. 259–306 (1981).
Die Entfernung von am PRO-Polypeptid vorhandenen Kohlenhydratgruppierungen kann chemisch oder enzymatisch oder durch Mutationssubstitution von Codons erzielt werden, die für Aminosäurereste kodieren, die als Glykosylierungsziele dienen. Chemische Deglykosylierungsstechniken sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden beispielsweise von Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987), und von Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981), beschrieben. Die enzymatische Spaltung von Kohlenhydratgruppierungen auf Polypeptiden kann durch Verwendung einer Vielzahl von Endo- und Exo-Glycosidasen erzielt werden, wie von Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138, 350 (1987), beschrieben wird.
Ein weiterer Typ der kovalenten Modifizierung von PRO-Polypeptiden der Erfindung umfasst das Binden des PRO-Polypeptids an eine Vielzahl von nicht-proteinartigen Polymeren, wie z.B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene auf eine Weise, wie sie in den US-Patenten Nr. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 oder 4.179.337 beschrieben wird.
Die PRO-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch auf eine Weise modifiziert werden, dass ein chimäres Molekül gebildet wird, das ein PRO-Polypeptid umfasst, das an ein(e) andere(s), heterologe(s) Polypeptid oder Aminosäuresequenz fusioniert ist. In einer der Ausführungsformen umfasst ein derartiges chimäres Molekül eine Fusion des PRO-Polypeptids mit einem Markerpolypeptid, das ein Epitop bereitstellt, an das ein Anti-Marker-Antikörper selektiv binden kann. Der Epitopmarker wird im Allgemeinen an den Amino- oder Carboxyterminus des PRO-Polypeptids angefügt. Die Gegenwart derartiger epitopmarkierter Formen des PRO-Polypeptids kann unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Markerpolypeptid nachgewiesen werden. Außerdem ermöglicht die Bereitstellung des Epitopmarkers die einfache Reinigung des PRO-Polypeptids mittels Affinitätsreinigung unter Verwendung eines Anti-Marker-Antikörpers oder einer anderen Art von Affinitätsmatrix, die an den Epitopmarker bindet. In einer alternativen Ausführungsform kann das chimäre Molekül eine Fusion des PRO-Polypeptids mit einem Immunglobulin oder einer speziellen Region eines Immunglobulins umfassen. Für eine zweiwertige Form des chimären Moleküls könnte eine derartige Fusion mit der Fc-Region eines IgG-Moleküls erfolgen.
Verschiedene Markerpolypeptide und ihre entsprechenden Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. Beispiele umfassen Poly-Histidin-(Poly-His-) oder Poly-Histidin-Glycin-(Poly-His-Gly-) Marker; das flu-HA-Markerpolypeptid und seinen Antikörper 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159–2165 (1988)]; den c-myc-Marker und die 8F9-, 3C7-, 6E10-, G4-, B7- und 9E10-Antikörper dagegen [Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5, 3610–3616 (1985)]; und den Herpes-Simplex-Virus-Glykoprotein-D-(gD-) Marker und sein Antikörper [Paborsky et al., Protein Engineering 3(6), 547–553 (1990)]. Andere Markerpolypeptide umfassen das Flag-Peptid (Hopp et al., BioTechnology 6, 1204–1210 (1988)); das KT3-Epitop-Peptid (Martin et al., Science 255, 192–194 (1992)); ein α-Tubulin-Epitop-Peptid (Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163–15166 (1991)); und den T7-Gen-10-Protein- Peptidmarker (Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6393–6397 (1990)).
Herstellung von PRO-Polypeptiden
Die unten stehende Beschreibung betrifft hauptsächlich die Herstellung von PRO-Polypeptiden durch Kultivieren von Zellen, die mit einem die gewünschte PRO-Polypeptidnucleinsäure enthaltenden Vektor transformiert oder transfiziert sind. Es ist selbstverständlich vorgesehen, dass alternative Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind, eingesetzt werden können, um das PRO-Polypeptid herzustellen. Beispielsweise können die PRO-Polypeptidsequenz oder Abschnitte davon durch direkte Peptidsynthese unter Verwendung von Festphasentechniken hergestellt werden (siehe z.B. Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149–2154 (1963)). Eine In-vitro-Proteinsynthese kann unter Verwendung manueller Techniken oder automatisiert durchgeführt werden. Eine automatisierte Synthese kann beispielsweise unter Verwendung eines Peptid-Synthesizers von Applied Biosystems (Foster City, CA) nach den Anleitungen des Herstellers erzielt werden. Verschiedene Abschnitte des gewünschten PRO-Polypeptids können gesondert chemisch hergestellt und unter Verwendung chemischer oder enzymatischer Verfahren kombiniert werden, um das PRO-Polypeptid voller Länge zu erlangen.
A. Isolierung von DNA, die für PRO-Polypeptide kodiert
Für PRO-Polypeptide kodierende DNA kann aus einer cDNA-Bibliothek erhalten werden, die aus Gewebe hergestellt worden ist, von dem angenommen wird, dass es die gewünschte PRO-Polypeptid-mRNA besitzt und diese in einem nachweisbaren Ausmaß exprimiert. Demgemäß kann menschliche PRO-Polypeptid-DNA leicht aus einer aus menschlichem Gewebe hergestellten cDNA-Bibliothek erhalten werden, wie z.B. in den Beispielen beschrieben wird. Das für das PRO-Polypeptid kodierende Gen kann auch aus einer Genombibliothek oder mittels Oligonucleotidsynthese erhalten werden.
Bibliotheken können mit Sonden (wie z.B. Antikörper gegen das gewünschte PRO-Polypeptid oder Oligonucleotide einer Länge von zumindest 20–80 Basen) gescreent werden, die zur Identifizierung des Gens von Interesse oder des von ihm kodierten Proteins konstruiert sind. Das Screening der cDNA- oder Genombibliothek mit der gewählten Sonde kann unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt werden, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989), beschrieben sind. Ein alternatives Mittel zur Isolierung des für das gewünschte PRO-Polypeptid kodierenden Gens ist die Verwendung von PCR-Verfahren (Sambroak et al., s.o.; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1995)).
Die unten stehenden Beispiele beschreiben Techniken zum Screenen einer cDNA-Bibliothek. Die als Sonden gewählten Oligonucleotidsequenzen sollten eine ausreichende Länge aufweisen und ausreichend eindeutig sein, so dass falsch-positive Ergebnisse minimiert werden. Das Oligonucleotid ist vorzugsweise markiert, so dass es bei Hybridisierung an DNA in der gescreenten Bibliothek nachgewiesen werden kann. Markierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt und umfassen die Verwendung von radioaktiven Markern, wie z.B. ³²P-markiertes ATP, Biotinylierung oder Enzymmarkierung. Hybridisierungsbedingungen, einschließlich mäßiger Stringenz und hoher Stringenz werden in Sambrook et al., s.o., bereitgestellt.
Bei derartigen Screeningverfahren identifizierte Sequenzen können verglichen und an andere bekannte Sequenzen angeglichen werden, die in öffentlichen Datenbanken, wie z.B. GenBank, oder anderen privaten Sequenzdatenbanken hinterlegt und verfügbar sind. Eine Sequenzidentität (entweder auf Aminosäure- oder auf Nucleotidebene) innerhalb von definierten Regionen des Moleküls oder über die volle Länge der Sequenz kann durch Sequenzangleichung unter Verwendung von Computersoftwareprogrammen, wie z.B. BLAST, ALIGN, DNAstar und INHERIT, ermittelt werden, die verschiedene Algorithmen einsetzen, um eine Homologie zu messen.
Nucleinsäure, die eine für Protein kodierende Sequenz aufweist, kann durch Screenen gewählter cDNA- oder Genombibliotheken erlangt werden, und zwar unter Verwendung der hierin erstmals offenbarten, abgeleiteten Aminosäuresequenzen und, falls notwendig, unter Verwendung herkömmlicher Primerextensionsverfahren, wie sie in Sambrook et al., s.o., beschrieben werden, um Vorläufer und Prozessierungszwischenprodukte von mRNA nachzuweisen, die möglicherweise nicht in cDNA revers-transkribiert worden ist.
B. Selektion und Transformation von Wirtszellen
Wirtszellen werden mit Expressions- oder Klonierungsvektoren, die hierin für die PRO-Polypeptid-Produktion beschrieben werden, transfiziert oder transformiert und in herkömmlichen Nährmedien kultiviert, die in geeigneter Weise zur Induktion von Promotoren, Selektieren von Transformanten oder Amplifizieren von für die gewünschten Sequenzen kodierenden Genen modifiziert wurden. Die Kulturbedingungen, wie z.B. Medium, Temperatur, pH und dergleichen, können vom Fachkundigen ohne übermäßiges Experimentieren gewählt werden. Im Allgemeinen finden sich Prinzipien, Protokolle und praktische Techniken zur Maximierung der Produktivität von Zellkulturen in Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler (Hrsg.), IRL Press (1991), und Sambrook et al., s.o.
Transfektionsverfahren sind dem Durchschnittsfachmann bekannt, beispielsweise CaPO₄ und Elektroporation. In Abhängigkeit von der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt, die für solche Zellen geeignet sind. Die Calciumchlorid einsetzende Calciumbehandlung, wie sie in Sambrook et al., s.o., beschrieben wird, oder die Elektroporation wird im Allgemeinen für Prokaryoten oder andere Zellen verwendet, die wesentliche Zellwandbarrieren enthalten. Die Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transformation gewisser Pflanzenzellen verwendet, wie sie von Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und in WO 89/05859, veröffentlicht am 29. Juni 1989, beschrieben wird. Für Säugetierzellen ohne derartige Zellwände kann das Calciumphosphatpräzipitationsverfahren von Graham und van der Eb, Virology 52, 456–457 (1978), eingesetzt wer den. Allgemeine Aspekte von Säugetierwirtszellsystem-Transformationen sind im US-Patent Nr. 4.399.216 beschrieben worden. Transformationen in Hefe werden typischerweise nach dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3829 (1979), durchgeführt. Jedoch können andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen, wie z.B. durch Kern-Mikroinjektion, Elektroporation, Bakterienprotoplastenfusion mit intakten Zellen, oder Polykationen, z.B. Polybren, Polyornithin, ebenfalls verwendet werden. Über verschiedene Techniken zur Transformation von Säugetierzellen siehe Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527–537 (1990), und Mansour et al., Nature 336, 348–352 (1988).
Geeignete Wirtszellen zum Klonieren und Exprimieren der DNA in die Vektoren hierin umfassen Prokaryoten-, Hefe- oder höhere Eukaryotenzellen. Geeignete Prokaryoten umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Eubakterien, wie z.B. Gram-negative oder Gram-positive Organismen, beispielsweise Enterobacteriaceae, wie z.B. E. coli. Es sind verschiedene E.-coli-Stämme öffentlich erhältlich, wie z.B. E.-coli-K12-Stamm MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); E.-coli-Stamm W3110 (ATCC 27.325) und K5 772 (ATCC 53.635). Andere geeignete prokaryotische Wirtszellen umfassen Enterobacteriaceae, wie z.B. Escherichia, wie z.B. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, z.B. Salmonella typhimurium, Serratia, z.B. Serratia marcescans, und Shigella, sowie Bacilli, wie z.B. B. subtilis und B. licheniformis (z.B. B. licheniformis 41 P, offenbart in DD 266.710 , veröffentlicht am 12. April 1989), Pseudomonas, wie z.B. P. aeruginosa, und Streptomyces. Verschiedene E.-coli-Stämme sind öffentlich erhältlich, wie z.B. E.-coli-K12-Stamm MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); E.-coli-Stamm W3110 (ATCC 27.325); und K5 772 (ATCC 53.635). Diese Beispiele sind illustrativ und nicht einschränkend. Stamm W3110 ist ein insbesondere bevorzugter Wirt oder Elternwirt, da er ein häufiger Wirtsstamm für rekombinante DNA-Produktfermentationen ist. Vorzugsweise sekretiert die Wirtszelle minimale Mengen an proteolytischen Enzymen. Beispielsweise kann Stamm W3110 dahingehend modifiziert werden, dass eine genetische Mutation in denjenigen Genen bewirkt wird, die für Proteine kodieren, die für den Wirt endogen sind, wobei derartige Wirte die Folgenden umfassen: den E.-coli- W3110-Stamm 1A2, der den vollständigen Genotyp tonA aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 9E4, der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 27C7 (ATCC 55.244), der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kan^r aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 37D6, der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7ilvG kan^r aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 40B4, der Stamm 37D6 mit einer nicht-kanamycinresistenten degP-Deletionsmutation ist; und ein E.-coli-Stamm mit einer im US-Patent Nr. 4.946.783, erteilt am 7. August 1990, offenbarten, mutierten periplasmatischen Protease. Alternativ dazu sind In-vitro-Klonierungsverfahren, z.B. PCR oder andere Nucleinsäurepolymerasereaktionen, geeignet.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroorganismen, wie z.B. Fadenpilze oder Hefe, geeignete Klonierungs- oder Expressionswirte für PRO-Polypeptidkodierende Vektoren. Saccharomyces cerevisiae ist ein häufig verwendeter niederer eukaryotischer Wirtsorganismus. Andere umfassen Schizosaccharomyces pombe (Beach und Nurse, Nature 290, 140 (1981); EP 139.383 , veröffentlicht am 2. Mai 1985); Kluyveromyces-Wirte (US-Patent Nr. 4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology 9, 968–975 (1991)), wie z.B. K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 737 (1983)), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology 8, 135 (1990)), K. thermotolerans und K. marxianus; yarrowia ( EP 402.226 ); Pichia pastoris ( EP 183.070 ; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265–278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia ( EP 244.234 ); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259–5263 (1979)); Schwanniomyces, wie z.B. Schwanniomyces occidentalis ( EP 394.538 , veröffentlicht am 31. Oktober 1990); und Fadenpilze, wie z.B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, veröffentlicht am 10. Jänner 1991), und Aspergillus-Wirte, wie z.B. A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284–289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205–221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470–1474 (1984)) und A. niger (Kelly und Hynes, EMBO J. 4, 475–479 (1985)). Methylotrophe Hefen sind hierin geeignet und umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Hefe, die zum Wachstum auf Methanol fähig und aus den aus Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis und Rhodotorula bestehenden Gattungen gewählt sind. Eine Liste von speziellen Spezies, die für diese Klasse von Hefen exemplarisch ist, findet sich in C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs 269 (1982).
Geeignete Wirtszellen zur Expression von glykosylierten PRO-Polypeptiden stammen aus mehrzelligen Organismen. Beispiele von Invertebratenzellen umfassen Insektenzellen, wie z.B. Drosophila S2 und Spodoptera Sf9, sowie Pflanzenzellen. Beispiele zweckdienlicher Säugetierwirtszelllinien umfassen Chinahamster-Eierstock-(CHO-) und COS-Zellen. Speziellere Beispiele umfassen die durch SV40 transformierte Affennieren-CV1-Linie (COS-7, ATCC CRL 1651); die menschliche Urnierenlinie (293 oder zum Wachstum in Suspensionskultur subklonierte 293-Zellen, Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); und Maus-Mammatumor (MMT 060562, ATCC CCL51). Die Wahl der geeigneten Wirtszelle wird als innerhalb des Gebiets der Erfindung befindlich erachtet.
C. Auswahl und Verwendung eines replizierbaren Vektors
Die für ein gewünschtes PRO-Polypeptid kodierende Nucleinsäure (z.B. cDNA oder genomische DNA) kann für die Klonierung (Amplifikation der DNA) oder für die Expression in einen replizierbaren Vektor insertiert werden. Es sind verschiedene Vektoren öffentlich erhältlich. Der Vektor kann beispielsweise in Form eines Plasmids, Cosmids, Virusteilchens oder Phagen vorliegen. Die geeignete Nucleinsäuresequenz kann durch eine Vielfalt von Verfahren in den Vektor insertiert werden. Im Allgemeinen wird DNA in (eine) geeignete Restriktionsendonucleasestelle(n) unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Techniken insertiert. Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, eine oder mehrere Signalsequenzen, einen Replikationsstartpunkt, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancerelement, einen Promotor und eine Transkriptionsterminations sequenz. Die Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere dieser Komponenten enthalten, setzt standardmäßige Ligationstechniken ein, die dem Fachkundigen bekannt sind.
Das PRO-Polypeptid von Interesse kann rekombinant nicht nur direkt, sondern auch als Fusionspolypeptid mit einem heterologen Polypeptid produziert werden, das eine Signalsequenz oder ein anderes Polypeptid mit einer spezifischen Spaltstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids sein kann. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein oder kann Teil der in den Vektor insertierten PRO-Polypeptid-DNA sein. Die Signalsequenz kann eine prokaryotische Signalsequenz sein, die beispielsweise aus der Gruppe der Alkalischen Phosphatase-, Penicillinase-, lpp- oder hitzestabilen Enterotoxin-II-Leader gewählt ist. Für die Hefesekretion kann die Signalsequenz z.B. der Hefe-Invertase-Leader, Alpha-Faktor-Leader (einschließlich Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktor-Leader, wobei letzterer im US-Patent Nr. 5.010.182 beschrieben wird) oder Saure-Phosphatase-Leader, der C.-albicans-Glucoamylase-Leader ( EP 362.179 , veröffentlicht am 4. April 1990) oder das in WO 90/13646 (veröffentlicht am 15. November 1990) beschriebene Signal sein. Bei der Säugetierzellenexpression können Säugetier-Signalsequenzen verwendet werden, um die Sekretion des Proteins zu steuern, wie z.B. Signalsequenzen aus sekretierten Polypeptiden derselben oder einer verwandten Spezies, sowie virale Sekretionsleader.
Expressions- sowie Klonierungsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, in einer oder mehreren gewählten Wirtszellen zu replizieren. Derartige Sequenzen sind für eine Vielzahl von Bakterien, Hefen und Viren wohlbekannt. Der Replikationsstartpunkt aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten Gramnegativen Bakterien geeignet, der 2μ-Plasmid-Startpunkt ist für Hefe geeignet, und verschiedene virale Startpunkte (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für die Klonierung von Vektoren in Säugetierzellen zweckdienlich.
