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FACHGEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die Identifikation,
Isolierung und rekombinante Produktion von neuer DNA und neuen Polypeptiden,
deren Gegenwart mit Entzündungserkrankungen
(mit Entzündung
assoziierten Antigenen) und/oder Krebs assoziiert ist, und Zusammensetzungen
und Verfahren zur Diagnose und Behandlung von Leiden, die durch
solche Antigene charakterisiert sind.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die
Entzündungsreaktion
ist komplex und wird durch eine Vielzahl von Signalmolekülen vermittelt,
die lokal durch Mastzellen, Nervenendungen, Plättchen, Leukozyten und Komplementaktivierung
produziert werden. Bestimmte dieser Signalgebungsmoleküle verursachen,
dass die Endothelzellanordnung poröser wird und/oder Selectine
exprimiert, die als Zelloberflächenmoleküle wirken,
die Leukozyten erkennen und durch spezifische Kohlenhydraterkennung
anziehen. Stärkere
Leukozytenbindung wird durch Integrine vermittelt, welche die Leukozytenbewegung
durch das Endothel vermitteln. Weitere Signalgebungsmoleküle wirken
als chemische Lockstoffe, was zur Folge hat, dass gebundene Leukozyten
sich in Richtung der Quelle des Lockstoffs bewegen. Andere Signalgebungsmoleküle, die
im Verlauf einer Entzündungsreaktion
gebildet werden, entweichen in das Blut und stimulieren das Knochenmark,
um mehr Leukozyten zu produzieren und sie in den Blutstrom freizusetzen.
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Entzündung wird
typischerweise durch ein Antigen initiiert, das im Wesentlichen
jegliches Molekül
sein kann, das in der Lage ist, eine Immunantwort zu initiieren.
Unter normalen physiologischen Bedingungen sind diese fremde Moleküle, aber
Moleküle,
die vom Organismus selbst erzeugt werden, können als Katalysator dienen,
wie es, wie bekannt ist, bei verschiedenen Erkrankungszuständen auftritt.
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T-Zellproliferation
in einer gemischten Lymphozytenkultur oder gemischten Lymphozytenreaktion (MLR)
ist ein etabliertes Anzeichen für
die Fähigkeit
einer Verbindung, das Immunsystem zu stimulieren. In einer Entzündungsreaktion
können
die entspre chenden Leukozyten neutrophil, eosinophil, monozytisch
oder lymphozytisch sein. Histologische Untersuchung der betroffenen
Gewebe stellt Beweise für
eine immunstimulierende oder hemmende Antwort bereit. Siehe Current
Protocols in Immunology, Hrsg. John E. Coligan, John Wiley and Sons,
Inc. (1994).
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Entzündliche
Darmerkrankung (IBD) ist ein Begriff, der verwendet wird, um kollektiv
Darmerkrankungen zu beschreiben, die sowohl Colitis ulcerosa (UC)
und Crohn-Erkrankung
umfassen, wovon beide als unterschiedliche Erkrankungen klassifiziert
sind, aber gemeinsame Eigenschaften und wahrscheinlich Pathologie
teilen. Die Gemeinsamkeit der diagnostischen Kriterien kann es schwierig
machen, genau zu bestimmen, welche der beiden Erkrankungen ein Patient
aufweist, jedoch unterscheiden sich Art und Ort der Läsion in
jedem Fall typischerweise voneinander. UC-Läsionen
sind charakteristischerweise ein oberflächliches Geschwür der Mucosa
und treten im Colon, nahe dem Rektum, auf. CD-Läsionen sind charakteristischerweise ausgedehnte
lineare Risse und können
irgendwo im Darm auftreten, gelegentlich sind Magen, Speiseröhre und
Duodenum involviert.
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Herkömmliche
Behandlungen für
IBD umfassen für
gewöhnlich
die Verabreichung eines entzündungshemmenden
oder immunsupprimierenden Mittels, wie z. B. Sulfasalazin, Corticosteroide,
6-Mercaptopurin/Azathioprin oder Cyclosporin, wovon alle nur eine
partielle Entlastung für
den betroffenen Patienten erbringen. Wenn jedoch entzündungshemmende/Immunsupressiva-Therapien
versagen, sind Kolektomien die letzte Verteidigungsmaßnahme.
Chirurgie ist bei etwa 30% der CD-Patienten innerhalb des ersten
Jahres nach Diagnose erforderlich, mit der Wahrscheinlichkeit eines
operativen Verfahrens, die danach jährlich um etwa 5% steigt. Leider
weist CD auch eine hohe Wiederauftretensrate auf, da etwa 5% der
Patienten nach dem ersten Jahr nachfolgende Chirurgie benötigen. UC-Patienten
weisen weiters ein im Wesentlichen erhöhtes Risiko auf, kolorektalen
Krebs zu entwickeln. Vermutlich ist dies auf die wiederkehrenden
Zyklen von Schäden
am Epithel zurückzuführen, gefolgt
von erneutem Wachstum, das kontinuierlich das Risiko von neoplastischer
Transformation erhöht.
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Ein
jüngst
entdeckter Angehöriger
der Immunglobulinüberfamilie,
der als Verbindungsadhäsionsmolekül (Junctional
Adhesion Molecule, JAM) bekannt ist, ist identifiziert worden, um
selektiv an interzellulären
Kontaktstellen von Endothel- und Epithelzellen von unterschiedlichen
Ursprüngen
konzentriert zu werden. I. Martin-Padura et al., J. Cell Biol. 142 (1),
117–27
(1998). JAM ist ein Typ-I Integralmembranprotein mit zwei extrazellulären Intrakettendisulfidschleifen
vom V-Typ. JAM trägt
wesentliche Homologie zu A33-Antigen (1 oder 18). Es wurde festgestellt, dass ein monoklonaler
Antikörper,
der gegen JAM gerichtet ist, diese spontane und chemokininduzierte
Monozytentransmigration durch eine Endothelzellmonoschicht in vitro hemmt.
Martin-Padura, siehe oben.
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Es
ist vor kurzem festgestellt worden, dass JAM-Expression im Colon
von CRF-2–4-(–/–)-Mäusen mit Colitis erhöht wird.
CRF 2–4 –/– (IL-10R-Untereinheitknockoutmäuse) entwickeln
eine spontane Colitis, die durch Lymphozyten, Monozyten und Neutrophile
vermittelt wird. Mehrere der Tiere entwickelten auch Colonadenokarzinom.
Als Folge ist es vorhersehbar wahrscheinlich, dass die Verbindungen
der Erfindung in erhöhten Ausmaßen bei
menschlichen Erkrankungen exprimiert werden oder auf andere Weise
mit diesen assoziiert sind, wie z. B. entzündlicher Darmerkrankung, anderen
entzündlichen
Erkrankungen des Darms sowie kolorektalem Karzinom.
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Die
Verbindungen der Erfindung tragen auch signifikante Homologie zu
A33-Antigen, einem bekannten kolorektalen krebsassoziierten Marker.
Das A33-Antigen wird in mehr als 90% von primärem oder metastatischem Colonkrebs
sowie normalem Colonepithel exprimiert. Bei Karzinomen, die aus
der Colonmucosa entstanden sind, wird das A33-Antigen in mehr als
95% der Fälle
homogen exprimiert. Das A33-Antigen
wurde jedoch nicht in einem großen
Bereich anderer normaler Gewebe nachgewiesen, d. h. seine Expression
scheint organspezifisch zu sein. Deshalb scheint das A33-Antigen
eine wichtige Rolle in der Induktion von kolorektalem Krebs zu spielen.
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Da
Colonkrebs eine weitverbreitete Erkrankung ist, ist die frühe Diagnose
und Behandlung ein wichtiges medizinisches Ziel. Diagnose und Behandlung
von Co lonkrebs können
unter Einsatz monoklonaler Antikörper
(mAk), welche dafür
spezifisch sind und über
Fluoreszenz, kernmagnetische oder radioaktive Markierungen verfügen, implementiert
werden. Ein radioaktives Gen, Toxine und/oder arzneimittelmarkierte
MAK können
zur In-situ-Behandlung mit minimaler Patientenbeschreibung verwendet
werden. MAKs können
auch zur Diagnose während
der Diagnose und Behandlung von Colonkrebs verwendet werden. Zum
Beispiel wenn die Serumspiegel des A33-Antigens bei einem Patienten
erhöht
sind, zeigt ein Abfallen der Werte nach Chirurgie, dass die Tumorresektion
erfolgreich war. Andererseits zeigt ein nachfolgender Anstieg der
Serum-A33-Antigenwerte nach Chirurgie, dass sich Metastasen des
ursprünglichen
Tumors gebildet haben oder dass neue primäre Tumoren aufgetreten sind.
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Solche
monoklonalen Antikörper
können
anstelle von oder in Verbindung mit Chirurgie und/oder anderen Chemotherapien
verwendet werden. Zum Beispiel sind präklinische Analyse- und Lokalisierungsstudien bei
Patienten, die mit kolorektalem Karzinom mit einem mAk gegen A33
infiziert sind, in Welt et al., J. Clin. Oncol. 8, 1894–1906 (1990),
und Welt et al., J Clin. Oncol. 12, 1561–1571 (1994), beschrieben,
während
US 4.579.827 und USSN 424.991
(
EP 199.141 ) auf die
therapeutische Verabreichung von monoklonalen Antikörpern ausgerichtet
sind, wovon Letztere die Anwendung von Anti-A33-mAk betrifft.
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Bestimmte
ESTs, wie z. B. die unter den Zugangsnummern F02373.1, W17369.1
und AA228697.1 erhältlichen,
weisen einige gewisse Ähnlichkeit
zur hierin geoffenbarten Nucleinsäuresequenz von PRO362 auf.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft weiters Zusammensetzungen und Verfahren
zur Diagnose von Entzündungserkrankungen
bei Säugetieren,
einschließlich
Menschen. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Identifikation
von Proteinen (einschließlich
Agonisten- und Antagonistenantikörpern),
welche die Immunantwort bei Säugetieren
entweder stimulieren oder hemmen. Entzündungserkrankungen können durch
die Unterdrückung
der Entzündungsreaktion
behandelt werden. Moleküle,
die eine Entzündungsreaktion
verstärken,
stimulieren oder potenzieren die Immunantwort auf ein Antigen. Moleküle, die
eine Immunantwort stimulieren, können
gehemmt werden, wo eine Unterdrückung
der Entzündungsreaktion
von Vorteil ist. Moleküle,
welche die Immunantwort stimulieren, können therapeutisch verwendet
werden, wo die Verstärkung
der Immunantwort vorteilhaft ist. Solche stimulierenden Moleküle können auch
gehemmt werden, wo die Suppression der Entzündungsreaktion von Vorteil
ist. Neutralisierende Antikörper
sind Beispiele für
Moleküle,
die Moleküle hemmen,
die über
eine immunstimulierende Aktivität
verfügen
und die in der Behandlung von Entzündungserkrankungen vorteilhaft
sind. Moleküle,
welche die Entzündungsreaktion
hemmen, können
ebenfalls verwendet werden (Proteine, direkt oder über die
Verwendung von Antikörperagonisten),
um die Entzündungsreaktion
zu hemmen und daher Entzündungserkrankungen
zu lindern.
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Dementsprechend
dienen die Proteine der Erfindung der Diagnose und/oder Behandlung
(einschließlich
Prävention)
von immunassoziierten Erkrankungen. Antikörper, die sich an stimulierende
Proteine binden, dienen der Unterdrückung der Immunantwort. Antikörper, die
sich an Hemmproteine binden, sind zur Stimulation der Entzündungsreaktion
und des Immunsystems nützlich.
Die Proteine und Antikörper
der Erfindung dienen der Herstellung von Arzneimitteln und Medikamenten
zur Behandlung von entzündlichen
und immunassoziierten Erkrankungen.
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Wie
in den Ansprüchen
definiert betrifft die Erfindung in einer Ausführungsform Agonisten eines PRO362-Polypeptids,
die eine oder mehrere der Funktionen oder Aktivitäten des
PRO362-Polypeptids nachahmen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart eines
PRO362-Polypeptids, umfassend das Aussetzen einer Zelle, von der
vermutet wird, dass sie das Polypeptid enthält, gegenüber einem Anti-PRO362-Antikörper sowie
die Bestimmung der Bindung des Antikörpers an die Zelle.
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In
einer weiteren Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose einer entzündlichen
Erkrankung bei einem Säugetier,
umfassend das Detektieren der Expressionsstärke eines Gens, das für ein PRO362-Polypeptid
kodiert, (a) in einer Testprobe von Gewebezellen, die dem Säugetier
entnommen wurden, und (b) in einer Kontrollprobe von bekannten Gewebezellen
des gleichen Zelltyps, worin eine höhere Expressionsstärke ni der
Testprobe die Gegenwart einer Entzündungserkrankung im Säugetier
anzeigt.
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In
einer weiteren Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose einer Entzündungserkrankung
bei einem Säugetier,
umfassend (a) das Kontaktieren eines Anti-PRO362-Antikörpers mit
einer Testprobe von Gewebekulturzellen, die dem Säugetier
entnommen wurden, und (b) das Detektieren der Bildung eines Komplexes
aus dem Antikörper
und dem PRO362-Polypeptid. Die Detektion kann qualitativ oder quantitativ
erfolgen und kann im Vergleich mit der Überwachung der Komplexbildung
in einer Kontrollprobe von bekannten normalen Gewebezellen des gleichen
Zelltyps durchgeführt
werden. Eine größere Menge
an in der Testprobe entstandenen Komplexe zeigt die Gegenwart eines
Tumors im Säugetier
an, dem die geprüften
Gewebezellen entnommen worden waren. Der Antikörper trägt vorzugsweise eine detektierbare
Markierung. Die Komplexbildung kann beispielsweise durch Lichtmikroskopie,
Durchflusszytometrie, Fluorometrie oder andere auf dem Gebiet der
Erfindung bekannte Verfahren überwacht
werden. Die Testprobe stammt normalerweise von einem Individuum,
von dem vermutet wird, dass es eine Defizienz oder Anomalität bezüglich entzündlicher
Reaktionen aufweist.
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Die
vorliegende Erfindung kann in einem Diagnoseset Anwendung finden,
das einen Anti-PRO362-Antikörper
und einen Träger
(z. B. einen Puffer) in einer geeigneten Verpackung enthält. Das
Set enthält
gegebenenfalls auch Anleitungen zur Verwendung des Antikörpers, um
das PRO362-Polypeptid zu detektieren.
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Die
Erfindung kann in einem Herstellungsartikel Anwendung finden, der
Folgendes umfasst;
einen Behälter;
ein Etikett auf
dem Behälter;
und
eine Zusammensetzung, die einen Wirkstoff umfasst, der
im Behälter
enthalten ist, worin die Zusammensetzung wirksam zur Stimulierung
oder Hemmung einer Entzündungsreaktion
in einem Säugetier
ist, das Etikett auf dem Behälter
angibt, dass die Zusammensetzung zur Behandlung einer Entzündungserkrankung
eingesetzt werden kann, und der Wirkstoff in der Zusammensetzung
ein Mittel ist, das die Expression und/oder Aktivität des PRO362-Polypeptids
stimuliert oder hemmt. In einem Aspekt ist der Wirkstoff ein PRO362-Polypeptid
oder ein Anti-PRO362-Antikörper.
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Die
Erfindung kann in einem Verfahren zur Identifikation einer Verbindung
Anwendung finden, die in der Lage ist, die Expression und/oder Aktivität eines
PRO362-Polypeptids
zu hemmen, indem eine Kandidatenverbindung unter Bedingungen und
ausreichend lange mit PRO362-Polypeptid kontaktiert wird, sodass
die beiden Verbindungen Wechselwirken können. In einem spezifischen
Aspekt wird entweder die Kandidatenverbindung oder das PRO362-Polypeptid
auf einem festen Träger
immobilisiert. In einem weiteren Aspekt trägt die nichtimmobilisierte
Komponente eine detektierbare Markierung.
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In
einem weiteren Aspekt kann die Erfindung in einem Verfahren zur
Behandlung einer Entzündungserkrankung
Anwendung finden, indem eine wirksame therapeutische Menge eines
PRO362-Antagonisten an einen Patienten verabreicht wird, der eine
solche benötigt,
um eine aus Folgenden ausgewählte
Erkrankung zu behandeln: entzündliche
Darmerkrankung, systemischer Lupus erythematodes, rheumatoide Arthritis,
juvenile chronische Arthritis, Spondyloarthropathien, systemische
Sklerose (Sclerodermia), idiopathische entzündliche Myopathien (Dermatomyositis,
Polymyositis), Sjögren-Syndrom,
systemische Vaskulitis, Sarkoidose, hämolytische Autoimmunanämie (Immunpanzytopenie,
paroxysmale nächtliche
Hämoglobinurie),
Autoimmunthrombozytopenie (idiopathische thrombozytopenische Purpurs,
immunvermittelte Thrombozytopenie), Thyreoiditis (Basedow-Krankheit,
Hashimoto-Thyreoiditis, juvenile lymphozytische Thyreoiditis, atrophische
Thyreoiditis), Diabetes mellitus, immunvermittelte Nierenerkrankung
(Glomerulonephritis, tubulointerstitielle Nephritis), Entmarkungskrankheiten
des zentralen und peripheren Nervensystems, wie z. B. multiple Sklerose,
idiopathische Polyneuropathie, Leber-Gallen-Erkrankungen, wie z.
B. infektiöse
Hepatitis (Hepatitis A, B, C, D, E und andere nichthepatotrope Viren),
chronische aktive Autoimmunhepatitis, primäre biliäre Leberzirrhose, granulomatöse Hepatitis
und sklerosierende Cholangitis, entzündliche und fibrotische Lungenerkrankungen
(z. B. zystische Fibrose, Eosinophilenpneumonien, idopathische Lungenfibrose
und exogen-allergische Alveolitis), Zöliakie, Whipple-Krankeit, Autoimmun-
oder immunvermittelte Hauterkrankungen, einschließlich bullöser Hauterkrankungen,
Erythema multiforme und Kontaktdermatitis, Psoriasis, allergische
Erkrankungen der Lunge, wie z. B. Eosinophilenpneumonien, idiopathische
Lungenfibrose und exogen-allergische Alveolitis, mit Transplantation
assoziierte Erkrankungen, einschließlich Transplantatabstoßung und
Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung.
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In
einer weiteren Ausführungsform
kann die vorliegende Erfindung in einem Verfahren zur Diagnose eines
Tumors in einem Säugetier
Anwendung finden, umfassend das Detektieren der Expressionsstärke eines Gens,
das für
ein PRO362-Polypeptid kodiert, (a) in einer Testprobe von Gewebezellen,
die dem Säugetier
entnommen wurden, und (b) in einer Kontrollprobe von bekannten Gewebezellen
des gleichen Zelltyps, worin eine höhere Expressionsstärke in der
Testprobe die Gegenwart eines Tumors im Säugetier anzeigt, von dem die geprüften Gewebezellen
stammten.
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In
einer weiteren Ausführungsform
kann die vorliegende Erfindung in einem Verfahren zur Diagnose eines
Tumors in einem Säugetier
Anwendung finden, umfassend (a) das Kontaktieren eines Anti-PRO362-Antikörpers mit
einer Testprobe der Gewebezellen, die dem Säugetier entnommen wurden, und
(b) das Detektieren der Bildung eines Komplexes aus dem Anti-PRO362
und dem PRO362-Polypeptid in der Testprobe. Die Detektion kann qualitativ
oder quantitativ erfolgen und kann im Vergleich mit der Überwachung
der Komplexbildung in einer Kontrollprobe von bekannten normalen
Gewebezellen des gleichen Zelltyps durchgeführt werden. Eine größere Menge
an in der Testprobe entstandenen Komplexe zeigt die Gegenwart eines
Tumors im Säugetier
an, dem die geprüften
Gewebezellen entnommen worden wa ren. Der Antikörper trägt vorzugsweise eine detektierbare
Markierung. Die Komplexbildung kann beispielsweise durch Lichtmikroskopie,
Durchflusszytometrie, Fluorometrie oder andere auf dem Gebiet der
Erfindung bekannte Verfahren überwacht
werden. Vorzugsweise stammt die Testprobe von einem Säugetier,
von dem vermutet wird, dass es neoplastische(s) Zellwachstum oder
-proliferation (z. B. Krebszellen) aufweist.
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In
einer weiteren Ausführungsform
kann die vorliegende Erfindung in einem Krebsdiagnoseset Anwendung
finden, das einen Anti-PRO362-Antikörper und einen Träger (z.
B. Puffer) in einer geeigneten Verpackung umfasst. Das Set kann
Anleitungen zur Anwendung des Antikörpers zur Detektion des PRO362-Polypeptids
enthalten.
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In
einer weiteren Ausführungsform
kann die Erfindung in einem Verfahren zur Hemmung des Wachstums
von Tumorzellen Anwendung finden, welches das Aussetzen einer Zelle,
die ein PRO362-Polypeptid überexprimiert,
gegenüber
einer wirksamen Menge eines Mittels umfasst, welche die Expression
und/oder Aktivität
des PRO362-Polypeptids
hemmt. Das Mittel ist vorzugsweise ein Anti-PRO362-Polypeptid, ein
kleines organisches und anorganisches Peptid, Phosphopeptid, Antisense-
oder Ribozym-Molekül
oder ein Tripelhelixmolekül.
In einem spezifische Aspekt führt
das Mittel, z. B. ein Anti-PRO362-Antikörper, zu Zelltod. In einem weiteren
Aspekt werden die Tumorzellen weiters einer Strahlungsbehandlung
und/oder einem zytotoxischen oder chemotherapeutischen Mittel ausgesetzt.
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Die
Erfindung kann in einem Herstellungsartikel Anwendung finden, der
Folgendes umfasst;
einen Behälter;
ein Etikett auf
dem Behälter;
und
eine Zusammensetzung, die einen Wirkstoff umfasst, der
im Behälter
enthalten ist, worin die Zusammensetzung wirksam zur Hemmung des
Wachstums von Tumorzellen ist, das Etikett auf dem Behälter angibt,
dass die Zusammensetzung zur Behandlung von Leiden eingesetzt werden
kann, die durch eine Überexpression eines
PRO362-Polypeptids gekennzeichnet sind, und der Wirkstoff in der
Zusammen setzung ein Mittel ist, das die Expression und/oder Aktivität des PRO362-Polypeptids
hemmt. In einem Aspekt ist der Wirkstoff ein Anti-PRO362-Antikörper.
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Wie
in den Ansprüchen
definiert stellt die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform
ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit,
das für
ein PRO362-Polypeptid kodierende DNA umfasst. In einem Aspekt umfasst
die isolierte Nucleinsäure
DNA, die für
das PRO362-Polypeptid mit den Aminosäureresten 1 bis 321 aus 3 (Seq.-ID
Nr. 2) kodiert, oder ist komplementär zu solch einer kodierenden
Nucleinsäuresequenz
und bleibt unter zumindest mäßig, und
gegebenenfalls hoch stringenten, Bedingungen stabil daran gebunden.
In einem weiteren Aspekt umfasst die isolierte Nucleinsäure DNA,
die für
das PRO362-Polypeptid mit den Aminosäureresten 1 bis X aus 3 (Seq.-ID
Nr. 2) kodiert, worin X ein beliebiger Aminosäurerest von 271 bis 280 ist,
oder ist komplementär
zu solch einer kodierenden Nucleinsäuresequenz und bleibt unter
zumindest moderaten, und gegebenenfalls hoch stringenten, Bedingungen
stabil daran gebunden. Die isolierte Nucleinsäuresequenz kann das cDNA-Insert
des DNA45416-1251-Vektors umfassen, der am 5. Februar 1998 als ATCC209620
hinterlegt wurde und die für
PRO362 kodierende Nucleinsäuresequenz
umfasst.
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Wie
in den Ansprüchen
definiert stellt die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform
isolierte Nucleinsäuremoleküle bereit,
die an das Komplement der für
die PRO362-Polypeptide kodierenden Nucleinsäuremoleküle hybridisieren. Die Nucleinsäure ist
vorzugsweise DNA, und die Hybridisierung findet unter stringenten
Bedingungen statt. Solche Nucleinsäuremoleküle können als Antisense-Moleküle der mit
der Entzündung assoziierten
Antigene dienen, die hierin identifiziert sind, welche wiederum
bei der Modulation der mit der Entzündung assoziierten Antigene
oder als Antisense-Primer in Amplifikationsreaktionen Anwendung
finden können.
Außerdem
können
solche Sequenzen als Teil eines Ribozyms und/oder einer Tripelhelixsequenz
verwendet werden, die wiederum bei der Regulation der mit der Entzündung assoziierten
Antigene eingesetzt werden können.
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Wie
in den Ansprüchen
definiert stellt die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform
einen Vektor bereit, der für
ein PRO362-Polypeptid kodierende DNA umfasst.
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Eine
Wirtszelle, die einen solchen Vektor umfasst, ist ebenfalls bereitgestellt.
Die Wirtszellen können beispielsweise
CHO-Zellen, E. coli oder Hefe sein. Ein Verfahren zur Herstellung
von PRO362-Polypeptiden ist ebenfalls bereitgestellt und umfasst
das Kultivieren von Wirtszellen unter Bedingungen, die für die Expression
von PRO301 oder PRO362 geeignet sind, sowie das Gewinnen derselben
aus der Zellkultur.
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Wie
in den Ansprüchen
definiert stellt die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform
ein isoliertes PRO362-Polypeptid bereit. Insbesondere stellt die
Erfindung isoliertes Nativsequenz-PRO362 bereit, das in einem Aspekt
eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche die Reste 1 bis 321 aus 3 (Seq.-ID
Nr. 2) umfasst. Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung betrifft eine isolierte extrazelluläre Domäne eines PRO362-Polypeptids,
das die Aminosäuren
1 bis X aus 3 (Seq.-ID Nr. 2) umfasst,
worin X ein beliebiger Aminosäurerest
271–280
ist. Das PRO362-Polypeptid
wird gegebenenfalls durch Exprimieren des Polypeptids, für welches
das cDNA-Insert des am 5. Februar 1998 unter der ATCC-Hinterlegungsnummer
209620 hinterlegten DNA45416-1251-Vektors kodiert, erhalten oder
ist dadurch erhältlich.
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In
einer weiteren Ausführungsform
stellt die Erfindung chimäre
Moleküle
bereit, die ein PRO362-Polypeptid umfassen, das an ein heterologes
Polypeptid oder eine heterologe Aminosäuresequenz fusioniert ist. Ein
Beispiel für
solch ein chimäres
Molekül
umfasst ein PRO362-Polypeptid, das an eine Epitop-Markierungssequenz
oder eine Fc-Region eines Immunglobulins fusioniert ist.
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Wie
ebenfalls hierin beschrieben ist eine exprimierte sequenzmarkierte
Stelle (EST), welche die Nucleotidsequenzen umfasst, wie folgt definiert:
DNA35936 (Seq.-ID Nr. 3) aus 4A,
consen01 (Seq.-ID Nr. 4) in 4B und
consen02 (DNA42257) (Seq.-ID Nr. 5).
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In
einer weiteren Ausführungsform
stellt die vorliegende Erfindung einen isolierten Antikörper bereit, der
an ein PRO362-Polypeptid bindet. Solch ein Antikörper kann die Aktivität eines
PRO362-Polypeptid nachahmen (ein Agonisten-Antikörper), oder umgekehrt kann
ein anderer solcher Antikörper
die Aktivität
eines PRO362-Polypeptids
hemmen oder neutralisieren (Antagonisten-Antikörper). In einem weiteren Aspekt
ist der Antikörper
ein monoklonaler Antikörper,
der vorzugsweise Reste einer nichtmenschlichen komplementaritätsbestimmenden
Region (CDR) und menschliche Gerüstreste
(FR-Reste) enthält.
Der Antikörper
kann markiert und/oder auf einem festen Träger immobilisiert sein. In
einem weiteren Aspekt ist der Antikörper affinitätsgereift,
ein Antikörperfragment
oder ein einkettiger Antikörper.
Die Erfindung stellt außerdem
einen antiidiotypischen Antikörper
bereit, der auf einen Anti-PRO362-Antikörper ausgerichtet
ist.
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Die
Erfindung kann in einer Zusammensetzung Anwendung finden, die ein
PRO362-Polypeptid
oder einen Agonisten- oder Antagonistenantikörper in einem Gemisch mit einem
Träger
oder Exzipienten enthält. In
einem Aspekt enthält
die Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge des Peptids
oder Antikörpers.
In einem weiteren Aspekt ist die Zusammensetzung, wenn die Zusammensetzung
ein entzündungsstimulierendes
Molekül
enthält,
nützlich
zur: (a) Steigerung der Infiltration von Entzündungszellen in ein Gewebe eines
Säugetiers,
das dies benötigt,
(b) Stimulation oder Steigerung einer Immunantwort in einem Säugetier, das
dies benötigt,
oder (c) Steigerung der Proliferation von T-Lymphozyten in einem
Säugetier,
das dies benötigt,
als Reaktion auf ein Antigen. In einem weiteren Aspekt, wenn die
Zusammensetzung ein entzündungshemmendes
Molekül
enthält,
ist die Zusammensetzung nützlich
zur: (a) Verringerung der Infiltration von Entzündungszellen in ein Gewebe
eines Säugetiers,
das dies benötigt,
(b) Hemmung oder Reduktion einer Immunantwort in einem Säugetier,
das dies benötigt,
oder (c) Verringerung der Proliferation von T-Lymphozyten in einem
Säugetier,
das dies benötigt,
als Reaktion auf ein Antigen. In einem weiteren Aspekt enthält die Zusammensetzung
einen weiteren Wirkstoffbestandteil, der beispielsweise ein weiterer
Antikörper
oder ein zytotoxisches oder chemotherapeutisches Mittel sein kann.
Vorzugsweise ist die Zusammensetzung steril.
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Die
Erfindung kann Anwendung finden bei der Bereitstellung einer Nucleinsäure, die
für einen
Anti-PRO362-Antikörper
kodiert, und von Vektoren und rekombinanten Wirtszellen, die eine
solche Nucleinsäure enthalten,
sowie bei der Herstellung solch eines Antikörpers durch Kultivieren einer
Wirtszelle, die mit einer für den
Antikörper
kodierenden Nucleinsäure
transformiert ist, und zwar unter Bedingungen, unter denen der Antikörper exprimiert
wird, und Gewinnen des Antikörpers
aus der Zellkultur.
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KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt einen Vergleich zwischen den Polypeptiden,
für welche
das A33-Antigen (Seq.-ID Nr. 6), DNA40628 (Seq.-ID Nr. 1), DNA45416
(Seq.-ID Nr. 2), DNA35638 (Seq.-ID Nr. 9) und JAM (Seq.-ID Nr. 10) kodieren.
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2 zeigt
die abgeleitete Aminosäuresequenz
von einem Nativsequenz-PRO301-Polypeptid (Seq.-ID
Nr. 1). Dieses Polypeptid ist 299 Aminosäuren lang und weist eine Signalsequenz
bei Rest 1 bis 27, eine extrazelluläre Domäne bei Rest 28 bis etwa 235,
eine Ig-Superfamilienhomologie bei Rest 94 bis 235, eine potentielle
Transmembrandomäne
bei Rest 236 bis etwa 258 und eine intrazelluläre Domäne bei etwa Rest 259 bis 299
auf.
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3 zeigt
die Aminosäurensequenz
(Seq.-ID Nr. 2), die von den Nucleotiden 119–1081 der in 6A und 6B dargestellten
Nucleotidsequenz abgleitet ist (DNA45416, Seq.-ID Nr. 7). Ebenfalls
in 3 angezeigt, und zwar durch Unterstreichungen,
sind die Positionen eine Glykosaminoglycanstelle und einer Transmembrandomäne.
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4A zeigt die Consensusanordnung DNA35936 (Seq.-ID
Nr. 3), und 4B zeigt consen01 (Seq.-ID
Nr. 4), die beide bei der Isolation von DNA40628 eingesetzt wurden. 4C zeigt consen02 (DNA42257) (Seq.-ID Nr. 5),
die bei der Isolation von DNA45416 (Seq.-ID Nr. 7) eingesetzt wurde.
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5 zeigt
die Nucleotidsequenz einer Nativsequenz-DNA40628-cDNA, die eine
Nativsequenz-PRO301-cDNA ist, die auch als „UNQ264" und/oder „DNA40628-1216" bezeichnet wird.
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6A & B
zeigen eine Nucleotidsequenz DNA45416 (Seq.-ID Nr. 7), die eine
Nativsequenz-PRO362-cDNA ist, die auch als „UNQ317" und/oder „DNA45416-1251" bezeichnet wird.
Ebenfalls dargestellt sind das Initiationsmethionin und die Proteintranslation
für ein
PRO362-Polypeptid voller Länge (Seq.-ID
Nr. 2)
-
7 zeigt
die Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 8) einer Nativsequenz-PRO245-cDNA,
worin die Nucleotidsequenz als „UNQ219" und/oder „DNA35638" bezeichnet wird.
-
8 zeigt
die Oligonucleotidsequenzen OLI2162 (35936.f1) (Seq.-ID Nr. 12),
OLI2163 (35936.p1) (Seq.-ID Nr. 13), OLI2164 (35936.f2) (Seq.-ID
Nr. 14), OLI2165 (35936.r1) (Seq.-ID Nr. 15), OLI2166 (35936.f3)
(Seq.-ID Nr. 6), OLI2167 (35936.r2) (Seq.-ID Nr. 17), die bei der
Isolation von DNA40628 eingesetzt wurden.
-
9 zeigt eine doppelsträngige Darstellung der DNA42257
(consen02) (Seq.-ID Nr. 5) und die Positionen von fünf Oligonucleotidprimern,
die unterstrichen sind und alle bei der Isolation von DNA45416 (Seq.-ID Nr.
7) eingesetzt wurden. Die dargestellten Oligonucleotide sind 42257.f1
(Seq.-ID Nr. 18), 42257.f2 (Seq.-ID Nr. 19), 42257.r1 (Seq.-ID Nr.
20), 42257.r2 (Seq.-ID Nr. 21) und 42257.p1 (Seq.-ID Nr. 22).
-
10 zeigt BLAST-Scoring, Übereinstimmungen
und prozentuelle Homologieanordnungen zwischen 2 überlappenden
Fragmenten von DNA40628 und A33_HUMAN, einem menschlichen A33-Antigen-Vorläufer. 10A vergleicht die kodierten Reste beginnend mit
der Nucleotidposition 121 bis 816 von DNA40628 (Seq.-ID Nr. 23)
mit den kodierten Resten beginnend bei Nucleotid 17 bis 284 von
A33_HUMAN (Seq.-ID Nr. 24); 10B vergleicht
die kodierten Reste beginnend bei Nucleotid 112 bis 810 (Seq.-ID
Nr. 25) mit den kodierten Resten beginnend bei Nucleotid 12 bis
284 (Seq.-ID Nr.
26).
-
11 zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz
von einem Nativsequenz-PRO245-Polypeptid (Seq.-ID
Nr. 7), für
welche die Nucleotidsequenz der 7 (DNA35638,
Seq.-ID Nr. 8) kodiert.
-
12 zeigt eine 25,3%ige Identität zwischen der Aminosäuresequenz,
für welche
DNA40628 kodiert (Seq.-ID Nr. 1), und einem A33-Antigen (Seq.-ID
Nr. 6) an.
-
13 zeigt eine 20,8%ige Identität zwischen der Aminosäuresequenz,
für welche
DNA45416 kodiert (Seq.-ID Nr. 2), und einem A33-Antigen (Seq.-ID
Nr. 6) an.
-
14 zeigt eine 24,3%ige Identität zwischen der Aminosäuresequenz,
für welche
DNA35638 kodiert (Seq.-ID Nr. 9), und einem A33-Antigen (Seq.-ID
Nr. 6) an.
-
15 zeigt eine 67,6%ige Identität zwischen der Aminosäuresequenz,
für welche
DNA40628 kodiert (Seq.-ID Nr. 1), und JAM (Seq.-ID Nr. 10) an.
-
16 zeigt eine 23,3%ige Identität zwischen der Aminosäuresequenz,
für welche
DNA45416 kodiert (Seq.-ID Nr. 2), und JAM (Seq.-ID Nr. 10) an.
-
17 zeigt eine 34,2%ige Identität zwischen der Aminosäuresequenz,
für welche
DNA35638 kodiert (Seq.-ID Nr. 9), und JAM (Seq.-ID Nr. 10) an.
-
18 zeigt eine 26%ige Identität zwischen der Aminosäuresequenz,
für welche
ein A33-Antigen kodiert (Seq.-ID Nr. 6), und JAM (Seq.-ID Nr. 10)
an.
-
19 zeigt die Ergebnisse des in Beispiel 8, beschriebenen
Dot-Blot-Hybridisierungsverfahrens.
-
20 zeigt die Ergebnisse des in Beispiel 9 beschriebenen
Taqman-mRNA-Expressionstests.
-
21 zeigt die Bindung eines Proteins, für welches
DNA40628 kodiert, an menschliche Neutrophile, wie in Beispiel 7
beschrieben ist.
-
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN
AUSFÜHRUNGSFORMEN
-
I. Definitionen
-
Die
Begriffe „PRO362" oder „PRO362-Polypeptid" und „krebsassoziiertes
Antigen" umfassen
bei der Verwendung hierin Nativsequenz-PRO362 und Varianten davon
(die hierin weiter definiert sind). PRO362 kann aus einer Vielzahl
von Quellen, zum Beispiel aus menschlichen Gewebstypen oder aus
einer anderen Quelle, isoliert oder durch Rekombinations- oder Syntheseverfahren
hergestellt werden.
-
Die
Begriffe „Entzündungserkrankung" stehen für eine Erkrankung,
bei welcher eine Komponente des Immunsystems eines Säugetiers
eine Entzündungsreaktion
verursacht, vermittelt oder aber dazu beitragt, die zur Morbidität des Säugetiers
führt.
Es sind auch Erkrankungen enthalten, bei welchen die Stimulation
oder Intervention der Entzündungsreaktion
eine lindernde Wirkung auf das Fortschreiten der Erkrankung zeigt.
Dieser Begriff umfasst immunvermittelte Entzündungserkrankungen.
-
Der
Begriff „T-zellenvermittelte
Erkrankung" steht
für eine
Erkrankung, bei welcher T-Zellen
direkt oder indirekt die Morbidität eines Säugetiers vermitteln oder aber
dazu beitragen. Die T-zellvermittelte Erkrankung kann mit zellvermittelten
Wirkungen, lymphokinvermittelten Wirkungen etc. und sogar Wirkungen
assoziiert sein, die mit B-Zellen
assoziiert sind, wenn die B-Zellen stimuliert werden, zum Beispiel
von den Lymphokinen, die von T-Zellen sekretiert werden.
-
Beispiele
für solche
immunassoziierten und entzündlichen
Erkrankungen, wovon einige T-zellvermittelt sind, die gemäß der Erfindung
behandelt werden können,
umfassen Folgende: entzündliche
Darmerkrankung, systemischer Lupus erythematodes, rheumatoide Arthritis,
juvenile chronische Arthritis, Spondyloarthropathien, systemische
Sklerose (Sclerodermia), idiopathische entzündliche Myopathien (Dermatomyositis,
Polymyositis), Sjögren-Syndrom,
systemische Vaskulitis, Sarkoidose, hämolytische Autoimmunanämie (Immunpanzytopenie,
paroxysmale nächtliche
Hä moglobinurie,
Autoimmunthrombozytopenie (idiopathische thrombozytopenische Purpurs,
immunvermittelte Thrombozytopenie), Thyreoiditis (Basedow-Krankheit,
Hashimoto-Thyreoiditis, juvenile lymphozytische Thyreoiditis, atrophische
Thyreoiditis), Diabetes mellitus, immunvermittelte Nierenerkrankung
(Glomerulonephritis, tubulointerstitielle Nephritis), Entmarkungskrankheiten
des zentralen und peripheren Nervensystems, wie z. B. multiple Sklerose,
idiopathische Polyneuropathie, Leber-Gallen-Erkrankungen, wie z. B. infektiöse Hepatitis
(Hepatitis A, B, C, D, E und andere nicht-hepatotrope Viren)„ chronische
aktive Autoimmunhepatitis, primäre
biliäre
Leberzirrhose, granulomatöse
Hepatitis und sklerosierende Cholangitis, entzündliche und fibrotische Lungenerkrankungen
(z. B. zystische Fibrose), Zöliakie, Whipple-Krankeit, Autoimmun-
oder immunvermittelte Hauterkrankungen, einschließlich bullöse Hauterkrankungen,
Erythema multiforme und Kontaktdermatitis, Psoriasis, allergische
Erkrankungen der Lunge, wie z. B. Eosinophilenpneumonien, idiopathische
Lungenfibrose und exogen-allergische Alveolitis, mit Transplantation assoziierte
Erkrankungen, einschließlich
Transplantatabstoßung
und Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung.
