BRPI0716299A2

BRPI0716299A2 - anticorpos murino,anticorpo quimÉrico, domÍnios variÁveis de um anticorpo humanizado, anticorpos anti-fator d humanizado, polipeptÍdeos, anticorpo humanizado, fragmento de anticorpo, Ácidos nuclÉico isolados, vetores , linhagem celular, composiÇço, uso, mÉtodo para produÇço de um anticorpo anti-fator d humanizado ou fragmentos destes e anticorpos

Info

Publication number: BRPI0716299A2
Application number: BRPI0716299-5A2A
Authority: BR
Inventors: Herren Wu; Sanjaya Singh; Sek Chung Fung; Ling-Ling An; Henry B Lowman; Robert F Kelley
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2006-11-02
Filing date: 2007-10-31
Publication date: 2013-08-13
Also published as: PE20081259A1; TW201843170A; HK1215712A1; CR10827A; RU2009120699A; SI2097455T1; US20120230985A1; NZ609813A; LT2907827T; KR20140101873A; JP2010508819A; NZ596042A; AR100225A2; AU2007313685B2; US8067002B2; US20160002352A1; ES2700609T3; KR20160092061A; RU2019102393A; CN106188304A

Abstract

"ANTICORPOS MURINA, ANTICORPO QUIMÉRICO, DOMÍNIOS VARIÁVEIS DE UM ANTICORPO HUMANIZADO, ANTICORPOS ANTI-FATOR D HUMANIZADO, POLIPEPTÍDEOS, ANTICORPO HUMANIZADO, FRAGMENTO DE ANTICORPO, ÁCIDOS NUCLÉICO ISOLADO, VETORES, LINHAGEM CELULAR, COMPOSIÇçO, USO, MÉTODO PARA PRODUÇçO DE UM ANTICORPO ANTI-FATOR D HUMANIZADO OU FRAGMENTO DESTES E ANTICORPOS". A presente invenção está relacionada com anticorpos monoclonais anti-Fator D humano, seus ácidos nucléicos e aminoácidos, células e os vetores que hospedam estes anticorpos e o uso destes na preparação de composições e medicamentos para o tratamento de doenças e distúrbios associada com a ativação excessiva ou descontrolada do complemento. Estes anticorpos são úteis para diagnóstico, profilaxia e tratamento da doença.

Description

"ANTICORPOS MURINO, ANTICORPO QUIMÉRICO, DOMÍNIOS VARIÁVEIS DE UM ANTICORPO HUMANIZADO, ANTICORPOS ANTI-FATOR D HUMANIZADOS, POLIPEPTÍDEOS, ANTICORPO HUMANIZADO, FRAGMENTO DE ANTICORPO, ÁCIDOS NUCLÉICOS ISOLADOS, VETORES, LINHAGEM CELULAR, COMPOSIÇÃO, USO DA COMPOSIÇÃO, MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO ANTI-FATOR D HUMANIZADO E ANTICORPOS" Antecedentes da Invenção 0 sistema complemento desempenha um papel central na depuração dos imunocomplexos e na resposta imune aos agentes infecciosos, antígenos estranhos, células infectadas por vírus e células tumorais. No entanto, o sistema complemento também está envolvido na inflamação patológica e nas doenças auto-imunes. Portanto, a inibição da ativação excessiva ou descontrolada da cascata do complemento poderia proporcionar um benefício clínico para pacientes com este tipo de doenças e condições.

O sistema complemento engloba duas vias de ativação distintas denominadas como via clássica e via alternativa Holers, em Clinicai ImmunologyrPrincipIes and Practice, Ed. R.R. Rich, Mosby Press, 1996, 363- 391). A via clássica e uma cascada cálcio/magnésio dependente, que é normalmente ativada pela formação de complexos antígeno-anticorpo. A via alternativa é uma cascata dependente de magnésio, que é ativada pela deposição e ativação de C3 em determinadas superfícies sensíveis (por exemplo, polissacarídeos da parede celular de leveduras e bactérias, e certos materiais biopolímeros). A ativação da via complemento gera fragmentos biologicamente ativos das proteínas do complemento, por exemplo, anafilatoxinas C3a, C4a e C5a e Complexo de Ataque à Membrana (MAC) C5b-9, que medeiam a atividade inflamatória envolvendo a quimiotaxia de leucócitos, ativação de macrófagos, neutrófilos, plaquetas, mastócitos e células endoteliais, permeabilidade vascular, citólise e lesão tecidual.

O Fator D é uma serina protease altamente específica essencial para a ativação da via alternativa do complemento. Ele cliva o fator B ligado a C3b, gerando a enzima C3b/Bb que é o componente ativo da via alternativa C3/C5 convertases. Fator D pode ser um alvo adequado para a inibição, uma vez que a sua concentração plasmática em humanos é muito baixa (1,8 pg/ml), e demonstrou-se ser a enzima Iimitante para a ativação da via alternativa do complemento (P.H. Lesavre e H.J. Muller-Eberhard. J. Exp. Med., 1978; 148: 1498-1510; J.E. VoIanakis et al., New Eng. J. Med., 1985; 312: 395-401). A infra-regulação da ativação do complemento foi demonstrada

como sendo eficaz no tratamento de várias doenças indicadas em modelos animais e em estudos ex vivo, por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico e glomerulonefrite (Y. Wáng et ai, Proc. NatL Acad. Sci.; 1996, 93: 8563-8568), artrite reumatóide (Y. Wang et ai., Proc. Natl.. Acad., 1995; 92: 8955-8959), circulação extracorpórea e hemodiálise (CS Rinder, J. Clin. Invest., 1995; 96: 1564-1572 ), rejeição hiperaguda no órgão de transplante (TJ Kroshus et ai Transplantation, 1995; 60: 1194-1202), infarto do miocárdio (JW Homeisteref al., J. Immunol., 1993; 150: 1055-1064; Weisman HF et al ., Science, 1990, 249: 146-151), lesão de re-perfusão (Amsterdam EA et al., Am. J. Physiol., 1995; 268: Η448-Η4^7), e síndrome do desconforto respiratório adulto (Rabinovici R. et al. , J. Immunol., 1992; 149: 1744-1750). Além disso, outras condições inflamatórias e doenças complexas auto-imunes/imunes estão também estreitamente associadas com a ativação do sistema complemento (VM Holers, ibid., BP Morgan. Eur. J. Clin. Invest., 1994: 24: 219-228), incluindo lesão térmica, asma grave, choque anafilático, inflamação intestinal, urticária, angio-edema, vasculite, esclerose múltipla, miastenia gravis, glomerulonefrite membranoproliferativa é Síndrome de Sjõgren.

Existe uma necessidade de anticorpos terapêuticos no campo dos

distúrbios mediados pelo complemento e os anticorpos humanizados da presente invenção fornecem anticorpos de alta afinidade úteis para satisfazer esta necessidade.

Descrição Resumida Da Invenção

A presente invenção está relacionada, de forma geral, a

anticorpos compreendendo as seqüências do domínio variável de cadeia pesada e cadeia leve de anticorpos murinos 166-32, que é um anticorpo capaz de inibir as atividades biológicas associadas com Fator D. Por exemplo, em uma concentração de 18 pg/ml (equivalente a cerca de 1,5 vezes a concentração molar do fator D humano no sangue; razão molar de anticorpos anti-Fator D para Fator D de cerca de 1,5:1), a inibição significativa da atividade alternativa do complemento pelos anticorpos pode ser observada (vide, por exemplo, Patente US 6.956.107).

A presente invenção também se relaciona com anticorpos 1,5 humanizados de MAb 166-32 murinos. A invenção inclui as seqüências de aminoácidos da cadeia pesada variável e cadeia leve variável de anticorpos e suas respectivas seqüências de ácidos nucléicos. Em outro exemplo de realização, a presente invenção inclui as seqüências CDR destes anticorpos.

Em outro exemplo de realização, a presente invenção inclui composições contendo um anticorpo da presente invenção. Em outro exemplo de realização, a invenção fornece linhagens de células e vetores hospedando as seqüências do anticorpo da presente invenção. Em um aspecto, a invenção inclui um método de fabricação e uso de anticorpos e composições da presente invenção.

Outro exemplo de realização da presente invenção é a utilização

desses anticorpos humanizados para a preparação de um medicamènto ou composição para o tratamento de distúrbios relacionados com a ativação excessiva ou descontrolada do complemento. Eles incluem a ativação do complemento durante operações com circulação extracorpórea; ativação do complemento devido à isquemia e reperfusão após infarto agudo do miocárdio, aneurisma, acidente vascular cerebral, choque hemorrágico, lesão por esmagamento, falência múltipla de órgãos, choque hipovolêmico, isquemia intestinal ou outros eventos que causam isquemia. A ativação do complemento também demonstrou estar associada a condições inflamatórias, tais como queimaduras graves, endotoxemia, choque séptico, síndrome do desconforto respiratório adulto, hemodiálise; choque anafilático, asma grave, angioedema, doença de Crohn, anemia falciforme, glomerulonefrite pós-estreptocócica e pancreatite. O distúrbio pode ser resultado de uma reação adversa ao medicamento, alergia ao medicamento, síndrome de extravasamento vascular induzido por IL-2 ou alergia ao meio de contraste radiográfico. Inclui também doenças auto-imunes, como lúpus eritematoso sistêmico, miastenia gravis, artrite reumatóide, doença de Alzheimer e a esclerose múltipla. A ativação do complemento está também associada com a rejeição de transplantes. A ativação do complemento está também associada a doenças oculares, como a degeneração macular relacionada com a idade e retinopatia diabética.

Breve Descrição Das Figuras

As Figuras 1A e 1B mostram a seqüência de aminoácidos da cadeia pesada variável (Figura 1A) e a cadeia leve variável (Figura 1B) do MAb 166-32 murino.

As Figuras 2A e 2B mostram a seqüência de ácidos nucléicos da cadeia pesada variável (Figura 2A) e a cadeia leve variável (Figura 2B) do MAb 166-32 murino.

A Figura 3 exibe a comparação das cadeias pesadas do MAb 166-32 murino.

A Figura 4 exibe a comparação das cadeias leves do MAb 166-32

murino. A Figura 5 mostra a seqüência de aminoácidos da cadeia pesada variável e a cadeia leve variável para cada anticorpo humanizado clone #56, #111, #250e#416.

A Figura 6 exibe os resultados do ensaio hemolítico para o anticorpo Fab humanizado clone #56, #111, #250 e #416.

A Figura 7 exibe a inibição da atividade complemento alternativa pelos anticorpos Fab humanizados clones #56, #111, #250 e #416.

A Figura 8A-B (região estrutural de consenso variável pesada (VH)) e a Figura 9A-B (região estrutural de consenso variável leve (VL)) exibe exemplos de da região estrutural de consenso humana aceptora que pode ser utilizada na pratica da presente invenção instantâneas com identificadores da seqüência da seguinte forma: (Figura 8A-B) região estrutural de consenso VH humano subgrupo I menos CDRs de Kabat (SEQ ID NO: 28), região estrutural de consenso VH humano subgrupo I menos regiões hipervariáveis alongadas 1,5 (SEQ ID No: 29-31), região estrutural de consenso VH humano subgrupo Il menos CDRs de Kabat (SEQ ID NO: 32), região estrutural de consenso VH humano subgrupo Il menos regiões hipervariáveis alongadas (SEQ ID No: 33- 35), região estrutural de consenso VH humano subgrupo Ill menos CDRs de Kabat (SEQ ID NO: 36), região estrutural de consenso VH humano subgrupo Ill menos regiões hipervariáveis alongadas (SEQ ID No: 37-39 ), região estrutural de consenso VH humano subgrupo Vll menos CDRs de Kabat (SEQ ID NO: 55), região estrutural de consenso VH humano subgrupo Vll menos regiões hipervariáveis alongadas (SEQ ID N.os: 56-58), região estrutural aceptora VH humana menos CDRs de Kabat (SEQ ID NO : 40), região estrutural aceptora VH humana menos règiões hipervariáveis alongadas (SEQ ID No: 41-42), região estrutural aceptora 2 VH humano menos CDRs de Kabat (SEQ ID No: 43) e região estrutural aceptora 2 VH humano menos menos regiões hipervariáveis alongadas (SEQ ID Nos: 44-46) e (Figura 9A-B) região estrutural de consenso VL kappa humano subgrupo I (SEQ ID NO: 47), região estrutüral de consenso VL kappa humano subgrupo Il (SEQ ID NO: 48), região estrutural de consenso VL kappa humano subgrupo Ill (SEQ ID NO: 49) e região estrutural de consenso VL kappa humano subgrupo IV (SEQ ID NO: 50).

Descrição Detalhada Da Invenção

Definições

Os termos utilizados em todo pedido devem ser interpretados pelos significados normais e típicos para os técnicos hábeis no assunto. No entanto, os requerentes desejam que aos seguintes termos seja dada a definição específica, tal como as definições específicas definidas abaixo.

A frase "substancialmente idêntica" quando se refere a uma seqüência de polipeptídeo da cadeia de anticorpo pode ser interpretada como uma cadeia de anticorpo que exibe, pelo menos, 70%, ou 80%, ou 90%, ou 95% de identidade com a seqüência do polipeptídeo de referência. Quando o termo se refere a uma seqüência de ácido nucléico pode ser entendida como uma seqüência de nuclèotídeos que exiba, pelo menos, cerca de 85%, ou 90%, ou 95%, ou 97% de identidade na seqüência com a seqüência do ácido

nucléico de referência.

O termo "identidade" ou "homologia" deve ser interpretado no sentido de percentagem de resíduos de aminoácidos na seqüência candidata que se identifica com o resíduo de uma seqüência correspondente com o qual eles são comparados, após o alinhamento das seqüências e introdução dos GAPs, se necessário pára alcançar a percentagem máxima de identidade para a seqüência toda, e não considerando eventuais substituições conservadoras, como parte da identidade da seqüência. Nem as extensões N- ou C-terminal nem as inserções devem ser interpretadas como seqüências que reduzem a identidade ou homologia. Métodos e programas de computadores para o alinhamento são bem conhecidos no estado da técnica. A identidade na seqüência pode ser mensurada utilizando um software de análise de seqüência.

O termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais amplo, e brange especificamente os anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento total), anticorpos policlonais e anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos). Anticorpos (Abs) e Imunoglobulinas (Igs) são glicoproteínas que possuem as mesmas características estruturais. Embora os anticorpos exibam especificidade de ligação a um alvo específico, as imunoglobulinas incluem tanto anticorpo quanto moléculas semelhantes a anticorpos que não têm especificidade a um alvo. Anticorpos e imunoglobulinas nativas são geralmente'glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 Daltons, compostas por duas cadeias leves idênticas (L) e duas cadeias pesadas idênticas (H). Cada cadeia pesada tem em uma extremidade um domínio variável (Vh), seguido por um número de domínios constante. Cada cadeia leve tem em um domínio variável em uma extremidade (VL), e um domínio constante ná outra extremidade.

Conforme utilizado no presente, "anticorpo anti-Fator D humano" designa um anticorpo que se liga especificamente ao fator D humano, de tal forma que inibe ou reduz substancialmente a ativação do complemento. O termo "variável", no contexto do domínio variável de anticorpos,

refere-se ao fato de que certas porções dos domínios variáveis diferem extensamente na seqüência entre os anticorpos e são utilizados na ligação e especificidade de cada anticorpo específico ao seu alvo principal. No entanto, a variabilidade não é uniformemente distribuída através dos domínios variável dos anticorpos. Elas estão concentradas em três segmentos denominados de regiões determinantes de complementaridade (CDRs), também conhecidos como regiões hipervariáveis (HVRs), nos domínios tanto de cadeia leve quanto de cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são denominadas de região estrutural (FR). Os domínios variáveis de cada cadeia pesada e leve nativa contêm quatro regiões FR1 adotando em grande parte uma conformação de folha-β, ligadas por três CDRs1 que formam alças (Ioops) que conectam e, em alguns casos, fazem parte da estrutura de folha β. Os CDRs em cada cadeia são unidos em estreita proximidade pelas regiões FR e, com os CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação ao alvo dos anticorpos (vide Kabat et al.). Conforme utilizado no presente, a numeração de resíduos de aminoácido na imunoglobulina é feita de acordo com o sistema de numeração de resíduos de aminoácido em imunoglobulina de Kabat et aí., (Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987), salvo quando indicado de outra maneira.

O termo "região hipervariável", "HVR", ou "HV", quando utilizado no presente referem-se às regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis na seqüência e/ou formam alças estruturalmente definidas. Geralmente, os anticorpos compreendem seis regiões hipervariáveis; sendo três na VH (H1, H2, H3), e três na VL (L1, L2, L3). Uma série delineamentos da região hipervariável são utilizadas e englobadas no presente. As regiões determinantes de complementaridade de Kabat (CDRs) são baseadas na variabilidade das seqüências e são as mais comumente usadas (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, Md. 1991), salvo quando indicado de outra maneira. Chothia por sua vez refere-se a localização das alças estruturais (Chothia e Lesk J. MoL Biol. 196:901-917 (1987)). As regiões hipervariável do AbM representam um acordo entre os CDRs de Kabat e as alças estruturais de Chothia, e são utilizados pelo programa "Oxford Molecular AbM antibody modeling software". O "contato" das regiões hipervariáveis é baseado em uma análise das estruturas cristalina do complexo disponíveis. Os resíduos de cada uma destas regiões hipervariáveis estão descritas a seguir.

