ES2270530T3 - Un procedimiento para inhibir la activacion del completo por la via alternativa. - Google Patents

Abstract

Un agente seleccionado entre un anticuerpo anti-properdina, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-properdina, o un péptido derivado de properdina, en el que dicho agente no activa sustancialmente un receptor Fcgamma, para uso en la inhibición terapéutica de la activación alternativa del complemento.

Description

Un procedimiento para inhibir la activación del complemento por la vía alternativa.

Campo técnico de la invención

El campo de esta invención es la activación del complemento. Más particularmente, la presente invención se refiere a un procedimiento para inhibir la activación del complemento por la vía alternativa, incluyendo la inhibición de la formación (es decir, generación o producción) de los productos de activación del complemento por la vía alternativa.

Antecedentes de la invención

El sistema del complemento proporciona un mecanismo de actuación temprana para iniciar y amplificar la respuesta inflamatoria a una infección microbiana y otras lesiones agudas. (Liszewski, M.K. y J.P. Atkinson, 1993, En Fundamental Immunology, Tercera Edición. Editado por W.E. Paul Raven Press, Ltd. Nueva York). Aunque la activación del complemento proporciona una defensa valiosa de primera línea contra patógenos potenciales, las actividades del complemento que promueven una respuesta inflamatoria protectora también pueden representar una amenaza potencial al huésped. (Kalli, K.R., P. Hsu, y D.T. Fearon, 1994, Springer Semin Immunopathol. 15:417-431; Morgan, B.P., Eur. J. Clinical Investig. 24:219-228). Por ejemplo, los productos proteolíticos de C3 y C5 reclutan y activan neutrófilos. Estas células activadas están indiscriminadas en su liberación de enzimas destructoras y pueden provocar la lesión de órganos. Además, la activación del complemento puede causar la deposición de componentes líticos del complemento sobre células huésped cercanas así como sobre dianas microbianas, dando lugar a la lisis de células huésped. El creciente reconocimiento de la importancia de la lesión tisular mediada por complementos en varios estados de enfermedad recalca la necesidad de fármacos eficaces inhibidores del complemento. En la actualidad no existen fármacos aprobados que inhiban la lesión del complemento.

El complemento puede activarse a través de dos cascadas enzimáticas distintas denominadas las vías clásica y alternativa (Liszewski, M.K. y J.P. Atkinson, 1993, En Fundamental Immunology. Tercera Edición. Editado por W.E. Paul. Raven Press Ltd. Nueva York). La vía clásica normalmente se activa por un anticuerpo unido a una partícula extraña y de esta forma requiere una exposición anterior a esa partícula para la generación del anticuerpo específico. Hay cuatro proteínas plasmáticas específicamente implicadas en la vía clásica: C1, C2, C4 y C3. La interacción de C1 con las regiones Fc de IgG o IgM en complejos inmunes activa una proteasa C1 que puede escindir la proteína plasmática C4, dando lugar a los fragmentos C4a y C4b. C4b puede unirse a otra proteína plasmática, C2. La especie resultante, C4b2, se escinde por la proteasa C1 para formar la convertasa C3 de la vía clásica, C4b2a. La adición del producto de escisión de C3, C3b, a la convertasa C3 conduce a la formación de la convertasa C5 de la vía clásica, C4b2a3b.

A diferencia de la vía clásica, la vía alternativa se activa espontáneamente por superficies extrañas u otras superficies anormales (bacterias, levadura, células infectadas viralmente o tejidos dañados) y por lo tanto es capaz de una respuesta inmediata a un organismo invasor (Liszewski, M.K. y J.P. Atkinson, 1993, En Fundamental Immunology, Tercera Edición. Editado por W.E. Paul. Raven Press. Ltd. Nueva York). Hay cuatro proteínas plasmáticas implicadas directamente en la vía alternativa: C3, factores B y D, y properdina (también denominada factor P). La interacción inicial que activa la vía alternativa no se entiende completamente. Sin embargo, se cree que C3 activada de forma espontánea [algunas veces denominada C3(H_{2}O)] se une al factor B, que después se escinde por el factor D para formar un complejo [C3(H_{2}O)Bb] con la actividad de la convertasa C3. La convertasa resultante modifica proteolíticamente C3, produciendo el fragmento C3b, que puede unirse convelentemente a la diana y después interactuar con los factores B y D y formar la convertasa C3 de la vía alternativa, C3bBb. La convertasa C3 de la vía alternativa se estabiliza mediante la unión de properdina. La properdina prolonga su semivida de seis a diez veces (Liszewski, M.K. y J. P. Atkinson, 1993. En Fundamental Immunology. Tercera Edición. Editado por W.E. Paul. Raven Press, Ltd. Nueva York). Sin embargo, no se requiere la unión de la properdina para formar una convertasa C3 de la vía alternativa que funcione (Schreiber, R.D., M.K. Pangburn, P.H. Lesavre y H.J. Muller-Eberhard, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 75:3948-3952; Sissons, J.G., M.B. Oldstone y R.D. Shreiber, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 77:559-562). Como el sustrato para la convertasa C3 de la vía alternativa es C3, C3 es, por lo tanto, tanto un componente como un producto de la reacción. Como la convertasa C3 genera cantidades cada vez mayores de C3b, se establece un bucle de amplificación (Liszewski, M.K. y J.P. Atkinson, 1993. En Fundamental Immunology, Tercera Edición. Editado por W.E. Paul. Raven Press, Ltd. Nueva York). Puesto que la vía clásica también puede generar C3b, ese C3b puede unir el factor B y así emplear la vía alternativa. Esto permite que se deposite más C3b en una diana. Por ejemplo, como se ha descrito anteriormente, la unión del anticuerpo al antígeno inicia la vía clásica. Si los anticuerpos se agarran a las bacterias, la vía clásica genera C3b, que se acopla a los patógenos diana. Sin embargo, se ha sugerido que del 10% al 90% del posterior C3b depositado puede proceder de la vía alternativa (Liszewski, M.K. y J.P. Atkinson, 1993, En Fundamental Immunology, Tercera Edición. Editado por W.E. Paul. Raven Press, Ltd. Nueva York). La contribución real de la vía alternativa a la formación de C3b adicional posterior al inicio de la vía clásica no se ha cuantificado claramente y por lo tanto sigue sin conocerse. La adición de C3b a la convertasa C3 conduce a la formación de la convertasa C5 de la vía alternativa, C3bBbC3b.

Tanto la vía clásica como la alternativa convergen en C5, que se escinde para formar productos con múltiples efectos proinflamatorios. La vía convergida se ha denominado vía del complemento terminal. C5a es la anafilatoxina más potente que induce alteraciones en el músculo liso y en el tono vascular, así como en la permeabilidad vascular. También es una quimiotaxina potente y un elemento activador de tanto neutrófilos como monocitos. La activación celular mediada por C5a puede amplificar significativamente respuestas inflamatorias induciendo la liberación de múltiples mediadores inflamatorios adicionales, incluyendo citoquinas, enzimas hidrolíticas, metabolitos de ácido araquidónico y especies de oxígeno reactivo. La escisión de C5 da lugar a la formación de C5b-9, también conocido como el complejo de ataque a la membrana (MAC). Ahora existen fuertes evidencias de que MAC puede desempeñar una papel importante en la inflamación además de su papel como complejo formador de poros líticos (Liszewski, M.K. y J.P. Atkinson, 1993, En Fundamental Immunology, Tercera Edición. Editado por W.E. Paul. Raven Press, Ltd. Nueva York).

La activación del complemento ha estado implicada como elemento que contribuye a diversos estados de enfermedad y afecciones, así como complicaciones de diversos procedimientos médicos (véanse las referencias citadas más adelante) tales como: infarto de miocardio; isquemia/lesión por reperfusión; apoplejía; síndrome de insuficiencia respiratoria aguda (ARDS); sepsis; lesión por quemadura; complicaciones que resultan de la circulación extracorpórea (ECC) incluyendo más comúnmente las que resultan de la derivación cardiopulmonar (CPB) pero también de la hemodiálisis o plasmaféresis o plaquetaféresis o leucoféresis u oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO) o precipitación extracorpórea de LDL inducida por heparina (HELP); uso de medios de contraste radiográfico; rechazo de transplante; artritis reumatoide, esclerosis múltiple; miastenia grave; pancreatitis y enfermedad de Alzheimer. A pesar de la necesidad médica significativa de tales agentes todavía sigue sin estar disponible un fármaco inhibidor del complemento eficaz para uso clínico habitual.

Gonzalez-Rubio y col., 1994, J. Biol Chem, 269:26017-24, describen el efecto inhibidor del Factor J en la vía alternativa del complemento. Huemer y col, 1993; Immunology, 79:639-47, describe el mimetismo molecular de las proteínas reguladoras del complemento por la glicoproteína C del virus del herpes simple. C. Fearon, 1980, J. Exp. Med., 152:20-30 describe la identificación de la glicoproteína de membrana que es el receptor C3b del eritrocito humano, leucocito polimorfonuclear, linfocito B y monocito.

La capacidad para inhibir específicamente sólo la vía provocando una patología particular sin que cesen completamente las capacidades de defensa inmune del complemento sería muy deseable. En función de los datos clínicos disponibles, parece que en la mayoría de los casos de lesión aguda, la activación del complemento está mediada principalmente por la vía alternativa (Moore, F.D. 1994, Advan. Immunol. 56:267-299; Bjornson, A.B., S. Bjornson y W.A. Altemeier, 1981 Ann. Surg. 194:224-231: Gelfand, J.A., M. Donelan, y J.F. Burke, 1983, Ann. Surg. 198:58-62). Estos hallazgos sugieren que sería ventajoso inhibir específicamente la lesión tisular mediada por la vía alternativa en diversos casos de lesión aguda, por ejemplo, en infarto de miocardio, ARDS, lesión por reperfusión, apoplejía, quemaduras térmicas e inflamación después de derivación cardiopulmonar. Esto dejaría la vía clásica intacta para manipular el procesamiento del complejo inmune y para ayudar en la defensa del huésped contra la infección. Como componentes esenciales de la vía alternativa, los factores B y D son dianas atractivas para la inhibición específica de la vía alternativa. Sin embargo, debido a su papel no esencial, no se espera que la properdina sea una diana adecuada para tal intervención.

Breve sumario de la invención

La presente solicitud se refiere a un procedimiento para inhibir la activación del complemento por la vía alternativa. El procedimiento incluye la etapa de inhibir la estabilización de la convertasa C3 inducida por properdina. La estabilización de la convertasa C3 inducida por properdina se inhibe inhibiendo la unión de properdina a C3b o C3bBb. La unión de properdina a C3b se inhibe exponiendo la properdina a una cantidad eficaz de un anticuerpo contra properdina.

Un procedimiento de la presente invención es particularmente útil en la inhibición de la activación del complemento por la vía alternativa in vivo en sujetos, incluyendo seres humanos, que padecen una lesión patológica aguda o crónica, tal como, pero sin limitación, infarto de miocardio, síndrome de insuficiencia respiratoria aguda, lesión por quemadura, apoplejía, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, enfermedad de Alzheimer o isquemia/lesión por reperfusión. La inhibición in vivo de la activación del complemento se realiza administrando el anticuerpo anti-properdina al sujeto. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen anticuerpos anti-properdina.

La presente solicitud describe, en un aspecto, un procedimiento para inhibir los efectos adversos de la activación de la vía alternativa del complemento en un sujeto administrando al sujeto una cantidad de un agente anti-properdina eficaz para inhibir selectivamente la formación (es decir, generación o producción) de un producto de activación del complemento por la vía alternativa del complemento. La formación de tales productos de activación dependientes de la vía alternativa se refiere a la generación o producción de tales productos mediante la activación del complemento, productos que cuando se generan o producen pueden detectarse e incluir productos C3a, C5a y/o C5b-9 (MAC) dependientes de la vía alternativa. Un agente anti-properdina de acuerdo con la invención bloquea la properdina como se describe en este documento e inhibe selectivamente la formación de productos de activación de la vía alternativa del complemento. Tales agentes incluyen un anticuerpo anti-properdina, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-properdina y un péptido derivado de properdina. Preferiblemente, el agente anti-properdina no activa sustancialmente los receptores Fc\gamma y/o la vía clásica del complemento.

La presente solicitud describe, en otro aspecto, un procedimiento para inhibir los efectos adversos de la activación de la vía clásica del complemento en un sujeto en el que la vía clásica del complemento se inicia administrando al sujeto una cantidad de una agente anti-properdina eficaz para inhibir selectivamente la formación de un producto de activación de la vía alternativa del complemento (por ejemplo, C3a, C5a, MAC dependiente de la vía alternativa).

La presente solicitud describe, en otro aspecto, un procedimiento para inhibir los efectos adversos de la activación de la vía clásica del complemento en un sujeto en el que la vía clásica del complemento se inicia administrando al sujeto un cantidad de un agente que inhibe la convertasa C3 de la vía alternativa eficaz para inhibir selectivamente la formación de un producto de activación del complemento por la vía alternativa del complemento (por ejemplo, C3a, C5a, MAC dependiente de la vía alternativa).

La presente solicitud, en otro aspecto, describe un procedimiento para realizar un procedimiento médico en un sujeto que comprende: (a) pasar la sangre circulante de un vaso sanguíneo del sujeto a través de un conducto y regresar a un vaso sanguíneo del sujeto, teniendo el conducto un superficie luminal que comprende un material que puede provocar al menos uno de activación del complemento, activación de plaquetas, activación de leucocitos o adhesión de plaquetas-leucocitos en la sangre del sujeto; (b) introducir un agente anti-properdina en el torrente circulatorio del sujeto en una cantidad eficaz para reducir al menos uno de activación del complemento, activación de plaquetas, activación de leucocitos o adhesión de plaquetas-leucocitos resultante del paso de la sangre circulante a través del conducto, donde la etapa (a) se produce antes y/o durante y/o después de la etapa (b). Preferiblemente, el agente anti-properdina reduce la conversión dependiente de la vía alternativa del componente del complemento C3 en los componentes del complemento C3a y C3b, y/o la formación dependiente de la vía alternativa de C5b-C9, y/o la activación de leucocitos dependiente de la vía alternativa. Los procedimientos médicos que incluyen procedimientos terapéuticos descritos en este documento incluyen procedimientos de circulación extracorpórea, incluyendo por ejemplo, procedimientos de derivación cardiopulmonar (CPB).

La presente invención describe, en otro aspecto, un artículo de fabricación que comprende un material de envasado y un agente farmacéutico (es decir, composición farmacéutica) contenido en el material de envasado, donde: (a) el agente farmacéutico comprende un agente anti-properdina, siendo el agente anti-properdina eficaz para reducir al menos uno de activación del complemento, activación de plaquetas, activación de leucocitos o adhesión de plaquetas provocada por el paso de la sangre circulante de un vaso sanguíneo de un sujeto a través de un conducto y el regreso al vaso sanguíneo del sujeto, teniendo el conducto una superficie luminal que comprende un material que puede provocar la menos uno de activación del complemento, activación de plaquetas, activación de leucocitos o adhesión de plaquetas-leucocitos en la sangre del sujeto; (b) el material de envasado comprende una etiqueta que indica que el agente farmacéutico es para uso junto con un procedimiento de circulación extracorpórea. Los artículos de fabricación descritos en este documento incluyen etiquetas que indican que los agentes anti-properdina son para uso junto con un procedimiento de derivación cardiopulmonar.

