DE60035693T2

DE60035693T2 - Zusammensetzung und verfahren zur behandlung von immunverwandten krankheiten

Info

Publication number: DE60035693T2
Application number: DE60035693T
Authority: DE
Inventors: Avi J. San Mateo Ashkenazi; Kevin P. Darnestown Baker; Sherman Alameda FONG; Audrey San Francisco Goddard; Paul J. Burlingame Godowski; Austin L. Belmont Gurney; Kenneth J. San Francisco Hillan; Melanie R. Burlingame MARK; Scot A. San Carlos Marsters; Robert M. El Cerrito Pitti; Daniel Orinda TUMAS; Colin K. Moraga Watanabe; William I. Hillsborough Wood
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1999-07-20
Filing date: 2000-03-15
Publication date: 2008-05-15
Anticipated expiration: 2020-03-16
Also published as: EP1198568B1; JP2003189880A; CA2375458A1; ES2291198T3; WO2001005972A1; JP2003505350A; JP2003180381A; EP1198568A1; AU4011300A; DE60035693D1; ATE368110T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren für die Diagnose und Behandlung von Immunerkrankungen.
Hintergrund der Erfindung
Immun- und Entzündungserkrankungen sind die Manifestation oder Konsequenz von relativ komplexen, häufig zahlreichen miteinander verbundenen biologischen Stoffwechselwegen, die bei normaler Physiologie entscheidend für die Reaktion auf einen Insult oder eine Verletzung, die Initiation der Reparatur des Insults oder der Verletzung und die Auslösung angeborener und erworbener Abwehr gegen fremde Organismen ist. Eine Erkrankung oder pathologischer Zustand tritt auf, wenn diese normalen physiologischen Stoffwechselwege einen zusätzlichen Insultus oder eine zusätzliche Verletzung auslösen, entweder in direktem Zusammenhang mit der Intensität der Reaktion, als Konsequenz abnormer Regulation oder übermäßiger Stimulation, als Reaktion auf einen selbst oder eine Kombination daraus.
Obwohl an der Entstehung dieser Erkrankungen häufig Mehrschritt-Stoffwechselwege und häufig auch mehrere unterschiedliche biologische Systeme/Stoffwechselwege beteiligt sind, kann eine Intervention an entscheidenden Punkten in einem oder mehreren dieser Stoffwechselwege lindernde oder therapeutische Wirkung haben. Eine therapeutische Intervention kann entweder durch Antagonismus eines schädlichen Prozesses/Stoffwechselwegs oder durch Stimulation eines vorteilhaften Prozesses/Stoffwechselwegs erfolgen.
Viele Immunerkrankungen sind bekannt und wurden eingehend untersucht. Solche Erkrankungen umfassen immunvermittelte Entzündungserkrankungen, nichtimmunvermittelte Entzündungserkrankungen, Infektionserkrankungen, Immundefizienzerkrankungen, Neoplasie usw.
T-Lymphozyten (T-Zellen) sind ein wichtiger Bestandteil der Immunantwort eines Säugetiers. T-Zellen erkennen Antigene, die mit einem eigenen Molekül assoziiert sind, für das Gene im Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) kodieren. Das Antigen kann zusammen mit MHC-Molekülen auf der Oberfläche von antigenpräsentierenden Zellen, virusinfizierten Zellen, Krebszellen, Transplantaten usw. präsentiert werden. Das T-Zell-System eliminiert diese veränderten Zellen, die eine Bedrohung für die Gesundheit des Wirt-Säugetiers darstellen. Zu den T-Zellen gehören Helfer-T-Zellen und zytotoxische T-Zellen. Helfer-T-Zellen proliferieren stark nach der Erkennung eines Antigen-MHC-Komplexes auf einer antigenpräsentierenden Zelle. Helfer-T-Zellen sekretieren außerdem verschiedene Zytokine, d.h. Lymphokine, die eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung von B-Zellen, zytotoxischen T-Zellen und eine Reihe anderer Zellen, die an der Immunantwort beteiligt sind, spielen.
Ein entscheidender Vorgang bei sowohl humoralen als auch zellvermittelten Immunantworten ist die Aktivierung und klonale Expansion von Helfer-T-Zellen. Die Aktivierung von Helfer-T-Zellen wird durch die Wechselwirkung des T-Zell-Rezeptor-(TCR-)-CD3-Komplexes mit einem Antigen-MHC auf der Oberfläche einer antigenpräsentierenden Zelle initiiert. Diese Wechselwirkung löst eine Kaskade von biochemischen Vorgängen aus, welche die ruhende Helfer-T-Zelle dazu bringen, in einen Zellzyklus einzutreten (der G0-G1-Übergang), und resultiert in der Expression eines hochaffinen Rezeptors für IL-2 und manchmal IL-4. Die aktivierte T-Zelle schreitet im Zyklus fort und proliferiert und differenziert sich zu Gedächtniszellen oder Effektorzellen.
Neben den durch den TCR vermittelten Signalen umfasst die Aktivierung von T-Zellen eine weitere Costimulation, die durch Zytokine ausgelöst wird, welche durch die antigenpräsentierende Zelle oder durch Wechselwirkungen mit membrangebundenen Molekülen auf der antigenpräsentierenden Zelle und der T-Zelle freigesetzt werden. Es wurde nachgewiesen, dass die Zytokine IL-1 und IL-6 ein Costimulationssignal bereitstellen. Außerdem führt die Wechselwirkung zwischen dem B7-Molekül, das auf der Oberfläche einer antigenpräsentierenden Zelle exprimiert wird, und CD28- und CTLA-4-Molekülen, die auf der T-Zelloberfläche exprimiert werden, zu einer T-Zell-Aktivierung. Aktivierte T-Zellen exprimieren eine erhöhte Anzahl an Zelladhäsionsmolekülen, wie z.B. ICAM-1, Integrine, VLA-4, LFA-1, CD56 usw.
T-Zell-Proliferation in einer Lymphozyten-Mischkultur oder gemischten Lymphozytenreaktion (MLR) ist ein anerkannter Hinweis auf die Fähigkeit einer Verbindung, das Immunsystem zu stimulieren. Bei vielen Immunantworten dringen Entzündungszellen in die Verletzungs- oder Infektionsstelle ein. Die migrierenden Zellen können neutrophil, eosinophil, monozytisch oder lymphozytisch sein, wie durch eine histologische Untersuchung der betroffenen Gewebe bestimmt wird. Current Protocols in Immunology, Hrsg. John E. Coligan, John Wiley & Sons, Inc. (1994).
Immunerkrankungen können behandelt werden, indem die Immunantwort unterdrückt wird. Der Einsatz von neutralisierenden Antikörpern, die Moleküle mit immunstimulierender Aktivität hemmen, wäre vorteilhaft bei der Behandlung von Immun- und Entzündungserkrankungen. Moleküle, welche die Immunantwort hemmen, können eingesetzt werden (Proteine direkt oder über die Verwendung von Antikörper-Agonisten), um die Immunantwort zu hemmen und so die Immunerkrankung zu lindern.
Zusammenfassung der Erfindung
A. Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, betrifft Zusammensetzungen zur Behandlung von Immunerkrankungen bei Säugetieren, einschließlich Menschen, und damit in Zusammenhang stehende Verfahren, Materialien und Verwendungen. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Identifikation von Proteinen (einschließlich Agonisten- und Antagonistenantikörpern), die entweder die Immunantwort bei Säugetieren stimulieren oder hemmen, und betrifft ein spezielles dieser Proteine, PRO256. Immunerkrankungen können behandelt werden, indem die Immunantwort unterdrückt oder gesteigert wird. Molekül, welche die Immunantwort steigern, stimulieren oder verstärken die Immunantwort auf ein Antigen. Moleküle, welche die Immunantwort stimulieren, können therapeutisch eingesetzt werden, wenn eine Steigerung der Immunantwort vor Vorteil ist. Solche stimulierenden Moleküle können auch gehemmt werden, wenn eine Suppression der Immunantwort vorteilhaft ist. Neutralisierende Antikörper sind Beispiele für Moleküle, welche Moleküle mit immunstimulierender Aktivität hemmen und die bei der Behandlung von Immun- und Entzündungserkrankungen förderlich wären. Moleküle, welche die Immunantwort hemmen, können auch eingesetzt werden (Proteine direkt oder über die Verwendung von Antikörper-Agonisten), um die Immunantwort zu hemmen und so die Immunerkrankung zu lindern.
Dementsprechend sind die Proteine der Erfindung, für welche die Gene der Erfindung kodieren, für die Diagnose und/oder Behandlung (einschließlich Prävention) von Immunerkrankungen von Nutzen. Antikörper, die an stimulierende Proteine binden, sind zweckdienlich zur Unterdrückung des Immunsystems und der Immunantwort. Antikörper, die an Hemmproteine binden, sind zur Stimulation des Immunsystems und der Immunantwort nützlich. Die Proteine und Antikörper der Erfindung sind außerdem für die Herstellung von Arzneimitteln und Medikamenten zur Behandlung von Immun- und Entzündungserkrankungen zweckdienlich.
In einer Ausführungsform, wie sie in den Ansprüchen definiert ist, betrifft die vorliegende Erfindung einen isolierten Antikörper, der an ein PRO256-Polypeptid bindet. In einem Aspekt hemmt oder neutralisiert der Antikörper die Aktivität eines PRO256-Polypeptids (ein Antagonistenantikörper). In einem weiteren Aspekt ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper, der vorzugsweise Reste einer nichtmenschlichen komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) und Reste einer menschlichen Gerüstregion (FR) aufweist. Der Antikörper kann markiert sein und kann auf einem festen Träger immobilisiert sein. In einem weiteren Aspekt ist der Antikörper ein Antikörperfragment, ein einkettiger Antikörper oder ein antiidiotypischer Antikörper.
In einer weiteren Ausführungsform, wie sie in den Ansprüchen definiert ist, betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung, die ein PRO256-Polypeptid oder einen Antagonisten-Antikörper, der das Polypeptid bindet, in einem Gemisch mit einem Träger oder Exzipienten enthält. In einem Aspekt enthält die Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge des Peptids oder Antikörpers. In einem weiteren Aspekt ist die Zusammensetzung, wenn die Zusammensetzung ein immunstimulierendes Molekül enthält, zweckdienlich zum: (a) Stimulieren oder Steigern einer Immunantwort in einem Säugetier, das dies benötigt; oder (b) Steigern der Proliferation von T-Lymphozyten in einem Säugetier, das dies benötigt, als Reaktion auf ein Antigen. In einem weiteren Aspekt ist die Zusammensetzung, wenn die Zusammensetzung ein immunhemmendes Molekül enthält, zweckdienlich zum: (a) Hemmen oder Reduzieren der Immunantwort in einem Säugetier, das dies benötigt; oder (b) Verringern der Proliferation von T-Lymphozyten in einem Säugetier, das dies benötigt, als Reaktion auf ein Antigen. In einem weiteren Aspekt enthält die Zusammensetzung einen weiteren Wirkbestandteil, der beispielsweise ein weiterer Antikörper oder ein zytotoxisches oder chemotherapeutisches Mittel sein kann. Vorzugsweise ist die Zusammensetzung steril.
In einer weiteren Ausführungsform, wie sie in den Ansprüchen definiert ist, betrifft die Erfindung die Verwendung der Polypeptide und Antikörper der Erfindung zur Herstellung einer Zusammensetzung oder eines Medikaments, das für die oben beschriebenen Anwendungen bestimmt ist.
Die Erfindung, wie sie in den Ansprüchen definiert ist, betrifft weiters Antagonisten eines PRO256-Polypeptids, die eine oder mehrere der Funktionen oder Aktivität des PRO256-Polypeptids hemmen.
In einer weiteren Ausführungsform, wie sie in den Ansprüchen definiert ist, betrifft die Erfindung isolierte Nucleinsäuremoleküle, die an das Komplement der Nucleinsäuremoleküle hybridisieren, die für die PRO256-Polypeptide kodieren. Die Nucleinsäure ist vorzugsweise DNA, und die Hybridisierung findet vorzugsweise unter stringenten Bedingungen statt. Solche Nucleinsäuremoleküle können als Antisense-Moleküle der hierin identifizierten amplifizierten Gene dienen, die wiederum bei der Modulation der jeweiligen amplifizierten Gene Anwendung finden, oder als Antisense-Primer in Amplifikationsreaktionen. Außerdem können solche Sequenzen als Teil eines Ribo zyms und/oder einer Tripelhelixsequenz eingesetzt werden, die wiederum bei der Regulierung der amplifizierten Gene verwendet werden können.
In einer weiteren Ausführungsform, wie sie in den Ansprüchen definiert ist, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose einer Immunerkrankung bei einem Säugetier, welches das Detektieren der Expressionsstärke eines Gens umfasst, das für ein PRO256-Polypeptid kodiert, und zwar (a) in einer Testprobe von Gewebezellen, die vom Säugetier erhalten wurden, und (b) in einer Kontrollprobe von bekannten normalen Gewebezellen desselben Zelltyps, worin ein höherer Expressionsgrad in der Testprobe die Gegenwart einer Immunerkrankung im Säugetier, von dem die Gewebezellen erhalten wurden, anzeigt.
In einer weiteren Ausführungsform, wie sie in den Ansprüchen definiert ist, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose einer Immunerkrankung in einem Säugetier, umfassend (a) das Kontaktieren eines Anti-PRO256-Antikörpers mit einer Testprobe von Gewebezellen, die vom Säugetier erhalten wurden, und (b) das Detektieren der Bildung eines Komplexes zwischen dem Antikörper und dem PRO256-Polypeptid in der Testprobe. Die Detektion kann qualitativ oder quantitativ erfolgen und kann vergleichend mit der Überwachung der Komplexbildung in einer Kontrollprobe von bekannten normalen Gewebezellen desselben Zelltyps durchgeführt werden. Eine größere Menge an gebildeten Komplexen in der Testprobe zeigt die Gegenwart eines Tumors im Säugetier an, aus dem die Gewebezellen für den Test entnommen wurden. Der Antikörper trägt vorzugsweise eine detektierbare Markierung. Die Komplexbildung kann beispielsweise durch Lichtmikroskopie, Durchflusszytometrie, Fluorimetrie oder andere auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren überwacht werden. Die Testprobe wird üblicherweise von einem Individuum entnommen, bei dem Verdacht auf einen Mangel oder eine Anomalie des Immunsystems besteht.
Eine weitere Ausführungsform, wie sie in den Ansprüchen definiert ist, ist ein Verfahren zur Identifikation einer Verbindung, die zur Hemmung der Expression und/oder Aktivität eines PRO256-Polypeptids in der Lage ist, indem eine Kandidatenverbin dung mit einem PRO256-Polypeptid kontaktiert wird, und zwar unter Bedingungen und ausreichend lange, damit diese beiden Komponenten Wechselwirken. In einem spezifischen Aspekt wird entweder die Kandidatenverbindung oder das PRO256-Polypeptid auf einem festen Träger immobilisiert. In einem weiteren Aspekt trägt die nichtimmobilisierte Komponente eine detektierbare Markierung.
In einer weiteren Ausführungsform, wie sie in den Ansprüchen definiert ist, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Stimulation der Proliferation von T-Lymphozyten, worin das Verfahren das Kontaktieren von T-Lymphozyten mit einem PRO256-Polypeptid in einer Menge umfasst, die ausreicht, um die Proliferation der T-Lymphozyten zu stimulieren.
B. Zusätzliche Ausführungsformen
In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die Erfindung Vektoren bereit, die DNA umfassen, die für eines der hierin beschriebenen Polypeptide kodiert. Wirtszellen, die einen solchen Vektor umfassen, werden auch bereitgestellt. Beispielsweise können die Wirtszellen CHO-Zellen, E. coli oder Hefe sein. Weiters wird ein Verfahren zur Herstellung eines der hierin beschriebenen Polypeptide bereitgestellt, und es umfasst das Kultivieren von Wirtszellen unter Bedingungen, die zur Expression des erwünschen Polypeptids geeignet sind, und die Gewinnung des erwünschten Polypeptids aus der Zellkultur.
In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die Erfindung chimäre Moleküle bereit, die beliebige der hierin beschriebenen Polypeptide, fusioniert an ein heterologes Polypeptid oder eine heterologe Aminosäuresequenz, umfassen. Beispiele für solche chimären Moleküle umfassen beliebige der hierin beschriebenen Polypeptide, die an eine Epitop-Tag-Sequenz oder eine Fc-Region eines Immunglobulins fusioniert sind.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die Erfindung einen Antikörper bereit, der spezifisch an ein be liebiges der oben oder nachstehend beschriebenen Polypeptide bindet. Gegebenenfalls ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper, humanisierter Antikörper, ein Antikörperfragment oder ein einkettiger Antikörper.
In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, nutzt die Erfindung Oligonucleotidsonden als Antisense-Sonden, worin diese Sonden von einer beliebigen der oben oder nachstehend beschrieben Nucleotidsequenzen abstammen können.
In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein PRO256-Polypeptid kodiert.
In einem Aspekt und in Abhängigkeit von den Anforderungen der Ansprüche umfasst das isolierte Nucleinsäuremolekül eine Nucleotidsequenz mit zumindest etwa 80 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 88 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98 % Nucleinsäuresequenzidentität und alternativ dazu zumindest etwa 99 % Sequenzidentität, mit (a) einem DNA-Molekül, das für ein PRO256-Polypeptid mit einer Volllängen-Amino säuresequenz wie hierin offenbart, mit einer Aminosäuresequenz, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, oder mit einer extrazellulären Domäne eines Transmembranproteins, mit oder ohne Signalpeptid, wie hierin offenbart, kodiert, oder (b) mit dem Komplement des DNA-Moleküls aus (a).
In anderen Aspekten und in Abhängigkeit von den Anforderungen der Ansprüche umfasst das isolierte Nucleinsäuremolekül eine Nucleotidsequenz mit zumindest etwa 80 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 88 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98 % Nucleinsäuresequenzidentität und alternativ dazu zumindest etwa 99 % Sequenzidentität, mit (a) einem DNA-Molekül, das die Kodiersequenz für eine PRO256-Polypeptid-cDNA voller Länge wie hierin offenbart, die Kodiersequenz eines PRO256-Polypeptids, dem das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, oder die Kodiersequenz einer extrazellulären Domäne eines Transmembran-PRO256-Polypeptids, mit oder ohne Signalpeptid, wie hierin offenbart, umfasst, oder (b) mit dem Komplement des DNA-Moleküls aus (a).
In einem weiteren Aspekt und in Abhängigkeit von den Anforderungen der Ansprüche betrifft die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das eine Nucleotidse quenz mit zumindest etwa 80 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86 %. Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 88 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98 % Nucleinsäuresequenzidentität und alternativ dazu zumindest etwa 99 % Nucleinsäuresequenzidentität, mit (a) einem DNA-Molekül, das für dasselbe reife Polypeptid kodiert, für das jede beliebige menschliche Protein-cDNA, hinterlegt bei der ATCC wie hierin offenbart, kodiert, oder (b) mit dem Komplement des DNA-Moleküls aus (a) umfasst.
In einem weiteren Aspekt, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein PRO256-Polypeptid kodiert, das entweder Transmembrandomänen-deletiert oder Transmembrandomänen-inaktiviert ist, oder das komplementär zu solcher einer kodierenden Nucleotidsequenz ist, worin die Transmembrandomäne(n) solch eines Polypeptids hierin offenbart sind. Deshalb sind auch lösliche extrazelluläre Domänen des hierin beschriebenen PRO256-Polypeptids vorgesehen.
Eine weitere Ausführungsform nutzt ein Fragment einer für ein PRO256-Polypeptid kodierenden Sequenz oder das Komplement davon, die als Antisense-Oligonucleotidsonden Anwendung finden können. Solche Nucleinsäurefragmente sind üblicher weise zumindest etwa 20 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 30 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 40 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 50 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 60 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 70 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 80 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 90 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 100 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 110 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 120 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 130 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 140 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 150 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 160 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 170 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 180 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 190 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 200 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 250 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 300 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 350 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 400 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 450 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 500 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 600 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 700 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 800 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 900 Nucleotide lang und alternativ dazu zumindest etwa 1000 Nucleotide lang, worin sich in diesem Zusammenhang die Bezeichnung „etwa" auf die genannte Nucleotidsequenzlänge plus oder minus 10 % dieser genannten Länge bezieht. Es gilt anzumerken, dass neue Fragmente einer für ein PRO256-Polypeptid kodierenden Nucleotidsequenz auf Routineweise bestimmt werden können, indem die für das PRO256-Polypeptid kodierende Nucleotidsequenz mit anderen bekannten Nucleotidsequenzen angeordnet wird, wobei eine Reihe von allgemein bekannten Sequenz-Anordnungsprogrammen eingesetzt werden kann, und bestimmt wird, welche(s) PRO256-Polypeptid-Kodiersequenz-Fragment(e) neu ist/sind. Alle solche für ein PRO256-Polypeptid kodierenden Nucleotidsequenzen sind hierin vorgesehen.
In einer weiteren Ausführungsform, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die Erfindung ein isoliertes PRO256-Polypeptid bereit, für das jede beliebige der hierin zuvor definierten isolierten Nucleinsäuresequenzen kodiert.
In einem bestimmten Aspekt, wie in den Ansprüchen definiert, betrifft die Erfindung ein isoliertes PRO256-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit zumindest etwa 97 % Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98 % Aminosäuresequenzidentität und alternativ dazu zumindest etwa 99 % Aminosäuresequenzidentität, mit einem PRO256-Polypeptid, das eine Volllängen-Aminosäuresequenz wie hierin offenbart, einer Aminosäuresequenz, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, einer extrazellulären Domäne eines Transmembranproteins, mit oder ihne Signalpeptid, wie hierin offenbart, aufweist.
In einem weiteren Aspekt und in Abhängigkeit von den Anforderungen der Ansprüche betrifft die Erfindung ein isoliertes PRO256-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit zumindest etwa 97 % Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98 % Aminosäuresequenzidentität und alternativ dazu zumindest etwa 99 % Aminosäuresequenzidentität, mit einer Aminosäuresequenz, für die jede beliebige der bei der ATCC hinterlegten menschlichen Protein-cDNAs wie hierin offenbart kodiert.
In einem weiteren Aspekt und in Abhängigkeit von den Anforderungen der Ansprüche betrifft die Erfindung ein isoliertes PRO256-Polypeptid, die verglichen mit einer Aminosäuresequenz eines PRO256-Polypeptids mit einer Volllängen-Aminosäuresequenz wie hierin offenbart, mit einer Aminosäuresequenz, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, oder mit einer extrazellulären Domäne eines Transmembranproteins, mit oder ohne Signalpeptid, wie hierin offenbart, eine Aminosäuresequenz mit einem Wert von zumindest etwa 97 % positiv, alternativ dazu zumindest etwa 98 % positiv und alternativ dazu zumindest etwa 99 % positiv, aufweist.
In einem spezifischen Aspekt, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die Erfindung ein isoliertes PRO256-Polypeptid ohne die N-terminale Signalsequenz und/oder das initiierende Methionin bereit, für das eine Nucleotidsequenz kodiert, die für eine Aminosäuresequenz wie hierin zuvor beschrieben kodiert. Verfahren zur Herstellung derselben werden hierin ebenfalls beschrieben, worin solche Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle, die einen Vektor umfasst, der das geeignete kodierende Nuc leinsäuremolekül umfasst, unter zur Expression des PRO256-Polypeptids geeigneten Bedingungen und das Gewinnen des PRO256-Polypeptids aus der Zellkultur umfassen.
In einem weiteren Aspekt, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die Erfindung ein isoliertes PRO256-Polypeptid bereit, das entweder Transmembrandomänen-deletiert oder Transmembrandomänen-inaktiviert ist. Verfahren zu deren Herstellung sind ebenfalls hierin beschrieben, worin diese Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle, die einen das geeignete kodierende Nucleinsäuremolekül aufweisenden Vektor umfasst, unter Bedingungen umfasst, die für die Expression des PRO256-Polypeptids geeignet sind, und die Gewinnung des PRO256-Polypeptids aus der Zellkultur umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform, wie in den Ansprüchen definiert, nutzt die Erfindung Agonisten und Antagonisten eines nativen PRO256-Polypeptids, wie hierin definiert. In einer speziellen Ausführungsform ist der Agonist oder Antagonist ein Anti-PRO256-Antikörper oder ein kleines Molekül.
In einer weiteren Ausführungsform, wie in den Ansprüchen definiert, betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifikation von Agonisten oder Antagonisten für bzw. gegen ein PRO256-Polypeptid, umfassend das Kontaktieren des PRO256-Polypeptids mit einem Kandidatenmolekül und das Beobachten einer biologischen Aktivität, die durch das PRO256-Polypeptid vermittelt wird. Vorzugsweise ist das PRO256-Polypeptid ein natives PRO256-Polypeptid.
In einer weiteren Ausführungsform, wie in den Ansprüchen definiert, betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung aus Stoffen, die ein PRO256-Polypeptid oder einen Agonisten oder Antagonisten eines PRO-Polypeptids, wie hierin beschrieben, oder einen Anti-PRO256-Antikörper in Kombination mit einem Träger umfasst. Gegebenenfalls ist der Träger ein pharmazeutisch annehmbarer Träger.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines PRO256-Polypeptids oder eines Agonisten oder Antagonisten davon, wie in den Ansprüchen definiert, oder eines Anti-PRO256-Antikörpers zur Herstellung eines Medikaments, das zur Behandlung eines Leidens nützlich ist, das auf das PRO256-Polypeptid, einen Agonisten oder Antagonisten davon oder einen Anti-PRO256-Antikörper reagiert.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Nucleotidsequenz einer cDNA, die eine für ein Nativsequenz-PRO256 kodierende Nucleotidsequenz (UNQ223) enthält, worin die Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 11) ein Klon ist, der hierin als „DNA35880-1160" bezeichnet wird. Die Positionen der jeweiligen Start- und Stoppcodons sind ebenfalls in fettgedruckter und unterstrichener Schrift dargestellt.
2 zeigt die Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 12) eines Nativsequenz-PRO256-Polypeptids, das von der kodierenden Sequenz aus 1 abgeleitet ist. Außerdem sind, sofern bekannt, die ungefähren Positionen verschiedener anderer wichtiger Polypeptiddomänen angezeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
I. Definitionen
Die Bezeichnung „immunbezogene Erkrankung" bzw. „Immunerkrankung" steht für eine Erkrankung, bei der ein Bestandteil des Immunsystems eines Säugetiers eine Erkrankung des Säugetiers auslöst oder auf andere Weise dazu beiträgt. Außerdem sind Erkrankungen eingeschlossen, bei denen eine Stimulation der oder ein Eingriff in die Immunantwort lindernde Wirkung bezüglich des Fortschreitens der Erkrankung hat. Dieser Begriff umfasst immunvermittelte Entzündungserkrankungen, nicht immunvermittelte Entzündungserkrankungen, Infektionserkrankungen, Immundefizienzerkrankungen, Neoplasie usw.
Die Bezeichnung „T-Zell-vermittelte" Erkrankung steht für eine Erkrankung, bei der T-Zellen direkt oder indirekt eine Erkrankung eines Säugetiers auslöst oder auf andere Weise dazu beiträgt. Die T-Zell-vermittelte Erkrankung kann mit zellvermittelten Wirkungen, lymphokinvermittelten Wirkungen usw. und sogar mit B-Zellen-assoziierten Wirkungen, wenn die B-Zellen beispielsweise durch die von T-Zellen sekretierten Lymphokine stimuliert werden, assoziiert sein.
Beispiele für Immun- und Entzündungserkrankungen, von denen manche Immun- oder T-Zell-vermittelt sind, die gemäß der Erfindung behandelt werden können, umfassen: systemischen Lupus erythematodes, rheumatoide Arthritis, juvenile chronische Arthritis, Spondyloarthropathien, systemische Sklerose (Sklerodermie), idiopathische entzündliche Myopathien (Dermatomyositis, Polymyositis), Sjögren-Syndrom, systemische Vaskulitis, Sarkoidose, autoimmunhämolytische Anämie (Immunpanzytopenie, paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie), Autoimmun-Thrombozytopenie (idiopathische thrombozytopenische Purpurs, immunvermittelte Thrombozytopenie), Thyreoiditis (Basedow-Krankheit, Hashimoto-Thyreoiditis, juvenile lymphozytäre Thyreoiditis, atrophische Thyreoiditis), Diabetes mellitus, immunvermittelte Nierenerkrankungen (Glomerulonephritis, tubulointerstitielle Nephritis), Entmarkungskrankheiten des Zentral- und peripheren Nervensystems, wie z.B. multiple Sklerose, idiopathische demyelinisierende Polyneuropathie oder Guillain-Barré-Syndrom und chronische entzündliche demyelinisierende Polyneuropathie, hepatobiliäre Erkrankungen, wie z.B. infektiöse Hepatitis (Hepatitis A, B, C, D, E und andere nicht-hepatotrope Viren), autoimmune chronische aktive Hepatitis, primäre biliäre Zirrhose, granulomatöse Hepatitis und sklerosierende Cholangitis, entzündliche Darmerkrankungen (Colitis ulcerosa: Crohn-Krankheit), glutenbedingte Enteropathie und Whipple-Krankheit, autoimmun- oder immunvermittelte Hauterkrankungen, einschließlich bullöser Hauterkrankungen, Erythema multiforme und Kontaktdermatitis, Psoriasis, Allergosen, wie z.B. Asthma, Rhinitis allergica, atopische Dermatitis, Lebensmittel-Hypersensitivität und Urtikaria, immunologische Erkrankungen der Lunge, wie z.B. eosinophile Pneumonien, idiopathische Lungenfibrose und Hypersensitivitätspneumonitis, mit einer Transplantation assoziierte Erkrankungen, einschließlich Transplantat-Abstoßung und Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankungen. Infektionserkrankungen umfassen Viruserkrankungen, wie z.B. AIDS (HIV-Infektion), Hepatitis A, B, C, D und E, Herpes usw., bakterielle Infektionen, Pilzinfektionen, Protozoeninfektionen und Parasiteninfektionen.
Eine „Behandlung" ist ein Eingriff, der mit dem Ziel durchgeführt wird, die Entstehung oder Änderung der Manifestation einer Erkrankung zu verhindern. Demgemäß bezieht sich „Behandlung" sowohl auf therapeutische Behandlung als auch auf prophylaktische oder präventive Maßnahmen. Individuen, die eine Behandlung benötigen, umfassen schon erkrankte als auch solche, bei denen der Krankheit vorgebeugt werden soll. Bei der Behandlung einer Immunerkrankung kann ein Therapeutikum direkt die Stärke einer Antwort eines Bestandteils der Immunantwort erhöhen oder verringern oder die Erkrankung empfänglicher für eine Behandlung mit anderen Therapeutika, z.B. Antibiotika, Antimykotika, Antiphlogistika, Chemotherapeutika usw., machen.
„Chronische" Verabreichung bezieht sich im Gegensatz zu einem akuten Modus auf die Verabreichung des Mittels/der Mittel auf kontinuierliche Weise, um die anfängliche therapeutische Wirkung (Aktivität) über eine längere Zeitspanne aufrechtzuerhalten. „Diskontinuierliche" Verabreichung ist eine Behandlung, die nicht in Serie ohne Unterbrechung erfolgt, sondern eher auf zyklische Weise durchgeführt wird.
Die „Manifestation" einer Immunerkrankung umfasst jegliche Phänomene, die das Wohlbefinden des Patienten beeinträchtigen. Dazu gehören unter anderem anomales oder unkontrollierbares Zellwachstum, Antikörperproduktion, Autoantikörperproduktion, Komplementproduktion und -aktivierung, Beeinträchtigung der normalen Funktionsweise von benachbarten Zellen, Freisetzung von Zytokinen oder anderen Sekretionsprodukten in anormaler Menge, Unterdrückung oder Verschlimmerung von Entzündungs- oder Immunantworten, Infiltration von Entzündungszellen (neutrophil, eosinophil, monozytisch, lymphozytisch) in Gewebehohlräumen usw.
„Säugetier” für die Zwecke der Behandlung bezieht sich auf jedes beliebige Tier, das als Säugetier klassifiziert ist, einschließlich Menschen, Zucht- und Nutztieren, Zoo-, Sport- und Haustieren, wie beispielsweise Hunde, Pferde, Katzen, Rinder, usw. Vorzugsweise ist das Säugetier ein Mensch.
Verabreichung „in Kombination mit" einem oder mehreren therapeutischen Mitteln schließt simultane (gleichzeitige) und aufeinander folgende Verabreichung in jeder beliebigen Reihenfolge ein.
„Träger" wie hierin verwendet schließen pharmazeutisch annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren ein, die gegenüber der Zelle oder dem Säugetier, die/das ihnen ausgesetzt wird, bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nichttoxisch sind. Häufig ist der physiologisch annehmbare Träger eine wässrige, pH-gepufferte Lösung. Beispiele für physiologisch annehmbare Träger umfassen Puffer wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidanzien einschließlich Ascorbinsäure; niedermolekulares Polypeptid (mit weniger als etwa 10 Resten); Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie z.B. EDTA; Zuckeralkohole wie z.B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen wie z.B. Natrium; und/oder nichtionische Tenside wie z.B. TWEEN^TM, Polyethylenglykol (PEG) und PLURONICS^TM.
Die Bezeichnung „zytotoxisches Mittel" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine Substanz, welche die Funktion von Zellen hemmt oder verhindert und/oder die Zerstörung von Zellen verursacht. Die Bezeichnung ist so zu verstehen, dass sie radioaktive Isotope (z.B. I131, I125, Y90 und Re186), Chemotherapeutika und Toxine, wie z.B. enzymatisch aktive Toxine von Bakterien, Pilzen, Pflanzen oder Tieren, oder Fragmente davon umfasst.
Ein „Chemotherapeutikum" ist eine chemische Verbindung, die bei der Behandlung von Krebs zweckdienlich ist. Beispiele für Chemotherapeutika umfassen Adriamycin, Doxorubicin, Epirubicin, 5-Fluoruracil, Cytosinarabinosid („Ara-C"), Cyclophosphamid, Thiotepa, Busulfan, Cytokin, Taxoide, z.B. Paclitaxel (Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ, USA) und Doxetaxel (Taxotere, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Rnace), Toxotere, Methotrexat, Cisplatin, Melphalan, Vinblastin, Bleomycin, Etoposid, Ifosfamid, Mitomycin C, Mitoxantron, Vincristin, Vinorelbin, Carboplatin, Teniposid, Daunomycin, Carminomycin, Aminopterin, Dactinomycin, Mitomycine, Esperamycine (siehe US-Pat. Nr. 4.675.187 ), Melphalan und andere verwandte Stickstofflost-Verbindungen. Außerdem umfasst diese Definition hormonale Wirkstoffe, welche die Hormonwirkung auf Tumoren regeln oder hemmen, wie z.B. Tamoxifen und Onapriston.
Ein „wachstumshemmendes Mittel", wenn hierin verwendet, betrifft eine Verbindung oder Zusammensetzung, die das Wachstum einer Zelle in vitro oder in vivo hemmt, im Besonderen das einer Krebszelle, die eines der hierin identifizierten Gene überexprimiert. Folglich kann das wachstumshemmende Mittel eines sein, das den Prozentsatz an Zellen, die solche Gene überexprimieren, in der S-Phase signifikant reduziert. Beispiele für wachstumshemmende Mittel umfassen Mittel, die die Zellzyklus-Progression blockieren (an einer anderen Stelle als an der S-Phase), wie z.B. Mittel, die G1-Stillstand oder M-Phasen-Stillstand induzieren. Klassische M-Phasen-Blocker umfassen die Vincas (Vincristin und Vinblastin), Taxol und Topo-II-Inhibitoren, wie z.B. Doxorubicin, Epirubicin, Daunorubicin, Etoposid und Bleomycin. Jene Mittel, die G1 hemmen, treten auch zum S-Phasen-Stillstand über, z.B. DNA-Alkylierungsmittel wie z.B. Tamoxifen, Prednison, Dacarbazin, Mechlorethamin, Cisplatin, Methotrexat, 5-Fluoruracil und ara-C. Weiterführende Informationen finden sich in The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn und Israel (Hrsg.), Kapitel 1, mit dem Titel „Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" von Murakami et al. (WB Saunders, Philadelphia (1995)), speziell Seite 13.
Die Bezeichnung „Cytokin" ist ein Sammelbegriff für von einer Zellpopulation freigesetzte Proteine, die auf eine andere Zelle als interzelluläre Mediatoren wirken. Bei spiele für solche Cytokine sind Lymphokine, Monokine und herkömmliche Polypeptidhormone. Zu den Cytokinen gehören Wachstumshormone, wie z.B. das menschliche Wachstumshormon, menschliche N-Methionyl-Wachstumshormon und Rinderwachstumshormon; das Parathormon; Thyroxin; Insulin; Proinsulin; Relaxin; Prorelaxin; Glykoproteinhormone, wie z.B. das follikelstimlierende Hormon (FSH), das thyreoideastimulierende Hormon (TSH) und das luteinisierende Hormon (LH); hepatischer Wachstumsfaktor; Fibroblasten-Wachstumsfaktor; Prolactin; Plazenta-Lactogen; Tumornekrosefaktor-α und -β; das Anti-Müller-Hormon; das Gonadotropinassoziierte Protein der Maus; Inhibin; Activin; der Gefäßendothelwachstumsfaktor; Integrin; Thrombopoietin (TPO); Nervenwachstumsfaktoren, wie z.B. NGF-β; der Thrombozyten-Wachstumsfaktor; transformierende Wachstumsfaktoren (TGFs), wie z.B. TGF-α und TGF-β; der insulinähnliche Wachstumsfaktor-I und -II; Erythropoietin (EPO); osteoinduktive Faktoren; Interferone, wie z.B. Interferon-α, -β und -γ; koloniestimulierende Faktoren (CSFs), wie z.B. Makrophagen-CSF (M-CSF); Granulozyten-Makrophagen-CSF (GM-CSF); und Granulozyten-CSF (G-CSF); Interleukine (ILs), wie z.B. IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; ein Tumornekrosefaktor, wie z.B. TNF-α oder TNF-β; und andere Polypeptidfaktoren, einschließlich LIF und Kit-Ligand (KL). Wie hierin verwendet umfasst der Begriff Cytokin Proteine aus natürlichen Quellen oder aus rekombinanten Zellkulturen und biologisch aktive Äquivalente der Nativsequenz-Cytokine.
Die Bezeichnungen „PRO-Polypeptid" und „PRO" wie hierin verwendet und wenn ihnen unmittelbar eine Nummernkennzeichnung folgt beziehen sich auf verschiedene Polypeptide, wobei sich die vollständige Bezeichnung (d.h. PRO/Nummer) auf spezifische Polypeptidsequenzen wie hierin beschrieben bezieht. Die Bezeichnungen „PRO/Nummer-Polypeptid" und „PRO/Nummer", worin die Bezeichnung „Nummer" hierin als eine tatsächliche numerische Benennung bereitgestellt wird, umfassen Nativsequenzpolypeptide und Polypeptidvarianten (die hierin noch näher definiert werden). Die hierin beschriebenen PRO-Polypeptide können aus zahlreichen verschiedenen Quellen isoliert werden, wie z.B. aus menschlichen Gewebetypen oder aus einer anderen Quelle, oder können durch Rekombinations- oder Syntheseverfahren hergestellt werden. Die Bezeichnung „PRO-Polypeptid" bezieht sich auf jedes einzelne hierin offenbarte PRO/Nummer-Polypeptid. Alle Offenbarungen in dieser Beschreibung, die sich auf das „PRO-Polypeptid" beziehen, beziehen sich sowohl auf die Polypeptide einzeln als auch insgesamt betrachtet. Beispielsweise beziehen sich Beschreibungen der Herstellung von, Reinigung von, Ableitung von, Bildung von Antikörpern für oder gegen, Verabreichung von, Zusammensetzungen mit, Behandlung einer Erkrankung mit usw. auf jedes der PRO-Polypeptide der Erfindung für sich genommen. Die Bezeichnung „PRO-Polypeptid" umfasst auch Varianten der hierin offenbarten PRO/Nummer-Polypeptide.
Ein „Nativsequenz-PRO-Polypeptid" umfasst ein Polypeptid mit derselben Aminosäuresequenz wie das entsprechende, aus der Natur gewonnene PRO-Polypeptid. Solche Nativsequenz-PRO-Polypeptide können aus natürlichen Quellen isoliert werden oder können mittels Rekombinations- oder Syntheseverfahren hergestellt werden. Die Bezeichnung „Nativsequenz-PRO-Polypeptid" umfasst insbesondere natürlich vorkommende, trunkierte oder sekretierte Formen des spezifischen PRO-Polypeptids (z.B. Sequenz einer extrazellulären Domäne), natürlich vorkommende Varianten (z.B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich vorkommende Allelvarianten des Polypeptids. In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung sind die hierin offenbarten Nativsequenz-PRO-Polypeptide reife oder Volllängen-Nativsequenz-Polypeptide, welche die in den beiliegenden Figuren gezeigten Volllängen-Aminosäuresequenzen umfassen. Start- und Stoppcodons sind in den Figuren fettgedruckt und unterstrichen. Während jedoch die PRO-Polypeptide, die in den beiliegenden Figuren offenbart sind, als mit Methioninresten beginnend dargestellt sind, die hierin als Aminosäureposition 1 in den Figuren bezeichnet sind, ist es ebenso denkbar und möglich, dass andere Methioninreste entweder stromauf oder stromab von der Aminosäureposition 1 in den Figuren als die Start-Aminosäurereste für die PRO-Polypeptide verwendet werden können.
Die „extrazelluläre Domäne" oder „ECD" des PRO-Polypeptids bezieht sich auf eine Form des PRO-Polypeptids, die im Wesentlichen frei von den Transmembran- und zytoplasmatischen Domänen ist. Normalerweise weist eine PRO-Polypeptid-ECD weniger als etwa 1 % solcher Transmembran- und/oder zytoplasmatischen Domänen und vorzugsweise weniger als 0,5 % solcher Domänen auf. Es versteht sich, dass jede Transmembrandomäne, die für die PRO-Polypeptide der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden, gemäß auf dem Gebiet der Erfindung routinemäßig eingesetzten Kriterien zur Identifikation dieses Typs hydrophober Domänen identifiziert werden. Die exakten Grenzen einer Transmembrandomäne können variieren, jedoch sehr wahrscheinlich nicht um mehr als etwa 5 Aminosäuren an jedem Ende der Domäne, wie sie anfangs hierin definiert wurde. Gegebenenfalls kann daher eine extrazelluläre Domäne eines PRO-Polypeptids etwa 5 oder weniger Aminosäuren an jeder Seite der Grenze zwischen Transmembrandomäne und extrazellulärer Domäne enthalten, wie sie in den Beispielen oder der Beschreibung identifiziert sind, und solche Polypeptide, mit dem oder ohne das assoziierte Signalpeptid, und Nucleinsäuren, die für sie kodieren, werden in der vorliegenden Erfindung bedacht.
Der ungefähre Ort der „Signalpeptide" der verschiedenen hierin offenbarten PRO-Polypeptide ist in der vorliegenden Beschreibung und/oder den beiliegenden Figuren gezeigt. Es gilt jedoch anzumerken, dass die C-terminale Grenze eines Signalpeptids variieren kann, jedoch sehr wahrscheinlich um nicht mehr als etwa 5 Aminosäuren an jeder Seite der C-terminalen Signalpeptidgrenze, wie es anfänglich hierin identifiziert wurde, worin die C-terminale Grenze des Signalpeptids gemäß auf dem Gebiet der Erfindung zur Identifikation dieses Typs von Aminosäuresequenzelement routinemäßig eingesetzten Kriterien identifiziert werden kann (z.B. Nielsen et al., Prot. Eng. 10, 1-6 (1997), und von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14, 4683-4690 (1986)). Darüber hinaus ist auch anerkannt, dass in manchen Fällen Spaltung einer Signalsequenz von einem sekretierten Polypeptid nicht gänzlich gleichförmig stattfindet, was zu mehr als einer sekretierten Spezies führt. Diese reifen Polypeptide, bei denen das Signalpeptid innerhalb von nicht mehr als etwa 5 Aminosäuren an jeder Seite der C-terminalen Grenze des Signalpeptids wie hierin identifiziert gespaltet wird, und die für sie kodierenden Polynucleotide sind in der vorliegenden Erfindung vorgesehen.