Loop Kabat AbM Chothia Contato L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (numeração Kabat) H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (numeração Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101

As regiões hipervariáveis podem incluir "regiões hipervariáveis alongadas", como as seguintes: 24-36 ou 24-34 (L1), 46-56 ou 50-56 (L2) e 89- 97 (L3) no VL e 26-35 (H1) , 50-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-102 ou 95-102 (H3), no VH. Os resíduos do domínio variável são numerados de acordo com a Kabat et al, supra para cada uma dessas definições.

Resíduos da "região estrutural" ou "FR" são aqueles resíduos do domínio variável diferentes dos resíduos da região hipervariável ou resíduos CDR definidos no presente. Os termos "numeração dos resíduos do domínio variável como

em Kabat" ou "numeração da posição de aminoácidos como em Kabat", e variações destes, rèfere-se ao sistema de numeração utilizado para os domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve da compilação de anticorpos em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). Usando este sistema de numeração, a seqüência de aminoácidos linear real pode conter menos ou mais aminoácidos, correspondendo a uma redução ou inserção em um FR ou CDR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir um único aminoácido inserido (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 do H2 e os resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b e 82c e etc, de acordo com Kabat) após o resíduo 82 do FR da cadeia pesada. A numeração dos resíduos de Kabat pode ser determinada para um determinado anticorpo pelo alinhamento das regiões de homologia da seqüência do anticorpo com uma seqüência numerada "padrão" de Kabat.

O sistema de numeração de Kabat é geralmente usado quando se refere a um resíduo no domínio variável (aproximadamente resíduos de 1-107 da cadeia leve e resíduos de 1-113 da cadeia pesada) (por exemplo, Kabat et ai, Sequences of Immunological Interest. 5a Ed. Public Health Sen/ice, National Institutes of Health, Bethesda, (1991)). O "sistema de numeração da EU" ou "índice EU" é geralmente usado quando se refere a um resíduo em uma região constante da cadeia pesada da imunoglobulina (por exemplo, o índice EU relatado em Kabat et ai, Supra; a região de dobradiça no domínio constante da cadeia pesada é aproximadamente os resíduos de 216-230 (numeração EU) da cadeia pesada). O termo "índice EU como em Kabat" refere-se à numeração dos resíduos do anticorpo EU IgGi humano. Salvo quando expresso de outra maneira no presente, as referências aos números de resíduos no domínio variável de anticorpos referem-se a numeração de resíduos pelo sistema de numeração de Kabat. Salvo quando expresso de outra maneira no presente, as referências aos números de resíduos no domínio constante de anticorpos referem-se a numeração de resíduos pelo sistema de numeração EU (vide, por exemplo, Pedido US 60/640.323, Figuras para a numeração EU).

O termo "fragmento de anticorpos" refere-se a uma porção de um anticorpo de comprimento total, em geral, a região de ligação ao alvo ou região variável. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem os fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv. A expressão "fragmento funcional ou análogo" de um anticorpo é um composto que possui atividade biológica qualitativa em comum com um anticorpo de comprimento total. Por exemplo, um fragmento funcional ou análogo de um anticorpo anti-Fator D humano é aquele que pode se ligar especificamente ao fator D humano, de tal forma que inibe ou reduz substancialmente a ativação do complemento. DA formo com é utilizada no presente, a expressão "fragmento funcional" no que diz respeito aos anticorpos, refere-se a fragmentos Fv, F(ab) e F(ab')2. Um fragmento "Fv" é o fragmento mínimo de anticorpo que contém um sítio completo de ligação e reconhecimento do alvo. Esta região é constituída por um dímero de um domínio variável de uma cadeia pesada e uma cadeia leve em uma associação firme, por ligação não-covalente (dímero Vh-Vl). É nesta configuração que os três CDRs de cada domínio variável interagem para formar o sítio de ligação ao alvo sobre a superfície do dímero Vh-Vl. Coletivamente, os seis" CDRs conferem a especificidade de ligação ao alvo para o anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três CDRs específicos para um alvo) tem a capacidade de reconhecer e se ligar ao alvo. Fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou "sFv" compreendem os domínios Vh e Vl de um anticorpo, onde estes domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídica. Geralmente, os polipeptídeos Fv contem ainda uma ponte de ligação polipeptídica entre os domínios Vh e VL, o que permite o sFv formar a estrutura necessária para sua ligação ao alvo.

O fragmento Fab contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos na extremidade cabóxi- terminal do domínio CH1 da cadeia pesada, incluindo um ou mais cisternas da região de dobradiça do anticorpo. Fragmentos F(ab') são produzidos pela clivagem da ponte dé' bissulfeto nas cisteínas da região de dobradiça do produto da digestão por pepsina F(ab')2. Acoplamentos químicos adicionais de fragmentos de anticorpos são conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto. A expressão "anticorpo monoclonal", da forma utilizada no presente, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único sítio antigênico. Além disso, ao contrário das preparações dos anticorpos policlonais que incluem diferentes anticorpos dirigidos a diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido a um único determinante sobre o antígeno. Além de sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos de modo que eles podem ser sintetizados por cultura de hibridomas, não contaminada por outras imunoglobulinas. O adjetivo "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialniente homogênea e não deve ser considerado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais para uso com a presente invenção podem ser isolados de bibliotecas de anticorpos de Fagos utilizando as técnicas conhecidas. Os anticorpos monoclonais parentais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser feitos pelo método de hibridoma primeiramente descrito por Kohler e Milstein, Nature 256, 495 (1975), ou podem ser feitos por métodos recombinantes.

Formas "humanizadas" de anticorpos não-humanos (por exemplo, murinos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulinas ou fragmentos destas (como por exemplo, Fv1 Fab, Fab', F(ab')2 ou outros anticorpos subseqüentes que se ligam ao antígeno) que contêm a seqüência mínima derivada de uma imunoglobulina não humana. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreender de substancialmente todos e, pelo menos, um e, normalmente, dois domínios variáveis, em que todas ou quase todas as regiões CDR correspondem aquelas de uma imunoglobulina não-humana e todas ou quase todas as regiões FR são aquelas seqüências de consenso da imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá de pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) da imunoglobulina, tipicamente aquela escolhida de uma imunoglobulina humana.

Métodos de humanização de anticorpos não-humanos são bem descritos no estado da arte. Geralmente, um anticorpo humanizado contém um ou mais resíduos de aminoácidos nele introduzidos a partir de uma fonte que não é humana. Esses resíduos de aminoácidos não-humanos são muitas vezes denominados resíduos "importados", que são tipicamente retirados de um domínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo-se o método de Winter e colaboradores (Jones et aí., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et ai, Science, 239:1534-1536 (1988)), por meio de substituição de seqüências de regiões hipervariáveis pelas seqüências correspondentes de anticorpo humano. Conseqüentemente, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente US 4.816.567), em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela seqüência correspondente de uma espécie não-humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos, em que alguns resíduos CDR e, possivelmente, alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores. A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leves quanto

pesados, a serem utilizados na fabricação dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade e/ou a resposta HAMA (anticorpo humano anti-camundongo) quando o anticorpo é feito para uso terapêutico em humanos. A redução ou eliminação de uma resposta HAMA é geralmente um aspecto importante do desenvolvimento clínico adequado de agentes terapêuticos. Vide, por exemplo, Khaxzaeli et ai, J. Nati Câncer Inst. (1988), 80:937; Jaffers et ai, Transplantation (1986), 41:572; Shawler et ai, J.

Immunol. (1985), 135:1530; Sears et ai, J. Biol. Response Mod. (1984), 3:138; Millerefa/., B/ood(1983), 62:988; Hakimi et ai, J. Immunol. (1991), 147:1352; Reichmann et al., Nature (1988), 332:323; Junghans et ai, Câncer Res.(1990), 50:1495. Conforme descrito no presente, a invenção fornece anticorpos que são humanizados de modo que a resposta HAMA é reduzida ou eliminada. Variantes destes anticorpos podem ainda ser obtidos através de métodos rotineiros conhecidos no estado da técnica, alguns dos quais estão descritos mais abaixo. De acordo com o método denominado "melhor adequação", a seqüência do domínio variável de um anticorpo de roedor é selecionada em comparação com toda a biblioteca de seqüências de domínio variável humano conhecida. A seqüência do domínio V humano que é mais próxima da seqüência do roedor é identificada e a região de estrutura humana (FR) dentro dele aceita para o anticorpo humanizado (Sims et ai, J. Immunol., 151:2296- 2308 (1993); Chothia e" Leskl J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)). Outro método utiliza uma região de estrutura específica derivada da seqüência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser utilizada para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et ai, Proc. Nati Acad.Sci. USA, 89:4285-4289 (1992); Presta et ai, J. Immunol., 151:2623-2632 (1993)).

Por exemplo, uma seqüência de aminoácidos de um anticorpo, como descrito no presente, pode servir como uma seqüência inicial (parental) para a diversificação da região estrutural e/ou seqüência(s) hipervariável(eis). Uma seqüência da região estrutural selecionada da qual uma seqüência hipervariável inicial está ligada é referida no presente como uma região estrutural humana aceptora. Embora a região estrutural humana aceptora possa ser de, ou derivada de uma imunoglobulina humana (as regiões Vl e/ou Vh desta), a região estrutural humana aceptora pode ser de, ou derivada de uma seqüência da região estrutural de consenso humano tal como as regiões estruturais que têm demonstrado possuir uma imunogenicidade mínima, ou nenhuma em pacientes humanos. Uma "região estrutural humana aceptora", para os propósitos do presente é uma região estrutural contendo a seqüência de aminoácidos de uma região estrutural VL ou VH derivada de uma região estrutural de imunoglobulina humana, ou a partir de uma região estrutural de consenso humano. Uma região estrutural humana aceptora "derivada de" uma região estrutural de imunoglobulina humana ou região estrutural de consenso humano pode compreender a mesma seqüência de aminoácido deste ou pode conter uma mudança na seqüência de aminoácidos pré-existentes. Quando alterações de aminoácidos pré-existentes estão presentes, preferivelmente não 1,5 mais de 5 e preferivelmente 4 ou menos, ou 3 ou menos alterações de aminoácidos pré-existentes estão presentes. Em um exemplo de realização, a região estrutural humana aceptora VH é idêntica, em sua seqüência a seqüência da região estrutural da imunoglobulina humana VH ou seqüência da região estrutural de consenso humano. Em um exemplo de realização, a região estrutural humana aceptora VL é idêntica, em sua seqüência a seqüência da região estrutural da imunoglobulina humana VL ou seqüência da região estrutural de consenso humano. Uma "região estrutural de consenso humano" é uma região estrutural que representa os mais comumente resíduos de aminoácidos que ocorrem em uma seleção de seqüências da região estrutural Vh ou Vl da imunoglobulina humana. Geralmente, a seleção das seqüências Vh ou VLda imunoglobulina humana é originada de um subgrupo de seqüências de domínios variáveis. Geralmente, o subgrupo de seqüências é um subgrupo como em Kabat et al. Em um exemplo de realização, para o VL1 o subgrupo é subgrupo kappa I como em Kabat et al. Em um exemplo de realização, para o VL1 o subgrupo é subgrupo Ill como em Kabat et al.

Quando a região aceptora é derivada de uma imunoglobulina humana, pode-se opcionalmente selecionar uma seqüência da região estrutural que é selecionada com base em sua homologia com a seqüência da região estrutural doadora, pelo alinhamento da seqüência da região estrutural doadora com várias seqüências de regiões estruturais humanas em uma coleção de seqüências de regiões estruturais humanas, e selecionando a seqüência de mais homologia como a região estrutural aceptora. A região estrutural humana aceptora pode ser derivada de seqüencias de linhagens germinativas de anticorpos humanos disponíveis em bases de dados públicas.

Em um exemplo de realização, a região estrutural de consenso humano na presente 'invenção é, ou derivada das, seqüências da região estrutural de consenso VH subgrupo Vll e/ou VL kappa subgrupo I. Em um exemplo de realização, o modelo (template) da região

estrutural humana utilizada para a produção de um anticorpo anti-Fator D pode compreender seqüencias da região estrutural a partir de um modelo que compreende uma combinação do Vl-4.1b+ (família VH7) e JH4d para a cadeia VH (Figura 3) e/ou um combinação do DPK4 (família VkI) e JK2 para a cadeia

VL (Figura 4).

Assim, a região estrutural aceptora VH humana pode incluir uma, duas, três ou todas as seguintes seqüências da região estrutural: FR1 compreendendo QX1QLVQSGX2ELKKPGASVKVSCKAS (aminoácidos 1-25 da SEQ ID No: 27), onde; X1 ê I ou V; X2 é P ou S; FR2 compreendendo WVX3QAPGQGLE (aminoácidos 36-46 da SEQ ID No: 27), onde X3 é K ou R; FR3 compreendendo r FVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAX4 YYCX5R (aminoácidos 67-98 da SEQ ID No: 27), onde é X4 é T ou V, X5 é E ou A; FR4 compreendendo WGQGTLVTVSS (aminoácidos 105-115 da SEQ ID No: 8 ou aminoácidos 105-115 da SEQ ID No: 27).

Exemplos de região estrutural de consenso VH incluem: região estrutural de consenso VH humanos subgrupo I menos CDRs de Kabat (SEQ ID No: 28);

região estrutural de consenso VH humano subgrupo I menos

regiões hipervariáveis alongadas (SEQ ID Nos: 29-31);

região estrutural de consenso VH humanos subgrupo Il menos

CDRs de Kabat (SEQ ID No: 32);

região estrutural de consenso VH humano subgrupo Il menos regiões hipervariáveis alongadas (SEQ ID Nos: 33-35);

região estrutural de consenso VH humanos subgrupo Ill menos CDRs de Kabat (SEQ ID No: 36);

região estrutural de consenso VH humano subgrupo Ill menos regiões hipervariáveis alongadas (SEQ ID Nos: 37-39); região estrutural de consenso VH humanos subgrupo Vll menos

a

CDRs de Kabat (SEQ ID No: 55);

região estrutural de consenso VH humano subgrupo Vll menos regiões hipervariáveis alongadas (SEQ ID Nos: 56-58);

região estrutural aceptora VH humano menos CDRs de Kabat (SEQ ID No: 40); região estrutural aceptora VH humano menos regiões hipervariáveis alongadas (SEQ ID Nos: 41-42);

região estrutural aceptora 2 VH humano menos CDRs de Kabat (SEQ ID No: 43); região estrutural aceptora 2 VH humano menos regiões

hipervariáveis alongadas (SEQ ID Nos: 44-45). Em um exemplo de realização, a região estrutural aceptora VH

humana compreende, duas, três ou todas as seguintes seqüências da região estrutural:

FR1 compreendendo QVQLVQSGPELKKPGASVKVSCKAS (aminoácidos 1-25 da SEQ ID No: 8); FR2 compreendendo WVRQAPGQGLE (aminoácidos 36-46 da SEQ ID No: 8); FR3 compreendendo RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCER (aminoácidos 67-98 da SEQ ID No: 8), RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCE (aminoácidos 67-97 da SEQ ID No: 8), RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC (aminoácidos 67-96 da SEQ ID No: 8), RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCS (SEQ ID No: 51), ou RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCSR (SEQ ID No: 52); FR4 compreendendo WGQGTLVTVSS (aminoácidos 105-115 da SEQ ID No: 8 ou

aminoácidos 105-115 da SEQ ID No: 27).

A região estrutural aceptora VL humana pode incluir uma, duas, três ou todas as seguintes seqüências da região estrutural:

FR1 compreendendo DIQX6TQSPSSLSX7SVGDRVTITC (aminoácidos 1-23 da SEQ ID No: 26), onde X6 é V ou M, X7 é M ou A; FR2 compreendendo WYQCiKPGKX8PKLLIX9 (aminoácidos 35-49 da SEQ ID No: 26), onde X8 é P ou V, X9 é S ou Y; FR3 compreendendo GVPSRFSX10SGSGX11DFTLTISSLQPEDVATYYC (aminoácidos 57-88 da SEQ ID No: 26), onde é X10 é S ou G, Xn é A ou T; FR4 compreendendo FGQGTKX12EIK (SEQ ID NO: 54), onde X12 é V ou L.

Exemplos de regiões estruturais de consenso VL incluem: região estrutural de consenso VL kappa humano subgrupo I (SEQ

ID No: 47);

região estrutural de consenso VL kappa humano subgrupo Il (SEQ ID No: 48);

região estrutural de consenso VL kappa humano subgrupo Ill

(SEQ ID No: 49); ou

região estrutural de consenso VL kappa humano subgrupo IV

(SEQ ID No: 50).

Em um exemplo de realização, a região estrutural aceptora VL humana pode compreender uma, duas, três ou todas as seguintes seqüências

da região estrutural:

FR1 compreendendo DIQVTQSPSSLSASVGDRVTITC (aminoácidos 1-23 da SEQ ID No: 7); FR2 compreendendo WYQQKPGKVPKLLIS (aminoácidos 35-49 da SEQ ID No: 7); FR3 compreendendo GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC (aminoácidos 57-88 da SEQ ID No: 7); FR4 compreendendo FGQGTKLEIK (aminoácidos 98- 107 da SEQ ID No: 7) ou FGQGTKVEIK (SEQ ID No: 53).

Embora o aceptor possa ser idêntico, em sua seqüência, a região estrutural humana selecionada, seja esta a partir de uma imunoglobulina humana ou uma região estrutural de consenso humano, a presente invenção contempla que a seqüência aceptora pode incluir substituições pré-existentes de aminoácidos em relação à seqüência de imunoglobulina humana ou região estrutural de consenso humano. Estas substituições pré-existentes são preferencialmente mínimas; normalmente quatro, três, dois ou uma diferença de aminoácido apenas em relação à seqüência da imunoglobulina humana ou região estrutural de consenso humano.

