BR112014004297B1 - Uso de um inibidor de antitrombina iii no tratamento ou prevenção de sangramento - Google Patents

Abstract

compostos para uso em reforço de coagulação. a presente invenção se refere a inibidores de antitrombina iii e ao uso médico desses em tratamento ou prevenção de sangramento. os inibidores são de preferência usados em indivíduos sofrendo de um distúrbio de sangramento adquirido ou genético, tal como hemofilia, ou em indivíduos possuindo uma condição clínica caracterizada por sangramento excessivo, tal como cirurgia, trauma e sangramento interno. o inibidor de antitrombina iii pode ser, por exemplo, um peptídeo, um aptâmero ou um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga especificamente a, e inibe, antitrombina iii.

Description

Campo da Invenção

[1] A invenção se refere ao campo da medicina, em particular a invenção se refere a fatores sanguíneos da coagulação, inibidores desses e seu uso para hemostasia. Mais especificamente, é revelado um método para reforço da atividade da trombina para estimular a coagulação sanguínea. A invenção pode ser usada para tratar ou prevenir sangramento excessivo, por exemplo devido a um distúrbio de sangramento tal como hemofilia, ou devido a cirurgia, trauma, ou ao uso de fármacos anticoagulantes, ou para parar uma hemorragia interna.

Antecedentes da Invenção

[2] A coagulação do sangue, coagulação, é um processo delicado que deve ser ligado imediatamente no caso de lesão vascular e desligado quando a vasculatura está intacta. A patologia resulta quando esse processo é regulado de forma incorreta: um distúrbio de sangramento ou sangramento extensivo resulta quando a coagulação é iniciada muito tarde ou de forma muito fraca, uma doença trombótica resulta quando a coagulação é iniciada muito cedo ou de forma muito forte. Esta invenção revela um novo método para estimular a coagulação e pode assim ser aplicada em doenças ou condições clínicas caracterizadas por sangramento (excessivo). Essas condições incluem hemofilia A ou B, sangramento devido a cirurgia ou trauma, bem como hemorragia interna, tal como acidente vascular cerebral hemorrágico e sangramento gastrointestinal, ou sangramento devido à utilização de fármacos anticoagulantes tais como a varfarina ou heparina.

[3] A coagulação do sangue compreende uma resposta humoral e celular. A primeira leva à conversão do fibrinogênio solúvel em fibrina insolúvel, a última à formação de um tampão de plaquetas. Ambas as respostas estão interligadas. Por exemplo, a enzima trombina, que se forma durante a resposta humoral, é um potente ativador de plaquetas, enquanto as membranas de plaquetas ativadas servem para montar complexos de fatores de coagulação, que são fundamentais para um processo de coagulação eficiente. Os tampões de plaquetas ativadas, as fibras de fibrina e os glóbulos vermelhos e brancos incluídos constituem juntos um coágulo de sangue. A presente patente trata de um novo método para reforçar a resposta humoral da coagulação do sangue. A resposta de coagulação humoral será portanto discutida primeiro.

[4] A resposta de coagulação humoral é mediada através de uma série de proteínas, os fatores de coagulação, que circulam como cofatores inativos e pró- enzimas. Em conjunto, esses fatores constituem o sistema de coagulação. A ativação da coagulação compreende um processo consistindo numa ativação seqüencial de pró-enzimas inativas e cofatores de um modo semelhante a uma cascata. A cada passo, uma protease de coagulação recém-formada catalisará a ativação do próximo fator. A ativação é iniciada após o contato do sangue com o fator tecidular de proteína de membrana (TF), que não é normalmente expresso por células endoteliais, mas existe em abundância em células subendoteliais, tais como células de músculo liso. Assim, a ruptura da camada de células endoteliais exporá o sangue a esse TF expresso constitutivamente o que desencadeia a coagulação. Durante a ativação do sistema de coagulação se formam vários complexos enzima-cofator, que se montam nas membranas das células, especialmente células endoteliais e plaquetas ativadas. Entre esses complexos enzima-cofator está o de TF e o fator VII ativado (TF- FVIIa), em que FVIIa tem atividade proteolítica que pode ativar os fatores X e IX (FX e FIX). O FX ativado (FXa) se monta com o fator V ativado (Fva) para formar o complexo de protrombinase, o qual por sua vez ativa a protrombina na protease ativa trombina. TF-FVIIa pode também converter o fator IX em FIXa que se monta com o fator VIII ativado (FIIIa) para gerar o complexo FVIIIa-FXIa. A protease ativa nesse complexo é FIXa, que, tal como FVIIa, pode ativar FX.

