PT1007092E

PT1007092E - Um processo para inibir a activação do complemento pela via alternativa

Info

Publication number: PT1007092E
Application number: PT98944501T
Authority: PT
Inventors: Rekha Gupta-Bansal; Kurt R Brunden; James B Parent
Original assignee: Amgen Fremont Inc
Priority date: 1997-08-26
Filing date: 1998-08-24
Publication date: 2006-12-29
Also published as: US20030198636A1; DE69835524T2; ES2270530T3; NZ503033A; NO20000935D0; NO20000935L; EP1007092A1; CA2302317A1; US20020015701A1; JP2001513576A; ATE335511T1; EP1007092B1; AU9203398A; DK1007092T3; WO1999010009A1; AU756490B2; DE69835524D1; US6333034B1

Description

DESCRIÇÃO

"UM PROCESSO PARA INIBIR A ACTIVAÇÃO DO COMPLEMENTO PELA VIA ALTERNATIVA”

CAMPO DO INVENTO O campo deste invento é a activação do complemento, Mais particularmente, o presente invento diz respeito a um processo para inibir a activação do complemento pela via alternativa, incluindo para inibir a formação (isto é, geração ou produção) de produtos de activação do complemento pela via alternativa.

ANTECEDENTES DO INVENTO 0 sistema do complemento fornece um mecanismo de actuação precoce para iniciar e amplificar a resposta inflamatória a infecções microbianas e outras provocações agudas. (Liszewski, M.K. e J.P. Atkinson, 1993, Em "Fundamental Immunology", Terceira Edição. Editado por W.E. Paul. Raven Press, Ltd. Nova Iorque.) Se bem que a activação do complemento proporcione uma defesa de primeira linha valiosa contra patogenes potenciais, as actividades do complemento que promovem uma resposta inflamatória protectora também podem representar uma ameaça potencial para o hospedeiro. (Kalli, K.R., P. Hsu e D.T. Fearon, 1994, Springer Semin. Immunopathol. 15: 417-431; Morgan, Β.Ρ., Eur„ J. Clinicai Investig- 24: 219-228.) Por exemplo, os produtos C3 e C5 proteoliticos recrutam e activam neutrófilos. Estas células activadas são indiscriminadas quanto á sua libertação de enzimas destrutivas e podem causar danos em órgãos. Adicionalmente, a activação do complemento pode causar a deposição de componentes liticos do complemento em células-hospedeiro vizinhas bem como em alvos microbianos, resultando em lise das células-hospedeiro. 0 reconhecimento crescente da importância de lesões em tecidos mediadas pelo complemento numa variedade de estados de doença sublinha a necessidade de fármacos inibidores do complemento eficazes. Presentemente não existem fármacos aprovados que inibam danos ocasionados pelo complemento. 0 complemento pode ser activado por qualquer uma de duas cascatas enzimáticas distintas, referidas como vias clássica e alternativa. (Liszewski, M.K. e J.P. Atkinson, 1993, Em "Fundamental Immunology", Terceira Edição. Editado por W.E. Paul. Raven Press, Ltd. Nova Iorque.) A via clássica é habitualmente desencadeada por anticorpos ligados a uma partícula estranha e, assim, requer exposição prévia a essa partícula para a geração de anticorpos específicos. Há quatro proteínas do plasma especificamente envolvidas na via clássica: Cl, C2, C4 e C3. A interacção de Cl com as regiões Fc de IgG ou IgM em complexos imunológicos activa uma Cl protease que pode clivar a proteína do plasma C4, resultando nos fragmentos C4a e C4b. A C4b pode ligar-se a outra proteína do plasma, C2. A espécie resultante, C4b2, é clivada pela Cl protease, formando a C3 convertase da via clássica, C4b2a. A adição 3 do produto de clivagem de C3, C3b, à C3 convertase conduz à formação da C5 convertase da via clássica, C4b2a3b.

Em contraste com a via clássica, a via alternativa é espontaneamente desencadeada por superfícies estranhas ou outras superfícies anormais (bactérias, leveduras, células viralmente infectadas ou tecido danificado) e, em consequência, é capaz de uma resposta imediata a um organismo invasor (Liszewski, M.K. e J.P. Atkinson, 1993, Em "Fundamental Immunology", Terceira Edição. Editado por W.E. Paul. Raven Press, Ltd. Nova Iorque). Há quatro proteínas do plasma directamente envolvidas na via alternativa: C.3, factores B e D e properdina (também denominada factor P). A ínteracção inicial que desencadeia a via alternativa não está completamente compreendida. No entanto, pensa-se que a C3 espontaneamente activada [por vezes denominada C3(H20)] se liga ao factor B, que é então clivado pelo factor D, formando um complexo [C3(H20)Bb] com actividade de C3 convertase. A convertase resultante modifica proteoliticamente a C3 produzindo o fragmento C3b, que pode ligar-se covalentemente ao alvo e depois interagir com os factores B e D e formar a C3 convertase da via alternativa, C3bBb. A C3 convertase da via alternativa é estabilizada pela ligação de properdina. A properdina prolonga o seu tempo de semi-vida de seis para dez vezes (Liszewski, M.K. e J.P. Atkinson, 1993, Em "Fundamental Immunology", Terceira Edição. Editado por W.E. Paul. Raven Press, Ltd. Nova Iorque). No entanto, a ligação da properdina não é necessária para formar uma C3 convertase da via alternativa em funcionamento (Schreiber, R.D., M.K. Pangburn, P.H. Lesavre e H.J. Muller-Eberhard, 1978, Proc. 4

Natl. Acad. Sei.. USA 75: 3948-3952; Sissons, J.G., Μ. B. Oldstone e R.D. Schreiber, 1980, Proa. Natl. Acad. Sei. USA 17: 559-562). Uma vez que o substrato para a C3 convertase da via alternativa é C3, a C3 é consequentemente um componente e um produto da reacçâo. Uma vez que a C3 convertase gera quantidades crescentes de C3b, estabelece-se um circuito de retorno com amplificação (Liszewski, M.K. e J.P. Atkinson, 1993, Em "Fundamental Immunology", Terceira Edição. Editado por W.E. Paul. Raven Press, Ltd. Nova Iorque) . Visto que a via clássica também pode gerar C3b, essa C3b pode ligar-se ao factor B e, desse modo, activar a via alternativa. Isto permite que mais C.3b se deposite num alvo. Por exemplo, como descrito acima, a ligação de anticorpos a antigenes inicia a via clássica. Se anticorpos aderirem a bactérias, a via clássica gera C3b, que se acopla a patogenes-alvo. No entanto, foi sugerido que desde 10% até 90% da C3b subsequente depositada pode provir da via alternativa (Liszewski, M.K. e J.P. Atkinson, 1993, Em "Fundamental Immunology", Terceira Edição. Editado por W.E. Paul. Raven Press, Ltd. Nova Iorque) , A contribuição real da via alternativa para a formação de C3b adicional subsequente à iniciação da via clássica não foi quantificada claramente e, assim, permanece desconhecida. A adição de C3b à C.3 convertase conduz à formação da C5 convertase da via alternativa, C3bBbC3b.

Ambas as vias clássica e alternativa convergem em C5, que é clivada formando produtos com múltiplos efeitos pró-inflamatórios. A via com convergência foi referida como via terminal do complemento. A C5a é a anafilatoxina mais potente, induzindo alterações no músculo liso e tónus 5 vascular, bem como na permeabilidade vascular. Também é uma poderosa quimiotaxina e activador de neutrófilos e monócitos* A activação celular mediada pela C5a pode amplificar significativamente respostas inflamatórias ao induzir a libertação de múltiplos mediadores inflamatórios adicionais, incluindo citoquinas, enzimas hidroliticas, metabolitos do ácido araquidónico e espécies reactivas de oxigénio. A clivagem de C5 conduz à formação de C5b~9, também conhecida como complexo de ataque à membrana (MAC). Há agora fortes evidências de que o MAC pode desempenhar um papel importante em inflamação, para além do seu papel como complexo lítico formador de poros (Liszewski, M.K. e J.P. Atkinson, 1993, Em "Fundamental Immunology", Terceira Edição. Editado por W.E. Paul. Raven Press, Ltd. Nova Iorque). A activação do complemento foi implicada na contribuição para uma variedade de estados e condições de doença, bem como complicações de uma variedade de procedimentos médicos (ver referências citadas infra), tais como: enfarte do miocárdio; isquemia/lesão de reperfusão; acidente vascular cerebral; síndroma da dificuldade respiratória aguda (ARDS); sepsia; lesão por queimadura,-complicações resultantes de circulação extra-corporal (ECC), incluindo mais habitualmente de derivação cardiopulmonar (CPB), mas também de hemodiálise ou plasmaférese ou plaquetaférese ou leucoférese ou oxigenação membranar extra-corporal (ECMO) ou precipitação de LDL extra-corporal induzida por heparina (HELP); utilização de meios de contraste radiográfico; rejeição de transplantes; artrite reumatóide; esclerose múltipla; miastenia gravis; 6 pancreatite, e doença de Alzheimer. Ainda não há nenhum fármaco inibidor do complemento eficaz disponível para utilização clínica de rotina, apesar da importante necessidade médica desses agentes.

Gonzalez-Rubio et al., 1994, J. Biol. Chem., 269: 26017-24, revelam o efeito inibidor do Factor J na via alternativa do complemento. Huemer et al., 1993, Immunology, _79: 639-47, revelam a imitação molecular de proteínas reguladoras do complemento pela glicoproteína C do vírus herpes simplex. Fearon, 1980, J. Exp. Med., 152: 20-30, revelam a identificação da glicoproteína membranar que é o receptor de C3b de eritrócitos, leucócitos polimorfonucleares, linfócitos B e monócitos humanos. A capacidade para inibir especificamente apenas a via causadora de uma patologia particular sem desligar completamente as capacidades de defesa imunológica do complemento seria altamente desejável. Com base nos dados clínicos disponíveis parece que, na maior parte dos cenários de lesão aguda, a activação do complemento é mediada predominantemente pela via alternativa (Moore, F.D., 1994, Ãdvan. Immunol. 56: 267-299; Bjornson, A.B., S. Bjornson e W.A. Altemeier, 1981, Ann. Suig. 194: 224-231; Gelfand, J.A., M. Donelan e J.F. Burke, 1983, Ann. Surg. 198: 58-62). Estas descobertas sugerem que seria vantajoso inibir especificamente danos em tecidos mediados pela via alternativa numa variedade de cenários de lesão aguda, por exemplo, em enfarte do miocárdio, ARDS, lesão de reperfusão, acidente vascular cerebral, queimaduras térmicas e inflamação pós-derivação cardiopulmonar. Isto 7 deixaria a via clássica intacta para gerir o processamento de complexos imunológicos e para auxiliar as defesas do hospedeiro contra infecções. Como componentes essenciais da via alternativa, os factores B e D são alvos atractivos para a inibição específica da via alternativa. Todavia e devido ao seu papel não essencial, não será de esperar que a properdina seja um alvo adequado para essa intervenção.

RESUMO DO INVENTO A presente candidatura refere-se a um processo para inibir a activação do complemento pela via alternativa. 0 processo inclui o passo de inibir a estabilização induzida por properdina da C3 convertase. A estabilização induzida por properdina da C3 convertase é inibida por inibição da ligação da properdina a C3b ou C3bBb. A ligação da properdina a C3b é inibida por exposição da properdina a uma quantidade eficaz de um anticorpo contra a properdina.

Um processo do presente invento é particularmente útil na inibição da activação do complemento pela via alternativa in vivo em sujeitos, incluindo humanos, que sofrem de uma lesão patológica aguda ou crónica, tal como, mas não se limitando a enfarte do miocárdio, síndroma da dificuldade respiratória aguda, lesão por queimadura, acidente vascular cerebral, esclerose múltipla, artrite reumatóide, doença de Alzheimer ou isquemia/lesão de reperfusão. Obtém-se inibição in vivo da activação do complemento administrando ao sujeito o anticorpo anti-properdina. Também são fornecidas composições farmacêuticas contendo anticorpos anti-properdina. 8 A presente candidatura revela, num aspecto, um processo para inibir os efeitos adversos da activação da via alternativa do complemento num sujeito por administração ao sujeito de uma quantidade de um agente anti-properdina eficaz para inibir selectivamente a formação (isto é, geração ou produção) de um produto de activação do complemento pela via alternativa do complemento. A formação desses produtos de activação dependentes da via alternativa refere-se à geração ou produção desses produtos por activação do complemento, cujos produtos, quando gerados ou produzidos, podem ser detectados e incluem produtos C.3a, C5a e/ou C5b-9 (MAC) dependentes da via alternativa. Um agente anti-properdina de acordo com o invento bloqueia a properdina como descrito aqui e inibe selectivamente a formação de produtos de activação da via alternativa do complemento. Esses agentes incluem um anticorpo anti-properdina, um fragmento de ligação a antigenes de um anticorpo anti-properdina e um péptido derivado da properdina. Preferivelmente, o agente anti-properdina não activa substancialmente receptores Fcy e/ou a via clássica do complemento. A presente candidatura revela, noutro aspecto, um processo para inibir os efeitos adversos da activação da via clássica do complemento num sujeito em que a via clássica do complemento está iniciada, por administração ao sujeito de uma quantidade de um agente anti-properdina eficaz para inibir selectivamente a formação de um produto de activação da via alternativa do complemento (por exemplo, C3a, C5a, MAC dependentes da via alternativa). 9 A presente candidatura revela, noutro aspecto, um processo para inibir os efeitos adversos da activação da via clássica do complemento num sujeito em que a via clássica do complemento está iniciada, por administração ao sujeito de uma quantidade de um agente que inibe a C3 convertase da via alternativa eficaz para inibir selectivamente a formação de um produto de activação do complemento pela via alternativa do complemento (por exemplo, C3a, C5a, MAC dependentes da via alternativa). A presente candidatura, noutro aspecto, revela um processo para realizar um procedimento médico num sujeito, compreendendo: (a) fazer passar sangue em circulação de um vaso sanguíneo do sujeito através de uma conduta e novamente para um vaso sanguíneo do sujeito, em que a conduta tem uma superfície luminal compreendendo um material capaz de causar pelo menos um entre activação do complemento, activação de plaquetas, activação de leucócitos ou adesão plaquetas-leucócitos no sangue do sujeito, e (b) introduzir um agente anti-properdina na corrente sanguínea do sujeito numa quantidade eficaz para reduzir pelo menos um entre activação do complemento, activação de plaquetas, activação de leucócitos ou adesão plaquetas-leucócitos resultantes da passagem do sangue em circulação através da conduta, em que o passo (a) ocorre antes e/ou durante e/ou após o passo (b). Preferivelmente, o agente anti-properdina reduz a conversão dependente da via alternativa do componente do complemento C3 em componentes do complemento C3a e C3b, e/ou a formação dependente da via alternativa de C5b-C9, e/ou a activação 10 de leucócitos dependente da via alternativa. Procedimentos médicos incluindo procedimentos terapêuticos revelados aqui incluem procedimentos de circulação extra-corporal, incluindo, por exemplo, procedimentos de derivação cardiopulmonar (CPB). O presente invento revela, noutro aspecto, um artigo de produção compreendendo material de embalagem e um agente farmacêutico (isto é, composição farmacêutica) contido no material de embalagem, em que: (a) o agente farmacêutico compreende um agente anti-properdina, em que o agente anti-properdina é eficaz para reduzir pelo menos um entre activação do complemento, activação de plaquetas, activação de leucócitos ou adesão de plaquetas causadas por passagem de sangue em circulação de um vaso sanguíneo de um sujeito através de uma conduta e novamente para um vaso sanguíneo do sujeito, em que a conduta tem uma superfície luminal compreendendo um material capaz de causar pelo menos uma activação de entre activação do complemento, activação de plaquetas, activação de leucócitos ou adesão plaquetas-leucócitos no sangue do sujeito, e (b) o material de embalagem compreende uma etiqueta que indica que o agente farmacêutico se destina a ser utilizado em associação com um procedimento de circulação extra-corporal. Artigos de produção revelados aqui incluem etiquetas que indicam que os agentes anti-properdina se destinam a serem utilizados em associação com um procedimento de derivação cardiopulmonar. O invento também se refere à utilização de um agente anti-properdina na preparação de ura medicamento para inibir selectivamente a formação de produtos de activação do complemento pela via alternativa do complemento num sujeito necessitado. Também é revelada uma utilização de um agente anti-properdina na preparação de um medicamento para inibir selectivamente a formação de produtos de activação do complemento pela via alternativa do complemento num sujeito onde a via clássica do complemento está iniciada. É adicionalmente revelada uma utilização de um agente inibidor da C3 convertase da via alternativa na preparação de um medicamento para inibir selectivamente a formação de produtos de activação do complemento pela via alternativa do complemento num sujeito onde a via clássica do complemento está iniciada.