Os resíduos da região hipervariável do anticorpo não-humano são incorporados na região estrutural aceptora VL e/ou VH humana. Por exemplo, ele pode incorporar resíduos correspondentes aos resíduos CDR de Kabat, os resíduos da alça hipervariável de Chothia, resíduos AbM, e/ou resíduos de contato. Opcionalmente, os resíduos das regiões hipervariáveis alongadas, são incorporados da seguinte forma: 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3), 26-35 (H1), 50-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-102 ou 95-102 (H3).

Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo compreendendo pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 compreendendo a seqüência de aminoácidos selecionada da SEQ ID No: 13 e SEQ ID No: 25; (b) HVR-H2 compreendendo a seqüência de 10

aminoácidos selecionàda a partir da SEQ ID No: 14; (c) HVR-H3 compreendendo a seqüência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 15 e SEQ ID No: 20; (d) HVR-L1 compreendendo a seqüência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 16; (e) HVR-L2 compreendendo a seqüência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 17, SEQ ID No; 21 e SEQ ID No: 23; e (f) HVR-L3 compreendendo a seqüência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 18, SEQ ID No:

22 e SEQ ID No: 24.

Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-Fator D compreendendo pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) uma HVR-H1 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenham pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade na seqüência com uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 13 e SEQ ID No: 25; (b) um HVR -H2 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenham pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade na seqüência com uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 14; (c) um HVR-H3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenham pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade na seqüência com uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 15 e SEQ ID No: 20; (d) um HVR-L1 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenham pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% , 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade na seqüência com uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 16; (e) uma HVR-L2 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenham pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade na seqüência com uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 17, SEQ ID No: 21 e SEQ ID No: 23; e (f) um HVR-L3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenham pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade na seqüência com uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 22 e SEQ ID No: 24. Em alguns exemplos de realização, um HVR que possuí uma seqüência de aminoácidos que tenham pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade na seqüência contém substituições, inserções ou deleções em relação à seqüência de referência, mas o anticorpo compreendendo tal seqüência de aminoácidos ainda mantém a capacidade de se ligar ao Fator D. Em alguns exemplos de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos, foram substituídos, inseridos ou deletados em relação a seqüência de referência selecionada a partir do grupo constituído pelas SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 25, SEQ ID No: 14, SEQ ID No: 15, SEQ ID No: 20, SEQ ID No: 16, SEQ ID No: 17, SEQ ID NO ; 21, SEQ ID No: 23, SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 22 e SEQ ID No: 24. Em alguns exemplos de realização, a invenção fornece um anticorpo compreendendo pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 13 e SEQ ID No: 25; (b) HVR-H2 compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 14; (c) HVR-H3 compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 15 e SEQ ID No: 20; (d) HVR-L1 compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 16; (e) HVR-L2 compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 17, SEQ ID NO; 21 e SEQ ID No: 23; e (f) HVR-L3 compreendendo a seqüência de aminoácidos selecionada da SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 22 e SEQ ID No: 24. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que

compreende um domínio variável de cadeia pesada selecionado a partir da SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 10 e SEQ ID NO: 12. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia leve selecionado a partir da SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 9 e SEQ; ID NO: 11. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID No: 6. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID No: 5. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID No: 6 e domínio variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID No: 5. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID No: 8. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID No: 7. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID No: 8 e domínio variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID No: 7. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID No: 10. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID No: 9. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID No: 10 e domínio variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID No: 9. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesáda compreendendo a SEQ ID No: 12. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID No: 11. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID No: 12 e domínio variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID No: 11. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-Fator D compreendendo um domínio variável de cadeia pesada que compreenda uma seqüência de aminoácidos que tenham pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade na seqüência com uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir do grupo constituído pelas SEQ ID Nos: 6, 8, 10 e 12. Em alguns exemplos de realização, uma seqüência de aminoácidos que tenham pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade na seqüência, contém substituições, inserções ou deleções em relação à seqüência de referência, mas o anticorpo compreendendo tal seqüência de aminoácidos ainda sim mantém a capacidade de se ligar ao Fator D. Em alguns exemplos de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos, foram substituídos, inseridos ou deletados de uma seqüência selecionada a partir do grupo constituído pela SEQ ID No: 6, 8, 10 ou 12. Em alguns exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões fora da HVRs (ou seja, nas FRs). Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-Fator D inclui um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo constituído pelas seqüências SEQ ID Nos: 6, 8,10 ou 12.

Em alguns exemplos de realização, a invenção fornece um anticorpo anti-Fator D compreendendo um domínio variável de cadeia leve que compreenda uma seqüência de aminoácidos que tenham pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade" na seqüência com uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir do grupo constituído pelas seqüências SEQ ID Nos: 5, 7, 9 e 11. Em alguns exemplos de realização, uma seqüência de aminoácidos que tenham pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade na seqüência, contém substituições, inserções ou deleções em relação à seqüência de referência, mas o anticorpo compreendendo tal seqüência de aminoácidos ainda sim mantém a capacidade de se ligar ao Fator D. Em alguns exemplos de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos, foram substituídos, inseridos ou deletados de uma seqüência selecionada a partir do grupo constituído pelas seqüências SEQ ID No: 5, 7, 9 e 11. Em alguns exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões fora da HVRs (ou seja, nas FRs). Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-Fator D inclui um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo constituído pelas seqüências SEQ ID Nos: 5, 7,9 e 11.

Um anticorpo anti-Fator D pode incluir qualquer seqüência

adequada do domínio variável da região estrutural, desde que o anticorpo mantenha a capacidade de se ligar ao Fator D. Por exemplo, em alguns exemplos de realização, anticorpos anti-Fator D da presente invenção compreendem uma seqüência do domínio variável da cadeia pesada da região estrutural que é uma combinação da Vl.4.1 b+ e JH4d (vide Figura 3). Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti-Fator D da presente invenção compreendem uma seqüência de consenso da região estrutural da cadeia pesada subgrupo Vll humana.Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti-Fator D da presente invenção compreendem uma seqüência do domínio variável de cadeia pesada da região estrutural contendo um FR1 compreendendo os aminoácidos 1-25 da SEQ ID No: 8; FR2 compreendendo os aminoácidos 36-46 da SEQ ID No: 8, FR3 compreendendo os aminoácidos 67-98 da SEQ ID No: 8 e FR4 compreendendo os aminoácidos 105-115 da SEQ ID No: 8 Em um exemplo de realização destes anticorpos, a seqüência do domínio variável da cadeia pesada inclui substituição(ões) na(s) posição(ões) 40 e/ou 88 (numeração de Kabat). Em um exemplo de realização destes anticorpos, a posição 40 é cisteína (C) ou alanina (A) e/ou a posição 88 é cisteína (C) ou alanina (A). Em alguns exemplos de realização, anticorpos anti- Fator D da presente invenção compreendem uma seqüência do domínio variável da cadeia leve da região estrutural que é uma combinação da DPK4 e JK2 (vide Figura 4). Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti- Fator D da presente invenção compreendem uma seqüência de consenso da região estrutural da cadeia leve kappa I (κΙ) humana. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti-Fator D da presente invenção compreendem uma seqüência do domínio variável de cadeia leve da região estrutural contendo um FR1 compreendendo os aminoácidos 1-23 da SEQ ID No: 7; FR2 compreendendo os aminoácidos 35-49 da SEQ ID No: 7, FR3 compreendendo os aminoácidos 57-88 da SEQ ID No: 7 e FR4 compreendendo os aminoácidos 98-107 da SEQ ID No: 7 Em um exemplo de realização destes anticorpos, a seqüência do domínio variável da cadeia leve da região estrutural compreende uma ou mias substituição(ões) na(s) posição(ões) 15, 43 e/ou 104 (numeração de Kabat). Em um exemplo de realização destes anticorpos, a posição 15 é cisteína (C) ou valina (V), a posição 43 é cisteína (C) ou alanina (A) e/ou a posição 104 é valina (V) ou Ieucina (L).

Além diséo, um anticorpo anti-Fator D pode incluir qualquer seqüência adequada de um domínio constante, desde que o anticorpo mantenha a capacidade de se ligar ao Fator D. Por exemplo, em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti-Fator D da presente invenção compreendem pelo menos uma porção de um domínio constante de cadeia pesada. Em um exemplo de realização, anticorpos anti-Fator D da presente invenção compreendem uma seqüência do domínio constante da cadeia pesada de cada uma ou uma combinação de cadeias pesadas α, δ, ε, γ ou μ. Dependendo da seqüência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas (CH), as imunoglobulinas podem ser classificadas em classes ou isotipos diferentes. Existem cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que possuem cadeias pesadas designadas, α, δ, ε, γ ou μ respectivamente. As classes γ e α são ainda divididas em subclasses, com base em diferenças relativamente pequenas nas seqüências do Ch e na função delas, por exemplo, os humanos expressam as seguintes subclasses: IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2. Em um exemplo de realização, anticorpos anti- Fator D da presente invenção compreendem uma seqüência do domínio constante da cadeia pesada compreendendo substituições nas posições de aminoácidos que resultam em um efeito desejado sobre a função efetora (por exemplo, afinidade de ligação). Em um exemplo de realização, anticorpos anti- Fator D da presente invenção compreendem uma seqüência do domínio constante da cadeia pesada compreendendo substituições nas posições de aminoácidos que não resultam em um efeito sobre a função efetora (por exemplo, afinidade de ligação). Em um exemplo de realização, anticorpos anti- Fator D da presente invenção compreende um domínio constante de cadeia pesada do tipo IgG (por exemplo, IgGi, IgG2, IgG3 ou IgG4) e inclui ainda uma substituição na posição 114 (numeração de Kabat1 equivalente a posição 118 na numeração EU), 168 (numeração de Kabat; equivalente a posição 172 na numeração EU), 172 (numeração de Kabat; equivalente a 176 na numeração EU) e/ou 228 (numeração EU). Em um exemplo de realização, anticorpos anti- Fator D da presente invenção compreende um domínio constante de cadeia pesada do tipo IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4) e compreendem ainda uma substituição na posição 114, em que a posição 114 é uma cisteína (C) ou alanina (A), a posição 168 é cisteína (C) ou alanina (A), a posição 172 é uma cisteína (C) ou alanina (A) e/ou a posição 228 é uma prolina (P), arginina (R) ou serina ( S).

Além disso, por exemplo, em alguns exemplos de realização, os

anticorpos anti-Fator D da presente invenção compreendem de pelo menos uma porção do domínio constante da cadeia leve. Em um exemplo de realização, anticorpos anti-Fator D da presente invenção compreendem um domínio constante de cadeia leve de cada, ou de uma combinação de, uma cadeia leve kappa ou lambda, como a cadeia leve de qualquer espécie de vertebrados que possa ser atribuída a um dos dois tipos claramente distintos, denominados de kappa e lambda, com base nas seqüências de aminoácidos de seu domínio constante. Em um exemplo de realização, anticorpos anti-Fator D da presente invenção compreendem um domínio constante da cadeia leve compreendendo substituições nas posições de aminoácidos que resultam em um efeito desejado sobre a função efetora (por exemplo, afinidade de ligação). Em um exemplo de realização, anticorpos anti-Fator D da presente invenção compreendem um domínio constante da cadeia leve compreendendo substituições nas posições de aminoácidos que não resultam em um efeito sobre a função efetora (por exemplo, afinidade de ligação). Em um exemplo de realização, anticorpos anti-Fator D da presente invenção compreendem um domínio constante da cadeia leve do tipo kappa e compreendem adicionalmente de uma substituição na posição 110, 144, 146 e/ou 168 (numeração de Kabat). Em um exemplo de realização, anticorpos anti-Fator D da presente invenção compreendem um domínio constante de cadeia leve do tipo kappa e compreendem adicionalmente de uma substituição na posição 110, em que a posição'110 é uma cisteína (C) ou alanina (A), a posição 146 é uma isoleucina (I) ou valina (V) e/ou na posição 168, em que a posição 168 é

uma cisteína (C) ou serina ( S).

Em um aspecto, a presente invenção fornece anticorpos que competem com o anticorpo murino 166-32 e/ou anticorpo anti-fator D humanizado clone #56, #111, #250 ou #416, e/ou um anticorpo compreendendo seqüências do domínio variável ou HVR do anticorpo anti- fator-D humanizado clone #56, #111, #250 ou #416. São também fornecidos anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que os anticorpos murinos 166-32 e/ou anticorpo anti-fator D humanizado clone #56, #111, #250 ou #416, e/ou um anticorpo compreendendo seqüências do domínio variável ou HVR do anticorpo anti-fator-D humanizado clone #56, #111, #250 ou #416.

Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D em que a afinidade monovalente do anticorpo para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) é mais baixa, por exemplo, pelo menos, 1 ou 2 vezes inferior a afinidade monovalente de um anticorpo quimérico (por exemplo, a afinidade dos anticorpos quiméricos como um fragmento Fab para o fator D), compreendendo, constando ou consistindo essencialmente de um domínio variável de cadeia leve da SEQ ID No: 2 e domínio variável de pesados cadeia

da SEQ ID No: 1.

Em um exemplo de realização, o presente invenção fornece um

anticorpo anti-fator D em que a afinidade bivalente do anticorpo para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) é mais baixa, por exemplo, pelo menos, 1 ou 2 vezes inferior do que a afinidade bivalente de um anticorpo quimérico (por exemplo, a afinidade dos anticorpos quiméricos como um fragmento Fab para o fator D), compreendendo, constando ou consistindo essencialmente de um domínio variável de cadeia leve da SEQ ID No: 2 e domínio variável de pesados cadeia da SEQ ID No: 1.

Em outro exemplo de realização, o presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D em que a afinidade monovalente do anticorpo para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) é maior, por exemplo, pelo menos 1 ou 2 vezes maior do que a afinidade monovalente de um anticorpo quimérico (por exemplo, a afinidade do anticorpo quimérico como um fragmento Fab para o fator D), compreendendo, constando ou consistindo essencialmente de um domínio variável de cadeia leve da SEQ ID No: 2 e domínio variável de pesados cadeia da SEQ ID No: 1.

Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) é de 1,0 nM (1,0x10"9 M ) ou melhor. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) é de 0,5 nM (0,5x10"9 M ) ou melhor. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) é de 1,0 pM (1,0x10'12 M ) ou melhor. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) é de 0,5 pM (0,5x10"12 M ) ou melhor. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um

anticorpo anti-Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um IgG para o Fator D) é de 1,0 nM (1,0x10"9 M ) ou melhor. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua formá bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um IgG para o Fator D) é de 0,5 nM (0,5x10 9 M ) ou melhor. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um IgG para o Fator D) é de 1,0 pM (1,0x10"12 M ) ou melhor. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um IgG para o Fator D) é de 0,5 pM (0,5x1012 M) ou melhor. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) está entre 0,5 mM (0,5x106 M) e 0,5 pM (0,5x10"12 M ). Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) está entre 15 nM (15x10"9 M) e 0,1 nM (0,1x10'9 M). Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) está entre 5,5 nM (5,5x10-9 M) e 1 nM (1x10 9 M). Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) está entre 0,5 pM (0,5x10"12 M) e 2 pM (2x10-12 M).

Em outrò exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Fator D ém que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um IgG para o Fator D) está entre 0,5 mM (0,5x10 6 M) e 0,5 pM (0,5x10"12 M ). Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um IgG para o Fator D) está entre 10 nM (10x10"9 M ) e 0,005 nM (0,05x10"9 M). Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um IgG para o Fator D) está entre 5,5 nM (5,5x10 9 M) e 1 nM (1x10 9 M). Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti- Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um IgG para o Fator D) está entre 0,5 pM (0,5x10"12 M ) e 2 pM (2x10"12 Μ).

Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) é de cerca de 3,7 nM (3,7x10"9 M ). Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) é de cerca de 3,3 nM (3,3x10"9 M ). Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) é de cerca de 5,1 nM (5,1χ1Ό"9 M ). Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) é de cerca dè 2,7 nM (2,7x10"9 M ). Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) é de cerca de 1,4 nM (1,4x10 9 M ). Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) é de cerca de 1,4 pM (1,4x10"12 M ). Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um IgG para o Fator D) é de cerca de 1,1 pM (1,1x10"12 Μ). Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) é de cerca de 0,19 nM (0,19 x10"9 M). Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti- Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um IgG para o Fator D) é de cerca de 0,08 nM (0,08x10"9 M). Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalentê para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) é de cerca de 12,3 nM (12,3x10 9 M ). Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um IgG para o Fator D) é de

cerca de 9,0 nM (9,0 x10 9 M).

Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) é de cerca de 1,4 pM (1,4 x10"12 Μ) ± 0,5. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti- Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um IgG para o Fator D) é de cerca de 1,1 pM (1,1x10"12 M) ±0,6. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) é de cerca de 0,19 nM (0,19 χ 10"9 Μ) ± .01. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um IgG para o Fator D) é de cerca de 0,08 nM (0,08x10"9 Μ) ± 0,01. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) é de cerca de 12,3 nM (12,3x109 Μ) ± 2. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Fator D em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um IgG para o Fator D) é de cerca de 9,0 nM (9,0x10"9 Μ) ± 1. Em outro exemplo de realização, um anticorpo anti-Fator D pode

ter uma afinidade em sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) de cerca de 3,7 nM (3,7x10 9 Μ) ± 2. Em outro exemplo de realização, um anticorpo anti-Fator D pode ter uma afinidade em sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D)' de cerca de 3,3 nM (3,3x10"9 Μ) ± 2. Em outro exemplo de realização, um anticorpo anti-Fator D pode ter uma afinidade em sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) de cerca de 5,1 nM (5,1x10 9 Μ) ± 2. Em outro exemplo de realização, um anticorpo anti-Fator D pode ter uma afinidade em sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) de cerca de 2,7 nM (2,7x109 Μ) ± 2. Em outro exemplo de realização, um anticorpo anti-Fator D pode ter uma afinidade em sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) de cerca de 1,4 nM (1,4x10"9 Μ) ± 2. Em outro exemplo de realização, um anticorpo anti-Fator D pode ter uma afinidade em sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) de cerca de 1,4 pM (1,4x10"12 Μ) ± 2. Em outro exemplo de realização, um anticorpo anti-Fator D pode ter uma afinidade em sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um IgG para o Fator D) de cerca de 1,1 pM (1,1x10"12 Μ) ± 2. Em outro exemplo de realização, um anticorpo anti-Fator D pode ter uma afinidade em sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) de cerca de 0,19 nM (0,19x10"9 Μ) ± 2. Em outro exemplo de realização, um anticorpo anti-Fator D pode ter uma afinidade em sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um IgG para o Fator D) de cerca de 0,08 nM (0,08x10 9 Μ) ± 2. Em outro exemplo de realização, um anticorpo anti-Fator D pode ter uma afinidade em sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) de cerca de 12,3 nM (12,3x109 Μ) ± 2. Em outro exemplo de realização, um anticorpo anti-Fator D pode ter uma afinidade em sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um IgG para o Fator D) de cerca de 9,0 nM (9,0x10 9 Μ) ± 2.

Como é bem estabelecida no estado da técnica, a afinidade de ligação de um Iigante ao seu receptor pode ser determinado por meio de qualquer um de uma variedade de ensaios, e expresso em termos de uma variedade de valores quantitativos. Assim, em um exemplo de realização, a afinidade de ligação é expressa como valores Kd e reflete a afinidade de ligação intrínseca (por exemplo, com efeitos de avidez minimizados). Geralmente, e preferencialmente, a afinidade de ligação é mensurada de maneira in vitro, seja em uma célula livre ou em um conjunto de células associadas. Conforme descrito em maior detalhe no presente, a diferença de aumento na afinidade de ligação pode ser quantificada em termos de proporção (razão) entre o valor da afinidade de ligação monovalente do anticorpo humanizado (por exemplo, na forma Fab) e o valor da afinidade de ligação monovalente de um anticorpo de referência/comparação (por exemplo, na forma Fab) (por exemplo, um anticorpo murino com as seqüências da região hipervariável doadora), onde os valores da afinidade de ligação são determinados sob condições de ensaio semelhantes. Assim, em um exemplo de realização, a diferença de aumento na afinidade de ligação é determinada como uma relação entre o valor de Kd do anticorpo humanizado na forma Fab e o anticorpo de referência/comparação mencionado. Por exemplo, em um exemplo de realização, se um anticorpo da presente invenção (A) tem uma afinidade que é "3 vezes menor" do que a afinidade de um anticorpo de referência (M), então se o valor de Kd para A é 3x, o valor de Kd para M seria 1x, ea relação (razão) de Kd de A para Kd de M seria de 3:1. De maneira inversa, em um exemplo de realização, se um anticorpo da presente invenção (C) tem uma afinidade que é "3 vezes maior" do que a afinidade de um anticorpo de refèrência (R), então o valor de Kd para C é 1x, o valor de Kd para R seria 3x, e a relação (razão) de Kd de C para Kd de R seria de 1:3. Qualquer um de uma série de experimentos conhecidos no estado da técnica, incluindo os descritos no presente, pode ser utilizado para se obter medições da afinidade de ligação, incluindo, por exemplo, o ensaio de Biacore, radioimunoensaio (RIA) e ELISA.

Além disso, os valore de Kd para um anticorpo da presente invenção pode variar dependendo das condições do ensaio utilizado em particular. Por exemplo, em um exemplo de realização, as medições da afinidade de ligação podem ser obtidas em um ensaio onde o Fab ou o anticorpo é imobilizados a ligação do ligante, ou seja, o Fator D, é mensurada ou alternativamente, o ligante, ou seja, o Fator D, para o anticorpo ou Fab é imobilizado e a ligação do Fab ou anticorpo é mensurada. Em um exemplo de realização, as mensurações da afinidade de ligação podem ser obtidas em um ensaio em que as condições de regeneração podem incluir (1) 10 mM de glicina ou 4M de MgCI2 em pH 1,5, e (2) pH entre pH 1,0 e pH 7,5, incluindo o pH 1,5, pH 5,0, pH 6,0 e pH 7,2. Em um exemplo de realização, as mensurações da afinidade de ligação podem ser obtidas em um ensaio em que as condições de ligação podem incluir (1) tampão salina PBS ou HEPES e (2) Tween-20, ou seja, Tween-20 a 0,1%. Em um exemplo de realização, as mensurações da afinidade de ligação podem ser obtidas em um ensaio em que a fonte do ligante, ou seja, o fator D pode ser de uma fonte disponível comercialmente. Em um exemplo de realização, as medições da afinidade de ligação podem ser obtidas em que (1) o Fab ou o anticorpo é imobilizado e a ligação do ligante, ou seja, o fator D é mensurado, (2) a condição de regeneração contém 4 mM de MgCI2 m pH 7,2 e (3) as condições de ligação compreendem tampão salina HEPES, pH 7,2 contendo 0,1% de Tween-20. Em um exemplo de realização, as medições da afinidade de ligação podem ser obtidas em que (1) o ligante, ou seja, o fator D é imobilizado e a ligação do Fab ou anticorpo é mensurada, (2) as condições de regeneração compreendem glicina a 10 mM em pH 1,5 e (3) a condição de ligação compreende tampão PBS.

Os termos "célula", "linhagem celular" e "cultura celular" incluem as progênies. É também compreendido que todas as progênies podem não ser precisamente idênticas com relação ao conteúdo de DNA, devido a mutações propositais ou involuntárias. Progênies variantes, que tem a mesma função ou propriedade biológica, tal como as selecionadas como células transformadas originalmente, estão incluídas. As "células hospedeiras" utilizadas na presente invenção são geralmente hospedeiras procarióticas ou eucarióticas. O termo "Vetor" designa uma construção de DNA contendo uma

seqüência de DNA que está operativamente ligado a uma seqüência controle adequada capaz de efetuar a expressão do DNA em um hospedeiro adequado. Tais seqüências controle incluem um promotor para realizar a transcrição, uma sequencia operadora opcional para controlar essa transcri^ao, uma seqiiencia de codificagao adequada com sitios de Iiga^ao do ribossomo no mRNA, e sequencias que controlam a termiriagao de transcripao e tradu9§o. O vetor pode ser um plasmideo, uma particula de Fago1 ou simplesmente um potencial genomico inserido. Uma vez transformada em um bom hospedeiro, ο vetor pode se replicar e funcionar independentemente do genoma hospedeiro, ou podem, em alguns casos, se integrar no genoma. Na presente descri^ao da invengao os termos "plasmidio" e "vetor" sao muitas vezes utilizados de forma alternada, pelo fato do plasmideo ser a forma mais comumente utilizada de vetor. Entretanto, a ϊηνβηφ§ο pretende abranger essas outras formas de veto res, que possuem fun?ao equivalente, e que sao, ou tornar-se-ao, conhecidos no estado da tecnica.

A palavra "marcador", quando utilizado no presente, refere-se a um composto ou composigao detectavel que possa ser conjugado de maneira direta ou indiretamente a uma molecula ou proteina, por exemplo, um anticorpo. O marcador pode ser detectavel per se (por exemplo, marcadores

«I

radioisotopes ou marcadores fluorescentes), ou, no caso de um marcador enzimatico, pode catalisar uma reagao quimica de um composto ou composigao de substrato que se torna detectavel. Conforme e utilizado no presente, ο termo "fase solida" designa

uma matriz nao-aquosa no qual ο anticorpo da presente inven9§o pode aderir. Exemplos de fases solidas abrangidas no presente incluem aquelas formadas parcialmente ou totalmente de vidro (por exemplo, vidro com tamanhos de poros controlados), polissacarideos (por exemplo, agarose), poliacrilamida, poliestireno, alcool polivinilico e silicones. Em certos exemplos de realizagao, dependendo do contexto, a fase solida pode compreender ο ροςο de uma placa de ensaio; em outros, e uma coluna de purificagao (por exemplo, uma coluna

de cromatografia por afinidade). Producao de Anticorpos

Celulas hospedeiras adequadas para a clonagem ou expressao de DNA nos vetores da presente inven^ao sao celulas procarioticas, leveduras, ou celulas eucarioticas superiores. Celulas procarioticas adequadas para esta realizagao incluem tanto organismos gram-negativos quanto gram-positivos, por exempio, Enterobacterias1 tais como E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia e Shigella, bem como Bacilli, Pseudomonas, e Streptomyces. Um clone preferido de E. coli hospedeira e a E. coli 294 (ATCC 31.446), embora outras cepas, como a E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31537) e E. coli W3110 (ATCC 27325) sejam adequadas. Estes exemplos sao ilustrativos e nao limitantes.

Alem de procariotos, microbios eucariotos tais como, fungos filamentosos e leveduras sao hospedeiros adequados para a clonagem ou expressao dos vetores que codificam ο anticorpo. Saccharomyces cerevisiae e ο microorganismo eucarioto mais comumente utilizado entre os microorganismos hospedeiros eucariotos inferiores. Entretanto, uma variedade de outros generos, especies e cepas sao comumente disponiveis e Oteis para a presente invengao, tal;como, Schizosaccharomyces pom be·, Kluyveromyces] Candida·’ Trichoderma; Neurospora crassa e fungos filamentosos como, por exempio, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium e Aspergillus, tais como ο A. nidulans e A. niger.

Celulas hospedeiras adequadas para a expressao de anticorpos glicosilados sao derivadas de organismos multicelulares. Em principio, qualquer cuItura de ceiula eucariotica superior e viavel, seja a partir de uma cuItura de celulas de vertebrados ou invertebrados. Exemplos de celulas de invertebrados incluem celulas vegetais e celulas de inseto, Luckow et al.,

Bio/Technology 6, 47-55 (1988), Miller et al., Genetic Engineering, Setlow et al. Eds. Vol. 8, pp. 277-279 (Plenam publishing 1986); Mseda et a/.’ Nature 315, 592-594 (1985). Foram identificadas numerosas cepas de baculovirus e celulas hospedeiras de insetos variantes e correspondentes permissivos a partir de hospedeiros como, Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes (mosquitos), Drosophila mela门ogaster (mosca de fruta), e Bombyx mori. Uma variedade de cepas virais para a transfec?ao esta disponivel publicamente, por exemplo, a variante L-1 da Autographa californica NPV e a cepa Bm-5 da Bombyx mori NPV, e esses virus podem ser usados como ο virus de acordo com a presente invensao’ particularmente na transfecgao de celulas da Spodoptera frugiperda. Alem disso, culturas de celulas vegetais de algodao, milho, batata, soja, petCinia, tomate e tabaco tambem podem ser utilizadas como hospedeiras.

Celulas de vertebrados e a propagagao de celulas de vertebrados, em cuItura (cultura de tecidos) tornaram-se um procedimento rotineiro. Vide, Tissue Culture, Academic Press, Kruse e Patterson, Eds. (1973). Exemplos de Iinhagem de celulas hospedeiras de mamiferos Citeis sao; de rim de macaco,

Λ

Iinhagem de celulas erhbrionarias de rim humano, celulas renais de hamster neonato; celulas de ovario de hamster chines/ DHFR (CHO, Urlaub et al·, Proc. Natl.. Acad. USA. 77: 4216 (1980 )); celulas de Sertoli de camundongos; celulas de carcinoma cervical humano (HeLa); celulas renais caninas; celulas de pulmao humano, celulas de figado humano; celulas de tumor mamario de camundongo e celulas NSO.

As celulai hospedeiras sao transformadas com os vetores acima descritos para produgao de anticorpos e cultivadas em meio nutriente convencional modificado de forma a ser apropriado para a indugao dos promotores, selegao de transformantes ou amplifica9ao dos genes que codificam as seqCiencias desejadas.

As celulas hospedeiras utilizadas para a produgao dos anticorpos

variante desta invengao podem ser cultivadas em uma variedade de meios de cultura. Meios de cuItura comercialmente disponiveis, tais como ο meio Ham's F10 (Sigma), Meio Essencial Minimo (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Meio de Eagle modificado da Dulbecco (DMEM1 Sigma) sao adequados para a cultura de celulas hospedeiras. Alem disso, qualquer um dos meios descritos em Ham et at., Meth. Enzymoi 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patente US 4.767.704, US 4.657.866, US 4.560.655, US 5.122.469’ US 5.712.163 ou US 6.048.728 podem ser utilizados como meios de cultura para as celulas hospedeiras. Qualquer um destes meios pode ser suplementado, se necessario, com hormonios e/ou outros fatores de crescimento (como a insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidermico), sais (como cloretos de X，onde X e de sodio, calcio, magnesio e fosfatos), tampoes (como HEPES), nucleotideos (tais como a adenosina e timidina), antibioticos (como GENTAMYCINA®), oligoelementos (definidas como compostos inorganicos normalmente presentes em concentragoes finais na ordem micromolar), e glicose ou uma fonte equivalente de energia. Quaisquer outros suplementos necessarios podem tambem ser incluidos em concentra^oes adequadas que seria conhecida pelos tecnicos no assunto. As condigoes de cultura tais como, temperatura, pH, e similares sao aquelas anteriormente utilizadas com a celula hospedeira selecionada para expressao, e sera evidente para ο tecnico habil no assunto.

Purificacao do Anticorpo Quando tecnicas recombinantes sao utilizadas, os anticorpos podem ser produzidos intracelularmente, no espago periplasmatico ou secretados diretamente no meio. Se ο anticorpo variante e produzido de forma intracelular, como uma primeira etapa, os residuos particulados, tanto de celulas hospedeiras quanto fragmentos lisados, sao removidos, por exemplo, atraves de centrifugagao ou uItrafiItragao. Carter et al., Bio/Technology 10:163-

167 (1992) descreve um procedimento para isolar anticorpos secretados para ο espago periplasmatico de Ε. coli. Em resumo, a pasta celular e fundida na presen?a de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA, e fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) durante 30 min. Os residuos celulares podem ser removidos atraves de centrifugagao. Quando ο anticorpo variante e secretado no meio, sobrenadantes a partir destes sistemas de expressao sao, em geral, primeiramente concentrados atraves do uso de um filtro de concentragao proteica comercialmente disponivel, por exemplo, uma unidade de ultrafiltragao Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protease tal como ο PMSF pode ser incluido em qualquer uma das etapas acima para inibir a proteolise e antibioticos podem ser incluidos para prevenir ο crescimento de contaminantes indesejados.

A composigao de anticorpo preparada a partir de celulas pode ser purificada atraves do dso, por exemplo, da cromatografia em hidroxilapatita, eletroforese em gel, dialise, e cromatografia por afinidade, com a cromatografia por afinidade sendo a tecnica de purifica^ao preferida. A disponibilidade da proteina A como um Iigante por afinidade depende das especies e isotipos de qualquer dominio Fc de imunoglobulina que esta presente no anticorpo variante. A proteina A pode ser utilizada para purificar anticorpos que sao baseados nas cadeias pesadas do IgG1, IgG2 ou IgG4 humanos (Lindmark et a/., J. Immunol. Meth, 62:1-13 (1983)). A proteina G e recomendada para todos os isotipos de camundongos e para ο IgG3 humano (Guss et a!., EMBO J: 5:15671575 (1986)). A matriz ao qual ο Iigante de afinidade e acoplado e mais freqQentemente, agarose, mas tambem sao disponiveis outras matrizes. Matrizes mecanicamente estaveis tais como vidro com poros controlados ou poli(estirenodivinil)benzeno permitem velocidade de fluxo mais rapidas e tempo de processamento mais curto do que os que podem ser alcangados com agarose. Quando ο anticorpo variante compreende um dominio CH3, a resina

Bakerbond ABX® (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) e Citil para purificasao. Outras tecnicas para a purificasao de proteina tais como fracionamento em uma coluna de troca ionica, precipitagao em etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em silica, cromatografia em heparins SEPHAROSE®, cromatografia em uma resina de troca cationica ou anionica (tal como uma coluna de acido poliaspartico), cromatofocusagao, SDS-PAGE, e precipitagao em suIfato de amonio tambem estao disponiveis dependendo do anticorpo a ser recuperado.

Apos qualquer (quaisquer) etapa(s) de purificagao preliminar, a mistura que compreende ο anticorpo variante de interesse e contaminarites pode ser submetida a cromat ografia de interagao hidrofobica de baixo pH utilizando uma eluigao tamponada a um pH de cerca de 2,5-4,5, preferencialmente reaiizada sob baixas concentragoes de sal (como, cerca de O -0,25 M de sal).

Formulacoes Farmaceuticas

Formularies terapeuticas do polipeptideo ou anticorpo da

«

invengao podem ser preparadas na forma de formulagoes Iiofilizadas ou

、、

solugoes aquosas atraves da mistura do polipeptideo que tenha ο grau desejado de ρUreza com veiculos "farmaceuticamente aceitaveis" opcionais, excipientes ou estabilizantes tipicamente empregados na tecnica (todos os quais sao denominados "excipientes"). Por exemplo, agentes de tamponamento, agentes estabilizantes, agentes conservantes, isotonificantes, detergentes nao-ionicos, antioxidantes e outros aditivos diversos. (Vide, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Edigao, Ed. A. Osol, (1980)). Tais aditivos devem ser atcfxicos aos recipientes nas dosagens e concentra^oes utilizadas.