„PRO-Polypeptidvariante” bezeichnet ein aktives PRO-Polypeptid wie zuvor oder nachstehend definiert mit zumindest etwa 80 % Aminosäuresequenzidentität mit einer Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz wie hierin offenbart, einer PRO-Polypeptidsequenz, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, einer extrazellulären Domäne eines PRO-Polypeptids, mit oder ohne Signalpeptid, wie hierin offenbart, oder jedem anderen Fragment einer Volllängen-PRO-Polypeptidsequenz, wie hierin offenbart. Solche PRO-Polypeptidvarianten umfassen beispielsweise PRO-Polypeptide, worin ein oder mehrere Aminosäurereste am N- oder C-Terminus der nativen Volllängen-Aminosäuresequenz addiert oder deletiert sind. Üblicherweise hat eine PRO-Polypeptidvariante zumindest etwa 80 % Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81 % Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82 % Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83 % Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84 % Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85 % Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86 % Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87 % Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 88 % Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89 % Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90 % Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91 % Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92 % Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93 % Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94 % Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95 % Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96 % Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97 % Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98 % Aminosäuresequenzidentität und alternativ dazu zumindest etwa 99 % Aminosäuresequenzidentität, mit einer Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz wie hierin offenbart, einer PRO-Polypeptidsequenz, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, einer extrazellulären Domäne eines PRO-Polypeptids, mit oder ohne Signalpeptid, wie hierin offenbart, oder mit einem beliebigen anderen, spezifisch definierten Fragment einer Volllängen-PRO-Polypeptidsequenz wie hierin offenbart. Üblicherweise weisen PRO-Polypeptidvarianten eine Länge von zumindest etwa 10 Aminosäuren, alternativ dazu zumindest eine Länge von etwa 20 Aminosäu ren, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 30 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 40 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 50 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 60 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 70 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 80 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 90 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 100 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 150 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 200 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 300 Aminosäuren oder mehr, auf.
„Prozent (%) Aminosäuresequenzidentität" in Bezug auf die hierin identifizierten PRO-Polypeptidsequenzen ist als der Prozentsatz an Aminosäureresten in einer Kandidatensequenz definiert, die mit den Aminosäureresten in der spezifischen PRO-Polypeptidsequenz nach Abgleichen der Sequenzen und Einführen von Lücken, sofern zur Erreichung maximaler prozentueller Sequenzidentität erforderlich, und ohne Berücksichtigung irgendwelcher konservativer Substitutionen als Teil der Sequenzidentität identisch sind. Abgleichen zum Zwecke der Bestimmung der prozentuellen Aminosäuresequenzidentität kann auf verschiedene Arten erreicht werden, die innerhalb des Gebiets der Erfindung liegen, beispielsweise unter Verwendung von allgemein erhältlichen Computerprogrammen wie z.B. BLAST-, BLAST-2-, ALIGN- oder Megalign-Software (DNASTAR). Fachleute können geeignete Parameter zur Messung von Abgleichung bestimmen, einschließlich sämtlicher Algorithmen, die erforderlich sind, um maximale Abgleichung über die volle Länge der zu vergleichenden Sequenzen zu erreichen. Für die vorliegenden Zwecke jedoch werden % Aminosäuresequenzidentitätswerte unter Verwendung des Computerprogramms zum Sequenzvergleich ALIGN-2 ermittelt, worin der vollständige Quellcode für das ALIGN-2-Programm nachstehend in Tabelle 1 bereitgestellt ist. Das ALIGN-2-Computerprogramm zum Sequenzvergleich wurde von Genentech, Inc., entworfen, und der in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigte Quellcode wurde mit Benutzerunterlagen im U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, eingereicht, wo er unter der U.S.-Copyright-Registrierungsnummer TXU510087 registriert ist. Das ALIGN-2-Programm ist über Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornien, öffentlich er hältlich oder kann aus dem in der nachstehenden Tabelle 1 bereitgestellten Quellcode kompiliert werden. Das ALIGN-2-Programm sollte zur Verwendung auf einem UNIX-Betriebssystem, vorzugsweise digital UNIX V4.0D, kompiliert werden. Alle Sequenzvergleichsparameter sind durch das ALIGN-2-Programm festgesetzt und variieren nicht.
In Fällen, in denen ALIGN-2 zum Aminosäuresequenzvergleich verwendet wird, wird die % Aminosäuresequenzidentität einer bestimmten Aminosäuresequenz A zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B (was alternativ auch als eine bestimmte Aminosäuresequenz A beschrieben werden kann, die eine bestimmte % Aminosäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B hat oder umfasst) wie folgt berechnet: 100 mal den Bruch X/Yworin X die Anzahl an Aminosäureresten ist, die durch das Sequenzabgleichungsprogramm ALIGN-2 in dieser Abgleichung des Programms von A und B als identische Übereinstimmungen verzeichnet wurden, und Y die Gesamtanzahl an Aminosäureresten in B ist. Es wird verstanden werden, dass, sofern die Länge der Aminosäuresequenz A mit der Länge der Aminosäuresequenz B nicht übereinstimmt, die % Aminosäuresequenzidentität von A zu B nicht gleich der % Aminosäuresequenzidentität von B zu A ist. Als Beispiele für Berechnungender % Aminosäuresequenzidentität unter Verwendung dieses Verfahrens zeigen Tabelle 2 und 3, wie die % Aminosäuresequenzidentität der Aminosäuresequenz, die als „Vergleichsprotein" bezeichnet wird, zur Aminosäuresequenz, die als „PRO" bezeichnet wird, berechnet wird, worin „PRO" für die Aminosäuresequenz eines hypothetischen PRO-Polypeptids von Interesse steht, „Vergleichsprotein" für die Aminosäuresequenz eines Polypeptids steht, mit dem das „PRO"-Polypeptid von Interesse verglichen wird, und „X", „Y" und „Z" jeweils verschiedene hypothetische Aminosäurereste darstellen.
Außer spezifisch anders festgehalten, werden alle hierin verwendeten % Aminosäuresequenzidentitätswerte wie im unmittelbar vorangehenden Absatz beschrieben unter Verwendung des ALIGN-2-Computerprogramms erhalten. % Aminosäuresequenzidentitätswerte können jedoch auch wie nachstehend beschrieben unter Verwendung des WU-BLAST-2-Computerprogramms (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996)) erhalten werden. Die meisten der WU-BLAST-2-Suchparameter sind auf Standardwerte eingestellt. Jene, die nicht auf Standardwerte eingestellt sind, d.h. die veränderbaren Parameter, werden mit den folgenden Werten eingestellt: overlap span = 1, overlap fraction = 0,125, Word threshold (T) = 11 und scoring matrix = BLOSUM62. Wird WU-BLAST-2 verwendet, so wird ein % Aminosäuresequenzidentitätswert durch Teilen (a) der Anzahl an übereinstimmenden identischen Aminosäureresten zwischen der Aminosäuresequenz des PRO-Polypeptids von Interesse mit einer Sequenz, die aus dem nativen PRO-Polypeptid abgeleitet ist, und der Vergleichs-Aminosäuresequenz von Interesse (d.h. die Sequenz, mit der das PRO-Polypeptid von Interesse verglichen wird, die eine PRO-Polypeptidvariante sein kann) wie durch WU-BLAST-2 bestimmt durch (b) die Gesamtzahl an Aminosäureresten des PRO-Polypeptids von Interesse bestimmt. Beispielsweise ist in der Feststellung „ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz A umfasst, die zumindest 80 % Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz B aufweist", die Aminosäuresequenz A die Vergleichs-Aminosäuresequenz von Interesse, und die Aminosäuresequenz B ist die Aminosäuresequenz des PRO-Polypeptids von Interesse.
Prozent Aminosäuresequenzidentität kann auch unter Verwendung des Sequenzvergleichprogramms NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402 (1997)) bestimmt werden. Das NCBI-BLAST2-Sequenzvergleichprogramm kann von der Adresse http://www.ncbi.nlm.nig.gov heruntergeladen oder sonst vom National Institute of Health, Bethesda, MD, bezogen werden. NCBI-BLAST2 verwendet mehrere Suchparameter, worin alle diese Suchparameter auf Standardwerte eingestellt sind, einschließlich beispielsweise unmask = yes, strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity length = 15/5, multi-pass e-value = 0,01, constant for multi-pass = 25, dropoff for final gapped alignment = 25 und scoring matrix = BLOSUM62.
In Fällen, in denen NCBI-BLAST2 für Aminosäuresequenzvergleiche verwendet wird, wird die % Aminosäuresequenzidentität einer bestimmten Aminosäuresequenz A zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B (was alternativ auch als eine bestimmte Aminosäuresequenz A beschrieben werden kann, die eine bestimmte % Aminosäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B hat oder umfasst) wie folgt berechnet: 100 mal den Bruch X/Yworin X für die Anzahl an Aminosäureresten steht, die als identische Übereinstimmungen des Sequenzabgleichungsprogramms NCBI-BLAST2 in der Programmabgleichung von A und B verzeichnet werden, und worin Y für die Gesamtzahl an Aminosäureresten in B steht. Es wird verständlich sein, dass, sofern die Länge von Aminosäuresequenz A nicht der Länge von Aminosäuresequenz B entspricht, die % Aminosäuresequenzidentität von A zu B nicht gleich der % Aminosäuresequenzidentität von B zu A ist.
„PRO-Polynucleotidvariante" oder „PRO-Nucleinsäuresequenzvariante" bezeichnet ein Nucleinsäuremolekül, das für ein aktives PRO-Polypeptid wie nachstehend definiert kodiert und das zumindest etwa 80 % Nucleinsäuresequenzidentität mit einer Nucleinsäuresequenz aufweist, die für eine Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz wie hierin offenbart, eine Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, eine extrazelluläre Domäne eines PRO-Polypeptids, mit oder ohne Signalpeptid, wie hierin offenbart, oder jedes andere Fragment einer Volllängen-PRO-Polypeptidsequenz wie hierin offenbart kodiert. Üblicherweise hat eine PRO-Polynucleotidvariante zumindest etwa 80 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87 % Nucleinsäuresequenzi dentität, alternativ dazu zumindest etwa 88 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97 % Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98 % Nucleinsäuresequenzidentität und alternativ dazu zumindest etwa 99 % Nucleinsäuresequenzidentität, mit einer Nucleinsäuresequenz, die für eine Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz wie hierin offenbart, eine Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, eine extrazelluläre Domäne eines PRO-Polypeptids, mit dem oder ohne das Signalpeptid, wie hierin offenbart, oder jedes andere Fragment einer Volllängen-PRO-Polypeptidsequenz wie hierin offenbart kodiert. Varianten umfassen nicht die native Nucleotidsequenz.
Üblicherweise weisen PRO-Polynucleotidvarianten eine Länge von zumindest etwa 30 Nucleotiden, alternativ dazu zumindest eine Länge von zumindest etwa 60 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 90 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 120 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 150 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 180 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 210 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 240 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 270 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 300 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 450 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 600 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 900 Nucleotiden, oder mehr auf.
„Prozent (%) Nucleinsäuresequenzidentität" in Bezug auf hierin identifizierte PRO-kodierende Nucleinsäuresequenzen ist als der Prozentsatz an Nucleotiden in einer Kandidatensequenz definiert, die mit den Nucleotiden in der PRO-Nucleinsäure sequenz von Interesse, nach Abgleichen der Sequenzen und Einführen von Lücken, sofern zur Erreichung maximaler Prozent-Sequenzidentität erforderlich, identisch sind. Abgleichung zum Zweck der Bestimmung von Prozent-Nucleinsäuresequenzidentität kann auf verschiedene Weisen erreicht werden, die in den Bereich des Gebiets der Erfindung fallen, beispielsweise unter Verwendung öffentlich erhältlicher Computersoftware wie BLAST, BLAST-2, ALIGN oder Megalign-Software (DNASTAR). Für die Zwecke hierin jedoch werden % Nucleinsäuresequenzidentitätswerte unter Verwendung des Sequenzvergleich-Computerprogramm ALIGN-2 ermittelt, worin der vollständige Quellcode für das ALIGN-2-Programm nachstehend in Tabelle 1 bereitgestellt ist. Das ALIGN-2-Sequenzvergleich-Computerprogramm wurde von Genentech, Inc., entwickelt, und der nachstehend in Tabelle 1 gezeigte Quellcode wurde mit Benutzerunterlagen im U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, eingereicht, wo er unter der U.S.-Copyright-Registrierungsnummer TXU510087 registriert ist. Das ALIGN-2-Programm ist über Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornien, öffentlich erhältlich oder kann aus dem in der nachstehenden Tabelle 1 bereitgestellten Quellcode kompiliert werden. Das ALIGN-2-Programm sollte zur Verwendung auf einem UNIX-Betriebssystem, vorzugsweise digital UNIX V4.0D, kompiliert werden. Alle Sequenzvergleichsparameter sind durch das ALIGN-2-Programm festgesetzt und variieren nicht.
In Fällen, in denen ALIGN-2 zum Nucleinsäuresequenzvergleich verwendet wird, wird die % Nucleinsäuresequenzidentität einer bestimmten Nucleinsäuresequenz C zu, mit oder gegen eine bestimmte Nucleinsäuresequenz D (was alternativ auch als eine bestimmte Nucleinsäuresequenz C beschrieben werden kann, die eine bestimmte % Nucleinsäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine bestimmte Nucleinsäuresequenz D hat oder umfasst) wie folgt berechnet: 100 mal den Bruch W/Zworin W die Anzahl an Nucleotiden ist, die als identische Übereinstimmungen durch das Sequenzabgleichungsprogramm ALIGN-2 in der Programmabgleichung von C und D verzeichnet sind, und worin Z die Gesamtzahl an Nucleotiden in D ist. Es wird verstanden werden, dass, sofern die Länge von Nucleinsäuresequenz C nicht der Länge von Nucleinsäuresequenz D entspricht, die % Nucleinsäuresequenzidentität von C zu D nicht gleich der % Nucleinsäuresequenzidentität von D zu C ist. Als Beispiele für % Nucleinsäuresequenzidentitäts-Berechnungen zeigen die Tabellen 4 und 5, wie die % Nucleinsäuresequenzidentität der Nucleinsäuresequenz, die als „Vergleichs-DNA" bezeichnet wird, zur Nucleinsäuresequenz, die als „PRO-DNA" bezeichnet ist, berechnet wird, worin „PRO-DNA" eine hypothetische PRO-kodierende Nucleinsäuresequenz von Interesse darstellt, „Vergleichs-DNA" die Nucleotidsequenz eines Nucleinsäuremoleküls darstellt, mit dem das „PRO-DNA"-Nucleinsäuremolekül von Interesse verglichen wird, und „N", „L" und „V" jeweils verschiedene hypothetische Nucleotide darstellen.
Außer spezifisch anders festgehalten, werden alle hierin verwendeten % Nucleinsäuresequenzidentitätswerte wie im unmittelbar vorangehenden Absatz beschrieben unter Verwendung des ALIGN-2-Computerprogramms erhalten. % Nucleinsäuresequenzidentitätswerte können jedoch auch wie nachstehend beschrieben unter Verwendung des WU-BLAST-2-Computerprogramms (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996)) erhalten werden. Die meisten der WU-BLAST-2-Suchparameter sind auf Standardwerte eingestellt. Jene, die nicht auf Standardwerte eingestellt sind, d.h. die veränderbaren Parameter, werden mit den folgenden Werten eingestellt: overlap span = 1, overlap fraction = 0,125, Word threshold (T) = 11 und scoring matrix = BLOSUM62. Wird WU-BLAST-2 verwendet, so wird ein % Nucleinsäuresequenzidentitätswert durch Teilen (a) der Anzahl an übereinstimmenden identischen Nucleotiden zwischen der Nucleinsäuresequenz des PRO-Polypeptidkodierenden Nucleinsäuremoleküls von Interesse mit einer Sequenz, die aus der Nativsequenz-PRO-Polypeptid-kodierenden Nucleinsäure abgeleitet ist, und dem Vergleichs-Nucleinsäuremolekül von Interesse (d.h. die Sequenz, mit der das PRO-Polypeptid-kodierende Nucleinsäuremolekül von Interesse verglichen wird, die eine PRO-Polynucleotidvariante sein kann) wie durch WU-BLAST-2 bestimmt durch (b) die Gesamtzahl an Nucleotiden des PRO-Polypeptid-kodierenden Nucleinsäuremoleküls von Interesse bestimmt. Beispielsweise ist in der Feststellung „ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das eine Nucleinsäuresequenz A umfasst, die zumindest 80 % Nucleinsäuresequenzidentität mit der Nucleinsäuresequenz B aufweist", die Nucleinsäuresequenz A das Vergleichs-Nucleinsäuremolekül von Interesse, und die Nucleinsäuresequenz B ist die Nucleinsäuresequenz des PRO-Polypeptid-kodierenden Nucleinsäuremoleküls von Interesse.
Prozent Nucleinsäuresequenzidentität kann auch unter Verwendung des Sequenzvergleichprogramms NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402 (1997)) bestimmt werden. Das NCBI-BLAST2-Sequenzvergleichprogramm kann von der Adresse http://www.ncbi.nlm.nih.gov heruntergeladen oder sonst vom National Institute of Health, Bethesda, MD, bezogen werden. NCBI-BLAST2 verwendet mehrere Suchparameter, worin alle diese Suchparameter auf Standardwerte eingestellt sind, einschließlich beispielsweise unmask = yes, strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity length = 15/5, multi-pass e-value = 0,01, constant for multi-pass = 25, dropoff for final gapped alignment = 25 und scoring matrix = BLOSUM62.
In Fällen, in denen NCBI-BLAST2 für Sequenzvergleiche verwendet wird, wird die % Nucleinsäuresequenzidentität einer bestimmten Nucleinsäuresequenz C zu, mit oder gegen eine bestimmte Nucleinsäuresequenz D (was alternativ auch als eine bestimmte Nucleinsäuresequenz C beschrieben werden kann, die eine bestimmte % Nucleinsäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine bestimmte Nucleinsäuresequenz D hat oder umfasst) wie folgt berechnet: 100 mal den Bruch W/Zworin W für die Anzahl an Nucleotiden steht, die als identische Übereinstimmungen durch das Sequenzabgleichprogramm NCBI-BLAST2 in der Programmabgleichung von C und D verzeichnet wurden, und worin Z für die Gesamtzahl an Nucleotiden in D steht. Es wird verstanden werden, dass, sofern die Länge von Nucleinsäuresequenz C nicht gleich der Länge von Nucleinsäuresequenz D ist, die % Nucleinsäuresequenzidentität von C zu D nicht der % Nucleinsäuresequenzidentität von D zu C entspricht.
In anderen Ausführungsformen sind PRO-Polynucleotidvarianten Nucleinsäuremoleküle, die für ein aktives PRO-Polypeptid kodieren und die in der Lage sind, vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen, an Nucleotidsequenzen zu hybridisieren, die für ein Volllängen-PRO-Polypeptid wie hierin offenbart kodieren. PRO-Polypeptidvarianten können jene sein, für die eine PRO-Polynucleotidvariante kodiert.
Die Bezeichnung „Positive" im Zusammenhang mit Sequenzvergleich, der wie zuvor beschrieben durchgeführt wird, schließt Reste in den verglichenen Sequenzen ein, die nicht identisch sind, jedoch ähnliche Eigenschaften aufweisen (z.B. als eine Folge von konservativen Substitutionen, siehe nachstehende Tabelle 6). Für die Zwecke hierin wird der %-Wert von Positiven durch Teilen (a) der Anzahl an Aminosäureresten, die einen positiven Wert zwischen der PRO-Polypeptid-Aminosäuresequenz von Interesse mit einer Sequenz, die aus der nativen PRO-Polypeptidsequenz abgeleitet ist, und der Vergleichs-Aminosäuresequenz von Interesse (d.h. der Aminosäuresequenz, mit der die PRO-Polypeptidsequenz verglichen wird) wie in der BLOSUM26-Matrix von WU-BLAST-2 bestimmt verzeichnen, durch (b) die Gesamtzahl an Aminosäureresten des PRO-Polypeptids von Interesse bestimmt.
Außer spezifisch anders festgehalten, wird der %-Wert von Positiven wie im unmittelbar vorangehenden Absatz beschrieben berechnet. Im Zusammenhang mit Aminosäuresequenzidentität binden jedoch Vergleiche, die wie oben für ALIGN-2 und NCBI-BLAST2 beschrieben durchgeführt wurden, nicht nur Aminosäurereste in den verglichenen Sequenzen ein, die identisch sind, sondern auch jene, die ähnliche Eigenschaften aufweisen. Aminosäurereste, die einen positiven Wert zu einem Aminosäurerest von Interesse verzeichnen, sind jene, die entweder mit dem Aminosäurerest von Interesse identisch sind oder eine bevorzugte Substitution (wie nachstehend in Tabelle 6 definiert) des Aminosäurerests von Interesse sind.
Für Aminosäuresequenzvergleiche unter Verwendung von ALIGN-2 oder NCBI-BLAST2 wird der %-Wert von Positiven einer bestimmten Aminosäuresequenz A zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B (was alternativ auch als eine bestimmte Aminosäuresequenz A beschrieben werden kann, die einen bestimmten % Positive zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B hat oder umfasst) wie folgt berechnet: 100 mal den Bruch X/Yworin X für die Anzahl an Aminosäureresten steht, die einen positiven Wert wie zuvor definiert durch das Sequenzabgleichprogramm ALIGN-2 oder NCBI-BLAST2 in der Programmabgleichung von A und B verzeichnen, und worin Y für die Gesamtzahl an Aminosäureresten in B steht. Es wird verstanden werden, dass, sofern die Länge von Aminosäuresequenz A nicht der Länge von Aminosäuresequenz B entspricht, die % Positive von A zu B nicht gleich den % Positiven von B zu A sind.
„Isoliert", sofern verwendet, um die verschiedenen, hierin offenbarten Polypeptide zu beschreiben, bezeichnet ein Polypeptid, das identifiziert und getrennt und/oder aus einer Komponente aus seiner natürlichen Umgebung gewonnen wurde. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die typischerweise diagnostische oder therapeutische Verwendungen für das Polypeptid stören würden, und können Enzyme, Hormone und andere proteinhaltige oder nicht-proteinhältige Gelöststoffe einbinden. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Polypeptid (1) bis zu einem ausreichenden Grad gereinigt, um zumindest 15 Reste von N-terminaler oder innerer Aminosäuresequenz durch Verwendung eines Zentrifugenröhrchensequenzierers zu erhalten, oder (2) durch SDS-PAGE unter nichtreduzierenden oder reduzierenden Bedingungen mittels Coomassie-Blau- oder vorzugsweise Silberfärbung bis zur Homogenität gereinigt. Ein isoliertes Polypeptid schließt ein Polypeptid in situ innerhalb rekombinanter Zellen ein, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des PRO-Polypeptids nicht vorhanden ist. Üblicherweise wird ein isoliertes Polypeptid durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
Eine für ein PRO-Polypeptid kodierende „isolierte" Nucleinsäure oder eine für ein anderes Polypeptid kodierende Nucleinsäure ist ein Nucleinsäuremolekül, das aus zumindest einem verunreinigenden Nucleinsäuremolekül identifiziert und getrennt wird, mit dem es normalerweise in der natürlichen Quelle der für das Polypeptid kodierenden Nucleinsäure assoziiert ist. Ein für ein Polypeptid kodierendes isoliertes Nucleinsäuremolekül liegt in einer anderen Form oder Beschaffenheit vor als es in der Natur zu finden ist. Für ein Polypeptid kodierende isolierte Nucleinsäuremoleküle werden daher von dem für ein Polypeptid kodierendes spezifisches Nucleinsäuremolekül, wie es in natürlichen Zellen existiert, unterschieden. Ein für ein Polypeptid kodierendes isoliertes Nucleinsäuremolekül schließt jedoch für ein Polypeptid kodierende Nucleinsäuremoleküle ein, die in Zellen enthalten sind, welche üblicherweise das Polypeptid exprimieren, wobei sich beispielsweise das Nucleinsäuremolekül an einer anderen chromosomalen Stelle befindet als in natürlichen Zellen.
Die Bezeichnung „Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die zur Expression einer operabel gebundenen Kodiersequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die Kontrollsequenzen, die beispielsweise für Prokaryoten geeignet sind, schließen einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, und eine Ribosomenbindungsstelle ein. Eukaryotische Zellen sind bekannt dafür, Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer zu verwenden.
Eine Nucleinsäure ist „operabel gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gebracht wird. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als ein Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt; ein Promotor oder ein Enhancer ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosomenbindungsstelle ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass sie Translation unterstützt. Im Allgemeinen bedeutet „operabel gebunden", dass die DNA-Sequenzen, die verbunden sind, zusammenhängend sind und, im Fall eines Sekretionsleaders, zusammenhängend und in Lesephase vorliegen. Enhancer müssen jedoch nicht zusammenhängend sein. Die Bindung erfolgt durch Ligation an passenden Restriktionsstellen. Existieren solche Stellen nicht, so werden die synthetischen Oligonucleotidadaptoren oder Linker gemäß herkömmlichen Praktiken verwendet.
Die Bezeichnung „Antikörper" wird im weitesten Sinn verwendet und deckt insbesondere beispielsweise einzelne monoklonale Anti-PRO-Antikörper (einschließlich Agonisten, Antagonisten und neutralisierender Antikörper), Anti-PRO-Antikörperzusammensetzungen mit polyepitopischer Spezifität, einkettige Anti-PRO-Antikörper und Fragmente von Anti-PRO-Antikörpern ab (siehe unten). Die Bezeichnung „monoklonaler Antikörper" wie hierin verwendet bezieht sich auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern gewonnen wurde, d.h. dass die einzelnen Antikörper, aus denen die Population besteht, identisch sind, unter Ausnahme möglicher, natürlich vorkommender Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können.
„Stringenz" von Hybridisierungsreaktionen können Fachleute leicht bestimmen und beruht im Allgemeinen auf einer empirischen Berechnung, die von Sondenlänge, Waschtemperatur und Salzkonzentration abhängt. Im Allgemeinen erfordern längere Sonden höhere Temperaturen für korrektes Annealing, während kürzere Sonden niedrigere Temperaturen erfordern. Hybridisierung im Allgemeinen hängt von der Fähigkeit denaturierter DNA ab, neuerlich ein Annealing zu durchlaufen, wenn komplementäre Stränge in einer Umgebung unter ihrer Schmelztemperatur vorhanden sind. Je höher der Grad an erwünschter Homogenität zwischen der Sonde und der hybridisierbaren Sequenz ist, desto höher ist auch die relative Temperatur, die verwendet werden kann. Als Resultat folgt, dass höhere relative Temperaturen dazu neigen würden, die Reaktionsbedingungen stringenter zu gestalten, während niedrigere Temperaturen dies weniger verlangen würden. Für zusätzliche Details und Erklärungen zur Stringenz von Hybridisierungsreaktionen siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995).
„Stringente Bedingungen" oder „Bedingungen hoher Stringenz" wie hierin definiert können als jene Bedingungen identifiziert werden, die: (1) geringe Ionenstärke und hohe Temperaturen für das Waschen verwenden, beispielsweise 0,015 M Natrium chlorid/0,0015 M Natriumcitrat/0,1 % Natriumdodecylsulfat bei 50 °C; (2) während der Hybridisierung ein denaturierendes Mittel verwenden, wie beispielsweise Formamid, z.B. 50 Vol.-% Formamid mit 0,1 % Rinderserumalbumin/0,1 % Ficoll/0,1 % Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bei 42 °C; oder (3) 50 % Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1 % Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardts Lösung, beschallte Lachssperma-DNA (50 μg/ml), 0,1 % SDS und 10 % Dextransulfat bei 42 °C, mit Waschschritten bei 42 °C in 0,2 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat) und 50 % Formamid bei 55 °C, gefolgt von einem Waschschritt bei hoher Stringenz bestehend aus 0,1 × SSC, das EDTA enthält, bei 55 °C, verwenden.
„Moderat stringente Bedingungen" können wie von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press (1989), beschrieben definiert werden und schließen die Verwendung von Waschlösung und Hybridisierungsbedingungen (z.B. Temperatur, Ionenstärke und % SDS) ein, die weniger stringent sind als jene, die zuvor beschrieben wurden. Ein Beispiel für moderat stringente Bedingungen ist Übernacht-Inkubation bei 37 °C in einer Lösung, umfassend: 20 % Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardts Lösung, 10 % Dextransulfat und 20 mg/ml denaturierte gescherte Lachssperma-DNA; gefolgt von Waschen der Filter in 1 × SSC bei etwa 37-50 °C. Fachleute werden erkennen, wie Temperatur, Ionenstärke usw. nach Erfordernis einzustellen sind, um Faktoren wie Sondenlänge und dergleichen anzupassen.
Die Bezeichnung „epitopmarkiert", wenn hierin verwendet, bezieht sich auf ein Hybridpolypeptid, das ein an ein „Markierungs-Polypeptid" fusioniertes PRO-Polypeptid umfasst. Das Markierungs-Polypeptid weist genug Reste auf, um ein Epitop bereitzustellen, gegen das ein Antikörper hergestellt werden kann, ist jedoch auch ausreichend kurz, dass es die Aktivität des Polypeptids, an das es fusioniert ist, nicht beeinträchtigt. Das Markierungs-Polypeptid ist vorzugsweise auch eher einmalig, sodass der Antikörper mit anderen Epitopen im Wesentlichen nicht kreuzreagiert. Ge eignete Markierungs-Polypeptide haben im Allgemeinen zumindest sechs Aminosäurenreste und üblicherweise zwischen etwa 8 und 50 Aminosäurereste (vorzugsweise zwischen etwa 10 und 20 Aminosäurereste).
Wie hierin verwendet bezieht sich die Bezeichnung „Immunoadhäsin" auf antikörperähnliche Moleküle, die die Bindungsspezifität eines heterologen Proteins (eines „Adhäsins") mit den Effektorfunktionen von konstanten Immunglobulindomänen kombinieren. Strukturell gesehen umfassen die Immunoadhäsine eine Fusion zwischen einer Aminosäuresequenz mit der erwünschten Bindungsspezifität, die sich von der Antigenerkennungs- und -bindungsstelle eines Antikörpers unterscheidet (d.h. „heterolog" ist), und der Sequenz einer konstanten Domäne eines Immunglobulins. Der Adhäsinteil eines Immunoadhäsinmoleküls ist typischerweise eine zusammenhängende Aminosäuresequenz, die zumindest die Bindungsstelle eines Rezeptors oder eines Liganden umfasst. Die Sequenz einer konstanten Domäne eines Immunglobulins im Immunoadhäsin kann aus einem Immunglobulin wie z.B. IgG-1-, IgG-2-, IgG-3- oder IgG-4-Subtypen, IgA (einschließlich IgA-1 und IgA-2), IgE, IgD oder IgM erhalten werden.
„Aktiv" oder „Aktivität" für die Zwecke hierin bezieht sich auf Form(en) eines PRO-Polypeptids, die eine biologische Aktivität von nativem oder natürlich auftretendem PRO in sich tragen, worin sich „biologische" Aktivität auf eine biologische Funktion (entweder hemmende oder stimulierende) bezieht, die durch ein natives oder natürlich vorkommendes PRO verursacht wird.
Die Bezeichnung „Antagonist" wird im weitesten Sinne verwendet und schließt jedes beliebige Molekül ein, das eine biologische Aktivität eines nativen, hierin offenbarten PRO-Polypeptids teilweise oder gänzlich blockiert, hemmt oder neutralisiert. Auf ähnliche Weise wird die Bezeichnung „Agonist" im weitesten Sinn verwendet und schließt jedes beliebige Molekül ein, das eine biologische Aktivität eines hierin offenbarten, nativen PRO-Polypeptids nachahmt. Geeignete Agonisten- oder Antagonistenmoleküle umfassen insbesondere Agonisten- oder Antagonistenantikörper oder Antikörperfragmente, Fragmente oder Aminosäuresequenzvarianten von nativen PRO-Polypeptiden, Peptiden, Antisense-Oligonucleotiden, kleinen organischen Molekülen usw. Verfahren zur Identifikation von Agonisten oder Antagonisten eines PRO-Polypeptids können das Kontaktieren eines PRO-Polypeptids mit einem Kandidatenagonisten- oder -antagonistenmolekül und das Messen einer nachweisbaren Veränderung einer oder mehrerer biologischer Aktivitäten, die normalerweise mit dem PRO-Polypeptid assoziiert umfassen.
„Antikörperfragmente" umfassen einen Abschnitt eines intakten Antikörpers, vorzugsweise die Antigenbindungs- oder variable Region des intakten Antikörpers. Beispiele für Antikörperfragmente umfassen Fab-, Fab'-, F(ab')₂- und Fv-Fragmente; Diabodies; lineare Antikörper (Zapata et al., Protein Eng. 8(10), 1057-1062 (1995)); einkettige Antikörpermoleküle; und multispezifische Antikörper, gebildet aus Antikörperfragmenten.
Papainverdau von Antikörpern produziert zwei identische Antigenbindungsfragmente, genannt „Fab"-Fragmente, jeweils mit einer einzelnen Antigen-Bindungsstelle, und ein verbleibendes „Fc"-Fragment, eine Bezeichnung, die die Fähigkeit widerspiegelt, leicht zu kristallisieren. Pepsinbehandlung ergibt ein F(ab')₂-Fragment, das zwei Antigen-kombinierende Stellen aufweist und dennoch zur Vernetzung von Antigen in der Lage ist.
„Fv" ist das minimale Antikörperfragment, das eine vollständige Antigenerkennungs- und -bindungsstelle aufweist. Diese Region besteht aus einem Dimer aus einer variablen Domäne einer schweren und einer leichten Kette in enger, nicht-kovalenter Assoziation. In dieser Konfiguration erfolgt eine Wechselwirkung zwischen den drei CDRs jeder variablen Domäne zur Definition einer Antigen-Bindungsstelle an der Oberfläche des V_H-V_L-Dimers. Gemeinsam verleihen die sechs CDRs dem Antikörper Antigen-Bindungsspezifität. Jedoch weist sogar eine einzelne variable Domäne (oder die Hälfte eines Fv, das nur drei CDRs umfasst, die für ein Antigen spezifisch sind) die Fähigkeit auf, Antigen zu erkennen und zu binden, dies jedoch bei einer geringeren Affinität als die gesamte Bindungsstelle.
Das Fab-Fragment enthält auch die konstante Domäne der leichten Kette und die erste konstante Domäne (CH1) der schweren Kette. Fab-Fragmente unterscheiden sich von Fab'-Fragmenten durch die Addition einiger weniger Reste am Carboxy-Terminus der Schwerketten-CH1-Domäne, einschließlich eines oder mehrerer Cysteine aus der Antikörper-Gelenksregion. Fab'-SH ist hierin die Bezeichnung für Fab', in dem der/die Cysteinrest(e) der konstanten Domänen eine freie Thiolgruppe aufweist/aufweisen. F(ab')₂-Antikörperfragmente wurden ursprünglich als Paare von Fab'-Fragmenten produziert, die Gelenks-Cysteine zwischen sich aufwiesen. Auch andere chemische Bindungen sind für Antikörperfragmente bekannt.
Die „leichten Ketten" von Antikörpern (Immunglobulinen) aus jeder beliebigen Wirbeltierspezies können einem oder zwei eindeutig unterscheidbaren Typen, genannt kappa und lambda, basierend auf den Aminosäuresequenzen ihrer konstanten Domänen zugeordnet werden.
Je nach Aminosäuresequenz der konstanten Domäne ihrer schweren Ketten können Immunglobuline verschiedenen Klassen zugeordnet werden. Es gibt fünf Hauptklassen von Immunglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, und mehrere von diesen können weiters in Unterklassen (Isotypen) unterteilt werden, z.B.: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA und IgA2.
Antikörper und Fragmente davon umfassen in dieser Erfindung auch „affinitätsgereifte" Antikörper, wobei ein Antikörper verändert ist, um die Aminosäuresequenz einer oder mehrerer der CDR-Regionen und/oder der Gerüstregionen zu ändern, um die Affinität des Antikörpers oder des Fragments davon für das Antigen zu ändern, an das diese binden. Affinitätsreifung kann zu einer Steigerung oder Verringerung der Affinität des gereiften Antikörpers für das Antigen in Bezug auf den Ausgangsantikörper führen. Typischerweise ist der Ausgangsantikörper ein humanisierter, menschlicher, Hybrid- oder Maus-Antikörper, und der affinitätsgereifte Antikörper weist eine höhere Affinität auf als der Ausgangsantikörper. Während des Reifungsprozesses werden einer oder mehrere der Aminosäurereste in den CDRs oder in den Gerüstregionen unter Einsatz eines beliebigen Standardverfahrens mit einem anderen Rest ausgetauscht. Geeignete Verfahren umfassen Punktmutationen unter Einsatz bekannter Kassettenmutagenese-Verfahren (Wells et al., Gene 34, 315 (1985)) oder Oligonucleotid-vermittelten Mutagenese-Verfahren (Zoller et al., Nucleic Acids Res. 10, 6487-6504 (1987)). Affinitätsreifung kann auch unter Einsatz bekannter Selektionsverfahren erfolgen, wobei zahlreiche Mutationen produziert und Mutanten mit der gewünschten Affinität basierend auf verbesserter Affinität für das Antigen oder den Liganden aus einem Pool oder einer Bibliothek von Mutanten ausgewählt werden. Bekannte Phagendisplay-Verfahren sind gut für diesen Ansatz geeignet. Siehe z.B. U.S. 5.750.373 ; U.S. 5.223.409 usw.
Menschliche Antikörper gehören ebenfalls zu den Antikörpern dieser Erfindung. Menschliche Antikörper können unter Einsatz verschiedener auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren hergestellt werden, einschließlich der Verwendung von Phagendisplay-Bibliotheken (Hoogenboom und Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)). Die Verfahren nach Cole et al. und Boerner et al. sind ebenfalls für die Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern geeigneten (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, S. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol. 147(1), 86-95 (1991); U.S. 5.750.373 ). Auf ähnliche Weise können menschliche Antikörper durch Einführen von menschlichen Immunglobulin-Loci in transgene Tiere, z.B. Mäuse, in denen endogene Immunglobulin-Gene teilweise oder komplett inaktiviert wurden, hergestellt werden. Bei einer Provokation kommt es zur Produktion eines menschlichen Antikörpers, in jeder Hinsicht sehr ähnlich wie bei Menschen, einschließlich Gen-Neuordnung, Assemblierung und Antikörper-Repertoir. Dieser Ansatz ist beispielsweise in den U.S.-Patenten Nr. 5.545.807 ; 5.545.806 ; 5.569.825 ; 5.625.126 ; 5.633.425 ; 5.661.016 und in den folgenden wissenschaftlichen Publikationen beschrieben: Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368, 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg und Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995).
„Einkettige Fv"- oder „sFv"-Antikörperfragmente umfassen die V_H- und V_L-Domänen des Antikörpers, worin diese Domänen in einer einzigen Polypeptidkette vorhanden sind. Vorzugsweise umfasst das Fv-Polypeptid weiters einen Polypeptidlinker zwischen den V_H- und V_L-Domänen, was dem sFv die Möglichkeit gibt, die erwünschte Struktur für Antigenbindung zu bilden. Einen Überblick zum Thema sFv liefert Pluckthun in The Parmacology of Monoclonal Antibodies, Bd. 113, Rosenburg & Moore (Hrsg.), Springer-Verlag, New York, 269-315 (1994).
Die Bezeichnung „Diabodies" bezieht sich auf kleine Antikörperfragmente mit zwei Antigen-Bindungsstellen, worin die Fragmente eine variable Schwerkettendomäne (V_H) verbunden mit einer variablen Leichtkettendomäne (V_L) in derselben Polypeptidkette (V_H-V_L) umfassen. Unter Verwendung eines Linkers, der zu kurz ist, um Paarung zwischen den zwei Domänen an derselben Kette zu ermöglichen, werden die Domänen gezwungen, mit den komplementären Domänen einer anderen Kette Paare zu bilden und zwei Antigen-Bindungsstellen zu schaffen. Diabodies werden ausführlicher beispielsweise in der EP 404.097 ; der WO 93/11161 ; und in Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448 (1993), beschrieben.
Ein „isolierter” Antikörper ist einer, der aus einer Komponente seiner natürlichen Umgebung identifiziert und getrennt und/oder gewonnen wurde. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die diagnostische oder therapeutische Verwendungen für den Antikörper stören würden, und umfassen gegebenenfalls Enzyme, Hormone und andere proteinhältige oder nicht-proteinhältige Gelöststoffe. In bevorzugten Ausführungsformen wird der Antikörper (1) zu einer Reinheit von über 95 Gew.-% des Antikörpers, bestimmt durch das Lowry-Verfahren, und am meisten bevorzugt zu einer Reinheit von über 99 Gew.-%, (2) zu einem ausreichenden Grad, um zumindest 15 Reste von N-terminaler oder innerer Aminosäuresequenz mittels eines Zentrifugenröhrchensequenzierers zu erhalten, oder (3) bis zur Homogenität mittels SDS-PAGE unter reduzierenden oder nichtreduzierenden Bedingungen mittels Coomassie-Blau- oder, vorzugsweise, Silberfärbung gereinigt. Ein isolierter Antikörper schließt den Antikörper in situ innerhalb rekombinanter Zellen ein, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des Antikörpers nicht vorhanden ist. Üblicherweise wird ein isolierter Antikörper jedoch durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
Das Wort „Markierung", sofern hierin verwendet, bezieht sich auf eine nachweisbare Verbindung oder Zusammensetzung, die direkt oder indirekt an den Antikörper konjugiert ist, um einen „markierten" Antikörper zu bilden. Die Markierung kann für sich allein nachweisbar sein (z.B. Radioisotopmarkierungen oder fluoreszierende Markierungen) oder kann, im Fall einer enzymatischen Markierung, eine chemische Änderung einer Substratverbindung oder -zusammensetzung katalysieren, die wiederum nachweisbar ist.
Unter „Festphase" wird eine nichtwässrige Matrix verstanden, an die der Antikörper der vorliegenden Erfindung anhaften kann. Beispiele für Festphasen, die hierzu gehören, schließen jene ein, die teilweise oder vollständig aus Glas (z.B. Controlled Pore Glass), Polysacchariden (z.B. Agarose), Polyacrylamiden, Polystyrol, Polyvinylalkohol und Siliconen gebildet sind. In bestimmten Ausführungsformen, je nach Kontext, kann die Festphase den Well einer Testplatte umfassen, in anderen ist sie eine Reinigungssäule (z.B. eine Affinitätschromatographiesäule). Diese Bezeichnung umfasst auch eine diskontinuierliche Festphase aus einzelnen Teilchen, wie z.B. jene, die im US-Patent Nr. 4.275.149 beschrieben werden.
Ein „Liposom" ist ein kleines Vesikel, das sich aus verschiedenen Typen an Lipiden, Phospholipiden und/oder Tensiden zusammensetzt und zur Zufuhr eines Wirkstoffs (wie z.B. eines PRO-Polypeptids oder Antikörpers dazu) zu einem Säugetier nützlich ist. Die Komponenten des Liposoms sind üblicherweise in einer zweischichtigen Formation angeordnet, ähnlich der Lipidanordnung biologischer Membranen.
Ein „kleines Molekül" ist hierin als ein Molekül definiert, das ein Molekulargewicht von unter etwa 500 Da aufweist. Tabelle 1
Tabelle 1 (Fortsetzung)
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Tabeele 1 (Fortsetzung)
Tabelle 1 (Fortsetzung)
Tabelle 1 (Fortsetzung)
Tabelle 1 (Fortsetzung)
Tabelle 1 (Fortsetzung)
Tabelle 2