Expressions- und Klonierungsvektoren werden typischerweise ein Selektionsgen enthalten, das auch selektierbarer Marker genannt wird. Typische Selektionsgene ko dieren für Proteine, die (a) Resistenz gegen Antibiotika oder andere Toxine, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin verleihen, (b) auxotrophe Defekte komplementieren oder (c) entscheidende Nährstoffe bereitstellen, die aus komplexen Medien nicht verfügbar sind, z.B. das für D-Alanin-Racemase kodierende Gen für Bacilli.
Ein Beispiel geeigneter selektierbarer Marker für Säugetierzellen sind jene, die die Identifizierung von Zellen ermöglichen, die zur Aufnahme der PRO-Polypeptid-Nucleinsäure kompetent sind, wie z.B. DHFR oder Thymidinkinase. Eine geeignete Wirtszelle beim Einsatz von DHFR der Wildform ist die hinsichtlich DHFR-Aktivität defekte CHO-Zelllinie, die wie von Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), beschrieben hergestellt und vermehrt wird. Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das im Hefeplasmid YRp7 vorliegende trp1-Gen (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)). Das trp1-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm bereit, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, beispielsweise ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics 85, 12 (1977)).
Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der operabel an die PRO-Polypeptid-Nucleinsäuresequenz gebunden ist, um die mRNA-Synthese zu steuern. Promotoren, die von einer Vielzahl von möglichen Wirtszellen erkannt werden, sind wohlbekannt. Zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten zweckdienliche Promotoren umfassen die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)), Alkalische Phosphatase, ein Tryptophan- (trp-) Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP 36.776 ) und Hybridpromotoren, wie z.B. den tac-Promotor (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 (1983)). Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen werden außerdem eine Shine-Dalgarno- (S.D.-) Sequenz enthalten, die operabel an die für das gewünschte PRO-Polypeptid kodierende DNA gebunden ist.
Beispiele geeigneter Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) oder für andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)), wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil der durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription sind, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, Saure Phosphatase, Abbauenzyme, die mit dem Stickstoffmetabolismus zusammenhängen, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefeexpression werden in EP 73.657 weitergehend beschrieben.
Die PRO-Polypeptid-Transkription aus Vektoren in Säugetier-Wirtszellen wird beispielsweise durch Promotoren kontrolliert, die aus den Genomen von Viren erlangt werden, wie z.B. aus Polyomavirus, Geflügelpockenvirus ( UK 2.211.504 , veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie z.B. Adenovirus 2), Rinder-Papillomavirus, Vogel-Sarkomvirus, Cytomegalovirus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und Simian-Virus 40 (SV 40), aus heterologen Säugetier-Promotoren, z.B. dem Actinpromotor oder einem Immunglobulinpromotor, und aus Hitzeschockpromotoren, unter der Voraussetzung, dass derartige Promotoren mit den Wirtszellsystemen kompatibel sind.
Die Transkription einer für das gewünschte PRO-Polypeptid kodierenden DNA durch höhere Eukaryoten kann durch Insertieren einer Enhancersequenz in den Vektor gesteigert werden. Enhancer sind cis-wirkende DNA-Elemente, die üblicherweise eine Länge von 10 bis 300 bp aufweisen, die an einem Promotor wirken, um dessen Transkription zu erhöhen. Es sind nun zahlreiche Enhancersequenzen aus Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise wird man jedoch einen Enhancer aus einem Virus einer eukaryotischen Zelle verwenden. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer an der späten Seite des Replikationsstartpunkts (bp 100–270), den frühen Cytomegalovirus-Promotor-Enhancer, den Polyoma-Enhancer an der späten Seite des Replikationsstartpunkts und Adenovirus-Enhancer. Der Enhancer kann an einer Position 5' oder 3' der für das PRO-Polypeptid kodierenden Sequenz in den Vektor gespleißt werden, befindet sich jedoch vorzugsweise an einer Stelle 5' des Promotors.
In eukaryotischen Wirtszellen (Hefe, Pilze, Insekten, Pflanzen, Tiere, Mensch oder kernhaltige Zellen aus anderen mehrzelligen Organismen) verwendete Expressionsvektoren werden außerdem Sequenzen enthalten, die zur Termination der Transkription und zur Stabilisierung der mRNA notwendig sind. Derartige Sequenzen sind allgemein aus den 5'- und gelegentlich 3'-untranslatierten Regionen eukaryotischer oder viraler DNAs oder cDNAs erhältlich. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente im untranslatierten Abschnitt der für PRO-Polypeptide kodierenden mRNA transkribiert werden.
Weitere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Adaptierung für die Synthese von PRO-Polypeptiden in rekombinanter Vertebratenzellkultur geeignet sind, werden in Gething et al., Nature 293, 620–625 (1981); Mantei et al., Nature 281, 40–46 (1979); EP 117.060 ; und EP 117.058 beschrieben.
D. Nachweisen der Genamplifikation/Genexpression
Die Genamplifikation und/oder Genexpression kann in einer Probe direkt, beispielsweise durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting zur Quantifizierung der Transkription von mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201–5205 (1980)), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung, gemessen werden, und zwar unter Verwendung einer geeignet markierten Sonde auf Basis der hierin bereitgestellten Sequenzen. Alternativ dazu können Antikörper eingesetzt werden, die spezifische Duplexe, einschließlich DNA-Duplexe, RNA-Duplexe und DNA-RNA-Hybrid-Duplexe oder DNA-Protein-Duplexe, erkennen können. Die Antikörper wiederum können markiert sein, und der Test kann durchgeführt werden, wo der Duplex an eine Oberfläche gebunden wird, so dass bei der Bildung des Duplex an der Oberfläche die Gegenwart von an den Duplex gebundenem Antikörper nachgewiesen werden kann.
Die Genexpression kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren wie z.B. durch immunhistochemische Färbung von Zellen oder Gewebeschnitten und Testen von Zellkultur- und Körperflüssigkeiten gemessen werden, um die Expression eines Genprodukts direkt zu quantifizieren. Für die immunhistochemische Färbung und/oder das Testen von Probenflüssigkeiten zweckdienliche Antikörper können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in jeglichem Säugetier hergestellt werden. Zweckdienlicherweise können die Antikörper gegen ein Nativsequenz-PRO-Polypeptid oder gegen ein synthetisches Peptid auf Basis der hierin bereitgestellten DNA-Sequenzen oder gegen eine exogene Sequenz, die an eine PRO-Polypeptid-DNA fusioniert ist und für ein spezifisches Antikörperepitop kodiert, hergestellt werden.
E. Polypeptidreinigung
Es können Formen von PRO-Polypeptiden aus Kulturmedium oder aus Wirtszelllysaten gewonnen werden. Falls es membrangebunden ist, kann es unter Verwendung einer geeigneten Tensidlösung (z.B. Triton-X 100) oder durch enzymatische Spaltung aus der Membran freigesetzt werden. Bei der Expression von PRO-Polypeptiden eingesetzte Zellen können durch verschiedene physikalische oder chemische Mittel aufgebrochen werden, wie z.B. durch Einfrier-Auftau-Zyklen, Beschallung, mechanischen Aufschluss oder durch Zelllysemittel.
Es kann wünschenswert sein, PRO-Polypeptide von rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu reinigen. Die folgenden Verfahren sind beispielhaft für geeignete Reinigungsverfahren: mittels Fraktionierung an einer Ionentauschersäule; Ethanolpräzipitation; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie an Silika oder an Kationentauscherharz, wie z.B. DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatpräzipitation; Gelfiltration, beispielsweise unter Verwendung von Sephadex G- 75; Protein-A-Sepharose-Säulen zur Entfernung von Verunreinigungen, wie z.B. IgG; und metallchelatierende Säulen zur Bindung epitopmarkierter Formen des PRO-Polypeptids. Es können verschiedene Proteinreinigungsverfahren eingesetzt werden, und derartige Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und beispielsweise in Deutscher, Methods in Enzymology 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982), beschrieben. Die gewählten Reinigungsschritte werden beispielsweise von der Art des verwendeten Produktionsverfahrens und des speziell produzierten PRO-Polypeptids abhängen.
Verwendungen für PRO-Polypeptide
Nucleotidsequenzen (oder ihre Komplemente), die für die PRO-Polypeptide der vorliegenden Erfindung kodieren, haben verschiedene Anwendungen auf dem Gebiet der Molekularbiologie, einschließlich Verwendungen als Hybridisierungssonden, bei der Chromosom- und Gen-Kartierung und bei der Erzeugung von Antisense-RNA und -DNA. Für PRO-Polypeptid kodierende Nucleinsäure wird außerdem zur Herstellung von PRO-Polypeptiden durch die hierin beschriebenen rekombinanten Techniken zweckdienlich sein.
Die für Nativsequenz-PRO-Polypeptid voller Länge kodierende Nucleinsäure oder Abschnitte davon können als Hybridisierungssonden für eine cDNA-Bibliothek verwendet werden, um das PRO-Polypeptid-Gen voller Länge zu isolieren oder um noch weitere Gene zu isolieren (z.B. jene, die für natürlich vorkommende Varianten des PRO-Polypeptids oder der PRO-Polypeptide kodieren), die eine gewünschte Sequenzidentität mit PRO-Polypeptid-Nucleinsäuresequenzen aufweisen. Gegebenenfalls wird die Länge der Sonden ungefähr 20 bis ungefähr 50 Basen betragen. Die Hybridisierungssonden können von der Nucleotidsequenz eines jeglichen hierin offenbarten DNA-Moleküls oder von Genomsequenzen, einschließlich Promotoren, Enhancerelementen und Introns der für Nativsequenz-PRO-Polypeptid kodierenden DNA, hergeleitet werden. Beispielhaft wird ein Screeningverfahren das Isolieren der kodierenden Region des PRO-Polypeptidgens unter Verwendung der bekannten DNA-Sequenz zur Synthese einer gewählten Sonde von ungefähr 40 Basen um fassen. Hybridisierungssonden können mit einer Vielzahl von Markern markiert werden, einschließlich mit Radionukliden, wie z.B. ³²P oder ³⁵S, oder mit enzymatischen Markern, wie z.B. Alkalischer Phosphatase, die über Avidin/Biotin-Kopplungssysteme an die Sonde gekoppelt sind. Markierte Sonden, die eine Sequenz aufweisen, die zu jener des speziellen PRO-Polypeptidgens der vorliegenden Erfindung komplementär ist, können verwendet werden, um Bibliotheken menschlicher cDNA, genomischer DNA oder mRNA zu screenen, um zu ermitteln, an welche Elemente derartiger Bibliotheken die Sonde hybridisiert. Hybridisierungstechniken werden in den unten stehenden Beispielen ausführlicher beschrieben.
Die in der vorliegenden Anmeldung offenbarten ESTs können auf ähnliche Weise unter Verwendung der hierin offenbarten Verfahren als Sonden eingesetzt werden.
Die Sonden können außerdem in PCR-Techniken eingesetzt werden, um einen Pool von Sequenzen zur Identifizierung nahe verwandter PRO-Polypeptidsequenzen zu erzeugen.
Für ein PRO-Polypeptid kodierende Nucleotidsequenzen können außerdem verwendet werden, um Hybridisierungssonden zur Kartierung des Gens zu konstruieren, das für dieses PRO-Polypeptid kodiert, und zur genetischen Analyse von Individuen mit genetischen Störungen. Die hierin bereitgestellten Nucleotidsequenzen können an ein Chromosom und an spezielle Regionen eines Chromosoms kartiert werden, und zwar unter Verwendung bekannter Techniken, wie z.B. In-situ-Hybridisierung, Bindungsanalyse gegen bekannte Chromosomenmarker und Hybridisierungsscreening mit Bibliotheken.
Wenn die kodierende Sequenz für das PRO-Polypeptid für ein Protein kodiert, das an ein anderes Protein bindet, kann das PRO-Polypeptid in Tests zur Identifizierung seiner Liganden verwendet werden. Gleichermaßen können Inhibitoren der Rezeptor/Liganden-Bindungswechselwirkung identifiziert werden. An derartigen Bindungswechselwirkungen beteiligte Proteine können außerdem verwendet werden, um auf Peptid- oder Kleinmolekül-Inhibitoren oder Agonisten der Bindungswechselwirkung zu screenen. Es können Screeningtests konstruiert werden, um Leitverbindungen aufzufinden, welche die biologische Aktivität eines nativen PRO-Polypeptids oder eines Liganden für das PRO-Polypeptid nachahmen. Derartige Screeningtests werden Tests umfassen, die dem High-throughput-Screening chemischer Bibliotheken zugänglich sind, was sie insbesondere zur Identifizierung von Kleinmolekül-Medikamentkandidaten geeignet macht. Vorgesehene Kleinmoleküle umfassen synthetische, organische oder anorganische Verbindungen. Die Tests können in einer Vielzahl von Ausführungen durchgeführt werden und umfassen Protein-Protein-Bindungstests, biochemische Screeningtests, Immuntests und auf Zellen basierende Tests, die alle auf dem Gebiet der Erfindung gut charakterisiert sind.
Nucleinsäuren, die für ein PRO-Polypeptid oder seine modifizierten Formen kodieren, können außerdem verwendet werden, um entweder transgene Tiere oder „Knock-out"-Tiere zu erzeugen, die ihrerseits bei der Entwicklung und beim Screening von therapeutisch zweckdienlichen Reagenzien zweckdienlich sind. Ein transgenes Tier (z.B. eine Maus oder Ratte) ist ein Tier mit Zellen, die ein Transgen enthalten, wobei das Transgen in einem pränatalen, z.B. embryonalen, Stadium in das Tier oder in einen Vorfahren des Tiers eingeführt worden ist. Ein Transgen ist eine DNA, die in das Genom einer Zelle integriert ist, aus der sich ein transgenes Tier entwickelt. In einer Ausführungsform kann die für ein PRO-Polypeptid von Interesse kodierende cDNA verwendet werden, um für das PRO-Polypeptid kodierende, genomische DNA nach etablierten Techniken zu klonieren, wobei die genomischen Sequenzen verwendet werden, um transgene Tiere zu erzeugen, die Zellen enthalten, die für das PRO-Polypeptide kodierende DNA exprimieren. Verfahren zur Erzeugung von transgenen Tieren, insbesondere Tieren wie Mäusen oder Ratten, sind auf dem Gebiet der Erfindung gebräuchlich geworden und werden beispielsweise in den US-Patenten Nr. 4.736.866 und 4.870.009 beschrieben. Typischerweise würde man für die PRO-Polypeptid-Transgen-Inkorporation mit gewebespezifischen Enhancern auf bestimmte Zellen abzielen. Transgene Tiere, die eine im Embryonalstadium in die Keimbahn des Tiers eingeführte Kopie des für ein PRO-Polypeptid kodierenden Transgens umfassen, können verwendet werden, um die Wirkung einer erhöhten Expression der für das PRO-Polypeptid kodierenden DNA zu untersuchen. Solche Tiere können als Testtiere für Reagenzien verwendet werden, von denen angenommen wird, dass sie Schutz, beispielsweise vor pathologischen Zuständen, verleihen, die mit seiner Überexpression zusammenhängen. Nach diesem Aspekt der Erfindung wird ein Tier mit dem Reagens behandelt, und ein vermindertes Auftreten des pathologischen Zustands im Vergleich zu unbehandelten, das Transgen tragenden Tieren würde die Möglichkeit einer therapeutischen Intervention für den pathologischen Zustand anzeigen.
Alternativ dazu können nicht-menschliche Homologe der PRO-Polypeptide verwendet werden, um ein PRO-Polypeptid-„knock-out"-Tier zu konstruieren, das ein defektes oder verändertes, für das PRO-Polypeptid von Interesse kodierendes Gen aufweist, und zwar als Resultat der homologen Rekombination zwischen dem endogenen, für das PRO-Polypeptid kodierenden Gen und der veränderten genomischen, für das PRO-Polypeptid kodierenden DNA, die in eine embryonale Zelle des Tiers eingeführt worden ist. Beispielsweise kann für ein PRO-Polypeptid kodierende cDNA verwendet werden, um für das PRO-Polypeptid kodierende genomische DNA nach etablierten Techniken zu klonieren. Ein Abschnitt der für ein PRO-Polypeptid kodierenden genomischen DNA kann deletiert oder durch ein anderes Gen, wie z.B. durch ein für einen selektierbaren Marker kodierendes Gen, ersetzt werden, das zur Beobachtung der Integration verwendet werden kann. Typischerweise sind mehrere Kilobasen unveränderte flankierende DNA (sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende) im Vektor enthalten (siehe z.B. Thomas und Capecchi, Cell 51, 503 (1987), für eine Beschreibung von homologen Rekombinationsvektoren). Der Vektor wird in eine embryonale Stammzelllinie (z.B. durch Elektroporation) eingeführt, und es werden Zellen ausgewählt, in denen die eingeführte DNA homolog mit endogener DNA rekombiniert hat (siehe Li et al., Cell 69, 915 (1992)). Die gewählten Zellen werden dann in eine Blastozyte eines Tiers (z.B. einer Maus oder Ratte) injiziert, um Aggregationschimären zu bilden (siehe z.B. Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson (Hrsg.), IRL, Oxford, S. 113–152 (1987)). Ein chimärer Embryo kann dann in ein geeignetes pseudoträchtiges weibliches Ziehtier implantiert und der Embryo geboren werden, um ein „Knock-out"-Tier zu erzeugen. Nachkommen, welche die homolog rekombinierte DNA in ihren Keimzellen tragen, können mittels Standardtechniken identifiziert und verwendet werden, um Tiere zu züchten, in denen alle Zellen der Tiere die homolog rekombinierte DNA enthalten. Knock-out-Tiere können beispielsweise auf ihre Fähigkeit hin charakterisiert werden, sich gegen bestimmte pathologische Zustände zu verteidigen und pathologische Zustände aufgrund des Fehlens des PRO-Polypeptids zu entwickeln.
Wenn eine In-vivo-Verabreichung eines PRO-Polypeptids eingesetzt wird, können normale Dosismengen von ungefähr 10 ng/kg bis zu 100 mg/kg Säugetier-Körpergewicht oder mehr pro Tag, vorzugsweise von ungefähr 1 μg/kg/Tag bis 10 mg/kg/Tag, in Abhängigkeit vom Verabreichungsweg variieren. Richtlinien über bestimmte Dosierungen und Abgabeverfahren werden in der Literatur bereitgestellt; siehe beispielsweise US-Patente Nr. 4.657.760; 5.206.344; oder 5.225.212. Es wird erwartet, dass unterschiedliche Formulierungen für unterschiedliche Behandlungsverbindungen und unterschiedliche Störungen wirksam sein werden und dass die auf ein Organ oder Gewebe abzielende Verabreichung beispielsweise die Abgabe auf eine Weise erfordern wird, die sich von der eines anderen Organs oder Gewebes unterscheidet.