Agentes de tamponamento ajudam a manter ο pH no intervalo que se aproxima das condigoes fisiologicas. Eles estao presentes

preferencialmente em um intervalo de concentragiao variando em cerca de 2 mM a 50 mM. Agentes de tamponamento adequados para uso na presente invengao incluem tanto acidos organicos quanto inorganicos e seus sais como, por exemplo, ο tampao citrato (por exemplo, mistura de citrato-monossodio e citrato dissodico, mistura de acido citrico e citrato trissodico, mistura de acido citrico e citrato monossodico, etc), tampoes succinato (por exemplo, mistura de acido succinico e succinato monossodico, mistura de acido succinico e hidroxido de sodio, mistura de acido succinico e succinato dissodico, etc), tampaes tartarato (por exemplo, mistura de acido tartarico e tartarato de sodio, mistura de acido tartarico e tartarato de potassio, mistura de acido tartarico e hidroxido de sodio, etc), tampoes fumarato (por exemplo, mistura de acido fumarico e fumarato monossodio, etc), tampoes fumarato (por exemplo, mistura de acido fumarico e fumarato monossodio, mistura de acido fumarico e fumarato dissodico, mistura de fumarato monossodio e fumarato dissodico, etc), tampoes gluconato (por exemplo, mistura de acido gluconico e gliconato de sodio, mistura de acido gluconico e hidroxido de sodio, mistura de acido gluconico e gliconato de potassio, etc), tampoes oxalato (por exemplo, mistura de acido oxalico e oxalato de sodio, mistura de acido oxalico e hidroxido de sodio, mistura de acido oxalico e oxalato de potassio, etc), tampoes Iactato (por exemplo, mistura de acido Iactico e Iactato de sodio, mistura de acido Iactico e hidroxido de sodio, mistura de acido Iatico e Iactato de potassio, etc) e tampoes acetato (por exemplo, mistura de acido acetico e acetato de sodio, mistura de acido acetico e hidroxido de sodio, etc.) Alem disso, podem ser mencionados os tampoes fosfato, tampoes histidina e sais trimetilamina como, Por exemplo, ο Tris.

Conservantes podem ser adicionados para retard a r ο crescimento

microbiano, e podem ser adicionados em quantidades variando de 0,2% -1% (p / ν). Conservantes adequados para ο uso com a presente inven^ao incluem

fenol, alcool berizilico, meta-cresol, metil parabeno, propilparabeno.cloreto de octadecildimetilbenzilamonio, benzalc6nio halogenatos (por exemplo, cloreto, brometo, iodeto), cloreto de hexametonio, alquil parabenos, tal como metil- ou propil-parabeno, catecol, resorcinol, ciclo-hexanol e 3-pentanol.

Isotonificantes por vezes conhecidos como "estabilizantes" podem ser adicionados para garantir a isotonicidade de composigoes Iiquidas da presente invengao e incluem alcoois de agCicar poli-hidrico, de preferencia tri- hidrico ou superiores, tais como a glicerina, eritritoi, arabitoi, xilitol, sorbitol e manitol.

Estabilizantes referem-se a uma vasta categoria de excipientes que podem variar na fungao desde um agente de volume ate um aditivo que solubiliza ο agente teriipeutico ou ajuda a evitar desnaturagao ou aderencia nas paredes do recipiente. Estabilizantes tipicos podem ser alcoois agiCicar poli- hidricos (referidos acima); aminoacidos como a arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina； histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, acido glutamico, treonina e etc agCicares organicos ou alcoois agiicar, como a lactose, trealose, estaquiose, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol e similares, incluindo ciclitois, como inositol; polietileno glicol; polimeros aminoacido;cenxofre contendo agentes redutores, como a ureia , glutationa, acido tioctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol,. aIfa-monotiogIicerol e sulfato de tio-sodio; polipeptideos de baixo peso molecular (ou seja, <10 residuos); proteinas como a albumina humana, albumina serica bovina, gelatina ou imunoglobulinas’ polimeros h id rofi licos, tais como polivinilpirrolidona monossacaride, como a xilose, manose, frutose, glicose; dissacaridios como a lactose, maltose, sacarose e trissacarideos como a rafinose; polissacarideos como ο dextrano. Estabilizantes podem estar presentes no intervalo de 0,1 a 10.000 em peso por parte de massa ativa de proteina.

Tensoativ6s nao-ionicos ou detergentes (tambem conhecidos como "agentes umidificantes") podem ser adicionados para ajudar a solubilizar ο agente terapeutico, bem como para proteger as proteinas terapeuticas contra a agregapao induzida pela agitagao, que tambem permite a formulagao ser exposta ao estresse de cisalhamento da superficie sem causar a desnaturagao da proteina. Tensoativos nao-ionicos apropriados inclui polissorbatos (20, 80, etc), polioxameros (184, 188 etc), Pluronic.RTM. poliois, polioxietileno sorbitano monoeteres (Tween.RTM.-20, Tween.RTM.-80, etc.) Tensoativos nao-ionicos podem estar presentes'em um intervalo de cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 1,0 mg/ml, preferencialmente cerca de 0,07 mg/ml a cerca de 0,2 mg/ml. -io Diversos excipientes adicionais incluem agentes de volume (por

exemplo, amido), quelantes (por exemplo, EDTA), antioxidantes (por exemplo, ο acido ascorbico, rrietionina, vitamina E), e co-solventes. A presente formula^ao tambem pode conter mais de um composto ativo de acordo com a necessidade para a indicagao especifica a ser tratada, preferencialmente aqueles com atividades complementares que nao prejudiquem os outros. Por exemplo, pode ser desejavel fornecer ainda um agente imunossupressor. Tais moleculas estao presentes de maneira adequada na combinagao em quantidades que sejam eficazes para os fins pretendidos. Os ingredientes ativos podem tambem ser armazenados em microcapsula preparadas, por exemplo, atraves de tecnicas de coacervagao ou atraves de polimerizagao interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcapsulas de gelatina e microcapsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsoes, nano-particulas e nanocapsulas) ou em macroemulsoes. Ditas tecnicas sao descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Edigao, Ed. A. Gennaro, (1980).

As formulagoes a serem utilizadas para administra^ao in vivo

deverao ser estereis Isso e facilmente obtido por filtragem atraves de membranas de filtragem estereis. Podem ser preparadas preparagoes de

Iiberagao prolongada, Exemplos adequados de prepara9oes de libera?ao

prolongada incluem matrizes semi-permeaveis de polimeros solidos

hidrofobicos contendo ο anticorpo, no qual as matrizes sao moldadas em forma

de artigos, por exemplo, filmes ou microcapsulas. Exemplos adicionais de

matrizes de Iiberagao 丨prolongada incluem poliesteres, hidrogeis (tais como

poli(2-hidroxietilmetacrilato) ou alcool (poli)vinilico, polilactideos (Patente US

3.773.919), copolimeros de acido L-glutamico e L-glutamato, etileno vinil

acetato nao degradavel, copolimeros degradaveis de acido Iactico e acido

glicolico, tais como LUPRON DEPOT® (microesferas injetaveis compostas de

copolimero de acido Iactico e acido glicolico e acetato de leuprolida) e acido

p0li-D-(-)-3-hidroxibutirico. Enquanto tais como polimeros de etileno vinil

acetato e acido Iatico - acido glicolico permitem a Iiberagao de moleculas por

mais de 100 dias, determinados tipos de hidrogeis Iiberam proteinas para

periodos curtos de tempo. Quando anticorpos encapsulados permanecem no ；. ,

corpo por um Iongo tempo, eles podem sofre desnaturagao ou agregagao

resultante da exposi^ao a umidade a 37 。C, resultando em uma perda da

atividade biologica e possiveis mudangas em sua imunogenicidade. Estrategias

racionais podem ser elaboradas para a estabilizagao, dependendo do

mecanismo envolvido. Por exemplo, se ο mecanismo de agregagao e

descoberto por ser a forma^ao de uma ponte S-S intermolecular atraves do

intercambio de tio-dissulfureto, a estabilizapao pode ser alcan^ada atraves da

modificagao nos residuos sulfidrilicos, Iiofilizando a partir de solu5oes acidas,

controlando a umidade, com a utilizagao de aditivos e desenvolvendo

composites de matriz com polimeros especificos.

A quantidade de polipeptideos terapeuticos, anticorpo ou fragmento deste, que vai sera eficaz no tratamento de um distCirbio ou condigao

especifica dependera da natureza do distCirbio ou condigao, e pode ser determinado por tecnicas padrao da clinica. Sempre que possivel, e desejavel determinar a curva dose-resposta e as composigoes farmaceuticas da inven^ao, primeiro de maneira in vitro e, em seguida em sistemas de modelos animais Citeis, antes da realizagao dos testes em seres humanos.

Em um exemplo de realizagao especifico, uma solu^ao aquosa de um polipeptideo terapeutico, anticorpo ou fragmento deste, e administrada por injegao subcutanea. Cada dose pode variar entre cerca de 0,5 pg a 50 pg/kg de peso corporal, ou preferencialmente, cerca de 3 pg a 30 Mg/kg de peso corporal.

Os esquemas de dosagem para a administragao subcutanea pode variar de uma vez por mes ate uma vez por dia em fungao de uma serie de fatores clinicos, incluindo ο tipo de doenga, a gravidade da doenga, e a sensibilidade do paciente para ο agente terapeutico.

Usos Para O Anticorpo Humanizado

Os anticorpos humanizados da presente invenq;ao sao Citeis para ensaios diagnosticos, por exemplo, para detectar a expressao de um alvo de interesse em celulas especificas, tecidos ou soro. Para aplica9oes diagnosticas, ο anticorpo variante tipicamente sera marcado com uma molecula detectavel. Uma variedade de marcadores esta disponivel. Tecnicas para quantificar uma mudariga na fluorescencia sao descritas acima. O substrato quimioluminescente torna-se excitado eletronicamente por uma rea^ao quimica e pode, entao, emitir Iuz que pode ser mensurada (usando um quimioluminometro) ou doa energia para um aceptor fluorescente. Exemplos de marcadores enzimaticos incluem Iuciferases (por exemplo, Luciferase firefly e Luciferases bacterianas (Patente US 4.737.456), Luciferina1 2,3- dihidroftalazinadionas, malato desidrogenase, urease, peroxidases como, por exemplo, peroxidase 'do rabano silvestre (HRP), fosfatase alcalina, β- galactosidase, glicoamilase, lisozima, sacarina oxidases (por exemplo, gIicose 15

20

25

oxidase, galactose oxidase, e glicose-6-fosfato-desidrogenase), oxidases heterociclicas (tais como uricase e xantina oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase e similares. Tecnicas para a conjugagao de enzimas aos anticorpos estao descritas em O'Sullivan et al., "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay" em: Methods in Enzym., Ed. J.J. Langone e H. Van Vunakis1 Academic Press, Nova lorque’ vol. 73, pags. 147-166 (1981).

Algumas vezes, ο marcador e conjugado indiretamente com ο anticorpo variante. Os tecnicos habeis no assunto terao conhecimento de diversas tecnicas para se chegar a isso. Por exemplo, ο anticorpo variante pode ser conjugado com biotina e qualquer um das tres grandes categorias de marcadores mencionados acima pode ser conjugado com a avidina, ou vice- versa. A biotina se Iiga^seletivamente a avidina e, assim, ο marcador pode ser conjugado com ο anticorpo variante de forma indireta. Alternativamente, para atingir a conjugagao indireta do marcador com ο anticorpo variante, ο anticorpo variante e conjugado com um pequeno hapteno (por exemplo, digloxina) e um dos diferentes tipos de marcadores mencionados acima e conjugado com um anticorpo anti-hapteno variante (por exemplo, anticorpos anti-digloxina). Assim, a conjugagao indireta do marcador com ο anticorpo variante pode ser alcangado.

Em οutro exemplo re realizagao da presente ίηνβηςβο, ο anticorpo variante nao precisa ser marcado, e a presenga deste pode ser detectada utilizando um anticorpo marcado que se Iiga ao anticorpo variante.

Os anticorpos da presente invengao podem ser empregados em qualquer metodo de ensaio conhecido, tais como ensaios de Iigagao competitiva, ensaios do tipo sanduiche diretos e indiretos e ensaios de imunoprecipitagao. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pags. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987). Ensaios de Iigagao competitivos contam com a capacidade de um marcador padrao competir com a amostra teste pela liga?ao com uma quantidade Iimitada de anticorpos variante. A quantidade de alvos na amostra teste e inversamente proporcional a quantidade de padrao que estara Iigada aos anticorpos. Para facilitar a determinate da quantidade de padrao que se tornara ligado, os anticorpos sao geralmente insolubilizados antes ou depois da competi^ao. Como resultado, ο padrao e a amostra que estao Iigados aos anticorpos podem convenientemente ser separados do padrao e a amostra teste continua ligada.

Ensaios do tipo sanduiche envolvem ο uso de dois anticorpos,

todos capazes de se Iigar a outra porgao imunogenica, ou epitopo, ou proteina a ser detectada. Em um ensaio do tipo sanduiche, a amostra a ser analisada e ligada a um primeiro anticorpo que esta imobilizado em um suporte solido, e, posteriormente, um segundo anticorpo liga-se a amostra, formando um complexo insoliivel em tres partes. Vide, por exemplo, a Patente US 4.376.110. O segundo anticorpo pode ele mesmo ser marcado com uma molecula detectavel (ensaio sanduiche direto) ou pode ser mensurado utilizando um anticorpo anti-imunogldbulina que e marcado com uma molecula detectavel (ensaio sanduiche indireto). Por exemplo, um tipo de ensaio sanduiche e um ensaio ELISA1 no caso a molecula detectavel e uma enzima.

Para a imuno-histoquimica, a amostra de tumor pode ser fresca ou congelada ou pode ser emblocada em parafina e fixada com conservantes,

como ο formol, por exemplo.

Os anticorpos tambem podem ser utilizados para ensaios diagnosticos in vivo. Geralmente, ο anticorpo variante e marcado com um radionucleotideo (tal como, Sup.111 In, .sup.99 Tc,. Sup.14 C, .sup.131 I, •sup.3 H, .sup.32 P ou .sup.35 S) de modo que ο tumor possa ser Iocalizado

utilizando a imuno-cintilografia. Por exemplo, uma anticorpo anti-lgE de alta afinidade da presente inven?ao pode ser utilizado para detectar a quantidade de IgE presente, por exemplo, nos pulmoes de um paciente asmatico.

O anticorpo da presente invengao pode ser oferecido em um kit, ou seja, combinagao de reagentes embalados em quantidades predeterminadas com instrug5es para a realizagao do teste diagnostico. Quando ο anticorpo variante e ma read ο com uma enzima, ο kit pode incluir substratos e co-fatores exigidos pela enzima (por exemplo, um substrato precursor que fornece ο cromoforo ou fluoroforo detectavel). Alem disso, outros aditivos podem ser incluidos, tais como estabilizantes, tampoes (por exemplo, tampao de bloqueio ou tampao de lise) e similares. As quantidades relativas dos varios reagentes podem variar amplamente para fornecer concentragoes na solu9§o dos reagentes que otimizam substancialmente a sensibilidade do ensaio. Particularmente, os reagentes podem ser fornecidos na forma de ρό seco, geralmente liofilizado, incluindo excipientes sobre ο qual a dissolugao ira

fornecer uma solugao reagente contendo a concentragao adequada. »

Usos In Vivo Para O Anticorpo

E contemplado que os anticorpos da presente invengao' podem ser usados para tratar Lim mamifero. Em um exemplo de realizagao ο anticorpo e administrado a um mamifero nao humano, para os propositos de obtenq;ao de dados pre-clinicos, por exemplo. Exemplos de mamiferos nao humanos para serem tratados incluem primatas nao humanos, caes, gatos, roedores e outros mamiferos nos quais estudos pre-clinicos sao realizados. Esses mamiferos podem ser modelos estabelecidos de animais para uma doenga a ser tratada com ο anticorpo ou podem ser utilizados para ο estudo da toxicidade do anticorpo de interesse. Em cad a um destes exemplos de realizagao, os estudos da curva de dose podem ser realizados no mamifero.

O anticorpo ou polipeptideo e administrado por qualquer meio

adequado, incluindo parenteral, subcutanea, intraperitoneal, intrapulmonares, e intra-nasal, e, se desejado para ο tratamento imunossupressor local, a administrapao intralesional. Na Infusao parenteral estao incluidas, infusao intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou administragao subcutanea. Alem disso, ο anticorpo variante e devidamente administrado por infusao de pulso, especialmente com doses decrescentes do anticorpo Γ.

variante. Preferencialrnente a dosagem e dada por inje^oes, mais preferencialmente por injegoes intravenosas ou subcutaneas, dependendo, em parte, se a administragao e breve ou cronica.

Para a prevengao ou tratamento da doenga, a dose adequada de anticorpo ou polipeptideo dependera do tipo de doeriga a ser tratada, da gravidade e evolugao da doen^a, se ο anticorpo variante e administrado para fins preventivos ou terapeuticos, da terapia anterior, da historia clinica do paciente e da resposta ao anticorpo e, ο do criterio do medico.