PRO XXXXXXXXXXXXXXX (Länge = 15 Aminosäuren)

Vergleichsprotein XXXXXYYYYYYY (Länge = 12 Aminosäuren)

% Aminosäuresequenzidentität = (die Anzahl identisch übereinstimmender Aminosäurereste zwischen den zwei Polypeptidsequenzen wie durch ALIGN-2 bestimmt) dividiert durch (die Gesamtzahl an Aminosäureresten des PRO-Polypeptids) = 5 dividiert durch 15 = 33,3 % Tabelle 3

PRO XXXXXXXXXX (Länge = 10 Aminosäuren)

Vergleichsprotein XXXXXYYYYYYZZYZ (Länge = 15 Aminosäuren)

% Aminosäuresequenzidentität = (die Anzahl identisch übereinstimmender Aminosäurereste zwischen den zwei Polypeptidsequenzen wie durch ALIGN-2 bestimmt) dividiert durch (die Gesamtzahl an Aminosäureresten des PRO-Polypeptids) = 5 dividiert durch 10 = 50 % Tabelle 4

PRO-DNA NNNNNNNNNNNNNN (Länge = 14 Nucleotide)

Vergleichs-DNA NNNNNNLLLLLLLLLL (Länge = 16 Nucleotide)

% Nucleinsäuresequenzidentität = (die Anzahl identisch übereinstimmender Nucleotide zwischen den zwei Nucleinsäuresequenzen wie durch ALIGN-2 bestimmt) dividiert durch (die Gesamtzahl an Nucleotiden der PRO-DNA-Nucleinsäuresequenz) = 6 dividiert durch 14 = 42,9 % Tabelle 5

PRO-DNA NNNNNNNNNNNN (Länge = 12 Nucleotide)

Vergleichs-DNA NNNNLLLVV (Länge = 9 Nucleotide)

% Nucleinsäuresequenzidentität = (die Anzahl identisch übereinstimmender Nucleotide zwischen den zwei Nucleinsäuresequenzen wie durch ALIGN-2 bestimmt) dividiert durch (die Gesamtzahl an Nucleotiden der PRO-DNA-Nucleinsäuresequenz) = 4 dividiert durch 12 = 33,3 %
II. Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung
1. Herstellung der Polypeptide der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt neu identifizierte und isolierte Nucleotidsequenzen bereit, die für Polypeptide kodieren, die in der vorliegenden Anmeldung als PRO-Polypeptide bezeichnet werden. Insbesondere wurden cDNAs, die für verschiedene PRO-Polypeptide kodieren, identifiziert und isoliert, wie näher in den nachstehenden Beispielen offenbart wird. Es gilt anzumerken, dass Proteine, die in getrennten Expressionsdurchgängen produziert wurden, unterschiedliche PRO-Nummern verliehen bekommen können, dass jedoch die UNQ-Nummer für jede bestimmte DNA und das kodierte Protein einmalig ist und nicht geändert wird. Zur einfachen und verständlichen Darstellung werden in der vorliegenden Beschreibung das Protein, für das die hierin offenbarten nativen Volllängen-Nucleinsäuremoleküle kodieren, sowie weitere native Homologe und Varianten, die in der obigen Definition von PRO eingebunden sind, als „PRO" oder „PRO/Nummer" bezeichnet, und zwar unabhängig von ihrem Ursprung oder der Art der Herstellung.
Wie in den Beispielen nachstehend offenbart, wurden verschiedene cDNA-Klone bei der ATCC hinterlegt. Die tatsächlichen Nucleotidsequenzen dieser Klone können von Fachleuten durch Sequenzieren des hinterlegten Klons mittels Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung Standard sind, leicht bestimmt werden. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz kann aus der Nucleotidsequenz mittels Standardverfahren bestimmt werden. Für die hierin beschriebenen PRO-Polypeptide und die kodierenden Nucleinsäuren konnten die Anmelder das identifizieren, was als der Leseraster angenommen wird, wie er am besten mit der zu dem Zeitpunkt zur Verfügung stehenden Sequenzinformation identifizierbar war.
A. PRO-Polypeptide
Die nachstehende Beschreibung betrifft vorrangig die Herstellung von PRO-Polypeptid der Erfindung durch Kultivieren von Zellen, die mit einem Vektor transformiert oder transfiziert sind, der für das erfindungsgemäße PRO-Polypeptid kodierende Nucleinsäure enthält. Natürlich ist auch die Verwendung von alternativen Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, zur Herstellung des PRO-Polypeptids der Erfindung vorgesehen. Beispielsweise können die Polypeptidsequenz oder Teile davon durch direkte Peptidsynthese unter Verwendung von Festphasenverfahren hergestellt werden (siehe z.B. Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963)). In-vitro-Proteinsynthese kann unter Verwendung manueller oder automatisierter Verfahren durchgeführt werden. Automatisierte Synthese kann beispielsweise unter Verwendung eines Peptid-Synthesegeräts von Applied Biosystems (Foster City, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers erfolgen. Verschiedene Teile des erfindungsgemäßen PRO-Polypeptids können separat chemisch synthetisiert und mittels chemischer oder enzymatischer Verfahren kombiniert werden, um das Volllängen-Polypeptid zu bilden.
B. PRO-Polvpeptidvarianten
Zusätzlich zu den hierin beschriebenen Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptiden ist vorgesehen, dass PRO-Varianten hergestellt werden können. PRO-Varianten können durch Einführen geeigneter Nucleotidänderungen in die PRO-DNA und/oder durch Synthese des erwünschten PRO-Polypeptids hergestellt werden. Fachleuten wird bekannt sein, dass Aminosäurenänderungen posttranslationale Prozesse des PRO verändern können, beispielsweise Änderung der Anzahl oder Position von Glykosylierungsstellen oder Ändern der Membranverankerungs-Eigenschaften.
Variationen im nativen Volllängensequenz-PRO oder in verschiedenen Domänen des hierin beschriebenen PRO können gemacht werden, beispielsweise unter Verwendung aller Verfahren und Richtlinien für konservative und nicht-konservative Mutationen, die beispielsweise im US-Patent Nr. 5.364.934 beschrieben werden. Variationen können eine Substitution, Deletion oder Insertion von einem oder mehreren Codons sein, die für das PRO kodieren, die im Vergleich mit dem Nativsequenz-PRO zu einer Änderung der Aminosäuresequenz des PRO führen. Gegebenenfalls erfolgt diese Variation durch Substitution von zumindest einer Aminosäure mit einer beliebigen anderen Aminosäure in einer oder mehreren Domänen des PRO. Hilfestellung bei der Bestimmung, welcher Aminosäurerest insertiert, substituiert oder deletiert werden kann, ohne die erwünschte Aktivität negativ zu beeinflussen, kann durch Vergleichen der Sequenz des PRO mit jener von homologen bekannten Proteinmolekülen und durch Minimieren der Anzahl an Aminosäuresequenzänderungen in Regionen hoher Homologie gefunden werden. Aminosäuresubstitutionen können durch Ersetzen einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften, beispielsweise durch Ersetzen eines Leucins mit einem Serin, d.h. durch konservative Aminosäureersetzungen, entstehen.
Insertionen oder Deletionen können gegebenenfalls im Bereich von etwa 1 bis 5 Aminosäuren liegen. Die zugelassene Variation kann durch systematisches Durchführen von Insertionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren in die Sequenz und Testen der resultierenden Varianten auf Aktivität, die die Volllängen- oder reife native Sequenz zeigt, bestimmt werden.
PRO-Polypeptidfragmente werden hierin bereitgestellt. Solche Fragmente können am N-Terminus oder C-Terminus trunkiert sein, oder ihnen können, beispielsweise im Vergleich zu einem Volllängennativprotein, innen gelegene Reste fehlen. Bestimmten Fragmenten fehlen Aminosäurereste, die für eine erwünschte biologische Aktivität des PRO-Polypeptids nicht essenziell sind.
PRO-Fragmente können durch jede beliebige Anzahl an herkömmlichen Verfahren hergestellt werden. Erwünschte Peptidfragmente können chemisch synthetisiert werden. Ein alternativer Ansatz umfasst die Bildung von PRO-Fragmenten durch enzymatischen Verdau, z.B. durch Behandlung des Proteins mit einem Enzym, das bekannt dafür ist, Proteine an Stellen zu spalten, die durch bestimmte Aminosäurereste definiert sind, oder durch Verdau der DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen und Isolieren des erwünschten Fragments. Wiederum ein anderes, nützliches Verfahren umfasst das Isolieren und Amplifizieren eines DNA-Fragments, das für ein erwünschtes Polypeptidfragment kodiert, durch Polymerasekettenreaktion (PCR). Oligonucleotide, die die erwünschten Termini des DNA-Fragments definieren, werden an den 5'- und 3'-Primern in der PCR verwendet. Vorzugsweise teilen PRO-Polypeptidfragmente zumindest eine biologische und/oder immunologische Aktivität mit dem hierin offenbarten nativen PRO-Polypeptid.

In besonderen Ausführungsformen sind konservative Substitutionen von Interesse in Tabelle 6 unter der Überschrift „Bevorzugte Substitutionen" gezeigt. Resultieren solche Substitutionen in einer Veränderung der biologischen Aktivität, so werden mehr substanzielle Veränderungen, die in Tabelle 6 als „Beispielhafte Substitutionen" bezeichnet sind oder wie nachstehend unter Verweis auf Aminosäureklassen noch näher beschrieben wird, eingeführt und die Produkte gescreent. Tabelle 6

Ursprünglicher	Beispielhafte	Bevorzugte
Rest	Substitutionen	Substitutionen

Ala (A)	val; leu; ile	val
Arg (R)	lys; gln; asn	lys
Asn (N)	gln; his; lys; arg	gln
Asp (D)	glu	glu
Cys (C)	ser	ser
Gln (Q)	asn	asn
Glu (E)	asp	asp
Gly (G)	pro; ala	ala
His (H)	asn; gln; lys; arg	arg
Ile (I)	leu; val; met; ala; phe;
	Norleucin	leu
Leu (L)	Norleucin; ile; val;
	met; ala; phe	ile
Lys (K)	arg; gln; asn	arg
Met (M)	leu; phe; ile	leu
Phe (F)	leu; val; ile; ala; tyr	leu
Pro (P)	ala	ala
Ser (S)	thr	thr
Thr (T)	ser	ser
Trp (W)	tyr; phe	tyr
Tyr (Y)	trp; phe; thr; ser	phe
Val (V)	ile; leu; met; phe;
	ala; Norleucin	leu

Wesentliche Modifikationen in Funktion oder immunologischer Identität des PRO-Polypeptids erfolgen durch Selektieren von Substitutionen, die sich in ihrer Wirkung auf die Aufrechterhaltung (a) der Struktur der Polypeptidhauptkette im Bereich der Substitution, beispielsweise in Form einer Faltblatt- oder Helixkonformation, (b) der Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Target-Stelle oder (c) des Volumens der Seitenkette signifikant unterscheiden. Natürlich vorkommende Reste werden auf Grundlage gemeinsamer Seitenketteneigenschaften in die folgenden Gruppen aufgeteilt:

(1) hydrophob: Norleucin, met, ala, val, leu, ile;
(2) neutral hydrophil: cys, ser, thr;
(3) sauer: asp, glu;
(4) basisch: asn, gln, his, lys, arg;
(5) Reste, die Kettenausrichtung beeinflussen: gly, pro; und
(6) aromatisch: trp, tyr, phe.