De acordo com um aspecto do presente invento, é fornecido um agente seleccionado entre um anticorpo anti-properdina, um fragmento de ligação a antigenes de um anticorpo anti-properdina ou um péptido derivado da properdina, em que esse agente não activa substancialmente um receptor Fcy, para utilização na inibição terapêutica da activação alternativa do complemento.

De acordo com o presente invento, também é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo um agente seleccionado entre um anticorpo anti-properdina, um fragmento de ligação a antigenes de um anticorpo anti-properdina ou um péptido derivado da properdina, em que o agente não activa substancialmente um receptor Fcy, e um transportador farmaceuticamente aceitável.

De acordo com o presente invento, também é proporcionada a utilização de um agente seleccionado entre 12 um anticorpo anti-properdina, um fragmento de ligação a antigenes de um anticorpo anti-properdina ou um péptido derivado da properdina, em que o agente não activa substancialmente um receptor Fcy, para o fabrico de um medicamento destinado a ser utilizado na inibição dos efeitos adversos da activação da via alternativa do complemento num sujeito por inibição selectiva da formação de um produto de activação da via alternativa do complemento.

De acordo com um aspecto suplementar do presente invento, é proporcionada a utilização de um agente seleccionado entre um anticorpo anti-properdina, ou um fragmento de ligação a antigenes de um anticorpo anti- properdina ou um péptido derivado da properdina, em que o agente não activa substancialmente um receptor Fcy, para o fabrico de um medicamento destinado a ser utilizado na inibição dos efeitos adversos da activação da via clássica do complemento num sujeito onde a via clássica do complemento está iniciada, por inibição selectiva da formação de um produto de activação da via alternativa do complemento.

De acordo com outro aspecto do presente invento, é proporcionada a utilização de um agente seleccionado entre um anticorpo anti-properdina, um fragmento de ligação a antigenes de um anticorpo anti-properdina ou um péptido derivado da properdina, em que o agente não activa substancialmente um receptor Fcy, para o fabrico de um medicamento destinado a ser utilizado num processo para 13 efectuar um procedimento médico num sujeito, cujo procedimento compreende: (a) fazer passar sangue em circulação de um vaso sanguíneo do sujeito através de uma conduta e novamente para um vaso sanguineo do sujeito, em que a conduta tem uma superfície luminal compreendendo um material capaz de causar pelo menos um entre activação do complemento, activação de plaquetas, activação de leucócitos ou adesão plaquetas-leucócitos no sangue do sujeito, e (b) introduzir o medicamento na corrente sanguínea do sujeito numa quantidade eficaz para reduzir pelo menos um entre activação do complemento, activação de plaquetas, activação de leucócitos ou adesão plaquetas-leucócitos resultantes da passagem do sangue em circulação através da conduta, em que o passo (a) ocorre antes e/ou durante e/ou após o passo (b).

De acordo com um aspecto suplementar do presente invento, é fornecido um artigo de produção compreendendo material de embalagem e um agente farmacêutico contido no material de embalagem, em que: {a} o agente farmacêutico compreende um agente seleccionado entre um anticorpo anti-properdina, ou um fragmento de ligação a antigenes de um anticorpo anti-properdina ou um péptido derivado da properdina, em que o agente não activa substancialmente um receptor Fcy, para utilização na redução terapêutica de pelo menos um entre activação do complemento, activação de plaquetas, activação de leucócitos ou adesão plaquetas-leucócitos causadas por passagem de sangue em circulação de um vaso sanguíneo do sujeito através de uma conduta e novamente para um vaso sanguíneo do sujeito, em que a conduta tem uma superfície luminal compreendendo um material capaz de causar pelo menos um entre activação do complemento, activação de plaquetas, activação de leucócitos ou adesão plaquetas-leucócitos no sangue do sujeito, e {b) o material de embalagem compreende uma etiqueta que indica que o agente farmacêutico se destina a ser utilizado em conjunção com um procedimento de circulação extra-corporal,

De acordo com um aspecto suplementar do presente invento, é proporcionado um método de rastreio e de selecção de um anticorpo anti-properdina, um fragmento de ligação a antigenes de um anticorpo anti-properdina ou um péptido derivado da properdina, cujo método compreende os passos seguintes: (a) avaliar o agente quanto à sua capacidade para inibir a formação de um produto de activação da via alternativa do complemento, e (b) seleccionar o agente que inibe a formação de um produto de activação da via alternativa do complemento.

DESCRIÇÃO BREVE DAS FIGURAS 15

Nas figuras, que constituem uma porção da especificação: A FIG. 1 mostra a ligação da properdina humana a C3b. A FIG. 2 mostra a inibição dependente da dose da ligação da properdina a C3b utilizando um anticorpo monoclonal anti-properdina. A FIG. 3 mostra a inibição dependente da dose da ligação da properdina a C3bBb utilizando um anticorpo monoclonal anti-properdina. A FIG. 4 mostra os efeitos de soro humano contendo componentes do complemento na deposição do complexo de ataque à membrana (MAC). A FIG. 5 mostra a inibição da deposição do complexo de ataque à membrana (MAC) causada por um anticorpo monoclonal anti-properdina. A FIG. 6 mostra os efeitos de um anticorpo monoclonal anti-properdina na lise de eritrócitos de coelho. A FIG. 7 mostra a inibição da formação de produtos de activaçao da via alternativa do complemento, incluindo C3a e MAC, utilizando um anticorpo monoclonal anti-properdina num modelo de circuito de retorno com tubagem de derivação cardiopulmonar (CPB). 16 A FIG. 8 mostra a ausência de activação de receptores Fcy detectada por ausência de geração de superóxido, utilizando uma preparação de fragmentos F(ab)2 de um anticorpo monoclonal anti-properdina com properdina. A FIG. 9 mostra a inibição da formação de produtos de activação da via alternativa do complemento, incluindo MAC, iniciada por complexos heparina-protamina, utilizando um anticorpo monoclonal anti-properdina. A FIG. 10 mostra a inibição da formação de produtos de activação da via alternativa do complemento, incluindo MAC, iniciada por complexos imunológicos ovalbumina/anti-ovalbumina, utilizando um anticorpo monoclonal anti-properdina . A FIG.. 11 mostra a inibição da formação de produtos de activação do complemento e de leucócitos dependente da via alternativa, incluindo inibição da formação de produtos C3a, MAC ou complexo elastase-anti-tripsina, utilizando um agente anti-properdina num modelo ex vivo de derivação cardiopulmonar (CPB)„

DESCRIÇÃO PORMENORIΖΑΡΑ DO INVENTO I„ O Invento A properdina é uma das três únicas proteínas do plasma directamente envolvidas na via alternativa. Juntamente com o factor D e o factor B, as três são alvos 17 potenciais para o desenvolvimento de agentes terapêuticos destinados a inibir a via alternativa. Como apresentado abaixo, mostra-se aqui pela primeira vez que a properdina é um alvo adequado para um processo de inibição da activação do complemento pela via alternativa. Também se mostra aqui pela primeira vez que a properdina é um alvo adequado mesmo quando a via clássica do complemento foi iniciada. 0 factor D é uma serina proteinase apenas com um único substrato natural conhecido: factor B ligado a C3b (Volanakis, J.E., S.R. Barnum e J.M. Kilpatrick, 1993, Methods in Enzymol. 223: 82-97). A concentração no soro de factor D, 2 pg/ml, é a mais baixa de qualquer proteína do complemento (Liszewski, M.K.. e J.P. Atkinson, 1993, Em "Fundamental Immunology", Terceira Edição. Editado por W.E. Paul. Raven Press, Ltd, Nova Iorque). Sabe-se que o factor D é a enzima limitadora da velocidade para a via alternativa e, em consequência, um alvo adequado para métodos terapêuticos de inibição da activação do complemento pela via alternativa. No entanto, cremos existirem vários motivos pelos quais inibidores do factor D poderão não ser agentes terapêuticos ideais para inibir a activação do complemento. Em primeiro lugar, as serina-proteinases também estão criticamente envolvidas nos sistemas de coagulação e fibrinolitico, tendo-se verificado ser difícil identificar inibidores específicos do factor D (Kilpatrick, J.M., 1996, IBC’s Second Annual Conference on Controlling the Complement System for Novel Drug Development, Conference Binder; Whitty, A., 1996, IBC's Second Annual Conference on Controlling the Complement System for Novel Drug Development, Conference Binder) . Em 18 segundo lugar, o factor D é uma proteína pequena (24,4 kDa} e é rapidamente reabsorvida e catabolizada pelo rim, com uma velocidade catabólica parcial de 60% por hora. A concentração no soro no estado estacionário de factor D é mantida por uma velocidade correspondentemente elevada de síntese. Em consequência, poderá ser difícil inibir a actividade do factor D em soro de pacientes durante períodos prolongados sem regimes complicados de dosagem de fármacos. Em terceiro lugar, o factor D é sintetizado por adipócitos, e há evidências de estudos com ratinhos geneticamente obesos de que o factor D pode ter um papel regulador no metabolismo da gordura (White, R.T., D. Damm, N. Hancock, B.S. Rosen, B.B. Lowell, P. dsher, J.S. Flier e B.M. Speigelman, 1992, J. Biol. Chem.. 267: 9210-9213). Em consequência, a inibição do factor D pode ter efeitos secundários prejudiciais em pacientes que não estão directamente relacionados com a inibição do complemento. O factor B desempenha um papel chave na via alternativa uma vez que fornece a subunidade catalítica, Bb, para a C3 convertase, C3bBb (Liszewski, M.K. e J.P. Atkinson, 1993, Em "Fundamental Immunology", Terceira Edição. Editado por W.E. Paul. Raven Press, Ltd. Nova Iorque). Consequentemente, o factor B também pareceria ser outro alvo adequado para métodos terapêuticos de inibição da activação do complemento pela via alternativa. Isoladamente, o factor B é um zimogénio sem actividade catalítica conhecida, mas depois de se ligar a C3b, a serina proteinase do factor B pode ser activada por clivagem pelo factor D. Com base nisto deveria ser possível desenvolver inibidores específicos da actividade catalítica 19 do factor Bb como agentes terapêuticos para inibir a via alternativa. No entanto, de modo semelhante às experiências com o factor D, verificou-se ser difícil identificar inibidores da actividade de proteinase do factor Bb que não inibam também serina-proteinases envolvidas na hemostase da coagulação sanguínea (Whitty, A., 1996, IBCs Second Annual Conference on Controlling the Complement System for Novel Drug Development, Conference Binder). Em qualquer caso, cremos que o factor B não é, provavelmente, o melhor alvo para o desenvolvimento de agentes terapêuticos destinados a inibir a via alternativa. 0 factor B é uma proteina do soro abundante (-210 pg/ml) (Clardy, C.W., 1994, Infect. Immun. 62: 4539-4555; Liszewski, M.K. e J.P. Atkinson, 1993, Em "Fundamental Immunology", Terceira Edição. Editado por W.E„ Paul. Raven Press, Ltd. Nova Iorque) e provavelmente necessitaria de uma concentração correspondentemente elevada de um inibidor do factor B para bloquear efectivamente a activação da via alternativa. Contudo, anticorpos monoclonais para o factor B humano foram preparados e testados quanto à sua capacidade in vitro para bloquear a activação da via alternativa do complemento por endotoxinas (LPS) (Clardy, C.W., 1994, Infect. Immun. 62: 4539-4555}. Um dos quatro anticorpos monoclonais anti-factor B testados conseguiu bloquear efectivamente a activação da via alternativa. Os outros três anticorpos testados não conseguiram bloqueá-la, apesar de terem afinidades que eram semelhantes à do anticorpo bloqueador. Em três outros estudos de anticorpos monoclonais anti-factor B que foram citados por Clardy et al., supra (1994), dois monoclonais aumentaram a actividade do factor B por estabilização da convertase da via alternativa, um aumentou 20 a actividade do factor B reforçando a ligação de B a C3b, três diminuíram a actividade do factor B desestabilizando a convertase e dois diminuíram a actividade do factor B bloqueando a ligação do factor B a C3b. A properdina desempenha um papel na regulação da via alternativa em virtude da sua capacidade para se ligar e estabilizar os complexos C3 e C5 convertases inerentemente instáveis (C3bBb e C3bBbC.3b) (Nolan, K.F. e K.B.M. Reid, 1993, Methods Enzymol. 223: 35-47), apesar do mecanismo exacto da estabilização da C3 convertase ser desconhecido {Daoudaki, M.E., J.D. Becherer e J.D. Lambris, 1988, J. Immunol. 140: 1577-1580). A ligação da properdina a estes complexos pode resultar numa velocidade decrescida de dissociação da subunidade catalítica Bb e também pode proteger os complexos de degradação pelas proteínas reguladoras negativas, factores I e H. No entanto, a properdina não é necessária para a actividade da C3 convertase funcional (Schreiber, R.D., M.K. Pangburn, P.H. Lesavre e H.J. Muller-Eberhard, 1978, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 7_5: 3948-3952; Sissons, J.G., M.B. Oldstone e R.D. Schreiber, 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA T7: 559-562; Pangburn, M.K. e H.J. Muller-Eberhard, 1984, Springer Semin, Immunopathol. T_: 163-192) . Determinou-se a concentração de properdina em plasma humano normal, 4,3 -5,7 pg/ml, o que a torna numa das proteínas do complemento menos abundantes {Nolan, K.F. e K.B.M. Reid, 1993, Methods Enzymol. 223: 35-47). Em estudos iniciais, foi relatado que a concentração de properdina no plasma estava situada na gama de 20 - 25 mg/ml; no entanto, esta estimativa baseou-se num coeficiente de extinção molar incorrecto para a 2! proteína. Sabe-se agora que a verdadeira concentração de properdina no plasma é significativamente inferior (Nolan, K.F. e K.B.M. Reid, 1993, Methods Enzymol. 223: 35-4 7}, Monócitos, neutrófilos e linfócitos T humanos sintetizam properdina {Schwaeble, W., W.G. Dippold, M.K. Schafer, H.

Pohla, D. Jones, B. Luttig, E. Weihe, H. . P. Huemer, M.P. Dierich e K.B.M. Reid, 1993, J. Immunol. 151 : 2521-2528; Schwaeble, W. , U. Wirthmuller, B . Dewald, M. Thelen, M.K.

Schafer, P. Eggelton, K. Whaley e K.B.M. Reid, 1996, Molec. Immunol. 33(1): 48; Schwaeble, W., H.P. Huemer, J. Most, M.P, Dierich, M, Strobel, C. Claus, K.B.M, Redi e H.W. Ziegler-Heitbrock, 1994, J. Eur. Biochem. 219: 759-764). Ao contrário da maioria das outras proteínas do complemento, a properdina não parece ser sintetizada pelo fígado. A properdina é armazenada em grânulos de neutrófilos humanos, e níveis fisiologicamente relevantes de TNF, 11-8, fMLP e C5a induzem a sua secreção rápida (Schwaeble, W., U. Wirthmuller, B. Dewald, M. Thelen, M.K.. Schafer, P. Eggelton, K. Whaley e K.B.M. Reid, 1996, Molec. Immunol, .33 (1): 48). Numa linha celular de monócitos humanos, o TNF e a IL-1 intensificaram tanto a abundância de mRNA de properdina bem como a secreção da proteína (Schwaeble, W., H.P. Huemer, J. Most, M.P. Dierich, M. Strobel, C. Claus, KB „ M, Redi e H.W. Ziegler-Heitbrock, 1994, J. Eur. Biochem. 219: 759-764).

De acordo com o presente invento, das três proteínas do complemento que estão unicamente envolvidas na via alternativa, a properdina é o alvo mais atractivo para o desenvolvimento de um inibidor do complemento específico para vias destinado a tratar perturbações inflamatórias 22 agudas. Como demonstrado aqui a seguir, um anticorpo anti-properdina que previne a ligação da properdina a C3 convertase inibe totalmente a activação da via alternativa. Em consequência, como descrito pela primeira vez aqui, a properdina é necessária para a activação normal da via alternativa. Uma vez que é demonstrado aqui que a properdina desempenha um papel central na activação do complemento, incluindo em condições envolvendo a iniciação da via clássica do complemento, podem ser rastreados e seleccionados agentes anti-properdina que são inesperadamente eficazes em processos de inibição selectiva e potente da activação da via alternativa do complemento, incluindo processos para inibir a formação de produtos de activação do complemento pela via alternativa. II. Processo para Inibir a Activação do Complemento pela Via Alternativa

Num aspecto, um processo do presente invento proporciona a inibição da activação do complemento pela via alternativa, incluindo a inibição da formação de produtos de activação do complemento pela via alternativa (por exemplo, formação de MAC). Não está bem compreendido o modo como a properdina interage com a C3 convertase, apesar de se ter verificado que a especificidade de ligação primária da properdina está dirigida para C3b (Nolan, K.F. e K.B.M. Reid, 1993, Methods Enzymol. 223: 35-47). 0 sítio de ligação da properdina em C3b foi localizado nos resíduos 1402-1435 da cadeia alfa de C3, como avaliado por estudos de inibição peptídica 23 (Daoudaki, M.E., J.D, Becherer e J.D. Lambris, 1988, J. Inununol. 140: 1577-1580) . A análise de péptidos com sobreposição indica que o sitio pode ser suplementarmente refinado nos resíduos 1424-1432 (Alzenz, J-, J.D. Becherer, I. Esparza, M..E. Daoudaki, D. Avita, S. Oppermann e J.D. Lambris, 1989, Complement Inflamm. 6: 307-314). Também há evidências de que a properdina se liga ao factor B, e esta interacção parece ocorrer através de sítios nas porções Ba e Bb da molécula. Apesar da properdina se ligar a C3b ligado a células, a ligação é significativamente intensificada com C3bBb ligado a células, sugerindo que os sítios de ligação de C3b e Bb podem contribuir para a interacção da properdina com o complexo de convertase (Farries, T.C., P.J. Lachmann e R.A. Harrison, 1988, Biochem. 252: 47-54) . Assim, a ligação da properdina a C3b pode ser inibida quer a C3b não esteja conjugada quer esteja conjugada ao factor B para formar C3bBb {C 3 convertase da via alternativa). Como mostrado em pormenor aqui a seguir nos Exemplos, podem ser rastreados e identificados anticorpos anti-properdina que bloqueiam a ligação da properdina a C3b e C3bBb.

De acordo com um processo do presente invento, a ligação da properdina a C3b é inibida por exposição da properdina, na presença de C3b, a uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-properdina, preferivelmente um anticorpo bloqueador e muito preferivelmente um anticorpo bloqueador sem a capacidade para activar o receptor Fcy por ligação à properdina, como descrito aqui. Meios para determinar uma quantidade eficaz de um anticorpo são bem conhecidos na área, O anticorpo anti-properdina pode ser um anticorpo 24 policlonal ou monoclonal. É preferida a utilização de anticorpos monoclonais. De acordo com o invento, foram identificados anticorpos bloqueadores contra a properdina, podendo ser obtidos de fontes comerciais {por exemplo, Quidel} ou preparados utilizando técnicas bem conhecidas na área. Agentes anti-properdina eficazes de acordo com o invento são preferivelmente anticorpos que bloqueiam selectivamente a activação da via alternativa, incluindo bloqueio da formação de produtos de activação do complemento pela via alternativa. Todavia, para além desses anticorpos bloqueadores, são semelhantemente contemplados pelo invento, como descrito aqui, outros agentes bloqueadores, como péptidos bloqueadores que se demonstrou inibirem substancialmente ou totalmente a formação dependente da via alternativa de C3a, C5a e/ou MAC após iniciação da via alternativa ou da via clássica ou de ambas.

Podem preparar-se anticorpos policlonais contra a properdina imunizando um animal com properdina ou respectiva porção imunogénica. Meios de imunização de animais para a produção de anticorpos são bem conhecidos na área. A título exemplificativo, pode injectar-se um mamífero com uma inoculação que inclui properdina. A properdina pode ser incluída numa inoculação isoladamente ou conjugada a uma proteína transportadora, como hemocianina de lapa californiana (KLH). A properdina pode ser suspensa, como é bem conhecido na área, num adjuvante para intensificar a sua imunogenicídade. Em seguida, do sangue desses animais imunizados são produzidos soros 25 contendo anticorpos imunologicamente activos utilizando procedimentos comuns bem conhecidos na área.

Procede-se à identificação de anticorpos que reagem imunologicamente e especificamente com a properdina expondo soros que se suspeita conterem esses anticorpos à properdina, para formar um conjugado entre anticorpos e properdina. Depois determina-se a existência do conjugado utilizando procedimentos comuns bem conhecidos na área. A properdina também pode ser utilizada para preparar anticorpos monoclonais contra a properdina e utilizada como ensaio de rastreio para identificar esses anticorpos monoclonais» Os anticorpos monoclonais são produzidos a partir de hibridomas preparados de acordo com técnicas comuns, como a descrita por Kohler et al. (Nature 256: 495, 1975) . Em resumo, um mamífero adequado (por exemplo, ratinho BALB/c) é imunizado por injecção com properdina. Após um período de tempo pré-determinado, esplenócitos do ratinho são removidos e suspensos num meio de cultura de células. Em seguida, os esplenócitos são fundidos a uma linha celular imortal, para formar um hibridoma. Os hibridomas formados são desenvolvidos em cultura de células e rastreados quanto à sua capacidade para produzir um anticorpo monoclonal contra a properdina. A inibição da ligação da properdina a C3b está associada à inibição da activação do complemento pela via alternativa. Como mostrado em pormenor aqui a seguir nos Exemplos, agentes anti-properdina, preferivelmente anticorpos anti-properdina, não só bloquearam a ligação da 26 properdina a C3b e C3bBb mas também bloquearam a formação de produtos da via alternativa, incluindo C5b-9, o Complexo de Ataque à Membrana (MAC), cujo complexo é o produto final da activação do complemento. Ainda suplementarmente, os dados dos Exemplos mostram que agentes anti-properdina, preferivelmente anticorpos anti-properdina, também bloqueiam a lise de eritrócitos dependente da via alternativa mediada pelo MAC. Ainda suplementarmente, os dados dos Exemplos mostram que agentes anti-properdina, preferivelmente anticorpos anti-properdina e seus fragmentos de ligação a antigenes, como F(ab)2, são eficazes na inibição da activação do complemento pela via alternativa em modelos de derivação cardiopulmonar e em condições de activação do complemento pela via clássica.

As presentes descobertas são surpreendentes e inesperadas tendo em vista a literatura existente. Por exemplo, Schreiber et al„ demonstraram que a via alternativa pode ser funcionalmente montada misturando todas as proteínas da via alternativa excepto a properdina; foi concluído que a properdina não é necessária para a iniciação e amplificação da via alternativa. (Schreiber, R.D., M.K„ Pangburn, P.H. Lesavre e H.J. Muller-Eberhard, 1978, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75: 3948-3952.) Além disso, a activação da via alternativa iniciada por células HeLa infectadas com o vírus do sarampo na ausência de IgG foi igual na ausência ou presença de properdina (Sissons, J.G., M.B. Oldstone e R..D. Schreiber, 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 22.'· 559-562). Estas descobertas anteriores conduziram à hipótese geralmente aceite de que "a properdina não é um componente essencial para a activação 27 da via, mas a sua presença resulta em amplificação mais rápida de C3b ligada" [ênfase adicionada] (Pangburn, M.K. e H.J. Muller-Eberhard, 1984, Springer Semin, Immunopathol. ]_: 163-192) . Efectivamente, estas referências afastam a identificação da properdina como alvo para intervenção na via alternativa. Em contraste e de acordo com o presente invento, a properdina é agora identificada como um componente essencial e necessário para a activação da via alternativa do complemento. Assim, um processo do presente invento refere-se à inibição selectiva da via alternativa por um agente anti-properdina. Esse agente bloqueia, surpreendente e efectivamente, a casca ta alternativa do complemento, incluindo em condições envolvendo a iniciação da via clássica do complemento.. III. Processo de Tratamento de Lesões Patológicas A capacidade para inibir a activação do complemento utilizando um processo do presente invento proporciona um regime terapêutico para o tratamento de pacientes com sintomas clínicos em que a activação do complemento é prejudicial. 0 sistema do complemento foi implicado na contribuição para a patogénese de numerosos estados e condições de doença graves e crónicos, bem como complicações de uma variedade de procedimentos médicos, incluindo enfarte do miocárdio (Moroko, P.R., C.B,

Carpenter, M. Chiarello, M.C. Fishbein, P. Radva, J,D. Knostman e S.L. Hale, 1978, Lab. Invest. 4J3: 43-47;

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Concino, M.P. Boyle, K.H. Roux, M.L. Weisfeldt e D.T. Fearon, 1990, Science 249: 146-151; Schafer, P.J., D.

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Morgan, B.P., R,H. Daniels e B.D. Williams, 1988, Clin. Exp. Immunol. 7_3 : 4 73-478), esclerose múltipla (Linington, C., B.P. Morgan, N.J. Scolding, S, Piddlesden e P. Wilkins, 1989, Brain 112: 895-911; Sanders, M.E., C.L. Koski, D.

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Engel, 1993, Neurology 4_3: 1167-72), pancreatite (Roxvall, L.f A.. Bengtson e M. Heideman, 1989, J. Surg. Res. 4_7: 138-143; Roxvall, L., A. Bentston e M. Heidman, 1990, Arch. Surg. 125: 918-921) e doença de Alzheimer (Eikelenboom, P-, C.E. Hack, J.M- Rozemuller e F.C. Stam, 1989, Virchows Arch. (Cell pathol.) 56: 259-62; Rogers, J., N.R. Cooper e S. Webster, 1992, Proc. Natl. Acad. Sei.· USA £9: 10016-20). Não obstante o complemento poder não ser a única causa da patogénese nestes estados, ainda assim é um mecanismo patológico importante e representa um ponto efectivo de controlo clínico em muitos destes estados de doença.

Detectaram-se produtos de activação do complemento em fluidos biológicos ou tecidos doentes isolados de pacientes com muitos dos estados acima mencionados, e foi demonstrada uma correlação entre a gravidade da indicação 31 clínica e a abundância de produtos de activação do complemento para algumas doenças (Zilow, G., A. Sturrn, U. Rother e M, Kirschfink, 1990, Clin. Exp. Immunol. J§_: 151-157; Hack, C.E., J.H, Nuijens, R.J.F. Felt-Bersma, W.O. Schreuder, A.J.M. Eerenberg-Belmer, J. Paardeltooper, W. Bronsveld e L.G. Thijs, 1989, Am. J. Med. 8_6: 20-26; Gelfand, J.A., M. Donelan e J.F, Burke, 1983, Ann. Surg. 198: 58-62). A evidência mais forte que implica directamente o complemento na patogénese de um grupo diverso de doenças humanas provém de estudos utilizando modelos animais aceites na área dessas doenças. Nesses modelos animais, a remoção de anticorpos activadores da via clássica (Fischel, R.J., R.M, Bolman, J.L. Platt, K.S. Naharian, F„H. Bach e J.J. Matas, 1990, Trans. Proc. 22: 1077-1083; Platt, J.L., R.J. Fischel, A.J. Matas, S.A. Reif, R.M. Bolman e F.H. Bach, 1991, Transplantation 52: 214-230), depleção do complemento por factor de veneno de cobra (Moroko, P.R„, C.B. Carpenter, M. Chiarello, M.C. Fxshbein, P. Radva, J.D. Knostman e S.L. Hale, 1978, Lab. Invés t. 4_8: 43-47; Mulligan, M.S., C.W. Smith, D.C.

Anderson, R.F. Todd, M. Miyaska, T. Tamatani, T.B. Issekuts e P.A. Ward, 1993, J. Iimunol. 150: 2401-2406; Gelfand, J.A., M. Donelan e J,.F. Burke, 1983, Ann. Surg. 198: 58-62; Leventahal, J.R„, A.P. Dalmasso, J.W. Cromwell, J.L. Platt, C.J. Bolman e A.J. Matas, 1993, Transplantation 5J5 : 857- 865), inibição da actividade do complemento (Weisman, H.F., T. Bartow, M.K., Leppo, H.C. Marsh, G„R. Carson, M.F. Concino, M.P. Boyle, K.H. Roux, M.L.. Weisfeldt e D.T. Fearon, 1990, Science 249: 146-151; Mulligan, M.S., C.G. Yeh, A.R. Rudolph e P.A. Ward, 1992, J. Immunol„ 148: 1479-1485; Pemberton, M., G. Anderson, V. Vetvicka, D.E. Justus 32 e G.D. Ross, 1993, J. Immunol. 150: 5104-5113) ou realização de testes em animais geneticamente deficientes em componentes específicos do complemento (Gelfand, J„A„, M. Donelan e J.F. Burke, 1983, Ann. Sarg„ 198: 58-62; Watson, W.C. e A.C. Townes, 1985, J. Exp. Med. 162: 1878-1883) demonstraram anular ou retardar a patogénese»

Foram reconhecidas deficiências herdadas em humanos para quase todos os componentes do complemento (Liszewski, M.K. e J,P. Atkinson, 1993, "Fundamental Immunology", Terceira Edição. Editado por W.E. Paul. Raven Press, Ltd. Nova Iorque). Deficiências de componentes da mesma via causam problemas clínicos semelhantes. Deficiências em componentes da via clássica (Cl, CA, C2) habitualmente causam infecções por uma variedade de organismos pirogénicos e doenças por complexos imunológicos, tal como a deficiência em C3. Deficiências em componentes da via alternativa (P, D} resultam frequentemente em infecções por Neisseria. Não há nenhuma evidência da deficiência em properdina causar susceptibilidade acrescida a doenças por complexos imunológicos nem a infecções por organismos diferentes de Neisseria. Não foram descritas deficiências homozigóticas em Factor B (Morgan, B.P. e M.J, Walport, 1991, Immunology Today _L2: 301-306). A inactivação da via alternativa do complemento é particularmente útil em sujeitos em que a activação está associada aos efeitos patológicos de estados de doença. Como aqui apresentado antes, sabe-se que a activação do complemento está associada a um grupo grande e diverso de estadas de doença. A activação do complemento pela via 33 alternativa é particularmente relevante em estados de lesão aguda. A septicemia meningocócica fulminante induzida pelo complemento em pacientes com doença meningocócica sistémica é provavelmente causada de forma predominante por activação da via alternativa (Brandtzaeg et al., Journal of Infectious Diseaser 173: 64 7-55, 1996). Em pacientes com síndroma da dificuldade respiratória do adulto (ARDS), a activação do complemento ocorreu apenas pela via alternativa durante as primeiras 4 8 horas (Zilow et al., J. Exp„ Iimunology 7J9: 151-57, 1990). Foi utilizado um agente que suprime a activação do complemento por ambas as vias para tratar inflamação do miocárdio e necrose pós-isquémicas em modelos animais de doença cardiovascular (Weisman et al,, Science 249: 146-71, 1990). De acordo com Weisman et al., a lesão tecidual aguda associada a numerosas doenças autoimunes resulta da activação do complemento. A lesão tecidual induzida pelo complemento encontra-se em vasculite induzida por complexos imunológícos, glomerulonefrite, anemia hemolitica, miastenia gravis, artrite induzida por colagénio de tipo II e isquemia.

Também foi relatado o papel da via alternativa do complemento na indução de danos cardíacos isquémicos durante reperfusão (Amsterdam et al., Amer. J„ Physiol, 268: H448-H457, 1995). Mulligan et al., 1992, J. Immunol. 148: 1479-1485, relataram que a activação do complemento desempenha um papel numa variedade de lesões teciduais, incluindo peritonite induzida por glicogénio, lesão 34 pulmonar e dérmica após deposição intra-alveolar ou intra-dérmica de complexos imunológicos de IgG, lesão pulmonar aguda resultante de activação intravascular do complemento após injecção de factor de veneno de cobra e lesão na pele e pulmonar aguda após trauma térmico.

Uma variedade de procedimentos médicos utiliza circulação extra-corporal (ECC), incluindo hemodiálise, plasmaférese, plaquetaférese, leucoférese, oxigenação membranar extra-corporal (ECMO), precipitação de LDL extra-corporal induzida por heparina (HELP) e, mais habitualmente, derivação cardiopulmonar (CPB). Estes procedimentos expõem sangue ou produtos sanguíneos a superfícies estranhas que podem alterar a função e hemostase celulares normais. Por exemplo, está bem estabelecido que a CPB conduz frequentemente a respostas inflamatórias complexas resultantes em complicações pós-cirúrgicas, geralmente denominadas "síndroma de pós-perfusão", Entre estes acontecimentos pós-operatórios contam-se falha respiratória, perturbações de hemorragias, disfunção renal e, nos casos mais graves, falha de múltiplos órgãos (Wan, S,, J.-L. LeClerc e J.-L. Vincent, 1997, Chest 112: 676-692). A principal causa suspeita destes problemas relacionados com a CPB é activação inapropriada do complemento durante o procedimento de derivação (Chenoweth, K., S. Cooper, T. Hugli, R. Stewart, E. Blackstone e J. Kirklin, 1981, N. Engl, J. Med, 304: 497-503; P. Haslam, P. Townsend e M. Branthwaite, 1980, Anaesthesia 2_5: 22-26; J.K. Kirklin, S. Westaby, E. Blackstone, J.W. Kirklin, K, Chenoweth e A. Pacifico, 1983, J. Thorac. Cardiovasc, Surg„ 8_6: 845-857; Moore, F.D., K.G. 35

Warner, B.A. Assousa, C.R. Valeri e S.F. Khuri, 1989, Ann. Surg. 208: 95-103; J. Steinberg, D. Kapelanski, J„ Olson e J. Weiler, 1993, J. Thorac. Cardiovasc. Surg„ 106: 1901-1918) , Apesar de parecer que o contacto do sangue com a tubagem e superfícies oxigenadoras do circuito de CPB resulta em activaçâo da via alternativa do complemento (Chenoweth, K„, S. Cooper, T. Hugli, R. Stewart, E. Blackstone e J. Kirklin, 1981, N. Engl. J. Med. 304: 497-503; Velthuis, H., P.G.M. Jansen, C.E. Hack, L. Eijsan e C.R.H, Wildevuur, 1996, Ann. Thorac. Surg. J51: 1153-1157), também há evidências de que a via clássica do complemento é activada durante a CPB (Wachtfogel, Y.T., P.C. Harpel, L.H. Edmunds, Jr. e R.W. Colman, 1989, Blood 23: 468-471)· Além disso, a cascata clássica do complemento é iniciada após a terminação de CPB, devido à adição de protamina ao sangue de um paciente. A protamina é utilizada clinicamente para se ligar e remover a heparina que é adicionada como anti-coagulante durante a cirurgia. Os complexos heparina-protamina causam activaçâo significativa da via clássica do complemento (Steinberg, J., D. Kapelanski, J. Olson e J. Weiler, 1993, J. Thorac, Cardiovasc. Surg. 106: 1901-1918), contribuindo suplementarmente para a síndroma pós-perfusão,

Sabe-se que espécies do complemento activado, particularmente as anafilotoxinas C3a e C5a, activam uma variedade de respostas inflamatórias a partir de muitos tipos de células. Por exemplo, a C5a pode regular positivamente a expressão de moléculas de adesão celular em neutrófilos e também pode evocar a libertação de enzimas lisossómicas e radicais livres a partir de neutrófilos e monócitos (Chenoweth, D. e T. Hugli, 1978, Proc. Natl. 36

Acad. Sei. USA 75: 3943-3947; Fletcher, M.P., G. Stakl e J. Longhurst, 1993, Am, J, Physiol. 265: Hl750-H1761). Da mesma forma, a C.5a pode activar plaquetas, tornando-as incapazes da função normal de coagulação (Foreman, K.E., A.A. Vaporciyan, B.K. Bonish, M.L. Jones, K.J. Johnson, M.M. Glovsky, S.M. Eddy e P.A. Ward, 1994, J. Clin. Invest. 94: 1147-1155) . Por fim, o produto terminal do complemento activado, C5b-9 (complexo de ataque à membrana) também pode afectar a função de plaquetas e células endoteliais (Foreman, K.E., A,A. Vaporciyan, B.K. Bonish, M.L. Jones, K„LJonhhon, M.M. Glovsky, S.M. Eddy e P.A. Ward, 1994, J. Clin, Invest, 9_4: 1147-1155; Hattori, R., K.K. Hamilton, R.D. Fugate, R.P. McEver e P.J. Sims, 1989, J. Biol. Chem. 264: 9053-9060). São as acções destas espécies do complemento em neutrófilos, plaquetas e outras células circulatórias que provavelmente conduzem aos vários problemas que surgem após a realização de CPB.

Recentemente tem havido evidências experimentais directas de que a activação do complemento é, de facto, responsável por muitas das alterações envolvendo disfunção dos sistemas imunológico e hemostático observadas após a realização de CPB. Utilizando o receptor do complemento solúvel de tipo 1 (sCRl), que previne a activação de ambas as vias clássica e alternativa do complemento, Gillinov A.M., P.A. DeValeria, J.A. Winkelstein, I. Wilson, W.E. Curtis, D. Shaw, C.G. Yeh, A.R. Rudolph, W.A. Baumgartner, A. Herskowitz e D.E. Cameron (1993, Ann. Thorac. Surg. 55: 619-624) demonstraram que a inibição da activação do complemento melhorou a resistência vascular pulmonar em porcos submetidos a um procedimento de CPB. Utilizando um 37 modelo e.v vivo de CPB simulada, Rinder et al. (1995, supra) mostraram que a adição de um anticorpo monoclonal a C5 reduziu significativamente a activação de neutrófilos e plaquetas que ocorreu durante o procedimento de derivação. 0 anticorpo para C5 bloqueia a clivagem de C5 em ambas as vias clássica e alternativa do complemento e, assim, previne a produção do complexo de ataque à membrana e da anafilotoxina, C5a. A utilização de um desses anticorpos monoclonais anti-C5 para reduzir a activação do complemento, plaquetas ou leucócitos ou a adesão plaquetas leucócitos resultantes da passagem do sangue de um paciente via circulação extra-corporal é descrita na patente WO95/25540 [PCT/US95/03614J. IV. Composições Farmacêuticas

Assim, um processo do presente invento pode ser utilizado para inibir a activação do complemento pela via alternativa, incluindo para inibir a formação de produtos de activação do complemento pela via alternativa, em pacientes por administração a um paciente necessitado de inactivação do complemento de uma quantidade inibidora eficaz de um agente anti-properdina, preferivelmente um anticorpo anti-properdina ou respectivo domínio de ligação a antigenes. Preferivelmente, o agente anti-properdina, muito preferivelmente um anticorpo anti-properdina ou respectivo domínio de ligação a antigenes, é administrado na forma de uma composição farmacêutica.

Essa composição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente anti- 38 properdina, preferivelmente um anticorpo anti-properdina, formulado juntamente com um ou mais transportadores não tóxicos e farmaceutícamente aceitáveis revelados. Tal como é aqui utilizado, o termo "transportador farmaceutícamente aceitável" significa um agente de enchimento, diluente, material de encapsulação ou auxiliar de formulação de qualquer tipo não tóxico, inerte, sólido, semi-sólido ou líquido. Alguns exemplos de materiais que podem servir de transportadores farmaceutícamente aceitáveis são açúcares, como lactose, glucose e sucrose; amidos, como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados, como carboximetilcelulose sódica, etilcelulose e acetato de celulose; tragacanto em pó; malte; gelatina; talco; excipientes, como manteiga de cacau e ceras para supositórios; óleos, como óleo de amendoim, óleo de sementes de algodão, óleo de açafroa, óleo de sésamo, azeite, óleo de milho e óleo de soja; glicóis, como propilenoglicol; ésteres, como oleato de etilo e laurato de etilo; agar; agentes de tamponamento, como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água sem pirogénios; solução salina isotónica; solução de Ringer; álcool etílico, e soluções tampão de fosfato, bem como outros lubrificantes compatíveis não tóxicos, como laurilsulfato de sódio e estearato de magnésio, bem como agentes corantes, agentes de libertação, agentes de revestimento, agentes adoçantes, aromatizantes e perfumantes, conservantes e antioxidantes também podem estar presentes na composição, de acordo com a avaliação do formulador. 39

As composições farmacêuticas deste invento podem ser administradas a humanos e outros animais oralmente, rectalmente, parentericamente, intracisternalmente, intravaginalmente, intraperitonealmente, transdermicamente, topicamente (na forma de pós, unguentos ou gotas) , bucalmente ou na forma de uma pulverização oral ou nasal.

Formas galénicas liquidas para administração oral incluem emulsões, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires farmaceuticamente aceitáveis. Para além dos compostos activos, as formas galénicas liquidas podem conter diluentes inertes habitualmente utilizados na área, tais como, por exemplo, água ou outros solventes, agentes solubílizadores e emulsionantes, como álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etílo, acetato de etilo, álcool benzílico, benzoato de benzilo, propilenoglicol, 1,3-butilenoglicol, dimetilformamida, óleos (em particular óleos de sementes de algodão, amendoim, milho, gérmen, azeite, rícino e sésamo), glicerol, álcool tetra-hidrofurfurílico, polietilenoglicóís e ésteres de ácidos gordos com sorbitano e misturas destes. Para além de diluentes inertes, a composição oral também pode incluir adjuvantes tais como agentes humedecedores, agentes emulsionantes e de suspensão, agentes adoçantes, aromatizantes e perfumantes.

Preparações injectáveis, por exemplo, suspensões injectáveis esterilizadas aquosas ou oleaginosas, podem ser formuladas de acordo com as técnicas conhecidas utilizando agentes dispersantes ou humedecedores e agentes de suspensão adequados. A preparação injectável esterilizada 40 também pode ser uma solução, suspensão ou emulsão injectável esterilizada num diluente ou solvente não tóxico e parentericamente aceitável, por exemplo, na forma de uma solução em 1,3-butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregues contam-se água, solução de Ringer, U.S.P. e solução de cloreto de sódio isotónica. Adicionalmente, óleos fixos esterilizados são convencionalmente empregues como solvente ou meio de suspensão. Para esta finalidade pode empregar-se qualquer óleo brando fixo, incluindo mono ou diglicéridos sintéticos. Adicionalmente, na preparação de injectáveis utilizam-se ácidos gordos, como ácido oleico.

As formulações injectáveis podem ser esterilizadas, por exemplo, por filtração através de um filtro que retém bactérias, ou por incorporação de agentes de esterilização na forma de composições sólidas esterilizadas que podem ser dissolvidas ou dispersas em água esterilizada, ou outro meio injectável esterilizado, antes da utilização.

Para prolongar o efeito de um fármaco é frequentemente desejável abrandar a absorção do fármaco a partir de uma injecção subcutânea ou intramuscular. Isto pode ser conseguido utilizando uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo com fraca solubilidade em água. Então, a velocidade de absorção do fármaco depende da sua velocidade de dissolução que, por sua vez, pode depender da dimensão dos cristais e da forma cristalina. Alternativamente, obtém-se absorção retardada de um fármaco administrado parentericamente dissolvendo ou suspendendo o fármaco num veiculo oleoso. Preparam-se formas de depósito 41 para injecçâo formando matrizes de microencapsulação do fármaco em polímeros biodegradáveis, tais como poliláctido-poliláctido-poliglicólido. Dependendo da razão entre fármaco e polímero e da natureza do polímero particular empregue, pode controlar-se a velocidade de libertação do fármaco. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem poli(ortoésteres) e poli(anidridos)* Também se preparam formulações injectáveis de depósito encerrando o fármaco em lipossomas de microemulsões que são compatíveis com tecidos corporais.

Composições para administração rectal ou vaginal consistem preferivelmente em supositórios, que podem ser preparados misturando os compostos deste invento com excipientes ou transportadores não irritantes adequados, tais como manteiga de cacau, polietilenoglicol ou uma cera para supositórios, que são sólidos à temperatura ambiente mas líquidos à temperatura do corpo e que, em consequência, fundem na cavidade rectal ou vaginal e libertam o composto activo.

Composições sólidas de tipo semelhante podem ser empregues como agentes de enchimento em cápsulas de enchimento de gelatina mole e endurecida, utilizando excipientes tais como lactose ou açúcar do leite, bem como polietilenoglicóis de elevado peso molecular e afins.

Os compostos activos também podem estar em forma microencapsulada com um ou mais excipientes como notado acima. As formas galénicas sólidas de pastilhas, drageias, cápsulas, comprimidos e grânulos podem ser preparadas com 42 revestimentos e invólucros tais como revestimentos entéricos, revestimentos controladores da libertação bem conhecidos na área da formulação farmacêutica. Nessas formas galénicas sólidas, o composto activo pode ser misturado com pelo menos um diluente inerte, como sucrose, lactose ou amido. Essas formas galénicas também podem compreender, como é prática normal, substâncias adicionais diferentes de diluentes inertes, por exemplo, lubrificantes para formação de pastilhas e outros ácidos para formação de pastilhas, como estearato de magnésio e celulose microcristalina. No caso de cápsulas, pastilhas e comprimidos, as formas galénicas também podem compreender agentes de tamponamento. Opcionalmente, podem conter agentes que conferem opacidade e também podem ter uma composição tal que libertem apenas o(s} ingrediente(s) activo(s), ou então, preferencialmente, em determinada parte do tracto intestinal, opcionalmente de forma retardada. Exemplos de composições de encerramento que podem ser utilizadas incluem substâncias poliméricas e ceras.

Formas galénicas para administração tópica ou transdérmica de um composto deste invento incluem unguentos, pastas, cremes, loções, géis, pós, soluções, pulverizações, inalações ou emplastros. 0 componente activo é misturado, em condições esterilizadas, com um transportador farmaceuticamente aceitável e quaisquer conservantes ou tampões necessários, consoante o requerido. Também são contemplados como pertencentes ao âmbito deste invento formulações oftálmicas, gotas auriculares, unguentos oculares, pós e soluções. 43

Os unguentos, pastas, cremes e géis podem conter, para além de um composto activo deste invento, excípientes tais como gorduras animais e vegetais, óleos, ceras, parafinas, amido, tragacanto, derivados de celulose, polietilenoglicóis, silicones, bentonites, ácido silícicq, talco e óxido de zinco, ou misturas destes, Pós e pulverizações podem conter, para além dos compostos deste invento, excípientes tais como lactose, talco, ácido silícico, hidróxido de alumínio, agentes de formação de silicatos de cálcio e pó de poliamida, ou misturas destas substâncias. As pulverizações podem conter adicionalmente impulsores habituais, tais como clorofluoro-hidrocarbonetos.

Os emplastros transdérmicos têm a vantagem adicional de proporcionarem distribuição controlada de um composto no corpo. Podem preparar-se essas formas galénicas dissolvendo ou distribuindo o composto no meio apropriado. Também podem utilizar-se intensificadores da absorção para aumentar o fluxo do composto através da pele, A velocidade pode ser controlada fornecendo uma membrana controladora da velocidade ou dispersando o composto numa matriz polimérica ou gel.

Os Exemplos que se seguem ilustram formas de realização preferidas do presente invento, não sendo, de modo nenhum, limitadores da especificação e reivindicações. EXEMPLO 1: Ligação C3b-Properdina 44

Revestiram-se placas de microtítulo de poliestireno com C3b humana {0,5 pg/50 μΐ por cavidade} (Calbiochem, San Diego, CA, N° Catálogo 204860) em solução salina tamponada com Veronal (VBS) : (barbiturato de dietilo 5 mM, NaCl 120 mM, MgCl2 5 mM, EGTA 5 mM) durante a noite a 4°C. Depois da aspiração da solução de C3b, as cavidades foram bloqueadas com VBS contendo albumina de soro humano (HSA) 0,5% (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, N° Catálogo A9511) durante 2 horas à temperatura ambiente. Cavidades sem revestimento de C.3b serviram de controlos de fundo. Adicionaram-se às cavidades aliquotas de properdina humana (ou factor P) (Advanced Research Technology, San Diego, CA, N° Catálogo A139) em concentrações variáveis em solução bloqueadora. Após 2 horas de incubação â temperatura ambiente, as cavidades foram enxaguadas extensamente com VBS.

Detectou-se a properdina ligada a C3b pela adição de anticorpo monoclonal de ratinho anti-properdina humana (anticorpo de detecção) (Quídel, San Diego, CA, anticorpo monoclonal anti-properdina humana P#2, N° Catálogo A235) numa diluição 1:1000 em solução bloqueadora, que se deixou incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. Depois da lavagem das placas com VBS, adicionou-se um anticorpo de cabra anti-ratinho conjugado com peroxidase (diluição 1:1000 em solução bloqueadora) (Sigma Chemical Company) e deixou-se incubar o sistema durante 1 hora. A placa foi outra vez enxaguada extensamente com VBS e adicionaram-se 100 μΐ de substrato de 3, 3', 5, 5'-tetrametilbenzidina (TMB) (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD, N° Catálogo 50-65-00). Após incubação durante 10 minutos a 45 25°C, a reacção de TMB foi rapidamente arrefecida por adição de 100 μΐ de ácido fosfórico e a placa foi lida, a 450 nm, num leitor de microplacas (por exemplo, SPECTRA MAX 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) . O Kd estimado da ligação da properdina a C3b baseou-se na concentração de properdina a 50% de ligação máxima (Programa Microcal Origin).

Avaliou-se a capacidade de um anticorpo monoclonal nnirino anti-properdina humana (anticorpo bloqueador) para inibir a ligação C3b-P por adição de concentrações variáveis deste anticorpo (anticorpo bloqueador, Quidel, anticorpo monoclonal anti-properdina humana P#l, N° Catálogo A233) a uma concentração constante de properdina (2 nM). Detectou-se a quantidade de properdina ligada a C3b com o sistema de detecção de anticorpo descrito acima.

Como mostrado na F1G. 1, a properdina humana liga-se a C3b, que tinha sido imobilizada em cavidades de uma placa de microtítulo. A partir destes dados, a constante de ligação aparente, definida como a concentração de properdina necessária para atingir metade da ligação máxima, é aproximadamente 1 nM. Neste ensaio, quando se adiciona anticorpo monoclonal bloqueador anti-properdina juntamente com properdina, observa-se inibição dependente da dose da ligação de properdina a C3b (FIG, 2). O valor ICso de 1 nM indica que o anticorpo se liga à properdina com afinidade elevada, desse modo bloqueando a sua interacção com C3b. EXEMPLO 2: Ligação C3b(Bb)-Properdina 46

Este ensaio foi realizado como descrito no Exemplo 1 acima com algumas alterações. Em resumo, cavidades de microtitulo foram revestidas com C3b, foram lavadas, bloqueadas e incubadas com várias concentrações de soro humano normal (NHS) (Sigma Chemical Company, N° Catálogo Ξ1764) diluído em solução bloqueadora durante 2 horas à temperatura ambiente. Nas condições deste ensaio de ligação, o factor B presente no soro ligar-se-á à C3b ligada à fase sólida e, após clivagem por factor D em soro, irá gerar C3bBb„ Sabe-se que a properdina se liga a C3bBb com afinidade elevada (Farries, T„C.,, P.J. Lachmann e R.A. Harrison, 1968, Biochem, 252: 47-54) . Cavidades não revestidas serviram de controlos de fundo. Após lavagem, detectou-se a properdina ligada com o anticorpo anti-properdina como descrito no Exemplo 1 acima.

Para avaliar o efeito do anticorpo bloqueador na inibição da ligação da properdina a C3b(Bb), adicionaram-se várias concentrações do anticorpo bloqueador descrito no Exemplo 1 acima a uma concentração fixa de soro (4% em solução bloqueadora). Detectou-se a quantidade de properdina ligada a C3b(Bb) utilizando o sistema de detecção descrito no Exemplo 1 acima.

Para além da properdina purificada, a properdina no soro pode ligar-se a C3b imobilizada. Uma vez que o soro também contém factor B, que se liga a C.3b com conversão resultante em Bb após clivagem por factor D, é provável que a properdina derivada do soro se ligue ao complexo C3bBb neste formato de ensaio. Quando o anticorpo monoclonal 47 bloqueador anti-properdina do Exemplo 1 é adicionado com soro humano a cavidades revestidas com C3b, ocorre uma inibição dependente da dose da ligação da properdina a C3bBb (FIG. 3} . Mais uma vez, o valor IC50 neste ensaio é 1-2 nM, consistente com os resultados obtidos na FIG. 2 e descritos no Exemplo 1 acima. EXEMPLO 3: Ensaio de MAC Dependente da Via Alternativa

Os dados de ligação dos Exemplos 1 e 2 acima revelam que o anticorpo monoclonal para a properdina previne a ligação da properdina a C3b e à C3 convertase funcional (C3bBb). Uma vez que a literatura sugere que a properdina estabiliza a C3 convertase, tivémos interesse em determinar se o anticorpo para a properdina poderá afectar apreciavelmente os aspectos terminais da cascata alternativa do complemento. 0 produto final desta via é o complexo de ataque à membrana (MAC) C5b-9. Para analisar os efeitos do anticorpo para a properdina na formação de MAC pela via alternativa, utilizou-se um ensaio em que se usou LPS bacteriano como substrato para iniciar a cascata da via alternativa do complemento.

Estudos prévios demonstraram que lipopolissacárido (LPS) de Salmonella typhosa (S. Typhosa) (Sigma Chemical Company, N° Catálogo 6386) serve de substrato potente para a activação da via alternativa do complemento (Clardy, C.W., 1994, Infect. Irniuun. 62'. 4539-4555) . Revestiram-se cavidades de microtitulo com LPS {2 μg/50 μΐ por cavidade) em VBS durante a noite a 4°C. Cavidades não revestidas serviram de controlos de fundo. Após aspiração da solução 48 de LPS, as cavidades foram tratadas com solução bloqueadora e foram incubadas com várias concentrações de soro humano normal. Após 3 horas de incubação a 37°C, detectou-se o MAC depositado com anticorpo monoclonal de ratinho anti-C.5b-9 solúvel humano (Quidel, N° Catálogo A239), utilizando metodologias de ELISA comuns essencialmente como descrito nos Exemplos acima. Avaliou-se o efeito do anticorpo bloqueador na formação de MAC adicionando várias concentrações de anticorpo bloqueador a uma concentração fixa de soro (4% em solução bloqueadora)„ Determinou-se a quantidade de inibição da formação de C5b-9 solúvel utilizando o sistema de detecção de anticorpo descrito nos Exemplos acima.

Como demonstrado na FIG. 4, a adição de quantidades crescentes de soro humano normal, que contém todos os componentes do complemento, resultou em deposição de MAC acrescida na superfície de LPS. Foi possível prevenir completamente a formação de MAC neste ensaio por adição do anticorpo monoclonal para a properdina, como observado na FIG. 5. Estes dados indicam que a properdina não procede meramente à estabilização e alteração da cinética da via alternativa, como sugerido na literatura, mas demonstram, pela primeira vez, que a properdina é, de facto, necessária para a progressão da cascata. EXEMPLO 4: Hemólise Dependente da Via Alternativa

Para confirmar e estender estes resultados, examinou-se o anticorpo para a properdina noutro ensaio da via alternativa. Eritrócitos de coelho iniciam a cascata 49 alternativa do complemento, e a formação resultante de MAC causa a lise destas células. Se o anticorpo para a properdina for capaz de inibir completamente a via alternativa, então a adição do reagente a eritrócitos de coelho banhados em soro humano deve prevenir a lise celular. Isto pode ser avaliado examinando o espalhamento de luz causado por glóbulos vermelhos intactos: as células que sofreram lise não difractam a luz, havendo uma redução consequente do espalhamento de luz. Está bem estabelecido que eritrócitos de coelho activam especificamente a via alternativa do complemento, com lise resultante das células pelo complexo C5b-9 (Nolan, K.F. e K.B.M. Reid, 1993, "Properdin" Methods Enzyiuol. 223: 35-47). Incubou-se soro humano normal, em várias concentrações em Tampão Gelatin Veronal (GVB) (Advanced Research Technology), com MgCl2 5 mM e EGTA 10 mM, a 37°C, com um número fixo de eritrócitos de coelho (Advanced Research Technology). Mediu-se um decréscimo progressivo do espalhamento de luz (devido a lise de células intactas), a 595 nm, em função do tempo num leitor de placas de ELISA de temperatura controlada (Polhill et al., J. Iimunol. 121: 383-370),. Para determinar a capacidade do anticorpo bloqueador para inibir a hemólise de eritrócitos de coelho, adicionaram-se várias concentrações do anticorpo bloqueador a uma concentração fixa de soro humano normal (8%), e efectuou-se o ensaio como descrito acima. Os dados foram registados e analisados com um leitor de placas e "software" SpectraMax.

Como mostrado na FIG. 6, a adição de soro na ausência de anticorpo para a properdina resultou em lise das células e numa redução dramática do espalhamento de 50 luz. A adição de concentrações crescentes do anticorpo causou um decréscimo da lise de eritrócitos, em que anticorpo 30 nM bloqueou completamente a destruição celular mediada pelo MAC. Estes resultados confirmam que anticorpos ntonoclonais que se ligam e bloqueiam a interacção da properdina com C3 convertase são reagentes potentes que podem anular completamente os efeitos da via alternativa do complemento. Técnicos experimentados reconhecem e aceitam que estudos in vitro do complemento são representativos e prevêem o estado in vivo do sistema do complemento. A titulo exemplificativo, a utilização de procedimentos ELISA {ensaio imunoabsorvente ligado a enzima) in vitro para detectar properdina associada a lipopolissacárido (LPS) é um "método simples, rápido e fiável para avaliar a função do complemento, particularmente a detecção de estados de deficiência do complemento" (Fredrikson et al., J. Immunol. Me th. 166: 263-70, 1993). Os autores concluem que a técnica in vitro pode ser utilizada in vivo com a mesma probabilidade de sucesso para detectar a activação da via alternativa do complemento em estados de doença.

De modo semelhante, verificou-se que a utilização de um péptido com 34 aminoácidos para estudar a ligação da properdina a C3b utilizando um teste de hemólise in vitro é uma indicação apropriada tanto do papel da properdina durante infecção como do mecanismo de estabilização da C3 convertase (Daoudaki et al., J. of Immun. 140: 1577-80, 1988) 51

Ainda suplementarmente, o ensaio comum de hemólise de eritrócitos de coelho (descrito aqui em pormenor no Exemplo 4), cujo ensaio é utilizado para medir a actividade da via alternativa do complemento, é aceite na área como sendo o "ensaio mais conveniente para a actividade da via alternativa humana" (Pangburn, Meth. in Enzymology 162: 639-53, 1988) . EXEMPLO 5: Derivação Cardiopulmonar: Modelo de Circuito de Retorno com Tubagem

Para testar o efeito de um anticorpo monoclonal bloqueador anti-properdina, como descrito nos Exemplos 1-4 acima, na inibição da activação do complemento em derivação cardiopulmonar (CPB), utilizou-se um modelo de circuito de retorno com tubagem de CPB como descrito por Gong, J., R. Larsson, K.N. Edkahl, T.E. Mollnes, U. Nilsson e B. Nilsson, 1996, J. Clin. Inununol. 1_6: 222-229. Recolheu-se sangue completo de um dador saudável para um tubo Vacutainer de 7 ml (Becton Dickinson, San Jose, CA) contendo 20 U de heparina/ml de sangue. Encheu-se tubagem de polietileno como a utilizada durante CPB (PE 330; D.I. 2,92 mm, D.E. 3,73 mm; Clay Adams, NJ) com 0,5 ml do sangue humano heparinizado, tendo sido fechada num circuito de retorno com uma pequena peça de tubagem de silício. Sangue heparinizado contendo EDTA 20 mM (que inactiva o complemento) serviu de controlo de fundo. Os circuitos de retorno com tubagem de amostra e de controlo foram submetidos a rotação vertical num banho de água durante 1 hora a 37°C. Após a incubação, as amostras de sangue foram transferidas para tubos Eppendorf siliconizados de 1,7 ml 52 que continham EDTA 0,5 M, para dar origem a uma concentração final de EDTA de 20 mM. Centrifugaram-se as amostras (4000 x g durante 5 minutos a 4°C) e recolheu-se o plasma,. Diluíram-se as amostras de plasma para 10% com tampão diluente de amostras e determinaram-se as quantidades de C3a e de MAC solúvel (sMAC) utilizando estojos de ensaios ELISA, seguindo as instruções do fabricante (Quidel, N°s Catálogo A015 para C3a e A009 para C5b-9/MAC). Para estudos da inibição do complemento, adicionaram-se várias concentrações (100 - 600 nM) do anticorpo monoclonal bloqueador anti-properdina, descrito nos Exemplos 1-4, ao sangue heparinizado imediatamente antes da circulação durante 1 hora a 37°C. Após circulação/rotação num banho de água a 37°C durante 1 hora, analisaram-se alíquotas quanto a MAC solúvel e C3a como descrito acima, utilizando estojos de ensaios ELISA (Quidel).

Utilizando este paradigma de CPB simplificado em que a tubagem comum de CPB foi parcialmente cheia com sangue humano fresco, deixando uma interface ar-sangue, e em que a tubagem é reunida nas extremidades com uma manga de silício para formar um circuito de retorno, de modo que este circuito de retorno cheio com sangue é submetido a rotação num banho de água aquecida (37°C) para simular o movimento de sangue através de um circuito de derivação, ocorre uma activação acentuada do complemento durante a rotação do sangue na tubagem. De forma importante, o anticorpo bloqueador anti-properdina humana provoca uma inibição significativa desta activação do complemento. Isto pode ser observado na FIG. 7, em que a formação do complexo 53 de ataque à membrana solúvel (sMAC) no modelo do circuito de retorno é quase completamente inibida por anticorpo anti-properdina 100 nM. Da mesma forma, a mesma quantidade de anticorpo provoca uma redução significativa da formação de C3a (FIG. 7).

Esta é a primeira demonstração da eficácia de um agente que inibe selectivamente a activação da via alternativa num modelo de CPB. Em contraste, todos os agentes anteriores até à data que têm sido utilizados experimentalmente para inibir a activação do complemento em protocolos de CPB inibem ambas as vias clássica e alternativa do complemento (por exemplo, Gillinov A.M.., P.A. DeValeria, J.A. Winkelstein, I. Wilson, W.E. Curtis, D. Shaw, C»G. Yeh, A.R.. Rudolph, W.A. Baumgartner, A. Herskowitz e D.E. Cameron, 1993, Ann. Thorac. Surg. 55: 619-624; Kinder, C.S., H.M. Rinder, B.R. Smith, J.C.K. Fitch, M.J. Smith, J.B. Tracey, L..A. Matís, S.P. Squinto e S.A. Rollins, 1995, J. Clin, Invest. 96: 1564-1572). Uma vez que foi sugerido que ambas as vias clássica e alternativa são activadas durante CPB {Wachtfogel, Y„T. , P.C. Harpel, L.H. Edmunds, Jr. e R„W. Colman, R.W., 1989,

Blood Τ3: 468-471), estes resultados com um agente que aborda selectivamente a via alternativa são particularmente surpreendentes, EXEMPLO 6: Agentes Bloqueadores: Ausência de Activação do Receptor Fcy

Como descrito no Exemplo 5 acima, o anticorpo monoclonal bloqueador anti-properdina inibe de forma 54 potente a geração de MAC solúvel e C3a num modelo de circuito de retorno com tubagem de derivação cardiopulmonar„ Sabe-se que os agentes pró-inflamatórios (C5a, C3a e sMAC) gerados por activação do complemento activam leucócitos, plaquetas e células endoteliais. Como marcadores da activação de neutrófilos, também se determinaram os níveis no soro de elastase dos neutrófilos em sangue completo no modelo de circuito de retorno com tubagem. Como esperado, os níveis de elastase em amostras de sangue incubadas no circuito de retorno com tubagem aumentaram relativamente aos níveis das amostras de controlo. No entanto, a libertação de elastase não foi inibida pelo anticorpo monoclonal anti-properdina. Ao invés, ocorreu um aumento inesperado dos níveis de elastase no soro com concentrações crescentes de anticorpo. Se forem gerados complexos imunológicos quando o anticorpo monoclonal anti-properdina é adicionado a sangue contendo properdina, estes complexos imunológicos poderão interagir com receptores Fcy em neutrófilos, resultando em activação celular. Receptores Fcy e sua activação foram revistos por Ravetch, J.V. e J.P. Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol. 9: 457-492, e Hulett, M.D, e P.M. Hogarth, 1994, Adv. Immunol. 57: 1-127.

Agentes de acordo com o presente invento que inibem selectivamente a activação da via alternativa do complemento são preferivelmente agentes que não activam receptores Fcy, por exemplo, via formação de complexos imunológicos com os seus antigenes. Esses agentes podem ser rastreados quanto à sua capacidade para activarem receptores Fcy por uma variedade de ensaios conhecidos na 55 área. Uma vez que a geração de superóxido é uma das respostas clássicas de neutrófilos e outros fagócitos à activação via receptores Fcy (RII), utilizou-se um ensaio especifico para a libertação de superóxido a partir de células em sangue completo diluído para rastrear e avaliar agentes e o possível papel de receptores Fcy na activação de neutrófilos por esses agentes. Agentes de anticorpos monoclonais são, geralmente, agentes de agregação ineficazes por ligação aos seus antigenes e, assim, ineficazes para activar receptores Fcy via formação de complexos imunológicos. No entanto, foi detectada do modo seguinte a activação de Fcy para um anticorpo monoclonal bloqueador anti-properdina.

Efectuou-se um ensaio de quimioluminescência para a produção de superóxido em sangue completo diluído (Tose, M.F. e A. Itamedani, 1992, Am. J. Clin. Pathol. £7: 566-573). Recolheu-se sangue completo por uma picada num dedo, tendo sido rapidamente diluído 350 vezes em meio RPMI-1640 sem vermelho de fenol contendo Pen-Strep, que foi tamponado com HEPES 10 mM (pH 7,4} a 37 °C. 0 meio também contém lucigenina 10 μΜ (Sigma Chemical Co.), um composto que se torna quimioluminescente quando reduzido por superóxido. Adicionaram-se estimuladores potenciais do impulso oxidativo (por exemplo, PMA ou C.5a) ou controlos de tampão a amostras em duplicado de 1 ml do sangue diluído lucigenina-meio RPMI e íncubou-se o sistema a 37°C durante 2-3 horas. Em intervalos regulares, monitorizou-se a quimioluminescência transferindo cada amostra para um contador de cintilações líquidas (Modelo Packard 1900 TR) 56 operado no modo de fotões simples, para determinar o "cpm", Experiências de controlo demonstraram que o sinal de "cpm" especifico foi completamente inibido por adição às amostras de 100 pg/ml de superóxido dismutase (Sigma Chemical Co„).

Uma caracteristica importante do receptor Fcy (RII) é o facto de ser activado por ligação de complexos imunológicos poliméricos; a IgG monomérica é ineficaz. Em consequência, células sanguíneas devem ter de ser expostas simultaneamente a properdina e anticorpo monoclonal anti-properdina para permitir a formação de complexos imunológicos e consequente activação celular via receptores Fcy.. Os resultados do ensaio de quimioluminescência demonstram que os níveis de superóxido em amostras de sangue diluído não estão significativamente aumentados relativamente aos níveis de controlo por adição de 5 pg/ml de properdina isoladamente ou de anticorpo monoclonal 100 nM isoladamente. Todavia, a adição simultânea de 5 pg/ml de properdina e de anticorpo monoclonal 100 nM às amostras de sangue diluido resulta num aumento acentuado da geração de superóxido relativamente aos níveis de controlo, indicando que ocorre activação celular via receptores Fcy. A C5a também activa a resposta de impulso oxidativo de neutrófilos via receptores da C5a, e amostras contendo C5a 10 nM foram controlos positivos neste ensaio. 0 anticorpo monoclonal anti-properdina humana tem uma especificidade de ligação para a proteína humana e não se liga à properdina de rato. De forma consistente com esta especificidade, a incubação de amostras de sangue com 5 pg/ml de properdina de rato e anticorpo monoclonal anti-humano 100 nM não 57 induziu um aumento da geração de superóxido .relativamente aos niveis de controlo. Os resultados deste estudo indicam que a activação de neutrófilos é mediada via ligação de complexos imunológicos properdina-anticorpo monoclonal a receptores Fcy em células, resultando numa libertação acrescida de elastase por adição do anticorpo monoclonal ao modelo do circuito de retorno com tubagem. Há várias estratégias potenciais que podem ser utilizadas na concepção de agentes de acordo com o presente invento que evitem interacções com receptores Fcy. Para agentes de anticorpos monoclonais, uma abordagem consiste em seleccionar o isotipo y4 de IgG humana durante a construção de um anticorpo humanizado. O isotipo y4 de IgG não se liga a receptores Fcy. Alternativamente, pode preparar-se geneticamente um agente de anticorpo monoclonal sem a região Fc, incluindo, por exemplo, anticorpos de cadeia simples e domínios de ligação a antigenes. Ainda outra abordagem consiste em remover quimicamente a região Fc de um anticorpo monoclonal utilizando digestão parcial com enzimas proteolíticas, desse modo gerando, por exemplo, fragmentos de anticorpos de ligação a antigenes tais como fragmentos Fab ou F(ab)2. Esses fragmentos e derivados de anticorpos de ligação a antigenes são igualmente úteis como inibidores potentes da activação do complemento pela via alternativa.

Neste estudo, utilizou-se proteólise para remover a região Fc do anticorpo monoclonal bloqueador anti-properdina descrito nos Exemplos acima, que é uma IgGl 58 murina. Especificamente, utilizou-se um procedimento para gerar F(ab)? a partir de IgGl murina utilizando digestão com ficina (Mariani, Μ., M. Camagna, L. Tarditi e E. Seccamani, 1991, Mol, Immunol, 2J3: 69-71}. A clivagem progressiva mediada por ficina deste anticorpo IgGl deu origem a uma espécie de 116 kD correspondente a F(ab)? e a outra espécie a 32 kD correspondente à região Fc clivada. Identificaram-se as condições de digestão com ficina que resultaram na geração de F(ab)2 com alto rendimento e na ausência total de qualquer banda de IgG Intacta detectável em géis de SDS-PAGE corados com Coomassie.

Comparou-se a potência deste fragmento F(ab)2 como inibidor da activação do complemento com a do anticorpo monoclonal anti-properdina intacto, utilizando o ensaio de hemólise de RBC de coelho como descrito no Exemplo 4. Os resultados mostraram que a preparação de anticorpo monoclonal digerido com ficina contendo o fragmento F(ab)2 tem essencialmente actividade inibidora idêntica à do anticorpo monoclonal intacto quando ambos são testados a 3,3 nM (inibição parcial) ou 6,7 nM (inibição completa). Adicionalmente, estes agentes anti-properdina têm potência essencialmente equivalente como inibidores da geração de C3 e sMAC no modelo de circuito de retorno com tubagem de derivação cardiopulmonar descrito no Exemplo 5.

Como mostrado na FIG. 8, quando se comparou a actividade de F(ab)2 com a do anticorpo intacto no ensaio de geração de superóxido utilizando sangue diluído, a adição às amostras de sangue diluído de anticorpo monoclonal intacto (100 nM) e properdina (5 pg/ml) resultou 59 num aumento acentuado da geração de superóxido relativamente aos níveis de controlo. Em comparação, a geração de superóxido nas amostras de sangue diluído após adição de F(ab)? {100 nM) e properdina (5 pg/ml) foi substancialmente reduzida e semelhante à geração de superóxido após a adição do F(ab>2 isoladamente (FIG. 8). Em instantes mais tardios (> 130 minutos), a geração de superóxido em ambas as amostras contendo F{ab)2 foi ligeiramente mais elevada do que nas amostras de controlo (FIG. 8) . Contudo, uma vez que a preparação de F{ab)2 não foi purificada para remover Fc contaminante ou quantidades vestigiais de anticorpo monoclonal intacto, pequenas quantidades desses contaminantes podem gerar uma pequena resposta residual. Os contaminantes de Fc podem ser removidos por métodos de purificação comuns, se desejado. Os resultados deste estudo demonstram que a geração de um fragmento de ligação a antigenes, como F(ab}2, pode eliminar essencialmente a activação de células sanguíneas via ligação de receptores Fcy. É interessante que este tipo de activação utilizando um anticorpo monoclonal anti-properdina não tenha sido notado com outros anticorpos monoclonais anti-complemento„ Por exemplo, verificou-se que um anticorpo monoclonal para C5 bloqueia as vias clássica e alternativa do complemento onde convergem em G5 (a via terminal do complemento) por bloqueio da clivagem de C5, prevenindo assim a produção de MAC e C5a (WO95/25540 [PCT/US95/03614]· Kinder et al., supra (1995)). 60

De acordo com o presente invento, podem ser rastreados e preparados agentes terapêuticos preferidos sem essa activação de receptores Fcy e que são particularmente eficazes em processos para a inibição selectiva da formação de produtos de activação da via alternativa do complemento. Adicionalmente, agentes de acordo com o presente invento são preferivelmente agentes que são selectivos quanto à sua inibição da formação de produtos de activação da via alternativa (isto é, que não inibem componentes da via clássica) e que não activam a via clássica do complemento. Complexos imunológicos, para além de activarem células via ligação a receptores Fcy, podem desencadear a via clássica da activação do complemento por ligação ao componente do complemento Cl. Para mostrar que a via clássica da activação do complemento não foi activada pelo anticorpo monoclonal bloqueador anti-properdina descrito acima, incubaram-se amostras em duplicado de soro humano normal (NHS) a 3 7°C, durante 120 minutos, com ou sem anticorpo monoclonal anti-properdina 200 nM (30 pg/ml). Aos 0, 30, 60 e 120 minutos, alíquotas de 50 μΐ foram removidas da mistura e queladas pela adição de EDTA para uma concentração final de 13 mM, de modo a interromper toda a activação do complemento dependente de magnésio e cálcio. Determinou-se a concentração do produto de activação do complemento C3a em todas as amostras utilizando um estojo ELISA, seguindo as instruções do fabricante (Quidel, N° catálogo A015). Nenhuma das amostras contendo o anticorpo monoclonal anti-properdina tinha níveis elevados de C3a, em comparação com amostras de controlo correspondentes. Estes resultados demonstram que o anticorpo monoclonal bloqueador anti-properdina não desencadeia a activação da via 61 clássica. Suplementarmente, estes resultados sugerem que os determinantes estruturais em complexos imunológicos reconhecidos por Cl são diferentes dos reconhecidos por receptores Fcy. Em consequência, agentes preferidos de acordo com o invento são agentes que não activam substancialmente receptores Fcy nem a via clássica do complemento, como mostrado aqui. EXEMPLO 7: Activação da Via Clássica: Complexos Heparina -Protamina

Foi mostrado que a adição de protamina a sangue heparinizado activa a via clássica do complemento (Cavarocchi, N.C., H.V. Schaff, T.A. Orszulak, H.A.

Homburger, W.A. Schnell e J,R. Pluth, 1985, Surgery 98: 525-531}. Assim, a activação do complemento ocorre não só durante a circulação do sangue através da tubagem de um circuito de derivação, como o utilizado no Exemplo 5 acima, mas também após a adição de protamina (para neutralizar a heparina anti-coagulante) no final do procedimento de CPB. Para avaliar o efeito da protamina na geração de MAC solúvel, sangue heparinizado foi incubado em tubos a 37°C, durante 60 minutos, com 100 pg/ml de protamina, na ausência ou presença de um anticorpo monoclonal bloqueador anti-properdina como descrito nos Exemplos 1-5 acima. As amostras foram processadas e analisadas quanto à geração de sMAC utilizando um estojo de ELISA e seguindo as instruções do fabricante (Quidel, N° Catálogo A009).

Como mostrado na FIG. 9, o anticorpo monoclonal anti-properdina inibe a activação do complemento iniciada 62 por complexos heparina-protamina, nas condições em que sangue fresco heparinizado foi incubado como descrito acima em tubos a 37°C durante 60 minutos com 100 pg/ml de protamina, na ausência ou presença de de anticorpo monoclonal anti-properdina 13, 66, 200 ou 330 nM e como detectado por geração de sMAC.

Uma vez que a activação do complemento ocorre não só durante o movimento de sangue através de um circuito de derivação mas também após a adição de protamina para completar o procedimento de CPB, e porque esta ultima activação envolve a via clássica do complemento (Cavarocchi, N.C., H.V. Schaff, T.A. Orszulak, H.A. Homburger, W.A. Schnell e J.R. Pluth, 1985, Surgery 98: 525-531), foi inesperado que um agente anti-properdina especifico para a via alternativa conseguisse atenuar ou inibir substancialmente a produção de produtos de activação do complemento desencadeada por complexos heparina-protamina, como mostrado na FIG. 9,

Apesar de ter sido sugerido que a via alternativa poderia contribuir, em alguma extensão, para a produção iniciada pela via clássica de produtos de activação terminal, porque a C3 convertase da via alternativa pode, em teoria, ser reunida a partir de C3b gerada na cascata clássica, tem havido uma escassez geral de dados experimentais respeitantes a esta hipótese. Um estudo relativamente recente abordou mais definitivamente a questão da contribuição da via alternativa para a via clássica, particularmente no que se refere ao papel da properdina. Especificamente, Fredrikson et al. (1993) J. 63

Immunol. Methods 166: 263-270, examinaram o efeito da deficiência de properdina na quantidade de MAC gerado após activação da via clássica. Os seus resultados revelam que a ausência de properdina no soro não teve nenhum efeito na produção de MAC pela via clássica. Em contraste, a depleção de componentes da via clássica (isto é, Clq, C2, C.4) aboliu completamente a geração de MAC no seu sistema de ensaio. Estes resultados indicam que a inibição da acção da properdina com um agente anti-properdina não deve ter nenhum efeito na produção de espécies do complemento activado após iniciação da via clássica por complexos protamina-heparina. Esta interpretação é suplementarmente suportada pelo trabalho de Soderstrom, C., J.H. Braconier, D. Danielsson e A.G. Sjoholm, 1987, J. Infect. Dis. 156: 107-112, que mostraram que reacções bactericidas no soro mediadas pela via clássica do complemento não estavam enfraquecidas em soro deficiente em properdina. Estes resultados ensinam especificamente que a inibição da acção da properdina deve ter pouco, se tiver algum, efeito na produção de proteínas de activação do complemento após iniciação da via clássica do complemento. De forma mais geral, estes dados implicam que a via alternativa contribui de forma desprezável para a produção induzida pela via clássica de produtos de activação do complemento. Esta interpretação mais geral é suportada pelo trabalho de Clardy, C.W., 1994, Infect. Immun. 62^: 4549-4555, que relatou que um anticorpo para o componente específico da via alternativa, factor B, não teve nenhum efeito na activação do complemento pela via clássica. 64

De acordo com o que se observa durante CPB clínica e como mostrado acima, a adição de protamina a sangue humano heparinizado provoca activação significativa do complemento, medida pela produção de sMAC (FIG. 9) . De forma notável, a adição do anticorpo anti-properdina ao sangue heparinizado antes da adição de protamina resulta em inibição quase completa da formação de sMAC (FIG. 9) e demonstra que um agente anti-properdina é eficaz na redução de complicações pós-perfusão associadas a CPB, uma vez que é capaz de inibir ambas as vias clássica e alternativa do complemento. EXEMPLO 8:_Activação da Via Clássica: Complexos

Imunológicos A via clássica do complemento é tipicamente desencadeada por complexos imunológicos, por exemplo, um anticorpo ligado a uma partícula estranha, e, assim, requer exposição prévia a essa partícula para a geração do anticorpo específico. Há quatro proteínas do plasma envolvidas nos passos iniciais da via clássica: Cl, C.2, C4 e C3. A interacção de Cl com as regiões Fc de IgG ou IgM em complexos imunológicos activa uma Cl protease que pode clivar a proteína do plasma C4, resultando nos fragmentos C4a e C4b. A C4b pode ligar-se a outra proteína do plasma, C2. A espécie resultante, C4b2, é clivada pela Cl protease para formar a C3 convertase da via clássica, C4b2a. A adição do produto de clivagem de C3, C3b, à C3 convertase conduz à formação da C5 convertase da via clássica, C4b2a3b. Para avaliar o efeito de complexos imunológicos na geração de C3a e MAC solúvel, prepararam-se complexos 65 imunológicos incubando IgG de coelho anti-ovalbumina (28 mg) (Biodesign, Kennebunk, ME) e ovalbumina (0,67 mg) (Sigma Chemical Company) em 3 ml de PBS durante 3 dias a 4°C, para permitir precipitação máxima. Experiências preliminares demonstraram que esta razão de reagentes corresponde ao ponto de equivalência para a reacção antigene-anticorpo. O precipitado foi recolhido por centrifugação a 15 000 rpm, durante 5 minutos a 4°C, e foi lavado 3 vezes por nova suspensão em 5ml de PBS e nova centrifugação. O precipitado final foi novamente suspenso em PBS, a 1 mg/ml, e foi congelado em aliquotas a -70°C. A análise de SDS-PAGE confirmou que o precipitado contém essencialmente apenas anticorpo e antigene.

Para testar o efeito de um anticorpo monoclonal anti-properdina em condições de activação do complemento em que a via clássica é iniciada por complexos imunológicos, amostras de 50 μΐ em triplicado contendo ΝΗΞ 90% foram incubadas a 37 °C na presença de 10 μg/ml de complexo ímunológico (IC) ou PBS, e amostras paralelas em triplicado (+/- IC) também continham anticorpo monoclonal anti-properdina 200 nM durante a incubação a 37°C. Após duas horas de incubação a 37°C, adicionou-se EDTA 13 mM a todas as amostras para interromper activação do complemento suplementar, e as amostras foram imediatamente arrefecidas para 5°C. Armazenaram-se as amostras a -70oC. antes de serem avaliadas quanto a produtos de activação do complemento (C3a e sC5b-9) utilizando estojos de ELISA (Quidel, N°s Catálogo A015 e AQ09), seguindo as instruções do fabricante. Os resultados de um ensaio de sMAC estão apresentados na FIG. 10. 66

Surpreendentemente, a adição de um anticorpo monoclonal anti-properdina ao soro antes da adição de complexos imunológicos inibiu substancialmente (por exemplo, â 50%) a formação de C3a e sMAC (aproximadamente 80% para sMAC, como mostrado na F1G. 10) . De modo semelhante aos resultados descritos no Exemplo 7 acima com complexos heparina-protamina, foi igualmente inesperado que um agente anti-properdina especifico para a via alternativa conseguisse atenuar ou inibir substancialmente a produção de espécies do complemento activado após iniciação da via clássica por complexos imunológicos, como mostrado na FIG. 10. EXEMPLO 9: Derivação Cardiopulmonar; Circulação Extra-

Corporal Esc Vivo

Para confirmar suplementarmente a utilidade de agentes anti-properdina, incluindo agentes de anticorpos anti-properdina, na redução da activação do complemento durante CPB e outros procedimentos extra-corporais, que envolvem fazer passar sangue em circulação de um vaso sanguíneo de um sujeito através de uma conduta e novamente para um vaso sanguíneo do sujeito, realizaram-se estudos em que se fez passar sangue humano recolhido de fresco através de um circuito idêntico ao que é tipicamente utilizado durante procedimentos cirúrgicos que requerem circulação extra-corporal pediátrica. Utilizou-se nestes estudos um agente anti-properdina F{ab)2 preparado como descrito no Exemplo 6. 67

Montaram-se os circuitos extra-corporais pediátricos utilizando um oxigenador membranar pediátrico de fibras ocas (oxigenador Lilliput), tubagem de cloreto de polivinilo, conectores de policarbonato e uma bomba de rolamentos minimamente oclusiva. 0 oxigenador e o sistema do circuito foram iniciados com 400 ml de Plasmalyte. Recolheu-se sangue {225 ml) de um voluntário saudável para uma embalagem de transferência contendo 1000 U de heparina, que depois foi adicionado ao circuito extra-corporal. Para estudos de inibição do complemento durante circulação extra-corporal, uma preparação de F(ab)2 de um anticorpo monoclonal anti-properdina em PBS (-25 pg/ml de sangue) foi adicionada à embalagem de transferência imediatamente antes da adição do sangue ao circuito extra-corporal. À medida que o sangue foi introduzido no reservatório via o porto de iniciação, 225 ml de fluido de iniciação foram simultaneamente recolhidos de forma distai ao orifício de descarga do oxigenador, para originar um volume final do circuito de 400 ml e um hematócrito final de 20%. O sangue foi circulado com fluido de iniciação, obtendo-se mistura completa em 2 minutos. Recolheu-se uma amostra de referência, tendo sido designada tempo 0. O circuito foi mantido a 37°C durante 30 minutos, depois foi arrefecido para 28°C durante cinco minutos e mantido a essa temperatura durante 60 minutos, após o que foi novamente aquecido para 37°C durante 60 minutos adicionais. Recolheram-se amostras de sangue em múltiplos instantes durante a recirculação. Prepararam-se amostras de soro por centrifugação imediata, tendo sido armazenadas a -70°C em alíquotas até serem avaliadas quanto a C3a ou sMAC via estojos de ELISA, seguindo as instruções do fabricante 68 (Quidel: estojo de C3a, N° Catálogo A015; estojo de sMAC, N° Catálogo A009), ou elastase dos neutrófilos utilizando um ensaio ELISA como descrito por Brower, M.S. e P.C. Harpel, 1983, Blood J51.: 842-849.

Como mostrado na FIG. 11, uma preparação de F(ab)2 de um anticorpo monoclonal bloqueador anti-properdina inibe a activação do complemento num modelo ex vivo de C.PB em que sangue humano fresco foi bombeado através de um circuito de derivação pediátrico, quer na ausência (círculos fechados} quer na presença (círculos abertos) de uma preparação de F(ab)2 de um anticorpo monoclonal anti-properdina. Como descrito acima, recolheram-se amostras de sangue em vários instantes durante o procedimento de derivação, tendo sido analisadas quanto a sMAC, C3a ou complexos elastase-anti-tripsina,

Para este estudo, os dois circuitos de derivação utilizados foram ligados a uma bomba não pulsatória comum, de modo que o fluxo de sangue foi idêntico nos dois sistemas. Enquanto um circuito continha sangue não tratado, o outro continha sangue ao qual se adicionou o agente anti-properdina antes do início da circulação. Adicionalmente, neste estudo utilizou-se uma preparação de F(ab)2 do anticorpo monoclonal anti-properdina para assegurar que complexos properdina-anti-properdina não desencadeassem acontecimentos celulares de transdução do sinal por ligação a receptores Fcy. Preparou-se este fragmento de anticorpo F(ab)2 por clivagem proteolítica com ficina, como descrito no Exemplo 6. Podem utilizar-se metodologias proteolíticas comuns, bem como metodologias recombinantes comuns, para 69 preparar proteínas à base de anticorpos, incluindo fragmentos, derivados, anticorpos de cadeia simples (SCA) e domínios de ligação a antxgenes sem a porção Fc da imunoglobulina, que permite a ligação a receptores Fcy (Janeway, C. e P. Travers, Jr., 1994, " Immunobiology: The

Immune System in Health and Disease" páginas 3:28-3:30. Garland Publishing, Inc., Nova Iorque). Alternativamente, a ligação potencial de anticorpos terapêuticos a receptores Fcy pode ser eliminada, se desejável ou necessário, utilizando anticorpos da subclasse y4 de IgG, que não interagem com estes receptores (Janeway, C. e P. Travers, Jr., supra (1994)).

Como demonstrado na FIG. 11, o início do fluxo de sangue neste modelo ex vivo de CPB resultou na produção rápida de sMAC. e C3a, em que os níveis destes componentes do complemento activado aumentaram em função do tempo de derivação. De modo semelhante, os níveis no sangue de complexos elastase-anti-tripsina, um marcador da activação de neutrófilos {Finn, A., S. Naik, N. Klein, R.J. Levinsky, S. Strobel e M. Elliott, 1993, J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 105: 234-241), aumentaram com o tempo de circulação no circuito de CPB (FIG. 9). Foi postulado que a activação de neutrófilos durante a CPB resulta da ligação de espécies de activação do complemento a estas células (Rinder, C.S., H.M. Rinder, B.R. Smith, J.C.K. Fitch, M.J. Smith, J.B. Tracey, L.A. Matis, S,P. Squinto e S.A, Rollxns, S.A., 1995, J. Clin. Invest. 96: 1564-1572; Wan, S., J.-L.

LeClerc e J.-L. Vincent, 1997, Chesb 112: 676-692). O circuito paralelo contendo sangue tratado com a preparação de anticorpo monoclonal anti-properdina de F(ab)2 exibiu 70 essencialmente nenhuma activaçâo do complemento, como revelado pela ausência virtual de sMAC e C3a em todos os instantes da derivação. De forma importante, o F(ab>2 anti-properdina também causou uma redução da activaçâo de neutrófilos, demonstrada pela redução dos níveis no sangue do complexo elastase-antí-tripsina (FIG. 11) „ Estes resultados confirmam os resultados obtidos com o modelo de circuito de retorno com tubagem descrito no Exemplo 5 acima. Estes resultados demonstram suplementarmente que um agente anti-properdina sem a capacidade de activaçâo de receptores Ecy reduz efectivamente a activaçâo do complemento e acontecimentos inflamatórios celulares relacionados resultantes de circulação extra-corporal e subsequente complexação de heparina com protamina.. EXEMPLO 10: Agentes Bloqueadores: Rastreio de Péptidos Derivados da Properdina Vários decapéptidos da properdina humana, descritos por Fredrikson et ai. supra {1996} J. Immunol „ 157: 3666-3671, foram preparados e testados quanto à sua capacidade para bloquear os efeitos da activaçâo da via alternativa do complemento como descrito para anticorpos anti-properdina nos Exemplos acima. Especificamente, estes péptidos derivados da properdina foram avaliados quanto à sua capacidade para inibir a formação de MAC num ensaio ELISA como descrito no Exemplo 3. 0 péptido 1, que consistiu nos aminoácidos 43-52 da properdina {P.M. 1158), o péptido 2, que consistiu nos aminoácidos 48-57 da properdina {P.M. 1320) , e o péptido 3, que consistiu nos aminoácidos 73-82 da properdina (P.M. 1309), cada um reduziu a formação de 71 MAC neste ensaio, com valores IC50 de 268 μΜ, 335 μΜ e 242 μΜ, respectivamente. Em contraste, o péptido 4, que consistiu nos aminoácidos 218-227 da properdina (P.M. 1173), não inibiu de modo semelhante a formação de MAC neste ensaio (IC50 > 600 μΜ) . Quando se testaram estes quatro péptidos como descrito no Exemplo 2 acima, os péptidos 1, 2 e 3, mas não o péptido 4, bloquearam a ligação de C3bBb, com o IC50 para os 3 péptidos bloqueadores situado na gama de cerca de 400-600 μΜ.

Num estudo prévio de Fredrikson et al. supra (1996) l7„ Immunol. 15 7: 3666-3671, para caracterizar uma proteína da properdina com disfunção de um paciente com deficiência em properdina de Tipo III, foram sintetizados 87 decapéptidos com sobreposição da properdina humana, incluindo os quatro péptidos descritos acima. Quando estes péptidos foram avaliados, às concentrações de 0-200 μg/mlt quanto à sua capacidade para competir com a ligação da properdina a placas revestidas com C3b, Fredrikson et al. supra (1996) determinaram que cinco péptidos, designados 9, 10, 15, 44 (correspondentes aos péptidos 1, 2, 3 e 4 aqui) e 81 competem com a properdina para a ligação a C3. Estes péptidos não foram testados em ensaios de actívação do complemento, como o ensaio de formação de MAC descrito acima.

Uma vez que foi agora demonstrado, de acordo com o presente invento, que a properdina é um componente crítico para a activação da via alternativa, agentes anti-properdina, incluindo péptidos derivados da properdina, 72 podem ser rastreados, identificados e seleccionados quanto à sua capacidade para bloquear a activação da via alternativa, como demonstrado aqui, por exemplo, bloqueando a formação de MAC. Visto que o ensaio de rastreio mostrou que a inibição da formação de MAC foi essencialmente completa às concentrações de péptidos mais elevadas, foi novamente demonstrado que a properdina é necessária para a activação da via alternativa. Agentes anti-properdina, incluindo péptidos derivados da properdina, podem ser identificados de acordo com o presente invento como agentes eficazes num processo para inibir selectívamente a geração (isto é, formação ou produção} de um produto de activação da via alternativa do complemento num sujeito, quer tenha sido iniciada a via alternativa ou a via clássica, incluindo em sujeitos com uma variedade de estados e condições de doença, bem como complicações de uma variedade de procedimentos médicos, e incluindo sujeitos com lesões patológicas agudas e/ou crónicas, como descrito e referido aqui. EXEMPLO 11: Agentes Bloqueadores: Rastreio e Identificação

Agentes que bloqueiam selectívamente a formação de produtos de activação do complemento pela via alternativa do complemento, incluindo anticorpos anti-properdina humana preferidos, podem ser obtidos e depois rastreados, identificados e seleccionados, como ensinado aqui, quanto à sua capacidade para bloquear substancialmente ou completamente a formação ou produção de produtos de activação dependentes da via alternativa do complemento, 73 incluindo em condições envolvendo a iniciação da via clássica do complemento.

Sete anticorpos monoclonais anti-properdina humana comercialmente disponíveis foram rastreados quanto à actividade bloqueadora; (1) Quidel anti-Factor P humano #1 (A233); (2) Quidel anti-Factor P humano #2 (A235); (3) Dako (Santa Barbara, CA) anti-Factor P humano (M0837); (4) Seriim Institute (Copenhaga, Dinamarca) anti-Factor P humano {HYB039 Clone 06); (5) Serum Institute anti-Factor P humano (HYB039 Clone 04); (6) Biogenesis (Poole, R.O.) anti-Factor P humano (Clone 10-18) [igual a Quidel #1], e Biogenesis anti-Factor P humano (Clone 10-24) [igual a Quidel #2]. Cada um destes sete anticorpos conseguiu ligar-se à properdina com afinidade elevada (KD « 0,1 - 1 nM) . No entanto, apenas o anticorpo monoclonal Quidel P#1 (e o anticorpo monoclonal idêntico (Clone 10-18) da Biogenesis) bloqueou completamente a activação do complemento pela via alternativa, detectado por inibição completa da formação de MAC. Verificou-se que o Serum Institute HYB039 clone 04 bloqueou apenas parcialmente, e o aumento da concentração deste anticorpo monoclonal não atingiu o bloqueio completo. Este anticorpo monoclonal cie bloqueio parcial e o anticorpo monoclonal Quidel tfl de bloqueio completo têm afinidades de ligação comparáveis para a properdina (KD * 0,1 - 0,2 nM). Em consequência e de acordo com o presente invento, agentes são eficazmente rastreados quanto a actividade de bloqueio essencialmente completa, parcial ou nula em um ou mais ensaios como descrito aqui, incluindo bloqueio da ligação de C3b (Exemplo 1), bloqueio da ligação de C3bBb (Exemplo 2), bloqueio da formação de MAC dependente da via 74 alternativa (Exemplos 3 e 5-7), bloqueio da hemólise dependente da via alternativa (Exemplo 4), bloqueio da formação de C3a dependente da via alternativa (Exemplos 5-7) ou bloqueio de um ou mais marcadores da activação celular dependente da via alternativa (Exemplo 7), incluindo marcadores da activação de leucócitos (por exemplo, elastase-anti-tripsina, CDllb/CDlB), activação de plaquetas (por exemplo, selecção de P, GPIIIa, GPIb (CD45b), GPIIb) e adesão plaquetas-leucócitos. Os agentes podem ser suplementarmente rastreados quanto à ausência de activação de receptores Fcy e/ou activação da via clássica (Exemplo 6).

Lisboa 07/11/2006

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Agente seleccionado entre um anticorpo anti-properdina, um fragmento de ligação a antigenes de um anticorpo anti-properdina ou um péptido derivado da properdina, cujo agente não activa substancialmente um receptor Fcy, para utilização na inibição terapêutica da activação alternativa do complemento.
2. Agente de acordo com a reivindicação 1 para utilização no tratamento de estados ou condições de doença agudos ou crónicos, lesões patológicas agudas ou crónicas ou complicações de procedimentos médicos num sujeito.
3. Agente de acordo com as reivindicações 1 ou 2 que inibe a estabilização induzida pela properdina da C3 convertase.
4. Agente de acordo com a reivindicação 3, cujo agente inibe a ligação da properdina a C3b.
5. Agente de acordo com a reivindicação 4, em que a C3b está na forma de C.3bBb.
6. Agente de acordo com a reivindicação 4, em que a C3b está localizada no plasma ou fluido intersticial de um sujeito. 1
7. Agente de acordo com a reivindicação 6 para administração no plasma ou fluido intersticial do sujeito.
8. Agente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 7 para inibir a formação de um produto de activação da via alternativa do complemento.
9. Agente de acordo com a reivindicação 8 para utilização na inibição dos efeitos adversos da activação da via alternativa do complemento num sujeito.
10. Agente de acordo com a reivindicação 8 para utilização na inibição dos efeitos adversos da activação da via clássica do complemento num sujeito onde a via clássica do complemento está iniciada.
11. Agente de acordo com a reivindicação 10, em que o agente inibe a C3 convertase da via alternativa.
12. Agente de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 até 11, em que o produto de activação da via alternativa do complemento é MAC, C3a ou C5a.
13. Agente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 12, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal..
14. Agente de acordo com a reivindicação 1 ou 2 seleccionado entre um anticorpo monoclonal sem a região Fc, um anticorpo monoclonal de cadeia simples, um fragmento Fab 3 ou F(ab>2 de um anticorpo monoclonal ou o isotipo γ4 de IgG humana de um anticorpo monoclonal.
15. Agente de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 até 14, em que o sujeito é um sujeito humano.
16. Agente de acordo com a reivindicação 15, em que o complemento do sujeito humano foi activado.
17. Agente de acordo com a reivindicação 16, em que a activação do complemento ocorre via uma lesão patológica aguda, incluindo enfarte do miocárdio, síndroma da dificuldade respiratória aguda, lesão por queimadura, acidente vascular cerebral, pancreatite, derivação cardiopulmonar ou isquemia/lesão de reperfusào.
18. Agente de acordo com a reivindicação 16, em que a activação do complemento contribui para um estado crónico, incluindo esclerose múltipla, artrite reumatóide, miastenia gravis ou doença de Alzheimer.
19. Composição farmacêutica compreendendo um agente seleccionado entre um anticorpo anti-properdina, um fragmento de ligação a antigenes de um anticorpo anti-properdina ou um péptido derivado da properdina, cujo agente não activa substancialmente um receptor Fcy, e um transportador farmaceuticamente aceitável.

20. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 19, compreendendo um agente de acordo com 4 qualquer uma das reivindicações 3-6 ou 11-14 e um transportador farmaceuticamente aceitável.

21. Utilização de um agente seleccionado entre um anticorpo anti-properdina, um fragmento de ligação a antigenes de um anticorpo antí-properdina ou um péptido derivado da properdina, cujo agente não activa substancialmente um receptor Fcy, ou de uma composição farmacêutica da reivindicação 19 ou 20, para o fabrico de um medicamento destinado a ser utilizado na inibição dos efeitos adversos da activação da via alternativa do complemento num sujeito, por inibição selectiva da formação de um produto de activação da via alternativa do complemento, ou destinado a ser utilizado na inibição dos efeitos adversos da activação da via clássica do complemento num sujeito onde a via clássica do complemento está iniciada, por inibição selectiva da formação de um produto de activação da via alternativa do complemento, ou destinado a ser utilizado na inibição da activação alternativa do complemento num método de tratamento de uma perturbação inflamatória aguda, uma lesão patológica aguda, incluindo enfarte do miocárdio, síndroma da dificuldade respiratória aguda, lesão por queimadura, acidente vascular cerebral, pancreatite, derivação cardiopulmonar ou isquemia/lesão de reperfusão, ou um estado crónico, incluindo esclerose múltipla, artrite reumatóide, miastenia gravis ou doença de Alzheimer num sujeito humano. 5

22. Utilização de acordo com a reivindicação 21, em que o agente inibe a C3 convertase da via alternativa.

23. Utilização de acordo com as reivindicações 21 ou 22, em que o produto de activação da via alternativa do complemento é MAC, C3a ou C5a..

24. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 até 23, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

25. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 até 24, em que o agente é seleccionado entre um anticorpo monoclonal sem a região Fc, um anticorpo monoclonal de cadeia simples, um fragmento Fab ou F(ab)2 de um anticorpo monoclonal ou o isotipo y4 de IgG humana de um anticorpo monoclonal.

26. Utilização de um agente seleccionado entre um anticorpo anti-properdina, um fragmento de ligação a antigenes de um anticorpo anti-properdina ou um péptido derivado da properdina, cujo agente não activa substancialmente um receptor Fcy, para o fabrico de um medicamento destinado a ser utilizado num processo para efectuar um procedimento médico num sujeito, cujo procedimento compreende: (a) fazer passar sangue em circulação de um vaso sanguineo do sujeito através de uma conduta e novamente para um vaso sanguineo do sujeito, em que a conduta tem uma superfície luminal compreendendo um material capaz de 6 causar pelo menos uma activaçâo de entre activaçâo do complemento, activaçâo de plaquetas, activaçâo de leucócitos ou adesão plaquetas-leucócitos no sangue do sujeito, e (b) introduzir o medicamento na corrente sanguínea do sujeito numa quantidade eficaz para reduzir pelo menos um entre activaçâo do complemento, activaçâo de plaquetas, activaçâo de leucócitos ou adesão plaquetas-leucócitos resultantes da passagem do sangue em circulação através da conduta, em que o passo (a) ocorre antes e/ou durante e/ou após o passo (b),

27. Utilização de acordo com a reivindicação 26, em que o agente reduz a conversão dependente da via alternativa do componente do complemento C3 nos componentes do complemento C3a e C3b, a formação dependente da via alternativa de C5b-C9 ou a activaçâo de leucócitos dependente da via alternativa,

28. Utilização de acordo com a reivindicação 2 6, em que o agente se liga especificamente à properdina e inibe a C3 convertase da via alternativa.

29. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 até 28, em que o procedimento médico é um procedimento de circulação extra-corporal.

30. Utilização de acordo com a reivindicação 29, em que o procedimento de circulação extra-corporal é um procedimento de derivação cardiopulmonar. 7

31. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 até 30, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

32. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 até 31, em que o agente é seleccionado entre um anticorpo monoclonal sem a região Fc, um anticorpo monoclonal de cadeia simples, um fragmento Fab ou F(ab)2 de um anticorpo monoclonal ou o isotipo y4 de IgG humana de um anticorpo monoclonal.

33. Artigo de produção compreendendo material de embalagem e um agente farmacêutico contido no material de embalagem, em que: (a) o agente farmacêutico compreende um agente seleccionado entre um anticorpo anti-properdina, um fragmento de ligação a antigenes de um anticorpo anti-properdina ou um péptido derivado da properdina, cujo agente não activa substancialmente um receptor Fcy, para utilização na redução terapêutica de pelo menos uma activação de entre activação do complemento, activação de plaquetas, activação de leucócitos ou adesão plaquetas-leucócitos causados por passagem de sangue em circulação de um vaso sanguíneo do sujeito através de uma conduta e novamente para um vaso sanguíneo do sujeito, em que a conduta tem uma superfície luminal compreendendo uma activação de material capaz de causar pelo menos um entre activação do complemento, activação de plaquetas, activação 8 de leucócitos ou adesão plaquetas-leucócitos no sangue do sujeito, e (b) o material de embalagem compreende uma etiqueta que indica que o agente farmacêutico se destina a ser utilizado em associação com um procedimento de circulação extra-corporal.

34. Artigo de produção da reivindicação 33, em que a etiqueta indica que o agente farmacêutico se destina a ser utilizado em associação com um procedimento de derivação cardiopulmonar.

35. Método de rastreio e selecção de um anticorpo anti-properdina, um fragmento de ligação a antigenes de um anticorpo anti-properdina ou um péptido derivado da properdina, cujo método compreende os passos seguintes: (a) avaliar o agente quanto à sua capacidade para inibir a formação de um produto de activação da via alternativa do complemento, e (b) seleccionar o agente que inibe a formação de um produto de activação da via alternativa do complemento.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, que compreende os passos seguintes: (a) avaliar o agente quanto à sua capacidade para inibir a formação de um produto de activação da via alternativa do complemento; 9 (b) avaliar o agente quanto à sua capacidade para activar receptores Fcy, e (c) seleccionar o agente que inibe a formação de um produto de activação da via alternativa do complemento e que não activa substancialmente receptores Fcy.

37. Método de acordo com a reivindicação 35 ou 36, em que o produto de activação da via alternativa do complemento é MAC, C3a ou C5a.

38.. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 até 37, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

39. Método de acordo com a reivindicação 38, em que o agente é seleccionado entre um anticorpo monoclonal sem a região Fc, um anticorpo monoclonal de cadeia simples, um fragmento Fab ou F(ab)2 de um anticorpo monoclonal ou o isotipo y4 de IgG humana de um anticorpo monoclonal. Lisboa, 07/11/2006 1/12

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0.8 - Eiastase dos Neutrófilos Μ

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