KR20140064768A

KR20140064768A - 항-프로퍼딘 항체 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20140064768A
Application number: KR1020147002837A
Authority: KR
Inventors: 웬차오 송
Original assignee: 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아
Priority date: 2011-07-01
Filing date: 2012-06-29
Publication date: 2014-05-28
Also published as: EP2726103A2; CN103796664A; AU2012279288A1; EP2726103B1; US20170334980A1; WO2013006449A2; JP6293659B2; AU2012279288B2; US20140212427A1; US9701742B2; ES2701075T3; WO2013006449A3; JP2014522845A; EP2726103A4

Abstract

본 발명은 항-프로퍼딘 항체를 사용한 보체 시스템의 대체 경로 (AP)의 선택적 억제에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 개체를 항-프로퍼딘 항체와 접촉시킴으로써 개체에서의 AP-매개 병리상태 또는 AP-매개 상태의 치료 방법에 관한 것이다.

Description

항-프로퍼딘 항체 및 그의 용도{ANTI-PROPERDIN ANTIBODIES AND USES THEREOF}

발명의 배경

보체 시스템은 침입 병원체에 대항하는 숙주 방어의 제1 라인을 제공한다. 보체는 또한 인간 염증성 질환에서 병원성 역할을 한다. 보체 시스템의 활성화는 세 가지 상이한 경로, 즉 고전(classical) 경로 (CP), 렉틴(lectin) 경로 (LP) 및 대체(alternative) 경로 (AP)를 통해 발생한다. CP는 항원-항체 결합에 의해 개시된다. LP는 만노스-결합 렉틴 (MBL)이 미생물 상의 표면 당 분자와 상호작용하는 경우 작동된다. 양 경로의 활성화는 CP C3 컨버타제 C4b2a의 어셈블리를 유도하지만, MBL-관련 세린 프로테아제에 의한 C3의 직접 절단이 또한 발생할 수 있다. AP는 AP C3 컨버타제인 C3bBb에 의해 작동되는 자가-증폭 루프이다. AP 활성화는 CP 또는 LP 활성화에 대해 이차적으로 발생할 수 있거나, 또는 독립적으로 개시된다. 후자의 경우, 낮은 수준의 자발적(spontaneous) C3 '무부하(tick-over)'가 초기 C3bBb를 발생시키는데, 이는 적당한(adequate) 조절의 부재하에 AP를 급속히 전파시킨다. 따라서, 음성 조절이 전혀 없거나 또는 불충분한 비-자가(self) 표면의 AP 활성화는 초기설정 프로세스로 고려되는 반면 자가(autologous) 세포는 전형적으로 다중 막-결합된 유체 상 보체 억제 단백질의 도움으로 이러한 결과를 방지하는 것으로 일반적으로 추정된다. 특정한 조건 하에, 변경되거나, 손상되거나 또는 스트레스받은 자가 세포 및 조직은 또한 AP를 활성화시키고 염증성 손상을 유발할 수 있다.

다수의 억제 단백질의 존재와 달리, 혈장 단백질 프로퍼딘은 보체 활성화 캐스케이드의 유일하게 공지된 양성 조절제이다. 프로퍼딘은 5-10 μg/ml의 추정 혈중 농도를 갖는, 대략 53 kDa의 혈장 당단백질이다. 이는 대부분 고정된 비율의 이량체, 삼량체 및 사량체로서 두미식(head-to-tail) 입체형태로 존재한다. 프로퍼딘 기능에 대한 현재의 관점은 그가 신생 C3bBb 컨버타제의 반감기를 연장함으로써 AP 활성화를 용이하게 한다는 것이다. 이러한 관점에 따라, 프로퍼딘은 AP 활성화를 용이하게 하지만 필수적이진 않은 역할을 한다. CP 및 LP의 활성화는 AP 증폭 루프를 예외없이 작동시킬 것이므로, 프로퍼딘은 또한 CP- 및 LP-매개된 보체 활성화를 간접적으로 촉진시킬 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명 이전의 일반적인 인식에 기초하여, 당업자는 프로퍼딘이 특이성이 결핍되고 보체 활성화에 필수적이지 않기 때문에 프로퍼딘을 매력적인 항-보체 치료 표적으로서 고려하지 않을 수 있다.

보체 활성화의 모든 세 가지 경로는 숙주가 미생물 감염에 맞서 싸우는데 도움을 주지만, 최근 연구는 인간에서 보체-매개된 병리상태, 예를 들어 연령-관련 황반 변성, 비정형적 용혈성 요독성 증후군, 발작성 야간 혈색소뇨 (PNH), 류마티스 관절염, 알레르기성 천식 및 허혈 재관류 손상이 주로 AP에 의해 매개됨을 밝혀냈다. 따라서, 당업계에서는 AP를 선택적으로 억제하되 CP 및 LP는 무손상 상태로 남겨두어 병원체와 싸우고 숙주를 감염으로부터 보호하게 함으로써 인간 염증성 질환을 치료하는 방법 및 이를 위한 항-보체 조성물이 여전히 필요한 실정이다. 본 발명은 상기 요구를 충족시킨다.

개요

본 발명은 항-프로퍼딘 항체 및 항-프로퍼딘 항체를 사용하는 보체의 대체 경로 (AP)의 억제 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 프로퍼딘에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 조성물이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 프로퍼딘은 인간 프로퍼딘이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간화 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 키메라 항체이다.

한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 VH-CDR1: 서열 3; VH-CDR2: 서열 4; VH-CDR3: 서열 5; VL-CDR1: 서열 8; VL-CDR2: 서열 9; 및 VL-CDR3: 서열 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 적어도 하나의 서열 52의 아미노산을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 VH-CDR1: 서열 13; VH-CDR2: 서열 14; VH-CDR3: 서열 15; VL-CDR1: 서열 18; VL-CDR2: 서열 19; 및 VL-CDR3: 서열 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR 중 적어도 하나를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 적어도 하나의 서열 53의 아미노산을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 VH-CDR1: 서열 23; VH-CDR2: 서열 24; VH-CDR3: 서열 25; VL-CDR1: 서열 28; VL-CDR2: 서열 29; 및 VL-CDR3: 서열 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 VH-CDR1: 서열 33; VH-CDR2: 서열 34; VH-CDR3: 서열 35; VL-CDR1: 서열 38; VL-CDR2: 서열 39; 및 VL-CDR3: 서열 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 44의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 44의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 49의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 51의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 49의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 51의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 2 및 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 7 및 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 2 및 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 7 및 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 12 및 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 17 및 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 12 및 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 17 및 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 22 및 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 27 및 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 22 및 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 27 및 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 32 및 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 37 및 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 32 및 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 37 및 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 항체는, 프로퍼딘에 결합하여 본원에 기재된 항-프로퍼딘 항체 중 하나 이상의 결합과 경쟁하는 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는, 프로퍼딘에 결합하여 mAb 19.1로 지정된 항체의 프로퍼딘에 대한 결합과 경쟁하는 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는, 프로퍼딘에 결합하여 mAb 25로 지정된 항체의 프로퍼딘에 대한 결합과 경쟁하는 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는, 프로퍼딘에 결합하여 mAb 22.1로 지정된 항체의 프로퍼딘에 대한 결합과 경쟁하는 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는, 프로퍼딘에 결합하여 mAb 30으로 지정된 항체의 프로퍼딘에 대한 결합과 경쟁하는 항체이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은, 개체에게 본원에 기재된 항-프로퍼딘 항체 중 하나 이상을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 대체 경로 (AP)-매개된 병리상태를 치료하는 방법이다. 다양한 실시양태에서, 대체 경로 (AP)-매개된 병리상태는 황반 변성, 허혈 재관류 손상, 관절염, 류마티스 관절염, 발작성 야간 혈색소뇨 (PNH) 증후군, 비전형적 용혈성 요독성 (aHUS) 증후군, 천식, 기관 이식 패혈증, 염증, 사구체신염, 루푸스 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 적어도 선택된다. 일부 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 대체 경로를 선택적으로 억제하지만, 고전적 경로 및 렉틴 경로를 억제하지는 않는다. 일부 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 고전적 경로 및 렉틴 경로의 AP 증폭 루프에 영향을 미치지 않는다. 일부 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 C3bBb 단백질의 생성을 억제한다.

한 실시양태에서, 본 발명은, 인간 프로퍼딘 (예를 들어, 서열 67; 서열 54)을 발현하지만, 뮤린 프로퍼딘을 발현하지 않는 트랜스제닉 마우스이다.