Nicht-konservative Substitutionen erfordern den Austausch eine Mitglieds einer dieser Klassen gegen eine andere Klasse. Solche substituierten Reste können auch in die konservativen Substitutionsstellen oder, noch bevorzugter, in die verbleibenden (nicht-konservierten) Stellen eingeführt werden.
Die Variationen können unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren, wie beispielsweise Oligonucleotid-vermittelter (ortsgerichteter) Mutagenese, Alaninscanning und PCR-Mutagenese, gebildet werden. Ortsgerichtete Mutagenese [Carter et al., Nucl. Acids Res. 13, 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10, 6487 (1987)], Kassettenmutagenese [Wells et al., Gene 34, 315 (1985)], Restriktionsselektionsmutagenese [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317, 415 (1986)] oder andere bekannte Verfahren können an der klonierten DNA durchgeführt werden, um die PRO-DNA-Variante zu bilden.
Scanning-Aminosäureanalyse kann auch verwendet werden, um eine oder mehrere Aminosäuren gemeinsam mit einer zusammenhängenden Sequenz zu identifizieren. Zu den bevorzugten Scanning-Aminosäuren zählen relativ kleine, neutrale Aminosäuren. Solche Aminosäuren schließen Alanin, Glycin, Serin und Cystein ein. Alanin ist typischerweise eine bevorzugte Scanning-Aminosäure in dieser Gruppe, da es die Seitenkette über den β-Kohlenstoff hinaus eliminiert und weniger wahrscheinlich die Hauptkettenkonformation der Variante verändert [Cunningham & Wells, Science 244, 1081-1085 (1989)]. Typischerweise wird ebenso Alanin bevorzugt, da es die häufigste Aminosäure ist. Weiters wird es häufig sowohl an verborgenen als auch an freiliegenden Positionen gefunden [Creighton, The Proteins (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol. 150, 1 (1976)]. Ergibt Alaninsubstitution keine adäquaten Mengen an Varianten, so kann eine isoterische Aminosäure verwendet werden.
C. Modifikationen von PRO
Kovalente Modifikationen von PRO sind im Schutzumfang dieser Erfindung enthalten. Ein Typ von kovalenter Modifikation umfasst das Umsetzen gerichteter Aminosäurereste eines PRO-Polypeptids mit einem organischen derivatisierenden Mittel, das in der Lage ist, mit ausgewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten des PRO zu reagieren. Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist nützlich, beispielsweise zum Vernetzen von PRO mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder -oberfläche zur Verwendung im Verfahren zur Reinigung von Anti-PRO-Antikörpern und umgekehrt. Üblicherweise verwendete Vernetzer umfassen z.B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, einschließlich Disuccinimidylester, wie z.B. 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), bifunktionelle Maleinimide wie z.B. Bis-N-maleinimido-1,8-octan, und Mittel wie z.B. Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat.
Andere Modifikationen umfassen Desamidierung von Glutaminyl- und Asparaginylresten zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten, Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxygruppen von Seryl- oder Threonylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 79-86 (1983)], Acetylierung des N-terminalen Amins und Amidierung jeder beliebigen C-terminalen Carboxylgruppe.
Eine andere Art kovalenter Modifikation des PRO-Polypeptids, die in den Schutzumfang dieser Erfindung fällt, umfasst das Ändern des nativen Glykosylierungsmusters des Polypeptids. „Ändern des nativen Glykosylierungsmusters" bedeutet für die vorliegenden Zwecke die Deletion von einer oder mehreren Kohlenhydratgruppierungen, die in Nativsequenz-PRO zu finden sind (entweder durch Entfernen der zugrundeliegenden Glykosylierungsstelle oder durch Deletion der Glykosylierung durch chemische und/oder enzymatische Mittel), und/oder das Addieren einer oder mehrerer Glykosylierungsstellen, die im Nativsequenz-PRO nicht zu finden sind. Darüber hinaus bindet diese Bezeichnung auch qualitative Änderungen an der Glykosylierung der nativen Proteine ein, einschließlich einer Änderung der Beschaffenheit und der Anteile der verschiedenen vorhandenen Kohlenhydratgruppierungen.
Das Hinzufügen von Glykosylierungsstellen zum PRO-Polypeptid kann durch Ändern der Aminosäuresequenz erfolgen. Die Änderung kann beispielsweise durch die Addition von einem oder mehreren oder die Substitution durch einen oder mehrere Serin- oder Threoninreste(n) zum oder am Nativsequenz-PRO (für O-gebundene Glykosylierungsstellen) durchgeführt werden. Die PRO-Aminosäuresequenz kann gegebenenfalls durch Änderungen auf DNA-Niveau geändert werden, insbesondere durch Mutation der DNA, die für das PRO-Polypeptid kodiert, an präselektierten Basen, sodass Codons gebildet werden, die zu den erwünschten Aminosäuren translatieren.
Ein anderes Mittel zur Steigerung der Anzahl an Kohlenhydratgruppierungen am PRO-Polypeptid ist chemisches oder enzymatisches Binden von Glykosiden an das Polypeptid. Solche Verfahren werden auf dem Gebiet der Erfindung, z.B. in der WO 87/05330 , veröffentlicht am 11. September 1987, und in Aplin & Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 259-306 (1981), beschrieben.
Das Entfernen von Kohlenhydratgruppierungen, die am PRO-Polypeptid vorhanden sind, kann chemisch oder enzymatisch oder durch Mutationssubstitutionen von Co dons, die für Aminosäurereste kodieren, die als Targets für Glykosylierung dienen, durchgeführt werden. Chemische Deglykosylierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und sind beispielsweise in Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987), und Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981), beschrieben. Enzymatische Spaltung von Kohlenhydratgruppierungen an Polypeptiden kann durch die Verwendung einer Vielzahl an Endo- und Exo-Glykosidasen erreicht werden, wie von Thotakura et al., in: Meth. Enzymol. 138, 350 (1987), beschrieben wird.
Eine andere Art von kovalenter Modifikation von PRO umfasst das Binden des PRO-Polypeptids an eines einer Vielzahl nicht-proteinhaltiger Polymere, z.B. Polyethylenglykol (PEG), Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, auf die Art und Weise, die in den US-Patenten Nr. 4.640.835 ; 4.496.689 ; 4.301.144 ; 4.670.417 ; 4.791.192 oder 4.179.337 beschrieben wird.
Das PRO der vorliegenden Erfindung kann auch auf eine Weise modifiziert werden, dass ein Hybridmolekül gebildet wird, das PRO, fusioniert an ein anderes, heterologes Polypeptid oder eine andere, heterologe Aminosäuresequenz, umfasst.
In einer Ausführungsform umfasst solch ein Hybridmolekül eine Fusion des PRO mit einem Markierungspolypeptid, das ein Epitop bereitstellt, an das ein Anti-Markierungs-Antikörper selektiv binden kann. Die Epitopmarkierung wird im Allgemeinen an den Amino- oder Carboxyterminus des PRO platziert. Die Gegenwart solcher Epitop-markierten Formen des PRO kann unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Markierungs-Polypeptid nachgewiesen werden. Die Bereitstellung der Epitopmarkierung ermöglicht es somit auch, dass das PRO leicht mittels Affinitätsreinigung unter Verwendung eines Anti-Markierungs-Antikörpers oder eines anderen Typs von Affinitätsmatrize, die an die Epitopmarkierung bindet, gereinigt werden kann. Verschiedene Markierungspolypeptide und ihre jeweiligen Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Beispiele umfassen Poly-Histidin-(poly-his-)oder Poly-Histidin-Glycin-(poly-his-gly-)Markierungen; das flu-HA-Markierungspolypeptid und seinen Antikörper 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159-2165 (1988)]; die c-myc-Markierung und die Antikörper 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 und 9E10 hierzu [Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5, 3610-3616 (1985)]; und die Herpes-Simplex-Virus-Glykoprotein-D-(-gD-)Markierung und ihren Antikörper [Paborsky et al., Protein Engineering 3(6), 547-553 (1990)]. Andere Markierungspolypeptide umfassen das Flag-Peptid [Hopp et al., Bio Technology 6, 1204-1210 (1988)]; das KT3-Epitoppeptid [Martin et al., Science 255, 192-194 (1992)]; ein α-Tubulinepitoppeptid [Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163-15166 (1991)]; und die T7-Gen-10-Proteinpeptidmarkierung [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6393-6397 (1990)].
In einer alternativen Ausführungsform kann das Hybridmolekül eine Fusion des PRO mit einem Immunglobulin oder einer bestimmten Region eines Immunglobulins umfassen. Für eine zweiwertige Form des Hybridmoleküls (auch als ein „Immunoadhäsin" bezeichnet) könnte solch eine Fusion zur Fc-Region eines IgG-Moleküls gebildet sein. Die Ig-Fusionen umfassen vorzugsweise die Substitution einer löslichen Form (deletierte oder inaktivierte Transmembrandomäne) eines PRO-Polypeptids anstelle von zumindest einer variablen Region innerhalb eines Ig-Moleküls. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Immunglobulinfusion die Gelenks-, CH2- und CH3- oder die Gelenks-, CH1-, CH2- und CH3-Regionen eines IgG1-Moleküls. Für weitere Information zur Herstellung von Immunglobulinfusionen siehe auch US-Patent Nr. 5.428.130 , ausgegeben am 27. Juni 1995.
D. Herstellung von PRO
Die nachstehende Beschreibung betrifft vorrangig die Herstellung von PRO durch Kultivieren von Zellen, die mit einem PRO-Nucleinsäure-hältigen Vektor transformiert oder transfiziert sind. Natürlich wird erwogen, dass alternative Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, zur Herstellung von PRO verwendet werden können. Beispielsweise kann die PRO-Sequenz oder Teile davon durch direkte Peptidsynthese unter Verwendung von Festphasenverfahren hergestellt werden [siehe z.B. Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963)]. In-vitro- Proteinsynthese kann unter Verwendung manueller oder automatisierter Verfahren durchgeführt werden. Automatisierte Synthese kann beispielsweise unter Verwendung eines Peptid-Synthesegeräts von Applied Biosystems (Foster City, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers erfolgen. Verschiedene Teile des PRO können separat chemisch synthetisiert und mittels chemischer oder enzymatischer Verfahren kombiniert werden, um das Volllängen-PRO zu bilden.
1. Isolation von für PRO kodierender DNA
DNA, die für PRO kodiert, kann aus einer cDNA-Bibliothek gewonnen werden, die aus Gewebe hergestellt wird, von dem angenommen wird, dass es die PRO-mRNA aufweist und diese auf einem nachweisbaren Niveau exprimiert. Demgemäß kann menschliche PRO-DNA leicht aus einer cDNA-Bibliothek gewonnen werden, die aus menschlichem Gewebe hergestellt wird, wie es auch in den Beispielen beschrieben ist. Das für PRO kodierende Gen kann auch aus einer genomischen Bibliothek oder mittels bekannter synthetischer Verfahren (z.B. automatisierter Nucleinsäuresynthese) gewonnen werden.
Bibliotheken können mit Sonden (wie Antikörpern gegen das PRO oder Oligonucleotide mit zumindest etwa 20-80 Basen) gescreent werden, deren Zweck es ist, das Gen von Interesse oder das durch dieses Gen kodierte Protein zu identifizieren. Screening der cDNA- oder genomischen Bibliothek mit der ausgewählten Sonde kann unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt werden, die z.B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laborstory Press (1989)), beschrieben sind. Ein alternatives Mittel zum Isolieren des für PRO kodierenden Gens ist die Verwendung der PCR-Methode [Sambrook et al., s.o.; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laborstory Manual (Gold Spring Harbor Laborstory Press (1995))].
Die nachstehenden Beispiele beschreiben Verfahren zum Screenen einer cDNA-Bibliothek. Die als Sonden ausgewählten Oligonucleotidsequenzen sollten eine ausreichende Länge aufweisen und ausreichend eindeutig sein, sodass falsche Positive minimiert werden. Das Oligonucleotid ist vorzugsweise so markiert, dass es durch Hybridisierung an DNA in der zu screenenden Bibliothek nachgewiesen werden kann. Markierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen die Verwendung von radioaktiven Markierungen wie z.B. von ³²P-markiertem ATP, Biotinylierung oder Enzymmarkierung. Hybridisierungsbedingungen, einschließlich moderater Stringenz und hoher Stringenz, sind in Sambrook et al., s.o., beschrieben.
Sequenzen, die in solchen Bibliotheks-Screening-Verfahren identifiziert werden, können mit anderen bekannten Sequenzen, die in öffentlichen Datenbanken wie z.B. GenBank oder anderen privaten Sequenzdatenbanken hinterlegt und zugänglich sind, verglichen und abgeglichen werden. Sequenzidentität (entweder auf Niveau der Aminosäuren oder der Nucleotide) innerhalb definierter Regionen des Moleküls oder über die gesamte Volllängensequenz hinweg kann mittels auf dem Gebiet bekannter Verfahren und wie hierin beschrieben bestimmt werden.
Nucleinsäure mit Protein-kodierender Sequenz kann durch Screenen ausgewählter cDNA- oder genomischer Bibliotheken unter Verwendung der hierin zum ersten Mal offenbarten, abgeleiteten Aminosäuresequenz und, sofern erforderlich, unter Verwendung herkömmlicher Primerextensionsverfahren wie in Sambrook et al., s.o., beschrieben, um Vorläufer und Verarbeitungs-Zwischenprodukte von mRNA zu detektieren, die eventuell nicht in cDNA revers-transkribiert worden sind, gewonnen werden.
2. Selektion und Transformation von Wirtszellen
Wirtszellen werden mit Expressions- oder Kloniervektoren, die hierin beschrieben werden, zur PRO-Produktion transfiziert oder transformiert und in herkömmlichem Nährmedium kultiviert, das zum Induzieren von Promotoren, zur Selektion von Transformanten oder Amplifikation der Gene, die für die erwünschten Sequenzen kodieren, geeignet modifiziert ist. Die Kulturbedingungen, wie z.B. Medium, Temperatur, pH und dergleichen, können von Fachleuten ohne übermäßiges Experimentie ren ausgewählt werden. Im Allgemeinen können Prinzipien, Arbeitsvorschriften und praktische Techniken zur Maximierung der Produktivität von Zellkulturen in Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler (Hrsg.), IRL Press (1991), und in Sambrook et al., s.o., gefunden werden.
Verfahren zur Transfektion eukaryotischer Zellen und Transformation prokaryotischer Zellen sind durchschnittlichen Fachleuten bekannt, z.B. CaCl₂-Verfahren, Ca-PO₄-Verfahren, Liposom-vermitteltes Verfahren und Elektroporation. Je nach verwendeten Wirtszellen erfolgt die Transformation unter Verwendung von Standardverfahren, die für die entsprechenden Zellen geeignet sind. Die Calciumbehandlung mittels Calciumchlorid, wie in Sambrook et al., s.o., beschrieben, oder Elektroporation wird im Allgemeinen für Prokaryoten verwendet. Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transformation bestimmter Pflanzenzellen verwendet, wie Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und die WO 89/05859 , veröffentlicht am 29. Juni 1989, beschreiben. Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände kann das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren von Graham & van der Eb, Virology 52, 456-457 (1978), verwendet werden. Allgemeine Aspekte von Säugetierzellen-Wirtssystemtransfektionen werden im US-Patent Nr. 4.399.216 beschrieben. Transformationen in Hefe werden typischerweise gemäß dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76, 3829 (1979), durchgeführt. Es können jedoch auch andere Verfahren zum Einführen von DNA in Zellen, wie beispielsweise Kernmikroinjektion, Elektroporation, bakterielle Protoplastenfusion mit intakten Zellen, oder Polykationen, z.B. Polybren, Polyornithin, verwendet werden. Für verschiedene Verfahren zur Transformation von Säugetierzellen siehe Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527-537 (1990), und Mansour et al., Nature 336, 348-352 (1988).
Geeignete Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren der DNA in die bzw. den Vektoren hierin schließen Prokaryoten-, Hefe-, oder höhere Eukaryotenzellen ein. Geeignete Prokaryoten umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Eubakterien, wie z.B. gram-negative oder gram-positive Organismen, beispielsweise Enterobacteriaceae wie z.B. E. coli. Verschiedene E.-coli-Stämme sind öffentlich erhältlich, wie z.B. E.-coli-K12-Stamm MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); E.-coli-Stamm W3110 (ATCC 27.325) und K5 772 (ATCC 53.635). Andere geeignete prokaryotische Wirtszellen umfassen Enterobacteriaceae wie Escherichia, z.B. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, z.B. Salmonella typhimurium, Serratia, z.B. Serratia marcescans, und Shigella sowie Bacilli wie z.B. B. subtilis und B. licheniformis (z.B. B. licheniformis 41 P, offenbart in DD 266.710 , veröffentlicht am 12. April 1989), Pseudomonas, wie z.B. P. aeruginosa, und Streptomyces. Diese Beispiele stellen eine Veranschaulichung und keine Einschränkung dar. Stamm W3110 ist ein besonders bevorzugter Wirt oder Ausgangswirt, da er ein üblicher Wirtstamm für Fermentationen von DNA-Rekombinationsprodukten ist. Vorzugsweise sekretiert die Wirtszelle minimale Mengen an proteolytischen Enzymen. Beispielsweise kann Stamm W3110 modifiziert werden, um in den Genen, die für die zum Wirt endogene Proteine kodieren, eine genetische Mutation zu bewirken, wobei Beispiele für solche Wirte E. coli-W3110-Stamm 1A2, der den vollständigen Genotyp tonA aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 9E4, der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 27C7 (ATCC 55.244), der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 phoA E15 (argF-Iac)169 degP ompT kan^r aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 37D6, der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan^r aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 4084, der Stamm 37D6 mit einer nicht Kanamycin-resistenten degP-Deletionsmutation ist; und ein E.-coli-Stamm mit mutierter periplasmatischer Protease, offenbart im US-Patent Nr. 4.946.783 , ausgegeben am 7. August 1990, sind. Alternativ dazu sind In-vitro-Klonierverfahren, z.B. PCR oder andere Nucleinsäure-Polymerasereaktionen, geeignet.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben wie beispielsweise Fadenpilze oder Hefe geeignete Klonier- oder Expressionswirte für PRO-kodierende Vektoren. Saccharomyces cerevisiae ist ein üblicherweise verwendeter, niederer eukaryotischer Wirtsmikroorganismus. Andere umfassen Schizosaccharomyces pombe (Beach & Nurse, Nature 290, 140 (1981); EP 139.383 , veröffentlicht am 2. Mai 1985); Kluyveromyces-Wirte ( US-Patent Nr. 4.943.529 ; Fleer et al., Bio/Technology 9, 968-975 (1991)) wie z.B. K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154(2), 737-742 (1983)), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology 8, 135 (1990)), K. thermotolerans und K. marxianus; yarrowia ( EP 402.226 ); Pichia pastoris ( EP 183.070 ; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265-278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia ( EP 244.234 ); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5339-5363 (1979)); Schwanniomyces wie z.B. Schwanniomyces occidentalis ( EP 394.538 , veröffentlicht am 31. Oktober 1990); und Fadenpilze wie z.B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium ( WO 91/00357 , veröffentlicht am 10. Januar 1991) und Aspergillus-Wirte wie z.B. A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284-289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470-1474 (1984)) und A. niger (Kelly & Hynes, EMBO J. 4, 475-479 (1985)). Methylotrophe Hefen sind hierin geeignet und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Hefe, die in der Lage ist, auf Methanol zu wachsen, ausgewählt aus den Gattungen von Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis und Rhodotorula. Eine Liste spezifischer Spezies, die für diese Klasse von Hefe beispielhaft sind, ist in C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982), zu finden.
Geeignete Wirtszellen für die Expression von glykosyliertem PRO werden von multizellulären Organismen abgeleitet. Beispiele für Wirbellosenzellen umfassen Insektenzellen wie z.B. Drosophila S2 und Spodoptera Sf9 sowie Pflanzenzellen. Beispiele für nützliche Säugetierwirtszelllinien umfassen Chinahamster-Eierstock-(CHO-) und COS-Zellen. Spezifischere Beispiele umfassen Affennieren-CVl-Linie, transformiert durch SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche embryonale Nierenlinie (293 oder 293-Zellen, subkloniert zum Wachstum in Suspensionskultur, Graham et al., J. Gen Virol. 36, 59 (1977)); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub & Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243-251 (1980)); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); und Maus-Brusttumor (MMT 060562, ATCC CCL51). Die Auswahl der geeigneten Wirtszelle wird als im Bereich der Erfindung liegend erachtet.
3. Auswahl und Verwendung eines replizierbaren Vektors
Die Nucleinsäure (z.B. cDNA oder genomische DNA), die für PRO kodiert, kann zum Klonieren (Amplifikation der DNA) oder zur Expression in einen replizierbaren Vektor insertiert werden. Verschiedene Vektoren sind öffentlich erhältlich. Der Vektor kann beispielsweise in Form eines Plasmids, Cosmids, viralen Partikels oder Phagen vorliegen. Die geeignete Nucleinsäuresequenz kann in den Vektor mittels zahlreicher verschiedener Verfahren insertiert werden. Im Allgemeinen wird DNA in (eine) geeignete Restriktionsendonucleasestelle(n) mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren insertiert. Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht beschränkt auf, eine oder mehrere Signalsequenzen, einen Replikationsursprung, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancer-Element, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz. Bei der Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere dieser Komponenten enthalten, werden herkömmliche Ligationsverfahren eingesetzt, die Fachleuten bekannt sind.
Das PRO kann rekombinant nicht nur direkt, sondern auch als ein Fusionspolypeptid mit einem heterologen Polypeptid hergestellt werden, das eine Signalsequenz oder ein anderes Polypeptid mit einer spezifischen Spaltungsstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids sein kann. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors oder kann ein Teil der für PRO kodierenden DNA sein, die in den Vektor insertiert wird. Die Signalsequenz kann eine prokaryotische Signalsequenz, ausgewählt beispielsweise aus der aus alkalischer Phosphatase, Penicillinase, Ipp oder wärmestabilen Enterotoxin-II-Leadern bestehenden Gruppe, sein. Zur Hefesekretion kann die Signalsequenz z.B. der Hefe-Invertaseleader, α-Faktorleader (einschließlich Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktorleader, wobei Letzterer im US-Patent Nr. 5.010.182 beschrieben wird) oder saure Phosphataseleader, der C.-albicans-Glucoamylaseleader ( EP 362.179 , veröffentlicht am 4. April 1990) oder das in der WO 90/13646 , veröffentlicht am 15. November 1990, beschriebene Signal sein. Zur Säugetierzellexpression können Säugetiersignalsequenzen verwendet werden, um Sekretion des Proteins zu steuern, wie beispielsweise Signalsequenzen aus sekretierten Polypeptiden derselben oder einer verwandten Spezies sowie virale Sekretionsleader.
Sowohl Expressions- als auch Kloniervektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es ermöglicht, dass sich der Vektor in einer oder mehreren der ausgewählten Wirtszellen repliziert. Solche Sequenzen sind für zahlreiche verschiedene Bakterien, Hefen und Viren bekannt. Der Replikationsursprung aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten gram-negativen Bakterien geeignet, der 2μ-Plasmidursprung ist für Hefe geeignet, und verschiedene virale Ursprünge (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für Kloniervektoren in Säugetierzellen nützlich.
Expressions- und Kloniervektoren enthalten typischerweise ein Selektionsgen, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, verleihen, (b) auxotrophe Mängel beheben oder (c) essenzielle Nährstoffe, die aus komplexem Medium nicht erhältlich sind, zuführen, z.B. das für D-Alaninracemase für Bacilli kodierende Gen.
Ein Beispiel für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind jene, die die Identifikation von Zellen ermöglichen, die in der Lage sind, die für PRO kodierende Nucleinsäure aufzunehmen, wie z.B. DHFR oder Thymidinkinase. Eine geeignete Wirtszelle ist, sofern Wildtyp-DHFR verwendet wird, die CHO-Zelllinie, der DHFR-Aktivität fehlt und die wie von Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), beschrieben hergestellt und vermehrt wird. Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trp1-Gen, das im Hefeplasmid YRp7 vorhanden ist [Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)]. Das trp1-Gen liefert einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, beispielsweise ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 [Jones, Genetics 85, 12 (1977)].
Expressions- und Kloniervektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der operabel an die für PRO kodierende Nucleinsäuresequenz gebunden ist, um mRNA- Synthese zu steuern. Promotoren, die durch zahlreiche verschiedene potenzielle Wirtszellen erkannt werden, sind bekannt. Promotoren, die zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignet sind, umfassen die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme [Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)], alkalische Phosphatase, ein Tryptophan-(trp-) Promotorsystem [Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP 36.776] und Hybridpromotoren wie z.B. den tac-Promotor [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25 (1983)]. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten auch eine Shine-Dalgarno-(S.D.-)Sequenz, die operabel an die für PRO kodierende DNA gebunden ist.
Beispiele für geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase [Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)] oder andere glykolytische Enzyme [Ness et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)] wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren sind und den zusätzlichen Vorteil haben, dass ihre Transkription durch Wachstumsbedingungen gesteuert wird, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, degradative Enzyme, die mit Stickstoffmetabolismus assoziiert sind, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei Hefeexpression werden näher in EP 73.657 beschrieben.
PRO-Transkription aus Vektoren in Säugetier-Wirtszellen wird beispielsweise durch Promotoren gesteuert, die aus den Genomen von Viren wie z.B. Polyomavirus, Geflügelpockenvirus ( UK 2.211.504 , veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie z.B. Adenovirus 2), Rinderpapillomavirus, Vogel-Sarkomvirus, Zytomegalie-Virus, ei nem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und Affenvirus 40 (SV40), aus heterologen Säugetierpromotoren, z.B. dem Actinpromotor oder einem Immunglobulinpromotor, und aus Hitzeschock-Promotoren gewonnen werden, vorausgesetzt, solche Promotoren sind mit den Wirtszellsystemen kompatibel.
Transkription einer DNA, die für das PRO kodiert, durch höhere Eukaryoten kann durch Insertieren einer Enhancersequenz in den Vektor gesteigert werden. Enhancer sind cis-wirkende Elemente von DNA, üblicherweise etwa mit 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor so wirken, dass seine Transkription gesteigert wird. Zahlreiche Enhancersequenzen sind aus Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise wird jedoch ein Enhancer aus einem eukaryotischen Zellvirus verwendet. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer an der späten Seite des Replikationsursprungs (bpp 100-270), den frühen Zytomegalie-Virus-Promotorenhancer, den Polyoma-Enhancer an der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer. Der Enhancer kann in den Vektor an einer Position 5' oder 3' zur PRO-Kodiersequenz gespleißt werden, wird jedoch vorzugsweise an einer Stelle 5' vom Promotor angeordnet.
Expressionsvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-, Tier-, Mensch- oder kernhaltigen Zellen aus anderen multizellulären Organismen) verwendet werden, enthalten auch Sequenzen, die zum Abschluss von Transkription und zur Stabilisierung der mRNA erforderlich sind. Solche Sequenzen sind üblicherweise aus den untranslatierten 5'-, und gegebenenfalls 3'-, Regionen eukaryotischer oder viraler DNAs oder cDNAs erhältlich. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente im untranslatierten Abschnitt der für PRO kodierenden mRNA transkribiert werden.
Weitere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Adaption an die Synthese von PRO in rekombinanter Wirbeltierzellkultur geeignet sind, werden in Gething et al., Nature 293, 620-625 (1981); Mantei et al., Nature 281, 40-46 (1979); EP 117.060 ; und EP 117.058 beschrieben.
4. Detektion von Genexpression
Genexpression kann in einer Probe direkt gemessen werden, z.B. durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting zur Quantifizierung der Transkription von mRNA [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201-5205 (1980)], Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer geeigneten markierten Sonde, basierend auf den hierin bereitgestellten Sequenzen. Alternativ dazu können Antikörper verwendet werden, die spezifische Duplexe, einschließlich DNA-Duplexen, RNA-Duplexen und DNA-RNA-Hybridduplexen oder DNA-Protein-Duplexen, erkennen. Die Antikörper wiederum können markiert sein, und der Test kann durchgeführt werden, wenn der Duplex an eine Oberfläche gebunden ist, sodass bei Bildung von Duplex an der Oberfläche die Gegenwart von Antikörper, der an den Duplex gebunden ist, nachgewiesen werden kann.
Genexpression kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren, wie beispielsweise immunhistochemisches Färben von Zellen oder Gewebeschnitten und Tests von Zellkultur oder Körperflüssigkeiten, gemessen werden, um die Expression von Genprodukt direkt zu quantifizieren. Antikörper, die für immunhistochemisches Färben und/oder Testen von Probenflüssigkeiten nützlich sind, können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in jedem beliebigen Säugetier hergestellt werden. Auf einfache Weise können die Antikörper gegen ein Nativsequenz-PRO-Polypeptid oder gegen ein synthetisches Peptid, basierend auf den hierin bereitgestellten DNA-Sequenzen, oder gegen exogene Sequenz, fusioniert an PRO-DNA und für ein spezifisches Antikörperepitop kodierend, hergestellt werden.
5. Reinigung von Polypeptid
Formen von PRO können aus Kulturmedium oder aus Wirtszelllysaten gewonnen werden. Sofern membrangebunden, kann es unter Verwendung einer geeigneten Tensidlösung (z.B. Triton-X 100) oder durch enzymatische Spaltung aus der Membran freigesetzt werden. Zellen, die zur Expression von PRO verwendet werden, können mittels verschiedener physikalischer oder chemischer Mittel, wie z.B. Gefrier- Auftau-Zyklieren, Beschallung, mechanischer Aufbruch oder Zelllysemittel, aufgeschlossen werden.
Es kann erwünscht sein, PRO aus rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu reinigen. Die folgenden Verfahren sind Beispiele für geeignete Reinigungsverfahren: Fraktionierung an einer Ionenaustauschsäule; Ethanolfällung; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie an Siliciumdioxid oder an einem Kationenaustauschharz wie z.B. DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatfällung; Gelfiltration unter Verwendung von beispielsweise Sephadex G-75; Protein-A-Sepharose-Säulen zur Entfernung von Verunreinigungen wie IgG; und Metallchelator-Säulen zur Bindung von Epitop-markierten Formen des PRO. Verschiedene Verfahren von Proteinreinigung können verwendet werden, und solche Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und beispielsweise in Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982), beschrieben. Der/Die ausgewählte(n) Reinigungsschritt(e) hängen beispielsweise von der Beschaffenheit des verwendeten Herstellungsverfahrens und dem bestimmten hergestellten PRO ab.
E. Gewebeverteilung
Die Position von Geweben, die PRO-Polypeptide der Erfindung exprimieren, kann durch Bestimmung von mRNA-Expression in verschiedenen menschlichen Geweben identifiziert werden. Die Position solcher Gene stellt Informationen darüber bereit, welche Gewebe am wahrscheinlichsten von der Stimulierung und Hemmung von Aktivitäten der PRO-Polypeptide der Erfindung betroffen sind. Die Position eines Gens in einem spezifischen Gewebe stellt auch Gewebeproben für die nachstehend erläuterten Aktivitätsblockierungstests bereit.
Wie oben erwähnt kann die Genexpression in verschiedenen Geweben durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting zur Quantifizierung der Transkription von mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201-5205 (1980)), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung gemessen werden, wobei eine passend markierte Sonde eingesetzt wird, basierend auf den hierin bereitgestellten Sequenzen. Alternativ dazu können Antikörper eingesetzt werden, die spezifische Duplexe, einschließlich DNA-Duplexen, RNA-Duplexen und DNA-RNA-Hybrid-Duplexen oder DNA-Protein-Duplexen, erkennen können.
Die Genexpression in verschiedenen Geweben kann alternativ dazu auch mittels immunologischer Verfahren gemessen werden, wie z.B. durch immunhistochemisches Färben von Gewebeschnitten und Testen einer Zellkultur oder Körperflüssigkeit, um die Expression des Genprodukts direkt zu quantifizieren. Antikörper, die für immunhistochemisches Färben und/oder Testen von Flüssigkeitsproben geeignet sind, können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in jedem beliebigen Säugetier gebildet werden. Am besten werden die Antikörper gegen eine Nativsequenz eines PRO-Polypeptids der Erfindung oder gegen ein synthetisches Peptid auf Basis von DNA-Sequenzen, die für das PRO-Polypeptid der Erfindung kodieren, oder gegen eine exogene Sequenz, die an eine DNA fusioniert ist, welche für ein PRO-Polypeptid der Erfindung kodiert und für ein spezifisches Antikörper-Epitop kodiert, gebildet. Allgemeine Verfahren zur Bildung von Antikörpern und spezielle Protokolle für Northern-Blotting und In-situ-Hybridisierung sind nachstehend bereitgestellt.
F. Antikörperbindungsstudien
Die Aktivität der Polypeptide der Erfindung kann weiters durch Antikörperbindungs studien verifiziert werden, in denen die Fähigkeit von Anti-PRO256-Antikörper getestet wird, die Wirkung der PRO256-Polypeptide auf Gewebezellen zu hemmen. Beispiele für Antikörper umfassen polyklonale, monoklonale, humanisierte, bispezifische und Heterokonjugat-Antikörper, deren Herstellung hierin im Folgenden beschrieben wird.
Antikörperbindungsstudien können mittels beliebiger bekannter Testverfahren, wie z.B. kompetitive Bindungstest, direkte und indirekte Sandwichtests und Immunpräzi pitationstests, durchgeführt werden. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, S. 147-158, CRC Press, Inc. (1987).
Kompetitive Bindungstests hängen von der Fähigkeit eines markierten Standards ab, mit dem Testprobenanalyt um die Bindung mit einer begrenzten Antikörpermenge zu konkurrieren. Die Zielproteinmenge in der Testprobe ist umgekehrt proportional zur Menge des Standards, die an die Antikörper gebunden wird. Um die Bestimmung der Menge des Standards, die gebunden wird, zu vereinfachen, werden die Antikörper vorzugsweise vor oder nach dem kompetitiven Vorgang unlöslich gemacht, sodass der Standard und der Analyt, die an die Antikörper gebunden sind, leicht vom Standard und Analyt getrennt werden können, die ungebunden bleiben.
Sandwichtests umfassen den Einsatz zweier Antikörper, die jeweils zur Bindung an einen anderen immunogenen Teil, oder ein anderes Epitop, des zu detektierenden Proteins in der Lage sind. In einem Sandwichtest wird der Testprobenanalyt von einem ersten Antikörper gebunden, der auf einem festen Träger immobilisiert ist, wonach ein zweiter Antikörper an den Analyten bindet, wodurch ein unlöslicher dreiteiliger Komplex gebildet wird. Seihe z.B. US-Patent Nr. 4.376.110 . Der zweite Antikörper kann selbst mit einer detektierbaren Gruppierung markiert sein (direkte Sandwichtests) oder unter Einsatz eines Antiimmunglobulin-Antikörpers gemessen werden, der mit einer detektierbaren Gruppierung markiert ist (indirekter Sandwichtest). Eine Art Sandwichtest ist beispielsweise ein ELISA-Assay, bei dem die detektierbare Gruppierung ein Enzym ist.
Bei der Immunhistochemie kann die Gewebeprobe frisch oder gefroren sein und kann in Paraffin eingebettet und mit einem Konservierungsmittel, wie z.B. Formalin, fixiert sein.
G. Zellbasierte Tests
Zellbasierte Tests und Tiermodelle für Immunerkrankungen können eingesetzt werden, um die Beziehung zwischen den hierin identifizierten Genen und Polypeptiden und der Entwicklung und Pathogenese von Immunerkrankungen genauer zu untersuchen.
Gemäß einem anderen Ansatz werden Zellen eines Zelltyps, der bekannterweise mit einer bestimmten Immunerkrankung zusammenhängt, mit den hierin beschriebenen cDNAs transfiziert, und die Fähigkeit dieser cDNAs, eine Immunfunktion zu stimulieren oder hemmen, wird analysiert. Geeignete Zellen können mit dem gewünschten Gen transfiziert werden, wonach die mit der Immunfunktion zusammenhängende Aktivität überwacht wird. Solche transfizierten Zelllinien können dann eingesetzt werden, um die Fähigkeit von poly- oder monoklonalen Antikörpern oder Antikörper-Zusammensetzungen zu testen, eine Immunfunktion zu hemmen oder zu stimulieren, beispielsweise um die T-Zell-Proliferation oder Infiltration von Entzündungszellen zu modulieren. Zellen, die mit den für die hierin identifizierten Gene kodierenden Sequenzen transfiziert sind, können weiters eingesetzt werden, um Arzneimittelkandidaten für die Behandlung von Immunerkrankungen zu identifizieren.
Außerdem können von transgenen Tieren abgeleitete Primärkulturen (wie oben beschrieben) hierin in den zellbasierten Tests eingesetzt werden, obwohl stabile Zelllinien bevorzugt sind. Verfahren zur Ableitung von kontinuierlichen Zelllinien von transgenen Tieren sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt (siehe z.B. Small et al., Mol. Cell. Biol. 5, 642-648 (1985)).
Ein geeignete zellbasierter Test ist die gemischte Lymphozytenreaktion (MLR). Current Protocols in Immunology, Unit 3.12; Hrsg. J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Marglies, E.M. Shevach, W. Strober, National Institutes of Health, veröffentlicht von John Wiley & Sons, Inc. Bei diesem Test wird die Fähigkeit einer Testverbindung, die Proliferation von aktivierten T-Zellen zu stimulieren oder zu hemmen, getestet. Eine Suspension von Responder-T-Zellen wird mit allogenen Stimulator-Zellen kultiviert, und die Proliferation von T-Zellen wird durch die Aufnahme von tritiiertem Thymidin gemessen. Dieser Test ist ein allgemeines Maß für die T-Zell-Reaktivität. Da die Mehrheit der T-Zellen auf eine Aktivierung reagieren und IL-2 produzieren, spiegeln Unterschiede in der Reaktionsbereitschaft in diesem Test teilweise Unterschiede in der IL-2-Produktion durch die reagierenden Zellen wider. Die MLR-Ergebnisse können durch einen herkömmlichen Lymphokin-(IL-2-)Detektionstest verifiziert werden. Current Protocols in Immunology, s.o., 3.15, 6.3.
Eine proliferative T-Zell-Reaktion in einem MLR-Test kann auf direkte mitogene Eigenschaften eines getesteten Moleküls oder auf eine durch ein externes Antigen induzierte Aktivierung zurückzuführen sein. Eine zusätzliche Verifizierung der T-Zell-stimulierenden Aktivität der Polypeptide der Erfindung kann mithilfe eines Costimulationstests erreicht werden. T-Zell-Aktivierung erfordert ein antigenspezifisches Signal, das durch den T-Zell-Rezeptor (TCR) vermittelt wird, und ein Costimulationssignal, das durch eine zweite Ligandenbindungswechselwirkung vermittelt wird, wie z.B. die B7(CD80, CD86)/CD28-Bindungswechselwirkung. CD28-Vernetzung steigert die Lymphokin-Sekretion durch aktivierte T-Zellen. T-Zell-Aktivierung weist sowohl negative als auch positive Kontrollen auf, und zwar durch die Bindung von Liganden, die eine negative oder positive Wirkung haben. CD28 und CTLA-4 sind verwandte Glykoproteine der Ig-Superfamilie, die an B7 bindet. CD28-Bindung an B7 hat eine positive Costimulationswirkung auf T-Zell-Aktivierung; umgekehrt hat CTLA-4-Bindung an B7 eine negative T-Zell-Deaktivierungswirkung. Chambers and Allison, Curr. Opin. Immunol. 9, 396 (1997). Schwartz, Cell 71, 1065 (1992); Linsey und Ledbetter, Annu. Rev. Immunol. 11, 191 (1993); June et al., Immunol. Today 15, 321 (1994); Jenkins, Immunity 1, 405 (1994). In einem Costimulationstest werden die PRO-Polypeptide der Erfindung auf T-Zell-Costimulations- oder -Hemmaktivität getestet.
PRO-Polypeptide der Erfindung sowie andere erfindungsgemäße Verbindungen, die Stimulatoren (Costimulatoren) von T-Zell-Proliferation und Agonisten, z.B. Agonisten-Antikörper, dafür sind, wie beispielsweise durch MLR- und Costimulationstests bestimmt, sind zweckdienlich für die Behandlung von Immunerkrankungen, die durch schlechte, suboptimale oder inadäquate Immunfunktion gekennzeichnet sind. Diese Erkrankungen werden durch Stimulation von Proliferation und Aktivierung von T-Zellen (und T-Zell-vermittelter Immunität) und Steigerung der Immunantwort in einem Säugetier durch Verabreichung einer stimulierenden Verbindung, wie z.B. der stimu lierenden Polypeptide der Erfindung, behandelt. Das stimulierende Polypeptid kann beispielsweise ein PRO256-Polypeptid oder ein Agonisten-Antikörper dafür sein.
Die direkte Verwendung einer stimulierenden Verbindung wie in der Erfindung wurde in Experimenten mit 4-IBB-Glykoprotein, einem Mitglied der Familie von Tumornekrosefaktor-Rezeptoren, das an einen Liganden (4-IBBL) bindet, der auf geprimten T-Zellen exprimiert wird, und T-Zell-Aktivierung und -Wachstum signalisiert, bestätigt. Alderson et al., J. Immunol. 24, 2219 (1994).
Die Verwendung einer agonistenstimulierenden Verbindung wurde ebenfalls in Experimenten bestätigt. Eine Aktivierung von 4-IBB durch Behandlung mit einem agonistischen Anti-4-IBB-Antikörper steigert die Auslöschung von Tumoren. Hellstrom und Hellstrom, Crit. Rev. Immunol 18, 1 (1998). Eine Immunadjuvans-Therapie zur Behandlung von Tumoren, die nachstehend genauer beschrieben ist, ist ein weiteres Beispiel für die Verwendung der erfindungsgemäßen stimulierenden Verbindungen.
Eine immunstimulierende oder -steigernde Wirkung kann auch erreicht werden, indem die Aktivität eines Proteins, dass sich im MLR-Test als hemmend herausgestellt hat, antagonisiert oder blockiert wird. Die Aufhebung der Hemmaktivität der Verbindung führt zu einem Nettostimulationseffekt. Geeignete Antagonisten/Blockierverbindungen sind Antikörper oder Fragmente davon, die das Hemmprotein erkennen und daran binden, wodurch die effektive Wechselwirkung des Proteins mit seinem Rezeptor blockiert und die Signalgebung durch den Rezeptor gehemmt wird. Diese Wirkung wurde in Versuchen unter Verwendung von Anti-CTLA-4-Antikörpern bestätigt, die T-Zell-Proliferation steigern, vermutlich durch Entfernung des Hemmsignals aufgrund der CTLA-4-Bindung. Walunas et al., Immunity 1, 405 (1994).
Andererseits können PRO-Polypeptide der Erfindung sowie andere erfindungsgemäße Verbindungen, die direkte Inhibitoren von T-Zell-Proliferation/Aktivierung und/oder Lymphokin-Sekretion sind, direkt eingesetzt werden, um die Immunantwort zu unterdrücken. Diese Verbindungen werden eingesetzt, um den Grad der Immunantwort zu reduzieren und Immunerkrankungen zu behandeln, die durch eine hyper aktive, überoptimale oder Autoimmunantwort gekennzeichnet sind. Diese Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen wurden durch die oben beschriebenen Experimenten bestätigt, bei denen CTLA-4-Bindung an den Rezeptor B7 T-Zellen deaktiviert. Die direkten Hemmverbindungen der Erfindung funktionieren auf analoge Weise.