Wo eine Retard-Verabreichung eines PRO-Polypeptids in einer Formulierung mit für die Behandlung einer beliebigen Krankheit oder Störung, bei der die Verabreichung des PRO-Polypeptids erforderlich ist, geeigneten Freisetzungseigenschaften erwünscht ist, wird die Mikroverkapselung des PRO-Polypeptids erwogen. Die Mikroverkapselung rekombinanter Proteine für nachhaltige Freisetzung ist mit menschlichem Wachstumshormon (rhGH), Interferon (rhIFN), Interleukin 2 und MN rgp120 erfolgreich durchgeführt worden. Johnson et al., Nat. Med. 2, 795–799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther. 27, 1221–1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology 8, 755–758 (1990); Cleland, Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems, in: Powell und Newman (Hrsg.), Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Plenum Press, New York, S. 439–462 (1995); WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; und US-Patent Nr. 5.654.010.
Die Retard-Formulierungen dieser Proteine wurden unter Verwendung von Poly-Milchsäure-Coglycolsäure-(PLGA-) Polymer aufgrund seiner Bioverträglichkeit und breiten Palette von biologisch abbaubaren Eigenschaften entwickelt. Die Abbauprodukte von PLGA, Milch- und Glycolsäure können schnell aus dem menschlichen Körper ausgeschieden werden. Darüber hinaus kann die Abbaubarkeit dieses Polymers in Abhängigkeit von seinem Molekulargewicht und seiner Zusammensetzung auf Monate bis Jahre eingestellt werden. Lewis, Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer, in: M. Chasin und R. Langer (Hrsg.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, New York, S. 1–41 (1990).
Beispielsweise wäre für eine Formulierung, die eine Dosierung von ungefähr 80 g/kg/Tag in Säugetieren mit einem Maximalkörpergewicht von 85 kg bereitstellen kann, die höchste Dosierung ungefähr 6,8 mg des PRO-Polypeptids pro Tag. Um dieses Dosierungsausmaß zu erzielen, ist eine nachhaltig freisetzende Formulierung notwendig, die eine maximal mögliche Proteinbeladung (15–20 Gew.-% PRO-Polypeptid) mit dem niedrigstmöglichen Anfangs-Burst (<20%) enthält. Eine kontinuierliche (nullter Ordnung) Freisetzung des PRO-Polypeptids aus Mikroteilchen für 1–2 Wochen ist ebenfalls wünschenswert. Außerdem sollte das verkapselte, freizusetzende Protein seine Integrität und Stabilität über den gewünschten Freisetzungszeitraum beibehalten.
PRO181-Polypeptide der vorliegenden Erfindung, die eine biologische Aktivität aufweisen, die mit der des Cornichon-Proteins verwandt ist, können sowohl in vivo für therapeutische Zwecke als auch in vitro eingesetzt werden. Dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Erfindung wird wohlbekannt sein, wie die PRO181-Polypeptide der vorliegenden Erfindung für derartige Zwecke einzusetzen sind.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können nach bekannten Verfahren formuliert werden, um pharmazeutisch zweckdienliche Zusammensetzungen herzustellen, wobei das PRO-Polypeptid hiervon in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägervehikel kombiniert wird. Geeignete Trägervehikel und ihre Formulierung, einschließlich anderer menschlicher Proteine, z.B. menschliches Serumalbumin, werden beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences, Oslo et al. (Hrsg.), 16. Aufl., Mack Publishing Co. (1980), beschrieben.
Dosierungen und gewünschte Medikamentkonzentrationen von pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in Abhängigkeit von der speziell vorgesehenen Verwendung variieren. Beispielsweise sind bei der Behandlung der Thrombose tiefer Venen oder peripheren Gefäßkrankheit „Bolus"-Dosierungen typischerweise bevorzugt, wobei nachträgliche Verabreichungen folgen, um einen annähernd konstanten Blutspiegel, vorzugsweise in der Größenordnung von ungefähr 3 μg/ml, zu erhalten.
Jedoch wird es zur Verwendung in Verbindung mit medizinischen Notfallseinrichtungen, wo eine Infusionsmöglichkeit im Allgemeinen nicht besteht, und aufgrund des allgemein kritischen Charakters der zugrunde liegenden Krankheit (z.B. Embolie, Infarkt) im Allgemeinen wünschenswert sein, etwas höhere Anfangsdosen, wie z.B. als intravenösen Bolus, bereitzustellen.
Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper
Die vorliegende Erfindung stellt weiters Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper bereit. Beispielhafte Antikörper umfassen polyklonale, monoklonale, humanisierte, bispezifische und heterokonjugierte Antikörper.
A. Polyklonale Antikörper
Die Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper können polyklonale Antikörper umfassen. Verfahren zur Herstellung polyklonaler Antikörper sind dem Fachmann bekannt. Polyklonale Antikörper können in einem Säugetier, beispielsweise durch eine oder mehrere Injektionen eines immunisierenden Mittels und, falls erwünscht, eines Adjuvans hergestellt werden. Typischerweise wird das immunisierende Mittel und/oder Adjuvans durch mehrfache subkutane oder intraperitoneale Injektionen in das Säugetier injiziert. Das immunisierende Mittel kann das PRO-Polypeptid oder ein Fusionsprotein davon umfassen. Es kann zweckdienlich sein, das immunisierende Mittel an ein Protein zu konjugieren, das im immunisierten Tier bekanntermaßen immunogen ist. Beispiele solcher immunogener Proteine umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Keyhole-Limpet-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyroglobulin und Sojabohnen-Trypsininhibitor. Beispiel von Adjuvantien, die eingesetzt werden können, umfassen Freundsches komplettes Adjuvans und MPL-TDM-Adjuvans (Monophosphoryl-Lipid A, synthetisches Trehalose-Dicorynomycolat). Das Immunisierungsprotokoll kann vom Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung ohne übermäßiges Experimentieren gewählt werden.
B. Monoklonale Antikörper
Die Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper können alternativ dazu monoklonale Antikörper sein. Monoklonale Antikörper können unter Verwendung von Hybridomverfahren, wie z.B. jenen, die von Kohler und Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschrieben werden, hergestellt werden. In einem Hybridomverfahren wird eine Maus, ein Hamster oder ein anderes geeignetes Wirtstier typischerweise mit einem immunisierenden Mittel immunisiert, um Lymphozyten hervorzubringen, die Antikörper produzieren oder zur Produktion von Antikörpern fähig sind, die spezifisch an das immunisierende Mittel binden. Alternativ dazu können die Lymphozyten in vitro immunisiert werden.
Das immunisierende Mittel wird typischerweise das PRO-Polypeptid von Interesse oder ein Fusionsprotein davon umfassen. Im Allgemeinen werden entweder Peripherblut-Lymphozyten („PBLs") verwendet, falls Zellen menschlichen Ursprungs erwünscht sind, oder Milzzellen oder Lymphknotenzellen, falls nicht-menschliche Säugetierquellen erwünscht sind. Die Lymphozyten werden dann mit einer immortalisierten Zelllinie unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels, wie z.B. Polyethylenglykol, fusioniert, um eine Hybridomzelle auszubilden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, S. 59–103 (1986)). Immortalisierte Zelllinien sind üblicherweise transformierte Säugetierzellen, insbesondere vom Nager, Rind oder Menschen stammende Myelomzellen. Üblicherweise werden Rat ten- oder Maus-Myelomzelllinien eingesetzt. Die Hybridomzellen können in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert werden, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben der unfusionierten, immortalisierten Zellen hemmen. Wenn beispielsweise den Elternzellen das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT) fehlt, umfasst das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium), wobei diese Substanzen das Wachstum von HGPRT-defekten Zellen verhindern.
Bevorzugte immortalisierte Zelllinien sind jene, die effizient fusionieren, eine stabile, hohe Antikörperexpression durch die gewählten, Antikörper produzierenden Zellen fördern und gegen ein Medium, wie z.B. das HAT-Medium, empfindlich sind. Bevorzugtere immortalisierte Zelllinien sind Maus-Myelomlinien, die beispielsweise vom Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien, und der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, erhalten werden können. Menschliche Myelom- und Maus-Mensch-Heteromyelomzelllinien sind außerdem für die Produktion von menschlichen monoklonalen Antikörpern beschrieben worden (Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker Inc., New York, S. 51–63 (1987)).
Das Kulturmedium, in dem die Hybridomzellen kultiviert werden, kann dann auf die Gegenwart von gegen das PRO-Polypeptid von Interesse gerichteten monoklonalen Antikörpern getestet werden. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität der von den Hybridomzellen gebildeten monoklonalen Antikörper mittels Immunpräzipitation oder durch einen In-vitro-Bindungstest, wie z.B. den Radioimmuntest (RIA) oder Enzymelinked-immunoabsorbent-assay (ELISA), bestimmt. Derartige Techniken und Tests sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann beispielsweise mit der Scatchard-Analyse von Munson und Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt werden.
Nachdem die gewünschten Hybridomzellen identifiziert worden sind, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und mittels Standardverfahren ge züchtet werden (Goding, s.o.). Geeignete Kulturmedien zu diesem Zweck umfassen beispielsweise Dulbecco's Modified Eagle's Medium und RPMI-1640-Medium. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in vivo als Aszites in einem Säugetier gezüchtet werden.
Die von den Subklonen sekretierten monoklonalen Antikörper können aus dem Kulturmedium oder aus der Aszitesflüssigkeit durch herkömmliche Immunglobulinreinigungsverfahren, wie z.B. Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie isoliert oder gereinigt werden.
Die monoklonalen Antikörper können auch durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt werden, wie z.B. durch jene, die im US-Patent Nr. 4.816.567 beschrieben sind. Für die monoklonalen Antikörper der Erfindung kodierende DNA kann unter Verwendung herkömmlicher Verfahren (z.B. durch Verwendung von Oligonucleotidsonden, die zur spezifischen Bindung an Gene fähig sind, die für die Schwer- und Leichtketten von Maus-Antikörpern kodieren) leicht isoliert und sequenziert werden. Die Hybridomzellen der Erfindung dienen als bevorzugte Quelle derartiger DNA. Wenn sie einmal isoliert ist, kann die DNA in Expressionsvektoren eingebaut werden, die dann in Wirtszellen wie z.B. Simian-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstock- (CHO-) Zellen oder Myelomzellen transfiziert werden, die ansonsten kein Immunglobulinprotein produzieren, um die Synthese monoklonaler Antikörper in den rekombinanten Wirtszellen zu erlangen. Die DNA kann auch modifiziert werden, beispielsweise durch Substituieren der kodierenden Sequenzen für konstante menschliche Schwer- und Leichtketten-Domänen an Stelle der homologen murinen Sequenzen (US-Patent Nr. 4.816.567; Morrison et al., s.o.) oder durch kovalentes Binden der gesamten oder eines Teils der kodierenden Sequenz für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid an die für Immunglobulin kodierende Sequenz. Die konstanten Domänen eines Antikörpers der Erfindung können durch ein derartiges Nicht-Immunglobulin-Polypeptid substituiert werden, oder es können die variablen Domänen einer der Antigen-kombinierenden Stellen eines Antikörpers der Erfindung substituiert werden, um einen chimären, zweiwertigen Antikörper zu erzeugen.
Die Antikörper können einwertige Antikörper sein. Verfahren zur Herstellung einwertiger Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. Beispielsweise umfasst eines der Verfahren die rekombinante Expression der Immunglobulin-Leichtkette und der modifizierten Schwerkette. Die Schwerkette ist im Allgemeinen an einer beliebigen Position in der Fc-Region trunkiert, so dass eine Schwerkettenvernetzung verhindert wird. Alternativ dazu werden die maßgeblichen Cysteinreste durch einen anderen Aminosäurerest substituiert, oder sie werden deletiert, so dass eine Vernetzung verhindert wird.
In-vitro-Verfahren sind ebenfalls zur Herstellung einwertiger Antikörper geeignet. Der Verdau von Antikörpern, um Fragmente davon, insbesondere Fab-Fragmente, zu produzieren, kann durch Verwenden von Routinetechniken erzielt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind.
C. Humanisierte Antikörper
Die Anti-PRO-Polypeptidantikörper der Erfindung können außerdem humanisierte Antikörper oder menschliche Antikörper umfassen. Humanisierte Formen nichtmenschlicher (z.B. muriner) Antikörper sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z.B. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere antigenbindende Untersequenzen von Antikörpern), die eine von nicht-menschlichem Immunglobulin stammende Minimalsequenz enthalten. Humanisierte Antikörper umfassen menschliche Immunglobuline (Empfängerantikörper), in denen Reste aus einer Complementary-determining-region (CDR) des Empfängers durch Reste aus einer CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Spenderantikörper), wie z.B. Maus, Ratte oder Kaninchen, mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In manchen Fällen werden Fv-Gerüstreste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Humanisierte Antikörper können außerdem Reste umfassen, die sich weder im Empfängerantikörper, noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen finden. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von zumindest einer und typischerweise zwei variablen Domänen, in denen alle oder im Wesentlichen alle CDR-Regionen denen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulin-Konsensussequenz sind. Der humanisierte Antikörper umfasst optimalerweise zumindest einen Abschnitt einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jenen eines menschlichen Immunglobulins (Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593–596 (1992)).
Verfahren zur Humanisierung nicht-menschlicher Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste auf, die in diesen aus einer nicht-menschlichen Quelle eingeführt worden sind. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden häufig als „Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise einer variablen „Import"-Domäne entnommen sind. Die Humanisierung kann im Wesentlichen nach dem Verfahren von Winter und Mitarbeitern (Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534–1536 (1988)) durch Substituieren entsprechender Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durch Nager CDRs oder CDR-Sequenzen durchgeführt werden. Demgemäß sind derartige „humanisierte" Antikörper chimäre Antikörper (US-Patent Nr. 4.816.567), worin im Wesentlichen weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch die entsprechende Sequenz aus einer nicht-menschlichen Spezies substituiert worden ist. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche Antikörper, in denen einige CDR-Reste und möglicherweise einige FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen in Nager-Antikörpern substituiert sind.
Menschliche Antikörper können außerdem unter Verwendung von verschiedenen, auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Techniken hergestellt werden, einschließlich Phagen-Display-Bibliotheken (Hoogenboom und Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)). Die Techniken von Cole et al. und Boerner et al. sind zur Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern ebenfalls verfügbar (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, S. 77 (1985), und Boerner et al., J. Immunol. 147(1), 86–95 (1991)).
D. Bispezifische Antikörper
Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise menschliche oder humanisierte Antikörper, die Bindungsspezifitäten für zumindest zwei verschiedene Antigene aufweisen. im vorliegenden Fall ist eine der Bindungsspezifitäten für das PRO-Polypeptid, die andere ist für ein beliebiges anderes Antigen und vorzugsweise für ein Zelloberflächenprotein oder einen Rezeptor oder eine Rezeptoruntereinheit.
Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Herkömmlicherweise basiert die rekombinante Produktion bispezifischer Antikörper auf der Coexpression von zwei Immunglobulin-Schwerketten/Leichtketten-Paaren, wobei die beiden Schwerketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen (Milstein und Cuello, Nature 305, 537–539 (1983)). Wegen der Zufallsverteilung von Immunglobulin-Schwer- und -Leichtketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein mögliches Gemisch von zehn verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten Moleküls wird üblicherweise durch affinitätschromatographische Schritte erzielt. Ähnliche Verfahren sind in WO 93/08829, veröffentlicht am 13. Mai 1993, und in Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655–3659 (1991), offenbart.
Variable Antikörperdomänen mit den gewünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-kombinierenden Stellen) können an Sequenzen konstanter Immunglobulindomänen fusioniert werden. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer konstanten Immunglobulin-Schwerkettendomäne, die zumindest einen Abschnitt der Gelenk-, CH2- und CH3-Regionen umfasst. Es wird bevorzugt, dass die erste konstante Schwerkettenregion (CH1), welche die für die Leichtkettenbindung notwendige Stelle enthält, in zumindest einer der Fusionen vorhanden ist. DNAs, die für die Immunglobulin-Schwerketten-Fusionen und, falls erwünscht, Immunglobulin-Leichtkette kodieren, werden in gesonderte Expressionsvektoren insertiert und in einen geeigneten Wirtsorganismus cotransfiziert. Für weitere Einzelheiten der Erzeugung bispezifischer Antikörper siehe beispielsweise Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
E. Heterokonjugat-Antikörper
Heterokonjugat-Antikörper sind im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung ebenfalls enthalten. Heterokonjugat-Antikörper sind aus zwei kovalent verbundenen Antikörpern zusammengesetzt. Derartige Antikörper sind beispielsweise zum Abzielen von Immunsystemzellen auf unerwünschte Zellen (US-Patent Nr. 4.676.980) und zur Behandlung der HIV-Infektion (WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089 ) vorgeschlagen worden. Es ist vorgesehen, dass die Antikörper in vitro unter Verwendung bekannter Verfahren der synthetischen Proteinchemie, einschließlich jener, die Vernetzungsmittel umfassen, hergestellt werden können. Beispielsweise können Immunotoxine unter Verwendung einer Disulfid-Austauschreaktion oder durch Bildung einer Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele geeigneter Reagenzien zu diesem Zweck umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat und jene, die beispielsweise im US-Patent Nr. 4.676.980 offenbart sind.