-
„Tumor" bezeichnet wie hierin
verwendet das gesamte neoplastische Zellwachstum und Proliferation, ob
gut- oder bösartig,
und alle präkanzerösen Zellen
und Gewebe.
-
Die
Begriffe „Krebs" und „kanzerös" bezeichnen oder
beschreiben das physiologische Leiden bei Säugetieren, das typischerweise
durch ein ungeregeltes Zellwachstum gekennzeichnet ist. Beispiele
für Krebs
umfassen unter anderem Karzinom, Lymphom, Blastom, Sarkom und Leukämie. Genauere
Beispiele für
solche Krebsarten sind Brustkrebs, Prostatakrebs, Colonkrebs, Plattenepithelkarzinom,
kleinzelliger Lungenkrebs, nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, Magendarmkrebs,
Pankreaskrebs, Glioblastom, Zervixkrebs, Eierstockkrebs, Leberkrebs,
Blasenkrebs, Hepatom, kolorektaler Krebs, Endometriumkarzinom, Speicheldrüsenkarzinom, Nierenkrebs,
Leberkrebs, Vulvakarzinom, Schilddrüsenkrebs, Leberkarzinom und
verschiedene Formen von Krebs im Kopf- und Halsbereich.
-
„Behandlung” ist eine
Intervention, die mit der Erfindung durchgeführt wird, um die Entwicklung
einer Erkrankung zu vermeiden oder Pathologie einer Erkrankung zu
verändern.
Dementsprechend bezeichnet „Behandlung" sowohl die therapeutische
Behandlung als auch prophylaktische oder präventive Maßnahmen. Jene, die eine Behandlung
benötigen,
umfassen jene, die schon eine Erkrankung aufweisen, sowie jene,
bei welchen die Erkrankung vermieden werden soll. Bei der Behandlung
einer immunassoziierten Erkrankung kann ein therapeutisches Mittel
direkt das Ausmaß der
Antwort einer Komponente der Immunantwort erhöhen oder verringern oder die
Erkrankung empfindlicher auf Behandlung mit anderen therapeutischen
Mitteln machen, z. B. Antibiotika, Antipilzmittel, entzündungshemmende
Mittel, Chemotherapeutika etc.
-
Die „Pathologie" einer immunassoziierten
Erkrankung umfasst alle Phänomene,
die das Wohlbefinden des Patienten umfassen. Dies umfasst ohne Einschränkung abnormes
oder nicht kontrollierbares Zellwachstum (neutrophile, eosinophile,
monozytische, lymphozytische Zellen), Antikörperproduktion, Autoantikörperproduktion,
Komplementproduktion, Interferenz mit dem normalen Funktionieren
der benachbarten Zellen, Freisetzung von Cytokinen oder anderen
sekretorischen Produkten bei abnormen Ausmaßen, Suppression oder Verschlechterung
einer beliebigen entzündlichen
oder immunologischen Antwort, Infiltration von entzündlichen
Zellen (neutrophilen, eosinophilen, monozytischen, lymphozytischen
Zellen) in Zellräume
etc.
-
Der
Begriff „Säugetier" wie hierin verwendet
bezeichnet ein beliebiges Säugetier,
einschließlich
Menschen, Haustiere und Nutztiere und Zoo-, Sport- oder Heimtiere
wie Pferde, Schweine, Rinder, Hunde, Katzen und Frettchen etc. In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist das Säugetier
ein Mensch.
-
Verabreichung „in Kombination
mit" einem oder
mehreren weiteren therapeutischen Mitteln umfasst die simultane
(gleichzeitige) und aufeinander folgende Verabreichung in einer
beliebigen Reihenfolge.
-
Der
Begriff „zytotoxische
Mittel" bezeichnet
wie hierin verwendet eine Substanz, welche die Funktion von Zellen
hemmt oder vermeidet und/oder die Zerstörung von Zellen verursacht.
Der Begriff soll radioaktive Isotope (z. B. I131,
I125, Y90 und Re186), Chemotherapeutika und Toxine, wie z.
B. enzymatisch aktive Toxine bakteriellen, Pilz-, Pflanzen- oder
tierischen Ursprungs, oder Fragmente davon umfassen.
-
Ein „chemotherapeutisches
Mittel" ist eine
Verbindung, die zur Behandlung von Krebs nützlich ist. Beispiele für chemotherapeutische
Mittel umfassen Adriamycin, Doxorubicin, Epirubicin, 5-Fluoruracil,
Cytosinarabinosid („Ara-C"), Cyclophosphamid,
Thiotepa, Busulfan, Cytoxin, Taxoide, z. B. Paclitaxel (Taxol
®,
Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, New Jersey) und Doxetacel
(Taxotere
®,
Rhône-Poulenc Roher, Antony, Frankreich),
Toxoter, Methotrexat, Cisplatin, Melphalan, Vinblastin, Bleomycin,
Etoposid, Ifosfamid, Mitomycin-C, Mitoxantron, Vincristin (Loucristin),
Vinorelbin, Carboplatin, Teniposid, Daunomycin, Carminomycin, Aminopterin,
Dactinomycin, Mitomycine, Esperamicine (siehe
US-Patent Nr. 4.675.187 ), Melphalan
und andere verwandte Stickstoff-Senfgase. Diese Definition umfasst
auch Hormonmittel, die wirken, um Hormonwirkung auf Tumoren zu regulieren
oder zu hemmen, wie z. B. Tamoxifen und Onapriston.
-
Ein „wachstumshemmendes
Mittel" bezeichnet
wie hierin verwendet eine Verbindung oder Zusammensetzung, die das
Wachstum einer Zelle hemmt, insbesondere von Krebszellen, die beliebige
der hierin identifizierten Gene exprimieren oder überexprimieren,
entweder in vitro oder in vivo. Daher ist das wachstumshemmende
Mittel ein Mittel, das den Prozentsatz der Zellen, die solche Gene
in der S-Phase exprimieren oder überexprimieren,
signifikant reduziert. Beispiele für wachstumshemmende Mittel
umfassen Mittel, die das Fortschreiten des Zellzyklus (an einer
anderen Stelle als die S-Phase) blockieren, wie z. B. Mittel, die
G1-Stillstand und M-Phasenstillstand
induzieren. Klassische M-Phasenblocker umfassen die Vincaalkaloide
(Vincristin und Vinblastin), Taxol und Topo-II-Inhibitoren, wie
z. B. Doxorubicin, Epirubicin, Daunorubicin, Etoposid und Bleomycin.
Diese Mittel, die G1 anhalten, gehen auch in den S-Phasenstillstand über, z.
B. DNA-Alkylierungsmittel, wie z. B. Ta moxifen, Prednison, Dacarbazin,
Mechlorethamin, Cisplatin, Methotrexat, 5-Fluoruracil und Ara-C.
Weitere Informationen sind in The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn
und Israel, Hrsg., Kapitel 1 mit dem Titel „Cell cycle regulation, oncogens
and antineoplastic drugs",
von Murakami et al. (WB Saunders, Philadelphia (1995)), insbesondere
Seite 13, zu finden.
-
Der
Begriff „Cytokin" ist ein generischer
Begriff für
Proteine, die aus einer Zellpopulation freigesetzt werden, die auf
eine andere Zelle als interzelluläre Vermittler einwirken. Beispiele
für solche
Cytokine sind Lymphokine, Monokine und herkömmliche Polypeptid-Hormone.
Zu den Cytokinen gehören
Wachstumshormon, wie z. B. menschliches Wachstumshormon, menschliches
N-Methionyl-Wachstumshormon und Rinderwachstumshormon, Parathormon,
Thyroxin, Insulin, Proinsulin, Relaxin, Prorelaxin, Glykoproteinhormone,
wie z. B. follikelstimulierendes Hormon (FSH), thyreoidstimulierendes
Hormon (TSH) und Luteinisierungshormon (LH), Leberwachstumsfaktor,
Fibroblastenwachstumsfaktor, Prolactin, Placenta-Lactogen, Tumornekrosefaktor-α und -β, Müllersche
hemmende Substanz, Maus-Gonadotropinassoziiertes Peptid, Inhibin,
Activin, Gefäßendothelwachstumsfaktor,
Integrin, Thrombopoietin (TPO), Nervenwachstumfaktoren, wie z. B.
NGF-β. Blutplättchenwachstumsfaktor,
transformierende Wachstumsfaktoren (TGFs), wie z. B. TGF-α und TGF-β, insulinähnlicher Wachstumsfaktor-I
und -II, Erythropoietin (EPO), osteoinduktive Faktoren, Interferone
wie z. B. Interferon-α,
-β und -γ, koloniestimulierende
Faktoren (CSFs), wie z. B. Makrophagen-CSF (M-CSF), Granulozytenmakrophagen-CSF
(GM-CSF) und Granulozyten-CSF
(G-CSF), Interleukine (ILs), wie z. B. IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3,
IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, ein Tumornekrosefaktor,
wie z. B. TNF-α oder
TNF-β, und
andere Polypeptidfaktoren, einschließlich LIF und kit-Ligand (KL).
Wie hierin verwendet umfasst der Begriff Cytokin Proteine aus natürlichen
Quellen oder aus rekombinanter Zellkultur und biologisch aktive Äquivalente
der Cytokine mit nativer Sequenz.
-
Die „therapeutisch
wirksame Menge" ist
die Menge eines aktiven PRO362-Agonisten,
die erforderlich ist, um eine messbare Stimulation der Entzündungsantwort
zu erreichen.
-
Ein „Nativsequenz-PRO362" umfasst ein Polypeptid
mit derselben Aminosäuresequenz
wie PRO362, das aus der Natur stammt. Ein solches Nativsequenz-PRO362
kann aus der Natur isoliert werden oder durch Rekombinations- oder
Synthesemittel produziert, werden. Der Begriff „Nativsequenz-PRO362" umfasst insbesondere
natürlich
auftretende trunkierte bzw. sekretierte Formen von PRO362 (z. B.
eine extrazelluläre
Domänensequenz),
natürlich
auftretende Variantenformen (z. B. alternativ gespleißte Formen)
und natürlich
auftretende Allelvarianten von PRO362.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
ist das Nativsequenz-PRO362-Polypeptid eine extrazelluläre Domäne des Volllängen-PRO362-Proteins,
welche die Aminosäuren
1 bis X der in 3 dargestellten Aminosäuresequenz
(Seq.-ID Nr. 2) umfasst, worin X ein beliebiger Aminosäurerest
von 271–280
ist. Gegebenenfalls wird das PRO362-Polypeptid durch Exprimieren des Polypeptids,
für welches
das cDNA-Insert des Vektors DNA45416–1251 kodiert, der am 5. Februar
1998 unter der ATCC-Hinterlegungsnummer
209620 hinterlegt wurde, erhalten oder ist dadurch erhältlich.
-
Die „extrazelluläre PRO362-Domäne" oder „PRO362-ECD" bezieht sich auf
eine Form des PRO362-Polypeptids, die im Wesentlichen frei von den
Transmembrandomänen
und zytoplasmatischen Domänen
der jeweiligen Volllängenmoleküle ist.
Normalerweise weist eine PRO362-ECD weniger als 1% solcher Transmembrandomänen oder
zytoplasmatischen Domänen
auf, vorzugsweise weniger als 0,5% solcher Domänen. Normalerweise umfasst
PRO362-Polypeptid-ECD die Aminosäurereste
1 bis X aus 3 (Seq.-ID Nr. 2), worin X
eine beliebige Aminosäure
von 271–280
ist. Es versteht sich, dass jede Transmembrandomäne, die in Bezug auf PRO362-Polypeptide
der vorliegenden Erfindung identifiziert wird, gemäß Kriterien
bestimmt wird, die auf dem Gebiet der Erfindung routinemäßig zur
Identifikation dieser Art von hydrophoben Domänen eingesetzt werden. Die
genauen Grenzen einer Transmembrandomäne können variieren, variieren aber
an jedem Ende der Domäne meistens
nicht um mehr als etwa 5 Aminosäuren
von den ursprünglich
identifizierten. Demgemäß kann die
PRO362-Polypeptid-ECD gegebenenfalls die Aminosäuren 1 bis X aus 3 (Seq.-ID Nr.
2) umfassen, worin X ein beliebiger Aminosäurerest von 271 bis 280 von 3 (Seq.-ID
Nr. 2) ist.
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„PRO362-Variante" steht für ein aktives
PRO362-Polypeptid, wie es nachstehend definiert ist, mit zumindest
etwa 80% Aminosäuresequenzidentität mit dem
PRO362-Polypeptid
mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz,
die in 3 (Seq.-ID Nr. 2) für ein Nativsequenz-PRO362-Polypeptid
voller Länge
dargestellt ist. Solche PRO362-Polypeptidvarianten
umfassen zum Beispiel PRO362-Polypeptide, worin ein oder mehrere Aminosäurereste
am N- oder C-Terminus der Sequenz von 3 (Seq.-ID
Nr. 2) addiert oder deletiert sind. Normalerweise weist eine PRO362-Polypeptidvariante
zumindest etwa 80% Aminosäuresequenzidentität, vorzugsweise
zumindest etwa 85% Aminosäuresequenzidentität, noch
bevorzugter zumindest etwa 90% Aminosäuresequenzidentität und noch
bevorzugter zumindest etwa 95% Aminosäuresequenzidentität, mit der
Aminosäuresequenz
aus 3 (Seq.-ID Nr. 2) auf.
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„Prozentuelle
(%) Aminosäuresequenzidentität" in Bezug auf PRO362-Sequenzen,
die hierin identifiziert sind, wird als Prozentsatz der Aminosäurereste
in einer Kandidatensequenz definiert, die mit den Aminosäureresten
in der PRO362-Sequenz identisch sind, nach Anordnung der Sequenzen
und Einführung
von Lücken,
wenn notwendig, um die maximale prozentuelle Sequenzidentität zu erreichen,
und ohne Berücksichtigung
jeglicher konservativer Substitutionen als Teil der Sequenzidentität. Anordnung
zum Zwecke der Bestimmung der prozentuellen Aminosäuresequenzidentität kann auf
verschiedenste Arten erreicht werden, die im Fachgebiet bekannt
sind, zum Beispiel unter Verwendung von öffentlich zugänglicher
Computersoftware, wie z. B. BLAST-, BLAST-2-, ALIGN- oder Megalign-(DNASTAR)Software.
Fachleute können
geeignete Parameter zur Messung der Anordnung bestimmen, einschließlich beliebiger
Algorithmen, die erforderlich sind, um maximale Anordnung über die
volle Länge
der verglichenen Sequenzen zu erreichen.
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„Prozentuelle
(%) Nucleinsäuresequenzidentität” in Bezug
auf die für
PRO362 kodierenden Sequenzen, die hierin identifiziert sind (DNA45416),
wird als Prozentsatz der Nucleotide in einer Kandidatensequenz definiert,
die mit den Nucleotiden in der für
PRO362 kodierenden Sequenz identisch sind, nach Anordnung der Sequenzen
und Einführung
von Lücken,
wenn notwendig, um die maximale prozentuelle Sequenzidentität zu erreichen.
Anordnung zum Zwecke der Bestimmung der prozentuellen Nucleinsäuresequenzidentität kann auf verschiedenste
Arten erreicht werden, die im Fachgebiet bekannt sind, zum Beispiel
unter Verwendung von öffentlich
zugänglicher
Computersoftware, wie z. B. BLAST-, BLAST-2-, ALIGN- oder Megalign-(DNASTAR)Software.
Fachleute können
geeignete Parameter zur Messung der Anordnung bestimmen, einschließlich beliebiger
Algorithmen, die erforderlich sind, um maximale Anordnung über die
volle Länge
der verglichenen Sequenzen zu erreichen.
-
„Isoliert", wenn es zur Beschreibung
der verschiedenen hierin offenbarten Polypeptide verwendet wird, steht
für ein
Polypeptid, das identifiziert und getrennt worden ist und/oder aus
einer Komponente seiner natürlichen
Umgebung gewonnen wurde. Kontaminierende Komponenten seiner natürlichen
Umwelt sind Materialien, die typischerweise die diagnostischen oder
therapeutischen Verwendungen des Polypeptids stören, und können Enzyme, Hormone und andere
proteinartige oder nichtproteinartige gelöste Stoffe umfassen. In bevorzugten
Ausführungsformen
wird das Polypeptid (1) durch die Verwendung eines Zentrifugenröhrchensequenzierers
auf einen Grad gereinigt, der ausreichend ist, um zumindest 15 Reste
von N-terminaler oder interner Aminosäuresequenz zu erhalten, oder
(2) durch SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen
unter Einsatz von Coomassie-Blau
oder vorzugsweise Silberfärbung
bis zur Homogenität
gereinigt. Isoliertes Polypeptid umfasst Polypeptide in situ in
rekombinanten Zellen, da zumindest eine Komponente der natürlichen
Umwelt von PRO301 nicht gegenwärtig
ist. Für
gewöhnlich
wird jedoch das isolierte Polypeptid durch zumindest einen Reinigungsschritt
hergestellt.
-
Ein „isoliertes", für PRO362-Polypeptid
kodierendes Nucleinsäuremolekül ist ein
Nucleinsäuremolekül, das identifiziert
und aus zumindest einem kontaminierenden Nuc leinsäuremolekül getrennt
wird, mit welchem es üblicherweise
in der natürlichen
Quelle der Nucleinsäure
assoziiert ist, die für
das PRO362-Polypeptid kodiert. Ein isoliertes, für PRO362-Polypeptid kodierendes
Nucleinsäuremolekül ist anders
als in der Form oder Umgebung, in welcher es in Natur zu finden
ist. Isolierte, für
ein PRO362-Polypeptid kodierende Nucleinsäuremoleküle werden daher von dem DNA40628-Nucleinsäuremolekül unterschieden,
wie es in natürlichen Zellen
besteht. Jedoch umfasst ein isoliertes, für PRO362-Polypeptid kodierendes
Nucleinsäuremolekül für PRO362-Polypeptide
kodierende Nucleinsäuremoleküle, die
in Zellen enthalten sind, die PRO362-Polypeptid, für das kodiert
wird, ordnungsgemäß exprimieren,
wo zum Beispiel das Nucleinsäuremolekül an einem
Chromosomenort vorliegt, der sich von jenem der natürlichen
Zellen unterscheidet.
-
Der
Begriff „Kontrollsequenzen" bezieht sich auf
DNA-Sequenzen, die für
die Expression einer operabel gebundenen kodierenden Sequenz in
einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig sind. Die Kontrollsequenzen,
die für
Prokaryoten geeignet sind, umfassen zum Beispiel einen Promotor,
gegebenenfalls eine Operatorsequenz und eine Ribosomenbindungsstelle.
Es ist bekannt, dass eukaryotische Zellen Promotoren, Polyadenylierungssignale
und Enhancer verwenden.
-
Nucleinsäure ist „operabel
gebunden", wenn
sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz
gesetzt wird. Zum Beispiel ist DNA für eine Präsequenz oder einen sekretorischen
Leader operabel an DNA für
ein Polypeptid gebunden, wenn es als Präprotein exprimiert wird, das
an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt; ein Promotor oder Enhancer
ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn er die Transkription
der Sequenz beeinflusst; eine Ribosomenbindungsstelle ist operabel
an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn sie die Transkription
der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosomenbindungsstelle ist operabel
an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn sie positioniert ist,
um Translation zu erleichtern. Im Allgemeinen steht „operabel
gebunden" dafür, dass
die gebundenen DNA-Sequenzen zusammenhängend sind und im Fall eines
sekretorischen Leaders zusammenhängend
und in Lesephase sind. Enhancer müssen jedoch nicht zusammenhängend sein.
Bindung wird durch Ligation an herkömmliche Restriktions stellen
erreicht. Wenn es solche Stellen nicht gibt, werden die synthetischen
Oligonucleotidadaptoren oder -Linker gemäß herkömmlicher Praxis verwendet.
-
Der
Begriff „Antikörper" wird hierin im weitesten
Sinn verwendet und deckt insbesondere einzelne monoklonale Anti-PRO362-Antikörper ab
(einschließlich
Agonisten-, Antagonisten- und neutralisierender Antikörper) und
Anti-PRO362-Antikörperzusammensetzungen
mit polyepitoper Spezifität.
Der Begriff „monoklonaler Antikörper" bezieht sich wie
hierin verwendet auf einen Antikörper,
der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern gewonnen
wird, d. h. die einzelnen Antikörper,
aus denen die Population besteht, sind identisch mit der Ausnahme
von möglichen
natürlich
auftretenden Mutationen, die in geringeren Mengen gegenwärtig sein
können.
-
„Aktiv" oder „Aktivität" für die hierin
erwähnten
Zwecke betrifft Form(en) von PRO362, welche die biologischen und/oder
immunologischen Aktivitäten
von nativem oder natürlich
auftretendem PRO362 beibehalten. Eine bevorzugte Aktivität ist die
Fähigkeit,
sich an die Aktivität
der Antigenbindung zu binden und diese zu beeinflussen, z. B. zu
blockieren oder auf andere Weise zu modulieren. Die Aktivität umfasst
vorzugsweise die Regulation, Aktivität von Krebs und/oder assoziierten
Virusantigenen.
-
„Stringenz" von Hybridisierungsreaktionen
ist einfach von einem Fachmann zu bestimmen und ist im Allgemeinen
eine empirische Berechnung abhängig
von der Sondenlänge,
Waschtemperatur und Salzkonzentration. Im Allgemeinen erfordern
längere
Sonden höhere
Temperaturen für
geeignetes Annealing, während kürzere Sonden
niedrigere Temperaturen benötigen.
Hybridisierung hängt
im Allgemeinen von der Fähigkeit denaturierter
DNA ab, sich erneut zu annealen, wenn komplementäre Stränge in einem Umfeld unter ihrer Schmelztemperatur
gegenwärtig
sind. Je höher
der Grad der gewünschten
Homologie zwischen der Sonde und hybridisierbaren Sequenz, desto
höher die
relative Temperatur, die verwendet werden kann. Als Folge zeigt
sich, dass höhere
relative Temperaturen die Reaktionsbedingungen stringenter machen
würden,
während
geringere Temperaturen weniger. Für weitere Details und eine
Erklärung
der Stringenz von Hybridisierungsreaktionen siehe Ausu bel et al.,
Current Protocol in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995).
-
„Stringente
Bedingungen" oder „hohe Stringenzbedingungen" können wie
hierin definiert durch jene identifiziert werden, die (1) geringe
Ionenstärke
und hohe Temperatur für
Waschung verwenden, zum Beispiel 0,015 M Natriumchlorid/0,0015 M
Natriumcitrat/0,1% Natriumdodecylsulfat bei 50°C; (2) während der Hybridisierung ein
Denaturierungsmittel verwenden, wie z. B. Formamid, 50 Vol.-% Formamid
mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylypyrrolidon/50
mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75
mM Natriumcitrat bei 42°C,
oder (3) 50% Formamid, 5 × SSC
(0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH
6,8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt-Lösung, beschallte
Lachsspermien-DNA (50 μg/ml),
0,1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42°C verwenden, mit Waschungen
bei 42°C
in 0,2 × SSC
(Natriumchlorid/Natriumcitrat) und 50% Formamid bei 55°C, gefolgt
von einer Waschung bei hoher Stringenz bestehend aus 0,1 × SSC, die
EDTA bei 55°C
enthielt.
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„Moderat
stringente Bedingungen" können wie
von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New
York, Cold Spring Harbor Press (1989), beschrieben identifiziert
werden und umfassen die Verwendung der Waschlösung und Hybridisierungsbedingungen
(z. B. Temperatur, Ionenstärke
und % SDS), die weniger stringent sind als die oben beschriebenen.
Ein Beispiel für
moderat stringente Bedingungen ist die Inkubation bei 37°C über Nacht
in einer Lösung,
die Folgendes umfasst; 20% Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat),
50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10%
Dextransulfat und 20 mg/ml denaturierter gescherter Lachsspermien-DNA,
gefolgt von Waschung der Filter in 1 × SSC bei etwa 37–50°C. Der Fachmann
erkennt, wie die Temperatur, Ionenstärke etc. anzupassen sind, wie
es notwendig ist, um Faktoren wie z. B. Sondenlänge und dergleichen Rechnung
zu tragen.
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Der
Begriff „epitopmarkiert" bezieht sich wie
hierin verwendet auf ein chimäres
Polypeptid, das ein Polypeptid der Erfindung umfasst, das an ein „Markierungspolypeptid" fusioniert ist.
Das Markierungspolypeptid hat genügend Reste, um ein Epitop bereitzustellen,
gegen welches ein Antikörper
hergestellt werden kann, es ist aber auch kurz genug, sodass es
nicht mit der Aktivität
des Polypeptids überlagert,
an welches es fusioniert ist. Das Markierungspolypeptid ist vorzugsweise
auch ziemlich einzigartig, sodass der Antikörper im Wesentlichen nicht
mit anderen Epitopen kreuzreagiert. Geeignete Markierungspolypeptide
verfügen
im Allgemeinen über
zumindest sechs Aminosäurereste
und für
gewöhnlich über zwischen
etwa 8 und 50 Aminosäureresten (vorzugsweise
zwischen etwa 10 und 20 Aminosäureresten).
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„Aktiv" oder „Aktivität" im Kontext der Varianten
des Polypeptids der Erfindung bezieht sich auf Form(en) der Proteine
der Erfindung, welche die biologischen und/oder immunologischen
Aktivitäten
eines nativen oder natürlich
auftretenden Polypeptids der Erfindung beibehalten.
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„Biologische
Aktivität" im Kontext eines
Antikörpers
oder eines anderen Moleküls,
das durch die hierin offenbarten Screeningtests identifiziert werden
kann (z. B. ein organisches oder anorganisches kleines Molekül, Peptid
etc.), wird dazu verwendet, die Fähigkeit solcher Moleküle zu beschreiben,
um Infiltration von entzündlichen
Zellen in ein Gewebe zu induzieren oder zu hemmen, T-Zellproliferation
zu stimulieren oder zu hemmen und Lymphokinfreisetzung durch Zellen
zu stimulieren oder zu hemmen. Eine andere bevorzugte Aktivität ist erhöhte vaskuläre Permeabilität oder Inhibition
davon.
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Der
Begriff „Antagonist" wird im breitesten
Sinn verwendet und umfasst ein beliebiges Molekül, das eine biologische Aktivität eines
nativen Polypeptids der hierin offenbarten Erfindung teilweise oder
vollständig blockiert,
hemmt oder neutralisiert. Auf ähnliche
Weise wird der Begriff „Agonist" im weitesten Sinn
verwendet und umfasst ein beliebiges Molekül, das eine biologische Aktivität eines
nativen Polypeptids der hierin offenbarten Erfindung nachahmt. Geeignete
Agonisten- oder Antagonistenmoleküle umfassen spezifisch Agonisten-
oder Antagonisten-Antikörper
oder -Antikörperfragmente,
Fragmente oder Aminosäuresequenzvarianten von
nativen Polypeptiden der Erfindung, Peptide, kleine organische Moleküle etc.
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Ein „kleines
Molekül" wird hierin so definiert,
dass es ein Molekulargewicht von unter etwa 600 Dalton umfasst.
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„Antikörper" (Abs) und „Immunglobuline" (IgG) sind Glykoproteine
mit denselben strukturellen Eigenschaften. Während Antikörper Bindungsspezifität an ein
spezifisches Antigen erzeugen, umfassen Immunglobuline sowohl Antikörper als
auch antikörperähnliche
Moleküle,
denen die Antigen-Spezifität
fehlt. Polypeptide letzterer Art werden z. B. in geringeren Ausmaßen durch
das Lymphsystem und in erhöhten
Ausmaßen
durch Myelome produziert. Der Begriff „Antikörper" wird im weitesten Sinn verwendet und
deckt ohne Einschränkung spezifisch
intakte monoklonale Antikörper,
polyklonale Antikörper,
multispezifische Antikörper
(z. B. bispezifische Antikörper),
die aus zumindest zwei intakten Antikörpern gebildet werden, und
Antiköperfragmente
ab, solange sie die gewünschte
biologische Aktivität
zeigen.
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„Native
Antikörper" und „native
Immunglobuline" sind
für gewöhnlich heterotetramere
Glykoproteine von etwa 150.000 Dalton, bestehend aus zwei identischen
Leicht-(L-)Ketten und zwei identischen Schwer-(H-)Ketten. Jede Leichtkette
ist an eine Schwerkette durch eine kovalente Disulfidbindung gebunden, während die
Zahl der Disulfidbindungen unter den Schwerketten von verschiedenen
Immunglobulinisotypen variiert. Jede Schwer- und Leichtkette hat
auch regelmäßig beabstandete
Disulfidbrücken
zwischen den Ketten. Jede Schwerkette hat an einem Ende eine variable
Domäne
(VH) gefolgt von einer Reihe von konstanten Domänen. Jede
Leichtkette hat eine variable Domäne an einem Ende (VL) und eine konstante Domäne an ihrem anderen Ende; die
konstante Domäne
der Leichtkette wird mit der ersten konstanten Domäne der Schwerkette
angeordnet, und die variable Domäne
der Leichtkette wird mit der variablen Domäne der Schwerkette angeordnet.
Von besonderen Aminosäureresten
wird angenommen, dass sie eine Schnittfläche zwischen den variablen
Leicht- und Schwerkettendomänen
bilden.
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Der
Begriff „variabel" bezieht sich auf
die Tatsache, dass bestimmte Abschnitte der variablen Domäne bei Antikörpern sich
in der Sequenz umfassend unterscheiden, und werden in der Bindung
und Spezifität
jedes besonderen Antikörpers
für sein
be sonderes Antigen verwendet. Jedoch ist die Variabilität nicht
gleichmäßig innerhalb
der variablen Domänen
von Antikörpern
verteilt. Sie ist in drei Segmenten konzentriert, die komplementaritätsbestimmende
Regionen (CDRs) oder hypervariable Regionen genannt werden, sowohl
in den variablen Leichtketten- als auch Schwerkettendomänen. Die
höher konservierten
Abschnitte der variablen Domänen
werden Gerüst
(FR) genannt. Die variablen Domänen
der nativen Schwer- und Leichtketten umfassen jeweils vier FR-Regionen,
die im Wesentlichen eine Beta-Faltblatt-Konfiguration annehmen,
verbunden durch drei CDRs, die Schleifen bilden, welche die Beta-Faltblattstruktur
verbinden und in einigen Fällen
Teil davon sind. Die CDRs in jeder Kette werden durch die FR-Regionen
in enger Nähe
zusammengehalten und tragen mit den CDRs aus der anderen Kette zur
Bildung der Antigenbindungsstelle von Antikörpern bei (siehe Kabat et al.,
NIH Publ. Nr. 91-3242, Band 1, 647–669 (1991)). Die konstanten
Domänen
sind nicht direkt in die Bindung eines Antikörpers an ein Antigen involviert,
zeigen aber verschiedene Effektorfunktionen, wie z. B. Teilnahme
des Antikörpers
an einer antikörperabhängigen zellulären Toxizität.
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„Antikörperfragmente" umfassen einen Abschnitt
eines intakten Antikörpers,
vorzugsweise die Antigenbindungs- oder variable Region des intakten
Antikörpers.
Beispiele für
Antikörperfragmente
umfassen Fab-, Fab'-,
F(ab')2-
und Fv-Fragmente, Diakörper,
lineare Antiköper
(Zapata et al., Protein Eng. 8 (10), 1057–1062 (1995)), einkettige Antikörpermoleküle und multispezifische
Antikörper,
die aus Antikörperfragmenten
gebildet werden.
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Papainverdau
von Antikörpern
produziert zwei identische Antigenbindungsfragmente, die „Fab"-Fragmente genannt
werden, jeweils mit einer Antigenbindungsstelle und einem übrigbleibenden „Fc"-Fragment. Die Bezeichnung „Fc" reflektiert die
Fähigkeit,
leicht zu kristallisieren. Pepsinbehandlung ergibt ein F(ab')2-Fragment,
das zwei Antigenkombinationsstellen aufweist und immer noch in der
Lage ist, Antigen zu vernetzen.
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„Fv" ist das minimale
Antikörperfragment,
das eine vollständige
Antigenerkennungsund -bindungsstelle enthält. Diese Region besteht aus
einem Dimer einer variablen Schwerketten- und einer variablen Leichtkettendomäne in enger,
nicht-kovalenter Assoziation. Es geschieht in dieser Konfiguration,
dass die drei CDRs jeder variablen Domäne Wechselwirken, um eine Antigenbindungsstelle
auf der Oberfläche
des VH-VL-Dimers zu definieren. Gemeinsam verleihen
die sechs CDRs dem Antikörper
Antigenbindungsspezifität.
Jedoch hat sogar eine einzelne variable Domäne (oder die Hälfte eines
Fv, das nur drei CDRs umfasst, die für ein Antigen spezifisch sind)
die Fähigkeit,
Antigen zu erkennen und zu binden, obgleich in einer geringeren
Affinität
als die gesamte, Bindungsstelle.
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Das
Fab-Fragment enthält
auch die konstante Domäne
der Leichtkette und die erste konstante Domäne (CH1) der Schwerkette. Fab'-Fragmente unterscheiden
sich von Fab-Fragmenten durch die Hinzufügung einiger weniger Reste
am Carboxyterminus der Schwerketten-CH1-Domäne, einschließlich ein
oder mehrere Cysteine aus der Antikörpergelenksregion. Fab'-SH ist die hierin
verwendete Bezeichnung für
Fab', in welcher der/die
Cysteinrest(e) der konstanten Domänen eine freie Thiolgruppe
trägt/tragen.
F(ab')2-Antikörperfragmente
wurden ursprünglich
als Paar von Fab'-Fragmenten produziert,
die Gelenkscysteine dazwischen aufweisen. Es sind ebenfalls andere
chemische Bindungen von Antikörperfragmenten
bekannt.
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Die „Leichtketten" von Antikörpern (Immunglobuline)
aus einer beliebigen Wirbeltierspezies können einer oder zwei verschiedenen
Arten zugeordnet werden, die kappa (κ) und lambda (λ) genannt
werden, basierend auf den Aminosäuresequenzen
ihrer konstanten Domänen.
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Abhängig von
der Aminosäuresequenz
der konstanten Domäne
ihrer Schwerketten können
Immunglobuline verschiedenen Klassen zugeordnet werden. Es gibt
fünf Hauptklassen
von Immunglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, und mehrere dieser
können
weiters in Unterklassen (Isotypen) unterteilt werden, z. B. IgG1,
IgG2, IgG3, IgG4, IgA und IgA2. Die konstanten Schwerkettendomänen, die
den verschiedenen Klassen von Immunglobulinen entsprechen, werden α, β, ε, γ bzw. μ genannt.
Es sind die Untereinheitsstrukturen und dreidimensionalen Konfigurationen
von verschiedenen Klassen von Immunglobulinen bekannt.
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Der
Begriff „monoklonaler
Antikörper" wie hierin verwendet
bezeichnet einen Antikörper,
der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern gewonnen
wird, d. h. die individuellen Antikörper, welche die Population
umfassen, sind identisch, mit Ausnahme von möglichen natürlich auftretenden Mutationen,
die in geringeren Mengen gegenwärtig
sein können.
Monoklonale Antikörper
sind höchst
spezifisch und sind auf eine einzelne Antigenstelle ausgerichtet.
Weiters ist im Gegensatz zu herkömmlichen
(polyklonalen) Antikörperformulierungen,
die typischerweise verschiedene Antikörper umfassen, die gegen verschiedene
Determinanten (Epitope) gerichtet sind, jeder monoklonale Antikörper gegen
eine einzelne Determinante auf dem Antigen ausgerichtet. Zusätzlich zu
ihrer Spezifität
sind die monoklonalen Antikörper
insofern vorteilhaft, als dass sie durch die Hybridomkultur synthetisiert
werden, nicht verunreinigt durch andere Immunglobuline. Der Modifikator „monoklonal" zeigt den Charakter
des Antikörpers
an, das er aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erhalten
wird, und soll nicht so ausgelegt werden, dass die Produktion des
Antikörpers
durch ein beliebiges spezielles Verfahren erforderlich ist. Zum
Beispiel können
die gemäß der vorliegenden
Erfindung zu verwendenden monoklonalen Antikörper durch das zuerst von Kohler
et al., Nature 256, 495 (1975), beschriebene Verfahren oder durch
DNA-Rekombinationsverfahren (siehe z. B.
US-Patent Nr. 4.816.567 ) hergestellt
werden. Die „monoklonalen
Antikörper" können auch
aus Phagenantikörperbibliotheken unter
Einsatz der z. B. von Clackson et al., Nature 352, 624–628 (1991),
und Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581–597 (1991), beschriebenen
Verfahren isoliert werden. Siehe auch
US-Patent
Nr. 5.750.373 ;
5.571.698 ;
5.403.484 und
5.223.409 , welche die Formulierung
von Antikörpern
unter Einsatz von Phagemid- und Phagenvektoren beschreiben.
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Die
hierin angeführten
monoklonalen Antikörper
umfassen spezifisch „chimäre" Antikörper (Immunglobuline),
in welchen ein Abschnitt der Schwer- und/oder Leichtkette mit den
entsprechenden Sequenzen in Antikörpern identisch ist oder homolog
zu ihnen ist, die von einer besonderen Spezies abstammen oder einer
besonderen Anti körperklasse
oder -Unterklasse angehören,
während
der Rest der Kette(n) identisch mit oder homolog zu den entsprechenden
Sequenzen in Antikörpern
ist, die von einer anderen Spezies abstammen oder einer anderen
Antikörperklasse
oder -Unterklasse angehören,
sowie Fragmente solcher Antikörper,
solange sie die gewünschte
biologische Aktivität
zeigen (
US-Patent Nr. 4.816.567 ;
Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851–6855 (1984)).
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„Humanisierte" Formen von nicht-menschlichen
(z. B. murinen) Antikörpern
sind chimäre
Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z.
B. Fv, Fab, Fab',
F(ab')
2 oder
andere antigenbindende Untersequenzen von Antikörpern), welche eine minimale
Sequenz enthalten, die von einem nicht-menschlichen Immunglobulin
stammen. Meistens sind humanisierte Antikörper menschliche Immunglobuline
(Empfängerantikörper), in
welchen mehrere oder alle Reste einer komplementaritätsbestimmenden
Region (CDR) des Empfängers
durch Reste aus einer CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Spenderantikörper), wie
z. B. einer Maus, Ratte oder eines Kaninchens, mit der gewünschten
Spezifität,
Affinität
und Kapazität ersetzt
sind. In einigen Fällen
können
auch bestimmte Fv-Gerüstregionenreste
(FR) des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche
Reste ersetzt sein. Weiters können
humanisierte Antikörper Reste
umfassen, die weder in den Empfängerantikörpern noch
in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen zu finden sind.
Diese Modifikationen werden gemacht, um die Antikörperleistung
weiter zu verfeinern und zu maximieren. Im Allgemeinen umfasst der
humanisierte Antikörper
im Wesentlichen die gesamte von zumindest einer und typischerweise
zwei variablen Domänen,
in welchen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen jenen
eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder
im Wesentlichen alle FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulinsequenz
sind. Der humanisierte Antikörper
umfasst auch optimalerweise zumindest einen Abschnitt einer konstanten
Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jene eines menschlichen
Immunglobulins. Für
weitere Details siehe Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Reichmann
et al., Nature 332, 323–329
(1988), und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593–596 (1992).
Der humanisierte Antikörper
umfasst einen „primatisierten" Antikörper, wo
die Antigenbindungsregion des Antikörpers von einem Antikörper stammt, der
durch die Immunisierung von Makakenaffen mit dem Antigen von Interesse produziert
wird. Antikörper,
die Reste aus Alte-Welt-Affen enthalten, sind innerhalb dieser Erfindung
ebenfalls möglich.
Siehe zum Beispiel
US-Patent
Nr. 5.658.570 ;
5.693.780 ;
5.681.722 ;
5.750.105 und
5.756.096 .