Dependendo do tipo e da gravidade da doensa, cerca de 0,1 mg/kg a 150 mg/kg (pbr exemplo, 0,1-20 mg/kg) de anticorpo e uma dose inicial ' candidata para ser administrada ao paciente, por exemplo, por uma ou mais administragoes separadas ou por infusao continua. Uma dose diaria tipica pode estar entre cerca de 1 mg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para as administra^oes repetidas ao Iongo de varios dias ou mais, dependendo da condigao, ο tratamento e mantido ate que ocorra a supressao pretendida dos sintomas da doenga. No entanto, outros regimes de dosagens podem ser iiteis. O progresso desta terapia e facilmente monitorada por tecnicas convenciohais e ensaios. Um regime de dosagem exemplar esta divulgado no documento WO 94/04188. As composigoes de anticorpo podem ser formuladas, dosadas e

administradas de uma forma consistente com a boa pratica medica. Fatores para serem considerados neste context。incluem ο distiirbio especifico a ser

tratado, ο mamifero especifico a ser tratado, ο estado clinico de cada paciente, a causa do distCirbio, ο sitio de entrega do agente, ο metodo de administragao, ο esquema de administragao, e outros fatores conhecidos pelos medicos. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" de anticorpo a ser administrado sera regido por tais considerag5es, e e a quantidade minima necessaria para prevenir, atenuar ou tratar uma doenga ou distCirbio. O anticorpo nao e necessariamente, mas e opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente utilizados para prevenir ou tratar ο disturbio em questao. A quantidade eficaz destes outros agentes depende da quantidade de anticorpos presentes na formulagao, do tipo de distCirbio ou tratamento e de outros fatores discutidos acima. Estes sao geralmente utilizados na mesma dosagem e com as vias de administra^ao utilizadas como mencionado anteriormente ou cerca de 1 a 99% das doses empregadas ate agora no presente.

Os anticorpos da presente inven^ao，que reconhecem ο Fator D como seu alvo, podem ser utilizados para tratar disturbios mediados pelo complemento. Estes tlistiirbios estao associados com a ativapao excessiva ou ‘ descontrolada do complemento. Eles incluem a ativaqiao do complemento durante operagoes com circulagao extracorporea; ativapao do complemento devido a isquemia e reperfusao apos infarto agudo do miocardio, aneurisma, acidente vascular cerebral, choque hemorragico, Iesao por esmagamento, falencia miiltipla de orgaos, choque hipovolemico e isquemia intestinal. Estes distiirbios podem tambem incluir doen^as ou condigoes em uma condigao inflamatoria, tais como queimaduras graves, endotoxemia, choque septico, sindrome do desconforto respiratorio aduIto1 hemodialise; choque anafilatico, asma grave, angioedema, doenga de Crohn, anemia falciforme, glomerulonefrite pos-estreptococica e pancreatite. O distCirbio pode ser resultado de uma reagSo adversa ao medicamento, aIergia ao medicamento, sindrome de extravasamento vascular induzido por IL-2 ou alergia ao meio de

contraste radiografico. Inclui tambem doengas auto-imunes, como ICipus eritematoso sistemico, miastenia gravis, artrite reumatoide, doenga de Alzheimer e a esclerose mCiltipla. A ativa^ao do complemento tambem esta associada com a rejeigao de transplante. Recentemente foi demonstrada uma forte correla^ao entre a ativa^ao do complemento com doengas oculares, como a degeneragao macular relacionada com a idade e retinopatia diabetica.

Exemplos

Os exemplos seguintes sao oferecidos com ο objetivo de ilustrar e nao sao destinados a:limitar a invengao.

Exemplo 1

Humanizacao do Mab 166-32 Murino Para Fator D

As seqdencias da regiao variavel de cadeia pesada (Vh) e da regiao variavel de cadeia Ieve (Vl) do mAb 166-32 murino foram comparadas com seqQencia de anticorpo humana de Iinhagem germinal disponivel em bases de dados pCiblicas. Varios criterios foram utilizados no momento de se optar por um modelo, como descrito na etapa 1 acima, incluindo ο comprimento • total, posigao de CDR semelhante dentro da regiao estrutural, homologia total, tamanho do CDR1 etc Todos estes criterios em conjunto forneceram um resultado para a escolha do modelo humano otimo como mostrado no alinhamento da seqCieficia entre as seqiiencias da cadeia Ieve e pesada do MAb 166-32 e as respectivas seqiiencias do modelos humano representadas

nas Figuras 3 e 4.

Neste caso, mais do que um modelo de regiao estrutural humana foi utilizado para ο desenvolvimento deste anticorpo. O modelo humano escolhido para a cadeia Vh foi uma combinafao do VI-4.1 b+ (locus 7-04.1) (n° de acesso X62110) (familia VH7) e JH4d (vide Figura 3). O modelo humano escolhido para a cadeia Vl foi uma combinagao do DPK4 (familia VKI) combinado com JK2 (vide Figura 4).

Uma vez que ο modelo foi escolhido, uma biblioteca de Fab foi construida por sintese de DNA e sobreposta por PCR. A biblioteca foi composta por CDRs sintetizados de MAb 166-32 sintetizado com os respectivos modelos humanos escolhidos. A sobreposigao de nucleotideos que codificam as sequencias parciais de Vh e Vl foram sintetizados em um intervalo de cerca de 63 a cerca de 76 nucleotideos, com a sobreposigao de 18 a 21 nucleotideos. Vetores expressando uma biblioteca de Fabs humanizados contra ο antigeno do Fator D foram construidos, e utilizados para a transformagao de E. coli DH10B que foram entao plaqueadas em placas com XL-1B.

A qualidade da biblioteca foi avaliada pelo tamanho (o niimero de

clones independentes) e diversidade (a distribui^ao das mutagoes). Foram seqiienciadas cerca de 14 de 20 clones individuals com dupla inser?§o de ambas as cadeias Ieve e pesada. Mutagoes oscilantes da regiao estrutural foram distribuidas uniformemente. A amplificagao por PCR do gene Vl e Vh foi realizada utilizando

* um primer direito biotinilado contendo a sequencia especifica para a regiao estrutural FR1 e uma seqdencia sobressalente anelada a seqQencia Iider final (GeneIII) e um primer reverso a partir da regiao constante conservada (CK ou CH1), sob condigoes padrao da PCR. O produto da PCR foi purificado por eletroforese em gel agarose, ou por kit de purificagao de PCR comercial para remover primers biotinilados nao incorporados e nao-especificos no PCR.

Exemplo2 Seleqao da Biblioteca Para a primeira selegao foi utilizado um ensaio de captura por filtragem "Capture Filter Lift'. O tamanho da selegao atual e mais que 3 vezes maior do que ο tamanho especulado da biblioteca. Os candidatos foram selecionados por um ensaio de ELISA de ponto ύηΐοο. Os melhores Iigantes

foram ainda confirmados por titulagao direta do antigeno usando Fator D baseado na concentragao de Fab.

Selegao por "capture lift"

O ensaio de captura por filtragem do tipo "Capture Filter Lift foi utilizado para a primeira sele?ao para a Iiga^ao do Fab ao Fator D. Os Fagos com valores de titulagao altas foram plaqueados e incubados a 37 0C ate sua utilizagao (cerca de 6-8 h). Anticorpos de cabra anti-kappa humano foram diluidos para 10 pg/ml em 10 ml PBST; Filtros de nitrocelulose para mobilidade das placas foram preparados de acordo c0m os procedimentos pad roes para a mobilidade em placa e, em seguida, imersos em 10ml de tampao de bloqueio por 2 horas em um agitador. Os fiItros foram Iavados 3x com PBST. Os fiItros foram aplicados a uma placa e incubados em temperatura ambiente por cerca de 15-24 horas. Os fiItros foram entao, removidos das placas e Iavados 3x com TBST.

O fator D (50 pg/ml) foi diluido em PBST a 0,1 Mg/ml e foi adicionado 4ml por flltro. Os filtros foram incubados na solugao por 2 horas sobre um agitador em temperatura ambiente seguido por 3 Iavagens a cada 5min. HRP-166-222 “ diluido (1:10.000 com PBST) foi adicionado a um volume de 4 ml por filtro e os filtros foram incubados por t hora em um agitador. Os filtros foram Iavados 4x. Os filtros foram secos e entao imersos em substrata TMB seguido pela imers§o em agua para parar a reagao. Os clones positivos foram identificados. Exemplo 3

SgLECAO POR ELISA DE PONTO llNICO

Urn ensaio de ELISA de ponto Linico foi utilizado para a selegao secundaria. Placas Immulon Il foram revestidas com anticorpos de cabra anti-Fab humano (1:12.000, 50 μΙ/ροςο) durante a noite em temperatura ambiente. No dia seguinte, as placas foram Iavadas 4x com um Iavador de placas. O tampao de bloqueio foi acrescentado a um volume bem de 100 μΙ por placas e incubadas durante 1 hora em temperatura ambiente. As placas foram entao Iavadas por 4x.

Cada Fab de ser selecionado foi adicionado a um volume de 50 μΙ por 15

20

ρος;ο (tanto a partir de 15ml da preparagao periplasmatica ou do sobrenadante) e incubadas por 1 hora epi temperatura ambiente. As placas foram Iavadas por 4x seguida pela adigao de 50 μΙ/pogo de fator D biotinilado a 0,01 Mg/ml. As placas foram incubadas por 1 hora em temperatura ambiente e entao Iavadas por 4x. A estreptoavidina-HRP foi adicionada (1:10.000 em PBST) e incubadas por 1 hora a temperatura ambiente. As placas foram Iavadas por 5x e, em seguida, desenvolvidas pela adi?ao de 50 μΙ/ρος;ο do substrata TMB. O tampao de bloqueio foi adicionado a um volume de 50 μΙ quando a reagao nos pogos ocorrera (10-45 min) e as placas foram Iidas a 450 nm.

Exemplo4

SEQijENClAMENTO DOS CLONES ANTI-FATOR HUMANIZADOS

Dezesseis clones humanizados com boa afinidade de Iigagao para ο fator D humano foram seqQenciados (vide a Tabela 1). Entre estes, a posigao 2 (100% humano) e 49 (100% do camundongo) na cadeia leve, e a posigao 93 (100% do camundongo) na cadeia pesada sao altamente conservadas indicandb que elas sao importantes na manutengao da capacidade de Iigapao do anticorpo.

Tabela 1

Analise Da SeqOencia De Aminoacidos Dos Clones Humanizados A Partir

VK 2 4 13 43 49 64 69 VH 2 9 38 93 97 Camundongo 丁 4 V M P S S A I P K T E Humano I I M A V Y G T V S R V A 7 I M M V S S T I P K V E I V A V S S A V P K T E 45 i V M V S G A I S R V E 46 I V M V S S T I S R V E VK 2 4 13 43 49 64 69 VH 2 9 38 93 97 47 j V A V S S T I S R V E 48 ϊ V M V S S T V P R V E 50 I V M V S G A V P R T E 51 I M M V S G T I S K T E 56 I V A V S G T V P K T E 57 I M M V S S A V S R V E 58 I V M P S G A V P R V E 59 I V A P S S T V P K V E 60 ί V M P S G T V P R V E 63 I V M V S S T V S R T E 74 V M V S S T I S R V E

O clone #56 foi avaliado pela analise com BIAcore e ensaio de inibigao da hemolise. A analise de BIAcore mostrou que ο clone #56 tern uma

afinidade ao fator D humano semelhante similar ao Fab 166-32 quimerico (vide,

»

• Tabela 4). O ensaio de inibi?ao da hemolise mostrou que ο clone #56 e um pouco mais potente do que ο Fab 166-32 quimerico (vide, Figura 6). O clone

#56 contem dois residuos murinos na regiao estrutural da cadeia Ieve e quatro i.

residuos murinos na cadeia pesada (vide, Tabela 1). Com base nestes

ρ

resultados, uma otimizagao adicional foi realizada.

Tabela2

Analise Da SeqOencia De Aminoacidos De Anticorpos Humanizados A Partir

Da B 旧 lioteba De Humanizaqao/ Otimizacao dps CDR3s

Posi^oes VK 2 4 13 43 49 64 69 CDR-L3 92 93 97 166-32 : T V M P S S A D N T Modelo Humano I M A V Y G T 104 I V M P S S T D S T PosiQoes VK 2 4 13 43 49 64 69 CDR-L3 92 93 97 109 I V A V S G A M N T 111 I V A V S G T D S T 112 I V A V S G T D S T 114 I V A V S G T D C T 121 I V A V S S A D N T 125 I V A P S S T D N T 130 I V A V S S T D N S

Posigoes VH 2 9 38 93 97 CDR-H3 98 99 100 166-32 I P K T E V D N Modelo Humano V S R V A 104 V S R V E V D T 109 V S R V E V N N 111 V S R V E V N N 112 V S R V E V N N 114 V S K V E V N N 121 I S R V E V N T 125 V S R V E P D N 130 V S R V E V D H

O clone #111 e #114 foram caracterizados pelo ensaio de BIAcore (vide, Tabela 4). O clone #104 e #111 foram tambem caracterizados pelo ensaio de inibi^ao da hemolise (vide, Figura 6). Esses clones possuem maiores afinidades do que ο quimerico 166-32, e sao mais potentes do que ο Fab quimerico na inibigao da via alternativa demonstrado pelo ensaio de inibi^ao da hemolise (Figura 7). O clone #111 cont6m os mesmos dois residuos murinos na cadeia Ieve (posigao 4 e 49) como no clone #56. Contem tambem residuos murinos conservados na posigao 97 da cadeia pesada como encontrado no clone #56. Existe uma muta?ao benefica em ambas as cadeias Ieves e pesadas CDR3 no clone #111. A partir de duas bibliotecas independentes selecionadas (biblioteca de humanizagao, e biblioteca de humanizagao/otimizagao de CDR3s), verificou-se que os melhores clones tem

residuos de consensos similares.

Para otimizar ainda mais a afinidade do clone #111’ uma

biblioteca de anticorpo foi construida pela introdugao de muta^oes pontuais no CDR-H1 e CDR-L2 simultaneamente. Resumidamente, a mutagenese sitio- dirigida foi utilizada para construir tais bibliotecas pelo anelamento de oligonucleotideos que codificam mutagoes pontuais no molde do clone #111. Um total de 24 clones com alta afinidade para ο Fator D humano foi seqOenciado. Entre os 24 clones, varias muta?oes beneficas redundantes foram identificadas. Os clones #250’ #315’ #345 e #416 foram selecionados pela analise de BIAcore (vide, Tabela 4). Os dados do BIAcore mostraram que

* esses clones tem maior afinidade ao fator D humano do que ο clone inicial

• #111. Os clones #250, #315, #348 e #416 foram tambem testados pelo ensaio de inibigao da hemolise (vide, Figura 6) e inibi^ao da via alternativa (Figura 7).

Exemplo5

Ensaio de Hemolise AP

A fungao biologica dos clones humanizados foi determinada atraves do ensaio de inibigao da hemolise e analise por BIAcore (vide Exemplo 6 abaixo). O ensaio hemolitico foi realizado de acordo com ο seguinte procedimento. 20 μΙ de globulos vermelhos de coelho (RRBC) diluidos 1:20 (0,5 m| + 9,5 ml GVB/Mg-tampao EGTA) em 20 ml de solugao salina (0,9% NaCI) em aproximadamente uma diluigao de 1:2x104 foram contadas com um contador Coulter. A concentragao de celulas foi entao ajustada para cerca de 2- x104 celulas/ml. Cada placa recebeu cerca de 500 x106 RRBC/placa ou cerca de 1 ml RRBC/placa (500 x106 / 2-5 x104).

As celulas foram diluidas em 6 ml GVB/Mg-tampao EGTA/placa, misturadas e Iavadas 3 vezes por centrifugagao a 1360 rpm χ 4 min a 4 °C. O sedimento de RRBC foi suspenso em 3 ml de GVB/Mg-tampao EGTA/placa e mantidos em gelo.

Soro humano armazenado em freezer -80 0C foi descongelado pouco antes do uso. O soro foi diluido a uma concentragao de 20% de soro em GVB/Mg-tampao EGTA, 5 ml/placa (final de 10%) e mantido em gelo.

Tabela3

2 3 S SB

GVB/Mg-EGTA: 50 μΙ ^^ 50 μΙ μΙ 50 μΙ 50 μΙ mAb: mix de50 μΙ bO μΙ “ 50 μΙ >50 μΙ — 20% de soro Hu:' 50 μΙ 50 μΙ 50 μΙ 50 μΙ 50 μΙ Agitagao por 30 segundos a 5-6 0C ；’e em seguida mantido em temp. ambiente por 7 min. RBC de coelho: 30 μΙ 30 μΙ 30 μΙ 30 μΙ

As amostras foram agitadas por 30 segundos a 5-6 0C e, em

seguida, durante 40 minutos a 37 °C. As amostras foram resfriadas a 5-6 °C sob agita9§o e entao centrifugadas a 2.000 rpm χ 3 minutos a 4 °C. Cerca de 80 μΙ do sobrenadante foi transferido para uma placa de 96 pogos de fundo chato e os valores O.D. a 590 nm foi lido atraves de uma Ieitora de placa padrao. A percentagem de inibigao foi calculada da seguinte forma: % inibigao ={[(S-SB) - (U-SB)] / (S-SB)} χ 100%. (U = amostra 1, 2 ou 3 (colunas 1’ 2 ou 3 da Tabela 3，respectivamente).