Verwendungen für Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper
Die Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper der Erfindung weisen verschiedene Verwendungen auf. Beispielsweise können Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper in diagnostischen Tests für ein PRO-Polypeptid, z.B. zum Nachweis seiner Expression in speziellen Zellen, Geweben oder Serum, verwendet werden. Es können verschiedene diagnostische Testtechniken, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, verwendet werden, wie z.B. kompetitive Bindungstests, direkte oder indirekte Sandwichtests und Immunpräzipitationstests, die entweder in heterogenen oder in homogenen Phasen durchgeführt werden (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRG Press Inc., S. 147–158 (1987)). Die in den diagnostischen Tests verwendeten Antikörper können mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert sein. Die nachweisbare Gruppierung sollte fähig sein, entweder direkt oder indirekt ein nachweisbares Signal zu produzieren. Beispielsweise kann die nachweisbare Gruppierung ein Radioisotop, wie z.B. ³H, ¹⁴C,³²P, ³⁵S oder ¹²⁵I, eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Verbindung, wie z.B. Fluorescein-Isothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin, oder ein Enzym, wie z.B. Alkalische Phosphatase, Beta-Galactosidase oder Meerrettich-Peroxidase, sein. Jegliches auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren zum Konjugieren des Antikörpers an die nachweisbare Gruppierung kann eingesetzt werden, einschließlich jener Verfahren, die von Hunter et al., Nature 144, 945 (1962); David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981); und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982), beschrieben sind.
Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper sind außerdem für die Affinitätsreinigung des PRO-Polypeptids aus rekombinanter Zellkultur oder natürlichen Quellen zweckdienlich. Bei diesem Verfahren werden die gegen das PRO-Polypeptid hergestellten Antikörper auf einem geeigneten Träger wie z.B. Sephadex-Harz oder Filterpapier unter Verwendung von Verfahren immobilisiert, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind. Der immobilisierte Antikörper wird dann mit einer das zu reinigende PRO-Polypeptid enthaltenden Probe kontaktiert, worauf der Träger mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen wird, der im Wesentlichen das gesamte Material in der Probe mit Ausnahme des PRO-Polypeptids, das an den immobilisierten Antikörper gebunden ist, entfernt. Schließlich wird der Träger mit einem weiteren geeigneten Lösungsmittel gewaschen, welches das PRO-Polypeptid vom Antikörper freisetzt.
Die folgenden Beispiele werden ausschließlich zu illustrativen Zwecken bereitgestellt und beabsichtigen nicht, den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken.
Beispiele
Im Handel erhältliche Reagenzien, auf die in den Beispielen Bezug genommen wird, wurden, falls nicht anders angegeben, nach den Anleitungen der Hersteller verwendet. Die Quelle jener Zellen, die in den folgenden Beispielen und in der gesamten Patentschrift mit ATCC-Zugangsnummern bezeichnet sind, ist die American Type Culture Collection, Rockville, Maryland.
Beispiel 1
Homologie-Screening extrazellulärer Domänen zur Identifizierung neuer Polypeptide und der dafür kodierenden cDNA
Die Sequenzen (einschließlich der Sekretionssignalsequenz, falls vorhanden) extrazellulärer Domänen (ECD) von ungefähr 950 bekannten sekretierten Proteinen aus der öffentlichen Swiss-Prot-Datenbank wurden verwendet, um EST-Datenbanken zu durchsuchen. Die EST-Datenbanken umfassten öffentliche Datenbanken (z.B. Dayhoff, GenBank) und geschützte Datenbanken (z.B. LIFESEQ^TM, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA). Die Suche wurde unter Verwendung des Computerprogramms BLAST oder BLAST2 (Altschul und Gish, Methods in Enzymology 266, 460–480 (1996)) als Vergleich der ECD-Proteinsequenzen mit einer 6-Rahmen-Translation der EST-Sequenzen durchgeführt. Jene Vergleiche mit einer Blast-Bewertung von 70 (oder in manchen Fällen 90) oder höher, die nicht für bekannte Protein kodierten, wurden angesammelt und mit dem Programm „phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, WA; (http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/phrap.html)) in Konsensus-DNA-Sequenzen assembliert.
Unter Verwendung dieses Homologie-Screenings extrazellulärer Domänen wurden Konsensus-DNA-Sequenzen bezüglich der anderen identifizierten EST-Sequenzen unter Verwendung von phrap assembliert. Zusätzlich wurden die erhaltenen Konsensus-DNA-Sequenzen häufig (jedoch nicht immer) unter Verwendung wiederholter BLAST-Zyklen und phrap verlängert, um die Konsensussequenz so weit wie möglich zu verlängern, wobei die oben erörterten Quellen von EST-Sequenzen verwendet wurden.
Auf Basis der wie oben beschrieben erhaltenen Konsensussequenzen wurden dann Oligonucleotide synthetisiert und verwendet, um mittels PCR eine die Sequenz von Interesse enthaltende cDNA-Bibliothek zu identifizieren, und zur Verwendung als Sonden, um einen Klon der kodierenden Sequenz für ein PRO-Polypeptid voller Länge zu isolieren, verwendet. Vorwärts- (.f-) und reverse (.r-) PCR-Primer liegen im Allgemeinen im Bereich von 20 bis 30 Nucleotiden und sind häufig so konstruiert, dass sie ein PCR-Produkt von ungefähr 100–1000 bp Länge liefern. Die Sonden- (.p-) Sequenzen weisen typischerweise ein Länge von 40–55 bp auf. In manchen Fällen werden zusätzliche Oligonucleotide synthetisiert, wenn die Konsensussequenz größer als ungefähr 1–1,5 kbp ist. Um mehrere Bibliotheken auf einen Klon voller Länge zu screenen, wurde DNA aus den Bibliotheken mittels PCR-Amplifikation gemäß Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, mit dem PCR-Primerpaar gescreent. Eine positive Bibliothek wurde dann verwendet, um für das Gen von Interesse kodierende Klone unter Verwendung des Sonden-Oligonucleotids und eines der Primerpaare zu isolieren.
Die zur Isolierung der cDNA-Klone verwendeten cDNA-Bibliotheken wurden mittels Standardtechniken unter Verwendung von im Handel erhältlichen Reagenzien, wie z.B. jenen von Invitrogen, San Diego, CA, konstruiert. Die cDNA wurde mit Oligo-dT geprimt, das eine Notl-Stelle enthielt, mit Hemikinase behandelten Stumpf→Sall-Adaptoren ligiert, mit Notl gespalten, mittels Gelelektrophorese in geeigneter Weise nach Größe aufgetrennt und in einer definierten Ausrichtung in einen geeigneten Klonierungsvektor (wie z.B. pRKB oder pRKD; pRK5B ist ein Vorläufer von pRK5D, der die Sfil-Stelle nicht enthält; siehe Holmes et al., Science 253, 1278–1280 (1991)) in die einzigartigen Xhol- und Notl-Stellen kloniert.
Beispiel 2
Isolierung von cDNA-Klonen mittels Amylase-Screening
1. Herstellung der Oligo-dT-geprimten cDNA-Bibliothek
mRNA wurde aus menschlichem Gewebe von Interesse unter Verwendung von Reagenzien und Protokollen von Invitrogen, San Diego, CA, (Fast Track 2) isoliert. Diese RNA wurde verwendet, um eine Oligo-dT-geprimte cDNA-Bibliothek im Vektor pRK5D unter Verwendung von Reagenzien und Protokollen von Life Technologies, Gaithersburg, MD, (Super Script Plasmid System) zu erzeugen. Bei diesem Verfahren wurde doppelsträngige cDNA auf eine Größe von mehr als 1.000 bp klassiert und die Sall/Notl-verbundene cDNA in den Xhol/Notl-gespaltenen Vektor kloniert. pRK5D ist ein Klonierungsvektor, der eine sp6-Transkriptionsinitiationsstelle, gefolgt von einer Sfil-Restriktionsenzymstelle aufweist, die den Xhol/Notl-cDNA-Klonierungsstellen vorausgeht.
2. Herstellung der zufallsgeprimten cDNA-Bibliothek
Es wurde eine sekundäre cDNA-Bibliothek erzeugt, um bevorzugt die 5'-Enden der primären cDNA-Klone darzustellen. Sp6-DNA wurde aus der Primärbibliothek (oben beschrieben) erzeugt und diese RNA verwendet, um eine zufallsgeprimte cDNA-Bibliothek in den Vektor pSST-AMY.0 unter Verwendung von Reagenzien und Protokollen von Life Technologies (Super Script Plasmid System, oben zitiert) zu erzeugen. Bei diesem Verfahren wurde doppelsträngige cDNA auf eine Größe von 500–1.000 bp klassiert, mit Stumpf→Notl-Adaptoren verbunden, mit Sfil gespalten und in den mit Sfil/Notl-gespaltenen Vektor kloniert. pSST-AMY.0 ist ein Klonierungsvektor, der einen den cDNA-Klonierungsstellen vorausgehenden Hefe-Alkoholdehydrogenase-Promotor und die Maus-Amylasesequenz aufweist (die reife Sequenz ohne Sekretionssignal), gefolgt vom Hefe-Alkoholdehydrogenase-Terminator im Anschluss an die Klonierungsstellen. Folglich werden die in diesen Vektor klonierten cDNAs, die mit der Amylasesequenz In-frame fusioniert sind, die Sekretion von Amylase aus geeignet transfizierten Hefekolonien bewirken.
3. Transformation und Nachweis
DNA aus der im obigen Abschnitt 2 beschriebenen Bibliothek wurde auf Eis gekühlt, worauf elektrokompetente DH10B-Bakterien (Life Technologies, 20 ml) zugegeben wurden. Bakterien und Vektorgemisch wurden dann wie vom Hersteller empfohlen der Elektroporation unterzogen. Anschließend wurde SOC-Medium (Life Technologies, 1 ml) zugegeben und das Gemisch bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert. Die Transformanten wurden dann auf 20 standardmäßige, Ampicillin enthaltende 150- mm-LB-Platten ausplattiert und 16 Stunden lang (37°C) inkubiert. Positive Kolonien wurden von den Platten abgeschabt und die DNA aus dem Bakterienpellet unter Verwendung von Standardprotokollen, z.B. mittels CsCl-Gradienten, isoliert. Die gereinigte DNA wurde dann nach den unten stehenden Hefeprotokollen weiterverarbeitet.
Die Hefeverfahren wurden in drei Kategorien unterteilt: (1) Transformation von Hefe mit dem kombinierten Plasmid/cDNA-Vektor; (2) Nachweis und Isolierung von Amylase sekretierenden Hefeklonen; und (3) PCR-Amplifikation des Inserts direkt aus der Hefekolonie und Reinigung der DNA zur Sequenzierung und weiteren Analyse.
Der verwendete Hefestamm war HD56-5A (ATCC 90785). Dieser Stamm weist den folgenden Genotyp auf: MAT alpha, ura3-52, leu2-3, leu2-112, his3-11, his3-15, MAL⁺, SUC⁺, GAL⁺. Vorzugsweise können Hefemutanten eingesetzt werden, die defekte post-translationelle Wege aufweisen. Derartige Mutanten können translokationsdefekte Allele in sec71, sec72, sec62 aufweisen, wobei trunkiertes sec71 insbesondere bevorzugt ist. Alternativ dazu können Antagonisten (einschließlich Antisense-Nucleotide und/oder Liganden), welche die normale Funktion dieser Gene stören, andere mit diesem Post-Translationsweg in Zusammenhang gebrachte Proteine (z.B. SEC61p, SEC72p, SEC62p, SEC63p, TDJ1p oder SSA1p-4p) oder die Komplexbildung dieser Proteine ebenfalls vorzugsweise in Kombination mit der Amylase exprimierenden Hefe eingesetzt werden.
Die Transformation wurde auf Basis des von Gietz et al., Nucl. Acid. Res. 20, 1425 (1992), dargelegten Protokolls durchgeführt. Die transformierten Zellen wurden dann aus Agar in komplexe YEPD-Medium-Kulturlösung (100 ml) inokuliert und über Nacht bei 30°C gezüchtet. Die YEPD-Kulturlösung wurde wie von Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 207 (1994), beschrieben hergestellt. Die Übernachtkultur wurde dann auf ungefähr 2 × 10⁶ Zellen/ml (ungefähre OD₆₀₀ = 0,1) in frische YEPD-Kulturlösung (500 ml) verdünnt und nochmals auf 1 × 10⁷ Zellen/ml (ungefähre OD₆₀₀ = 0,4–0,5) gezüchtet.
Die Zellen wurden dann geerntet und zur Transformation vorbereitet, und zwar durch Transfer in GS3-Rotorflaschen in einem Sorval-GS3-Rotor bei 5.000 U/min für 5 Minuten, Verwerfen des Überstands und anschließende Resuspension in sterilem Wasser und nochmalige Zentrifugation in 50-ml-Falcon-Röhrchen bei 3.500 U/min in einer Beckman-GS-6KR-Zentrifuge. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen anschließend mit LiAc/TE (10 ml, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5, 100 mM Li₂OOCCH₃) gewaschen und in LiAc/TE (2,5 ml) resuspendiert.
Die Transformation erfolgte durch Mischen der präparierten Zellen (100 μl) mit frisch denaturierter einzelsträngiger Lachshoden-DNA (Lofstrand Labs, Gaithersburg, MD) und transformierender DNA (1 μg, Vol. < 10 μl) in Mirozentrifugenröhrchen. Das Gemisch wurde durch Vortexen kurz vermischt, worauf 40% PEG/TE (600 μl, 40% Polyethylenglykol-4000, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM Li₂OOCCH₃ pH 7,5) zugegeben wurden. Das Gemisch wurde sanft vermischt und bei 30°C unter Schwenken 30 Minuten lang inkubiert. Die Zeilen wurden dann einem Hitzeschock bei 42°C für 15 Minuten unterzogen und das Reaktionsgefäß in einer Mikrozentrifuge bei 12.000 U/min 5–10 Sekunden lang zentrifugiert, dekantiert und in TE (500 μl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5) resuspendiert, gefolgt von nochmaliger Zentrifugation. Die Zellen wurden dann in TE (1 ml) verdünnt und Aliquoten (200 μl) auf Selektivmedium ausgestrichen, das vorher in 150-mm-Wachstumsplatten (VWR) hergestellt worden war.
Alternativ dazu wurde die Transformation anstelle von mehreren kleinen Reaktionen unter Verwendung einer einzigen Reaktion im großen Maßstab durchgeführt, worin die Reagensmengen entsprechend erhöht wurden.
Das verwendete Selektivmedium war ein synthetischer vollständiger Dextrose-Agar, dem Uracil fehlte (SCD-Ura) und der wie in Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. S. 208–210 (1994), beschrieben hergestellt wurde. Die Transformanten wurden bei 30°C 2–3 Tage lang gezüchtet.
Der Nachweis von Amylase sekretierenden Kolonien wurde durchgeführt, indem rote Stärke in das Selektivwachstumsmedium aufgenommen wurde. Die Stärke wurde an den roten Farbstoff (Reactive Red-120, Sigma) nach dem von Biely et al., Anal. Biochem. 172, 176–179 (1988), beschriebenen Verfahren gekoppelt. Die gekoppelte Stärke wurde in SCD-Ura-Agarplatten in einer Endkonzentration von 0,15 (Gew./Vol.) inkorporiert und war mit Kaliumphosphat auf einen pH von 7,0 (50–100 mM Endkonzentration) gepuffert.
Die positiven Kolonien wurden entnommen und auf frisches Selektivmedium (auf 150-mm-Platten) ausgestrichen, um gut isolierte und identifizierbare Einzelkolonien zu erhalten. Gut isolierte, für Amylasesekretion positive Einzelkolonien wurden durch direkte Inkorporation von roter Stärke in gepufferten SCD-Ura-Agar nachgewiesen. Positive Kolonien wurden aufgrund ihrer Fähigkeit festgestellt, Stärke abzubauen, was in einem direkt sichtbaren, durchsichtigen Halo um die positive Kolonie herum resultierte.
4. Isolierung von DNA mittels PCR-Amplifikation
Wenn eine positive Kolonie isoliert war, wurde ein Teil von ihr mittels Zahnstocher entnommen und in sterilem Wasser (30 μl) in eine 96-Napf-Platte verdünnt. Zu diesem Zeitpunkt wurden die positiven Kolonien entweder eingefroren und für die anschließende Analyse gelagert oder sofort amplifiziert. Eine Aliquote von Zellen (5 μl) wurde als Templat für die PCR-Reaktion verwendet, und zwar in einem Volumen von 25 μl, das Folgendes enthielt: 0,5 μl Klentaq (Clontech, Palo Alto, CA); 4,0 μl 10 mM dNTPs (Perkin Elmer-Cetus); 2,5 μl Klentaq-Puffer (Clontech); 0,25 μl Vorwärts-Oligo 1; 0,25 μl reverses Oligo 2; 12,5 μl destilliertes Wasser. Die Sequenz des Vorwärts-Oligonucleotids 1 war:
5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT-3' (Seq.-ID Nr. 4)
Die Sequenz des reversen Oligonucleotids 2 war:
5'-CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT-3' (Seq.-ID Nr. 5)
Die PCR wurde dann wie folgt durchgeführt:
Die unterstrichenen Regionen der Oligonucleotide anellierten an die ADH-Promotorregion bzw. Amylaseregion und amplifizierten eine 307-bp-Region des Vektors pSST-AMY.0, wenn kein Insert vorhanden war. Typischerweise enthielten die ersten 18 Nucleotide des 5'-Endes dieser Oligonucleotide Anellierungsstellen für die Sequenzierungsprimer. Folglich war das Gesamtprodukt der PCR-Reaktion aus einem leeren Vektor 343 bp lang. Jedoch lieferte die Signalsequenz-fusionierte cDNA beträchtlich längere Nucleotidsequenzen.
Im Anschuss an die PCR wurde eine Aliquote der Reaktion (5 μl) mittels Agarosegelelektrophorese in einem 1%igen Agarosegel unter Verwendung eines Tris-Borat- EDTA-(TBE-) Puffersystems wie von Sambrook et al., s.o., beschrieben untersucht. Klone, die ein einziges starkes PCR-Produkt einer Größe von mehr als 400 bp lieferten, wurden mittels DNA-Sequenzierung nach Reinigung mit einer 96-Qiaquick-PCR-Aufreinigungssäule (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) weiter analysiert.