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„Einzelkettige
Fv-" oder „sFv"-Antikörperfragmente
umfassen die VH- und VL-Domänen des
Antikörpers,
worin diese Domänen
in einer einzigen Polypeptidkette gegenwärtig sind. Vorzugsweise umfasst
das Fv-Polypeptid weiters einen Polypeptidlinker zwischen den VH- und VL-Domänen, die
dem sFv ermöglichen, die
gewünschte
Struktur für
die Antigenbindung zu bilden. Für
einen Überblick über sFv
siehe Pluckthun in: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Band
113, Rosenburg und Moore (Hrsg.), Springer-Verlag, New York, 269–315 (1994).
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Der
Begriff „Diakörper" bezeichnet kleine
Antikörperfragmente
mit zwei Antigenbindungsstellen, wobei die Fragmente eine variable
Schwerkettendomäne
(V
H), umfassen, die an eine variable Leichtkettendomäne (V
L) in derselben Polypeptidkette gebunden
ist (V
H-V
L). Durch
die Verwendung eines Linkers, der zu kurz ist, um Paarung zwischen
den zwei Domänen
auf derselben Kette zu ermöglichen,
werden die Domänen
dazu gezwungen, sich mit den komplementären Domänen einer anderen Kette zu
paaren und zwei Antigenbindungsstellen zu schaffen. Diakörper werden
detaillierter in z. B.
EP 404.097 ;
WO 93/11161 und Hollinger
et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 90, 6444–6448 (1993), beschrieben.
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Ein „isolierter
Antikörper" ist einer, der identifiziert
und aus einer Komponente seiner natürlichen Umwelt getrennt und/oder
gewonnen wurde. Kontaminierende Komponenten ihrer natürlichen
Umwelt sind Materialien, die in die diagnostischen oder therapeutischen
Verwendungen des Antikörpers
eingreifen, und können Enzyme,
Hormone und andere proteinhältige
oder nichtproteinhältige
gelöste
Stoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Verbindung
der Erfindung (1) auf mehr als 95 Gew.-% der Verbindung gereinigt, wie
durch das Lowry-Verfahren bestimmt wird, und am bevorzugtesten mehr
als 99 Gew.-%, (2) auf einen ausreichenden Grad unter Verwendung
eines Zentrifugenröhrchensequenzierers
gereinigt, um zumindest 15 Reste der N-terminalen oder internen
Aminosäuresequenz
zu erhalten; oder (3) auf Homogenität durch SDS-PAGE unter reduzierenden
oder nicht-reduzierenden Bedingungen unter Einsatz von Coomassie-Blau
oder vorzugsweise Silberfärbung
gereinigt. Eine isolierte Verbindung, z. B. Antikörper oder
Polypeptid, umfasst die Verbindung in situ innerhalb rekombinanter
Zellen, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung der Verbindung
nicht gegenwärtig
ist. Üblicherweise
wird jedoch eine isolierte Verbindung durch zumindest einen Reinigungsschritt
hergestellt.
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Das
Wort „Markierung" bezieht sich wie
hierin verwendet auf eine detektierbare Verbindung oder Zusammensetzung,
die direkt oder indirekt an die Verbindung konjugiert ist, z. B.
Antikörper
oder Polypeptid, um eine „markierte" Verbindung zu erzeugen.
Die Markierung kann selbst detektiert werden (z. B. Radioisotopmarkierungen
oder Fluoreszenzmarkierungen) oder im Fall einer enzymatischen Markierung
chemische Änderung einer
Substratverbindung oder -Zusammensetzung katalysieren, die detektierbar
ist.
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Unter „Festphase" versteht man eine
nicht-wässrige
Matrix, an welcher die Verbindung der vorliegenden Erfindung anhaften
kann. Beispiele für
Festphasen, die hierin enthalten sind, umfassen jene, die teilweise oder
vollständig
aus Glas (z. B. Glas mit gesteuerter Porengröße), Polysacchariden (z. B.
Agarose), Polyacrylamid, Polystyrol, Polyvinylalkohol und Silikonen
gebildet sind. In bestimmten Ausführungsformen kann die Festphase
abhängig
vom Kontext das Well einer Testplatte umfassen, in anderen ist sie
eine Reinigungssäule (z.
B. eine Affinitätschromatographiesäule). Dieser
Begriff umfasst auch eine diskontinuierliche Festphase von diskreten
Teilchen, wie beispielsweise die in
US-Patent
Nr. 4.275.149 beschriebenen.
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Ein „Liposom" ist ein kleines
Vesikel, bestehend aus verschiedenen Formen von Lipiden, Phospholipiden
und/oder Tensid, das zur Verabreichung eines Arzneimittels (wie
z. B. der hierin offenbarten Anti-ErbB2-Antikörper und optional eines chemotherapeutischen
Mittels) an ein Säugetier
nützlich
ist. Die Komponenten des Liposoms werden üblicherweise in einer Doppelschichtformation
angeordnet, ähnlich
der Lipidanordnung von biologischen Membranen.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Immunadhäsin" antikörperähnliche Moleküle, welche
die Bindungsspezifität
eines heterologen Proteins (eines „Adhäsins") mit den Effektorfunktionen von konstanten Immunglobulindomänen kombinieren.
Strukturell umfassen die Immunadhäsine eine Fusion einer Aminosäuresequenz
mit der gewünschten
Bindungsspezifität,
die eine andere ist als die Antigenerkennungs- und -bindungsstelle eines Antikörpers (d.
h. ist „heterolog"), und einer konstanten
Domänensequenz
von Immunglobulin. Der Adhäsinteil
eines Immunadhäsinmoleküls ist typischerweise
eine zusammenhängende
Aminosäuresequenz,
die zumindest die Bindungsstelle eines Rezeptors oder eines Liganden
umfasst. Die konstante Domänensequenz
von Immunglobulin im Immunadhäsin
kann aus einem Immunglobulin erhalten werden, wie z. B. IgG-1-,
IgG-2-, IgG-3-, oder IgG-4-Unterarten, IgA (einschließlich IgA-1
und IgA-2), IgE, IgD oder IgM.
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II. Zusammensetzungen und Verfahren der
Erfindung
-
A. Herstellung der PRO362-Polypeptide
-
1. Volllängen-PRO362-Polypeptide
-
Die
vorliegende Anmeldung identifiziert und isoliert sie Nucleotidsequenzen,
die für
Polypeptide kodieren, die in der vorliegenden Anmeldung als PRO301,
PRO362 oder PRO245 bezeichnet werden. Insbesondere haben die Anmelder
cDNA identifiziert und isoliert, die für ein PRO301-, PRO362- oder
PRO245-Polypeptid kodiert, wie in den nachstehenden Beispielen detaillierter
offenbart wird. Unter Einsatz von BLAST- und FastA-Sequenzanordnungscomputerprogrammen
stellten die Anmelder fest, dass ein Volllängen-Nativsequenz-PRO301 (2,
Seq.-ID Nr. 1); -PRO362 (3, Seq.-ID
Nr. 2) und -PRO245 (11, Seq.-ID Nr. 9) signifikante
Homologie sowohl zum A33-Antigen als auch JAM zeigt (siehe 1, 12–18).
Dementsprechend wird derzeit davon ausgegangen, dass PRO362, das
in der vorliegenden Anmeldung offenbart ist, ein neu identifiziertes
Mitglied der A33-Antigenproteinfamilie ist und mit Entzündungserkrankungen,
wie z. B. entzündlicher
Darmerkrankung, sowie mensch lichen neoplastischen Erkrankungen,
wie z. B. kolorektalem Krebs, assoziiert sein kann.
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2. PRO362-Varianten
-
Zusätzlich zu
Nativsequenz-PRO362 voller Länge,
das hierin beschrieben ist, ist zu nennen, dass PRO362-Varianten
hergestellt werden können.
PRO362-Varianten können
durch die Einführung
von geeigneten Nucleotidänderungen
in die PRO362-DNA
oder durch Synthese der gewünschten
PRO362-Polypeptide hergestellt werden. Für Fachleute versteht sich,
dass Aminosäureänderungen
Posttranslationsprozesse von PRO362 verändern können, wie z. B. die Veränderung
der Zahl oder Position von Glykosylierungsstellen oder Änderungen
der Membranverankerungseigenschaften.
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Variationen
in Nativsequenz-PRO362 voller Länge
oder in verschiedenen Domänen
des hierin beschriebenen PRO362 können zum Beispiel unter Verwendung
beliebiger Verfahren und Richtlinien für konservative und nicht-konservative
Mutationen, die z. B. in
US-Patent
Nr. 5.364.934 dargelegt sind, hergestellt werden. Variationen
können
eine Substitution, Deletion oder Insertion eines oder mehrerer Codons
sein, die für das
PRO362 kodieren, was im Vergleich mit Nativsequenz-PRO362 zu einer
Veränderung
der Aminosäuresequenz
von PRO362 führt.
Gegebenenfalls erfolgt die Variation durch Substitution von zumindest
einer Aminosäure
durch eine andere Aminosäure
in einer oder mehreren Domänen
von PRO362. Hinweise zur Bestimmung, welcher Aminosäurerest
insertiert, substituiert oder deletiert werden kann, ohne die gewünschte Aktivität negativ
zu beeinflussen, sind durch den Vergleich der Sequenz von PRO362
mit jener der homologen bekannten Proteinmoleküle und das Minimieren der Zahl
der Aminosäuresequenzänderungen,
die in den Regionen hoher Homologie erfolgen, zu finden. Aminosäuresubstitutionen
können
das Ergebnis des Ersetzens einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen
strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften sein, wie z. B.
das Ersetzen eines Leucins durch ein Serin, d. h. konservatives
Ersetzen von Aminosäuren. Insertionen
oder Deletionen können
gegebenenfalls im Bereich von 1 bis 5 Aminosäuren liegen. Die erlaubte Va riation
kann durch die systematische Herstellung von Insertionen, Deletionen
oder Substitutionen von Aminosäuren
in der Sequenz und das Testen der resultierenden Varianten auf Aktivität in den
nachstehenden Beispielen beschriebenen In-vitro-Tests bestimmt werden.
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Die
Variationen können
unter Verwendung fachbekannter Verfahren, wie z. B. oligonucleotidvermittelter
(ortsgerichteter) Mutagenese, Alaninscanning und PCR-Mutagenese, hergestellt
werden. Ortsgerichtete Mutagenese [Carter et al., Nucl. Acids Res.,
13, 4331 (1986), Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10, 6487 (1987)], Kassettenmutagenese
[Wells et al., Gene 34, 315 (1985)], Restriktions-Selektions-Mutagenese [Wells
et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317, 415 (1986)] oder
andere bekannte Verfahren können
auf der klonierten DNA durchgeführt
werden, um die PRO301-DNA-Variante zu produzieren.
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Scanning-Aminosäureanalyse
kann ebenfalls verwendet werden, um eine oder mehrere Aminosäuren entlang
einer zusammenhängenden
Sequenz zu identifizieren. Unter den bevorzugten Scanningaminosäuren sind
relativ kleine neutrale Aminosäuren.
Solche Aminosäuren
umfassen Alanin, Glycin, Serin und Cystein. Alanin ist typischerweise
eine bevorzugte Scanning-Aminosäure
in dieser Gruppe, weil es die Seitenketten über den Beta-Kohlenstoff hinaus
eliminiert und weniger wahrscheinlich die Hauptkettenkonformation
der Variante ändert.
Alanin wird typischerweise auch bevorzugt, weil es die häufigste
Aminosäure
ist. Weiters ist es häufig
sowohl an versteckten als auch exponierten Positionen zu finden
[Creighton, The Proteins (W.H. Freeman & Co., N Y.); Chothia, J. Mol. Biol.
150, 1 (1976)]. Wenn Alaninsubstitution keine adäquaten Mengen von Varianten
erbringt, kann eine isoterische Aminosäure verwendet werden.
-
3. Modifikationen von PRO362
-
Kovalente
Modifikationen von PRO362 sind im Schutzumfang dieser Erfindung
enthalten. Eine Form von kovalenter Modifikation umfasst das Umsetzen
von Aminosäureresten
von PRO362, auf die abgezielt wird, mit einem organischen derivatisieren den
Mittel, das in der Lage ist, mit ausgewählten Seitenketten oder N- oder
Cterminalen Resten von PRO362 zu reagieren. Derivatisierung mit
bifunktionellen Mitteln ist nützlich,
zum Beispiel zur Vernetzung von PRO362 mit einer wasserunlöslichen
Trägermatrix
oder Oberfläche
zur Verwendung im Verfahren zur Reinigung von Antikörpern und
vice-versa. Häufig
verwendete Vernetzungsmittel umfassen z. B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan,
Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, z. B. Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle
Imidoester, einschließlich
Disuccinimidylester, wie z. B. 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), bifunktionelle
Maleinimide, wie z. B. Bis-N-maleinimid-1,8-octan, und Mittel, wie
z. B. Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat.
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Andere
Modifikationen umfassen Deamidierung von Glutaminyl- und Asparaginylresten
zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten, Hydroxylierung
von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl-
oder Threonylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin-,
und Histidinseitenketten [T.E. Creighton, Proteins: Structure and
Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 79–86 (1983)],
Acetylierung des N-terminalen Amins und Amidierung einer beliebigen
C-terminalen Carboxylgruppe.
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Eine
andere Form von kovalenter Modifikation des PRO362-Polypeptids,
das im Schutzumfang dieser Erfindung enthalten ist, umfasst die Änderung
des nativen Glykosylierungsmusters des Polypeptids. „Änderung
des nativen Glykosylierungsmusters" dient den hierin angeführten Zwecken
und soll für
die Deletion einer oder mehrerer Kohlenhydratgruppierungen, die
in dem Nativsequenz-PRO362 zu finden sind, und/oder Hinzufügung von
einer oder mehreren Glykosylierungsstellen, die im Nativsequenz-PRO362
nicht gegenwärtig sind,
und/oder Änderung
des Verhältnisses
und/oder der Zusammensetzung von Zuckerresten, die an die Glykosylierungsstelle(n)
angeheftet sind, stehen.
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Hinzufügung von
Glykosylierungsstellen an das PRO362-Polypeptid kann durch Änderung
der Aminosäuresequenz
erreicht werden. Die Änderung
kann zum Beispiel durch die Hinzufügung von oder Substitution durch
einen oder mehrere Serin- oder Threoninreste zu Nativsequenz-PRO362
(für O-gebundene
Glykosylierungsstellen) erreicht werden. Die PRO362-Aminosäuresequenz
kann gegebenenfalls durch Veränderungen auf
DNA-Ebene erreicht werden, insbesondere durch Mutation der DNA,
die für
das PRO362-Polypeptid kodiert, an vorausgewählten Basen, sodass Codons
erzeugt werden, die sich in die gewünschten Aminosäuren translatieren.
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Ein
anderes Mittel zur Steigerung der Zahl von Kohlenhydratgruppierungen
auf dem PRO362-Polypeptid erfolgt durch chemische oder enzymatische
Bindung von Glykosiden an das Polypeptid. Solche Verfahren sind
fachbekannt, z. B. in
WO 87/05330 ,
veröffentlicht
am 11. September 1987, und in Aplin und Wriston, CRC Crit. Rev.
Biochem. 259–306
(1981), beschrieben.
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Entfernung
von Kohlenhydratgruppierungen, die auf dem PRO362-Polypeptid gegenwärtig sind,
kann chemisch oder enzymatisch oder durch Mutationssubstitution
von Codons erreicht werden, die für Aminosäurereste kodierten, die als
Targets für
die Glykosylierung dienen. Chemische Deglykosylierungsverfahren
sind fachbekannt und werden zum Beispiel von Hakimuddin et al.,
Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987), und von Edge et al., Anal.
Biochem. 118, 131 (1981), beschrieben. Enzymatische Spaltung von
Kohlenhydratgruppierungen auf Polypeptiden kann durch die Verwendung
einer Vielzahl von Endo- und Exoglykosidasen wie von Thotakura et
al., Meth. Enzymol. 138, 350 (1987), beschrieben, erreicht werden.
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Eine
andere Form von kovalenter Modifikation von PRO362 umfasst die Bindung
des PRO301-, PRO362- oder PRO245-Polypeptids an eine Vielzahl von
nicht-proteinartigen Polymeren, z. B. Polyethylenglykal, Polypropylenglykol
oder Polyoxyalkylenen, in der Art und Weise, wie es in
US-Patent Nr. 4.640.835 ,
4.496.689 ;
4.301.144 ;
4.670.417 ,
4.791.192 oder
4.179.337 dargelegt ist.
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Das
PRO362 der vorliegenden Erfindung kann auch so modifiziert werden,
dass ein chimäres
Molekül gebildet
wird, das PRO362 an ein(e) andere(s) heterologe(s) Polypeptid oder
Aminosäuresequenz
fusioniert umfasst. In einer Ausführungsform umfasst ein solches
chimäres
Molekül
eine Fusion von PRO362 mit einem Markie rungspolypeptid, das ein
Epitop bereitstellt, an welches sich ein Anti-Markierungs-Antikörper selektiv binden
kann. Die Epitopmarkierung wird im Allgemeinen an den Amino- oder
Carboxylterminus von PRO362 positioniert. Die Gegenwart solcher
epitopmarkierter Formen von PRO362 kann unter Einsatz eines Antikörpers gegen
das Markierungspolypeptid detektiert werden. Die Bereitstellung
der Epitopmarkierung ermöglicht PRO362
auch, einfach durch Affinitätsreinigung
unter Einsatz eines Anti Markierungsantikörpers oder einer anderen Form
von Affinitätsmatrix,
die sich an die Epitopmarkierung bindet, gereinigt zu werden. In
einer alternativen Ausführungsform
kann das chimäre
Molekül
eine Fusion von PRO362 mit einem Immunglobulin oder einer bestimmten
Region eines Immunglobulins umfassen. Für eine bivalente Form des chimären Moleküls kann
eine solche Fusion an die Fc-Region eines IgG-Moleküls erfolgen.
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Verschiedene
Markierungspolypeptide und ihre jeweiligen Antikörper sind fachbekannt. Beispiele
umfassen Polyhistidin-(poly-his-) oder Polyhistidinglycin-(poly-his-gly-)Markierungen,
das flu-HA-Markierungspolypeptid und seinen Antikörper 12CA5
[Field et al., Mol. Cell Biol. 8, 2159–2165 (1988)], die c-myc-Markierung und
die 8F9-, 3C7-, 6E10, G4-, B7- und 9E10-Antikörper dagegen [Evan et al.,
Molecular and Cellular Biology 5, 3610–3616 (1985)] und die Herpes-simplex-Virus-Glykoprotein-D-(gD) Markierung und
ihre Antikörper
[Paborsky et al., Protein Engineering 3 (6), 547–553 (1990)]. Andere Markierungspolypeptide
umfassen das Flag-Peptid [Hopp et al., Biotechnology 6, 1204–1210 (1988)],
das KT3-Epitoppeptid [Martin et al., Science 255, 192–194 (1992)],
ein α-Tubulinepitoppeptid
[Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163–15166 (1991)] und die T7-Gen-10-Proteinpeptidmarkierung
[Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6393–6397 (1990)].
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4. Produktion und Isolation von PRO362
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Die
nachstehende Beschreibung betrifft primär die Produktion von PRO362
durch die Kultivierung von Zellen, die mit einem Vektor transformiert
oder transfiziert sind, der die PRO362-Nucleinsäure enthält. Es versteht sich daher,
dass alternative fachbekannte Verfahren dazu verwendet werden können, PRO362
herzustellen. Zum Bei spiel kann die PRO362-Sequenz oder Abschnitte
davon durch direkte Peptidsynthese unter Einsatz von Festphasenverfahren
[siehe z. B. Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, W.H.
Freeman Co., San Francisco, Kalifornien (1969), Merrifield, J. Am.
Chem. Soc. 85, 2149–2154
(1963)] hergestellt werden. In-vitro-Proteinsynthese kann unter
Einsatz von manuellen Verfahren oder durch Automatisierung durchgeführt werden.
Automatisierte Synthese kann zum Beispiel unter Einsatz eines Peptidsynthesegeräts von Applied
Biosystems (Foster City, Kalifornien) unter Verwendung der Gebrauchsanweisungen
des Herstellers erreicht werden. Verschiedene Abschnitte von PRO362
können
separat chemisch synthetisiert werden und unter Einsatz chemischer
oder enzymatischer Verfahren kombiniert werden, um PRO362 voller
Länge zu
produzieren.
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a. Isolation von DNA, die für PRO362
kodiert
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DNA,
die für
PRO362 kodiert, kann aus einer cDNA-Bibliothek gewonnen werden,
die aus Gewebe hergestellt wurde, von dem angenommen wird, dass
es PRO362-mRNA besitzt
und sie in einem detektierbaren Ausmaß exprimiert. Dementsprechend
kann menschliche PRO362-DNA einfach aus einer cDNA-Bibliothek gewonnen
werden, die aus menschlichem Gewebe hergestellt wurde, wie in den
Beispielen beschrieben. Das für
PRO362 kodierende Gen kann auch aus einer genomischen Bibliothek
oder durch Oligonucleotidsynthese erhalten werden.
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Bibliotheken
können
mit Sonden gescreent werden (wie z. B. Antikörpern zu PRO362 oder Oligonucleotiden
von zumindest etwa 20–80
Basen), die zur Identifikation des Gens von Interesse oder des davon
kodierten Proteins entworfen wurden. Screening der cDNA- oder genomischen
Bibliothek mit der ausgewählten Sonde
kann unter Einsatz von Standardverfahren durchgeführt werden,
wie z. B. den in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (New York; Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) beschriebenen. Ein
alternatives Mittel zur Isolierung des Gens, das für PRO362
kodiert, ist, PCR-Methodologie zu verwenden [Sambrook et al., siehe
oben, Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory Press (1995)].
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Die
nachstehenden Beispiele beschreiben Verfahren zum Screening einer
cDNA-Bibliothek.
Die Oligonucleotidsequenzen, die als Sonden ausgewählt werden,
sollen ausreichend lang und ausreichend unzweideutig sein, sodass
falsche Positive minimiert werden. Das Oligonucleotid wird bevorzugt
so markiert, dass es nach Hybridisierung an DNA in der zu screenenden
Bibliothek detektiert werden kann. Verfahren zur Markierung sind
fachbekannt und umfassen die Verwendung von Radiomarkierungen wie 32P-markiertes ATP, Biotinylierung oder Enzymmarkierung.
Hybridisierungsbedingungen, einschließlich moderate Stringenz und
hohe Stringenz, sind in Sambrook et al., siehe oben, bereitgestellt.
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Sequenzen,
die in solchen Bibliothekscreeningverfahren identifiziert werden,
können
verglichen und an andere bekannte Sequenzen, die in öffentlichen
Datenbanken, wie z. B. GenBank, oder anderen privaten Sequenzdatenbanken
hinterlegt und zugänglich
sind, angeordnet werden. Sequenzidentität (entweder auf Aminosäure- oder
Nucleotidebene) innerhalb definierter Regionen des Moleküls oder über die
Sequenz voller Länge
kann durch Sequenzanordnung unter Einsatz von Computersoftwareprogrammen
wie BLAST, BLAST-2, ALIGN, DNAstar und INHERIT bestimmt werden,
die verschiedene Algorithmen verwenden, um Homologie zu messen.
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Nucleinsäure mit
einer für
Protein kodierenden Sequenz kann durch Screening von ausgewählten cDNA-
oder genomischen Bibliotheken unter Einsatz der abgeleiteten Aminosäuresequenz,
die hierin zum ersten Mal offenbart ist, und wenn notwendig unter
Einsatz herkömmlicher
Primerextensionsverfahren, wie sie in Sambrook et al., siehe oben,
beschrieben sind, um Vorläufer
zu detektieren, und Verarbeiten der Zwischenprodukte von mRNA, die
nicht in cDNA umkehrtranskribiert worden sind, erhalten werden.
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b. Auswahl und Transformation von Wirtszellen
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Wirtszellen
werden mit den hierin für
die PRO301-, PRO362- oder PRO245-Produktion
beschriebenen Expressions- oder Klonierungsvektoren transfiziert
oder transformiert und in herkömmlichen
Nährstoffmedien, die
in geeigneter Weise zur In duktion von Promotoren, Auswahl von Transformanten
oder Amplifikation der Gene, die für die gewünschten Sequenzen kodieren,
modifiziert sind, kultiviert. Die Kulturbedingungen, wie z. B. Medium,
Temperatur, pH und dergleichen, können vom Fachmann ohne übermäßiges Experimentieren
ausgewählt
werden. Im Allgemeinen sind die Prinzipien, Protokolle und praktischen
Verfahren zur Maximierung der Produktivität von Zellkulturen in Mammalian
Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, Hrsg. IRL Press
(1991), und Sambrook et al., siehe oben, zu finden.
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Transfektionsverfahren
sind dem Fachmann bekannt, z. B. CaPO
4 und
Elektroporation. Abhängig
von der verwendeten Wirtszelle wird Transformation unter Verwendung
von Standardverfahren durchgeführt,
die für
solche Zellen geeignet sind. Die Kalziumbehandlung, die Kalziumchlorid
verwendet, wie in Sambrook et al., siehe oben, beschrieben ist,
oder Elektroporation wird im Allgemeinen für Prokaryoten oder andere Zellen
verwendet, die wesentliche Zellwandbarrieren enthalten. Infektion
mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transformation von bestimmten
Pflanzenzellen wie von Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und
WO89/05859 , veröffentlicht
am 29. Juni 1989, beschrieben verwendet. Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände kann
das Calciumphosphatpräzipitationsverfahren
von Graham und Van der Eb, Virology 52, 456–457 (1978), verwendet werden.
Allgemeine Aspekte der Säugetierwirtszelltransformationen
sind in
US-Patent Nr. 4.399.216 beschrieben
worden. Transformationen in Hefe werden typischerweise gemäß dem Verfahren
von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et
al., Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 76, 3829 (1979), durchgeführt. Jedoch können auch
andere Verfahren zur Einführung
von DNA in Zellen, wie z. B. nukleare Mikroinjektion, Elektroporation,
bakterielle Protoplastenfusion mit intakten Zellen oder Polykationen,
z. B. Polybren, Poylornithin, verwendet werden. Für verschiedene
Verfahren zur Transformation von Säugetierzellen siehe Keown et
al., Methods in Enzymology 185, 527–537 (1990), und Mansour et
al., Nature 336, 348–352
(1988).
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Geeignete
Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren von DNA in den hierin
beschriebenen Vektoren umfassen Prokaryoten, Hefe oder höhere Eukaryotenzellen.
Geeignete Prokaryoten umfassen unter anderem Eubakterium, wie z.
B. gramnegati ve oder grampositive Organismen, z. B. Enterobacteriaceae,
wie z. B. E. coli. Verschiedene E.-coli-Stämme sind öffentlich verfügbar, wie
z. B. E.-coli-K12-Stamm MM294 (ATCC 31.446), E. coli X1776 (ATCC
31.537), E.-coli-Stamm W3110 (ATCC 27.325) und K5 772 (ATCC 53.635).
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Zusätzlich zu
Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben, wie z. B. Fadenpilze oder
Hefe, geeignete Klonierungs- oder Expressionswirte für die für PRO362
kodierenden Vektoren. Saccharomyces cerevisiae ist ein häufig verwendeter
niedriger eukaryotischer Wirtsorganismus.
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Geeignete
Wirtszellen für
die Expression von glykosyliertem PRO362 stammen von multizellulären Organismen.
Beispiele für
Invertebratenzellen umfassen Insektenzellen, wie z. B. Drosophila
S12 und Spodoptera Sf9, sowie Pflanzenzellen. Beispiele für geeignete
Säugetierwirtszelllinien
umfassen Chinahamster-Eierstockzellen (CHO) und COS-Zellen. Spezifischere
Beispiele umfassen Affennieren-CV1-Linie, transformiert mit SV40
(COS-7, ATCC CRL 1651), menschliche embryonale Nierenlinie (293-
oder 293-Zellen, die für Wachstum
in Suspensionskultur subkloniert wurden, Graham et al., J. Gen.
Virol. 36, 59 (1977)), Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO,
Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980));
Maussertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)),
menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75), menschliche Leberzellen
(Hep G2, HB 8065) und Mausmammatumoren (MMT 060562, ATCC CCL51).
Es wird davon ausgegangen, dass die Auswahl der geeigneten Wirtszelle
innerhalb des Fachgebiets liegt.
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c. Auswahl und Verwendung eines replizierbaren
Vektors
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Die
Nucleinsäure
(z. B. cDNA oder genomische DNA), die für PRO362 kodiert, kann in einen
replizierbaren Vektor zum Klonieren (Amplifikation der DNA) oder
zur Expression insertiert werden. Verschiedene Vektoren sind öffentlich
erhältlich.
Der Vektor kann z. B. in Form eines Plasmids, Cosmids, Virusteilchens
oder Phagen vorliegen. Die geeignete Nucleinsäuresequenz kann mithilfe einer
Reihe von Verfahren in den Vektor insertiert werden. Im Allgemeinen
wird DNA unter Verwendung von fach bekannten Verfahren in (eine)
geeignete Restriktionsendonucleasestelle(n) eingeführt. Vektorkomponenten
umfassen im Allgemeinen unter anderem eine oder mehrere von einer
Signalsequenz, einem Replikationsstartpunkt, einem oder mehreren
Markergenen, einem Enhancerelement, einem Promotor und einer Transkriptionsterminationssequenz.
Herstellung geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere dieser Komponenten
enthalten, verwendet Standardligationsverfahren, die dem Fachmann
bekannt sind.
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Das
PRO301, PRO362 oder PRO245 kann rekombinant nicht nur direkt, sondern
auch als Fusionspolypeptid mit einem heterologen Polypeptid, das
eine Signalsequenz oder ein anderes Polypeptid mit einer spezifischen
Spaltstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids sein
kann, hergestellt werden. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz
eine Komponente des Vektors sein oder Teil der PRO362-DNA, die in den Vektor
insertiert ist. Die Signalsequenz kann eine prokaryotische Signalsequenz
sein, die z. B. aus der Gruppe von alkalischer Phosphatase, Penicilinase,
Ipp oder hitzestabilen Enterotoxin-II-Leadern ausgewählt ist.
Zur Hefesekretion kann die Signalsequenz z. B. der Hefeinvertaseleader,
Alphafaktorleader (einschließlich
Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktorleader,
Letzterer ist in
US-Patent Nr.
5.010.182 beschrieben) oder saure-Phosphataseleader, der
C.-Albicans-Glucoamylaseleader
(
EP 362.179 , veröffentlicht
am 4. April 1990) oder das in
WO
90/13646 , veröffentlicht
am 15. November 1990, beschriebene Signal sein. Bei der Säugetierzellexpression
können
die Säugetiersignalsequenzen
dazu verwendet werden, die Sekretion des Proteins zu steuern, wie
z. B. Signalsequenzen aus sekretierten Polypeptiden derselben oder
verwandter Spezies, wie auch virale sekretorische Leader.
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Sowohl
die Expressions- als auch Klonierungsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz,
die dem Vektor ermöglicht,
sich in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren.
Solche Sequenzen sind für
eine Vielzahl von Bakterien, Hefe und Viren bekannt. Der Replikationsstartpunkt
aus dem Plasmid pBR322 ist für
die meisten gramnegativen Bakterien geeignet, der 2μ-Plasmidursprung
ist für
Hefe geeignet, und verschiedene Virusstartpunkte (SV40, Polyom,
Adenovirus, VVS oder BPV) sind für
Klonierungsvektoren in Säugetierzellen
geeignet.
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Expressions-
und Klonierungsvektoren umfassen typischerweise ein Selektionsgen,
auch selektierbarer Marker genannt. Typische Selektionsgene kodieren
für Proteine,
die (a) Resistenz gegen Antibiotika oder anderen Toxinen, z. B.
Ampicillin, Neomycin, Metotrexat oder Tetracyclin, verleihen, (b)
auxotrophe Defizienzen komplementieren oder (c) kritische Nährstoffe
zur Verfügung
stellen, die aus komplexen Medien nicht verfügbar sind, z. B. das Gen, das
für D-Alaninracemase
für Bacilli
kodiert.
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Ein
Beispiel für
geeignete selektierbare Marker für
Säugetierzellen
sind jene, welche die Identifikation von Zellen ermöglichen,
die in der Lage sind, die PRO362-Nucleinsäure aufzunehmen,
wie z. B. DHFR oder Thymidinkinase. Eine geeignete Wirtszelle, wenn
Wildtyp-DHFR verwendet wird, ist die CHO-Zelllinie, die defizient
an DHFR-Aktivität
ist und wie von Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216
(1980), beschrieben hergestellt und vermehrt wird. Ein geeignetes
Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trp1-Gen, das im Hefeplasmid
YRp7 gegenwärtig
ist [Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979), Kingsman et al.,
Gene 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)]. Das
trp1-Gen stellt einen selektierbaren Marker für einen Mutantstamm von Hefe
bereit, dem die Fähigkeit
fehlt, in Tryptophan zu wachsen, z. B. ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1
[Jones, Genetics 85, 12 (1977)].
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Expressions-
und Klonierungsvektoren enthalten üblicherweise einen Promotor,
der operabel mit der PRO362-Nucleinsäuresequenz verbunden ist, um
mRNA-Synthese zu steuern. Promotoren, die von einer Vielzahl von
potenziellen Wirtszellen erkannt werden, sind bekannt. Promotoren,
die zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignet sind, umfassen
die β-Lactamase-
und Lactosepromotorsysteme [Chang et al., Nature 275, 615 (1987);
Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)], alkalische Phosphatase,
ein Tryptophan-(trp-)Promotorsystem [Goeddel, Nucleic Acids Res.
8, 4057 (1980),
EP 36.776 ]
und Hybridpromotoren, wie z. B. den tac-Promotor [deBoer et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 (1983)]. Promotoren zur
Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten auch eine Shine-Dalgarno-(SD-)Sequenz,
die operabel an DNA gebunden ist, die für PRO362 kodiert.
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Beispiele
für geeignete
Promotingsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren
für 3-Phosphoglyceratkinase
[Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)] oder andere glykolytische Enzyme
[Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland, Biochemistry
17, 4900 (1978)], wie z. B. Enolase, Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase,
Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase,
3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase
und Glucokinase.
-
Andere
Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren sind, die über den
zusätzlichen
Vorteil von durch Wachstumsbedingungen kontrollierter Transkription
verfügen,
sind die Promotorregionen für
Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, Abbauenzyme,
die mit Stickstoffmetabolismus assoziiert sind, Metallothionein,
Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für Maltoseund
Galactoseverwertung nützlich
sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung in Hefeexpression
sind weiters in
EP 73.657 beschrieben.
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PRO362-Transkription
aus Vektoren in Säugetierwirtszellen
wird zum Beispiel durch Promotoren kontrolliert, die aus den Genomen
von Viren, wie z. B. Polyomavirus, Geflügelpockenvirus (
UK 2.211.504 , veröffentlicht am 5. Juli 1989),
Adenovirus (wie z. B. Adenovirus 2), Rinderpapillomavirus, Geflügelsarkomvirus,
Cytomegalievirus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus, und Simian-Virus-40
(SV-40), aus heterologen Säugetierpromotoren,
z. B. dem Actinpromotor oder einem Immunglobulinpromotor, und aus
Hitzeschockpromotoren erhalten werden, vorausgesetzt solche Promotoren
sind mit den Wirtszellsystemen kompatibel.
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Transkription
von DNA, die für
PRO362 kodiert, durch höhere
Eukaryoten, kann durch Insertion einer Enhancersequenz in den Vektor
erhöht
werden. Enhancer sind cis-wirkende Elemente von DNA, für gewöhnlich von
etwa 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor einwirken, um ihre Transkription
zu erhöhen.
Viele Enhancersequen zen sind von Säugetiergenen bekannt (Globin,
Elastase, Albumin, α-Fötoprotein
und Insulin). Typischerweise wird jedoch ein Enhancer aus einem
eukaryotischen Zellvirus verwendet. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer
auf der späten
Seite des Replikationsstartpunkts (bp 100–270), den frühen Promotorehancer von
Cytomegalievirus, den Polyomaenhancer auf der späten Seite des Replikationsstartpunkts
und Adenovirusenhancer. Die Enhancer können in den Vektor an einer
Position 5' oder
3' zur PRO362-Kodiersequenz
gespleißt
werden, befindet sich aber bevorzugt an einer Position 5' vom Promotor.
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Expressionsvektoren,
die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe, Pilzen, Insekten, Pflanzen,
Tieren, Menschen oder kernhaltigen Zellen aus anderen multizellulären Organismen)
verwendet werden, enthalten auch Sequenzen, die zur Termination
von Transkription und zur Stabilisierung von mRNA notwendig sind.
Solche Sequenzen sind üblicherweise
aus den 5'- und
gelegentlich 3'-nicht-translatierten
Regionen von eukaryotischen oder viralen DNAs oder cDNAs erhältlich.
Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte
Fragmente transkribiert werden, im nicht-translatierten Abschnitt der mRNA, die
für PRO362
kodiert.
-
Andere
Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Anpassung an die Synthese
von PRO362 in rekombinanter Vertebratenzellkultur geeignet sind,
sind in Gething et al., Nature 293, 620–625 (1981); Mantei et al.,
Nature 281, 40–46
(1979),
EP 117.060 und
EP 117.058 beschrieben.
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d. Detektion von Genamplifikation/-expression
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Genamplifikation
und/oder -expression kann in einer Probe direkt z. B. durch herkömmliches Southern-Blotting,
Northern-Blotting, um die Transkription von mRNA zu quantifizieren
[Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 77, 5201–5205 (1980)], Dot-Blotting (DNA-Analyse)
oder In-situ-Hybridisierung unter Einsatz einer geeignet markierten
Sonde, basierend auf den hierin bereitgestellten Sequenzen, gemessen
werden. Alternativ dazu können
Antikörper
verwendet werden, die spezifische Duplexe erkennen können, einschließlich DNA-Duplexe,
RNA-Duplexe und DNA-RNA- Hybridduplexe
oder DNA-Proteinduplexe. Die Antikörper können wiederum markiert sein,
und der Test kann ausgeführt
werden, wo der Duplex an eine Oberfläche gebunden ist, sodass nach
Bildung des Duplexes auf der Oberfläche die Gegenwart von Antikörper, der
an den Duplex gebunden ist, detektiert werden kann.
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Genexpression
kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren gemessen werden,
wie z. B. immunhistochemische Färbung
von Zellen oder Gewebeschnitten und Test von Zellkultur oder Körperflüssigkeiten,
um direkt die Expression des Genprodukts zu quantifizieren. Antikörper, die
zur immunhistochemischen Färbung
und/oder zum Test von Fluidproben geeignet sind, können entweder
monoklonal oder polyklonal sein und können in einem beliebigen Säugetier
hergestellt werden. In geeigneter Weise können Antikörper gegen das Nativsequenz-PRO362-Polypeptid
oder gegen ein synthetisches Peptid, basierend auf den hierin bereitgestellten
DNA-Sequenzen, oder
gegen eine exogene Sequenz, fusioniert an PRO362-DNA und für ein spezifisches
Antikörperepitop
kodierend, hergestellt werden.
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e. Reinigung von Polypeptid
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Formen
von PRO362 können
aus dem Kulturmedium oder aus Wirtszelllysaten gewonnen werden. Wenn
sie membrangebunden sind, können
sie aus der Membran unter Einsatz einer geeigneten Detergenslösung (z.
B. Triton-X-100) oder durch enzymatische Spaltung gewonnen werden.
Zellen, die in der Expression von PRO362 verwendet werden, können durch
verschiedene physikalische oder chemische Mittel, wie z. B. Gefrier-Auftau-Zyklus,
Beschallung, mechanische Unterbrechung oder Zelllysemittel, zerstört werden.