La invención también se refiere a un uso de un agente anti-properdina en la preparación de un medicamento para inhibir selectivamente la formación de los productos de activación del complemento por la vía alternativa del complemento en un sujeto en necesidad del mismo. También se describe un uso de un agente anti-properdina en la preparación de un medicamento para inhibir selectivamente la formación de productos de activación del complemento por la vía alternativa del complemento en un sujeto en el que se inicia la vía clásica del complemento. Adicionalmente, se describe un uso de un agente que inhibe la convertasa C3 de la vía alternativa en la preparación de un medicamento para inhibir selectivamente la formación de productos de activación del complemento por la vía alternativa del complemento en un sujeto en el que se inicia la vía clásica del complemento.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un agente seleccionado entre un anticuerpo anti-properdina, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-properdina, o un péptido derivado de properdina, donde dicho agente no activa sustancialmente un receptor Fc\gamma, para uso en la inhibición terapéutica de la activación alternativa del complemento.

De acuerdo con la presente invención, también se proporciona una composición farmacéutica que comprende un agente seleccionado entre un anticuerpo anti-properdina, un fragmento de un unión a antígeno de un anticuerpo anti-properdina, o un péptido derivado de properdina, donde el agente no activa sustancialmente un receptor Fc\gamma, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con la presente invención, también se proporciona el uso de un agente seleccionado entre un anticuerpo anti-properdina, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-properdina, o un péptido derivado de properdina, donde el agente no activa sustancialmente un receptor Fc\gamma, para la fabricación de un medicamento para uso en la inhibición de los efectos adversos de la activación de la vía alternativa del compuesto en un sujeto inhibiendo selectivamente la formación de un producto de activación del complemento por la vía alternativa.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el uso de un agente seleccionado entre un anticuerpo anti-properdina, o un fragmento de unión a antígeno de una anticuerpo anti-properdina, o un péptido derivado de properdina, donde el agente no activa sustancialmente un receptor Fc\gamma, para la fabricación de un medicamento para uso en la inhibición de los efectos adversos de la activación de la vía clásica del complemento en un sujeto en el que se inicia la vía clásica del complemento, inhibiendo selectivamente la formación de un producto de activación del complemento por la vía alternativa.

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De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un agente seleccionado entre un anticuerpo anti-properdina, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-properdina o un péptido derivado de properdina, en el que el agente no activa sustancialmente un receptor Fc\gamma, para la fabricación de un medicamento para uso en un procedimiento para realizar un procedimiento médico en un sujeto, comprendiendo el procedimiento:

(a) pasar la sangre circulante de un vaso sanguíneo del sujeto, a través de un conducto, y regresar a un vaso sanguíneo del sujeto, teniendo el conducto una superficie luminal que comprende un material que puede provocar al menos uno de activación del complemento, activación de plaquetas, activación de leucocitos o adhesión de plaquetas/leucocitos en la sangre del sujeto;

(b) introducir el medicamento en el torrente circulatorio del sujeto en una cantidad eficaz para reducir al menos uno de activación del complemento, activación de plaquetas, activación de leucocitos o adhesión de plaquetas-leucocitos que resulta del paso de la sangre circulante a través del conducto donde la etapa (a) se produce antes y/o durante y/o después de la etapa (b).

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un artículo de fabricación que comprende un material de envasado y un agente farmacéutico contenido dentro del material de envasado, donde:

(a) el agente farmacéutico comprende un agente seleccionado entre anticuerpo anti-properdina, o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-properdina, o un péptido derivado de properdina, donde el agente no se activa sustancialmente en el receptor Fc\gamma, para uso en la reducción de forma terapéutica de al menos uno de activación del complemento, activación de plaquetas, activación de leucocitos o adhesión de plaquetas-leucocitos causada por el paso de la sangre circulante de un vaso sanguíneo del sujeto, a través de un conducto, y el regreso a un vaso sanguíneo del sujeto, teniendo el conducto una superficie luminal que comprende un material que puede provocar al menos uno de activación del complemento, activación de plaquetas, activación de leucocitos o adhesión de plaquetas-leucocitos en la sangre del sujeto; y

(b) el material de envasado comprende una etiqueta que indica que el agente farmacéutico es para uso junto con un procedimiento de circulación extracorpórea.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento para investigar y seleccionar un anticuerpo anti-properdina, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-properdina, o un péptido derivado de properdina, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(a) ensayar el agente con respecto a su capacidad para inhibir la formación de un producto de activación de la vía alternativa del complemento; y

(b) seleccionar el agente que inhibe la formación de un producto de activación de la vía alternativa del complemento.

Breve descripción de los dibujos

En los dibujos, que forman una parte de la memoria descriptiva:

La Fig. 1 muestra la unión de properdina humana a C3b.

La Fig. 2 muestra la inhibición dependiente de la dosis de la unión de properdina a C3b usando un anticuerpo monoclonal anti-properdina.

La Fig. 3 muestra la inhibición dependiente de la dosis de la unión de properdina a C3bBb usando una anticuerpo monoclonal anti-properdina.

La Fig. 4 muestra los efectos del suero humano que contiene componentes del complemento en la deposición del complejo de ataque a la membrana (MAC).

La Fig. 5 muestra la inhibición de la deposición del complejo de ataque a la membrana (MAC) provocado por un anticuerpo monoclonal anti-properdina.

La Fig. 6 muestra los efectos en un anticuerpo monoclonal anti-properdina en la lisis de eritrocitos en conejos.

La Fig. 7 muestra la inhibición de la formación de productos de activación de la vía alternativa del complemento, incluyendo C3a y MAC, usando un anticuerpo monoclonal anti-properdina en un modelo de bucle de tubo de derivación cardiopulmonar (CPB).

La Fig. 8 muestra la falta de activación de receptor Fc\gamma detectada por la falta de generación de superóxido, usando una preparación del fragmento F(ab)_{2} de un anticuerpo monoclonal anti-properdina con properdina.

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La Fig. 9 muestra la inhibición de la formación de los productos de activación de la vía alternativa del complemento, incluyendo MAC, iniciada por complejos heparina-protamina usando un anticuerpo monoclonal anti-properdina.

La Fig. 10 muestra la inhibición de la formación de los productos de activación de la vía alternativa del complemento, incluyendo MAC, iniciada por complejos inmunes de ovalbúmina/anti-ovalbúmina usando un anticuerpo monoclonal anti-properdina.

La Fig. 11 muestra la inhibición de la formación de productos de activación de leucocitos y complementos dependientes de la vía alternativa, incluyendo la inhibición de C3a, MAC o formación del producto del complejo elastasa-antitripsina, usando un agente anti-properdina en un modelo ex vivo de derivación cardiopulmonar (CPB).

Descripción detallada de la invención 1. La Invención

La properdina es una de las tres únicas proteínas plasmáticas que están directamente implicadas en la vía alternativa. Junto con el factor D y el factor B, estas tres proteínas son dianas potenciales para el desarrollo de agentes terapéuticos para inhibir la vía alternativa. Como se indica más adelante, se demuestra por primera vez en este documento que la properdina es una diana adecuada para un procedimiento para inhibir la activación del complemento mediante la vía alternativa. También se demuestra por primera vez en este documento que la properdina es una diana adecuada incluso cuando se ha iniciado la vía clásica del complemento.

El factor D es una serina proteinasa con sólo un sustrato natural conocido: el factor B unido a C3b (Volanakis, J.E., S.R. Barnum, y J.M. Kilpatrick, 1993, Methods in Enzymol. 223: 82-97). La concentración en suero del factor D, 2 \mug/ml, es la más baja de cualquier proteína del complemento (Liszewski, M.K. y J.P. Atkinson, 1993, En Fundamental Immunology, Tercera Edición. Editado por W.E. Paul. Raven Press. Ltd. Nueva York). Se sabe que el factor D es la enzima de limitación de velocidad para la vía alternativa y por lo tanto es una diana adecuada para procedimientos terapéuticos de la inhibición de la activación del complemento mediante la vía alternativa. Sin embargo, se cree que hay diversas razones por las que los inhibidores del factor D no pueden ser agentes terapéuticos ideales para inhibir la activación del complemento. En primer lugar, las serina proteinasas también están implicadas de forma importante en la coagulación y sistemas fibrinolíticos, y ha resultado difícil identificar inhibidores específicos del factor D (Kilpatrick, J.M., 1996, IBC's Second Annual Conference on Controlling the Complement System for Novel Drug Development, Conference Binder; Whitty, A., 1996, IBC's Second Annual Conference on Controlling the Complement System for Novel Drug Development, Conference Binder). En segundo lugar, el factor D es una proteína pequeña (24,4 kDa) y se reabsorbe rápidamente y es catabolizada por el riñón con una velocidad catabólica fraccional del 60% por hora. La concentración en suero en estado de reposo del factor D se mantiene mediante una velocidad proporcionalmente alta de la síntesis. Por lo tanto, puede ser difícil inhibir la actividad del factor D en el suero de un paciente durante periodos de tiempo prolongados sin regímenes de dosificación del fármaco complicados. En tercer lugar, los adipocitos sintetizan el factor y existen pruebas de estudios con ratones genéticamente obesos de que el factor D puede tener un papel regulador en el metabolismo de la grasa (White, R.T., D. Damm. N. Hancock, B.S. Rosen, B.B. Lowell. P. Usher, J.S., Flier, y B.M. Speigelman., 1992, J. Biol. Chem. 267:9210-9213). Por lo tanto, la inhibición del factor D puede tener efectos secundarios perjudiciales en pacientes que no están directamente relacionados con la inhibición del complemento.

El factor B desempeña un papel clave en la vía alternativa ya que proporciona la subunidad catalítica, Bb, para la convertasa C3, C3bBb (Liszewski, M.K. y J.P. Atkinson, 1993, En Fundamental Immunology, Tercera Edición. Editado por W.E. Paul. Raven Press, Ltd. Nueva York). Por lo tanto, el factor B también parece ser otra diana adecuada para procedimientos terapéuticos para inhibir la activación del complemento por la vía alternativa. El factor B, solo, es un zimógeno con actividad catalítica desconocida, pero después de la unión a C3b, la serina proteinasa del factor B puede activarse mediante escisión por el factor D. En función de esto, debe ser posible desarrollar inhibidores específicos de la actividad catalítica del factor Bb como agentes terapéuticos para inhibir la vía alternativa. Sin embargo, de forma similar a la experiencia con el factor D, ha resultado difícil identificar inhibidores de la actividad proteinasa del factor Bb que no sólo inhiban las serina proteinasas implicadas en la hemostasis de la coagulación sanguínea (Whitty, A., 1996, IBC's Second Annual Conference on Controlling the Complement System for Novel Drug Development, Conference Binder). En cualquier caso, se cree que el factor B no es probablemente la mejor diana para el desarrollo de agentes terapéuticos para inhibir la vía alternativa. El factor B es una proteína en suero abundante (\sim210 \mug/ml) (Clardy, C.W., 1994, Infect. Immun. 62:4539-4555; Liszewski, M.K. y J.P. Atkinson, 1993, En Fundamental Immunology, Tercera Edición. Editado por W.E. Paul, Raven Press, Ltd. Nueva York) y probablemente requerirá una concentración proporcionalmente alta de un inhibidor del factor B para bloquear eficazmente la activación de la vía alternativa. Sin embargo, los anticuerpos monoclonales contra el factor B humano se han preparado y ensayado con respecto a su capacidad in vitro para bloquear la activación de la vía alternativa del complemento del complemento mediante endotoxina (LPS) (Clardy, C.W. 1994, Infect Immun. 62:4539-4555). Uno de los cuatro anticuerpos monoclonales anti-factor B ensayados pudo bloquear eficazmente la activación de la vía alternativa. Los otros tres anticuerpos ensayados no pudieron realizar el bloqueo a pesar de tener afinidades que eran similares a la del anticuerpo de bloqueo. En otros tres estudios de anticuerpos monoclonales anti-factor B que Clardy y col., supra (1994) citaron, dos anticuerpos monoclonales aumentaron la actividad del factor B estabilizando la convertasa de la vía alternativa, uno aumentó la actividad del factor B potenciando la unión de B a C3b, tres disminuyeron la actividad del factor B desestabilizando la convertasa y dos disminuyeron la actividad del factor B bloqueando la unión del factor B a C3b.

La properdina desempeña un papel en la regulación de la vía alternativa en virtud de su capacidad para unirse y estabilizar los complejos convertasa C3 y C5 intrínsecamente lábiles (C3bBb y C3bBbC3b) (Nolan K.F. y K.B.M. Reid, 1993, Methods Enzymol. 223:35-47), aunque se desconoce el mecanismo exacto de la estabilización de la convertasa C3 (Dauodaki, M.E., J.D. Becherer y J.D. Lambris, 1988, J. Immunol. 140:1577-1580). La unión de properdina a estos complejos puede dar lugar a una reducción de la velocidad de disociación de la subunidad catalítica Bb y también puede proteger los complejos de la degradación por parte de proteínas reguladoras negativas, factores I y H. Sin embargo, la properdina no se requiere para la actividad de la convertasa C3 funcional (Schreiber, R.D., M.K. Pangburn. P.H. Lesavre y H.J. Muller-Eberhard, 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 75:3948-3952; Sissons, J.G., M.B. Oldstone y R.D. Schreiber, 1980. Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 77:559-562; Pangburn, M.K. y H.J. Muller-Eberhard, 1984, Springer Semin. Immunopathol. 7:163-192). Se determinó que la concentración de la properdina en plasma humano normal era de 4,3-5,7 \mug/ml, haciéndola una de las proteínas del complemento menos abundantes (Nolan, K.F. y K.B.M. Reid, 1993 Methods Enzymol. 223:35-47). En estudios tempranos, se informó de que la concentración en plasma de la properdina estaba en el intervalo de 20-25 mg/ml; sin embargo, esta estimación se basó en un coeficiente de extinción molar incorrecto para la proteína. Ahora se sabe que la verdadera concentración en plasma de properdina es significativamente inferior (Nolan, K.F. y K.B.M. Reid, 1993. Methods Enzymol. 223:35-47). Los monocitos, neutrófilos y linfocitos T humanos sintetizan la properdina (Schwaeble, W., W.G. Dippold, M.K. Schafer, H. Pohla. D. Jones. B. Luttig, E. Weihe, H.P. Huemer, M.P. Dierich. y K.B.M. Reid, 1993, J. Immunol. 151:2521-2528: Schwaeble, W., U. Wirthmuller. B. Dewald, M. Thelen, M.K. Schafer, P. Eggelton, K. Whaley, y K.B.M. Reid. 1996, Molec. Immunol. 33(1):48; Schwaeble, W., H.P. Huemer, J. Most., M.P. Dierich, M. Strobel. C. Claus, K.B.M. Redi y H.W. Ziegler-Heitbrock, 1994, J. Eur. Biochem. 219:759-764). A diferencia de la mayoría de las proteínas del complemento, la properdina no parece estar sintetizada por el hígado. La properdina se almacena en gránulos de neutrófilos humanos y en niveles fisiológicamente relevantes de TNF. IL-8, fMLP y C5a inducen su rápida secreción (Schwaeble, W., U. Wirthmuller. B. Dewald. M. Thelen. M.K. Schafer, P. Eggelton, K. Whaley. y K.B.M. Reid, 1996. Molec. Immunol. 33(1):48). En una línea celular de monocitos humana, TNF e IL-1 potenciaron tanto la abundancia de ARNm de properdina con la secreción de la proteína (Schwaeble, W., H.P. Huemer, J. Most. M.P. Dierich, M. Strobel, C. Claus, K.B.M. Redi y H. W. Ziegler-Heitbrock. 1994. J. Eur. Biochem. 219:759-764).

De acuerdo con la presente invención, de las tres proteínas del complemento que están exclusivamente implicadas en la vía alternativa, la properdina es la diana más atractiva para el desarrollo de un inhibidor del complemento específico de una vía para tratar trastornos inflamatorios agudos. Como se demuestra más adelante en este documento, un anticuerpo anti-properdina que previene la unión de properdina a la convertasa C3 inhibe totalmente la activación de la vía alternativa. Por lo tanto, como se describe por primera vez en este documento, se requiere la properdina para la activación normal de la vía alternativa. Como se demuestra en este documento que la properdina desempeña un papel central en la activación del complemento, incluyendo condiciones que implican el inicio de la vía clásica del complemento, pueden investigarse y seleccionarse agentes anti-properdina que sean inesperadamente eficaces en los procedimientos para inhibir selectiva y potencialmente la activación de la vía alternativa del complemento, incluyendo procedimientos para inhibir la formación de productos de activación del complemento por la vía alternativa.

II. Procedimiento para Inhibir la Activación de la Vía Alternativa del Complemento

En un aspecto, un procedimiento de la presente invención proporciona la inhibición de la activación del complemento por la vía alternativa, incluyendo la inhibición de la formación de productos de activación del complemento por la vía alternativa (por ejemplo, formación de MAC).

No se entiende bien cómo la properdina interactúa con la convertasa C3, aunque se ha demostrado que la especificidad de unión principal de la properdina de dirige a C3b (Nolan, K.F. y K.B.M. Reid, 1993. Methods Enzymol. 223:35-47). El sitio de unión de properdina en C3b se ha localizado en los restos 1402-1435 en la cadena alfa de C3, evaluado por estudios de inhibición de péptidos (Daoudaki. M.E., J.D. Becherer y I.D. Lambris. 1988. J. Immunol. 140:1577-1580). El análisis para superponer péptidos indica que el sitio podría purificarse para los restos 1424-1432 (Alzenz, J. J.D. Becherer., I. Esparza, M.E. Daoudaki. D. Avita, S. Oppermann, y J.D. Lambris, 1989, Complement Inflamm. 6:307-314). También hay pruebas de que la properdina se une al factor B y de que esta interacción parece tener lugar a través de sitios tanto en las porciones Ba como Bb de la molécula. Aunque la properdina une C3b unida a células, la unión se potencia significativamente con C3bBb unida a células, lo que sugiere que los sitios de unión de tanto C3b como Bb pueden contribuir a la interacción de la properdina con el complejo convertasa (Farries, T.C., P.J. Lachmann, y R.A. Harrison, 1988. Biochem. 252:47-54). De esta forma, puede inhibirse la unión de la properdina a C3b si C3bBb no se conjuga o se conjuga con el factor B para formar C3bBb (convertasa C3 de la vía alternativa). Como se muestra con detalle más adelante en los Ejemplos, pueden seleccionarse e identificarse anticuerpos anti-properdina que bloquean la unión de properdina tanto a C3b como a C3bBb.

De acuerdo con un procedimiento de la presente invención, la unión de properdina a C3b es inhibe exponiendo properdina, en presencia de C3b, a una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-properdina, preferiblemente un anticuerpo de bloqueo y más preferiblemente un anticuerpo de bloqueo que carece de la capacidad para activar el receptor Fc\gamma tras la unión a properdina, como se describe en este documento. En la técnica se conocen bien medios para determinar una cantidad eficaz de un anticuerpo. El anticuerpo anti-properdina puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal. Se prefiere el uso de anticuerpos monoclonales. De acuerdo con la invención, se han identificado anticuerpos de bloqueo contra properdina y pueden obtenerse de fuentes comerciales (por ejemplo, Quidel) o pueden prepararse usando técnicas bien conocidas en la técnica. Son agentes anti-properdina que son eficaces de acuerdo con la invención preferiblemente anticuerpos que bloquean selectivamente la activación de la vía alternativa, incluyendo el bloqueo de la formación de los productos de activación del complemento por la vía alternativa. Sin embargo, además de tales anticuerpos de bloqueo, la invención como se describe en este documento contempla igualmente otros agentes de bloqueo tales como péptidos de bloqueo que se demuestra que inhiben sustancial o totalmente la formación dependiente de la vía alternativa de C3a, C5a y/o MAC después del inicio de la vía alternativa o de la vía clásica o de ambas.

Pueden prepararse anticuerpos policlonales contra properdina inmunizando un animal con properdina o una parte inmunogénica de la misma. En la técnica se conocen bien medios para inmunizar animales para la producción de anticuerpos. A modo de ejemplo, a un mamífero se le puede inyectar un inóculo que incluya properdina. La properdina puede incluirse en un inóculo sólo o conjugado con una proteína de vehículo tal como hemocianina de lapa californiana (KLH). Como se conoce en la técnica, la properdina puede suspenderse en un adyuvante para mejorar su inmunogenicidad. Después, pueden producirse sueros que contienen anticuerpos inmunológicamente activos a partir de la sangre de tales animales inmunizados usando procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica.

La identificación de anticuerpos que inmunorreaccionan específicamente con la properdina se realiza exponiendo los sueros que se cree que contienen tales anticuerpos a properdina para formar un conjugado entre anticuerpos y properdina. Después, la existencia del conjugado se determina usando procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica.

La properdina también puede usarse para preparar anticuerpos monoclonales contra properdina y puede usarse para un ensayo de investigación para identificar tales anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se producen a partir de hibridomas preparados de acuerdo con técnicas convencionales tales como las descritas por Kohler y col. (Nature, 256:495, 1975). En resumen, se inmuniza un mamífero adecuado, (por ejemplo, ratón BALB/c) mediante inyección con properdina. Después de un periodo de tiempo predeterminado, los esplenocitos se retiran del ratón y se suspenden en un medio de cultivo celular. Después, los esplenocitos se funden con una línea celular inmortal para formar un hibridoma. Los hibridomas formados se cultivan en cultivo celular y se seleccionan con respecto a su capacidad para producir un anticuerpo monoclonal contra properdina.

La inhibición de la unión de properdina a C3b se asocia con la inhibición de la activación del complemento por la vía alternativa. Como se muestra con detalle más adelante en los Ejemplos, los agentes anti-properdina, preferiblemente anticuerpos anti-properdina, no sólo bloquearon la unión de properdina a C3b y a C3bBb, sino que también bloquearon la formación de productos de la vía alternativa, incluyendo C5b-9, el complejo de ataque a la membrana (MAC), siendo el complejo el producto final de la activación del complemento. Adicionalmente, los datos en los Ejemplos muestran que los agentes anti-properdina, preferiblemente anticuerpos anti-properdina, también bloquean la lisis de eritrocitos dependiente de la vía alternativa mediada por MAC. Adicionalmente, los datos en los Ejemplos demuestran que los agentes anti-properdina, preferiblemente anticuerpos anti-properdina y sus fragmentos de unión a antígeno tales como F(ab)_{2}, son eficaces en la inhibición de la activación del complemento por la vía alternativa en modelos de derivación cardiopulmonar en condiciones de activación del complemento por la vía clásica.

Los presentes hallazgos son sorprendentes e inesperados a la vista de la bibliografía existente. Por ejemplo, Schreiber y col. demostraron que la vía alternativa podría recopilarse funcionalmente mezclando todas las proteínas de la vía alternativa excepto properdina; se concluyó que no se requiere properdina para el inicio y amplificación de la vía alternativa. (Schreiber, R.D. M.K. Pangburn, P.H. Lesavre y H.J. Muller-Eberhard, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 75:3948-3952). Además, la activación de la vía alternativa iniciada por células HeLa infectadas con el virus del sarampión en ausencia de IgG fue igual en ausencia o presencia de properdina (Sissons, J.G., M.B: Oldstone y R.D. Schreiber, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 77:559-562). Estos hallazgos anteriores han dado lugar a la hipótesis generalmente aceptada de que "la properdina no es un componente esencial para la activación de la vía, aunque su presencia da lugar a una amplificación más rápida de C3b unida" [énfasis añadido] (Pangburn, M.K. y H.J. Muller-Eberhard, 1984, Springer Semin. Immunopathol. 7:163-192). Estas referencias muestran eficazmente la identificación de properdina como una diana para la intervención de la vía alternativa. En contraste, de acuerdo con la presente invención, ahora la properdina se identifica como un componente esencial de y requerido para la activación de la vía alternativa del complemento. De esta forma, un procedimiento de la presente invención se refiere a la inhibición selectiva de la vía alternativa por un agente anti-properdina. Tal agente bloquea sorprendente y eficazmente la cascada alternativa del complemento, incluyendo en condiciones que implican el inicio de la vía clásica del complemento.

III. Procedimiento para tratar lesión patológica

La capacidad para inhibir la activación del complemento usando un procedimiento de la presente invención proporciona un régimen terapéutico para el tratamiento de pacientes que tienen síntomas clínicos en los que la activación del complemento es perjudicial. El sistema del complemento ha estado implicado como elemento que contribuye a la patogénesis de numerosas afecciones y estados de enfermedad agudos y crónicos, así como complicaciones de diversos procedimientos médicos, incluyendo infarto de miocardio (Moroko. P.R., C.B. Carpenter, M. Chiarello, M.C. Fishbein, P. Radva, J.D. Knostman, y S.L. Hale, 1978, Lab Invest. 48:43-47; Kilgore, K.S., G.S. Friedrichs, J.W. Homeister, y B.R. Lucchesi. 1994. Cardiovasc. Res. 28:437-44; Weisman, H.F., T. Bartow, M.K. Leppo, H.C. Marsh, G.R. Carson. M.F. Concino. M.P. Boyle, K.H. Roux. M.L. Weisteldt; y D.T. Fearon, 1990, Science 249:146-151: Schafer. P.J., D. Mathey, F. Hugo. y S. Bhaki. 1986, J. Imnunol. 137:1945-1949), apoplejía (Kaczorowski, S.L., J.K. Schiding, C.A. Toth y P. M. Kochanek, 1995. J. Cereb. Blood Flow Metab. 15:860-864; Morgan, B.P., P. Gasque. S.K. Singhrao, y S.J. Piddlesden, 1997, Exp. Clin. Immunogenet. 14: 19-23; Vasthare, U.S., R.H. Rosenwasser. F.C. Barone, y R.F. Tuma, 1993. FASEB J. 7:A424-429) ARDS (Mulligan. M.S., C.W. Smith. D.C. Anderson. R.F. Todd. M. Miyaska, T. Tamatani, T.B. Issekuts, y P.A. Ward, 1993. J. Immunol. 150:2401-2406; Solomkin. J.S., L.A. Cotta, P.S. Satoh, J.M. Hurst, y R.D. Nelson. 1985, Surgery 97:668-678: Mulligan. M.S., C.G. Yeh. A.R. Rudolph, y P.A. Ward, 1992, J. Immunol. 148:1479-1485; Anner, H., R.P. Kaufman, L Kobzik, C.R. Valeri. D. Shepro, y H.B. Hechtman, 1987. Ann Surgery 206:642-648; Zilow, G., A. Sturm. U. Rother; y M. Kirsctrfink. 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:151-157), lesión por reperfusión (Hsu. P., R Simpson, T.F. Lindsay. T. Hebell. L. Kobzik. F.D. Moore, D.T.Fearon. y H.B. Hechtman, 1993. Clin. 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Squinto, y S.A. Rollins, 1995, J. Clin Invest. 96:1564-1572), hemodiálisis (Hakim. R.M., J. Breillatt. J.M. Lazarus, y F.K. Port, 1984. New Eng. J. Med. 311:878-882), uso de medios de contraste radiográfico (Arroyaue. C.M., y E.M. Tan. 1977, Clin. Exp. Immunol. 29:89-94), rechazo de transplante (Pruitt. S.K., W.M. Baldwin. H.C. Marsh, S. Lin, C.G. Yeh, y R.R. Bollinger. 1991, Transplantation 52:868-873; Leventhal. J.R., A.P. Dalmasso. J.W. Cromwell. J.L. Platt, C.J. Bolman. y A.J. Matas, 1993. Transplantation 55:857-865, Dalmasso, A.P., G.M. Vercelloti, R.J. Fischel. R.J. Bolman. F.H. Bach y J.L. Platt. 1992, Am. J. Pathol. 140:1157-1166: Xia. W., D.T. Fearon. F.D. Moore. F.J. Schoen. F. Ortiz y R.L. Kirkman, 1992, Transplant Proc. 24:479-480), artritis reumatoide (Mollnes. T.E., T. Lea, O.J. Mellbye, J. Pahle. O. Grand, y M. Harboe. 1986, Arth. Rheum. 29:715-721: Morgan, B.P., R.H. Daniels, y B.D. Williams, 1988. Clin. Exp. Immunol. 73:473-478), esclerosis múltiple (Linington, C., B.P. Morgan, N.J. Scolding. S. Piddlesden, y P Wilkins, 1989. Brain. 112:895-911; Sanders. M.E., C.L. Koski, D. Robbins. M.L. Shin, M.M. Frank, y K.A. Joiner. 1986, J. Immunol. 135:4456), miastenia grave (Biesecker. G. y C.M. Gomez, 1989. J. Immunol. 142:2654-9; Nakano. S. y A.G. Engel. 1993 Neurology 43:1167-72), pancreatitis (Roxvall. L., A. Bengtson. y M. Heideman. 1989. J. Surg. Res. 47:138-143; Roxvall. L., A. Bentston. y M. Heidman, 1990 Arch. Surg. 125:918-921) y enfermedad de Alzheimer (Eikelenboom. P., C.E. Hack. J.M. Rozemuller. y F.C Stam, 1989, Virchows Arch. (Cell pathol.) 56:259-62: Rogers, J. N.R. Cooper, y S. Webster. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 89:10016-20). Aunque el complemento puede no ser la única causa de patogénesis en esas afecciones, sin embargo es un mecanismo patológico importante y representa un punto eficaz para el control clínico en muchos de estos estados de enfermedad.

Se han detectado productos de activación del complemento en fluidos biológicos o en tejidos enfermos aislados de pacientes con muchas de las afecciones mencionadas anteriormente, y para algunas enfermedades se ha demostrado una correlación entre la gravedad de los indicios clínicos con la abundancia de los productos de activación del complemento (Zilow, G., A. Sturm, U. Rother, y M. Kirschfink, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:151-157; Hack. C.E., J.H. Nuijens. R.J.F. Felt-Bersma, W.O. Schreuder. A.J.M. Eerenberg-Belmer, J. Paardekooper. W. Bronsveld, y L.G. Thijs, 1989. Am. J. Med. 86:20-26; Gelfand. J.A., M. Donelan, y J.F. Burke, 1983, Ann. Surg. 198:58-62). La mayoría de las pruebas convincentes que implican directamente el complemento en la patogénesis de un grupo diverso de enfermedades humanas provienen de estudios que usan modelos animales aceptados en la técnica de tales enfermedades. En tales modelos animales, se ha demostrado que la retirada de anticuerpos de activación de la vía clásica (Fischel, R.J., R.M. Bolman. J.L. Platt, K.S. Naharian, F.H. Bach, y J.J. Matas. 1990, Trans. Proc. 22:1077-1083; Platt. J.L., R.J. Fischel, A.J. Matas. S.A. Reif, R.M. Bolman., y F.H. Bach, 1991. Transplantation 52:214-230), reducción del complemento por el factor del veneno de cobra (Moroko, P.R., C.B. Carpenter, M. Chiarello. M.C. Fishbein, P. Radva, J.D. Knostman. y S.L. Hale. 1978, Lab. Invest. 48:43-47; Mulligan, M.S., C.W. Smith. D.C. Anderson. R.F. Todd, M. Miyaska. T. Tamatani, T.B. Issekuts. y P.A. Ward, 1993. J. Immunol 150:2401-2406; Gelfand, J.A., M. Donelan, y J.F. Burke, 1983. Ann. Surg. 198:58-62; Leventahal J.R., A.P. Dalmasso, J.W. Cromwell, J.L. Platt, C.J. Bolman, y A.J. Matas. 1993. Transplantation 55:857-865), inhibición de la actividad del complemento (Weisman, H.F., T. Bartow, M.K, Leppo, H.C. Marsh, G.R. Carson, M.F. Concino, M.P. Boyle, K.H. Roux, M.L. Weisfeldt, y D.T. Fearon, 1990. Science 249:146-151; Mulligan, M.S., C.G. Yeh, A.R. Rudolph, y P.A. Ward. 1992. J. Immunol. 148:1479-1485; Pemberton. M., G. Anderson, V. Vervicka. D.E. Justus, y G.D. Ross. 1993. J. Immunol. 150:5104-5113), o el ensayo en animales genéticamente deficientes en componentes específicos del complemento (Gelfand, J.A., M. Donelan, y J.F. Burke, 1983, Ann. Surg. 198:58-62; Watson, W.C. y A.C. Townes, 1985, J. Exp. Med. 162:1878-1883), anulan o retrasan la patogénesis.

Se han reconocido deficiencias heredadas en seres humanos para casi todos los componentes del complemento (Liszewski, M.K. y J.P. Atkinson, 1993, Fundamental Immunology, Tercera Edición. Editado por W.E. Paul, Raven Press. Ltd. Nueva York). La deficiencias de los componentes de la misma vía provocan problemas clínicos similares. Las deficiencias del componente de la vía clásica (C1, C4, C2) causan comúnmente infecciones por varios organismos pirogénicos y enfermedades del complejo inmune, como lo hace la deficiencia de C3. Las deficiencias del componente de la vía alternativa (P, D) suelen dar lugar a infecciones por Neisseria. No hay pruebas de que la deficiencia de properdina provoque un aumento de la susceptibilidad a enfermedades del complejo inmune o a infecciones con organismos distintos de Neisseria. No se han descrito deficiencias homocigóticas en el factor B (Morgan, B.P. y M.J. Walport, 1991, Immunology Today 12:301-306).

La inactivación de la vía alternativa del complemento es particularmente útil en sujetos en los que la activación se asocia con los efectos patológicos de los estados de enfermedad. Como se ha indicado anteriormente en este documento, se sabe que la activación del complemento está asociada con un grupo grande y diverso de estados de enfermedad. La activación del complemento por la vía alternativa es particularmente prominente en estados de lesión aguda.

La septicemia fulminante de meningococos inducida por el complemento en pacientes con enfermedad sistémica de meningococos es probable que esté causada predominantemente por la activación de la vía alternativa (Brandtzaeg y col., Journal of Infections Diasease. 173:647-55, 1996). En pacientes con síndrome de insuficiencia respiratoria en adultos (ARDS), la activación del complemento se produce sólo por la vía alternativa durante las primeras 48 horas (Zilow y col., J. Exp. Immunology, 79: 151-57, 1990). Se ha usado un agente que suprime la activación del complemento por ambas vías para tratar la inflamación miocárdica post-isquémica y necrosis en modelos animales de enfermedad cardiovascular (Weisman y col., Science, 249:146-71, 1990). De acuerdo con Weisman y col., la lesión tisular aguda asociada con numerosas enfermedades autoinmunes es el resultado de la activación del complemento. La lesión tisular inducida por el complemento se encuentra en vasculitis inducida por el complejo inmune, glomerulonefritis, anemia hemolítica, miastenia grave, artritis inducida por colágeno de tipo II e isquemia.

También se ha informado del papel de la vía alternativa del complemento en la inducción de la lesión cardiaca isquémica durante reperfusión (Amsterdam y col., Amer. J. Physiol., 268: H448-H457, 1995). Mulligan y col., 1992, J. Immunol. 148:1479-1485 informaron de que la activación del complemento desempeña un papel en diversas lesiones tisulares incluyendo peritonitis inducida por glucógeno, lesión pulmonar y dérmica tras deposición intra-alveolar o intra-dérmica de complejos inmunes de IgG, lesión pulmonar aguda que resulta de la activación intravascular del complemento tras la inyección del factor del veneno de cobra, y lesión pulmonar y cutánea aguda después de un traumatismo térmico.

Diversos procedimientos médicos utilizan la circulación extracorpórea, (ECC) incluyendo hemodiálisis, plasmaféresis, plaquetaféresis, leucoféresis, oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), precipitación extracorpórea de LDL inducida por heparina (HELP) y más comúnmente derivación cardiopulmonar (CPB). Estos procedimientos exponen la sangre o productos sanguíneos a superficies extrañas que pueden alterar la función celular normal y la hemostasis. Por ejemplo, está establecido que CPB suele conducir a respuestas inflamatorias complejas que dan lugar a complicaciones post-quirúrgicas, generalmente denominadas "síndrome post-perfusión". Entre estos eventos post-operatorios están insuficiencia respiratoria, trastornos hemorrágicos, disfunción renal y, en la mayoría de los casos graves, insuficiencia de múltiples órganos (Wan, S., J-L. LeClerc, y J-L. Vincent, 1997, Chest 112:676-692). La principal causa sospechosa de estos problemas relacionados con CPB es la activación inapropiada del complemento durante el procedimiento de derivación (Chenoweth, K., S. Cooper, T. Hugli, R. Stewart, E. Blackstone, y J. Kirklin, 1981, N. Engl. J. Med. 304:497-503; P. Haslam, P Townsend, y M. Branthwaite, 1980, Anaesthesia 25:22-26; J.K. Kirklin, S. Westaby, E. Blackstone, J.W. Kirklin, K. Chenoweth, y A. Pacifico, 1983, J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 86:845-857; Moore, F.D., K.G. Warner, B.A. Assousa, C.R. Valeri, y S.F. Khuri, 1988. Ann. Surg. 208:95-103; J. Steinberg, D. Kapelanski, J. Olson, y J. Weiler, 1993, J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 106:1901-1918). Aunque parece que el contacto de la sangre con el tubo y las superficies oxigenadoras del circuito de CPB da lugar a la activación de la vía alternativa del complemento (Chenoweth, K., S. Cooper, T. Hugli, R. Stewart, E. Blackstone, y J. Kirklin, 1981, N. Engl. J. Med. 304:497-503; Velthuis, H., P.G.M. Jansen, C.E. Hack, L. Eijsan y C.R.H. Wildevuur, 1996, Ann. Thorac. Surg. 61:1153-1157), también hay pruebas de que la vía clásica del complemento se activa durante CPB (Wachtfogel, Y.T., P.C. Harpel, L.H. Edmunds, Jr. y R.W. Colman, 1989, Blood 73: 468-471). Además, la cascada clásica del complemento se inicia tras la finalización de CPB debido a la adición de protamina a la sangre de un paciente. La protamina se utiliza clínicamente para unir y retirar la heparina que se añade como anticoagulante durante la intervención quirúrgica. Los complejos heparina-protamina provocan la activación significativa de la vía clásica del complemento (Steinberg J., D. Kapelanski, J. Olson y J. Weiler, 1993, J. Thorac Cardiovasc. Surg. 106: 1901-1918), contribuyendo además al síndrome post-perfusión.

Se sabe que las especies activadas del complemento, particularmente las anafilotoxinas C3a y C5a, suscitan diversas respuestas inflamatorias de muchos tipos celulares. Por ejemplo, C5a puede regular positivamente la expresión molecular de la lesión celular en neutrófilos, y también puede inducir enzima lisosomal y liberación del radical libre de tanto neutrófilos como monocitos (Chenoweth, D. y T. Hugli. 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 75:3943-3947; Fletcher, M.P., G. Stakl, y J. Longhurst, 1993, Am. J. Physiol. 265:H1750-H1761). Asimismo, C5a puede activar plaquetas, haciéndolas incapaces de la función de coagulación normal (Foreman, K.E., A.A. Vaporciyan, B.K. Bonish, M.L. Jones, K.J. Johnson, M.M. Glovsky, S.M: Eddy y P.A. Ward, 1994, J. Clin. Invest. 94:1147-1155). Finalmente, el producto del complemento activado terminal, C5b-9 (complejo de ataque a la membrana), también puede afectar a la función de plaquetas y células endoteliales (Foreman, K.E., A.A. Vaporciyan, B.K. Bonish, M.L. Jones, K.L. Johnson, M.M. Glovsky, S.M. Eddy, y P.A. Ward, 1994, J. Clin. Invest. 94:1147-1155; Hattori, R., K.K. Hamilton, R.D. Fugate, R.P. McEver, y P.J. Sims, 1989, J. Biol. Chem. 264:9053-9060). Son las acciones de estas especies del complemento en neutrófilos, plaquetas y otras células circulatorias las que probablemente conducen a diversos problemas que surgen después de CPB.

Recientemente, ha habido pruebas experimentales directas de que la activación del complemento es, de hecho, responsable de muchos de los cambios que implican la disfunción de los sistemas inmune y hemostático observados después de CPB. Usando el receptor del complemento soluble de tipo 1 (sCR1) que previene la activación de las vías tanto clásica como alternativa del complemento, Gillinov, A.M., P.A. DeValeria. J.A. Winkelstein, I. Wilson, W.E. Curtis, D. Shaw, C.G. Yeh, A.R. Rudolph, W.A. Baumgartner, A. Herskowitz, y D.E. Cameron, (1993, Ann. Thorac. Surg. 55:619-624) demostraron que la inhibición de la activación del complemento mejoraba la resistencia pulmonar vascular en cerdos que sufrieron un procedimiento de CPB. Utilizando un modelo ex vivo de CPB estimulado, Rinder y col., (1995, supra) demostraron que la adición de un anticuerpo monoclonal a C5 reducía significativamente la activación de neutrófilos y plaquetas que se produce durante el procedimiento de derivación. El anticuerpo contra C5 bloquea la escisión de C5 en las vías tanto clásica como alternativa del complemento, y de esta forma previene la producción de tanto el complejo de ataque a la membrana como la nafilotoxina, C5a. El uso de tal anticuerpo monoclonal anti-C5 para reducir la activación del complemento, plaquetas y leucocitos o la adhesión de plaquetas-leucocitos resultante del paso de la sangre de un paciente por la circulación extracorpórea se describe en el documento WO95/25540 [PCT/US95/03614].

IV. Composiciones farmacéuticas

De esta forma puede usarse un procedimiento de la presente invención para inhibir la activación del complemento por la vía alternativa, incluyendo inhibir la formación de productos de activación del complemento por la vía alternativa, en pacientes administrando a un paciente en necesidad de inactivación del completo una cantidad inhibidora eficaz de un agente anti-properdina, preferiblemente un anticuerpo anti-properdina o dominio de unión a antígeno del mismo. Preferiblemente, el agente anti-properdina, más preferiblemente un anticuerpo anti-properdina o dominio de unión a antígeno del mismo, se administra la forma de una composición farmacéutica.

Tal composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente anti-properdina, se describe preferiblemente un anticuerpo anti-properdina formulado junto con uno o más vehículos no tóxicos farmacéuticamente aceptables. Como se usa en este documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa una carga sólida, semi-sólida o líquida no tóxica, inerte, diluyente, material de encapsulación o auxiliar de formulación de cualquier tipo. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables son azúcares tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados tales como carboximetil celulosa sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina, talco, excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cartamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de semilla de soja; glicoles tales como polietilenglicol; ésteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponantes tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico, agua sin pirógenos; solución salina isotónica, solución de Ringer, alcohol etílico, y soluciones de tampón fosfato, además también pueden estar presentes en la composición, de acuerdo con el juicio del formulador, otros lubricantes no tóxicos compatibles tales como lauril sulfato sódico y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, edulcorantes, aromatizantes y agentes perfumantes, conservantes y antioxidantes.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse a seres humanos y a otros animales por vía oral, rectal, parenteral, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, transdérmica, tópica (en forma de polvos, pomadas o gotas), bucal, o como pulverizador oral o nasal.

Las formas de dosificación líquidas para administración oral incluyen emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los compuestos activos, las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes de solubilización y emulsionantes tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, tetrahidrofurfuril alcohol, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán, y mezclas de los mismos. Además de diluyentes inertes, la composición oral también puede incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, emulsionantes o agentes de suspensión, edulcorantes, aromatizantes y agentes perfumantes.

Pueden formularse preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles de acuerdo con la técnica conocida usando agentes de dispersión o humectantes adecuados y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución inyectable estéril, suspensión o emulsión en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, en forma de una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están el agua, solución de Ringer, U.S.P. y solución isotónica de cloruro sódico. Además, se emplean convenientemente aceites estériles fijos en forma de un disolvente o medio de suspensión. Para este propósito, puede emplearse cualquier aceite blando fijo incluyendo mono- o di-glicéridos sintéticos. Además, en la preparación de agentes inyectables se usan ácidos grasos tales como ácido oleico.

Las formulaciones inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, por filtración a través de un filtro que retiene bacterias, o incorporando agentes de esterilización en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse o dispersarse en agua estéril o en otro medio inyectable estéril antes de su uso.

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Para prolongar el efecto de un fármaco, suele ser deseable retrasar la absorción del fármaco de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto puede realizarse mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con poca solubilidad en agua. Después, la velocidad de absorción del fármaco depende de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y de la forma cristalina. Como alternativa, el retraso de la absorción de un fármaco administrado por vía parenteral se realiza disolviendo o suspendiendo el fármaco en un vehículo oleoso. Las formas de inyección en depósito se fabrican formando matrices en microencápsulas del fármaco en polímeros biodegradables tales como polilactida-polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la relación entre el fármaco y el polímero y de la naturaleza del polímero particular empleado, puede controlarse la velocidad de liberación del fármaco. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). También pueden prepararse formulaciones inyectables en depósito incluyendo el fármaco en liposomas de microemulsiones que son compatibles con los tejidos del cuerpo.

Las composiciones para administración rectal o vaginal son preferiblemente supositorios que pueden prepararse mezclando los compuestos de esta invención con excipientes o vehículos adecuados no irritantes tales como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera para supositorio que son sólidos a temperatura ambiente pero líquidos a temperatura corporal y por lo tanto pueden fundirse en el recto o en la cavidad vaginal y liberar el compuesto activo.

Las composiciones sólidas de un tipo similar pueden emplearse como cargas en cápsulas de gelatina cargadas blandas y duras usando excipientes tales como lactosa o azúcar de la leche así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.

Como se ha podido observar anteriormente, los compuestos activos también pueden estar en forma micro-encapsulada con uno o más excipientes. Las formas de dosificación sólidas de comprimidos, grageas, cápsulas, píldoras y gránulos pueden prepararse con recubrimientos y envueltas tales como recubrimientos entéricos, recubrimientos que controlan la liberación bien conocidos en la técnica de la formulación farmacéutica. En tales formas de dosificación sólidas, el compuesto activo puede mezclarse con al menos un diluyente inerte tal como sacarosa, lactosa o almidón. Tales formas de dosificación también pueden comprender, como es práctica normal, sustancias adicionales distintas de diluyentes inertes, por ejemplo, lubricantes para la formación de comprimidos y otros ácidos para la formación de comprimidos tales como estearato de magnesio y celulosa microcristalina. En el caso de las cápsulas, comprimidos y píldoras, las formas de dosificación también pueden comprender agentes tamponantes. Pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y también pueden ser de una composición tal que liberan sólo el o los ingredientes activos, o preferiblemente, en una cierta parte del tracto intestinal, opcionalmente, de una manera retrasada. Los ejemplos de composiciones embebidas que pueden usares incluyen sustancias poliméricas y ceras.

Las formas de dosificación para administración tópica o transdérmica de un compuesto de esta invención incluyen, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, pulverizadores, inhaladores o parches. El componente activo se mezcla en condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable y puede requerirse cualquier conservante o tampón necesario. También se contemplan como que están dentro del alcance de esta invención la formulación oftálmica, gotas para el oído, pomadas para el ojo, polvos y soluciones.

Las pomadas, pastas, cremas y geles pueden contener, además de un compuesto activo de esta invención, excipientes tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de cinc, o mezclas de los mismos.

Los polvos y pulverizadores pueden contener, además de los compuestos de esta invención, excipientes tales como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Los pulverizadores pueden contener adicionalmente propulsores habituales tales como clorofluorohidro-
carburos.

Los parches transdérmicos tienen las ventajas añadidas de proporcionar un administración controlada de un compuesto al cuerpo. Tales formas de dosificación pueden fabricarse disolviendo o administrando el compuesto en el medio adecuado. También pueden usarse potenciadores de la absorción para aumentar el flujo del compuesto a través de la piel. La velocidad puede controlarse proporcionando una membrana de control de la velocidad o dispersando el compuesto en una matriz polimérica o gel.

Los Ejemplos que se muestran a continuación ilustran realizaciones preferidas de la presente invención y no limitan de forma alguna la memoria descriptiva ni las reivindicaciones.

Ejemplo 1 Unión de Properdina a C3b

Se recubrieron placas de microtitulación de poliestireno con C3b humano (0,5 \mug/50 \mul por pocillo) (Calbiochem, San Diego, CA, Cat. Nº 204860) en solución salina tamponada con Veronal (VBS); (barbiturato de dietilo 5 mM, NaCl 120 mM, MgCl_{2} 5 mM, EGTA 5 mM) durante noche a 4ºC. Después de aspirar la solución de C3b, los pocillos se bloquearon con VBS que contenía albúmina de suero humano al 0,5% (HSA) (Sigma Chemical Company, St. Louis. MO. Cat. Nº A95111) durante 2 horas a temperatura ambiente. Los pocillos sin el recubrimiento de C3b sirvieron como controles de fondo. Se añadieron a los pocillos alícuotas de properdina humana (o factor P) (Advanced Research Technology, San Diego, CA. Cat. Nº A139) en diversas concentraciones en la solución de bloqueo. Después de 2 horas de incubación a temperatura ambiente, los pocillos se aclararon bien con VBS.

La properdina unida a C3b se detectó por la adición de anticuerpo monoclonal de ratón anti-properdina humana (anticuerpo de detección) (Quidel, San Diego, CA, anticuerpo monoclonal anti-properdina humana P Nº 2. Cat. Nº A235) a una dilución 1:1000 en solución de bloqueo, que se dejó incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar las placas con VBS, se añadió un anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con peroxidasa (dilución 1:1000 en solución de bloqueo) (Sigma Chemical Company) y se dejó incubar durante 1 hora. La placa se volvió a aclarar a fondo con VBS, y se añadieron 100 \mul del sustrato 3,3',5,5'-tetrametil bencidina (TMB) (Kirkergaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD. Cat. Nº 50-65-00). Después de la incubación durante 10 minutos a 25ºC, la reacción de TMB se interrumpió por la adición de 100 \mul de ácido fosfórico, y la placa se leyó a 450 nm en un lector de microplacas (por ejemplo, SPECTRA MAX 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). El valor estimado de K_{d} de la unión de
properdina a C3b se basó en la concentración de properdina en una unión máxima del 50% (Microcal Origin Program).

La capacidad de un anticuerpo monoclonal murino anti-properdina humana (anticuerpo de bloqueo) para inhibir la unión de P a C3b se evaluó añadiendo diversas concentraciones de este anticuerpo (anticuerpo de bloqueo, Quidel, anticuerpo monoclonal anti-properdina humana P Nº 2 Cat. Nº A233) a una concentración constante de properdina (2 nM). La cantidad de properdina unida a C3b se detectó con sistema de detección de anticuerpos descrito anteriormente.

Como se muestra en la Fig.1, la properdina humana se une a C3b, que se ha inmovilizado en los pocillos de placa de microtitulación. La constante de unión aparente de estos datos, definida como la concentración de properdina necesaria para alcanzar una unión semimáxima, es de aproximadamente 1 nM. Cuando se añade el anticuerpo monoclonal de bloqueo anti-properdina junto con la properdina en este ensayo, se observa inhibición dependiente de la dosis de la unión de properdina a C3b (Fig. 2). El valor del CI_{50} de 1 nM indica que el anticuerpo se une con alta afinidad a properdina, bloqueando por lo tanto su interacción con C3b.

Ejemplo 2 Unión de properdina a C3b(Bb)

Este ensayo se realizó como se describe en el Ejemplo 1 anterior con algunos cambios. En resumen, se recubrieron pocillos de microtitulación con C3b, se lavaron, bloquearon e incubaron con diversas concentraciones de suero humano normal (NHS) (Sigma Chemical Company, Cat. Nº S1764) diluido en solución de bloqueo durante 2 horas a temperatura ambiente. En las condiciones de este ensayo de unión, el factor B en suero unirá C3b unido a la fase sólida y, después de la escisión por el factor D en suero, generará C3bBb. Se sabe que la properdina se une a C3bBb con alta afinidad (Farries, T.C., P.J. Lachman y R.A. Harrison, 1988, Biochem. 252:47-54). Los pocillos no recubiertos sirvieron como controles de fondo. Después del lavado, la properdina unida se detectó con el anticuerpo anti-properdina descrito en el Ejemplo 1 anterior.

Para evaluar el efecto del anticuerpo de bloqueo para inhibir la unión de properdina a C3b(Bb), se añadieron diversas concentraciones del anticuerpo de bloqueo descrito en el Ejemplo 1 a una concentración fija de suero (4% en solución de bloqueo). La cantidad de properdina unida a C3b(Bb) se detectó usando el sistema de detección descrito en el Ejemplo 1 anterior.

Además de la properdina purificada, la properdina en suero puede unirse a C3b inmovilizado. Como el suero también contiene el factor B, que une C3b con una conversión resultante en Bb después de la descripción por el factor D, es probable que la properdina derivada del suero una el compleja C3bBb, en este formato de ensayo. Cuando el anticuerpo monoclonal de bloqueo anti-properdina del Ejemplo 1 se añade con suero humano a los pocillos recubiertos con C3b, hay una inhibición dependiente de la dosis de la unión de properdina a C3bBb (Fig. 3). De nuevo, el valor de CI_{50} en este ensayo es 1-2 nM, coherente con los resultados obtenidos en la Fig. 2 descritos en el Ejemplo 1 anterior.

Ejemplo 3 Ensayo de MAC Dependiente de la Vía Alternativa

Los datos de unión de los Ejemplos 1 y 2 anteriores revelan que el anticuerpo monoclonal contra properdina previene la unión de properdina a C3b y la convertasa C3 funcional (C3bBb). Como la bibliografía sugiere que la properdina estabiliza la convertasa C3, resultó interesante determinar si el anticuerpo contra properdina debía afectar de forma apreciable a los aspectos terminales de la cascada alternativa del complemento. El producto final de esta vía es el complejo de ataque a la membrana C5b-9 (MAC). Para analizar los efectos del anticuerpo contra properdina en la formación de MAC mediante la vía alternativa, se utilizó un ensayo en el que se usó LPS bacteriano como un sustrato para iniciar la cascada de la vía alternativa del complemento.

Estudios anteriores han demostrado que el lipopolisacárido (LPS) de Salmonella typhosa (S. Typhosa) (Sigma Chemical Company, Cat. Nº 6386) sirve como sustrato potente para la activación de la vía alternativa del complemento (Clardy, C.W., 1994, Infect. Immun. 62:4539-4555). Se recubrieron pocillos se microtitulación con LPS (2 \mug/50 \mul por pocillo) en VBS durante una noche a 4ºC. Los pocillos no recubiertos sirvieron de controles de fondo. Después de aspirar la solución de LPS, los pocillos se trataron con solución de bloqueo y se incubaron con diversas concentraciones de suero humano normal. Después de una incubación de 3 horas a 37ºC, en el MAC depositado se detectó con anticuerpo monoclonal de ratón anti-C5b-9 soluble humano (Quidel, Cat. Nº A239) usando metodologías de ELISA convencionales esencialmente como se ha descrito en los Ejemplos anteriores. El efecto del anticuerpo de bloqueo en la formación de MAC se evaluó añadiendo diversas concentraciones del anticuerpo de bloqueo a una concentración fija del suero (4% en solución de bloqueo). La cantidad de inhibición de la formación de C5b-9 soluble se determinó usando el sistema de detección de anticuerpos descrito en los Ejemplos anteriores.

Como se demuestra en la Fig. 4, la adición de cantidades cada vez mayores de suero humano normal, que contienen todos los componentes del complemento, dio lugar a un aumento de la deposición de MAC en la superficie de LPS. La formación de MAC en este ensayo pudo prevenirse completamente por la adición del anticuerpo monoclonal contra properdina, como se observa en la Fig. 5. Estos datos indican que la properdina no se estabiliza simplemente y altera la cinética de la vía alternativa, como se sugiere en la bibliografía, sino que demuestra por primera vez que la properdina es de hecho necesaria para la progresión de la cascada.

Ejemplo 4 Hemolisis Dependiente de la Vía Alternativa

Para confirmar y ampliar estos resultados, el anticuerpo contra properdina se examinó en otro ensayo de la vía alternativa. Los eritrocitos de conejo inician la cascada alternativa del complemento y la formación resultante de más provoca la lisis de estas células. Si el anticuerpo contra properdina puede completar la inhibición de la vía alternativa, entonces la adición del reactivo a los eritrocitos de conejo bañados en suero humano debería prevenir la lisis celular. Esto puede ensayarse examinando la dispersión de luz causada por los glóbulos rojos intactos: las células lisadas no difractan la luz y hay una reducción consecuente de la luz dispersada. Está establecido que los eritrocitos de conejo activan específicamente la vía alternativa del complemento, con una lisis resultante de las células por el complejo C5b-9 (Nolan, K.F. y K.B.M. Reid, 1993. Properdin. Methods Enzymol. 223:35-47). El suero humano normal, en diversas concentraciones en Tampón Veronal con Gelatina (GVB) (Advanced Research Technology) con MgCl_{2} 5 mM y EGTA 10 mM, se incubó con 37ºC con un número fijo de eritrocitos de conejo (Advanced Research Technology). Se midió una disminución progresiva de la dispersión de luz (debido a la lisis de células intactas) a 595 nm como una función de tiempo en un lector de placas ELISA con temperatura controlada (Polhill y col., J. Immunol. 121:383:370). Para determinar la capacidad del anticuerpo de bloqueo para inhibir la hemolisis de eritrocitos de conejo, se añadieron diversas concentraciones del anticuerpo de bloqueo a una concentración fija de suero humano normal (8%) y el ensayo se realizó como se ha descrito anteriormente. Los datos se registraron y analizaron con un lector de placas SpectraMax y un software.

Como se muestra en la Fig. 6, la adición del suero en ausencia del anticuerpo contra properdina dio lugar a la lisis de las células y a una reducción espectacular de la dispersión de luz. La adición del aumento de las concentraciones del anticuerpo provocó una disminución de la lisis de eritrocitos, con el anticuerpo 30 nM bloqueando completamente la destrucción celular mediada por MAC. Estos resultados confirman que los anticuerpos monoclonales que unen y bloquean la interacción de la properdina con la convertasa C3 son reactivos potentes que pueden anular completamente los efectos de la vía alternativa del complemento.

Especialistas en la técnica reconocen y aceptan que los estudios in vitro del complemento son representativos de y predicen el estado in vivo del sistema del complemento. A modo de ejemplo, el uso de procedimientos de ELISA in vitro (ensayo inmunoabsorbente ligado a una enzima) para detectar la properdina asociada con lipopolisacárido (LPS) es un "procedimiento sencillo rápido y fiable para la evaluación de la función del complemento particularmente la detección de los estados con falta de complemento" (Fredrikson y col., J. Immunol. Meth., 166:263-70, 1993). Los autores concluyen que la técnica in vitro puede usarse in vivo con la misma probabilidad de éxito en la detección de la activación de la vía alternativa del complemento en estados de enfermedad.

Asimismo, se descubrió que el uso de un péptido de 34 aminoácidos para estudiar la unión de properdina con C3b usando un ensayo de hemolisis in vitro es un indicio apropiado de tanto el papel de la properdina durante la infección como del mecanismo de la estabilización de la convertasa C3 (Daoudaki y col., J. of Immun., 140:1577-80, 1988).

Además, el ensayo de hemolisis de eritrocitos de conejo convencional (descrito con detalle en el Ejemplo 4), que se usa para medir la actividad de la vía alternativa del complemento, se acepta en la técnica como "el ensayo más conveniente para la actividad de la vía alternativa humana" (Pangburn, Meth. In Enzymology, 162:639-53, 1988).

Ejemplo 5 Derivación Cardiopulmonar: Modelo de bucle de tubo

Para ensayar el efecto de un anticuerpo monoclonal de bloqueo anti-properdina, como se describe en los Ejemplos 1-4 anteriores, en la inhibición de la activación del complemento en derivación cardiopulmonar (CPB), se utilizó un modelo de bucle de tubo de CPB como se describe por Gong, J., R. Larsson, K.N. Edkahl, T.E. Mollnes, U. Nilsson, y B. Nilsson, 1996, J. Clin. Immunol. 16:222-229. Se recogió la sangre entera de un donante sano en un tubo vacutainer de 7 ml (Becton Dickinson, San Jose, CA) que contenía 20 U de heparina/ml de sangre. El tubo de polietileno como el usado durante CPB (PE 330; I.D., 2,92 mm, D.O., 3,73 mm; Clay Adams, NJ) se llenó con 0,5 ml de la sangre humana heparinizada y se cerró en un bucle con una pieza corta de un tubo de silicio. La sangre heparinizada que contenía EDTA 20 mM (que inactiva el complemento) sirvió de control de fondo. Los bucles del tubo de muestra y control rotaron verticalmente en un baño de agua durante 1 hora a 37ºC. Después de la incubación, las muestras de sangre se transfirieron en 1,7 ml de tubos eppendorf siliconados que contenían EDTA 0,5 M dando una concentración final de EDTA de 20 mM. Las muestras se centrifugaron (4000 x g durante 5 minutos a 4ºC) y se recogió el plasma. Las muestras de plasma se diluyeron al 10% con un tampón diluyente de muestra y se determinaron las cantidades de C3a así como de MAC soluble (sMAC) usando kits de ensayo ELISA siguiendo las instrucciones del fabricante (Quidel, Catálogos Nº A015 para C3a y A009 para C5b-9/MAC). Para los estudios de inhibición del complemento, se añadieron diversas concentraciones (100-600 nM) del anticuerpo de monoclonal de bloqueo anti-properdina descrito en los Ejemplos 1-4 a la sangre heparinizada inmediatamente antes de la circulación durante 1 hora a 37ºC. Después de circulación/rotación en una baño de agua a 37ºC durante 1 hora, las alícuotas se analizaron con respecto a MAC soluble y C3a como se ha descrito anteriormente usando kits de ensayo ELISA (Quidel).

Usando este paradigma de CPB simplificado en el que se llenó parcialmente un tubo de CPB convencional con sangre humana reciente, dando una interfaz aire-sangre y en el que el tubo se une extremo a extremo con un manguito de silicio para formar un bucle, de forma que este bucle lleno de sangre rote en un baño de agua caliente (37ºC) para estimular el movimiento de la sangre a través de un circuito de derivación, hay una activación marcada del complemento durante la rotación de la sangre en el tubo. De forma importante, el anticuerpo de bloqueo anti-properdina humana provoca la inhibición significativa de esta activación del complemento. Esto puede observarse en la Fig. 7, donde la formación del complejo de ataque a la membrana soluble (sMAC) en el modelo de bucle se inhibe casi completamente por el anticuerpo anti-properdina 100 nM. Asimismo, la misma cantidad de anticuerpo provoca una reducción significativa de la formación de C3a (Fig. 7).

Esta es la primera demostración de la eficacia de un agente que inhibe selectivamente la activación de la vía alternativa en un modelo de CPB. En contraste, todos los agentes anteriores a la fecha que se han usado experimentalmente para inhibir la activación del complemento en protocoles de CPB inhiben las vías tanto clásica como alternativa del complemento (por ejemplo, Gillinov, A.M., P.A. DeValeria, J.A. Winkelstein. I. Wilson, W.E. Curtis. D. Shaw. C.G. Yeh, A.R. Rudolph, W.A. Baumgartner, A. Herskowitz, y D.E. Cameron, 1993, Ann. Thorac. Surg. 55:619-624; Rinder, C.S., H.M. Rinder, B.R. Smith. J.C.K. Fitch, M.J. Smith, J.B. Tracey, L.A. Matis, S.P. Squinto, y S.A. Rollins, 1995, J. Clin. Invest. 96:1564-1572). Como se ha sugerido que las vías tanto clásica como alternativa se activan durante CPB (Wachtfogel, Y.T., P.C. Harpel. L.H. Edmunds, Jr. y R.W. Colman, R.W., 1989, Blood, 73:468-471), estos resultados con un agente de dirección de la vía alternativa son particularmente sorprendentes.

Ejemplo 6 Agentes de Bloqueo: Falta de la Activación del Receptor Fc\gamma

Como se describe en el Ejemplo 5 anterior, el anticuerpo monoclonal de bloqueo anti-properdina inhibe potencialmente MAC soluble y la generación de C3a en un modelo de bucle de tubo de derivación cardiopulmonar. Se sabe que los agentes pro-inflamatorios (C5a, C3a y sMAC) generados por la activación del complemento activan leucocitos, plaquetas y células endoteliales. Como marcador para la activación de neutrófilos, también se determinaron niveles en suero de elastasa de neutrófilos en la sangre entera en el modelo de bucle de tubo. Como se esperaba, los niveles de elastasa en las muestras de sangre incubadas en el bucle de tubo aumentaron sobre los niveles en las muestras de control. Sin embargo, el anticuerpo monoclonal anti-properdina no inhibió la liberación de elastasa. Más bien hubo un aumento inesperado de los niveles de elastasa en suero con un aumento de las concentraciones de anticuerpo. Si se generan complejos inmunes cuando el anticuerpo monoclonal anti-properdina se añade a la sangre que contiene properdina, estos complejos inmunes podrían interactuar con receptores Fc\gamma en neutrófilos dando lugar a la activación celular. Ravetch, J.V. y J.P. Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol. 9:457-492 y Hulett, M.D. y P.M. Hogarth, 1994, Adv. Immunol. 57:1-127 han analizado receptores Fc\gamma y su activación.

Son preferiblemente agentes de acuerdo con la presente invención que inhiben selectivamente la activación de la vía alternativa del complemento agentes que no activan receptores Fc\gamma, por ejemplo, mediante la formación de complejos inmunes con su antígeno. Tales agentes pueden seleccionarse con respecto a su capacidad para activar receptores Fc\gamma mediante diversos ensayos conocidos en la técnica. Como la generación de superóxido es una de las respuestas clásicas de neutrófilos y de otros fagocitos a la activación mediante receptores Fc\gamma (RII), se utilizó una ensayo específico para la liberación de superóxido de células en sangre entera diluida para seleccionar y evaluar los agentes y el posible papel de los receptores Fc\gamma en la activación de neutrófilos por tal agente. Los agentes de anticuerpo monoclonal son agentes de agregación generalmente ineficaces tras la unión a su antígeno y de esta forma son ineficaces para activar receptores Fc\gamma mediante la formación de complejos inmunes. Sin embargo, se detectó la activación de Fc\gamma para un anticuerpo monoclonal de bloqueo anti-properdina como se muestra a continuación.

Se realizó un ensayo de quimioluminiscencia para la producción de superóxido en la sangre entera diluida (Tose, M.F. y A. Itamedani, 1992, Am. J. Clin. Pathol. 97:566-573). La sangre reciente se recogió mediante un pinchazo en el dedo y se diluyó rápidamente 350 veces en medio RPMI-1640 sin rojo fenol que contenía Pen-Strep que se tamponó con HEPES 10 mM (pH 7,4 a 37ºC. El medio también contiene lucigenina 10 \muM (Sigma Chemical Co.), un compuesto que se vuelve quimioluminiscente cuando es reducido por el superóxido. Se añadieron estimulares potenciales del estallido oxidativo (por ejemplo, PMA o C5a) o controles de tampón a muestras duplicadas de 1 ml del medio RPMI de licigenina de sangre entera y se incubó a 37ºC durante 2-3 horas. A intervalos regulares, la quimioluminiscencia se controló transfiriendo cada muestra en un contador de escintilación de líquidos (Packard Modelo 1900 TR) que funcionaba en un modo de fotón único para determinar la "cpm". Los experimentos de control demostraron que la señal específica de "cpm" se inhibió completamente por la adición de 100 \mug/ml de superóxido dismutasa (Sigma Chemical Co.) a las muestras.

Una característica importante del receptor Fc\gamma (RII) es que se activa uniendo los complejos inmunes poliméricos; IgG monomérica es ineficaz. Por lo tanto, las células sanguíneas deben estar expuestas simultáneamente a la properdina y al anticuerpo monoclonal anti-properdina para permitir la formación del complejo inmune y la activación celular consecuente mediante receptores Fc\gamma. Los resultados del ensayo de quimioluminiscencia demuestran que los niveles de superóxido en las muestras de sangre diluida no son significativamente elevados sobre los niveles de control por la adición de 5 \mug/ml de properdina sola o anticuerpo monoclonal solo 100 nM. Sin embargo, la adición simultánea de tanto 5 \mug/ml de properdina como del anticuerpo monoclonal 100 nM a las muestras de sangre diluidas da lugar a un aumento notable de la generación de superóxido sobre los niveles de control, lo que indica que la activación celular se produce mediante receptores Fc\gamma. C5a también activa la respuesta de estallido oxidativo de neutrófilos mediante los receptores C5a, y las muestras que contienen C5a 10 nM fueron controles positivos en este ensayo. El anticuerpo monoclonal anti-properdina humana tiene una especificidad de unión para la proteína humana y no une la properdina de rata. Coherente con esta especificidad, la incubación de las muestras de la sangre con 5 \mug/ml de properdina de rata y anticuerpo monoclonal anti-humano 100 nM no suscitó un aumento de la generación de superóxido sobre los niveles de control. Los resultados de estudio indican que la activación de neutrófilos está mediada por la unión de los complejos inmunes de anticuerpo monoclonal contra properdina a receptores Fc\gamma en células, dando lugar a una liberación mayor de elastasa tras la adición del anticuerpo monoclonal al modelo de bucle de tubo.

Hay varias estrategias potenciales que pueden usarse para diseñar los agentes de acuerdo con la presente invención que evitan interacciones del receptor Fc\gamma. Para los agentes de anticuerpo monoclonal, un enfoque es seleccionar el isotipo de IgG \gamma4 humano durante la construcción de un anticuerpo humanizado. El isotipo de IgG \gamma4 no une receptores Fc\gamma. Como alternativa, puede diseñarse por ingeniería genética un agente de anticuerpo monoclonal que carece de la región Fc, incluyendo por ejemplo, anticuerpos monocatenarios y dominios de unión a antígeno. Otro enfoque es retirar químicamente la región Fc de un anticuerpo monoclonal usando la digestión parcial de las enzimas proteolíticas, generando así, por ejemplo, fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno tales como fragmentos Fab o F(ab)_{2}. Tales fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno y derivados son igualmente útiles como inhibidores potentes de la activación de la vía alternativa del complemento.

En este estudio, la proteolisis se utilizó para retirar la región Fc del anticuerpo monoclonal de bloqueo anti-properdina descrito en los Ejemplos anteriores, que es una IgG1 murina. Específicamente, se utilizó un procedimiento para generar F(ab)_{2} a partir de IgG1 murina usando la digestión con ficina (Mariani, M. M. Camagna, L. Tarditi y E. Seccamani, 1991, Mol. Immunol. 28:69-71). La escisión mediada por ficina progresiva de este anticuerpo IgG1 produjo una especie a 116 kD correspondiente a F(ab)_{2} y otra especie a 32 kD correspondiente a la región Fc escindida. Se identificaron las condiciones de digestión de ficina se identificaron que dieron lugar a la generación de F(ab)_{2} a un rendimiento alto y a una ausencia total de cualquier banda de IgG intacta detectable sobre geles SDS-PAGE teñidos con Coomassie.

La potencia de este fragmento F(ab)_{2} como inhibidor de la activación del complemento se comparó con la del anticuerpo monoclonal intacto anti-properdina, usando el ensayo de hemolisis RBC de conejo como se describe en el Ejemplo 4. Los resultados demostraron que la preparación del anticuerpo monoclonal digerido con ficina que contiene el fragmento F(ab)_{2} tiene esencialmente la actividad inhibidora idéntica que el anticuerpo monoclonal intacto cuando ambos se ensayan a 3,3 nM (inhibición parcial) o a 6,7 nM (inhibición completa). Además, estos agentes anti-properdina tienen potencia esencialmente equivalente como inhibidores de C3 y generación de sMAC en el modelo de bucle de tubo de la derivación cardiopulmonar descrito en el Ejemplo 5.

Como se muestra en la Fig. 8, cuando la actividad F(ab)_{2} y el anticuerpo intacto se compararon en el ensayo de generación de superóxido usando sangre diluida, la adición de tanto el anticuerpo monoclonal intacto (100 nM) como de properdina (5 \mug/ml) a las muestras de sangre diluida dio lugar a un aumento notable de la generación de superóxido sobre los niveles de control. En comparación, la generación de superóxido en las muestras de sangre diluida después de la adición de tanto F(ab)_{2} (100 nM) como properdina (5 \mug/ml) se redujo sustancialmente y fue similar a la generación de superóxido después de la adición de F(ab)_{2} solo (Fig. 8). En puntos temporales posteriores (> 130 minutos), la generación de superóxido en las muestras que contenían F(ab)_{2} fue ligeramente más alta que en las muestras de control (Fig. 8). Sin embargo, como la preparación de F(ab)_{2} no se purificó para retirar el Fc contaminante o pequeñas cantidades del anticuerpo monoclonal intacto, las cantidades pequeñas de tales contaminantes podrían generar una respuesta residual pequeña. Si se desea, los elementos contaminantes de Fc pueden retirarse por procedimientos de purificación convencionales. Los resultados de este estudio demuestran que la generación de un fragmento de unión a antígeno tal como F(ab)_{2} puede eliminar esencialmente al activación de las células sanguíneas mediante la unión de receptores FC\gamma.

Interesa que este tipo de activación usando un anticuerpo monoclonal anti-properdina no se haya observado con otros anticuerpos monoclonales anti-complemento. Por ejemplo, se ha demostrado que un anticuerpo monoclonal contra C5 bloquea las vías alternativa y clásica de complemento donde convergen en C5 (vía del complemento terminal) bloqueando la escisión de C5, previniendo de esta forma la producción de MAC y C5a (documento WO95/25540 [PCT/US95/03614]; Rinder, y col., supra (1995)).

De acuerdo con la presente invención, pueden seleccionarse y prepararse agentes terapéuticos preferidos que carecen de tal activación del receptor Fc\gamma y son particularmente eficaces en procedimientos para la inhibición selectiva de la formación de productos de activación de la vía alternativa del complemento. Además, los agentes de acuerdo con la presente invención son preferiblemente agentes que son selectivos para su inhibición de la formación de los productos de activación de la vía alternativa (es decir, no inhiben los componentes de la vía clásica) y que no activan la vía clásica del complemento. Los complejos inmunes, además de activar las células mediante la unión a receptores Fc\gamma, pueden activar la vía clásica de la activación del complemento mediante la unión al componente del complemento C1. Para demostrar que el anticuerpo monoclonal de bloqueo anti-properdina descrito anteriormente no activó la vía clásica de la activación del complemento, se incubaron muestras por duplicado de suero humano normal (NHS) a 37ºC durante 120 minutos con o sin anticuerpo monoclonal anti-properdina 200 nM (30 \mug/ml). A los 0, 30, 60 y 120 minutos, se retiraron 50 \mul de alícuotas de la mezcla y se sometieron a quelación por la adición de EDTA a una concentración final de 13 mM para detener toda la activación del complemento dependiente de magnesio y calcio. La concentración del producto de activación del complemento C3a se determinó en todas las muestras usando un kit ELISA siguiendo las instrucciones del fabricante (Quidel, Catálogo Nº A015). Ninguna de las muestras que contenían el anticuerpo monoclonal anti-properdina elevaron los niveles de C3a en comparación con las muestras de control correspondientes. Estos resultados demuestran que el anticuerpo monoclonal de bloqueo anti-properdina no activa la activación de la vía plástica. Además, estos resultados sugieren que los determinantes estructurales en los complejos inmunes reconocidos por C1 son diferentes a los reconocidos por los receptores Fc\gamma. Los agentes preferidos de acuerdo con la invención son por lo tanto agentes que no activan sustancialmente receptores Fc\gamma o la vía clásica del complemento como se muestra en este documento.

Ejemplo 7 Activación por la Vía Clásica: Complejo Heparina-Protamina

Se ha demostrado que la adición de protamina a sangre heparinizada activa la vía clásica del complemento (Cavarocchi, N.C., H.V. Schaff, T.A. Orszulak, H.A. Homburger, W.A. Schnell y J. R. Pluth, 1995, Surgery 98:525-531). De esta forma, la activación del complemento se produce no sólo durante la circulación sanguínea a través de un tubo para un circuito de derivación como el utilizado en el Ejemplo 5 anterior, sino también después de la adición de protamina (para neutralizar la heparina anticoagulante) al final del procedimiento de CPB. Para evaluar el efecto de la protamina en la generación de MAC soluble, se incubó sangre heparinizada en tubos a 37ºC durante 60 minutos con 100 \mug/ml de protamina en ausencia o presencia de un anticuerpo monoclonal de bloqueo anti-properdina como se describe en los Ejemplos 1-5 anteriores. Las muestras se procesaron y analizaron con respecto a la generación de sMAC usando un kit ELISA siguiendo las instrucciones del fabricante (Quidel, Catálogo Nº A009).

Como se muestra en la Fig. 9, el anticuerpo monoclonal anti-properdina inhibe la activación del complemento iniciada por complejos heparina-protamina en las condiciones en las que se incubó sangre heparinizada reciente como se ha descrito anteriormente en tubos a 37ºC durante 60 minutos con 100 \mug/ml de protamina en ausencia o presencia de anticuerpo monoclonal anti-properdina 13, 66, 200 ó 330 nM y detectado por la generación de sMAC.

Como la activación del complemento se produce no sólo durante el movimiento de la sangre a través de un circuito de derivación, sino también después de la adición de protamina tras la finalización de CPB, y como esta última activación implica la vía clásica del complemento (Cavarocchi, N.C., H.V. Schaff, T.A. Orszulak, H.A. Homburger, W.A. Schnell y J.R. Pluth, 1985, Surgery 98.525-531), no se esperaba que un agente anti-properdina específico de la vía alternativa atenuase o inhibiese sustancialmente la producción de la activación de los productos de activación del complemento activados por complejos heparina-protamina como se muestra en la Fig. 9.

Aunque se ha sugerido que la vía alternativa debe contribuir en cierta forma a la producción iniciada por la vía clásica de los productos de activación terminales ya que la convertasa C3 de la vía alternativa en teoría podría recopilarse a partir de C3b generado en la cascada clásica, ha habido una escasez general de datos experimentales que aborden esta hipótesis. Un estudio relativamente reciente ha abordado de forma más definitiva la cuestión de la contribución de la vía alternativa a la vía clásica, particularmente ya que esto está relacionado con el papel de la properdina. Específicamente, Fredrikson y col., (1993) J. Immunol. Methods 166:263-270 examinó el efecto de la deficiencia de properdina en la cantidad de MAC generada tras la activación de la vía clásica. Estos resultados revelan que la ausencia de properdina en suero no tuvo ningún efecto en la producción de MAC por la vía clásica. En contraste, la reducción de los componentes de la vía clásica, (es decir, C1q, C2, C4) suprimió completamente la generación de MAC en su sistema de ensayo. Estos resultados indican que la inhibición de la acción de la properdina con un agente anti-properdina no tendría ningún efecto en la producción de la especie del complemento activado tras el inicio de la vía clásica por los complejos protamina-heparina. El trabajo de Soderstrom, C., J.H. Braconier, D. Danielsson, y A.G. Sjoholm, 1987, J. Infect. Dis. 156:107-112 proporciona un respaldo adicional para esta interpretación y estos autores demostraron que las regiones bactericidas en suero mediadas por la vía clásica del complemento no afectaron en el suero deficiente de properdina. Estos resultados muestran específicamente que la inhibición de la acción de properdina debe tener poco efecto, si lo hubiera, en la producción de las proteínas de activación de complemento después del inicio de la vía clásica del complemento. Más generalmente, estos datos implican que la vía alternativa contribuye de forma insignificante a la producción de los productos de activación del complemento inducida por la vía clásica. Esta interpretación más general está respaldada por el trabajo de Clardy, C.W., 1994, Infect. Immun. 62:4549-4555, quien informó de que un anticuerpo contra el componente específico de la vía alternativa, factor B, no tenía ningún efecto en la activación del complemento por la vía clásica.

De acuerdo con lo que se observa durante la CPB clínica y como se ha demostrado anteriormente, la adición de protamina a sangre humana heparinizada provoca la activación significativa del complemento, medida por la producción de sMAC (Fig. 9). De forma notable, la adición del anticuerpo anti-properdina a la sangre heparinizada antes de la adición de la protamina da lugar a una inhibición casi completa de la formación de sMAC (Fig. 9) y demuestra que un agente anti-properdina es eficaz en la reducción de las complicaciones después de perfusión asociadas con CPB ya que puede inhibir las vías tanto clásica como alternativa del complemento.

Ejemplo 8 Activación de la Vía Clásica: Complejos Inmunes

La vía clásica del complemento se activa típicamente por complejos inmunes, por ejemplo, un anticuerpo unido a una partícula extraña, y de esta forma requiere una exposición previa a esa partícula para la generación del anticuerpo específico. Hay cuatro proteínas de plasma implicadas en las etapas iniciales de la vía clásica: C1, C2, C4 y C3. La interacción de C1 con las regiones Fc de IgG o IgM en complejos inmune activa una proteasa C1 que puede escindir la proteína plasmática C4, dando lugar a los fragmentos C4a y C4b. C4b puede unir otra proteína plasmática, C2. La especie resultante, C4b2, se escinde por la proteasa C1 para formar la convertasa C3 de la vía clásica, C4b2a. La adición del producto de escisión de C3, C3b, a la convertasa C3 conduce a la formación de la convertasa C5 de la vía clásica, C4b2a3b. Para evaluar el efecto de los complejos inmunes en la generación de C3a y MAC soluble, se prepararon complejos inmunes incubando IgG de conejo anti-ovalbúmina (28 mg) (Biodesing, Kennebunk, ME) y ovalbúmina (0,67 mg) (Sigma Chemical Company) en 3 ml de PBS durante 3 días a 4ºC para permitir la máxima precipitación. Los experimentos preliminares demostraron que esta relación de reactivos corresponde al punto de equivalencia para la reacción antígeno-anticuerpo. El precipitado se recogió por centrifugación a 15.000 rpm durante 5 minutos a 4ºC y se lavó 3 veces por resuspensión en 5 ml de PBS y recentrifugación. El precipitado final se resuspendió en PBS a 1 mg/ml y se congeló en alícuotas a -70ºC. El análisis SDS-PAGE confirmó que el precipitado contiene esencialmente sólo anticuerpo y antígeno.

Para ensayar el efecto de un anticuerpo monoclonal anti-properdina en las condiciones de activación del complemento donde la vía clásica se inicia por los complejos inmunes, se incubaron 50 \mul de muestras por triplicado que contenían NHS al 90% a 37ºC en presencia de 10 \mug/ml de complejo inmune (IC) o PBS, y muestras paralelas por triplicado (+/- IC) también contenían anticuerpo monoclonal anti-properdina 200 nM durante la incubación a 37ºC. Después dos horas de incubación a 37ºC, se añadió EDTA 13 mM a todas las muestras para detener la activación adicional del complemento y las muestras se enfriaron inmediatamente a 5ºC. Las muestras se almacenaron a -70ºC antes de ser ensayadas para los productos de activación del complemento (C3a y sC5b-9) usando kits ELISA (Quidel, Catálogos Nº A015 y A009) siguiendo las instrucciones del fabricante. En la Fig. 10 se muestran los resultados de un ensayo de sMAC.

Sorprendentemente, la adición de un anticuerpo monoclonal anti-properdina al suero antes de la adición de complejos inmune inhibió sustancialmente (por ejemplo \geq 50%) la formación de tanto de C3a como sMAC (aproximadamente el 80% para sMAC como se muestra en la Fig. 10). De forma similar a los resultados descritos en el Ejemplo 7 anterior con complejos heparina-protamina, fue igualmente inesperado que un agente anti-properdina específico de la vía alternativa atenuase o inhibiese sustancialmente la producción de la especie activada del complemento después del inicio de la vía clásica por los complejos inmunes como se muestra en la Fig. 10.

Ejemplo 9 Derivación cardiopulmonar: Circulación Extracorpórea Ex Vivo

Para confirmar adicionalmente la utilidad de los agentes anti-properdina, incluyendo agentes del anticuerpo anti-properdina, en la reducción de la activación del complemento durante CPB y otros procedimientos extracorpóreos que implican pasar la sangre circulante de un vaso sanguíneo de un sujeto a través de un conductor y regresar a un vaso sanguíneo del sujeto, se realizaron estudios en los que la sangre humana recogida recientemente se pasó a través de un circuito que es idéntico al que se usa típicamente durante procedimientos quirúrgicos que requieren circulación extracorpórea pediátrica. En estos estudios se usó un agente anti-properdina F(ab)_{2} preparado como se describe en el Ejemplo 6.

Los circuitos extracorpóreos pediátricos se recopilaron usando un oxigenador de membrana pediátrico de fibra hueco (oxigenador Lilliput), un tubo de cloruro de polivinilo, conectores de policarbonato y una bomba de rodillo mínimamente oclusiva. El oxigenador y el circuito se prepararon con 400 ml de Plasmalite. Se extrajo sangre (225 ml) de un voluntario sano en un envase de transferencia que contenía 1000 U de heparina que después se añadió al circuito extracorpóreo. Para estudios de inhibición del complemento durante la circulación extracorpórea, se añadió a una preparación F(ab)_{2} de un anticuerpo monoclonal anti-properdina en PBS (\sim25 \mug/ml de sangre) al envase de transferencia inmediatamente antes de la adición de la sangre al circuito extracorpóreo. Cuando la sangre se introdujo en un depósito mediante el orificio de preparación, se retiraron simultáneamente 225 ml de fluido de preparación en posición distal a la salida del oxigenador para producir un volumen de circuito final de 400 ml y un hematocrito final del 20%. La sangre se hizo circular con el fluido de preparación y la mezcla completa se consiguió en un periodo de 2 minutos. Se extrajo una muestra basal y se designó tiempo 0. El circuito se mantuvo a 37ºC durante 30 minutos, después se enfrió a 28ºC durante cinco minutos y se mantuvo a esa temperatura durante 60 minutos, después de lo cual se volvió a calentar a 37ºC durante 60 minutos más. Las muestras de sangre se retiraron en tiempos múltiples durante la recirculación. Se prepararon muestras en suero por centrifugación inmediata y se almacenaron a -70ºC en alícuotas hasta que se ensayó para C3a o sMAC mediante kits ELISA siguiendo las instrucciones del fabricante (Quidel; kit para C3a, Catálogo Nº A015; kit para sMAC, Catálogo Nº A009) o elastasa de neutrófilos usando un ensayo ELISA como se describe por Brower, M.S. y P.C. Harpel, 1983; Blood 61:842-849.

Como se muestra en la Fig. 11, una preparación F(ab)_{2} de un anticuerpo monoclonal de bloqueo anti-properdina inhibe la activación del complemento en un modelo ex vivo de CPB donde la sangre humana reciente se bombeó a través de un circuito de derivación pediátrico en ausencia (círculos cerrados) o presencia (círculos abiertos) de una preparación F(ab)_{2} de un anticuerpo monoclonal anti-properdina. Como se ha descrito anteriormente, las muestras de sangre se recogieron en diversos periodos de tiempo durante el procedimiento de derivación y se analizaron con respecto a sMAC, C3a o complejos elastasa-antitripsina.

Para este estudio, los dos circuitos de derivación que se utilizaron se conectaron a una bomba común no pulsatoria de forma que el flujo sanguíneo fue idéntico en los dos sistemas. Mientras que un circuito contenía sangre no tratada, el otro contenía sangre a la que se le añadió un agente anti-properdina antes del comienzo de la circulación. Además de este estudio, se utilizó una preparación F(ab)_{2} del anticuerpo monoclonal anti-properdina para asegurar que los complejos properdina-anti-properdina no activasen eventos de transducción de señal celular mediante la unión a receptores Fc\gamma. Este fragmento de anticuerpo F(ab)_{2} se preparó por escisión proteolítica con ficina como se describe en el Ejemplo 6. Pueden usarse metodologías proteolíticas convencionales así como metodologías recombinantes convencionales para preparar proteínas basadas en anticuerpo, incluyendo fragmentos, derivados, anticuerpos monocatenarios (SCA) y dominios de unión a antígeno que carecen de la porción Fc de la inmunoglobulina que permite la unión a receptores Fc\gamma (Janeway, C. y P. Travers, Jr., 1994, Immunobiology: the Immune System in Health and Disease: págs. 3:28-3:30, Garland Publishing, Inc., Nueva York). Como alternativa, la unión potencial de los receptores Fc\gamma de anticuerpos terapéuticos puede eliminarse, si se desea o es necesario, utilizando anticuerpos de la subclase \gamma4 de IgG, que no interactúan con estos receptores (Janeway, C. y P. Travers, Jr., supra (1994)).

Como demuestra en la Fig. 11, el comienzo del flujo sanguíneo en este modelo ex vivo de CPB dio lugar a la producción rápida de sMAC y C3a, aumentando los niveles de estos componentes de complemento activado con una función de tiempo de derivación. Asimismo, los niveles en sangre de los complejos elastasa-antitripsina, un marcador de la activación de neutrófilos (Finn. A., S. Naik, N. Klein, R.J. Levinsky, S. Strobel y M. Elliott, 1993, J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 105: 234-241), aumentó con el tiempo de circulación en el circuito de CPB (Fig. 9). Se ha postulado que la activación de neutrófilos durante CPB resulta de la unión de la especie de activación del complemento a esas células (Rinder, C.S., H.M. Rinder, B.R. Smith, J.C.K. Fitch, M.J. Smith, J.B. Tracey, L.A. Matis, S.P. Squinto, y S.A. Rollins, S.A., 1995, J. Clin. Invest. 96:1564-1572; Wan, S., J-L. LeClerc, y J-L. Vicent, 1997, Chest 112:676-692). El circuito paralelo que contiene la sangre a tratada con la preparación F(ab)_{2} de anticuerpo monoclonal anti-properdina mostró esencialmente una no activación del complemento, como se reveló por la ausencia virtual de sMAC y C3a en todos los tiempos de derivación. De forma importante, la anti-properdina F(ab)_{2} también provoco una reducción de la activación de neutrófilos, como se demuestra por la reducción de los niveles del complejo elastasa-antitripsina en sangre (Fig. 11). Estos resultados confirman los resultados obtenidos con el modelo de bucle de tubo descrito en el Ejemplo 5 anterior. Estos resultados demuestran además que un agente anti-properdina que carece de la capacidad de activación del receptor Fc\gamma reduce eficazmente la activación del complemento y los eventos inflamatorios celulares relacionados que resultan de la circulación extracorpórea y de la posterior complejación de protamina de
heparina.

Ejemplo 10 Agentes de Bloqueo: Selección de Péptidos Derivados de Properdina

Se prepararon diversos decapéptidos de la properdina humana como se describe por Fredrikson y col., supra (1996) J. Immunol. 157:3666-3671 y se ensayaron con respecto a su capacidad para bloquear los efectos de la activación de la vía alternativa del complemento como se describe para los anticuerpos-anti-properdina en los Ejemplos anteriores. Específicamente, estos péptidos derivados de properdina se ensayaron con respecto a su capacidad para inhibir la formación de MAC en un ensayo ELISA como se describe en el Ejemplo 3. El péptido 1 constituido por 43-52 aminoácidos de properdina (1158 P.M.), el péptido 2 constituido por 48-57 aminoácidos de properdina (1320 P.M.) y el péptido 3 constituido por 73-82 aminoácidos de properdina (1309 P.M.) redujeron cada uno la formación de MAC en este ensayo, con valores de CI_{50} de 268 \muM, 335 \muM y 242 \muM, respectivamente. En contraste, el péptido 4 constituido por 218-277 aminoácidos de properdina (1173 P.M.) no inhibió de forma similar la formación de MAC en este ensayo (CI_{50} > 600 \muM). Cuando estos cuatro péptidos se ensayaron como se describe en el Ejemplo 2 anterior, los péptidos 1, 2 y 3, pero no el péptido 4, bloquearon la unión a C3bBb, con el valor de CI_{50} para los tres péptidos de bloqueo en el intervalo de aproximadamente 400-600 \muM.

En un estudio previo realizado por Fredrikson y col., supra J. Immunol. 157:3666-3671 para caracterizar una proteína properdina disfuncional de un paciente con deficiencia de properdina de tipo III, se sintetizaron 87 decapéptidos de solapamiento de properdina humana, incluyendo los cuatro péptidos descritos anteriormente. Cuando estos péptidos se ensayaron a concentraciones de 0-200 \mug/ml con respecto a su capacidad para competir con la unión de la properdina a placas recubiertas con C3b, Fredrikson y col., supra (1996) determinó cinco péptidos denominados 9, 10, 15, 44 (correspondiente a los péptidos 1, 2, 3 y 4 en este documento) y 81 para competir con la properdina para la unión a C3. Estos péptidos no se ensayaron en ensayos de activación del complemento, tal como el ensayo de formación de MAC descrito anteriormente.

Ya que ahora se ha demostrado de acuerdo con la presente invención que la properdina es un componente crítico para la activación de la vía alternativa, pueden investigarse, identificarse y seleccionarse agentes anti-properdina, incluyendo péptidos derivados de properdina, con respecto a su capacidad para bloquear la activación de la vía alternativa, como se demuestra en este documento, por ejemplo, bloqueando la formación de MAC. Ya que el ensayo de selección demostró que la inhibición de la formación de MAC estaba esencialmente completa en las concentraciones peptídicas más altas, se volvió a demostrar que se necesita la properdina para la activación de la vía alternativa. Los agentes anti-properdina, incluyendo péptidos derivados de properdina, pueden identificarse de acuerdo con la presente invención como agentes eficaces en un procedimiento para inhibir selectivamente la generación (es decir, formación o producción) de un producto de activación de la vía alternativa del complemento en un sujeto en el que se ha iniciado la vía alternativa o la vía clásica, incluyendo en sujetos con una diversos estados de enfermedad y afecciones, así como complicaciones de diversos procedimientos médicos, e incluyendo sujetos con lesiones patológicas agudas y/o crónicas como se describe y se referencia en este documento.

Ejemplo 11 Agentes de Bloqueo: Selección e Identificación

Los agentes que bloquean selectivamente la formación de los productos de activación del complemento mediante la vía alternativa del complemento, incluyendo anticuerpos anti-properdina humana preferidos, pueden obtenerse y después investigarse, identificarse y seleccionarse como se muestra en este documento con respecto a su capacidad para bloquear sustancial o completamente la formación o producción de productos de activación dependientes de la vía alternativa del complemento, incluyendo en condiciones que implican el inicio de la vía clásica del complemento.

Se seleccionaron con respecto a la actividad de bloqueo siete anticuerpos monoclonales anti-properdina humana disponibles en el mercado: (1) anti-factor P Nº 1 humano de Quidel (A233); (2) anti-factor P Nº 2 humano de Quidel (A235); (3) anti-factor P humano (MO837) de Dako (Santa Barbara, CA; (4) anti-factor P humano (HYB39 Clon 06) de Serum Institute (Copenhague, Dinamarca); (5) anti-factor P humano (HYB039 Clon 04) de Serum Institute; (6) anti-factor P humano (Clon 10-18) de Biogenesis (Poole, UK) [igual que Quidel Nº 2]; y anti-factor P humano (Clon 10-24) de Biogenesis [igual que Quidel Nº 2]. Cada uno de estos siete anticuerpos pudieron unirse a la properdina con alta afinidad (K_{D} \approx 0,1 - 1 nM). Sin embargo, sólo el anticuerpo monoclonal contra P Nº 1 de Quidel (y el anticuerpo monoclonal idéntico (Clon 10-18) de Biogenesis) bloqueó completamente la activación del complemento por la vía alternativa, como se detecta por la inhibición completa de la formación de MAC. Se descubrió que HYB039 clon 04 de Serum Institute bloquea sólo parcialmente y que el aumento de la concentración de este anticuerpo monoclonal no consiguió un bloqueo completo. Este anticuerpo monoclonal de bloqueo parcial y el anticuerpo monoclonal completamente de bloqueo Nº 1 de Quidel tienen afinidades de unión comparables para la properdina (K_{D} \approx 0,1 - 0,2 nM). De acuerdo con la presente invención, por lo tanto, los agentes se seleccionan eficazmente con respecto a la actividad esencialmente completa, parcial o de no bloqueo en uno o más ensayos como se describe en este documento, incluyendo el bloqueo de la unión de la unión a C3b (Ejemplo 1), el bloqueo de la unión a C3bBb (Ejemplo 2), el bloqueo de la formación de MAC dependiente de la vía alternativa (Ejemplos 3 y 5-7), el bloqueo de la hemolisis dependiente de la vía alternativa (Ejemplo 4), el bloqueo de la formación de C3a dependiente de la vía alternativa (Ejemplo 5-7), o el bloqueo de uno o más marcadores de la activación celular dependiente de la vía alternativa (Ejemplo 7), incluyendo marcadores de la activación de leucocitos (por ejemplo, elastasa-antitripsina, CD11b/CD18), activación de plaquetas (por ejemplo, selección de P, GPIIIa, GPIb (CD45b), GPIIb) y adhesión de plaquetas-leucocitos. Los agentes pueden seleccionarse adicionalmente con respecto a la falta de activación de los receptores Fc\gamma y/o la activación de la vía clásica (Ejemplo 6).

Claims (39)

1. Un agente seleccionado entre un anticuerpo anti-properdina, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-properdina, o un péptido derivado de properdina, en el que dicho agente no activa sustancialmente un receptor Fc\gamma, para uso en la inhibición terapéutica de la activación alternativa del complemento.

2. Un agente de acuerdo con la reivindicación 1 para uso en el tratamiento de estados de enfermedad o afecciones agudas o crónicas, lesiones patológicas agudas o crónicas, o complicaciones de procedimientos médicos en un sujeto.

3. Un agente de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2 que inhibe la estabilización de la convertasa C3 inducida por properdina.

4. Un agente de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el agente inhibe la unión de properdina a C3b.

5. Un agente de acuerdo con la reivindicación 4, en el que C3b está en forma de C3bBb.

6. Un agente de acuerdo con la reivindicación 4, el que C3b se encuentra en el plasma o fluido intersticial de un sujeto.

7. Un agente de acuerdo con la reivindicación 6, para administración en el plasma o en el fluido intersticial del sujeto.

8. Un agente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para inhibir la formación de un producto de activación de la vía alternativa del complemento.

9. Un agente de acuerdo con la reivindicación 8, para uso en la inhibición de los efectos adversos de la activación de la vía alternativa del complemento en un sujeto.

10. Un agente de acuerdo con la reivindicación 8, para uso en la inhibición de los efectos adversos de la activación de la vía clásica del complemento en un sujeto en el que se inicia la vía clásica del complemento.

11. Un agente de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el agente inhibe la convertasa C3 de la vía alternativa.

12. Un agente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que el producto de activación de la vía alternativa del complemento es MAC, C3a o C5a.

13. Un agente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

14. Un agente de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 seleccionado entre un anticuerpo monoclonal que carece de la región Fc, un anticuerpo monoclonal monocatenario, un fragmento de un anticuerpo monoclonal Fab o F(ab)_{2} o el isotipo de IgG \gamma4 humano de un anticuerpo monoclonal.

15. Un agente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14, en el que el sujeto es un sujeto humano.

16. Un agente de acuerdo con la reivindicación 15, en el que se ha activado el complemento del sujeto humano.

17. Un agente de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la activación del complemento es mediante una lesión patológica aguda, incluyendo infarto de miocardio, síndrome de insuficiencia respiratoria aguda, lesión por quemadura, apoplejía, pancreatitis, derivación cardiopulmonar, o isquemia/lesión por reperfusión.

18. Un agente de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la activación del complemento contribuye a una afección crónica, incluyendo esclerosis múltiple, artritis reumatoide, miastenia grave o enfermedad de Alzheimer.

19. Una composición farmacéutica que comprende un agente seleccionado entre un anticuerpo anti-properdina, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-properdina, o un péptido derivado de properdina, donde el agente no activa sustancialmente un receptor Fc\gamma, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

20. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 19 que comprende un agente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3-6 u 11-14 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

21. Uso de un agente seleccionado entre un anticuerpo anti-properdina, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-properdina, o un péptido derivado de properdina, donde el agente no activa sustancialmente un receptor Fc\gamma, o una composición farmacéutica de la reivindicación 19 ó 20, para la fabricación de un medicamento para uso en la inhibición de los efectos adversos de la activación de la vía alternativa del complemento en un sujeto inhibiendo selectivamente la formación de un producto de activación de la vía alternativa del complemento, o

para uso en la inhibición de los efectos adversos de la activación de la vía clásica del complemento en un sujeto en el que se inicia la vía clásica del complemento, inhibiendo selectivamente la formación de un producto de activación de la vía alternativa del complemento, o

para uso en la inhibición de la activación alternativa del complemento en un procedimiento para tratar un trastorno inflamatorio agudo, una lesión patológica aguda, incluyendo infarto de miocardio, síndrome de insuficiencia respiratoria aguda, lesión por quemadura, apoplejía, pancreatitis, derivación cardiopulmonar o isquemia/lesión por reperfusión, o una afección crónica, incluyendo esclerosis múltiple, artritis reumatoide, miastenia grave o enfermedad de Alzheimer en un sujeto humano.

22. Uso de acuerdo con la reivindicación 21, en el que el agente inhibe la convertasa C3 de la vía alternativa.

23. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 21 ó 22, en el que el producto de activación de la vía alternativa del complemento es MAC, C3a o C5a.

24. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

25. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, en el que el agente se selecciona entre un anticuerpo monoclonal que carece de la región Fc, un anticuerpo monoclonal monocatenario, un fragmento de un anticuerpo monoclonal Fab o F(ab)_{2}, o un isotipo de IgG \gamma4 humano de un anticuerpo monoclonal.

26. Uso de un agente seleccionado entre un anticuerpo anti-properdina, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-properdina, o un péptido derivado de properdina, en el que el agente no activa sustancialmente un receptor Fc\gamma, para la fabricación de un medicamento para uso en un procedimiento para realizar un procedimiento médico en un sujeto, comprendiendo el procedimiento:

(a) pasar la sangre circulante de un vaso sanguíneo del sujeto, a través de un circuito, y regresar a un vaso sanguíneo del sujeto, teniendo el conducto una superficie luminal que comprende un material que puede provocar al menos uno de activación del complemento, activación de plaquetas, activación de leucocitos o adhesión de plaquetas-leucocitos en la sangre del sujeto; y

(b) introducir un medicamento en el torrente circulatorio del sujeto en una cantidad eficaz para reducir al menos uno de activación del complemento, activación de plaquetas, activación de leucocitos o adhesión de plaquetas-leucocito resultante del paso de la sangre circulante a través del conducto, donde la etapa (a) se produce antes y/o durante y/o después de la etapa (b).

27. Uso de acuerdo con la reivindicación 26, en el que el agente reduce la conversión dependiente de la vía alternativa del componente del complemento C3 en los componentes del complemento C3a y C3b, la formación dependiente de la vía alternativa de C5b-C9, o la activación leucocitos dependiente de la vía alternativa.

28. Uso de acuerdo con la reivindicación 26, en el que el agente se une específicamente a la properdina e inhibe la convertasa C3 de la vía alternativa.

29. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, en el que el procedimiento médico es un procedimiento de circulación extracorpórea.

30. Uso de acuerdo con la reivindicación 29, en el que el procedimiento de circulación extracorpórea es un procedimiento de derivación cardiopulmonar.

31. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

32. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 31, en el que el agente se selecciona entre un anticuerpo monoclonal que carece de la región Fc, un anticuerpo monoclonal monocatenario, un fragmento de un anticuerpo monoclonal Fab o F(ab)_{2}, o el isotipo de IgG \gamma4 humano de un anticuerpo monoclonal.

33. Un artículo de fabricación que comprende material de envasado y un agente farmacéutico contenido dentro del material de envasado, en el que:

(a) el agente farmacéutico comprende un agente seleccionado entre un anticuerpo anti-properdina, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-properdina, o un péptido derivado de properdina, en el que el agente no activa sustancialmente un receptor Fc\gamma, para uso en reducir terapéuticamente al menos uno de activación del complemento, activación de plaquetas, activación de leucocitos o adhesión de plaquetas-leucocitos causada por el paso de la sangre circulante de un vaso sanguíneo del sujeto, a través de un conducto, y el regreso a un vaso sanguíneo del sujeto, teniendo el conducto una superficie luminal que comprende un material que puede provocar al menos uno de activación del complemento, activación de plaquetas, activación de leucocitos o adhesión de plaquetas-leucocitos en la sangre del sujeto; y

(b) el material de envasado comprende una etiqueta que indica que el agente farmacéutico es para uso junto con un procedimiento de circulación extracorpórea.

34. El artículo de fabricación de la reivindicación 33, en el que la etiqueta indica que el agente farmacéutico es para uso junto con un procedimiento de derivación cardiopulmonar.

35. Un procedimiento para investigar y seleccionar un anticuerpo anti-properdina, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-properdina, o un péptido derivado de properdina, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(a) ensayar el agente con respecto a su capacidad para la inhibir la formación de un producto de activación de la vía alternativa del complemento;

(b) seleccionar al agente que inhibe la formación de un producto de activación de la vía alternativa del complemento.

36. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 35, que comprende las etapas de:

(a) ensayar el agente con respecto a su capacidad para inhibir la formación de un producto de activación de la vía alternativa del complemento;

(b) ensayar el agente con respecto a su capacidad para activar receptores Fc\gamma; y

(c) seleccionar el agente que inhibe la formación de un producto de activación de la vía alternativa del complemento y que no activa sustancialmente receptores Fc\gamma.

37. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 35 ó 36, en el que el producto de activación de la vía alternativa del complemento es MAC, C3a o C5a.

38. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

39. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 38, en el que el agente se selecciona entre un anticuerpo monoclonal que carece de la región Fc, un anticuerpo monoclonal monocatenario, o un fragmento de un anticuerpo monoclonal Fab o F(ab)_{2}, o el isotipo IgG \gamma4 humano de un anticuerpo monoclonal.