Beispiel 3
Isolierung von für menschliches PRO181 kodierenden cDNA-Klonen
Von einer im in obigem Beispiel 2 beschriebenen Amylase-Screen isolierten cDNA- Sequenz wurde durch BLAST und FastA-Sequenzabgleich herausgefunden, dass sie mit einer für das Cornichon-Protein kodierenden Nucleotidsequenz Sequenzhomologie aufweist. Diese cDNA-Sequenz wird hierin als DNA13242 bezeichnet (3; Seq.-ID Nr. 3). Basierend auf der Sequenzhomologie wurden aus der Sequenz des DNA13242-Moleküls Oligonucleotidsonden erzeugt und verwendet, um eine menschliche Plazenta- (LIB89-) Bibliothek zu screenen, die wie in Absatz 1 von obenstehendem Beispiel 2 beschrieben hergestellt wird. Der Klonierungsvektor war pRK5B (pRK5B ist ein Vorläufer von pRK5D, das die Sfil-Stelle nicht enthält; siehe Holmes et al., Science 253, 1278–1280 (1991)), und die cDNA-Größe wurde auf weniger als 2800 bp geschnitten.
Die verwendeten Oligonucleotidsonden umfassten:
Vorwärts-PCR-Primer 5'-GTGCAGCAGAGTGGCTTACA-3' (Seq.-ID Nr. 6)
Rückwärts-PCR-Primer 5'-ACTGGACCAATTCTTCTGTG-3' (Seq.-ID Nr. 7)
Hybridisierungssonde 5'-GATATTCTAGCATATTGTCAGAAGGAAGGATGGTGCAAATTAGCT-3' (Seq.-ID Nr. 8)
Es wurde ein Klon voller Länge identifiziert, der einen einzigen offenen Leseraster mit einer scheinbaren Translationsinitiationsstelle an den Nucleotidpositionen 14–16 enthielt und am an den Nucleotidpositionen 446–448 zu findenden Stoppcodon endete (1; Seq.-ID Nr. 1). Der vorhergesagte Polypeptidvorläufer ist 144 Aminosäuren lang, hat ein berechnetes Molekulargewicht von etwa 16.699 Dalton und einen geschätzten pl von etwa 5,6. Eine Analyse der in 2 (Seq.-ID Nr. 2) gezeigten PRO181-Sequenz voller Länge weist folgende Präsenz nach: ein Signalpeptid von etwa Aminosäure 1 bis etwa Aminosäure 20, eine mutmaßliche Typ-II-Transmembrandomäne von etwa Aminosäure 11 bis etwa Aminosäure 31 und andere Transmembrandomänen von etwa Aminosäure 57 bis etwa Aminosäure 77 und von etwa Aminosäure 123 bis etwa Aminosäure 143. Klon UNQ155 (DNA23330-1390) wurde am 14. April 1998 bei der ATCC hinterlegt, und ihm wurde die ATCC-Hinterlegungsnr. 209775 zugewiesen.
Eine Analyse der Aminosäuresequenz des PRO181-Polypeptids voller Länge deutet darauf hin, dass es signifikante Sequenzähnlichkeit mit dem Cornichon-Protein aufweist, wodurch angedeutet wird, PRO181 könnte ein neues Cornichon-Homolog sein. Spezifischer zeigte eine Analyse der Dayhoff-Datenbank (Version 35.45 SwissProt 35) eine signifikante Homologie zwischen der PRO181-Aminosäuresequenz und den folgenden Dayhoff-Sequenzen, AF022811_1, CET09E8_3, S64058, YGF4_YEAST, YB60_YEAST, EBU89455_1, SIU36383_3 und PH1371.
Beispiel 4
Verwendung der für PRO-Polypeptid kodierenden Nucleinsäure als Hybridisierungssonden
Das folgende Verfahren beschreibt die Verwendung einer für ein PRO-Polypeptid kodierenden Nucleotidsequenz als Hybridisierungssonde.
Die die kodierende Sequenz für ein hierin offenbartes PRO-Polypeptid von Interesse umfassende DNA kann als Sonde eingesetzt oder als Basis verwendet werden, von der aus Sonden zum Screenen auf homologe DNAs (wie z.B. jene, die für natürlich vorkommende Varianten des PRO-Polypeptids kodieren) in Humangewebe-cDNA-Bibliotheken oder Humangewebe-Genombibliotheken hergestellt werden.
Die Hybridisierung und das Waschen von Filtern, die eine der Bibliothek-DNAs enthalten, wird unter folgenden hohen Stringenzbedingungen durchgeführt. Die Hybridisierung einer radioaktiv markierten, von für PRO-Polypeptid kodierender Nucleinsäure hergeleiteten Sonde an die Filter wird in einer Lösung von 50% Formamid, 5 × SSC, 0,1% SDS, 0,1% Natriumpyrophosphat, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 2 × Denhardt-Lösung und 10% Dextransulfat bei 42°C 20 Stunden lang durchgeführt. Das Waschen der Filter wird in einer wässrigen Lösung von 0,1 × SSC und 0,1% SDS bei 42°C durchgeführt.
DNAs mit der gewünschten Sequenzidentität zur DNA, die für Nativsequenz-PRO-Polypeptid voller Länge kodiert, kann dann unter Verwendung von Standardtechniken, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, identifiziert werden.
Beispiel 5
Expression von PRO-Polypeptiden in E. coli
Dieses Beispiel illustriert die Herstellung einer unglykosylierten Form eines gewünschten PRO-Polypeptids durch rekombinante Expression in E. coli.
Die für das gewünschte PRO-Polypeptid kodierende DNA-Sequenz wird zunächst unter Verwendung gewählter PCR-Primer amplifiziert. Die Primer sollten Restriktionsenzymstellen enthalten, die den Restriktionsenzymstellen auf dem gewählten Expressionsvektor entsprechen. Es kann eine Vielzahl von Expressionsvektoren eingesetzt werden. Ein Beispiel eines geeigneten Vektors ist pBR322 (hergeleitet von E. coli; siehe Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)), der Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz enthält. Der Vektor wird mit Restriktionsenzym verdaut und dephosphoryliert. Die PCR-amplifizierten Sequenzen werden dann in den Vektor ligiert. Der Vektor wird vorzugsweise Sequenzen umfassen, die für ein antibiotisches Resistenzgen, einen trp-Promotor, einen polyhis-Leader (einschließlich der ersten sechs STII-Codons, polyhis-Sequenz und Enterokinase-Spaltstelle), die spezielle für PRO- Polypeptid kodierende Region, Lambda-Transkriptionsterminator und ein argU-Gen kodieren.
Das Ligationsgemisch wird dann verwendet, um einen gewählten E.-coli-Stamm unter Verwendung von in Sambrook et al., s.o., beschriebenen Verfahren zu transformieren. Transformanten werden aufgrund ihrer Fähigkeit identifiziert, auf LB-Platten zu wachsen, worauf Antibiotikum-resistente Kolonien selektiert werden. Plasmid-DNA kann isoliert und mittels Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung bestätigt werden.
Selektierte Klone können über Nacht in Flüssigkulturmedium, wie z.B. in mit Antibiotika ergänzter LB-Kulturlösung, gezüchtet werden. Die Übernachtkultur kann anschließend verwendet werden, um eine Kultur im größeren Maßstab zu inokulieren. Die Zellen werden dann auf eine gewünschte optische Dichte gezüchtet, während der der Expressionsvektor angeschaltet wird.
Nach dem Kultivieren der Zellen für mehrere Stunden können die Zellen mittels Zentrifugation geerntet werden. Das durch Zentrifugation erhaltene Zellpellet kann unter Verwendung verschiedener, auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Mittel solubilisiert werden, und das solubilisierte PRO-Polypeptid kann dann unter Verwendung einer Metallchelatierungssäule unter Bedingungen gereinigt werden, die eine feste Bindung des Proteins ermöglichen.
PRO181 wurde in E. coli in einer poly-His-markierten Form unter Verwendung des folgenden Verfahrens exprimiert. Die für das PRO-Polypeptid kodierende DNA wurde zunächst unter Verwendung gewählter PCR-Primer amplifiziert. Die Primer enthielten Restriktionsenzymstellen, die den Restriktionsenzymstellen auf dem gewählten Expressionsvektor entsprechen, und andere zweckdienliche Sequenzen, die für eine effiziente und verlässliche Translationsinitiation, schnelle Reinigung an einer Metallchelatierungssäule und proteolytische Entfernung mit Enterokinase sorgen. Die PCR-amplifizierten, poly-His-markierten Sequenzen wurden dann in einen Expressionsvektor ligiert, der dazu verwendet wurde, einen auf Stamm 52 basierenden E.-coli- Wirt (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts(htpRts) clpP(Laclq)) zu transformieren. Transformanten wurden zunächst in 50 mg/ml Carbenicillin enthaltendem LB bei 30°C unter Schütteln gezüchtet, bis eine O.D.600 von 3–5 erreicht war. Die Kulturen wurden dann 50- bis 100fach in CRAP-Medium (hergestellt durch Mischen von 3,57 g (NH₄)₂SO₄, 0,71 g Natriumcitrat 2H₂O, 1,07 g KCl, 5,36 g Difco-Hefeextrakt, 5,36 g Sheffield-Hycase SF in 500 ml Wasser sowie 110 mM MPOS, pH 7,3, 0,55 (Gew./Vol.) Glucose und 7 mM MgSO₄) verdünnt und ungefähr 20–30 Stunden lang bei 30°C unter Schütteln gezüchtet. Es wurden Proben entfernt, um die Expression mittels SDS-PAGE-Analyse zu verifizieren, und die Massenkultur zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Die Zellpellets wurden bis zur Reinigung und Neufaltung eingefroren.
E.-coli-Paste aus 0,5- bis 1-l-Fermentationen (6- bis 10-g-Pellets) wurde in 10 Volumina (Gew./Vol.) 7 M Guanidin, 20 mM Tris-Puffer (pH 8) resuspendiert. Festes Natriumsulfit und Natriumtetrathionat werden zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,1 M bzw. 0,02 M zu liefern, und die Lösung wurde über Nacht bei 4°C gerührt. Dieser Schritt resultiert in einem denaturierten Protein, in dem alle Cysteinreste durch Sulfitolisierung blockiert sind. Die Lösung wurde bei 40.000 U/min in einer Beckman-Ultrazentrifuge 30 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 3–5 Volumina Metallchelat-Säulenpuffer (6 M Guanidin, 20 mM Tris, pH 7,4) verdünnt und durch 0,22-Mikronfilter zur Klärung filtriert. Der geklärte Extrakt wurde auf eine 5-ml-Ni-NTA-Metallchelatsäule von Qiagen aufgegeben, die im Metallchelat-Säulenpuffer äquilibriert war. Die Säule wurde mit zusätzlichem Puffer gewaschen, der 50 mM Imidazol (Calbiochem, Utrol-Qualität), pH 7,4, enthielt. Das Protein wurde mit 250 mM Imidazol enthaltendem Puffer eluiert. Das gewünschte Protein enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und bei 4°C gelagert. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung des berechneten Extinktionskoeffizienten auf Basis seiner Aminosäuresequenz abgeschätzt.
Die Proteine wurden durch langsames Verdünnen der Probe in frisch hergestellten Neufaltungspuffer neu gefaltet, der aus Folgendem bestand: 20 mM Tris, pH 8,6, 0,3 M NaCl, 2,5 M Harnstoff, 5 mM Cystein, 20 mM Glycin und 1 mM EDTA. Neufal tungsvolumina wurden so gewählt, dass die endgültige Proteinkonzentration zwischen 50 und 100 Mikrogramm/ml betrug. Die Neufaltungslösung wurde bei 4°C 12–36 Stunden lang sanft gerührt. Die Neufaltungsreaktion wurde durch die Zugabe von TFA auf eine Endkonzentration von 0,4% (pH von ungefähr 3) gestoppt. Vor der weiteren Reinigung des Proteins wurde die Lösung durch ein 0,22-Mikronfilter filtriert und Acetonitril auf eine Endkonzentration von 2–10% zugegeben. Das neugefaltete Protein wurde an einer Poros-R1/H-Umkehrphasensäule unter Verwendung eines mobilen Puffers von 0,1% TFA mit Elution mit einem Gradienten aus Acetonitril von 10 bis 80% chromatographiert. Aliquoten von Fraktionen mit A280-Absorption wurden an SDS-Polyacrylamidgelen analysiert, und Fraktionen, die heterogenes neugefaltetes Protein enthielten, wurden vereinigt. Im Allgemeinen werden die richtig gefalteten Spezies der meisten Proteine bei den niedrigsten Acetonitrilkonzentrationen eluiert, da diese Spezies die kompaktesten sind und deren hydrophobes Inneres von der Wechselwirkung mit dem Umkehrphasenharz abgeschirmt ist. Aggregierte Spezies werden üblicherweise bei höheren Acetonitrilkonzentrationen eluiert. Zusätzlich zur Abtrennung fehlgefalteter Proteinformen von der gewünschten Form entfernt der Umkehrphasenschritt auch Endotoxin aus den Proben.
Die gewünschten gefalteten PRO-Proteine enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und das Acetonitril unter Verwendung eines sanften, auf die Lösung gerichteten Stickstoffstroms entfernt. Die Proteine wurden in 20 mM Hepes, pH 6,8, mit 0,14 M Natriumchlorid und 4% Mannit durch Dialyse oder Gelfiltration unter Verwendung von im Formulierungspuffer äquilibrierten G25-Superfine-Harzen (Pharmacia) formuliert und sterilfiltriert.
Beispiel 6
Expression von PRO-Polypeptiden in Säugetierzellen
Dieses Beispiel illustriert die Herstellung einer glykosylierten Form eines gewünschten PRO-Polypeptids durch rekombinante Expression in Säugetierzellen.
Der Vektor pRK5 (siehe EP 307.247 , veröffentlicht am 15. März 1989) wird als Expressionsvektor eingesetzt. Gegebenenfalls wird die für PRO-Polypeptid kodierende DNA mit gewählten Restriktionsenzymen in pRK5 ligiert, um die Insertion der PRO-Polypeptid-DNA unter Verwendung von Ligationsverfahren zu ermöglichen, wie sie z.B. in Sambrook et al., s.o., beschrieben sind. Der resultierende Vektor wird pRK5-PRO-Polypeptid genannt.
In einer der Ausführungsformen können die gewählten Wirtszellen 293-Zellen sein. Menschliche 293-Zellen (ATCC CCL 1573) werden in Gewebekulturplatten in Medium, wie z.B. in mit Fötalkälberserum und gegebenenfalls mit Nährstoffkomponenten und/oder Antibiotika ergänztem DMEM, zur Konfluenz gezüchtet. Ungefähr 10 μg pRK5-PRO-Polypeptid-DNA wird mit ungefähr 1 μg der für das VA-RNA-Gen kodierenden DNA (Thimmappaya et al., Cell 31, 543 (1982)) vermischt und in 500 μl 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl₂ gelöst. Diesem Gemisch werden tropfenweise 500 μl 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO₄ zugegeben und die Bildung eines Präzipitats für 10 Minuten bei 25°C ermöglicht. Das Präzipitat wird suspendiert und zu den 293-Zellen zugegeben und für ungefähr vier Stunden bei 37°C absetzen gelassen. Das Kulturmedium wird abgesaugt, und es werden 2 ml 20% Glycerin in PBS für 30 Sekunden zugegeben. Die 293-Zellen werden dann mit serumfreiem Medium gewaschen, worauf frisches Medium zugegeben wird und die Zellen ungefähr 5 Tage lang inkubiert werden.
Ungefähr 24 Stunden nach den Transfektionen wird das Kulturmedium entfernt und durch Kulturmedium (alleine) oder 200 μCi/ml ³⁵S-Cystein und 200 μCi/ml ³⁵S-Methionin enthaltendes Kulturmedium ersetzt. Nach einer Inkubation von 12 Stunden wird das konditionierte Medium gesammelt, auf einem Zentrifugenfilter konzentriert und auf ein 15%iges SDS-Gel aufgegeben. Das verarbeitete Gel kann getrocknet und für eine gewählte Zeitdauer einem Film exponiert werden, um die Gegenwart von PRO-Polypeptid erkennen zu lassen. Diejenigen Kulturen, die transfizierte Zellen enthalten, können einer weiteren Inkubation (in serumfreiem Medium) unterzogen werden, und das Medium wird in gewählten Biotests getestet.
In einer alternativen Technik kann das PRO-Polypeptid unter Verwendung des von Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 12, 7575 (1981), beschriebenen Dextransulfat-Verfahrens vorübergehend in 293-Zellen eingeführt werden. 293-Zellen werden in einer Zentrifugenflasche auf maximale Dichte gezüchtet, worauf 700 μg pRK5-PRO-Polypeptid-DNA zugegeben werden. Die Zellen werden zuerst aus der Zentrifugenflasche mittels Zentrifugation konzentriert und mit PBS gewaschen. Das DNA-Dextran-Präzipitat wird auf dem Zellpellet vier Stunden lang inkubiert. Die Zellen werden mit 20% Glycerin 90 Sekunden lang behandelt, mit Gewebekulturmedium gewaschen und wieder in die Zentrifugenflasche gegeben, die Gewebekulturmedium, 5 μg/ml Rinderinsulin und 0,1 μg/ml Rindertransferrin enthält. Nach ungefähr vier Tagen wird das konditionierte Medium zentrifugiert und filtriert, um Zellen und Trümmer zu entfernen. Die das exprimierte PRO-Polypeptid enthaltende Probe kann dann mit einem beliebigen gewählten Verfahren, wie z.B. Dialyse und/oder Säulenchromatographie, konzentriert und gereinigt werden.
In einer weiteren Ausführungsform können die PRO-Polypeptide in CHO-Zellen exprimiert werden. Das pRK5-PRO-Polypeptid kann unter Verwendung bekannter Reagenzien, wie z.B. CaPO₄ oder DEAE-Dextran, in CHO-Zellen transfiziert werden. Wie oben beschrieben wurde, können die Zellkulturen inkubiert und das Medium durch Kulturmedium (alleine) oder durch ein Medium ersetzt werden, das einen Radiomarker, wie z.B. ³⁵S-Methionin, enthält. Nach Feststellung der Gegenwart von PRO-Polypeptid kann das Kulturmedium durch serumfreies Medium ersetzt werden. Vorzugsweise werden die Kulturen ungefähr 6 Tage lang inkubiert, worauf das konditionierte Medium geerntet wird. Das das exprimierte PRO-Polypeptid enthaltende Medium kann dann mit einem beliebigen gewählten Verfahren konzentriert und gereinigt werden.