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Es
kann wünschenswert
sein, PRO362 aus rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu
reinigen. Die folgenden Verfahren sind exemplarisch für geeignete
Reinigungsverfahren: Fraktionierung auf einer Ionenaustauschsäule, Ethanolpräzipitation,
Umkehrphasen-HPLC, Chromatographie auf Kieselgel oder auf einem
Kationenaustauschharz, wie z. B. DEAE, Chromatofokussierung, SDS-PAGE,
Ammoniumsulfatpräzipitation,
Gelfiltration unter Verwendung von z. B. Sephadex-G-75, Protein-A- Sepharose-Säulen zur
Entfernung von Kontaminanten, wie z. B. IgG, und Metallchelatierungssäulen, um
epitopmarkierte Formen von PRO362 zu binden. Verschiedene Verfahren
zur Proteinreinigung können
verwendet werden, und solche Verfahren sind fachbekannt und zum
Beispiel in Deutscher, Methods in Enzymology 182 (1990), Scopes,
Protein Purification; Principles and Practice, Springer-Verlag,
New York (1982), beschrieben. Der/die ausgewählten Reinigungsschritt(e)
hängen
z. B. vom Wesen des verwendeten Produktionsverfahrens und dem besonderen
produzierten PRO362 ab.
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2. Gewebsverteilung
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Die
Stelle der Gewebe, welche die Polypeptide der Erfindung exprimieren,
kann durch Bestimmung der mRNA-Expression in verschiedenen menschlichen
Geweben bestimmt werden. Der Ort solcher Gene stellt Informationen
darüber
bereit, welche Gewebe am wahrscheinlichsten von den stimulierenden
und hemmenden Aktivitäten
der Polypeptide der Erfindung beeinflusst sind. Der Ort eines Gens
in einem spezifischen Gewebe stellt auch Probengewebe für die aktivitätsblockierenden,
hierin diskutierten Tests bereit.
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Genexpression
in verschiedenen Geweben kann durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting,
um die Transkription von mRNA zu quantifizieren (Thomas, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 77, 5201–5205
(1980)), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung
unter Einsatz einer geeignet markierten Sonde, basierend auf den
hierin bereitgestellten Sequenzen, gemessen werden. Alternativ dazu
können
Antikörper
verwendet werden, die spezifische Duplexe erkennen, einschließlich DNA-Duplexe,
RNA-Duplexe und DNA-RNA-Hybridduplexe oder DNA-Protein-Duplexe.
-
Genexpression
in verschiedenen Geweben kann alternativ dazu durch immunologische
Verfahren, wie z. B. immunhistochemische Färbung von Gewebssektionen,
und Test von Zellkultur oder Körperfluiden
gemessen werden, um direkt die Expression von Genprodukt zu quantifizieren.
Antikörper,
die zur immunhistochemischen Fär bung
und/oder zum Testen von Fluidproben geeignet sind, können entweder
monoklonal oder polyklonal sein und können in einem Säugetier
hergestellt werden. Geeigneterweise können die Antikörper gegen eine
native Sequenz eines Polypeptids der Erfindung oder gegen ein synthetisches
Peptid basierend auf den DNA-Sequenzen,
die für
das Polypeptid der Erfindung kodieren, oder gegen eine exogene Sequenz,
die an eine DNA fusioniert ist, die für ein Polypeptid der Erfindung
kodiert und für
ein spezifisches Antikörperepitop kodiert,
hergestellt werden. Allgemeine Verfahren zur Erzeugung von Antikörpern und
spezielle Protokolle für Northern-Blotting
und In-situ-Hybridisierung sind nachstehend bereitgestellt.
-
3. Antikörperbindungsstudien
-
Die
Aktivität
der Polypeptide der Erfindung kann weiters durch Antikörperbindungsstudien
verifiziert werden, in welchen die Fähigkeit von Anti-PRO362-Antikörpern, die
Wirkung von PRO362-Polypeptiden auf Gewebszellen zu hemmen, getestet
wird. Exemplarische Antikörper
umfassen polyklonale, monoklonale, humanisierte, bispezifische und
Heterokonjugatantikörper,
deren Herstellung hierin nachstehend beschrieben ist.
-
Antikörperbindungsstudien
können
in einem beliebigen Testverfahren durchgeführt werden, wie z. B. kompetitive
Bindungstests, direkte und indirekte Sandwichtests und Immunpräzipitationstests.
Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, 147–158, CRC
Press, Inc. (1987).
-
Kompetitive
Bindungstests basieren auf der Fähigkeit
eines markierten Standards, mit dem Testprobenanalyt um die Bindung
mit einer begrenzten Menge von Antikörper zu konkurrieren. Die Menge
von Targetprotein in der Testprobe ist umgekehrt proportional zur
Menge des Standards, der an die Antikörper gebunden wird. Um die
Bestimmung der Menge des Standards zu erleichtern, der gebunden
wird, werden die Antikörper vor
oder nach der Konkurrenz vorzugsweise unlöslich gemacht, sodass der Standard
und Analyt, die an die Antikörper
gebunden sind, in geeigneter Weise von dem Standard und Analyt getrennt
werden können,
die ungebunden bleiben.
-
Sandwichtests
umfassen die Verwendung von zwei Antikörpern, wobei jeder in der Lage
ist, sich an ein(en) anderen/s immunogenen/s Abschnitt oder Epitop
des zu detektierenden Proteins zu binden. In einem Sandwichtest
wird der Testprobenanalyt durch einen ersten Antikörper gebunden,
der auf einem festen Träger immobilisiert
ist, und danach bindet sich ein zweiter Antikörper an den Analyt, wodurch
ein unlöslicher
dreiteiliger Komplex gebildet wird. Siehe z. B.
US-Patent Nr. 4.376.110 . Der zweite
Antikörper
kann selbst mit einer detektierbaren Gruppierung markiert werden
(direkter Sandwichtest) oder kann unter Einsatz eines Anti-Immunglobulinantikörpers gebunden
werden, der mit einer detektierbaren Gruppierung markiert ist (indirekter Sandwichtest).
Zum Beispiel ist eine Form von Sandwichtests ein ELISA-Test, in
welchem die detektierbare Gruppierung ein Enzym ist.
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Zur
Immunhistochemie kann die Gewebsprobe frisch oder gefroren oder
in Paraffin eingebettet sein und mit einem Konservierungsmittel
wie z. B. Formalin fixiert sein.
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4. Auf Zellen basierende Tests
-
Auf
Zellen basierende Tests und Tiermodelle für immunassoziierte Erkrankungen
können
verwendet werden, um die Beziehung zwischen den Genen und Polypeptiden,
die hierin identifiziert werden, und die Entwicklung und Pathogenese
von immunassoziierten Erkrankungen besser zu verstehen.
-
In
einem anderen Ansatz werden Zellen eines Zelltyps, von dem bekannt
ist, dass er in eine bestimmte immunassoziierte Erkrankung involviert
ist, mit den hierin beschriebenen cDNAs transfiziert, und es wird
die Fähigkeit
dieser cDNAs analysiert, Immunfunktion zu stimulieren oder zu hemmen.
Geeignete Zellen können mit
dem gewünschten
Gen transfiziert werden und werden auf Immunfunktionsaktivität beobachtet.
Derartige transfizierte Zelllinien können dann verwendet werden,
um die Fähigkeit
von poly- oder monoklonalen Antikörpern oder Antikörperzusammensetzun gen
zu testen, Immunfunktion zu hemmen oder zu stimulieren, z. B. um die
T-Zellproliferation
oder Infiltration in die entzündete
Zelle zu modulieren. Mit den kodierenden Sequenzen der hierin identifizierten
Gene transfizierte Zellen können
weiter verwendet werden, um Medikament-Kandidaten für die Behandlung
von immunassoziierten Erkrankungen zu identifizieren.
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Außerdem können Primärkulturen,
die aus transgenen Tieren stammen (wie unten beschrieben), in den
auf Zellen basierenden Tests hierin verwendet werden, obgleich stabile
Zelllinien bevorzugt sind. Techniken zur Herleitung kontinuierlicher
Zelllinien aus transgenen Tieren sind auf dem Gebiet der Erfindung
wohlbekannt (siehe z. B. Small et al., Mol. Cell. Biol. 5, 642–648 (1985)).
-
Ein
geeigneter, auf Zellen basierender Test ist die gemischte Lymphozytenreaktion
(MLR). Current Protocols in Immunology, Kapitel 3.12, herausgegeben
von J.E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Marglies, E. M. Shevach,
W. Strober, National Institutes of Health, veröffentlicht von John Wiley & Sons, Inc. In
diesem Test wird die Fähigkeit
einer Testverbindung, die Proliferation von aktivierten T-Zellen
zu stimulieren, getestet. Eine Suspension von Responder-T-Zellen
wird mit allogenen Stimulatorzellen getestet, und die Proliferation
von T-Zellen wird durch die Aufnahme von tritiiertem Thymidin gemessen.
Dieser Test ist eine allgemeine Messung der T-Zellreaktitivität. Da die Mehrheit von T-Zellen
auf IL-2 reagiert und nach Aktivierung IL-2 produziert, reflektieren
Unterschiede der Reaktion in diesem Test teilweise die Unterschiede
bei der IL-2-Produktion durch die entsprechenden Zellen. Die MLR-Ergebnisse können durch
Standard-Lymphokin (IL-2-) Detektionstest verifiziert werden. Current
Protocols in Immunology, siehe oben, 3.15, 6.3.
-
Eine
proliferative T-Zellantwort in einem MLR-Test kann auf eine mitogene
Antwort oder eine Stimulationsantwort der T-Zellen zurückzuführen sein.
Zusätzliche
Verifikation der T-Zellstimulationsaktivität der Polypeptide der Erfindung
kann durch einen Co-Stimulationstest erhalten werden. T-Zellaktivierung
erfordert ein antigenspezifisches Signal, das durch den Haupthistokompatibilitätskomplex
(MHC) und ein costimulierendes Signal vermittelt wird, das durch
eine zweite Ligandenbindungswech seiwirkung vermittelt wird, wie
z. B. die B7(CD80, CD86)/CD28-Bindungswechselwirkung. CD28-Vernetzung
erhöht
die Lymphokinsekretion durch aktivierte T-Zellen. T-Zellaktivierung
weist durch die Bindung von Liganden, die eine negative oder positive
Wirkung haben, sowohl negative als auch positive Kontrollen auf.
CD28 und CTLA-4 sind verwandte Glykoproteine in der Ig-Überfamilie,
die sich an B7 binden. CD28-Bindung an B7 hat eine positive costimulierende
Wirkung von T-Zellaktivierung; hingegen weist die CTLA-4-Bindung
an B7 eine negative T-zelldeaktivierende Wirkung auf. C.A. Chambers
und J.P. Allison, Curr. Opin. Immunol. 9, 396 (1997), R.H. Schwartz,
Cell 71, 1065 (1992), P.S. Linsey und J.A. Ledbetter, Annu. Rev.
Immunol 11, 191 (1993), C.H. June et al., Immunol. Today 15, 321
(1994), M. K. Jenkins, Immunity 1, 405 (1994). In einem Costimulationstest
werden die Polypeptide der Erfindung auf T-Zellcostimulations- oder
-Hemmaktivität
getestet.
-
Polypeptide
der Erfindung sowie andere Verbindungen der Erfindung, die Stimulatoren
(Costimulatoren) von T-Zellproliferation sind, wie z. B. durch MLR
und Costimulationstest bestimmt, sind zur Behandlung von immunassoziierten
Erkrankungen nützlich,
die durch schlechte, suboptimale oder inadäquate Immunfunktion charakterisiert
sind. Diese Erkrankungen werden durch Stimulation der Proliferation
und Aktivierung von T-Zellen (und T-zellvermittelter Immunität) und durch
die Verstärkung
der Immunantwort in einem Säugetier durch
Verabreichung einer stimulierenden Verbindung, wie z. B. den stimulierenden
Polypeptiden der Erfindung, behandelt. Das stimulierende Polypeptid
kann ein PRO362-Polypeptid oder ein Agonistenantikörper dafür sein.
Immunadjuvanstherapie zur Behandlung von Tumoren, die nachstehend
detailliert beschrieben ist, ist ein Beispiel für diese Verwendung der stimulierenden
Verbindungen der Erfindung. Antikörper, die sich an Hemmpolypeptide
binden, wirken, um die Immunantwort zu verstärken, indem die Hemmwirkung
der hemmenden Polypeptide entfernt wird. Diese Wirkung ist in Versuchen
zu sehen, die Anti-CTLA-4-Antikörper verwenden,
die T-Zellproliferation verstärken,
vermutlich durch Entfernung des Hemmsignals, das durch CTLA-4-Bindung
verursacht ist. T.L. Walunas et al., Immunity 1, 405 (1994). Diese
Verwendung wird auch in Versuchen mit 4-1BB-Glykoprotein, einem Mitglied der Tumornekrosefaktorrezeptorfamilie,
das sich an einen Liganden (4-1BBL) bindet, der auf geprimten T-Zellen
exprimiert wird, und T- Zellaktivierung
und -Wachstum signalisiert, bestätigt.
M.E. Alderson et al., J. Immunol. 24, 2219 (1994). Hemmung von 4-1BB-Bindung
durch Behandlung mit einem Anti-4-1BB-Antikörper erhöht die Schwere der Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung
und kann verwendet werden, um Tumoren auszulöschen. I. Hellstrom und K.E.
Hellstrom, Crit. Rev. Immunol. 18, 1 (1998).
-
Andererseits
können
Polypeptide der Erfindung sowie andere Verbindungen der Erfindung,
die Inhibitoren von T-Zellproliferation/-aktivierung und/oder Lymphokinsekretion
sind, direkt dazu verwendet werden, die Immunantwort zu unterdrücken. Diese
Verbindungen sind dazu nützlich,
den Grad der Immunantwort zu reduzieren und immunassoziierte Erkrankungen
zu behandeln, die durch hyperaktive, superoptimale oder Autoimmunantwort
charakterisiert sind. Alternativ dazu können Antikörper, die sich an die stimulierenden
Polypeptide der Erfindung binden und die stimulierende Wirkung dieser
Moleküle
blockieren, dazu verwendet werden, die T-zellvermittelte Immunantwort
durch Hemmung der T-Zellproliferation/-aktivierung und/oder Lymphokinsekretion
zu unterdrücken.
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5. Tiermodelle
-
Die
Ergebnisse der auf Zellen basierenden In-vitro-Tests können weiter
unter Einsatz von In-vivo-Tiermodellen und Tests auf T-Zellfunktion
untersucht werden. Es kann eine Vielzahl wohlbekannter Tiermodelle verwendet
werden, um die Rolle der hierin identifizierten Gene bei der Entwicklung
und Pathogenese von immunassoziierten Erkrankungen besser zu verstehen
und die Wirksamkeit von therapeutischen Kandidatenmitteln, einschließlich Antikörpern und
anderen Antagonisten der nativen Polypeptide, einschließlich kleiner
Antagonisten-Moleküle,
zu testen. Der In-vivo-Charakter
derartiger Modelle macht diese besonders prognostisch für Antworten
in menschlichen Patienten. Tiermodelle von immunassoziierten Erkrankungen
umfassen nicht-rekombinante sowie rekombinante (transgene) Tiere.
Nicht-rekombinante Tiermodelle umfassen beispielsweise Nager-, z.
B. Mausmodelle. Derartige Modelle können durch Einführen von
Zellen in syngenetische Mäuse
unter Verwendung von Standardverfahren, z. B. subkutane Injektion,
Schwanzveneninjektion, Milzimplantati on, intraperitoneale Implantation,
Implantation unter die Nierenkapsel etc., erzeugt werden.
-
Kontakthypersensibilität ist ein
einfacher In-vivo-Test von zellvermittelter Immunfunktion. In diesem Verfahren
werden epidermale Zellen gegenüber
exogenen Haptenen exponiert, die eine Überempfindlichkeitsreaktion
verspäteter
Art entstehen lassen, die gemessen und quantifiziert wird. Kontaktsensibilität umfasst
eine anfängliche
Sensibilisierungsphase gefolgt von einer Auslösungsphase. Die Auslösungsphase
tritt ein, wenn epidermale Zellen auf ein Antigen treffen, mit welchem
sie zuvor Kontakt hatten. Schwellung und Entzündung treten ein, wobei dies
ein exzellentes Modell für
menschliche allergische Kontaktdermatitis ist. Ein geeignetes Verfahren
ist in Current Protocols in Immunology, Hrsg. J.E. Cologan, A.M.
Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach und W. Strober, John Wiley & Sons Inc., Kapitel
4.2 (1994), beschrieben. Siehe auch S. Grabbe und T. Schwarz, Immun.
Today 19 (1), 37–44
(1998).
-
Eine
Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung tritt ein, wenn immunkompetente
Zellen in immunsupprimierte oder tolerante Patienten transplantiert
werden. Die Spenderzellen erkennen und reagieren auf Wirtsantigene.
Die Antwort kann von lebensbedrohlicher schwerer Entzündung bis
hin zu schwachen Fällen
von Durchfall und Gewichtsverlust führen. Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankungsmodelle
stellen ein Mittel zur Beurteilung der T-Zellreaktivität gegen
MHC-Antigen und Transplantat-Nebenantigene bereit. Ein geeignetes
Verfahren ist in Current Protocols in Immunology, siehe oben, Kapitel
4.3, beschrieben.
-
Ein
Tiermodell für
Hautallotransplantatabstoßung
ist ein Mittel zum Testen der Fähigkeit
von T-Zellen, In-vivo-Gewebszerstörung zu vermitteln, das deren
Rolle in antiviraler und Tumorimmunität anzeigt und ein Maß dieser
Rolle ist. Die häufigsten
und am meisten akzeptierten Modelle verwenden Mausschwanzhauttransplantate.
Wiederholte Versuche haben gezeigt, dass Hautallotransplantatabstoßung durch
T-Zellen, Helfer-T-Zellen,
und Killer-Effektor-T-Zellen vermittelt wird und nicht durch Antikörper. H.
Auchincloss jr. und D.H. Sachs, Fundamental Immunology, 2. Auflage,
W.E. Paul, Hrsg., Raven Press, New York, 889–992 (1989). Ein geeignetes
Verfah ren ist in Current Protocols in Immunology, siehe oben, Kapitel
4.4., detailliert beschrieben. Andere Transplantatabstoßungsmodelle,
die verwendet werden können,
um die Verbindungen der Erfindung zu testen, sind die allogenen
Herztransplantatmodelle, die von M. Tanabe et al., Transplantation
58, 23 (1994), und S.A. Tinubu et al., J. Immunol., 4330–4338 (1994),
beschrieben sind.
-
Tiermodelle
für Hypersensibilität der verspäteten Art
stellen ebenfalls einen Test der zellvermittelten Immunfunktion
bereit. Hyperempfindlichkeitsreaktionen verspäteter Art sind eine T-zellvermittelte
In-vivo-Immunantwort, die durch Entzündung charakterisiert ist,
die keinen Höhepunkt
erreicht, bis ein gewisser Zeitraum nach Provokation mit einem Antigen
vergangen ist. Diese Reaktionen treten auch bei gewebsspezifischen
Autoimmunerkrankungen, wie z. B. Multipler Sklerose (MS) und experimenteller
Autoimmunenzephalomyelitis (EEA, ein Modell für MS), auf. Ein geeignetes
Verfahren ist in Current Protocols in Immunology, oben, Kapitel 4.5,
detaillierter beschrieben.
-
EAE
ist eine T-zellvermittelte Autoimmunerkrankung, die durch T-Zell-
und mononukleare Zellentzündung
und nachfolgende Demyelinisierung von Axonen im zentralen Nervensystem
charakterisiert ist. EAE soll im Allgemeinen ein relevantes Tiermodell
für MS
beim Menschen sein. C. Bolton, Multiple Sclerosis 1, 143 (1995).
Sowohl akute als auch rückfallverhindernde
Modelle sind entwickelt worden. Die Verbindungen der Erfindung können auf
T-zellstimulierende oder -Hemmaktivität gegen immunvermittelte Entmarkungserkrankung unter
Einsatz des in Current Protocols in Immunology, siehe oben, Kapitel
15.1 und 15.2, beschriebenen Arbeitsverfahrens getestet werden.
Siehe auch die Modelle für
Myelinerkrankung, bei welchen Oligodendrozyten der Schwann-Zellen
in das zentrale Nervensystem transplantiert werden, wie in I.D.
Duncan et al., Molec. Med. Today, 554–561 (1997), beschrieben.
-
Ein
Tiermodell für
Arthritis ist kollageninduzierte Arthritis. Dieses Modell stellt
klinische histologische oder immunologische Eigenschaften von menschlicher
autoimmuner rheumatoider Arthritis bereit und ist ein annehmbares
Modell für
menschliche Autoimmunarthritis. Maus- und Rattenmodelle sind durch
Synovitis, Knorpelerosion und subchondralem Knochen charakterisiert.
Die Verbindungen der Erfindung können
auf Aktivität
gegen Autoimmunarthritis unter Einsatz der in Current Protocols
in Immunology, oben, Kap. 15.5, beschriebenen Arbeitsvorschriften
getestet werden. Siehe auch das Modell, das einen monoklonalen Antikörper gegen
CD18- und VLA-4-Integrine
verwendet, wie in A.C. Issekutz et al., Immunology 88, 569 (1996),
beschrieben.
-
Ein
Asthmamodell ist beschrieben worden, in welchem antigeninduzierte
Atemweghyperreaktivität, Lungeneosinophilie
und Entzündung
durch Sensibilisierung eines Tiers mit Ovalbumin induziert wird
und dann das Tier mit demselben Protein provoziert wird, das durch
Aerosol geliefert wird. Verschiedene Tiermodelle (Meerschweinchen,
Ratte, nichtmenschlicher Primat) zeigten ähnliche Symptome zu atopischem
Asthma bei Menschen nach Provokation mit Aerosolantigenen. Murine
Modelle haben viele der Eigenschaften von menschlichem Asthma. Geeignete
Verfahren zum Testen der Verbindungen der Erfindung auf Aktivität und Wirksamkeit
in der Behandlung von Asthma sind von W.W. Wolyniec et al., Am J.
Respir. Cell. Mol. Biol. 18, 777 (1998), und den hierin zitierten
Referenzen beschrieben.
-
Zusätzlich dazu
können
die Verbindungen der Erfindung bei Tiermodellen für Psoriasis-ähnliche
Erkrankungen getestet werden. Beweise lassen eine T-Zellpathogenese
für Psoriasis
vermuten. Die Verbindungen der Erfindung können im scid/scid-Mausmodell, das von
M.P. Schon et al., Nat. Med. 3, 183 (1997), beschrieben wurde, in
welchem die Mäuse
histopathologische Hautläsionen
zeigen, die Psoriasis ähneln,
getestet werden. Ein anderes geeignetes Modell ist die menschliche
Haut-/scid-Mauschimäre, die
wie von B.J. Nickoloff et al., Am. J. Path. 146, 580 (1995), beschrieben
hergestellt worden ist.
-
Rekombinante
(transgene) Tiermodelle können
durch Einführung
des kodierenden Abschnitts der hierin identifizierten Gene in das
Genom des Tiers von Interesse unter Einsatz von Standardverfahren
zur Produktion von transgenen Tieren erzeugt werden Tiere, die als
Target für
transgene Manipulation dienen, umfassen unter anderem Mäuse, Ratten,
Kaninchen, Meerschweinchen, Schafe, Ziegen, Schweine und nicht-menschliche
Primaten, z. B. Paviane, Schimpansen und Affen. Fachbekannte Verfahren
zur Einführung eines
Transgens in solche Tiere umfassen Mikroinjektion in den Pronukleus
(Hoppe und Wanger,
US-Patent Nr.
4.873.191 ), retrovirusvermittelten Gentransfer in Keimlinien
(z. B. Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148–615 (1985)),
Gentargeting in embryonalen Stammzellen (Thompson et al., Cell 56, 313–321 (1989)),
Elektroporation von Embryos (Lo, Mol. Cell Biol. 3, 1803–1814 (1983)),
spermavermittelten Gentransfer (Lavitrano et al., Cell 57, 717–73 (1989)).
Für einen Überblicksartikel
siehe z. B.
US-Patent Nr. 4.736.866 .
-
Für den Zweck
der vorliegenden Erfindung umfassen transgene Tiere jene, die das
Transgen nur in einem Teil ihrer Zellen tragen („Mosaiktier"). Das Transgen kann
entweder als einzelnes Transgen oder in Concatemeren, z. B. Kopf-zu-Kopf-
oder Kopf-zu-Schwanz-Tandems,
integriert werden. Selektive Einführung eins Transgens in einen
besonderen Zelltyp ist auch durch Folgendes möglich, zum Beispiel das Verfahren
von Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 623–636 (1992).
-
Die
Expression des Transgens in transgenen Tieren kann durch Standardverfahren überwacht
werden. Zum Beispiel kann Southern-Blot-Analyse oder PCR-Amplifikation
verwendet werden, um die Integration des Transgens zu verifizieren.
Der Grad der mRNA-Expression kann dann unter Einsatz von Verfahren,
wie z. B. In-situ-Hybridisierung,
Northern-Blot-Analyse, PCR oder Immunzytochemie, analysiert werden.
-
Die
Tiere können
weiter auf Zeichen für
Immunerkrankungspathologie untersucht werden, zum Beispiel durch
histologische Untersuchung, um die Infiltration von Immunzellen
in spezifische Gewebe zu bestimmen. Blockierungsversuche können ebenfalls
durchgeführt
werden, in welchen die transgenen Tiere mit den Verbindungen der
Erfindung behandelt werden, um das Ausmaß der T-Zellproliferationsstimulation
oder -inhibition der Verbindungen zu bestimmen. In diesen Versuchen
werden blockierende Antikörper,
die sich an das Polypeptid der Erfindung binden, die wie nachstehend
beschrieben hergestellt wurden, an das Tier verabreicht, und die
Wirkung auf Immunfunktion wird bestimmt.
-
Alternativ
dazu können „Knock-out"-Tiere hergestellt
werden, die ein defektes oder geändertes
Gen besitzen, das für
ein hierin identifiziertes Polypeptid kodiert, als Folge einer homologen
Rekombination zwischen dem endogenen Gen, das für das Polypeptid kodiert, und
geänderter
genomischer DNA, die für
dasselbe Polypeptid kodiert, das in eine embryonale Zelle des Tiers
eingeführt
wird. Zum Beispiel kann cDNA, die für ein bestimmtes Polypeptid
kodiert, verwendet werden, um genomische DNA, die für dieses
Polypeptid kodiert, gemäß etablierter
Verfahren zu klonieren. Ein Abschnitt der genomischen DNA, die für ein besonderes
Polypeptid kodiert, kann deletiert oder durch ein anderes Gen ersetzt
werden, wie z. B. ein Gen, das für
einen selektierbaren Marker kodiert, der dazu verwendet werden kann,
Integration zu überwachen.
Typischerweise sind mehrere Kilobasen von nicht-geänderter
flankierender DNA (sowohl an den 5'- als auch 3'-Enden) im Vektor enthalten (siehe z.
B. Thomas und Capecchi, Cell 51, 503 (1987), für eine Beschreibung von homologen Rekombinationsvektoren].
Der Vektor wird in eine embryonale Stammzellenlinie (z. B. durch
Elektroporation) eingeführt,
und Zellen, in welchen sich die eingeführte DNA homolog mit der endogenen
DNA rekombiniert hat, werden ausgewählt [siehe z. B. Li et al.,
Cell 69, 915 (1992)]. Die ausgewählten
Gene werden dann in eine Blastozyste eines Tiers (z. B. eine Maus
oder Ratte) eingeführt,
um Aggregationschimären
zu bilden [siehe z. B. Bradley, in Teratocarcinomas und Embryonic
Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, Hrsg., IRL Oxford,
113–152
(1987)). Ein chimärer
Embryo kann dann in ein geeignetes scheinschwangeres weibliches Pflegetier
implantiert werden und der Embryo ausgetragen werden, um ein „Knock-out"-Tier zu schaffen.
Nachkommen, welche die homolog rekombinierte DNA in ihren Keimzellen
beherbergen, können
durch Standardverfahren identifiziert werden und dazu verwendet
werden, Tiere zu züchten,
in welchen alle Zellen des Tiers die homolog rekombinierte DNA beinhalten.
Knockout-Tiere können
zum Beispiel aufgrund ihrer Fähigkeit
charakterisiert sein, sich gegen bestimmte pathologische Leiden
und ihre Entwicklung von pathologischen Leiden aufgrund des Fehlens
des Polypeptids zu verteidigen.
-
6. Immunadjuvanstherapie
-
In
einer Ausführungsform
können
Verbindungen der Erfindung, die eine immunstimulierende Wirkung zeigen,
in Immunadjuvanstherapie zur Behandlung von Tumoren (Krebs) verwendet
werden. Es versteht sich nun, dass T-Zellen menschliches tumorspezifisches
Antigen erkennen. Eine Gruppe von Tumorantigenen, für welche
MAGE, BAGE und GAGE-Genfamilien kodieren, sind in allen normalen
erwachsenen Geweben stumm, aber werden in Tumoren in signifikanten
Mengen exprimiert, wie z. B. in Melanomen, Lungentumoren, Tumoren
im Kopf- und Nackenbereich und Blasenkarzinomen. C. Desmet et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 7149 (1996). Es ist gezeigt worden,
dass die Costimulierung von T-Zellen Tumorregression und eine Antitumorantwort
sowohl in vitro als auch in vivo induziert. I. Melero et al., Nature
Medicine 3, 682 (1997), E.D. Kwon et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 94, 8099 (1997), D.H. Lynch et al., Nature Medicine 3, 625 (1997),
O.J. Finn und M.T. Lotze, J. Immunol. 21, 114 (1998). Die stimulierenden
Verbindungen der Erfindung können
als Adjuvanzien alleine oder gemeinsam mit einem wachstumsregulierenden
Mittel, zytotoxischen Mittel oder chemotherapeutischen Mittel verabreicht
werden, um T-Zellproliferation/-aktivierung
und eine Antitumorantwort auf Tumorantigene zu stimulieren. Das
wachstumsregulierende zytotoxische oder chemotherapeutische Mittel wird
in herkömmlichen
Mengen unter Einsatz bekannter Verabreichungspläne verabreicht. Immunstimulierende
Aktivität
durch die Verbindungen der Erfindung ermöglicht reduzierte Mengen von
wachstumsregulierenden, zytotoxischen oder chemotherapeutischen
Mitteln, wodurch die Toxizität
für den
Patienten potenziell verringert wird.
-
Krebs
ist durch den Anstieg der Zahl von abnormen oder neoplastischen
Zellen, die von einem normalen Gewebe abstammen und proliferieren,
um eine Tumormasse zu bilden, die Invasion der angrenzenden Gewebe
durch diese neoplastischen Tumorzellen und die Erzeugung von malignen
Zellen charakterisiert, die sich letztendlich über das Blut- oder lymphatische
System bis hin zu den regionalen Lymphknoten und in entfernte Stellen
(Metastasen) erstrecken. In einem kanzerösen Zustand proliferiert eine
Zelle unter Bedingungen, unter welchen normale Zellen nicht wachsen würden. Krebs
manifestiert sich in einer Vielzahl von Formen, die durch verschiedene
Grade von Invasivität
und Aggressivität
charakterisiert sind.
-
Änderung
der Genexpression ist eng mit dem unkontrollierten Zellwachstum
und der Dedifferenzierung verbunden, die eine häufige Eigenschaft aller Krebsformen
ist. Es hat sich gezeigt, dass die Genome bestimmter gut studierter
Tumoren verringerte Expression rezessiver Gene, die für gewöhnlich als
Tumorsuppressionsgene bezeichnet werden, die normalerweise wirken,
um malignes Zellwachstum zu vermeiden, und/oder Überexpression bestimmter dominanter
Gene, wie z. B. Onkogene, die wirken, um malignes Wachstum zu fördern, zeigen.
Jede dieser Genänderungen
scheint für
den Import einiger Merkmale verantwortlich zu sein, die zusammen
einen vollständigen
neoplastischen Phänotyp
repräsentieren
(Hunter, Cell 64, 1129 (1991), Bishop, Cell 64, 235–248 (1991)).
-
Ein
bekannter Mechanismus von Gen-(z. B. Onkogen-)Überexpression in Krebszellen
ist die Genamplifikation. Dies ist ein Verfahren, wo im Chromosom
der Stammzelle multiple Kopien eines besonderen Gens produziert
werden. Der Prozess umfasst die außerplanmäßige Replikation der Region
des Chromosoms, welches das Gen umfasst, gefolgt von Rekombination
der replizierten Segmente zurück
in das Chromosom (Alitalo et al., Adv. Cancer Res. 47, 235–281 (1986)).
Es wird davon ausgegangen, dass die Überexpression des Gens Genamplifikation
parallelisiert, d. h. zur Zahl der hergestellten Kopien proportional
ist.
-
Es
ist festgestellt worden, dass Proto-Onkogene, die für Wachstumsfaktoren
und Wachstumsfaktorrezeptoren kodieren, wichtige Rollen in der Pathogenese
verschiedener menschlicher Malignitäten spielen, einschließlich Brustkrebs.
Zum Beispiel ist herausgefunden worden, dass das menschliche ErbB2-Gen
(erbB2, auch bekannt als her2 oder c-erbB-2), das für einen
185-kd-Transmembranglykoproteinrezeptor kodiert (p185Her2,
Her2), verwandt mit dem Epidermiswachstumsfaktorrezeptor (EGFR),
in etwa 25% bis 30% des menschlichen Brustkrebs überexprimiert wird (Slamon
et al., Science 235, 177–182
(1987), Slamon et al., Science 244, 707–712 (1989)).
-
Es
ist berichtet worden, dass Genamplifikation eines Protoonkogens
ein Ereignis ist, das typischerweise in die maligneren Formen von
Krebs involviert ist und als Anzeichen für das klinische Ergebnis wirken
kann (Schwab et al., Genes Chromosomes Cancer 1, 181–193 (1990),
Alitalo et al., siehe oben). Daher wird die erbB2-Überexpression
für gewöhnlich als
Anzeichen für
eine schlechte Prognose angesehen, besonders bei Patienten mit einer
Primärerkrankung,
die axillare Lymphkoten umfasst (Slamon et al. (1987) und (1989),
siehe oben, Ravdin und Chamness, Gene 159, 19–27 (1995), und Hynes und Stern,
Biochim. Biophys. Acta 1198, 165–184 (1994)), und mit Empfindlichkeit
und/oder Resistenz gegenüber
Hormontherapie und chemotherapeutischen Behandlungsplänen verbunden
ist, einschließlich
CMF (Cyclophosphamid, Methotrexat und Fluoruracil) und Anthracycline
(Baselga et al., Oncology 11 (3 Beilage 1), 43–48 (1997)). Jedoch waren trotz
der Assoziation von erbB2-Überexpression
mit schlechter Prognose die Chancen von HER2-positiven Patienten, klinisch
auf Behandlung mit Taxanen zu reagieren, dreimal so hoch wie jene
von HER2-negativen Patienten (ebenda). Ein rekombinanter humanisierter
monoklonaler Anti-ErbB2-(Anti-Her2-)Antikörper (eine humanisierte Version
des murinen AntiErbB2-Antikörpers
4D5, der als rhuMAK HER2 oder Herceptin7 bezeichnet wird) ist bei
Patienten mit ErbB2-überexprimierendem
Metastasenbrustkrebs, der ausgedehnte vorherige Antikrebstherapie
erhielt, klinisch aktiv gewesen (Baselga et al., J. Clin. Oncol.
14, 737–744
(1996)).
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7. Screeningtests für Arzneimittelkandidaten
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Screeningtests
für Arzneimittelkandidaten
sind so entworfen, dass sie Verbindungen identifizieren, die Polypeptide
binden oder mit ihnen Komplexe bilden, für welche die hierin identifizierten
Gene oder ein biologisch aktives Fragment davon kodieren, oder aber
in die Wechselwirkung der kodierten Polypeptide mit anderen zellulären Proteinen
eingreifen. Solche Screeningtests umfassen Tests, die für Hochdurchsatzverfahren von
chemischen Bibliotheken zugänglich
sind, was sie besonders geeignet zur Identifizierung von kleinen Wirkstoffkandidaten
macht. Kleine in Betracht gezogene Moleküle umfassen synthetische organische
oder anorganische Verbindungen, einschließlich Peptide, vorzugsweise
lösliche
Peptide, (Poly)Peptid-Immunglobulin fusionen und insbesondere Antikörper, die
unter anderem poly- und monoklonale Antikörper und Antikörperfragmente,
einkettige Antikörper,
antiidiotypische Antikörper
und chimäre
oder humanisierte Versionen solcher Antikörper oder Fragmente umfassen,
sowie menschliche Antikörper
als auch Antikörperfragmente.
Die Tests können
in einer Vielzahl von Formaten durchgeführt werden, einschließlich Protein-Proteinbindungstests,
biochemischer Screeningtests, Immuntests und zellbasierter Tests,
die alle im Fachgebiet gut beschrieben sind.
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Alle
Tests sind insofern gleich, als dass sie ein Kontaktieren des Arzneimittelkandidaten
mit einem Polypeptid verlangen, für welches eine hierin identifizierte
Nucleinsäure
kodiert, unter Bedingungen und für
einen ausreichenden Zeitraum, um diesen zwei Komponenten zu ermöglichen,
wechselzuwirken.
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In
Bindungstests ist die Wechselwirkung Bindung, und der gebildete
Komplex kann isoliert oder im Reaktionsgemisch detektiert werden.
In einer besonderen Ausführungsform
wird das Polypeptid, das vom hierin identifizierten Gen kodiert
wird, oder der Arzneimittelkandidat auf einer Festphase, z. B. einer
Mikrotiterplatte, durch kovalente oder nicht-kovalente Anheftungen,
immobilisiert. Nicht-kovalente Anheftung wird im Allgemeinen durch
Beschichtung der festen Oberfläche
mit einer Lösung
des Polypeptids und Trocknung erreicht. Alternativ dazu kann ein
immobilisierter Antikörper,
z. B. ein monoklonaler Antikörper,
der für
das zu immobilisierende Polypeptid spezifisch ist, dazu verwendet
werden, es an einer festen Oberfläche zu verankern. Der Test wird
durch Hinzufügung
der nicht-immobilisierten Komponente, die durch eine detektierbare
Markierung markiert werden kann, zur immobilisierten Komponente,
z. B. die beschichtete Oberfläche,
welche die verankerte Komponente enthält, durchgeführt. Wenn
die Reaktion vollständig
ist, werden nicht-umgesetzte Komponenten entfernt, z. B. durch Waschung,
und Komplexe, die auf der festen Oberfläche verankert sind, werden
detektiert. Wenn die ursprüngliche
nicht-immobilisierte Komponente eine detektierbare Markierung trägt, zeigt
die Detektion der Markierung, die auf der Oberfläche immobilisiert ist, dass
Komplexierung eintrat. Wo die ursprüngliche nicht-immobilisierte
Komponente keine Markierung trägt,
kann Komplexierung z. B. durch Verwendung eines markierten Antikörpers, der
spezifisch den immobilisierten Komplex bindet, detektiert werden.
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Wenn
die Kandidatenverbindung mit einem bestimmten Protein, für welches
ein hierin identifiziertes Gen kodiert, wechselwirkt aber sich nicht
daran bindet, kann seine Wechselwirkung mit dem Protein durch wohlbekannte
Verfahren zur Detektion von Protein-Protein-Wechselwirkungen getestet
werden. Solche Tests umfassen traditionelle Ansätze, wie z. B. Vernetzung,
Co-Immunpräzipitation
und Co-Reinigung durch Gradienten oder chromatographische Säulen. Zusätzlich dazu
können
Protein-Proteinwechselwirkungen
durch Verwendung eines hefebasierten, von Fields und Mitarbeitern
beschriebenen genetischen Systems überwacht werden [Fields und
Song, Nature (London) 340, 245–246
(1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578–9582 (1991)],
wie von Chevray und Nathans offenbart [Proc. Natl. Acad. Sci., USA
89, 5789–5793 (1991)].
Viele Transkriptionsaktivatoren, wie z. B. Hefe GAL4, bestehen aus
zwei physikalisch diskreten Modulardomänen, wovon eine als DNA-Bindungsdomäne wirkt,
während
die andere als Transkriptionsaktivierungsdomäne wirkt. Das Hefeexpressionssystem,
das in den vorangegangenen Veröffentlichungen
beschrieben worden ist (im Allgemeinen als „Zweihybridsystem" bezeichnet), zieht
aus dieser Eigenschaft Vorteil und verwendet zwei hybride Proteine,
eines, in welchem das Targetprotein an die DNA-Bindungsdomäne von GAL4
fusioniert ist, und ein anderes, in welchem das Kandidaten-Aktivierungsprotein
an die Aktivierungsdomäne
fusioniert ist. Die Expression eines GAL4-lacZ-Reportergens unter
Kontrolle eines GAL4-aktivierten Promotors hängt von der Rekonstitution
von GAL4-Aktivität über Protein-Protein-Wechselwirkung
ab. Kolonien, die wechselwirkende Polypeptide enthalten, werden
mit einem chromogenen Substrat für β-Galactosidase
detektiert. Ein vollständiges
Set (MATCHMAKERTM) zur Identifikation von
Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen
zwei spezifischen Proteinen, welche die Zweihybridverfahren benutzen,
ist kommerziell von Clontech zu beziehen. Dieses System kann auch
ausgedehnt werden, um Proteindomänen
anzugleichen, die in spezifische Proteinwechselwirkungen involviert
sind, sowie um Aminosäurereste
zu lokalisieren, die für
diese Wechselwirkungen entscheidend sind.