Alternativ dazu können Verbindungen, z.B. Antikörper, die an stimulierende PRO-Polypeptide der Erfindung binden und die stimulierende Wirkung dieser Moleküle blockieren, eine Nettohemmwirkung erzeugen und zur Unterdrückung der T-Zell-vermittelten Immunantwort durch Hemmung von T-Zell-Proliferation/Aktivierung und/oder Lymphokin-Sekretion eingesetzt werden. Durch die Blockierung der Stimulationswirkung der PRO-Polypeptide wird die Immunantwort des Säugetiers unterdrückt. Diese Verwendung wurde in Experimenten unter Verwendung eines Anti-IL2-Antikörpers bestätigt. In diesen Experimenten bindet der Antikörper an 112 und blockiert die Bindung von 112 an seinen Rezeptor, wodurch eine T-Zell-Hemmwirkung erzielt wird.
H. Tiermodelle
Die Ergebnisse der zellbasierten In-vitro-Tests können unter Verwendung von In-vivo-Tiermodellen und Tests für die T-Zell-Funktion bestätigt werden. Eine Reihe von allgemein bekannten Tiermodellen kann eingesetzt werden, um die Rolle der hierin identifizierten Gene bei der Entwicklung und Pathogenese von Immunerkrankungen genauer zu analysieren und die Wirksamkeit von Therapeutikumkandidaten, einschließlich Antikörper, und anderen Antagonisten der nativen Polypeptide, einschließlich kleinmolekularer Antagonisten, zu testen. Die In-vivo-Natur solcher Modelle erlaubt eine Vorhersage von Reaktionen bei menschlichen Patienten. Tiermodelle von Immunerkrankungen umfassen sowohl nichtrekombinante als auch rekombinante (transgene) Tiere. Nichtrekombinante Tiermodelle umfassen beispielsweise Nagetiermodelle, z.B. Mausmodelle. Solche Modelle können erzeugt werden, indem Zellen unter Verwendung von Standardverfahren, z.B. subkutane Injektion, Schwanzvenen-Injektion, Milz-Implantation, intraperitoneale Implantation, Implantation unter der Nierenkapsel usw., in syngene Mäuse eingebracht werden.
Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankungen treten auf, wenn immunkompetente Zellen in immunsupprimierte oder tolerante Patienten transplantiert werden. Die Spenderzellen erkennen die Wirt-Antigene und reagieren darauf. Die Antwort kann von lebensbedrohlichen schweren Entzündungen bis zu leichten Fällen von Durchfall und Gewichtsverlust reichen. Transplantat-gegen-Wirt-Krankheitsmodelle stellen ein Mittel dar, um die T-Zell-Reaktivität gegen MHC-Antigene und Transplantat-Nebenantigene zu beurteilen. Ein geeignetes Verfahren ist in Current Protocols in Immunology, s.o., Unit 4.3., detailliert beschrieben.
Ein Tiermodell für die Abstoßung von allogenen Hauttransplantaten ist ein Mittel zum Testen der Fähigkeit von T-Zellen, In-vivo-Gewebezerstörung zu vermitteln, und ein Maß für ihre Rolle bei der Abstoßung von Transplantaten. Die häufigsten und am weitesten anerkannten Modelle nutzen Mausschwanz-Hauttransplantate. Wiederholte Experimente haben gezeigt, dass die Abstoßung von allogenen Hauttransplantaten durch T-Zellen, Helfer-T-Zellen und Killer-Effektor-T-Zellen und nicht durch Antikörper vermittelt wird. Auchincloss and Sachs, Fundamental Immunology, 2. Aufl., S. 889-992, W.E. Paul; Hrsg., Raven Press, NY, USA (1989). Ein geeignetes Verfahren ist in Current Protocols in Immunology, s.o., Unit 4.4, beschrieben. Weitere Transplantat-Abstoßungsmodelle, die eingesetzt werden können, um die Verbindungen der Erfindung zu testen, sind die allogenen Herztransplantat-Modelle, die von Tanabe et al., Transplantation 58, 23 (1994), und Tinubu et al., J. Immunol., 4330-4338 (1994), beschrieben wurden.
Tiermodelle für verzögerte Hypersensitivität stellen ebenfalls einen Test für zellvermittelte Immunfunktionen dar. Verzögerte Hypersensitivitätsreaktionen sind eine T-Zell-vermittelte In-vivo-Immunantwort, die durch Entzündungen gekennzeichnet ist, die ihren Höhepunkt erst einige Zeit nach der Provokation mit einem Antigen erreichen. Diese Reaktionen finden auch bei gewebespezifischen Autoimmunerkrankungen statt, wie z.B. bei multipler Sklerose (MS) und experimenteller Autoimmun- Enzephalomyelitis (EAE, ein Modell für MS). Ein geeignetes Verfahren ist in Current Protocols in Immunology, s.o., Unit 4.5, im Detail beschrieben.
EAE ist eine T-Zell-vermittelte Autoimmunerkrankung, die durch Entzündungen, welche durch T-Zellen und mononukleare Zellen ausgelöst werden, und eine darauf folgende Entmarkung von Axonen im Zentralnervensystem gekennzeichnet ist. EAE wird im Allgemeinen als geeignetes Tiermodell für MS bei Menschen erachtet. Bolton, Multiple Sclerosis 1, 143 (1995). Sowohl akute als auch schubförmig remittierende Modelle wurden entwickelt. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können mithilfe des in Current Protocols in Immunology, s.o., Unit 15.1 und 15.2, auf T-Zell-stimulierende oder -hemmende Aktivität gegen immunvermittelte Entmarkungskrankheiten getestet werden. Siehe auch die Modelle für Myelinerkrankungen, bei denen Oligodendrozyten oder Schwann-Zellen in das Zentralnervensystem transplantiert werden, wie in Duncan et al., Molec. Med. Today, 554-561 (1997), beschrieben ist.
Kontakthypersensitivität ist ein einfacher In-vivo-Test für verzögerte Hypersensitivität bei zellvermittelten Immunfunktionen. Bei diesem Verfahren wird die Haut exogenen Haptenen ausgesetzt, die zur einer verzögerten Hypersensitivitätsreaktion führen, welche gemessen und quantifiziert wird. Kontaktsensitivität umfasst eine anfängliche Sensibilisierungsphase, gefolgt von einer Auslösephase. Die Auslösephase findet statt, wenn die T-Lymphozyten auf ein Antigen treffen, mit dem sie schon vorher Kontakt hatten. Es kommt zu Schwellungen und Entzündungen, wodurch dieses Modell ein hervorragendes Modell für allergische Kontaktdermatitis bei Menschen darstellt. Ein geeignetes Verfahren ist in Current Protocols in Immunology, Hrsg. J.E. Cologan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach und Strober, John Wiley & Sons, Inc., Unit 4.2 (1994), im Detail beschrieben. Siehe auch Grabbe and Schwarz, Immun. Today 19(1), 37-44 (1998).
Ein Tiermodell für Arthritis ist collageninduzierte Arthritis. Dieses Modell und autoimmune rheumatoide Arthritis bei Menschen weisen gemeinsame klinische, histologische und immunologische Merkmale auf und stellt ein akzeptables Modell für menschliche Autoimmunarthritis dar. Maus- und Rattenmodelle sind durch Synovititis sowie Abbau von Knorpel und subchondralem Knochen gekennzeichnet. Die PRO-Polypeptide und Verbindungen der Erfindung können unter Verwendung des in Current Protocols in Immunology, s.o., Unit 15.5, beschriebenen Protokolls auf ihre Aktivität gegen Autoimmunarthritis getestet werden. Siehe auch das in Issekutz et al., Immunology 88, 569 (1996) beschriebene Modell, bei dem ein monoklonaler Antikörper gegen CD18- und VLA-4-Integrine verwendet werden.
Auch ein Asthmamodell wurde beschrieben, bei dem antigeninduzierte Atemwegshyperreaktivität, pulmonale Eosinophilie und Entzündungen induziert werden, indem ein Tier mit Ovalbumin sensibilisiert wird, wonach das Tier mit dem gleichen Protein mithilfe eines Aerosols provoziert wird. Mehrere Tiermodelle (Meerschweinchen, Ratte, nichtmenschliche Primaten) weisen ähnliche Symptome auf wie atopisches Asthma bei Menschen, wenn mit Aerosol-Antigenen provoziert wird. Mausmodelle weisen viele der Merkmale von Asthma bei Menschen auf. Geeignete Verfahren zum Testen der PRO-Polypeptide und Verbindungen der Erfindung auf Aktivität und Wirksamkeit bei der Behandlung von Asthma wurden von Wolyniec et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 18, 777 (1998), und den darin angeführten Literaturverweisen beschrieben.
Außerdem können die PRO-Polypeptide und Verbindungen der Erfindung an Tiermodellen auf Psoriasis-ähnliche Erkrankungen getestet werden. Es gibt Beweise für die Beteiligung von T-Zellen an der Pathogene von Psoriasis. Die Verbindungen der Erfindung können am SCID/SCID-Maus-Modell getestet werden, das von Schon et al., Nat. Med. 3, 183 (1997), beschrieben wurde, worin die Mäuse histopathologische Hautläsionen aufweisen, die Psoriasis ähneln. Ein weiteres geeignetes Modell ist die Chimäre aus Menschenhaut und SCID-Maus, die wie von Nickoloff et al., Am. J. Path. 146, 580 (1995), beschrieben hergestellt wird.
Rekombinante (transgene) Tiermodelle können erzeugt werden, indem der kodierende Teil der hierin identifizierten Gene in das Genom von Tieren von Interesse eingeführt wird, wobei Standardverfahren für den Erhalt von transgenen Tieren ein gesetzt werden. Tiere, die als Target für eine transgene Manipulation dienen können, umfassen unter anderem Mäuse, Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen, Schafe, Ziegen, Schweine und nichtmenschliche Primaten, z.B. Paviane, Schimpansen und andere Tieraffen. Auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren zur Einführung eines Transgens in solche Tiere umfassen pronukleäre Mikroinjektion (Hoppe und Wanger, U.S.-Patent Nr. 4.873.191 ); retrovirusvermittelten Gentransfer in Keimlinien (z.B. Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-615 (1985)); Gentargeting in embryonale Stammzellen (Thompson et al., Cell 56, 313-321 (1989)); Elektroporation von Embryos (Lo, Mol. Cell. Biol. 3, 1803-1814 (1983)); spermienvermittelten Gentransfer (Lavitrano et al., Cell 57, 717-73 (1989)). Für einen Überblick siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 4.736.866 .
Für den Zweck der vorliegenden Erfindung umfassen transgene Tiere jene, die das Transgen nur in einem Teil ihrer Zellen tragen („Mosaiktiere"). Das Transgen kann entweder als einzelnes Transgen oder in Concatameren, z.B. Kopf-Kopf- oder Kopf-Schwanz-Tandems, integriert werden. Die selektive Einführung eines Transgens in einen bestimmten Zelltyp ist beispielsweise auch nach dem Verfahren gemäß Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232-636 (1992), möglich.
Die Expression des Transgens in transgenen Tieren kann durch Standardverfahren überwacht werden. Beispielsweise können Southern-Blot-Analysen oder PCR-Amplifikation eingesetzt werden, um die Integration des Transgens zu überprüfen. Der Grad der mRNA-Expression kann dann mithilfe von Verfahren wie In-situ-Hybridisierung, Northern-Blot-Analyse, PCR oder Immunzytochemie analysiert werden.
Die Tiere können weiters auf Anzeichen einer Immunerkrankungspathologie untersucht werden, beispielsweise durch histologische Untersuchung, um die Infiltration von Immunzellen in bestimmte Gewebe zu bestimmen. Blockierungsexperimente können ebenfalls durchgeführt werden, wobei transgene Tiere mit den erfindungsgemäßen Verbindungen behandelt werden, um das Ausmaß der T-Zell-Proliferationsstimulierung oder -hemmung der Verbindungen zu bestimmen. In diesen Expe rimenten werden blockierende Antikörper, die an das PRO-Polypeptid der Erfindung binden, hergestellt wie oben beschrieben, dem Tier verabreicht, und ihre Wirkung auf die Immunfunktion wird bestimmt.
Alternativ dazu können „Knock-out-Tiere" geschaffen werden, die ein defektes oder verändertes Gen aufweisen, das für ein hierin identifiziertes Polypeptid kodiert, und zwar als Ergebnis einer homologen Rekombination zwischen dem endogenen Gen, das für das Polypeptid kodiert, und veränderter genomischer DNA, die für das gleiche Polypeptid, eingeführt in eine embryonale Zelle des Tiers, kodiert. Beispielsweise kann cDNA, die für ein bestimmtes Polypeptid kodiert, eingesetzt werden, um nach bekannten Verfahren genomische DNA zu klonieren, die für das Polypeptid kodiert. Ein Teil der genomischen DNA, die für ein bestimmtes Polypeptid kodiert, kann deletiert oder durch ein anderes Gen ersetzt werden, beispielsweise durch ein Gen, das für einen selektierbaren Marker kodiert, der zur Überwachung der Integration genutzt werden kann. Typischerweise werden einige Kilobasen unveränderter flankierender DNA (sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende) in den Vektor inkludiert (siehe z.B. Thomas und Capecchi, Cell 51, 503 (1987), für eine Beschreibung von homologen rekombinanten Vektoren). Der Vektor wird in eine embryonale Stammzelllinie eingeführt (z.B. durch Elektroporation), und Zellen, in denen die eingeführte DNA homolog mit der endogenen DNA rekombiniert wurde, werden ausgewählt (siehe z.B. Li et al., Cell 69, 915 (1992)). Die ausgewählten Zellen werden dann in eine Blastozyste eines Tiers (z.B. eine Maus oder Ratte) injiziert, um Aggregationschimären zu bilden (siehe z.B. Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, S. 113-152, Robertson, Hrsg., IRL, Oxford (1987)). Ein Hybridembryo kann dann in ein geeignetes scheinträchtiges weibliches Ammentier implantiert und der Embryo ausgetragen werden, um ein „Knock-out-Tier" zu erhalten. Nachkommen mit der homolog rekombinierten DNA in ihren Keimzellen können mittels Standardverfahren identifiziert und zur Züchtung von Tieren verwendet werden, wobei alle Zellen des Tiers die homolog rekombinierte DNA enthalten. Knockout-Tiere können beispielsweise durch ihre Fähigkeit, sich gegen bestimmte pathologische Zustände zu wehren, und durch die Entstehung pathologischer Zustände aufgrund der Abwesenheit des Polypeptids gekennzeichnet sein.
I. Immunadjuvans-Therapie
In einer Ausführungsform können die immunstimulierenden PRO-Polypeptide und Verbindungen der Erfindung in einer Immunadjuvans-Therapie eingesetzt werden, um Tumoren (Krebs) zu behandeln. Es ist nun allgemein anerkannt, dass T-Zellen menschliche tumorspezifische Antigene erkennen. Eine Gruppe von Tumorantigenen, für welche die MAGE-, BAGE- und GAGE-Genfamilien kodieren, sind in allen normalen Geweben von Erwachsenen inaktiv, werden in Tumoren, wie z.B. Melanomen, Lungentumoren, Hals- und Kopftumoren und Blasenkarzinomen, aber in signifikanten Mengen exprimiert. DeSmet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 7149 (1996). Es wurde gezeigt, dass die Costimulation von T-Zellen sowohl in vitro als auch in vivo Tumorregression und eine Antitumorantwort auslöst. Melero et al., Nature Medicine 3, 682 (1997); Kwon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 8099 (1997); Lynch et al., Nature Medicine 3, 625 (1997); Finn und Lotze, J. Immunol. 21, 114 (1998). Die stimulierenden PRO-Polypeptide und Verbindungen der Erfindung können als Adjuvans, alleine oder zusammen mit einem Wachstumsregulator, zytotoxischen Mittel oder Chemotherapeutikum, verabreicht werden, um die T-Zell-Proliferation/Aktivierung und eine Antitumorantwort auf Tumorantigene zu stimulieren. Der Wachstumsregulator, das zytotoxische Mittel oder das Chemotherapeutikum können in herkömmlichen Mengen unter Einsatz bekannter Verabreichungsschemata verabreicht werden. Die immunstimulierende Aktivität durch die PRO-Polypeptide und Verbindungen der Erfindung ermöglichen verringerte Mengen des Wachstumsregulators, zytotoxischen Mittels oder Chemotherapeutikums, wodurch möglicherweise die Toxizität für den Patienten verringert wird.
J. Screening-Tests für Arzneimittelkandidaten
Screening-Tests für Arzneimittelkandidaten sind darauf ausgerichtet, Verbindungen zu identifizieren, die an die Polypeptide, für welche die hierin identifizierten Gene kodieren, oder ein biologisch aktives Fragment davon binden oder einen Komplex damit bilden oder sonst die Wechselwirkung der kodierten Polypeptide mit anderen zellulären Proteinen stören. Solche Screening-Tests umfassen Tests, die zum Hoch durchsetz-Screenen von chemischen Bibliotheken angepasst werden können, wodurch sie sich besonders gut zur Identifikation kleinmolekularer Arzneimittelkandidaten eignen. Die hierin vorgesehenen kleinen Moleküle umfassen synthetische organische oder anorganische Verbindungen, einschließlich Peptiden, vorzugsweise löslichen Peptiden, (Poly)peptid-Immunglobulin-Fusionen, und insbesondere Antikörper, einschließlich unter anderem poly- und monoklonaler Antikörper und Antikörperfragmenten, einkettiger Antikörper, antiidiotypischer Antikörper und chimärer oder humanisierter Versionen solcher Antikörper oder Fragmente sowie menschlicher Antikörper und Antikörperfragmenten. Die Tests können in zahlreichen verschiedenen Formaten durchgeführt werden, einschließlich Protein-Protein-Bindungstests, biochemischer Screening-Tests, Immuntests und zellbasierter Tests, die auf dem Gebiet der Erfindung eingehend beschrieben sind.
Alle Tests gleichen sich darin, dass sie das Kontaktieren des Arzneimittelkandidaten mit einem Polypeptid, für das eine hierin identifizierte Nucleinsäure kodiert, unter Bedingungen und eine ausreichende Zeit lang erfordert, um diese zwei Komponenten in Wechselwirkung zu setzen.
Bei Bindungstests manifestiert sich die Wechselwirkung in Form einer Bindung, und der gebildete Komplex kann isoliert oder im Reaktionsgemisch nachgewiesen werden. In einer bestimmten Ausführungsform wird das durch das hierin identifizierte Gen kodierte Polypeptid oder der Arzneimittelkandidat an einer festen Phase, z.B. einer Mikrotiterplatte, durch kovalente oder nicht-kovalente Bindungen immobilisiert. Nicht-kovalente Bindung erfolgt im Allgemeinen durch Beschichten der festen Oberfläche mit einer Lösung des Polypeptids und Trocknen. Alternativ dazu kann ein immobilisierter Antikörper, z.B. ein monoklonaler Antikörper, der für das zu immobilisierende Polypeptid spezifisch ist, verwendet werden, um es an einer festen Oberfläche zu verankern. Der Test wird durch Zusetzen der nicht-immobilisierten Komponente, die mit einer nachweisbaren Markierung markiert sein kann, zur immobilisierten Komponente, z.B. der beschichteten Oberfläche, die die verankerte Komponente aufweist, durchgeführt. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, werden die nicht umgesetzten Komponenten z.B. durch Waschen entfernt, und die an der festen Ober fläche verankerten Komplexe werden nachgewiesen. Trägt die ursprünglich nichtimmobilisierte Komponente eine nachweisbare Markierung, so weist die Detektion von an der Oberfläche immobilisierter Markierung darauf hin, dass Komplexbildung stattgefunden hatte. Trägt die ursprünglich nicht-immobilisierte Komponente keine Markierung, kann Komplexbildung beispielsweise durch Verwendung eines markierten Antikörpers, der den immobilisierten Komplex spezifisch bindet, nachgewiesen werden.
Zeigt die Kandidatenverbindung mit einem bestimmten Protein, für das ein hierin identifiziertes Gen kodiert, Wechselwirkung, bindet jedoch nicht daran, so kann ihre Wechselwirkung mit diesem Polypeptid mittels zur Detektion von Protein-Protein-Wechselwirkungen bekannter Verfahren getestet werden. Solche Tests umfassen herkömmliche Ansätze, wie z.B. Vernetzung, Co-Immunfällung und Co-Reinigung mittels Gradienten oder chromatographischer Säulen. Darüber hinaus können Protein-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung eines auf Hefe basierenden genetischen Systems beobachtet werden, das von Fields & Mitarbeitern (Fields & Song, Nature (London) 340, 245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)) beschrieben wurde, wie von Chevray & Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991), offenbart. Zahlreiche Transkriptionsaktivatoren, wie z.B. Hefe GAL4, bestehen aus zwei physikalisch getrennten modularen Domänen, wobei die eine als die DNA-Bindungsdomäne und die andere als die Transkriptions-Aktivierungsdomäne agiert. Das in den obigen Veröffentlichungen beschriebene Hefeexpressionssystem (im Allgemeinen als das „Zweihybridsystem" bezeichnet) profitiert von dieser Eigenschaft und verwendet zwei Hybridproteine, eines, in dem das Targetprotein an die DNA-Bindungsdomäne von GAL4 fusioniert ist, und ein zweites, in dem Kandidaten-Aktivierungsproteine an die Aktivierungsdomäne fusioniert sind. Die Expression von einem GAL1-lacZ-Reportergen unter der Kontrolle eines GAL4-aktivierten Promotors hängt von der Wiederherstellung von GAL4-Aktivität über Protein-Protein-Wechselwirkung ab. Kolonien, die wechselwirkende Polypeptide enthalten, werden mit einem chromogenen Substrat für β-Galactosidase nachgewiesen. Ein vollständiges Set (MATCHMAKER^TM) zur Identifikation von Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen zwei spezifischen Proteinen in-Protein-Wechselwirkungen zwischen zwei spezifischen Proteinen unter Verwendung des Zweihybridverfahrens ist im Handel bei Clontech erhältlich. Dieses System kann auch ausgedehnt werden, um Proteindomänen zu kartieren, die in spezifische Protein-Wechselwirkungen involviert sind, sowie Aminosäurereste, die für diese Wechselwirkungen maßgeblich sind, genau zu lokalisieren.
Um Verbindungen zu finden, welche die Wechselwirkungen eines hierin identifizierten Gens und anderer intra- oder extrazellulärer Komponenten stören, wird üblicherweise ein Reaktionsgemisch hergestellt, welches das Produkt des Gens und der intra- oder extrazellulären Komponente enthält, und zwar unter solchen Bedingungen und über eine bestimmte Zeitspanne, sodass eine Wechselwirkung und Bindung der zwei Produkte möglich ist. Um die Fähigkeit einer Testverbindung zu testen, Bindung zu hemmen, wird die Reaktion in Abwesenheit und in Gegenwart der Testverbindung durchgeführt. Weiters kann ein Placebo zu einem dritten Reaktionsgemisch zugesetzt werden, das als positive Kontrolle dient. Die Bindung (Komplexbildung) zwischen der Testverbindung und der intra- oder extrazellulären Komponente im Gemisch wird wie zuvor beschrieben beobachtet. Die Bildung eines Komplexes in der/den Kontrollreaktion(en), jedoch nicht im Reaktionsgemisch, das die Testverbindung enthält, weist darauf hin, dass die Testverbindung die Wechselwirkung der Testverbindung und ihres Reaktionspartners stört.
K. Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung von Immunerkrankungen
Die bei der Behandlung von Immunerkrankungen zweckdienlichen Zusammensetzungen umfassen unter anderem Proteine, Antikörper, kleine organische Moleküle, Peptide, Phosphopeptide, Antisense- und Ribozym-Moleküle, Tripelhelixmoleküle usw., die eine Immunfunktion, beispielsweise T-Zell-Proliferation/Aktivierung, Lymphokinfreisetzung oder Immunzelleninfiltration, hemmen oder stimulieren.
Beispielsweise wirken Antisense-RNA- und RNA-Moleküle so, dass sie die Translation von mRNA durch Hybridisieren an Target-mRNA und Unterbinden von Prote intranslation blockieren. Wird Antisense-DNA verwendet, so werden Oligodesoxyribonucleotide, die von der Translationsinitiationsstelle, z.B. zwischen den Positionen von etwa -10 und +10 der Targetgen-Nucleotidsequenz, abstammen, bevorzugt.
Ribozyme sind enzymatische RNA-Moleküle, die in der Lage sind, die spezifische Spaltung von RNA zu katalysieren. Ribozyme wirken durch sequenzspezifische Hybridisierung an die komplementäre Target-RNA, gefolgt von endonucleolytischer Spaltung. Spezifische Ribozym-Spaltungsstellen innerhalb eines potenziellen RNA-Targets können durch bekannte Verfahren identifiziert werden. Für nähere Details siehe z.B. Rossi, Current Biology 4, 469-471 (1994), und die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/33551 (veröffentlicht am 18. September 1997).
Nucleinsäuremoleküle in Tripelhelixformation, die zur Transkriptionshemmung eingesetzt werden, sollten einzelsträngig sein und aus Desoxynucleotiden bestehen. Die Basenzusammensetzung dieser Oligonucleotide sieht so aus, dass sie Tripelhelixbildung gemäß den Hoogsteen-Basenpaarungsregeln fördern, die im Allgemeinen relativ große Abschnitte von Purinen oder Pyrimidinen auf einem Strang eines Duplex erfordern. Für nähere Details siehe z.B. PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/33551 , s.o.
Diese Moleküle können mithilfe eines beliebigen oder einer beliebigen Kombination von Screening-Tests identifiziert werden, wie sie oben beschrieben sind, und/oder durch ein beliebiges anderes Screening-Verfahren, wie es Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist.
L. Anti-PRO-Antikörper
Die vorliegende Erfindung stellt weiters Anti-PRO-Antikörper bereit. Beispiele für solche Antikörper schließen polyklonale, monoklonale, humanisierte, bispezifische und heterokonjugierte Antikörper ein. Einige der vielversprechendsten Arzneimittelkandidaten gemäß der vorliegenden Erfindung sind Antikörper und Antikörperfragmente, die T-Zell-Proliferation, Eosinophileninfiltration usw. hemmen (Antagonisten) oder stimulieren (Agonisten) können.
1. Polyklonale Antikörper
Die Anti-PRO-Antikörper können polyklonale Antikörper umfassen. Verfahren zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern sind Fachleuten bekannt. Polyklonale Antikörper können in einem Säugetier, beispielsweise durch eine oder mehrere Injektionen eines immunisierenden Mittels und, sofern erwünscht, eines Adjuvans, gezüchtet werden. Typischerweise wird das immunisierende Mittel und/oder das Adjuvans dem Säugetier durch multiple subkutane oder intraperitoneale Injektionen injiziert. Das immunisierende Mittel kann das PRO-Polypeptid oder ein Fusionsprotein davon umfassen. Es kann nützlich sein, das immunisierende Mittel an ein Protein zu konjugieren, das dafür bekannt ist, im zu immunisierenden Säugetier immunogen zu sein. Beispiele für solche immunogenen Proteine umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyreoglobulin und Sojabohnentrypsininhibitor. Beispiele für Adjuvantien, die verwendet werden können, umfassen komplettes Freundsches Adjuvans und MPL-TDM-Adjuvans (Monophosphoryl-Lipid A, synthetisches Trehalosedicorynomycolat). Die Arbeitsvorschrift zur Immunisierung kann von Fachleuten ohne übermäßiges Experimentieren ausgewählt werden.
2. Monoklonale Antikörper
Die Anti-PRO-Antikörper können alternativ auch monoklonale Antikörper sein Monoklonale Antikörper können unter Verwendung von Hybridomverfahren, wie beispielsweise jenen, die von Kohler & Milstein, Nature 356, 495 (1975), beschrieben werden, hergestellt werden. In einem Hybridomverfahren wird eine Maus, ein Hamster oder ein anderes geeignetes Wirttier typischerweise mit einem immunisierenden Mittel immunisiert, um Lymphozyten hervorzubringen, die Antikörper produzieren oder zu produzieren in der Lage sind, die spezifisch an das immunisierende Mittel binden. Alternativ dazu können die Lymphozyten in vitro immunisiert werden.
Das immunisierende Mittel umfasst typischerweise das PRO-Polypeptid oder ein Fusionsprotein davon. Im Allgemeinen werden entweder Lymphozyten des peripheren Bluts („PBLs"), sofern Zellen menschlichen Ursprungs erwünscht sind, oder Milzzellen oder Lymphknotenzellen verwendet, sofern nicht-menschliche Säugetierquellen erwünscht sind. Die Lymphozyten werden dann mit einer immortalisierten Zelllinie unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels, wie z.B. Polyethylenglykol, fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 59-103 (1986)]. Immortalisierte Zelllinien sind üblicherweise transformierte Säugetierzellen, insbesondere Myelomzellen von Nagetieren, Rindern und Menschen. Üblicherweise werden Ratten- oder Mausmyelomzelllinien verwendet. Die Hybridomzellen können in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert werden, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben der nicht fusionierten, immortalisierten Zellen hemmen. Fehlt beispielsweise den Ausgangszellen das Enzym Hypoxanthinguaninphosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT), so umfasst das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin („HAT-Medium"), Substanzen, die das Wachstum von HGPRT-defizienten Zellen unterbindet.
Bevorzugte, immortalisierte Zelllinien sind jene, die wirksam fusionieren, die stabile hochgradige Expression eines Antikörpers durch die ausgewählten, Antikörper produzierenden Zellen fördern und die auf ein Medium wie beispielsweise HAT-Medium empfindlich sind. Noch bevorzugtere, immortalisierte Zelllinien sind Maus-Myelomlinien, die beispielsweise vom Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien, und bei der American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, erhalten werden können. Menschliche Myelom- und Maus-Mensch-Heteromyelomzelllinien wurden auch für die Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern beschrieben [Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, 51-63 (1987)].
Das Kulturmedium, in dem die Hybridomzellen kultiviert werden, kann dann auf die Gegenwart von monoklonalen Antikörpern, die gegen PRO gerichtet sind, getestet werden. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität von monoklonalen Antikörpern, die durch die Hybridomzellen produziert werden, durch Immunfällung oder durch einen In-vitro-Bindungstest, wie beispielsweise Radioimmuntest (RIA) oder enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA), bestimmt. Solche Verfahren und Tests sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann beispielsweise durch die Scatchard-Analyse von Munson & Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt werden.
Nachdem die erwünschten Hybridomzellen identifiziert wurden, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und mittels herkömmlicher Verfahren gezüchtet werden [Goding, s.o.]. Geeignete Kulturmedien für diesen Zweck umfassen beispielsweise Dulbecco's Modified Eagle's Medium und RPMI-1640-Medium. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in vivo als Aszites in einem Säugetier gezüchtet werden.
Die monoklonalen Antikörper, die durch die Subklone sekretiert werden, können aus dem Kulturmedium oder der Ascitesflüssigkeit durch herkömmliche Immunglobulinreinigungsverfahren, wie beispielsweise Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie, isoliert oder gereinigt werden.
Die monoklonalen Antikörper können auch durch DNA-Rekombinationsverfahren, wie jenen, die im US-Patent Nr. 4.816.567 beschrieben werden, hergestellt werden. DNA, die für die monoklonalen Antikörper der Erfindung kodiert, kann leicht isoliert und unter Verwendung herkömmlicher Verfahren (z.B. unter Verwendung von Oligonucleotidsonden, die in der Lage sind, spezifisch an Gene zu binden, die für die schweren und leichten Ketten von Maus-Antikörper kodieren) sequenziert werden. Die Hybridomzellen der Erfindung dienen als eine bevorzugte Quelle für solche DNA. Nachdem sie isoliert wurde, kann die DNA in Expressionsvektoren platziert werden, die dann in Wirtszellen wie beispielsweise Affen-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstock-(CHO-) Zellen oder Myelomzellen transfiziert werden, die sonst kein Immunglobulinprotein produzieren, um die Synthese von monoklonalen Antikörpern in den rekombinanten Wirtszellen zu erreichen. Die DNA kann auch beispielsweise durch Substituieren der Kodiersequenz für menschliche Schwer- und Leichtketten-Konstantdomänen anstelle der homologen Maus-Sequenzen [ US-Patent Nr. 4.816.567 ; Morrison et al., s.o.] oder durch kovalentes Binden der gesamten oder eines Teils der Kodiersequenz für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid an die Immunglobulin-Kodiersequenz modifiziert werden. Solch ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid kann anstelle der konstanten Domänen eines Antikörpers der Erfindung oder anstelle der variablen Domänen einer Antigen-Kombinationsstelle eines Antikörpers der Erfindung eingesetzt werden, um einen zweiwertigen Hybridantikörper zu bilden.
Die Antikörper können einwertige Antikörper sein. Verfahren zur Herstellung einwertiger Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Beispielsweise umfasst ein Verfahren rekombinante Expression von Immunglobulin-Leichtkette und modifizierter Schwerkette. Die Schwerkette ist im Allgemeinen an einem beliebigen Punkt in der Fc-Region trunkiert, sodass Schwerketten-Vernetzung unterbunden wird. Alternativ dazu werden die relevanten Cysteinreste durch einen anderen Aminosäurerest substituiert oder werden deletiert, um Vernetzung zu unterbinden.
In-vitro-Verfahren sind auch zur Herstellung einwertiger Antikörper geeignet. Verdau von Antikörpern zur Produktion von Fragmenten davon, vorzugsweise Fab-Fragmenten, kann gemäß herkömmlichen Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, durchgeführt werden.
3. Menschliche und humanisierte Antikörper
Die Anti-PRO-Antikörper der Erfindung können weiters humanisierte Antikörper oder menschliche Antikörper umfassen. Humanisierte Formen von nicht-menschlichen (z.B. Maus-) Antikörpern sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z.B. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere Antigen-bindende Subsequenzen von Antikörpern), die eine Mindest-Sequenz, abgeleitet aus nicht-menschlichem Immunglobulin, enthalten. Humanisierte Antikörper umfassen menschliche Immunglobuline (Akzeptor-Antikörper), in denen Reste aus einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) des Akzeptors durch Reste aus einer CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Donorantikörper) wie Maus, Ratte oder Kaninchen mit der erwünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt werden. In manchen Fällen werden Fv-Gerüstreste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Humanisierte Antikörper können auch Reste umfassen, die weder im Akzeptor-Antikörper noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen zu finden sind. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen die gesamte von zumindest einer, und typischerweise zwei, variablen Domänen, in denen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen jenen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulin-Consensussequenz sind. Die humanisierten Antikörper umfassen im besten Fall auch zumindest einen Abschnitt einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jenen eines menschlichen Immunglobulins [Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596 (1992)].
Verfahren zur Humanisierung nicht-menschlicher Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste auf, die in ihn aus einer Quelle eingeführt wurden, die nicht-menschlich ist. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden oft als „Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise aus einer variablen „Import"-Domäne genommen werden. Humanisierung kann im Wesentlichen gemäß dem Verfahren von Winter und Mitarbeiter [Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988)] durch Substituieren von Nagetier-CDRs- oder -CDR-Sequenzen anstelle der entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durchgeführt werden. Demgemäß sind solche „humanisierten" Antikörper Hybridantikörper ( US-Patent Nr. 4.816.567 ), worin wesentlich weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch die entsprechende Sequenz aus einer nicht-menschlichen Spezies substituiert wurde. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche Anti körper, in denen manche CDR-Reste und möglicherweise manche FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen in Nagetierantikörpern ersetzt sind.
Menschliche Antikörper können auch unter Verwendung verschiedener Techniken, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, einschließlich Phagendisplay-Bibliotheken [Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)] hergestellt werden. Die Verfahren von Cole et al. und Boerner et al. sind auch zur Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern geeignet [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, S. 77 (1985), und Boerner et al., J. Immunol. 147(1), 86-95 (1991)]. Demähnlich können menschliche Antikörper durch Einführen menschlicher Immunglobulinloci in transgene Tiere, z.B. Mäuse, in denen die endogenen Immunglobulingene teilweise oder vollständig deaktiviert wurden, hergestellt werden. Bei Provokation wird menschliche Antikörperproduktion beobachtet, die jener in allen Aspekten sehr stark ähnlich ist, die in Menschen selbst beobachtet wurde, einschließlich Genneuanordnung, Assemblierung und Antikörperrepertoire. Dieser Ansatz wird beispielsweise in den US-Patenten Nr. 5.545.807 ; 5.545.806 ; 5.569.825 ; 5.625.126 ; 5.633.425 ; 5.661.016 und den folgenden wissenschaftlichen Publikationen beschrieben: Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368, 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 65-93 (1995).
Die Antikörper können auch wie oben beschrieben unter Einsatz bekannter Selektions- und/oder Mutageneseverfahren affinitätsgereift sein. Bevorzugte affinitätsgereifte Antikörper weisen eine Affinität auf, die fünfmal, vorzugsweise 10-mal, noch bevorzugter 20- bis 30-mal, stärker ist als die des Ausgangsantikörpers (im Allgemeinen von einer Maus, humanisiert oder menschlich), aus dem der gereifte Antikörper hergestellt wird.
4. Bispezifische Antikörper
Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise menschliche oder humanisierte, Antikörper, die Bindungsspezifitäten für zumindest zwei verschiedene Antigene aufweisen. Im vorliegenden Fall ist eine der Bindungsspezifitäten für das PRO, die andere ist für jedes beliebige andere Antigen, und vorzugsweise für ein(en) Zell-oberflächen-Protein oder -Rezeptor oder eine Rezeptoruntereinheit.
Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Herkömmlicherweise basiert die Produktion von bispezifischen Antikörpern auf der Co-Expression von zwei Immunglobulin-Schwerketten/Leichtketten-Paaren, worin die zwei schweren Ketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen [Milstein & Cuello, Nature 305, 537-539 (1983)]. Aufgrund der zufälligen Auswahl an Immunglobulinschwer- und -leichtketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein potenzielles Gemisch von zehn verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten Moleküls erfolgt üblicherweise durch Affinitätschromatographieschritte. Ähnliche Verfahren sind in der WO 93/08829 , veröffentlicht am 13. Mai 1993, und in Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655-3659 (1991), offenbart.
Variable Antikörperdomänen mit den erwünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Kombinationsstellen) können an Immunglobulinkonstantdomänen-Sequenzen fusioniert werden. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer Immunglobulin-Schwerkettenkonstantdomäne, umfassend zumindest einen Teil der Gelenks-, CH2- und CH3-Regionen. Es wird bevorzugt, dass die erste Schwerketten-Konstantregion (CH1) die Stelle enthält, die für Leichtkettenbindung, vorhanden in zumindest einer der Fusionen, erforderlich ist. DNAs, die für die Immunglobulin-Schwerkettenfusionen und, sofern erwünscht, für die Immunglobulin-Leichtkette kodieren, werden in getrennte Expressionsvektoren insertiert und werden in geeignete Wirtsorganismen co-transfiziert. Für nähere Details zur Herstellung von bispezifischen Antikörpern siehe beispielsweise Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
Gemäß einem anderen Ansatz, der in der WO 96/27011 beschrieben wird, kann die Grenzfläche zwischen einem Paar von Antikörpermolekülen bearbeitet werden, um den Prozentsatz an Heterodimeren, die aus rekombinanter Zellkultur gewonnen werden, zu maximieren. Die bevorzugte Grenzfläche umfasst zumindest einen Teil der CH3-Region einer konstanten Antikörperdomäne. In diesem Verfahren werden eine oder mehr kurze Aminosäureseitenketten von der Grenzfläche des ersten Antikörpermoleküls durch längere Seitenketten (z.B. Tyrosin oder Tryptophan) ersetzt. Kompensations-„Hohlräume” von identischer oder ähnlicher Größe wie die lange(n) Seitenkette(n) werden an der Grenzfläche des zweiten Antikörpermoleküls durch Ersetzen der langen Aminosäureseitenketten durch kürzere (z.B. Alanin oder Threonin) geschaffen. Dies liefert einen Mechanismus zur Steigerung der Ausbeute des Heterodimers im Vergleich zu unerwünschten Endprodukten wie beispielsweise Homodimeren.
Bispezifische Antikörper können als Volllängenantikörper oder Antikörperfragmente (z.B. bispezifische F(ab')₂-Antikörper) hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper aus Antikörperfragmenten wurden in der Literatur bereits beschrieben. Beispielsweise können bispezifische Antikörper unter Verwendung chemischer Bindung hergestellt werden. Brennan et al., Science 229, 81 (1985), beschreiben ein Verfahren, worin intakte Antikörper proteolytisch gespaltet werden, um F(ab')₂-Fragmente zu bilden. Diese Fragmente werden in Gegenwart des Dithiol-Komplexbildners Natriumarsenit reduziert, um vicinale Dithiole zu stabilisieren und intermolekulare Disulfidbildung zu unterbinden. Die gebildeten Fab'-Fragmente werden dann zu Thionitrobenzoat-(TNB-) Derivaten umgesetzt. Eines der Fab'-TNB-Derivate wird dann zum Fab'-Thiol durch Reduktion mit Mercaptoethylamin rekonvertiert und mit einer äquimolaren Menge des anderen Fab'-TNB-Derivats vermischt, um den bispezifischen Antikörper zu bilden. Die produzierten bispezifischen Antikörper können als Mittel für die selektive Immobilisierung von Enzymen verwendet werden.
Fab'-Fragmente können direkt aus E. coli gewonnen und chemisch gebunden werden, um bispezifische Antikörper zu bilden. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217-225 (1992), beschreiben die Produktion eines vollständig humanisierten bispezifischen F(ab')₂-Antikörper-Moleküls. Jedes Fab'-Fragment wurde separat aus E. coli sekretiert und gerichteter chemischer Bindung in vitro unterzogen, um den bispezifischen Antikörper zu bilden. Der so gebildete bispezifische Antikörper war in der Lage, an Zellen zu binden, die den ErbB2-Rezeptor überexprimierten, sowie an normale menschliche T-Zellen, und konnte die lytische Aktivität menschlicher zytotoxischer Lymphozyten gegen menschliche Brusttumortargets steigern.
Verschiedene Techniken zur Herstellung und Isolation bispezifischer Antikörperfragmente direkt aus rekombinanten Zellkulturen wurden auch beschrieben. Beispielsweise wurden bispezifische Antikörper unter Verwendung von Leucin-Zipper hergestellt. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5), 1547-1553 (1992). Die Leucin-Zipper-Peptide aus den Fos- und Jun-Proteinen wurden an die Fab'-Abschnitte von zwei verschiedenen Antikörpern durch Genfusion gebunden. Die Antikörper-Homodimere wurden an der Gelenksregion reduziert, um Monomere zu bilden, und dann reoxidiert, um die Antikörper-Heterodimere zu bilden. Dieses Verfahren kann auch zur Herstellung von Antikörper-Homodimeren verwendet werden. Die von Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448 (1993), beschriebene „Diabody"-Technologie stellt einen alternativen Mechanismus zur Herstellung bispezifischer Antikörperfragmente bereit. Die Fragmente umfassen eine variable Schwerkettendomäne (V_H), die über einen Linker an eine variable Leichtkettendomäne (V_L) gebunden ist, der zu kurz ist, um Paarung zwischen den zwei Domänen an derselben Kette zu ermöglichen. Demgemäß werden die V_H- und V_L-Domänen eines Fragments gezwungen, Paare mit den komplementären V_L- und V_H-Domänen eines anderen Fragments zu bilden, wodurch zwei Antigen-Bindungsstellen gebildet werden. Auch eine andere Vorgehensweise zur Herstellung bispezifischer Antikörperfragmente durch die Verwendung von einkettigen Fv-(sFv-) Dimeren wurde bereits beschrieben. Siehe Gruber et al., J. Immunol. 152, 5368 (1994). Antikörper mit mehr als zwei Wertigkeiten werden ebenfalls erwogen. Beispielsweise können trispezifische Antikörper hergestellt werden. Tutt et al., J. Immunol. 147, 60 (1991).