Epitopmarkiertes PRO-Polypeptid kann ebenfalls in Wirts-CHO-Zellen exprimiert werden. Das PRO-Polypeptid kann aus dem pRK5-Vektor heraus subkloniert werden. Das Subklon-Insert kann einer PCR unterzogen werden, um In-frame mit einem gewählten Epitopmarker, wie z.B. einem poly-his-Marker, in einen Baculovirus-Expressionsvektor zu fusionieren. Das poly-his-markierte PRO-Polypeptidinsert kann dann in einen SV40-angetriebenen Vektor subkloniert werden, der einen Selektionsmarker, wie z.B. DHFR, zur Selektion stabiler Klone enthält. Schließlich können die CHO-Zellen mit dem SV40-angetriebenen Vektor (wie oben beschrieben) transfiziert werden. Die Markierung kann wie oben beschrieben durchgeführt werden, um die Expression zu verifizieren. Das das exprimierte poly-His-markierte PRO-Polypeptid enthaltende Kulturmedium wird dann mit einem beliebigen gewählten Verfahren, wie z.B. durch Ni²⁺-Chelat-Affinitätschromatographie, konzentriert und gereinigt werden.
Die stabile Expression in CHO-Zellen wurde unter Verwendung des folgenden Verfahrens durchgeführt. Die Proteine wurden als ein IgG-Konstrukt (Immunoadhäsin) exprimiert, in dem die kodierenden Sequenzen für lösliche Formen (z.B. extrazelluläre Domänen) der entsprechenden Proteine an eine Sequenz der konstanten IgG1-Region fusioniert waren, welche die Gelenks-, CH2- und CH2-Domänen enthielt, und/oder ist eine poly-His-markierte Form.
Im Anschluss an die PCR-Amplifikation wurden die entsprechenden DNAs in einen CHO-Expressionsvektor subkloniert, und zwar unter Verwendung von Techniken, wie sie in Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997), beschrieben sind. CHO-Expressionsvektoren werden so konstruiert, dass sie kompatible Restriktionsstellen 5' und 3' der DNA von Interesse aufweisen, um das geeignete Shuttling von cDNAs zu ermöglichen. Der zur Expression in CHO-Zellen verwendete Vektor entspricht dem in Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24, 9 (1774–1779 (1996), beschriebenen und verwendet den frühen SV40-Promotor/Enhancer, um die Expression der cDNA von Interesse und Dihydrofolatreductase (DHFR) anzutreiben. Die DHFR-Expression erlaubt die Selektion auf stabile Erhaltung des Plasmids nach der Transfektion.
Zwölf Mikrogramm der gewünschten Plasmid-DNA wurden in ungefähr 10 Millionen CHO-Zellen eingeführt, und zwar unter Verwendung der im Handel erhältlichen Transfektionsreagenzien Superfect* (Qiagen), Dosper* oder Fugene* (Boehringer Mannheim). Die Zellen wurden wie in Lucas et al., s.o., beschrieben gezüchtet. Un gefähr 3 × 10⁷ Zellen werden in eine Ampulle zur weiteren, unten beschriebenen Züchtung und Produktion eingefroren.
Die die Plasmid-DNA enthaltenden Ampullen wurden aufgetaut, indem sie in ein Wasserbad gestellt und durch Vortexen gemischt wurden. Der Inhalt wurde in ein Zentrifugenröhrchen pipettiert, das 10 ml Medium enthielt, und bei 1.000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und die Zellen in 10 ml Selektivmedium (0,2-μm-filtriertes PS20 mit 5% 0,2-μm-diafiltriertem Fötalkälberserum) resuspendiert. Die Zellen wurden dann in eine 100-ml-Zentrifugenflasche aliquotiert, die 90 ml Selektivmedium enthielt. Nach 1–2 Tagen wurden die Zellen in eine mit 150 ml Selektivmedium gefüllte 250-ml-Zentrifugenflasche überführt und bei 37°C inkubiert. Nach weiteren 2–3 Tagen wurden eine 250-ml-, 500-ml- und 2000-ml-Zentrifugenflaschen mit 3 × 10⁵ Zellen/l inokuliert. Das Zellmedium wurde gegen frisches Medium durch Zentrifugation und Resuspension in Produktionsmedium ausgetauscht. Obgleich jegliches geeignete CHO-Medium eingesetzt werden kann, wurde tatsächlich ein im US-Patent Nr. 5.122.469 (erteilt am 16. Juni 1992) beschriebenes Medium verwendet. Eine 3-1-Produktionszentrifugenflasche wird mit 1,2 × 10⁶ Zellen/ml inokuliert. Am Tag 0 wurden Zellzahl und pH bestimmt. Am Tag 1 wurde der Zentrifugenflasche Probe entnommen und eine Spülung mit gefilterter Luft vorgenommen. Am Tag 2 wurde der Zentrifugenflasche Probe entnommen, die Temperatur auf 33°C verschoben und 30 ml 500 g/ml Glucose und 0,6 ml 10% Antischaum (z.B. 35% Polydimethylsiloxan-Emulsion, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion) zugegeben. Über die gesamte Produktion hinweg wurde der pH wie erforderlich eingestellt, um ihn auf ca. 7,2 zu halten. Nach 10 Tagen oder bis die Lebensfähigkeit auf unter 70% abfiel, wurde die Zellkultur durch Zentrifugation und Filtration durch ein 0,22-μm-Filter geerntet. Das Filtrat wurde entweder bei 4°C gelagert oder sofort auf Säulen zur Reinigung aufgegeben.
Für poly-His-markierte Konstrukte wurden die Proteine unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule (Qiagen) gereinigt. Vor der Reinigung wurde dem konditionierten Medium Imidazol auf eine Konzentration von 5 mM zugegeben. Das konditionierte Medium wurde bei einer Flussrate von 4–5 ml/min bei 4°C auf eine 6-ml-Ni-NTA-Säule ge pumpt, die in 20 mM Hepes-Puffer, pH 7,4, der 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol enthielt, äquilibriert war. Nach der Beladung wurde die Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen und das Protein mit 0,25 M Imidazol enthaltendem Äquilibrierungspuffer eluiert. Das hochgereinigte Protein wurde anschließend in einen Aufbewahrungspuffer, der 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4% Mannit, pH 6,8, enthielt, mit einer 25-ml-G25-Superfine-Säule (Pharmacia) entsalzt und bei –80°C gelagert.
Immunoadhäsin- (Fc enthaltende) Konstrukte wurden aus dem konditionierten Medium wie folgt gereinigt. Das konditionierte Medium wurde auf eine 5-ml-Protein-A-Säule (Pharmacia) gepumpt, die in 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH 6,8, äquilibriert worden war. Nach der Beladung wurde die Säule ausgiebig mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, bevor sie mit 100 mM Zitronensäure, pH 3,5, eluiert wurde. Das eluierte Protein wurde sofort durch Auffangen von 1-ml-Fraktionen in Röhrchen neutralisiert, die 275 μl 1 M Tris-Puffer, pH 9, enthielten. Das hochgereinigte Protein wurde anschließend wie oben für die poly-His-markierten Proteine beschrieben in Aufbewahrungspuffer entsalzt. Die Homogenität wurde mittels SDS-Polyacrylamidgelen und durch N-terminale Aminosäuresequenzierung mittels Edman-Abbau beurteilt.
Das folgende PRO-Polypeptid wurde erfolgreich vorübergehend in COS-Zellen exprimiert: PRO181.
Das folgende PRO-Polypeptid wurde erfolgreich stabil in CHO-Zellen exprimiert: PRO181.
Beispiel 7
Expression von PRO-Polypeptiden in Hefe
Das folgende Verfahren beschreibt die rekombinante Expression eines gewünschten PRO-Polypeptids in Hefe.
Zuerst werden Hefe-Expressionsvektoren für die intrazelluläre Produktion oder Sekretion von PRO-Polypeptiden aus dem ADH2/GAPDH-Promotor konstruiert. Für ein gewünschtes PRO-Polypeptid kodierende DNA, ein gewähltes Signalpeptid und der Promotor werden in geeignete Restriktionsenzymstellen im gewählten Plasmid insertiert, um die intrazelluläre Expression des PRO-Polypeptids zu steuern. Für die Sekretion kann für das PRO-Polypeptid kodierende DNA in das gewählte Plasmid gemeinsam mit DNA kloniert werden, die für den ADH2/GAPDH-Promotor, die Hefe-Alpha-Faktor-Sekretionssignal/Leader-Sequenz und für Linkersequenzen (falls benötigt) zur Expression des PRO-Polypeptids kodiert.
Hefezellen, wie z.B. der Hefestamm AB110, können dann mit den oben beschriebenen Expressionsplasmiden transformiert und in gewählten Fermentationsmedien kultiviert werden. Die Überstände der transformierten Hefen können durch Präzipitation mit 10% Trichloressigsäure und Trennung mittels SDS-PAGE, gefolgt von der Färbung der Gele mit Coomassie-Blau-Farbstoff analysiert werden.
Rekombinantes PRO-Polypeptid kann anschließend isoliert und gereinigt werden, indem die Hefezellen aus dem Fermentationsmedium durch Zentrifugation entfernt werden, worauf das Medium unter Verwendung gewählter Kartuschenfilter konzentriert wird. Das das PRO-Polypeptid enthaltende Konzentrat kann durch Verwendung gewählter Säulenchromatographieharze weiter gereinigt werden.
Beispiel 8
Expression von PRO-Polypeptiden in Baculovirus-infizierten Insektenzellen
Das folgende Verfahren beschreibt die rekombinante Expression von PRO-Polypeptiden in Baculovirus-infizierten Insektenzellen.
Das gewünschte PRO-Polypeptid wird stromauf eines in einem Baculovirus-Expressionsvektor enthaltenen Epitopmarkers fusioniert. Derartige Epitopmarker umfassen poly-his-Marker und Immunglobulin-Marker (wie z.B. Fc-Regionen von IgG). Es kann eine Vielzahl von Plasmiden eingesetzt werden, einschließlich Plasmide, die sich von im Handel erhältlichen Plasmiden, wie z.B. pVL1393 (Novagen), herleiten. Zusammenfassend wird das PRO-Polypeptid oder der gewünschte Abschnitt des PRO-Polypeptids (wie z.B. die für die extrazelluläre Domäne eines Transmembranproteins kodierende Sequenz) mittels PCR mit Primern amplifiziert, die zu den 5'- und 3'-Regionen komplementär sind. Der 5'-Primer kann flankierende (gewählte) Restriktionsenzymstellen enthalten. Das Produkt wird dann mit diesen gewählten Restriktionsenzymen verdaut und in den Expressionsvektor subkloniert.
Das rekombinante Baculovirus wird durch Cotransfektion von obigem Plasmid und BaculoGold^TM-Virus-DNA (Pharmingen) in Spodoptera-frugiperda- („Sf9"-) Zellen (ATCC CRL 1711) unter Verwendung von Lipofectin (im Handel von GIBCO-BRL erhältlich) erzeugt. Nach 4–5 Tagen Inkubation bei 28°C werden die freigesetzten Viren geerntet und für weitere Amplifikationen verwendet. Virusinfektion und Proteinexpression werden wie von O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford University Press, Oxford (1994), beschrieben durchgeführt.
Das exprimierte poly-his-markierte PRO-Polypeptid kann dann beispielsweise durch Ni²⁺-Chelat-Affinitätschromatographie wie folgt gereinigt werden. Extrakte werden aus rekombinanten, virusinfizierten Sf9-Zellen wie von Rupert et al., Nature 362, 175–179 (1993), beschrieben hergestellt. Zusammenfassend werden Sf9-Zellen gewaschen, in Beschallungspuffer (25 ml Hepes, pH 7,9; 12,5 mM MgCl₂; 0,1 mM EDTA, 10% Glycerin; 0,1% NP-40; 0,4 M KCl) resuspendiert und zweimal 20 Sekunden lang auf Eis beschallt. Die beschallten Zellen werden durch Zentrifugation geklärt und der Überstand 50fach in Beladungspuffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10% Glycerin, pH 7,8) verdünnt und durch ein 0,45-μm-Filter filtriert. Eine Ni²⁺-NTA-Agarosesäule (im Handel von Qiagen erhältlich) wird mit einem Bettvolumen von 5 ml hergestellt, mit 25 ml Wasser gewaschen und mit 25 ml Beladungspuffer äquilibriert. Der filtrierte Zellextrakt wird mit 0,5 ml/min auf die Säule aufgegeben. Die Säule wird mit Beladungspuffer auf A₂₈₀-Basislinie gewaschen, wobei zu diesem Zeitpunkt die Sammlung der Fraktionen gestartet wird. Als nächstes wird die Säule mit einem zweiten Waschpuffer (50 mM Phosphat; 300 mM NaCl, 10% Glycerin, pH 6,0) gewaschen, wodurch unspezifisch gebundenes Protein entfernt wird. Nach neuerlichem Erreichen der A₂₈₀-Basislinie wird die Säule mit einem 0- bis 500-mM-Imidazolgradienten im zweiten Waschpuffer entwickelt. Es werden Einmilliliter-Fraktionen aufgefangen und mittels SDS-PAGE und Silberfärbung oder Western-Blotting mit Ni²⁺-NTA-konjugierter Alkalischer Phosphatase (Qiagen) analysiert. Das eluierte His₁₀-markierte PRO-Polypeptid enthaltende Fraktionen werden vereinigt und gegen Beladungspuffer dialysiert.
Alternativ dazu kann die Reinigung des IgG-markierten (oder Fc-markierten) PRO-Polypeptids unter Verwendung bekannter Chromatographietechniken, einschließlich beispielsweise Protein-A- oder Protein-G-Säulenchromatographie, durchgeführt werden.
In der EP-Anmeldung Nr. 99912321.9 wurden Polypeptide erfolgreich in Baculovirusinfizierten Sf9-Insektenzellen exprimiert. Obgleich die Expression tatsächlich in einem Maßstab von 0,5–2 l durchgeführt wurde, kann sie leicht im größeren Maßstab (z.B. 8 l) durchgeführt werden. Die Proteine wurden als ein IgG-Konstrukt (Immunoadhäsin) exprimiert, in dem die extrazelluläre Proteinregion an eine Sequenz der konstanten IgG1-Region fusioniert war, welche die Gelenks-, CH2- und CH3-Domänen enthielten, und/oder als poly-His-markierte Formen.
Zur Expression in Baculovirus-infizierten Sf9-Zellen im Anschluss an die PCR-Amplifikation wurden die entsprechenden kodierenden Sequenzen in einen Baculovirus-Expressionsvektor (pb.PH.IgG für IgG-Fusionen und pb.PH.His.c für poly-His-markierte Proteine) subkloniert, und der Vektor und Baculogold^TM-Baculovirus-DNA (Pharmingen) wurden in 105 Spodoptera-frugiperda- („Sf9"-) Zellen (ATCC CRL 1711) unter Verwendung von Lipofectin (Gibco BRL) cotransfiziert. pb.PH.IgG und pb.PH.His sind Modifizierungen des im Handel erhältlichen Baculovirus-Expressionsvektors pVL1393 (Pharmingen), wobei modifizierte Polylinkerregionen die His- oder Fc-Markersequenzen enthalten. Die Zellen wurden in mit 10% FBS (Hyclone) ergänztem Hink-TNM-FH-Medium gezüchtet. Die Zellen wurden 5 Tage lang bei 28°C inkubiert. Der Überstand wurde geerntet und anschließend für die erste Virusamplifi kation durch Infizieren von Sf9-Zellen in mit 10% FBS ergänztem Hink-TNM-FH-Medium bei einer ungefähren Infektionsmultiplizität (MOI) von 10 verwendet. Die Zellen wurden 3 Tage lang bei 28°C inkubiert. Der Überstand wurde geerntet und die Expression der Konstrukte im Baculovirus-Expressionsvektor durch Chargenbindung von 1 ml Überstand an 25 ml Ni-NTA-Perlen (QIAGEN) für Histidin-markierte Proteine oder Protein-A-Sepharose-CL-4B-Perlen (Pharmacia) für IgG-markierte Proteine, gefolgt von SDS-PAGE-Analyse im Vergleich zu einer bekannten Konzentration von Proteinstandard mittels Coomassie-Blau-Färbung bestimmt.
Der Überstand der ersten Virusamplifikation wurde verwendet, um eine Spinner-Kultur (500 ml) von in ESF-921-Medium (Expression Systems LLC) gezüchteten Sf9-Zellen bei einer ungefähren MOI von 0,1 zu infizieren. Die Zellen wurden 3 Tage lang bei 28°C inkubiert. Der Überstand wurde geerntet und filtriert. Die Chargenbindung und SDS-PAGE-Analyse wurden wie erforderlich wiederholt, bis die Expression der Spinner-Kultur bestätigt war.
Das konditionierte Medium aus den transfizierten Zellen (0,5 bis 3 l) wurde mittels Zentrifugation geerntet, um die Zellen zu entfernen, und durch 0,22-μm-Filter filtriert. Für die poly-His-markierten Konstrukte wurde das Proteinkonstrukt unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule (Qiagen) gereinigt. Vor der Reinigung wurde dem konditionierten Medium Imidazol auf eine Konzentration von 5 mM zugegeben. Das konditionierte Medium wurde bei einer Flussrate von 4–5 ml/min bei 4°C auf eine 6-ml-Ni-NTA-Säule gepumpt, die in 20 mM Hepes-Puffer, pH 7,4, äquilibriert war, der 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol enthielt. Nach der Beladung wurde die Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen und das Protein mit 0,25 M Imidazol enthaltendem Äquilibrierungspuffer eluiert. Das hochgereinigte Protein wurde anschließend mit einer 25-ml-G25-Superfine-Säule (Pharmacia) in Aufbewahrungspuffer entsalzt, der 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4% Mannit, pH 6,8, enthielt, und bei –80°C gelagert.