Exemplo6

Analise Cinetica do Fab Anti-Fator D Humano por BiaCore

Imobilizagao- Fator D humano (Advanced Research lnc, 0,1

mg/ml) foi imobilizada diretamente no chip CM5 (BiaCore)1 utilizando um metodo de Iigagao com a amina. O procedimento e descrito resumidamente da seguinte forma: (1) Fluxo constante de (PBS) de 5 μΙ/min. (2) injepao de 35 μΙ de EDC/NHS (1:1). (3) injegao de 35 μΙ do fator D humano em tampao acetato, pH 4,5. (4) Bloqueio do grupo ativado pela injegao de 35 μΙ etolamina. (5) Iimpeza da superficie com 5 μΙ de glicina 10 mM, pH 1,5. O nivel de imobilizagao do Iigante (fator D humano) e de cerca de 1.000 RU. O Ensaio corre utilizando um fator D humano (huDi, 40 μΙ, 31,5 pg/ml) produzindo uma resposta de cerca de 900 RU.

Analise Cinetica -Todos os FAbs anti-fator D humano foram diluidos em tampao PBS. Cada amostra foi preparada em uma serie de concentragoes: 12,5 nM, 25 nM, 50 nM, 75nM, 100 nM, 125 nM e 150 nM, com 40 μΙ de pulso de injegao em uma aIta taxa de aquisigao. A regeneragao foi realizada atraves da aplicagao de pulso de 5 μΙ de Glicina 10 mM, pH 1.5. Os parametros cineticos foram obtidos pelo ajuste dos tragos de Iigagao dos Fabs de um modelo de Iigagao 1:1 foram avaliados pela aplicagao dos modelos

* cineticos de pseudo-primeira-ordem utilizando um software da BIAevaIuation

*

versao 3.0. Os resultados sao apresentados na Tabela 4 abaixo. Todos os dados sao obtidos por ajuste global de rotina.

Tabela4

Resultados do BIAcore

-· I t Clone Fab ka(M-1s-1) kd (s-1) Kd(M) Fab Anti-fafor D 315 7,1x105 2,7x1ο·4 3,7x1 O·10 Fab Anti-fator D 416 8,2x105 Ι,δχΙΟ"4 3,3x10"10 Fab Anti-fator D 345 6,8x105 3.5X10"4 5,1χ10"10 Fab Anti-fator D 250 5,7x105 1’9x1CT4 3,3x10"10 Fab Anti-fator D 56 3,6x105 9,8x1ο·4 2,7x109 Quimerico 4,4x105 1,2x103 2,7x109 Fab Anti-fatorD 111 3,3x105 3,7x1ο·4 1,14x109 Os tecnicos no assunto irao reconhecer, ou serao capazes de determinar pelo uso de nao mais do que a experimentagao de rotina, muitos equivalentes para os exemplos de realizag5es da invengao descrita no presente. Pretende-se que tais equivalentes sejam englobados pelas seguintes reivindica?oes. Listagem de Sequencias Gly Trp 50

lie Asn Thr Tyr

Thr 55

Gly Glu Thr Thr

Gly Val

Asp Asn Trp 105

Gly Gln Gly Thr

Thr Leu Thr 110

Glu

Gly Arg Phe Val

Phe 70

Ser Leu Glu Thr

Ser Ala 75

Ser Thr Ala

Ala Asp Asp

Val Ser Ser 115

Leu Glu lie Asn

Asn 85

Leu Lys Asn Glu

Asp 90

Met Ala Thr

Tyr Phe Cys 95

<110> Genentech, Inc. Herren WU Sanjaya SINGH Sek Chung FUNG Ling-Ling AN Henry B. LOWMAN Robert F. KELLEY

<120> Anticorpos antifator D humanizados e seus usos

<130> P4028R1 WO

<150> US 60/856,505

<151> 02-11-2006

<160> 58

<170> PatentIn version 3.4

1

115 PRT

ARTIFICIAL

<210> <211> <212> <213>

<220> <223>

<400>

lie Gln Leu

Gln 1

Dominic de cadeia pesada variavel de Mab 1

Gln Ser Gly Pro

Thr Val Lys

Gly Met

lie 20

Asn 35

Val 5

Ser Cys Trp Val Lys

Lys Ala Ser 25

Gln Ala Pro 40

Glu 10

Gly Gly

166-32

Leu Lys Lys

Tyr Thr Phe

Lys Gly Leu 45

Pro Gly Glu 15

Thr Asn Tyr 30

Lys Trp Met

r

y O T 6

Arg Glu Gly 100

e r h y O P T 8

S

y 5 L 6 <210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Dominio de Cadeia Ieve variavel de Mab 166-32

<400> 2

Glu 1

Thr Thr Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Met Ala lie Gly

5

10

15

Glu Lys Val Thr lie Arg Cys lie Thr Ser Thr Asp lie Asp Asp Asp

一 —

Met

Ser

Ser 65

Glu

Thr

Asn Trp 35

Gly Gly 50

Gly Tyr Asp Val Phe Gly

Tyr Gln Gln

Asn Thr Leu

Lys

Arg 55

Pro 40

25 Gly

Ala

Gly 100

Asp 85

Tyr Tyr Cys Leu

Glu

Pro Gly Val

Gly Ala Asp Phe Val Phe Thr 70

Gln 90

Gly Thr Arg Leu Glu lie

105

Pro Pro Lys 45

Pro Ser Arg 60

lie Asp Asn 75

Ser Asp Asn Lys

30

Leu Leu lie Phe Ser Ser

Met Leu

Ser 80

Leu Pro Tyr 95

<210> 3

<211> 345

<212> DNA

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Dominio de cadeia pesada variavel de Mab 166-32 <400> 3

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60

tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct 120

ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacct acactggaga gacaacatat 180

gctgatgact tcaagggacg gtttgtcttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240

ttggagatca acaacctcaa aaatgaggac atggctacat atttctgtga aagagagggg 300

ggggttgaca actggggcca aggcacc.act ctcacagtct CCtca 345

<210> 4

<211> 321

<212> DNA

<213> ARTIFICIAL <220> <223> Dominio de cadeia Ieve variavel de Mab 166-32

<400> 4

gaaacaactg tgacccagtc tcctgcatcc ctgtccatgg

atcagatgca taaccagcac tgatattgat gatgatatga

ggggaacctc ctaagctcct tatttcagga ggcaatactc

cgattctcca gcagtggcta tggtgcagat tttgttttta

gaagatgttg cagattacta ctgtttgcaa agtgataact

gggaccaggc tggaaataaa a

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Dominio de cadeia Ieve variavel de Mab 166-32

ctataggaga aaaagtcacc 60 actggtacca gcagaagcca 120 ttcgtcctgg agtcccatcc 18 0 caattgacaa catgctctca 24 0 tgccgtacac gttcggaggg 300

321

<400> 5

Asp lie Gln 1

Asp Arg Val

Met Asn Trp 35

Ser Gly Gly 50

Ser Gly Ser 65

Glu Asp Val Thr Phe Gly

Val

Thr 20

Thr 5

Gln Ser Pro Ser

Ser 10

Leu Ser Ala

lie Thr

Tyr Gln Gln

Asn Thr Leu

Cys Lys

Arg 55

lie

Pro 40

Pro

Thr

25

Gly Gly

Ser Thr Asp lie

Ser Val 15

Asp Asp 30

Arg Asp

Lys Val Pro

S

y 5 L 4

Leu Leu lie

Val Pro

Ser 60

Arg Phe Ser Gly

Gly Thr

Asp 70

Phe Thr Leu Thr

工Ie 75

Ser Ser Leu Gln

Ala

Gln 100

Thr 85

Tyr Gly Thr

Tyr Lys

Cys Leu

Gln 90

Leu

Glu 105

Ser Asp Asn

工Ie Lys

Leu Pro 95

Pro 80

Tyr

<210> 6

<211> 115

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Dominio de cadeia pesada

<400> 6

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly 1 5

variavel de clone #56 humanizado

Pro Glu Leu 10

Lys Lys Pro Gly Ala 15 Phe Phe

Asp

Ala

Val

Ala Gly

Leu Gln lie Ser

Gly Trp lie Asn

50

Leu Leu lie

Met Asn Trp 35

Tyr Gln Gln Lys

Pro Gly Lys 40

Val Pro

Thr Leu Val Thr 110

Thr Gly 55

Ser Leu Lys Ala Asp Asn

Thr Thr

Thr Ser 75

Asp Thr 90

Gly Gln

Glu

Asp

Glu

Trp 105

Glu Arg

Ala Asp

Ser Thr Thr Tyr

Thr Tyr

Val Phe 70

Ser Leu 85

Phe Ser Gly

Leu Gln Pro 80

Leu Pro Tyr 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105

<210> 8 <211〉 115 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220>

Ser Gly Gly 50

Ser Gly Ser 65

Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg 55 60

GIy Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser 70 75

Ser Asp Ser

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr 85

Cys Leu Gln 90

Val Ser Ser 115

<210> <211> <212> <213>

<220> <223>

7

107 PRT

ARTIFICIAL

Dominio de cadeia Ieve variavel de clone #111 humanizado <400> 7

Asp lie Gln 1

Val

Thr 5

Gln Ser

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys 20

Pro Ser Ser 10

lie Thr Ser 25

Leu Ser Ala Ser

Val 15

Gly

Thr Asp lie Asp Asp Asp 30

Ser Val Lys

Val 20

Ser Cys Lys Ala

Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala 40

Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 45

Met

Lys Gly Arg

65

Tyr

80

Cys

r

y 5 T 9

r

y O T 6

S

y 5 L 4

Glu Gly Gly Val 100 Met Asn Trp 35

Tyr Gln Gln Lys

Pro 40

Gly Lys Val Pro

Leu Gln lie

Ser Ser Leu Lys Ala 85

Glu Asp Thr Ala Val 90

Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu 70

Asp Thr Ser Val Ser Thr 75

Ala

Ala Asp Asp Phe

Leu Leu lie

Gly Val Asn Asn

Trp Gly Gln Gly Thr Leu 105 HO

Val Thr

Glu

Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly 50 55

Glu Thr Thr

Ser His Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro

Ser 65

Glu

50 Gly

Asp

55

Ser Arg Phe 60

Ser Gly

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln

70

75

Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Ser Leu

85

90

Pro 95

Pro 80

Tyr

Val Ser Ser 115

<210> <211> <212> <213>

<220> <223>

9

107 PRT

ARTIFICIAL

Dominio de cadeia Ieve variavel de clone #250 humanizado 9

Gln Ser Pro Ser

<400>

Asp lie Gln Val 1

Thr 5

Ser 10

Leu Ser Ala Ser

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys lie Thr Ser Thr 25

Val 15

Asp lie Asp 30

Gly Asp Asp

<223> Dominio de cadeia pesada variavel de clone # 111 humanizado

<400> 8 '

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 40 45

S

y 5 L 4

Tyr Tyr Cys 95

r

y O T 8

y S

1 y 5 G L 6

r

y O T 6

Arg Glu Gly 100 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys

Leu Leu lie

Met Asn Trp 35

Tyr Gln

Gln Lys Pro 40

Gly Lys Val Pro

Val Ser

Ser 115

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220> . ^

<223〉 Dominio de cadeia Ieve variavel de clone #416 humanxzado

<400> 11

Asp lie Gln Val 1

Asp Arg Val

Thr 20

Thr 5

Gln Ser Pro Ser

lie Thr Cys lie

Thr 25

Ser Leu Ser Ala 10

Ser Thr Asp lie

Ser Val 15

Asp Asp 30

Gly Asp

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

110

Glu Arg Glu

Gly Gly Val Asn Asn 100

<210> <211> <212> <213>

10

115

PRT

ARTIFICIAL

<220> . , <223> Dominio de cadeia pesada variavel de clone #250 humanxzado

<400> 10

Gln Val Gln 1

Ser Val Lys

Gly Leu

Gly Trp 50

Asn 35

lie

Lys Gly Arg 65

Leu Gln lie

Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala ‘ 10 15

Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 25 30

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

40 45

Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 55 60

Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 70 75 80

Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

S

y 5 L 4

Trp 105 Ser Asp Gly

Asn

Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe 55 60

Ser Gly

Gly Val Asn Asn Trp 105

Gly Gln Gly Thr

Leu Val Thr 110

Glu

Leu Gln lie

Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp 85 90

Thr Ala Val

Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp 70

Thr

Ser Val 75

Ser Thr Ala

Ala Asp Asp Phe

Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu 50 55

Thr Thr

Val Ser Ser 115

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220> ‘'

<223> CDR-Hl de MAB 166-32

<400> 13

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 65 70

Glu Asp Val Ala

Thr Phe Gly

Thr Tyr Tyr Cys Leu 85

Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro 75 80

Gln Ser Asp Ser Leu Pro Tyr 90 95

Gln 100

Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys

105

<210> <211> <212> <.213>

12

115

PRT

ARTIFICIAL

<220>

<223> Dominio de cadeia pesada variavel de clone #416 humanizado <400> 12

Leu Lys Lys Pro Gly Ala

Gln Val Gln 1

Leu Val Gln Ser Gly Pro 5

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 25

Gly Met Asn 35

Trp Val Arg Gln Ala Pro 40

Glu 10

Gly Gly

Tyr Thr Phe

Gln Gly Leu 45

Thr 30

Gly 15

Ser Tyr

Glu Trp Met

Arg Glu Gly 100

Tyr Tyr Cys 95

r

y O T 8

y S

1 y 5 G L 6

r

y O T 6 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly 1 5

<210> 14

<211> 19

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> CDR-H2 de MAB 166-32 <400> 14

Trp Met Gly Trp lie Asn Thr Tyr 1 5

Asp Phe Lys

<210> 15

<211> 6

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> CDR-H3 de MAB 166-32

<400> 15

Glu Gly Gly Val Asp Asn 1 5

<210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> CDR-Ll de MAB 166-32

<400> 16

lie Thr Ser Thr Asp lie Asp Asp 1 5

<210> 17

<211> 7

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> CDR-L2 de MAB 166-32

<400> 17

Met Asn 10

Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Asp 15

Asp Met Asn 10

Gly Gly Asn Thr Leu Arg Pro 1 5 <210> 18 <211> 9

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> CDR-L3 de MAB 166-32

<400> 18

Leu Gln Ser Asp Asn Leu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> CDR-L3 de clone #111 humanizado

<400> 19

Leu Gln Ser Asp Ser Leu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 20

<211> 6

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> CDR-H3 de clone #111 humanizado

<400> 20

Glu Gly Gly Val Asn Asn

1 5

<210> 21 ..

<211> 7

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> CDR-L2 de clone #250 humanizado

<400> 21

His Gly Asn Thr Leu Arg Pro

1 5

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL <220>

<223> CDR-L3 de clone #250 humanizado <400> 22

Leu Gln Ser Asp Ser Leu Pro Tyr Thr 1 5

<210> 23

<211> 10

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> CDR-Hl de clone #250 humanizado

<400> 23

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Leu Asn 1 5 10

<210> 2 4

<211> 7

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> CDR-L2 de clone #416 humanizado

<400> 2 4

Asp Gly Asn Thr Leu Arg Pro 1 5

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> CDR-Hl de clone #416 humanizado

<400> 25

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Met Asn 1 5 10

<210> 26

<211> 107

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Composito de cadeia Ieve variavel de clones humanizados <220> ' <221> misc—feature

<222> (4).7(4)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoacido que ocorra naturalmente <220>

<221> misc_feature

<222> (13)7.(13)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoacido que ocorra naturalmente <220>

<221> misc—feature

<222> (43)7.(43)

<223〉 Xaa pode ser qualquer aminoacido que ocorra naturalmente <220>

<221> misc—feature

<222> (49)7.(49)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoacido que ocorra naturalmente <220>

<221> misc—feature

<222> (64)7.(64)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoacido que ocorra naturalmente <220>

<221> misc—feature

<222> (69)7.(69)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoacido que ocorra naturalmente <400> 26

Asp lie Gln Xaa Thr Gln Ser

1 5

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys 20

Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys 35

Xaa Asp Gly Asn Thr Leu Arg 50 55

Ser Gly Ser Giy Xaa Asp Phe 65 70

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr 85

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 100

<210> 27 <211> 115 <212> PRT ：

<213> ARTIFICIAL

Pro Ser Ser Leu Ser Xaa 10

lie Thr Ser Thr Asp lie 25

Pro Gly Lys Xaa 40

Pro Gly Val Pro

Pro Lys 45

Ser Arg 60

Cys Leu Gln 90

Leu Glu lie 105

Ser Val Gly 15

Asp Asp Asp 30

Leu Leu lie

Phe Ser Xaa

Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu 75

Ser Asp Ser Leu Lys

Gln Pro 80

Pro Tyr 95 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

110

Gly Val Asn Asn

Xaa Arg Glu

Val Ser Ser 115

<210> 28 <211> 87

<220> <223>

<220> <221> <222> <223>

<220> <221> <222〉 <223>

Composito de cadeia Ieve variavel de clones humanizados

misc—feature (2).7(2)

Xaa pode ser qualquer aminoacido que ocorra naturalmente

misc—feature (9).7(9)

Xaa pode ser qualquer aminoacido que ocorra naturalmente

misc—feature (38)7.(38)

Xaa pode ser qualquer aminoacido que ocorra naturalmente

misc_feature (93)7.(93)

Xaa pode ser qualquer aminoacido que ocorra naturalmente

misc—feature (97)7.(97)