Beispielhafte bispezifische Antikörper können an zwei verschiedene Epitope an einem gegebenen PRO-Polypeptid der vorliegenden Erfindung binden. Alternativ dazu kann ein Anti-PRO-Polypeptidarm mit einem Arm kombiniert werden, der an ein Trigger-Molekül an einem Leukozyten wie beispielsweise ein T-Zellrezeptormolekül (z.B. CD2, CD3, CD28 oder B7) oder Fc-Rezeptoren für IgG (FcγR), wie z.B. FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) und FcγRIII (CD16), bindet, sodass zelluläre Abwehrmechanismen auf die Zelle fokussiert werden, die das bestimmte PRO-Polypeptid exprimiert. Bispezifische Antikörper können auch verwendet werden, um zytotoxische Mittel zu Zellen lokalisieren, die ein bestimmtes PRO-Polypeptid exprimieren. Diese Antikörper besitzen einen PRO-Bindungsarm und einen Arm, der ein zytotoxisches Mittel oder einen Radionuclidehelatbildner bindet, wie z.B. EOTUBE, DPTA, DOTA oder TETA. Ein anderer bispezifischer Antikörper von Interesse bindet das PRO-Polypeptid und bindet weiters Gewebefaktor (tissue factor, TF).
5. Heterokonjugierte Antikörper
Heterokonjugierte Antikörper liegen auch im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Heterokonjugierte Antikörper setzen sich aus zwei kovalent gebundenen Antikörpern zusammen. Solche Antikörper wurden beispielsweise vorgeschlagen, um Immunsystemzellen auf unerwünschte Zellen zu richten [ US-Patent Nr. 4.676.980 ] sowie zur Behandlung von HIV-Infektion [ WO 91/00360 ; WO 92/200373 ; EP 03089 ]. Es wird erwogen, dass die Antikörper in vitro unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet der synthetischen Proteinchemie bekannt sind, hergestellt werden können, einschließlich jener, die Vernetzungsmittel einbinden. Beispielsweise können Immunotoxine unter Verwendung einer Disulfid-Austauschreaktion oder durch Bildung einer Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele für geeignete Reagenzien für diesen Zweck umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat sowie jene Reagenzien, die beispielsweise im US-Patent Nr. 4.676.980 offenbart sind.
6. Effektorfunktionsbearbeitung
Es kann wünschenswert sein, den Antikörper der Erfindung hinsichtlich der Effektorfunktion zu modifizieren, um z.B. die Wirksamkeit des Antikörpers bei der Behandlung von Krebs zu steigern. Beispielsweise können ein oder mehrere Cysteinreste in die Fc-Region eingeführt werden, wodurch die Bildung von Disulfidbindungen zwischen den Ketten in dieser Region ermöglicht wird. Der so gebildete homodimere Antikörper kann verbesserte Internalisierungsfähigkeit und/oder gesteigertes komplementvermitteltes Zelltöten und antikörpervermittelte zelluläre Zytotoxizität (ADCC) aufweisen. Siehe Caron et al., J. Exp. Med. 176, 1191-1195 (1992), und Shopes, J. Immunol. 148, 2918-2922 (1992). Homodimere Antikörper mit gesteigerter Anti-Tumor-Aktivität können auch unter Verwendung heterobifunktioneller Vernetzer hergestellt werden, wie in Wolff et al., Cancer Research 53, 2560-2565 (1993), beschrieben wird. Alternativ dazu kann ein Antikörper so bearbeitet werden, dass er duale Fc-Regionen aufweist und dadurch über gesteigerte Komplementlyse- und ADCC-Fähigkeiten verfügen kann. Siehe Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3,219-230(1989).
7. Immunkonjugate
Die Erfindung betrifft auch Immunkonjugate, die einen Antikörper umfassen, der an ein zytotoxisches Mittel wie beispielsweise ein chemotherapeutisches Mittel, Toxin (z.B. ein enzymatisch aktives Toxin oder ein Toxin bakteriellen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs oder auch von Pilzen oder Fragmente davon) oder an ein radioaktives Isotop (d.h. ein Radiokonjugat) konjugiert ist.
Chemotherapeutische Mittel, die zur Herstellung solcher Immunkonjugate nützlich sind, wurden oben beschrieben. Enzymatisch aktive Toxine und Fragmente davon, die verwendet werden können, umfassen Diphtherie-A-Kette, nichtbindende aktive Fragmente von Diphtherietoxin, Exotoxin-A-Kette (aus Pseudomonas aeruginosa), Ricin-A-Kette, Abrin-A-Kette, Modeccin-A-Kette, α-Sarcin, Aleurites-fordii-Proteine, Dianthin-Proteine, Phytolaca-americana-Proteine (PAPI, PAPII und PAP-S), Momordica-charantia-Inhibitor, Curcin, Crotin, Sapaonaria-officinalis-Inhibitor, Gelonin, Mitogellin, Restrictocin, Phenomycin, Enomycin und die Tricothecene. Zahlreiche verschiedene Radionuclide sind zur Herstellung von radiokonjugierten Antikörpern erhältlich. Beispiele umfassen ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y und ¹⁸⁶Re. Konjugate des Antikörpers und des zytotoxischen Mittels werden unter Verwendung zahlreicher verschiedener bifunktioneller Proteinbindungsmittel wie z.B. N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionat (SPDP), Iminothiolan (IT), bifunktionellen Derivaten von Imidoestern (wie z.B. Dimethyladipimidat-HCl), aktiver Ester (wie z.B. Disuccinimidylsuberat), Aldehyden (wie Glutaraldehyd), Bisazido-Verbindungen (wie z.B. Bis(p-azidobenzoyl)hexandiamin), Bisdiazonium-Derivaten (wie z.B. Bis(p-diazoniumbenzoyl)ethylendiamin), Diisocyanaten (wie Tolylen-2,6-diisocyanat) und bis-aktiven Fluorverbindungen (wie z.B. 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol) hergestellt. Beispielsweise kann ein Ricinimmunotoxin wie in Vitetta et al., Science 238, 1098 (1987), beschrieben hergestellt werden. C-14-markierte 1-Isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylentriaminpentaessigsäure (MX-DTPA) ist ein beispielhafter Chelatbildner zur Konjugation von Radionucleotid an den Antikörper. Siehe die WO 94/11026 .
In einer anderen Ausführungsform kann der Antikörper an einen „Rezeptor" (wie Streptavidin) zur Verwendung bei Tumor-Pretargeting konjugiert werden, worin das Antikörper-Rezeptor-Konjugat dem Patienten verabreicht wird, gefolgt von der Entfernung ungebundenen Konjugats aus dem Blutkreislauf unter Verwendung eines Klärungsmittels und der anschließenden Verabreichung eines „Liganden" (z.B. Avidin), der an ein zytotoxisches Mittel (z.B. ein Radionucleotid) konjugiert ist.
8. Immunoliposomen
Die hierin offenbarten Antikörper können auch als Immunoliposomen formuliert werden. Liposomen, die den Antikörper enthalten, werden durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren hergestellt, wie sie beispielsweise in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030 (1980); und den US-Patenten Nr. 4.485.045 und 4.544.545 beschrieben wer den. Liposomen mit gesteigerter Zirkulationsdauer sind im US-Patent Nr. 5.013.556 offenbart.
Besonders nützliche Liposomen können durch das Umkehrphasenverdampfungsverfahren mit einer Lipidzusammensetzung, die Phosphatidylcholin, Cholesterin und PEG-derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (PEG-PE) umfasst, hergestellt werden. Liposomen werden durch Filter von definierter Porengröße filtriert, um Liposomen mit dem erwünschten Durchmesser zu ergeben. Fab'-Fragmente des Antikörpers der vorliegenden Erfindung können an die Liposomen wie in Martin et al., J. Biol. Chem. O 257, 286-288 (1982), beschrieben mittels einer Disulfid-Austauschreaktion konjugiert werden. Ein chemotherapeutisches Mittel (wie beispielsweise Doxorubicin) ist gegebenenfalls im Liposom enthalten. Siehe Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19), 1484 (1989).
M. Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die aktiven Moleküle der Erfindung, PRO-Polypeptide und Antikörper, sowie andere Moleküle, die durch die zuvor offenbarten Screening-Tests identifiziert wurden, können zur Behandlung von Immunerkrankungen in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden.
Therapeutische Formulierungen des aktiven Moleküls, vorzugsweise ein PRO-Polypeptid oder Anti-PRO-Antikörper der Erfindung, werden zur Lagerung hergestellt, indem das aktive Molekül mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit optionalen pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren vermischt werden (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., A. Osol, Hrsg. (1980)), und zwar in Form von gefriergetrockneten Formulierungen oder wässrigen Lösungen. Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für Rezipienten in den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer, wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidanzien, einschließlich Ascorbinsäure und Methionin; Konservierungsmittel (wie z.B. Octadecyldimethylbenzylammoniumchlorid; Hexamethoniumchlorid; Benzalkoniumchlorid, Ben zethoniumchlorid; Phenol, Butyl- oder Benzylalkohol; Alkylparabene wie z.B. Methyl- oder Propylparaben; Catechin; Resorcin; Cyclohexanol; 3-Pentanol; und m-Cresol); niedermolekulare Polypeptide (weniger als etwa 10 Reste); Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Histidin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie z.B. EDTA; Zucker wie z.B. Saccharose, Mannit, Trehalose oder Sorbit; salzbildende Gegenionen wie z.B. Natrium; Metallkomplexe (z.B. Zn-Protein-Komplexe); und/oder nichtionische Tenside wie z.B. TWEEN^TM, PLURONICS^TM oder Polyethylenglykol (PEG).
Verbindung, die durch die Screening-Tests der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden, können auf analoge Weise formuliert werden, und zwar unter Einsatz von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Standardverfahren.
Auch Lipofektionen oder Liposomen können verwendet werden, um einen Antikörper oder ein Antikörperfragment in Zellen zuzuführen. Werden Antikörperfragmente verwendet, so wird das kleinste Inhibitionsfragment, das spezifisch an die Bindungsdomäne des Targetproteins bindet, bevorzugt. Beispielsweise können auf Grundlage der Sequenzen der variablen Regionen eines Antikörpers Peptidmoleküle entworfen werden, die die Fähigkeit beibehalten, die Target-Proteinsequenz zu binden. Solche Peptide können chemisch synthetisiert und/oder durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden (siehe z.B. Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)).
Die Formulierung hierin kann auch mehr als nur ein(e) aktive(s) Polypeptid oder Verbindung als für die bestimmte zu behandelnde Indikation erforderlich ist enthalten, vorzugsweise jene mit komplementären Aktivitäten, die sich gegenseitig nicht negativ beeinflussen. Alternativ oder zusätzlich dazu kann die Zusammensetzung ein zytotoxisches Mittel, Zytokin oder wachstumshemmendes Mittel umfassen. Solche Moleküle sind geeigneterweise in Kombination vorhanden, und dies in Mengen, die für die beabsichtigten Zwecke wirksam sind.
Die aktiven Moleküle können auch in Mikrokapseln eingekapselt werden, die beispielsweise durch Koazervierungsverfahren oder durch Grenzflächenpolymerisation hergestellt wurden, z.B. Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln, in kolloidale Wirkstoffzufuhrsysteme (z.B. Liposomen, Albuminmikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanopartikeln und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen. Solche Verfahren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., A. Osol, Hrsg. (1980), offenbart.
Die Formulierungen, die zur In-vivo-Verabreichung verwendet werden, müssen steril sein. Dies kann leicht mittels Filtration durch sterile Filtermembranen erreicht werden.
Es können Retardpräparate hergestellt werden. Geeignete Beispiele für Retardpräparate umfassen semipermeable Matrizen von festen hydrophoben Polymeren, die den Antikörper enthalten, wobei die Matrizen in Form von Formstücken, z.B. Filmen oder Mikrokapseln, vorliegen. Beispiele für Retard-Matrizen umfassen Polyester, Hydrogele (z.B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide ( US-Patent Nr. 3.773.919 ), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat, nicht abbaubares Ethylenvinylacetat, abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere wie z.B. LUPRON DEPOT^TM (injizierbare Mikrokügelchen, zusammengesetzt aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat) und Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure. Während Polymere wie z.B. Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure die Freisetzung von Molekülen über eine Zeitspanne von 100 Tagen ermöglichen, setzen bestimmte Hydrogele Proteine über kürzere Zeitspannen hinweg frei. Verbleiben eingekapselte Antikörper über eine längere Zeit im Körper, so können sie als ein Resultat von Aussetzung gegenüber Feuchtigkeit bei 37 °C denaturieren oder aggregieren, was zu einem Verlust von biologischer Aktivität und möglichen Veränderungen der Immunogenität führen kann. Je nach vorliegendem Mechanismus können rationale Vorgehensweisen zur Stabilisierung entwickelt werden. Stellt der Aggregationsmechanismus beispielsweise intermolekulare S-S-Bindungsbildung durch Thiodisulfidaustausch dar, so kann Stabilisierung durch Modifikation von Sulfhydrylresten, Lyophilisierung aus sauren Lösungen, Steuerung des Feuchtigkeitsgehalts, Verwendung geeigneter Additive und Entwicklung spezifischer Polymermatrizenzusammensetzungen erreicht werden.
N. Behandlungsverfahren
Es ist vorgesehen, dass die PRO-Polypeptide, Antikörper und anderen aktiven Verbindungen der vorliegenden Erfindung zur Behandlung verschiedener Immunerkrankungen und mit dem Immunsystem zusammenhängender Leiden, wie z.B. T-Zell-vermittelte Erkrankungen, einschließlich solcher, die durch Infiltration von Entzündungszellen in eine Gewebe, Stimulierung der T-Zell-Proliferation, Hemmung der T-Zell-Proliferation, gesteigerte oder verringerte Gefäßpermeabilität oder deren Hemmung, eingesetzt werden können.
Beispiele für Leiden oder Störungen, die mit den PRO-Polypeptiden, Antikörpern oder anderen Verbindungen der Erfindung zu behandeln sind, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, systemischen Lupus erythematodes, rheumatoide Arthritis, juvenile chronische Arthritis, Osteoarthritis, Spondyloarthropathien, systemische Sklerose (Sklerodermie), idiopathische entzündliche Myopathien (Dermatomyositis, Polymyositis), Sjögren-Syndrom, systemische Vaskulitis, Sarkoidose, autoimmunhämolytische Anämie (Immunpanzytopenie, paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie), Autoimmun-Thrombozytopenie (idiopathische thrombozytopenische Purpurs, immunvermittelte Thrombozytopenie), Thyreoiditis (Basedow-Krankheit, Hashimoto-Thyreoiditis, juvenile lymphozytäre Thyreoiditis, atrophische Thyreoiditis), Diabetes mellitus, immunvermittelte Nierenerkrankungen (Glomerulonephritis, tubulointerstitielle Nephritis), Entmarkungskrankheiten des Zentral- und peripheren Nervensystems, wie z.B. multiple Sklerose, idiopathische demyelinisierende Polyneuropathie oder Guillain-Barré-Syndrom und chronische entzündliche demyelinisierende Polyneuropathie, hepatobiliäre Erkrankungen, wie z.B. infektiöse Hepatitis (Hepatitis A, B, C, D, E und andere nicht-hepatotrope Viren), autoimmune chronische aktive Hepatitis, primäre biliäre Zirrhose, granulomatöse Hepatitis und sklerosierende Cholangitis, entzündliche Darmerkrankungen (Colitis ulcerosa: Crohn-Krankheit), glutenbe dingte Enteropathie und Whipple-Krankheit, autoimmun- oder immunvermittelte Hauterkrankungen, einschließlich bullöser Hauterkrankungen, Erythema multiforme und Kontaktdermatitis, Psoriasis, Allergosen, wie z.B. Asthma, Rhinitis allergica, atopische Dermatitis, Lebensmittel-Hypersensitivität und Urtikaria, immunologische Erkrankungen der Lunge, wie z.B. eosinophile Pneumonien, idiopathische Lungenfibrose und Hypersensitivitätspneumonitis, mit einer Transplantation assoziierte Erkrankungen, einschließlich Transplantat-Abstoßung und Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankungen.
Beim systemischen Lupus ist der Hauptauslöser der Krankheit die Produktion von autoreaktiven Antikörpern gegen eigene Proteine/Gewebe und die daraus resultierende Bildung einer immunvermittelten Entzündung. Obwohl keine direkte Beteiligung von T-Lymphozyten an Gewebeschädigung nachgewiesen wurde, sind T-Lymphozyten für die Entstehung von autoreaktiven Antikörpern erforderlich. Die Entstehung der Krankheit hängt somit von T-Lymphozyten ab. Mehrere Organe und Systeme sind klinisch betroffen, einschließlich Niere, Lunge, muskuloskelettalem System, mukokutanem System, Augen, Zentralnervensystem, kardiovaskulärem System, Gastrointestinaltrakt, Knochenmark und Blut.
Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronisch-entzündliche systemische Autoimmunerkrankung, die hauptsächlich die Synovialmembran verschiedener Gelenke befällt und zu einer Läsion des Gelenksknorpels führt. Die Pathogenese ist T-Lymphozytenabhängig und mit der Produktion von Rheumafaktoren, Autoantikörpern gegen eigenes IgG, assoziiert, was in der Bildung von Immunkomplexen resultiert, die hohe Werte in Gelenksflüssigkeit und Blut erreichen. Diese Komplexe im Gelenk können die ausgeprägten Infiltrate von Lymphozyten und Monozyten in die Synovialmembran und darauf folgende ausgeprägte synoviale Veränderungen induzieren; der Gelenkspalt/die Gelenksflüssigkeit werden von ähnlichen Zellen infiltriert, mit der Folge eines vermehrten Auftretens von Neutrophilen. Betroffene Gewebe sind vor allem die Gelenke, oft auf symmetrische Weise. Aber auch extraartikuläre Erkrankungen treten in zwei Hauptformen auf. Eine Form ist die Entstehung von extraartikulären Läsionen mit fortlaufend progressiver Gelenkserkrankung und typischen Läsio nen wie Lungenfibrose, Visculitis und Hautgeschwüren. Die zweite Form der extraartikulären Erkrankung ist das so genannten Felty-Syndrom, das im späten Verlauf der RA-Erkrankung auftritt, manchmal nachdem die Gelenkserkrankung zur Ruhe gekommen ist, und das Vorhandensein von Neutropenie, Thrombozytopenie und Splenomegalie umfasst. Dies kann von einer Vaskulitis in mehreren Organen begleitet werden, was zu Infarkten, Hautgeschwüren und Gangränen führt. Patienten leiden außerdem häufig an Rheumaknoten im Unterhautgewebe über den betroffenen Gelenken; in der späten Phase weisen die Knoten nekrotische Zentren auf, die von einem gemischten Entzündungszellinfiltrat umgeben sind. Andere Manifestationen, die bei RA auftreten können, umfassen: Perikarditis, Pleuritis, Koronararteriitis, interstitielle Pneumonitis mit Lungenfibrose, Keratokonjunktivitis sicca und Rheumaknoten.
Juvenile chronische Arthritis ist eine chronische idiopathische Entzündungserkrankung, die oft in einem Alter von unter 16 Jahren einsetzt. Ihr Phänotypus weist Ähnlichkeiten mit RA auf; manche Patienten mit einem positiven Rheumafaktor werden als juvenile rheumatoide Arthritis klassifiziert. Die Erkrankung wird in drei Hauptgruppen unterteilt: pauciartikulär, polyartikulär und systemisch. Die Arthritis kann sehr schwer sein und ist typischerweise destruktiv und führt zu Gelenksankylose und Wachstumsstörungen. Weitere Manifestationen können chronische anteriore Uveitis und systemische Amyloidose umfassen.
Spondyloarthropathien sind eine Gruppe von Leiden mit einer Reihe von gemeinsamen Merkmalen und der gemeinsamen Assoziation mit der Expression eines HLA-B27-Genprodukts. Die Leiden umfassen: Spondylitis ankylosans, Reiter-Syndrom (reaktive Arthritis), mit entzündlichen Darmerkrankungen assoziierte Arthritis, mit Psoriasis assoziierte Spondylitis, juvenile Spondyloarthropathie und undifferenzierte Spondyloarthropathie. Typische Merkmale umfassen Sakroileitis mit oder ohne Spondylitis; entzündliche asymmetrische Arthritis; Assoziation mit HLA-B27 (ein serologisch definiertes Allel des HLA-B-Locus von Klasse-I-MHC); Augenentzündungen und das Fehlen von Autoantikörpern, die mit anderen rheumatoiden Erkrankungen assoziiert sind. Die Zelle, die am häufigsten als Schlüssel zur Auslösung der Krankheit betrachtet wird, ist der CD8⁺-T-Lymphozyt, ein Zelle, die auf ein von Klasse-I-MHC-Molekülen präsentiertes Antigen ausgerichtet ist. CD8⁺-T-Zellen MHC-Molekülen präsentiertes Antigen ausgerichtet ist. CD8⁺-T-Zellen können gegen Klasse-I-MHC-Allel HLA-B27 reagieren, als wenn es ein fremdes Peptid wäre, das von MHC-Klasse-I-Molekülen exprimiert wird. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass ein Epitop von HLA-B27 ein bakterielles oder anderes mikrobielles antigenes Epitop nachahmen kann und so eine CD8⁺-T-Zell-Reaktion auslöst.
Systemische Sklerose (Sklerodermie) weist eine unbekannte Ätiologie auf. Ein Kennzeichen der Erkrankung ist eine Induration der Haut; wahrscheinlich wird dies durch einen aktiven Entzündungsprozess induziert. Sklerodermie kann lokal oder systemisch sein; häufig treten Gefäßläsionen auf, und eine mikrovaskuläre Endothelzellenschädigung ist ein früher und wichtiger Vorfall in der Entstehung von systemischer Sklerose; die Gefäßläsion kann immunvermittelt sein. Eine immunologische Grundlage wird durch die Gegenwart von mononuklearen Zellinfiltraten in den Hautläsionen und durch die Gegenwart von antinukleären Antikörpern bei vielen Patienten impliziert. ICAM-1 ist oft auf der Zelloberfläche von Fibroblasten in Hautläsionen hochreguliert, was vermuten lässt, dass eine T-Zell-Wechselwirkung mit diesen Zellen eine Rolle bei der Pathogenes der Erkrankung spielen könnte. Andere Organe, die involviert sind, umfassen: den Gastrointestinaltrakt; Atrophie und Fibrose von glatten Muskeln, was zu anormaler Peristaltik/Motilität führt; Niere: konzentrische subendotheliale Intimaproliferation, die sich auf kleine Arteriae arcuatae und interlobares auswirken, was zu geringerem Nierenrinden-Blutfluss und somit zu Proteinurie, Azotämie und Hypertension führt; Skelettmuskel: Atrophie, interstitielle Fibrose; Entzündung; Lunge: interstitielle Pneumonitis und interstitielle Fibrose; und Herz: Kontraktionsbandnekrose; Vernarbung/Fibrose.
Idiopathische entzündliche Myopathien, einschließlich Dermatomyositis, Polymyositis und andere, sind chronische Muskelentzündungserkrankungen mit unbekannter Ätiologie, die zu Muskelschwäche führen. Muskelläsionen/-entzündungen sind oft symmetrisch und progressiv. Autoantikörper sind mit den meisten Formen assoziiert. Diese Myositis-spezifischen Autoantikörper sind gegen die Funktion von Komponenten, Proteinen und RNAs, die an der Proteinsynthese beteiligt sind, gereichtet und hemmen diese.
Das Sjögren-Syndrom ist auf eine immunvermittelte Entzündung und darauf folgende funktionale Zerstörung der Tränendrüsen und Speicheldrüsen zurückzuführen. Die Krankheit kann mit entzündlichen Bindegewebeerkrankungen assoziiert sein oder von diesen begleitet werden. Sie ist mit Autoantikörperbildung gegen Ro- und La-Antigenen assoziiert, die beide kleine RNA-Protein-Komplexe darstellen. Läsionen führen zu Keratokonjunktivitis sicca und Xerostomie, während weitere Manifestationen oder Assoziationen biliäre Zirrhose, periphere oder sensorische Neuropathie und tastbare Purpurs umfassen.
Systemische Vaskulitis umfasst Erkrankungen, bei denen die primäre Läsion eine Entzündung mit nachfolgender Schädigung der Blutgefäße ist, was zu Ischämie/Nekrose/Degeneration von Geweben, die von den betroffenen Gefäßen versorgt werden, und schließlich in manchen Fällen zu einer Endorgan-Dysfunktion führt. Vaskulitiden können auch als sekundäre Läsion oder als Folge anderer immunvermittelter Entzündungserkrankungen, wie z.B. rheumatoider Arthritis, systemischer Sklerose usw., auftreten, vor allem bei Krankheiten, die auch mit der Bildung von Immunkomplexen assoziiert sind. Erkrankungen der Gruppe der primären systemischen Vaskuliti umfassen: systemische nekrotisierende Vaskulitis: Polyarteriitis nodosa, allergische Angiitis und Granulomatose, Polyangiitis; Wegener-Granulomatose; lymphomatoide Granulomatose; und Riesenzellarteriitis. Diverse Vaskulitiden umfassen: mukokutanes Lymphknotensyndrm (MLNS oder Kawasaki-Syndrom), isolierte ZNS-Vaskulitis, Behet-Erkrankung, Thromboangiitis obliterans (Buerger-Syndrom) und kutane nekrotisierende Venulitis. Der pathogene Mechanismus der meisten angeführten Vaskulitisarten ist wahrscheinlich primär auf die Ablagerung von Immunglobulinkomplexen in der Gefäßwand und die darauf folgenden Induktion einer Entzündungsreaktion entweder durch ADCC, Komplementaktivierung oder beides zurückzuführen.
Sarkoidose ist ein Leiden unbekannter Ätiologie, das durch die Gegenwart von Epitheloidgranulomen in fast jedem Gewebe des Körpers gekennzeichnet ist; meist ist auch die Lunge beteiligt. Die Pathogenese umfasst das Bestehen von aktivierten Makrophagen und Lymphoidzellen an erkrankten Stellen mit chronischen Folgen, die aus der Freisetzung von lokal und systemisch aktiven Produkten resultieren, die von diesen Zelltypen freigesetzt werden.
Autoimmunhämolytische Anämie, einschließlich autoimmunhämolytischer Anämie, Immunpanzytopenie und paroxysmaler nächtlicher Hämoglobinurie, ist das Ergebnis der Produktion von Antikörpern, die mit Antigenen reagieren, welche auf der Oberfläche von roten Blutkörperchen (und in manchen Fällen auch anderen Blutkörperchen, einschließlich Blutplättchen) exprimiert werden, und spiegelt die Entfernung jener Antikörper-beschichteten Zellen durch komplementvermittelte Lyse und/oder ADCC/Fc-Rezeptor-vermittelte Mechanismen wider.
Bei Autoimmun-Thrombozytopenie, einschließlich idiopathischer thrombozytopenischer Purpurs und immunvermittelter Thrombozytopenie vor anderen klinischen Hintergründen, findet als Ergebnis von entweder Antikörper- oder Komplementbindung an Blutplättchen und die darauf folgende Entfernung durch Komplementlyse, ADCC- oder Fc-Rezeptor-vermittelte Mechanismus eine Blutplättchen-Zerstörung/Entfernung statt.
Thyreoiditis, einschließlich Basedow-Krankheit, Hashimoto-Thyreoiditis, juveniler lymphozytärer Thyreoiditis und atrophischer Thyreoiditis, ist das Ergebnis einer Autoimmunantwort auf Schilddrüsenantigene, die zur Produktion von Antikörpern führt, welche mit Proteinen reagieren, die in der Schilddrüse vorhanden und oft für diese spezifisch sind. Es gibt Versuchsmodelle, einschließlich spontaner Modelle: Ratten (BUF- und BB-Ratten) und Hühner (Stamm von fettleibigen Hühnern); induzierbarer Modelle: Immunisierung von Tieren mit entweder Thyreoglobulin, mikrosomalem Schilddrüsenantigen (Schilddrüsenperoxidase).
Diabetes mellitus Typ 1 oder insulinabhängiger Diabetes mellitus ist die autoimmune Zerstörung von β-Zellen der Langerhans-Inseln; diese Zerstörung wird durch Autoantikörper und autoreaktive T-Zellen vermittelt. Antikörper gegen Insulin oder den Insu linrezeptor können auch den Phänotyp der mangelnden Reaktionsfähigkeit auf Insulin erzeugen.
Immunvermittelte Nierenerkrankungen, einschließlich Glomerulonephritis und tubulointerstitieller Nephritis, sind das Ergebnis von Antikörper- oder T-Lymphozytenvermittelten Läsionen des Nierengewebes, entweder direkt als Ergebnis der Produktion von autoreaktiven Antikörpern oder T-Zellen gegen Nierenantigene oder indirekt als Ergebnis der Ablagerung von Antikörpern und/oder Immunkomplexen in der Niere, die auf andere Antigene, die nicht von der Niere stammen, reagieren. Somit können auch andere immunvermittelte Erkrankungen, die zur Bildung von Immunkomplexen führen, als indirekte Folge immunvermittelte Nierenerkrankungen auslösen. Sowohl direkte als auch indirekte Immunmechanismen führen zu einer Entzündungsreaktion, welche zur Bildung von Läsionen in Nierengewebe führt bzw. diese induziert, was wiederum zu Beeinträchtigungen der Organfunktion und in manchen Fällen bis zu Nierenversagen führt. Sowohl humorale als auch zelluläre Immunmechanismen können an der Pathogenese von Läsionen beteiligt sein.
Entmarkungskrankheiten des Zentral- und peripheren Nervensystems, einschließlich multipler Sklerose, idiopathischer demyelinisierender Polyneuropathie oder Guillain-Barre-Syndrom; und chronische entzündliche demyelinisierende Polyneuropathie sind wahrscheinlich das Ergebnis von Schädigungen an den Oligodendrozyten oder am Myelin direkt. Bei MS gibt es Anzeichen dafür, dass die Auslösung und das Fortschreiten der Krankheit von T-Lymphozyten abhängen. Multiple Sklerose ist eine Entmarkungskrankheit, die T-Lymphozyten-abhängig ist und entweder schubförmig remittierend oder chronisch progressiv verläuft. Die Ätiologie ist unbekannt; es tragen aber Virusinfektionen, genetische Veranlagung, die Umwelt und die Autoimmunität dazu bei. Läsionen umfassen Infiltrate aus vorwiegend T-Lymphozyten-vermittelten Mikrogliazellen und infiltrierenden Makrophagen; CD4⁺-T-Lymphzyten sind der vorherrschende Zelltyp in den Läsionen. Der Mechanismus des Oligodendrozyten-Zelltods und der darauf folgenden Entmarkung sind nicht bekannt, werden aber wahrscheinlich von T-Lymphozyten angetrieben.
Entzündliche und fibrotische Lungenerkrankungen, einschließlich eosinophiler Pneumonien, idiopathischer Lungenfibrose und Hypersensitivitätspneumonitis, können eine deregulierte entzündliche Immunantwort umfassen. Die Hemmung dieser Antwort wäre von therapeutischem Nutzen.
Autoimmun- oder immunvermittelte Hauterkrankungen, einschließlich bullöser Hauterkrankungen, Erythema multiforme und Kontaktdermatitis, werden durch Autoantikörper vermittelt, deren Entstehung T-Lymphozyten-abhängig ist.
Psoriasis ist eine T-Lymphozyten-vermittelte Entzündungserkrankung. Läsionen enthalten Infiltrate aus T-Lymphozyten, Makrophagen und antigenprozessierenden Zellen sowie einige Neutrophilen.
Allergosen, einschließlich Asthma; Rhinitis allergica; atopischer Dermatitis; Lebensmittel-Hypersensitivität; und Urtikaria, sind T-Lymphozyten-abhängig. Diese Erkrankungen werden vorwiegend durch T-Lymphozyten-induzierte Entzündungen, IgE-vermittelte Entzündungen oder eine Kombination aus beiden vermittelt.
Mit einer Transplantation assoziierte Erkrankungen, einschließlich Transplantat-Abstoßung und Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankungen, sind T-Lymphozytenabhängig; die Hemmung von T-Lymphozyten-Funktion wird verringert.
Weitere Erkrankungen, bei denen ein Eingriff in die Immun- und/oder Entzündungsreaktion von Vorteil sind, sind Infektionskrankheiten, einschließlich, nicht jedoch eingeschränkt auf, Virusinfektionen (einschließlich, nicht jedoch eingeschränkt auf, AIDS, Hepatitis A, B, C, D, E und Herpes), bakterielle Infektionen, Pilzinfektionen und Protozoen- und Parasiteninfektionen (Moleküle oder Derivate/Agonisten, welche die MLR stimulieren, können therapeutisch eingesetzt werden, um die Immunantwort auf Erreger zu verstärken), Immundefekterkrankungen (Moleküle/Derivate/Agonisten, welche die MLR stimulieren, können therapeutisch eingesetzt werden, um die Immunantwort bei Leiden mit vererbter, erworbener, infektionsinduzierter (wie z.B. durch eine HIV-Infektion) oder iatrogener (z.B. aufgrund einer Chemotherapie) Immundefizienz zu steigern) und Neoplasie.
Es wurde gezeigt, dass manche menschliche Krebspatienten einen Antikörper und/oder eine T-Lymphozyten-Reaktion auf Antigene auf neoplastischen Zellen bilden. In Tiermodellen von Neoplasie wurde außerdem gezeigt, dass eine Steigerung der Immunantwort zur einer Abstoßung oder Rückbildung des jeweiligen Neoplasmas führen kann. Moleküle, welche die T-Lymphozytenreaktion in der MLR fördern, sind in vivo für die Steigerung der Immunantwort gegen Neoplasie geeignet. Moleküle, welche die proliferative T-Lymphozytenreaktion auf die MLR fördern (oder kleinmolekulare Agonisten oder Antikörper, die auf agonistische Weise auf den gleichen Rezeptor wirken), können therapeutisch zur Behandlung von Krebs eingesetzt werden. Moleküle, welche die Lymphozytenreaktion in der MLR hemmen, funktionieren auch in vivo bei Neoplasie, um die Immunantwort auf ein Neoplasma zu unterdrücken; solche Moleküle können entweder durch die neoplastischen Zellen selbst exprimiert werden, oder ihre Expression kann durch das Neoplasma in andere Zellen induziert werden. Der Antagonismus solcher inhibitorischen Moleküle (entweder mit einem Antikörper, kleinmolekularen Antagonisten oder anderen Mitteln) erhöht die immunvermittelte Tumorabstoßung.
Weiters kann die Hemmung von Molekülen mit proinflammatorischen Eigenschaften therapeutische Wirkung bei Reperfusionsschäden; Schlaganfällen, Myokardinfarkt; Atherosklerose; akuten Lungenschäden; Blutungsschocks; Verbrennungen; Sepsis/septischen Schocks; akuter Tubulusnekrose; Endometriose; Osteoarthritis und Pankreatitis aufweisen.
Die PRO-Polypeptide und Verbindungen der vorliegenden Erfindung, z.B. PRO-Polypeptide oder Antikörper, werden einem Säugetier, vorzugsweise einem Menschen, gemäß bekannten Verfahren, wie z.B. intravenöser Verabreichung als Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion über einen gewissen Zeitraum, auf intramuskulärem, intraperitonealem, intrazerebrospinalem, subkutanem, intraartikulärem, intrasynovialem, intrathekalem, oralem, topischem oder inhalatorischem (intranasa lem, intrapulmonalem) Weg, verabreicht. Intravenöse oder Inhalationsverabreichung von Polypeptiden und Antikörpern ist bevorzugt.
Bei einer Immunadjuvans-Therapie können andere Therapieschemata, wie z.B. die Verabreichung eines Antikrebsmittels, mit der Verabreichung der Proteine, Antikörper oder Verbindungen der vorliegenden Erfindung kombiniert werden. Der mit dem Immunadjuvans der Erfindung zu behandelnde Patient kann beispielsweise außerdem ein Antikrebsmittel (Chemotherapeutikum) oder Strahlungstherapie erhalten. Die Herstellung und Dosierungsschemata für solche Chemotherapeutika können den Anleitungen der Hersteller entsprechend oder von Fachleuten empirisch bestimmt werden. Die Herstellung und Dosierungsschemata für solch eine Chemotherapie sind auch in Chemotherapy Service, M.C. Perry, Hrsg., Williams & Williams, Baltimore, MD, USA (1992), beschrieben. Das Chemotherapeutikum kann vor oder nach der Verabreichung des Immunadjuvans oder gleichzeitig damit gegeben werden. Außerdem kann auch eine Antiöstrogenverbindung, wie z.B. Tamoxifen, oder ein Antiprogesteron, wie z.B. Onapriston (siehe EP 616812 ), in für solche Moleküle bekannten Dosierungen verabreicht werden.
Es kann wünschenswert sein, auch Antikörper gegen andere assoziierte Immunerkrankungen oder tumorassoziierte Antigene, wie z.B. Antikörper, die an CD20, CD11a, CD18, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 oder den Gefäßendothelfaktor (VEGF) binden, zu verabreichen. Alternativ oder zusätzlich dazu können dem Patienten gemeinsam zwei oder mehr Antikörper, welche die gleichen oder zwei oder mehr unterschiedliche Antigene, wie hierin offenbart, binden, verabreicht werden. Manchmal kann es von Vorteil sein, dem Patienten auch ein oder mehrere Cytokine zu verabreichen. In einer Ausführungsform werden die Polypeptide der Erfindung gemeinsam mit einem wachstumshemmenden Mittel verabreicht. Das wachstumshemmende Mittel kann beispielsweise zuerst verabreicht werden, gefolgt von einem PRO-Polypeptid der Erfindung. Aber auch eine gleichzeitige Verabreichung oder eine Verabreichung als Erstes sind vorgesehen. Geeignete Dosierungen des wachstumshemmenden Mittels sind die derzeit verwendeten, und diese können aufgrund des Zusammenwirkens (Synergie) des wachstumshemmenden Mittels und des PRO-Polypeptids der Erfindung verringert werden.
Für die Behandlung oder Linderung der Schwere einer Immunerkrankung hängt die geeignete Dosis eines PRO-Polypeptids oder einer Verbindung der Erfindung von der Art der zu behandelnden Krankheit, wie oben definiert, der Schwere und dem Verlauf der Krankheit, davon, ob das Mittel für präventive oder therapeutische Zwecke verabreicht wird, von vorangegangenen Therapien, der klinischen Vorgeschichte des Patienten, davon, wie er auf die Verbindung anspricht, und vom Ermessen des behandelnden Arztes ab. Die Verbindung kann dem Patienten auf einmal oder in mehreren Behandlungen verabreicht werden.
Beispielsweise ist, je nach Art und Schwere der Erkrankung, etwa 1 μg/kg bis 15 mg/kg (z.B. 0,1-20 mg/kg) Polypeptid oder Antikörper eine passende Anfangsdosierung für die Verbindung an einen Patienten, egal ob es sich um eine einmalige oder um mehrere Verabreichungen oder um eine kontinuierliche Infusion handelt. Eine typische Tagesdosis kann, in Abhängigkeit von den oben genannten Faktoren, von etwa 1 μg/kg bis 100 mg/kg oder mehr reichen. Für wiederholte Verabreichungen über mehrere Tage oder länger wird die Behandlung, je nach Zustand, fortgesetzt, bis eine gewünschte Unterdrückung der Krankheitssymptome zu verzeichnen ist. Aber auch andere Dosierungsschemata können geeignet sein. Der Fortschritt dieser Therapie kann leicht mithilfe herkömmlicher Verfahren und Tests überwacht werden.
O. Herstellungsartikel
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Herstellungsartikel, der Materialien enthält, die für die Diagnose oder Behandlung der oben beschriebenen Erkrankungen nützlich sind, bereitgestellt. Der Herstellungsartikel umfasst einen Behälter und eine Markierung. Geeignete Behälter umfassen beispielsweise Flaschen, Phiolen, Spritzen und Teströhrchen. Die Behälter können aus zahlreichen verschiedenen Materialien wie z.B. Glas oder Kunststoff hergestellt sein. Der Behälter enthält eine Zusammensetzung, die zur Diagnose oder Behandlung des Leidens wirksam ist, und kann eine sterile Zugangsöffnung aufweisen (beispielsweise kann der Behälter ein intravenöser Lösungsbeutel oder eine Phiole mit einem Septum, das mit einer subkutanen Injektionsnadel durchstochen werden kann, sein). Der Wirkstoff in der Zusammensetzung ist üblicherweise ein PRO-Polypeptid oder ein Antikörper der Erfindung. Die Beschriftung am Behälter oder die in Verbindung mit dem Behälter vorhandene Beschreibung gibt an, dass die Zusammensetzung zur Diagnose oder Behandlung der betreffenden Erkrankung verwendet wird. Der Herstellungsartikel kann ferner einen zweiten Behälter umfassen, der einen pharmazeutisch annehmbaren Puffer wie z.B. eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Ringer-Lösung und Dextrose-Lösung umfasst. Weiters kann er andere Materialien umfassen, die aus wirtschaftlicher Sicht und aus der Sicht des Benutzers wünschenswert sind, einschließlich anderer Puffer, Verdünnungsmittel, Filter, Nadeln, Spritzen und Packungsbeilagen mit Gebrauchsanweisungen.
P. Diagnose und Prognose von Immunerkrankungen
Zelloberflächenproteine, wie z.B. Proteine, die bei bestimmten Immunerkrankungen überexprimiert werden, sind hervorragende Targets für Arzneimittelkandidaten oder die Behandlung von Krankheiten. Die gleichen Proteine finden zusammen mit sekretierten Proteinen, für welche die bei Immunerkrankungen amplifizierten Gene kodieren, außerdem Anwendung bei der Diagnose und Prognose dieser Erkrankungen. Beispielsweise können Antikörper, die gegen die Proteinprodukte von Genen gerichtet sind, die bei multipler Sklerose, rheumatoider Arthritis oder anderen Immunerkrankungen amplifiziert werden, als Diagnostika oder Prognosemittel eingesetzt werden.
Beispielsweise können Antikörper, einschließlich Antikörperfragmenten, zur qualitativen oder quantitativen Detektion der Expression von Proteinen verwendet werden, für welche amplifizierte oder überexprimierte Gene kodieren („Markergenprodukte"). Der Antikörper ist vorzugsweise mit einer detektierbaren, z.B. fluoreszierenden, Markierung versehen, und die Bindung kann mithilfe von Lichtmikroskopie, Durchflusszytometrie, Fluorimetrie oder anderen auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfah ren überwacht werden. Diese Verfahren sind besonders gut geeignet, wenn das überexprimierte Gen für ein Zelloberflächenprotein kodiert. Solche Bindungstests werden im Wesentlichen wie oben beschrieben durchgeführt.
In-situ-Detektion von Antikörperbindung an die Markergenprodukte kann beispielsweise durch Immunfluoreszenz oder Immun-Elektronenmikroskopie durchgeführt werden. Zu diesem Zweck wird eine histologische Probe vom Patienten entnommen, und ein markierter Antikörper wird darauf angewendet, vorzugsweise indem der Antikörper über die biologische Probe geschichtet wird. Dieses Verfahren ermöglicht außerdem die Bestimmung der Verteilung des Markergenprodukts im untersuchten Gewebe. Für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung wird offensichtlich sein, dass unterschiedlichste histologische Verfahren für In-situ-Detektion zur Verfügung stehen.
Die folgenden Beispiele werden ausschließlich als Veranschaulichung bereitgestellt und sollen den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung in keiner Weise einschränken.
In den Beispielen genannte, im Handel erhältliche Reagenzien wurden, sofern nicht anders angegeben, gemäß den Anweisungen der Hersteller verwendet. Die Quelle jener Zellen, die in den folgenden Beispielen und in der gesamten Beschreibung durch ATCC-Zugriffsnummern identifiziert werden, ist die American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA. Sofern nicht anders angegeben werden in der vorliegenden Erfindung Standardverfahren der DNA-Rekombinationstechnologie eingesetzt, beispielsweise die hierin weiter oben und in den folgenden Literaturverweisen beschriebenen: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Press N.Y., USA (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., USA (1989); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., N.Y., USA (1990); Harlow et al., Antibodies: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor (1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford (1984); Freshney, Animal Cell Culture (1987); Coligan et al., Current Protocols in Immunology (1991).
BEISPIELE
Im Handel erhältliche Reagenzien, auf die in den Beispielen verwiesen wird, wurden, außer anders angemerkt, gemäß den Vorschriften der Hersteller verwendet. Die Quelle jener Zellen, die in den folgenden Beispielen und in der gesamten Beschreibung durch ATCC-Zugriffsnummern identifiziert werden, ist die American Type Culture Collection, Manassas, VA.
BEISPIEL 1: Isolierung von cDNA-Klonen, die für menschliches PRO256 (UNQ223) kodieren
A. Assemblierung von Consensus-cDNA-Sequenzen
Die Sequenzen der extrazellulären Domänen (ECD) (einschließlich des Sekretionssignals, sofern vorhanden) aus etwa 950 bekannten sekretierten Proteinen aus der öffentlich zugänglichen Swiss-Prot-Proteindatenbank wurden verwendet, um EST-Datenbanken (EST = exprimierte sequenzmarkierte Stellen) zu durchsuchen. Die EST-Datenbanken umfassten öffentliche EST-Datenbanken (z.B. GenBank) und eine private EST-DNA-Datenbank (LIFESEQ^TM, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA, USA). Die Suche wurde unter Verwendung des Computerprogramms BLAST oder BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996)) in Form eines Vergleichs der ECD-Proteinsequenzen mit einer 6-Raster-Translation der EST-Sequenzen durchgeführt. Diese Vergleiche mit einem BLAST-Score von 70 (oder in manchen Fällen von 90) oder mehr, die nicht für bekannte Proteine kodierten, wurden gruppiert und mit dem Programm „phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, WA, USA) zu Consensus-DNA-Sequenzen assembliert.
B. Isolierung von cDNA-Klonen, die für menschliches PRO256 (UNQ223) kodieren
Eine Consensus-DNA-Sequenz wurde unter Bezugnahme auf andere EST-Sequenzen unter Verwendung von phrap assembliert, wie in Beispiel 1, Teil A, oben beschrieben ist. Diese Consensus-Sequenz wird hierin als DNA28725 bezeichnet. Ausgehend von der DNA28725-Consensus-Sequenz wurden Oligonucleotide synthetisiert, 1) um mittels PCR eine cDNA-Bibliothek zu identifizieren, welche die Sequenz von Interesse enthielt, und 2) zur Verwendung als Sonde zur Isolierung eines Klons der für PRO256 kodierenden Sequenz voller Länge. Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Primer weisen im Allgemeinen 20 bis 30 Nucleotide auf und sind oft so beschaffen, dass sie ein PCR-Produkt mit einer Länge von etwa 100-1.000 bp ergeben. Die Sondensequenzen weisen typischerweise eine Länge von 40-55 bp auf. In manchen Fällen werden zusätzliche Oligonucleotide synthetisiert, wenn die Consensus-Sequenz länger als etwa 1-1,5 kbp ist. Um mehrere Bibliotheken auf einen Volllängenklon zu screenen, wurde DNA aus den Bibliotheken durch PCR-Amplifikation, wie von Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, beschrieben, mit dem PCR-Primerpaar gescreent. Eine positive Bibliothek wurde dann verwendet, um unter Verwendung des Sonden-Oligonucleotids und eines der Primerpaare Klone zu isolieren, die für das Gen von Interesse kodieren.
Ein Paar PCR-Primer (vorwärts und rückwärts) wurden synthetisiert:

Vorwärts-PCR-Primer: 5'-TGTCCACCAAGCAGACAGAAG-3' (SEQ.-ID Nr. 35)
Rückwärts-PCR-Primer: 5'-ACTGGATGGCGCCTTTCCATG-3' (Seq.-ID Nr. 36)

Darüber hinaus wurden zwei Oligonucleotid-Hybridisierungssonden aus der Consensus-DNA28725-Sequenz konstruiert, die die folgende Nucleotidsequenzen aufwiesen:
Hybridisierungssonden:

5'-CTGACAGTGACTAGCTCAGACCACCCAGAGGACACGGCCAACGTCACAGT-3' (Seq.-ID Nr. 37)
5'-GGGCTCTTTCCCACGCTGGTACTATGACCCCACGGAGCAGATCTG-3' (Seq.-ID Nr. 38)

Um mehrere Bibliotheken auf eine Quelle eines Klons voller Länge zu screenen, wurde DNA aus den Bibliotheken mittels PCR-Amplifikation mit dem oben identifizierten PCR-Primerpaar gescreent. Eine positive Bibliothek wurde dann verwendet, um Klone, die für das PRO256-Gen kodieren, unter Verwendung der Sondenoligonucleotide und eines der PCR-Primer zu isolieren.
RNA zur Konstruktion der cDNA-Bibliotheken wurde aus menschlichem Plazentagewebe isoliert. Die cDNA-Bibliotheken, die zur Isolation der cDNA-Klone verwendet wurden, wurden mittels herkömmlicher Verfahren unter Verwendung von im Handel erhältlichen Reagenzien wie jenen von Invitrogen, San Diego, CA, konstruiert. Die cDNA wurde mit Oligo-dT, das eine NotI-Stelle enthielt, geprimt, mit dem Blunt-Ende an hemikinasierte Sall-Adaptoren gebunden, mit NotI gespaltet, auf geeignete Weise durch Gelelektrophorese klassiert und in einer definierten Ausrichtung in einen geeigneten Kloniervektor (wie z.B. pRKB oder pRKD; pRK5B ist ein Vorläufer von pRK5D, der die Sfil-Stelle nicht enthält; siehe Holmes et al., Science 253, 1278-1280 (1991)) in den einmaligen XhoI- und NotI-Stellen kloniert.
DNA-Sequenzieren der wie zuvor beschrieben isolierten Klone ergab die DNA-Sequenz voller Länge für PRO256 (hierin als DNA35880-1660 bezeichnet) (Seq.-ID Nr. 11) und die abgeleitete Proteinsequenz für PRO256.
Die gesamte Nucleotidsequenz von DNA35880-1660 ist in 1 (Seq.-ID Nr. 11) gezeigt. Klon DNA35880-1660 enthält einen einzelnen offenen Leseraster mit einer eindeutigen Translationsinitiationsstelle an Nucleotidpositionen 188-190 und endet mit dem Stoppcodon an Nucleotidpositionen 1775-1777. Der vorhergesagte Polypeptidvorläufer ist 529 Aminosäuren lang (2). Der Klon DNA35880-1660 wurde bei der ATCC hinterlegt und bekam die ATCC-Hinterlegungs-Nr. 209379 zugeteilt.
Eine Analyse der Aminosäuresequenz des Volllängen-PRO256-Polypeptids legt nahe, dass Abschnitte davon signifikante Homologie zu dem menschlichen Bikunin-Protein aufweisen, was darauf hinweist, dass PRO256 ein neuer Proteinase-Inhibitor sein könnte.
BEISPIEL 2: Stimulierende Aktivität in einem gemischten Lymphozytenreaktions-(MLR-) Test (Assay 24)
Dieses Beispiel zeigt, dass bestimmte Polypeptide der Erfindung als Stimulatoren der Proliferation von stimulierten T-Lymphozyten aktiv sind. Verbindungen, welche die Proliferation von Lymphozyten stimulieren, sind therapeutisch von Nutzen, wenn eine Steigerung der Immunantwort vorteilhaft ist. Ein Therapeutikum kann in Form von Antagonisten des PRO-Polypeptids der Erfindung vorliegen, beispielsweise von Maus-Mensch-chimären, humanisierten oder menschlichen Antikörpern gegen das Polypeptid.
Die grundlegende Arbeitsvorschrift für diesen Test ist in Current Protocols in Immunology, Unit 3.12, J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Marglies, E.M. Shevach, W. Strober, Hrsg., National Institutes of Health, veröffentlicht von John Wiley & Sons, Inc., beschrieben.
Genauer gesagt werden in einer Testvariante mononukleäre Zellen des peripheren Bluts (PBMC) durch Leukopherese aus Säugetieren, beispielsweise menschlichen Freiwilligen, isoliert (ein Spender stellt Stimulator-PBMCs bereit, der andere Spender Responder-PBMCs). Falls erwünscht können die Zellen nach der Isolation in fötalem Rinderserum und DMSO eingefroren werden. Eingefrorene Zellen können über Nacht in einem Testmedium (37 °C, 5 % CO₂) aufgetaut und dann gewaschen und auf 3 × 10⁶ Zellen/ml Testmedium (RPMI; 10 % fötales Rinderserum, 1 % Penicillin/Streptomycin, 1 % Glutamin, 1 % HEPES, 1 % nichtessentielle Aminosäuren, 1 % Pyruvat) resuspendiert werden. Die Stimulator-PBMCs werden durch Bestrahlen der Zellen (etwa 3000 rad) hergestellt.
Der Test wird durch Ausplattieren von
100:1 einer auf 1 % oder 0,1 % verdünnten Testprobe,
50:1 bestrahlten Stimulatorzellen und
50:1 Responder-PBMC-Zellen
in Wells in dreifacher Ausfertigung vorbereitet.
100 μl Zellkulturmedium oder 100 μl CD4-IgG werden als Kontrolle verwendet. Die Wells werden dann bei 37 °C, 5 % CO₂ 4 Tage lang inkubiert. Am 5. Tag wird jeder Well mit tritiiertem Thymidin gepulst (1,0 mC/Well; Amersham). Nach 6 Stunden werden die Zellen 3-mal gewaschen, und die Aufnahme der Markierung wird bewertet.
Bei einer andere Variante dieses Tests werden PBMCs aus der Milz von Balb/c-Mäusen und C57B6-Mäusen isoliert. Die Zellen werden von frisch gewonnen Milzen in einem Testmedium abgetrennt (RPMI; 10 % fötales Rinderserum, 1 % Penicillin/Streptomycin, 1 % Glutamin, 1 % HEPES, 1 % nichtessentielle Aminosäuren, 1 % Pyruvat), und die PBMCs werden isoliert, indem diese Zellen über Lympholyte M (Organon Teknika) überschichtet, bei 2000 U/min 20 Minuten lang zentrifugiert, abgenommen und die Schicht aus mononuklearen Zellen in einem Testmedium gewaschen und die Zellen auf 1 × 10⁷ Zellen/ml Testmedium resuspendiert wurden. Der Test wird dann wie oben beschrieben durchgeführt.
Positive Steigerungen im Vergleich zur Kontrolle werden als positiv erachtet, wobei Steigerungen von mehr als oder gleich 180 % bevorzugt sind. Jeder Wert, der höher ist als bei der Kontrolle, weist jedoch auf eine stimulierende Wirkung des Testproteins hin. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 7 zusammengefasst. Tabelle 7

PRO PRO-Konzentration Prozentuelle Steigerung zur Kontrolle

PRO256 1,80 nM 261,0

" 0,225 nM 202,0

" 0,028 nM 150,0
BEISPIEL 3: Human-Costimulationstest
Neben dem durch den T-Zell-Rezeptor vermittelten Aktivierungssignal erfordert die T-Zell-Aktivierung auch ein Costimulationssignal. Ein Costimulationssignal wird durch die Wechselwirkung zwischen B7 (CD3) und CD28 erzeugt. Bei diesem Test werden 96-Well-Platten mit CD3 mit oder ohne CD28 beschichtet, und dann werden menschliche Peripherblut-Lymphozyten und dann ein Testprotein zugesetzt. Die Proliferation der Lymphozyten wird durch die Aufnahme von tritiiertem Thymidin bestimmt. Ein positiver Test zeigt, dass das Testprotein ein stimulierendes Signal für die Lymphozytenproliferation bereitstellte.
Material:

1) Hyclone D-PBS ohne Calcium, Magnesium
2) Zertifizierte Nunc-96-Well-Platten Nr. 4-39454
3) Anti-Human-CD3 Amac 0178 200 μm/ml Stammlösung
4) Anti-Human-CD28 Biodesign P42235M
5) Medium: Gibco RPMI 1640 + 10 % Intergen Nr. 1020-90 FBS, 1 % Glu, 1 % P/S, 50 μg/ml Gentamycin, 10 mM Hepes, bei jedem Test frisch
6) Tritiiertes Thymidin
7) Eingefrorene menschliche Peripherblut-Lymphozyten (PBL), gewonnen mittels eines Leukophorese-Verfahrens.

Platten werden vorbereitet, indem 96-Well-Flachbodenplatten mit einem Anti-CD3-Antikörper (Amac) oder einem Anti-CD28-Antikörper (Biodesign) oder beidem in Hyclone D-PBS ohne Calcium und Magnesium beschichtet werden. 10 ng/Well (50:1 von 200 ng/ml) Anti-CD3-Antikörper und 25 ng/Well (50:1 von 0,5 μg/ml) werden in einem Gesamtvolumen von 100:1 verwendet.
PBLs werden unter Einsatz herkömmlicher Leukophorese-Verfahren aus menschlichen Spendern isoliert. Die Zellpräparate werden in 50 % fötalem Rinderserum und 50 % DMSO eingefroren, bis der Test durchgeführt wird. Die Zellen werden vorbereitet, indem die PBLs aufgetaut und in einem Medium gewaschen, die PBLs dann in 25 ml Medium resuspendiert und bei 37 °C, 5 % CO₂ über Nacht inkubiert werden.
Bei der Durchführung des Tests wird die beschichtete Platte zweimal mit PBS gewaschen, und die PBLs werden gewaschen und auf 1 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert, wobei 100 μl/Well eingesetzt werden. 100 μl eines Testproteins oder eines Kontrollmediums werden zur Platte zugesetzt, was ein Gesamtvolumen von 200 μl pro Well ergibt. Die Platte wird 72 Stunden lang inkubiert. Dann wird die Platte 6 h lang mit tritiiertem Thymidin gepulst (1 mC/Well, Amersham), und die PBLs werden von den Platten geerntet und auf die Aufnahme von tritiiertem Thymidin bewertet.

Die Ergebnisse dieses Tests für Verbindungen der Erfindung sind in Tabelle 8 zusammengefasst. Positive Steigerungen im Vergleich zur Kontrolle werden als positiv erachtet, wobei Steigerungen von mehr als oder gleich 180 % bevorzugt sind. Jeder Wert, der höher ist als bei der Kontrolle, weist jedoch auf eine stimulierende Wirkung des Testproteins hin. PBMC steht für mononukleäre Zellen des peripheren Bluts. Tabelle 8

PRO	PRO-Konzentration	Prozentuelle Steigerung
		zur Kontrolle
PRO256	0,4 % der Stammlösung (CD4)	254 (Stammlösung = 180 mM)
PRO256	0,04 % der Stammlösung (CD4)	338
PRO256	0,7 % der Stammlösung (PBMC)	243
PRO256	0,07 % der Stammlösung (PBMC)	659