상기 발명의 요약 뿐만 아니라 하기 본 발명의 바람직한 실시양태의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명을 설명하기 위해서 본 발명의 바람직한 실시양태를 도면에 나타낸다. 그러나, 본 발명은 도면에 나타낸 실시양태의 정확한 배열 및 방법으로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 도면은 다음과 같다.
도 1은 보체 경로의 도식이다. 보체는 다음 3가지 경로를 통해 활성화될 수 있다: 고전적, 렉틴 및 대체 경로. 고전적 경로는 C1q가 항원에 부착된 항체에 결합할 때 활성화되며, C1r 및 C1s를 활성화시키고 C4 및 C2를 절단한다. 렉틴 경로는 만노스-결합 렉틱 (MBL)이 보존된 병원성 탄수화물 모티프와 만날 때 활성화되며, MBL-관련 세린 프로테아제 (MASP)를 활성화시키고 다시 C4 및 C2를 절단한다. C4 및 C2 절단 생성물은 고전적 및 렉틴 경로 C3 컨버타제인 C4bC2a를 형성하고, 이는 C3을 C3b 및 C3a로 절단한다. C3b의 제2 분자는 C4bC2a와 회합하여 고전적 및 렉틴 경로의 C5 컨버타제인 C4bC2aC3b를 형성할 수 있다. 대체 경로 (AP)는 C3이 자발적으로 가수분해될 때 활성화되고, 인자 B 및 D의 존재 하에 최초 AP C3 컨버타제인 C3(H2O)Bb를 형성하여, 추가적인 C3 절단, 및 AP C3 컨버타제 (C3bBb) 및 AP C5 컨버타제 (C3bBbC3b)의 최종 형성을 유발한다. 프로퍼딘은 AP 컨버타제를 안정화시켜 AP 활성화를 촉진한다. 3가지 경로는 모두 결국 컨버타제를 형성하며, 이는 보체 시스템의 주요 이펙터인 아나필라톡신 (C4a/C3a/C5a), 막 공격 복합체 (MAC) 및 옵소닌 (예를 들어, C3b)을 생성한다. 아나필라톡신은 C4, C3 및 C5의 절단으로부터 유래한 강력한 염증유발 분자이다. MAC는 표적화된 표면을 직접 용해시킬 수 있는 보체 성분 C5b 내지 C9의 말단 어셈블리이다. C3b는 옵소닌화된 표적의 식세포작용을 유도하고, 또한 AP를 통해 보체 활성화를 증폭시키는 역할을 한다.
도 2는 mAb 19.1, 22.1, 25 및 30에 의한 LPS-유도된 AP 보체 활성화의 용량-의존성 억제를 입증하는 실험의 결과를 나타낸다. mAb의 4종의 클론은 모두 5 μg/ml의 최종 농도로 50% 정상 인간 혈청 (NHS)에 첨가될 때 AP 보체 활성화를 효과적으로 억제하였다. EDTA가 첨가된 샘플 (NHSEDTA)은 음성 대조군의 역할을 하였다 (EDTA는 보체 활성화를 차단함). mAb가 첨가되지 않은 샘플 (0 Ab)은 기준선 AP 보체 활성화의 역할을 하였다. 본 실험을 GVB-EGTA-Mg++ 완충액에서 수행하였다. ELISA 플레이트를 LPS로 밤새 코팅하였다. NHS를 mAb와 함께 예비 인큐베이션한 후, 플레이트에 첨가하였다. 플레이트 상의 C3 침전량 (OD450)을 측정하여 AP 보체 활성화를 검출하였다.
도 3은, 항-인간 프로퍼딘 mAb가 fH 및 DAF 기능장애로 인한 인간 적혈구 (RBC) 용해를 억제한다는 것을 입증하는 실험의 결과를 나타낸다. 인간 RBC는 인간 혈청의 부재시 (Eh 단독) 용해되지 않는다. 또한, 이는 fH 19-20, 즉, 자가 세포와의 fH 상호작용을 막는 재조합 fH 단편의 부재시 (0fh1920) 인간 혈청 (50%)에 의한 용해에 저항성이 된다. 그러나, 인간 RBC를 30 μM fH 19-20 및 7.5 μg/ml의 기능-차단 항-붕괴 촉진 인자 (DAF, 막 보체 조절제) mAb의 존재 하에 50% 인간 혈청과 함께 인큐베이션하는 경우 (fh1920+항CD55), 약 70%의 RBC가 용해되었다. 상기 용해는 5 μg/ml의 4종의 항-프로퍼딘 mAb (19.1, 22.1, 25, 30) 각각에 의해 완전히 억제되었다. 증류수로 처리된 RBC 샘플 (Eh + DDW)은 완전한 용해를 유발하였고, 이는 양성 대조군의 역할을 하였다. EDTA로 처리된 정상 인간 혈청 내 RBC 샘플 (NHSEDTA)은 음성 대조군의 역할을 하였다 (EDTA가 보체 활성화를 차단하여 용해가 일어나지 않음). AP 보체 활성화만이 가능하도록 용해 검정을 Mg++-EGTA GVB++ 완충액에서 수행하였다.
도 4는 5 μg/ml의 항-프로퍼딘 mAb의 부재 또는 존재 하에 50% 정상 인간 혈청 (NHS)과 함께 인큐베이션된 항체-감작된 양 RBC를 평가하는 실험의 결과를 나타낸다. 인간 혈청이 첨가되지 않은 RBC의 샘플 (ShEs 단독)은 용해를 나타내지 않았고; 항-프로퍼딘 mAb가 첨가되지 않은 50% NHS와 함께 인큐베이션된 RBC는 완전한 용해를 나타내었으며 (50% NHS); 50% NHS, 및 5μg/ml의 mAb 19.1, 22.1, 25 또는 30과 함께 인큐베이션된 RBC도 또한 완전히 용해되었는데, 이는 mAb가 감작된 양 RBC의 고전적 경로-매개된 보체 용해에 억제 효과를 갖지 않았음을 입증한다. EDTA의 존재 하에 50% NHS와 함께 인큐베이션된 RBC (NHSEDTA)는 용해가 일어나지 않았는데, 이는 용해가 보체에 의해 매개되었음을 입증하고; 증류수로 처리된 양 RBC (Es+ DDW)는 100% 용해 대조군의 역할을 하였다.
도 5a-5c를 포함한 도 5는 mAb 19.1 및 25에 대한 에피토프 맵핑, 및 인간 프로퍼딘 (fP)의 결실 돌연변이체 생성의 결과를 나타낸다. 도 5a는 인간 프로퍼딘의 추정 아미노산 서열 (서열 54)을 나타낸다. 신호 펩티드에는 밑줄이 그어져 있다. 성숙 단백질은 잔기 28에서 시작한다. 도5b는 인간 프로퍼딘의 7 트롬보스폰딘 반복 (TSR) 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다. 이는 다음과 같다: TSR0 (서열 55), TSR1 (서열 56), TSR2 (서열 57), TSR3 (서열 58), TSR4 (서열 59), TSR5 (서열 60), TSR6 (서열 61). 도 5c는 mAb 19.1 및 25에 대한 에피토프 맵핑, 및 인간 프로퍼딘 (fP)의 결실 돌연변이체 생성의 결과를 나타낸다. 인간 프로퍼딘 (fP)은 0에서 6으로 넘버링된 7 트롬보스폰딘 반복 (TSR) 도메인으로 구성된다. 각각의 TSR 도메인 (및 일부 경우에는 2개의 TSR 도메인)이 결실되었고, 돌연변이체 단백질은 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 발현되었다. 예상 크기보다 실질적으로 작은 TSR5 결실 돌연변이체를 제외하고는, 모든 TSR 결실 돌연변이체는 예상 크기대로 발현한다. TSR5 결실 돌연변이체는 단백질분해되었을 가능성이 있다. TSR5 결실체의 크기는 TSR5+6 결실 돌연변이체의 크기와 유사하고, 이는 TSR6이 TSR5 결실 돌연변이체에서 단백질분해로 제거될 수 있음을 시사한다. CHO 세포 용해물을 폴리클로날 염소 항-인간 fP 항체를 사용한 웨스턴 블롯으로 분석하였다. M: 분자량 (MW) 마커.
도 6은 mAb 19.1 및 25에 대한 에피토프 맵핑, 및 인간 프로퍼딘 결실 돌연변이체에 대한 mAb 19.1 및 25 결합의 ELISA 검정의 결과를 나타낸다. CHO 세포 용해물을 ELISA 플레이트 상에 코팅하고, mAb 19.1 또는 25로 검출하였다. 19.1 및 25와 상이한 에피토프에 결합하는 제3의 mAb 29.3을 단백질 발현을 확인하기 위한 대조군으로 사용하였다. 그 결과, mAb 19.1 및 25는 둘 다 다음의 결실 돌연변이체와 반응한 것으로 나타났다: dTSR0, dTSR1, dTSR2, dTSR3, dTSR4. 따라서, mAb 19.1 및 25에 대한 에피토프는 TSR 0-4에 위치하지 않는 것으로 결론지을 수 있다. 게다가, mAb 19.1은 dTSR5 및 dTSR 5+6과의 결합을 상실하였지만, dTSR6과의 결합을 보유하였고, 이는 그의 에피토프가 TSR5에 위치한다는 것을 시사한다. mAb 25는 dTSR5, dTSR5+6 및 dTSR6과의 결합을 상실하였고, 이는 그의 에피토프가 TSR 5-6에 위치한다는 것을 시사한다. 그러나, dTSR5가 단백질분해를 겪어 TSR6 제거를 유발할 가능성이 있으므로 (도 5), mAb 25에 대한 에피토프가 TSR6에 위치할 가능성도 있다. HuP는 양성 대조군으로 사용되는 전장 인간 프로퍼딘 형질감염을 나타낸다. Con은 결합 결여에 대한 음성 대조군으로 사용되는 형질감염되지 않은 CHO 세포 용해물을 나타낸다. 모든 돌연변이체 단백질은 C-말단에 6X His 태그를 함유하였다.
도 7은 mAb 19.1의 에피토프가 아미노산 서열 RGRTCRGRKFDGHRCAGQQQDIRHCYSIQHCP (서열 52)를 갖는 TSR5의 C-말단 절반으로 맵핑되었음을 보여주는 에피토프 맵핑의 결과를 나타낸다. TSR0-4 (즉, dTSR5+6)는 mAb 19.1과 반응하지 않은 반면에, TSR0-5 (즉, dTSR6)는 19.1과 반응하였으므로 (도 6), 다음의 추가 결실 돌연변이체를 생성하였다: TSR0-4 + ¼ TSR5, TSR0-4 + ½ TSR5 및 TSR0-4 + ¾ TSR5. 무손상 프로퍼딘 단백질이 아닌 돌연변이체는 그의 C-말단에 6X His 태그를 함유하였다. 항-인간 fP 및 항-His 태그 항체를 모두 사용한 웨스턴 블롯 분석 결과, TSR0-4 + ¾ TSR5는 잘 발현되지 않은 것으로 나타났다. 나머지 2종의 돌연변이체인 TSR0-4 + ¼ TSR5 및 TSR0-4 + ½ TSR5는 발현되었지만, 어느 것도 mAb 19.1에 의해 인식되지 않았고, 이는 mAb 19.1에 대한 에피토프를 상실하였음을 시사한다. 따라서, mAb 19.1에 대한 핵심 에피토프 잔기는 TSR5의 C-말단 절반 (서열 52) 내에 위치하는 것으로 결론지을 수 있다.
도 8 (도 8a 및 8b 포함)은 mAb 25의 에피토프를 나타내는 에피토프 맵핑의 결과를 도시한다. 도 8a에서, 데이터는 아미노산 서열 LVVEEKRPCLHVPACKDPEEEEL (서열 53)을 갖는 TSR6의 C-말단 ¼ 절편에 맵핑된 에피토프를 나타낸다. TSR0-5 (즉, dTSR6)가 mAb 25에의 결합을 손실했기 때문에, TSR6이 mAb 25의 에피토프의 적어도 일부를 구성한다고 판단되었다. TSR6의 추가의 돌연변이체가 다음과 같이 생성되었다: TSR0-5 + ¼ TSR6, TSR0-5 + ½ TSR6 및 TSR0-5 + ¾ TSR6. 돌연변이체이지만 무손상은 아닌 프로퍼딘 단백질은 그의 C-말단에 6X His 태그를 함유하였다. 항-인간 fP 및 항-His 태그 항체로의 웨스턴 블롯에 의해 나타난 것과 같이, 3가지 돌연변이체 모두가 성공적으로 발현되었다. ELISA 결합 실험은 3가지 돌연변이체 모두가 mAb 25에의 결합을 손실하였음을 나타내었다. 양성 대조군으로서, 모든 돌연변이체 단백질이 mAb 19.1과 반응되었다. 이러한 결과는 TSR6의 마지막 ¼ 절편 (서열 53으로 표시되는 서열을 가짐)이 mAb 25의 에피토프의 핵심 부분을 구성함을 시사한다. HuP는 양성 대조군으로서 전장 (무손상) 인간 fP 형질감염된 CHO 세포를 나타내며; ConLysate는 결합에 대한 음성 대조군으로서 형질감염되지 않은 CHO 세포를 나타낸다. 도 8b에서, 데이터는 mAb 25의 에피토프가 TSR6 (서열 61, 도 5b에서 나타냄) 내의 2개의 시스테인 잔기에 의존성임을 나타낸다. 이들은 TSR6의 시스테인 62 (C62) 및 시스테인 78 (C78)이다. 전장 인간 프로퍼딘에서의 C62 또는 C78 중 하나의 알라닌 (A)으로의 단일 돌연변이는 mAb 25 결합을 해제하지 않았지만, C62A 및 C78A의 이중 돌연변이는 mAb 25 결합을 해제하였다. 돌연변이체 단백질 발현에 대한 양성 대조군으로서, mAb 19.1은 모든 샘플에 대하여 반응성을 나타내었다. 이러한 결과는 TSR6의 마지막 ¼ 절편 (서열 53으로 표시되는 서열을 가짐) 내의 C78, 및 서열 53의 외부에 위치되지만 TSR6 (서열 61) 내에 위치되는 C62가 mAb 25의 에피토프의 2개의 중요한 잔기를 구성함을 시사한다. mAb 19.1 및 25의 결합 검정을 형질감염된 CHO 세포의 균질물을 사용하여 ELISA 플레이트에서 수행하였다. HuP는 양성 대조군으로서 전장 (무손상) 인간 fP 형질감염된 CHO 세포를 나타내며; Con은 결합에 대한 음성 대조군으로서 형질감염되지 않은 CHO 세포를 나타낸다. 다른 샘플은 단일 또는 이중 C62A 및 C78A 돌연변이를 함유하는 돌연변이체 인간 fP cDNA로 형질감염된 CHO 세포이다.
도 9는 CDR (VH-CDR1: 서열 3; VH-CDR2: 서열 4; VH-CDR3: 서열 5; VL-CDR1: 서열 8; VL-CDR2: 서열 9; VL-CDR3: 서열 10)을 포함하는 mAb 19.1의 중쇄 (서열 1; 서열 2) 및 경쇄 (서열 6; 서열 7)의 가변 영역 서열의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 10은 CDR (VH-CDR1: 서열 13; VH-CDR2: 서열 14; VH-CDR3: 서열 15; VL-CDR1: 서열 18; VL-CDR2: 서열 19; VL-CDR3: 서열 20)을 포함하는 mAb 25의 중쇄 (서열 11; 서열 12) 및 경쇄 (서열 16; 서열 17)의 가변 영역 서열의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 11은 CDR (VH-CDR1: 서열 23; VH-CDR2: 서열 24; VH-CDR3: 서열 25; VL-CDR1: 서열 28; VL-CDR2: 서열 29; VL-CDR3: 서열 30)을 포함하는 mAb 22.1의 중쇄 (서열 21; 서열 22) 및 경쇄 (서열 26; 서열 27)의 가변 영역 서열의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 12는 CDR (VH-CDR1: 서열 33; VH-CDR2: 서열 34; VH-CDR3: 서열 35; VL-CDR1: 서열 38; VL-CDR2: 서열 39; VL-CDR3: 서열 40)을 포함하는 mAb 30의 중쇄 (서열 31; 서열 32) 및 경쇄 (서열 36; 서열 37)의 가변 영역 서열의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 13은 2개의 인간 생식세포(germline) VH 서열 (인간 VH 4-59-01 (서열 41); 인간 VH 3-66-04 (서열 43))을 사용하여 CDR 그래프팅한 이후의 mAb 19.1의 중쇄의 가변 영역의 인간화 아미노산 서열 (인간화 19.1 VH-4-59-01 (서열 42); 인간화 19.1 VH-3-66-04 (서열 44))을 도시한다.
도 14는 인간 생식세포 VL 서열 (인간 VL 4-1-01 (서열 45); 인간 JK2 (서열 46))을 사용하여 CDR 그래프팅한 이후의 mAb 19.1의 경쇄의 가변 영역의 인간화 아미노산 서열 (인간화 19.1 VL-4-1-01 (서열 47))을 도시한다.
도 15는 인간 생식세포 VH 서열 (인간 VH 1-69-06 (서열 48))을 사용하여 CDR 그래프팅한 이후의 mAb 25의 중쇄의 가변 영역의 인간화 아미노산 서열 (인간화 25-VH-1-69-06 (서열 49))을 도시한다.
도 16은 인간 생식세포 VL 서열 (인간 VL 1-69-06 (서열 50)); 인간 Jk3 (서열 62)을 사용하여 CDR 그래프팅한 이후의 mAb 25의 경쇄의 가변 영역의 인간화 아미노산 서열 (인간화 25-VL-1-69-06 (서열 51))을 도시한다.
도 17 (도 17a 및 17b 포함)은 재조합 키메라 및 인간화 19.1 mAb를 평가한 실험의 결과를 도시한다. 도 17a는 세린 229의 프롤린으로의 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 불변 중쇄 영역의 아미노산 서열 (서열 63), 및 인간 카파 불변 경쇄 영역의 아미노산 서열 (서열 64)을 도시한다. 이들 서열을 사용하여 키메라 (마우스 가변 영역 + 인간 불변 영역) 및 인간화 (인간화 마우스 가변 영역 + 인간 불변 영역) 항-프로퍼딘 항체를 구축하였다. 도 17b는 재조합 키메라 및 인간화 19.1 mAb의 발현을 평가한 실험의 결과를 도시한다. 재조합 키메라 19.1 mAb 및 2개의 인간화 19.1 mAb의 SDS PAGE 분석을 하였다. 키메라 19.1 중쇄의 구축은 19.1의 VH 영역과 인간 IgG4 중쇄의 불변 영역과의 결합에 의해 달성되었다. 키메라 19.1 경쇄의 구축은 19.1의 VL 영역과 인간 카파 쇄의 불변 영역과의 결합에 의해 달성되었다. 인간화 19.1 중쇄 및 경쇄는 동일한 방식으로 구축되었으며, 즉 인간화 VH 영역을 인간 IgG4 중쇄의 불변 영역과 결합시키고, 인간화 경쇄를 인간 카파 쇄의 불변 영역과 결합시켰다. CHO 세포를 중쇄 및 경쇄 cDNA로 공동-형질감염시키고, 안정한 세포주가 약물 섹션에 의해 확립되었다. 2개의 인간화 mAb에 대하여, 각각의 2개의 인간화 중쇄를 형질감염을 위해 동일한 인간화 경쇄와 함께 쌍형성시켰다. 발현된 mAb를 단백질 G 친화도 칼럼에 의해 CHO 세포 배양 배지로부터 정제하였다.
도 18은 비아코어를 사용하여 19.1, 키메라 19.1 및 인간화 19.1 mAb의 항원 결합 친화도를 측정한 실험의 결과를 도시한다. 정제된 인간 fP를 아민 커플링 방법을 사용하여 CM4 칩에 커플링시켰다. 비아코어 분석을 비아코어-2000 기기 상에서 수행하였다. 칩을 각 결합 사이에 50 mM NaOH를 사용하여 재생시켰다.
도 19는 비아코어 분석에 의해 측정되는 것과 같은 mAb 25, 22.1 및 30의 항원 결합 친화도를 측정한 실험의 결과를 도시한다. 정제된 인간 fP를 아민 커플링 방법을 사용하여 CM4 칩에 커플링시켰다. 비아코어 분석을 비아코어-2000 기기 상에서 수행하였다. 칩을 각 결합 사이에 50 mM NaOH를 사용하여 재생시켰다.
도 20은 LPS-유도 인간 AP 상보체 활성화의 차단에서의 19.1, 키메라 19.1 및 인간화 19.1 mAb의 상대적 활성을 평가한 실험의 결과를 도시한다. ELISA 플레이트를 LPS로 밤새 코팅하고, GVB-Mg++-EGTA 중에서 희석된 50％ 정상 인간 혈청 (NHS)을 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 이후 항-C3 항체를 사용하여 C3 침착을 검출하였다. 항체가 첨가되지 않은 NHS는 양성 대조군 (NHS)으로서 기능하였으며, EDTA 첨가된 NHS는 음성 대조군 (NHSEDTA)으로서 기능하였다. 19.1 mAb에 대하여, 5 μg/ml 및 10 μg/ml의 농도는 상보체 활성화를 억제시키는데 충분하였다. 키메라 및 2개 인간화 19.1 mAb에 대하여, 5 μg/ml의 농도는 상보체 활성화를 억제시키는데 충분하지 않았다. 그러나, 10 μg/ml 및 20 μg/ml의 농도는 AP 상보체 활성화의 차단에 효과적이었다.
도 21은 fH 및 DAF 기능장애의 관점에서 인간 AP 상보체에 의한 인간 RBC 용해의 차단에서의 19.1, 키메라 19.1 및 인간화 19.1 mAb의 상대적 활성을 평가한 실험의 결과를 도시한다. 인간 RBC를 fH19-20 (30 μM) 및 항-DAF 항체 (7.5 μg/ml)의 존재 하에 50％ 정상 인간 혈청과 함께 인큐베이션하였다. 인간 혈청을 GVB-Mg++-EGTA 중에서 희석시키고, 인큐베이션을 37℃에서 1시간 동안 수행하였다. RBC에 첨가하기 이전에, 인간 혈청을 4℃에서 1시간 동안 증가하는 농도의 19.1, 키메라 19.1 및 인간화 19.1 mAb (1-15 μg/ml)와 함께 예비-인큐베이션하였다. 4개 mAb 모두에 의한 RBC 용해의 용량-의존성 억제가 있었다. 그러나, 키메라 및 인간화 19.1 mAb에 대한 EC50은 19.1 mAb의 EC50에 비해 더 높았다. 이 결과는 도 20에서 나타낸 데이터에 부합하였다.
도 22는 LPS-유도 레서스 원숭이 AP 상보체 활성화의 차단에서 19.1, 키메라 19.1 및 인간화 19.1 mAb의 상대적 활성을 평가한 실험의 결과를 도시한다. ELISA 플레이트를 LPS로 밤새 코팅하고, GVB-Mg++-EGTA 중에서 희석된 50％ 정상 레서스 원숭이 혈청 (NRS)을 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 이후 항-인간 C3 항체를 사용하여 C3 침착을 검출하였다. 항체가 첨가되지 않은 NRS는 양성 대조군 (NRS)으로서 기능하였으며, EDTA 첨가된 NRS는 음성 대조군 (NRSEDTA)으로서 기능하였다. 19.1 및 키메라 19.1 mAb에 대하여, 10-40 μg/ml의 농도는 레서스 원숭이 상보체 활성화를 억제시키는데 충분하였다. 2개의 인간화 19.1 mAb에 대하여, 30 또는 40 μg/ml의 농도는 상보체 활성화를 억제시키는데 효과적이었다. 10 또는 20 μg/ml의 농도 또한 레서스 원숭이 AP 상보체 활성화를 실질적으로 억제시켰다.
도 23은 LPS-유도 시노몰구스 원숭이 AP 상보체 활성화의 차단에서의 19.1, 키메라 19.1 및 인간화 19.1 mAb의 상대적 활성을 평가한 실험의 결과를 도시한다. ELISA 플레이트를 LPS로 밤새 코팅하고, GVB-Mg++-EGTA 중에서 희석된 50％ 정상 시노몰구스 원숭이 혈청 (NCS)을 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 이후 항-인간 C3 항체를 사용하여 C3 침착을 검출하였다. 항체가 첨가되지 않은 NCS는 양성 대조군 (NCS)으로서 기능하였으며, EDTA 첨가된 NCS는 음성 대조군 (NCSEDTA)으로서 기능하였다. 19.1 mAb에 대하여, 10-40 μg/ml의 농도는 시노몰구스 원숭이 AP 상보체 활성화를 억제시키는데 충분하였다. 키메라 19.1 mAb에 대하여, 20-40 μg/ml의 농도는 시노몰구스 원숭이 AP 상보체 활성화를 억제시키는데 충분하였으며, 10 μg/ml의 농도 또한 상보체 활성화를 실질적으로 억제시켰다. 2개의 인간화 19.1 mAb에 대하여, 30 또는 40 μg/ml의 농도는 시노몰구스 상보체 활성화를 억제시키는데 효과적이었다. 그러나, 20 μg/ml의 농도 또한 시노몰구스 원숭이 AP 상보체 활성화를 실질적으로 억제시켰다. 10 μg/ml의 농도 또한 시노몰구스 AP 상보체 활성을 부분적으로 억제시켰다.
도 24는 mAb 19.1, 25 및 인간화 19.1에 의한 PNH 환자 적혈구의 산성화된 혈청 용해의 억제를 평가한 실험 (햄(Ham) 시험)의 결과를 도시한다. 발작성 야간 혈색소뇨 (PNH) 환자로부터의 RBC를 mAb의 존재 또는 부재 하에 햄의 산성화된 혈청 시험하였다. RBC를 37℃에서 2시간 동안 자가 혈청 (최종 농도 83％)과 함께 인큐베이션하고, 상청액의 OD405의 측정에 의해 용해 퍼센트를 계산하였으며, 증류수에 의해 완전히 용해된 RBC의 샘플 (Eh DDW)에 대해 표준화시켰다. 인큐베이션 혼합물은 다음으로 구성되었다: 240 μl의 혈청, 25 μl의 1/6 N HCL (또는 음성 대조군에 대하여 25 μl 염수), 12.5 μl의 50％ (v/v) RBC 현탁액, 염수 중 10 μl mAb. 산성화되지 않은 자가 혈청 (NHS)과 함께 인큐베이션된 RBC의 샘플을 음성 대조군으로서 사용하였다 (배경 용해). mAb의 부재 하에, 약 50％의 RBC가 산성화된 혈청에 의해 용해되었다. 이 용해는 8 μg/ml 이상의 농도의 mAb 19.1, 20 μg/ml의 농도의 인간화 19.1 mAb (#459) 및 8 μg/ml 이상의 mAb 25에 의해 완전히 억제되었다.
도 25 (도 25a-25e 포함)는 프로퍼딘 인간화 마우스의 생성을 도시한다. 인간 fP 발현 벡터는 도 25a에서의 도식도에서 예시된 것과 같이 진핵 세포에서의 cDNA의 안정한 발현을 위한 CVM-IE 인핸서 및 토끼 β-글로빈 polyA 말단을 갖는 닭 β-액틴 프로모터를 사용하여 구축되었다. 이러한 플라스미드를 선형화하고, C57BL/6 마우스의 접합체로 마이크로주입하여, 인간 fP 트랜스제닉 창립자(founder) 마우스를 생성하였다. PCR 스크리닝 (인간 fP 5'-ATCAGAGGCCTGTGACACC-3' (서열 65) 및 5'-CTGCCCTTGTAGCTCCTCA-3' (서열 66)에 특이적인 프라이머 사용)에 의해 양성 창립자 마우스 (약 800 bp의 인간 fP cDNA 단편을 나타냄)를 확인하였다. 분석된 40마리 마우스 중, 5마리 (#15, 20, 24, 27 및 32)가 양성이었다 (도 25b, 적색 화살표). ELISA 검정을 수행하여 트랜스제닉 양성 마우스에서 인간 fP를 검출하였다 (도 25c). 플레이트를 인간 fP에 대한 비-차단 mAb로 코팅하였다 (클론 8.1). 묽은 혈청 (10％)으로 인큐베이션한 이후, 인간 fP를 HRP-컨쥬게이션된 염소-항인간 fP 항체를 사용하여 ELISA에 의해 검출하였다. 정상 인간 혈청 (NHS)을 양성 대조군으로서 사용하였다. 나타낸 것과 같이, 인간 fP가 NHS 및 5마리 트랜스제닉 마우스의 혈청에서 검출되었지만, 정상 (즉, 비-트랜스제닉) 마우스 혈청 (NMS), 트랜스제닉-음성 (#29) 또는 fP^-/- 마우스 혈청에서는 검출되지 않았다. 창립자 마우스 #32를 WT 마우스로 번식시키고, 새끼를 상기 기재된 것과 같이 PCR에 의해 스크리닝하였다. 3마리의 대표적인 F1 마우스 (1마리의 PCR-음성 (F1-429) 및 2마리의 PCR-양성 (F1-430 및 F1-431))를 그의 혈청 중의 인간 fP의 존재에 대하여 ELISA에 의해 시험하였다 (도 25D). 나타낸 것과 같이, 인간 fP는 2마리의 PCR-양성 마우스에서 검출되었지만, PCR-음성 마우스에서는 검출되지 않았다. NHS 및 창립자 모체 (#32)로부터의 혈청을 양성 대조군으로서 사용하였다. 이 결과는 트랜스진이 안정하였으며, 생식세포를 통해 전달될 수 있음을 시사하였다. 이후, 창립자 마우스 #32를 fP^-/- 마우스로 번식시켜 fP^-/--인간 fP 트랜스진 + 마우스를 생성하였다. LPS-유도 AP 상보체 활성화 검정은, fP^-/--인간 fP 트랜스진 + 마우스는 WT 마우스 (도 25E)의 혈청 AP 상보체 활성과 구별되는 혈청 AP 상보체 활성을 갖지만, fP^-/- 마우스는 갖지 않는다는 것을 나타내어, 트랜스제닉 발현된 인간 fP가 fP^-/- 마우스의 표현형을 구제할 수 있었음을 시사한다. EDTA로 처리된 WT 혈청을 음성 대조군으로서 사용하였다. 이 결과는 프로퍼딘 인간화 마우스 계통이 생성되었음을 입증하였다.
도 26은 "프로퍼딘 인간화" 마우스 내 mAb 25의 생체내 활성 및 동역학을 조사하는 실험을 묘사한다. 프로퍼딘 인간화 마우스 (fP^-/--인간 fP 트랜스진 + )을 0.5 mg (i.p.)의 mAb 25로 주사하였다. 혈청 샘플을 주사 전 (0 시간) 이어서 주사 후 다양한 시점에 수집하고, LPS-유도된 AP 보체 활성화에 대해 시험하였다. 나타난 바와 같이, fP^-/- 마우스 혈청 또는 EDTA로 처리된 WT 혈청에서는 AP 보체 활성이 전혀 존재하지 않았다. 대조적으로, AP 보체 활성은 WT 혈청 및 0 시간 시점 (mAb 처리 전)의 fP 인간화 마우스의 혈청에서 검출되었다. 인간화 마우스에서의 AP 보체 활성은 mAb 처리 후 8, 24 및 48 시간에 비검출로 유지되었으나, 72, 96 및 120 시간에서는 검출되었다. 이들 결과는 0.5 mg/마우스의 투여량에서 mAb 25가 48 시간 동안 생체내 AP 보체 활성을 억제할 수 있음을 암시한다.
도 27은 항-인간 프로퍼딘 mAb 19.1이 혈관외 용혈 (EVH)을 방지함을 입증하는 실험 결과를 묘사한다. 이러한 EVH 모델에서, 프로퍼딘 인간화 마우스 (n= 4마리/실험군)를 Crry/DAF/C3 트리플 녹아웃 (TKO) 마우스로부터의 적혈구 (RBC)로 수혈하였다. 수용자 마우스 (프로퍼딘 인간화 마우스)를 RBC 전달 전 6 시간에 mAb 19.1 (2 mg/마우스, i.p.)로 처리하거나, 또는 대조군 마우스를 IgG1 mAb (MOPC, MoPC 31C 하이브리도마로부터 정제됨, ACTT)로 처리하였다. 이전에 공개된 절차 (Miwa et al., 2002, Blood 99: 3707-3716)에 따라, RBC를 공여자 TKO 마우스로부터 수집하고, PBS에서 세척하고, (꼬리 정맥을 통해) 수용자 마우스로 주사하기 전에 CFSE로 라벨링하였다. 각각의 수용자 마우스는 100 μl의 혈액과 동일한 RBC를 받았다. RBC 수혈 후 5분 및 6, 24, 48, 72, 96, 120 시간에, 수용자 마우스를 채혈하고, RBC를 분석하여 혈액순환에서 남아 있는 CFSE-라벨링된 (즉, 수혈된) RBC의 수를 결정하였다. 각각의 수용자의 CFSE-라벨링된 RBC의 수를 5분 시점에서 검출된 CFSE-라벨링된 RBC의 수로 정규화하였다 (% 단위). 이전 공개 (Miwa et al., 2002, Blood 99: 3707-3716)와 마찬가지로, 대조군 IgG (MOPC)-처리된 수용자 마우스에서, TKO RBC는 EVH를 통해 빠르게 제거되었다. 그러나, 항-인간 프로퍼딘 19.1 mAb로 처리된 수용자 마우스에서, EVH가 전혀 발생하지 않았고, 수혈된 RBC가 계속 존재하였으며, 이는 항-프로퍼딘 mAb가 EVH를 방지하는데 효과적임을 입증한다.