Xaa pode ser qualquer aminoacido que ocorra naturalmente

<400> 27

Gln Xaa Gln Leu 1

Vai Gln 5

Ser Gly Xaa

Glu Leu Lys Lys 10

Pro Gly Ala 15

Ser Val Lys Val Ser Cys 20

Lys Ala Ser 25

Gly Tyr Thr Phe

Thr Ser Tyr 30

Gly Met Asn Trp Val Xaa 35

Gly Trp lie Asn Thr Tyr 50

Gln Ala Pro 40

Thr Gly Glu 55

Gly Gln Gly Leu 45

Thr Thr Tyr Ala 60

Glu Trp Met Asp Asp Phe

Lys Gly Arg Phe 65

Leu Gln lie Ser

Val Phe

：.-70

Ser Leu 85

Ser Leu Asp Lys Ala Glu

Thr Ser Val Ser 75

Asp Thr Ala Xaa 90

Thr Ala Tyr 80

Tyr Tyr Cys 95

P 5 r O T 1

Gly 100 <212> PRT <213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Sequencia e sintetizada

<400> 28

Gln Val Gln Leu 1

Ser Val Lys Val 20

Arg Gln Ala Pro 35

Thr Ala Asp Thr 50

Arg Ser Glu Asp 65

Thr Leu Val Thr

<210> 29

<211> 81

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Seqiiencia e sintetizada <400> 29 ‘

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 25 30

Gln Gly Leu Glu Trp Met Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Thr Ser Thr 40 45

Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala 50 55 60

Val Tvr Tvr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 65 70 75 80

Ser

<210> 30 <211> 80

Val Gln Ser Gly Ala Glu 10

Ser Cys Lys Ala Ser Gly 25

Gly Gln Gly Leu Glu Trp 40

Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 55

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 70

Val Ser Ser 85

Val Lys Lys Pro Gly Ala

15

Tyr Thr Phe Thr Trp Val 30

Met Gly Arg Val Thr lie 45

Met Glu Leu Ser Ser Leu 60

Ala Arg Trp Gly Gln Gly 75 80 <212> PRT <213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Seqiiencia e sintetizada <400> 30

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 25 30

Gln Gly Leu Glu Trp Met Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Thr Ser Thr 40 45

Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala 50 55 60

Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 65 70 75 80

<210> 31

<211> 79

<212> PRT '

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Sequencia e sintetizada <400> 31

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 25 30

Gln Gly Leu Glu Trp Met Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Thr Ser Thr 40 45

Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala 50 — 55 60

Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 65 70 75

<210> 32

<211> 87

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220> <223> <400>

Sequencia e sintetizada 32 Gln Val Gln Leu Gln 1 5

Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr 20

Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Trp lie 30

Arg Gln Pro 35

Ser Val Asp 50

Thr Ala Ala 65

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Gly Arg Val Thr lie 40 45

Thr Ser Lys

Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val 55 60

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly 70 75 80

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 85

<210> <211> <212> <213>

33 81 PRT

ARTIFICIAL

<220>

<223> Sequencia e sintetizada <400> 33

Leu

Gln Val Gln 1

Thr Leu Ser

Lys Gly Leu 35

Gln Glu Ser 5

Thr Cys Thr Glu Trp lie Arg

Leu 20

Asn Gln Phe Ser 50

Val Tyr Tyr 65

Leu Lys Leu 55

Cys Ala Arg Trp 70

Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 15

Val Ser Trp lie Arg Gln Pro Pro Gly 30

Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys 40 45

Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 60

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 75 80

Ser

<210> <211> <212> <213>

34 80 PRT

ARTIFICIAL

<220>

<223> Sequencia e sintetizada <400> 34 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Trp lie Arg Gln Pro Pro Gly 25 30

Lys Gly Leu Giu Trp lie Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys 40 45

Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 50 55 60

Val Tvr Tvr Cvs Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 65 “70 75 80

<210> 35

<211> 79

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Seqiiencia e sintetizada

<400> 35

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly 1 5

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val 20

Lys Gly Leu Glu Trp lie Arg Val 40

Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser 50 55

Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly 65 70

Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 15

Ser Trp lie Arg Gln Pro Pro Gly 30

Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys

45

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 60

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 75

<210> 36

<211> 87

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Seqiiencia e sintetizada

<400> 36

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 r 10 15

Ser Leu Arg Leu 20

Ser

Cys Ala Ala

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Val 30 Arg Gln Ala

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Phe Thr lie 40 45

Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

50 55 60

Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly 65 70 75 80

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 85

<210> 37

<211> 81

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Sequencia e sintetizada

<400> 37

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 25 30

Lys Gly

Asn Thr 50

Val Tyr 65

Ser

Leu 35

Leu

Tyr

Glu Trp Val Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys

40 45

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

55 60

Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 70 75 80

<210> 38

<211> 80

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Sequencia e sintetizada <400> 38

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 25 30 Lys Gly Leu

Glu Trn Val Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp “ 40 45

Asn Ser Lys

Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 50 55 60

Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 65 VO 75 80

<210> 39

<211> 79

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Seqiiencia e sintetizada <400> 39

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 25 30

Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys 40 45

Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 50 55 60

Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 65 70 75

<210> 40

<211> 87

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Sequencia e sintetizada

<400> 40

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn lie Lys Trp Val 25 30

Arq Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Phe Thr lie 40 45

Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn 50 55

Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

60 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gln Gly

65 70 75 80

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 85

<210> 41 <211> 81 <212> PRT <213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Sequencia e sintetizada <400> 41 :

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 1 5

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20

Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe 40

Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn 50 55

Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly 65 70

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15

Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 30

Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys

45

Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 60

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 75 80

Ser

<210> 42

<211> 80

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Sequencia e sintetizada <400> 42 ：

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 25 30

Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys 40 45

Asn Thr 50

Ala

Tyr Leu Gln Met 55

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

60 Val Tvr Tyr Cys Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 65 ： 70 75 80

<210> <211> <212> <213>

43 87 PRT

ARTIFICIAL

<220>

<223> Sequencia e sintetizada <400> 43

Glu Val Gln 1

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn lie Lys Trp Val

Arg Gln Ala 35

Ser Ala Asp 50

Leu 20

Pro Gly Lys Gly

Thr

25

30

Arg Ala Glu Asp 65

Thr Leu Val Thr

Ser Lys Asn 55

Thr Ala Val 70

Val Ser Ser 85

Leu Glu Trp Val Ser Arg Phe Thr lie 40 45

Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

60

Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly 75 80

<210> <211> <212> <213>

44 .

81

PRT

ARTIFICIAL

<220>

<223> Seqiiencia e sintetizada <400> 44

Glu Val 1

Gln Leu Val ‘

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

10

15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 25 30

Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys 40 45

Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 50 55 60

Val Tvr Tvr Cvs Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 65 70 75 80 Ser

<210> 45

<211> 80

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Sequencia e■sintetizada <400> 45

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 25 30

Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys 40 45

Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 50 “ 55 60

Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 65 7 0 75 80

<210> <211> <212> <213>

46 79 PRT

ARTIFICIAL

<220>

<223> Sequencia e sintetizada <400> 46

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 25 30

Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys 40 45

Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 50 55 60

Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

65

<210> 47

<211> 80

<212> PRT

70

75 <213> ARTIFICIAL

Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

30

Gln Gln Lys Pro

Asp Arg Val Thr lie Thr 20

Ser Tyr Thr

Glu Pro Ala Ser lie 20

Pro Gln Leu Leu lie 35

Ser Gly Thr Asp Phe 50

Val Gly Val Tyr Tyr 65 ,

Pro Lys Leu 35

Leu lie Tyr Gly

Val Pro Ser Arg Phe Ser 40 45

<220>

<223> Sequencia e sintetizada <400> 47

Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 1 5 10

<210> 49

<211> 80

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Sequencia e sintetizada

Gly

Leu 55

Phe

Val Pro Asp 40

Lys lie Ser Gly Gln Gly

Arg Phe

Arg Val 60

Thr Lys 75

Ser Gly Ser Gly 4 5

Glu Ala Glu Asp

Val Glu lie Lys 80

<210> 48

<211> 80

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223〉 Sequencia e sintetizada <400> 48

Leu Pro Val Thr Pro Gly

15

Asp lie Val Met 1

Thr Gln r.

Ser Pro Leu Ser 10

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu

50 55 60

Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie 65 70 75

Ser Val Gly 15

Gly Lys Ala 30

Gly Ser Gly

Cys Trp Tyr 25

S

y O C 7

P S S y O

A L 8

<400>

49 Val Ala Val 65

Tyr Tyr Cys Phe 70

Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie 75

Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 65 70 75

<210> 50

<211> 80

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Sequencia e sintetizada

<400> 50 -

<210> 51

<211> 31

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Sequencia e sintetizada

<400> 51

Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln 10 15

Asp lie Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 10 15

Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro 25 30

Pro Lys Leu Leu lie Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 40 45

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp 50 55 60

Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 25 30

Pro Arg Leu Leu lie Tyr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 40 45

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp 50 55 60

S

y O L 8

S

y O L 8

e 1 I

lie Ser Ser Leu 20

Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser 30 <210> 52

<211> 32

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<2 2 0>

<223> Seqüência é sintetizada <4 00> 52

Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr 1 5

Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp 20

Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln 15

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg 30

<210> 53

<211> 10

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Seqüência é sintetizada

<4 00> 53

Phe Gly Gln Gly Thr 1 5

Lys Val Glu Ile Lys

10

<210> 54

<211> 10

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Seqüência é sintetizada

<220>

<221> misc_feature................ .. .

<222> (7)..(7)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmen

<400> 54

Phe Gly Gln Giy Thr 1 5

Lys Xaa Glu Ile Lys

10

<210> 55

<211> 87

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Seqüência é sintetizada <400> 55 Gln Val Gln Leu Val 1 5

Ser Val Lys Val Ser 20

Arg Gln Ala Pro Gly 35

Ser Leu Asp Thr Ser 50

Lys Ala Glu Asp Thr 65

Gln Ser Gly Ser Glu Leu

10

Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

25

Gln Gly Leu Glu Trp Met 40

Val Ser Thr Ala Tyr Leu 55

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 70 75

Lys Lys Pro Gly Ala 15

Thr Phe Thr Trp Val 30

Gly Arg Phe Val Phe 45

Gln Ile Ser Ser Leu 60

Arg Trp Gly Gln Gly

80

Thr Ser Leu Thr Val Ser Ser 85

<210> 56

<211> 81

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Seqüência é sintetizada <4 00> 5 6

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 25 30

Gln Gly Leu Glu Trp Met Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val 40 45

Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala 50 55 60

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Ser Leu Thr Val Ser 65 70 75 80

Ser

<210> 57

<211> 80

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Seqüência é sintetizada <4 00> 57 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 25 30

Gln Gly Leu Glu Trp Met Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val 40 45

Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala 50 55 60

Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gln Gly Thr Ser Leu Thr Val Ser Ser 65 · 70 75 80

<210> 58

<211> 79

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Seqüência é sintetizada <4 00> 58 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 25 30

Gln Gly Leu Glu TrP Met Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val 40 45

Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala 50 55 60

Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Ser Leu Thr Val Ser Ser 65 70 75

Claims

1. ANTICORPO MURINO, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência do domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 1.

2. ANTICORPO MURINO, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência do domínio variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 2.

3. ANTICORPO MURINO, caracterizado pelo fato de compreender a seqüência do domínio variável de cadeia pesada conforme definida na reivindicação 1 e a seqüência do domínio variável de cadeia leve conforme definida na reivindicação 2.

4. ANTICORPO, caracterizado pelo fato de compreender as SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 e 18.

5. ANTICORPO QUIMÉRICO, caracterizado pelo fato de compreender as SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2.

6. DOMÍNIO VARIÁVEL DE UM ANTICORPO HUMANIZADO, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12.

7. DOMÍNIO VARIÁVEL DE UM ANTICORPO HUMANIZADO, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve selecionada a partir do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11.

8. DOMÍNIO VARIÁVEL, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato do aminoácido na posição 104 da SEQ ID No: 7 ser uma valina ou uma leucina.

9. ANTICORPO ANTI-FATOR D HUMANIZADO, caracterizado pelo fato de compreender a seqüência de domínio variável da SEQ ID NO: 5 e a seqüência de domínio variável na SEQ ID NO: 6.

10. ANTICORPO ANTI-FATOR D HUMANIZADO, caracterizado pelo fato de compreender a seqüência de domínio variável da SEQ ID NO: 7 e a seqüência de domínio variável na SEQ ID NO: 8.

11. ANTICORPO ANTI-FATOR D HUMANIZADO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de compreender a seqüência de domínio variável da SEQ ID No: 7, em que o aminoácido na posição 104 da SEQ ID No: 7 é uma valina ou uma leucina, e a seqüência do domínio a variável da SEQ ID NO: 8.

12. ANTICORPO ANTI-FATOR D HUMANIZADO, caracterizado pelo fato de compreender a seqüência de domínio variável da SEQ ID NO: 9 e a seqüência de domínio variável na SEQ ID NO: 10.

13. ANtlCORPO ANTI-FATOR D HUMANIZADO, caracterizado pelo fato de compreender a seqüência de domínio variável da SEQ ID NO: 11 e a seqüência de domínio variável na SEQ ID No: 12.

14. ANTICORPO ANTI-FATOR D HUMANIZADO, caracterizado pelo fato de possuir uma cadeia leve variável que contém um CDR-L1 portando a seqüência da SEQ ID NO: 16; um CDR-L2 portando a seqüência da SEQ ID NO: 17, 21, ou 23, e um CDR-L3 portando a seqüência da SEQ ID NO: 18, 22 ou 24.

15. ANTICORPO ANTI-FATOR D HUMANIZADO, caracterizado pelo fato de possuir uma cadeia pesada variável que contém um CDR-H1 portando a seqüência da SEQ ID NO: 13 ou 25; um CDR-H2 portando a seqüência SEQ ID NO: 14, e um CDR-H3 portando a seqüência SEQ ID NO: 15 ou 20.

16. POLIPEPTÍDEO, caracterizado pelo fato de compreender a seguinte seqüência de aminoácidos: QXiQLVQSGX2E LKKPGASVKV sckasgytft Sygmnvwx3QA pgqglewmgw INTYTGETTYADDFKGRFVF SLDTSVSTAY LQISSLKAED TAX4YYCX5REG GVNNWGQGTL VTVSS (SEQ ID No: 27), onde X1 é I ou V; X2 é P ou S; X3 é K ou R; X4 é T ou V; e X5 é E ou A.

17. POLIPEPTÍDEO, caracterizado pelo fato de compreender a seguinte seqüência de aminoácidos: DIQX6TQSPSSLSX7 SVGDRVTITCITSTDIDDDMNWYQQKPGKXsPKLLIXgDGNTLRPGVPSRFSXio SGSGXiiDFTLTISSLQPEDVATYYCLQSDSLPYTFGQ GTKLEIK (SEQ ID No: 26), onde; X6 é V ou M; X7 é M ou A; X8 é P ou V; X9 é S ou Υ; X10 é S ou G e X11 é A ou T.

18. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato do aminoácido na posição 104 da SEQ ID No: 26 ser uma valina ou uma leucina.

19. POÜPEPTÍDEO, caracterizado pelo fato de compreender a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 6, 8, 10 ou 12.

20. POLIPEPTÍDEO, caracterizado pelo fato de compreender a * seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 5, 7, 9, ou 11.

21. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato do aminoácido na posição 104 da SEQ ID No: 7 ser uma valina ou uma leucina.

22. ANTICORPO HUMANIZADO, caracterizado pelo fato de compreender o polipeptídeo conforme definido na reivindicação 16.

23. ANTICORPO HUMANIZADO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente o polipeptídeo conforme definido em uma das reivindicações 15 ou 18.

24. FRAGMENTO DE ANTICORPO, caracterizado pelo fato de ser de um anticorpo conforme definido em uma das reivindicações 1 a 15, 22 ou 23.

25. ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO, caracterizado pelo fato de compreender a seqüência da SEQ ID No: 3.

26. ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO, caracterizado pelo fato de compreender a seqüência da SEQ ID No:4.

27. ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO, caracterizado pelo fato de codificar um anticorpo conforme definido em uma das reivindicações 1 a 15, 22 ou 23.

28. ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO, caracterizado pelo fato de codificar o polipeptídeo conforme definido em uma das reivindicações 16 a 20.

29. VETOR, caracterizado pelo fato de compreender o ácido nucléico conforme definido na reivindicação 27.

30. VETOR, caracterizado pelo fato de compreender o ácido nucléico conforme definido na reivindicação 28.

31. LINHAGEM CELULAR, caracterizada pelo fato de compreender o vetor conforme definido em uma das reivindicações 29 ou 30.

32. COMPOSIÇÃO, caracterizada pelo fato de compreender o anticorpo conforme definido em uma das reivindicações 1 a 15, 22 ou 23.

33. USO DA COMPOSIÇÃO, conforme definida na reivindicação 32, caracterizado pelo fato de ser para tratar um distúrbio mediado pelo complemento.

34. USO, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato do distúrbio ser uma doença ocular, tal como a degeneração macular relacionada à idade ou a retinopatia diabética.

35. MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO ANTI- FATOR D HUMANIZADO, ou fragmento destes, caracterizado pelo fato do anticorpo ser conforme definido em uma das reivindicações 1 a 15, 22 ou 23.

36. ANTICORPO, caracterizado pelo fato de competir com um anticorpo murino 166-32 e/ou um anticorpo anti-fator D humanizado clone #56, #111, #250 ou'#416 e/ou um anticorpo que compreende as seqüências do domínio variável ou seqüências HVR do anticorpo anti-fator D humanizado clone #56, #111, #250 ou #416.

37. ANTICORPO, caracterizado pelo fato de se ligar ao mesmo epítopo que o anticorpo murino 166-32 e/ou anticorpo anti-fator D humanizado clone #56, #111, #250 e #416 e/ou anticorpo que compreende as seqüências do domínio variável ou HVR do anticorpo anti-fator D humanizado clone #56, #111, #250 ou #416.