BEISPIEL 4: Verwendung von PRO als Hybridisierungssonde
Das folgende Verfahren beschreibt die Verwendung einer für PRO kodierenden Nucleotidsequenz als Hybridisierungssonde.
DNA, welche die kodierende Sequenz von Volllängen- oder reifem PRO wie hierein offenbart umfasst, wird als Sonde zum Screenen auf homologe DNAs (wie z.B. solche, die für natürlich vorkommende Varianten von PRO kodieren) in Humangewebe-cDNA-Bibliotheken oder genomischen Humangewebe-Bibliotheken eingesetzt.
Die Hybridisierung und das Waschen von Filtern, die DNAs aus einer der Bibliotheken enthalten, werden unter folgenden hochstringenten Bedingungen durchgeführt.
Die Hybridisierung einer radioaktiv markierten, von PRO abgeleiteten Sonde an die Filter wird in einer Lösung aus 50 % Formamid, 5 × SSC, 0,1 % SDS, 0,1 % Natriumpyrophosphat, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 2 × Denhardt-Lösung und 10 % Dextransulfat bei 42 °C 20 Stunden lang durchgeführt. Das Waschen der Filter wird in einer wässrigen Lösung aus 0,1 × SSC und 0,1 % SDS bei 42 °C durchgeführt.
DNAs mit einer gewünschten Sequenzidentität mit der DNA, die für Nativsequenz-PRO voller Länge kodiert, können dann unter Einsatz von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Standardverfahren identifiziert werden.
BEISPIEL 5: Expression von PRO in E. coli
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung einer unglykosylierten Form von PRO durch rekombinante Expression in E. coli.
Die für PRO kodierende DNA-Sequenz wird anfänglich unter Verwendung von selektierten PCR-Primern amplifiziert. Die Primer sollten Restriktionsenzymstellen enthalten, die den Restriktionsenzymstellen am ausgewählten Expressionsvektor entsprechen. Zahlreiche verschiedene Expressionsvektoren können verwendet werden. Ein Beispiel für einen geeigneten Vektor ist pBR322 (abgeleitet von E. coli; siehe Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)), der Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz enthält. Der Vektor wird mit Restriktionsenzym verdaut und dephosphoryliert. Die PCR-amplifizierten Sequenzen werden dann in den Vektor ligiert. Der Vektor umfasst vorzugsweise Sequenzen, die für ein Antibiotika-Resistenzgen, einen trp-Promotor, einen Polyhis-Leader (einschließlich der ersten sechs STII-Codons, Polyhis-Sequenz und Enterokinase-Spaltungsstelle), die PRO-Kodierregion, λ-Transkriptionsterminator und ein argU-Gen kodieren.
Das Ligationsgemisch wird dann verwendet, um einen ausgewählten E.-coli-Stamm unter Verwendung der in Sambrook et al., s.o., beschriebenen Verfahren zu transformieren. Transformanten werden durch ihrer Fähigkeit identifiziert, auf LB-Platten zu wachsen, und Antibiotika-resistente Kolonien werden dann ausgewählt. Plasmid-DNA kann isoliert und durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzieren bestätigt werden.
Ausgewählte Klone können über Nacht in flüssigem Kulturmedium wie beispielsweise LB-Nährmedium, ergänzt mit Antibiotika, gezüchtet werden. Die Übernacht-Kultur kann in weiterer Folge verwendet werden, um eine Kultur größeren Ausmaßes zu inokulieren. Die Zellen werden dann bis zu einer erwünschten optischen Dichte gezüchtet, währenddessen der Expressionspromotor angeschaltet ist.
Nach dem Kultivieren der Zellen über mehrere weitere Stunden hinweg können die Zellen durch Zentrifugation geerntet werden. Das durch die Zentrifugation erhaltene Zellpellet kann unter Verwendung verschiedener, auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Mittel solubilisiert werden, und das solubilisierte PRO-Protein kann dann unter Verwendung einer Metallchelatbildnersäule unter Bedingungen, die feste Bindung des Proteins ermöglichen, gereinigt werden.
PRO kann in E. coli in einer poly-His-markierten Form unter Verwendung des folgenden Verfahrens exprimiert werden. Die für PRO kodierende DNA wird anfänglich unter Verwendung selektierter PCR-Primer amplifiziert. Die Primer enthalten Restriktionsenzymstellen, die den Restriktionsenzymstellen am ausgewählten Expressionsvektor entsprechen, sowie andere nützliche Sequenzen, die für wirksame und zuverlässige Translationsinitiation, rasche Reinigung an einer Metallchelatbildungssäule und proteolytische Entfernung mit Enterokinase sorgen. Die PCR-amplifizierten, poly-His-markierten Sequenzen werden dann in einen Expressionsvektor ligiert, der verwendet wird, um einen E.-coli-Wirt, basierend auf Stamm 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts(htpRts) clpP(laclq)), zu transformieren. Transformanten werden zuerst in LB, das 50 mg/ml Carbenicillin enthält, bei 30 °C unter Schütteln gezüchtet, bis eine O.D.₆₀₀ von 3-5 erreicht ist. Kulturen werden dann 50- bis 100fach in CRAP-Medium (hergestellt durch Vermischen von 3,57 g (NH₄)₂SO₄, 0,71 g Natriumcitrat 2H₂O, 1,07 g KCl, 5,36 g Difco Hefeextrakt, 5,36 g Sheffield-Hycase SF in 500 ml Wasser sowie 110 mM MPOS, pH 7,3, 0,55 % (Gew./Vol.) Glucose und 7 mM MgSO₄) verdünnt und etwa 20-30 Stunden lang bei 30 °C unter Schütteln gezüchtet. Proben werden dann entnommen, um Expression durch SDS-PAGE-Analyse zu überprüfen, und der Hauptteil der Kultur wird zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Zellpellets werden bis zur Reinigung und Rückfaltung eingefroren.
E.-coli-Paste aus 0,5- bis 1-1-Fermentationen (6-10 g Pellets) wird in 10 Volumina (Gew./Vol.) in 7 M Guanidin, 20 mM Tris, pH 8 (Puffer) resuspendiert. Festes Natriumsulfit und Natriumtetrathiosulfat werden zugesetzt, um Endkonzentrationen von 0,1 M bzw. 0,02 M zu erreichen, und die Lösung wird über Nacht bei 4 °C gerührt.
Dieser Schritt führt zu einem denaturierten Protein, in dem alle Cysteinreste durch Sulfitolisierung blockiert sind. Die Lösung wird bei 40.000 U/min in einer Beckman-Ultrazentrifuge 30 min lang zentrifugiert. Der Überstand wird mit 3-5 Volumina Metallchelatsäulenpuffer (6 M Guanidin, 20 mM Tris, pH 7,4) verdünnt und durch 0,22-μm-Filter zur Klärung filtriert. Der geklärte Extrakt wird auf eine 5-ml-Qiagen-Ni-NTA-Metallchelatsäule geladen, die in Metallchelatsäulenpuffer äquilibriert wurde. Die Säule wird mit zusätzlichem Puffer gewaschen, der 50 mM Imidazol (Calbiochem, Utrol-Gütegrad), pH 7,4, enthält. Das Protein wird mit Puffer, der 250 mM Imidazol enthält, eluiert. Die das erwünschte Protein enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und bei 4 °C gelagert. Die Proteinkonzentration wird durch sein Absorptionsvermögen bei 280 nm unter Verwendung des berechneten Extinktionskoeffizienten basierend auf seiner Aminosäuresequenz geschätzt.
Die Proteine werden durch langsames Verdünnen der Probe in frisch hergestellten Rückfaltungspuffer, der aus 20 mM Tris, pH 8,6, 0,3 M NaCl, 2,5 M Harnstoff, 5 mM Cystein, 20 mM Glycin und 1 mM EDTA besteht, rückgefaltet. Rückfaltungsvolumina werden so ausgewählt, dass die Endproteinkonzentration zwischen 50 und 100 μg/ml liegt. Die Rückfaltungslösung wird bei 4 °C 12-36 Stunden lang sanft gerührt. Die Rückfaltungsreaktion wird durch den Zusatz von TFA zu einer Endkonzentration von 0,4 % (pH etwa 3) gequencht. Vor weiterer Reinigung des Proteins wird die Lösung durch ein 0,22-μm-Filter filtriert, und Acetonitril wird zur Erreichung einer Endkonzentration von 2-10 % zugesetzt. Das rückgefaltete Protein wird an einer Poros-R1/H-Umkehrphasensäule unter Verwendung eines mobilen Puffers von 0,1 % TFA mittels Elution mit einem Acetonitril-Gradienten von 10 bis 80 % chromatographiert. Aliquoten von Fraktionen mit A280-Absorption werden an SDS-Polyacrylamidgelen analysiert, und Fraktionen, die homogenes rückgefaltetes Protein enthalten, werden gesammelt. Im Allgemeinen werden die korrekt gefalteten Spezies der meisten Proteine bei den niedrigsten Konzentrationen von Acetonitril eluiert, da diese Spezies am kompaktesten sind und ihr hydrophobes Inneres vor Wechselwirkung mit dem Umkehrphasenharz geschützt ist. Aggregierte Spezies werden üblicherweise bei höheren Acetonitrilkonzentrationen eluiert. Zusätzlich zum Auflösen fehlgefalteter Formen von Proteinen aus der erwünschten Form entfernt der Umkehrphasenschritt auch Endotoxin aus den Proben.
Fraktionen, die das erwünschte gefaltete PRO-Polypeptid enthalten, werden gesammelt, und das Acetonitril wird unter Verwendung eines sanften Stickstoffstroms, der auf die Lösung gerichtet ist, entfernt. Proteine werden in 20 mM Hepes, pH 6,8, mit 0,14 M Natriumchlorid und 4 % Mannit durch Dialyse oder durch Gelfiltration unter Verwendung von G25-Superfine-Harzen (Pharmacia), äquilibriert im Formulierungspuffer, formuliert und steril filtriert.
Zahlreiche der in der WO 01/05972 offenbarten PRO-Polypeptide wurden erfolgreich wie oben beschrieben exprimiert.
BEISPIEL 6: Expression von PRO in Säugetierzellen
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung einer potenziell glykosylierten Form von PRO durch rekombinante Expression in Säugetierzellen.
Der Vektor pRK5 (siehe die EP 307.247 , veröffentlicht am 15. März 1989) wird als der Expressionsvektor verwendet. Gegebenenfalls wird die PRO-DNA in pRK5 mit ausgewählten Restriktionsenzymen ligiert, um Insertion der PRO-DNA unter Verwendung von Ligationsverfahren, wie sie in Sambrook et al., s.o., beschrieben werden, zu ermöglichen. Der resultierende Vektor wird als pRK5-PRO bezeichnet.
In einer Ausführungsform können die ausgewählten Wirtszellen 293-Zellen sein. Menschliche 293-Zellen (ATCC CCL 1573) werden bis zur Konfluenz in Gewebekulturplatten in Medium wie z.B. DMEM, ergänzt mit fötalem Kälberserum und gegebenenfalls Nährstoffkomponenten und/oder Antibiotika, gezüchtet. Etwa 10 μg pRK5-PRO-DNA werden mit etwa 1 μg DNA, die für das VA-RNA-Gen kodiert [Thimmappaya et al., Cell 31, 543 (1982)], vermischt und in 500 μl von 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl₂ aufgelöst. Zu diesem Gemisch werden 500 μl von 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO₄ zugetropft, und ein Niederschlag wird 10 min lang bei 25 °C bilden gelassen. Der Niederschlag wird suspendiert, zu den 293-Zellen zugesetzt und etwa vier Stunden lang bei 37 °C absetzen gelassen. Das Kulturmedium wird abgesaugt, und 2 ml von 20 % Glycerin in PBS werden 30 Sekunden lang zugesetzt. Die 293-Zellen werden dann mit serumfreiem Medium gewaschen, frisches Medium wird zugesetzt, und die Zellen werden etwa 5 Tage lang inkubiert.
Etwa 24 Stunden nach den Transfektionen wird das Kulturmedium entfernt und durch Kulturmedium (alleine) oder Kulturmedium, das 200 μCi/ml ³⁵S-Cystein und 200 μCi/ml ³⁵S-Methionin enthält, ersetzt. Nach einer 12-ständigen Inkubation wird das konditionierte Medium gesammelt, an einem Zentrifugenfilter eingeengt und auf ein 15%iges SDS-Gel geladen. Das bearbeitete Gel kann getrocknet werden, und ein Film kann damit eine ausgewählte Zeitspanne lang belichtet werden, um die Gegenwart von PRO-Polypeptid aufzuzeigen. Die Kulturen, die transfizierte Zellen enthalten, können weiterer Inkubation (in serumfreiem Medium) unterzogen werden, und das Medium wird in ausgewählten Biotests getestet.
In einem alternativen Verfahren kann PRO in 293-Zellen unter Verwendung des Dextransulfatverfahrens, das von Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 12, 7575 (1981), beschrieben wird, vorübergehend eingeführt werden. 293-Zellen werden in einem Zentrifugenkolben bis zu maximaler Dichte gezüchtet, und 700 μg pRK5-PRO-DNA werden zugesetzt. Die Zellen werden zuerst aus dem Zentrifugenkolben durch Zentrifugieren eingeengt und mit PBS gewaschen. Das DNA-Dextran-Präzipitat wird am Zellpellet vier Stunden lang inkubiert. Die Zellen werden mit 20 % Glycerin 90 Sekunden lang behandelt, mit Gewebekulturmedium gewaschen und neuerlich in den Zentrifugenkolben, der Gewebekulturmedium, 5 μg/ml Rinderinsulin und 0,1 μg/ml Rindertransferrin enthält, eingeführt. Nach etwa vier Tagen wird das konditionierte Medium zentrifugiert und filtriert, um Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Die Probe, die exprimiertes PRO enthält, kann dann eingeengt und mittels jedes beliebigen Verfahrens wie z.B. Dialyse und/oder Säulenchromatographie gereinigt werden.
In einer anderen Ausführungsform kann PRO in CHO-Zellen exprimiert werden. Das pRK5-PRO kann unter Verwendung bekannter Reagenzien wie beispielsweise Ca-PO₄ oder DEAE-Dextran in CHO-Zellen transfiziert werden. Wie zuvor beschrieben können die Zellkulturen inkubiert und das Medium durch Kulturmedium (alleine) oder Medium, das eine radioaktive Markierung wie z.B. ³⁵S-Methionin enthält, ersetzt werden. Nach Bestimmen der Gegenwart von PRO-Polypeptid kann das Kulturmedium durch serumfreies Medium ersetzt werden. Vorzugsweise werden die Kulturen etwa 6 Tage lang inkubiert, und dann wird das konditionierte Medium geerntet. Das das exprimierte PRO enthaltende Medium kann dann konzentriert und durch jedes ausgewählte Verfahren gereinigt werden.
Epitop-markiertes PRO kann auch in Wirts-CHO-Zellen exprimiert werden. Das PRO kann aus dem pRK5-Vektor subkloniert werden. Das Subklon-Insert kann PCR unterzogen werden, um in Raster mit einer ausgewählten Epitopmarkierung wie beispielsweise einer poly-His-Markierung in einen Baculovirus-Expressionsvektor zu fusionieren. Das poly-His-markierte PRO-Insert kann dann in einen SV40-gesteuerten Vektor subkloniert werden, der einen Selektionsmarker wie z.B. DHFR zur Selektion stabiler Klone enthält. Schließlich können die CHO-Zellen (wie zuvor beschrieben) mit dem SV40-gesteuerten Vektor transfiziert werden. Es kann eine Markierung wie zuvor beschrieben angebracht werden, um Expression zu überprüfen. Das Kulturmedium, das das exprimierte poly-His-markierte PRO enthält, kann dann eingeengt und durch jedes ausgewählte Verfahren wie z.B. durch Ni²⁺-Chelataffinitätschromatographie gereinigt werden.
PRO kann auch in CHO- und/oder COS-Zellen durch ein Verfahren zur vorübergehenden Expression oder in CHO-Zellen durch ein anderes Verfahren zur stabilen Expression exprimiert werden.
Stabile Expression in CHO-Zellen wird unter Verwendung des folgenden Verfahrens durchgeführt. Die Proteine werden als ein IgG-Konstrukt (Immunoadhäsin) exprimiert, in dem die Kodiersequenzen für die löslichen Formen (z.B. extrazelluläre Domänen) der jeweiligen Proteine an eine IgG1-Konstantregionensequenz, die die Ge lenks-, CH2 und CH2-Domänen enthält und/oder eine poly-His-markierte Form ist, fusioniert werden.
Nach PCR-Amplifikation werden die jeweiligen DNAs in einem CHO-Expressionsvektor unter Verwendung herkömmlicher Verfahren wie in Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley & Sons (1997), beschrieben subkloniert. CHO-Expressionsvektoren werden so konstruiert, dass sie kompatible Restriktionsstellen 5' und 3' der DNA von Interesse aufweisen, um leichtes Verschieben von cDNAs zu ermöglichen. Der Vektor, der für Expression in CHO-Zellen verwendet wird, ist wie in Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24(9), 1774-1779 (1996), beschrieben und verwendet den frühen SV40-Promotor/Enhancer, um Expression der cDNA von Interesse und von Dihydrofolatreductase (DHFR) zu steuern. DHFR-Expression ermöglicht Selektion für stabile Aufrechterhaltung des Plasmids nach erfolgter Transfektion.
12 μg der erwünschten Plasmid-DNA werden in etwa 10 Millionen CHO-Zellen unter Verwendung von im Handel erhältlichen Transfektionsreagenzien Superfect^® (Qiagen), Dosper^® oder Fugene^® (Boehringer Mannheim) eingeführt. Die Zellen werden wie in Lucas et al., s.o., beschrieben gezüchtet. Etwa 3 × 10^-7 Zellen werde in einer Ampulle für weitere Züchtung und Herstellung wie nachstehend beschrieben eingefroren.
Die die Plasmid-DNA enthaltenden Ampullen werden durch Platzieren in ein Wasserbad aufgetaut und durch Verwirbeln vermischt. Die Inhalte werden in ein Zentrifugenröhrchen pipettiert, das 10 ml Medium enthält, und werden bei 1.000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt, und die Zellen werden in 10 ml selektivem Medium (0,2-μm-filtriertes PS20 mit 5 % 0,2-μm-diafiltriertem fötalem Rinderserum) resuspendiert. Die Zellen werden dann in einer 100-ml-Zentrifuge, die 90 ml selektives Medium enthält, aliquotiert. Nach 1-2 Tagen werden die Zellen in eine 250-ml-Zentrifuge, gefüllt mit 150 ml selektivem Wachstumsmedium, übertragen und bei 37 °C inkubiert. Nach weiteren 2-3 Tagen werden 250-ml-, 500-ml- und 2.000-ml-Zentrifugen mit 3 × 10⁵ Zellen/ml beimpft. Das Zellmedium wird durch frisches Medium durch Zentrifugieren und Resuspension in Produktionsmedium ausgetauscht. Obwohl jedes geeignete CHO-Medium verwendet werden kann, kann hier ein Produktionsmedium, das im US-Patent Nr. 5.122.469 , ausgegeben am 16. Juni 1992, beschrieben wird, verwendet werden. Eine 3-I-Produktionszentrifuge wird bei einer Konzentration von 1,2 × 10⁶ Zellen/ml beimpft. An Tag 0 wird der Zellanzahl-pH bestimmt. An Tag 1 werden der Zentrifuge Proben entnommen, und Hindurchperlenlassen von filtrierter Luft wird begonnen. An Tag 2 werden der Zentrifuge Proben entnommen, die Temperatur wird auf 33 °C geändert, und 30 ml von 500 g/l Glucose und 0,6 ml von 10%igem Antischaummittel (z.B. 35%ige Polydimethylsiloxanemulsion, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion) werden genommen. Im Laufe der Produktion wird der pH sofern erforderlich eingestellt, um ihn auf etwa 7,2 zu halten. Nach 10 Tagen, oder sobald die Lebensfähigkeit auf unter 70 % abgefallen ist, wird die Zellkultur durch Zentrifugieren und Filtrieren durch ein 0,22-μm-Filter geerntet. Das Filtrat wurde entweder bei 4 °C gelagert oder sofort auf Säulen zur Reinigung geladen.
Für die poly-His-markierten Konstrukte wurden die Proteine unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule (Qiagen) gereinigt. Vor der Reinigung wird Imidazol zu dem konditionierten Medium zu einer Konzentration von 5 mM zugesetzt. Das konditionierte Medium wird auf eine 6-ml-Ni-NTA-Säule, äquilibriert in 20 mM Hepes-Puffer, pH 7,4, der 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol enthält, bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 4-5 ml/min bei 4 °C gepumpt. Nach dem Laden wird die Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen, und das Protein wird mit Äquilibrierungspuffer, der 0,25 M Imidazol enthält, eluiert. Das hochgereinigte Protein wird daraufhin in einen Ladepuffer, der 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4 % Mannit, pH 6,8, enthält, mit einer 25-ml-G25-Superfine-Säule (Pharmacia) entsalzt und bei -80 °C gelagert.
(Fc-hältige) Immunoadhäsin-Konstrukte werden aus dem konditionierten Medium wie folgt gereinigt. Das konditionierte Medium wird auf eine 5-ml-Protein-A-Säule (Pharmacia) gepumpt, die in 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH 6,8, äquilibriert wurde. Nach dem Laden wird die Säule ausführlich mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, bevor mit 100 mM Zitronensäure, pH 3,5, eluiert wird. Das eluierte Protein wird unverzüglich durch Sammeln von 1-ml-Fraktionen in Röhrchen, die 275 μl von 1 M Tris-Puffer, pH 9, enthält, neutralisiert. Das hochgereinigte Protein wird daraufhin in Ladepuffer wie zuvor für die poly-His-markierten Proteine beschrieben entsalzt. Die Homogenität wird durch SDS-Polyacrylamidgele und durch Sequenzieren N-terminaler Aminosäuren durch Edman-Abbau bewertet.
Zahlreiche der in der WO 01/05972 offenbarten PRO-Polypeptide wurden erfolgreich wie oben beschrieben exprimiert.
BEISPIEL 7: Expression von PRO in Hefe
Das folgende Verfahren beschreibt rekombinante Expression von PRO in Hefe.
Zuerst werden Hefe-Expressionsvektoren zur intrazellulären Produktion oder Sekretion von PRO aus dem ADH2/GAPDH-Promotor konstruiert. DNA, die für PRO und den Promotor kodiert, wird in geeignete Restriktionsenzymstellen im selektierten Plasmid insertiert, um intrazelluläre Expression von PRO zu steuern. Zur Sekretion kann für PRO kodierende DNA zusammen mit DNA, die für den ADH2/GAPDH-Promotor, ein natives PRO-Signalpeptid oder ein anderes Säugetier-Signalpeptid kodiert, oder beispielsweise einer Hefe-α-Faktor- oder -Invertase-Sekretionssignal/Leadersequenz und Linkersequenzen (sofern erforderlich) zur Expression von PRO in das selektierte Plasmid kloniert werden.
Hefezellen, wie z.B. Hefestamm AB110, können dann mit den zuvor beschriebenen Expressionsplasmiden transformiert und in ausgewähltem Fermentationsmedium kultiviert werden. Die Überstände transformierter Hefe können durch Fällen mit 10 % Trichloressigsäure und durch Trennen durch SDS-PAGE, gefolgt von Färben der Gele mit Coomassie-Blaufärbung, analysiert werden.
Rekombinantes PRO kann daraufhin isoliert und durch Entfernen der Hefezellen aus dem Fermentationsmedium durch Zentrifugieren und anschließendes Einengen des Mediums unter Verwendung ausgewählter Patronenfilter gereinigt werden. Das PRO-hältige Konzentrat kann weiters unter Verwendung ausgewählter Säulenchromatographieharze gereinigt werden.
Zahlreiche der in der WO 01/05972 offenbarten PRO-Polypeptide wurden erfolgreich wie oben beschrieben exprimiert.
BEISPIEL 8: Expression von PRO in mit Baculovirus infizierten Insektenzellen
Das folgende Verfahren beschreibt rekombinante Expression von PRO in mit Baculovirus infizierten Insektenzellen.
Die für PRO kodierende Sequenz wird stromauf einer Epitopmarkierung, die in einem Baculovirus-Expressionsvektor enthalten ist, fusioniert. Solche Epitop-Markierungen umfassen poly-His-Markierungen und Immunglobulinmarkierungen (wie Fc-Regionen von IgG). Zahlreiche verschiedene Plasmide können verwendet werden, einschließlich Plasmiden, die aus im Handel erhältlichen Plasmiden wie z.B. pVL1393 (Novagen) stammen. Kurz zusammengefasst wird die für PRO kodierende Sequenz oder der erwünschte Abschnitt der Kodiersequenz von PRO, wie z.B. die Sequenz, die für die extrazelluläre Domäne eines Transmembranproteins kodiert, oder die Sequenz, die für das reife Protein kodiert, sofern das Protein extrazellulär ist, durch PCR mit Primern, die zu den 5'- und 3'-Regionen komplementär sind, amplifiziert. Der 5'-Primer kann flankierende (selektierte) Restriktionsenzymstellen inkorporieren. Das Produkt wird dann mit jenen ausgewählten Restriktionsenzymen verdaut und in den Expressionsvektor subkloniert.
Rekombinantes Baculovirus wird durch Co-Transfektion des obigen Plasmids und BaculoGold^TM-Virus-DNA (Pharmingen) in Spodoptera-frugiperda-(„Sf9"-) Zellen (ATCC CRL 1711) unter Verwendung von Lipofectin (im Handel bei GIBCO-BRL erhältlich) hergestellt. Nach 4-5 Tagen Inkubation bei 28 °C werden die freigesetzten Viren geerntet und zur weiteren Amplifikation verwendet. Virale Infektion und Proteinexpression werden wie von O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laborstory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994), beschrieben durchgeführt.
Exprimiertes poly-His-markiertes PRO kann dann, beispielsweise durch Ni²⁺-Chelataffinitätschromatographie, wie folgt gereinigt werden. Extrakte werden aus rekombinanten, virusinfizierten Sf9-Zellen wie von Rupert et al., Nature 362, 175-179 (1993), beschrieben hergestellt. Kurz zusammengefasst werden Sf9-Zellen gewaschen, in Beschallungspuffer (25 ml Hepes, pH 7,9; 12,5 mM MgCl₂; 0,1 mM EDTA; 10 % Glycerin, 0,1 % NP-40; 0,4 M KCl) resuspendiert und zweimal 20 Sekunden lang auf Eis beschallt. Die beschallten Produkte werden durch Zentrifugation geklärt, und der Überstand wird 50fach in Ladepuffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10 % Glycerin, pH 7,8) verdünnt und durch ein 0,45-μm-Filter filtriert. Eine Ni²⁺-NTA-Agarosesäule (im Handel bei Qiagen erhältlich) wird mit einem Bettvolumen von 5 ml hergestellt, mit 25 ml Wasser gewaschen und mit 25 ml Ladepuffer äquilibriert. Der filtrierte Zellextrakt wird auf die Säule bei 0,5 ml pro Minute geladen. Die Säule wird mit Ladepuffer zu A₂₈₀-Basislinie gewaschen, ein Punkt, an dem Fraktionssammlung gestartet wird. Als Nächstes wird die Säule mit einem sekundären Waschpuffer (50 mM Phosphat; 300 mM NaCl, 10 % Glycerin, pH 6,0) gewaschen, der nichtspezifisch gebundenes Protein eluiert. Nach neuerlichem Erreichen der A₂₈₀-Basislinie wird die Säule mit einem 0- bis 500-mM-Imidazolgradienten im sekundären Waschpuffer entwickelt. 1-ml-Fraktionen werden gesammelt und durch SDS-PAGE und Silberfärbung oder Western-Blot mit Ni²⁺-NTA konjugiert an alkalische Phosphatase (Qiagen) analysiert. Fraktionen, die das eluierte His₁₀-markierte PRO enthalten, werden gesammelt und gegen Ladepuffer dialysiert.
Alternativ dazu kann Reinigung des IgG-markierten (oder Fc-markierten) PRO unter Verwendung bekannter Chromatographieverfahren, einschließlich beispielsweise Protein-A- oder Protein-G-Säulenchromatographie, durchgeführt werden.
Zahlreiche der in der WO 01/05972 offenbarten PRO-Polypeptide wurden erfolgreich wie oben beschrieben exprimiert.
BEISPIEL 9: Herstellung von Antikörpern, die PRO binden
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung monoklonaler Antikörper, die spezifisch an PRO binden können.
Verfahren zur Herstellung der monoklonalen Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden beispielsweise in Goding, s.o., beschrieben. Immunogene, die verwendet werden können, umfassen gereinigtes PRO, Fusionsproteine, die PRO enthalten, und Zellen, die rekombinantes PRO an der Zelloberfläche exprimieren. Die Auswahl des Immunogens können Fachleute ohne übermäßiges Experimentieren treffen.
Mäuse, wie z.B. Balb/c, werden mit dem PRO-Immunogen immunisiert, das in komplettem Freundschem Adjuvans emulgiert ist und subkutan oder intraperitoneal in einer Menge von 1 bis 100 μg injiziert wird. Alternativ dazu wird das Immunogen in MPL-TDM-Adjuvans (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) emulgiert und in die Fußballen der Hinterläufe der Tiere injiziert. Die immunisierten Mäuse werden dann 10 bis 12 Tage später mit zusätzlichem Immunogen, das im ausgewählten Adjuvans emulgiert ist, geboostet. Hiernach können die Mäuse auch für mehrere Wochen mit zusätzlichen Immunisierungsinjektionen geboostet werden. Serumproben können den Mäusen durch retroorbitale Blutabnahme zum Testen mittels ELISA-Tests zur Detektion von Anti-PRO-Antikörpern in periodisch Abständen entnommen werden.
Nachdem ein geeigneter Antikörpertiter nachgewiesen wurde, kann den Tieren mit „positiven" Antikörperwerten eine letzte intravenöse Injektion von PRO verabreicht werden. Drei oder vier Tage später werden die Mäuse getötet und die Milzzellen geerntet. Die Milzzellen werden dann an eine selektierte Mausmyelomzelllinie wie z.B. P3X63AgU.1, die bei der ATCC, Nr. CRL 1597, erhältlich ist, (unter Verwendung von 35 % Polyethylenglykol) fusioniert. Die Fusionen bilden Hybridomzellen, die dann in 96-Well-Gewebekulturplatten, welche HAT-(Hypoxanthin, Aminopterin und Thymi din) Medium enthalten, ausplattiert werden, um Proliferation von nicht-fusionierten Zellen, Myelomhybriden und Milzzellhybriden zu hemmen.
Die Hybridomzellen werden in einem ELISA auf Reaktivität gegen PRO gescreent. Bestimmung von „positiven" Hybridomzellen, die die erwünschten monoklonalen Antikörper gegen PRO sekretieren, liegt im Bereich der Erfindung.
Die positiven Hybridomzellen können intraperitoneal in syngenetische Balb/c-Mäuse injiziert werden, um Ascites zu produzieren, die die monoklonalen Anti-PRO-Antikörper enthalten. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in Gewebekulturkolben oder Rollerflaschen gezüchtet werden. Reinigung der monoklonalen Antikörper, die in Ascites produziert werden, kann unter Verwendung von Ammoniumsulfatfällung, gefolgt von Gelausschlusschromatographie, erfolgen. Alternativ dazu kann Affinitätschromatographie basierend auf Bindung von Antikörper an Protein A oder Protein G verwendet werden.
BEISPIEL 10: Reinigung von PRO-Polypeptiden unter Verwendung spezifischer Antikörper
Native oder rekombinante PRO-Polypeptide können mittels zahlreicher verschiedener Verfahren zur Proteinreinigung, die auf dem Gebiet der Erfindung Standard sind, gereinigt werden. Beispielsweise wird Pro-PRO-Polypeptid, reifes PRO-Polypeptid oder Prä-PRO-Polypeptid mittels Immunaffinitätschromatographie unter Verwendung von Antikörpern, die für das PRO-Polypeptid von Interesse spezifisch sind, gereinigt. Im Allgemeinen wird eine Immunaffinitätssäule durch kovalentes Binden des Anti-PRO-Polypeptidantikörpers an ein aktiviertes Chromatographieharz konstruiert.
Polyklonale Immunglobuline werden aus Immunseren entweder durch Fällung mit Ammoniumsulfat oder durch Reinigung an immobilisiertem Protein A (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.) hergestellt. Demähnlich werden monoklonale Antikörper aus Maus-Ascitesflüssigkeit durch Ammoniumsulfatfällung oder durch Chromatographie an immobilisiertem Protein A hergestellt. Teilweise gereinigtes Immunglobulin wird kovalent an ein Chromatographieharz wie z.B. CnBr-aktivierte SEPHAROSE^TM (Pharmacia LKB Biotechnology) gebunden. Der Antikörper wird an das Harz gebunden, das Harz wird blockiert, und das Derivatharz wird gemäß den Anweisungen des Herstellers gewaschen.
Solch eine Immunaffinitätssäule wird zur Reinigung von PRO-Polypeptid durch Herstellung einer Fraktion von Zellen, die PRO-Polypeptid in einer löslichen Form enthält, verwendet. Dieses Präparat wird durch Solubilisierung der ganzen Zelle oder einer subzellulären Fraktion, die durch differenzielles Zentrifugieren durch den Zusatz von Detergens oder mittels anderer Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, erhalten wurde, abgeleitet. Alternativ dazu kann lösliches PRO-Polypeptid, das eine Signalsequenz enthält, in nützlicher Menge in das Medium sekretiert werden, in dem die Zellen gezüchtet werden.
Ein lösliches PRO-Polypeptid-hältiges Präparat wird über eine Immunaffinitätssäule geführt, und die Säule wird unter Bedingungen gewaschen, die die präferenzielle Absorption von PRO-Polypeptid ermöglichen (z.B. Puffer mit hoher Ionenstärke in Gegenwart von Detergens). Dann wird die Säule unter Bedingungen eluiert, die Antikörper/PRO-Polypeptid-Bindung aufbrechen (z.B. ein Puffer mit niedrigem pH wie etwa pH 2-3 oder eine hohe Konzentration eines Chaotrops wie z.B. Harnstoff oder Thiocyanation), und PRO-Polypeptid wird gesammelt.
BEISPIEL 11: Arzneimittel-Screenen
Diese Erfindung ist besonders nützlich zum Screenen von Verbindungen unter Verwendung von PRO-Polypeptiden oder Bindungsfragmenten davon im Rahmen eines von zahlreichen verschiedenen Arzneimittel-Screeningverfahren. Das PRO-Polypeptid oder -Fragment, das in solch einem Test verwendet wird, kann entweder frei in Lösung, fixiert an einen festen Träger, an einer Zelloberfläche getragen oder intrazellulär angeordnet sein. Ein Verfahren zum Arzneimittel-Screenen verwendet eukaryotische oder prokaryotische Wirtszellen, die mit rekombinanten Nucleinsäuren, die das PRO-Polypeptid oder -Fragment exprimieren, stabil transformiert sind. Arzneimit tel werden gegen solche transformierten Zellen in Konkurrenzbindungstests gescreent. Solche Zellen, entweder in lebensfähiger oder in fixierter Form, können für herkömmliche Bindungstests verwendet werden. Es kann beispielsweise die Bildung von Komplexen zwischen PRO-Polypeptid oder einem -Fragment und dem zu testenden Mittel gemessen werden. Alternativ dazu kann die Abnahme von Komplexbildung zwischen dem PRO-Polypeptid und seiner Targetzelle oder seinen Targetrezeptoren untersucht werden, die durch das zu testende Mittel verursacht wird.
Somit stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Screenen auf Arzneimittel oder auf beliebige andere Mittel bereit, die mit PRO-Polypeptid assoziierte Erkrankungen oder Leiden beeinflussen können. Diese Verfahren umfassen das Kontaktieren solch eines Mittels mit einem PRO-Polypeptid oder Fragment davon und das Testen (I) auf die Gegenwart eines Komplexes zwischen dem Mittel und dem PRO-Polypeptid oder -Fragment oder (II) auf die Gegenwart eines Komplexes zwischen dem PRO-Polypeptid oder -Fragment und der Zelle mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren. In solchen Konkurrenzbindungstests ist das PRO-Polypeptid oder -Fragment typischerweise markiert. Nach geeigneter Inkubation wird freies PRO-Polypeptid oder -Fragment von dem, das in gebundener Form vorliegt, getrennt, und die Menge an freier oder nicht komplexierter Markierung stellt ein Maß für die Fähigkeit des bestimmten Mittels dar, an PRO-Polypeptid zu binden oder den PRO-Polypeptid/Zell-Komplex zu stören.
Ein anderes Verfahren zum Arzneimittel-Screenen sorgt für Screenen mit hohem Durchsatz von Verbindungen mit geeigneter Bindungsaffinität an ein Polypeptid und wird in der WO 84/03564 , veröffentlicht am 13. September 1984, detailliert beschrieben. Kurz zusammengefasst wird eine große Anzahl an verschiedenen Testverbindungen in Form kleiner Peptide an einem festen Substrat, wie z.B. an Kunststoffstiften oder einer anderen Oberfläche, synthetisiert. Nachdem sie auf ein PRO-Polypeptid aufgetragen wurden, werden Peptidtestverbindungen mit PRO-Polypeptid umgesetzt und gewaschen. Gebundenes PRO-Polypeptid wird mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren nachgewiesen. Gereinigtes PRO-Polypeptid kann zur Verwendung in den zuvor genannten Arzneimittel-Screening-Verfahren auch direkt auf Platten beschichtet werden. Darüber hinaus können nicht-neutralisierende Antikörper verwendet werden, um das Peptid einzufangen und es am festen Träger zu immobilisieren.
Diese Erfindung sieht auch die Verwendung von kompetitiven Arzneimittel-Screeningtests vor, in denen neutralisierende Antikörper, die in der Lage sind, PRO-Polypeptid zu binden, spezifisch mit einer Testverbindung um Bindung an PRO-Polypeptid oder Fragmenten davon konkurrieren. Auf diese Weise können die Antikörper verwendet werden, um die Gegenwart jedes beliebigen Peptids nachzuweisen, das mit PRO-Polypeptid eine oder mehrere antigene Determinanten gemeinsam hat.
BEISPIEL 12: Rationales Arzneimitteldesign
Das Ziel von rationalem Arzneimitteldesign ist die Herstellung struktureller Analoga von biologisch aktivem Polypeptid von Interesse (z.B. von einem PRO-Polypeptid) oder von kleinen Molekülen, mit denen sie Wechselwirken, z.B. Agonisten, Antagonisten oder Inhibitoren. Jedes dieser Beispiele kann verwendet werden, um Arzneimittel zu entwerfen, die aktivere oder stabilere Formen des PRO-Polypeptids sind oder die die Funktion des PRO-Polypeptids in vivo verstärken oder stören (vgl. Hodgson, Bio/Technology 9, 19-21 (1991)).
In einem Ansatz wird die dreidimensionale Struktur des PRO-Polypeptids oder eines PRO-Polypeptid-Inhibitor-Komplexes durch Röntgenkristallographie, durch Computermodellierung oder, was am häufigsten vorkommt, durch eine Kombination der zwei Ansätze bestimmt. Sowohl die Form als auch die Ladungen des PRO-Polypeptids müssen bestimmt werden, um die Struktur erkennen zu können und um (eine) aktive Stelle(n) des Moleküls zu identifizieren. Weniger häufig können nützliche Informationen hinsichtlich der Struktur des PRO-Polypeptids durch Modellieren auf Grundlage der Struktur homologer Proteine gewonnen werden. In beiden Fällen wird relevante strukturelle Information verwendet, um analoge PRO-Polypeptidähnliche Moleküle zu entwerfen oder um wirksame Inhibitoren zu identifizieren. Nütz liche Beispiele für rationales Arzneimitteldesign können Moleküle umfassen, die verbesserte Aktivität oder Stabilität aufweisen, wie von Braxton & Wells, Biochemistry 31, 7796-7801 (1992), gezeigt wird, oder die als Inhibitoren, Agonisten oder Antagonisten von nativen Peptiden wirken, wie von Athauda et al., J. Biochem. 113, 742-746 (1993), gezeigt wird.
Auch ist es möglich, einen Target-spezifischen Antikörper zu isolieren, der wie zuvor beschrieben durch funktionelle Tests selektiert wird, und dann seine Kristallstruktur aufzuklären. Dieser Ansatz ergibt im Prinzip ein „Pharmacore", auf Grundlage dessen Arzneimitteldesign vollzogen werden kann. Es ist möglich, Proteinkristallographie ganz zu umgehen, indem anti-idiotypische Antikörper (Anti-Ids) zu einem funktionellen, pharmakologisch aktiven Antikörper gebildet werden. Es wird erwartet, dass, als ein Spiegelbild eines Spiegelbildes, die Bindungsstelle der Anti-Ids analog zu dem Originalrezeptor ist. Der Anti-Id könnte dann verwendet werden, um Peptide aus Banken chemisch oder biologisch hergestellter Peptide zu identifizieren und zu isolieren. Die isolierten Peptide würden dann als das „Pharmacore" wirken.
Durch die vorliegende Erfindung können ausreichende Mengen des PRO-Polypeptids verfügbar gemacht werden, um solche analytischen Studien wie z.B. Röntgenkristallographie durchzuführen. Darüber hinaus liefert die Kenntnis der hierin bereitgestellten PRO-Polypeptid-Aminosäuresequenz einen Leitfaden für jene, die Computermodellierungsverfahren anstelle von oder zusätzlich zu Röntgenkristallographie verwenden.
Hinterlegung von Material
Die folgenden Materialien wurden bei der American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA, (ATCC) hinterlegt. Tabelle 9

Material UNQ PRO ATCC-Hinterlegungs-Nr. ATCC-Hinterlegungsdatum

DNA35880-1660 223 256 209379 16. September 1997
Diese Hinterlegung erfolgte gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und den darunter gültigen Bestimmungen (Budapester Vertrag). Dies sichert die Erhaltung einer lebensfähigen Kultur der Hinterlegung 30 Jahre lang ab dem Zeitpunkt der Hinterlegung. Die Hinterlegungen werden von der ATCC gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages und gemäß einem Abkommen zwischen Genentech, Inc., und ATCC verfügbar gemacht, was permanente und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Kultur der Hinterlegung für die Öffentlichkeit bei Ausgabe des betreffenden US-Patents oder bei Offenlegung für die Öffentlichkeit entweder der US- oder einer ausländischen Patentanmeldung, je nachdem, was zuerst kommt, garantiert und die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft für jemanden, der durch den Präsidenten des Patentamtes der Vereinigten Staaten hierzu gemäß 35 USC § 122 und den dazu gültigen Bestimmungen (einschließlich 37 CFR § 1.14 unter besonderem Verweis auf 886 OG 638) befugt ist, sicherstellt.
Der Abtretungsempfänger der vorliegenden Anmeldung hat sich einverstanden erklärt, dass, sofern eine Kultur der hinterlegten Materialien, die unter geeigneten Bedingungen kultiviert wurde, sterben oder verloren gehen oder zerstört werden sollte, die Materialien unverzüglich nach Benachrichtigung durch neue derselben Art ersetzt werden. Verfügbarkeit des hinterlegten Materials ist nicht als eine Lizenz zur Ausführung der Erfindung in Widerspruch mit den unter der Behörde einer beliebigen Regierung gemäß ihrer Patentgesetze garantierten Rechte zu verstehen.
Sequenzprotokoll

Claims

Isoliertes PRO256-Polypeptid mit zumindest 97 % Aminosäuresequenzidentität zu: (a) der in 2 gezeigten und nachstehend angeführten Aminosäuresequenz:
(b) den Resten X bis 529 der in Anspruch 1, Teil (a), gezeigten Aminosäuresequenz; (c) den Resten 1 bis Y der in Anspruch 1, Teil (a), gezeigten Aminosäuresequenz; oder (d) den Resten X bis Y der in Anspruch 1, Teil (a), gezeigten Aminosäuresequenz, worin die Sequenzidentität unter Verwendung des Computerprogramms ALIGN-2 bestimmt wird und worin X 36±5 ist und Y 465±5 ist, und worin das PRO256-Polypeptid in der Lage ist, die Proliferation von T-Lymphozyten zu stimulieren, wie durch den gemischten Lymphozytenreaktionstest (MLR-Test) und/oder den Human-Costimulationstest bestimmt wird.
Polypeptid nach Anspruch 1, worin der Identitätsgrad zumindest 98 % beträgt.
Polypeptid nach Anspruch 2, worin der Identitätsgrad zumindest 99 % beträgt.
Polypeptid nach Anspruch 3, umfassend: (a) die in Anspruch 1, Teil (a), gezeigte Aminosäuresequenz; (b) die Reste X bis 529 der in Anspruch 1, Teil (a), gezeigten Aminosäuresequenz; (c) die Reste 1 bis Y der in Anspruch 1, Teil (a), gezeigten Aminosäuresequenz; oder (d) die Reste X bis Y der in Anspruch 1, Teil (a), gezeigten Aminosäuresequenz.
Polypeptid nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin X 36 ist und/oder Y 465 ist.
Isolierte Nucleinsäure, eine für ein Polypeptid nach einem der vorangegangenen Ansprüche kodierende Nucleinsäuresequenz umfassend.
Vektor, eine Nucleinsäure nach Anspruch 6 umfassend.
Vektor nach Anspruch 7, operabel an Kontrollsequenzen gebunden, die durch eine mit dem Vektor transformierte Wirtszelle erkannt werden.
Wirtszelle, einen Vektor nach Anspruch 8 umfassend.
Wirtszelle nach Anspruch 9, worin die Zelle eine CHO-Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 9, worin die Zelle eine E. coli ist.
Wirtszelle nach Anspruch 9, worin die Zelle eine Hefezelle ist.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, umfassend das Kultivieren der Wirtszelle nach einem der Ansprüche 9 bis 12 unter Bedingungen, die zur Expression dieses Polypeptids geeignet sind, und Gewinnen dieses Polypeptids aus der Zellkultur.
Chimäres Molekül, das ein an eine heterologe Aminosäuresequenz fusioniertes PRO256-Polypeptid umfasst, worin das PRO256-Polypeptid ein Polypeptid mit zumindest 80 % Aminosäuresequenzidentität zu (a) der in Anspruch 1, Teil (a), gezeigten Aminosäuresequenz; (b) den Resten X bis 529 der in Anspruch 1, Teil (a), gezeigten Aminosäuresequenz; (c) den Resten 1 bis Y der in Anspruch 1, Teil (a), gezeigten Aminosäuresequenz; oder (d) den Resten X bis Y der in Anspruch 1, Teil (a), gezeigten Aminosäuresequenz ist, worin die Sequenzidentität unter Verwendung des Computerprogramms ALIGN-2 bestimmt wird und worin X 36±5 ist und Y 465±5 ist, und worin das PRO256-Polypeptid in der Lage ist, die Proliferation von T-Lymphozyten zu stimulieren, wie durch den gemischten Lymphozytenreaktionstest (MLR-Test) und/oder den Human-Costimulationstest bestimmt wird.
Chimäres Molekül nach Anspruch 14, worin der Identitätsgrad im PRO256-Polypeptid zumindest 90 % beträgt.
Chimäres Molekül nach Anspruch 15, worin der Identitätsgrad im PRO256-Polypeptid zumindest 95 % beträgt.
Chimäres Molekül nach Anspruch 16, worin das PRO256-Polypeptid wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert ist.
Chimäres Molekül nach einem der Ansprüche 14 bis 17, worin die heterologe Aminosäuresequenz eine Epitop-Markierungssequenz ist.
Chimäres Molekül nach einem der Ansprüche 14 bis 18, worin die heterologe Aminosäuresequenz eine Fc-Region eines Immunglobulins ist.
Antagonistenantikörper, der sich spezifisch an ein PRO256-Polypeptid nach einem der Ansprüche 14 bis 17 bindet und der Aktivität des PRO256-Polypeptids entgegenwirkt, um die Proliferation von T-Lymphozyten zu stimulieren, wie durch den gemischten Lymphozytenreaktionstest (MLR-Test) und/oder den Human-Costimulationstest bestimmt wird.
Antikörper nach Anspruch 20, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper, ein humanisierter Antikörper oder ein einkettiger Antikörper ist.
Verfahren zur Herstellung eines Anti-PRO256-Antikörpers, der sich spezifisch an ein PRO256-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 bindet, die Herstellung eines Antikörpers unter Einsatz dieses Polypeptids umfassend.
Verfahren nach Anspruch 22, worin der Anti-PRO256-Antikörper ein monoklonaler Antikörper, ein humanisierter Antikörper oder ein einkettiger Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 22 oder Anspruch 23, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle, die mit für den Anti-PRO256-Antikörper kodierender Nucleinsäure transformiert ist, unter Bedingungen, sodass der Anti-PRO256-Antikörper exprimiert wird, und das Gewinnen des Antikörpers aus der Zellkultur.
Zusammensetzung, umfassend ein Molekül und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Exzipienten, worin das Molekül zweckdienlich ist zum: (a) Stimulieren oder Steigern einer Immunantwort in einem Säugetier, das dies benötigt; oder (b) Steigern der Proliferation von T-Lymphozyten in einem Säugetier, das dies benötigt, und worin das Molekül ein PRO256-Polypeptid nach einem der Ansprüche 14 bis 17 oder ein Fragment davon ist, wobei das Fragment ein Stimulator von T-Zell-Proliferation ist, wie durch den MLR-Test und/oder den Human-Costimulationstest bestimmt wird.
Zusammensetzung, umfassend ein Molekül und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Exzipienten, worin das Molekül zweckdienlich ist zum: (a) Hemmen oder Reduzieren der Immunantwort in einem Säugetier, das dies benötigt; oder (b) Verringern der Proliferation von T-Lymphozyten in einem Säugetier, das dies benötigt, und worin das Molekül ein Antagonistenantikörper nach Anspruch 20 oder Anspruch 21 oder ein Antisense-Oligonucleotid zu einem PRO256-Polypeptid nach einem der Ansprüche 14 bis 17 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 26, worin der Antikörper ein monoklonaler Antagonistenantikörper ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 26 oder 27, worin der Antikörper ein Antikörperfragment oder ein einkettiger Antikörper ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 26 bis 28, worin der Antikörper Reste einer nichtmenschlichen komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) und Reste einer menschlichen Gerüstregion (FR) aufweist.
Molekül nach einem der Ansprüche 25 bis 29 zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren.
Verwendung eines Moleküls nach Anspruch 25 bei der Herstellung eines Medikaments zum: (a) Stimulieren oder Steigern einer Immunantwort in einem Säugetier, das dies benötigt; oder (b) Steigern der Proliferation von T-Lymphozyten in einem Säugetier, das dies benötigt, (c) Behandeln einer immunbezogenen Störung, wie z.B. einer T-Zell-vermittelten Störung.
Verwendung eines Moleküls nach einem der Ansprüche 26 bis 29 bei der Herstellung eines Medikaments zum: (a) Hemmen oder Reduzieren der Immunantwort in einem Säugetier, das dies benötigt; oder (b) Verringern der Proliferation von T-Lymphozyten in einem Säugetier, das dies benötigt, (c) Behandeln einer immunbezogenen Störung, wie z.B. einer T-Zell-vermittelten Störung.
Verfahren zur Identifikation einer Verbindung, die zur Bindung an ein, Komplexbildung mit oder Wechselwirkung mit einem PRO256-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in der Lage ist, umfassend das Kontaktieren einer Kanndidatenverbindung mit dem Polypeptid unter Bedingungen und ausreichend lange, damit diese beiden Komponenten Wechselwirken.
Verfahren nach Anspruch 33, worin die Kandidatenverbindung oder das PRO256-Polypeptid auf einem festen Träger immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 34, worin die nichtimmobilisierte Komponente eine detektierbare Markierung trägt.
In-vitro-Verfahren zur Stimulation der Proliferation von T-Lymphozyten, wobei das Verfahren das Kontaktieren von T-Lymphozyten mit einem PRO256-Polypeptid nach einem der Ansprüche 14 bis 17 in einer Menge umfasst, die ausreicht, um die Proliferation der T-Lymphozyten zu stimulieren.
Verfahren zur Identifikation eines Agonisten oder Antagonisten eines PRO256-Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend das Kontaktieren des PRO256-Polypeptids mit einem Kandidatenmolekül und Überwachen einer durch das PRO256-Polypeptid vermittelten biologischen Aktivität.
Verfahren nach Anspruch 37, worin die biologische Aktivität die Stimulation der T-Zell-Proliferation ist.