Immunoadhäsin- (Fc enthaltende) Konstrukte von Proteinen wurden aus dem konditionierten Medium wie folgt gereinigt. Das konditionierte Medium wurde auf eine 5- ml-Protein-A-Säule (Pharmacia) gepumpt, die in 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH 6,8, äquilibriert worden war. Nach der Beladung wurde die Säule ausgiebig mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, bevor sie mit 100 mM Zitronensäure, pH 3,5, eluiert wurde. Das eluierte Protein wurde sofort neutralisiert, indem 1-ml-Fraktionen in Röhrchen aufgefangen wurden, die 275 ml 1 M Tris-Puffer, pH 9, enthielten. Das hochgereinigte Protein wurde anschließend wie oben für die poly-His-markierten Proteine beschrieben in Aufbewahrungspuffer entsalzt. Die Homogenität der Proteine wurde mittels SDS-Polyacrylamid- (PEG-) Elektrophorese und N-terminale Aminosäuresequenzierung mittels Edman-Abbau verifiziert.
PRO181 wurde erfolgreich in Baculovirus-infizierten Hi5-Insektenzellen exprimiert. Obgleich die Expression tatsächlich in einem Maßstab von 0,5–2 l durchgeführt wurde, kann sie leicht in einem größeren Maßstab (z.B. 8 l) durchgeführt werden.
Zur Expression in Baculovirus-infizierten Hi5-Insektenzellen kann die für das PRO-Polypeptid kodierende DNA mit geeigneten Systemen, wie z.B. Pfu (Stratagene), amplifiziert oder stromauf (5') eines im Baculovirus-Expressionsvektor enthaltenen Epitopmarkers fusioniert werden. Derartige Epitopmarker umfassen poly-his-Marker und Immunglobulin-Marker (wie z.B. Fc-Regionen von IgG). Es kann eine Vielzahl von Plasmiden eingesetzt werden, einschließlich Plasmide, die sich von im Handel erhältlichen Plasmiden, wie z.B. pVL1393 (Novagen), herleiten. Zusammenfassend wird das PRO-Polypeptid oder der gewünschte Abschnitt des PRO-Polypeptids (wie z.B. die für die extrazelluläre Domäne eines Transmembranproteins kodierende Sequenz) mittels PCR mit Primern amplifiziert, die zu den 5'- und 3'-Regionen komplementär sind. Der 5'-Primer kann flankierende (gewählte) Restriktionsenzymstellen enthalten. Das Produkt wird dann mit diesen gewählten Restriktionsenzymen verdaut und in den Expressionsvektor subkloniert. Beispielsweise können Abkömmlinge von pVL1393 die Fc-Region von menschlichem IgG (pb.PH.IgG) oder einen 8-Histidin-(pB.PH.His) Marker stromab (3') der NAME-Sequenz umfassen. Vorzugsweise wird das Vektorkonstrukt zur Bestätigung sequenziert.
Hi5-Zellen werden auf eine Konfluenz von 50% unter den Bedingungen von 27°C, kein CO₂, NO pen/strep gezüchtet. Für jede 150-mm-Platte werden 30 μg des plE-basierten, das PRO-Polypeptid enthaltenden Vektors mit 1 ml Ex-Cell-Medium vermischt (Medium: Ex-Cell 401 + 1/100 L-Glu JRH Biosciences Nr. 14401-78P (Anmerkung: dieses Medium ist lichtempfindlich)), und in einem gesonderten Röhrchen werden 100 μl CellFectin (CellFECTIN (GibcoBRL Nr. 10362-010) (zur Durchmischung gevortext)) mit 1 ml Ex-Cell-Medium gemischt. Die beiden Lösungen werden vereinigt und bei Raumtemperatur 15 Minuten lang inkubiert. 8 ml Ex-Cell-Medium werden zu den 2 ml des DNA/CellFECTIN-Gemisches zugegeben, und dieses Gemisch wird auf Hi5-Zellen überschichtet, die einmal mit Ex-Cell-Medium gewaschen worden waren. Die Platte wird dann im Dunkeln 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das DNA/CellFECTIN-Gemisch wird dann abgesaugt und die Zellen einmal mit Ex-Cell gewaschen, um überschüssiges CellFECTIN zu entfernen. 30 ml frisches Ex-Cell-Medium werden den Zellen zugegeben und die Zellen 3 Tage lang bei 28°C inkubiert. Der Überstand wird geerntet, und die Expression des PRO-Polypeptids im Baculovirus-Expressionsvektor kann durch Chargenbindung von 1 ml Überstand an 25 ml Ni-NTA-Perlen (QIAGEN) für his-markierte Proteine oder Protein-A-Sepharose-CL-4B-Perlen (Pharmacia) für IgG-markierte Proteine, gefolgt von SDS-PAGE-Analyse im Vergleich zu einer bekannten Konzentration von Proteinstandard mittels Coomassie-Blau-Färbung bestimmt werden.
Das konditionierte Medium aus den transfizierten Zellen (0,5 bis 3 l) wird mittels Zentrifugation zur Entfernung der Zellen geerntet und durch 0,22-μm-Filter filtriert. Für die poly-his-markierten Konstrukte wird das das PRO-Polypeptid umfassende Protein unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule (Qiagen) gereinigt. Vor der Reinigung wird dem konditionierten Medium Imidazol auf eine Konzentration von 5 mM zugegeben. Das konditionierte Medium wird bei einer Flussrate von 4–5 ml/min bei 4°C auf eine 6-ml-Ni-NTA-Säule gepumpt, die in 20 mM Hepes-Puffer, pH 7,4, äquilibriert war, der 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol enthielt. Nach der Beladung wurde die Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen und das Protein mit 0,25 M Imidazol enthaltendem Äquilibrierungspuffer eluiert. Das hochgereinigte Protein wird anschließend mit einer 25-ml-G25-Superfine-Säule (Pharmacia) in Aufbewahrungspuf fer entsalzt, der 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4% Mannit, pH 6,8, enthielt, und bei –80°C gelagert.
Immunoadhäsin- (Fc enthaltende) Konstrukte von Proteinen werden aus dem konditionierten Medium wie folgt gereinigt. Das konditionierte Medium wird auf eine 5-ml-Protein-A-Säule (Pharmacia) gepumpt, die in 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH 6,8, äquilibriert worden war. Nach der Beladung wird die Säule ausgiebig mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, bevor sie mit 100 mM Zitronensäure, pH 3,5, eluiert wird. Das eluierte Protein wird sofort neutralisiert, indem 1-ml-Fraktionen in Röhrchen aufgefangen wurden, die 275 ml 1 M Tris-Puffer, pH 9, enthalten. Das hochgereinigte Protein wird anschließend wie oben für die poly-His-markierten Proteine beschrieben in Aufbewahrungspuffer entsalzt. Die Homogenität des PRO-Polypeptids kann mittels SDS-Polyacrylamidgelen und durch N-terminale Aminosäuresequenzierung mittels Edman-Abbau oder andere analytische Verfahren wie gewünscht und notwendig beurteilt werden.
Beispiel 9
Herstellung von Antikörpern die an PRO-Polypeptide binden
Dieses Beispiel illustriert die Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch an ein PRO-Polypeptid binden können.
Techniken zur Herstellung monoklonaler Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden beispielsweise in Goding, s.o., beschrieben. Immunogene, die eingesetzt werden können, umfassen gereinigtes PRO-Polypeptid, das PRO-Polypeptid enthaltende Fusionsproteine und Zellen, die rekombinantes PRO-Polypeptid an der Zelloberfläche exprimieren. Die Auswahl des Immunogens kann vom Fachmann ohne übermäßiges Experimentieren getroffen werden.
Mäuse, wie z.B. Balb/c, werden mit dem in komplettem Freundschen Adjuvans emulgierten und subkutan oder intraperitoneal in einer Menge von 1–100 Mikrogramm inji zierten PRO-Polypeptid-Immunogen immunisiert. Alternativ dazu wird das Immunogen in MPL-TDM-Adjuvans (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) emulgiert und in die Hinterpfoten des Tiers injiziert. Die immunisierten Mäuse werden dann 10 bis 12 Tage später mit zusätzlichem, im gewählten Adjuvans emulgiertem Immunogen geboostet. Danach können die Mäuse außerdem für mehrere Wochen mit zusätzlichen Immunisierungsinjektionen geboostet werden. Serumproben können aus den Mäusen regelmäßig durch retro-orbitale Blutabnahme für das Testen in ELISA-Tests zum Nachweis von Anti-PRO-Polypeptid-Antikörpern entnommen werden.
Nachdem ein geeigneter Antikörpertiter nachgewiesen worden ist, können die für Antikörper „positiven" Tiere mit einer letzten intravenösen Injektion von PRO-Polypeptid injiziert werden. Drei bis vier Tage später werden die Mäuse getötet und die Milzzellen gewonnen. Die Milzzellen werden dann an eine gewählte murine Myelom-Zelllinie, wie z.B. P3X63AgU.1, die von ATCC (Nr. CRL 1597) erhältlich ist, fusioniert (unter Verwendung von 35% Polyethylenglykol). Die Fusionen erzeugen Hybridomzellen, die dann in 96-Napf-Gewebekulturplatten ausplattiert werden können, die HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) enthalten, um die Vermehrung von nicht fusionierten Zellen, Myelom-Hybriden und Milzzellen-Hybriden zu hemmen.
Die Hybridomzellen werden in einem ELISA-Test auf Reaktivität gegen das PRO-Polypeptid gescreent. Die Ermittlung „positiver" Hybridomzellen, welche die gewünschten monoklonalen Antikörper gegen das PRO-Polypeptid sekretieren, ist auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
Die positiven Hybridomzellen können intraperitoneal in syngenetische Balb/c-Mäuse injiziert werden, um Aszites zu produzieren, welche die monoklonalen Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper enthalten. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in Gewebekulturflaschen oder Rollerflaschen gezüchtet werden. Die Reinigung der in den Aszites produzierten monoklonalen Antikörper kann unter Verwendung von Ammonsulfatpräzipitation, gefolgt von Gelausschlusschromatographie erzielt werden. Alter nativ dazu kann Affinitätschromatographie auf Basis der Bindung von Antikörper an Protein A oder Protein G eingesetzt werden.
Beispiel 10
Chimäre PRO-Polypeptide
PRO-Polypeptide können als chimäre Proteine mit einer oder mehreren zusätzlichen, angefügten Polypeptiddomänen exprimiert werden, um die Proteinreinigung zu erleichtern. Derartige die Reinigung erleichternde Domänen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, metallchelatierende Peptide, wie z.B. Histidin-Tryptophan-Module, die eine Reinigung an immobilisierte Metalle ermöglichen, Protein-A-Domänen, die eine Reinigung an immobilisiertem Immunglobulin ermöglichen, und die im FLAGS^TM-Extension/Affinitätsreinigungssystem (Immunex Corp., Seattle, WA) eingesetzte Domäne. Die Aufnahme einer spaltbaren Linkersequenz, wie z.B. Faktor XA oder Enterokinase (Invitrogen, San Diego, CA), zwischen der Reinigungsdomäne und der PRO-Polypeptidsequenz kann zweckdienlich sein, um die Expression von für das PRO-Polypeptid kodierender DNA zu erleichtern.
Beispiel 11
Reinigung von PRO-Polypeptiden unter Verwendung spezifischer Antikörper
Native oder rekombinante PRO-Polypeptide können durch eine Vielzahl von Standardtechniken auf dem Gebiet der Proteinreinigung gereinigt werden. Beispielsweise wird Pro-PRO-Polypeptid, reifes PRO-Polypeptid oder Prä-PRO-Polypeptid mittels Immunoaffinitätschromatographie unter Verwendung von für das PRO-Polypeptid von Interesse spezifischen Antikörpern gereinigt. Im Allgemeinen wird eine Immunoaffinitätssäule konstruiert, indem der Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper kovalent an ein aktiviertes Chromatographieharz gebunden wird.
Polyklonale Immunglobuline werden aus Immunseren entweder durch Präzipitation mit Ammonsulfat oder durch Reinigung an immobilisiertem Protein A (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) hergestellt. Desgleichen werden monoklonale Antikörper aus Maus-Aszitesflüssigkeit durch Ammonsulfatpräzipitation oder Chromatographie an immobilisiertem Protein A hergestellt. Teilweise gereinigtes Immunglobulin wird kovalent an ein Chromatographieharz, wie z.B. CnBr-aktivierte SEPHAROSE^TM (Pharmacia LKB Biotechnology), gebunden. Der Antikörper wird an das Harz gekoppelt, das Harz wird blockiert und das derivatisierte Harz nach den Anleitungen des Herstellers gewaschen.
Eine derartige Immunoaffinitätssäule wird bei der Reinigung eines PRO-Polypeptids eingesetzt, indem eine Fraktion aus Zellen hergestellt wird, die PRO-Polypeptid in löslicher Form enthält. Dieses Präparat wird erlangt, indem die ganze Zelle oder eine subzelluläre Fraktion solubilisiert wird, die über Differentialzentrifugation durch Zugabe von Tensid erlangt wurde oder durch andere, auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren erlangt wurde. Alternativ dazu kann lösliches PRO-Polypeptid, das eine Signalsequenz enthält, in brauchbarer Menge in das Medium sekretiert werden, in dem die Zellen gezüchtet werden.
Ein Präparat, das lösliches PRO-Polypeptid enthält, wird über die Immunoaffinitätssäule geschickt und die Säule unter Bedingungen gewaschen, die eine bevorzugte Absorption des PRO-Polypeptids ermöglichen (z.B. Puffer hoher Ionenstärke in Gegenwart von Tensid). Danach wird die Säule unter Bedingungen eluiert, welche die Antikörper/PRO-Polypeptid-Bindung zerstören (z.B. ein Puffer mit niedrigem pH-Wert, wie z.B. ungefähr pH 2–3, oder eine hohe Konzentration eines Chaotrops, wie z.B. Harnstoff oder Thiocyanat-Ion), und das PRO-Polypeptid wird aufgefangen.
Beispiel 12
Medikamenten-Screening
Diese Erfindung ist insbesondere für das Screenen von Verbindungen durch Verwendung von PRO-Polypeptiden oder Bindungsfragmenten davon in beliebigen einer Vielzahl von Medikament-Screeningtechniken zweckdienlich. Das in einem derartigen Test eingesetzte PRO-Polypeptid oder Fragment kann entweder frei in Lösung, an einen festen Träger fixiert, an einer Zelloberfläche oder intrazellulär vorliegen. Eines der Verfahren des Medikamenten-Screenings setzt eukaryotische oder prokaryotische Wirtszellen ein, die stabil mit rekombinanten Nucleinsäuren transformiert sind, die das PRO-Polypeptid oder Fragment exprimieren. Medikamente werden gegen solche transformierten Zellen in kompetitiven Bindungstests gescreent. Solche Zellen können entweder in lebensfähiger oder fixierter Form für Standardbindungstests verwendet werden. Man kann beispielsweise die Bildung von Komplexen zwischen PRO-Polypeptid oder einem Fragment und dem getesteten Mittel messen. Alternativ dazu kann man die Verminderung der Komplexbildung zwischen dem PRO-Polypeptid und seiner Zielzelle oder seinen Zielrezeptoren untersuchen, die vom getesteten Mittel verursacht wird.
Folglich stellt die vorliegenden Erfindung Screeningverfahren für Medikamente oder jegliche andere Mittel bereit, die eine PRO-Polypeptid-assoziierte Krankheit oder Störung beeinflussen. Diese Verfahren umfassen das Kontaktieren eines derartigen Mittels mit einem PRO-Polypeptid oder einem Fragment davon und das Testen (i) auf das Vorliegen eines Komplexes zwischen dem Mittel und dem PRO-Polypeptid oder Fragment oder (ii) auf das Vorliegen eines Komplexes zwischen dem PRO-Polypeptid oder Fragment und der Zelle, und zwar mittels Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind. In derartigen kompetitiven Bindungstests ist das PRO-Polypeptid oder Fragment typischerweise markiert. Nach geeigneter Inkubation wird freies PRO-Polypeptid oder Fragment vom in gebundener Form vorliegenden abgetrennt, und die Menge an freiem oder gebundenem Marker ist ein Maß für die Fähigkeit des jeweiligen Mittels, an PRO-Polypeptid zu binden oder den PRO-Polypeptid/Zell-Komplex zu stören.
Eine weitere Technik zum Medikamenten-Screening stellt ein High-throughput-Screening für Verbindungen bereit, die eine geeignete Bindungsaffinität für ein Polypeptid aufweisen, und wird ausführlich in der am 13. September 1984 veröffentlichten WO 84/03564 beschrieben. Zusammenfassend dargelegt wird eine große Anzahl verschiedener kleiner Peptidtestverbindungen an einem festen Substrat, wie z.B. an Kunststoffnadeln oder irgendwelchen anderen Oberflächen, synthetisiert. Auf ein PRO-Polypeptid angewendet werden die Peptidtestverbindungen mit PRO-Polypeptid zur Reaktion gebracht und gewaschen. Gebundenes PRO-Polypeptid wird mit auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannten Verfahren nachgewiesen. Gereinigtes PRO-Polypeptid kann auch direkt auf Platten zur Verwendung in den oben genannten Medikamenten-Screeningtechniken beschichtet werden. Außerdem können nicht-neutralisierende Antikörper verwendet werden, um das Peptid einzufangen und es am festen Träger zu immobilisieren.
Diese Erfindung erwägt auch die Verwendung kompetitiver Medikamenten-Screeningtests, in denen neutralisierende Antikörper, die zur Bindung von PRO-Polypeptid fähig sind, spezifisch mit einer Testverbindung um die Bindung an PRO-Polypeptid oder Fragmente davon konkurrieren. Auf diese Weise können die Antikörper verwendet werden, um das Vorliegen jeglichen Peptids nachzuweisen, das eine oder mehrere antigene Determinanten mit dem PRO-Polypeptid gemeinsam hat.
Beispiel 13
Rationales Arzneimittel-Design
Das Ziel von rationalem Arzneimittel-Design ist es, Strukturanaloga biologisch aktiver Polypeptide von Interesse (d.h. eines PRO-Polypeptids) oder von kleinen Molekülen herzustellen, mit denen sie wechselwirken, z.B. Agonisten, Antagonisten oder Inhibi toren. Jedes dieser Beispiele kann verwendet werden, um Medikamente zu gestalten, die aktivere oder stabilere Formen des PRO-Polypeptids sind oder die die Funktion des PRO-Polypeptids in vivo steigern oder stören (vgl. Hodgson, Bio/Technology 9, 19–21 (1991)).