도 28은 인간 프로퍼딘 트랜스제닉 마우스를 생성하는데 사용되는 인간 프로퍼딘 cDNA (서열 67)의 핵산 서열을 묘사한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 항-프로퍼딘 항체를 사용하는 보체의 대안적 경로 (AP)의 억제에 관한 것이다. 다양한 실시양태에서, 본 발명은 개체를 항-프로퍼딘 항체와 접촉시킴으로써 개체에서 AP-매개된 병리상태 또는 AP-매개된 상태를 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 및 방법으로 치료될 수 있는 AP-매개된 병리상태 및 상태는 황반 변성, 허혈 재관류 손상, 관절염, 류마티스 관절염, 천식, 발작성 야간 혈색소뇨 (PNH) 증후군, 비정형적 용혈성 요독성 (aHUS) 증후군, 패혈증, 기관 이식, 염증 (심폐 우회 수술 및 신장 투석과 연관된 염증을 포함하나 이에 제한되지는 않음), 사구체신염 (항-호중구 세포질 항체 (ANCA)-매개된 사구체신염을 포함하나 이에 제한되지 않음), 루푸스, 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 전문 과학 용어는 본 발명이 속한 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 방법 및 물질과 유사하거나 동일한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있으나, 바람직한 방법 및 물질이 기재된다.
본원에 사용된 바와 같이, 각각의 하기 용어는 해당 섹션과 연관된 의미를 갖는다.
단수 형태 기재는 기재된 대상 1개 또는 1개 초과 (즉, 1개 이상)를 지칭하는 것으로 본원에 사용된다. 예로서, "성분"은 1개의 성분 또는 1개 초과의 성분을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "억제하다" 및 "억제"는 대조 값과 비교하여 적어도 약 10% 만큼 활성 또는 기능을 감소시키거나, 억제하거나, 줄이거나, 방지하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 활성은 대조 값과 비교하여 50% 만큼, 보다 바람직하게는 75% 만큼, 보다 더 바람직하게는 95% 만큼 억제되거나 방지된다.
용어 "유효량" 및 "제약 유효량"은 작용제가 바람직한 생물학적 결과를 제공하도록 하는 충분한 양을 지칭한다. 상기 결과는 질환 또는 장애의 징후, 증상 또는 원인의 감소 및/또는 완화, 또는 생물계의 임의의 다른 바람직한 변화일 수 있다. 임의의 개별 경우에서 적절한 유효량은 통상적인 실험을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
용어 "환자," "대상체," "개체" 등은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 상태 또는 그의 후유증에 대한 요법이 필요하거나 또는 그에 대해 감수성인 인간을 비롯하여 보체계를 갖는 임의의 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간을 지칭한다. 개체는 예를 들어, 개, 고양이, 돼지, 소, 양, 염소, 말, 래트, 원숭이 및 마우스 및 인간을 포함할 수 있다.
용어 "비정상적"은, 유기체, 조직, 세포 또는 그의 성분의 문맥에서 사용되는 경우에, 적어도 1개의 관찰가능하거나 검출가능한 특성 (예를 들어, 연령, 처리, 시각 등)에 있어서 각각의 "정상적" (예상되는/항상성) 특성을 나타내는 이들 유기체, 조직, 세포 또는 그의 성분과 상이한 유기체, 조직, 세포 또는 그의 성분을 지칭한다. 하나의 세포, 조직 유형 또는 대상체에 대해 정상적인 또는 예상되는 특성은 상이한 세포 또는 조직 유형에 대해 비정상적일 수 있다.
"질환"은 동물이 항상성을 유지할 수 없고, 질환이 개선되지 않아 동물의 건강이 지속적으로 악화되는 것인 동물의 건강 상태이다.
대조적으로, 동물에서 "장애"는 동물이 항상성을 유지할 수 있지만, 동물의 건강 상태가 장애가 없는 경우가 보다 덜 바람직한 상태인 동물의 건강 상태이다. 치료받지 않아도, 장애는 동물의 건강 상태를 반드시 더 악화시키는 것은 아니다.
질환 또는 장애는, 질환 또는 장애의 징후 또는 증상의 중증도, 환자가 겪는 이러한 징후 또는 증상 또는 둘 다의 빈도가 감소되는 경우에 "완화된다".
화합물의 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 화합물이 투여되는 대상체에게 유익한 효과를 제공하기에 충분한 화합물의 양이다.
본원에 사용된 바와 같은 "지침 자료"는 본원에 언급된 다양한 질환 또는 장애를 완화시키기 위한 키트에 공개물, 녹화물, 다이어그램, 또는 본 발명의 화합물, 조성물, 벡터 또는 전달 시스템의 유용성을 전달하는데 사용될 수 있는 임의의 다른 매체를 포함한다. 임의로, 또는 대안적으로, 지침 자료는 포유동물의 세포 또는 조직에서의 질환 또는 장애를 경감시키는 하나 이상의 방법을 기재할 수 있다. 본 발명의 키트의 지침 자료는 예를 들어 본 발명의 해당 화합물, 조성물, 벡터 또는 전달 시스템을 함유하는 용기에 부착되거나, 또는 해당 화합물, 조성물, 벡터 또는 전달 시스템을 함유하는 용기와 함께 포장될 수 있다. 대안적으로, 지침 자료는 수용자가 지침 자료 및 화합물을 함께 사용하도록 용기와 별도로 포장될 수 있다.
"치료적" 치료는 병리상태의 징후를 나타내는 대상체에게 이들 징후를 감소시키거나 없애기 위한 목적으로 투여하는 치료이다.
본원에 사용된 바와 같은 "질환 또는 장애를 치료하는"은 질환, 장애 또는 병리상태의 징후 및/또는 증상의 빈도 및/또는 중증도가 감소하는 것을 환자가 경험하는 것을 의미한다. 질환, 장애 및 병리상태는 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은 어구 "생물학적 샘플"은 핵산 또는 폴리펩티드의 발현을 검출할 수 있는 세포, 조직, 또는 체액을 포함하는 임의의 샘플을 포함하는 것을 의도한다. 이러한 생물학적 샘플의 예는 혈액, 림프, 골수, 생검 및 도말을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 본래 액체인 샘플은 본원에서 "체액"으로 지칭된다. 생물학적 샘플은 다양한 기술에 의해, 예를 들어 영역을 크레이핑 또는 스와빙함으로써 또는 바늘을 사용하여 체액을 수득함으로써 환자로부터 수득될 수 있다. 다양한 신체 샘플을 수집하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 항원의 특이적 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 이뮤노글로불린 분자를 지칭한다. 항체는 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래된 무손상 이뮤노글로불린일 수 있으며, 무손상 이뮤노글로불린의 면역반응성 부분일 수 있다. 본 발명의 항체는 예를 들어, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 세포내 항체 ("세포내항체"), Fv, Fab, Fab', F(ab)2 및 F(ab')2, 뿐만 아니라 단일 쇄 항체 (scFv), 중쇄 항체, 예컨대 낙타류 항체, 및 인간화 항체를 비롯한 다양한 형태로 존재할 수 있다 (Harlow et al., 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).
본원에 사용된 바와 같은 "합성 항체"는 재조합 DNA 기술, 예컨대, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 박테리오파지에 의해 발현되는 항체를 사용하여 생성될 수 있는 항체를 의미한다. 상기 용어는 또한 항체를 코딩하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성되는 항체를 의미하는 것으로 이해되어야 하며, 상기 DNA 분자는 항체 단백질, 또는 항체를 특정하는 아미노산 서열을 발현하고, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은 당업계에서 입수가능하고 잘 알려진 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 수득할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "중쇄 항체(들)"은 펩티드를 사용한 면역화 및 이후 혈청의 단리, 또는 이러한 항체를 코딩하는 핵산 서열의 클로닝 및 발현에 의해 낙타류 종으로부터 유래된 이뮤노글로불린 분자를 포함한다. 용어 "중쇄 항체(들)"은 중쇄 질환이 있는 동물로부터 단리되거나 동물로부터의 VH (가변 중쇄 이뮤노글로불린) 유전자의 클로닝 및 발현에 의해 제조된 이뮤노글로불린 분자를 추가로 포함한다.
"키메라 항체"는 수용 항체로부터 유래된 경쇄 및 중쇄 불변 영역과 결합된, 공여 항체로부터 유래된 자연 발생 가변 영역 (경쇄 및 중쇄)을 함유하도록 조작된 항체 유형을 지칭한다.
"인간화 항체"는 비-인간 공여자 이뮤노글로불린으로부터 유래된 CDR을 갖고 해당 분자의 나머지 이뮤노글로불린-유래 부분은 1종의 (또는 1종 초과의) 인간 이뮤노글로불린(들)로부터 유래된 것이도록 조작된 항체 유형을 지칭한다. 추가로, 프레임워크 지지 잔기를 변형시켜서 결합 친화도를 보존할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [1989, Queen et al., Proc. Natl. Acad Sci USA, 86:10029-10032], [1991, Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421] 참조). 적합한 인간 수용 항체는 공여 항체의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 상동성에 의해 통상적인 데이터베이스, 예를 들어 카바트(KABAT) 데이터베이스, 로스 알라모스(Los Alamos) 데이터베이스, 및 스위스 프로테인(Swiss Protein) 데이터베이스로부터 선택된 것일 수 있다. 공여 항체의 프레임워크 영역에 대한 상동성 (아미노산 기초)을 특징으로 하는 인간 항체는, 공여자 CDR의 삽입을 위한 중쇄 불변 영역 및/또는 중쇄 가변 프레임워크 영역을 제공하는데 적합할 수 있다. 경쇄 불변 또는 가변 프레임워크 영역을 제공할 수 있는 적합한 수용 항체는 유사한 방식으로 선별될 수 있다. 수용 항체 중쇄 및 경쇄는 동일 수용 항체로부터 기원할 필요가 없다는 것을 유념해야 한다. 선행 기술은 이러한 인간화 항체를 제조하는 여러 방법을 기재한다 (예를 들어, EP-A-0239400 및 EP-A-054951 참조).
용어 "공여 항체"는 그의 가변 영역, CDR, 또는 다른 기능적 단편 또는 그의 유사체의 아미노산 서열을 제1 이뮤노글로불린 파트너에게 제공하는 항체 (모노클로날 및/또는 재조합)를 지칭하며, 이로 인해 이뮤노글로불린 코딩 영역이 변경되고 그로 인해 공여 항체의 특징적인 항원 특이성 및 중화 활성을 갖는 변경된 항체가 발현된다.
용어 "수용 항체"는 그의 중쇄 및/또는 경쇄 프레임워크 영역 및/또는 그의 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 코딩하는 아미노산 서열 모두 (또는 임의의 일부, 그러나 일부 실시양태에서는 모두)를 제1 이뮤노글로불린 파트너에게 제공하는, 공여 항체에 이종인 항체 (모노클로날 및/또는 재조합)를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 인간 항체는 수용 항체이다.
"CDR"은 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역인, 항체의 상보성 결정 영역 아미노산 서열로 정의된다. 예를 들어, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)]을 참조한다. 이뮤노글로불린의 가변 부분에는 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR (또는 CDR 영역)이 존재한다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, "CDR"은 모든 3개의 중쇄 CDR, 또는 모든 3개의 경쇄 CDR (또는 적절한 경우에는 모든 중쇄 및 모든 경쇄 CDR 둘다)을 지칭한다. 항체의 구조 및 단백질 폴딩은 다른 잔기가 항원 결합 영역의 일부로 고려됨을 의미할 수 있고, 이는 당업자에게 이해되는 바이다. 예를 들어, 문헌 [Chothia et al., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p 877-883]을 참조한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "면역검정"은 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 사용하여 표적 분자를 검출 및 정량화하는 임의의 결합 검정을 지칭한다.
본원에서 항체에 대해 사용된 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합"은 항체가 특이적 항원을 인식하고 샘플 내 다른 분자는 실질적으로 인식 또는 결합하지 않는다는 것을 의미한다. 예를 들어, 하나의 종으로부터의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 하나 이상의 종으로부터의 상기 항원에도 결합할 수 있다. 그러나, 이러한 교차-종 반응성 그 자체는 특이적이라는 항체의 분류를 변경시키지 않는다. 또 다른 예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 항원의 상이한 대립유전자 형태에도 결합할 수 있다. 그러나, 이러한 교차 반응성 그 자체는 특이적이라는 항체의 분류를 변경시키지 않는다.
일부 경우에서, 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 항체, 단백질 또는 펩티드와 제2의 화학적 종의 상호작용과 관련하여 이러한 상호작용이 화학적 종에 있는 특정 구조 (예를 들어, 항원 결정자 또는 에피토프)의 존재에 의존적이라는 것을 의미하는데 사용될 수 있고, 예를 들어 항체는 일반적으로 단백질이 아닌 특이적 단백질 구조를 인식하고 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 특이적인 경우, 표지된 "A" 및 항체를 함유하는 반응물에서 에피토프 A를 함유하는 분자 (또는 유리 형태의 미표지 A)의 존재는 항체에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
유전자의 "코딩 영역"은 유전자 코딩 가닥의 뉴클레오티드 잔기 및 유전자 비-코딩 가닥의 뉴클레오티드로 이루어지고, 이것들은 유전자의 전사에 의해 생성되는 mRNA 분자의 코딩 영역에 각각 상동성 또는 상보적이다.
또한, mRNA 분자의 "코딩 영역"은 mRNA 분자의 번역 동안에 운반 RNA 분자의 대응-코돈 영역과 매칭되거나 정지 코돈을 코딩하는, mRNA 분자의 뉴클레오티드 잔기로 이루어진다. 따라서, 코딩 영역은 mRNA 분자에 의해 코딩되는 성숙 단백질 내에는 존재하지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 단백질 배출 신호 서열 내의 아미노산 잔기)에 대한 코돈을 포함하는 뉴클레오티드 잔기를 포함할 수 있다.
핵산과 관련하여 본원에서 사용된 바와 같이, "상보적"은 2개의 핵산 가닥의 영역 사이 또는 동일 핵산 가닥의 2개 영역 사이의 서열 상보성에 대한 광범위한 개념을 지칭한다. 제1 핵산 영역의 아데닌 잔기는 제1 영역과 역평행한 제2 핵산 영역의 잔기가 티민 또는 우라실일 경우에 상기 잔기와 특이적 수소 결합을 형성 ("염기 쌍형성")할 수 있다는 것은 공지되어 있다. 유사하게, 제1 핵산 가닥의 시토신 잔기는 제1 가닥과 역평행한 제2 핵산 가닥의 잔기가 구아닌일 경우에 상기 잔기와 염기 쌍형성을 할 수 있다는 것은 공지되어 있다. 핵산의 제1 영역과 동일 또는 상이한 핵산의 제2 영역의 2개 영역이 역평행 방식으로 정렬되고 제1 영역의 적어도 1개의 뉴클레오티드 잔기가 제2 영역의 잔기와 염기 쌍형성을 할 수 있는 경우, 상기 제1 영역은 상기 제2 영역에 상보적이다. 바람직하게는, 제1 영역은 제1 부분을 포함하고 제2 영역은 제2 부분을 포함하여, 이들 제1 및 제2 부분이 역평행 방식으로 정렬되고 적어도 약 50%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%의 제1 부분 뉴클레오티드 잔기가 제2 부분의 뉴클레오티드 잔기와 염기 쌍형성을 할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 제1 부분의 모든 뉴클레오티드 잔기가 제2 부분의 뉴클레오티드 잔기와 염기 쌍형성을 할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "DNA"는 데옥시리보핵산으로 정의된다.
"코딩"은 폴리뉴클레오티드, 예컨대 유전자, cDNA, 또는 mRNA 내 뉴클레오티드의 특이적 서열이, 뉴클레오티드 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 규정된 서열 또는 아미노산의 규정된 서열 및 그로 인한 생물학적 특성을 갖는, 생물학적 과정 내의 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로 작용하는 본래의 특성을 지칭한다. 따라서, 세포 또는 다른 생물계에서 특정 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 단백질을 생성하는 경우, 그 유전자는 상기 단백질을 코딩한다. 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 통상적으로 서열 목록으로 제공되는 코딩 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로 사용되는 비-코딩 가닥 모두가, 단백질 또는 그 유전자 또는 cDNA의 다른 생성물을 코딩한다고 언급될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 동의성 버전이고 동일 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또한, 어구 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 RNA는, 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도로 인트론을 포함할 수 있다.
"단리된"은 천연 상태로부터 변경 또는 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 통상적인 문맥에서 살아있는 동물 내에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이 아니지만, 자연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수도 있고, 또는 비-천연 환경, 예를 들어 숙주 세포에 존재할 수도 있다.
"단리된 핵산"은 자연 발생 상태에서 그와 측접한 서열로부터 분리된 핵산 절편 또는 단편, 즉 그와 통상적으로 인접한 서열, 즉 게놈 내 상기 단편에 자연적으로 인접한 서열로부터 제거된 DNA 단편을 지칭한다. 상기 용어는 또한 자연적으로 세포 내에서 함께 수반되는 핵산, 즉 RNA 또는 DNA 또는 단백질인 자연적으로 수반되는 다른 성분으로부터 실질적으로 정제된 핵산에도 적용된다. 따라서, 상기 용어는 예를 들어 벡터, 자율 복제 플라스미드 또는 바이러스, 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA로 혼입되거나 다른 서열과는 독립적인 별개의 분자 (즉, PCR 또는 제한 효소 소화에 의해 생성된 cDNA 또는 게놈 또는 cDNA 단편)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 이것은 또한 추가의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA도 포함한다.
본 발명의 문맥에서, 흔히 발생하는 핵산 염기에 대해 하기 약어가 사용된다. "A"는 아데노신을 지칭하고, "C"는 시토신을 지칭하고, "G"는 구아노신을 지칭하고, "T"는 티미딘을 지칭하고, "U"는 우리딘을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 쇄로서 정의된다. 또한, 핵산은 뉴클레오티드의 중합체이다. 따라서, 본원에 사용된 핵산 및 폴리뉴클레오티드는 상호교환가능하다. 당업자는 핵산이 단량체 "뉴클레오티드"로 가수분해될 수 있는 폴리뉴클레오티드임을 일반적으로 알고 있다. 단량체 뉴클레오티드는 뉴클레오시드로 가수분해될 수 있다. 본원에 사용된 폴리뉴클레오티드에는 당업계에서 이용되는 임의의 수단에 의해, 예컨대 비제한적으로, 재조합 수단에 의해, 즉 통상적인 클로닝 기술 및 PCR 등을 이용하는 재조합 라이브러리 또는 세포 게놈으로부터의 핵산 서열의 클로닝에 의해, 및 합성 수단에 의해 수득되는 모든 핵산 서열이 포함되나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용된 용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 상호교환가능하게 사용되고, 펩티드 결합에 의해 공유 연결된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하고, 단백질 또는 펩티드 서열을 구성할 수 있는 아미노산의 최대 개수에는 제한이 없다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 서로 결합된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어는 예를 들어 당업계에서 일반적으로 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로도 지칭되는 단쇄, 및 당업계에서 일반적으로 여러 유형의 단백질로 지칭되는 장쇄 둘 다를 지칭한다. "폴리펩티드"는 예를 들어 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성인 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 개질된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질 등을 포함한다. 폴리펩티드에는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 합성 펩티드, 또는 이들의 조합이 포함된다.
본원에 사용된 용어 "자손"은 후대 또는 후손을 지칭하며, 포유동물의 후손을 포함하고, 모 세포로부터 유래된 분화 또는 미분화 후대 세포 또한 포함한다. 한 예로, 용어 자손은 모 세포와 유전자가 동일한 후대 세포를 지칭한다. 또 다른 예로, 용어 자손은 모 세포와 유전자 및 표현형이 동일한 후대 세포를 지칭한다. 또 다른 예에서, 용어 자손은 모 세포로부터 분화된 후대 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "RNA"는 리보핵산으로 정의된다.
본원에 사용된 용어 "재조합 DNA"는 상이한 공급원으로부터의 DNA 조각들을 합쳐서 생성된 DNA로서 정의된다.
본원에 사용된 용어 "재조합 폴리펩티드"는 재조합 DNA 방법을 이용하여 생성된 폴리펩티드로서 정의된다.
본원에 사용된 "접합된"은 제1 분자와 제2 분자의 공유 부착을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "변이체"는 각각 참고 핵산 서열 또는 펩티드 서열과 서열이 상이하지만 참고 분자의 본질적인 생물학적 특징은 보유하는 핵산 서열 또는 펩티드 서열이다. 핵산 변이체의 서열에서의 변화는 참고 핵산에 의해 코딩된 펩티드의 아미노산 서열을 변경시키지 않을 수 있거나, 또는 아미노산 치환, 부가, 결실, 융합 및 말단절단을 일으킬 수 있다. 펩티드 변이체의 서열에서의 변화가 전형적으로 제한되거나 보존되어, 참고 펩티드 및 변이체의 서열이 전체적으로 매우 유사하고 여러 영역에서 동일하다. 변이체 및 참고 펩티드는 임의의 조합으로 하나 이상의 치환, 부가, 결실에 의해 아미노산 서열이 상이할 수 있다. 핵산 또는 펩티드의 변이체는 대립유전자 변이체와 같이 자연 발생적일 수 있거나, 또는 자연 발생적인 것으로 알려지지 않은 변이체일 수 있다. 핵산 및 펩티드의 비-자연 발생 변이체는 돌연변이 유발 기술에 의해 또는 직접 합성에 의해 이루어질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "번식"은 적어도 하나의 자손을 생성하는 종의 번식을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "자연 번식"은 성적 결합에 의한 종의 번식을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "동종교배 동물"은 특정한 특성을 보존 및 고정시키기 위해 또는 다른 특성이 번식 집단에 도입되는 것을 방지하기 위해 동일한 종의 다른 유사 동물과 이종교배된 동물을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "이계교배 동물"은 특정한 특성의 보존과 관계없이 동일한 종의 임의의 다른 동물과 교배된 동물을 지칭한다.
범위: 본 개시내용에 걸쳐, 본 발명의 다양한 측면이 소정 범위의 형식으로 제시될 수 있다. 이러한 범위 형식의 기재는 단지 편의성 및 간결성을 위한 것임을 이해해야 하며, 본 발명의 범위를 융통성없이 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 따라서, 소정 범위의 기재는 구체적으로 개시된 가능한 모든 하위 범위 뿐만 아니라, 상기 범위 내의 개별적인 수치 값을 갖는 것으로 고려되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 기재는 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 구체적으로 개시된 하위 범위 뿐만 아니라, 상기 범위 내의 개별적인 숫자, 예를 들어 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 갖는 것으로 고려되어야 한다. 이는 범위의 크기와는 무관하게 적용된다.
상세한 설명
본 발명은 항-프로퍼딘 항체를 이용하는 보체의 대안적인 경로 (AP)의 억제에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 개체를 항-프로퍼딘 항체와 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 개체에서 AP-매개된 병리상태 또는 AP-매개된 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 항-프로퍼딘 항체를 투여하는 단계를 포함하며, 이로써 C3bBb 단백질 복합체의 생성을 억제하는 것인, 상기 개체에서 AP-매개된 병리상태를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 이용하여 치료될 수 있는 보체-매개된 병리상태의 예에는 황반 변성, 허혈 재관류 손상, 관절염, 류마티스 관절염, 발작성 야간 혈색소뇨 (PNH) 증후군, 비정형적 용혈성 요독성 (aHUS) 증후군, 천식, 염증, 사구체신염, 루푸스, 기관 이식 패혈증, 또는 이들의 조합이 포함되나, 이로 제한되는 것은 아니다.
"자가" 및 "비-자가" 항원 간에 식별하는 면역계의 능력은 침입 미생물에 대한 특이적 방어로서의 면역계의 기능에 있어서 필수적이다. "비-자가" 항원은 동물 그 자신의 구성성분과는 검출가능하게 상이한 또는 외래인, 체내에 들어오거나 체내에 존재하는 물질 상의 항원인 반면, "자가" 항원은 건강한 동물에서 그 자신의 구성성분과는 검출가능하게 상이한 또는 외래가 아닌 항원이다. 본원에 기재된 방법의 다양한 실시양태에서, 억제되는 AP 활성화는 미생물 항원, 비-생물학적 외래 표면, 변경된 자가-조직 또는 그의 조합으로 이루어진 군 중 하나 이상에 의해 촉발된 것이다. 비-생물학적 외래 표면의 한 예는 심폐 우회로 수술 또는 신장 투석에서 사용되는 것과 같은 혈액 튜빙이다. 변경된 자가-조직의 예는 아폽토시스성, 괴사성 및 허혈-스트레스성 조직 및 세포, 또는 그의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-프로퍼딘 항체는 AP를 선택적으로 억제하나, 고전적 경로 (CP) 또는 렉틴 경로 (LP)를 억제하지 않는다. 일반적으로, CP는 항원-항체 복합체에 의해 개시되고, LP는 미생물 표면 상의 당 분자로의 렉틴의 결합에 의해 활성화되는 반면, AP는 낮은 수준에서 구성적으로 활성이나, 조절 단백질의 결핍으로 인해 박테리아, 바이러스 및 기생충 세포 표면 상에서 신속하게 증폭될 수 있다. 숙주 세포는 통상적으로 조절 단백질에 의한 AP 보체 활성화로부터 보호된다. 그러나 일부 상황에서, 예컨대 조절 단백질이 결함이 있거나 부재인 상황에서, AP는 또한 숙주 세포 상에서 제어하기 힘들게 활성화될 수 있으며, 이는 보체-매개 병리상태에 이르게 한다. CP는 성분 C1, C2, C4로 이루어지며, C3 활성화 단계에서 AP와 수렴한다. LP는 만노스-결합 렉틴 (MBL) 및 MBL-회합 세린 프로테아제 (Masp)로 이루어지고, CP와 성분 C4 및 C2를 공유한다. AP는 성분 C3 및 여러 인자, 예컨대 인자 B, 인자 D, 프로퍼딘 및 유체 상 조절제 인자 H로 이루어진다. 보체 활성화는 다음 세 단계로 이루어진다: (a) 인식, (b) 효소적 활성화, 및 (c) 세포 사멸에 이르게 하는 막 공격. CP 보체 활성화의 제1 상은 C1로 시작된다. C1은 다음 세 가지 별개의 단백질로 구성된다: 인식 서브유닛, C1q, 및 세린 프로테아제 하위성분, C1r 및 C1s (이들은 함께 칼슘-의존성 사량체 복합체, C1r2 s2로 결합됨). 무손상 C1 복합체는 C1의 생리적인 활성화가 일어나는데 있어 필수적이다. 활성화는 무손상 C1 복합체가 항원과 복합체를 형성한 이뮤노글로불린에 결합할 때 발생한다. 이 결합은 C4 및 C2 단백질 양자 모두를 절단하여 C4a 및 C4b, 뿐만 아니라 C2a 및 C2b를 생성시키는 C1s를 활성화시킨다. C4b 및 C2a 단편은 조합하여 C3 컨버타제, C4b2a를 형성하고, 이는 다시 C3을 절단하여 C3a 및 C3b를 형성시킨다. LP의 활성화는 표적 표면 상의 특정 당으로의 MBL 결합에 의해 개시되고, 이는 Masp의 활성화를 촉발하며, 이는 CP의 C1s의 활성과 유사한 방식으로 C4 및 C2를 절단하여 C3 컨버타제, C4b2a의 생성에 이르게 한다. 그러므로, CP 및 LP는 상이한 메카니즘에 의해 활성화되나, 동일한 성분 C4 및 C2를 공유하고, 두 경로 모두는 동일한 C3 컨버타제, C4b2a의 생성에 이르게 한다. C4b2a에 의한 C3의 C3b 및 C3a로의 절단은 두 가지 이유로 보체 경로의 중심 사건이다. 이는 표면 침착된 C3b가 AP의 중심 중간체이기 때문에 AP 증폭 루프를 개시한다. C3a 및 C3b 양자 모두는 생물학적으로 중요하다. C3a는 염증유발성이고, C5a와 함께 아나필라톡신이라 지칭된다. C3b 및 그의 추가 절단 생성물은 또한 호중구, 호산구, 단핵구 및 대식세포 상에 존재하는 보체 수용체에 결합하여, 이에 의해 식세포작용 및 C3b-옵소닌화된 입자의 클리어런스를 촉진한다. 최종적으로, C3b는 C4b2a와 회합하여 CP 및 LP의 C5 컨버타제를 형성하여 말단 보체 서열을 활성화시켜, C5a, 강력한 염증유발 매개인자, 및 용해성 막 공격 복합체 (MAC), C5-C9의 어셈블리의 생성에 이르게 할 수 있다.
CP 및 AP가 숙주 방어에서 중대한 역할을 수행하고 많은 보체-의존성 인간 병리상태가 AP에 의해 매개되기 때문에, 이러한 인간 병리상태의 치료에서 AP를 선택적으로 억제하는 것이 바람직하다. 따라서, 본원에 기재된 방법의 바람직한 실시양태에서, AP는 선택적으로 억제되나 CP 및 LP에 의해 제공되는 면역은 유지된다. 그러므로, 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 사용되는 항-프로퍼딘 항체는 CP 및 LP를 억제하지 않는다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-프로퍼딘 항체는 AP 및 CP 양자 모두를 억제하는 앞서 개발된 항-프로퍼딘 항체와는 별개이다.
AP는 C3(H2O)를 형성하는 C3의 자발적 가수분해로 인해 낮은 수준에서 구성적으로 활성이라고 생각된다. C3(H2O)는 fB와 회합할 수 있다는 점에서 C3b와 유사하게 행동하며, 이는 fB를 fD 절단 및 활성화에 대해 감수성으로 만든다. 생성된 C3(H2O)Bb는 이어서 C3를 절단하여 C3b 및 C3a를 생성하여, AP의 C3 컨버타제, C3bBb를 형성시킴으로써 AP 캐스케이드를 개시한다. 초기 C3 컨버타제는 증가하는 양의 C3b를 생성하기 때문에, 증폭 루프가 확립된다. CP 및 LP가 또한 C3b를 생성하기 때문에 (여기서 C3b는 인자 B에 결합할 수 있고 AP를 차지함), AP 증폭 루프는 또한 이들 경로가 활성화되면 CP 및 LP에 참여한다는 것에 주목해야 한다. 그러므로, AP는 두 가지 기능성 실체로 이루어진다: CP 또는 LP와 관련없는 독립적 보체 활성화 경로, 및 CP 및 LP의 완전 소견에 참여하고 이에 기여하는 증폭 과정. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 사용되는 항-프로퍼딘 항체는 AP 활성화 과정을 선택적으로 억제하고, CP 및 LP의 AP 증폭 루프를 방해하지 않는다.
프로퍼딘은 N-말단 도메인 및 6종의 트롬보스폰딘 유형 I 반복 (TSR) 도메인으로 구조적으로 구성된다. 생리적인 조건 하에, 이는 단량체의 머리 꼬리 회합 (head to tail association)에 의해 형성된 시클릭 폴리머 (이량체, 삼량체, 사량체)로서 혈장에 존재한다. 인간 프로퍼딘은 X 염색체의 짧은 아암 상에 코딩되고, 그의 결핍은 특히 C2, MBL 또는 IgG2 결핍과 조합된 경우에 치명적 네이세리아 감염에 대한 위험 인자를 구성한다.
AP 개시에서 프로퍼딘에 대한 필요성은 가변적이고 활성화 표면의 성질에 의존적인 것으로 보인다. 비제한적 예로서, 프로퍼딘은 LPS- 및 LOS-유도 AP 활성화, 뿐만 아니라 AP-매개 자가 조직 손상, 예컨대 Crry-결핍 마우스 적혈구의 혈관외 용혈에 필수적인 것으로 보인다 (미국 특허 출원 제2010/0263061호 참조). 본원에 기재된 본 발명은 프로퍼딘이 fH 및 DAF 기능장애/차단의 문맥에서 인간 AP 보체-매개 적혈구 용해에 필수적이라고 개시한다 (도 3). 본원에 기재된 본 발명은 또한 프로퍼딘이 PNH 적혈구의 자가 혈청 용해에 필수적이라고 개시한다 (도 24). 다른 한편으로는, 지모산-유도 AP 활성화는 프로퍼딘 결핍에 의해 중간 정도로 손상되고, 프로퍼딘은 CVF- 및 CP-촉발 AP 증폭에서 실질적인 역할을 수행하는 것으로 보이지 않는다 (미국 특허 출원 제2010/0263061호 참조). 주어진 표면 상의 AP 활성화는 C3bBb 안정화를 통한 프로퍼딘-의존성 촉진 및 C3 '틱-오버(tick-over)'의 인자 H (fH)-의존성 억제 간의 균형을 대표할 수 있다. 프로퍼딘이 필수적이 아닌 AP 활성화제는 fH와의 제한된 상호작용을 가질 수 있고, 충분한 fH-의존성 억제의 결핍의 결과로서 자발적 C3 활성화 및 증폭은 프로퍼딘의 도움 없이 디폴트 과정으로서 일어날 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 본 발명의 다양한 실시양태에서, 본 발명의 항-프로퍼딘 항체에 의한 프로퍼딘 기능의 억제는 다음을 포함하는 여러 이점을 제공한다: 이는 CP 및 LP의 AP 증폭 루프를 위태롭게 하지 않으며, 이는 이들 경로를 숙주 방어에 대한 완전 활성 상태로 두고; 모든 AP 활성화제 (즉, 병원체)가 이 경로를 촉발하기 위해 프로퍼딘을 필요로 하는 것은 아니기 때문에 AP 보체 활성화를 완전히 제거하지 않으며, 이는 항-fB 및 항-fD 항체와 같은 AP의 다른 억제 방법과 비교하여 숙주 방어에서 손상 정도를 감소시킨다.
한 실시양태에서, 본 발명의 방법을 이용하여 억제되는 AP의 활성은 리포폴리사카라이드 (LPS), 리포올리고사카라이드 (LOS), 병원체-회합 분자 패턴 (PAMP) 및 위험-회합 분자 패턴 (DAMP)으로부터 선택되는 군의 하나 이상에 의해 유도되는 AP 활성화이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법을 이용하여 억제되는 AP의 활성은 C3bBb 단백질 복합체의 생성이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법을 이용하여 억제되는 AP의 활성은 프로퍼딘 의존성이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 CP 및 LP를 통해 감염을 방지하는 개인의 능력을 보존한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 항-프로퍼딘 항체를 투여하여 이에 의해 개인에서 박테리아 LOS에 의해 유도되는 AP 활성화를 억제하는 단계를 포함하는, 개인에서 박테리아 리포올리고사카라이드 (LOS)에 의해 유도되는 AP 활성화를 억제하는 방법이다. 또 다른 실시양태에서, 박테리아 LPS에 의해 유도되는 AP 활성화를 억제하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, AP 활성화는 에스. 티포사(S. typhosa) LPS에 의해 유도되고, 본원에 제공되는 방법에서 사용되는 억제제는 에스. 미네소타(S. minnesota) LPS 또는 이. 콜라이(E. coli) LPS에 의해 유도되는 AP 활성화를 억제하지 않는다. 다양한 실시양태에서, 본 발명의 항-프로퍼딘 항체는 AP를 선택적으로 억제하나, CP-촉발 보체 활성화, LP-촉발 보체 활성화, 지모산-유도 활성화, 또는 코브라 베놈(cobra venom) 인자-유도 활성화를 억제하지 않는다.
한 실시양태에서, 개체에게 항-프로퍼딘 항체를 투여하여 이에 의해 개인에서 PAMP-매개 AP 활성화를 억제하는 단계를 포함하는, 개인에서 병원체-회합 분자 패턴-매개 AP 활성화를 억제하는 방법이 본원에 제공된다. AP의 활성화가 본 발명의 방법에 의해 억제될 수 있는 PAMP의 예는 뮤라밀 디펩티드 (MDP), 박테리아 DNA, 이중-가닥 바이러스성 RNA로부터의 CpG 모티프, 펩티도글리칸, 리포테이코산, 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi)로부터의 외부 표면 단백질 A, 합성 마이코플라스마성 대식세포-활성화 지단백질-2, 트리팔미토일-시스테이닐-세릴-(리실)3-리신 (P3CSK4), 디팔미토일-CSK4 (P2-CSK4), 모노팔미토일-CSK4 (PCSK4), 암포테리신 B, 트리아실화된 또는 디아실화된 박테리아 폴리펩티드, 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
한 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 항-프로퍼딘 항체를 투여하여 이에 의해 개인에서 AP 활성화의 개시를 억제하는 단계를 포함하는, 개인에서 AP 활성화의 개시를 억제하는 방법이다. 또 다른 실시양태에서, 개체에게 AP의 억제제를 투여하여 이에 의해 개인에서 AP 활성화의 증폭을 억제하는 단계를 포함하는, 개인에서 AP 활성화의 증폭을 억제하는 방법이 본원에 제공된다. 이들 실시양태의 예는 AP 보체-매개 용혈을 앓는 PNH 환자 및 AP 보체-매개 aHUS, 천식, 허혈성/재관류 손상, 류마티스 관절염 및 ANCA-매개 신장 질환을 앓는 개인이다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법을 이용하여 치료될 수 있는 질환 및 장애는 AP 보체-매개 용혈, AP 보체-매개 aHUS, 천식, 허혈성/재관류 손상, 류마티스 관절염 및 ANCA-매개 신장 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
다양한 실시양태에서, a) 개인에게 항-프로퍼딘 항체를 투여하는 단계; b) 개인의 얻어진 표현형을 측정하는 단계; 및 c) 프로퍼딘^-/- 녹아웃 동물의 표현형과 개인의 얻어진 표현형을 비교하는 단계를 포함하는, AP에 대한 억제 효과를 갖는 잠재적 항체를 확인하는 방법이 본원에 제공된다 (미국 특허 출원 제2010/0263061호 참조). 또 다른 실시양태에서, 본원에 제공되는 방법에서 사용되는 항-프로퍼딘 항체는 프로퍼딘^-/- 녹아웃 동물을 사용하여 잠재적 치료 화합물을 선택하는 방법에 의해 확인된다 (미국 특허 출원 제2010/0263061호 참조).
다양한 다른 실시양태에서, AP에 대한 억제 효과를 갖는 잠재적 항-프로퍼딘 항체를 확인하는 방법이 본원에 제공된다. 한 이러한 방법은 a) 플레이트를 리포폴리사카라이드 (LPS)로 코팅하는 단계; b) 플레이트를 세척하여 미결합 LPS를 제거하는 단계; c) 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중 소 혈청 알부민 (BSA)을 첨가하는 단계; d) 플레이트를 세척하여 미결합 BSA를 제거하는 단계; e) 인간 혈청으로 혼합된 후보 항-프로퍼딘 항체 화합물의 혼합물을 첨가하는 단계; f) 플레이트를 세척하는 단계; g) 항-인간 C3 항체를 첨가하는 단계; h) 플레이트를 세척하여 미결합 항체를 제거하는 단계; i) TMB 기재 시약을 첨가하는 단계; j) 황산을 첨가하여 반응을 중지시키는 단계; k) 450 nm에서 광학 밀도를 측정하는 단계; l) 양성 비교 대조군 및 음성 비교 대조군의 광학 밀도와 후보 항-프로퍼딘 항체 화합물을 함유하는 플레이트의 광학 밀도를 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 양성 비교 대조군과 비교하여 광학 밀도가 약화되는 경우, 항-프로퍼딘 항체가 확인된다.
항- 프로퍼딘 항체
일부 실시양태에서, 본 발명은 프로퍼딘에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 조성물을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 폴리클로날 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 키메라 항체이다. 추가 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 인간화 항체이다. 바람직한 실시양태에서, 프로퍼딘은 인간 프로퍼딘이다.
한 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 VH-CDR1: 서열 3; VH-CDR2: 서열 4; VH-CDR3: 서열 5; VL-CDR1: 서열 8; VL-CDR2: 서열 9; 및 VL-CDR3: 서열 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 VH-CDR1: 서열 3; VH-CDR2: 서열 4; VH-CDR3: 서열 5; VL-CDR1: 서열 8; VL-CDR2: 서열 9; 및 VL-CDR3: 서열 10으로 이루어진 군의 모든 CDR을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 mAb 19.1이라 지칭되는 모노클로날 항체이다. mAb 19.1이라 지칭되는 모노클로날 항-프로퍼딘 항체는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, mAb 19.1이라 지칭되는 모노클로날 항-프로퍼딘 항체는 인간화이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-프로퍼딘 항체는 TSR5 (서열 60)의 하나 이상의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-프로퍼딘 항체는 아미노산 서열 RGRTCRGRKFDGHRCAGQQQDIRHCYSIQHCP (서열 52)의 하나 이상의 아미노산을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 서열 52의 하나 이상의 아미노산을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-프로퍼딘 항체는 mAb 19.1이라 지칭되는 mAb이다. 일부 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 mAb 19.1이라 지칭되는 항체와의 결합에 대해 경쟁하는 항체이다. 다양한 실시양태에서, 본 발명의 항체가 결합할 수 있는 에피토프는 선형 에피토프 또는 입체형태적 에피토프이다.
한 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 VH-CDR1: 서열 13; VH-CDR2: 서열 14; VH-CDR3: 서열 15; VL-CDR1: 서열 18; VL-CDR2: 서열 19; 및 VL-CDR3: 서열 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 VH-CDR1: 서열 13; VH-CDR2: 서열 14; VH-CDR3: 서열 15; VL-CDR1: 서열 18; VL-CDR2: 서열 19; 및 VL-CDR3: 서열 20으로 이루어진 군의 모든 CDR을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 mAb 25라 지칭되는 모노클로날 항체이다. mAb 25라 지칭되는 모노클로날 항-프로퍼딘 항체는 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, mAb 25라 지칭되는 모노클로날 항-프로퍼딘 항체는 인간화이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-프로퍼딘 항체는 TSR5 (서열 60) 및/또는 TSR6 (서열 61)의 하나 이상의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-프로퍼딘 항체는 아미노산 서열 LVVEEKRPCLHVPACKDPEEEEL (서열 53)의 하나 이상의 아미노산을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-프로퍼딘 항체는 서열 61에 존재하는 시스테인 62 (C62)를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-프로퍼딘 항체는 서열 53에 존재하는 시스테인 78 (C78)을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 서열 53의 아미노산을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-프로퍼딘 항체는 mAb 25라 지칭되는 mAb이다. 일부 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 mAb 25라 지칭되는 항체와의 결합에 대해 경쟁하는 항체이다. 다양한 실시양태에서, 본 발명의 항체가 결합할 수 있는 에피토프는 선형 에피토프 또는 입체형태적 에피토프이다.
한 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 VH-CDR1: 서열 23; VH-CDR2: 서열 24; VH-CDR3: 서열 25; VL-CDR1: 서열 28; VL-CDR2: 서열 29; 및 VL-CDR3: 서열 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 VH-CDR1: 서열 23; VH-CDR2: 서열 24; VH-CDR3: 서열 25; VL-CDR1: 서열 28; VL-CDR2: 서열 29; 및 VL-CDR3: 서열 30으로 이루어진 군의 모든 CDR을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 mAb 22.1로 지명된 모노클로날 항체이다. mAb 22.1로 지명된 모노클로날 항-프로퍼딘 항체는 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 mAb 22.1로 지명된 항체와 결합에 대해 경쟁하는 항체이다. 일부 실시양태에서, mAb 22.1로 지명된 모노클로날 항-프로퍼딘 항체는 인간화된다.
한 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 VH-CDR1: 서열 33; VH-CDR2: 서열 34; VH-CDR3: 서열 35; VL-CDR1: 서열 38; VL-CDR2: 서열 39; 및 VL-CDR3: 서열 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 VH-CDR1: 서열 33; VH-CDR2: 서열 34; VH-CDR3: 서열 35; VL-CDR1: 서열 38; VL-CDR2: 서열 39; 및 VL-CDR3: 서열 40으로 이루어진 군의 CDR 모두를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 mAb 30으로 지명된 모노클로날 항체이다. mAb 30으로 지명된 모노클로날 항-프로퍼딘 항체는 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 mAb 30으로 지명된 항체와 결합에 대해 경쟁하는 항체이다. 일부 실시양태에서, mAb 30으로 지명된 모노클로날 항-프로퍼딘 항체는 인간화된다.
다른 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 서열 42의 아미노산 서열을 포함하는 인간화된 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 서열 44의 아미노산 서열을 포함하는 인간화된 중쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 서열 47의 아미노산 서열을 포함하는 인간화된 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 서열 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 서열 44의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함한다. 추가 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 본원에 기재된 인간화 항체와 결합에 대해 경쟁하는 항체이다.
일부 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 서열 49의 아미노산 서열을 포함하는 인간화된 중쇄를 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 서열 51의 아미노산 서열을 포함하는 인간화된 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 서열 49의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 51의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함한다. 추가 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 본원에 기재된 인간화 항체와 결합에 대해 경쟁하는 항체이다.
일부 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 중쇄 및 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 인간 중쇄 불변 영역, 예를 들면, 비제한적 예로서 인간 IgG4 불변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 경쇄 및 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 인간 경쇄 불변 영역, 예를 들면, 비제한적 예로서 인간 카파 경쇄 불변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 서열 2 및 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 중쇄 및 서열 7 및 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 중쇄 및 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 인간 중쇄 불변 영역, 예를 들면, 비제한적 예로서 인간 IgG4 불변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 경쇄 및 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 인간 경쇄 불변 영역, 예를 들면, 비제한적 예로서 인간 카파 경쇄 불변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 서열 12 및 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 중쇄 및 서열 17 및 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 중쇄 및 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 인간 중쇄 불변 영역, 예를 들면, 비제한적 예로서 인간 IgG4 불변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 경쇄 및 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 인간 경쇄 불변 영역, 예를 들면, 비제한적 예로서 인간 카파 경쇄 불변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 서열 22 및 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 중쇄 및 서열 27 및 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 중쇄 및 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 인간 중쇄 불변 영역, 예를 들면, 비제한적 예로서 인간 IgG4 불변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 경쇄 및 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 인간 경쇄 불변 영역, 예를 들면, 비제한적 예로서 인간 카파 경쇄 불변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-프로퍼딘 항체는 서열 32 및 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 중쇄 및 서열 37 및 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 경쇄를 포함한다.
스크리닝 검정
본 발명은 후보 항-프로퍼딘 항체가 AP를 억제할 수 있는지의 여부를 결정하는 것을 포함하여 다양한 스크리닝 검정에의 적용을 갖는다.
일부 실시양태에서, 후보 항-프로퍼딘 항체의 존재하에서의 AP 활성의 수준을 양성 비교측정기 대조군에서 검출된 AP 활성과 비교한다. 양성 비교측정기 대조군은 첨가된 시험 화합물의 부재하에서의 AP 활성화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 후보 항-프로퍼딘 항체의 존재하의 AP 활성이 양성 비교측정기 대조군에서 검출된 AP 활성의 약 70% 미만인 경우 (이는 시험 화합물의 존재하에 AP 활성의 약 30% 초과의 억제와 상응함), 후보 항-프로퍼딘 항체는 AP의 억제제로서 확인된다. 다른 실시양태에서, 후보 항-프로퍼딘 항체의 존재하의 AP 활성이 양성 비교측정기 대조군에서 검출된 AP 활성의 약 80% 미만인 경우 (이는 시험 화합물의 존재하에 AP 활성의 약 20% 초과의 억제와 상응함), 후보 항-프로퍼딘 항체는 AP의 억제제로서 확인된다. 또 다른 실시양태에서, 후보 항-프로퍼딘 항체의 존재하의 AP 활성이 양성 비교측정기 대조군에서 검출된 AP 활성의 약 90% 미만인 경우 (이는 시험 화합물의 존재하에 AP 활성의 약 10% 초과의 억제와 상응함), 후보 항-프로퍼딘 항체는 AP의 억제제로서 확인된다. 일부 실시양태에서, 후보 항-프로퍼딘 항체에 의한 AP 억제의 수준을 음성 비교측정기 대조군에서 검출된 억제의 수준과 비교한다.
경쟁적 및 비-경쟁적 면역검정 포맷, 항원 포획 검정, 2-항체 샌드위치 검정, 및 3-항체 샌드위치 검정을 비롯한 다양한 면역검정 포맷이 본 발명의 유용한 방법이다 (Self et al., 1996, Curr. Opin. Biotechnol. 7:60-65). 본 발명은 검정이 AP의 억제를 검출할 수 있는 한, 공지된 또는 지금까지 미공지된 검정의 임의의 한 유형에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다.
용혈 검정이 본 발명의 방법에 포함된다. 다양한 실시양태에서, 적혈구 (RBC)를 정상인 (건강한) 개인 또는 질환 또는 장애, 예를 들어, PNH의 징후 또는 증상을 나타내는 개인으로부터 수득한다. 다양한 실시양태에서, RBC를 fH의 보체 대조군 단백질 (CCP) 반복 19 및 20 (fH19-20, 5-50 μM) 및 항-DAF 중화 항체 (3-20 ㎍/ml)를 포함하는 재조합 fH 단편의 존재하에 5% 내지 75% 정상 인간 혈청 (NHS)으로 용균한다. 일부 실시양태에서, PNH와 같은 질환 또는 장애의 징후 또는 증상을 나타내는 개인으로부터 얻은 RBC를 산성화된 혈청으로 용균한다. 일부 실시양태에서, 오직 AP 보체 활성화만을 허용하기 위하여 GVB++-Mg++-EGTA 완충제 중에서 용혈 검정을 수행하나, 당업자는 완충제가 오직 AP 보체 활성화만을 허용하는 한 다른 적절한 완충제를 사용할 수 있음을 이해할 것이다. 한 실시양태에서, 용균의 정도는 용액으로의 헤모글로빈 방출의 측정치로서 인큐베이션 혼합물의 상청액의 OD410을 측정함으로써 계산한다. 다양한 실시양태에서, 하나 이상의 항-프로퍼딘 항체를 약 1 ㎍/ml 내지 약 50 ㎍/ml의 농도로 첨가하고, 혈청과 예비-인큐베이션하고, RBC의 용혈의 억제 정도를 측정한다.
효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)은 본 발명의 방법에 유용하다. 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 우레아제와 같은 (이에 제한되지 않음) 효소들이 예를 들어, 본 발명의 방법에서의 사용을 위해 항-C3 항체 또는 2차 항체에 연결될 수 있다. 양고추냉이-퍼옥시다제 검출 시스템은 예를 들어, 발색 기질 테트라메틸벤지딘 (TMB)과 함께 사용할 수 있고, 이는 450 nm에서 검출가능한 과산화수소의 존재하에 가용성 생성물을 생성한다. 다른 편리한 효소-연결 시스템은 예를 들어, 발색 기질 p-니트로페닐 포스페이트와 함께 사용되어 405 nm에서 쉽게 검출가능한 가용성 생성물을 생성할 수 있는 알칼리성 포스파타제 검출 시스템을 포함한다. 유사하게, 베타-갈락토시다제 검출 시스템을 발색 기질 o-니트로페닐-베타-D-갈락토피라노시드 (ONPG)와 함께 사용하여 410 nm에서 검출가능한 가용성 생성물을 생성할 수 있다. 다르게는, 우레아제 검출 시스템을 우레아-브로모크레졸 퍼플 (시그마 이뮤노케미칼즈(Sigma Immunochemicals), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)과 같은 기질과 함께 사용할 수 있다. 유용한 효소-연결 1차 및 2차 항체는 다수의 상업적 공급원으로부터 얻을 수 있다.
화학발광 검출은 또한 AP의 억제를 검출하기 위해 유용하다. 화학발광 2차 항체는 다수의 상업적 공급원으로부터 얻을 수 있다.
형광 검출은 또한 AP의 억제를 검출하기 위해 유용하다. 유용한 형광색소는 DAPI, 플루오레세인, 훽스트 33258, R-피코시아닌, B-피코에리트린, R-피코에리트린, 로다민, 텍사스 레드 및 리사민- 플루오레세인- 또는 로다민-표지된 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
방사성면역검정 (RIA)은 또한 본 발명의 방법에 유용하다. 이러한 검정은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어 문헌 [Brophy et al. (1990, Biochem. Biophys. Res. Comm. 167:898-903)] 및 [Guechot et al. (1996, Clin. Chem. 42:558-563)]에 기재되어 있다. 방사성면역검정은 예를 들어 요오드-125-표지된 1차 또는 2차 항체를 사용하여 수행한다 (Harlow et al., 상기 문헌, 1999).
검출가능한 항체로부터 방출되는 신호는, 예를 들어 발색 기질로부터 색을 검출하기 위하여 분광광도계를; 방사선을 검출하기 위하여 방사선 계수기를, 예컨대 요오드-125의 검출을 위해 감마 계수기를; 또는 특정 파장의 빛의 존재하에 형광을 검출하기 위하여 형광계를 사용하여 분석한다. 효소-연결 검정을 이용하는 경우, 정량 분석은 분광광도계를 이용하여 수행한다. 본 발명의 검정은 수동으로 수행하거나, 원한다면 자동화될 수 있고, 다중 샘플로부터 방출된 신호는 상업적으로 이용가능한 다수의 시스템에서 동시에 검출될 수 있음을 이해한다.
본 발명의 방법은 또한 모세관 전기영동 기재 면역검정 (CEIA)의 사용을 포함하며, 이는 원한다면 자동화될 수 있다. 면역검정은 또한 예를 들어, 문헌 [Schmalzing et al. (1997, Electrophoresis 18:2184-2193)] 및 [Bao (1997, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. 699:463-480)]에 기재된 바와 같은 레이저-유도 형광과 함께 사용될 수 있다. 리포솜 면역검정, 예컨대 유동-주사 리포솜 면역검정 및 리포솜 면역센서를 또한 본 발명의 방법에 따라 사용할 수 있다 (Rongen et al., 1997, J. Immunol. Methods 204:105-133).
정량적 웨스턴 블롯팅은 또한 본 발명의 방법에서 AP 억제의 수준을 결정하기 위하여 사용될 수 있다. 웨스턴 블롯은 주사 밀도계와 같은 공지된 방법을 이용하여 정량한다 (Parra et al., 1998, J. Vasc. Surg. 28:669-675).
투여 방법
본 발명의 방법은 AP-매개의 병리상태를 갖는 것으로 확인된 개인에게 하나 이상의 항-프로퍼딘 항체의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 개인은 AP 시스템을 갖는 포유동물이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 개인은 인간이다.
본 발명의 방법은 본원에 기재된 임의의 항-프로퍼딘 항체의 하나 이상을 투여하는 것을 포함할 수 있으나, 본 발명은 본원에 기재된 항-프로퍼딘 항체에 한정되는 것으로 해석되어서는 안되고, AP 활성화를 약화 및 감소시키는 공지된 것 및 비공지된 것 둘 다를 포함하여 임의의 항-프로퍼딘 항체를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명의 방법은 치료 유효량의 하나 이상의 항-프로퍼딘 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 항-프로퍼딘 항체 또는 그의 조합을 포함하는 본 발명의 조성물은 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여 사용된다. 본 발명은, 예를 들어 항염증 요법 등과 같은 다른 치료 양식과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 방법과 조합하여 사용될 수 있는 항염증 요법의 예로는, 예를 들어, 스테로이드성 약물을 이용하는 요법, 및 또한 비-스테로이드성 약물을 이용하는 요법이 있다.
제약 조성물 및 요법
본 발명의 치료 방법에서 항-프로퍼딘 항체의 투여는, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 다수의 상이한 방식으로 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명의 치료적 및 예방적 방법은 항-프로퍼딘 항체를 포함하는 제약 조성물을 사용하는 것을 포괄한다. 본 발명을 실시하기에 유용한 제약 조성물은 1 ng/kg/일 내지 100 mg/kg/일의 용량을 전달하도록 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 개체에서 1 μM 내지 10 μM의 본 발명의 항-프로퍼딘 항체의 농도를 가져오는 용량을 투여하는 것을 고려한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 개체의 혈장에서 1 μM 내지 10 μM의 본 발명의 항-프로퍼딘 항체의 농도를 가져오는 용량을 투여하는 것을 고려한다.
전형적으로, 본 발명의 방법에서 동물, 바람직하게는 인간에 투여될 수 있는 투여량은 동물의 체중 1 킬로그램당 0.5 μg 내지 약 50 mg의 양의 범위이다. 투여되는 정확한 투여량은, 이들에 제한되는 것은 아니나, 동물의 유형 및 치료되는 질환 상태의 유형, 동물의 연령 및 투여 경로를 비롯한 임의 수의 인자에 따라 달라질 것이다. 바람직하게는, 화합물의 투여량은 동물의 체중 1 킬로그램당 약 1 μg 내지 약 10 mg으로 다양할 것이다. 보다 바람직하게는, 투여량은 동물의 체중 1 킬로그램당 약 3 μg 내지 약 1 mg으로 다양할 것이다.
화합물은 1일 수회 정도로 빈번히 동물에 투여될 수 있거나, 또는 보다 덜 빈번히, 예컨대 1일 1회, 매주 1회, 격주 1회, 매월 1회 또는 훨씬 덜 빈번히, 예컨대, 수개월마다 1회 또는 심지어 1년에 1회 또는 그 미만으로 투여될 수 있다. 투여의 빈도는 당업자에게 자명할 것이며, 이들에 제한되는 것은 아니나, 치료되는 질환의 유형 및 중증도, 동물의 유형 및 연령 등과 같은 임의 수의 인자에 좌우될 것이다. 본원에 기재된 제약 조성물의 제제는 약리학 업계에서 공지되었거나 이후에 개발된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 그러한 제조 방법은 활성 성분을 담체 또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 회합시키는 단계, 및 이어서, 필요한 경우 또는 바람직한 경우, 생성물을 원하는 단일- 또는 다회-용량 단위로 성형 또는 포장하는 단계를 포함한다.
본원에서 제공되는 제약 조성물에 대한 설명이 주로 인간에 대한 윤리적 투여에 적합한 제약 조성물에 관한 것이지만, 이러한 조성물이 일반적으로 모든 종류의 동물에의 투여에 적합하다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 인간에 투여하기에 적합한 제약 조성물을 다양한 동물에 투여하기에 적합하게 하기 위해 변형시키는 것은 익히 알려져 있으며, 통상의 숙련된 수의과 약리학자는 (있다 하더라도) 단지 통상적인 실험을 이용하여 그러한 변형을 설계 및 실시할 수 있다. 본 발명의 제약 조성물의 투여가 고려되는 개체에는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 인간 및 기타 영장류, 비-인간 영장류, 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 및 개와 같은 상업적으로 관련있는 포유동물을 비롯한 포유동물이 포함된다.
본 발명의 방법에 유용한 제약 조성물은 안과적, 경구, 직장, 질, 비경구, 국소, 폐, 비강내, 협측 투여 경로에 적합한 제제로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 고려되는 다른 제제로는 활성 성분을 함유하는 투사된 나노입자, 리포솜 제제, 재밀봉된 적혈구, 및 면역학적 기반 제제가 있다.
본 발명의 제약 조성물은 벌크로, 단일 단위 용량으로, 또는 복수 개의 단일 단위 용량으로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 단위 용량은 예정량의 활성 성분을 포함하는 제약 조성물의 분리된 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 개체에게 투여 예정인 활성 성분의 투여량 또는, 예를 들어, 그러한 투여량의 1/2 또는 1/3과 같은 그러한 투여량의 편리한 분획과 동일하다.
본 발명의 제약 조성물 중의 활성 성분, 제약상 허용되는 담체, 및 임의의 부가적 성분의 상대적인 양은 치료되는 개체의 신원, 크기, 및 상태에 따라 및 추가로 조성물이 투여되는 경로에 따라 달라질 것이다. 일례로, 조성물은 0.1% 내지 100% (w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있다.
활성 성분에 더하여, 본 발명의 제약 조성물은 하나 이상의 부가적 제약 활성제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물의 제어- 또는 지속-방출 제제가 통상의 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
제약 조성물의 비경구 투여에는 개체의 조직에 대한 물리적 파괴 및 상기 조직 내의 파괴구를 통한 제약 조성물의 투여를 특징으로 하는 임의의 투여 경로가 포함된다. 따라서, 비경구 투여에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 조성물의 주사, 외과적 절개를 통한 조성물의 적용, 조직-관통 비외과적 상처를 통한 조성물의 적용 등에 의한 제약 조성물의 투여가 포함된다. 특히, 비경구 투여는, 이에 제한되는 것은 아니나, 정맥내, 안내, 유리체내, 피하, 복강내, 근육내, 흉골내 주사, 및 종양내를 포함하는 것으로 고려된다.
비경구 투여에 적합한 제약 조성물의 제제는 멸균수 또는 멸균 등장성 염수와 같은 제약상 허용되는 담체와 조합된 활성 성분을 포함한다. 그러한 제제는 볼루스 투여 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 주사가능한 제제는 단위 투여 형태로, 예컨대 앰플로 또는 보존제를 함유하는 다회 용량 용기로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제로는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액, 에멀젼, 페이스트, 및 이식가능 지속-방출 또는 생분해성 제제가 있다. 그러한 제제는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 현탁화제, 안정화제, 또는 분산제를 비롯한 하나 이상의 부가적 성분을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제의 한 실시양태에서, 활성 성분은 재구성된 조성물의 비경구 투여 전에 적합한 비히클 (예컨대 발열원 무함유 멸균수)을 이용한 재구성을 위한 건조 (즉 분말 또는 과립) 형태로 제공된다.
제약 조성물은 주사가능한 멸균 수성 또는 유성 현탁액 또는 용액의 형태로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 이 현탁액 또는 용액은 공지된 기술에 따라 제제화될 수 있으며, 활성 성분 이외에, 본원에 기재된 분산제, 습윤제, 또는 현탁화제와 같은 부가적 성분을 포함할 수 있다. 그러한 주사가능한 멸균 제제는, 예를 들어 물 또는 1,3-부탄 디올과 같은 비경구적으로 허용되는 비독성 희석제 또는 용매를 사용하여 제조될 수 있다. 기타 허용되는 희석제 및 용매로는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 링거액, 등장성 염화나트륨 용액, 및 합성 모노 또는 디-글리세리드와 같은 고정 오일이 있다. 기타 유용한 비경구로 투여가능한 제제로는, 활성 성분을 미세결정질 형태로, 리포솜 제제 중에, 또는 생분해성 중합체 시스템의 성분으로서 포함하는 것들이 있다. 지속 방출 또는 이식을 위한 조성물은 에멀젼, 이온 교환 수지, 난용성 중합체, 또는 난용성 염과 같은 제약상 허용되는 중합체성 또는 소수성 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 협강을 통한 폐 투여에 적합한 제제로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 그러한 제제는 활성 성분을 포함하며 직경이 약 0.5 내지 약 7 나노미터, 바람직하게는 약 1 내지 약 6 나노미터 범위인 건조 입자를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 추진제 스트림이 분말을 거기에 분산시키도록 유도되어 있을 수 있는 건조 분말 저장소를 포함하는 장치를 사용하는 투여 또는 밀봉된 용기 내에서 저비점 추진제 중에 용해 또는 현탁된 활성 성분을 포함하는 장치와 같은 자가 추진 용매/분말 분배 용기를 사용하는 투여를 위해 편의상 건조 분말 형태로 존재한다. 바람직하게는, 그러한 분말은 입자를 포함하며, 여기서 중량 기준으로 98% 이상의 입자가 직경이 0.5 나노미터 초과이며, 수량 기준으로 95% 이상의 입자가 직경이 7 나노미터 미만이다. 보다 바람직하게는, 중량 기준으로 95% 이상의 입자가 직경이 1 나노미터 초과이며, 수량 기준으로 90% 이상의 입자가 직경이 6 나노미터 미만이다. 건조 분말 조성물은 바람직하게는 당과 같은 고체 미분 희석제를 포함하며, 편의상 단위 투여 형태로 제공된다.
저비점 추진제에는 일반적으로 대기압에서 65℉ 미만의 비점을 갖는 액체 추진제가 포함된다. 일반적으로 추진제는 조성물의 50 내지 99.9% (w/w)를 구성할 수 있으며, 활성 성분은 조성물의 0.1 내지 20% (w/w)를 구성할 수 있다. 추진제는 액체 비-이온성 또는 고체 음이온성 계면활성제 또는 고체 희석제 (바람직하게는 활성 성분을 포함하는 입자와 동일한 자릿수의 입자 크기를 갖는 것)와 같은 부가적 성분을 추가로 포함할 수 있다.
폐 전달용으로 제제화된 본 발명의 제약 조성물은 또한 용액 또는 현탁액의 액적 형태의 활성 성분을 제공할 수 있다. 그러한 제제는 활성 성분을 포함하는, 임의로 멸균성인 수성 또는 희석된 알콜성 용액 또는 현탁액으로서 제조, 포장, 또는 판매될 수 있으며, 편의상 임의의 분무 또는 원자화 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 그러한 제제는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 사카린 나트륨과 같은 향미제, 휘발성 오일, 완충제, 표면 활성제, 또는 메틸히드록시벤조에이트와 같은 보존제를 비롯한 하나 이상의 부가적 성분을 추가로 포함할 수 있다. 이 투여 경로에 의해 제공되는 액적은 바람직하게는 평균 직경이 약 0.1 내지 약 200 나노미터 범위이다.
본원에서 폐 전달용으로 유용한 것으로 기재된 제제는 본 발명의 제약 조성물의 비강내 전달에도 또한 유용하다.
비강내 투여에 적합한 또 다른 제제는 활성 성분을 포함하며 약 0.2 내지 500 마이크로미터의 평균 입자를 갖는 조대 분말이다. 그러한 제제는 코담배를 맡는 방식으로, 즉 비공 가까이 유지된 분말 용기로부터 비도를 통한 신속한 흡입에 의해 투여된다.
비강 투여에 적합한 제제는, 예를 들어, 대략 0.1% (w/w) 정도로 적은 내지 100% (w/w) 정도로 많은 활성 성분을 포함할 수 있으며, 본원에 기재된 부가적 성분 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 협측 투여에 적합한 제제로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 그러한 제제는, 예를 들어, 통상의 방법을 사용하여 제조된 정제 또는 로젠지의 형태로 존재할 수 있으며, 예를 들어, 0.1 내지 20% (w/w) 활성 성분을 포함할 수 있고, 나머지는 용해성 또는 분해성 경구 조성물 및, 임의로, 본원에 기재된 부가적 성분 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 다르게는, 협측 투여에 적합한 제제는 활성 성분을 포함하는 분말 또는 에어로졸화 또는 원자화 용액 또는 현탁액을 포함할 수 있다. 그러한 분말화, 에어로졸화, 또는 에어로졸화 제제는 분산시 바람직하게는 약 0.1 내지 약 200 나노미터 범위의 평균 입자 또는 액적 크기를 가지며, 본원에 기재된 부가적 성분 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 "부가적 성분"에는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 하기 중 하나 이상이 포함된다: 부형제; 표면 활성제; 분산제; 불활성 희석제; 과립화제 및 붕해제; 결합제; 윤활제; 감미제; 향미제; 착색제; 보존제; 젤라틴과 같은 생리학상 분해성 조성물; 수성 비히클 및 용매; 유성 비히클 및 용매; 현탁화제; 분산제 또는 습윤제; 유화제, 완화제; 완충제; 염; 증점제; 충전제; 유화제; 항산화제; 항생제; 항진균제; 안정화제; 및 제약상 허용되는 중합체성 또는 소수성 물질. 본 발명의 제약 조성물에 포함될 수 있는 기타 "부가적 성분"은 당업계에게 공지되어 있으며, 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (1985, Genaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA)]에 기재되어 있다.
인간 프로퍼딘 마우스
본 발명은 또한 인간 프로퍼딘을 발현하고 마우스 프로퍼딘은 발현하지 않는 트랜스제닉 마우스를 포함한다. 트랜스제닉 마우스를 생성하기 위해, 인간 프로퍼딘 단백질을 코딩하는 핵산을 숙주 세포에서 인간 프로퍼딘 단백질의 발현에 적합한 형태의 재조합 발현 벡터 내로 통합시킬 수 있다. 용어 "숙주 세포에서 융합 단백질의 발현에 적합한 형태의"란 재조합 발현 벡터가 인간 프로퍼딘 단백질을 코딩하는 핵산의 mRNA로의 전사 및 상기 mRNA의 인간 프로퍼딘 단백질로의 번역을 가능하게 하는 방식으로 상기 핵산에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 서열을 포함하는 것을 의미하도록 의도된 것이다. 용어 "조절 서열"은 당업계에 인지되어 있으며, 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소 (예컨대, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된 것이다. 그러한 조절 서열은 당업자에 공지되어 있으며, 문헌 [1990, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif]에 기재되어 있다. 발현 벡터의 설계는 트랜스펙션시킬 숙주 세포의 선택 및/또는 발현시킬 인간 프로퍼딘 단백질의 양과 같은 인자에 좌우될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
트랜스제닉 마우스는, 예를 들어, 인간 프로퍼딘 단백질을 코딩하는 핵산 (전형적으로는 구성적 또는 조직-특이적 인핸서와 같은 적절한 조절 요소에 연결되어 있음)을, 예컨대, 미세주사에 의해, 난모세포 내로 도입하고, 이 난모세포가 여성 수양 마우스로 발달될 수 있게 함으로써 생성될 수 있다. 트랜스진의 발현 효율을 증가시키기 위해 트랜스진에 인트론 서열 및 폴리아데닐화 신호를 또한 포함시킬 수 있다. 트랜스제닉 동물, 특히 마우스와 같은 동물을 생성시키는 방법은 당업계에 통상적인 것이 되었으며, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,736,866 및 4,870,009 및 문헌 [1986, Hogan et al., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory]에 기재되어 있다. 최초 트랜스제닉 마우스는 트랜스진을 보유하는 추가의 동물을 번식시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 프로퍼딘 단백질을 코딩하는 트랜스진을 보유하는 트랜스제닉 마우스는 나아가 다른 트랜스진을 보유하는 다른 트랜스제닉 마우스로, 또는 다른 녹아웃 마우스, 예컨대, 뮤린 프로퍼딘 유전자를 발현하지 않는 녹아웃 마우스, 예컨대 미국 특허 출원 번호 2010/0263061에 기재된 마우스로 번식될 수 있다. 본원에 기재된 시스템이 트랜스제닉 마우스 외에 다른 인간 프로퍼딘 발현 동물을 생성하는데 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 트랜스제닉 마우스가 CVM-IE 인핸서를 이용하여 닭 β-액틴 프로모터로부터 인간 프로퍼딘을 발현하지만, 당업자는 본 발명의 트랜스제닉 마우스가 다른 프로모터 및 인핸서로부터의 인간 프로퍼딘의 발현을 포괄한다는 것을 이해할 것이다. 본 발명에 유용한 프로모터의 예로는, 이들에 제한되는 것은 아니나, DNA pol II 프로모터, PGK 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 알부민 프로모터, 글로빈 프로모터, 오브알부민 프로모터, SV40 초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 레트로바이러스 LTR 및 렌티바이러스 LTR이 있다. 본 발명에 유용한 프로모터 및 인핸서 발현 시스템에는 또한 유도성 및/또는 조직-특이적 발현 시스템이 포함된다.
일부 실시양태에서, 마우스 게놈 내로 삽입된 인간 프로퍼딘은 서열 67의 핵산 서열 및 서열 54의 아미노산 서열을 포함한다.
키트
본 발명은 또한 본 발명의 항-프로퍼딘 항체, 또는 그의 조합 및, 예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재된 치유적 치료 또는 비-치료적 용도로서 항-프로퍼딘 항체 또는 그의 조합을 개체에게 투여하는 것을 설명하는 교육용 자료를 포함하는 키트를 포함한다. 한 실시양태에서, 이러한 키트는, 예를 들어 개체에게 항체를 투여하기 전에, 본 발명의 항-프로퍼딘 항체, 또는 그의 조합을 포함하는 치료 조성물을 용해 또는 현탁화하기에 적합한 (바람직하게는 멸균) 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 임의로, 키트는 항체를 투여하기 위한 어플리케이터를 포함한다.
실험 실시예
이제, 하기 실시예를 참조하여 본 발명을 기재한다. 이들 실시예는 단지 예시를 위해 제공되는 것일 뿐 본 발명이 이들 실시예에 제한되는 것으로 해석되지 않아야 하며, 본원에 제공되는 교시의 결과로서 명백한 임의의 및 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
추가의 기재없이, 상기 기재 및 하기 예시적인 실시예를 사용하여 당업자가 본 발명의 화합물을 제조하고 이용하고 주장된 방법을 실시할 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태를 구체적으로 기재하나, 본원의 나머지를 임의의 방식으로 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 1
문헌 [Kohler et al. (1975, Nature, 256:495)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법을 일부 변형하여 사용함으로써 항-인간 프로퍼딘 모노클로날 항체를 생성하였다. 프로퍼딘 녹아웃 마우스 (fP^-/-) (8주차)를 100 μl의 타이터맥스 아주반트 (시그마 제품)로 유화시킨 50 μg (100 μl PBS 중)의 정제된 인간 프로퍼딘 (컴텍 인크.)으로 복강내로 면역화하였다. 제14일 및 제21일에, 마우스를 타이터맥스 아주반트로 유화시킨 50 μg의 정제된 인간 프로퍼딘으로 다시 면역시켰다. 1주 후, 마우스를 혈청 항-프로퍼딘 역가에 대해 시험하였다. 1:10,000 이상의 항체 역가를 갖는 마우스를 하이브리도마 융합 실험에 대해 사용하였다. 융합 실험하기 2일 전, 50 μg의 정제된 인간 프로퍼딘 (100 μl PBS 중)을 다시 마우스에 주입하였다 (복강내). 마우스를 자궁경부 전위시킴으로써 희생시키고 단세포 현탁액의 제조를 위해 기계적 파쇄에 의해 비장을 분리시켰다. 비장 세포 현탁액을 HYB-SFM (인비트로젠) + 10% FBS 배지로 1회 세척하고, 세포를 계수하고, X63-Ag8.653 골수종 세포 (ATCC)와 2:1 비로 혼합시켰다. 세포 혼합물을 HYB-SFM 배지로 다시 세척하고, 세포 펠릿을 원심분리 (1000 rpm x 5 min)에 의해 제조하였다. 세포 펠릿을 온화하게 휘젓고 느슨하게 하고 이어서 폴리 에틸렌 글리콜 (PEG 1500) (3x 10⁸ 세포에 대해 1.5 ml PEG)을 서서히 첨가함으로써 세포 융합을 유도하였다. 세포를 37℃에 1분 동안 두고 이어서 3분에 걸쳐 20 ml의 HYB-SFM 배지를 세포에 첨가하였다 (첫번째 1분 동안 1 ml, 두번째 1분 동안 3 ml 및 세번째 1분 동안 16 ml). 혼합물을 5분 동안 1000 rpm으로 원심분리하고 세포를 HAT 배지 (500 ml의 HYB-SFM 배지 중 10ml의 HAT [시그마 H0262], 5ml의 펜/스트렙, 500 μl의 겐타미신 및 10% FBS) 중의 24 웰 플레이트에 두었다. 2주 후, ELISA에 의해 정제된 인간 프로퍼딘과의 반응성을 스크리닝하기 위해 가시적인 콜로니를 갖는 웰로부터의 상청액을 회수하였다. 희석 방법을 한정함으로써 양성 클론을 얻고 96 웰 플레이트에 두어 ELISA에 의한 제2 라운드 스크리닝 후 단일 클론을 수득하였다. 양성 클론을 HT-배지 (500 ml의 HYB-SFM 배지 중 10ml의 HT, 5ml의 펜/스트렙 500 μl의 겐타미신 및 10%FBS)에서 팽창시켰다. 항체 수집 전, 2-3일 동안 하이브리도마 세포를 무혈청 배지 (HYB-SFM)로 대체하였다. 단백질 G 친화성 크로마토그래피에 의한 mAb 정제를 위해 세포 배양 배지를 수집하였다.
항-프로퍼딘 mAb의 cDNA를 클로닝하기 위해, 트리졸 시약 (시그마)에 의해 하이브리도마 세포로부터 전체 RNA를 단리하였다. 올리고(dT) 프라이머를 사용하여 역전사에 의해 제1-가닥 cDNA를 합성하였다. (IgG1, IgG2a/b에 대한) 중쇄 cDNA를 증폭시키기 위해, 다음의 프라이머를 PCR 반응에서 사용하였다: 5'-GAGGTGAAGCTGGTGGAG(T/A)C(T/A)GG-3' (서열 68) 및 5'-GGGGCCAGTGGATAGAC-3' (서열 69). k 경쇄를 증폭시키기 위해, 다음의 프라이머를 사용하였다: 4개의 상류 프라이머: 5'-CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGACTCCA-3' (서열 70); 5'-CCAGTTCCGAGCTCGTGCTCACCCAGTCTCCA-3' (서열 71); 5'-CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCA-3' (서열 72); 5'-CCAGTTCCGAGCTCGTGATGACACAGTCTCCA-3' (서열 73); 하류 프라이머: 5'- GTTGGTGCAGCATCAGC-3' (서열 74)의 혼합물. PCR 앰플리콘을 pCR TOPO TA 2.1 벡터 (인비트로젠)로 클로닝하고 서열화하였다. mAb의 신호 펩티드 (리더) 서열을 수득하기 위해, 인비트로젠으로부터의 키트 (진레이서)를 사용하여 5'-RACE 방법을 사용하였다. 5'-RACE 및 초기 서열분석 데이터로부터 측정된 특정 프라이머를 사용하여 완전한 가변적인 영역 cDNA를 증폭시켰다.
실시예 2
mAb 19.1, 22.1, 25 및 30에 의한 LPS-유도성 AP 상보성 활성화의 용량-의존성 억제를 시험하였다. mAb의 모든 4개의 클론은 5 μg/ml의 최종 농도로 50% 정상 인간 혈청 (NHS)에 첨가되는 경우 AP 상보성 활성화를 효율적으로 억제시켰다 (도 2 참조). ELISA 플레이트 (96-웰, 눈크)를 4℃에서 밤새 50 μl의 LPS 용액 (포스페이트-완충 염수 [PBS] 중의 40 μg/ml)으로 코팅하였다. 다음날, 플레이트를 0.05% 트윈-20 (PBS-T)를 함유하는 PBS로 3회 세척하고, 1-5 μg/ml의 항-프로퍼딘 mAb로 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 50 μl의 50% 정상 인간 혈청 (NHS)을 첨가하였다. NHS를 GVB-EGTA-Mg++ (10 mM EGTA 및 2.5mM Mg++ 최종 농도 함유)로 희석하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, PBS-T로 3회 세척하고, 이어서 50 μl HRP-접합 염소 항-인간 C3 항체 (1:4000, 카펠)를 첨가하고, 플레이트를 1시간 동안 실온에 두었다. 플레이트를 PBS-T로 3회 세척하고, 이어서 BD 파밍겐 A+B 시약을 사용하여 전개하였다. 2 N H2SO4를 사용하여 5분 후 반응을 중지시켰다. 플레이트 (OD450)상에서 C3 침착물의 양을 측정함으로써 AP 상보성 활성화가 검출되었다. 첨가된 EDTA를 갖는 샘플 (NHSEDTA)이 음성 대조군으로서 작용하였다 (EDTA가 상보성 활성화를 차단함). 첨가된 mAb를 갖지 않는 샘플 (0 Ab)이 AP 상보성 활성화의 기준선으로서 작용하였다.
실시예 3
항-인간 프로퍼딘 mAb가 fH 및 DAF 기능장애로 야기되는 인간 적혈구 (RBC) 용균을 억제함을 증명하는 실험을 수행하였다 (도 3 참조). 정상 인간 RBC (5 x 10⁶ 세포)를 30 μM 재조합 fH 19-20 및 7.5 μg 마우스 항-인간 DAF (AbD 세로텍 제조)의 존재하에 37℃에서 100 μl의 50% NHS (10 mM EGTA 및 2.5mM Mg++ 최종 농도를 함유하는 GVB-EGTA-Mg++로 희석됨)로 20분 동안 인큐베이션하였다 (문헌 [2006, Ferreira et al., J Immunol. 177:6308-6316]). PBS 중의 매우 차가운 20 mM EDTA 200 μl를 첨가함으로써 용균 반응을 중지시켰다. 인큐베이션 혼합물을 1500 g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 수집하고, OD420 nm에 대해 측정하였다. RBC에 첨가하기 전, NHS를 4℃에서 1시간 동안 0 또는 5 μg/ml 항-프로퍼딘 항체로 미리 인큐베이션하였다. 첨가된 NHS 또는 fH19-20을 갖지 않거나 첨가된 EDTA를 갖는 샘플을 음성 용균 대조군으로서 사용하고, 100 μl의 증류수로 완전히 용해된 RBC의 샘플을 양성 대조군 (100% 용균)으로서 사용하고, 다른 샘플 중의 % 용균을 정규화하였다.
실시예 4
5 μg/ml의 항-프로퍼딘 mAb의 부재 또는 존재하에 50% 정상 인간 혈청 (NHS)으로 인큐베이션된 항체-감작화된 양 RBC를 평가하는 실험 (도 4 참조). 항체-감작화된 양 RBC (컴텍 인크.로부터의 5 x 10⁶ 세포)를 100 μl 50% NHS (GVB++ 완충제로 희석함)로 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 양 RBC에 첨가하기 전, NHS를 0 또는 5 μg/ml 항-프로퍼딘 항체로 4℃에서 1시간 동안 미리 인큐베이션하였다. PBS 중의 매우 차가운 20 mM EDTA 200 μl를 첨가함으로써 용균 반응을 중지시켰다. 인큐베이션 혼합물을 1500 g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 수집하고 OD420 nm에 대해 측정하였다. NHS를 갖지 않거나 첨가된 EDTA를 갖는 샘플을 음성 용균 대조군으로서 사용하고, 100 μl 증류수로 완전히 용해된 양 RBC의 샘플을 양성 대조군 (100% 용균)으로서 사용하였고, 다른 샘플 중의 % 용균을 정규화하였다.
실시예 5
인간 프로퍼딘의 결실 돌연변이체의 발생 및 CHO 세포에서의 이들의 발현의 웨스턴 블롯의 확인 (도 5 참조). 인간 프로퍼딘 (fP)은 0 내지 6으로 번호 매겨진 7개의 트롬보스폰딘 반복 (TSR) 도메인으로 이루어진다. 주형으로서 pCMV 벡터 (오리진 제조) 중의 긴 인간 프로퍼딘 cDNA (서열 67)을 사용하여 역 PCR에 의해 개개의 TSR 도메인 0 내지 5 (서열 55, 56, 57, 58, 59 및 60 참조)를 결실시켰다 (문헌 [1989, Hemsley et al., Nucleic Acid.5 Res. 17:6545]). TSR 6 (서열 61) 또는 TSR 5-6을 결실시키기 위해, 정상 PCR 방법을 사용하고, 이어서 발현 벡터로 클로닝하였다 (pCAGGS 벡터를 사용함). 옵티멈 배지 중의 6 웰 플레이트에서 리포펙타민 시약 (인비트로젠)을 사용하여 결실 돌연변이체를 CHO 세포로 형질감염시켰다. 48시간 후, 세포를 150 mM NaCl, 10% 글리세롤, 1mM EDTA 및 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈)을 함유하는 50 mM 트리스-HCL (ph 7.4) 및 1% 트리톤 X-100 (웰당 250 μl)로 용해시켰다. 용해물을 10분 동안 10,000 rpm으로 원심분리하고, 단백질 농도를 BCA 단백질 검정 방법에 의해 측정하였다. SDS-PAGE 분석을 위해 각각의 샘플로부터의 약 100 μg의 전체 단백질을 사용하였다.
실시예 6
mAb 19.1 및 25의 에피토프 맵핑을 위해 인간 프로퍼딘 결실 돌연변이체에 결합된 mAb 19.1 및 25의 샌드위치 ELISA 검정을 수행하였다 (도 6 참조). ELISA 플레이트를 4℃에서 밤새 2 μg/ml의 관련 mAb 50 μl로 코팅하였다. 플레이트를 PBS-T로 3회 세척하고 이어서 25 μg (1% BSA를 함유하는 50 μl의 PBS 중)의 CHO 세포 용해물 단백질을 웰에 첨가하고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-T로 3회 세척하고 이어서 포획된 단백질을 비오티닐화 염소 항-인간 프로퍼딘 항체 및 HRP-아비딘 시스템에 의해 검출하였다. 19.1 및 25와 상이한 에피토프에 결합된 제3 mAb 29.3을 돌연변이체 단백질 발현을 확인하기 위한 대조군으로서 사용하였다.
실시예 7
에피토프 맵핑은 다음의 아미노산 서열 RGRTCRGRKFDGHRCAGQQQDIRHCYSIQHCP (서열 52)을 갖는 TSR5의 C-말단 반에 맵핑된 mAb 19.1의 에피토프를 보여주었다 (도 7 참조). 통상의 PCR에 의해 TSR0-4 + ¼ TSR5, TSR0-4 + ½ TSR5 또는 TSR0-4 + 3/4 TSR5를 포함하는 세 인간 프로퍼딘 돌연변이체를 생성하였다. 이들을 pCAGGS로 클로닝하고 실시예 5에 기재된 바와 같이 CHO 세포에서 발현시켰다. 염소 항-인간 프로퍼딘 항체를 사용하여 웨스턴 분석에 의해 단백질 발현을 확인하였다. 블롯을 스트리핑하고 마우스 항-His 태그 항체 (퀴아젠)으로 재프로빙하여 C-말단 His 태그가 존재함 (C-말단 단백질이 분해되지 않음)을 확인하였다. mAb 19.1과의 반응성을 측정하기 위해 실시예 6에 기재된 바와 같이 샌드위치 ELISA 검정을 수행하였다. 19.1과 상이한 에피토프에 결합된 mAb 29.3을 대조군으로서 사용하여 돌연변이체 단백질 발현을 확인하였다.
실시예 8
에피토프 맵핑은 다음의 아미노산 서열 LVVEEKRPCLHVPACKDPEEEEL (서열 53)을 갖는 TSR6의 C-말단 쿼터 절편에 맵핑된 mAb 25의 에피토프를 보여주었다 (도 8 참조). 통상의 PCR에 의해 TSR0-5 + ¼ TSR6, TSR0-5 + ½ TSR6 또는 TSR0-5 + 3/4 TSR6를 포함하는 세 인간 프로퍼딘 돌연변이체를 생성하였다. 이들을 pCAGGS로 클로닝하고 실시예 5에 기재된 바와 같이 CHO 세포에서 발현시켰다. 염소 항-인간 프로퍼딘 항체를 사용하여 웨스턴 분석에 의해 단백질 발현을 확인하였다. 블롯을 스트리핑하고 마우스 항-His 태그 항체 (퀴아젠)으로 재프로빙하여 C-말단 His 태그가 존재함 (C-말단 단백질이 분해되지 않음)을 확인하였다. mAb 25와의 반응성을 측정하기 위해 실시예 6에 기재된 바와 같이 샌드위치 ELISA 검정을 수행하였다. 25와 상이한 에피토프에 결합된 mAb 19.1을 대조군으로서 사용하여 돌연변이체 단백질 발현을 확인하였다. 에피토프 맵핑은 또한 mAb 25의 에피토프가 TSR6 (서열 61 (도 5b에 나타냄))에서의 두 시스테인 잔기에 좌우됨을 보여주었다. 이들은 TSR6의 시스테인 62 (C62) 및 시스테인 78 (C78)이다. 긴 인간 프로퍼딘에서의 C62 또는 C78의 알라닌 (A)에 대한 단일 돌연변이는 mAb 25 결합을 제거하지 않았으나 C62A 및 C78A의 이중 돌연변이는 mAb 25 결합을 제거하였다. 돌연변이체 단백질 발현을 위한 양성 대조군으로서, mAb 19.1은 모든 샘플에 대해 반응성을 보였다. 이러한 결과는 서열 53 외부에 위치하나 TSR 6 (서열 61) 내에 위치하는 C62뿐만 아니라 TSR6의 마지막 쿼터 절편 내의 C78 (서열 53에 의해 고안된 서열을 가짐)이 mAb 25의 에피토프의 두 중요한 잔기를 구성함을 암시한다. 형질감염된 CHO 세포의 균질물을 사용하여 ELISA 플레이트상에서 mAb 19.1 및 25의 결합 검정을 수행하였다. HuP는 양성 대조군으로서 긴 (무손상) 인간 fP 형질감염된 CHO 세포를 지칭하며, Con은 결합을 위한 음성 대조군으로서 형질감염되지 않은 CHO 세포를 지칭한다. 다른 샘플은 단일 또는 이중 C62A 및 C78A 돌연변이를 함유하는 돌연변이체 인간 fP cDNA로 형질감염된 CHO 세포이다.
실시예 9
CHO 세포에서의 재조합 키메라 및 인간화 19.1 mAb의 발현을 평가하는 실험을 수행하였다 (도 17 참조). EcoRI/NheI 부위를 사용하여 mAb 19.1의 가변적인 영역 (서열 1)을 pFUSE-CHIg-hG4 벡터 (인비보젠 제조, 인간 IgG4 중쇄 유전 영역 함유, 프롤린으로 변이시킨 세린 229를 가짐)로 클로닝함으로써 키메라 19.1 중쇄 cDNA가 구성되었다. AgeI/BsiWI 부위를 사용하여 mAb 19.1 (서열 6)의 가변적인 영역을 pFUSE2-CLIg-hk 벡터 (인비보젠 제조, 인간 k 경쇄 유전 영역 함유)로 클로닝함으로써 키메라 19.1 경쇄 cDNA가 구성되었다. EcoRI/NheI 부위를 사용하여 19.1의 인간화 중쇄 가변적인 영역 (서열 42 및 서열 44를 코딩하는 cDNA, 진스크립트에 의해 합성됨)을 pFUSE-CHIg-hG4 벡터 (인비보젠 제조, 인간 IgG4 중쇄 유전 영역 함유, 프롤린으로 변이시킨 세린 229를 가짐)로 클로닝함으로써 인간화 19.1 중쇄 cDNA가 구성되었다. AgeI/BsiWI 부위를 사용하여 19.1의 인간화 경쇄 가변적인 영역 (서열 47을 코딩하는 cDNA, 진스크립트에 의해 합성됨)을 pFUSE2-CLIg-hk 벡터 (인비보젠 제조, 인간 k 경쇄 유전 영역 함유)로 클로닝함으로써 인간화 19.1 경쇄 cDNA가 구성되었다. 리포펙타민 시약을 사용하여 CHO세포를 19.1의 키메라 중쇄 및 경쇄 또는 19.1의 인간화 중쇄 및 경쇄 (두 인간화 중쇄는 동일한 인간화 경쇄와 쌍을 이룸)로 공동-형질감염시켰다. 형질감염 후, CHO 세포를 대략 7일 동안 제오신 (1 mg/ml) 및 블라스트시딘 (10μg/ml)으로 선택하였다. 약물-내성 세포 콜로니를 얻고, 트립신화하고, 동일한 선택 약물의 존재하에 96-웰 플레이트에서 제한된 희석 배양을 수행하였다. 96-웰 플레이트에서 세포를 합한 후, 배지를 ELISA에 의해 인간 프로퍼딘과의 반응성에 대해 시험하고, 양성 클론을 팽창시켰다. 항체 제조를 위해, 형질감염된 CHO 세포의 안정한 라인을 DMEM: 150 cm 배양 플라스크 중에서 10% FBS를 갖는 F12 배지에서 성장시키고, 합한 후, 이들을 혈청이 없는 CD-CHO 배지 (인비트로젠)로 대체하였다. 3일 후, 배지를 수집하고 mAb를 단백질 G 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 정제된 mAb의 분취액을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
실시예 10
mAb 19.1, 키메라 mAb 19.1, 인간화 mAb 19.1, mAb 25, mAb 22.1 및 mAb 30의 항원 결합 친화도를 측정하는 실험을 수행하였다 (도 18 및 19 참조). 표면 플라즈몬 공명 분석을 이용하여 항-인간 프로퍼딘 mAb의 고정화 인간 프로퍼딘에의 결합에 대한 회합 및 해리 속도 상수를 비아코어 2000 기기 (비아코어 AB, 스웨덴 웁살라)를 사용하여 측정하였다. 비아코어 실험은 25℃에서 수행하였다. CM4 센서 칩의 카르복실화 덱스트란 매트릭스를 사용하여 아민 커플링 화학에 의해 정제된 인간 프로퍼딘을 커플링하여 200RU 표면 밀도를 얻었다. mAb를 HBSET (EDTA 및 트윈 20을 갖는 HEPES 완충 염수) 완충제 중에서 150, 75, 35.5, 17.75, 8.87 및 0 nM로 희석하고, 샘플을 프로퍼딘 표면 상으로 30 μl/분 (60 μl 주사)으로 120초 동안 주사하고, 결합된 분석물의 해리가 900초 동안 진행되게 하였다. 데이터를 2가 결합 모델을 가정한 BIA 평가 소프트웨어 3.2에 의해 분석하였다. 표면의 재생을 50 mM NaOH 50 μl 주사 (50μl/분)로 달성하였다.
실시예 11
LPS-유도된 인간 AP 보체 활성화를 차단하는데 있어서 19.1, 키메라 19.1 및 2가지 인간화 19.1 mAb의 상대적 활성을 평가하는 실험을 수행하였다 (도 20 참조). ELISA 플레이트 (96-웰, 눈크)를 50 μl LPS 용액으로 코팅하였다 (PBS 중 40 μg/ml, 4℃에서 밤새). 다음날, 플레이트를 0.05% PBS-T를 함유하는 PBS로 3회 세척하고, 0, 5, 10 또는 20 μg/ml 항-프로퍼딘 mAb로 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션된 50 μl 50% NHS를 첨가하였다. NHS를 GVB-EGTA-Mg++ (10 mM EGTA 및 2.5mM Mg++ 함유, 최종 농도)로 희석하였다. 플레이트를 방치하여 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, PBS-T로 3회 세척한 후, 50 μl HRP-컨쥬게이션된 염소 항-인간 C3 항체 (1:4000, 카펠)를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 방치하였다. 플레이트를 PBS-T로 3히 세척한 후, BD 파밍겐 A+B 시약을 사용하여 전개시켰다. 2 N H2SO4로 5분 후 반응을 중지시켰다. AP 보체 활성화를 플레이트 상의 C3 침착의 양 (OD450)을 측정함으로써 검출하였다. EDTA가 첨가된 샘플 (NHSEDTA)은 음성 대조군으로서 기능하였다 (EDTA는 보체 활성화를 차단함). mAb가 첨가되지 않은 샘플 (NHS)은 기준선 AP 보체 활성화로서 기능하였다.
실시예 12
fH 및 DAF 기능장애의 맥락에서 인간 AP 보체에 의한 인간 RBC 용해를 차단하는데 있어서 19.1, 키메라 19.1 및 2가지 인간화 19.1 mAb의 상대적 활성을 평가하기 위한 실험을 수행하였다 (도 21 참조). 정상 인간 RBC (5 x 10⁶ 세포)를 100 μl 50% NHS (10 mM EGTA 및 2.5mM Mg++ 최종 농도를 함유하는 GVB-EGTA-Mg++로 희석)로 30 μM 재조합 fH 19-20 및 7.5 μg 마우스 항-인간 DAF (ADB 세로텍으로부터)의 존재하에 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다 (문헌 [2006, Ferreira et al., J Immunol. 177:6308-6316]). RBC에 첨가하기 전, NHS를 1 내지 15 μg/ml의 다양한 항-프로퍼딘 mAb로 4℃에서 1시간 동안 예비-인큐베이션하였다. PBS 중 200 μl 빙냉 20 mM EDTA의 첨가에 의해 용해 반응을 중지시켰다. 인큐베이션 혼합물을 1500 g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 수집하고, OD420 nm에 대해 측정하였다. 첨가된 NHS 또는 fH19-20이 없거나 EDTA가 첨가된 샘플을 음성 용해 대조군으로서 사용하고, 100 μl 증류수로 완전히 용해된 RBC의 샘플을 다른 샘플에서의 % 용해율이 표준화된 양성 대조군 (100% 용해)으로서 사용하였다.
실시예 13
LPS-유도된 레서스 원숭이 및 시노몰구스 원숭이 AP 보체 활성화를 차단하는데 있어서 19.1, 키메라 19.1 및 2가지 인간화 19.1 mAb의 상대적 활성을 평가하기 위한 실험을 수행하였다 (도 22 및 23 참조). ELISA 플레이트 (96-웰, 눈크)를 50 μl LPS 용액으로 코팅하였다 (PBS 중 40μg/ml, 4℃에서 밤새). 다음날, 플레이트를 0.05% PBS-T를 함유하는 PBS로 3회 세척하고, 0, 10, 20, 30 또는 40 μg/ml 항-프로퍼딘 mAb로 4℃에서 1시간 동안 예비-인큐베이션된 50 μl 50% 정상 레서스 원숭이 혈청 (NRS) 또는 정상 시노몰구스 원숭이 혈청 (NCS)을 첨가하였다. NRS 또는 NCS를 GVB-EGTA-Mg++ (10 mM EGTA 및 2.5mM Mg++ 함유, 최종 농도)로 희석하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 방치하여 인큐베이션하고, PBS-T에서 3회 세척한 후, 50 μl HRP-컨쥬게이션된 염소 항-인간 C3 항체 (1:4000, 카펠, 원숭이 C3과 교차 반응)를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 방치하였다. 플레이트를 PBS-T로 3회 세척한 후, BD 파밍겐 A+B 시약을 사용하여 전개시켰다. 2 N H2SO4로 5분 후 반응을 중지시켰다. AP 보체 활성화를 플레이트 상의 C3 침착의 양 (OD450)을 측정함으로써 검출하였다. EDTA가 첨가된 샘플 (NRSEDTA 또는 NCSEDTA)는 음성 대조군으로서 기능하였다 (EDTA는 보체 활성화를 차단함). mAb가 첨가되지 않은 샘플 (NRS 또는 NCS)은 기준선 AP 보체 활성화로서 기능하였다.
실시예 14
mAb 19.1, 25 및 인간화 19.1-459에 의한 PNH 적혈구의 산성화된 혈청 용해의 억제를 평가하기 위한 실험 (햄 (Ham)의 시험)을 수행하였다 (도 24 참조). 발작성 야간 혈색소뇨 (PNH) 환자로부터의 RBC에 대해 mAb의 존재 또는 부재하에 햄의 산성화된 혈청 시험을 수행하였다. RBC를 자가 혈청 (최종 농도 83%)으로 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고, % 용해율을 상청액의 OD405를 측정함으로써 계산하고, 증류수 (Eh DDW)에 의해 완전히 용해된 RBC의 샘플에 대해 표준화하였다. 인큐베이션 혼합물은 하기로 구성되었다: 혈청 240 μl, 1/6 N HCL 25 μl (또는 음성 대조군용 25 μl 염수), 50% (v/v) RBC 현탁액 12.5 μl, 염수 중 10 μl mAb. 비산성화된 자가 혈청 (NHS)으로 인큐베이션된 RBC의 샘플을 음성 대조군 (배경 용해물)으로서 사용하였다. mAb의 부재하에, RBC 약 50%가 산성화된 혈청에 의해 용해되었다. 이 용해는 mAb 19.1에 의해 8 μg/ml 및 상기 농도에서, 인간화 19.1 mAb (#459)에 의해 20 μg/ml의 농도에서, 그리고 mAb 25에 의해 8 μg/ml 및 상기 농도에서 완전히 억제되었다.
실시예 15
프로퍼딘 인간화 마우스를 하기와 같이 생성하였다 (도 25 참조). 도 25a의 개략도에 예시된 바와 같이, 인간 fP 발현 벡터를 pACGGS 플라스미드 중에서 진핵 세포 중 cDNA의 적합한 발현을 위한 CVM-IE 인핸서를 갖는 닭 β-액틴 프로모터 및 토끼 β-글로빈 polyA 꼬리를 사용하여 구축하였다. 발현 벡터를 구축하는데 사용된 인간 프로퍼딘 cDNA 서열 및 그의 코딩된 단백질 서열은 서열 67 및 서열 68에 나타나 있다. 플라스미드를 제한 효소 소화에 의해 선형화하고, C57BL/6 마우스의 접합체 내로 미세주사하여 인간 fP 트랜스제닉 파운더 마우스를 제조하였다. PCR 스크리닝 (인간 fP 5'-ATCAGAGGCCTGTGACACC-3' (서열 65) 및 5'-CTG CCCTTGTAGCTCCTCA-3' (서열 66) 및 마우스 꼬리로부터 단리된 게놈 DNA에 특이적인 프라이머 사용)에 의해, 양성 파운더 마우스 (약 800 bp의 인간 fP cDNA 단편을 나타냄)를 확인할 수 있다. 분석된 40 마리의 마우스 중에서, 5 마리 (#15, 20, 24, 27 및 32)는 양성이었다 (도 25b, 적색 화살표). 샌드위치 ELISA 검정을 수행하여 트랜스제틱 양성 마우스에서 인간 fP를 검출하였다 (도 25c). 플레이트를 인간 fP에 대한 비-차단 mAb (클론 8.1)로 코팅하였다. 희석된 마우스 혈청 (10%)으로 인큐베이션한 후, 인간 fP를 HRP-컨쥬게이션된 염소 항-인간 fP 항체를 사용하여 검출하였다. 정상 인간 혈청 (NHS)을 양성 대조군으로서 사용하였다. 이 방법에 의해, 인간 fP는 NHS 및 트랜스진 양성 마우스의 혈청 (예를 들어, 15, 20, 24, 27, 32)에서는 검출되지만, 정상 (즉, 비-트랜스제닉, 예를 들어 29) 마우스 또는 fP^-/--마우스 혈청에서는 검출되지 않았다. 그 후, 생식선 전달을 확립하기 위해 트랜스제닉 양성 파운더 마우스를 WT 마우스와 함께 사육하였다. 이러한 교배로부터의 F1 마우스의 스크리닝은 상기 기재된 바와 같이 트랜스진을 검출하는 꼬리 DNA의 PCR에 의해, 및 그들의 혈청 중에서 인간 프로퍼딘을 검출하는 샌드위치 ELISA에 의해 달성되었다. 생식선 전달을 확인한 후, 파운더 마우스를 fP^-/- 마우스와 함께 사육하여 fP^-/--인간 fP 트랜스진 + 마우스를 생성하였다. fP^-/--인간 fP 트랜스진+ 마우스에서의 AP 보체 활성의 복원을 실시예 2에 기재된 바와 같이 LPS-유도된 AP 활성화 검정에 의해 평가하였다. 본 검정에서, AP 보체 활성은 인간 fP 트랜스진 양성인 fP^-/- 마우스의 혈청 및 WT 마우스 혈청에서 검출되지만, fP^-/- 마우스의 혈청에서는 검출되지 않았다. 본 검정에서, EDTA로 처리된 WT 마우스 혈청은 AP 보체 활성화에 대한 음성 대조군으로서 사용될 것이다.
실시예 16
"프로퍼딘 인간화" 마우스에서의 mAb 25의 생체내 활성 및 동역학을 검사하기 위한 실험을 수행하였다 (도 26). 프로퍼딘 인간화 마우스 (fP^-/--인간 fP 트랜스진+)에 mAb 25 0.5 mg (i.p.)을 주사하였다. 주사 전 (0시간)에, 그 후 주사 후 다양한 시점에서 레트로-오비탈 사육 및 제조된 혈청에 의해 혈액 샘플 (50 내지 75 μl)을 수집하였다. 혈청 샘플을 LPS-유도된 AP 보체 활성화에 대해 시험하였다. 본 검정을 위해, ELISA 플레이트 (96-웰, 눈크)를 50 μl LPS 용액으로 코팅하였다 (PBS 중 40 μg/ml, 4℃에서 밤새). 다음날, 플레이트를 0.05% 트윈-20 (PBS-T)을 함유하는 PBS로 3회 세척하고, 연속적으로 희석된 (1:10부터 시작) 마우스 혈청 50 μl을 각 웰에 첨가하였다. 마우스 혈청을 GVB-EGTA-Mg++ (10 mM EGTA 및 2.5mM Mg++ 함유, 최종 농도)로 희석하였다. 플레이트를 방치하여 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, PBS-T로 3회 세척한 후, 50 μl HRP-켄쥬게이션된 토끼 항-마우스 C3 항체 (1:2000, 카펠)를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 방치하였다. 플레이트를 PBS-T로 3회 세척한 후, BD 파밍겐 A+B 시약을 사용하여 전개시켰다. 2 N H2SO4로 5분 후에 반응을 중지시켰다. AP 보체 활성화를 플레이트 상의 C3 침착의 양 (OD450)을 측정함으로써 검출하였다. 이 예시된 실시예에서, AP 보체 활성은 fP^-/- 마우스 혈청 또는 EDTA로 처리된 WT 혈청에서는 존재하지 않았다. 반대로, AP 보체 활성은 WT 혈청 및 fP 인간화 마우스의 혈청에서 0시간 (mAb 25 처리 전)에 검출되었다. 인간화 마우스에서의 AP 보체 활성은 mAb 25 처리 후 8, 24 및 48시간에서 억제되어 잔류하지만, 72, 96 및 120시간에서 검출가능하게 되었다. 이 결과는 0.5 mg/마우스의 투여량에서 mAb 25는 적어도 48시간 동안 생체내에서 AP 보체 활성을 억제할 수 있음을 입증한다.
실시예 17
혈관외 용혈 (EVH)에 대한 항-인간 프로퍼딘 mAb 19.1의 효과를 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 이 EVH 모델에서, 프로퍼딘 인간화 마우스 (실험군 당 n=4)에 Crry/DAF/C3 트리플 녹아웃 (TKO) 마우스로부터의 적혈구 (RBC)를 주입하였다. 수용자 마우스 (프로퍼딘 인간화 마우스)를 mAb 19.1 (2 mg/마우스, i.p.) 또는 대조군 마우스 IgG1 mAb (MOPC, MoPC 31C 하이브리도마로부터 정제됨, ACTT로부터)로 RBC 이동 전 6시간 처리하였다. 이미 공개된 절차에 따라, RBC를 공여자 TKO 마우스로부터 수확하고, PBS 중에서 세척하고, CFSE로 라벨링한 후, 수용자 마우스 내로 주사 (꼬리 정맥을 통해)하였다 (문헌 [Miwa et al., 2002, Blood 99: 3707-3716]). 각각의 수용자 마우스는 혈액 100 μl 와 동등한 RBC를 받았다. RBC 수혈 5분 및 6, 24, 48, 72, 96, 120시간 후, 수용자 마우스를 사육하고, RBC를 분석하여 순환기에 잔류하는 CFSE-라벨링된 (즉, 주입된) RBC의 수를 측정하였다. 각각의 수용자에서 CFSE-라벨링된 RBC의 수를 5분 시점에서 검출된 것으로 표준화하였다 (%로서). 대조군 IgG (MOPC)-처리된 수용자 마우스에서, TKO RBC는 이전의 발견과 일치하게 EVH를 통해 급속하게 제거된다 (문헌 [Miwa et al., 2002, Blood 99: 3707-3716]). 그러나, 항-인간 프로퍼딘 19.1 mAb로 처리된 수용자 마우스에서, EVH는 발생하지 않고, 주입된 RBC는 존속하며, 이는 항-프로퍼딘 mAb는 EVH를 방지하는데 효과적임을 입증한다 (도 27).
본원에 인용된 각각의 및 모든 특허, 특허 출원 및 간행물의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.
본 발명을 구체적 실시양태를 참고로 개시하였지만, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 본 발명의 다른 실시양태 및 변경이 당업자에 의해 고안될 수 있음은 명백하다. 첨부된 특허청구범위는 모든 이러한 실시양태 및 등가의 변경을 포함하는 것으로 간주되는 것을 의도한다.

SEQUENCE LISTING <110> The Trustees of the University of Pennsylvania Song, Wenchao <120> ANTI-PROPERDIN ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 046483-6012-00-WO.601477 <150> US 61/503,900 <151> 2011-07-01 <160> 67 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 427 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 gagcatggct gtcttggggc tgctcttctg cctggtgaca ttcccaagct gtgtcctatc 60 ccaggtgcag ctcaagcagt caggacctgg cctagtgcag ccctcacaga gcctgtccat 120 ctcctgcaca gtctctggtt tctcattaac tacctatggt gttcactggg ttcgccagtc 180 tccaggaaag ggtctggaat ggctgggagt gatttggagt ggtggagaca cagactataa 240 tgcatctttc atatccagac tgcgcatcaa caaggacact tccaagagcc aagttttctt 300 taaaatgaac agtctgcaag ctgatgacac agccatttat tactgtgcca gaaataagga 360 ctattatact aactacgact ttactatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt 420 ctcctca 427 <210> 2 <211> 140 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 Thr Thr Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Ala 65 70 75 80 Ser Phe Ile Ser Arg Leu Arg Ile Asn Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln 85 90 95 Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Tyr Tyr 100 105 110 Cys Ala Arg Asn Lys Asp Tyr Tyr Thr Asn Tyr Asp Phe Thr Met Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr Gly Val His 1 5 10 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Val Ile Trp Ser Gly Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Ala Ser Phe Ile Ser 1 5 10 15 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Asn Lys Asp Tyr Tyr Thr Asn Tyr Asp Phe Thr Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 429 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 ggcaggggga tcaagatgga atcacagact caggtcttcc tctccctgct gctctgggta 60 tctggtacct gtgggaacat tatgatgaca cagtcgccat catctctggc tgtgtctgca 120 ggagaaaagg tcactatgag ctgtaagtcc agtcaaagtg ttttatacag ttcaaatcag 180 aagaacttct tggcctggta ccagcagaaa ccaggacagt ctcctaaact gctgatctac 240 tgggcatcca ctagggaatc tggtgtccct gatcgcttca caggcagtgg atctgggaca 300 gattttattc ttacgatcaa cagtgtacaa gttgaagacc aggcagttta ttactgtcac 360 caatacctct cctcgtacac gttcgggggg gggaccaagc tggaaataaa acgggctgat 420 gctgcacca 429 <210> 7 <211> 132 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Phe Leu Ser Leu Leu Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Ile Leu Thr Ile Asn Ser Val Gln Val Glu Asp Gln Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys His Gln Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys 130 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Phe Leu 1 5 10 15 Ala <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 His Gln Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr 1 5 <210> 11 <211> 487 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 11 aacagcatat gatcagtgtc ctctccaaag tccttgaaca tagactctaa ccatggactg 60 gacctgggtc tttctcttcc tcctgtcagt aactgcaggt gtccactccc aggttcagct 120 gctgcagtct ggagctgagg tgatgaagcc tggggcctca gtgacccttt cctgcaaggc 180 tattggttac acattcattg actactggat agagtggata aagcagaggc ctggacatgg 240 ccttgagtgg attggagaga tttttcctgg aagtgggact attaatcaca atgagaagtt 300 caaggacaag gccagtttta gtgctcattc atcctccaac acagcctaca tgcaactcag 360 cagactgaca agtgaggact ctgccatcta ttactgtgca agagagggac tggactattg 420 gggccaaggc accactctca cagtctcctc agccaaaacg acacccccat ctgtctatcc 480 actggcc 487 <210> 12 <211> 133 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Met Asp Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Met Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ile Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Ile Asp Tyr Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Thr Ile Asn His Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Ser Phe Ser Ala His Ser Ser Ser Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 115 120 125 Leu Thr Val Ser Ser 130 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr Trp Ile Glu 1 5 10 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Thr Ile Asn His Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Glu Gly Leu Asp Tyr 1 5 <210> 16 <211> 420 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 16 ccaaaattca aagacaaaat ggattttcaa gtgcagattt tcagcttcct gctaatcagt 60 gcctcagtca taatatccag aggacaaatt gttctcaccc agtctccagc aatcatgtct 120 gcatctccag gggagagggt caccatgacc tgcagtgcca gctcaagtgt aagttatata 180 tactggtacc agcagaagtc aggcacgtcc cccaaaagat ggatttttga cacatccaca 240 ctggcttctg gagtccctac tcgcttcagt ggcagtgggt ctgggacctc ttactctctc 300 acaatcagca gcatggagac tgaagatgct gccacttatt actgccagca gtggagtaga 360 aacccattca cgttcggttc ggggacaaag ttggaaataa aacgggctga tgctgcacca 420 <210> 17 <211> 128 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Ile Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile 20 25 30 Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser 35 40 45 Ser Ser Val Ser Tyr Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser 50 55 60 Pro Lys Arg Trp Ile Phe Asp Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Thr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Met Glu Thr Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 100 105 110 Ser Arg Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile Tyr 1 5 10 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 Asp Thr Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Phe Thr 1 5 <210> 21 <211> 464 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 21 gagcatggct gtcttggggc tgctcttctg cctggtgaca ttcccaagct gtgtcctatc 60 ccaggtgcag ctgaagcagt caggacctgg cctagtgcag ccctcacaga gcctgtccat 120 cacctgcaca gtctctggtt tctcattaac tagctatggt gtacactggg ttcgccagtc 180 tccaggaaag ggtctggagt ggctgggagt gatatggagt ggtggaagca cagactataa 240 tgcagctttc atatccagac tgagcatcag caaagacact tccaagagcc aagttttctt 300 taaaatgaac agtctgcaac ctgatgacac agccatatat tactgtgcca gaaataaaga 360 cttctatagt aactacgact atactatgga actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg 420 tctcctcagc caaaacgaca cccccatctg tctatccact ggcc 464 <210> 22 <211> 141 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22 Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 Thr Ser Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala 65 70 75 80 Ala Phe Ile Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln 85 90 95 Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Pro Asp Asp Thr Ala Ile Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Asn Lys Asp Phe Tyr Ser Asn Tyr Asp Tyr Thr Met 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val His 1 5 10 <210> 24 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 24 Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser 1 5 10 15 <210> 25 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 25 Asn Lys Asp Phe Tyr Ser Asn Tyr Asp Tyr Thr Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 26 <211> 414 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 26 atggaatcac agactcaggt cttcctctcc ctgctgctct gggtatctgg tacctgtggg 60 aacattatga tgacacagtc gccatcattt ttggctgtgt ctgcaggaga aaaggtcact 120 ttgagctgta agtccagtca aagtgtttta tacagttcaa atcagaagaa cttcttggcc 180 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 240 gaatctggtg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt tactcttacc 300 atcagcagtg tacaagctga agacctggca gtttattact gtcatcaata cctctcctcg 360 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacggg ctgatgctgc acca 414 <210> 27 <211> 132 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27 Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Phe Leu Ser Leu Leu Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ala 20 25 30 Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys His Gln Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys 130 <210> 28 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Phe Leu 1 5 10 15 Ala <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 His Gln Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr 1 5 <210> 31 <211> 451 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 31 atggaattga tctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactctgag 60 gtccagcttc agcagtctgg agttgagctg gtgaggcctg ggtcctcagt gaagatgtcc 120 tgcaagactt ctggatatac attyacagcc tacggtataa actgggtgaa gcagaggcct 180 ggacagggcc tggaatggat tggatatatt tatattggaa atggttatac tgactacaat 240 gagaagttca agggcaaggc cacactgact tcagacacat cctccagcac agcctacatg 300 cagctcagca gcctggcatc tgaggactct gcaatctatt tctgtcaaga tcggggtggg 360 acgaggacta tgctatggac ttctggggtc aaggaacctc agtcaccgtc tcctcagcca 420 aaacaacagc cccatcggtc tatccatggc c 451 <210> 32 <211> 139 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 32 Met Glu Leu Ile Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Val Glu Leu Val Arg 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Xaa 35 40 45 Thr Ala Tyr Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Ile Gly Asn Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Ile 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Gly Trp Asp Glu Asp Tyr Ala Met Asp Phe 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 33 Gly Tyr Thr Xaa Thr Ala Tyr Gly Ile Asn 1 5 10 <210> 34 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 34 Tyr Ile Tyr Ile Gly Asn Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 35 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 35 Ser Gly Trp Asp Glu Asp Tyr Ala Met Asp Phe 1 5 10 <210> 36 <211> 399 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 36 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacagg tggcagatgt 60 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 120 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agttatttag catggtatca gcagaaacag 180 agaaaatctc ctcacctcct ggtctatcat gcaaaaacct tagcagaagg tgtgacatca 240 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttctctga agatccacag cctgcagcct 300 gaagattttg ggacttatta ctgtcaacat cattatggtc ctcctcccac gttcggctcg 360 gggacaaagt tggaaataaa acgggctgat gctgcacca 399 <210> 37 <211> 127 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37 Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Gly Gly Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn 35 40 45 Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Arg Lys Ser Pro 50 55 60 His Leu Leu Val Tyr His Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Thr Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile His 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr 100 105 110 Gly Pro Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 38 Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 39 His Ala Lys Thr Leu Ala Glu 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 40 Gln His His Tyr Gly Pro Pro Pro Thr 1 5 <210> 41 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile 35 40 45 Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 85 90 95 Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg 115 <210> 42 <211> 141 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 42 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 Thr Thr Tyr Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Ala 65 70 75 80 Ser Phe Ile Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 85 90 95 Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Asn Lys Asp Tyr Tyr Thr Asn Tyr Asp Phe Thr Met 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 43 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg <210> 44 <211> 141 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 44 Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 Thr Thr Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Val Ile Trp Ser Gly Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Ala 65 70 75 80 Ser Phe Ile Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 85 90 95 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Asn Lys Asp Tyr Tyr Thr Asn Tyr Asp Phe Thr Met 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 45 <211> 99 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr 85 90 95 Ser Thr Pro <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 47 <211> 132 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 47 Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Phe Leu Ser Leu Leu Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys His Gln Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys 130 <210> 48 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 49 <211> 133 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 49 Met Asp Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Ile Asp Tyr Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Thr Ile Asn His Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 115 120 125 Val Thr Val Ser Ser 130 <210> 50 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser 100 105 110 Asn Trp Pro 115 <210> 51 <211> 126 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 51 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser 35 40 45 Val Ser Tyr Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg 100 105 110 Asn Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 115 120 125 <210> 52 <211> 32 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 52 Arg Gly Arg Thr Cys Arg Gly Arg Lys Phe Asp Gly His Arg Cys Ala 1 5 10 15 Gly Gln Gln Gln Asp Ile Arg His Cys Tyr Ser Ile Gln His Cys Pro 20 25 30 <210> 53 <211> 23 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 53 Leu Val Val Glu Glu Lys Arg Pro Cys Leu His Val Pro Ala Cys Lys 1 5 10 15 Asp Pro Glu Glu Glu Glu Leu 20 <210> 54 <211> 469 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Met Ile Thr Glu Gly Ala Gln Ala Pro Arg Leu Leu Leu Pro Pro Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gly Ser Asp Pro Val Leu Cys 20 25 30 Phe Thr Gln Tyr Glu Glu Ser Ser Gly Lys Cys Lys Gly Leu Leu Gly 35 40 45 Gly Gly Val Ser Val Glu Asp Cys Cys Leu Asn Thr Ala Phe Ala Tyr 50 55 60 Gln Lys Arg Ser Gly Gly Leu Cys Gln Pro Cys Arg Ser Pro Arg Trp 65 70 75 80 Ser Leu Trp Ser Thr Trp Ala Pro Cys Ser Val Thr Cys Ser Glu Gly 85 90 95 Ser Gln Leu Arg Tyr Arg Arg Cys Val Gly Trp Asn Gly Gln Cys Ser 100 105 110 Gly Lys Val Ala Pro Gly Thr Leu Glu Trp Gln Leu Gln Ala Cys Glu 115 120 125 Asp Gln Gln Cys Cys Pro Glu Met Gly Gly Trp Ser Gly Trp Gly Pro 130 135 140 Trp Glu Pro Cys Ser Val Thr Cys Ser Lys Gly Thr Arg Thr Arg Arg 145 150 155 160 Arg Ala Cys Asn His Pro Ala Pro Lys Cys Gly Gly His Cys Pro Gly 165 170 175 Gln Ala Gln Glu Ser Glu Ala Cys Asp Thr Gln Gln Val Cys Pro Thr 180 185 190 His Gly Ala Trp Ala Thr Trp Gly Pro Trp Thr Pro Cys Ser Ala Ser 195 200 205 Cys His Gly Gly Pro His Glu Pro Lys Glu Thr Arg Ser Arg Lys Cys 210 215 220 Ser Ala Pro Glu Pro Ser Gln Lys Pro Pro Gly Lys Pro Cys Pro Gly 225 230 235 240 Leu Ala Tyr Glu Gln Arg Arg Cys Thr Gly Leu Pro Pro Cys Pro Val 245 250 255 Ala Gly Gly Trp Gly Pro Trp Gly Pro Val Ser Pro Cys Pro Val Thr 260 265 270 Cys Gly Leu Gly Gln Thr Met Glu Gln Arg Thr Cys Asn His Pro Val 275 280 285 Pro Gln His Gly Gly Pro Phe Cys Ala Gly Asp Ala Thr Arg Thr His 290 295 300 Ile Cys Asn Thr Ala Val Pro Cys Pro Val Asp Gly Glu Trp Asp Ser 305 310 315 320 Trp Gly Glu Trp Ser Pro Cys Ile Arg Arg Asn Met Lys Ser Ile Ser 325 330 335 Cys Gln Glu Ile Pro Gly Gln Gln Ser Arg Gly Arg Thr Cys Arg Gly 340 345 350 Arg Lys Phe Asp Gly His Arg Cys Ala Gly Gln Gln Gln Asp Ile Arg 355 360 365 His Cys Tyr Ser Ile Gln His Cys Pro Leu Lys Gly Ser Trp Ser Glu 370 375 380 Trp Ser Thr Trp Gly Leu Cys Met Pro Pro Cys Gly Pro Asn Pro Thr 385 390 395 400 Arg Ala Arg Gln Arg Leu Cys Thr Pro Leu Leu Pro Lys Tyr Pro Pro 405 410 415 Thr Val Ser Met Val Glu Gly Gln Gly Glu Lys Asn Val Thr Phe Trp 420 425 430 Gly Arg Pro Leu Pro Arg Cys Glu Glu Leu Gln Gly Gln Lys Leu Val 435 440 445 Val Glu Glu Lys Arg Pro Cys Leu His Val Pro Ala Cys Lys Asp Pro 450 455 460 Glu Glu Glu Glu Leu 465 <210> 55 <211> 48 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Asp Pro Val Leu Cys Phe Thr Gln Tyr Glu Glu Ser Ser Gly Lys Cys 1 5 10 15 Lys Gly Leu Leu Gly Gly Gly Val Ser Val Glu Asp Cys Cys Leu Asn 20 25 30 Thr Ala Phe Ala Tyr Gln Lys Arg Ser Gly Gly Leu Cys Gln Pro Cys 35 40 45 <210> 56 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Ser Pro Arg Trp Ser Leu Trp Ser Thr Trp Ala Pro Cys Ser Val Thr 1 5 10 15 Cys Ser Glu Gly Ser Gln Leu Arg Tyr Arg Arg Cys Val Gly Trp Asn 20 25 30 Gly Gln Cys Ser Gly Lys Val Ala Pro Gly Thr Leu Glu Trp Gln Leu 35 40 45 Gln Ala Cys Glu Asp Gln Gln Cys Cys Pro 50 55 <210> 57 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Glu Met Gly Gly Trp Ser Gly Trp Gly Pro Trp Glu Pro Cys Ser Val 1 5 10 15 Thr Cys Ser Lys Gly Thr Arg Thr Arg Arg Arg Ala Cys Asn His Pro 20 25 30 Ala Pro Lys Cys Gly Gly His Cys Pro Gly Gln Ala Gln Glu Ser Glu 35 40 45 Ala Cys Asp Thr Gln Gln Val Cys Pro 50 55 <210> 58 <211> 64 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Thr His Gly Ala Trp Ala Thr Trp Gly Pro Trp Thr Pro Cys Ser Ala 1 5 10 15 Ser Cys His Gly Gly Pro His Glu Pro Lys Glu Thr Arg Ser Arg Lys 20 25 30 Cys Ser Ala Pro Glu Pro Ser Gln Lys Pro Pro Gly Lys Pro Cys Pro 35 40 45 Gly Leu Ala Tyr Glu Gln Arg Arg Cys Thr Gly Leu Pro Pro Cys Pro 50 55 60 <210> 59 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Val Ala Gly Gly Trp Gly Pro Trp Gly Pro Val Ser Pro Cys Pro Val 1 5 10 15 Thr Cys Gly Leu Gly Gln Thr Met Glu Gln Arg Thr Cys Asn His Pro 20 25 30 Val Pro Gln His Gly Gly Pro Phe Cys Ala Gly Asp Ala Thr Arg Thr 35 40 45 His Ile Cys Asn Thr Ala Val Pro Cys Pro 50 55 <210> 60 <211> 64 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Val Asp Gly Glu Trp Asp Ser Trp Gly Glu Trp Ser Pro Cys Ile Arg 1 5 10 15 Arg Asn Met Lys Ser Ile Ser Cys Gln Glu Ile Pro Gly Gln Gln Ser 20 25 30 Arg Gly Arg Thr Cys Arg Gly Arg Lys Phe Asp Gly His Arg Cys Ala 35 40 45 Gly Gln Gln Gln Asp Ile Arg His Cys Tyr Ser Ile Gln His Cys Pro 50 55 60 <210> 61 <211> 92 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Leu Lys Gly Ser Trp Ser Glu Trp Ser Thr Trp Gly Leu Cys Met Pro 1 5 10 15 Pro Cys Gly Pro Asn Pro Thr Arg Ala Arg Gln Arg Leu Cys Thr Pro 20 25 30 Leu Leu Pro Lys Tyr Pro Pro Thr Val Ser Met Val Glu Gly Gln Gly 35 40 45 Glu Lys Asn Val Thr Phe Trp Gly Arg Pro Leu Pro Arg Cys Glu Glu 50 55 60 Leu Gln Gly Gln Lys Leu Val Val Glu Glu Lys Arg Pro Cys Leu His 65 70 75 80 Val Pro Ala Cys Lys Asp Pro Glu Glu Glu Glu Leu 85 90 <210> 62 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 1 5 10 <210> 63 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 64 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 65 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 atcagaggcc tgtgacacc 19 <210> 66 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 66 ctgcccttgt agctcctca 19 <210> 67 <211> 1603 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 67 tatcaaccca gataaagcgg gacctcctct ctggtagagg tgcagggggc agtactcaac 60 atgatcacag agggagcgca ggcccctcga ttgttgctgc cgccgctgct cctgctgctc 120 accctgccag ccacaggctc agaccccgtg ctctgcttca cccagtatga agaatcctcc 180 ggcaagtgca agggcctcct ggggggtggt gtcagcgtgg aagactgctg tctcaacact 240 gcctttgcct accagaaacg tagtggtggg ctctgtcagc cttgcaggtc cccacgatgg 300 tccctttggt ccacatgggc cccctgttcg gtgacgtgct ctgagggctc ccagctgcgg 360 taccggcgct gtgtgggctg gaatgggcag tgctctggaa aggtggcacc tgggaccctg 420 gagtggcagc tccaggcctg tgaggaccag cagtgctgtc ctgagatggg cggctggtct 480 ggctgggggc cctgggagcc ttgctctgtc acctgctcca aagggacccg gacccgcagg 540 cgagcctgta atcaccctgc tcccaagtgt gggggccact gcccaggaca ggcacaggaa 600 tcagaggcct gtgacaccca gcaggtctgc cccacacacg gggcctgggc cacctggggc 660 ccctggaccc cctgctcagc ctcctgccac ggtggacccc acgaacctaa ggagacacga 720 agccgcaagt gttctgcacc tgagccctcc cagaaacctc ctgggaagcc ctgcccgggg 780 ctagcctacg agcagcggag gtgcaccggc ctgccaccct gcccagtggc tgggggctgg 840 gggccttggg gccctgtgag cccctgccct gtgacctgtg gcctgggcca gaccatggaa 900 caacggacgt gcaatcaccc tgtgccccag catgggggcc ccttctgtgc tggcgatgcc 960 acccggaccc acatctgcaa cacagctgtg ccctgccctg tggatgggga gtgggactcg 1020 tggggggagt ggagcccctg tatccgacgg aacatgaagt ccatcagctg tcaagaaatc 1080 ccgggccagc agtcacgcgg gaggacctgc aggggccgca agtttgacgg acatcgatgt 1140 gccgggcaac agcaggatat ccggcactgc tacagcatcc agcactgccc cttgaaagga 1200 tcatggtcag agtggagtac ctgggggctg tgcatgcccc cctgtggacc taatcctacc 1260 cgtgcccgcc agcgcctctg cacacccttg ctccccaagt acccgcccac cgtttccatg 1320 gtcgaaggtc agggcgagaa gaacgtgacc ttctggggga gaccgctgcc acggtgtgag 1380 gagctacaag ggcagaagct ggtggtggag gagaaacgac catgtctaca cgtgcctgct 1440 tgcaaagacc ctgaggaaga ggaactctaa cacttctctc ctccactctg agccccctga 1500 ccttccaaac ctcaataaac tagcctcttc gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1603

Claims

프로퍼딘에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, 프로퍼딘이 인간 프로퍼딘인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 인간화 항체인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 키메라 항체인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 VH-CDR1: 서열 3; VH-CDR2: 서열 4; VH-CDR3: 서열 5; VL-CDR1: 서열 8; VL-CDR2: 서열 9; 및 VL-CDR3: 서열 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 하나 이상을 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 CDR: VH-CDR1: 서열 3; VH-CDR2: 서열 4; VH-CDR3: 서열 5; VL-CDR1: 서열 8; VL-CDR2: 서열 9; 및 VL-CDR3: 서열 10을 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 52의 하나 이상의 아미노산을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 VH-CDR1: 서열 13; VH-CDR2: 서열 14; VH-CDR3: 서열 15; VL-CDR1: 서열 18; VL-CDR2: 서열 19; 및 VL-CDR3: 서열 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 하나 이상을 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 CDR: VH-CDR1: 서열 13; VH-CDR2: 서열 14; VH-CDR3: 서열 15; VL-CDR1: 서열 18; VL-CDR2: 서열 19; 및 VL-CDR3: 서열 20을 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 53의 하나 이상의 아미노산을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 VH-CDR1: 서열 23; VH-CDR2: 서열 24; VH-CDR3: 서열 25; VL-CDR1: 서열 28; VL-CDR2: 서열 29; 및 VL-CDR3: 서열 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 하나 이상을 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 CDR: VH-CDR1: 서열 23; VH-CDR2: 서열 24; VH-CDR3: 서열 25; VL-CDR1: 서열 28; VL-CDR2: 서열 29; 및 VL-CDR3: 서열 30을 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 VH-CDR1: 서열 33; VH-CDR2: 서열 34; VH-CDR3: 서열 35; VL-CDR1: 서열 38; VL-CDR2: 서열 39; 및 VL-CDR3: 서열 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 하나 이상을 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 CDR: VH-CDR1: 서열 33; VH-CDR2: 서열 34; VH-CDR3: 서열 35; VL-CDR1: 서열 38; VL-CDR2: 서열 39; 및 VL-CDR3: 서열 40을 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 44의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 44의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 49의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 51의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 49의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 51의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 2 및 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 7 및 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 2 및 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 7 및 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 12 및 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 17 및 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 12 및 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 17 및 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 22 및 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 27 및 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 22 및 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 27 및 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 32 및 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 37 및 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체가 서열 32 및 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 37 및 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 조성물.
프로퍼딘에 결합하며, 프로퍼딘에의 제1항의 항체의 결합과 경쟁하는 항체를 포함하는 조성물.
프로퍼딘에 결합하며, 프로퍼딘에의 mAb 19.1로 지정된 항체의 결합과 경쟁하는 항체를 포함하는 조성물.
프로퍼딘에 결합하며, 프로퍼딘에의 mAb 25로 지정된 항체의 결합과 경쟁하는 항체를 포함하는 조성물.
프로퍼딘에 결합하며, 프로퍼딘에의 mAb 22.1로 지정된 항체의 결합과 경쟁하는 항체를 포함하는 조성물.
프로퍼딘에 결합하며, 프로퍼딘에의 mAb 30으로 지정된 항체의 결합과 경쟁하는 항체를 포함하는 조성물.
개체에게 제1항의 항-프로퍼딘 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서의 대체 경로 (AP)-매개 병리상태의 치료 방법.
제53항에 있어서, 병리상태가 적어도 황반 변성, 허혈 재관류 손상, 관절염, 류마티스 관절염, 발작성 야간 혈색소뇨 (PNH) 증후군, 비정형적 용혈성 요독성 (aHUS) 증후군, 천식, 기관 이식 패혈증, 염증, 사구체신염, 루푸스, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
제53항에 있어서, 항-프로퍼딘 항체가 대체 경로를 선택적으로 억제하나, 고전 경로 및 렉틴 경로는 억제하지 않는 것인 방법.
제53항에 있어서, 항-프로퍼딘 항체가 고전 경로 및 렉틴 경로의 AP 증폭 루프에 영향을 주지 않는 것인 방법.
제53항에 있어서, 항-프로퍼딘 항체의 투여가 C3bBb 단백질의 생성을 억제하는 것인 방법.
인간 프로퍼딘을 발현하되, 뮤린 프로퍼딘은 발현하지 않으며, 여기서 인간 프로퍼딘의 핵산 서열이 서열 67이고 인간 프로퍼딘의 아미노산 서열이 서열 54인, 트랜스제닉 마우스.