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Um
Verbindungen zu finden, welche die Wechselwirkung eines hierin identifizierten
Gens und anderer intra- oder extrazellulärer Komponenten beeinflusst,
wird für
gewöhnlich
ein Reaktionsgemisch, welches das Produkt des Gens und die intra-
oder extrazelluläre
Komponenten enthält,
unter Bedingungen und für
einen Zeitraum, die Wechselwirkung und die Bindung von zwei Produkten
ermöglichen,
hergestellt. Um die Fähigkeit einer
Testverbindung zu testen, Bindung zu hemmen, wird die Reaktion in
Abwesenheit und in Gegenwart der Testverbindung laufen gelassen.
Zusätzlich
dazu kann ein Placebo zu einem dritten Reaktionsgemisch zugegeben
werden, um als positive Kontrolle zu dienen. Die Bindung (Komplexbildung)
zwischen der Testverbindung und der intra- oder extrazellulären Komponente,
die im Gemisch gegenwärtig
ist, wurde wie oben beschrieben überwacht.
Die Bildung eines Komplexes in der/den Kontrollreaktion(en), aber
nicht im Reaktionsgemisch, das die Testverbindung enthält, zeigt,
dass die Testverbindung die Wechselwirkung der Testverbindung und
ihrer Reaktionspartner beeinflusst.
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B. Zusammensetzungen und Verfahren zur
Behandlung von immunassoziierten Erkrankungen
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Die
Zusammensetzungen, die zur Behandlung von immunassoziierten Erkrankungen
zweckdienlich sind, umfassen ohne Einschränkung Antikörper, kleine organische und
anorganische Moleküle,
Peptide, Phosphopeptide, Antisense- und Ribozym-Moleküle, Tripelhelixmoleküle usw.,
welche die Immunfunktion, z. B. die T-Zellproliferation/-aktivierung,
Lymphokinfreisetzung oder Immunzellfiltration, hemmen oder stimulieren.
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Beispielsweise
wirken Antisense-RNA und RNA-Molekül, um die Translation von mRNA
durch Hybridisieren an abgezielte mRNA und Verhinderung der Proteintranslation
direkt zu blockieren. Wenn Antisense-DNA verwendet wird, sind Oligodesoxyribonucleotide
bevorzugt, die von der Translationsinitiationsstelle stammen, z.
B. von einer Position zwischen ungefähr –10 und +10 der Ziel-Gen-Nucleotidsequenz.
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Ribozyme
sind enzymatische RNA-Moleküle,
die fähig
sind, die spezifische Spaltung von RNA zu katalysieren. Ribozyme
agieren durch sequenzspezifische Hybridisierung an die komplementäre Ziel-RNA,
gefolgt von endonucleolytischer Spaltung. Spezifische Ribozym-Spaltstellen
innerhalb eines potentiellen RNA-Ziels können mithilfe bekannter Techniken
identifiziert werden. Für
weitere Einzelheiten siehe z. B. Rossi, Current Biology 4, 469–471 (1994),
und PCT-Veröffentlichung
Nr.
WO 97/33551 (veröffentlicht
am 18. September 1997).
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Nucleinsäuremoleküle in Tripelhelix-Formation,
die zur Hemmung der Transkription verwendet werden, sollten einzelsträngig und
aus Desoxynucleotiden zusammengesetzt sein. Die Basenzusammensetzung dieser
Oligonucleotide ist so konstruiert, dass sie die Tripelhelix-Bildung über Hoogsteen-Basenpaarungsgesetze
fördert,
was im Allgemeinen beträchtliche
Abschnitte von Purinen oder Pyrimidinen an einem Strang eines Duplex
erfordert. Für
weitere Einzelheiten siehe z. B. PCT-Veröffentlichung Nr.
WO 97/33551 , s. o.
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Diese
Moleküle
können
durch ein beliebiges oder durch jegliche Kombination der hierin
oben erörterten
Screeningtests und/oder durch jegliche andere Screeningtests identifiziert
werden, die dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt
sind.
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9. Antikörper
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Einige
der aussichtsreichsten Medikament-Kandidaten gemäß der vorliegenden Erfindung
sind Antikörper
und Antikörperfragmente,
welche die Proliferation von T-Zellen,
Leukozyteninfiltration etc. hemmen (Antagonisten) oder stimulieren
(Agonisten) können.
Exemplarische Antikörper
umfassen polyklonale, monoklonale, humanisierte, bispezifische und
Heterokonjugatantikörper.
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a. Polyklonale Antikörper
-
Verfahren
zur Herstellung polyklonaler Antikörper sind dem Fachmann bekannt.
Polyklonale Antikörper
können
in einem Säugetier
hergestellt werden, beispielsweise durch eine oder mehrere Injektionen
eines immunisierenden Mittels und, falls erwünscht, eines Adjuvans. Typischerweise
wird das immunisierende Mittel und/oder Adjuvans durch mehrfache
subkutane oder intraperitoneale Injektionen in das Säugetier
injiziert. Das immunisierende Mittel kann das PRO362-Polypeptid
der Erfindung oder ein Fusionsprotein davon umfassen. Es kann zweckdienlich
sein, das immunisierende Mittel an ein Protein zu konjugieren, das
im zu immunisierenden Säugetier
bekanntermaßen
immunogen ist. Beispiele derartiger immunogener Proteine umfassen,
sind jedoch nicht beschränkt
auf, Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyreoglobulin
und Sojabohnen-Trypsininhibitor. Beispiele für Adjuvanzien, die eingesetzt
werden können,
umfassen Freundsches komplettes Adjuvans und MPL-TDM-Adjuvans (Monophosphoryl-Lipid
A, synthetisches Trehalose-Dicorynomycolat). Das Immunisierungsprotokoll
kann von einem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung ohne übermäßiges Experimentieren
gewählt
werden.
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b. Monoklonale Antikörper
-
Antikörper, die
Polypeptide der Erfindung erkennen oder als Antagonisten dazu wirken,
können
alternativ dazu monoklonale Antikörper sein. Monoklonale Antikörper können unter
Verwendung von Hybridomverfahren, wie z. B. jenen von Kohler und
Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschriebenen, hergestellt werden. Bei
einem Hybridomverfahren wird eine Maus, ein Hamster oder ein anderes
geeignetes Wirtstier typischerweise mit einem immunisierenden Mittel
immunisiert, um Lymphozyten hervorzurufen, die Antikörper produzieren
oder dazu fähig
sind, Antikörper
zu produzieren, die spezifisch an das immunisierende Mittel binden. Alternativ
dazu können
die Lymphozyten in vitro immunisiert werden.
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Das
immunisierende Mittel wird typischerweise das PRO362-Polypeptid
der Erfindung, ein Antigenfragment oder ein Fusionsprotein davon
umfassen. Im Allgemeinen werden entweder Peripherblut-Lymphozyten
(„PBLs") verwendet, falls
Zellen menschlichen Ursprungs gewünscht sind, oder Milzzellen
oder Lymphknotenzellen, falls nicht-menschliche Säugetierquellen
gewünscht
sind. Die Lymphozyten werden dann mit einer immortalisierten Zelllinie
unter Verwendung eines geeigneten Fusionierungsmittels, wie z. B.
Polyethylenglykol, fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden (Goding,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press,
S. 59–103
(1986)). Immortalisierte Zelllinien sind üblicherweise transformierte
Säugetierzellen, insbesondere
Myelomzellen von Nagetieren, Rindern oder menschlichen Ursprungs. Üblicherweise
werden Ratten- oder Maus-Myelomzelllinien eingesetzt. Die Hybridomzellen
können
in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert werden, das vorzugsweise
eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben
nicht fusionierter, immortalisierter Zellen hemmt. Wenn beispielsweise
den elterlichen Zellen das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase
(HGPRT oder HPRT) fehlt, wird das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise
Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin („HAT-Medium") umfassen, wobei
diese Substanzen das Wachstum HGPRT-defizienter Zellen verhindert.
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Bevorzugte
immortalisierte Zelllinien sind jene, die effizient fusionieren,
eine stabile Expression des Antikörpers durch die selektierten
Antikörper-produzierenden
Zellen im hohen Ausmaß aufrechterhalten
und gegen ein Medium, wie z. B. HAT-Medium, empfindlich sind. Bevorzugtere
immortalisierte Zelllinien sind Maus-Myelomlinien, die beispielsweise
vom Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien,
und der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland,
erhalten werden können.
Menschliche Myelom- und Maus-Mensch-Heteromyelomzelllinien sind
zur Produktion menschlicher monoklonaler Antikörper ebenfalls beschrieben
worden (Kozbor, J. immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal
Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker Inc.,
New York, S. 51–63
(1987)).
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Das
Kulturmedium, in dem die Hybridomzellen kultiviert werden, kann
dann auf die Gegenwart von monoklonalen Antikörpern getestet werden, die
gegen das Polypeptid der Erfindung gerichtet sind und ähnliche
Aktivität
wie das Polypeptid der Erfindung haben. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität der von
den Hybridomzellen produzierten monoklonalen Antikörper mittels
Immunopräzipitation
oder durch einen In-vitro-Bindungstest, wie z. B. Radioimmuntest
(RIA) oder enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA), ermittelt.
Derartige Techniken und Tests sind auf dem Gebiet der Erfindung
bekannt. Die Bindungsaffinität des
monoklonalen Antikörpers
kann beispielsweise mittels Scatchard-Analyse von Munson und Pollard,
Anal. Biochem. 107, 220 (1980), ermittelt werden.
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Nachdem
die gewünschten
Hybridomzellen identifiziert worden sind, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren
subkloniert und mittels Standardverfahren gezüchtet werden (Goding, s. o.).
Geeignete Kulturmedien zu diesem Zweck umfassen beispielsweise Dulbecco's Modified Eagle's Medium und RPMI-1640-Medium.
Alternativ dazu können
die Hybridomzellen in vivo als Aszites in einem Säugetier
gezüchtet werden.
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Die
von den Subklonen sekretierten monoklonalen Antikörper können durch
herkömmliche
Immunglobulin-Reinigungsverfahren, wie z. B. Protein-A-Sepharose,
Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie,
aus dem Kulturmedium oder Aszites isoliert oder gereinigt werden.
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Die
monoklonalen Antikörper
können
außerdem
durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden, wie z. B.
jene, die im
US-Patent Nr. 4.816.567 beschrieben
sind. Für
die monoklonalen Antikörper
der Erfindung kodierende DNA kann unter Verwendung herkömmlicher
Verfahren (z. B. durch Verwendung von Oligonucleotidsonden, die
fähig sind,
spezifisch an Gene zu binden, die für die Schwer- und Leichtketten
von Maus-Antikörpern
kodieren) leicht isoliert und sequenziert werden. Die Hybridomzellen
der Erfindung dienen als bevorzugte Quelle derartiger DNA. Wenn
sie einmal isoliert ist, kann die DNA in Expressionsvektoren gesetzt
werden, die dann in Wirtszellen, wie z. B. Simian-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstock-(CHO-)Zellen oder
Myelomzellen transfiziert werden, die ansonsten kein Immunglobulinprotein
produzieren, um die Synthese monoklonaler Antikörper in den rekombinanten Wirtszellen
zu erzielen. Die DNA kann auch modifiziert werden, beispielsweise
durch Substituieren der kodierenden Sequenz für menschliche konstante Schwer-
und Leichtkettendomänen
anstelle der homologen Maus-Sequenzen (
US-Patent Nr. 4. 816.567 ; Morrison
et al., s. o.) oder durch kovalentes Verbinden der gesamten oder
eines Teils der kodierenden Sequenz für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid
mit der für
Immunglobulin kodierenden Sequenz. Die konstanten Domänen eines
Antikörpers
der Erfindung oder die variablen Domänen einer der Antigen-kombinierenden
Stellen eines Antikörpers
der Erfindung können
durch ein derartiges Nicht-Immunglobulin-Polypeptid ersetzt werden,
um einen chimären
bivalenten Antikörper
zu erzeugen.
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Die
Antikörper
sind vorzugsweise monovalente Antikörper. Verfahren zur Herstellung
monovalenter Antikörper
sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. Beispielsweise umfasst
eines der Verfahren die rekombinante Expression der Immunglobulin-Leichtkette und der
modifizierten Schwerkette. Die Schwerkette ist im Allgemeinen an
einer beliebigen Stelle in der Fc-Region trunkiert, um die Schwerkettenvernetzung
zu verhindern. Alternativ dazu werden die maßgeblichen Cysteinreste mit
einem anderen Aminosäurerest
substituiert oder werden deletiert, um eine Vernetzung zu verhindern.
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In-vitro-Verfahren
sind zur Herstellung monovalenter Antikörper ebenfalls geeignet. Der
Verdau von Antikörpern,
um Fragmente davon, insbesondere Fab-Fragmente, herzustellen, kann
unter Verwendung von Routineverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung
bekannt sind, erzielt werden.
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c. Menschliche und humanisierte Antikörper
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Die
Antikörper
der Erfindung können
außerdem
humanisierte oder menschliche Antikörper umfassen. Humanisierte
Formen nicht-menschlicher (z. B. Maus-)Antikörper sind chimäre Immunglobuline,
Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z. B. Fv, Fab, Fab', F(ab')2 oder
andere antigenbindende Untersequenzen von Antikörpern), die eine vom nicht-menschlichen
Immunglobulin stammende Minimalsequenz enthalten. Humanisierte Antikörper umfassen
menschliche Immunglobuline (Empfänger-Antikörper), in
denen Reste einer komplementaritätsbestimmenden
Region (CDR) des Empfängers
durch Reste einer CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Spender-Antikörper), wie
z. B. Maus, Ratte oder Kaninchen, mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt
sind. In manchen Fällen
werden Fv-Gerüstregionreste
des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste
ersetzt. Humanisierte Antikörper
können
außerdem
Reste umfassen, die sich weder im Empfänger-Antikörper noch in den importierten CDR-
oder Gerüstsequenzen
finden. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im
Wesentlichen alle von zumindest einer und typischerweise zwei variablen
Domänen,
in denen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen jenen des
nicht-menschlichen
Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der
FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulin-Konsensussequenz
sind. Der humanisierte Antikörper
umfasst im Optimalfall außerdem
zumindest einen Teil einer konstanten Immunglobulinregion (Fc),
typischerweise jenen eines menschlichen Immunglobulins (Jones et
al., Nature 321, 522–525
(1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–329 (1988); und Presta, Curr.
Op. Struct. Biol. 2, 593–596
(1992)).
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Verfahren
zur Humanisierung nicht-menschlicher Antikörper sind auf dem Gebiet der
Erfindung wohlbekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen
oder mehrere Aminosäurereste
auf, die aus einer nicht-menschlichen Quelle in diesen eingeführt sind.
Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste
werden häufig
als „Import"-Reste bezeichnet,
die typischerweise einer variablen „Import"-Domäne
entnommen sind. Die Humanisierung kann im Wesentlichen nach dem
Verfahren von Winter und Mitarbeitern (Jones et al., Nature 321,
522–525
(1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–327 (1988); Verhoeyen et al.,
Science 239, 1534–1536
(1988)) durchgeführt
werden, indem die entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durch
Nagetier-CDRs oder -CDR-Sequenzen substituiert werden. Dementsprechend
sind derartige „humanisierte" Antikörper chimäre Antikörper (
US-Patent Nr. 4.816.567 ),
worin im Wesentlichen weniger als eine intakte menschliche variable Domäne mit der
entsprechenden Sequenz aus einer nicht-menschlichen Spezies substituiert
worden ist. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise
menschliche Antikörper,
bei denen einige CDR-Reste und möglicherweise
einige FR-Reste
durch Reste aus analogen Stellen in Nager-Antikörpern substituiert sind.
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Menschliche
Antikörper
können
ebenfalls hergestellt werden, und zwar unter Verwendung verschiedener,
auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Techniken, einschließlich Phagen-Display-Bibliotheken
(Hoogenboom und Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et
al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)). Die Techniken von Cole et al.
und Boerner et al. sind zur Herstellung menschlicher monoklonaler
Antikörper
ebenfalls verfügbar (Cole
et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,
S. 77 (1985), und Boerner et al., J. Immunol. 147 (1), 86–95 (1991);
US 5.750.373 ). Gleichermaßen können menschliche
Antikörper
durch Einführen menschlicher
Immunglobulin-Loci in transgene Tiere hergestellt werden, z. B.
in Mäuse,
bei denen die endogenen Immunglobulingene teilweise oder vollständig inaktiviert
worden sind. Bei Exposition wird eine Produktion menschlicher Antikörper beobachtet,
die der im Menschen beobachteten in allen Aspekten, einschließlich Gen-Umordnung,
Assemblierung und Antikörper-Repertoire,
sehr nahe kommt. Dieser Ansatz wird beispielsweise in den
US-Patenten Nr. 5.545.807 ;
5.545.806 ;
5.569.852 ;
5.625.126 ;
5.633.425 ;
5.661.016 und in den folgenden wissenschaftlichen
Veröffentlichungen
beschrieben: Marks et al., Bio/Technology 10, 779–783 (1992);
Lonberg et al., Nature 368, 856–859
(1994); Morrison, Nature 368, 812–13 (1994); Fishwild et al.,
Nature Biotechnology 14, 845–51
(1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg
und Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 65–93 (1995).
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d. Bispezifische Antikörper
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Bispezifische
Antikörper
sind monoklonale, vorzugsweise menschliche oder humanisierte, Antikörper, die
Bindungsspezifitäten
für zumindest
zwei verschiedene Antigene aufweisen. Im vorliegenden Fall kann
eine der Bindungsspezifitäten
für das
Polypeptid der Erfindung sein, die andere ist für jedes beliebige andere Antigen,
und vor zugsweise für
ein(en) Zelloberflächen-Protein
oder -Rezeptor oder eine -Rezeptoruntereinheit.
-
Verfahren
zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind auf dem Gebiet der
Erfindung bekannt. Herkömmlicherweise
basiert die rekombinante Produktion von bispezifischen Antikörpern auf
der Co-Expression von zwei Immunglobulin-Schwerketten/Leichtketten-Paaren,
worin die zwei schweren Ketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen
(Milstein & Cuello,
Nature 305, 537–539
(1983)). Aufgrund der zufälligen
Auswahl an Immunglobulinschwer- und -leichtketten produzieren diese
Hybridome (Quadrome) ein potenzielles Gemisch von zehn verschiedenen
Antikörpermolekülen, von
denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die
Reinigung des korrekten Moleküls
erfolgt üblicherweise
durch Affinitätschromatographieschritte. Ähnliche
Verfahren sind in der
WO 93/08829 ,
veröffentlicht
am 13. Mai 1993, und in Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655–3659 (1991),
offenbart.
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Variable
Antikörperdomänen mit
den erwünschten
Bindungsspezifitäten
(Antikörper-Antigen-Kombinationsstellen)
können
an Immunglobulinkonstantdomänen-Sequenzen
fusioniert werden. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer Immunglobulin-Schwerkettenkonstantdomäne, umfassend
zumindest einen Teil der Gelenks-, CH2- und CH3-Regionen. Es wird bevorzugt,
dass die erste Schwerketten-Konstantregion (CH1) die Stelle enthält, die
für Leichtkettenbindung,
vorhanden in zumindest einer der Fusionen, erforderlich ist. DNAs, die
für die
Immunglobulin-Schwerkettenfusionen und, sofern erwünscht, für die Immunglobulin-Leichtkette
kodieren, werden in getrennte Expressionsvektoren insertiert und
werden in einen geeigneten Wirtsorganismen co-transfiziert. Für nähere Details
zur Herstellung von bispezifischen Antikörpern siehe beispielsweise
Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
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e. Heterokonjugierte Antikörper
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Heterokonjugierte
Antikörper
setzen sich aus zwei kovalent gebundenen Antikörpern zusammen. Solche Antikörper wurden
beispielsweise vorgeschlagen, um Immunsystemzellen auf unerwünschte Zellen
zu richten [
US-Patent Nr. 4.676.980 ],
sowie zur Behandlung von HIV-Infektion [
WO 91/00360 ;
WO 92/200373 ;
EP 03089 ]. Es wird erwogen, dass die
Antikörper
in vitro unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet der synthetischen
Proteinchemie bekannt sind, hergestellt werden können, einschließlich jener,
die Vernetzungsmittel einbinden. Beispielsweise können Immunotoxine
unter Verwendung einer Disulfid-Austauschreaktion oder durch Bildung
einer Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele für geeignete
Reagenzien für
diesen Zweck umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat
sowie jene Reagenzien, die beispielsweise im
US-Patent Nr. 4.676.980 offenbart
sind.
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f. Effektorfunktionsbearbeitung
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Es
kann wünschenswert
sein, den Antikörper
der Erfindung hinsichtlich der Effektorfunktion zu modifizieren,
um z. B. die Wirksamkeit des Antikörpers bei der Behandlung von
immunassoziierter Erkrankung zu steigern. Beispielsweise können ein
oder mehrere Cysteinreste in die Fc-Region eingeführt werden,
wodurch die Bildung von Disulfidbindungen zwischen den Ketten in
dieser Region ermöglicht
wird. Der so gebildete homodimere Antikörper kann verbesserte Internalisierungsfähigkeit
und/oder gesteigerte komplementvermittelte Zellabtötung und
antikörpervermittelte
zelluläre
Zytotoxizität
(ADCC) aufweisen. Siehe Caron et al., J. Exp. Med. 176, 1191–1195 (1992),
und B. Shopes, J. Immunol. 148, 2918–2922 (1992). Homodimere Antikörper mit gesteigerter
Anti-Tumor-Aktivität
können
auch unter Verwendung heterobifunktioneller Vernetzer hergestellt werden,
wie in Wolff et al., Cancer Research 53, 2560–2565 (1993), beschrieben wird.
Alternativ dazu kann ein Antikörper
so gentechnisch verändert
werden, dass er duale Fc-Regionen aufweist und dadurch über gesteigerte
Komplementlyse- und ADCC-Fähigkeiten
verfügen
kann. Siehe Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3, 219–230 (1989).
-
g. Immunkonjugate
-
Die
Erfindung betrifft auch Immunkonjugate, die einen Antikörper umfassen,
der an ein zytotoxisches Mittel wie beispielsweise ein chemotherapeutisches
Mittel, Toxin (z. B. ein enzymatisch aktives Toxin oder ein Toxin
bakteriellen, pflanzlichen oder tie rischen Ursprungs oder auch von
Pilzen oder Fragmente davon) oder ein radioaktives Isotop (d. h.
ein Radiokonjugat) konjugiert ist.
-
Chemotherapeutische
Mittel, die zur Herstellung solcher Immunkonjugate nützlich sind,
wurden oben beschrieben. Enzymatisch aktive Toxine und Fragmente
davon, die verwendet werden können,
umfassen Diphtherie-A-Kette, nichtbindende aktive Fragmente von
Diphtherietoxin, Exotoxin-A-Kette (aus Pseudomonas aeruginosa),
Ricin-A-Kette, Abrin-A-Kette, Modeccin-A-Kette, α-Sarcin, Aleurites-fordii-Proteine,
Dianthin-Proteine, Phytolaca-americana-Proteine (PAPI, PAPII und
PAP-S), Momordica-charantia-Inhibitor, Curcin, Crotin, Sapaonaria-officinalis-Inhibitor,
Gelonin, Saporin, Mitogellin, Restrictocin, Phenomycin, Enomycin
und die Tricothecene. Zahlreiche verschiedene Radionuclide sind
zur Herstellung von radiokonjugierten Antikörpern erhältlich. Beispiele umfassen 212Bi, 131I, 131In, 90Y und 186Re.
-
Konjugate
des Antikörpers
und des zytotoxischen Mittels werden unter Verwendung zahlreicher
verschiedener bifunktioneller Proteinbindungsmittel wie z. B. N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithioppropionat
(SPDP), Iminothiolan (IT), bifunktioneller Derivate von Imidoestern
(wie z. B. Dimethyladipimidat-HCl), aktiver Ester (wie z. B. Disuccinimidylsuberat),
Aldehyden (wie Glutaraldehyd), Bisazido-Verbindungen (wie z. B.
Bis(p-azidobenzoyl)hexandiamin), Bisdiazonium-Derivaten (wie z.
B. Bis(p-diazoniumbenzoyl)ethylendiamin), Diisocyanaten (wie Toluol-2,6-diisocyanat)
und bis-aktiver Fluorverbindungen (wie z. B. 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol) hergestellt.
Beispielsweise kann ein Ricinimmunotoxin wie in Vitetta et al.,
Science 238, 1098 (1987), beschrieben hergestellt werden. C-14-markierte
1-Isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylentriaminpentaessigsäure (MX-DTPA)
ist ein beispielhafter Chelatbildner zur Konjugation von Radionucleotid
an den Antikörper.
Siehe die
WO 94/11026 .
-
In
einer anderen Ausführungsform
kann der Antikörper
an einen „Rezeptor" (wie Streptavidin)
zur Verwendung bei Gewebs-Pretargeting konjugiert werden, worin
das Antikörper-Rezeptor-Konjugat
dem Patienten verabreicht wird, gefolgt von der Entfernung ungebundenen
Konjugats aus dem Blutkreislauf unter Verwendung eines Klärungsmittels
und der anschließenden
Verabreichung eines „Liganden" (z. B. Avidin),
der an ein zytotoxisches Mittel (z. B. ein Radionucleotid) konjugiert
ist.
-
h. Immunoliposomen
-
Die
hierin offenbarten Proteine, Antikörper usw. können auch als Immunoliposomen
formuliert werden. Liposomen, die den Antikörper enthalten, werden durch
auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren hergestellt, wie
sie beispielsweise in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82, 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030
(1980); und den
US-Patenten Nr.
4.485.045 und
4.544.545 beschrieben
werden. Liposomen mit gesteigerter Zirkulationsdauer sind im
US-Patent Nr. 5.013.556 offenbart.
-
Besonders
nützliche
Liposomen können
durch das Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren mit einer Lipidzusammensetzung,
die Phosphatidylcholin, Cholesterin und PEG-derivatisiertes Phosphatidylethanolamin
(PEG-PE) umfasst, hergestellt werden. Liposomen werden durch Filter
von definierter Porengröße filtriert, um
Liposomen mit dem erwünschten
Durchmesser zu ergeben. Fab'-Fragmente
des Antikörpers
der vorliegenden Erfindung können
an die Liposomen wie in Martin et al., J. Biol. Chem. 257, 286–288 (1982),
beschrieben mittels einer Disulfid-Austauschreaktion konjugiert
werden. Ein Chemotherapeutikum (wie beispielsweise Doxorubicin)
ist gegebenenfalls im Liposom enthalten. Siehe Gabizon et al., J.
National Cancer Inst. 81 (19), 1484 (1989).
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10. Pharmazeutische Zusammensetzungen
-
Die
aktiven Moleküle
der Erfindung, Polypeptide und Antikörper, sowie andere Moleküle, die
durch die oben offenbarten Screeningtests identifiziert werden,
können
zur Behandlung von Entzündungserkrankungen in
Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden.
-
Therapeutische
Formulierungen des aktiven Moleküls,
vorzugsweise eines PRO362-Antikörpers der Erfindung,
werden für
die Lagerung hergestellt, indem das aktive Molekül mit dem gewünschten
Reinheitsgrad mit optionalen pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Exzipienten
oder Stabilisatoren (Remington's
Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., A. Osol (Hrsg.) (1980)) vermischt
werden, und zwar in Form von lyophilisierten Formulierungen oder
wässrigen
Lösungen.
Annehmbare Träger,
Exzipienten oder Stabilisatoren sind für Empfänger bei den eingesetzten Dosierungen
und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer, wie z. B. Phosphat,
Citrat und andere organische Säuren;
Antioxidantien, einschließlich
Ascorbinsäure
und Methionin; Konservierungsmittel (wie z. B. Octadecyldimethylbenzylammoniumchlorid;
Hexamethoniumchlorid; Benzalkoniumchlorid, Benzethoniumchlorid;
Phenol; Butyl- oder Benzylalkohol; Alkylparabene, wie z. B. Methyl-
oder Propylparaben; Catechin; Resorcin; Cyclohexanol; 3-Pentanol;
und m-Cresol); niedermolekulare (weniger als etwa 10 Reste) Polypeptide;
Proteine, wie z. B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline;
hydrophile Polymere, wie z. B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie
z. B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Histidin, Arginin oder Lysin;
Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose,
Mannose oder Dextrine; Chelatierungsmittel, wie z. B. EDTA; Zucker,
wie z. B. Saccharose, Mannit, Trehalose oder Sorbit; salzbildende
Gegenionen, wie z. B. Natrium; Metallkomplexe (z. B. Zn-Protein-Komplexe); und/oder
nichtionische Tenside, wie z. B. TWEENTM,
PLURONICSTM oder Polyethylenglykol (PEG).
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Verbindungen,
die von Screeningtests der vorliegenden Erfindung identifiziert
wurden, können
auf analoge Weise unter Anwendung von Standardtechniken formuliert
werden, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind.
-
Jedoch
können
auch Lipofektionen oder Liposomen verwendet werden, um das Polypeptid,
den Antikörper
oder ein Antikörperfragment
an Zellen abzugeben. Wenn Antikörperfragmente
verwendet werden, ist das kleinste hemmende Fragment, das spezifisch
an die Bindungsdomäne
des Zielproteins bindet, bevorzugt. Beispielsweise können auf
Basis der Sequenzen der variablen Regionen eines Antikörpers Peptidmoleküle konstruiert
werden, welche die Fähigkeit
zur Bindung der Ziel-Protein sequenz beibehalten. Derartige Peptide können chemisch
synthetisiert und/oder mittels DNA-Rekombinationstechnologie hergestellt
werden (siehe z. B. Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,
7889–7893
(1993)).
-
Die
Formulierung hierin kann außerdem
mehr als eine aktive Verbindung enthalten, die für die jeweilige behandelte
Indikation notwendig sind, vorzugsweise jene mit komplementären Aktivitäten, welche
sich gegenseitig nicht nachteilig beeinflussen. Alternativ oder
zusätzlich
dazu kann die Zusammensetzung ein zytotoxisches Mittel, Cytokin
oder wachstumshemmendes Mittel umfassen. Derartige Moleküle sind
in geeigneter Weise in Kombination in Mengen vorhanden, die für den beabsichtigten
Zweck wirksam sind.
-
Die
aktiven Moleküle
können
auch in Mikrokapseln eingeschlossen sein, die beispielsweise durch
Koazervationstechniken oder durch Grenzflächenpolymerisation, beispielsweise
Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln,
in kolloidalen Arzneimittel-Abgabesystemen (beispielsweise Liposomen,
Albumin-Mikrokügelchen,
Mikroemulsionen, Nanopartikeln und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen
hergestellt werden. Derartige Techniken werden in Remington's Pharmaceutical
Sciences, 16. Aufl., A. Osol (Hrsg.) (1980), offenbart.
-
Die
zur In-vivo-Verabreichung verwendeten Formulierungen müssen steril
sein. Dies kann leicht mittels Filtration durch Sterilfiltrationsmembranen
erzielt werden.
-
Es
können
Präparate
mit nachhaltiger Freisetzung hergestellt werden. Geeignete Beispiele
von Präparaten
mit nachhaltiger Freisetzung umfassen semipermeable Matrices fester
hydrophober Polymere, die den Antikörper enthalten, wobei die Matrices
in Form von Formteilen, z. B. Filmen oder Mikrokapseln, vorliegen.
Beispiele für
Matrices für
nachhaltige Freisetzung umfassen Polyester, Hydrogele (beispielsweise
Poly(2-hydroxyethl-methacrylat) oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide
(
US-Patent Nr. 3.773.919 ),
Copolymere von L-Glutaminsäure
und ☐-Ethyl-L-glutamat, nicht abbaubares Ethylenvinylacetat,
abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere,
wie z. B. das LUPRON DEPOT
TM (injizierbare
Mikrokügelchen,
die aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer
und Leuprolid-Acetat zusammengesetzt sind) und Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure. Während Polymere,
wie z. B. Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure, die Freisetzung von Molekülen für über 100
Tage ermöglichen,
setzen gewisse Hydrogele Protein über kürzere Zeiträume frei. Wenn verkapselte Antikörper für lange
Zeit im Körper
verbleiben, können
sie als Ergebnis des Aussetzens gegenüber Feuchtigkeit bei 37°C denaturieren
oder aggregieren, was in einem Verlust biologischer Aktivität und möglichen
Veränderungen
der Immunogenität
resultiert. Es können
rationale Strategien zur Stabilisierung in Abhängigkeit vom beteiligten Mechanismus
entwickelt werden. Wenn beispielsweise der Aggregationsmechanismus
als Bildung intermolekularer S-S-Bindungen über Thio-Disulfid-Austausch
erkannt wird, kann eine Stabilisierung durch Modifizieren von Sulfhydrylresten,
Lyophilisieren aus sauren Lösungen,
Kontrolle des Feuchtigkeitsgehalts, Verwendung geeigneter Zusätze und
Entwickeln spezieller Polymermatrix-Zusammensetzungen erzielt werden.
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11. Behandlungsverfahren
-
Es
ist vorgesehen, dass die Polypeptide, Antikörper und andere aktive Verbindungen
der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, um verschiedene Entzündungserkrankungen
und -leiden, wie beispielsweise T-zellvermittelte Erkrankungen,
zu behandeln, einschließlich
jener, die durch Infiltration von Leukozytenzellen in ein Gewebe,
Stimulation der Proliferation von T-Zellen, Inhibition der Proliferation
von T-Zellen, erhöhte oder
verringerte vaskuläre
Permeabilität
oder Inhibition davon gekennzeichnet sind.
-
Die
hierin geoffenbarten Verbindungen (z. B. PRO301, PRO362, PRO245)
kodieren für
neue Mitglieder einer Familie von Proteinen, die durch Homologie
zu dem A33-Antigen
gekennzeichnet sind. Die proentzündliche
Natur der Verbindungen der Erfindung ist in den nachstehenden In-vitro-Tests
angezeigt.
-
Die
Proteine, für
welche die hierin geoffenbarten DNA40628-, DNA45416- und DNA35638-Verbindungen
kodieren (Seq.-ID Nr. 1, Seq.-ID Nr. 2 bzw. Seq.-ID Nr. 9), teilen
Homologie mit der Identität
mit Bindungsadhäsionsmolekülen (JAM),
Martin-Padura et
al., J. Cell Biol. 142 (1), 117–27
(1998). Die wesentlichste Identität mit 67% weist das PRO301-Protein
auf, für
das DNA40628 kodiert (Seq.-ID Nr. 1). JAM ist an der Rekrutierung
von Monozyten als Reaktion auf MCP-1, MCP-3 und LPS in vivo involviert.
Antikörper
gegen JAM blockieren Monozytentransmigration in vivo. JAM befindet
sich am Mausepithel und -endothel als Bindungsadhäsionsmolekül für Monozytentransmigration.
Andere Leukozyten können
ebenfalls JAM verwenden, aber es gibt keine Informationen, die diese
Annahme unterstützen.
JAM ist im Colon von Mäusen
mit Colitis erhöht
und spielt wahrscheinlich eine Rolle in der Rekrutierung von Monozyten
oder Leukozyten in die Colonläsion.
-
Exemplarische
Leiden oder Erkrankungen, die mit den Polypeptiden, Antikörpern und
anderen Verbindungen der Erfindung behandelt werden, umfassen unter
anderem entzündliche
Darmerkrankung (z. B. Colitis ulcerosa, Crohn-Krankheit), systemischen
Lupus erythematodes, rheumatoide Arthritis, juvenile chronische Arthritis,
Spondyloarthropathien, systemische Sklerose (Sclerodermia), idiopathische
entzündliche
Myopathien (Dermatomyositis, Polymyositis), Sjögren-Syndrom, systemische Vaskulitis,
Sarkoidose, hämolytische
Autoimmunanämie
(Immunpanzytopenie, paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie), Autoimmunthrombozytopenie
(idiopathische thrombozytopenische Purpurs, immunvermittelte Thrombozytopenie),
Thyreoiditis (Basedow-Krankheit,
Hashimoto-Thyreoiditis, juvenile lymphozytische Thyreoditis, atrophische
Thyreoditis), Diabetes mellitus, immunvermittelte Nierenerkrankung
(Glomerulonephritis, tubulointerstitielle Nephritis), Entmarkungskrankheiten
des zentralen und peripheren Nervensystems, wie z. B. multiple Sklerose,
idiopathische Entmarkungspolyneuropathie oder Guillain-Barre-Syndrom
und chronische entzündliche
Entmarkungspolyneuropathie, Leber-Gallen-Erkrankungen, wie z. B.
infektiöse
Hepatitis (Hepatitis A, B, C, D, E und andere nicht-hepatotrope
Viren), chronische aktive Autoimmunhepatitis, primäre biliäre Leberzirrhose,
granulomatöse
Hepatitis und sklerosierende Cholangitis, entzündliche und fibrotische Lungenerkrankungen
(z. B. zystische Fibrose, Zöliakie
und Whipple-Krankeit, Autoimmun- oder immunvermittelte Hauterkrankungen,
einschließlich
bullöse Hauterkrankungen,
Erythema multiforme und Kontaktdermatitis, Psoriasis, allergische
Erkrankungen der Lunge, wie z. B. Asthma, allergische Rhinitis,
atopische Dermatitis, Lebensmittelüberempfindlichkeit und Urtikaria, immunologische
Krankheiten der Lunge, wie z. B. Eosinophilenpneumonien, idiopathische
Lungenfibrose und exogen-allergische Alveolitis, mit Transplantation
assoziierte Erkrankungen, einschließlich Transplantatabstoßung und
Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung.
-
Bei
systemischem Lupus erythematodes ist der Hauptvermittler von Erkrankung
die Produktion von selbstreagierenden Antikörpern zu Selbstproteinen/Geweben
und die folgende Erzeugung von immunvermittelter Entzündung. Antikörper vermitteln
entweder direkt oder indirekt Gewebsschäden. Obwohl sich nicht gezeigt
hat, dass T-Lymphozyten
direkt in Gewebsschäden
involviert sind, sind T-Lymphozyten für die Entwicklung von selbstreagierenden
Antikörpern
erforderlich. Die Genese von Erkrankung ist daher T-lymphozytenabhängig. Mehrere
Organe und Systeme sind klinisch betroffen, einschließlich Nieren,
Lungen, das Muskelskelettsystem, das mukokutane, Aug-, zentrale
Nervensystem, kardiovaskuläre
System, der gastrointestiriale Trakt, das Knochenmark und Blut.
-
Rheumatoide
Arthritis (RA) ist eine chronische systemische Autoimmunentzündungserkrankung,
die hauptsächlich
die Membrana synovialis mehrerer Gelenke mit resultierender Verletzung
am Gelenksknorpel umfasst. Die Pathogenese ist T-lymphozytenabhängig und mit der Produktion
von rheumatoiden Faktoren assoziiert, Auto-Antikörpern, die gegen Selbst-IgG
gerichtet sind, mit der resultierenden Bildung von Immunkomplexen,
die ein hohes Ausmaß in
Gelenksflüssigkeit
und Blut erreichen. Diese Komplexe im Gelenk können das spezielle Infiltrat
von Lymphozyten und Monozyten im Synovium und nachfolgende deutliche
Synovialveränderungen induzieren; der Gelenksraum/fluid, wenn
es durch ähnliche
Zellen unter Zugabe von zahlreichen Neutrophilen infiltriert wird.
Die betroffenen Gewebe sind primär
die Gelenke, oft in einem symmetrischen Muster. Jedoch treten extraartikuläre Erkrankungen
auch in zwei Hauptformen auf. Eine Form ist die Entwicklung von
extraartikulären
Läsionen
mit anhaltender progressiver Gelenkserkrankung und typischen Läsionen von Lungenfibrose,
Vaskulitis und kutanen Geschwüren.
Die zweite Form von extraartikulärer
Erkrankung ist das so genannte Felty-Syndrom, das spät im Krankheitsverlauf
von RA auftritt, manchmal nachdem Gelenkserkrankung ruhend geworden
ist, und umfasst die Gegenwart von Neutropenie, Thrombozytopenie
und Splenomegalie. Dies kann von Vaskulitis in mehreren Organen
mit Bildungen von Infarkten, Hautgeschwüren und Gangrän begleitet
sein. Patienten entwickeln oft auch Rheumaknoten im Subcutis-Gewebe,
das die betroffenen Gelenke überlagert,
die Knoten im späten
Stadium haben nekrotische Zentren, umgeben von einem gemischten
entzündlichen
Zellinfiltrat. Andere Manifestationen, die bei RA auftreten können, umfassen
Pericarditis, Pleuritis, Koronararteriitis, interstitielle Pneumonie
mit Lungenfibrose, Keratokonjunktivitis sicca und Rheumaknoten.
-
Juvenile
chronische Arthritis ist eine chronische idiopathische entzündliche
Erkrankung, die oft im Alter von unter 16 Jahren beginnt. Ihr Phänotyp hat
gewisse Ähnlichkeiten
mit RA, einige Patienten, die rheumatoidfaktorpositiv sind, werden
als Patienten klassifiziert, die juvenile rheumatoide Arthritis
aufweisen. Die Erkrankung wird in drei Hauptkategorien unterteilt:
pauciartikulär,
polyartikulär
und systemisch. Die Arthritis kann schwer sein und ist typischerweise
schädlich
und führt
zu Gelenksankylose und verspätetem
Wachstum. Andere Manifestationen können chronische Uveitis anterior
und systemische Amyloidose umfassen.
-
Spondyloarthropathien
sind eine Gruppe von Erkrankungen mit gewissen gemeinsamen klinischen
Eigenschaften und der gemeinsamen Assoziation mit der Expression
von HLA-B27-Genprodukt. Die Erkrankungen umfassen: Bechterew-Krankheit,
Reiter-Syndrom (reaktive Arthritis), Arthritis, die mit entzündlicher Darmerkrankung
assoziiert ist; Spondylitis, die mit Psoriasis assoziiert ist, juvenile
Spondyloarthropathie und nicht-differenzierte Spondyloarthropathie.
Unterscheidungsmerkmale umfassen Sacroileitis mit oder ohne Spondylitis,
entzündliche
asymmetrische Arthritis; Assoziation mit HLA-B27 (ein serologisch
definiertes Allel des HLA-B-Lokus von Klasse-I-MHC), Augenentzündung und
Fehlen von Autoantikörpern,
die mit einer anderen Rheumaerkrankung assoziiert sind. Die Zelle,
die als Schlüssel
zur Induktion der Erkrankung am meisten impliziert ist, ist der
CD8+-T-Lymphozyt, eine Zelle, die auf ein Antigen abzielt, das von
Klasse-I-MHC-Molekülen
präsentiert
wird. CD8+-T-Zellen
können
gegen das Klasse-I-MHC-Allel HLA-B27 reagieren, als ob es ein Fremdpeptid
ist, das von MHC-Klasse-I-Molekülen
exprimiert wird. Es ist die Hypothese aufgestellt worden, dass ein
Epitop von HLA-B27 ein bakterielles oder anderes Mikrobenantigenepitop
nachahmt und daher eine CD8+-T-Zellreaktion induziert.
-
Systemische
Sklerose (Sclerodermia) hat eine unbekannte Ätiologie. Ein Kennzeichen der
Erkrankung ist die Induration der Haut, wahrscheinlich wird diese
durch einen aktiven Entzündungsprozess
induziert. Sclerodermia kann lokal oder systemisch sein, vaskuläre Läsionen sind
häufig,
und endothelialer Zellschaden in der Mikrovaskulatur ist ein frühes und
wichtiges Ereignis in der Entwicklung von systemischer Sklerose,
der vaskuläre
Schaden kann immunvermittelt sein. Eine immunologische Basis ist
durch die Gegenwart von mononuklearen Zellinfiltraten in den kutanen
Läsionen
und die Gegenwart von antinuklearen Antikörpern bei vielen Patienten
impliziert. ICAM-1 wird oft auf der Zelloberfläche von Fibroblasten in Hautläsionen hinaufreguliert,
was vermuten lässt,
dass die T-Zellwechselwirkung mit diesen Zellen eine Rolle in der
Pathogenese der Erkrankung spielt. Andere involvierte Organe umfassen:
den Gastrointestinaltrakt: Atrophie glatter Muskulatur und Fibrose,
was zu abnormer Peristaltik/Motilität führt; Niere: konzentrische subendotheliale
Intimaproliferation, die kleine gebogene und interlobuläre Arterien
mit resultierendem reduziertem Nierenkortexblutfluß betreffen,
resultieren in Proteinurie, Azotämie
und Hypertonie; Skelettmuskel: Atrophie, interstitielle Fibrose;
Entzündung;
Lunge: interstitielle Pneumonitis und interstitielle Fibrose; und
Herz: Kontraktionsbandnekrose, Vernarbung/Fibrose.
-
Idiopathische
entzündliche
Myopathien, einschließlich
Dermatomyositis, Polymyositis und anderer, sind Erkrankungen der
chronischen Muskelentzündung
von unbekannter Ätiologie,
die zu Muskelschwäche führen. Muskelschaden/-entzündung ist
oft symmetrisch und progressiv. Autoantiköper sind mit den meisten Formen
assoziiert. Diese mysoitisspezifischen Autoantikörper sind gegen die Funktion
von Komponenten, Proteinen und RNAs gerichtet, die in die Proteinsynthese
involviert sind.
-
Das
Sjögren-Syndrom
ist auf immunvermittelte Entzündung
und nachfolgende funktionelle Zerstörung von Tränendrüsen und Speicheldrüsen zurückzuführen. Die
Erkrankung kann mit entzündlichen
Bindegewebserkrankungen assoziiert sein oder davon begleitet sein.
Die Erkrankung ist mit Autoantikörperproduktion gegen
Ro- und La-Antigene assoziiert, wovon beide kleine RNA-Proteinkomplexe
sind. Läsionen
führen
zu Keratokonjunktivitis sicca, Xerostomie, mit anderen Manifestationen
oder Assoziationen, einschließlich
biliärer Leberzirrhose,
peripherer oder sensorischer Neuropathie und palpabler Purpurs.
-
Systemische
Vaskulitis sind Erkrankungen, bei welchen die primäre Läsion Entzündung und
nachfolgender Schaden an Blutgefäßen ist,
die zu Ischämie/Nekrose/Abbau
bei Geweben führt,
die mit den betroffenen Geweben und in manchen Fällen schlussendlicher Endorgandysfunktion
einhergehen. Vaskulitiden können
ebenso als sekundäre
Läsion
oder Folgewirkungen zu anderen immun-entzündungsvermittelten Erkrankungen
auftreten, wie z. B. rheumatoide Arthritis, systemische Sklerose
etc., insbesondere bei Erkrankungen, die auch mit der Bildung von
Immunkomplexen assoziiert sind. Erkrankungen in der primären systemischen Vaskulitisgruppe
umfassen: systemische nekrotisierende Vaskulitis, Polyarteritis
nodosa, allergische Angiitis und Granulomatose, Polyangiitis, Wegener-Granulomatose,
lymphomatoide Granulomatose und Riesenzellarteritis. Verschiedenartige
Vaskulitides umfassen: mucokutanes Lymphknotensyndrom (MLNS oder
Kawasaki-Syndrom), isolierte ZNS-Vaskulitis,
Behet-Erkrankung, Thromboangitis obliterans (Bürger-Erkrankung) und kutane
nekrotisierende Venulitis. Der pathogene Mechanismus der meisten
angeführten
Formen von Vaskulitis soll primär
auf die Ablagerung von Imunglobulinkomplexen in der Gefäßwand und
nachfolgende Induktion einer Entzündungsreaktion entweder über ADCC,
Komplementaktivierung oder beide zurückzuführen sein.
-
Sarkoidose
ist ein Leiden von unbekannter Atiologie, das durch die Gegenwart
von epitheloiden Granulomen in nahezu jedem beliebigen Gewebe im
Körper
charakterisiert ist; die Involvierung der Lunge ist am häufigsten.
Die Pathogenese umfasst die Persistenz von aktivierten Makrophagen
und Lymphoidzellen an Stellen der Erkrankung mit nachfolgenden chronischen
Anzeichen, die sich aus der Freisetzung von lo kal und systemisch
aktiven Produkten ergeben, die von diesen Zelltypen freigesetzt
werden.
-
Hämolytische
Autoimmunanämie,
die hämolytische
Autoimmunanämie,
Immunpancytopenie und paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie umfasst, ist eine
Folge der Produktion von Antikörpern,
die mit Antigenen reagieren, die auf der Oberfläche der roten Blutzellen exprimiert
werden (und in manchen Fällen
anderen Blutzellen, die auch Plättchen
umfassen), und ist eine Reflektion der Entfernung dieser mit Antiköper umhüllten Zellen über komplementvermittelte
Lyse und/oder ADCC/Fc-Rezeptorvermittelte Mechanismen.
-
Bei
Autoimmunthrombozytopenie, einschließlich thrombozytopenischer
Purpurs und immunvermittelter Thrombocytopenie in anderen klinischen
Bereichen, tritt Plättchenzerstörung/-entfernung
als Folge von entweder Antikörper-
oder Komplement-Bindung
an Plättchen
und nachfolgende Entfernung durch Komplementlyse, ADCC oder FC-rezeptorvermittelte
Mechanismen auf.
-
Thyreoiditis,
einschließlich
Basedow-Krankheit, Hashimoto-Thyreoiditis, juvenile lymphozytische
Thyreoditis und atrophische Thyreoditis, sind das Ergebnis einer
Autoimmunantwort gegen Thyreoidantigene mit Produktion von Antikörpern, die
mit Proteinen reagieren, die in der Schilddrüse gegenwärtig sind und oft für diese
spezifisch sind. Es bestehen Versuchsmodelle, die spontane Modelle
umfassen: Ratten (BUF- und BB-Ratten) und Hühner (Stamm fettleibiger Hühner); induzierbare
Modelle: Immunisierung von Tieren entweder mit Thyreoglobulin oder
Schilddrüsenmikrosomenantigen
(Thyreoidperoxidase).
-
Diabetes
mellitus Typ 1 oder insulinabhängiger
Diabetes ist die Autoimmunzerstörung
von β-Inselzellen
des Pankreas; diese Zerstörung
wird durch Autoantikörper
und autoreaktive T-Zellen vermittelt. Antikörper gegen insulin oder den
Insulinrezeptor können
auch den Phänotyp
von Insulinresistenz produzieren.
-
Immunvermittelte
Nierenerkrankungen, einschließlich
Glomerulonephritis und tubulointerstitielle Nephritis, sind das
Ergebnis von Antikörper-
oder T-lymphozytenvermittelten Schäden an Nierengewebe entweder
direkt als Ergebnis der Produktion von autoreaktiven Antikörpern oder
T-Zellen gegen Nierenantigen oder indirekt als Ergebnis der Ablagerung
von Antikörpern
und/oder Immunkomplexen in der Niere, die gegen andere Nichtnierenantigene
reagieren. Daher können
andere immunvermittelte Erkrankungen, die zur Bildung von Immunkomplexen
führen,
auch eine immunvermittelte Nierenerkrankung als direktes Folge besitzen.
Sowohl direkte als auch indirekte Immunmechanismen führen zu
einer Entzündungsreaktion,
die Läsionsentwicklung
von Nierengeweben mit resultierendem Schaden an der Organfunktion
und in manchen Fällen
Fortschreiten bis zum Nierenversagen produziert/induziert. Sowohl
humorale als auch zelluläre
Immunmechanismen können
in die Pathogenese von Läsionen
involviert sein.
-
Von
Entmarkungskrankheiten der zentralen und peripheren Nervensysteme,
wie z. B. multiple Sklerose, idiopathische Entmarkungspolyneuropathie
oder Guillain-Barré-Syndrom und chronische
entzündliche Entmarkungspolyneuropathie,
wird angenommen, dass sie eine Autoimmunbasis haben und zu Nervenentmarkung
als Folge von Schäden
direkt an Oligodendrozyten oder Myelin haben. Bei MS gibt es Beweise,
die vermuten lassen, dass Krankheitsinduktion und -progression von
T-Lymphozyten abhängen.
Multiple Sklerose ist eine Entmarkungskrankheit, die T-lymphozytenabhängig ist
und entweder einen rückfallverhindernden
Verlauf oder einen chronisch progressiven Verlauf nimmt. Die Ätiologie
ist unbekannt, jedoch tragen Virusinfektionen, genetische Prädisposition,
Umwelt und Autoimmunität
alle dazu bei. Läsionen
enthalten Infiltrate von vorherrschend durch T-Lymphozyten vermittelten
Mikroglia und infiltrierenden Makrophagen; CD4+-T-Lymphozyten sind
der vorherrschende Zelltyp an Läsionen.
Der Mechanismus des Oligodendrozytenzelltods und nachfolgende Entmarkung
ist nicht bekannt, aber vermutlich T-lymphozytengesteuert.
-
Entzündliche
und fibrotische Lungenerkrankung, einschließlich Eosinophilenpneumonien,
idiopathischer Lungenfibrose und Hypersensibilitätspneumonitis, kann eine deregulierte
immunentzündliche
Erkrankung umfassen. Die Inhibition dieser Antwort kann von therapeutischem
Nutzen sein.
-
Autoimmun-
oder immunvermittelte Hauterkrankung, einschließlich bullöser Hauterkrankungen, Erythema
multiforme und Kontaktdermatitis, werden durch Autoantikörper vermittelt,
deren Genese T-lymphozytenabhängig
ist.
-
Psoriasis
ist eine T-Iymphozytenvermittelte Entzündungsreaktion. Läsionen enthalten
Infiltrate von T-Lymphozyten, Makrophagen und antigenverarbeitenden
Zellen und einige Neutrophile.
-
Allergische
Erkrankungen, einschließlich
Asthma, Rhinitis allergica, atopischer Dermatitis, Nahrungsmittelhypersensibilität und Urtikaria,
sind T-lymphozytenabhängig.
Diese Erkrankungen werden vorrangig durch T-lymphozyteninduzierte
Entzündung,
IgE-vermittelte Entzündung
oder eine Kombination von beiden vermittelt.
-
Transplantationsassoziierte
Erkrankungen, einschließlich
Transplantatabstoßung
und Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung (GVHD), sind T-lymphozytenabhängig, die
Inhibition von T-Lymphozytenfunktion ist meliorativ.
-
Andere
Erkrankungen, bei welchen die Intervention der Immunität und/oder
Entzündungsreaktion
Vorteil haben, sind Infektionskrankheiten, einschließlich von
unter anderem Virusinfektion (einschließlich von u. a. Aids, Hepatitis
A, B, C, D, E), bakterielle Infektion, Pilzinfektion und Protozoen-
und Parasiteninfektionen (Moleküle
(oder Derivate/Agonisten), die MLR stimulieren, können therapeutisch
verwendet werden, um die Immunantwort auf Infektionsmittel zu verstärken), Immundefizienzkrankheiten
(Moleküle/Derivate/Agonisten,
die MLR stimulieren, können
therapeutisch verwendet werden, um die Immunantwort für erbliche,
erworbene, infektiöse
induzierte (wie bei HIV-Infektion) oder iatrogene Leiden (d. h.
aus Chemotherapie) Immundefizienz zu verstärken) und Neoplasie.
-
Es
ist gezeigt worden, dass manche menschliche Krebspatienten einen
Antikörper
und/oder T-Lymphozytenantwort auf Antigene auf neoplastischen Zellen
entwickeln. Es ist auch in Tiermodellen von Neoplasie gezeigt worden,
dass die Verstärkung
der Immunantwort zu einer Abstoßung
oder Regression dieses besonderen Neoplasmas führt. Moleküle, welche die T-Lymphozytenantwort
in MLR verstärken,
sind in-vivo in der Verstärkung
der Immunantwort gegen Neoplasie nützlich. Moleküle, welche
die T-lymphozytenproliferative Antwort in MLR (oder kleine Molekülagonisten
oder Antikörper,
die denselben Rezeptor auf agonistische Art beeinflussten) verstärken, können dazu
verwendet werden, Krebs therapeutisch zu behandeln. Moleküle, die die
Lymphozytenantwort in MLR hemmen, wirken während Neoplasie auch in vivo,
um die Immunantwort auf ein Neoplasma zu unterdrücken; solche Moleküle können entweder
von den neoplastischen Zellen selbst exprimiert werden, oder ihre
Expression kann von Neoplasma in anderen Zellen induziert werden.
Antagonismus solcher Hemmmoleküle
(entweder mit Antikörpern,
kleinen Molekülantagonisten
oder anderen Mitteln) verstärkt
immunvermittelte Tumorabstoßung.
-
Weiters
zeigt die Inhibition von Molekülen
mit proentzündlichen
Eigenschaften therapeutischen Nutzen bei Reperfusionsschädigung,
Schlaganfall, Myokardinfarkt, Atherosklerose, akuter Lungenschädigung, hämmorhagischem
Schock, Verbrennung, Sepsis/septischem Schock, akuter tubulärer Nekrose,
Endometriose, degenerativer Gelenkserkrankung und Pankreatitis.
-
Die
PRO362-Verbindungen der vorliegenden Erfindung, z. B. Polypeptide
oder Antikörper,
werden einem Säugetier,
vorzugsweise einem Menschen, nach bekannten Verfahren, wie z. B.
intravenöser
Verabreichung als Bolus- oder kontinuierliche Infusion über einen
Zeitraum, durch intramuskuläre,
intraperitoneale, intrazerebrospinale, subkutane, intraartikuläre, intrasynoviale,
intrathekale, orale, topische oder inhalative Wege (intranasal,
intrapulmonär),
verabreicht. Die intravenöse
oder inhalierte Verabreichung von Polypeptiden und Antikörpern ist
bevorzugt.
-
In
der Immunadjuvanstherapie können
andere therapeutische Regime, wie beispielsweise Verabreichung der
Anti-Krebs-Mittel, mit der Verabreichung der Proteine, Antikörper oder
Verbindungen der vorliegenden Erfindung kombiniert werden. Beispielsweise
kann der mit Immunadjuvanzien der Erfindung zu behandelnde Patient
außerdem
ein Anti-Krebsmittel (chemotherapeutisches Mittel) oder Bestrahlungstherapie
erhalten. Herstellungs- und Dosierungspläne für derartige chemotherapeutische
Mittel können
nach Anleitungen des Herstellers verwendet oder vom geübten Praktiker
empirisch ermittelt werden. Herstellungs- und Dosierungspläne für eine derartige
Chemotherapie werden auch in Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry,
Williams & Wilkins,
Baltimore, MD (1992), beschrieben. Das chemotherapeutische Mittel
kann der Verabreichung des Immunadjuvans vorangehen oder folgen
oder kann gleichzeitig damit verabreicht werden. Der Antikörper kann zusätzlich dazu
mit einer Anti-Östrogen-Verbindung,
wie z. B. Tamoxifen, oder einem Anti-Progesteron, wie z. B. Onapriston
(siehe
EP 616812 ), in
Dosierungen kombiniert werden, die für derartige Moleküle bekannt
sind.
-
Es
kann wünschenswert
sein, außerdem
Antikörper
gegen andere Tumor-assoziierte Antigene zu verabreichen, wie z.
B. Antikörper,
die an CD20, CD11a, CD18, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 oder Gefäßendothelfaktor
(VEGF) binden. Alternativ oder zusätzlich dazu können dem
Patienten gleichzeitig zwei oder mehr Antikörper verabreicht werden, die
dasselbe oder zwei oder mehrere verschiedene hierin offenbarte Antigene binden.
Manchmal kann es vorteilhaft sein, dem Patienten auch ein oder mehrere
Cytokine zu verabreichen. In einer Ausführungsform werden die Polypeptide
der Erfindung gemeinsam mit einem wachstumshemmenden Mittel verabreicht.
Beispielsweise kann das wachstumshemmende Mittel zuerst verabreicht
werden, gefolgt von einem Polypeptid der vorliegenden Erfindung.
Jedoch ist die gleichzeitige Verabreichung oder die Verabreichung
des Polypeptids der vorliegenden Erfindung als Erstes ebenfalls
vorgesehen. Geeignete Dosierungen für das wachstumshemmende Mittel
sind jene, die gegenwärtig
verwendet werden, und können
aufgrund der kombinierten Wirkung (Synergie) des wachstumshemmenden
Mittels und des Polypeptids der Erfindung erniedrigt werden.
-
Zur
Behandlung oder Reduktion der Schwere einer immunassoziierten Krankheit
wird die geeignete Dosierung einer Verbindung der Erfindung von
der Art der zu be handelnden Krankheit, wie oben definiert, der Schwere
und dem Verlauf der Krankheit abhängen, davon, ob das Mittel
zu präventiven
oder therapeutischen Zwecken verabreicht wird, von der vorhergehenden
Therapie, der Krankengeschichte des Patienten und Reaktion auf das
Mittel und dem Ermessen des behandelnden Arztes. Die Verbindung
wird dem Patienten in geeigneter Weise auf einmal oder über eine
Reihe von Behandlungen verabreicht. Vorzugsweise ist es wünschenswert,
die Dosis-Reaktionskurve und die pharmazeutische Zusammensetzung
der Erfindung zuerst in vitro und dann in nützlichen Tiermodellen vor dem
Testen am Menschen zu bestimmen.
-
Beispielsweise
sind in Abhängigkeit
von der Art und Schwere der Krankheit ungefähr 1 μg/kg bis 15 mg/kg (z. B. 0,1–20 mg/kg)
Polypeptid oder Antikörper
eine mögliche
anfängliche
Dosierung für
die Verabreichung an den Patienten, sei es beispielsweise durch
eine oder mehrere gesonderte Verabreichungen oder durch kontinuierliche
Infusion. Eine typische tägliche
Dosierung kann in Abhängigkeit
von den oben erwähnten Faktoren
von etwa 1 μg/kg
bis 100 mg/kg oder mehr reichen. Für wiederholte Verabreichungen über mehrere Tage
oder länger
wird die Behandlung in Abhängigkeit
vom Zustand aufrechterhalten, bis eine gewünschte Unterdrückung von
Krankheitssymptomen auftritt. Jedoch können andere Dosierungsregime
zweckdienlich sein. Der Fortschritt dieser Therapie kann durch herkömmliche
Techniken und Tests leicht überwacht
werden.
-
12. Fertigartikel
-
Die
Verbindungen der Erfindung können
in einem Fertigartikel Anwendung finden, der Materialien enthält, die
zur Diagnose oder Behandlung der oben beschriebenen Störungen zweckdienlich
sind. Der Fertigartikel umfasst einen Behälter und ein Etikett. Geeignete
Behälter
umfassen beispielsweise Flaschen, Fläschchen, Spritzen und Teströhrchen.
Die Behälter
können
aus einer Vielzahl von Materialien, wie z. B. Glas oder Kunststoff,
bestehen. Der Behälter
enthält
eine Zusammensetzung, die zur Diagnose oder Behandlung des Leidens
wirksam ist, und kann eine sterile Füllöffnung aufweisen (beispielsweise
kann der Behälter
ein Beutel für
intravenöse
Lösun gen
oder ein Fläschchen
sein, das einen von einer subkutanen Injektionsnadel durchstechbaren
Stopfen aufweist). Das aktive Mittel in der Zusammensetzung ist üblicherweise
ein Polypeptid oder ein Antikörper
der Erfindung. Das Etikett, das am Behälter angebracht oder diesem
beigefügt
ist, weist darauf hin, dass die Zusammensetzung zur Diagnose oder
Behandlung des Leidens der Wahl verwendet wird. Der Fertigartikel
kann weiters einen zweiten Behälter
umfassen, der einen pharmazeutisch annehmbaren Puffer, wie z. B.
phosphatgepufferte Salzlösung,
Ringerlösung
und Dextrose-Lösung,
umfasst. Er kann weiters andere Materialien umfassen, die vom kommerziellen
Standpunkt oder Standpunkt des Anwenders wünschenswert sind, einschließlich anderer
Puffer, Verdünner,
Filter, Nadeln, Spritzen und Packungsbeilagen mit Gebrauchsanweisungen.
-
13. Diagnose und Prognose
von immunassoziierten Erkrankungen
-
Zelloberflächenproteine,
wie z. B. Proteine, die in bestimmten immunassoziierten Erkrankungen überexprimiert
werden, sind exzellente Ziele für
Arzneimittelkandidaten oder Krankheitsbehandlung. Gemeinsam mit
sekretierten, von den in immunassoziierten Krankheitszuständen amplifizierten
Genen kodierten Proteinen finden dieselben Proteine weitere Anwendungen
bei der Diagnose und Prognose dieser Erkrankungen. Beispielsweise
können
Antikörper,
die gegen Proteinprodukte von Genen, die in multipler Sklerose,
rheumatoider Arthritis oder einer anderen immunassoziierten Erkrankung
amplifiziert werden, als Tumor-Diagnostika oder -Prognostika verwendet
werden.
-
Beispielsweise
können
Antikörper,
einschließlich
Antikörperfragmente,
verwendet werden, um die Expression der von den amplifizierten oder überexprimierten
Genen kodierten Proteine qualitativ oder quantitativ nachzuweisen
(„Markergenprodukte"). Der Antikörper ist
vorzugsweise mit einem detektierbaren, z. B. fluoreszierenden, Marker
ausgestattet, und die Bindung kann mittels Lichtmikroskopie, Durchflusszytometrie,
Fluorimetrie oder anderen auf dem Gebiet der Erfindung bekannten
Techniken beobachtet werden. Diese Techniken sind besonders geeignet,
wenn das übe rexprimierte
Gen für
ein Zelloberflächenprotein
kodiert. Derartige Bindungstests werden im Wesentlichen wie oben
beschrieben durchgeführt.
-
Der
In-situ-Nachweis der Antikörperbindung
an die Markergenprodukte kann beispielsweise mittels Immunfluoreszenz
oder Immunelektronenmikroskopie durchgeführt werden. Zu diesem Zweck
wird eine histologische Probe aus dem Patienten entfernt und ein
markierter Antikörper
auf diese vorzugsweise durch Überschichten
der biologischen Probe mit dem Antikörper aufgebracht. Dieses Verfahren
ermöglicht
die Bestimmung der Verteilung des Markergenprodukts im untersuchten
Gewebe. Für
den qualifizierten Fachmann ist offensichtlich, dass eine breite
Vielfalt an histologischen Verfahren für den in-situ-Nachweis leicht
verfügbar
ist.
-
Die
folgenden Beispiele werden ausschließlich zu illustrativen Zwecken
bereitgestellt und beabsichtigen in keiner Weise eine Einschränkung des
Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung.
-
BEISPIELE
-
Im
Handel erhältliche
Reagenzien, auf die in den Beispielen Bezug genommen wird, wurden,
sofern nicht anders angegeben, gemäß den Anleitungen des Herstellers
verwendet. Die Quelle jener Zellen, die in den folgenden Beispielen
und in der gesamten Patentbeschreibung durch ATCC-Zugangsnummern
gekennzeichnet sind, ist die American Type Culture Collection, Rockville,
Maryland.
-
BEISPIEL 1 (HINTERGRUND)
-
Isolierung von cDNA-Klonen, die für menschliches
PRO301 kodieren
-
Die
extrazellulären
Domänen-(ECD-)Sequenzen
(einschließlich
der Sekretionssignalsequenz, sofern vorhanden) aus etwa 950 bekannten
sekretierten Proteinen aus der öffentlich
zugänglichen
Swiss-Prot-Proteindatenbank wurden verwendet, um EST-Datenbanken
zu durchsuchen. Die EST-Datenbanken umfassten öffentliche EST-Datenbanken
(z. B. GenBank) und eine private EST-Datenbank (z. B. LIFESEQTM, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA).
Die Suche wurde unter Verwendung des Computerprogramms BLAST oder BLAST-2
(Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460–480 (1996); http://blast.wustl.edu/blast/README.html)
in Form eines Vergleichs der ECD-Proteinsequenzen mit einer 6-Raster-Translation
der EST-Sequenz
durchgeführt.
Diese Vergleiche mit einem BLAST-Score von 70 (oder in manchen Fällen von
90) oder mehr, die nicht für
bekannte Proteine kodierten, wurden gruppiert und mit dem Programm „phrap" (Phil Green, University
of Washington, Seattle, WA, USA; http:/(bozeman.mbt.Washington.edu/phrap.docs/phrap.html)
zu Consensus-DNA-Sequenzen assembliert.
-
Eine
für DNA35936
kodierende Consensus-DNA-Sequenz wurde unter Verwendung von phrap
assembliert. In manchen Fällen
wurde die Consensus-DNA-Sequenz unter Einsatz von wiederholten blast-
und phrap-Zyklen verlängert,
um die Consesus-Sequenz
so weit wie möglich
unter Verwendung der drei oben angeführten Quellen von EST-Sequenzen
zu verlängern.
-
Basierend
auf dieser Consensus-Sequenz wurden Oligonucleotide synthetisiert:
1) um durch PCR eine cDNA-Bibliothek zu identifizieren, die die
Sequenz von Interesse enthielt, und 2) um als Sonden verwendet zu
werden, um einen Klon der Codiersequenz voller Länge zu isolieren. Vorwärts- und
Rückwärts-PCR-Primer
(als *.f bzw. *.r angegeben) können
im Bereich von 20 bis 30 Nucleotiden liegen (typischerweise etwa
24) und sind so konzipiert, dass sie ein PCR-Produkt mit einer Länge von
100–1.000
bp bereitstellen. Die Sonden-Sequenzen (als *.p angegeben) umfassen
typischerweise eine Länge
von 40–55
bp (typischerweise etwa 50). In manchen Fällen werden zusätzliche
Oligonucleotide dann synthetisiert, wenn die Consensus-Sequenz länger als
etwa 1–1,5
kbp ist. Um mehrere Bibliotheken für eine Quelle eines Volllängen-Klons
zu screenen, wurde DNA aus den Bibliotheken mittels PCR-Amplifikation, nach
Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, mit dem
PCR-Primerpaar gescreent. Eine positive Bibliothek wurde dann verwendet,
um Klone, die für
das Gen von Interesse kodieren, mittels des In-vivo-Klonierungsverfahrens
unter Einsatz des Sondenoligonucleotids und eines der PCR-Primer
zu isolieren.
-
Um
mehrere Bibliotheken auf eine Quelle eines Volllängen-Klons zu screenen, wurde
DNA aus den Bibliotheken durch PCR-Amplifikation mit dem oben identifizierten
PCR-Primerpaar gescreent. Eine positive Bibliothek wurde dann verwendet,
um für
das PRO301-Gen kodierende Klone unter Einsatz des Sondenoligonucleotids
und eines der PCR-Primer zu isolieren.
-
RNA
für die
Konstruktion der cDNA-Bibliotheken wurde aus einer menschlichen
fötalen
Niere isoliert. Die cDNA-Bibliotheken, die verwendet wurden, um
die cDNA-Klone zu isolieren, wurden mittels Standardverfahren unter
Verwendung von im Handel erhältlichen
Reagenzien (z. B. Invitrogen, San Diego, CA, USA; Clontech usw.)
konstruiert. Die cDNA wurde mit Oligo-dT, das eine NotI-Stelle enthielt,
geprimt, über
das stumpfe Ende mit mit SalI-Hemikinase verdauten Adaptoren verbunden,
mit NotI gespalten, geeignet mittels Gel-Elektrophorese klassiert
und in einer definierten Ausrichtung in einen geeigneten Kloniervektor
(wie pRKB oder pRKD; pRK5B ist ein Vorläufer von pRK5D, der die SfiI-Stelle
nicht enthält;
siehe Holmes et al., Science 253, 1278–1280 (1991)) in die einzigartigen
XhoI- und NotI-Stellen kloniert.
-
Ein
cDNA-Klon wurde als Ganzes sequenziert. Die Volllängen-Nucleotidsequenz
einer Nativsequenz-DNA40628 ist in 5 dargestellt.
Der DNA40628-Klon enthält
ein einzelnes offenes Leseraster mit einer offensichtlichen Translationsinitiationsstelle
an den Positionen 52–54
(5). Der vorhergesagte Polypeptidvorläufer ist
299 Aminosäuren
lang und weist ein vorhergesagtes Molekulargewicht von 32583 Dalton
und einen pI von 8,29 auf. Der DNA40628-Klon wurde bei der ATCC
hinterlegt, und die ATCC-Hinterlegungsnummer 209432 wurde ihm zugewiesen.
-
Basierend
auf einer BLAST- und FastA-Sequenzanordnungsanalyse der Volllängensequenz
weist PRO301, für
das DNA40628 kodiert, eine Aminosäuresequenzidentität mit einem
A33-Antigen-Vorläufer
(30%) und einem Coxsackie- und Adenovirus-Rezeptorprotein (29%) auf.
-
Die
im obigen Verfahren verwendeten Oligonucleotidsequenzen waren die
folgenden:
-
BEISPIEL 2 (HINTERGRUND)
-
Isolierung von cDNA-Klonen, die für menschliches
PRO362 kodieren
-
Die
extrazellulären
Domänen-(ECD-)Sequenzen
(einschließlich
des Sekretionssignals, sofern vorhanden) aus etwa 950 bekannten
sekretierten Proteinen aus der öffentlich
zugänglichen
Swiss-Prot-Proteindatenbank wurden verwendet, um EST-Datenbanken zu durchsuchen.
Die EST-Datenbanken umfassten öffentliche EST-Datenbanken (z. B.
GenBank) und eine private EST-DNA-Datenbank (z. B. LIFESEQTM, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA).
Die Suche wurde unter Verwendung des Computerprogramms BLAST oder BLAST-2
(z. B. Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460–480 (1996))
in Form eines Vergleichs der ECD-Proteinsequenzen
mit einer 6-Raster-Translation der EST-Sequenz durchgeführt. Diese
Vergleiche mit einem BLAST-Score von 70 (oder in manchen Fällen von
90) oder mehr, die nicht für
bekannte Proteine kodierten, wurden gruppiert und mit dem Programm „phrap" (Phil Green, University
of Washington, Seattle, Washington, USA) zu Consensus-DNA-Sequenzen
zusammengebaut.
-
Eine
Consensus-DNA-Sequenz wurde in Bezug auf die anderen EST-Sequenzen
unter Verwendung von phrap assembliert. Diese Consensus-Sequenz
wird hierin als DNA42257 (Seq.-ID Nr. 5) bezeichnet (siehe 4C). Basierend auf der DNA42257-(Seq.-ID Nr. 5) Consensussequenz,
die in 4C dargestellt ist, wurden
Oligonucleotide synthetisiert: 1) um durch PCR eine cDNA-Bibliothek
zu identifizieren, welche die Sequenz von Interesse enthielt, und
2) zur Verwendung als Sonden zur Isolierung eines Klons der für PRO362 kodierenden
Sequenz voller Länge.
Vorwärts-
und Rückwärts-PCR-Primen
reichen im Allgemeinen von 20 bis 30 Nucleotiden und sind oft so
entworfen, dass sie ein PCR-Produkt von etwa 100–1.000 bp Länge ergeben. Die Sondensequenzen
sind typischerweise 40–55
bp lang. In manchen Fällen
werden zusätzliche
Oligonucleotide synthetisiert, wenn die Consensussequenz größer als
etwa 1–1,5
kbp ist. Um mehrere Bibliotheken für einen Klon voller Länge zu screenen,
wurde DNA aus den Bibliotheken durch PCR-Amplifikation mit dem PCR-Primerpaar gescreent,
wie von Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology,
beschrieben. Eine positive Bibliothek wurde dann verwendet, um Klone,
die für
das Gen von Interesse kodieren, unter Verwendung des Sondenoligonucleotide
und eines der Primerpaare zu isolieren.
-
PCR-Primer
(Vorwärts-
und Rückwärtsprimer)
wurde synthetisiert:
-
Außerdem wurde
eine synthetische Oligonucleotid-Hybridisierungssonde aus der Consensus-DNA42257-Sequenz
konstruiert, welche die folgende Nucleotidsequenz aufwies:
-
Hybridisierungssonde
(42257.p1)
-
Um
mehrere Bibliotheken für
eine Quelle eines Volllängen-Klons
zu screenen, wurde DNA aus den Bibliotheken mittels PCR-Amplifikation
mit den oben identifizierten PCR-Primerpaaren gescreent. Eine positive Bibliothek
wurde dann verwendet, um Klone, die für das PRO362-Gen kodieren,
unter Einsatz des Sondenoligonucleotids und eines der Primerpaare
zu isolieren.
-
RNA
für die
Konstruktion der cDNA-Bibliotheken wurde aus menschlichem fötalem Hirngewebe (LIB153)
isoliert. Die cDNA-Bibliotheken, die verwendet wurden, um die cDNA-Klone
zu isolieren, wurden mittels Standardverfahren unter Verwendung
von im Handel erhältlichen
Reagenzien, wie z. B. von Invitrogen, San Diego, CA, USA, konstruiert.
Die cDNA wurde mit Oligo-dT, das eine NotI-Stelle enthielt, geprimt, über das stumpfe
Ende mit mit SalI-Hemikinase verdauten Adaptoren verbunden, mit
NotI gespalten, geeignet mittels Gel-Elektrophorese klassiert und
in einer definierten Ausrichtung in einen geeigneten Kloniervektor
(wie pRKB oder pRKD; pRK5B ist ein Vorläufer von pRK5D, der die SfiI-Stelle
nicht enthält;
siehe Holmes et al., Science 253, 1278–1280 (1991)) in die einzigartigen
XhoI- und NotI-Stellen kloniert.
-
Die
DNA-Sequenzierung der wie beschrieben isolierten Klone lieferte
die DNA-Sequenz
voller Länge für ein isoliertes
PRO362 (hierin als UNQ317 (DNA45416–1251) bezeichnet) (Seq.-ID
Nr. 7).
-
Die
gesamte Nucleotidsequenz von UNQ317 (DNA45416–1251) ist in 6 dargestellt
(Seq.-ID Nr. 7). Klon UNQ367 (DNA45416–1251) (Seq.-ID Nr. 7) enthält ein einzelnes
offenes Leseraster mit einer offensichtlichen Translationsinitiationsstelle
an den Nucleotidpositionen 1082–1084
(6; Seq.-ID Nr. 7). Der vorhergesagte
Polypeptidvorläufer
ist 321 Aminosäuren
lang (3, Seq.-ID Nr. 2). Das in 3 dargestellte PRO362-Protein
voller Länge
weist ein geschätztes
Molekulargewicht von etwa 35.544 Dalton und einen pI von etwa 8,51
auf. Eine Analyse des Volllängen-PRO362-Polypeptids,
wie es in 3 dargestellt ist (Seq.-ID Nr.
2), belegt die Gegenwart einer Glykosaminoglycanbindungsstelle bei
etwa Aminosäure
149 bis etwa Aminosäure
152 und einer Transmembrandomäne
von etwa Aminosäure
276 bis etwa Aminosäure
306. Klon UNQ317 (DNA45416–1251)
wurde unter der ATCC-Hinterlegungsnummer
209620 hinterlegt.
-
BEISPIEL 3 (HINTERGRUND)
-
Isolierung von cDNA-Klonen, die für menschliches
PRO245 kodieren
-
Die
extrazellulären
Domänen-(ECD-)Sequenzen
(einschließlich
des Sekretionssignals, sofern vorhanden) aus etwa 950 bekannten
sekretierten Proteinen aus der öffentlich
zugänglichen
Swiss-Prot-Proteindatenbank wurden verwendet, um EST-Datenbanken zu durchsuchen.
Die EST-Datenbanken umfassten öffentliche EST-Datenbanken (z. B.
GenBank) und eine private EST-DNA-Datenbank (z. B. LIFESEQTM, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA).
Die Suche wurde unter Verwendung des Computerprogramms BLAST oder BLAST-2
(z. B. Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460–480 (1996))
in Form eines Vergleichs der ECD-Proteinsequenzen
mit einer 6-Raster-Translation der EST-Sequenz durchgeführt. Diese
Vergleiche mit einem BLAST-Score von 70 (oder in manchen Fällen von
90) oder mehr, die nicht für
bekannte Proteine kodierten, wurden gruppiert und mit dem Programm „phrap" (Phil Green, University
of Washington, Seattle, WA) zu Consensus-DNA-Sequenzen zusammengebaut.
-
Eine
Consensus-DNA-Sequenz wurde in Bezug auf die anderen EST-Sequenzen
zusammengebaut, worin die Consensus-Sequenz hierin DNA30954 genannt
wird (Seq.-ID Nr. 27). Basierend auf der DNA30954-Consensussequenz
wurden Oligonucleotide synthetisiert, um durch PCR eine cDNA-Bibliothek
zu identifizieren, wel che die Sequenz von Interesse enthielt und
zur Verwendung als Sonden zur Isolierung eines Klons der für PRO245
kodierenden Sequenz voller Länge
diente.
-
Ein
Paar von PCR-Primern (Vorwärts-
und Rückwärts-) wurde
synthetisch hergestellt:
-
Vorwärts- und
Rückwärts-PCR-Primer
reichen im Allgemeinen von 20 bis 30 Nucleotiden und sind oft so
entworfen, dass sie ein PCR-Produkt von etwa 10–1000 bp Länge ergeben. Die Sondensequenzen
sind typischerweise 40–55
bp lang. In manchen Fällen
werden zusätzliche
Oligonucleotide synthetisiert, wenn die Consensussequenz größer als
etwa 1–1,5
kbp ist. Um mehrere Bibliotheken für einen Klon voller Länge zu screenen,
wurde DNA aus den Bibliotheken durch PCR-Amplifikation mit dem PCR-Primerpaar
gescreent, wie von Ausubel et al., Current Protocols in Molecular
Biology, beschrieben.
-
Zusätzlich dazu
wurde eine synthetische Oligonucleotidhybridisierungssonde aus den DNA30954-Consensussequenzen
hergestellt, die folgende Nucleotidsequenz aufwiesen:
-
Um
mehrere Bibliotheken auf eine Quelle eines Klons voller Länge zu screenen,
wurde DNA aus den Bibliotheken durch PCR-Amplifikation mit dem oben
identifizierten PCR-Primerpaar gescrennt. Eine positive Bibliothek
wurde dann verwendet, um Klone, die für das PRO245-Gen kodierten,
unter Verwendung des Sondenoligonucleotide und eines der PCR-Primer
zu isolieren.
-
RNA
zur Herstellung der cDNA-Bibliotheken wurde aus Lebergewebe eines
menschlichen Fötus
isoliert. Die cDNA-Bibliotheken, die verwendet wurden, um die cDNA-Klone zu isolieren,
wurden durch Standardverfahren unter Einsatz von im Handel erhältlichen
Reagenzien, wie jenen von invitrogen, San Diego, CA, hergestellt.
Die cDNA wurde mit Oligo-cT geprimt, das eine notI-Stelle enthielt,
mit dem stumpfen Ende an SalI-Hämokinaseadaptoren
gebunden, mit NotI gespalten, durch Gelektrophorese geeignet klassiert
und in einer definierten Orientierung in den einzigartigen XhoI-
und NotI-Stellen in einen geeigneten Klonierungsvektor kloniert
(wie z. B. pRKB oder pRKD, pRK5B ist ein Vorläufer von pRK5D, der keine SfiI-Stelle
enthält;
siehe Holmes et al., Science 253, 1278–1280 (1991)).
-
DNA-Sequenzierung
der Klone, die wie oben beschrieben isoliert wurden, ergab die DNA-Sequenz voller
Länge für ein Nativsequenz-PRO245
[hierin UNQ219 (DNA35638) (Seq.-ID Nr. 8) genannt] und die abgeleitete
Proteinsequenz (Seq.-ID Nr. 9).
-
Die
gesamte Nucleotidsequenz von UNQ219 (DNA35638) ist in 7 dargestellt
(Seq.-ID Nr. 8). Klon UNQ219 (DNA35638) (Seq.-ID Nr. 8) enthält einen
einzigen offenen Leseraster mit einer offensichtlichen Translationsinitiationsstelle
an Nucleotidpositionen 89–91
(Kozak et al., siehe oben) und mit Ende am Stopp-Codon an den Nucleotidpositionen
1025–1027
(7, Seq.-ID Nr. 8). Der vorhergesagte Polypeptidvorläufer ist
312 Aminosäuren
lang (11) (Seq.-ID Nr. 9). Klon UNQ219
(DNA35638) ist bei der ATCC am 17. September 1997 hinterlegt worden,
und es wurde ihm die ATCC-Hinterlegungsnummer 209265 zugeteilt.
-
BEISPIEL 4 (HINTERGRUND)
-
Inhibition
von VEGF-stimulierter Proliferation des Wachstums von Endothelzellen
Adrenokortikale Rinderkapillarendothelzellen (ACE) (aus primärer Kultur,
maximal 12–14
Passagen) wurden auf 96-Well-Mikrotiterplatten (Amersham Life Science)
bei einer Dichte von 500 Zellen/Well pro 100 μl in DMEM mit wenig Glukose,
10% Kälberserum,
2 mM Glutamin, 1 × pen/strept
und Fungizon, ergänzt
mit 3 ng/ml VEGF, ausplattiert. Kontrollen wurden auf dieselbe Art
und Weise ausplattiert, manche umfassten aber kein VEGF. Eine Testprobe des
PRO301- und PRO245-Polypeptids wurde in einem Volumen von 100 μl für ein Endvolumen
von 200 μl hinzugefügt. Zellen
wurden 6–7
Tage lang bei 37°C
inkubiert. Das Medium wurde abgesaugt und die Zellen einmal mit
PBS gewaschen. Ein Saure-Phosphatasereaktionsgemisch (100 μl, 0,1 M
Natriumacetat, pH 5,5, 0,1% Triton-100, 10 mM p-Nitrophenylphosphat)
wurde hinzugegeben. Nach Inkubation 2 Stunden lang bei 37°C wurde die
Reaktion durch Hinzufügung
von 10 μl
1 N NaOH gestoppt. OD wurde auf einem Mikrotiterplattenlesegerät bei 405
nm gemessen. Die Kontrollen waren keine Zellen, Zellen alleine,
Zellen + FGF (5 ng/ml), Zellen + VEGF (3 ng/ml), Zellen + VEGF (3
ng/ml) + TGF-β (1
ng/ml) und Zellen + VEGF (3 ng/ml) + LIF (5 ng/ml). (Von TGF-β bei einer
Konzentration von 1 ng/ml ist bekannt, dass es 70–90% von
VEGF-stimulierter Zellproliferation blockiert.)
-
Die
Ergebnisse wurden durch Berechnung der prozentuellen Hemmung von
mit VEGF (3 ng/ml) stimulierter Zellproliferation beurteilt, bestimmt
durch die Messung der Aktivität
von saurer Phosphatase bei OD
405 nm, (1)
in Bezug auf Zellen ohne Stimulation und (2) in Bezug auf die Referenz-TGF-β-Inhibition
von VEGF-stimulierter
Aktivität.
Die Ergebnisse, die in Tabelle 1 dargestellt sind, zeigen die Nützlichkeit
des PRO301- und PRO245-Polypeptids in der Inhibition von Zellwachstum,
insbesondere Krebstherapie und insbesondere Hemmung von Tumorangiogenese. Tabelle
1
Verbindung | Konzentration | Prozentuelle
Proliferation in Bezug auf die Kontrolle |
DNA40628-Protein
(Seq.-ID Nr. 1) | 7,0
nM | 1,02 |
DNA40628-Protein
(Seq.-ID Nr. 1) | 70,0
nM | 0,88 |
DNA40628-Protein
(Seq.-ID Nr. 1) | 700,0
nM | 0,44 |
DNA40628-Protein
(Seq.-ID Nr. 1) | 0,01% | 0,92 |
DNA40628-Protein
(Seq.-ID Nr. 1) | 0,1% | 0,85 |
DNA40628-Protein
(Seq.-ID Nr. 1) | 1,0% | 0,68 |
DNA35638-Protein
(Seq.-ID Nr. 9) | 0,01% | 0,76 |
DNA35638-Protein
(Seq.-ID Nr. 9) | 0,1% | 0,35 |
DNA35638-Protein
(Seq.-ID Nr. 9) | 1,0% | 0,11 |
DNA35638-Protein
(Seq.-ID Nr. 9) | 0,48
nM | 1,03 |
DNA35638-Protein
(Seq.-ID Nr. 9) | 4,8
nM | 0,95 |
DNA35638-Protein
(Seq.-ID Nr. 9) | 48,0
nM | 0,49 |
-
BEISPIEL 5
-
Stimulationsaktivität in einem Test der Reaktion
gemischter Lymphozyten (MLR)
-
Dieses
Beispiel zeigt, dass die Polypeptide der Erfindung als Stimulator
der Proliferation von stimulierten T-Lymphozyten aktiv sind. Verbindungen,
welche die Proliferation von Lymphozyten stimulieren, sind therapeutisch
nützlich,
wo die Verstärkung
einer Entzündungsreaktion
vorteilhaft ist. Verbindungen, welche die Proliferation von Lymphozyten
hemmen, sind therapeutisch nützlich,
wo eine Unterdrückung
der Entzündungsreaktion
besteht. Ein therapeutisches Mittel kann die Form von Antagonisten
des Polypeptids der Erfindung annehmen, z. B. murin-menschlicher
chimärer,
humanisierter oder menschlicher Antikörper gegen das Polypeptid.
-
Das
Basisprotokoll für
diesen Test ist in Current Protocol in Immunology, Kapitel 3.12,
J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Marglies, E.M. Shevach und W.
Strober, Hrsg., National Institutes of Health, veröffentlicht von
John Wiley & Sons,
Inc., beschrieben.
-
Genauer
werden in einer Testvariante mononukleare periphere Blutzellen (PBMC)
aus Säugetieren,
z. B. einem freiwilligen Menschen, durch Leukophorese isoliert (ein
Spender stellt stimulierende PBMCs bereit, der andere Responder-PBMCs).
Wenn erwünscht
werden die Zellen in fötalem
Rinderserum und DMSO nach Isolierung gefroren. Gefrorene Zellen
können über Nacht
in Testmedium (37°C,
5% CO2) aufgetaut und dann gewaschen und
auf 3 × 106 Zellen/ml Testmedium (RPMI, 10% fötales Rinderserum,
1% Penicillin/Streptomycin, 1% Glutamin, 1% HEPES, 1% nicht-essentielle Aminosäuren, 1%
Pyruvat) resuspendiert werden.
-
Die
Stimulatoren von PBMCs werden durch Bestrahlung der Zellen (etwa
3000 Rad) hergestellt. Der Test wird durch dreifaches Ausplattierung
von Wells eines Gemisches von: 100 μl Testprobe, verdünnt auf
1% von 0,1%, 50 μl
bestrahlter Stimulatorzellen und 50 μl von Responder-PBMC-Zellen
hergestellt. 100 μl
von Zellkulturmedium oder 100 ml von CD4-IgG wird als Kontrolle
verwendet. Die Wells werden dann bei 37°C, 5% CO2 4
Tage lang inkubiert. An Tag 5 wird jedes Well mit tritiiertem Thymidin
(1,0 mC/ Well, Amersham) pulsiert. Nach Stunden werden die Zellen
dreimal gewaschen, und dann wird die Aufnahme der Markierung bewertet.
-
In
einer anderen Variante dieses Tests werden PBMCs aus den Milzen
von Balb/c-Mäusen und C57B6-Mäusen isoliert.
Die Zellen werden aus frisch geernteten Milzen in Testmedium (RPMI,
10% fötales Rinderserum,
1% Penicillin/Streptomycin, 1% Glutamin, 1% HEPES, 1% nicht-essentielle
Aminosäuren,
1% Pyruvat} gewonnen und die PBMCs durch Überlagerung dieser Zellen über Lympholyt-M
(Organon Teknika), Zentrifugieren bei 2000 U/min 20 min lang, Gewinnung
und Waschung der mononuklearen Zellschicht in Testmedium und Resuspension
der Zellen auf 1 × 10
7 Zellen/ml Testmedium isoliert. Der Test
wird dann wie oben beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse dieses
Tests für
Verbindungen der Erfindung sind in Tabelle 2 dargestellt. Positive
Zunahmen in Bezug auf die Kontrolle werden mit Zunahmen von mehr
als oder gleich viel wie 180%, was bevorzugt ist, als positiv erachtet.
Jedoch zeigt jeder Wert über
jenem der Kontrolle eine stimulierende Wirkung für das Testprotein an. Tabelle
2
Verbindung | Konzentration | Prozentueller
Anstieg in Bezug auf die Kontrolle |
DNA40628-Protein
(Seq.-ID Nr. 1) | 0,1% | 181,7 |
DNA40628-Protein
(Seq.-ID Nr. 1) | 1,0% | 187,3 |
DNA40628-Protein
(Seq.-ID Nr. 1) | 0,1% | 193,4 |
DNA40628-Protein
(Seq.-ID Nr. 1) | 1,0% | 204,1 |
| | |
DNA45416-Protein
(Seq.-ID Nr. 2) | 0,1% | 87,4 |
DNA45416-Protein
(Seq.-ID Nr. 2) | 1,0% | 180,2 |
| | |
DNA35638-Protein
(Seq.-ID Nr. 9) | 0,1% | 189,7 |
DNA35638-Protein
(Seq.-ID Nr. 9) | 0,1% | 193,7 |
DNA35638-Protein
(Seq.-ID Nr. 9) | 1,0% | 212,5 |
DNA35638-Protein
(Seq.-ID Nr. 9) | 1,0% | 300,5 |
-
BEISPIEL 6
-
Entzündete
Zelle infiltriert in Meerschweinchenhaut
-
Das
folgende Beispiel zeigt, dass die Polypeptide der Erfindung proentzündlich sind,
insofern, als dass sie Infiltrate von entzündeten Zellen (d. h. neutrophile,
eosinophile, monozytische oder lymphozytische) in Meerschweinchenhaut
stimulieren. Der hierin beschriebene Test überwacht die Kapazität jedes
Proteins, ein Infiltrat einer entzündeten Zelle in die Haut eines
Meerschweinchens zu induzieren. Verbindungen, die Entzündungsinfiltration
stimulieren, sind therapeutisch nützlich, wo eine Verstärkung einer
Entzündungsreaktion
von Vorteil ist. Verbindungen, welche die Proliferation von Lymphozyten
hemmen, sind therapeutisch nützlich,
wo die Unterdrückung
einer Entzündungsreaktion
von Vorteil ist. Ein therapeutisches Mittel kann die Form von Anta gonisten
der Polypeptide der Erfindung annehmen, zum Beispiel murin-menschliche
chimäre,
humanisierte oder menschliche Antikörper gegen das Polypeptid.
-
Haarlose
Meerschweinchen (Charles River Labs), die 350 Gramm oder mehr wiegen,
werden mit Ketamin (75–80
mg/kg Körpergewicht)
und Xylazin (5 mg/kg Körpergewicht)
intramuskulär
anästhesiert.
Die Proteinproben werden intradermal auf die Rücken jedes Tiers in einem Volumen
von 100 μl
pro Injektionsstelle injiziert. Es gibt etwa 16–24 Injektionsstellen pro Tier.
Ein ml von Evans-Blau-Farbstoff (1% in physiologischer gepufferter
Salzlösung)
wird intrakardial injiziert. Die Tiere werden nach 6 Stunden getötet. Jede
Hautinjektionsstelle wird biopsiert und in Formalin fixiert. Die
Häute werden
für histopathologische
Evaluierung vorbereitet. Jede Stelle wird auf Infiltration von entzündeten Zellen
in die Haut überprüft. Haut
mit sichtbaren entzündeten
Zellen wird als positiv bewertet. Proben, die ein Infiltrat von
entzündeten
Zellen induzieren, werden als proentzündliche Substanzen bewertet. Tabelle
3
Verbindung | Proentzündliche
Aktivität |
DNA40628-Protein
(Seq.-ID Nr. 1) | + |
DNA45416-Protein
(Seq.-ID Nr. 2) | + |
DNA35638-Protein
(Seq.-ID Nr. 9) | + |
Negative
Kontrolle | – |
-
BEISPIEL 7 (HINTERGRUND)
-
Wechselwirkung mit menschlichen Neutrophilen
-
Das
folgende Beispiel zeigt die Fähigkeit
der Polypeptide der Erfindung, an menschliche Neutrophilen, ein
mit Entzündungen
und der Entzündungsreaktion
assoziiertes Molekül,
zu binden.
-
Neutrophile,
die wie in Scan. J. Clin. Lab. Invest. Suppl 97, 51–76 (1968),
beschrieben aus dem Blut von menschlichen Spendern (PMN) isoliert
worden waren, wurden mit einer Ig-Fusion eines Proteins, für das DNA40628
kodiert (wie in den folgenden Beispielen erläutert hergestellt), oder mit
einem humanisierten Antikörper
als negative Kontrolle inkubiert.
-
Die
PMNs wurden in einem Mikrozentrifugenröhrchen in PBS mit einer Dichte
von 2 × 106 Zelläquivalenten
pro Leiden resuspendiert. Die Zellen wurden zweimal mit eiskaltem
PBS gewaschen und zwischen den Waschvorgängen bei 400 × g pelletiert.
Die PMN-Zellen wurden mit 0,5 BSA in PBS (Blockierreagens) 1 h lang bei
4°C blockiert.
Nach der Inkubation wurden die Zellen weitere zweimal mit einem
Blockierreagens gewaschen. Die PMNs wurden nach dem letzten Waschschritt
pelletiert und in 1 ml Blockierpuffer mit 0,1 μg/ml an DNA40628-Protein bzw.
Kontroll-Antikörper
resuspendiert. Die Inkubation wurde 2 h lang bei 4°C durchgeführt. Die
PMN-Zellen wurden alle 15 min vorsichtig auf Eis resuspendiert,
dann gewaschen und 5-mal in einem Blockierpuffer pelletiert, wobei
jeder Waschvorgang 5 min lang bei 4°C durchgeführt wurde und das Pelletieren
bei 400 × g
erfolgte. Eine 1:1000-Verdünnung
von Fc-spezifischem alkalische-Phosphatase-gebundenem Ziegen- und
Antimensch-IgG im Blockierpuffer wurden dann an den PMN-Zellen angewendet.
Die PMN-Zellen wurden 1 h lang bei 4°C inkubiert, wobei sie alle
15 min vorsichtig auf Eis durchmischt wurden. Die PMN-Zellen wurden
dann 5-mal mit einem Blockierpuffer gewaschen, im geeigneten Substrat
für alkalische
Phosphatase resuspendiert und in 4 äquivalenten 100-μl-Aliquoten
auf einer Mikrotiterplatte verteilt. Die Farbentwicklung wurde bei
einer O.D. von 405 abgelesen. Die Ergebnisse sind in 21 zu sehen.
-
BEISPIEL 8 (HINTERGRUND)
-
Dot-Blot-Gewebehybridisierung
-
Ein
menschlicher RNA-Master-Blot (Clontech) wurde über Nacht bei 65°C in einem
Expresshyb©-Puffer
(Clontech) laut den Anweisungen des Herstellers mit 100 nM Psoralen-Biotin-markierter
DNA40628-cDNA-Sonde (Seq.-ID Nr. 7) hybridisiert. Streptavidin-alkalische-Phosphatase
wurde verwendet, um die biotinylierte Sonde zu detektieren. Der
Blot wurde mit CDP-Star-Substrat (Ambion) entwickelt und mehrere Male
auf einem Biomax-Film (Kodak) belichtet. Eine cDNA-Hybridisierungsanalyse
von menschlichen Geweben zeigte, dass DNA40628-mRNA in vielen Geweben
exprimiert wird, mit Ausnahme des Cerebellums und des Rückenmarks,
wie in 19 zu sehen ist. DNA40628-mRNA
wird im Colon, in der Prostata, im Magen, im O-varium, in der Speicheldrüse, in der
Niere, in der Lunge, in der Luftröhre und in der Plazenta stark
exprimiert.
-
BEISPIEL 9
-
Genproduktüberexpression
-
Dieses
Beispiel zeigt, dass Gene, die für
verschiedene Proteine kodieren, die in 20 angezeigt sind,
in Kolitiscolon von CRF2-4-(–/–)-„Knockout"-Mäusen überexprimiert
werden. Therapeutische Mittel können
die Form von Antagonisten der angegebenen Genprodukte annehmen,
zum Beispiel murin-humane chimäre,
humanisierte oder menschliche Antikörper dagegen.
-
CRF2-4-(–/–)-Mäuse (Spencer
et al., J. Exp. Med. 187, 571–578
(1998)) sind Tiere, bei welchen eine Untereinheit des Gens entfernt
wurde, das für
den IL-10-Rezeptor kodiert. Die Mäuse reagieren nicht auf die herabregulierende
Funktion von IL-10 für
Makrophagenaktivierung und können
eine Antwort auf Lipopolysaccharidauslösung der Makrophagen-TNF-α-Sekretion
nicht herabregulieren. Sie entwickeln eine chronische Colitis, die
zu Colonadenokarzinom führen
kann.
-
Die
Sonden für
die in 20 angegebenen Proteine wurden
aus mRNA-Matrizen für
die angegebenen Genprodukte geschaffen und im 5'-Nucleasetest (z. B. TaqManTM)
und quantitativer Echtzeit-PCR (z. B. ABI Prizm 7700 Sequence Detection
SystemTM (Perkin-Elmer, Applied Biosystems
Division, Foster City, CA)) verwendet. Die Ergebnisse sind in Delta-CT-Einheiten
dargestellt. Eine Einheit entspricht 1 PCR-Zyklus oder etwa einer
doppelten Amplifikation in Bezug zum Normalen, zwei Einheiten entsprechen
4fach, 3 Einheiten 8fach etc. Quantifizierung wurde unter Einsatz
von Primern und einer fluoreszenzmarkierten TaqManTM-mRNA
erhalten, die von den getesteten, mit Entzündung in Verbindung stehenden
Genprodukten abstammen, die in 20 gezeigt
werden. Regionen der angezeigten Genprodukte, die am wahrscheinlichsten
einzigartige Nucleinsäuresequenzen
sind und am wenigsten wahrscheinlich ausgespleißte Introns haben, sind für die Primerderivatisierung
bevorzugt, z. B. nichttranslatierte 3'-Region.
-
Die
5'-Nucleasetestreaktion
ist ein auf Fluoreszenz-PCR basierendes Verfahren, das die 5'-Exonucleaseaktivität von Taq-DNA-Polymeraseenzym
verwendet, um Amplifikation in Echtzeit zu überwachen. Zwei Oligonucleotidprimer
werden dazu verwendet, ein Amplicon zu erzeugen, das für eine PCR-Reaktion
typisch ist. Es wurde ein drittes Oligonucleotid oder Sonde hergestellt,
um die Nucleotidsequenz zu detektieren, die sich zwischen den zwei
PCR-Primern befindet. Die Sonde ist durch Taq-DNA-Polymeraseenzym nicht verlängerbar
und wird mit einem ausgewiesenen Fluoreszenzfarbstoff und einem
Quencherfluoreszenzfarbstoff markiert. Jegliche laserinduzierte
Emission aus dem Reporterfarbstoff wird durch Quenching-Farbstoff
gequencht, wenn sich die zwei Farbstoffe nahe beieinander befinden
wie auf der Sonde. Während
der Amplifikationsreaktion wird die Sonde durch Taq-DNA-Polymeraseenzym
in einer matrizenabhängigen
Art gespalten. Die resultierenden Sondenfragmente trennen sich in
Lösung,
und das Signal aus dem Freisetzungreporterfarbstoff ist frei von
der Quenchingwirkung des zweiten Fluoreszenzfarbstoffs. Ein Molekül des Reporterfarbstoffs
wird für jedes
synthetisierte neue Molekül
freigesetzt, und die Detektion des nicht gequenchten Reporterfarbstoffs
stellte die Grundlage für
die quantitative Dateninterpretation bereit.
-
Das
5'-Nucleaseverfahren
wird auf einem quantitativen PCR-Gerät in Echtzeit laufen gelassen,
wie z. B. ABI Prism 770TM Sequence Detection.
Das System besteht aus einem Thermocycler, Laser, einer Kamera mit
hochauflösendem
Bildpunktfeld (CDD) und Computer. Das System amplifiziert Proben
in einem 96-Well-Format auf einem Thermocycler. Während der
Amplifikation wird ein laserinduziertes Fluoreszenzsignal in Echtzeit
durch Faseroptikkabel für
alle 96 Wells gewonnen und am CCD detektiert. Das System umfasst Software
zum Betreiben des Geräts
und zur Analyse der Daten.
-
Die
5'-Nucleasetestdaten
werden anfänglich
als Ct oder Schwellenzyklus ausgedrückt. Dies wird als jener Zyklus
definiert, an welchem sich das Reportersignal über dem Hintergrundausmaß von Fluoreszenz
akkumuliert. Die Ct-Werte werden als quantitatives Maß der relativen
Zahl von Startkopien einer bestimmten Targetsequenz in einer Nucleinsäureprobe
verwendet.
-
Die
Ergebnisse der mRNA-Amplifikation sind in 20 dargestellt.
Expression in Wildtyptieren wurde mit CRF2.4-KO-Tieren mit Beta-Actin
als Referenzstandard verglichen. In jeder Gruppe wurden vier Tiere
gemessen. Bei allen vier KO-Tieren wurde Colitis festgestellt, und
zusätzlich
dazu wiesen drei davon ein Colonadenokarzinom auf.
-
18 zeigt, dass JAM-mRNA 3,3fach im Colon von CRF2-4-(–/–)-Mäusen mit
Colitis erhöht
ist. Diese Mäuse
sind IL-10-Rezeptorknockouts, die eine spontane Colitis entwickeln,
die durch Lymphozyten, Monozyten und Neutrophile vermittelt wird.
IL-10 unterdrückt
die Entzündungsreaktion
durch Modulation der Expression bestimmter entzündlicher Cytokine.
-
Als
Ergebnis ist es wahrscheinlich, dass PRO301, PRO362 und PRO245 auch
erhöhte
Expression bei menschlichen Entzündungskrankheiten
aufweist, wie z. B. entzündliche
Darmerkrankung und andere Entzündungserkrankungen
des Darms.
-
BEISPIEL 10 (HINTERGRUND)
-
Induktion von Endothelzellapoptose
-
Die
Fähigkeit
der Polypeptide der Erfindung, Apoptose in Endothelzellen zu induzieren,
wurde in Endothelzellen einer menschlichen Nabelschnurvene (HUVEC,
Cell Systems) getestet. Am ersten Tag wurden die Zellen auf 96-Well-Mikrotiterplatten
(Amersham Life Science, Cytostar-T-Szintillationsmikroplatte, RPNQ160,
steril, gewebskulturbehandelt, individuell verpackt) in 10% Serum
(CSG-Medium, Cell Systems) bei einer Dichte von 2 × 10
4 Zellen pro Well in einem Gesamtvolumen
von 100 μl
ausplattiert. Am zweiten Tag wurden ein PRO301- und ein PRO245-Polypeptid,
für welche
die DNA40628 bzw. die DNA35638 kodierten, in dreifacher Form in
Verdünnungen
von 1%, 0,33% und 0,11% hinzugefügt.
Am dritten Tag wurde die Fähigkeit der
PRO301- und PRO245-Polypeptide, Apoptose zu induzieren, unter Verwendung
eines im Handel erhältlichen
Sets bestimmt. Ein Apoptose-Detektionsset (R&D Systems, Minnesota), in welchem
Annexin-V, ein Mitglied der Kalzium- und Phospholipidbindungsproteine,
wird zur Detektion von Apoptose gemäß dem vom Hersteller empfohlenen
Protokoll eingesetzt. Fluorescein-markiertes Annexin-V und Propidiumiodid
wurden zu den Zellen hinzugefügt.
Analyse wurde mit Cytometern durchgeführt, die mit einem einzelnen
Laser ausgestattet waren, der Anregungslicht bei 488 nm emittiert.
In diesem Test werden lebende Zellen mit keinem Fluoreszenzfarbstoff
gefärbt,
nekrotische Zellen werden mit beiden Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt, und
Zellen, die Apoptose unterworfen werden, werden mit Annexin-V-FITC-Reagens
gefärbt.
Das durch Annexin-V-FITC erzeugte Signal wurde im FITC-Signaldetektor
detektiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 nachstehend angeführt. Tabelle
4
Getestete
Verbindung | Konzentration | %
im Vergleich zur Hintergrundfluoreszenz |
DNA40628-Protein
(Seq.-ID Nr. 1) | 0,11% | 115,8 |
DNA40628-Protein
(Seq.-ID Nr. 1) | 0,33% | 199,3 |
DNA40628-Protein
(Seq.-ID Nr. 1) | 1,0% | 335,6 |
DNA35638-Protein
(Seq.-ID Nr. 9) | 0,11% | 77,6 |
DNA35638-Protein
(Seq.-ID Nr. 9) | 0,33% | 143,7 |
DNA35638-Protein
(Seq.-ID Nr. 9) | 1,0% | 146,0 |
DNA35638-Protein
(Seq.-ID Nr. 9) | 6,82
nM | 67,2 |
DNA35638-Protein
(Seq.-ID Nr. 9) | 20,46
nM | 102,6 |
DNA35638-Protein
(Seq.-ID Nr. 9) | 62,0
nM | 118,8 |
-
Die
Fähigkeit
der Proteinverbindungen der Erfindung, Endothelzellapoptose zu induzieren,
insbesondere in Kombination mit der Zerstörung der Zellbindungsformation,
wie in Beispiel 4 beschrieben, zeigt, dass die Verbindungen Rollen
in der Zelladhäsi an
und -Transmigration spielen. Ähnlich
wie murines JAM sind die Verbindungen wahrscheinliche Zellbindungsmoleküle in Epithel
und Endothel, was ihre ausgedehnte Gewebsverteilung erklärt. Die
Zerstörung
der Induktion von Endothelzellapoptose unterstützt eine Rolle in Zellwachstum
und Apoptose.
-
BEISPIEL 11
-
In-vitro-Antitumortest
-
Die
antiproliferative Aktivität
der PRO301- und PRO362-Polypeptide der Erfindung wurde im investigativen,
krankheitsorientierten In-vitro-Antikrebsarzneimittelentdeckungstest
des National Cancer Institutes (NCI) unter Verwendung von Sulforhodamin-B-(SRB-)Farbstoffbindungstest
bestimmt, im Wesentlichen wie von Skehan et al., J. Natl. Cancer
Inst. 82, 1107–1112
(1990), beschrieben. Die 60 Tumorzelllinien, die in dieser Studie
verwendet wurden („das
NCI-Panel"), sowie
die Bedingungen für
deren Aufrechterhaltung und Kultur in vitro sind von Monks et al.,
J. Natl. Cancer Inst. 83, 757–766
(1991), beschrieben worden. Der Zweck dieses Screens ist es, anfänglich die
zytotoxische und/oder zytostatische Aktivität der Testverbindungen gegen
verschiedene Formen von Tumoren zu beurteilen (Monks et al., siehe
oben, Boyd, Cancer: Princ. Pract. Oncol. Update 3 (10), 1–12 (1989)).
-
Zellen
aus etwa 60 menschlichen Tumorzelllinien wurden mit Trypsin/EDTA
(Gibco) geerntet, einmal gewaschen, in IMEM resuspendiert, und ihre
Lebensfähigkeit
wurde bestimmt. Die Zellsuspensionen wurden in separate 96-Well-Mikrotiterplatten
durch eine Pipette (100 μl
Volumen) hinzugefügt.
Die Zelldichte für
die 60-tägige
Inkubation war geringer als für
die 20-tägige
Inkubation, um übermäßiges Wachstum
zu vermeiden. Inokulaten wurde eine Präinkubationsperiode von 24 Stunden
bei 37°C
zur Stabilisierung ermöglicht.
Verdünnungen
auf das Doppelte der beabsichtigten Testkonzentration wurden zum
Zeitpunkt null in 100-ml-Aliquoten zu den Mikrotiterplattenwells
hinzugefügt
(Verdünnung
1:2). Testverbindungen wurden bei halb-log-Verdünnungen
(1000 bis 100000fach) beurteilt. Inkubationen fanden zwei Tage lang
und sechs Tage lang in einer 5-%-CO2-Atmosphäre und 100%
Feuchtigkeit statt.
-
Nach
Inkubation wurde das Medium entfernt, und die Zellen wurden in 0,1
ml von 10% Trichloressigsäure
bei 40°C
fixiert. Die Platten wurden fünfmal
mit entionisiertem Wasser gespült,
getrocknet, 30 Minuten lang mit 0,1 ml 0,4% Sulforhodamin-B-Farbstoff (Sigma)
gefärbt,
der in 1% Essigsäure
gelöst
war, viermal mit 1% Essigsäure
gespült,
um ungebundenen Farbstoff zu entfernen, getrocknet, und der Farbstoff
wurde 5 Minuten lang mit 0,1 ml von 10 mM Tris-Base [Tris(hydroxymethyl)aminomethan],
pH 10,5, extrahiert. Die Absorption (OD) von Sulforhodamin-B bei
492 nm wurde unter Verwendung eines 96-Well-Mikrotiterplattenlesegeräts mit Computer-Schnittstelle
gemessen.
-
Eine
Testprobe wird als positiv erachtet, wenn sie zumindest 50% Wachstumshemmwirkung
in einer oder mehreren Konzentrationen zeigt. Die Ergebnisse sind
in den folgenden Tabellen dargestellt, wo die Abkürzungen
Folgende sind:
- NSCL
- = nicht-kleinzelliges
Lungenkarzinom
- ZNS
- = zentrales Nervensystem
- Leuk
- = Leukämie
Tabelle 5 Testverbindung | Konzentration | Testlänge | Tumorzelllinie |
Typ | Bezeichnung |
DNA40628-Protein
(Seq.-ID Nr. 1) | 0,075
nM | 6 | Colon-Melanom | HCC-2998
M14 |
DNA40628-Protein
(Seq.-ID Nr. 1) | 700
nM | 6 | Melanom | M14 |
DNA40628-Protein
(Seq.-ID Nr. 1) | 152
nM | 6 | Colon-Melanom | SR
LOX IMVI |
DNA40628-Protein
(Seq.-ID Nr. 1) | 15,2
nM | 6 | Melanom | LOX
IMVI |
DNA40628-Protein
(Seq.-ID Nr. 1) | 0,85
nM | 6 | NSCL
Ovarium Prostata | HOP62
OVCAR-3 PC3 |
DNA45416-Protein
(Seq.-ID Nr. 2) | 15
nM | 2 | Ovarium | SK-OV-3 |
DNA45416-Protein
(Seq.-ID Nr. 2) | 15
nM | 6 | NSCL
Prostata | NCI-H322M
PC-3 |
DNA45416-Protein
(Seq.-ID Nr. 2) | 4,7
nM | 6 | Melanom | LOX
IMVI |
DNA45416-Protein
(Seq.-ID Nr. 2) | 47
nM | 6 | NSCL
Colon | NCI-H322M
Colo 205 |
DNA45416-Protein
(Seq.-ID Nr. 2) | 152
nM | 2 | ZNS
Brust | SR-295
T047D |
DNA45416-Protein
(Seq.-ID Nr. 2) | 152
nM | 6 | Leuk
NSCL
Colon ZNS Melanom | SR,
HL-60 (TB), MOLT-4, K-562 NCI-H23, EKVX HCC-2998 U251 UACC-62, UACC-257, LOX IMVI |
DNA35638-Protein
(Seq.-ID Nr. 9) | 0,35
nM | 2 | NSCL
Ovarium | HOP92
OVCAR-4 |
DNA35638-Protein
(Seq.-ID Nr. 9) | 0,35
nM | 2 | Leuk | SR |
DNA35638-Protein
(Seq.-ID Nr. 9) | 0,35
nM | 6 | Colon | HCC-2998 |
DNA35638-Protein
(Seq.-ID Nr. 9) | 3,5
nM | 6 | Leuk
Colon | SR
SW-620 |
DNA35638-Protein
(Seq.-ID Nr. 9) | 6,2
nM | 6 | Colon | HCT-116 |
DNA35638-Protein
(Seq.-ID Nr. 9) | 6,2
nM | 6 | Leuk | RPMI-8226 |
-
BEISPIEL 12
-
Verwendung von PRO362 als Hybridisierungssonde
-
Das
folgende Verfahren beschreibt die Verwendung einer Nucleotidsequenz,
die für
ein PRO362 kodiert, als Hybridisierungssonde.
-
DNA,
welche die kodierende Sequenz des Nativsequenz-PRO362 (wie in 6, Seq.-ID Nr. 7 dargestellt) umfasst,
wird als Sonde zum Screenen auf homologe DNAs (wie z. B. jene, die
für natürlich auftretende Varianten
von PRO362 kodieren) in menschlichen Gewebs-cDNA-Bibliotheken oder
menschlichen genomischen Gewebsbibliotheken verwendet.
-
Hybridisierung
und Waschung von Filtern, die beide Bibliotheks-DNAs enthalten,
werden unter den folgenden Bedingungen hoher Stringenz durchgeführt. Hybridisierung
von radiomarkierter, von PRO362 abstammender Sonde an die Filter
wird in einer Lösung
von 50% Formamid, 5 × SSC,
0,1% SDS, 0,1% Natriumpyrophosphat, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8,
2 × Denhardt-Lösung und
10% Dextransulfat bei 42°C
20 Stunden lang durchgeführt.
Waschung der Filter wird in einer wässrigen Lösung von 0,1 × SSC und
0,1% SDS bei 42°C durchgeführt.
-
DNA
mit einer gewünschten
Sequenzidentität
mit der DNA, die für
ein Nativsequenz-PRO362
voller Länge
kodiert, kann dann unter Einsatz von fachbekannten Standardverfahren
identifiziert werden.
-
BEISPIEL 13
-
Expression von PRO362 in E. coli
-
Dieses
Beispiel veranschaulicht die Herstellung einer nicht-glykosylierten
Form von PRO362 durch rekombinante Expression in E. coli.
-
Die
DNA-Sequenz, die für
PRO362 kodiert, wird anfänglich
unter Verwendung ausgewählter
PCR-Primer amplifiziert. Die Primer sollen Restriktionsenzymstellen
um fassen, die den Restriktionsenzymstellen auf dem ausgewählten Expressionsvektor
entsprechen. Es kann eine Vielzahl von Expressionsvektoren verwendet
werden. Ein Beispiel für
einen geeigneten Vektor ist pBR322 (von E. coli abstammend, siehe
Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)), das Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz
enthält.
Der Vektor wird mit Restriktionsenzym verdaut und dephosphoryliert.
Die PCR-amplifizierten
Sequenzen werden dann in den Vektor ligiert. Der Vektor umfasst
vorzugsweise Sequenzen, die für
ein Antibiotikaresistenzgen kodieren, einen trp-Promotor, einen polyhis-Leader (einschließlich der
ersten sechs STII-Codons, poly-his-Sequenz
und Enterokinasespaltstelle), die für PRO362 kodierende Region,
lambda-Transkriptionsterminator und ein argU-Gen.
-
Das
Ligationsgemisch wird dann dazu verwendet, einen ausgewählten E.-coli-Stamm
unter Verwendung der in Sambrook et al., siehe oben, beschriebenen
Verfahren zu transformieren. Transformanten werden durch ihre Fähigkeit
identifiziert, auf LB-Platten
zu wachsen, und es werden antibiotikaresistente Kolonien ausgewählt. Plasmid-DNA
kann isoliert werden und durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung
nachgewiesen werden.
-
Ausgewählte Klone
können über Nacht
in flüssigem
Kulturmedium, wie z. B. LB-Kulturlösung, die
mit Antibiotika ergänzt
ist, gezüchtet
werden. Die Übernachtkultur
kann in der Folge dazu verwendet werden, eine Kultur in großem Maßstab zu
inokulieren. Die Zellen werden dann auf eine gewünschte optische Dichte gezüchtet, während welcher
der Expressionspromotor eingeschaltet wird.
-
Nach
Kultivieren der Zellen für
mehrere Stunden können
die Zellen durch Zentrifugation geerntet werden. Das durch Zentrifugation
erhaltene Zellpellet kann unter Einsatz verschiedener fachbekannter
Mittel solubilisiert werden, und das solubilisierte PRO301-, PRO362-
oder PRO245-Protein kann dann unter Einsatz einer metallchelatbildenden
Säule unter
Bedingungen gereinigt werden, die eine enge Bindung des Proteins ermöglichen.
-
PRO301
wurde unter Verwendung des folgenden Verfahrens in E. coli in einer
poly-his-markierten Form
exprimiert. Die für
PRO301 kodierende DNA wurde anfänglich
unter Verwendung ausgewählter
PCR-Primer amplifiziert. Die Primer enthielten Restriktionsenzymstellen,
die den Restriktionsenzymstellen am ausgewählten Expressionsvektor entsprachen,
und andere nützliche
Sequenzen, die für
effiziente und zuverlässige Translationsinitiation,
rasche Reinigung an einer Metallchelatbildungssäule und proteolytische Entfernung
mit Enterokinase sorgten. Die PCR-amplifizierten, poly-His-markierten
Sequenzen wurden anschließend
in einen Expressionsvektor ligiert, der verwendet wurde, um einen
E.-coli-Wirt, basierend auf Stamm 52, (W3110 fuhA(tonA) Ion galE
rpoHts(htpRts) clpP(lacIq)) zu transformieren. Die Transformanten
wurden zuerst in LB mit 50 mg/ml Carbenicillin bei 30°C unter Schütteln gezüchtet, bis
eine O.D. 600 von 3–5
erreicht war. Die Kulturen wurden 50- bis 100fach in CRAP-Medien
(hergestellt durch Vermischen von 3,57 g (NH4)2SO4, 0,71 g Natriumcitrat·2H2O, 1,07 g KCl, 5,36 g Difco-Hefeextrakt,
5,36 g Sheffield-Hycase SF in 500 ml Wasser sowie 110 mM MPOS, pH
7,3, 0,55% (Gew./Vol.) Glucose und 7 mM MgSO4)
verdünnt
und etwa 20–30
Stunden lang bei 30°C unter
Schütteln
gezüchtet.
Proben wurden entfernt, um Expression mittels SDS-PAGE-Analyse zu überprüfen, und
der Großteil
der Kultur wurde zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Zellpellets
wurden bis zur Reinigung und Neufaltung eingefroren.
-
E.-coli-Paste
aus 0,5- bis 1-l-Fermentationen (6–10 g Pellets) wurde in 10
Volumina (Gew./Vol.) in 7 M Guanidin, 20 mM Tris-Puffer, pH 8, resuspendiert.
Festes Natriumsulfit und Natriumtetrathionat wurden zugesetzt, um
die Endkonzentrationen von 0,1 M bzw. 0,02 M herzustellen, und die
Lösung
wurde über
Nacht bei 4°C
gerührt.
Dieser Verfahrensschritt resultierte in einem denaturierten Protein,
in dem alle Cysteinreste durch Sulfitolisierung blockiert waren.
Die Lösung
wurde bei 40.000 U/min in einer Beckman-Ultrazentrifuge 30 Minuten
lang zentrifugiert. Der Überstand
wurde mit 3–5
Volumina Metallchelatsäulen-Puffer
(6 M Guanidin, 20 mM Tris, pH 7,4) verdünnt und durch 0,22-μm-Filter
filtriert, um ihn zu klären.
Eventuell wurde der geklärte
Extrakt auf eine 5-ml-Qiagen-Ni-NTA-Metallchelatsäule geladen,
die im Metallchelatsäulenpuffer äquilibriert
worden war. Die Säule
wurde mit zusätzlichem
Puffer, der 50 mM Imidazol (Calbiochem, Utrol-Gütegrad), pH 7,4, enthielt,
gewaschen.
-
Das
Protein wurde mit 250 mM Imidazol enthaltendem Puffer eluiert. Fraktionen,
die das erwünschte Protein
enthielten, wurden gepoolt und bei 4°C gelagert. Die Proteinkonzentration
wurde durch seine Absorption bei 280 nm unter Verwendung des auf
Grundlage seiner Aminosäuresequenz
berechneten Extinktionskoeffizienten berechnet.
-
Das
Protein wurde durch langsames Verdünnen der Probe in frisch vorbereiteten
Rückfaltungspuffer aus
20 mM Tris, pH 8,6, 0,3 M NaCl, 2,5 M Harnstoff, 5 mM Cystein, 20
mM Glycin und 1 mM EDTA rückgefaltet.
Die Rückfaltungsvolumina
wurden so gewählt,
dass die endgültige
Proteinkonzentration im Bereich zwischen 50 bis 100 μg/ml lag.
Die Rückfaltungs-Lösung wurde
bei 4°C
12–36
Stunden lang leicht gerührt.
Die Rückfaltungs-Reaktion
wurde durch Zusatz von TFA auf eine Endkonzentration von 0,4% (pH
etwa 3) gequencht. Vor weiterer Reinigung des Proteins wurde die
Lösung
durch einen 0,22-μm-Filter
filtriert, und Acetonitril wurde zugesetzt, sodass eine Endkonzentration
von 2 bis 10% erhalten wurde. Das rückgefaltete Protein wurde mittels
Chromatographie auf einer Poros-R1/H-Umkehrphasensäule unter
Verwendung eines mobilen Puffers aus 0,1% TFA unter Elution mit
einem Gradienten aus Acetonitril von 10 bis 80% untersucht. Aliquoten von
Fraktionen mit A280-Extinktion
wurden auf SDS-Polyacrylamidgelen analysiert, und Fraktionen, die
homogene, rückgefaltete
Proteine enthielten, wurden gepoolt. Im Allgemeinen werden die korrekt
rückgefalteten Spezies
der meisten Proteine bei geringsten Konzentrationen von Acetonitril
verdünnt,
da diese Spezies die kompaktesten sind, deren hydrophobes Innere
von Wechselwirkungen mit dem Umkehrphasenharz geschützt ist.
Aggregierte Spezies werden üblicherweise
bei höheren
Acetonitril-Konzentrationen eluiert. Zusätzlich zum Auflösen fehlgefalteter
Proteine von der erwünschten
Form entfernt der Umkehrphasenschritt auch Endotoxin aus den Proben.
-
Fraktionen,
die das erwünschte
gefaltete PRO301-Protein enthielten, wurden gepoolt, und Acetonitril wurde
unter Verwendung eines schwachen Stickstoffstroms, der auf die Lösung gerichtet
war, entfernt. Proteine wurden in 20 mM Hepes, pH 6,8, mit 0,14
M Natriumchlorid und 4% Mannit durch Dialyse oder Gelfiltrierung unter Verwendung
von G25-Superfine-Harzen (Pharmacia), äquilibriert im Formulierungspuffer,
formuliert und steril filtriert.
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BEISPIEL 14
-
Expression von PRO362 in Säugetierzellen
-
Dieses
Beispiel veranschaulicht die Herstellung einer glykosylierten Form
eines PRO362 durch rekombinante Expression in Säugetierzellen.
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Der
Vektor pRK5 (siehe
EP 307.247 ,
veröffentlicht
am 15. März
1989) wird als Expressionsvektor verwendet. Gegebenenfalls ist die
PRO362-DNA in pRK5 unter Verwendung von Ligationsverfahren, wie
z. B. in Sambrook et al., siehe oben, beschrieben, mit ausgewählten Restriktionsenzymen
ligiert, um Insertion von PRO362-DNA
zu ermöglichen.
Der resultierende Vektor wird pRK5-PRO362 genannt.
-
In
einer Ausführungsform
können
die gewählten
Wirtszellen 293-Zellen sein. Menschliche 293-Zellen (ATCC CCL 1573)
werden in Gewebskulturplatten in Medium, wie z. B. DMEM, das mit
fötalem
Kälberserum und
optional Nährstoffkomponenten
und/oder Antibiotika ergänzt
ist, bis zur Konfluenz gezüchtet.
Etwa 10 μg pRK5-PRO362-DNA werden
mit etwa 1 μg
DNA gemischt, die für
das VA-RNA-Gen kodiert (Thimmappaya et al., Cell 31, 543 (1982)],
und in 500 μl
von 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl2 gelöst. Zu diesem Gemisch
werden tröpfchenweise
500 μl von
50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO4 hinzugefügt, und
ein Präzipitat
wird 10 Minuten lang bei 25°C
gebildet. Das Präzipitat
wird suspendiert und zu den 293-Zellen hinzugegeben und etwa vier
Stunden bei 37°C
absetzen gelassen. Das Kulturmedium wird abgesaugt, und 2 ml von
20% Glycerin in PBS wird 30 Sekunden lang hinzugegeben. Die 293-Zellen
werden dann mit serumfreiem Medium gewaschen, frisches Medium wird
hinzugegeben, und die Zellen werden etwa 5 Tage lang inkubiert.
-
Etwa
24 Stunden nach den Transfektionen wird das Kulturmedium entfernt
und durch ein Kulturmedium (alleine) oder ein Kulturmedium ersetzt,
das 200 μCi/ml 35S-Cystein
und 200 μCi/ml 35S-Methionin enthält. Nach einer 12-stündigen Inkubation
wird das konditionierte Medium gewonnen, auf einem Zentrifugenfilter konzentriert
und auf ein 15% SDS-Gel geladen. Das verarbeitete Gel kann getrocknet
und für
einen ausgewählten
Zeitraum Film ausgesetzt werden, um die Gegenwart von PRO362-Polypeptid
zu zeigen. Die Kulturen, die transfizierte Zellen enthielten, können weiterer
Inkubation unterworfen werden (in serumfreiem Medium), und das Medium
wird in ausgewählten
Biotests getestet.
-
In
einem alternativen Verfahren kann PRO362-DNA in 293-Zellen vorübergehend
unter Verwendung des von Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
12, 7575 (1981), beschriebenen Dextransulfatverfahrens eingeführt werden.
293-Zellen werden in einer Spinnerflasche auf maximale Dichte gezüchtet, und
700 μg pRK5-PRO362-DNA
werden hinzugegeben. Die Zellen werden zuerst durch Zentrifugation
aus der Spinnerflasche konzentriert und mit PBS gewaschen. Das DNA-Dextran-Präzipitat
wird auf dem Zellpellet 4 Stunden lang inkubiert. Die Zellen werden
mit 20% Glycerin 90 Sekunden lang behandelt, mit Gewebskulturmedium
gewaschen und wieder in die Spinnerflasche eingeführt, die
das Gewebskulturmedium, 5 μg/ml
Rinderinsulin und 0,1 μg/ml
Rindertransferrin enthält.
Nach etwa 4 Tagen wird das konditionierte Medium zentrifugiert und
filtriert, um Zellen und Trümmer
zu entfernen. Die Probe, die exprimiertes PRO362 enthielt, kann
dann konzentriert und durch ein beliebiges ausgewähltes Verfahren
gereinigt werden, wie z. B. Dialyse und/oder Säulenchromatographie.
-
In
einer anderen Ausführungsform
kann PRO362 in CHO-Zellen exprimiert werden. Das PRK5-PRO362 kann
in CHO-Zellen unter Einsatz bekannter Reagenzien, wie z. B. CaPO4 oder DEAE-Dextran, transfiziert werden.
Wie oben beschrieben können
die Zellkulturen inkubiert werden und das Medium durch ein Kulturmedium
(alleine) oder ein Medium ersetzt werden, das eine Radiomarkierung,
wie z. B. 35S-Methionin, enthält. Nach
der Bestimmung der Gegenwart von PRO362-Polypeptid kann das Kul turmedium
durch serumfreies Medium ersetzt werden. Vorzugsweise werden die
Kulturen etwa 6 Tage lang inkubiert, und dann wird das konditionierte
Medium geerntet. Das Medium, welches das exprimierte PRO362 enthält, kann
dann konzentriert und durch ein beliebiges ausgewähltes Verfahren
gereinigt werden.
-
Epitopmarkiertes
PRO362 kann auch in Wirts-CHO-Zellen exprimiert werden. Das PRO362
kann aus dem pRK5-Vektor subkloniert werden. Das Subkloninsert kann
PCR unterzogen werden, um im Raster mit einer ausgewählten Epitopmarkierung,
wie z. B. Poly-his-Markierung, in einen Baculovirus-Expressionsvektor
zu fusionieren. Das poly-his-markierte PRO362-Insert kann dann in
einen SV40-gesteuerten Vektor subkloniert werden, der einen Selektionsmarker,
wie z. B. DHFR, zur Selektion von stabilen Klonen enthält. Letztendlich können die
CHO-Zellen (wie oben beschrieben) mit dem SV40-gesteuerten Vektor
transfiziert werden. Eine Markierung kann wie oben beschrieben durchgeführt werden,
um die Expression zu verifizieren. Das Kulturmedium, welches das
exprimierte poly-his-markierte PRO362 enthält, kann dann konzentriert
und durch ein beliebiges ausgewähltes
Verfahren, wie z. B. durch Ni2+-Chelataffinitätschromatographie,
gereinigt werden.
-
PRO362
wurde in CHO-Zellen sowohl durch ein vorübergehendes als auch ein stabiles
Expressionsverfahren exprimiert.
-
Stabile
Expression in CHO-Zellen wurde unter Einsatz des folgenden Verfahrens
durchgeführt.
Die Proteine wurden als IgG-Konstrukt (Immunadhäsin) exprimiert, in welchem
die für
die löslichen
Formen kodierenden Sequenzen (z. B. extrazelluläre Domänen) der jeweiligen Proteine
an eine IgG1-Konstantregionsequenz fusioniert wurden, welche die
Gelenks-, CH2- und CH2-Domänen
enthielt, und/oder als poly-his-markierte
Form.
-
Nach
PCR-Amplifikation wurden die entsprechenden DNAs in einen CHO-Expressionsvektor
unter Verwendung von Standardverfahren wie von Ausubel et al., Current
Protocols of Molecular Biology, Kapitel 3.16, John Wiley und Sons
(1997), subkloniert. CHO-Expressionsvektoren werden hergestellt,
um kompatible Restrikti onsstellen 5' und 3' der DNA von Interesse aufzuweisen,
um das geeignete Shuttling von cDNAs zu ermöglichen. Der zur Expression
in CHO-Zellen verwendete Vektor wird in Lucas et al., Nucl. Acids
Res. 24, 9, 1174–1779
(1996), beschrieben und verwendet den frühen SV40 Promotor/Enhancer,
um die Expression der cDNA von Interesse und Dihydrofolatreductase
(DHFR) zu steuern. DHFR-Expression ermöglicht eine Auswahl zur stabilen
Aufrechterhaltung des Plasmids nach Transfektion.
-
Zwölf Mikrogramm
der gewünschten
Plasmid-DNA wurden in etwa 10 Millionen CHO-Zellen unter Verwendung
von im Handel erhältlichen
Transfektionsreagenzien Superfect® (Qiagen),
Dosper® oder
Fugene® (Boehringer
Mannheim) eingeführt.
Die Zellen wurden gezüchtet
und in Lucas et al., siehe oben, beschrieben. Etwa 3 × 10–7 Zellen
werden in einer Ampulle für
weiteres Wachstum gefroren, und Produktion erfolgt wie nachstehend
beschrieben.
-
Die
Ampullen, welche die Plasmid-DNA enthalten, wurden aufgetaut, indem
sie in ein Wasserbad getaucht wurden, und durch Verwirbeln gemischt.
Die Inhalte wurden in ein Zentrifugenröhrchen pipettiert, das 10 ml
Medium enthielt, und bei 1000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert.
Der Überstand
wurde abgesaugt, und die Zellen wurden in 10 ml selektivem Medium
(0,2-μm-filtriertem
PS20 mit 5% 0,2-μm-diafiltriertem
fötalem Rinderserum)
resuspendiert. Die Zellen wurden dann in einen 100-ml-Spinner aliquotiert,
der 90 ml von selektivem Medium enthielt. Nach 1–2 Tagen wurden die Zellen
in einen 250-ml-Spinner transferiert, der mit 150 ml selektivem
Wachstumsmedium gefüllt
war, und bei 37°C
inkubiert. Nach weiteren 2–3
Tagen wurden ein 250-ml-,
500-ml- und 2000-ml-Spinner mit 3 × 10
5 Zellen/ml
beimpft. Das Zellmedium wurde durch frisches Medium durch Zentrifugation
und Resuspension in Produktionsmedium ausgetauscht. Obwohl ein beliebiges
geeignetes CHO-Medium verwendet werden kann, wird im Wesentlichen
ein Produktionsmedium verwendet, das in
US-Patent Nr. 5.122.469 , veröffentlicht
am 16. Juni 1992, beschrieben ist. 3-l-Produktionsspinner wird bei 1,2 × 10
6 Zellen/ml beimpft. An Tag 0 wurde die Zellanzahl
und der pH bestimmt. An Tag 1 wurde der Spinner einer Probe unterzogen
und das Hindurchleiten von filtrierter Luft begonnen. An Tag 2 wurde
der Spinner einer Probe unterworfen, die Temperatur änderte sich
auf 33°C
und 30 ml von 500 g/l Glucose und 0,6 ml von 10% Antischaummittel
(z. B. 35% Polydimethylsiloxanemulsion, Dow Corning 365 Medical
Grade Emulsion). Während
der Produktion wurde der pH wie notwendig angepasst, um bei etwa
7,2 zu bleiben. Nach 10 Tagen oder bis die Lebensfähigkeit
unter 70% fiel wurde die Zellkultur durch Zentrifugation geerntet
und durch einen 0,22-μm-Filter
filtriert. Das Filtrat wurde entweder bei 4°C aufbewahrt oder sofort auf
Säulen
zur Reinigung geladen.
-
Für die poly-His-markierten
Konstrukte wurden die Proteine unter Einsatz einer Ni-NTA-Säule (Qiagen)
gereinigt. Vor Reinigung wurde Imidazol zum konditionierten Medium
bis zu einer Konzentration von 5 mM hinzugefügt. Das konditionierte Medium
wurde auf eine 6-ml-Ni-NTA-Säule
gepumpt, die in 20 mM HEPES-Puffer, pH 7,4, der 0,3 M NaCl und 5
mM Imidazol enthielt, bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 4–5 ml/min
bei 4°C äquilibriert
worden war. Nach Ladung wurde die Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen
und das Protein mit Äquilibrierungspuffer
eluiert, der 0,25 M Imidazol enthielt. Das höchst gereinigte Protein wurde
in der Folge in einem Speicherpuffer, der 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl
und 4% Mannit enthielt, pH 6,8, mit einer 25-ml-G25-Superfine-Säule (Pharmacia)
entsalzt und bei –80°C aufbewahrt.
-
Immunadhäsin-(Fc-enthaltende)Konstrukte
wurden aus dem konditionierten Medium wie folgt gereinigt. Das konditionierte
Medium wurde auf eine 5-ml-Protein-A-Säule
(Pharmacia) gepumpt, die in 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH 6,8, äquilibriert
worden war. Nach dem Laden wurde die Säule umfassend mit Äquilibrierungspuffer
gewaschen, bevor mit 100 mM Zitronensäure, pH 3,5, eluiert wurde.
Das eluierte Protein wurde sofort neutralisiert, durch Gewinnung
von 1-ml-Fraktionen in Röhrchen,
die 275 μl
von 1 M Tris-Puffer, pH 9, enthielten. Das höchst gereinigte Protein wurde
in der Folge in einen Speicherpuffer entsalzt, wie oben für die Poly-his-markierten Proteine
beschrieben ist. Die Homogenität
wurde unter Verwendung von SDS-Polyacrylamid-Gelen beurteilt und
durch N-terminale Aminosäuresequenzierung
durch Edman-Abbau beurteilt.
-
PRO362
wurde auch durch vorübergehende
Expression in COS-Zellen produziert.
-
BEISPIEL 15
-
Expression von PRO362 in Hefe
-
Das
folgende Verfahren beschreibt die rekombinante Expression von PRO362
in Hefe.
-
Zuerst
werden Hefeexpressionsvektoren für
intrazelluläre
Produktion oder Sekretion von PRO362 aus dem ADH2/GAPDH-Promotor
hergestellt. DNA, die für
PRO362, ein ausgewähltes
Signalpeptid und den Promotor kodiert, wird in geeignete Restriktionsenzymstellen
im ausgewählten
Plasmid insertiert, um intrazelluläre Expression von PRO362 zu
steuern. Zur Sekretion kann DNA, die für PRO362 kodiert, in das ausgewählte Plasmid
kloniert werden, gemeinsam mit DNA, die für den ADH2/GAPDH-Promotor,
die sekretorische Signal/Leadersequenz von Hefe-Alphafaktor und
Linkersequenzen (wenn nötig)
kodiert, zur Expression von PRO362.
-
Hefezellen,
wie z. B. Hefestamm AB110, können
dann mit den Expressionsplasmiden, die oben beschrieben sind, transformiert
werden und in ausgewähltem
Fermentationsmedium kultiviert werden. Die transformierten Hefeüberstände können durch
Präzipitation
mit 10% Trichloressigsäure
und Trennung durch SDS-PAGE, gefolgt von Färbung der Gele mit Coomassie-Blau-Farbstoff
analysiert werden.
-
Rekombinantes
PRO362 kann in der Folge durch Entfernen der Hefezellen aus dem
Fermentationsmedium und Zentrifugation und anschließende Konzentration
des Mediums unter Einsatz ausgewählter
Kassettenfilter isoliert und gereinigt werden. Das Konzentrat, das
PRO362 enthält,
kann unter Verwendung ausgewählter
Säulenchromatographieharze
weiter gereinigt werden.
-
BEISPIEL 16
-
Expression von PRO362 in mit Baculovirus
infizierten Insektenzellen
-
Das
folgende Verfahren beschreibt die rekombinante Expression von PRO362
in mit Baculovirus infizierten Insektenzellen.
-
Das
PRO362 ist stromauf einer Epitopmarkierung fusioniert, die in einem
Baculovirus-Expressionsvektor enthalten ist. Solche Epitopmarkierungen
umfassen poly-his-Markierungen
und Immunglobulinmarkierungen (wie Fc-Regionen von IgG). Eine Vielzahl
an Plasmiden kann verwendet werden, einschließlich Plasmide, die von im
Handel erhältlichen
Plasmiden abstammen, wie z. B. pVL1393 (Novagen). Kurz gesagt wird das
PRO362 oder der gewünschte
Abschnitt von PRO362 (wie z. B. die Sequenz, die für die extrazelluläre Domäne eines
Transmembranproteins kodiert) durch PCR mit Primern amplifiziert,
die zu den 5'- und
3'-Regionen komplementär sind.
Der 5'-Primer kann
flankierende (ausgewählte)
Restriktionsenzymstellen aufnehmen. Das Produkt wird dann mit den
ausgewählten
Restriktionsenzymen verdaut und in den Expressionsvektor subkloniert.
-
Rekombinantes
Baculovirus wird durch Cotransfektion des obigen Plasmids und BaculoGoldTM-Virus-DNA (Pharmingen) in Spodoptera-frugiperda-(„Sf9"-)Zellen (ATCC CRL
1711) unter Einsatz von Lipofectin (im Handel von GIBCO-BRL erhältlich)
erzeugt. Nach 4–5
Tagen Inkubation bei 28°C
werden die freigesetzten Viren geerntet und für weitere Amplifikationen verwendet.
Virusinfektion und Proteinexpression wird wie von O'Reilley et al., Baculovirus
expression vectors: A laboratory Manual, Oxford, Oxford University
Press (1994), durchgeführt.
-
Exprimiertes
poly-his-markiertes PRO362 kann dann z. B. durch Ni2+-Chelataffinitätschromatographie wie
folgt gereinigt werden. Extrakte werden aus rekombinanten virusinfizierten
Sf9-Zellen wie von Rupert et al., Nature 362, 175–179 (1993),
hergestellt. Kurz gesagt wurden Sf9-Zellen gewaschen, in Beschallungspuffer resuspendiert
(25 ml Hepes, pH 7,9, 12,5 mM MgCl2, 0,1
mM EDTA, 10% Glycerin, 0,1% NP-40, 0,4 M KCl) und zweimal 20 Sekunden
auf Eis beschallt. Die beschallten Prä parate werden durch Zentrifugation
gereinigt, und der Überstand
wird 50fach in Ladungspuffer verdünnt (50 mM Phosphat, 300 mM
NaCl, 10% Glycerin, pH 7,8) und durch einen 0,45-Fm-Filter filtriert.
Eine Ni2+-NTA-Agarosesäule (im Handel von Qiagen erhältlich) wird
mit einem Bettvolumen von 5 ml hergestellt, mit 25 ml Wasser gewaschen
und mit 25 ml Ladungspuffer äquilibriert.
Das filtrierte Zellextrakt wird bei 0,5 ml pro Minute auf die Säule geladen.
Diese Säule
wird mit Ladungspuffer auf Basislinie A280 gewaschen, an welchem
Punkt die Gewinnung von Fraktionen begonnen wird. Als Nächstes wird
die Säule
mit einem sekundären
Waschpuffer gewaschen (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10% Glycerin,
pH 6,0), der nicht-spezifisch gebundenes Protein eluiert. Nachdem
wieder die A280-Basislinie erreicht worden
ist, wird die Säule
mit einem Imidazolgradienten von 0 bis 500 mM im sekundären Waschpuffer entwickelt.
1-ml-Fraktionen werden gewonnen und durch SDS-PAGE und Silber-Färbung oder
Western-Blot mit Ni2+-NTA, das an alkalische
Phosphatase konjugiert ist (Qiagen), analysiert. Fraktionen, die
das eluierte His10-markierte PRO362 enthalten,
werden vereinigt und gegen Ladungspuffer dialysiert.
-
Alternativ
dazu kann die Reinigung von IgG-markiertem (oder Fc-markiertem)
PRO362 unter Verwendung bekannter Chromatographieverfahren durchgeführt werden,
einschließlich
z. B. Protein-A- oder Protein-G-Säulenchromatographie.
-
PRO362
wurde in mit Baculovirus infizierten Sf9-Insektenzellen exprimiert.
Während
die Expression im Wesentlichen in einem Maßstab von 0,5–2 l durchgeführt wurde,
kann sie einfach für
größere (z.
B. 8 l) Formulierungen angepasst werden. Die Proteine wurden als
IgG-Konstrukt (Immunadhäsin)
exprimiert, in welchem die extrazelluläre Proteinregion an eine IgG1-Konstantregionsequenz
fusioniert war, welche die Gelenks-, CH2- und CH3-Domänen enthielt,
oder in poly-his-markierten Formen.
-
Nach
der PCR-Amplifikation wurden die jeweiligen kodierenden Sequenzen
in einen Baculovirus-Expressionsvektor subkloniert (pb.PH.IgG für IgG-Fusionen
und pb.PH.His.c für
poly-his-markierte Proteine), und der Vektor und Baculogold®-Baculovirus-DNA (Pharmingen)
wurden zu 105 Spodoptera-frugiperda-(„Sf9"-)Zellen (ATCC CRL 1711) unter Verwendung
von Lipofectin (Gibco BRL) co-transfiziert. pb.PH.IgG und pb.PH.His
sind Modifikationen des im Handel erhältlichen Baculovirusexpressionsvektors
pVL1393 (Pharmingen) mit modifizierten Polylinkerregionen, welche
die His- oder Fc-Markierungssequenzen umfassen sollen. Die Zellen
wurden in Hinks TNM-FH-Medium gezüchtet, das mit 10% FBS (Hyclone)
ergänzt
war. Die Zellen wurden 5 Tage lang bei 28°C inkubiert. Der Überstand
wurde geerntet und in der Folge für die erste Virusamplifikation
verwendet, indem Sf9-Zellen in Hinks TNM-FH-Medium, das mit 10% FBS ergänzt war,
bei einer ungefähren
Infektionsmultiplizität
(MOI) von 10 infiziert wurden. Die Zellen wurden drei Tage lang
bei 28°C
inkubiert. Der Überstand
wurde geerntet, und die Expression der Konstrukte im Baculovirusexpressionsvektor
wurde durch Batch-Bindung von 1 ml von Überstand an 25 ml von Ni-NTA-Kugeln
(QIAGEN) für
histidinmarkierte Proteine oder Protein-A-Sepharose-CL-4B-Kügelchen (Pharmacia) für IgG-markierte
Proteine bestimmt, gefolgt von SDS-PAGE-Analyse, die mit einer bekannten
Konzentration von Proteinstandard durch Coomassieblaufärbung verglichen
werden kann.
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Der
erste Virusamplifikationsüberstand
wurde dazu verwendet, eine Spinnerkultur von Sf9-Zellen bei einem
ungefähren
MOI von 0,1 zu infizieren (500 ml), die in ESF-921-Medium gezüchtet wurden (Expression Systems
LLC). Die Zellen wurden 3 Tage lang bei 28°C inkubiert. Der Überstand
wurde geerntet und filtriert. Batchbindung und SDS-PAGE-Analyse
wurden wiederholt, wenn notwendig bis eine Expression der Spinnerkultur
nachgewiesen wurde.
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Das
konditionierte Medium aus den transfizierten Zellen (0,5 bis 3 l)
wurde durch Zentrifugation geerntet, um die Zellen zu entfernen,
und durch 0,22-μm-Filter
filtriert. Für
die poly-His-markierten Konstrukte wurde das Proteinkonstrukt unter
Einsatz einer Ni-NTA-Säule
(Qiagen) gereinigt. Vor Reinigung wurde Imidazol zum konditionierten
Medium auf eine Konzentration von 5 mM hinzugegeben. Die konditionierten
Medien wurden auf eine 6-ml-Ni-NTA-Säule gepumpt, die in 20 mM HEPES-Puffer,
pH 7,4, der 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol bei einer Durchflussgeschwindigkeit
von 4–5
ml/min bei 4°C
enthielt, äquilibriert
worden war. Nach der Ladung wurde die Säule mit einem zusätzlichen Äquilibrierungspuffer
gewaschen und das Protein mit Äquilibrierungspuffer
eluiert, der 0,25 M Imidazol enthielt. Das höchst gereinigte Pro tein wurde
in der Folge mit einer 25-ml-G25-Superfine-Säule (Pharmacia) in einen Speicherpuffer
entsalzt, der 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4% Mannit, pH 6,8 enthielt,
und bei –80°C aufbewahrt.
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Immunadhäsin-(Fc-enthaltende)
Konstrukte von Proteinen wurden wie folgt aus den konditionierten Medien
gereinigt. Die konditionierten Medien wurden auf eine 5-ml-Protein-A-Säule (Pharmacia)
gepumpt, die in 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH 6,8, äquilibriert
worden war. Nach der Ladung wurde die Säule ausgiebig mit Äquilibrierungspuffer
gewaschen, bevor mit 100 mM Zitronensäure, pH 3,5, eluiert wurde.
Das eluierte Protein wurde sofort durch Gewinnung von 1-ml-Fraktionen
in Röhrchen
neutralisiert, die 275 ml von 1 M Tris-Puffer, pH 9, enthielten.
Das höchst
gereinigte Protein wurde in der Folge in Speicherpuffer entsalzt,
wie oben für
die Poly-his-markierten
Proteine beschrieben ist. Die Homogenität der Proteine wurde durch
SDS-Polyacrylamidgel-(PEG-)Elektrophorese und N-terminale Aminosäuresequenzierung
durch Edman-Abbau nachgewiesen.
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PRO362
wurde auch in mit Baculovirus infizierten High-5-Zellen unter Verwendung
eines analogen Verfahrens exprimiert. High-5-Zellen wurden bei 27°C, kein CO2, kein Penicillin und kein Streptomycin
auf eine Konfluenz von 50% gezüchtet.
Für jede
150-mm-Platte wurden 30 μg
von pIE-basiertem Vektor, der PRO362 enthielt, mit 1 ml Ex-Cell-Medium
gemischt (Medium: Ex-Cell 401, 1/100 L-Glu JRH Biosciences, Nr. 14401-78P,
Anmerkung: das Medium ist lichtempfindlich), und in einem separaten
Röhrchen
wurden 100 μl von
CellFectin (GibcoBRL.Nr. 10362-010) mit 1 ml von Ec-Cell-Medium
gemischt. Die pIE1-1- und pIE1-2-Vektoren sind zur konstitutiven
Expression von rekombinanten Proteinen aus dem Baculovirus-ie1-Promotor
in stabil transformierten Insektenzellen entworfen (J.L. Cartier
et al., J. Virol. 68, 7728–7737
(1994)). Die Plasmide unterscheiden sich nur in der Orientierung
der multiplen Klonierungsstellen und enthalten alle Promotorsequenzen,
von denen bekannt ist, dass sie für die ie1-vermittelte Genexpression
in nicht-infizierten Insektenzellen wichtig sind, sowie das hr5-Enhancerelement.
pIE1-1 und pIE1-2 umfassen die ie1-Transla tionsinitiationsstelle
und können
zur Produktion von Fusionsproteinen verwendet werden.
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Die
zwei Lösungen
wurden kombiniert und bei Raumtemperatur 15 Minuten lang inkubieren
gelassen. 8 ml von Ex-Cell-Medium wurden zu 2 ml von DNA/CellFectin-Gemisch zugegeben
und auf High-5-Zellen geschichtet, die zuvor mit Ex-Cell-Medium gewaschen
worden waren. Die Platte wurde in Dunkelheit 1 Stunde lang bei Raumtemperatur
inkubiert. Das DNA/CellFektin-Gemisch wurde abgesaugt, und die Zellen
wurden einmal mit Ex-Cell gewaschen, um überschüssiges CellFectin zu entfernen.
Frisches Ex-Cell-Medium (30 ml) wurde hinzugegeben, und die Zellen
wurden 3 Tage lang bei 28°C
inkubiert. Der Überstand
wurde geerntet, und die Expression von PRO362 wurde durch Batchbindung
auf ähnlichen
Art und Weise bestimmt wie für SF9-Zellen.
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BEISPIEL 17
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Herstellung von Antikörpern, die PRO362 binden
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die
PRO362 spezifisch binden.
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Verfahren
zur Herstellung der monoklonalen Antikörper sind fachbekannt und zum
Beispiel in Goding, s. o., beschrieben. Immunogene, die verwendet
werden können,
umfassen gereinigtes PRO362, Fusionsproteine, die PRO362 enthalten,
und Zellen, die rekombinantes PRO362 auf der Zelloberfläche exprimieren.
Die Auswahl des Immunogens kann vom Fachmann ohne übermäßiges Experimentieren
durchgeführt
werden.
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Mäuse, wie
z. B. Balb/c-Mäuse,
werden mit dem PRO362-Immunogen immunisiert, das in komplettem Freund-Adjuvans
emulgiert worden ist, und dieses wird ihnen subkutan oder intraperitoneal
in einer Menge von 1–100
Mikrogramm injiziert. Alternativ dazu wird das Immunogen in MPL-TDM-Adjuvans
emulgiert (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) und in die
Hinterpfoten des Tiers injiziert. Die immu nisierten Mäuse werden
dann 10 bis 12 Tage später
mit zusätzlichem
Immunogen, das im ausgewählten
Adjuvans emulgiert worden war, aufgefrischt. Danach werden die Mäuse für mehrere
Wochen mit weiteren Immunisierungsinjektionen aufgefrischt. Serumproben
können
von den Mäusen
periodisch durch retroorbitale Blutabnahme zum Testen in ELISA-Tests
erhalten werden, um PRO362-Antikörper
zu detektieren.
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Nachdem
ein geeigneter Antikörpertiter
detektiert worden ist, kann den für Antikörper „positiven" Tieren eine finale intravenöse Injektion
von PRO362 gegeben werden. Drei bis vier Tage später werden die Mäuse getötet und
die Milzzellen gewonnen. Die Milzzellen werden dann (unter Verwendung
von 35% Polyethylenglykol) an eine ausgewählte murine Myelomzelllinie,
wie z. B. P3X63AgU.1, fusioniert, erhältlich von ATCC Nr. CRL 1597.
Die Fusionen erzeugen Hybridomzellen, die dann in 96-Well-Gewebskulturplatten
ausplattiert werden können,
die HAT-Medium (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) enthalten,
um die Proliferation von nicht-fusionierten Zellen, Myelomhybriden
und Milzzellhybriden zu hemmen.
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Die
Hybridomzellen werden in einem ELISA auf Reaktivität gegen
PRO362 getestet. Die Bestimmung von „positiven" Hybridomzellen, welche die gewünschten
monoklonalen Antikörper
gegen PRO362 sekretieren, ist im Fachgebiet bekannt.
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Die
positiven Hybridomzellen können
intraperitoneal in syngenetische Balb/c-Mäuse injiziert werden, um Aszites
zu produzieren, die monoklonale Anti-PRO362-Antikörper enthalten.
Alternativ dazu können
die Hybridomzellen in Gewebskulturflaschen oder Rollerflaschen gezüchtet werden.
Die Reinigung der monoklonalen Antikörper, die in den Aszites produziert
werden, kann durch Ammoniumsulfatpräzipitation erreicht werden,
gefolgt von Gelausschlusschromatographie. Alternativ dazu kann Affinitätschromatographie
basierend auf der Bindung von Antikörper an Protein A oder Protein
G verwendet werden.
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Hinterlegung von Material
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Die
folgenden Materialien sind bei der American Type Culture Collection,
12301 Parklaven Drive, Rockville, MD, USA (ATCC), hinterlegt worden.
Bezeichnung | ATCC-Hinterleg.-Nr. | Hinterlegungsdatum |
pRK5-basierte
Plasmid-DNA40628-1216 | 209432 | 7.
November 1997 |
DMA45416-1251 | 209620 | 5.
Februar 1998 |
DNA35638-1141 | 209265 | 16.
September 1997 |
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Diese
Hinterlegungen wurden unter den Vorschriften des Budapester Vertrages über die
internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen
für die
Zwecke von Patentverfahren und den darunter gültigen Bestimmungen (Budapester
Vertrag) durchgeführt.
Dieser stellt die Aufrechterhaltung einer lebensfähigen Kultur
der Hinterlegung für
30 Jahre vom Hinterlegungsdatum an sicher. Die Hinterlegung wird
von ATCC unter den Bestimmungen des Budapester Vertrages verfügbar gemacht
und unterliegt dem Abkommen zwischen Genentech, Inc., und ATCC,
das die permanente und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft
der Kultur der Hinterlegung der Öffentlichkeit
nach Erteilung des geeigneten US-Patents oder nach Offenlegung einer
beliebigen US- oder fremden Patentanmeldung gegenüber der Öffentlichkeit
sicherstellt, abhängig
davon, was zuerst kommt, und die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft
für einen
vom Präsidenten des
Patentamts der USA bestimmten Anspruchsberechtigten gemäß 35 USC '122 und den Regeln
des Präsidenten
diesbezüglich
(einschließlich
37 CFR § 1.14
mit besonderem Hinweis auf 886 OG 638) sicherstellt.
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Der
Zessionar der vorliegenden Anmeldung hat zugestimmt, dass bei Tod
oder Verlust oder Zerstörung
einer Kultur der hinterlegten Materialien bei Kultivierung unter
geeigneten Bedingungen die Materialien unmittelbar nach Bekanntwerden
durch andere derselben Art ersetzt werden. Die Verfügbarkeit
der hinterlegten Materialien soll nicht als Lizenz zur Umsetzung
der Erfindung bei Übertretung
der Rechte verstanden werden, die von einer beliebigen Regierung
gemäß ihrer
Patentrechte gewährt
werden.
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Die
vorangegangene schriftliche Beschreibung wird als ausreichend erachtet,
um einem Fachmann zu ermöglichen,
die Erfindung umzusetzen. Die vorliegende Erfindung soll im Schutzumfang
nicht vom hinterlegten Konstrukt eingeschränkt werden, da die hinterlegte
Ausführungsform
als einzelne Veranschaulichung von bestimmten Aspekten der Erfindung
gedacht ist, und Konstrukte, die funktionell äquivalent sind, können im Schutzumfang
dieser Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, liegen. Die
Hinterlegung des hierin angeführten
Materials stellt kein Zugeständnis
dar, dass die hierin enthaltene schriftliche Beschreibung ungeeignet
ist, um die Umsetzung eines Aspektes der Erfindung zu ermöglichen,
einschließlich
des besten Modus davon, noch soll sie den Schutzumfang der Ansprüche auf
die spezifischen Veranschaulichungen, die sie repräsentiert,
einschränken.
Tatsächlich
werden verschiedene Modifikationen zusätzlich zu den hierin dargestellten
und beschriebenen Fachleuten aus der vorangegangenen Beschreibung
offensichtlich sein und fallen in den Schutzumfang der Ansprüche im Anhang.
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