In einem der Ansätze wird die dreidimensionale Struktur des PRO-Polypeptids oder eines PRO-Polypeptid-Inhibitor-Komplexes mittels Röntgenkristallographie, mittels Computermodellierung oder am typischsten mittels einer Kombination beider Ansätze bestimmt. Die Form sowie die Ladungen des PRO-Polypeptids müssen ermittelt sein, um die Struktur aufzuklären und die aktive(n) Stelle(n) des Moleküls zu bestimmen. Seltener können brauchbare Informationen bezüglich der Struktur des PRO-Polypeptids durch Modellierung auf Basis der Struktur homologer Proteine erlangt werden. In beiden Fällen werden maßgebliche Strukturinformationen verwendet, um analoge PRO-Polypeptid-artige Moleküle zu konstruieren oder um effiziente Inhibitoren zu identifizieren. Brauchbare Beispiele des rationalen Arzneimittel-Designs können Moleküle umfassen, die eine verbesserte Aktivität oder Stabilität aufweisen, wie von Braxton und Wells, Biochemistry 31, 7796–7801 (1992), gezeigt wurde, oder die als Inhibitoren, Agonisten, Antagonisten nativer Peptide wirken, wie von Athauda et al., J. Biochem. 113, 742–746 (1993), gezeigt wurde.
Es ist außerdem möglich, einen für das Ziel spezifischen Antikörper zu isolieren, der wie oben beschrieben durch einen Funktionstest selektiert wurde, und dann seine Kristallstruktur aufzuklären. Dieser Ansatz liefert im Prinzip ein Pharmakor, auf dem eine nachfolgende Medikamentkonstruktion basieren kann. Es ist möglich, die Proteinkristallographie gänzlich zu umgehen, indem Anti-Idiotyp-Antikörper (Anti-Ids) gegen einen funktionellen, pharmakologisch aktiven Antikörper erzeugt werden. Als Spiegelbild eines Spiegelbilds kann von der Bindungsstelle der Anti-Ids erwartet werden, dass sie ein Analogon des ursprünglichen Rezeptors ist. Der Anti-Id könnte dann verwendet werden, um Peptide aus Banken chemisch oder biologisch produzierter Peptide zu identifizieren und zu isolieren. Die isolierten Peptide würden dann als Pharmakor agieren.
Aufgrund der vorliegenden Erfindung können ausreichende Mengen des PRO-Polypeptids verfügbar gemacht werden, um derartige analytische Untersuchungen wie eine Röntgenkristallographie durchzuführen. Außerdem stellt die Kenntnis der hierin bereitgestellten PRO-Polypeptid-Aminosäuresequenz eine Orientierung für jene bereit, die Computermodellierungstechniken anstelle der oder zusätzlich zur Röntgenkristallographie einsetzen.
Beispiel 14
In-vitro-Antiproliferationstest
Die Antiproliferationsaktivität verschiedener PRO-Polypeptide wurde im investigativen, krankheitsorientierten In-vitro-Anti-Krebs-Arzneimittel-Entdeckungstest des National Cancer Institute (NCl) unter Verwendung eines Sulforhodamin-B-(SRB-) Farbbindungstests bestimmt, wie im Wesentlichen von Skehan et al., J. Natl. Cancer Inst. 82, 1107–1112 (1990), beschrieben. Die in dieser Studie („dem NCl-Panel") verwendeten 60 Tumorzelllinien sowie die Bedingungen zu ihrer Erhaltung und Kultivierung in vitro wurden von Monks et al., J. Natl. Cancer Inst. 83, 757–766 (1991), beschrieben. Ziel dieses Screenings ist es, anfänglich die cytotoxische und/oder cytostatische Aktivität der Testverbindungen gegen verschiedene Arten von Tumoren zu evaluieren (Monks et al., s.o., Boyd, Cancer: Princ. Pract. Oncol. Update 3 (10), 1–12 [1989]).
Zellen von etwa 60 menschlichen Tumorzelllinien wurden mit Trypsin/EDTA (Gibco) geerntet, einmal gewaschen, in IMEM resuspendiert, und ihre Lebensfähigkeit wurde bestimmt. Die Zellsuspensionen wurden mit einer Pipette (100 μl Volumen) in getrennte 96-Well-Mikrotiterplatten hinzugefügt. Die Zelldichte für die 6-Tage-Inkubation lag unter der der 2-Tage-Inkubation, um übermäßiges Wachstum zu verhindern. Es wurde den Inokulaten eine Präinkubationszeit von 24 Stunden bei 37°C zur Stabilisierung gegeben. Verdünnungen mit der doppelten beabsichtigten Testkonzentration wurden zum Zeitpunkt 0 in 100-μl-Aliquoten in die Mikrotiterplatten-Wells (1:2- Verdünnung) hinzugefügt. Die Testverbindungen wurden in fünf Halb-Log-Verdünnungen (1000 bis 100.000fach) evaluiert. Die Inkubationen fanden über zwei Tage und sechs Tage hinweg in einer 5-%-CO₂-Atmosphäre und bei 100% Feuchtigkeit statt.
Nach der Inkubation wurde das Medium entfernt, und die Zellen wurden in 0,1 ml 10-%-Trichloressigsäure bei 40°C fixiert. Die Platten wurden fünf Mal mit entionisiertem Wasser gespült, getrocknet, 30 Minuten lang mit 0,1 ml in 1% Essigsäure gelöstem 0,4-%-Sulforhodamin-B-Farbstoff (Sigma) gefärbt, vier Mal mit 1% Essigsäure gespült, um ungebundenen Farbstoff zu entfernen, getrocknet, und die Färbung wurde 5 Minuten lang mit 0,1 ml 10-mM-Tris-Base [Tris(hydroxymethyl)aminomethan], pH 10,5, extrahiert. Die Extinktion (OD) von Sulforhodamin-B bei 492 nm wurde mittels eines mit einer Computerschnittstelle ausgestatteten 96-Well-Mikrotiterplattenlesers gemessen.
Eine Testprobe wird als positiv angesehen, wenn sie zumindest 50% wachstumshemmende Wirkung bei einer oder mehreren Konzentrationen aufweist. Das folgende PRO-Polypeptid ergab positive Resultate in zumindest einer Tumorzelllinie: PRO181.
Beispiel 15
In-situ-Hybridisierung
Die In-situ-Hybridisierung ist eine leistungsfähige und vielseitige Technik zur Detektion und Lokalisierung von Nucleinsäuresequenzen in Zell- oder Gewebepräparaten. Sie kann beispielsweise zweckdienlich sein, um Orte der Genexpression zu identifizieren, die Gewebeverteilung der Transkription zu analysieren, Virusinfektion festzustellen und zu lokalisieren, Veränderungen der spezifischen mRNA-Synthese zu verfolgen und die Chromosomenkartierung zu unterstützen.
Die In-situ-Hybridisierung wurde nach einer optimierten Version des Protokolls von Lu und Gillet, Cell Vision 1, 169–176 (1994), unter Verwendung von PCR-erzeugten, ³³P-markierten Ribosonden durchgeführt. Zusammenfassend wurden in Formalin fixierte, in Paraffin eingebettete menschliche Gewebe geschnitten, von Paraffin befreit, in Proteinase K (20 g/ml) 15 Minuten lang bei 37°C von Protein befreit und für die Insitu-Hybridisierung wie von Lu und Gillet, s.o., beschrieben weiterverarbeitet. Eine [³³P]UTP-markierte Antisense-Ribosonde wurde aus einem PCR-Produkt erzeugt und bei 55°C über Nacht hybridisiert. Die Objektträger wurden in Kodak NTB2-Nuclear-track-Emulsion eingetaucht und 4 Wochen lang exponiert.
Synthese der ³³P-Ribosonde
6,0 μl (125 mCi) ³³P-UTP (Amersham BF 1002, SA<2.000 Ci/mmol) wurden mittels Speed-Vac getrocknet. Zu jedem getrocknetes ³³P-UTP enthaltenden Röhrchen wurden die folgenden Bestandteile zugegeben:
2,0 μl 5 × Transkriptionspuffer
1,0 μl DTT (100 mM)
2,0 μl NTP-Gemisch (2,5 mM; je 10 mM GTP, CTP & ATP + 10 μl H₂O)
1,0 μl UTP (50 μM)
1,0 μl Rnasin
1,0 μl DNA-Templat (1 μg)
1,0 μl H₂O
1,0 μl RNA-Polymerase (für PCR-Produkte T3 = AS, T7 = S, üblicherweise)
Die Röhrchen wurden bei 37°C eine Stunde lang inkubiert. 1,0 μl RQ1-DNase wurde zugegeben, gefolgt von Inkubation bei 37°C für 15 Minuten. Es wurden 90 μl TE (10 mM Tris pH 7,6/1 mM EDTA pH 8,0) zugegeben und das Gemisch auf DE81-Papier pipettiert. Die verbleibende Lösung wurde in eine Microcon-50-Ultrafiltrationseinheit gegeben und unter Verwendung von Programm 10 zentrifugiert (6 Minuten). Die Filtrationseinheit wurde über ein zweites Röhrchen invertiert und unter Verwendung von Programm 2 zentrifugiert (3 Minuten). Nach einer letzten Zentrifugation zur Ge winnung wurden 100 μl TE zugegeben. 1 μl des Endprodukts wurde auf DE81-Papier pipettiert und in 6 ml Biofluor II gezählt.
Die Sonde wurde an einem TBE/Harnstoff-Gel laufen gelassen. 1–3 μl der Sonde oder 5 μl RNA Mrk III wurden zu 3 μl Beladungspuffer zugegeben. Nach Erhitzen auf einem Heizblock bei 95°C für 3 Minuten wurde das Gel sofort auf Eis gegeben. Die Näpfe des Gels wurden gespült, die Probe aufgegeben und bei 180–250 V 45 Minuten lang laufen gelassen. Das Gel wurde in Saranfolie eingewickelt und einem XAR-Film mit einem Bildverstärkerschirm in einem Gefrierschrank bei –70°C für eine Stunde bis über Nacht exponiert.
³³P-Hybridisierung
A. Vorbehandlung von Gefrierschnitten
Die Objektträger wurden dem Gefrierschrank entnommen, auf Aluminiumschalen gegeben und bei Raumtemperatur 5 Minuten lang aufgetaut. Die Schalen wurden fünf Minuten lang bei 55°C in einen Inkubator gestellt, um die Kondensation zu vermindern. Die Objektträger wurden 10 Minuten lang in 4% Paraformaldehyd auf Eis in einem Abzug fixiert und in 0,5 × SSC 5 Minuten lang bei Raumtemperatur gewaschen (25 ml 20 × SSC + 975 ml SQ-H₂O). Nach der Proteinentfernung in 0,5 μg/ml Proteinase K für 10 Minuten bei 37°C (12,5 μl einer 10 mg/ml Stammlösung in 250 ml vorgewärmtem, RNase-freiem RNAse-Puffer) wurden die Schnitte in 0,5 × SSC 10 Minuten lang bei Raumtemperatur gewaschen. Die Schnitte wurden in 70%, 95%, 100% Ethanol für je 2 Minuten entwässert.
B. Vorbehandlung von in Paraffin eingebetteten Schnitten
Die Objektträger wurden vom Paraffin befreit, in SQ-H₂O gegeben und zweimal in 2 × SSC bei Raumtemperatur jeweils 5 Minuten lang gespült. Die Schnitte wurden von Protein befreit, und zwar in 20 μg/ml Proteinase K (500 μl von 10 mg/ml in 250 ml RNase-freiem RNase-Puffer; 37°C, 15 Minuten) – menschlicher Embryo, oder 8 × Proteinase K (100 μl in 250 ml RNase-Puffer, 37°C, 30 Minuten) – Formalingewebe. Die anschließende Spülung in 0,5 × SSC und Entwässerung wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
C. Vorhybridisierung
Die Objektträger wurden in einer mit Box-Puffer- (4 × SSC, 50% Formamid) gesättigtem Filterpapier ausgekleideten Kunststoffbox ausgelegt. Das Gewebe wurde mit 50 μl Hybridisierungspuffer (3,75 g Dextransulfat + 6 ml SQ-H₂O) bedeckt, gevortext und in der Mikrowelle 2 Minuten lang mit gelockertem Deckel erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Eis wurden 18,75 ml Formamid, 3,75 ml 20 × SSC und 9 ml SQ-H₂O zugegeben, das Gewebe gut gevortext und bei 42°C 1–4 Stunden lang inkubiert.
D. Hybridisierung
1,0 × 106 cpm Sonde und 1,0 μl tRNA (50 mg/ml Stammlösung) je Objektträger wurden für 3 Minuten auf 95°C erhitzt. Die Objektträger wurden auf Eis gekühlt, und es wurden 48 μl Hybridisierungspuffer je Objektträger zugegeben. Nach dem Vortexen wurden 50 μl ³³P-Gemisch zu 50 μl der Vorhybridisierung auf dem Objektträger zugegeben. Die Objektträger wurden über Nacht bei 55°C inkubiert.
E. Waschungen
Das Waschen wurde für 2 × 10 Minuten mit 2 × SSC, EDTA bei Raumtemperatur (400 ml 20 × SSC + 16 ml 0,25 M EDTA, V_f = 4 l) durchgeführt, gefolgt von RNaseA-Behandlung bei 37°C für 30 Minuten (500 μl von 10 mg/ml in 250 ml Rnase-Puffer = 20 μg/ml). Die Objektträger wurden 2 × 10 Minuten mit 2 × SSC, EDTA bei Raumtemperatur gewaschen. Die Stringenz-Waschbedingungen waren die folgenden: 2 Stunden bei 55°C, 0,1 × SSC, EDTA (20 ml 20 × SSC + 16 ml EDTA, V_f = 4 l).
F. Oligonucleotide
Die In-situ-Analyse wurde an einer Vielzahl von in EP 99912321.9 offenbarten DNA-Sequenzen vorgenommen. Die für diese Analysen eingesetzten Oligonucleotide wurden von den in EP 99912321.9 offenbarten Nucleotidsequenzen hergeleitet und weisen im Allgemeinen eine Länge im Bereich von 40 bis 55 Nucleotiden auf.
Hinterlegung von Material
Die folgenden Materialien sind bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA, (ATCC) hinterlegt worden:
Diese Hinterlegung wurde unter den Bestimmungen des „Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and the Regulations thereunder" (Budapester Vertrag) vorgenommen. Dies garantiert die Erhaltung einer lebensfähigen Kultur der Hinterlegung für 30 Jahre vom Datum der Hinterlegung. Die Hinterlegung wird von ATCC unter den Bedingungen des Budapest-Übereinkommens zur Verfügung gestellt und unterliegt einer Vereinbarung zwischen Genentech Inc. und ATCC, was die ständige und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Kultur der Hinterlegung für die Öffentlichkeit bei Erteilung des einschlägigen US-Patents oder bei Offenlegung jeglicher US- oder ausländischen Patentanmeldung gewährleistet, was auch immer als erstes eintrifft, und die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft für jemanden vom US-Bevollmächtigten für Patente und Warenzeichen bestimmten gewährleistet, der dazu gemäß 35 USC §122 und gemäß den Regeln des Bevollmächtigten dafür (einschließlich 37 CFR § 1,14 mit besonderer Bezugnahme auf 886 OG 638) berechtigt ist.
Der Abtretungsempfänger der vorliegenden Anmeldung hat zugestimmt, dass die Materialien, falls eine Kultur der hinterlegten Materialien bei Kultivierung unter geeigneten Bedingungen abstirbt, verloren geht oder zerstört werden sollte, bei Benachrichtigung unverzüglich durch andere derselben ersetzt werden. Die Verfügbarkeit der hinterlegten Materialien ist nicht als Erlaubnis auszulegen, die Erfindung entgegen der unter der Amtsgewalt einer beliebigen Regierung gemäß ihrer Patentrechte gewährten Rechte praktisch umzusetzen.
Die vorangehende niedergeschriebene Patentschrift wird als ausreichend erachtet, einem Fachkundigen zu ermöglichen, die Erfindung in die Praxis umzusetzen. Die vorliegende Erfindung wird durch das hinterlegte Konstrukt in ihrem Umfang nicht eingeschränkt, da die hinterlegte Ausführungsform als einzelne Illustration gewisser Aspekte der Erfindung gedacht ist. Die Hinterlegung von Material hierin stellt kein Zugeständnis dar, dass die hierin enthaltende niedergeschriebene Beschreibung unzulänglich ist, um die praktische Umsetzung irgendeines Aspekts der Erfindung, einschließlich der besten Ausführungsart davon, zu ermöglichen, noch ist sie dahingehend auszulegen, dass sie den Schutzumfang der Ansprüche auf die speziellen II-lustrationen einschränkt, die sie verkörpert. In der Tat werden verschiedene Modifizierungen zusätzlich zu jenen, die hierin dargestellt und beschrieben sind, dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung aus der vorhergehenden Beschreibung offensichtlich und liegen im Schutzumfang der beigefügten Ansprüche. Sequenzprotokoll

Claims

Isoliertes Polypeptid zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren, worin das Polypeptid: (a) zumindest 80% Sequenzidentität mit der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) aufweist, worin die Sequenzidentität über die volle Länge der Aminosäuresequenz aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) bestimmt wird, (b) die Reste 1 oder 21 bis X der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) umfasst, worin X ein beliebiger Rest von 52 bis 61 ist oder X 144 ist, (c) eine extrazelluläre Domäne der Aminosäuresequenz aus 2 mit der Sequenz der Aminosäuren 32 ± 5 bis 56 ± 5 umfasst, (d) zumindest 80% Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz aufweist, für die die Volllängenkodiersequenz des Nucleinsäureinserts des unter der Zugriffsnummer ATCC 209775 hinterlegten Vektors kodiert, worin die Sequenzidentität über die volle Länge der kodierten Aminosäuresequenz bestimmt wird, oder (e) aus der Aminosäuresequenz besteht, für die die Volllängenkodiersequenz des Nucleinsäureinserts des unter der Zugriffsnummer ATCC 209775 hinterlegten Vektors kodiert.
Polypeptid nach Anspruch 1 zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren, worin sich der Identitätsgrad auf zumindest 90% beläuft.
Polypeptid nach Anspruch 2 zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren, worin sich der Identitätsgrad auf zumindest 95% beläuft.
Polypeptid nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren, worin die Behandlung jene von Tumoren ist.
Verwendung eines Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumoren.