EA044227B1 - Антитела против фактора d и их применения - Google Patents
Антитела против фактора d и их применения Download PDFInfo
- Publication number
- EA044227B1 EA044227B1 EA201991876 EA044227B1 EA 044227 B1 EA044227 B1 EA 044227B1 EA 201991876 EA201991876 EA 201991876 EA 044227 B1 EA044227 B1 EA 044227B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- antibody
- factor
- amino acid
- acid sequence
- Prior art date
Links
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 207
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 160
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 100
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 81
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 64
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 64
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 60
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 49
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 36
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 34
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 33
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 27
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 claims description 20
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 claims description 14
- 208000035913 Atypical hemolytic uremic syndrome Diseases 0.000 claims description 10
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 claims description 10
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 claims description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 9
- 208000000733 Paroxysmal Hemoglobinuria Diseases 0.000 claims description 9
- 102100036050 Phosphatidylinositol N-acetylglucosaminyltransferase subunit A Human genes 0.000 claims description 9
- 201000003045 paroxysmal nocturnal hemoglobinuria Diseases 0.000 claims description 9
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 8
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 8
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 7
- 206010063837 Reperfusion injury Diseases 0.000 claims description 6
- 230000004154 complement system Effects 0.000 claims description 6
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 claims description 5
- 206010014989 Epidermolysis bullosa Diseases 0.000 claims description 4
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 claims description 4
- 201000009961 allergic asthma Diseases 0.000 claims description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 4
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 96
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 89
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 83
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 82
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 81
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 79
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 74
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 59
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 58
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 55
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 54
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 54
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 53
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 51
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 48
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 46
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 46
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 46
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 41
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 40
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 39
- 102100024952 Protein CBFA2T1 Human genes 0.000 description 35
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 32
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 30
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 29
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 28
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 28
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 26
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 26
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 26
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 26
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 25
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 25
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 24
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 24
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 24
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 24
- 102100022133 Complement C3 Human genes 0.000 description 23
- 101000901154 Homo sapiens Complement C3 Proteins 0.000 description 23
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 22
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 22
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 21
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 21
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 20
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 19
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 19
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 19
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 19
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 18
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 17
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 15
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 15
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 14
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 14
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 14
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 13
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 13
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 13
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 description 13
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 13
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 12
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 12
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 12
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 12
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 12
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 12
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 11
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 11
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 102000016574 Complement C3-C5 Convertases Human genes 0.000 description 9
- 108010067641 Complement C3-C5 Convertases Proteins 0.000 description 9
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 9
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 9
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 9
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 9
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 7
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 7
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 7
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 7
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 108010034753 Complement Membrane Attack Complex Proteins 0.000 description 6
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 230000036541 health Effects 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 6
- 208000029574 C3 glomerulopathy Diseases 0.000 description 5
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 5
- 101150097493 D gene Proteins 0.000 description 5
- 206010015871 Extravascular haemolysis Diseases 0.000 description 5
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 5
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 5
- 102000004528 Mannose-Binding Protein-Associated Serine Proteases Human genes 0.000 description 5
- 108010042484 Mannose-Binding Protein-Associated Serine Proteases Proteins 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- -1 RNA or DNA Chemical class 0.000 description 5
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 5
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 5
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 5
- 208000027134 non-immunoglobulin-mediated membranoproliferative glomerulonephritis Diseases 0.000 description 5
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 4
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 4
- 108090000056 Complement factor B Proteins 0.000 description 4
- 102000003712 Complement factor B Human genes 0.000 description 4
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 102000009112 Mannose-Binding Lectin Human genes 0.000 description 4
- 108010087870 Mannose-Binding Lectin Proteins 0.000 description 4
- 102000001698 Mannose-Binding Lectins Human genes 0.000 description 4
- 108010068997 Mannose-Binding Lectins Proteins 0.000 description 4
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 4
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 210000003423 ankle Anatomy 0.000 description 4
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 4
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 4
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 4
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 4
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 4
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 4
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 4
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 108010089414 Anaphylatoxins Proteins 0.000 description 3
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 3
- 101150018425 Cr1l gene Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 206010018372 Glomerulonephritis membranous Diseases 0.000 description 3
- 208000032759 Hemolytic-Uremic Syndrome Diseases 0.000 description 3
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 108010079723 Shiga Toxin Proteins 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 3
- 201000008350 membranous glomerulonephritis Diseases 0.000 description 3
- 231100000855 membranous nephropathy Toxicity 0.000 description 3
- 208000015994 miscarriage Diseases 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 3
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 3
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 2
- 241001156739 Actinobacteria <phylum> Species 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- 241001142141 Aquificae <phylum> Species 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 241000192142 Proteobacteria Species 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 2
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241001180364 Spirochaetes Species 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000002847 Surgical Wound Diseases 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000011861 anti-inflammatory therapy Methods 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000002612 cardiopulmonary effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 2
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical group O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 2
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 2
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 2
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- XMBWDFGMSWQBCA-YPZZEJLDSA-N iodane Chemical compound [125IH] XMBWDFGMSWQBCA-YPZZEJLDSA-N 0.000 description 2
- 229940044173 iodine-125 Drugs 0.000 description 2
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 2
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical group CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- OEDPHAKKZGDBEV-GFPBKZJXSA-N (2s)-6-amino-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-[[(2r)-3-[2,3-di(hexadecanoyloxy)propylsulfanyl]-2-(hexadecanoylamino)propanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]hexanoyl]amino]hexanoyl]amino]hexanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)CSCC(COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC OEDPHAKKZGDBEV-GFPBKZJXSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 1
- 108020005098 Anticodon Proteins 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000714230 Avian leukemia virus Species 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 101100028791 Caenorhabditis elegans pbs-5 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 1
- 101710172562 Cobra venom factor Proteins 0.000 description 1
- 108010053085 Complement Factor H Proteins 0.000 description 1
- 102000016550 Complement Factor H Human genes 0.000 description 1
- 102000000989 Complement System Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010069112 Complement System Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003706 Complement factor D Human genes 0.000 description 1
- 108090000059 Complement factor D Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000010567 DNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010063113 DNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 101000834253 Gallus gallus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000836540 Homo sapiens Aldo-keto reductase family 1 member B1 Proteins 0.000 description 1
- 101000809450 Homo sapiens Amphiregulin Proteins 0.000 description 1
- 101000998953 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 1-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000942967 Homo sapiens Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 1
- 101000928259 Homo sapiens NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101001072067 Homo sapiens Proprotein convertase subtilisin/kexin type 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 1
- 102100036887 Immunoglobulin heavy variable 1-2 Human genes 0.000 description 1
- 206010023203 Joint destruction Diseases 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 1
- 102100032352 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 1
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 1
- 108010084333 N-palmitoyl-S-(2,3-bis(palmitoyloxy)propyl)cysteinyl-seryl-lysyl-lysyl-lysyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108700022034 Opsonin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 102100022239 Peroxiredoxin-6 Human genes 0.000 description 1
- 101800001016 Picornain 3C-like protease Proteins 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102400001018 Proadrenomedullin N-20 terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800000795 Proadrenomedullin N-20 terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 108010005642 Properdin Proteins 0.000 description 1
- 102100038567 Properdin Human genes 0.000 description 1
- 102100036371 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 4 Human genes 0.000 description 1
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010062237 Renal impairment Diseases 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241001222774 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Minnesota Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 101710151386 Serine protease 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001010097 Shigella phage SfV Bactoprenol-linked glucose translocase Proteins 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 239000004902 Softening Agent Substances 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 241001143310 Thermotogae <phylum> Species 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 102100034396 Trypsin-3 Human genes 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 229920000392 Zymosan Polymers 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 description 1
- 210000000776 antibody secreting cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008135 aqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000544 articulatio talocruralis Anatomy 0.000 description 1
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000000823 artificial membrane Substances 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000001246 colloidal dispersion Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 102000006834 complement receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010047295 complement receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 description 1
- 239000006046 creatine Substances 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 238000004401 flow injection analysis Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 230000005251 gamma ray Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000003979 granulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 208000025750 heavy chain disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003284 homeostatic effect Effects 0.000 description 1
- 102000046818 human AR Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 1
- 230000006749 inflammatory damage Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 208000037906 ischaemic injury Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000001499 laser induced fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- OTQCKZUSUGYWBD-BRHMIFOHSA-N lepirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)[C@@H](C)O)C1=CC=C(O)C=C1 OTQCKZUSUGYWBD-BRHMIFOHSA-N 0.000 description 1
- 229960004408 lepirudin Drugs 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000002088 nanocapsule Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 108010068617 neonatal Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001209 o-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C(C([H])=C1[H])[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- PIRWNASAJNPKHT-SHZATDIYSA-N pamp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)N)C(C)C)C1=CC=CC=C1 PIRWNASAJNPKHT-SHZATDIYSA-N 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006201 parenteral dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N pibenzimol Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=CC=C(N=C(N2)C=3C=C4NC(=NC4=CC=3)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1 INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 231100000857 poor renal function Toxicity 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000026447 protein localization Effects 0.000 description 1
- 230000022558 protein metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000003637 steroidlike Effects 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N tetratriacontaethylene glycol monomethyl ether Chemical compound COCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000000341 volatile oil Substances 0.000 description 1
- 238000011816 wild-type C57Bl6 mouse Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Description
Перекрестная ссылка на родственную заявку
По настоящей заявке испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США 62/457,477, поданной 10 февраля 2017 года, содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством отсылки.
Заявление в отношении финансируемых из федерального бюджета научных исследований или разработок
Настоящее изобретение было сделано при правительственной поддержке по гранту NIH AI085596 и NIH AI117410, выданному Национальными институтами здравоохранения США (NIH).
Правительство обладает некоторыми правами на изобретение.
Уровень техники
Система комплемента обеспечивает первую линию иммунной защиты организма от чужеродных патогенов. Комплемент также играет патогенную роль при воспалительных заболеваниях человека. Активация системы комплемента проходит по трем различным путям: классический путь (СР), лектиновый путь (LP) и альтернативный путь (АР). СР инициируется при связывании антигена-антитела. LP включается, когда маннозосвязывающие лектины (MBL) взаимодействуют с поверхностными молекулами сахаров на микроорганизмах. Активация обоих путей приводит к сборке СР C3 конвертазы C4b2a, хотя также может происходить прямое расщепление C3 MBL-ассоциированными сериновыми протеазами. АР представляет собой самоусиливающуюся петлю, регулируемую C3 конвертазой АР, C3bBb. Активация АР может происходить вторично по отношению к активации СР или LP или инициируется независимо. В последнем случае низкий уровень спонтанной номинальной активности C3 генерирует первичную C3bBb, которая быстро ускоряет АР в отсутствие достаточной регуляции. Таким образом, обычно предполагают, что активация АР на чужих поверхностях с отсутствием или недостаточной негативной регуляцией считается процессом по умолчанию, тогда как аутологичные клетки обычно избегают такого результата с помощью множества мембраносвязанных и присутствующих в жидкой фазе белков, ингибирующих комплемент. При некоторых условиях измененные, поврежденные или подвергшиеся стрессу аутологичные клетки и ткани также могут активировать АР и вызывать воспалительное повреждение.
Фактор D (FD) является важным ферментом для активации АР комплемента. Он расщепляет фактор В после того, как последний связывается с C3b, с образованием активной C3 конвертазы, C3bBb. Фактор D представляет собой сериновую протеазу размером приблизительно 24 кДа и циркулирует в крови как конститутивно активный фермент после образования из про-фактора D под действием фермента маннозо-связывающей лектин-ассоциированной сериновой протеазы-3 (MASP-3). По сравнению с другими белками комплемента в крови, концентрация фактора D в крови довольно низкая (приблизительно 2 мкг/мл). Хотя последний факт может указывать на то, что терапевтическое ингибирование активности фактора D в крови возможно и может быть легко достигнуто, предыдущие исследования показали, что фактор D обладает быстрым метаболизмом, и, соответственно, консенсус в области исследований комплемента заключается в том, что может не получиться блокировать фактор D системно. В данной области существует потребность в мАт против фактора D человека, которые могут системно ингибировать АР активность комплемента и, таким образом, лечить АР комплемент-зависимые патологии, при этом существует потребность в соответствующих моделях на животных для тестирования и использования таких мАт против фактора D человека. Настоящее изобретение направлено на удовлетворение этих и других потребностей.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к антителам против фактора D и способам ингибирования альтернативного пути (АР) комплемента с применением антитела против фактора D.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложена композиция, включающая антитела, которые специфично связываются с фактором D. В некоторых вариантах осуществления фактор D является фактором D человека. В некоторых вариантах осуществления антитела согласно изобретению являются моноклональными антителами. В некоторых вариантах осуществления антитела согласно изобретению являются гуманизированными антителами. В некоторых вариантах осуществления антитело по изобретению является химерным антителом. В некоторых вариантах осуществления антитело является полноразмерным антителом. В некоторых вариантах осуществления антитело является фрагментом антитела, который включает, без ограничения перечисленными, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 и scFv. В некоторых вариантах осуществления антитело является частью конструкции, например слитой конструкции, включающей антитело и направляющий фрагмент или эффекторный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело является частью конъюгированной конструкции, такой как конъюгированная конструкция антитела-лекарственного средства.
В одном из вариантов осуществления антитело по изобретению включает по меньшей мере одну из CDR-областей, выбранных из группы, состоящей из: VH-CDR1: SEQ ID NO: 3; VH-CDR2: SEQ ID NO: 4; VH-CDR3: SEQ ID NO: 5; VL-CDR1: SEQ ID NO: 8; VL-CDR2: SEQ ID NO: 9; и VL-CDR3: SEQ ID NO: 10 или их варианта или вариантов. В другом варианте осуществления антитело по изобретению включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или ее вариант. В одном из вариантов осуществления антитело по изобретению включает легкую цепь, включающую амино- 1 044227 кислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или ее вариант. В другом варианте осуществления антитело по изобретению включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID
NO: 2, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, или их вариант или варианты.
В одном из вариантов осуществления антитело по изобретению включает по меньшей мере одну из CDR-областей, выбранных из группы, состоящей из: VH-CDR1: SEQ ID NO: 13; VH-CDR2: SEQ ID NO: 14; VH-CDR3: SEQ ID NO: 15; VL-CDR1: SEQ ID NO: 18; VL-CDR2: SEQ ID NO: 19; и VL-CDR3: SEQ ID NO: 20, или их вариант или варианты. В другом варианте осуществления антитело по изобретению является антителом, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или ее вариант. В одном из вариантов осуществления антитело по изобретению включает легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17 или ее вариант. В другом варианте осуществления антитело по изобретению является антителом, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, или их вариант или варианты.
В одном из вариантов осуществления антителом согласно изобретению является мАт 11-8А1 или мАт 1F10-5. В одном из вариантов осуществления антитело по изобретению является антителом, которое связывается с фактором D и конкурирует за связывание по меньшей мере с еще одним антителом против фактора D. В одном из вариантов осуществления антитело по изобретению является антителом, которое связывается с фактором D и конкурирует за связывание по меньшей мере с одним из антител против фактора D, описанных в настоящем документе. В другом варианте осуществления антитело по изобретению является антителом, которое связывается с фактором D и конкурирует за связывание с фактором D с антителом, обозначенным как мАт 11-8А1. В другом варианте осуществления антитело по изобретению является антителом, которое связывается с фактором D и конкурирует за связывание с фактором D с антителом, обозначенным как мАт 1F10-5.
В другом варианте осуществления изобретения предложен способ лечения заболевания или нарушения, опосредованного альтернативным путем (АР), у пациента, включающий этап введения указанному пациенту по меньшей мере одного антитела против фактора D. В различных вариантах осуществления заболевание или нарушение, опосредованное альтернативным путем (АР), по меньшей мере, выбрано из группы, состоящей из: макулодистрофии (МД), возрастной макулодистрофии (ВМД), ишемического и реперфузионного повреждения, артрита, ревматоидного артрита, астмы, аллергической астмы, синдрома пароксизмальной ночной гемоглобинурии (ПНГ), атипичного гемолитико-уремического синдрома (аГУС), буллезного эпидермолиза, сепсиса, трансплантации органа, воспаления (в том числе, без ограничения перечисленным, воспаления, связанного с хирургической операцией в условиях искусственного кровообращения и гемодиализом), C3 гломерулопатии, мембранозной нефропатии, гломерулонефрита (в том числе, без ограничения перечисленным, опосредованного антинейтрофильными цитоплазматическими антителами (АНЦА) гломерулонефрита, волчанки и их комбинаций), АНЦА- опосредованного васкулита, шигатоксин-индуцированного ГУС и вызванного антифосфолипидными антителами невынашивания, а также их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D ингибирует альтернативный путь, но не ингибирует активацию классического пути и лектинового пути. В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D ингибирует образование белка C3bBb. В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D ингибирует влияние АР на последующую сигнализацию комплемента. В некоторых вариантах осуществления опосредованным АР заболеванием является C3 гломерулопатия. В некоторых вариантах осуществления опосредованным АР заболеванием является макулодистрофия, такая как возрастная макулодистрофия.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложен способ снижения активности альтернативного пути системы комплемента пациента, включающий введение антитела пациенту путем введения, включающим энтеральное введение, парентеральное введение и их комбинацию, и где антитело включает шесть определяющих комплементарность областей, имеющих следующие аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, или их вариант или варианты. В другом варианте осуществления антитело является фрагментом антитела, выбранным из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv и их комбинаций.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложен способ снижения активности альтернативного пути системы комплемента пациента, включающий введение антитела пациенту путем введения, включающим энтеральное введение, парентеральное введение и их комбинацию, и где антитело включает шесть определяющих комплементарность областей, имеющие следующие аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20, или их вариант или варианты. В другом варианте осуществления антитело является фрагментом антитела, включающим Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv и их комбинации.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложено выделенное антитело, которое связывается с фактором D человека, где антитело альтернативно связывается с любым из первого эпитопа и второго эпитопа фактора D, при этом первый эпитоп и второй эпитоп имеют части, которые принимают спиральную конформацию в своей вторичной структуре, и где часть фактора D, которая принимает кон- 2 044227 формацию бета-тяжа в своей вторичной структуре, расположена между первым эпитопом и вторым эпитопом. В другом варианте осуществления первый эпитоп имеет аминокислотную последовательность, которая включает SEQ ID NO: 21, и второй эпитоп имеет аминокислотную последовательность, которая включает SEQ ID NO: 22. В другом варианте осуществления первый эпитоп имеет аминокислотную последовательность, которая включает SEQ ID NO: 23, и второй эпитоп имеет аминокислотную последовательность, которая включает SEQ ID NO: 24. В другом варианте осуществления антитело является фрагментом антитела, выбранным из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv и их комбинаций. В другом варианте осуществления антитело связывается с эпитопом фактора D, и где эпитоп имеет аминокислотную последовательность, которая включает SEQ ID NO: 21. В другом варианте осуществления антитело является фрагментом антитела, выбранным из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv и их комбинаций.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложено выделенное антитело, которое связывается с фактором D человека, где антитело связывается с эпитопом фактора D, и где эпитоп имеет аминокислотную последовательность, которая включает SEQ ID NO: 22. В другом варианте осуществления антитело является фрагментом антитела, выбранным из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv и их комбинаций.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложено выделенное антитело, которое связывается с фактором D человека, где антитело связывается с эпитопом фактора D, и где эпитоп имеет аминокислотную последовательность, которая включает SEQ ID NO: 23. В другом варианте осуществления антитело является фрагментом антитела, выбранным из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv и их комбинаций.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложено выделенное антитело, которое связывается с фактором D человека, где антитело альтернативно связывается с любым из первого эпитопа и второго эпитопа фактора D, где первый эпитоп имеет аминокислотную последовательность, которая включает SEQ ID NO: 21, и где второй эпитоп имеет аминокислотную последовательность, которая включает SEQ ID NO: 22. В другом варианте осуществления антитело состоит из Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv и их комбинаций.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложен выделенный полипептид, который связывается с фактором D человека, где полипептид связывается с эпитопом фактора D, при этом эпитоп имеет аминокислотную последовательность, которая включает SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 22, и полипептид включает по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, или их варианта или вариантов.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложен выделенный полипептид, который связывается с фактором D человека, где полипептид связывается с эпитопом фактора D, при этом эпитоп имеет аминокислотную последовательность, которая включает SEQ ID NO: 24, и полипептид включает по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20, или их варианта или вариантов.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложено антитело против фактора D человека, где антитело имеет вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая имеет аминокислотную последовательность, которая больше чем на 90% (например, больше чем на 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%) идентична SEQ ID NO: 2. В другом варианте осуществления антитело является фрагментом антитела, выбранным из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv и их комбинаций.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложено антитело против фактора D человека, где антитело имеет вариабельную область легкой цепи (VL), которая имеет аминокислотную последовательность, которая больше чем на 90% (например, больше чем на 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%) идентична SEQ ID NO: 7. В другом варианте осуществления антитело является фрагментом антитела, выбранным из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv и их комбинаций.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложено антитело против фактора D человека, где антитело имеет вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где VH область имеет аминокислотную последовательность, которая больше чем на 90% (например, больше чем на 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%) идентична SEQ ID NO: 2, и где VL область имеет аминокислотную последовательность, которая больше чем на 90% (например, больше чем на 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%) идентична SEQ ID NO: 7. В другом варианте осуществления антитело является фрагментом антитела, выбранным из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv и их комбинаций.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложена клетка, которая продуцирует антитело, где антитело направленно взаимодействует с фактором D. В одном из вариантов осуществления клетка является гибридомой. В другом варианте осуществления клетка является клеточной линией.
В другом варианте осуществления изобретения предложено генетически модифицированное, не относящееся к человеку животное, которое экспрессирует фактор D человека. В некоторых вариантах осу
- 3 044227 ществления не относящееся к человеку животное является грызуном, таким как крыса или мышь. В одном из вариантов осуществления изобретения предложена генетически модифицированная мышь, которая экспрессирует фактор D человека. В одном из вариантов осуществления изобретения предложена генетически модифицированная мышь, которая экспрессирует фактор D человека, но не экспрессирует фактора D мыши. В другом варианте осуществления изобретения предложена генетически модифицированная мышь, которая экспрессирует фактор D человека с регуляторных элементов мыши, но не экспрессирует фактора D мыши.
Краткое описание чертежей
Предыдущее краткое описание, а также последующее подробное описание примеров осуществления изобретения будет лучше понято при прочтении в сочетании с прилагаемыми чертежами. Однако следует понимать, что изобретение не ограничено точными структурами и техническими средствами вариантов осуществления, показанных на чертежах.
Фиг. 1 - схема путей комплемента. Система комплемента может быть активирована тремя различными путями в зависимости от инициирующего стимула: классический путь (СР), лектиновый путь (LP) и альтернативный путь (АР) (фиг. 1). СР активируется в основном иммунными комплексами, состоящими из антигена и специфичного антитела. Связывание C1q с антителом, присоединенным к антигену, активирует C1r и C1s. Активированный C1s расщепляет С4 и С2. LP активируется, когда маннозосвязывающий лектин (MBL) связывается с маннозными группами микробных углеводов, активируя MBLассоциированные сериновые протеазы (MASP), и снова расщепляет С4 и С2. Продукты расщепления С4 и С2 образуют СР и LP C3 конвертазу, C4bC2a, которая расщепляет C3 с образованием C3b и C3a. Вторая молекула C3b может связываться с C4bC2a с образованием С5 конвертазы СР и LP. АР активируется, когда C3 подвергается спонтанному гидролизу и образует первичную C3 конвертазу АР, C3(H2O)Bb, в присутствии факторов В и D, что приводит к дополнительному расщеплению C3 и, в конечном счете, образованию C3 конвертазы АР (C3bBb) и С5 конвертазы АР (C3bBbC3b). Пропердин способствует активации АР, стабилизируя конвертазы АР. Все три пути завершаются образованием конвертаз, которые, в свою очередь, генерируют основные эффекторы системы комплемента: анафилатоксины (С4а/С3а/С5а), мембраноатакующий комплекс (MAC) и опсонины (например, C3b). Анафилатоксины являются мощными провоспалительными молекулами и образуются в результате расщепления С4, C3 и С5, соответственно. C5b образует комплекс при последовательном связывании белков С6-С9, что ведет к образованию MAC (C5b-9), который может непосредственно лизировать служащие мишенями поверхности. C3b индуцирует фагоцитоз опсонизированных мишеней, а также служит для усиления активации комплемента по пути АР.
На фиг. 2 показаны результаты экспериментов, демонстрирующих дозо-зависимое ингибирование ЛПС-индуцированной активации АР комплемента мАт против фактора D человека, 11-8А1 и 1F10-5. Оба мАт эффективно ингибировали активацию АР комплемента при добавлении к 50% нормальной человеческой сыворотке (НЧС) в конечной концентрации 5 мкг/мл или выше. Образец с добавлением ЭДТА служил в качестве отрицательного контроля (ЭДТА блокирует активацию комплемента). Образец без добавления мАт (0 Ab) служил в качестве базового уровня активации АР комплемента. Эксперимент проводили в буфере GVB-3TTA-Mg++. Планшеты для ИФА покрывали ЛПС, 37°C, 1 ч. НЧС предварительно инкубировали с мАт перед добавлением в планшет. Активацию АР комплемента обнаруживали путем измерения количества осаждаемого C3 на поверхности планшета (OD450).
На фиг. 3 показана нуклеотидная и аминокислотная последовательность последовательностей вариабельных областей тяжелой (SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2) и легкой (SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7) цепей мАт 11-8А1, включая CDR-области (VH-CDR1: SEQ ID NO: 3; VH-CDR2: SEQ ID NO: 4; VHCDR3: SEQ ID NO: 5; VL-CDR1: SEQ ID NO: 8; VL-CDR2: SEQ ID NO: 9; VL-CDR3: SEQ ID NO: 10) мАт 11-8A1.
На фиг. 4 показана нуклеотидная и аминокислотная последовательность последовательностей вариабельных областей тяжелой (SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12) и легкой (SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17) цепей мАт 1F10-5, включая CDR-области (VH-CDR1: SEQ ID NO: 13; VH-CDR2: SEQ ID NO: 14; VHCDR3: SEQ ID NO: 15; VL-CDR1: SEQ ID NO: 18; VL-CDR2: SEQ ID NO: 19; VL-CDR3: SEQ ID NO: 20) мАт 1F10-5.
На фиг. 5 показаны результаты экспериментов по оценке относительной активности мАт 11-8А1 и 1F10-5 при блокировании ЛПС-индуцированной активации АР комплемента у человека, обезьяны, морской свинки и мыши. Способность мАт 11А8-1 и 1F10-5 ингибировать активность альтернативного пути в сыворотках различных видов млекопитающих исследовали при использовании ЛПС-АР анализа. Планшеты для ИФА покрывали ЛПС, 37°С, 1 ч, затем добавляли 50% нормальной сыворотки человека, обезьяны, морской свинки или мыши, разведенной в GVB-Mg++-3TTA и инкубировали при 37°С в течение 1 ч перед обнаружением осаждения C3 с использованием антител против C3 человека или антител против C3 мыши. Для мАт 11-8А1 концентрации 5-20 мкг/мл были достаточными для ингибирования активации АР комплемента человека, тогда как мАт 11-8А1 не могло ингибировать активацию АР комплемента мыши, морской свинки, обезьяны (резуса и циномолгуса). Для мАт 1F10-5 концентрации 5-20 мкг/мл были достаточными для ингибирования активации комплемента АР человека, тогда как мАт
- 4 044227
1F10-5 не могло ингибировать активацию АР комплемента мыши и морской свинки. МАт 1F10-5 в концентрации 10 или 20 мкг/мл эффективно ингибировало активацию АР комплемента яванского макака. С другой стороны, 50 мкг/мл мАт 1F10-5 вызывало частичное ингибирование активации АР комплемента макака-резуса.
На фиг. 6 показаны результаты эксперимента, в котором сравнивали активность полученного из гибридомы мышиного 11-8А1 и рекомбинантного химерного 11-8А1 (вариабельная область 118А1+константная область человеческого IgG4) при блокировании ЛПС-индуцированной активации АР комплемента человека. Планшеты для ИФА покрывали ЛПС, 37°С, 1 ч, затем добавляли 50% нормальную человеческую сыворотку (НЧС), разведенную в GVB-Mg++-ЭГТА, и инкубировали при 37°C в течение 1 ч перед обнаружением осаждения C3 при использовании антител против C3 человека. НЧС с добавлением ЭДТА использовали в качестве отрицательного контроля (ЭДТА). При концентрациях 1,2510 мкг/мл обе формы мАт 11-8А1 были достаточными для ингибирования активации АР комплемента человека, при этом не наблюдали никакого различия по активности.
На фиг. 7 показаны результаты экспериментов, в которых сравнивали антигенсвязывающую аффинность полученных из гибридомы мышиного мАт 11-8А1 и рекомбинантного химерного мАт 11-8А1 при использовании BiaCore. Очищенный фактор D человека связывали на чипе СМ4 при использовании метода аминосочетания. Анализ BiaCore выполняли на приборе BiaCore-2000. Чип регененрировали между каждым связыванием при использовании 50 мМ NaOH. Две формы мАт 11-8А1 показали аналогичную аффинность.
На фиг. 8 показаны результаты измерения антигенсвязывающей аффинности мАт 1F10-5 при использовании BiaCore. Очищенный фактор D человека связывали на чипе СМ4 при использовании метода аминосочетания. Анализ BiaCore выполняли на приборе BiaCore-2000. Чип регененрировали между каждым связыванием при использовании 50 мМ NaOH. При определении Kd 1F10-5 составило 1,5 Е-10 М.
На фиг. 9, включая фиг. 9A-9D, показаны результаты картирования эпитопов для мАт 11-8А1 с использованием делеционных конструкций (фиг. 9А). Показанная последовательность (228 аминокислот) является зрелой формой фактора D человека без пропептида. Аминокислоты 107-110 (SEQ ID NO: 21), 130-134, 148-151 (SEQ ID NO: 22) и 178-184 подчеркнуты. (фиг. 9В) Схематическая диаграмма интактного и 9 мутантов с делециями фактора D человека для картирования эпитопов. Эти белки экспрессировали в клетках СНО (фиг. 9С). Подтверждение экспрессии белка. Рекомбинантные интактный и делеционные мутанты фактора D человека из супернатанта (Sup) или из лизата (CL) клеток СНО подвергали иммуноблоттингу с антителом козы против фактора D человека. + и - обозначают положительное и отрицательное обнаружение, соответственно (фиг. 9D).
Реактивность мАт 11-8А1 в отношении полноразмерного и делеционных мутантных белков оценивали с помощью Вестерн-блоттинга (WB) с поликлональным антителом козы против фактора D человека после иммунопреципитации (IP) с мАт 11-8А1. + и -обозначают положительное и отрицательное обнаружение, соответственно. NT - не исследовали.
Для картирования областей или сайтов в факторе D человека, которые являются важными для связывания мАт, мАт 11-8А1 тестировали на реактивность с серией мутантов с делециями в полноразмерном (Full) факторе D человека. Вестерн-блоттинг с использованием поликлонального антитела козы против фактора D человека подтвердил экспрессию большинства мутантов с делециями при ожидаемой молекулярной массе. Однако в нескольких попытках не удалось получить рекомбинантные белкис с делецией-6 и 9. Как показано на фиг. 9, мАт 11-8А1 распознавало Full, делецию-2 и 4, но не распознавало делецию-1, 3, 5, 7 и 8. Эти результаты подтверждают, что делеция четырех аминокислот PLPW в положениях 107-110 (SEQ ID NO: 21) или VLDR в положениях 148-151 (SEQ ID NO: 22) нарушала связывание с мАт 11-8А1.
На фиг. 10 показаны результаты картирования эпитопов для мАт 11-8А1 с помощью сайтнаправленного мутагенеза. Исследования с сайт-направленным мутагенезом проводили для подтверждения двух сайтов связывания (107-110 и 148-151) в факторе D человека, которые влияют на распознавание мАт 11-8А1. Производили замену четырех аминокислот PLPW в положениях 107-110 или VLDR в положениях 148-151 на остатки аланина (АААА). Клетки СНО трансфицировали векторами для получения мутантного белка. Экспрессию мутантного белка в супернатантах и лизатах клеток (через 48 ч после трансфекции) подтверждали с помощью Вестерн-блоттинга при использовании поликлонального антитела козы против фактора D человека. Обе мутации, как и ожидали, нарушали распознавание белка мАт 11-8А1 при IP с последующим Вестерн-блоттингом с антителами козы против фактора D человека. Результаты исследований мутантов с делециями и мутагенеза (PLPW-АААА и VLDR-AAAA) показали, что четыре аминокислоты, расположенные в PLPW107-110 и VLDR148-151 фактора D человека, являются ключевыми для активности связывания и функционального блокирования 11-8А1.
На фиг. 11, включая фиг. 11A-11D, показана схема получения мышей с нокаутом фактора D человека. (фиг. 11А) Схематические диаграммы, на которых представлены конструкции, направленно воздействующие на фактор D человека, локус фактора D мыши, аллель-мишень и неоделетированный аллель (сверху вниз). кДНК фактора D человека кодирует весь белок из 253 аминокислот, включающий сигнальный пептид, пропептид и зрелый пептид. Пунктирными линиями обозначены сайты интеграции
- 5 044227 кДНК фактора D человека в ген фактора D мыши. Положение зонда для скрининга клеток ES указано внизу на диаграммах. Сокращенные обозначения: сайты рестрикции BamHI (В), HindIII (Н), NotI (N) и XhoI (X). FRT, мишень, распознаваемая флиппазой. LoxP, локус кроссинговера в Р1 (фиг. 11В). Кодирующая последовательность фактора D человека фланкирована 5' и 3'-некодирующими последовательностями фактора D мыши в направляющей конструкции. Последовательность нуклеиновой кислоты фактора D человека подчеркнута (SEQ ID NO: 25), и сайт рестриктазы XhoI выделен жирным шрифтом, и последовательность нуклеиновой кислоты 5' и 3'-нетранслируемой области фактора D мыши показана заглавными и строчными буквами, соответственно. (фиг. 11С) Данные Саузерн-блоттинга, показывающие, что положительный клон клеток ES продуцировал два рестрикционных фрагмента BamRI (5 тому подобноен. и 4,5 тому подобноен.), тогда как репрезентативный нецелевой клон клеток ES продуцировал только полосу 5 тому подобноен. (фиг. 11D) ПЦР генотипирование мышей дикого типа (WT), мышей с нокаутом, гетерозиготных (Het) и гомозиготных (Homo) по фактору D человека, при использовании специфичных к фактору D человека (размер мишени: 450 пн)
5'-GTC AGG GTG CCA TGC AGG AG-3' (SEQ ID NO: 26) и
5'-ССС AGG AGA ACC TGC АСС ТТС-3' (SEQ ID NO: 27), специфичных к фактору D мыши (размер мишени: 292 пн)
5'-CCTCCCACCCTTAGCTATCC-3' (SEQ ID NO: 28) и
5'-ACCCAGACTGTGTCCCTCAC-3' (SEQ ID NO: 29).
На фиг. 12, включая фигуры 12А и 12В, показаны результаты экспериментов по оценке экспрессии фактора D человека в сыворотке мышей с нокаутом фактора D человека. Вестерн-блоттинг и ИФА проводили для подтверждения присутствия белка фактора D человека в сыворотке мышей с нокаутом фактора D человека. Образцы сыворотки получали у мышей с 3 разными генотипами: дикого типа, гетерозиготных и гомозиготных. НЧС и сыворотку мыши с нокаутом по фактору D мыши (fDKO) использовали для контроля анализа. (фиг. 12А) С помощью Вестерн-блоттинга с использованием поликлональных антител против фактора D человека детектировали полосу белка массой 24 кДа, соответствующую фактору D человека, в нормальной человеческой сыворотке (НЧС), а также у гетерозиготных и гомозиготных мышей с нокаутом фактора D человека (HDKI), тогда как в сыворотке мышей дикого типа (-/-) и гетерозиготных HDKI мышей была обнаружена полоса массой приблизительно 40-45 кДа, соответствующая фактору D мыши. (фиг. 12В) Экспрессия белка фактора D человека может быть подтверждена с помощью сэндвич-ИФА у гомозиготных мышей HDKI. Планшет покрывали поликлональным антителом против фактора D человека (R&D, AF1824). После инкубирования с разведенной сывороткой (1/2 или 1/5) фактор D человека детектировали при использовании биотин-конъюгированного антитела козы против фактора D человека с последующим добавлением HRP-конъюгированного стрептавидина. Как и ожидали, фактор D человека был обнаружен в НЧС, контрольных лунках с рекомбинантным фактором D человека и в сыворотке гомозиготных мышей с нокаутом фактора D человека, но не обнаружен у мышей дикого типа.
На фиг. 13 показаны результаты экспериментов по оценке ЛПС-индуцированной активности АР комплемента в сыворотке мышей с нокаутом фактора D человека. Даже в отсутствие мышиного фактора D активность АР комплемента была обнаружена у гомозиготных мышей с нокаутом фактора D человека, что указывает на то, что фактор D человека, экспрессируемый у этих мышей, являлся функциональным in vivo. Как показано, анализ ЛПС-индуцированной активации АР комплемента указывает, что гомозиготные мыши с нокаутом фактора D человека, а также мыши дикого типа обладали активностью АР комплемента в сыворотке. С другой стороны, в этом анализе активность АР комплемента не была обнаружена ни в сыворотке мышей с нокаутом по фактору D, ни в сыворотке мышей WT, ни в обработанной ЭДТА сыворотке гомозиготных мышей с нокаутом. Эти наблюдения продемонстрировали, что экспрессия фактора D человека могла восстанавливать активность АР комплемента у мыши, и что мыши с нокаутом могут использоваться в качестве экспериментальной модели на животных для исследования терапии, направленной на фактор D, при заболеваниях и нарушениях, опосредованных АР комплементом.
На фиг. 14 показаны результаты экспериментов по оценке in vivo активности и кинетики мАт 1181А у мышей с нокаутом фактора D человека. Гомозиготной мыши с нокаутом фактора D человека вводили 1 мг (в/б) мАт 11-8А1. Образцы сыворотки собирали до инъекции (0 ч) и затем в различные моменты времени после инъекции и исследовали на ЛПС-индуцированную активацию АР комплемента. Как показано, в сыворотке мышей с нокаутом по фактору D или в НЧС, обработанной ЭДТА, активность АР комплемента отсутствовала. Напротив, активность АР комплемента была обнаружена в НЧС и в сыворотке гомозиготных мышей с нокаутом фактора D человека в момент 0 ч (до введения мАт). Активность АР комплемента у гомозиготных мышей с нокаутом фактора D человека была ингибирована через 6 ч и в день 1-5 после введения мАт 11-8А1. Активность АР комплемента возвращалась к нормальному уровню в день 7. Эти результаты указывают, что в дозе 1 мг/мышь мАт 11-8А1 могло ингибировать активность АР комплемента in vivo до 3-5 дней.
На фиг. 15 показаны результаты экспериментов по оценке in vivo активности и кинетики мАт 1F105 и нерелевантного контрольного мАт (МОРС) у мышей с нокаутом фактора D человека. Гомозиготной мыши с нокаутом фактора D человека (HDKI) вводили 1 мг (в/б) мАт 1F10-5 или мАт изотипического
- 6 044227 контроля (МОРС, мышиный IgG1). Образцы сыворотки собирали до инъекции (0 ч) и затем в различные моменты времени после инъекции и исследовали на ЛПС-индуцированную активацию АР комплемента. Изменения уровней циркулирующего фактора D человека в образцах сыворотки до и после обработки, оценивали с помощью Вестерн-блоттинга при использовании поликлонального антитела козы против фактора D человека. Как показано, в сыворотке мыши с нокаутом по фактору D (DKO) или в сыворотке WT, обработанной ЭДТА, активность АР комплемента отсутствовала. Напротив, активность АР комплемента была обнаружена в сыворотке WT и в сыворотке гомозиготной мыши HDKI в момент 0 ч (до введения мАт). После введения мАт 1F10-5, активность АР комплемента у гомозиготной мыши HDKI была ингибирована в различной степени между 6 ч и днем 5. Она возвращалась к нормальному уровню в день 7. Эти результаты указывают, что мАт 1F10-5 могло вызвать длительное ингибирование активности АР комплемента при системном введении. Данные Вестерн-блоттинга показали накопление фактора D человека в крови вследствие образования комплексов фактора D/антитела к фактору D. Свободный фактор D человека экскретировался из почки и присутствовал в моче мышей HDKI. Повышение уровней фактора D человека в крови мышей HDKI позволяет предположить, что комплексы фактора D/антитела к фактору D не могли экскретироваться через почки. мАт изотипического контроля, МОРС, не ингибировало активность АР комплемента у гомозиготной мыши HDKI и при этом это не вызывало накопления фактора D человека в крови.
На фиг. 16 показаны результаты экспериментов по оценке активности in vivo и кинетики мАт 118А1 у мышей с нокаутом фактора D человека во время длительного лечения. Непрерывное введение мАт 11А8-1 двум гомозиготным мышам с нокаутом фактора D человека (HDKI) (мыши #3 и #21, мАт вводили раз в 4 дня в дозе 1 мг/мышь) вызывало устойчивое ингибирование активности АР комплемента в течение 4-х недельного периода. Как и в предыдущем эксперименте с однократным введением дозы, мАт 118А-1 вызывало накопление фактора D человека в крови, однако фактор D в конечном счете достигал стационарного уровня у обеих обработанных мышей, что определяли с помощью Вестерн-блоттинга. Вместе эти данные показали, что при введении индивиду мАт против фактора D в соответствующих дозах и интервалах можно вызвать устойчивое ингибирование системной активности АР комплемента.
На фиг. 17, включая фиг. 17А и 17В, показаны результаты экспериментов по оценке терапевтической эффективности мАт 11-8А1 в предотвращении IgG-индуцированного артрита у мышей K/BxN. (фиг. 17А) Восприимчивость гомозиготных мышей с нокаутом фактора D человека (HDKI) к артриту K/BxN. В этой модели сыворотку или очищенный IgG мышей K/BxN с артритом адоптивно переносили мышам C57BL/6 для индукции артрита высокоэффективным способом. Заболевание демонстрирует много характерных признаков ревматоидного артрита человека, включающих утолщение голеностопного сустава, опухание и прогрессирующее разрушение суставов. Как показано на панели А, как и мыши дикого типа C57BL/6, мыши HDKI также были восприимчивы к артриту K/BxN, что подтверждалось увеличением толщины голеностопного сустава и клиническим показателем после адоптивного переноса IgG мышей K/BxN. Эти данные подтверждали, что фактор D человека был полностью функционален у мышей в условиях АР комплемент-опосредованного заболевания. (фиг. 17В). Терапевтическая эффективность мАт 11-8А1 при артрите K/BxN у мышей HDKI. Введение мАт 11-8А1 (1 мг/мышь, раз в 4 дня, с началом введения до переноса IgG мышей K/BxN) значительно снижало тяжесть симптомов артрита, что подтверждалось уменьшением толщины голеностопного сустава и клиническим показателем по сравнению с мышами, получавшими контрольное мАт (МОРС). Эти результаты продемонстрировали, что можно снизить тяжесть локального повреждения, вызванного активацией комплемента, путем системного направленного воздействия на фактор D.
На фиг. 18 показаны результаты экспериментов по оценке терапевтической эффективности мАт 118А1 в предотвращении внесосудистого гемолиза (EVH) с использованием мыши с нокаутом фактора D человека в качестве модели. Гомозиготным мышам с нокаутом фактора D человека (HDKI) переливали эритроциты (Э) мышей дикого типа и мышей с тройным нокаутом Crry/DAF/C3 (ТКО). Реципиентным мышам HDKI за 24 ч до переноса эритроцитов вводили мАт 118А-1 (2 мг/мышь, в/б) или PBS. Смесь 1:1 меченных DDAO-SE WT и меченных CFSE ТКО эритроцитов (Эр) вводили реципиентным мышам в хвостовую вену. Через 5 мин и через 1, 2 и 3 дня после переливания эритроцитов у реципиентных мышей забирали кровь и исследовали эритроциты для определения процента перелитых эритроцитов, оставшихся в кровотоке. Количество CFSE-меченных ТКО Эр у каждого реципиента нормализовали (в %) по DDAO-SE-меченным Эр WT в каждой временной точке. У реципиентных мышей HDKI без обработки мАт эритроциты ТКО быстро подвергались элиминации в результате EVH, в соответствии с полученными ранее данными (Miwa et al., 2002, Blood 99: 3707-3716). Однако у реципиентных мышей HDKI, получавших мАт 11-8А1 против фактора D человека, EVH не наблюдали, при этом перелитые эритроциты ТКО сохранялись. Эти результаты демонстрируют, что мАт против фактора D человека был эффективным в профилактике EVH.
На фиг. 19, включая фиг. 19A-19D, показано картирование эпитопов мАт 1F10-5 с использованием делеционной конструкции. На фиг. 19А в зрелой последовательности фактора D человека выделены аминокислоты 132-135, 155-159 (SEQ ID NO: 23), 173-176 (SEQ ID NO: 24) и 202-208. На фиг. 19В показана схематическая диаграмма четырех мутантов с делецией фактора D человека для картирования эпи
- 7 044227 топов. Эти белки были получены в клетках млекопитающих. На фиг. 19С показаны результаты, подтверждающие экспрессию белка. Супернатант (Sup) и лизат клеток (CL) полноразмерного фактора D и мутантов с делецией подвергали иммуноблоттингу с антителами козы против фактора D человека. На фиг. 19D показана реактивность мАт 1F10-5 по отношению к полноразмерному белку и мутантным белкам с делецией согласно оценке с помощью ИФА. Эти результаты указывают, что делеция аминокислот NRRTH в положениях 155-159 (SEQ ID NO: 23) или SNRR в положениях 173-176 (SEQ ID NO: 24) нарушала связывание с мАт 1F10-5.
На фиг. 20 показаны результаты примерных экспериментов по оценке активности мАт 11-8А1, 1F10-5 и 166-32 in vivo у мышей с нокаутом фактора D человека. Для оценки эффективности мАт 166-32 (см. патент США 8124090, Tanox), 11-8A1 и 1F10-5 при блокировании активности альтернативного пути (АР) комплемента in vivo, гуманизированных по фактору D мышей подвергали многократному введению доз (1 мг/мышь, раз в 3 дня, п/к введение). Образцы плазмы собирали до введения мАт (время 0) и через 6 ч, 1, 3, 6 и 9 дней после введения мАт и исследовали на ЛПС-индуцированную активность АР комплемента. Активность АР комплемента в различные моменты времени нормализовали относительно 100% значений, полученных в момент времени 0. Данные показали, что мАт 11-8А1 и 1F10-5 обладали превосходной фармакодинамической активностью in vivo по сравнению с мАт 166-32. В частности, мАт 11-8А1 единообразно ингибировало 80-90% активности АР комплемента во всех временных точках после введения мАт, тогда как мАт 166-32 вызывало сопоставимое ингибирование только через 6 ч и 1 день после введения мАт. мАт 1F10-5 показало 50% ингибирование АР комплемента в день 9, тогда как ингибирование активности АР комплемента под действием мАт 166-32 в день 9 почти не наблюдалось.
На фиг. 21 показаны результаты примерных экспериментов по оценке in vivo активности химерного мАт 11-8А1 и химерного AFD у мышей с нокаутом фактора D человека. Для оценки эффективности 118А1/человеческого IgG4 химерного мАт и AFD/человеческого IgG4 химерного мАт при блокировании активности альтернативного пути (АР) комплемента in vivo, гуманизированных по фактору D мышей подвергали многократному введению доз (1 мг/мышь, раз в 3 дня, п/к введение). Образцы плазмы собирали до введения мАт (время 0) и через 6 ч, 1, 3, 6, 9, 12 и 15 дней после введения мАт и исследовали ЛПС-индуцированную активность АР комплемента. Активность АР комплемента в различных временных точках нормализовало относительно 100% значений, полученных в момент времени 0. AFD представляет собой гуманизированный вариант мАт 166-32 (см. Katschke et al., J Biol Chem. 2012 Apr 13; 287:12886-12892, WO/2008/055206, патент США 8372403, патент США 8273352, заявка на патент США 2014/0212433). Данные показали, что 11-8А1/человеческое IgG4 химерное мАт было намного более активным и показало намного лучший фармакодинамический профиль, чем AFD/человеческое IgG4 химерное мАт. В частности, тогда как оба мАт вызывали 90-100% ингибирование через 6 часов и 1 день после введения мАт, 11-8А1/человеческое IgG4 химерное мАт, но не AFD/человеческое IgG4 химерное мАт, вызвало больше чем 75% ингибирование активности АР комплемента в день 6-15.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к ингибированию альтернативного пути (АР) комплемента с применением антитела против фактора D. В различных вариантах осуществления изобретение направлено на композиции и способы лечения АР-опосредованного заболевания или АР-опосредованного нарушения у пациента путем контакта пациента с антителом против фактора D.
АР-опосредованные патологии и состояния, которые можно лечить с применением композиций и способов согласно изобретению, включают, без ограничения перечисленными, макулодистрофию (МД), возрастную макулодистрофию (ВМД), ишемическое и реперфузионное повреждение, артрит, ревматоидный артрит, астму, аллергическую астму, синдром пароксизмальной ночной гемоглобинурии (ПНГ), атипичный гемолитико-уремический синдром (аГУС), буллезный эпидермолиз, сепсис, трансплантацию органа, воспаление (в том числе, без ограничения перечисленным, воспаление, связанное с хирургической операцией в условиях искусственного кровообращения и гемодиализом), C3 гломерулопатию, мембранозную нефропатию, гломерулонефрит (в том числе, без ограничения перечисленным, опосредованный антинейтрофильными цитоплазматическими антителами (АНЦА) гломерулонефрит, волчанку и их комбинации), АНЦА-опосредованный васкулит, шигатоксин-индуцированный ГУС и вызванное антифосфолипидными антителами невынашивание или любые их комбинации.
Определения
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют такое же значение, которое обычно известно специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя любые материалы и методы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, могут использоваться при практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения, описаны иллюстративные материалы и методы.
При использовании в настоящем документе каждый из следующих терминов имеет значение, связанное с ним в данном разделе.
Термины ингибировать и ингибирование при использовании в настоящем документе означают снижать, подавлять, уменьшать или блокировать активность или функцию по меньшей мере приблизительно на 10% относительно контрольного значения. В некоторых вариантах осуществления активность
- 8 044227 подавлена или блокирована на 50% по сравнению с контрольным значением или на 75%, или на 95%.
Термины эффективное количество и фармацевтически эффективное количество относятся к достаточному количеству средства, которое обеспечивает требуемый биологический результат. Такой результат может являться снижением и/или облегчением признаков, симптомов или причин заболевания или нарушения или любым другим требуемым изменением в биологической системе. Подходящее эффективное количество в любом отдельном случае может быть определено средним специалистом в данной области при использовании стандартных экспериментов.
Термины пациент, индивид, лицо и тому подобное используются в настоящем документе попеременно и относятся к любому животному, в некоторых вариантах осуществления млекопитающему, и в некоторых вариантах осуществления человеку, имеющему систему комплемента, в том числе человеку, нуждающемуся в терапии состояния или его последствий или подверженному состоянию или его последствиям. Пациент может включать, например, собак, кошек, свиней, коров, овец, коз, лошадей, крыс, обезьян, а также мышей и людей.
Термин отклоняющийся от нормы при использовании в отношении организмов, тканей, клеток или их компонентов относится к таким организмам, тканям, клеткам или их компонентам, которые отличаются по меньшей мере одной заметной или поддающейся обнаружению характеристикой (например, возрастом, лечением, временем суток и т.д.) от тех организмов, тканей, клеток или их компонентов, которые демонстрируют нормальную (ожидаемую/гомеостатическую) соответствующую характеристику. Характеристики, которые являются нормальными или предполагаемыми для одной клетки, типа ткани или индивида, могут быть отклоняющимися от нормы для другой клетки или типа ткани.
Заболевание является состоянием здоровья индивида, когда индивид не может поддерживать гомеостаз, и если заболевание не устраняется, то тогда состояние здоровья индивида продолжает ухудшаться.
В отличие от этого, нарушение у индивида является состоянием здоровья, при котором индивид способен поддерживать гомеостаз, но при котором состояние здоровья индивида менее благоприятное, нежели в отсутствие нарушения. Без лечения нарушение не обязательно приводит к дальнейшему ухудшению состояния здоровья индивида.
Заболевание или нарушение облегчаются, если тяжесть признака или симптома заболевания или нарушения, частота, с которой такой признак или симптом возникают у пациента, или и то и другое, уменьшаются.
Эффективное количество или терапевтически эффективное количество соединения является таким количеством соединения, которое достаточно, чтобы произвести благоприятный эффект у индивида, которому вводят соединение.
При использовании в настоящем документе инструкционный материал включает публикацию, запись, диаграмму или любое другое средство выражения, которое может использоваться для описания полезности соединения, композиции, вектора или системы доставки согласно изобретению, в наборе для облегчения различных заболеваний или нарушений, указанных в настоящем документе. Необязательно или альтернативно инструкционный материал может описывать один или более способов облегчения заболеваний или нарушений в клетке или ткани млекопитающего. Инструкционный материал в наборе согласно изобретению может, например, быть прикреплен к контейнеру, который содержит идентифицированное соединение, композицию, вектор или систему доставки согласно изобретению, или отправлен вместе с контейнером, который содержит идентифицированное соединение, композицию, вектор или систему доставки. В альтернативе инструкционный материал может быть отправлен отдельно от контейнера с намерением, чтобы инструкционный материал и соединение применялись реципиентом совместно.
Функционально связанный при использовании в настоящем документе может означать, что экспрессия гена находится под контролем промотора, с которым он пространственно связан. Промотор может быть расположен 5' (перед) или 3' (после) гена, находящегося под его контролем. Расстояние между промотором и геном может быть приблизительно таким же, как расстояние между этим промотором и геном, который он контролирует в гене, из которого происходит промотор. Как известно в данной области техники, изменение этого расстояния может быть выполнено без потери функции промотора.
Терапевтическое лечение является лечением, назначаемым индивиду, который демонстрирует симптомы заболевания или нарушения, с целью уменьшения или устранения таких признаков.
При использовании в настоящем документе лечение заболевания или нарушения означает уменьшение частоты и/или тяжести признака и/или симптома заболевания или нарушения, испытываемого пациентом.
Фраза биологический образец, образец или проба при использовании в настоящем документе включает любой образец, содержащий клетку, ткань или физиологическую жидкость, в которой может быть обнаружена экспрессия нуклеиновой кислоты или полипептида. Биологический образец может содержать любой биологический материал, подходящий для обнаружения требуемых биомаркеров, и может содержать клеточный и/или бесклеточный материал, полученный от пациента. Примеры таких биологических образцов включают, без ограничения, кровь, лимфу, костный мозг, биоптат и мазки. Образцы, которые по своей природе являются жидкими, именуются в настоящем документе биологическими
- 9 044227 жидкостями. Биологические образцы могут быть получены от пациента различными способами, в том числе, например, путем соскоба или смазывания участка, или с помощью иглы, для получения физиологических жидкостей. Способы взятия различных проб у пациента хорошо известны в данной области.
Термин антитело при использовании в настоящем документе относится к молекуле иммуноглобулина, которая способна специфично связываться с определенным эпитопом антигена. Антитела могут быть интактными иммуноглобулинами, полученными из природных источников или из рекомбинантных источников, и могут быть иммунореактивными частями интактных иммуноглобулинов. Антитела в настоящем изобретении могут существовать во множестве форм, включающих, например, поликлональные антитела, моноклональные антитела, внутриклеточные антитела (интратела), Fv, Fab, Fab', F(ab)2 и F(ab')2, а также одноцепочечные антитела (scFv), антитела из тяжелых цепей, такие как антитела верблюдовых, и гуманизированные антитела (Harlow et al., 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).
Под термином синтетическое антитело при использовании в настоящем документе подразумевается антитело, которое получено при использовании технологии рекомбинантных ДНК, такое как, например, антитело, экспрессируемое бактериофагом. Также следует понимать, что данный термин означает антитело, которое было получено в результате синтеза молекулы ДНК, кодирующей антитело, при этом такая молекула ДНК экспрессирует белок антитела или аминокислотную последовательность, определяющую антитело, где последовательность ДНК или аминокислоты была получена при использовании технологии синтетических последовательностей ДНК или аминокислотных последовательностей, которая доступна и хорошо известна в уровне техники.
При использовании в настоящем документе термин антитело из тяжелых цепей или антитела из тяжелых цепей включает молекулы иммуноглобулинов, полученные из видов верблюдовых или путем иммунизации пептидом и последующего выделения сыворотки, или путем клонирования и экспрессии последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих такие антитела. Термин антитело из тяжелых цепей или антитела из тяжелых цепей также охватывает молекулы иммуноглобулинов, выделенные у индивида с болезнью тяжелых цепей или полученные при клонировании и экспрессии генов VH (вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулинов) индивида.
Химерное антитело относится к типу сконструированного антитела, которое содержит природную вариабельную область (легкую цепь и тяжелые цепи), полученную из донорного антитела, в сочетании с константными областями легкой и тяжелой цепи, полученными из акцепторного антитела.
Гуманизированное антитело относится к типу сконструированного антитела, CDR-области которого получены из нечеловеческого донорного иммуноглобулина, а остальные части молекулы иммуноглобулина получены из одного или более иммуноглобулинов человека. Кроме того, остатки каркасной области могут быть изменены с сохранением аффинности связывания (см., например, 1989, Queen et al., Proc. Natl. Acad Sci USA, 86:10029-10032; 1991, Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421). Подходящее человеческое акцепторное антитело может быть антителом, которое выбрано из общедоступной базы данных, например, из базы данных КАВАТ, базы данных Los Alamos и базы данных Swiss Protein, по гомологии с нуклеотидной и аминокислотной последовательностями донорного антитела. Антитело человека, отличающееся гомологией с каркасными областями донорного антитела (на основе аминокислот), может подходить для получения константной области тяжелой цепи и/или вариабельной области тяжелой цепи для вставки донорных CDR-областей. Подходящее акцепторное антитело, способное давать константные или вариабельные каркасные области легкой цепи, может быть выбрано аналогичным образом. Следует отметить, что тяжелые и легкие цепи акцепторного антитела не должны обязательно происходить из одного и того же акцепторного антитела. В предшествующем уровне техники описано несколько способов получения таких гуманизированных антител (см., например, ЕР-А-0239400 и ЕР-А-054951).
Термин донорное антитело относится к антителу (моноклональному и/или рекомбинантному), из которого аминокислотные последовательности его вариабельных областей, CDR-областей или других функциональных фрагментов или аналогов передают первому иммуноглобулину-партнеру, с получением измененной кодирующей области иммуноглобулина, и в результате экспрессируется измененное антитело с характеристиками антигенной специфичности и нейтрализирующей активности донорного антитела.
Термин акцепторное антитело относится к антителу (моноклональному и/или рекомбинантному), гетерологичному по отношению к донорному антителу, из которого все (или любую часть, но в некоторых вариантах осуществления все) аминокислотные последовательности, кодирующие его каркасные области тяжелой и/или легкой цепи, и/или его константные области тяжелой и/или легкой цепи передают первому иммуноглобулину-партнеру. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело является акцепторным антителом.
CDR-области определяют как определяющие комплементарность области аминокислотных последовательностей антитела, которые представляют собой гипервариабельные области тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина. См., например, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). В вариабельной час- 10 044227 ти иммуноглобулина содержатся три CDR (или CDR-области) тяжелой цепи и три CDR легкой цепи. Таким образом, термин CDR при использовании в настоящем документе относится ко всем трем CDRобластям тяжелой цепи или всем трем CDR-областям легкой цепи (или ко всем CDR тяжелой цепи и ко всем CDR легкой цепи, при необходимости). Структура и укладывание антитела могут означать, что другие остатки считаются частью антигенсвязывающей области и будут известны специалисту в данной области. См., например, Chothia et al., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p 877-883.
При использовании в настоящем документе иммуноанализ относится к любому анализу связывания, в котором антитело, способное специфично связываться с молекулой-мишенью, используется для обнаружения и количественного определения молекулы-мишени.
Под термином специфично связывается, при использовании в настоящем документе в отношении антитела, подразумевается антитело, которое распознает и связывается с определенной молекулоймишенью, но по существу не распознает или не связывает другие молекулы в образце. В некоторых случаях термины специфичное связывание или специфично связывающий используются для обозначения, что распознавание и связывание зависят от присутствия конкретной структуры (например, антигенной детерминанты или эпитопа) на молекуле-мишени. Если, например, антитело специфично связывается с эпитопом А, присутствие немеченой молекулы, содержащей эпитоп А (или свободный, немеченый А) в реакции, содержащей меченый А и антитело, будет уменьшать количество меченого А, связавшегося с антителом.
Система CRISPR/Cas относится к широко распространенному классу бактериальных систем для защиты против чужеродной нуклеиновой кислоты. Системы CRISPR/Cas обнаружены в целом ряде эубактерий и архей. Системы CRISPR/Cas включают I, II и III подтипы. В природных системах CRISPR/Cas II типа используется РНК-опосредованная нуклеаза, Cas9, в комплексе с направляющей и активирующей РНК, для распознавания и расщепления чужеродной нуклеиновой кислоты. Гомологи Cas9 обнаружены в большом разнообразии эубактерий, включающих, без ограничения, бактерий следующих таксономических групп: Actinobacteria, Aquificae, Bacteroidetes-Chlorobi, Chlamydiae-Verrucomicrobia, Chlroflexi, Cyanobacteria, Firmicutes, Proteobacteria, Spirochaetes и Thermotogae. Примером белка Cas9 является белок Cas9 Streptococcus pyogenes. Дополнительные белки Cas9 и их гомологи описаны, например, в публикациях Chylinksi, et al., RNA Biol. 2013 May 1; 10(5):726-737; Nat. Rev. Microbiol. 2011 June; 9(6):467-477; Hou, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2013 Sep 24; 110(39):15644-9; Sampson et al., Nature. 2013 May 9; 497(7448):254-7; и Jinek, et al., Science. 2012 Aug 17; 337 (6096) :816-21.
Кодирующая область гена состоит из нуклеотидных остатков кодирующей цепи гена и нуклеотидов некодирующей цепи гена, которые являются гомологичными или комплементарными, соответственно, кодирующей области молекулы мРНК, которая образуется в результате транскрипции гена.
Кодирующая область молекулы мРНК также состоит из нуклеотидных остатков молекулы мРНК, которые совпадают с антикодоновой областью молекулы транспортной РНК в ходе трансляции молекулы мРНК или кодируют стоп-кодон. Кодирующая область, таким образом, может включать нуклеотидные остатки, включающие кодоны аминокислотных остатков, которые не присутствуют в зрелом белке, кодируемом молекулой мРНК (например, аминокислотных остатков в сигнальной последовательности экспорта белка).
Дифференциально сниженная экспрессия или ингибирование относятся к уровням продукта биомаркера, которые ниже по меньшей мере на 10% или больше, например, на 20, 30, 40 или 50, 60, 70, 80, 90% или меньше, и/или ниже в 2,0 раза, 1,8 раза, 1,6 раза, 1,4 раза, 1,2 раза, 1,1 раза, или меньше, включая все возможные целые или дробные приращения между указанными значениями, по сравнению с контролем.
Дифференциально повышенная экспрессия или активация относятся к уровням продукта биомаркера, которые выше по меньшей мере на 10% или больше, например, на 20, 30, 40 или 50, 60, 70, 80, 90% или больше, и/или выше в 1,1 раза, 1,2 раза, 1,4 раза, 1,6 раза, 1,8 раза, 2,0 раза или больше, включая все возможные целые или дробные приращения между указанными значениями, по сравнению с контролем.
Комплементарный, при использовании в настоящем документе в отношении нуклеиновой кислоты, относится к широкой концепции комплементарности последовательностей между областями двух цепей нуклеиновой кислоты или между двумя областями одной и той же цепи нуклеиновой кислоты. Известно, что остаток аденина первой области нуклеиновой кислоты способен образовывать специфические водородные связи (спаривание оснований) с остатком второй области нуклеиновой кислоты, которая антипараллельна первой области, если таким остатком является тимин или урацил. Аналогичным образом, известно, что остаток цитозина первой цепи нуклеиновой кислоты способен образовывать пару оснований с остатком второй цепи нуклеиновой кислоты, которая антипараллельна первой цепи, если таким остатком является гуанин. Первая область нуклеиновой кислоты комплементарна второй области той же или другой нуклеиновой кислоты, если в том случае, когда две области расположены антипараллельно, по меньшей мере один нуклеотидный остаток первой области способен образовывать пару оснований с остатком второй области. В некоторых вариантах осуществления первая область содержит первую часть, а вторая область содержит вторую часть, при этом, когда первая и вторая части расположены
- 11 044227 антипараллельно, по меньшей мере приблизительно 50% или по меньшей мере приблизительно 75%, или по меньшей мере приблизительно 90%, или по меньшей мере приблизительно 95% нуклеотидных остатков первой части способны образовывать пару оснований с нуклеотидными остатками во второй части. В некоторых вариантах осуществления все нуклеотидные остатки первой части способны образовывать пару оснований с нуклеотидными остатками во второй части.
Термин ДНК при использовании в настоящем документе определен как дезоксирибонуклеиновая кислота.
Кодирующий относится к неотъемлемому свойству определенных последовательностей нуклеотидов в полинуклеотиде, таком как ген, кДНК или мРНК, служить в качестве матрицы для синтеза других полимеров и макромолекул в биологических процессах, имеющих либо определенную последовательность нуклеотидов (т.е. рРНК, тРНК и мРНК), либо определенную последовательность аминокислот, и в результате обладающих определенными биологическими свойствами. Таким образом, ген кодирует белок, если транскрипция и трансляция мРНК, соответствующей такому гену, приводят к образованию белка в клетке или другой биологической системе. Как кодирующая цепь, нуклеотидная последовательность которой идентична последовательности мРНК и обычно представлена в списках последовательностей, так и некодирующая цепь, используемая в качестве матрицы для транскрипции гена или кДНК, могут быть указаны как кодирующие белок или другой продукт этого гена, или кДНК.
Если не определено иное, нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность включает все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными вариантами друг друга и которые кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность. Фраза нуклеотидная последовательность, которая кодирует белок или РНК также может включать интроны в такой степени, в которой нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, может, в некотором варианте, содержать интрон(ы).
Выделенный означает измененный или удаленный из естественного состояния. Например, нуклеиновая кислота или пептид, обычно присутствующие в нормальных условиях в организме живого индивида, не являются выделенными, но при этом та же нуклеиновая кислота или пептид, частично или полностью отделенные от сопутствующих материалов своего природного окружения, являются выделенными. Выделенная нуклеиновая кислота или белок могут существовать по существу в очищенной форме или могут существовать в ненативном окружении, таком как, например, клетка-хозяин.
Термин гибридома при использовании в настоящем документе относится к клетке, полученной в результате слияния В-лимфоцита и партнера по слиянию, такого как миеломная клетка. Гибридому можно клонировать и поддерживать в клеточной культуре в течение неопределенного времени, при этом она способна продуцировать моноклональные антитела. Гибридому также можно считать гибридной клеткой.
Выделенная нуклеиновая кислота относится к сегменту или фрагменту нуклеиновой кислоты, который был отделен от последовательностей, которые фланкируют его в естественном состоянии, т.е. фрагменту ДНК, который был удален из последовательностей, которые обычно граничат с фрагментом, т.е. последовательностей, граничащих с фрагментом в геноме, в котором он существует в естественном состоянии. Термин также относится к нуклеиновым кислотам, которые были по существу очищены от других компонентов, которые обычно сопутствуют нуклеиновой кислоте, т.е. РНК или ДНК, или белки, которые обычно сопутствуют ей в клетке. Данный термин, таким образом, включает, например, рекомбинантную ДНК, которая включена в вектор, в автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус, или в геномную ДНК прокариота или эукариота, или которая существует как отдельная молекула (т.е. как кДНК или геномный фрагмент, или фрагмент кДНК, полученный с помощью ПЦР или при расщеплении эндонуклеазами рестрикции), независимо от других последовательностей. Он также включает рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего дополнительную полипептидную последовательность.
В рамках данного изобретения используются следующие сокращения для обычных оснований нуклеиновых кислот. А соответствует аденозину, С соответствует цитозину, G соответствует гуанозину, Т соответствует тимидину, и U соответствует уридину.
Термин полинуклеотид при использовании в настоящем документе определен как цепь нуклеотидов. Кроме того, нуклеиновые кислоты являются полимерами нуклеотидов. Таким образом, нуклеиновые кислоты и полинуклеотиды при использовании в настоящем документе являются взаимозаменяемыми. Специалисту в данной области известно, что нуклеиновые кислоты являются полинуклеотидами, которые могут быть гидролизованы до мономерных нуклеотидов. Мономерные нуклеотиды могут быть гидролизованы до нуклеозидов. Используемые в настоящем документе полинуклеотиды включают, без ограничения перечисленными, все последовательности нуклеиновых кислот, которые получены любыми способами, доступными в уровне техники, в том числе, без ограничения, рекомбинантными способами, то есть при клонировании последовательностей нуклеиновых кислот из рекомбинантной библиотеки или генома клетки с применением обычной технологии клонирования и ПЦР и тому подобное, а также с помощью методов синтеза.
При использовании в настоящем документе термины пептид, полипептид и белок используются попеременно и относятся к соединению, состоящему из аминокислотных остатков, ковалентно свя- 12 044227 занных пептидными связями. Белок или пептид должны содержать по меньшей мере две аминокислоты, при этом никакое ограничение не накладывается на максимальное количество аминокислот, которые может включать последовательность белка или пептида. Полипептиды включают любой пептид или белок, включающий две или более аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями. При использовании в настоящем документе термин относится как к коротким цепям, которые также обычно называют в уровне техники пептидами, олигопептидами и олигомерами, например, так и к более длинным цепям, которые обычно называют в уровне техники белками, множество типов которых известно. Полипептиды включают, например, биологически активные фрагменты, по существу гомологичные полипептиды, олигопептиды, гомодимеры, гетеродимеры, варианты полипептидов, модифицированные полипептиды, производные, аналоги, слитые белки и другие. Полипептиды включают природные пептиды, рекомбинантные пептиды, синтетические пептиды или их комбинацию.
Термин потомство при использовании в настоящем документе относится к потомку или потомству и включает потомство млекопитающего, а также включает дифференцированную или недифференцированную дочернюю клетку, полученную из родительской клетки. В одном применении термин потомство относится к дочерней клетке, которая генетически идентична родителю. В другом применении термин потомство относится к дочерней клетке, которая генетически и фенотипически идентична родителю. В еще одном применении термин потомство относится к дочерней клетке, которая дифференцировалась из родительской клетки.
Термин РНК при использовании в настоящем документе определен как рибонуклеиновая кислота.
Термин рекомбинантная ДНК при использовании в настоящем документе определен как ДНК, полученная в результате соединения фрагментов ДНК из разных источников.
Термин рекомбинантный полипептид при использовании в настоящем документе определен как полипептид, полученный при помощи методов рекомбинантных ДНК.
При использовании в настоящем документе конъюгированный относится к ковалентному присоединению одной молекулы ко второй молекуле.
Вариант в качестве термина, используемого в настоящем документе, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты или пептидную последовательность, которая отличается по последовательности от эталонной последовательности нуклеиновой кислоты или последовательности пептида соответственно, но сохраняет существенные биологические свойства эталонной молекулы. Изменения в последовательности варианта нуклеиновой кислоты могут не затрагивать аминокислотную последовательность пептида, кодируемую эталонной нуклеиновой кислотой, или могут приводить к аминокислотным заменам, вставкам, делециям, слияниям и усечениям. Изменения в последовательности вариантов пептидов обычно ограничены или являются консервативными, в результате последовательности эталонного пептида и варианта в целом очень похожи, а во многих областях идентичны. Вариант и эталонный пептид могут отличаться по аминокислотной последовательности одной или более заменами, вставками, делециями в любой комбинации. Вариант нуклеиновой кислоты или пептида может быть природным, таким как аллельный вариант, или может быть вариантом, который, как известно, не существует в природе. Не существующие в природе варианты нуклеиновых кислот и пептидов могут быть получены методами мутагенеза или путем прямого синтеза. В различных вариантах вариантная последовательность по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 85% идентична эталонной последовательности.
Термин регуляторный при использовании в настоящем документе может означать любой способ изменения уровня или активности субстрата. Неограничивающие примеры регуляции в отношении белка включают в себя воздействие на экспрессию (включая транскрипцию и/или трансляцию), воздействие на укладывание, воздействие на деградацию или метаболизм белка и воздействие на локализацию белка. Неограничивающие примеры регуляции в отношении фермента дополнительно включают воздействие на ферментативную активность. Регулятор относится к молекуле, активность которой включает воздействие на уровень или активность субстрата. Регулятор может быть прямым или непрямым. Регулятор может функционировать, вызывая активацию или ингибирование или модуляцию своего субстрата иным образом.
Окно сканирования при использовании в настоящем документе относится к сегменту ряда смежных положений, в которых последовательность может быть оценена независимо от какой-либо фланкирующей последовательности. Окно сканирования обычно перемещают с определенным шагом по оцениваемой последовательности, при этом каждый новый сегмент оценивают независимо. Шаг перемещения может включать 1 или больше одного положения.
Вектор при использовании в настоящем документе может означать последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую точку начала репликации. Вектор может быть плазмидой, бактериофагом, бактериальной искусственной хромосомой или дрожжевой искусственной хромосомой. Вектор может быть ДНК или РНК вектором. Вектор может быть либо самореплицирующимся внехромосомным векто- 13 044227 ром, либо вектором, который интегрируется в геном хозяина.
Термин размножение используется в настоящем документе для обозначения размножения биологического вида с получением в результате по меньшей мере одного потомка.
Термин естественное размножение используется в настоящем документе для обозначения размножения биологического вида путем полового скрещивания.
Термин инбредное животное используется в настоящем документе для обозначения животного, которое было скрещено с другими подобными животными того же вида для сохранения и закрепления некоторых признаков или для предотвращения введения других признаков в популяцию скрещиваемых особей.
Термин аутбредное животное используется в настоящем документе для обозначения животного, которое скрещивается с любым другим животным или индивидами тех же видов без учета сохранения некоторых признаков.
Диапазоны: по всему тексту настоящего описания различные аспекты изобретения могут быть представлены в формате диапазона. Следует понимать, что описание в формате диапазона предназначено лишь для удобства и краткости, и не должно считаться жестким ограничением объема изобретения. Таким образом, следует считать, что описание диапазона конкретно раскрывает все возможные поддиапазоны, а также отдельные числовые значения в данном диапазоне. Например, описание диапазона, такого как от 1 до 6, должно рассматриваться как прямо раскрытые поддиапазоны, такие как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 до 6 и т.д., а также отдельные числа в пределах данного диапазона, например, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 и 6. Это применимо независимо от ширины диапазона.
Описание
Данное изобретение относится к ингибированию альтернативного пути (АР) комплемента с применением антитела против фактора D человека. В одном из вариантов осуществления изобретение направлено на способы лечения и предотвращения воспаления и аутоиммунных заболеваний, опосредованных нежелательной, неконтролируемой, избыточной активацией АР комплемента. В одном из вариантов осуществления изобретение направлено на лечение АР-опосредованного заболевания или АРопосредованного нарушения у пациента путем контакта пациента с антителом против фактора D.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложен способ лечения АР-опосредованного заболевания или нарушения у пациента, включающий этап введения указанному пациенту антитела против фактора D с ингибированием, в результате, образования белкового комплекса C3bBb. Примеры опосредованных комплементом патологий, которые можно лечить с применением способов согласно изобретению, включают, без ограничения перечисленным, макулодистрофию (МД), возрастную макулодистрофию (ВМД), ишемическое и реперфузионное повреждение, артрит, ревматоидный артрит, астму, аллергическую астму, синдром пароксизмальной ночной гемоглобинурии (ПНГ), атипичный гемолитико-уремический синдром (аГУС), буллезный эпидермолиз, сепсис, трансплантацию органа, воспаление (в том числе, без ограничения перечисленным, воспаление, связанное с хирургической операцией в условиях искусственного кровообращения и гемодиализом), C3 гломерулопатию, мембранозную нефропатию, гломерулонефрит (в том числе, без ограничения перечисленным, опосредованный антинейтрофильными цитоплазматическими антителами (АНЦА) гломерулонефрит, волчанку и их комбинации), АНЦАопосредованный васкулит, шигатоксин-индуцированный ГУС и вызванное антифосфолипидными антителами не вынашивание, а также их комбинации.
Способность иммунной системы различать свои и чужие антигены жизненно важна для функционирования иммунной системы как специфической защиты против проникших извне микроорганизмов. Чужие антигены являются антигенами на веществах, поступающих или присутствующих в организме, которые заметно отличаются от или являются чужеродными по отношению к собственным компонентам в организме индивида, тогда как свои антигены являются антигенами, которые у здорового индивида заметно не отличаются или не являются чужеродными по отношению к собственным компонентам его организма. В различных вариантах осуществления способов активация АР, которая ингибирована, является активацией, которая была инициирована по меньшей мере одним из группы, состоящей из микробного антигена, небиологической чужеродной поверхности, измененной своей ткани или их комбинаций. Одним из примеров небиологической чужеродной поверхности является кровопроводящие магистрали, такие как используемые в аппаратах искусственного кровообращения или гемодиализе. Примеры измененных своих тканей включают апоптотические, некротические и ишемизированные ткани и клетки или их комбинации.
В некоторых вариантах осуществления антитела против фактора D согласно изобретению ингибируют АР, но не ингибируют активацию классического пути (СР) или лектинового пути (LP). Как правило, СР инициируют комплексы антигена-антитела, LP активируется при связывании лектинов с молекулами сахара на поверхности микробов, тогда как АР конститутивно активен на низком уровне, но может быстро усиливаться на поверхности бактериальных клеток, вирусов и паразитарных клетках при отсутствии регуляторных белков. Клетки-хозяева обычно защищены от активации АР комплемента регуляторными белками. Однако в некоторых ситуациях, например, когда регуляторные белки являются дефектными или отсутствуют, АР также может неконтролируемо активироваться на клетках-хозяевах, что
- 14 044227 приводит к комплемент-опосредованному заболеванию или нарушению. СР состоит из компонентов С1, С2, С4 и совпадает с АР на этапе активации С3. LP состоит из маннозосвязывающих лектинов (MBL) и MBL-ассоциированных сериновых протеаз (Masp) и имеет общие с СР компоненты, С4 и С2. АР состоит из компонентов C3 и нескольких факторов, таких как фактор В, фактор D и регулятор в жидкой фазе, фактор Н. Активация комплемента состоит из трех этапов: (а) распознавание, (b) ферментативная активация и (с) атака мембраны, вызывающая гибель клетки. Первая фаза активации комплемента СР начинается с С1. С1 состоит из трех отдельных белков: распознающей субъединицы, Clq, и субкомпонентов сериновых протеаз, C1r и C1s, которые связываются с образованием кальций-зависимого тетрамерного комплекса, C1r2 s2. Интактный С1 комплекс необходим для физиологической активации С1. Активация происходит, когда интактный С1 комплекс связывается с иммуноглобулином, связанным в комплексе с антигеном. Это связывание активирует C1s, который затем расщепляет белки С4 и С2 с образованием C4a и C4b, а также C2a и C2b. Фрагменты C4b и C2a объединяются с образованием C3 конвертазы, C4b2a, которая, в свою очередь, расщепляет C3 с образованием C3a и C3b. Активацию LP инициирует связывание MBL с некоторыми сахарами на поверхности мишени, которое вызывает активацию Masp протеаз, которые затем расщепляют С4 и С2 способом, аналогичным активности C1s в СР, что приводит к образованию C3 конвертазы, C4b2a. Таким образом, СР и LP активируются разными механизмами, но они включают одни и те же компоненты, С4 и С2, и оба пути приводят к образованию одной и той же C3 конвертазы, C4b2a. Расщепление C3 при воздействии C4b2a с образованием C3b и C3a является главным событием пути комплемента по двум причинам. Оно инициирует петлю амплификации АР, поскольку связанный на поверхности C3b является центральным интермедиатом АР. C3a и C3b являются биологически важными. C3a является провоспалительным, и вместе с С5а их называют анафилатоксинами. C3b и его последующие продукты расщепления также связываются с рецепторами комплемента, присутствующими на нейтрофилах, эозинофилах, моноцитах и макрофагах, тем самым способствуя фагоцитозу и клиренсу C3b-опсонизированных частиц. Наконец, C3b может связываться с C4b2a с образованием С5 конвертазы СР и LP, активирующей терминальную последовательность комплемента, которая приводит к образованию С5а, мощного провоспалительного медиатора, и сборке литического мембраноатакующего комплекса (MAC), C5-C9.
Считается, что АР конститутивно активен на низком уровне вследствие спонтанного гидролиза C3 с образованием C3(H2O). C3(H2O) ведет себя подобно C3b, так как он может связываться с fB, что делает fB восприимчивым к расщеплению fD и активации. Образующийся в результате C3(H2O)Bb затем расщепляет C3 с образованием C3b и C3a, инициируя каскад АР при образовании C3 конвертазы АР, C3bBb. Поскольку исходная C3 конвертаза генерирует растущее количество C3b, устанавливается петля амплификации. Следует отметить, что, поскольку при СР и LP также образуется C3b, где C3b может связывать фактор В и запускать АР, цмкл амплификации АР также участвует в СР и LP при активации этих путей. Таким образом, АР состоит из двух функциональных компонентов: независимого пути активации комплемента, который не связан с СР или LP, и процесса амплификации, который уже участвует в СР и LP и способствует проявлению СР и LP в полной мере. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитела против фактора D согласно изобретению ингибируют процесс амплификации или петлю амплификации.
В одном из вариантов осуществления активностью АР, которая ингибируется с применением способа согласно изобретению, является активация АР, индуцированная по меньшей мере одним из группы, выбранной из липополисахарида (ЛПС), липоолигосахарида (ЛОС), патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (РАМР) и ассоциированных с опасностью молекулярных паттернов (DAMP). В другом варианте осуществления активностью АР, которая ингибируется с применением способа согласно изобретению, является образование белкового комплекса C3bBb. В другом варианте осуществления активность АР, которая ингибируется с применением способа согласно изобретению, является зависимой от фактора D.
В некоторых вариантах осуществления способы согласно настоящему изобретению сохраняют способность пациента бороться с инфекцией посредством СР и LP. В одном из вариантов осуществления изобретения предложен способ ингибирования активации АР, индуцированной бактериальным липоолигосахаридом (ЛОС) у пациента, включающий этап введения указанному пациенту антитела против фактора D и, таким образом, ингибирования активации АР, индуцированной бактериальным ЛОС, у пациента. В другом варианте осуществления в настоящем документе предложен способ ингибирования активации АР, индуцированной бактериальным ЛПС. В некоторых вариантах осуществления активация АР индуцирована ЛПС S.typhosa, и ингибиторы, применяемые в способах, представленных в настоящем документе, не ингибируют активность АР, индуцированную ЛПС S.minnesota или ЛПС E.coli. В различных вариантах осуществления антитела против фактора D согласно изобретению ингибируют АР, но не ингибируют СР-инициированную активацию комплемента, LP-инициированную активацию комплемента, зимозан-индуцированную активацию или индуцированную фактором яда кобры активацию.
В одном из вариантов осуществления в настоящем документе предложен способ ингибирования опосредованной патоген-ассоциированным молекулярным паттерном активации АР у пациента, включающий этап введения указанному пациенту антитела против фактора D, ингибируя, таким образом,
- 15 044227
РАМР-опосредованную активацию АР у пациента. Примеры РАМР, вызванная которым активация АР может быть ингибирована способами согласно изобретению, включают, без ограничения перечисленными, мурамилдипептид (MDP), CpG мотив из бактериальной ДНК, двухцепочечные вирусные РНК, пептидогликан, липотейхоевую кислоту, поверхностный белок A Borrelia burgdorferi, синтетический микоплазменный макрофаг-активирующий липопротеин-2, трипальмитоил-цистеинил-серил-(лизил)3-лизин (P3CSK4), дипальмитоил-CSK4 (P2-CSK4), монопальмитоил-CSK4 (PCSK4), амфотерицин В, триацилированный или диацилированный бактериальный полипептид и их комбинации.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложен способ ингибирования инициации активации АР у пациента, включающий этап введения указанному пациенту антитела против фактора D, ингибируя, таким образом, инициацию активации АР у пациента. В другом варианте осуществления в настоящем документе предложен способ ингибирования амплификации активации АР у пациента, включающий этап введения указанному пациенту ингибитора АР, ингибируя, таким образом, амплификацию активации АР у пациента. Примерами этих вариантов осуществления являются пациенты с ПНГ, которые страдают АР комплемент-опосредованным гемолизом, и пациенты, страдающие АР комплементопосредованным аГУС, астмой, ишемическим/реперфузионным повреждением, ревматоидным артритом и АНЦА-опосредованными заболеваниями почек. В различных вариантах осуществления изобретения заболевания и нарушения, которые можно лечить с применением композиций и способов согласно изобретению, включают, без ограничения, АР комплемент-опосредованный гемолиз, АР комплементопосредованный аГУС, астму, ишемическое/реперфузионное повреждение, ревматоидный артрит и АНЦА-опосредованные заболевания почек или нарушения функции почек.
В различных вариантах осуществления в настоящем документе предложены способы идентификации потенциального антитела, обладающего ингибирующим действием в отношении АР, включающие этапы: а) введение антитела против фактора D пациенту; b) определение полученного фенотипа пациента; и с) сравнение полученного фенотипа пациента с фенотипом животного с нокаутом фактора D-/-. В другом варианте осуществления антитело против фактора D, применяемое в способах, предложенных в настоящем документе, идентифицировано способом отбора потенциального терапевтического соединения с применением животного с нокаутом фактора D’/’.
В различных других вариантах осуществления в настоящем документе предложены способы идентификации потенциального антитела против фактора D, обладающего ингибирующим действием в отношении АР. Один такой способ включает следующие этапы: а) покрытие планшета липополисахаридом (ЛПС); b) промывку планшета для удаления несвязавшегося ЛПС; с) добавление бычьего сывороточного альбумина (BSA) в фосфатно-солевом буфере (PBS); d) промывку планшета для удаления несвязавшегося BSA; е) добавление смеси кандидатного соединения антитела против фактора D, которое было предварительно инкубировано с сывороткой и смешано с нормальной человеческой сывороткой; f) промывку планшета; g) добавление HRP-конъюгированного антитела против C3 человека; h) промывку планшета для удаления несвязавшегося антитела; i) добавление реагента субстрата HRP; j) добавление серной кислоты для остановки реакции; k) измерение оптической плотности при 450 нм; 1) сравнение оптической плотности планшета, содержащего кандидатное соединение антитела против фактора D, с оптической плотностью положительного сравнительного контроля и отрицательного сравнительного контроля; где при уменьшении оптической плотности по сравнению с положительным сравнительным контролем идентифицируют антитело против фактора D.
Антитела против фактора D
В некоторых вариантах осуществления изобретение включает композиции, включающие антитело, которое специфично связывается с фактором D. В одном из вариантов осуществления антитело против фактора D является поликлональным антителом. В еще одном варианте осуществления антитело против фактора D является моноклональным антителом. В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D является химерным антителом. В других вариантах осуществления антитело против фактора D является гуманизированным антителом. В некоторых вариантах осуществления антитело является фрагментом антитела. В некоторых вариантах осуществления фактор D является фактором D человека.
В некоторых вариантах осуществления связывание антитела или фрагмента антитела с фактором D человека ассоциировано со снижением образования C3bBb в пути активации комплемента в интактном организме. В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен белок или полипептид, способный связываться с фактором D человека. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела; белок или полипептид связываются с соответствующей частью или фракцией или эпитопом фактора D человека; и связывание антитела или фрагмента антитела, или белка или полипептида с соответствующей частью фактора D человека ассоциировано со снижением образования C3bBb в интактном организме.
В некоторых вариантах осуществления связывающее антитело против фактора D или фрагмент связывающего антитела против фактора D конъюгированы с белком, пептидом или другим соединением. В некоторых вариантах осуществления белок, пептид или другое соединение, с которым конъюгировано антитело против фактора D или фрагмент такого антитела, является направляющим фрагментом (т.е. направляющий фрагмент специфично связывается с другой молекулой, отличной от фактора D). В некото- 16 044227 рых вариантах осуществления белок, пептид или другое соединение, с которым конъюгировано антитело против фактора D или фрагмент такого антитела, является эффекторной молекулой (например, цитотоксической молекулой).
В одном из вариантов осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает по меньшей мере одну из CDR-областей, выбранных из группы, состоящей из VH-CDR1: SEQ ID NO: 3; VH-CDR2: SEQ ID NO: 4; VH-CDR3: SEQ ID NO: 5; VL-CDR1: SEQ ID NO: 8; VL-CDR2: SEQ ID NO: 9; и VL-CDR3: SEQ ID NO: 10, или их варианта или вариантов. В другом варианте осуществления антитело против фактора D включает все CDR-области из группы, состоящей из VH-CDR1: SEQ ID NO: 3; VH-CDR2: SEQ ID NO: 4; VH-CDR3: SEQ ID NO: 5; VL-CDR1: SEQ ID NO: 8; VL-CDR2: SEQ ID NO: 9; и VL-CDR3: SEQ ID NO: 10, или их варианта или вариантов.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH-CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; и VL-CDR1: SEQ ID NO: 8, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен. В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH-CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и VL-CDR1: SEQ ID NO: 8.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH-CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; и VL-CDR2: SEQ ID NO: 9, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен. В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH-CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; и VL-CDR2: SEQ ID NO: 9.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH-CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; и VL-CDR3: SEQ ID NO: 10, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен. В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH-CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и VL-CDR3: SEQ ID NO: 10.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH-CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; VH-CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; VH-CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; VL-CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; VL-CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; и VL-CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH-CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; VH-CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; VH-CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; VL-CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; VL-CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; и VL-CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH-CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; VH-CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; VH-CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; VL-CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; VL-CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; и VL-CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий
- 17 044227 фрагмент включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, или ее вариант. В других вариантах осуществления антитело против фактора D включает легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, или ее вариант. В другом варианте осуществления антитело против фактора D является моноклональным антителом, обозначенным мАт 11-8А1.
Моноклональное антитело против фактора D, обозначенное мАт 11-8А1, включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, или ее вариант, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, или ее вариант. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело против фактора D гуманизировано. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело против фактора D, обозначенное мАт 11-8А1, является химерным антителом.
В одном из вариантов осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает по меньшей мере одну из CDR-областей, выбранных из группы, состоящей из VH-CDR1: SEQ ID NO: 13; VH-CDR2: SEQ ID NO: 14; VH-CDR3: SEQ ID NO: 15; VL-CDR1: SEQ ID NO: 18; VL-CDR2: SEQ ID NO: 19; и VL-CDR3: SEQ ID NO: 20 или их варианта или вариантов. В другом варианте осуществления антитело против фактора D включает все CDR-области из группы, состоящей из: VH-CDR1: SEQ ID NO: 13; VH-CDR2: SEQ ID NO: 14; VH-CDR3: SEQ ID NO: 15; VL-CDR1: SEQ ID NO: 18; VL-CDR2: SEQ ID NO: 19; и VL-CDR3: SEQ ID NO: 20 или их варианта или вариантов.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH-CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; и VL-CDR1: SEQ ID NO: 18, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен. В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH-CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и VL-CDR1: SEQ ID NO: 18.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH-CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; и VL-CDR2: SEQ ID NO: 19, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен. В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH-CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; и VL-CDR2: SEQ ID NO: 19.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH-CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; и VL-CDR3: SEQ ID NO: 20, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен. В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH-CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; и VL-CDR3: SEQ ID NO: 20.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH-CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; VH-CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; VH-CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; VL-CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; VL-CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; и VL-CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH-CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; VH-CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; VH-CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; VL-CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; VL-CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, или ее вариант, включающий до приблизительно 3 (например, приблизительно 1, 2 или 3) аминокислотных замен; и VL-CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.
- 18 044227
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент включает: VH-CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; VH-CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; VH-CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; VL-CDR1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; VL-CDR2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; и VL-CDR3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, или ее вариант. В других вариантах осуществления антитело против фактора D включает легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, или ее вариант. В другом варианте осуществления антитело против фактора D является моноклональным антителом, обозначенным мАт 1F10-5. Моноклональное антитело против фактора D, обозначенное мАт 1F10-5, включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, или ее вариант, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, или ее вариант. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело против фактора D гуманизировано. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело против фактора D является химерным антителом.
В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело связывается с фактором D человека, где антитело альтернативно связывается с любым из первого эпитопа и второго эпитопа фактора D, где первый эпитоп и второй эпитоп имеют части, которые принимают спиральную конформацию в своей вторичной структуре, и где часть фактора D, которая принимает конформацию бета-тяжа в своей вторичной структуре, расположена между первым эпитопом и вторым эпитопом.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D согласно изобретению является антителом, которое связывается с определенным эпитопом фактора D. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере одна (например, по меньшей мере 1, 2, 3 или 4) из аминокислот в SEQ ID NO: 21 находится в эпитопе антитела против фактора D. Аминокислоты SEQ ID NO: 21 соответствуют аминокислотам 107-110 в аминокислотной последовательности фактора D. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере одна (например, по меньшей мере 1, 2, 3 или 4) из аминокислот в SEQ ID NO: 22 находится в эпитопе антитела против фактора D. Аминокислоты SEQ ID NO: 22 соответствуют аминокислотам 148-151 в аминокислотной последовательности фактора D. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере одна (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5) из аминокислот в SEQ ID NO: 23 находится в эпитопе антитела против фактора D. Аминокислоты SEQ ID NO: 23 соответствуют аминокислотам 155-159 в аминокислотной последовательности фактора D. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере одна (например, по меньшей мере 1, 2, 3 или 4) из аминокислот в SEQ ID NO: 24 находится в эпитопе антитела против фактора D. Аминокислоты SEQ ID NO: 24 соответствуют аминокислотам 173-176 в аминокислотной последовательности фактора D.
В одном из вариантов осуществления антитело против фактора D является антителом, которое связывается по меньшей мере с одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3 или 4) аминокислотой в SEQ ID NO: 21. В одном из вариантов осуществления антитело против фактора D является антителом, которое связывается по меньшей мере с одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3 или 4) аминокислотой в SEQ ID NO: 22. В одном из вариантов осуществления антитело против фактора D является антителом, которое связывается по меньшей мере с одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5) аминокислотой в SEQ ID NO: 23. В одном из вариантов осуществления антитело против фактора D является антителом, которое связывается по меньшей мере с одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3 или 4) аминокислотой в SEQ ID NO: 24.
В другом варианте осуществления антитело против фактора D является антителом, которое конкурирует за связывание с антителом, которое связывается по меньшей мере с одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3 или 4) аминокислотой в SEQ ID NO: 21. В другом варианте осуществления антитело против фактора D является антителом, которое конкурирует за связывание с антителом, которое связывается по меньшей мере с одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3 или 4) аминокислотой в SEQ ID NO: 22. В другом варианте осуществления антитело против фактора D является антителом, которое конкурирует за связывание с антителом, которое связывается по меньшей мере с одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5) аминокислотой в SEQ ID NO: 23. В другом варианте осуществления антитело против фактора D является антителом, которое конкурирует за связывание с антителом, которое связывается по меньшей мере с одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3 или 4) аминокислотой в SEQ ID NO: 24.
В некоторых вариантах осуществления связывание антитела против фактора D человека или его антигенсвязывающего фрагмента по меньшей мере с любой одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5) из аминокислотных последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 21, 22, 23 и 24, фактора D человека в живом организме ассоциировано со снижением образования C3bBb в организме. В некоторых вариантах осуществления организмом является человек. В некоторых вариантах осуществления антителом против фактора D является мАт 11-8А1 или мАт IF10-5. В некоторых вариантах осуществления системное введение терапевтически эффективного количества 11-8А1 мАт или мАт IF10-5 в организм снижает образование C3bBb в пути активации комплемента в организме. В некоторых вариантах осуществления организмом является человек. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к
- 19 044227 белку, антителу, фрагменту антитела или пептиду, которые могут связываться по меньшей мере с одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5) аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 21, 22, 23 и 24, фактора D человека, и которые при введении в терапевтически эффективной дозе в организм способны снижать образование C3bBb в альтернативном пути активации комплемента в организме. В некоторых вариантах осуществления организмом является человек. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к белку, антителу, фрагменту антитела или пептиду, которые могут связываться по меньшей мере с одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5) аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 21, 22, 23 и 24, фактора D человека, которые препятствуют каталитическому расщеплению АР фактора В с образованием Ba и Bb. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает антитело или его фрагмент, белок или пептид, которые могут связываться с четырьмя аминокислотами, имеющими последовательность PLPW, расположенными в положениях 107-110 фактора D человека, или четырьмя аминокислотами, имеющими последовательность VLDR, расположенными в положениях 148-151 фактора D человека, и демонстрируют блокирующую фактор D человека активность.
В некоторых вариантах осуществления антитела являются химерными антителами. В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D человека может включать константные области человеческой легкой цепи и человеческой тяжелой цепи в комбинации с CDR-последовательностями вариабельной области или их вариантом, описанными в другой части настоящего описания. Специалист в данной области сумеет подготовить и получить химерное антитело при использовании известных методов замены соответствующих доменов определенных антител, представляющих интерес. Такое антитело можно легко получить с помощью пересадки гетерогенных доменов антител, включающих одну или более CDR-последовательностей, описанных в настоящем изобретении. При использовании известной рекомбинантной технологии можно получить рекомбинантное антитело, содержащее константные области тяжелой и легкой цепи, кодируемые последовательностями нуклеиновых кислот константных областей тяжелой и легкой цепи человека; и вариабельные области тяжелой и легкой цепи, включающие CDR-области, кодируемые последовательностями нуклеиновой кислоты, соответствующими CDRпоследовательностям, представленным в описании. Специалист в данной области может получить антитело против фактора D человека, содержащее одну или более CDR-последовательностей, описанных в настоящем описании, в котором части одной легкой цепи или только части тяжелой цепи заменены областями из антитела, относящегося к другому виду, такому как человек. Человеческое антитело против фактора D человека, включающее вариабельные области, содержащие одну или более CDRпоследовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 3-5, 8-10, 13-15 и 18-20, или их вариант или варианты, в комбинации со структурными элементами мышиного или не мышиного антитела вне CDR-областей, могут быть получены с помощью обычных способов, известных в уровне техники. В некоторых вариантах осуществления антитела или фрагменты антител дополнительно гуманизованы при использовании известных методик из уровня техники.
В некоторых вариантах осуществления антитело против фактора D включает антитело, обладающее по меньшей мере приблизительно 85% (например, по меньшей мере, приблизительно любой из 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%) аминокислотной идентичностью с одной или более CDR-последовательностей, описанных в настоящем документе, перечисленных в SEQ ID NO: 3-5, 8-10, 13-15 и 18-20.
В одном из вариантов осуществления настоящее описание охватывает антитело против фактора D, имеющее CDR-последовательности, обладающие приблизительно 85% идентичностью с CDRпоследовательностями, описанными в настоящем документе. Настоящее описание охватывает антитело против фактора D или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие CDR-последовательности, которые по меньшей мере приблизительно на 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 и 99% идентичны CDR-последовательностям, описанным в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления антитело против фактора D человека имеет вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где VH область имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на приблизительно 85% идентична SEQ ID NO: 2, и где VL область имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на приблизительно 85% идентична SEQ ID NO: 7.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела модифицированы. В некоторых вариантах осуществления модификации включают слияние антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с частями другого белка или фрагментом белка. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела согласно изобретению модифицированы с целью увеличения их полупериода циркуляции in vivo. Например, антитело или его фрагмент могут быть слиты с молекулой FcRn, который также известен как неонатальный Fc-рецептор, для повышения стабильности антитела in vivo. (Nature Reviews Immunology 7:715-725). В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент конъюгированы (например, слиты) с эффекторной молекулой и/или другим направляющим фрагментом (таким как антитело или фрагмент антитела, распознающие другую молекулу, другой антиген или другой эпитоп).
Специалист в данной области сумеет получить связывающий фактор D человека одноцепочечный
- 20 044227 вариабельный фрагмент (scFv), содержащий по меньшей мере одну специфическую CDRпоследовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3-5, 8-9, 13-15 и 18-20, или ее вариант или варианты. ScFv может включать последовательности вариабельной области тяжелой цепи, указанные в SEQ ID NO: 3-5, или их вариант или варианты, и вариабельные области легкой цепи, указанные в SEQ ID NO: 8-10, или их вариант или варианты. ScFv может включать последовательности вариабельной области тяжелой цепи, указанные в SEQ ID NO: 13-15, или их вариант или варианты, и вариабельные области легкой цепи, указанные в SEQ ID NO: 18-20, или их вариант или варианты. CDR-последовательности, включенные в scFv, обладающие идентичностью аминокислотной последовательности порядка, по меньшей мере, приблизительно 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 и 99% с CDR-последовательностями, описанными в настоящем описании, включены в объем настоящего описания. ScFv связывается с фактором D человека, например, с эпитопом по меньшей мере в одной из аминокислотных последовательностей, перечисленных в группе, состоящей из SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24.
Скрининговые анализы
Настоящее изобретение находит применение в различных скрининговых анализах, в том числе при определении, может ли кандидатное антитело против фактора D ингибировать АР.
В некоторых вариантах осуществления уровень активности АР в присутствии кандидатного антитела против фактора D сравнивают с активностью АР, обнаруженной в положительном сравнительном контроле. Положительный сравнительный контроль включает активацию АР в отсутствие добавленного тестируемого соединения. В некоторых вариантах осуществления кандидатное антитело против фактора D идентифицируют как ингибитор АР, когда активность АР в присутствии кандидатного антитела против фактора D составляет меньше чем приблизительно 70% активности АР, обнаруженной в положительном сравнительном контроле; это соответствует больше чем приблизительно 30% ингибированию активности АР в присутствии тестируемого соединения. В других вариантах осуществления кандидатное антитело против фактора D идентифицируют как ингибитор АР, когда активность АР в присутствии кандидатного антитела против фактора D составляет меньше чем приблизительно 80% активности АР, обнаруженной в положительном сравнительном контроле; это соответствует больше чем приблизительно 20% ингибированию активности АР в присутствии тестируемого соединения. В других вариантах осуществления кандидатное антитело против фактора D идентифицируют как ингибитор АР, когда активность АР в присутствии кандидатного антитела против фактора D составляет меньше чем приблизительно 90% активности АР, обнаруженной в положительном сравнительном контроле; это соответствует больше чем приблизительно 10% ингибированию активности АР в присутствии тестируемого соединения. В некоторых вариантах осуществления уровень ингибирования АР кандидатным антителом против фактора D сравнивают с уровнем ингибирования, обнаруженным в отрицательном сравнительном контроле.
Различные форматы иммуноанализа, включая конкурентный и неконкурентный форматы иммуноанализа, анализы захвата антигена, сэндвич-анализы с двумя антителами и сэндвич-анализы с тремя антителами, являются полезными способами изобретения (Self et al., 1996, Curr. Opin. Biotechnol. 7:60-65). Изобретение не следует считать ограниченным каким-либо одним типом известного или на сегодняшний день неизвестного анализа, при условии, что анализ позволяет обнаруживать ингибирование АР.
Внесосудистые гемолитические анализы включены в способы согласно изобретению. В различных вариантах осуществления эритроциты (Эр) получают от нормальных (здоровых) лиц или лиц, демонстрирующих признаки или симптомы заболевания или нарушения, такого как, например, ПНГ. В различных вариантах осуществления заболевание или нарушение индуцируют в модели на животных, такой как мышь с тройным нокаутом (ТКО) Crry/DAF/C3. В некоторых вариантах осуществления реципиентам перелитых Эр за 24 ч до переноса Эр вводят по меньшей мере одно антитело против фактора D или контрольный раствор, такой как PBS. Донорские Эр промывают и метят CFSE при использовании метода, такого как описанный в публикации Miwa et al., 2002, Blood 99; 3707-3716. В некоторых вариантах осуществления донорские Эр собирают у нормальных доноров, промывают и метят DDAO-SE при использовании методики, описанной производителем, или которую специалист в данной области сочтет подходящей. В некоторых вариантах осуществления смесь нормальных Эр в соотношении 1:1 с Эр ТКО специалист вводит реципиенту путем внутривенного введения, который является наиболее подходящим, включая, без ограничения этим, хвостовую вену в случае реципиента мыши. В одном из вариантов осуществления образцы крови собирают в различные моменты времени после введения донорских Эр. В одном из вариантов осуществления образцы крови собирают через 5 мин, 6, 24, 48, 72, 96 и 120 ч после переливания. Собранную кровь анализируют для определения процента эритроцитов, меченных CFSE или DDAO-SE (т.е. перелитых), оставшихся в кровотоке. Количество меченных CFSE ТКО Эр у каждого реципиента нормализуют по меченным DDAO-SE нормальным Эр в каждый момент времени.
Лечение KRN артрита является полезным способом изобретения. Артрит индуцируют у гомозиготных мышей с нокаутом фактора D человека путем пассивного переноса очищенных суммарных IgG от мышей K/BxN. В одном из вариантов осуществления утолщение голеностопного сустава измеряют штангенциркулем и клинические показатели регистрируют с использованием критериев, таких как критерий, ранее описанный в публикации Kimura et. al. (Kimura et al., 2010, JCI; 3545-3554). Субъектам вводят дозу антитела против фактора D человека. В некоторых вариантах осуществления индивида лечат в
- 21 044227 день 1, день 3, день 7 и 11, и день 15 после индукции артрита.
Иммуноферментные анализы (ИФА) могут применяться в способах согласно изобретению. Фермент, такой как, без ограничения перечисленным, пероксидаза хрена (HRP), щелочная фосфатаза, бетагалактозидаза или уреаза, может быть связан, например, с антителом против C3 или с вторичным антителом для применения в способе согласно изобретению. Система обнаружения пероксидазы хрена может использоваться, например, с хромогенным субстратом тетраметилбензидином (ТМВ), который дает растворимый продукт в присутствии перекиси водорода, который можно обнаруживать при 450 нм. Другие подходящие системы с использованием ферментных меток включают, например, систему обнаружения щелочной фосфатазы, которую можно использовать с хромогенным субстратом п-нитрофенилфосфатом для получения растворимого продукта, легко обнаруживаемого при 405 нм. Аналогичным образом, система обнаружения бета-галактозидазы может использоваться с хромогенным субстратом о-нитрофенилбетаЮ-галактопиранозидом (ONPG) для получения растворимого продукта, обнаруживаемого при 410 нм. В альтернативе система обнаружения уреазы может использоваться с субстратом, таким как мочевина-бромкрезоловый пурпурный (Sigma Immunochemicals, St. Louis, МО). Полезные первичные и вторичные антитела с ферментной меткой могут быть получены из любых коммерческих источников.
Хемилюминесцентное обнаружение также может применяться для обнаружения ингибирования АР. Хемилюминесцентные вторичные антитела могут быть получены из любых коммерческих источников.
Флуоресцентное обнаружение также может применяться для обнаружения ингибирования АР. Полезные флуорохромы включают, без ограничения, DAPI, флуоресцеин, Hoechst 33258, R-фикоцианин, Вфикоэритрин, R-фикоэритрин, родамин, техасский красный и лиссамин-флуоресцеин- или родаминмеченные антитела.
Радиоиммуноанализы (РИА) также могут применяться в способах согласно изобретению. Такие анализы известны в уровне техники и описаны, например, в публикациях Brophy et al. (1990, Biochem. Biophys. Res. Comm. 167:898-903) и Guechot et al. (1996, Clin. Chem. 42:558-563). Радиоиммуноанализы выполняют, например, с использованием меченного иодом-125 первичного или вторичного антитела (Harlow et al., выше, 1999).
Сигнал, испускаемый обнаруживаемым антителом, анализируют, например, с использованием спектрофотометра для детектирования цвета от хромогенного субстрата; индикатора излучения для обнаружения излучения, такого как счетчик гамма-излучения для детектирования иода-125; или флуорометра для обнаружения флуоресценции в присутствии света определенной длины волны. Если используется анализ с ферментной меткой, количественный анализ проводят с использованием спектрофотометра. Следует понимать, что анализы согласно изобретению могут быть выполнены вручную или, при необходимости, могут быть автоматизированы, и что сигнал, испускаемый от множества образцов, может быть обнаружен одновременно во многих системах, доступных в продаже.
Способы согласно изобретению также охватывают применение иммуноанализов на основе капиллярного электрофореза (CEIA), которые могут быть автоматизированы при необходимости. Иммуноанализы также могут использоваться вместе с лазерно-индуцированной флуоресценцией, как описано, например, в Schmalzing et al. (1997, Electrophoresis 18:2184-2193) и Вао (1997, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. 699:463-480). Липосомные иммуноанализы, такие как проточно-инжекционные липосомные иммуноанализы и липосомные иммуносенсоры, также могут применяться согласно способам изобретения (Rongen et al., 1997, J. Immunol. Methods 204:105-133).
Количественный вестерн-блоттинг также может использоваться для определения уровня ингибирования АР в способах согласно изобретению. Вестерн-блоты анализируют количественно при использовании известных методов, таких как сканирующая денситометрия (Parra et al., 1998, J. Vase. Surg. 28:669-675).
Способы введения
Способы согласно изобретению включают введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного антитела против фактора D или его связывающего фрагмента (таких как любое из антител или их фрагментов, описанных в другой части настоящего документа) пациенту, у которого идентифицировано АР-опосредованное заболевание или нарушение. В одном из вариантов осуществления пациент является млекопитающим, имеющим систему АР. В одном из вариантов осуществления пациент является человеком. В различных вариантах осуществления по меньшей мере одно антитело против фактора D или его связывающий фрагмент вводят локально, регионарно или системно. В некоторых вариантах осуществления АР-опосредованным заболеванием или нарушением является C3гломерулопатия. В некоторых вариантах осуществления АР-опосредованным заболеванием или нарушением является макулодистрофия (такая как ВМД).
Способы согласно изобретению могут включать введение по меньшей мере одного антитела против фактора D или его связывающего фрагмента, однако никоим образом не следует считать, что настоящее изобретение ограничено антителами против фактора D, описанными в настоящем документе, а скорее следует считать, что оно охватывает любое антитело против фактора D, как известное, так и неизвестное, которые уменьшают и снижают активацию АР.
Способ согласно изобретению включает введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного антитела против фактора D или его связывающего фрагмента пациенту, где компо
- 22 044227 зиция согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере одно антитело против фактора D или его связывающий фрагмент либо отдельно, либо в комбинации по меньшей мере с одним другим лекарственным средством. Изобретение может применяться в комбинации с другими методами лечения, такими как, например, противовоспалительная терапия и тому подобное Примеры противовоспалительной терапии, которую можно применять в комбинации со способами согласно изобретению, включают, например, терапии, в которых используются стероидные лекарственные средства, а также терапию, в которой используются нестероидные лекарственные средства.
Способ согласно изобретению включает введение индивиду терапевтически эффективного количества антитела против фактора D или его антигенсвязывающего фрагмента, которые способны связываться в пределах любой из последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу лечения заболеваний, связанных с фактором D, включающих нарушение пути активации АР комплемента, путем введения терапевтически эффективного количества антитела согласно изобретению или терапевтически эффективного количество фрагмента антитела, в результате чего у индивида происходит снижение C3bBb. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу лечения заболеваний, связанных с фактором D, включающих нарушение пути активации АР комплемента, путем введения терапевтически эффективного количества антитела или фрагмента антитела, способных связываться с некоторым специфическим эпитопом или эпитопами в факторе D человека, таким как эпитоп, содержащийся в аминокислотных последовательностях, выбранных из SEQ ID NO: 21-24. В некоторых вариантах осуществления изобретение охватывает способ лечения заболеваний, связанных с фактором D, включающих нарушение пути активации АР комплемента, путем введения индивиду эффективного количества антитела, фрагмента антитела, полипептида, пептида, конъюгированного пептида, способных связываться с некоторыми специфическими эпитопами фактора D человека, где эпитоп содержится в аминокислотных последовательностях, выбранных из SEQ ID NO: 21-24, в результате чего активация пути активации АР комплемента у индивида снижается. В некоторых вариантах осуществления способ лечения включает системное введение индивиду эффективной дозы антитела или фрагмента антитела, способных связываться с аминокислотами, выбранными из последовательностей, перечисленных в SEQ ID NO: 21-24, в результате чего достигается системное снижение C3bBb у индивида. Фармацевтические композиции и способы лечения Введение антитела против фактора D или его связывающего фрагмента в способе лечения согласно изобретению может быть достигнуто различными способами при использовании методов, известных в уровне техники. Терапевтические и профилактические способы согласно изобретению, таким образом, охватывают применение фармацевтических композиций, включающих антитело против фактора D.
Фармацевтические композиции, подходящие для осуществления изобретения, могут вводить для доставки дозы по меньшей мере приблизительно 1 нг/кг, по меньшей мере приблизительно 5 нг/кг, по меньшей мере приблизительно 10 нг/кг, по меньшей мере приблизительно 25 нг/кг, по меньшей мере приблизительно 50 нг/кг, по меньшей мере приблизительно 100 нг/кг, по меньшей мере приблизительно 500 нг/кг, по меньшей мере приблизительно 1 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 5 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 10 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 25 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 50 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 100 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 500 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 1 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 5 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 10 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 25 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 50 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 100 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 200 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 300 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 400 мг/кг и по меньшей мере приблизительно 500 мг/кг массы тела индивида. В одном из вариантов осуществления изобретения вводят дозу, которая приводит к концентрации антитела против фактора D согласно настоящему изобретению по меньшей мере приблизительно 1 пМ, по меньшей мере приблизительно 10 пМ, по меньшей мере приблизительно 100 пМ, по меньшей мере приблизительно 1 нм, по меньшей мере приблизительно 10 нм, по меньшей мере приблизительно 100 нм, по меньшей мере приблизительно 1 мкМ, по меньшей мере приблизительно 2 мкМ, по меньшей мере приблизительно 3 мкМ, по меньшей мере приблизительно 4 мкМ, по меньшей мере приблизительно 5 мкМ, по меньшей мере приблизительно 6 мкМ, по меньшей мере приблизительно 7 мкМ, по меньшей мере приблизительно 8 мкМ, по меньшей мере приблизительно 9 мкМ и по меньшей мере приблизительно 10 мкМ у пациента. В другом варианте осуществления изобретения предусмотрено введение дозы, которая приводит к концентрации антитела против фактора D согласно настоящему изобретению в пределах по меньшей мере приблизительно 1 пМ, по меньшей мере приблизительно 10 пМ, по меньшей мере приблизительно 100 пМ, по меньшей мере приблизительно 1 нм, по меньшей мере приблизительно 10 нм, по меньшей мере приблизительно 100 нм, по меньшей мере приблизительно 1 мкМ, по меньшей мере приблизительно 2 мкМ, по меньшей мере приблизительно 3 мкМ, по меньшей мере приблизительно 4 мкМ, по меньшей мере приблизительно 5 мкМ, по меньшей мере приблизительно 6 мкМ, по меньшей мере приблизительно 7 мкМ, по меньшей мере приблизительно 8 мкМ, по меньшей мере приблизительно 9 мкМ и по меньшей мере приблизительно 10 мкМ в плазме человека.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции, подходящие для осуществ
- 23 044227 ления изобретения, могут быть введены для доставки дозы не больше чем приблизительно 1 нг/кг, не больше чем приблизительно 5 нг/кг, не больше чем приблизительно 10 нг/кг, не больше чем приблизительно 25 нг/кг, не больше чем приблизительно 50 нг/кг, не больше чем приблизительно 100 нг/кг, не больше чем приблизительно 500 нг/кг, не больше чем приблизительно 1 мкг/кг, не больше чем приблизительно 5 мкг/кг, не больше чем приблизительно 10 мкг/кг, не больше чем приблизительно 25 мкг/кг, не больше чем приблизительно 50 мкг/кг, не больше чем приблизительно 100 мкг/кг, не больше чем приблизительно 500 мкг/кг, не больше чем приблизительно 1 мг/кг, не больше чем приблизительно 5 мг/кг, не больше чем приблизительно 10 мг/кг, не больше чем приблизительно 25 мг/кг, не больше чем приблизительно 50 мг/кг, не больше чем приблизительно 100 мг/кг, не больше чем приблизительно 200 мг/кг, не больше чем приблизительно 300 мг/кг, не больше чем приблизительно 400 мг/кг и не больше чем приблизительно 500 мг/кг массы тела индивида. В одном из вариантов осуществления изобретения вводят дозу, которая приводит к концентрации антитела против фактора D согласно настоящему изобретению не больше чем приблизительно 1 пМ, не больше чем приблизительно 10 пМ, не больше чем приблизительно 100 пМ, не больше чем приблизительно 1 нм, не больше чем приблизительно 10 нм, не больше чем приблизительно 100 нм, не больше чем приблизительно 1 мкМ, не больше чем приблизительно 2 мкМ, не больше чем приблизительно 3 мкМ, не больше чем приблизительно 4 мкМ, не больше чем приблизительно 5 мкМ, не больше чем приблизительно 6 мкМ, не больше чем приблизительно 7 мкМ, не больше чем приблизительно 8 мкМ, не больше чем приблизительно 9 мкМ и не больше чем приблизительно 10 мкМ в человеке. В другом варианте осуществления изобретения предусмотрено введение дозы, которая приводит к концентрации антитела против фактора D согласно настоящему изобретению в пределах не больше чем приблизительно 1 пМ, не больше чем приблизительно 10 пМ, не больше чем приблизительно 100 пМ, не больше чем приблизительно 1 нм, не больше чем приблизительно 10 нм, не больше чем приблизительно 100 нм, не больше чем приблизительно 1 мкМ, не больше чем приблизительно 2 мкМ, не больше чем приблизительно 3 мкМ, не больше чем приблизительно 4 мкМ, не больше чем приблизительно 5 мкМ, не больше чем приблизительно 6 мкМ, не больше чем приблизительно 7 мкМ, не больше чем приблизительно 8 мкМ, не больше чем приблизительно 9 мкМ и не больше чем приблизительно 10 мкМ в плазме человека. Также предусмотрены диапазоны доз между любыми из доз, раскрытых в настоящем документе.
Как правило, дозы, которые могут вводить в способе согласно изобретению индивиду, в некоторых вариантах осуществления человеку, изменяются в количестве от 0,5 мкг до приблизительно 50 мг на килограмм массы тела индивида. Хотя точная вводимая доза будет изменяться в зависимости от различных факторов, включающих, без ограничения, тип индивида и тип подвергаемого лечению патологического состояния, возраст индивида и путь введения. В некоторых вариантах осуществления доза соединения будет изменяться от приблизительно 1 мкг до приблизительно 10 мг на килограмм массы тела индивида. В других вариантах осуществления доза будет изменяться от приблизительно 3 мкг до приблизительно 1 мг на килограмм массы тела индивида.
Соединение могут вводить индивиду с частотой несколько раз в день, или его могут вводить реже, например, один раз в день, два раза в день, три раза в день, один раз в неделю, два раза в неделю, три раза в неделю, один раз в две недели, два раза в две недели, три раза в две недели, один раз в месяц, два раза в месяц, три раза в месяц, или еще реже, например, один раз в несколько месяцев или даже один раз или несколько раз в год или меньше. Частота введения дозы будет очевидна специалисту и будет зависеть от различных факторов, таких как, без ограничения перечисленным, тип и тяжесть подвергаемого лечению заболевания, тип и возраст индивида, и т.д. Лекарственные формы фармацевтических композиций могут быть изготовлены любым известным, или разработанным впоследствии, способом в области фармакологии. Как правило, такие способы получения включают этап приведения действующего вещества в ассоциацию с носителем или одним или более другими вспомогательными компонентами, а затем, в случае необходимости или потребности, формования или упаковки продукта в форме требуемой однодозовой или многодозовой единицы.
Хотя описание фармацевтических композиций, представленное в настоящем документе, в основном направлено на фармацевтические композиции, которые подходят для рецептурного медицинского применения, специалисту в данной области будет очевидно, что такие композиции обычно подходят для введения индивидам всех типов. Модификация фармацевтических композиций, подходящих для медицинского применения, с целью получить композиции, подходящие для введения различным индивидам, хорошо известна, при этом ветеринар-фармаколог средней квалификации сможет разработать и выполнить такую модификацию с помощью простых экспериментов, если таковые потребуются. Пациенты, которым предполагается вводить фармацевтические композиции согласно изобретению, включают, без ограничения перечисленными, людей и других приматов, млекопитающих, в том числе коммерчески значимых млекопитающих, таких как приматы, не относящиеся к человеку, крупный рогатый скот, свиньи, лошади, овцы, кошки и собаки.
Фармацевтические композиции, которые могут применяться в способах согласно изобретению, могут быть изготовлены, упакованы или выпущены в продажу в форме препаратов, подходящих для офтальмологического, перорального, ректального, вагинального, парентерального, наружного, ингаляцион- 24 044227 ного, интраназального, буккального, внутриглазного, интравитреального, внутримышечного, внутрикожного и внутривенного путей введения. Другие предполагаемые лекарственные формы включают перспективные наночастицы, липосомные препараты, повторно закрытые эритроциты, содержащие действующее вещество, и лекарственные формы на основе иммунологических средств.
Фармацевтическая композиция согласно изобретению может быть изготовлена, упакована или выпущена в продажу в недозированном виде, в виде однократной единичной дозы или множества однократных единичных доз. Единичная доза представляет собой дискретное количество фармацевтической композиции, содержащее заданное количество действующего вещества. Количество действующего вещества, как правило, равно дозе действующего вещества, которую вводят пациенту, или подходящей части такой дозы, такой как, например, половина или треть такой дозы.
Относительные количества действующего вещества, фармацевтически приемлемого носителя и любых дополнительных компонентов в фармацевтической композиции согласно изобретению будут изменяться в зависимости от идентифицирующих сведений, размера и состояния пациента, подвергаемого лечению, и, кроме того, в зависимости от пути, которым композицию требуется вводить. Например, композиция может включать 0,1-100% (в/в) действующего вещества. В различных вариантах осуществления композиция включает по меньшей мере приблизительно 1%, по меньшей мере приблизительно 2%, по меньшей мере приблизительно 3%, по меньшей мере приблизительно 4%, по меньшей мере приблизительно 5%, по меньшей мере приблизительно 6%, по меньшей мере приблизительно 7%, по меньшей мере приблизительно 8%, по меньшей мере приблизительно 9%, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 11%, по меньшей мере приблизительно 12%, по меньшей мере приблизительно 13%, по меньшей мере приблизительно 14%, по меньшей мере приблизительно 15%, по меньшей мере приблизительно 16%, по меньшей мере приблизительно 17%, по меньшей мере приблизительно 18%, по меньшей мере приблизительно 19%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 21%, по меньшей мере приблизительно 22%, по меньшей мере приблизительно 23%, по меньшей мере приблизительно 24%, по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 26%, по меньшей мере приблизительно 27%, по меньшей мере приблизительно 28%, по меньшей мере приблизительно 29%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 31%, по меньшей мере приблизительно 32%, по меньшей мере приблизительно 33%, по меньшей мере приблизительно 34%, по меньшей мере приблизительно 35%, по меньшей мере приблизительно 36%, по меньшей мере приблизительно 37%, по меньшей мере приблизительно 38%, по меньшей мере приблизительно 39%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 41%, по меньшей мере приблизительно 42%, по меньшей мере приблизительно 43%, по меньшей мере приблизительно 44%, по меньшей мере приблизительно 45%, по меньшей мере приблизительно 46%, по меньшей мере приблизительно 47%, по меньшей мере приблизительно 48%, по меньшей мере приблизительно 49%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 51%, по меньшей мере приблизительно 52%, по меньшей мере приблизительно 53%, по меньшей мере приблизительно 54%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 56%, по меньшей мере приблизительно 57%, по меньшей мере приблизительно 58%, по меньшей мере приблизительно 59%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 61%, по меньшей мере приблизительно 62%, по меньшей мере приблизительно 63%, по меньшей мере приблизительно 64%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 66%, по меньшей мере приблизительно 67%, по меньшей мере приблизительно 68%, по меньшей мере приблизительно 69%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 71%, по меньшей мере приблизительно 72%, по меньшей мере приблизительно 73%, по меньшей мере приблизительно 74%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 76%, по меньшей мере приблизительно 77%, по меньшей мере приблизительно 78%, по меньшей мере приблизительно 79%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 81%, по меньшей мере приблизительно 82%, по меньшей мере приблизительно 83%, по меньшей мере приблизительно 84%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 86%, по меньшей мере приблизительно 87%, по меньшей мере приблизительно 88%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или по меньшей мере приблизительно 100% (в/в) действующего вещества
В дополнение к действующему веществу фармацевтическая композиция согласно изобретению может также включать один или более дополнительных фармацевтически активных компонентов.
Лекарственные формы фармацевтической композиции согласно изобретению с контролируемым или замедленным высвобождением могут быть получены с применением стандартной технологии.
Парентеральное введение фармацевтической композиции включает любой путь введения, характеризующийся физическим проникновением через ткань пациента и введением фармацевтической композиции через отверстие в ткани. Парентеральное введение может быть локальным, регионарным или системным. Парентеральное введение, таким образом, включает, без ограничения перечисленным, введение
- 25 044227 фармацевтической композиции путем инъекции композиции, путем нанесения композиции через хирургический разрез, путем нанесения композиции через проникающую в ткань нехирургическую рану и тому подобное В частности, предусмотрено, что парентеральное введение включает, без ограничения перечисленным, внутривенное, внутриглазное, интравитреальное, подкожное, внутрибрюшинное, внутримышечное, внутрикожное, внутригрудинное и внутриопухолевое введение.
Лекарственные формы фармацевтической композиции, подходящие для парентерального введения, включают действующее вещество в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, таким как стерильная вода или стерильный изотонический раствор хлорида натрия. Такие лекарственные формы могут быть изготовлены, упакованы или выпущены в продажу в форме, подходящей для болюсного введения или для непрерывного введения. Лекарственные формы для инъекций могут быть изготовлены, упакованы или выпущены в продажу в виде стандартной лекарственной формы, такой как ампулы или многодозовые контейнеры, содержащие консервант. Лекарственные формы для парентерального введения включают, без ограничения перечисленными, суспензии, растворы, эмульсии в масляных или водных носителях, пасты и имплантируемые лекарственные формы с замедленным высвобождением или биоразлагаемые препараты. Такие лекарственные формы могут дополнительно содержать один или более дополнительных компонентов, включающих, без ограничения перечисленными, суспендирующие, стабилизирующие или диспергирующие вещества. В одном из вариантов осуществления лекарственной формы для парентерального введения действующее вещество предоставлено в сухой (то есть порошковой или гранулированной) форме для восстановления подходящим растворителем (например, стерильной апирогенной водой) перед парентеральным введением восстановленной композиции.
Фармацевтические композиции могут быть изготовлены, упакованы или выпущены в продажу в форме стерильной водной или масляной суспензии или раствора для инъекций. Эта суспензия или раствор могут быть изготовлены в соответствии с известным уровнем техники и могут содержать, помимо действующего вещества, дополнительные компоненты, такие как диспергирующие вещества, смачивающие вещества или суспендирующие вещества. Такие стерильные препараты для инъекций могут быть изготовлены с применением нетоксичного, парентерально приемлемого разбавителя или растворителя, такого как, например, вода или 1,3-бутандиол. Другие приемлемые разбавители и растворители включают, без ограничения перечисленными, раствор Рингера, изотонический раствор хлорида натрия и нелетучие масла, такие как синтетические моно- или диглицериды. Другие парентерально вводимые лекарственные формы, которые являются подходящими, включают такие лекарственные формы, которые содержат действующее вещество в микрокристаллической форме, в липосомном препарате или в качестве компонента биоразлагаемых полимерных систем. Композиции для замедленного высвобождения или имплантации могут включать фармацевтически приемлемые полимерные или гидрофобные материалы, такие как эмульсию, ионообменную смолу, малорастворимый полимер или малорастворимую соль.
Фармацевтическая композиция согласно изобретению может быть изготовлена, упакована или выпущена в продажу в лекарственной форме, подходящей для ингаляционного введения через полость рта. Такая лекарственная форма может включать сухие частицы, которые включают действующее вещество и имеют диаметр в пределах от приблизительно 0,5 до приблизительно 7 нм, и в некоторых вариантах осуществления от приблизительно 1 до приблизительно 6 нм. Такие композиции предпочтительно находятся в форме сухих порошков для введения с помощью устройства, включающего резервуар для сухого порошка, в который может быть направлен поток пропеллента для диспергирования порошка, или при использовании низкокипящего растворителя/дозатора сухого порошка, такого как устройство, включающее действующее вещество, растворенное или суспендированное в низкокипящем пропелленте в герметичном контейнере. В некоторых вариантах осуществления такие порошки включают частицы, где по меньшей мере 98% частиц в по весу имеют диаметр больше 0,5 нм, и по меньшей мере 95% частиц по количеству имеют диаметр меньше 7 нм. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 95% частиц по весу имеют диаметр больше 1 нм, и по меньшей мере 90% частиц по количеству имеют диаметр меньше 6 нм. В некоторых вариантах осуществления композиции сухого порошка включают твердый тонкодисперсный разбавитель, такой как сахар, и предпочтительно представлены в форме стандартной дозы.
Низкокипящий пропеллент обычно включает жидкие пропелленты, имеющие точку кипения ниже 65°F (~18°C) при атмосферном давлении. Обычно пропеллент может составлять 50-99,9% (в/в) композиции, и действующее вещество может составлять 0,1-20% (в/в) композиции. Пропеллент может также включать дополнительные компоненты, такие как жидкое неионогенное или твердое анионное поверхностно-активное вещество или твердый разбавитель (в некоторых вариантах осуществления имеющий размер частиц такого же порядка, как и частицы, включающие действующее вещество).
Фармацевтические композиции согласно изобретению, изготовленные для доставки в легкие, также могут предоставлять действующее вещество в форме капель раствора или суспензии. Такие лекарственные формы могут быть изготовлены, упакованы или выпущены в продажу в виде водных или разбавленных спиртовых растворов или суспензий, необязательно стерильных, включающих действующее вещество, и могут быть удобно введены с помощью любого устройства для небулизации или распыления. Такие лекарственные формы могут дополнительно включать один или более дополнительных компонентов, включающих, без ограничения перечисленными, вкусовую добавку, такую как сахарин натрия, ле- 26 044227 тучее масло, буферное вещество, поверхностно-активное вещество или консервант, такой как метилгидроксибензоат. В некоторых вариантах осуществления капли, вводимые таким путем введения, имеют средний диаметр в пределах от приблизительно 0,1 до приблизительно 200 нм.
Лекарственные формы также могут применяться для интраназальной доставки фармацевтической композиции согласно изобретению.
Другая лекарственная форма, подходящая для интраназального введения, является грубым порошком, включающим действующее вещество и имеющим среднюю крупность частиц от приблизительно 0,2 до 500 микрометров. Такую лекарственную форму вводят путем быстрого вдыхания порции порошка для ингаляции через носовой ход из контейнера для порошка, удерживаемого близко к ноздре.
Лекарственные формы, подходящие для назального введения, могут, например, включать от приблизительно 0,1% (в/в) и до 100% (в/в) действующего вещества, и могут также включать один или более дополнительных компонентов.
Фармацевтическая композиция согласно изобретению может быть изготовлена, упакована или выпущена в продажу в лекарственной форме, подходящей для буккального введения. Такие лекарственные формы могут быть, например, в форме таблеток или таблеток для рассасывания, изготовленных с применением стандартных способов, и могут, например, содержать от 0,1 до 20% (в/в) действующего вещества, при этом остальная часть включает растворимую в полости рта или разлагаемую композицию и, необязательно, один или более дополнительных компонентов. В альтернативе лекарственные формы, подходящие для буккального введения, могут содержать порошок или аэрозольный или распыляемый раствор, или суспензию, содержащую действующее вещество. В некоторых вариантах осуществления такие порошковые, аэрозольные или распыляемые лекарственные формы при диспергировании имеют средний размер частиц или капель в пределах от приблизительно 0,1 до приблизительно 200 нм и дополнительно могут включать один или более дополнительных компонентов.
При использовании в настоящем документе дополнительные компоненты включают, без ограничения перечисленным, один или более из следующего: вспомогательные вещества; поверхностноактивные вещества; диспергирующие вещества; инертные разбавители; гранулирующие вещества и разрыхлители; связующие вещества; смазывающие вещества; подсластители; ароматизаторы; красители; консерванты; физиологически разлагаемые композиции, такие как желатин; водные разбавители и растворители; масляные разбавители и растворители; суспендирующие вещества; диспергирующие или смачивающие вещества; эмульгаторы, смягчающие вещества; буферы; соли; загустители; наполнители; эмульгаторы; антиоксиданты; антибиотики; противогрибковые средства; стабилизирующие вещества; и фармацевтически приемлемые полимерные или гидрофобные материалы. Другие дополнительные компоненты, которые могут быть включены в фармацевтические композиции согласно изобретению, известны в уровне техники и описаны, например, в справочнике Remington's Pharmaceutical Sciences (1985, Genaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA), который включен в настоящий документ посредством отсылки.
Клетки, продуцирующие антитела и их антигенсвязывающие фрагменты
В некоторых вариантах осуществления изобретения предложена клетка или клеточная линия (такие как клетки-хозяева), которая продуцирует по меньшей мере одно из антител против фактора D или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления клетка или клеточная линия представляет собой генетически модифицированную клетку, которая продуцирует по меньшей мере одно из антител против фактора D или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления клетка или клеточная линия является гибридомой, которая продуцирует по меньшей мере одно из антител против фактора D или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе.
Гибридные клетки (гибридомы) обычно получают в результате массовых слияний мышиных спленоцитов, которые обогащены В-лимфоцитами, и миеломных клетков-партнеров по слиянию (Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (Garland Publishing, Inc. 1994); Harlow et al., Antibodies. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988). Клетки при слиянии затем распределяют в пулы, которые можно исследовать на продукцию антител с нужной специфичностью. Положительные пулы могут быть затем подразделены дополнительно, пока не будут идентифицированы одиночные клеточные клоны, которые продуцируют антитела с нужной специфичностью. Антитела, продуцируемые такими клонами, называются моноклональными антителами.
Также предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие любое из антител или фрагментов антител, раскрытых в настоящем документе, а также векторы, содержащие нуклеиновые кислоты. Таким образом, антитела и фрагменты согласно изобретению могут быть получены при экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке или клеточной линии, такой как клеточные линии, обычно используемые для экспрессии рекомбинантных или гуманизированных иммуноглобулинов. Таким образом, антитела и фрагменты согласно изобретению также могут быть получены при клонировании нуклеиновых кислот в один или более векторов экспрессии и трансформации вектора в клеточную линию, такую как клеточные линии, обычно используемые для экспрессии рекомбинантных или гуманизированных иммуноглобулинов.
Гены, кодирующие тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов или их фрагменты, могут быть сконструированы в соответствии со способами, включающими, без ограничения, полимеразную цепную ре- 27 044227 акцию (ПЦР), известную в данной области (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Berger & Kimmel, Methods in Enzymology, Vol. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, Inc., San Diego, Calif., 1987; Co et al., 1992, J. Immunol. 148:1149). Например, гены, кодирующие тяжелые и легкие цепи или их фрагменты, можно клонировать из геномной ДНК клетки, секретирующей антитело, или кДНК получают в результате обратной транскрипции клеточной РНК. Клонирование выполняют с помощью стандартных методов, включающих использование ПЦР праймеров, которые гибридизуются с последовательностями, фланкирующими или перекрывающимися с генами или сегментами генов, подлежащих клонированию.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие антитело по изобретению, или тяжелую цепь или легкую цепь, или их фрагменты, можно получать и применять в соответствии с технологиями рекомбинантных нуклеиновых кислот для получения специфического иммуноглобулина, цепи иммуноглобулина или их фрагмента, или варианта, в различных клетках-хозяевах или в системе трансляции in vitro. Например, нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела или их фрагменты, могут быть помещены в подходящие прокариотические или эукариотические векторы, например векторы экспрессии, и введены в подходящую клетку-хозяина подходящим способом, например путем трансформации, трансфекции, электропорации, инфицирования, при этом нуклеиновая кислота функционально связана с одним или более элементами регуляции экспрессии, например в векторе, или интегрирована в геном клетки-хозяина.
В некоторых вариантах осуществления тяжелые и легкие цепи или фрагменты этого, могут быть собраны в двух разных векторах экспрессии, которые могут использоваться для котрансфекции реципиентной клетки. В некоторых вариантах осуществления каждый вектор может содержать два или более селективных генов, один для селекции в бактериальной системе и один для селекции в эукариотической системе. Эти векторы обеспечивают получение и амплификацию генов в бактериальной системе, и последующую котрансфекцию эукариотических клеток и отбор котрансфицированных клеток. Процедура отбора может использоваться для отбора по экспрессии нуклеиновых кислот антитела, введенных в двух разных ДНК векторах в эукариотическую клетку.
В альтернативе нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелые и легкие цепи или их фрагменты, могут экспрессироваться с одного вектора. Хотя легкие и тяжелые цепи кодируются отдельными генами, их можно соединить при использовании рекомбинантных методов. Например, два полипептида можно соединить синтетическим линкером, который позволяет получать их в виде одной белковой цепи, в который VL и VH области спарены с образованием моновалентных молекул (известных как одиноцепочечный Fv (scFv); см., например, Bird et al., 1988, Science 242: 423-426; и Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883).
В изобретении предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую тяжелую цепь и/или легкую цепь, а также ее фрагменты.
Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательности, кодирующие легкую и тяжелую цепь или их фрагменты, может быть сконструирована так, что она содержит синтетическую сигнальную последовательность для секреции антитела или фрагмента при продукции в клетке. Кроме того, молекула нуклеиновой кислоты может содержать специфические ДНК линкеры, которые позволяют вводить другие последовательности антител и сохраняют трансляционную рамку считывания, чтобы не изменять аминокислоты, обычно присутствующие в последовательностях антител.
В соответствии с настоящим изобретением последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие антитело, могут быть встроены в соответствующий вектор экспрессии. В различных вариантах осуществления вектор экспрессии содержит необходимые элементы для транскрипции и трансляции нуклеиновой кислоты, кодирующей встроенное антитело, обеспечивая получение молекул рекомбинантной ДНК, которые направляют экспрессию последовательностей антитела для образования антитела или его фрагмента.
Кодирующие антитело нуклеиновые кислоты или их фрагменты могут быть подвергнуты различным генно-инженерным методам, которые известны специалистам в данной области, таким как сайтнаправленный мутагенез.
Различные способы могут использоваться для экспрессии нуклеиновых кислот в клетке. Нуклеиновые кислоты можно клонировать во множество типов векторов. Однако настоящее изобретение не следует считать ограниченным каким-либо конкретным вектором. Напротив, настоящее изобретение следует рассматривать как охватывающее целый ряд векторов, которые легко доступны и/или известны в уровне техники. Например, нуклеиновую кислоту согласно изобретению можно клонировать в вектор, включающий, без ограничения перечисленным, плазмиду, фагмиду, производное фага, вирус животного и космиду. Векторы, представляющие особый интерес, включают векторы экспрессии, векторы репликации, векторы генерации зондов и секвенирующие векторы.
В конкретных вариантах осуществления вектор экспрессии выбран из группы, состоящей из вирусного вектора, бактериального вектора и вектора клеток млекопитающего. Существует множество векторных систем экспрессии, которые включают, по меньшей мере, часть или все композиции, обсуждаемые выше. Системы на основе прокариотических и/или эукариотических векторов можно использовать для применения в настоящем изобретении для получения полинуклеотидов или их родственных поли- 28 044227 пептидов. Многие такие системы широко доступны в продаже.
Технология вирусных векторов хорошо известна в данной области и описана, например, в Sambrook et al. (2012) и в Ausubel et al. (1999), а также в других руководствах по вирусологии и молекулярной биологии. Вирусы, которые могут использоваться в качестве векторов, включают, без ограничения перечисленными, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, герпесвирусы и лентивирусы. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе вируса стволовых клеток мыши (MSCV) используется для экспрессии требуемой нуклеиновой кислоты. Было показано, что векторы MSCV эффективно экспрессируют требуемые нуклеиновые кислоты в клетках. Однако изобретение не должно быть ограничено применением только вектора MSCV, напротив, в изобретение включен любой способ ретровирусной экспрессии. Другими примерами вирусных векторов являются векторы на основе вируса мышиного лейкоза Молони (MoMuLV) и ВИЧ. В некоторых вариантах осуществления подходящий вектор содержит точку начала репликации, функционирующую по меньшей мере в одном организме, промоторную последовательность, удобные сайты рестрикции и один или более селективных маркеров (см., например, WO 01/96584; WO 01/29058; и патент США 6326193).
Могут использоваться дополнительные регуляторные элементы, например, энхансеры, модулирующие частоту инициации транскрипции. Промотор может быть таким промотором, который обычно связан с последовательностью гена или нуклеиновой кислоты, и который может быть получен при выделении 5'-некодирующих последовательностей, расположенных перед кодирующим сегментом и/или экзоном. Такой промотор может именоваться эндогенным. Аналогичным образом, энхансер может являться энхансером, обычно связанным с последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенным после или перед этой последовательностью. В альтернативе определенные преимущества будут получены при помещении сегмента кодирующей нуклеиновой кислоты под контроль рекомбинантного или гетерологичного промотора, который относится к промотору, который обычно не связан с последовательностью нуклеиновой кислоты в ее естественном окружении. Рекомбинантный или гетерологичный энхансер также относится к энхансеру, обычно не связанному с последовательностью нуклеиновой кислоты в ее естественном окружении. Такие промоторы или энхансеры могут включать в себя промоторы или энхансеры других генов, а также промоторы или энхансеры, выделенные из любой другой прокариотической, вирусной или эукариотической клетки, и промоторы или энхансеры, не встречающиеся в природе, например, содержащие разные элементы из различных областей регуляции транскрипции и/или мутации, которые изменяют экспрессию. В дополнение к получению последовательностей нуклеиновых кислот из промоторов и энхансеров синтетически, последовательности могут быть получены при использовании технологии рекомбинантного клонирования и/или амплификации нуклеиновых кислот, включая ПЦР, в сочетании с композициями, раскрытыми в настоящем документе (патент США 4683202, патент США 5928906). Кроме того, предполагается, что также могут использоваться контрольные последовательности, которые направляют транскрипцию и/или экспрессию последовательностей внутри неядерных органелл, таких как митохондрии, хлоропласты и тому подобное.
Конечно, будет важно использовать промотор и/или энхансер, который эффективно направляет экспрессию сегмента ДНК в типе клетки, органелле и организме, выбранных для экспрессии. Специалистам в области молекулярной биологии обычно известно, как использовать промоторы, энхансеры и комбинации типов клеток для экспрессии белка, например, см. Sambrook et al. (2012). Используемые промоторы могут быть конститутивными, тканеспецифическими, индуцируемыми и/или могут применяться в соответствующих условиях для направления экспрессии введенного сегмента ДНК на высоком уровне, что является преимуществом при крупномасштабном производстве рекомбинантных белков и их фрагментов.
Примером промотора является последовательность предраннего промотора цитомегаловируса (ЦМВ). Эта промоторная последовательность является сильной конститутивной промоторной последовательностью, способной индуцировать высокие уровни экспрессии любой полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с ней. Впрочем, также могут использоваться другие последовательности конститутивных промоторов, включающие, без ограничения перечисленными, ранний промотор вируса обезьян 40 (SV40), вирус опухоли молочной железы мыши (MMTV), промотор длинного концевого повтора (LTR) вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), промотор вируса Молони, промотор вируса лейкоза птиц, предранний промотор вируса Эпштейна-Барр, промотор вируса саркомы Рауса, а также промоторы генов человека, такие как, без ограничения перечисленными, промотор актина, промотор миозина, промотор гемоглобина и промотор креатина мышц. Кроме того, изобретение не должно ограничиваться применением конститутивных промоторов. Индуцируемые промоторы также рассматриваются как часть изобретения. Применение индуцируемого промотора в изобретении обеспечивает молекулярный включатель, способный включать экспрессию полинуклеотидной последовательности, с которой он функционально связан, когда такая экспрессия требуется, или отключать экспрессию, когда экспрессия нежелательна. Примеры индуцируемых промоторов включают, без ограничения перечисленными, промотор металлотионеина, глюкокортикоидный промотор, прогестероновый промотор и тетрациклиновый промотор. Кроме того, изобретение включает применение тканеспецифического промотора или промотора, специфического для типа клеток, который является промотором, который активен только в
- 29 044227 требуемой ткани или клетке. Тканеспецифические промоторы хорошо известны в данной области и включают, без ограничения перечисленными, промотор HER-2 и промоторные последовательности, связанные с PSA.
Для оценки экспрессии нуклеиновых кислот вектор экспрессии, который предполагается ввести в клетку, также может содержать либо селективный маркерный ген, либо репортерный ген, либо оба, для облегчения идентификации и отбора экспрессирующих клеток из популяции клеток, которые считаются трансфицированными или инфицированными посредством вирусных векторов. В других вариантах осуществления селективный маркер может находиться на отдельной нуклеиновой кислоте и использоваться в процедуре котрансфекции. Как селективные маркеры, так и репортерные гены могут быть фланкированы соответствующими регуляторными последовательностями для обеспечения экспрессии в клеткаххозяевах. Подходящие селективные маркеры известны в данной области и включают, например, гены устойчивости к антибиотикам, такие как пое и тому подобное
Репортерные гены используются для идентификации потенциально трансфицированных клеток и для оценки функциональности регуляторных последовательностей. Репортерные гены, которые кодируют легко определяемые белки, хорошо известны в данной области. Обычно репортерный ген представляет собой ген, который не присутствует или не экспрессируется организмом или тканью реципиента, и который кодирует белок, экспрессия которого проявляется в некотором легко обнаруживаемом свойстве, например ферментативной активности. Экспрессию репортерного гена определяют в подходящее время после введения ДНК в реципиентные клетки.
Подходящие репортерные гены могут включать гены, кодирующие люциферазу, бетагалактозидазу, хлорамфениколацетилтрансферазу, секретируемую щелочную фосфатазу, или ген зеленого флуоресцентного белка (см., например, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Lett. 479:79-82). Подходящие системы экспрессии хорошо известны и могут быть получены при использовании хорошо известных методик или приобретены на рынке. Как правило, конструкцию с минимальной 5'-фланкирующей областью, демонстрирующую наиболее высокий уровень экспрессии репортерного гена, идентифицируют как промотор. Такие промоторные области могут быть связаны с репортерным геном и могут использоваться для оценки средств на способность модулировать направляемую промотором транскрипцию.
Способы введения и экспрессии нуклеиновых кислот в клетке известны в уровне техники. В отношении вектора экспрессии вектор может быть с легкостью введен в клетку-хозяина, например, клетку млекопитающего, бактериальную, дрожжевую клетку или клетку насекомого любым способом из уровня техники. Например, вектор экспрессии может быть перенесен в клетку-хозяина физическими, химическими или биологическими способами.
Физические способы введения полинуклеотида в клетку-хозяина включают осаждение фосфатом кальция, липофекцию, бомбардировку частицами, микроинъекцию, электропорацию, лазеропорацию и тому подобное Способы получения клеток, включающих векторы и/или экзогенные нуклеиновые кислоты, известны в уровне техники. См., например, Sambrook et al. (2012) и Ausubel et al. (1999).
Биологические способы введения представляющей интерес нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина включают применение ДНК и РНК векторов. Вирусные векторы и особенно ретровирусные векторы стали наиболее широко применяемым методом вставки генов в клетки млекопитающих, например, клетки человека. Другие вирусные векторы могут быть получены из лентивируса, поксвирусов, вируса простого герпеса I, аденовирусов и аденоассоциированных вирусов, и тому подобное См., например, патенты США 5350674 и 5585362.
Химические способы введения нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина включают коллоидные дисперсионные системы, такие как макромолекулярные комплексы, нанокапсулы, микросферы, гранулы и системы на основе липидов, включая эмульсии типа масло в воде, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Предпочтительной коллоидной системой для применения в качестве носителя доставки in vitro и in vivo является липосома (например, везикула из искусственной мембраны). Получение и применение таких систем хорошо известно в уровне техники.
Независимо от способа, используемого для введения экзогенных нуклеиновых кислот в клеткухозяина или иного воздействия на клетку нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, для подтверждения присутствия последовательности рекомбинантной ДНК в клетке-хозяине могут проводить различные анализы. Такие анализы включают, например, молекулярно-биологические анализы, хорошо известные специалистам в данной области, такие как Саузерн и Нозерн-блоттинг, ОТ-ПЦР и ПЦР; биохимические анализы, такие как обнаружение присутствия или отсутствия конкретного пептида, например, с помощью иммунологических методов (ИФА и Вестерн-блоты) или с помощью анализов, описанных в настоящем документе для идентификации средств, включенных в объем изобретения.
Не относящиеся к человеку животные, экспрессирующие фактор D человека
Изобретение также включает генетически модифицированное животное, не относящееся к человеку, которое экспрессирует фактор D человека. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, не относящееся к человеку, которое экспрессирует фактор D человека, не экспрессирует фактор D животного, не относящегося к человеку. В одном из вариантов осуществления изобретения предложено генетически модифицированное животное, не относящееся к человеку, которое
- 30 044227 экспрессирует фактор D человека с эндогенных регуляторных элементов животного, не относящегося к человеку, но не экспрессирует фактор D животного, не относящегося к человеку. В некоторых вариантах осуществления животное, не относящееся к человеку, является млекопитающим. В некоторых вариантах осуществления животное, не относящееся к человеку, является грызуном. В некоторых вариантах осуществления животное, не относящееся к человеку, является крысой или мышью.
Для создания генетически модифицированного животного, не относящегося к человеку, нуклеиновая кислота, кодирующая белок фактора D человека, может быть включена в рекомбинантный вектор экспрессии в форме, подходящей для экспрессии белка фактора D человека в клетке-хозяине. Термин в форме, подходящей для экспрессии слитого белка в клетке-хозяине предназначен для обозначения того, что рекомбинантный вектор экспрессии включает одну или более регуляторных последовательностей, функционально связанных с нуклеиновой кислотой, кодирующей белок фактора D человека таким способом, который обеспечивает транскрипцию нуклеиновой кислоты в мРНК и трансляцию мРНК в белок фактора D человека. Термин регуляторная последовательность известен в данной области техники и включает промоторы, энхансеры и другие элементы регуляции экспрессии (например, сигналы полиаденилирования). Такие регуляторные последовательности известны специалистам в данной области и описаны в публикации 1990, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. Следует понимать, что конструкция вектора экспрессии может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина для трансфекции и/или количество белка фактора D человека, которое должно быть экспрессировано.
Генетически модифицированное животное, не относящееся к человеку, может быть создано, например, путем введения нуклеиновой кислоты, кодирующей белок фактора D человека (обычно связанный с соответствующими регуляторными элементами, такими как конститутивный или тканеспецифический энхансер), в ооцит, например, путем микроинъекции, с последующим развитием ооцита у самки мыши-основателя. Интронные последовательности и сигналы полиаденилирования также могут быть включены в трансген для повышения эффективности экспрессии трансгена. Способы создания генетически модифицированных животных, таких как мыши, стали стандартными в данной области и описаны, например, в патентах США 4736866 и 4870009, а также в публикации 1986, Hogan et al., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory. Генетически модифицированное животное-основатель может использоваться для размножения дополнительных индивидов, несущих трансген. Генетически модифицированные животные, несущие трансген, кодирующий белок фактора D согласно изобретению, могут быть затем скрещены с другими генетически модифицированными животным, несущим другие трансгены, или другими нокаутными животными, например, нокаутной мышью, которая не экспрессирует ген фактора D мыши. Следует понимать, что в дополнение к генетически модифицированным животным система может применяться для создания других индивидов, экспрессирующих фактор D человека.
В одном из вариантов осуществления генетически модифицированное животное, не относящееся к человеку, которое экспрессирует фактор D человека с регуляторных элементов животного, не относящегося к человеку, но не экспрессирует фактор D животного, не являющегося человеком, получено с применением системы, которая заменяет последовательности экзонов (или последовательности экзонов и интронов) фактора D животного, не относящегося к человеку, последовательностями экзонов (или последовательностями экзонов и интронов) фактора D человека, но оставляет без изменений нативные последовательности одного, нескольких или всех регуляторных элементов животного, не относящегося к человеку (например, промотор, энхансеры, фланкирующие области, интроны и т.д.). Хотя может использоваться любая подходящая система, одной примерной системой, с помощью которой может быть получено генетически модифицированное не относящееся к человеку животное, является система CRISPr/Cas9. Система CRISPR/Cas относится к широко распространенному классу бактериальных систем для защиты от чужеродной нуклеиновой кислоты. Системы CRISPR/Cas встречаются в широком спектре эубактериальных и архейных организмов. Системы CRISPR/Cas включают в себя подтипы I, II и III. В системах CRISPR/Cas II дикого типа используется РНК-опосредованная нуклеаза Cas9 в комплексе с направляющей и активирующей РНК для распознавания и расщепления чужеродной нуклеиновой кислоты. Гомологи Cas9 обнаружены в целом ряде эубактерий, включающих, без ограничения перечисленными, бактерии следующих таксономических групп: Actinobacteria, Aquificae, Bacteroidetes-Chlorobi, Chlamydiae-Verrucomicrobia, Chlroflexi, Cyanobacteria, Firmicutes, Proteobacteria, Spirochaetes и Thermototo. Примером белка Cas9 является белок Cas9 Streptococcus pyogenes. Дополнительные белки Cas9 и их гомологи описаны, например, в Chylinksi, et al., RNA Biol. 2013 May 1; 10(5): 726-737; Nat. Rev. Microbiol. 2011 June; 9(6):467-477; Hou, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2013 Sep 24; 110 (39):15644-9; Sampson et al., Nature. 2013 May 9; 497 (7448):254-7; и Jinek, et al., Science. 2012 Aug 17; 337 (6096) :816-21.
В одном из вариантов осуществления генетически модифицированное не относящееся к человеку животное согласно настоящему изобретению экспрессирует фактор D человека с промотора β-актина курицы с энхансером CVM-IE, однако специалисту в данной области будет понятно, что генетически модифицированное не относящееся к человеку животное согласно изобретению охватывает экспрессию фактора D человека с других промоторов и энхансеров. Примеры промоторов, которые могут приме- 31 044227 няться в изобретении, включают, без ограничения перечисленными, нативный промотор мыши, промотор ДНК pol II, промотор PGK, промотор убиквитина, промотор альбумина, промотор глобина, промотор овальбумина, ранний промотор SV40, промотор вируса саркомы Рауса (RSV), ретровирусный LTR и лентивирусный LTR. Системы экспрессии промоторов и энхансеров, используемые в изобретении, также включают индуцируемые и/или тканеспецифические системы экспрессии.
Описанные в настоящем документе генетически модифицированные животные, не относящиеся к человеку, могут применяться в различных исследованиях и для клинических применений. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предложены способы скрининга соединения против фактора D (такого как антитело). В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предложены способы проверки соединения против фактора D (такого как антитело). В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предложены способы оценки терапевтической эффективности соединения против фактора D (такого как антитело) при различных комплемент-опосредованных заболеваниях и нарушениях, в том числе заболеваниях и нарушениях, которые могут быть индуцированы у гуманизированного не относящегося к человеку животного, или заболеваниях или нарушениях, которые могут самопроизвольно развиваться у не относящихся к человеку животных с двойной мутацией, которые могут быть получены при скрещивании не относящегося к человеку животного с фактором D и другого не относящегося к человеку животного, имеющего другие мутации, которые могут вызывать комплемент-ассоциированное заболевание или нарушение (см., например, Lesher, 2013, J. Am. Soc. Nephrol. 24: 53-65; Ueda et al., 2017, Blood Mar 2; 129: 1184-1196).
Наборы
Изобретение также включает набор, включающий антитело против фактора D или его комбинации согласно изобретению и инструкционный материал, в котором описано, например, введенние антитела против фактора D или его комбинаций пациенту в качестве терапевтического лечения или нелечебное применение, как описано в другой части настоящего документа. В варианте осуществления данный набор дополнительно включает фармацевтически приемлемый носитель, подходящий для растворения или суспендирования терапевтической композиции, включающей антитело против фактора D или его комбинации согласно изобретению, например, перед введением антитела пациенту. Набор необязательно включает аппликатор для введения антитела.
Экспериментальные примеры
Далее изобретение будет описано со ссылкой на следующие примеры. Эти примеры приведены исключительно с целью иллюстрации, и изобретение никоим образом не следует считать ограниченным этими примерами, а скорее следует рассматривать как охватывающее любые возможные варианты, которые становятся очевидными в качестве результата описания, представленного в настоящем документе.
Без дополнительного описания считается, что средний специалист в данной области, при использовании предыдущего описания и следующих иллюстративных примеров, может получить и применить соединения настоящего изобретения и осуществить на практике заявленные способы. Таким образом, следующие рабочие примеры не должны быть истолкованы как ограничивающие каким-либо образом остальную часть настоящего описания.
Пример 1.
Моноклональные антитела против фактора D человека были получены при использовании метода гибридом, первоначально описанного Колером с соавт. (Kohler et al., 1975, Nature, 256:495), с некоторыми модификациями. Самок мышей Balb/c (Jackson laboratory) иммунизировали 100 мкг очищенного фактора D человека (из человеческой плазмы), эмульгированного с адъювантом. В день 21 и день 35 мышей снова иммунизировали 100 мкг очищенного фактора D человека, эмульгированного с адъювантом. Мышей стимулировали 25 мкг очищенного фактора D человека два раза перед слиянием. Затем мышей умерщвляли путем смещения шейных позвонков и забирали селезенку для приготовления суспензии одиночных клеток путем механического разрушения. Суспензию клеток селезенки один раз промывали средой HYB-SFM (Invitrogen) + 10% FBS, после чего клетки посчитывали и смешивали с миеломными клетками X63-Ag8.653 (ATCC) в соотношении 2:1. Смесь клеток снова промывали средой HYB-SFM и получали осадок клеток с помощью центрифугирования (1000 об/мин х5 мин). Осадок клеток мягко перемешивали и отделяли, а затем слияние клеток вызывали путем медленного добавления полиэтиленгликоля (ПЭГ 1500) (1,5 мл ПЭГ на 3х108 клеток). Клетки оставляли на 1 мин при 37°С, затем 20 мл среды HYB-SFM добавляли к клеткам за 3 мин (1 мл в течение первой минуты, 3 мл в течение второй минуты и 16 мл в течение третьей минуты). Смесь центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин и сеяли клетки в 24-луночные планшеты в среде HAT (10 мл HAT [Sigma H0262], 5 мл пен/стреп, 500 мкл гентамицина и 10% FBS в 500 мл среды HYB-SFM). Через 2 недели супернатанты из лунок с видимыми колониями отбирали для скрининга реактивности с очищенным фактором D человека методом ИФА. Положительные клоны отбирали и сеяли в 96-луночные планшеты метод серийных разведений с получением одиночных клонов после второго раунда скрининга с помощью ИФА. Положительные клоны размножали в среде НТ (10 мл НТ, 5 мл пен/стреп, 500 мкл гентамицина и 10% FBS в 500 мл среды HYB-SFM). Перед сбором антитела клетки гибридомы переводили на бессывороточную среду (HYB-SFM) на 2-3
- 32 044227 дня. Среду культивирования клеток собирали для очистки мАт с помощью афинной хроматографии с белком G.
Пример 2.
Микротитровальные планшеты покрывали липополисахаридом (ЛПС) (2 мкг/лунка) в PBS (фосфатно-солевом буфере) при 37°C в течение 1 ч. После промывки планшетов PBST (фосфатно-солевым буфером и 0,05% tween) 3 раза планшет блокировали 1% BSA в PBS в течение 1 ч при КТ. 10% нормальную человеческую сыворотку (НЧС), нормальную сыворотку яванского макака, нормальную сыворотку резуса, нормальную сыворотку морской свинки, нормальную сыворотку мыши предварительно инкубировали с различными концентрациями мАт 11А8-1 или мАт 1F10-5, или химерного 11А8-1 при 4°С в течение 1 ч. 10% сыворотка в Mg++-ЭГТА GVB++ буфере служила в качестве положительного контроля, и 10% сыворотка в GVB++ ЭДТА буфере служила в качестве отрицательного контроля. Планшеты инкубировали с НЧС при 37°C в течение 1 ч, затем реакцию останавливали холодным 10 мМ ЭДТА в PBS и промывали 3 раза. Планшеты инкубировали с HRP-конъюгированным козьим поликлональным антителом против C3 человека или поликлональным антителом против C3 мыши, разведенным 1:4000 в блокирующем буфере, при комнатной температуре в течение 1 ч. Планшеты 3 раза промывали и проявляли HRP субстратом в течение 6-10 мин. Реакцию останавливали 2 Н H2SO4, считывали планшет при 450 нм в микропланшетном анализаторе.
Пример 3.
Полистирольные микротитровальные планшеты покрывали очищенным фактором D человека (50 нг/лунка) в PBS при 37°C в течение 1 ч. После аспирации раствора фактора D лунки блокировали PBS, содержащим 1% BSA в PBS, при комнатной температуре в течение 1 ч. Лунки без fD покрытия служили в качестве фонового контроля. В лунки добавляли различные концентрации мАт 11А8-1 или мАт 1F10-5, или химерного 11А8-1, 50 мкл/лунка в блокирующем растворе. После инкубирования в течение 1 ч при комнатной температуре лунки тщательно промывали PBST. Связавшееся с фактором D человека мАт детектировали при добавлении HRP-конъюгата потив IgG мыши в разведении 1:4000 в блокирующем растворе, который оставляли для инкубирования в течение 1 ч при КТ. После промывки PBST планшет проявляли HRP субстратом в течение 6-10 мин. Реакцию останавливали 2 Н H2SO4 и считывали планшет при 450 нм в микропланшетном анализаторе.
Пример 4.
Анализ методом поверхностного плазмонного резонанса использовали для измерения константы скорости ассоциации и скорости диссоциации для связывания фактора D человека с иммобилизированным мАт 11А8-1, мАт 1F10-5 и химерным 11А8-1 при использовании системы BIAcore 3000 (BiaCore AB, Uppsala, Sweden), все эксперименты BiaCore проводили при 25°С. Карбоксилированную декстрановую матрицу сенсорного чипа СМ5 использовали для связывания очищенного антитела, мАт 11А8-1, мАт 1F10-5 и химерного 11А8-1 методом аминосочетания с получением поверхностной плотности 400500 RU. Человеческий fD разводили до 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,12, 1,56 и 0 нМ в буфере HBSET (забуференном HEPES растворе хлорида натрия с ЭДТА и Tween 20) и образцы инкубировали на поверхности с мАт 11А8-1, мАт 1F10-5 и химерным 11А8-1 при 30 мкл/мин (инъекция 60 мкл) в течение 120 с, и проводили диссоциацию связанного аналита в течение 900 с. Данные анализировали с помощью программы для оценки BIA 3.2 с использованием модели бивалентного связывания. Регенерацию поверхности выполняли инъекциями 50 мкл (50 мкл/мин) 50 мМ NaOH.
Пример 5.
Для клонирования кДНК 11А8-1 и 1F10-5, суммарную РНК выделяли из клеток гибридом с помощью реактива TRizol (Sigma). Первую цепь кДНК синтезировали с помощью обратной транскрипции при использовании олиго (dT) праймера, для амплификации кДНК тяжелой цепи (для IgG 1, IgG2a/b) в реакциях ПЦР использовали следующие праймеры:
5'-GAG GTG A AGCTG GTG G AG (T/A) С (Т/А) GG-3' (SEQ ID NO: 68) и 5'-GGGGCCAGTGGATAGAC-3' (SEQ ID NO: 69).
Для амплификации к легкой цепи использовали следующие праймеры: смесь 4 прямых праймеров: 5'-CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGACTCCA-3' (SEQ ID NO: 70);
5'-CCAGTTCCGAGCTCGTGCTCACCCAGTCTCCA-3' (SEQ ID NO: 71);
5'-CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCA-3' (SEQ ID NO: 72);
5'-CC AGTTC CG G CTC GTG ATG AC AC AGTCTCC-3' (SEQ ID NO: 73); обратный праймер: 5'-GTTGGTGCAGCATCAGC-3' (SEQ ID NO: 74).
ПЦР ампликоны клонировали в вектор pCR TOPO ТА 2.1 (Invitrogen) и секвенировали. Для получения последовательности сигнального пептида (лидерной) мАт использовали метод 5'-RACE с набором (GeneRacer) производства Invitrogen. Полные кДНК вариабельной области амплифицировали при использовании специфических праймеров, определенных на основе 5'-RACE и начальных данных секвенирования.
Пример 6.
Плазмиду pND1 использовали для сборки окончательного направляющего вектора. Для гомологичной последовательности короткого плеча амплифицировали smaI-smaI фрагмент длиной 4,2 тому подобноен., содержащий 3'-область гена фактора D мыши, при использовании
- 33 044227
5'-CCCGGGCTGGGTTTTGGTTTTTGC-3' (прямой; сайт SmaI подчеркнут) и
5'-CCCGGGTCCTTGACATGAACACTTTGC-3' (обратный; сайт SmaI подчеркнут) в качестве праймеров (сайты SmaI подчеркнуты). Этот фрагмент клонировали в вектор pND1 по сайтам KpnI, обработанным затупляющим реактивом. Для гомологичной последовательности длинного плеча амплифицировали фрагмент длиной 5,7 тому подобноен., содержащий 5'-область гена фактора D мыши, при использовании в качестве праймеров
5'-ATCGATACTCAGAAATCTGCCTGCCTC-3' (прямой; сайт ClaI подчеркнут) и
5'-GCGGCCGCTCCTAGGAGGACCAGAACTGCCAGGCGCTCCCAGCTGTGCATTCTGACAGCA-3' (обратный; сайт NotI подчеркнут). Также амплифицировали фрагмент длиной 1,2 тому подобноен., содержащий 3'-область гена фактора D мыши при использовании в качестве праймеров
5'-CTCGAGAGAGACACGTGGCTCACAATA-3' (прямой; сайт XhoI подчеркнут) и
5'-CTCGAGAATTATCGAAGTACTCCACCG-3' (обратный; сайт XhoI подчеркнут) (сайты SmaI подчеркнуты). Фрагмент 826 пн, содержащий кодирующую последовательность фактора D человека, синтезировали в Genscript Corp. и выделяли 0,75 тому подобноен. фрагмент NotI-XhoI при расщеплении NotI и XhoI. Эти три фрагмента, 5,7 тому подобноен. ClaI-NotI фрагмент, 0,75 тому подобноен. NotI-XhoI фрагмент и 1,2 тому подобноен. XhoI-XhoI фрагмент субклонировали в вышеуказанный вектор pND1 по сайтам ClaI-XhoI. Направляющую конструкцию линеаризовали, электропорировали в клетки C57BL/6 ES и отбирали по устойчивости к неомицину. Направляющие ES клоны идентифицировали с помощью Саузерн-блоттинга при использовании 3'-зонда, распознающего 5 тому подобноен. фрагмент дикого типа и 4,5 тому подобноен. фрагмент в правильно модифицированной геномной области после расщепления BamHI (фиг. 11с). Правильно направленные клоны ES вводили в бластоцисту с получением химерных мышей. Полученных химерных самцов скрещивали с самками мышей C57BL/6 для определения передачи целевого аллеля по зародышевой линии. Гетерозиготные мыши с нокаутом фактора D человека скрещивали с генетически модифицированными мышами FLPe (фон C57BL/6, Jackson laboratory) для удаления пео кассеты из нокин аллеля фактора D человека. Гетерозиготных мышей с нокаутом фактора D человека без пео кассеты скрещивали с получением гомозиготных мышей с нокаутом фактора D человека. Мышей дикого типа (WT), гетерозиготных (Het) и гомозиготных (Homo) мышей с нокаутом фактора D человека идентифицировали при ПЦР генотипировании ДНК из хвоста с использованием специфичного к фактору D человека (целевой размер: 450 пн)
5'-GTC AGG GTG CCA TGC AGG AG-3' (SEQ ID NO: 26) и
5'-CCC TGC AGG AGA ACC ACC ТТС-3' (SEQ ID NO: 27), и специфичного к фактору D мыши (целевой размер: 292 пн), 5'-ССТ ССС АСС СТТ AGC ТАТ СС-3' (SEQ ID NO: 28) и 5'-АСС CAG ACT GTG ТСС СТС АС-3' (SEQ ID NO: 29) (фиг. 11d). Пример 7.
Эксперименты проводили для изучения активности и кинетики in vivo мАт 11А8-1 и 1F10-5 у гомозиготных мышей с нокаутом фактора D. Мышам вводили 1 мг (в/б) мАт 11А8-1 или мАт 1F10-5. Образцы крови (50-75 мкл) собирали перед инъекцией (24 ч), а затем в различные моменты времени после инъекции путем забора крови из ретроорбитального синуса и приготовления сыворотки. Образцы сыворотки исследовали на ЛПС-индуцированную активацию АР комплемента. Для этого анализа ИФА планшеты (96-луночные, Nunc) покрывали 50 мкл раствора ЛПС (2 мкг/лунка в PBS, 37°C, 1 ч). Планшеты промывали 3 раза PBS, содержащим 0,05% Твин-20 (PBS-T), и в каждую лунку добавляли по 50 мкл серийно разведенной (начиная с 1:10) мышиной сыворотки. Мышиную сыворотку разбавляли GVB-3TTAMg++ (содержащей 10 мМ ЭГТА и конечную концентрацию Mg++ 2,5 мМ). Планшет оставляли для инкубирования при 37°С в течение 1 ч, 3 раза промывали PBS-T и затем добавляли 50 мкл HRPконъюгированного антитела козы против C3 мыши (1:4000, Cappel) и оставляли планшет на 1 ч при комнатной температуре. Планшет три раза промывали PBS-T и затем проявляли при использовании А+В реагента BD Pharmingen. Реакцию останавливали через 6-10 мин при использовании 2 Н H2SO4. Активацию АР комплемента обнаруживали путем измерения количества осаждения C3 на планшете (OD450).
Пример 8.
Для создания мутантов с делениями праймеры (таблица ниже) подбирали таким образом, чтобы сайты контакта были удалены прямым и обратным праймером. Мутанты с заменами создавали при включении нужного нуклеотида в прямой праймер. 20 нг плазмиды pCMV-XL4-hfD амплифицировали с соответствующими прямыми и обратными праймерами при использовании мастер-микса Q5® Hot Start High-Fidelity. Амплифицированные продукты разгоняли на электрофорезе в агарозном геле для подтвержения чистоты. Соответствующие амплифицированные продукты вырезали из агарозного геля и выделяли ДНК при использовании набора для выделения из геля Bioneer. Очищенную ДНК лигировали ДНКлигазой (Takara DNA ligase mix), трансформировали в компетентные клетки JM109 и 100 мкл сеяли на чашку с LB агаром с ампициллином (50 мкг/мл). Колонии отбирали и инокулировали среду LB, содержащую 75 мкг/мл ампициллина. Плазмиды выделяли и подтверждали присутствие вставки при расщеплении рестриктазой NotI. Положительные в рестрикционном анализе плазмиды секвенировали для обнаружения мутантов с делециями и заменами. Положительные мутанта плазмиды с делециями и заменами
- 34 044227 использовали для экспрессии делеционного белка при трансфекции.
SEQ ID NO | Делеция | Праймер (3'-5') | Положение в мРНК | Длина | ||
SEQ ID NO:30/31 | Делеции | Δ1 [P107-W110] | Прям. | CAGCGCGTGGACCGCGACGT | 431-450 | 20 |
Обр. | GCGCACAGCAGGGCCCAGTG | 399-418 | 20 | |||
SEQ ID NO:32/33 | Δ2 [Ι130-Α134] | Прям. | GGCCGCCGCCCGGACAGCCT | 503-522 | 20 | |
Обр. | GCCCCAGCCGGCCACGTCGCA | 467-487 | 21 | |||
SEQ ID NO:34/35 | Δ3 [V14B-R151] | Прям. | GCCACCTGCAACCGGCGCACG | 554-574 | 21 | |
Обр. | TGGCAAGAGCACGTGCTGCAGGC | 519-541 | 23 | |||
SEQ ID NO:36/37 | Δ4 [S17B-G184] | Прям. | GGCCCGCTGGTGTGCGGG | 653-670 | 18 | |
Обр. | GTCCCGGCGATTGCTCTCCGC | 611-631 | 21 | |||
SEQ ID NO:38/39 | Δ12 [Ρ107-Α134] | Прям. | GGCCGCCGCCCGGACAGCCT | 503-522 | 20 | |
Обр. | GCGCACAGCAGGGCCCAGTG | 399-418 | 20 | |||
SEQ ID NO:40/41 | Δ13 [P107-R151] | Прям. | GCCACCTGCAACCGGCGACG | 554-574 | 21 | |
Обр. | GCGCACAGCAGGGCCCAGTG | 399-418 | 20 | |||
SEQ ID NO:42/43 | Δ14 [P107-G184] | Прям. | GGCCCGCTGGTGTGCGGG | 653-670 | 18 | |
Обр. | GCGCACAGCAGGGCCCAGTG | 399-418 | 20 | |||
SEQ ID NO:44/45 | Δ23 [I130-R151] | Прям. | GCCACCTGCAACCGGCGCAGCG | 554-574 | 21 | |
Обр. | GCCCCAGCCGGCCACGTCGCA | 467-487 | 21 | |||
SEQ ID NO:46/47 | Δ34 [V148-G184] | Прям. | GGCCCGCTGGTGTGCGGG | 653-670 | 18 | |
Обр. | GTCCCGGCGATTGCTCTCCGC | 611-631 | 21 | |||
SEQ ID NO:43/49 | Мутации | Ρ107Α | Прям. | TGCTGTGCGCgccCTGCCCTGGC | 409-431 | 23 |
Обр. | GGGCCCAGTGTGGCCTTCTCCG | 387-408 | 22 | |||
SEQ ID NO:50/51 | L108A | Прям. | TGTGCGCCCCGCCCCCTGGCAGCG | 412-435 | 24 | |
Обр. | GCAGGGCCCAGTGTGGCC | 394-411 | 18 | |||
SEQ ID NO:52/53 | Ρ109Α | Прям. | GCGCCCCCTGgccTGGCAGCGCG | 415-437 | 23 | |
Обр. | ACAGCAGGGCCCAGTGTGGCCTTCTCC | 388-414 | 27 | |||
SEQ ID NO:54/55 | WHOA | Прям. | CCCCCTGCCCgccCAGCGCGTGG | 418-440 | 23 | |
Обр. | CGCACAGCAGGGCCCAGT | 400-417 | 18 | |||
SEQ ID NO:56/57 | V14 8A | Прям. | GCTCTTGCCAAgccCTGGACCGCG | 532-554 | 23 | |
Обр. | ACGTGCTGCAGGCTGTCC | 514-531 | 18 | |||
SEQ ID NO:58/59 | L149A | Прям. | CTTGCCAGTGgccGACCGCGCCACC | 535-559 | 25 | |
Обр. | AGCACGTGCTGCAGGCTG | 517-534 | 18 | |||
SEQ ID NO:60/61 | D150A | Прям. | GCCAGTGCTGgccCGCGCCACCT | 538-560 | 23 | |
Обр. | AAGAGCACGTGCTGCAGGCTGTC | 515-537 | 23 | |||
SEQ ID NO:62/63 | R151A | Прям. | AGTGCTGGACgccGCCACCTGCAAC | 541-565 | 25 | |
Обр. | GGCAAGAGCACGTGCTGC | 523-540 | 18 | |||
SEQ ID NO:64/65 | P107A-W110A | Прям. | gccgccCAGCGCGTGGACCGCGAC | 425-448 | 24 | |
Обр. | ggcggcGCGCACAGCAGGGCCCAG | 401-424 | 24 | |||
SEQ ID NO:66/67 | V148A-R151A | Прям. | gccgccGCCACCTGCAACCGGCGC | 548-571 | 24 | |
Обр. | ggcggcTGGCAAGAGCACGTGCTGC | 523-547 | 25 | |||
SEQ ID NO:68/69 | R156L-H158Y | Прям. | CCTGCGCACGTACCACGACGGCG | 565-587 | 23 | |
Обр. | TTGCAGGTGGCGCGGTCCAGC | 544-564 | 21 | |||
SEQ ID NO:70/71 | L168M | Прям. | CACCGAGCGCatgATGTGCGCGG | 592-614 | 23 | |
Обр. | ATGGCGCCGTCGTGGTAG | 574-591 | 18 |
Пример 9.
Не содержащие эндотоксин плазмиды использовали для трансфекции. Клеткам яичника китайского хомячка (СНО) позволяли расти в 6-луночных планшетах до 85-90% конфлюэнтности. Плазмиды положительного контроля и мутантные плазмиды с делецией трансфицировали с использованием липофектамина (Invitrogen) в соотношении 1:2 в Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific). Через 48 ч после трансфекции супернатант собирали и хранили при -20°С до применения. Клетки промывали охлажденным во льду PBS (Invitrogen), добавляли неденатурирующий буфер RIPA (для радиоиммунопреципитационного анализа) (20 мМ Трис НС1, pH 8, 137 мМ NaCl, 1% NP-40, 2 мМ ЭДТА) и выдерживали во льду в течение 30 мин с периодическим перемешиванием. Лизат клеток собирали после центрифугирования и хранили супернатант при -20°С. Супернатант клеток СНО и лизат клеток использовали в качестве отрицательного контроля.
Пример 10.
Картирование эпитопов 11А8-1 выполняли методом иммунопреципитации и Вестерн-блоттинга. 300 мг CNBr-активированных гранул сефарозы 4В (номер по кат. 17-0430-1, GE healthcare) оставляли для набухания в 1 мМ НС1 в течение 15 мин. Затем гранулы переносили в воронку со стеклянным фильтром и промывали 200 мл 1 мМ НС1. Гель (гранулы) промывали буфером для связывания pH 9,0 (0,1 М NaНСО3, pH 9,0, 0,5 М NaCl) и сразу переносили в пробирку, содержащую 1 мг антитела 11-8А1 в буфере для связывания, на 5 мин. Пробирку оставляли на ночь на вращающейся платформе при 40°С. Связыва
-35044227 ние антитела с CNBr гранулами проверяли с помощью измерения оптического поглощения раствора антитела до и после связывания. Избыток лиганда удаляли при промывке 3 раза буфером для связывания, и оставшиеся активные сайты блокировали блокирующим буфером (1 М Трис-основание, рН 9,0) в течение 2 ч при комнатной температуре. Для удаления избытка несвязавшегося лиганда после связывания, гранулы поочередно промывали буфером с низким рН (0,1 М уксусная кислота, 0,5 М NaCl) и высоким рН (буфер для связывания) 2 раза. 200 мкл связавшихся гранул инкубировали с супернатантами после трансфекции и лизатом клеток в течение 2 ч при комнатной температуре на вращающейся платформе. Гранулы промывали 0,5 М NaCl в PBS 5 раз. Белки элюировали буфером для элюции антитела (0,1 М глицин, рН 2,0) и нейтрализовали 1,5 М Трис, рН 9,0. 50 мкл элюированных образцов использовали для иммуноблоттинга.
Пример 11.
Картирование эпитопов 1F10-5 выполняли методом ИФА. Микротитровальные планшеты покрывали 1F10-5 (2 мкг/мл) в PBS при 37°C в течение 1 ч. После аспирации раствора антитела лунки блокировали PBS, содержащим 1% BSA в PBS, при комнатной температуре в течение 1 ч. В лунки добавляли супернатанты культуры клеток транзиентных СНО трансфекантов полноразмерного или четырех мутантов с делецией (мутант 9, 10, 11 или 12) фактора D человека. Контролем служила среда клеточной культуры нетрансфицированных клеток. После инкубирования в течение 1 ч при комнатной температуре, лунки тщательно промывали. 1F10-5, связанное с фактором D человека, детектировали при использовании биотин-конъюгированного козьего антитела против фактора D человека с последующим добавлением HRP-конъюгированного стрептавидина. После промывки планшет проявляли HRP субстратом в течение 6-10 мин. Реакцию останавливали 2 Н H2SO4 и считывали планшет при 450 нм в микропланшетном анализаторе.
Для картирования эпитопов, мАт 1F10-5 тестировали на реактивность с полноразмерным и четырьмя мутантами с делецией фактора D человека. Вестерн-блоттинг подтверждал экспрессию белка для четырех мутантов с делецией. В ИФА мАт 1F10-5 связывало полноразмерный, мутант-9 и -12, но его связывание с мутантом-10 и -11 было значительно снижено. Эти результаты, показанные на фиг. 19, указывают, что делеция пяти аминокислот NRRTH в положениях 155-159 (SEQ ID NO: 23) или четырех аминокислот SNRR в положениях 173-176 (SEQ ID NO: 24) нарушала связывание мАт 1F10-5, и что эпитоп мАт 1F-10 включает аминокислоты SNRR.
Пример 12.
Гомозиготным мышам с нокаутом фактора D человека переливали эритроциты (Эр) мышей дикого типа и мышей с тройным нокаутом (ТКО) Crry/DAF/C3. Реципиентным мышам (гомозиготные мыши с нокаутом фактора D человека) за 24 ч до переноса Эр вводили мАт 118А-1 (2 мг/мышь, в/б) или PBS. Донорские Эр собирали у мышей ТКО, промывали в PBS и метили CFSE согласно ранее опубликованной методике (Miwa et al., 2002, Blood 99; 3707-3716). Аналогичным образом, донорские Эр также собирали у мышей дикого типа (C57BL/6J), промывали в PBS и метили DDAO-SE (Thermo Fisher Scientific) согласно инструкциям производителя. Смесь 1:1 WT и ТКО Эр, эквивалентных 200 мкл крови, вводили реципиентным мышам в хвостовую вену. Через 5 мин и 6, 24, 48, 72, 96, 120 ч после переливания Эр у реципиентных мышей забирали кровь и исследовали Эр для определения процента CFSE- или DDAO-SEмеченных (т.е. перелитых) Эр, оставшихся в кровотоке. Количество CFSE-меченных ТКО Эр у каждого реципиента нормализовали (в %) по DDAO-SE-меченным WT Эр в каждой временной точке.
Пример 13.
Артрит индуцировали у гомозиготных мышей с нокаутом фактора D человека путем пассивного переноса очищенных суммарных IgG от мышей K/BxN (2 мг/мышь, в/б в дни 0 и 2). Утолщение голеностопного сустава измеряли штангенциркулем (Mitutoyo), и клинические показатели регистрировали при использовании ранее опубликованных критериев (Kimura et al., 2010, JCI; 3545-3554). Мышам вводили 1 мг 11А8-1 в день-1, день 3, 7, 11 и 15.
Пример 14.
Активность 11-8А1 мАт, 1F10-5 и 166-32 in vivo оценивали у мышей с нокаутом фактора D человека. Для оценки эффективности мАт 166-32 (см. Tanox US8124090), 11-8А1 и 1F10-5 при блокировании активности альтернативного пути (АР) комплемента in vivo, фактор D-гуманизированных мышей лечили путем многократного введения доз (1 мг/мышь, раз в 3 дня, п/к введение). Образцы плазмы собирали до лечения мАт (время 0) и через 6 ч, 1, 3, 6 и 9 дней после лечения мАт и исследовали ЛПСиндуцированную активность АР комплемента. Активность АР комплемента в различные временные точки нормализовали по 100% значениям, полученным в момент времени 0. Данные показали, что мАт 118А1 и 1F10-5 обладали превосходной фармакодинамической активностью in vivo по сравнению с мАт 166-32 (фиг. 20). В частности, мАт 11-8А1 стабильно ингибировало активность АР комплемента на 8090% во все временные точки после введения мАт, тогда как мАт 166-32 достигало сопоставимого ингибирования только через 6 ч и в день 1 после введения мАт. мАт 1F10-5 показало 50% ингибирование АР комплемента в день 9, тогда как ингибирование активности АР комплемента мАт 166-32 в день 9 почти не наблюдалось (фиг. 20).
Активность in vivo химерного мАт 11-8А1 и химерного AFD оценивали у мышей с нокаутом фактора
- 36 044227
D человека. Для оценки эффективности 11-8А1/человеческого IgG4 химерного мАт и AFD/человеческого IgG4 химерного мАт при блокировании активности альтернативного пути (АР) комплемента in vivo, фактор D-гуманизированных мышей лечили путем многократного введения доз (1 мг/мышь, раз в 3 дня, п/к введение). Образцы плазмы собирали до введения мАт (время 0) и через 6 ч, 1, 3, 6, 9, 12 и 15 дней после введения мАт и исследовали на ЛПС-индуцированную активность АР комплемента. Активность АР комплемента в различные временные точки нормализовали по 100% значений, полученных в момент времени 0. AFD представляет собой гуманизированный вариант мАт 166-32 (см. Katschke et al., J Biol Chem. 2012 Apr 13; 287:12886-12892, WO/2008/055206, патент США 8372403, патент США 8273352, заявка на патент США 2014/0212433). Данные показали, что 11-8А1/человеческое IgG4 химерное мАт было намного более активным и показало лучший фармакодинамический профиль по сравнению с AFD/человеческое IgG4 химерное мАт (фиг. 21). В частности, тогда как оба мАт вызывали 90-100% ингибирование через 6 ч и в день 1 после введения мАт, 11-8А1/человеческое IgG4 химерное мАт, но не AFD/человеческое IgG4 химерное мАт, вызвало более чем 75% ингибирование активности АР комплемента в день 6-15 (фиг. 21).
Далее описаны материалы и методы, используемые в примере.
Очистка мАт 166-32.
Для получения очищенного мАт 166-32, мышиные клетки гибридомы (НВ124-76), которые секретируют моноклональное антитело 166-322, которое связывается с фактором D человека, получали из АТСС (см. Tanox, патент США 8124090) и культивировали. Среду культивирования клеток собирали для очистки мАт с помощью афинной хроматографии с белком G.
Получение 11-8А1/человеческого IqG4 химерного мАт.
Для клонирования кДНК мАт 11-8А1, суммарную РНК выделяли из клеток гибридомы при использовании реактива TRizol (Sigma). кДНК первой цепи синтезировали путем обратной транскрипции с использованием олиго (dT) праймера. Для амплификации кДНК тяжелой цепи (для IgG 1, IgG2a/b) в реакциях ПЦР использовали следующие праймеры:
5'-GAGGTGAAGCTGGTGGAG (Т/А) С (Т/А) GG-3' SEQ ID NO: 72 и 5'-GGGGCCAGTGGATAGAC-3' SEQ ID NO: 73.
Для амплификации каппа легкой цепи использовали следующие праймеры: смесь 4 прямых праймеров:
5'-CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGACTCCA-3' SEQ ID NO: 74;
5'-CCAGTTCCGAGCTCGTGCTCACCCAGTCTCCA-3' SEQ ID NO: 75; 5'-CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCA-3' SEQ ID NO: 76; 5'-CCAGTTCCGAGCTCGTGATGACACAGTCTCCA-3' SEQ ID NO: 77; обратный праймер: 5'-GTTGGTGCAGCATCAGC-3' SEQ ID NO: 78.
ПЦР ампликоны клонировали в вектор pCR TOPO ТА 2.1 (Invitrogen) и секвенировали. Для получения последовательности сигнального пептида (лидерной) мАт использовали метод 5'-RACE с набором (GeneRacer) производства Invitrogen. Полноразмерные кДНК вариабельных областей амплифицировали с использованием специфичных праймеров, определенных с помощью 5'-RACE и первоначальных данных секвенирования. кДНК, кодирующие вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи мАт 11-8А1, субклонировали в векторы pFUSE-CHIg-hG4 и pFUSE2-CLIg-hk (InVivoGen, San Diego, CA), соответственно. Для предотвращения обмена молекулами IgG4 мутацию S228P вводили в Fc домен 118А1/человеческого IgG4 химерного мАт. Рекомбинантное 11-8А1/человеческое IgG4 химерное антитело экспрессировали в системе экспрессии ExpiCHO (Thermo Fisher Scientific). Среду культивирования клеток собирали для очистки химерного мАт с помощью афинной хроматографии с белком G.
Получение гуманизированного Ат 166-32 (AFD) кДНК, кодирующие вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи AFD (см. Katschke et al., J Biol Chem. 2012 Apr 13; 287:12886-12892, WO/2008/055206, патент США 8372403, патент США 8273352, заявка на патент США 2014/0212433), синтезировали и клонировали в векторы pFUSE-CHIg-hG4 и pFUSE2-CLIg-hk (InVivoGen, San Diego, CA), соответственно. Для предотвращения обмена молекулами IgG4 мутацию S228P вводили в Fc домен AFD/человеческого IgG4 химерного мАт. Рекомбинантное AFD/человеческое IgG4 мАт экспрессировали в системе экспрессии ExpiCHO (Thermo Fisher Scientific). Среду культивирования клеток собирали для очистки химерного мАт с помощью афинной хроматографии с белком G.
Оценка фармакодинамики мАт у гомозиготных мышей с нокаутом фактора D человека
Эксперименты проводили с целью исследования и сравнения активности in vivo мышиных мАт 118А1, 1F10-5, 166-32 и 11-8А1/человеческого IgG4 химерного и AFD/человеческого IgG4 химерного мАт у гомозиготных мышей с нокаутом фактора D человека. Мышам (10-12 недель) вводили 1 мг/мышь (п/к в PBS) мАт раз в 3 дня. Обработанные антикоагулянтом лепирудином образцы плазмы (50-75 мкл) собирали до инъекции (время 0) и затем в различные временные точки после инъекции путем забора крови из ретроорбитального синуса и приготавливали плазму. Образцы плазмы замораживали при -80°С и хранили до исследования в анализе ЛПС-индуцированной активации АР комплемента на основе ИФА. Активацию комплемента АР оценивали путем измерения количества активированных фрагментов C3, осаждаемых на планшете (OD450), как описано ранее (см. Kimura et al., 2008, Blood 111:732-40).
-
Claims (11)
- Описание каждого патента, заявки на патент и публикации, процитированных в настоящем документе, полностью включено посредством отсылки.Хотя данное изобретение было раскрыто со ссылкой на конкретные варианты осуществления, очевидно, что другие варианты осуществления и вариации настоящего изобретения могут быть предложены другими специалистами в данной области без отступления от истинной сущности и объема изобретения. Предполагается, что прилагаемая формула изобретения включает все подобные варианты осуществления и эквивалентные варианты.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Антитело, которое специфично связывается с фактором D человека, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где VH содержитi) VH-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или ее вариант, который сохраняет основные биологические свойства и содержит консервативные замены, включающие до 3, 2 или 1 аминокислотных замен;ii) VH-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или ее вариант, который сохраняет основные биологические свойства и содержит консервативные замены, включающие до 3, 2 или 1 аминокислотных замен; и iii) VH-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 или ее вариант, который сохраняет основные биологические свойства и содержит консервативные замены, включающие до 3, 2 или 1 аминокислотных замен; и где VL содержитi) VL-CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 или ее вариант, который сохраняет основные биологические свойства и содержит консервативные замены, включающие до 3, 2 или 1 аминокислотных замен;ii) VL-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или ее вариант, который сохраняет основные биологические свойства и содержит консервативные замены, включающие до 3, 2 или 1 аминокислотных замен; и iii) VL-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 или ее вариант, который сохраняет основные биологические свойства и содержит консервативные замены, включающие до 3, 2 или 1 аминокислотных замен.
- 2. Антитело по п.1, которое содержит следующие CDR-области: VH-CDR1: SEQ ID NO: 3; VH-CDR2: SEQ ID NO: 4; VH-CDR3: SEQ ID NO: 5; VL-CDR1: SEQ ID NO: 8; VL-CDR2 : SEQ ID NO: 9; и VL-CDR3: SEQ ID NO: 10.
- 3. Антитело по п.1, которое содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, или ее вариант.
- 4. Антитело по п.1, которое содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, или ее вариант.
- 5. Антитело по п.1, которое содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, или ее вариант, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, или ее вариант.
- 6. Антитело по п.1, которое связывается с эпитопом, содержащим аминокислотную последовательность фактора D, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24, или ее варианта.
- 7. Антитело по любому из пп.1-6, где антитело связывается с эпитопом фактора D человека с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24.
- 8. Клетка, продуцирующая по меньшей мере одно антитело, которое специфично связывается с фактором D человека, содержащая антитело по меньшей мере по одному из пп.1-7.
- 9. Клетка, продуцирующая по меньшей мере одно антитело, которое специфично связывается с фактором D человека, содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело по меньшей мере по одному из пп.1-7.
- 10. Способ лечения опосредованного альтернативным путем (АР) системы комплемента заболевания или нарушения у пациента, включающий стадию введения указанному пациенту антитела против фактора D по любому из пп. 1-7.
- 11. Способ по п.10, где заболевание или нарушение, по меньшей мере, выбрано из группы, состоящей из макулодистрофии (МД), возрастной макулодистрофии (ВМД), ишемического и реперфузионного повреждения, артрита, ревматоидного артрита, астмы, аллергической астмы, синдрома пароксизмальной ночной гемоглобинурии (ПНГ), атипичного гемолитико-уремического синдрома (аГУС), буллезного эпидермолиза, сепсиса, трансплантации органа, воспаления (в том числе, без ограничения перечислен-
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US62/457,477 | 2017-02-10 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA044227B1 true EA044227B1 (ru) | 2023-08-01 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7364221B2 (ja) | 抗c5抗体およびその使用 | |
US20230032737A1 (en) | Anti-factor d antibodies and uses thereof | |
US20170334980A1 (en) | Anti-properdin antibodies and uses thereof | |
JP7251792B2 (ja) | 抗C5a抗体とその使用 | |
US20220204602A1 (en) | Bi-functional humanized anti-c5 antibodies and factor h fusion proteins and uses thereof | |
KR20210055742A (ko) | 인간화된 항-c5 항체 및 이의 용도 | |
RU2799044C2 (ru) | Антитела против фактора d и их применения | |
EA044227B1 (ru) | Антитела против фактора d и их применения | |
RU2773779C2 (ru) | АНТИ-C5a-АНТИТЕЛА И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | |
EA043843B1 (ru) | Анти-c5a-антитела и их применения |