[5] Em contato com estímulos apropriados, p. ex. TF, a ativação do sistema de coagulação é iniciada através do complexo TF-FVIIa e propagada através da ação do complexo FVIIIa-FIXa e amplificada através da ativação de FXI (ver Figura 1).

[6] Em condições fisiológicas, a maioria das respostas hemostáticas necessita dessa amplificação dependente de FIX e FVIII para assegurar uma ativação suficiente de FX (e assim a geração de trombina). Essa necessidade de FVIII e IX é mostrada de forma dramática através das manifestações clínicas de deficiências genéticas dessas proteínas: hemofilia A ou B, que são distúrbios de sangramento graves e resultam de uma deficiência de FVIII ou FIX, respectivamente.

[7] A hemofilia é um distúrbio de sangramento congênito ligado ao X, geralmente resultante de uma deficiência de FVIII (Hemofilia A) ou FIX (Hemofilia B) de coagulação (Mannucci et al., N. Engl. J. Med. 2001; 344: 1773-1779). A freqüência da doença é de cerca de um em 10000 nascimentos do sexo masculino. A prevalência da hemofilia A é cerca de 5-6 vezes maior do que a da hemofilia B, que é também uma deficiência genética ligada ao X. Clinicamente, a hemofilia é classificada em hemofilia ligeira, moderada e grave, dependo da gravidade das manifestações de sangramento. As pessoas com hemofilia grave têm muitas vezes uma história de fáceis contusões no início da infância, sangramento espontâneo (particularmente nas articulações e tecidos moles) e sangramento excessivo após trauma ou cirurgia. Os pacientes com hemofilia ligeira dificilmente sofrem de episódios de sangramento espontâneo, e têm principalmente trauma excessivo ou sangramento induzido por cirurgia. Testes de coagulação adequados confirmarão o diagnóstico e revelarão se o paciente sofre de hemofilia A ou B. A hemofilia A grave se caracteriza por níveis de FVIII funcional muito baixos ou ausentes (<1% do normal), enquanto que no caso de hemofilia ligeira os níveis de FVIII funcional são 5-15% do normal. A terapia a pedido e profilática de pacientes de hemofilia consiste tipicamente em terapia de substituição, que se baseia na complementação de sistema de coagulação deficiente do paciente com o fator de coagulação em falta. Assim, os pacientes com hemofilia A e B são infundidos com concentrados de FVIII e FIX, respetivamente, para tratar ou prevenir episódios hemorrágicos. Os pacientes hemofílicos tratados com preparações do fator deficiente estão, no entanto, em risco de desenvolver anticorpos neutralizantes (inibidores) do fator em falta. O fator de coagulação em falta não é endógeno para esses pacientes e consequentemente seu sistema imunológico não se tornou tolerante a ele. A formação de anticorpos neutralizantes ocorre em 15-30% dos pacientes de hemofilia A grave (Goudemond et al., Blood 2006; 107: 46-51; Gouw et al.,Blood 2007; 109: 4693-4697) e 1-3% dos pacientes de hemofilia B. Particularmente, os pacientes com defeitos genéticos graves que levam a níveis plasmáticos de FVIII <1% do normal, tais como deleção ou inversão do gene, mutações sem sentido (nonsense) e de mudança de enquadramento (frameshift), podem desenvolver inibidores uma vez que seu sistema imunológico não se tornou tolerante a FVIII. Quando os níveis de inibidores em circulação são altos, os pacientes necessitam de quantidades muito elevadas do fator deficiente para superar os efeitos neutralizantes dos inibidores. Tal terapia de dose elevada de FVIII é muito cara. Como alternativa, foi desenvolvida a terapia de bypass de FVIII. O princípio subjacente a esses tratamentos é que o defeito no complexo FVIII/FIX é contornado pelo uso de formas ativadas de FVII, IX e X. Exemplos de tais terapias de bypass de FVIII são concentrados de complexo de protrombina ativada e FVIIa recombinante (J. Astermark. et al., Blood 2007; 109: 546551; HR Roberts et al., Blood 2004; 104: 3858-3864; WK Hoots, Blood 2007; 109: 395-396). Uma desvantagem dessas terapias de bypass de FVIII é que elas são adequadas apenas para terapia a pedido.

[8] A única terapia de bypass de FVIII recombinante licenciada é FVIIa recombinante (rFVIIa; NovoSeven®, NovoNordisk, Copenhaga, Dinamarca). rFVIIa estimula a hemostasia através de ligação, diretamente ou em complexo com o fator tecidular, a fosfolípidos carregados negativamente expostos na superfície de plaquetas ativadas, dirigindo assim a ativação de FX para o local da lesão. Alternativamente, o seu efeito pode ser devido a um aumento na razão de FVIIa para FVII. rFVIIa pára o sangramento em 70-75% dos pacientes com inibidores. Uma limitação da terapia de bypass de FVIII com rFVIIa ou complexo de protrombina ativada é que é cara e não é aplicável como terapia profiláctica devido à sua curta semivida de 2-3 horas. No entanto, o tratamento profilático da hemofilia previne a artropatia hemofílica e melhora a qualidade de vida (Manco-Johnson et al., N. Engl. J. Med. 2007; 357: 535-44). Assim, existe uma necessidade médica não satisfeita de terapia de bypass de FVIII profilática de hemofílicos com inibidores de FVIII. É um objeto da presente invenção proporcionar uma tal terapia.

[9] Várias outras condições clínicas são acompanhadas de sangramento excessivo ou indesejado, tais como sangramento induzido por cirurgia, sangramento devido a acidentes de guerra ou trânsito, hemorragias internas tais como acidente vascular cerebral hemorrágico e sangramento gastrointestinal, e sangramento associado ao uso de anticoagulantes tais como varfarina. Essas condições podem ser tratadas com agentes hemostáticos que são aplicados localmente tais como selantes de fibrina, ou com rFVIIa administrado sistemicamente. O tratamento dessas condições com rFVIIa, no entanto, tem um risco de desencadear processos tromboembólicos conduzindo a graves efeitos colaterais (O'Connel et al., JAMA 2006; 295: 293-298; Levi et al., N. Engl. J. Med. 2010; 363: 1791-1800). Esse risco tromboembólico tem possivelmente a ver com esse rFVIIa ser uma protease de coagulação ativa. A infusão de rFVIIa na circulação resulta assim na presença de uma protease de coagulação ativa em toda a circulação. Além disso, é difícil titular rFVIIa devido à falta de um ensaio simples para monitorar seus efeitos farmacodinâmicos.

[10] É um objeto da presente invenção proporcionar novos compostos e métodos para o tratamento e a prevenção de sangramento excessivo devido a cirurgia, acidentes e outras condições. Em contraste com a terapia com rFVIIa, os novos compostos e métodos da invenção podem ser utilizados como terapia profilática, bem como em terapia a pedido, e a sua dosagem terapeuticamente necessária pode ser titulada e monitorada com um ensaio de cabeceira simples e conveniente.

Resumo da Invenção

[11] A invenção proporciona um método para tratamento e prevenção de sangramento excessivo, compreendendo a administração de um inibidor da antitrombina III (AT) para diminuir os níveis de AT funcional a um paciente de sangramento ou um paciente com risco de sangramento. Esse método é surpreendente e novo uma vez que nunca tinham sido descritos inibidores de AT como um método terapêutico para tratar ou prevenir sangramentos em pacientes. A invenção pode ser aplicada em hemofilia, cirurgia, trauma ou outras condições em que ocorra sangramento excessivo tais como a utilização de anticoagulantes, e também no caso de hemorragia interna tal como acidente vascular cerebral hemorrágico ou sangramento gastrointestinal, tal como sangramento esofágico devido a varizes. O método descrito pela presente invenção pode também ser utilizado para prevenir sangramento em pacientes com risco de sangramento, por exemplo em pacientes de hemofilia para prevenir sangramento nas articulações, no músculo e/ou tecidos moles num paciente hemofílico. O sangramento pode ser prevenido num tal paciente através de tratamento com um inibidor de AT.

[12] Em certas formas de realização, o inibidor de AT é uma molécula que se liga a AT e inibe a função da AT ou aumenta a eliminação da AT em humanos ou num animal. Em outras formas de realização da invenção, essa molécula de ligação é um peptídeo, uma proteína ou um anticorpo ou um fragmento de anticorpo. Também outras moléculas tais como compostos químicos que se ligam a AT e inibem a sua função, estão no escopo da presente invenção.

[13] Em certas formas de realização da invenção, o inibidor de AT é um anticorpo monoclonal, humano, humanizado ou de uma espécie animal, ou seus fragmentos, que se liga a AT e inibe a atividade de AT.

[14] Em outras formas de realização da invenção, o inibidor de AT é um anticorpo monoclonal, humano, humanizado ou de uma espécie animal, ou seus fragmentos, que se liga a AT e diminui os níveis de AT em humanos ou em um animal.

[15] Em outras formas de realização da invenção, os inibidores de AT são anticorpos policlonais ou seus fragmentos, que inibem a atividade da AT.

[16] Em outras formas de realização da invenção, os inibidores de AT são anticorpos policlonais, humanos, humanizados ou de uma espécie animal, ou seus fragmentos, que se ligam a AT e diminuem os níveis de AT em humanos ou em um animal.

[17] Em outras formas de realização da invenção, o inibidor de AT é uma molécula não anticorpo tal como um aptâmero, proteína, peptídeo ou composto químico que se liga a AT e inibe a atividade de AT.

[18] Em outras formas de realização da invenção, o inibidor de AT é uma molécula não anticorpo tal como um aptâmero, proteína, peptídeo ou composto químico que se liga a AT e diminui os níveis de AT em humanos ou em um animal.

[19] Em algumas formas de realização da invenção, o inibidor de AT se liga e bloqueia locais em AT envolvidos na interação de AT com suas proteases alvo. Em outras formas de realização da invenção, o inibidor de AT se liga a locais do AT prevenindo assim o aumento de atividade funcional de AT através de heparina ou outros glicosaminoglicanos.

[20] Em uma forma de realização preferida da presente invenção, o inibidor de AT previne a inserção da volta do local reativo de AT na folha β central de AT, que causa inativação proteolítica de AT através das suas proteases alvo.

[21] Em outra forma de realização da invenção, o inibidor de AT é administrado para tratar ou prevenir sangramento em um paciente de hemofilia com deficiência de FVIII que pode ou não ter anticorpos neutralizantes contra FVIII. Em outras formas de realização, o paciente de hemofilia é deficiente em atividade de FIX e pode ter ou não anticorpos neutralizantes contra FIX.

[22] Em outra forma de realização da invenção, o inibidor de AT é administrado para tratar ou prevenir sangramento em um paciente de hemofilia com deficiência de FXI. Em outras formas de realização, o inibidor de AT é dado para tratar ou prevenir sangramento em um paciente com uma deficiência de um fator de coagulação além dessa de FVIII, FIX ou FXI.

[23] A invenção proporciona também um método para redução ou prevenção da possibilidade de geração de inibidores para FVIII em um paciente de hemofilia A, compreendendo a administração de um inibidor de AT, diminuindo assim a necessidade de FVIII. A invenção proporciona ainda um método para redução ou prevenção da possibilidade de geração de inibidores para FIX em um paciente de hemofilia B, compreendendo a administração de um inibidor de AT ao paciente.

[24] A invenção proporciona também um método de tratamento ou prevenção de sangramento em não hemofílicos compreendendo a administração de um inibidor de AT ao paciente que sofre de sangramento (excessivo). Assim, em uma forma de realização, a invenção se refere a um inibidor de AT para uso na prevenção ou no tratamento de uma condição clínica caracterizada por sangramento excessivo, tal como p. ex. cirurgia, trauma e hemorragia interna.

[25] De acordo com as formas de realização da invenção descritas acima, uma quantidade hemostática de inibidor de AT é administrada ao referido paciente. A referida quantidade é de preferência uma quantidade hemostática eficaz.

[26] Em certas formas de realização, a dosagem de inibidor de AT a administrar a um paciente de hemofilia é calculada a partir de um ensaio in vitro que é utilizado para estabelecer a concentração do referido inibidor de AT que pode compensar o fator de coagulação que é deficiente no referido plasma, compreendendo: a) adição ao plasma de um paciente de hemofilia de uma diluição de fator tecidular e Ca2+ a concentrações às quais o tempo de coagulação seria dependente da adição do fator de coagulação (p. ex., FVIII ou FIX), que é deficiente no referido plasma; b) medição da geração de fibrina ou geração de trombina em plasma hemofílico na ausência do referido fator de coagulação; c) medição da geração de fibrina ou geração de trombina em plasma hemofílico na presença do fator de coagulação deficiente adicionado para alcançar concentrações de 0,01 a 1 U/ml, em que 1 U/ml é a quantidade de fator presente em plasma humano normal reunido; e d) medição da geração de fibrina ou geração de trombina (bem como dos níveis de AT) em plasma hemofílico na ausência do referido fator de coagulação mas na presença de várias concentrações de inibidor de AT. O nível desejado de AT funcional a alcançar através de administração de inibidor de AT pode ser estimado através de comparação da geração de trombina e formação de fibrina a diferentes níveis de inibidor de AT com aqueles observados a diferentes níveis do fator deficiente.

[27] Em outra forma de realização, a dosagem de inibidor de AT a administrar a um paciente de hemofilia com inibidores é calculada a partir de um ensaio in vitro que é utilizado para estabelecer a concentração do referido inibidor de AT que pode compensar o fator de coagulação que é deficiente no referido plasma, compreendendo: a) adição ao plasma de um paciente de hemofilia com inibidores de FVIII ou IX de uma diluição de fator tecidular e Ca2+ a concentrações às quais o tempo de coagulação seria dependente da adição do fator de coagulação (p. ex. FVIII ou FIX) em plasma hemofílico com inibidores; b) medição da geração de fibrina ou geração de trombina no plasma hemofílico com inibidores; e c) medição da geração de fibrina ou geração de trombina em plasma normal reunido. A dose de inibidor de AT que normaliza a geração de trombina e a formação de fibrina pode ser selecionada como o nível alvo para administração in vivo. A dose de inibidor de AT a utilizar in vivo é então monitorada através da administração de inibidor de AT ao paciente enquanto se mede o nível de AT funcional na circulação.

[28] Em outra forma de realização, a invenção proporciona um método para estimativa da capacidade do inibidor de AT de estimular a formação de fibrina e a geração e a atividade de trombina em plasma de um sangramento de um paciente não hemofílico devido a cirurgia, trauma, utilização de anticoagulantes ou devido a outra razão, compreendendo: a) proporcionar plasma desse paciente com uma diluição de fator tecidular; b) medir a geração de fibrina ou geração de trombina nesse plasma; c) medir a geração de fibrina ou geração de trombina na presença de uma dose de inibidor de AT que cause uma queda da atividade de AT entre 0 e 1 U/ml (0 e 100% do normal, respetivamente); e d) medir a geração de fibrina ou geração de trombina no referido plasma na ausência ou presença de inibidor de AT, para estabelecer a capacidade do inibidor de AT para aumentar a formação de fibrina ou a geração de trombina no referido plasma.

[29] Em outra forma de realização, a dose de inibidor de AT a utilizar in vivo é monitorada através da administração de inibidor de AT ao paciente enquanto se mede o nível de AT funcional na circulação.

[30] Em um aspecto, a invenção proporciona um método para tratamento de um paciente de sangramento ou um paciente em risco de sangramento, compreendendo a administração ao paciente de um inibidor de AT para obter uma concentração plasmática de AT funcional abaixo de 80% do normal, de preferência entre 20 e 80%, de preferência entre 20 e 60% do normal, de maior preferência entre 40 e 60% do normal, ainda de preferência de cerca de 50% do normal. Assim, de preferência, o inibidor é administrado numa quantidade que diminui a atividade de AT funcional até pelo menos 90, 80, 50, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,2, 0,1% do nível normal de AT, em que AT normal é de preferência entendido aqui como o nível em plasma reunido de voluntários saudáveis.

[31] Em certas formas de realização, a invenção proporciona um método para tratamento de um paciente não hemofílico com um episódio de sangramento através da administração ao paciente de um inibidor de AT para obter uma concentração plasmática de AT funcional abaixo de 80% do normal, de preferência entre 20 e 80%, de maior preferência entre 20 e 60% do normal, ainda de preferência entre 40 e 60% do normal, ainda de maior preferência de cerca de 50% do normal. Em certas formas de realização, a dose de inibidor de AT administrada é monitorada utilizando um ensaio para níveis plasmáticos de AT funcional.

[32] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para tratamento de um paciente possuindo uma deficiência de FVIII onde um nível hemostático subótimo de FVIII é administrado ao paciente em combinação com inibidor de AT, para obter uma quantidade hemostática eficaz da mistura. Em certas formas de realização, FVIII, em combinação com inibidor de AT, é administrado a um nível suficientemente baixo para não provocar uma resposta imunológica no paciente a FVIII.

Descrição Detalhada da Invenção

[33] A ativação ibrin li de coagulação in vivo é regulada através de vários inibidores. Um inibidor principal é antitrombina III (AT), que pertence à família de proteínas inibidoras de serina-proteinase ou serpinas. Até agora ninguém demonstrou ou sugeriu que a inibição de AT constituísse uma abordagem terapêutica para reforçar a coagulação. A presente invenção revela a inesperada descoberta de que a inibição de AT constitui uma opção terapêutica para pacientes com ibrin lia ou outros distúrbios de sangramento. Através da administração de um inibidor de AT, p. ex. Um anticorpo inibidor, a um paciente sofrendo ou em risco de sangramento, os níveis de AT são diminuídos permitindo que mais trombina seja gerada e prolongando a atividade da trombina, o que leva à geração de mais ibrin e formação mais eficiente de coágulos sanguíneos.

Justificativa da invenção

[34] A AT inibe várias proteinases de coagulação particularmente trombina e FXa, e também FVIIa, FIXa e FXIa. Estimou-se que cerca de 80% da quantidade de trombina gerada in vivo é neutralizada por AT. Níveis diminuídos de AT funcional, por exemplo, devido a uma deficiência genética heterozigótica, resultam em menos inibição de trombina, FXa, FIXa, FXIa e FVIIa, e, portanto, em mais geração de fibrina. Notavelmente, a níveis decrescentes de AT não só a semivida da atividade de trombina é prolongada como também mais moléculas de trombina são geradas uma vez que a semivida de FXa, a protease de coagulação que gera trombina a partir de protrombina, é também prolongada. A atividade de FXA prolongada aumenta o número de moléculas de protrombina convertidas em trombina por molécula de FXa. Assim, os efeitos pró-coagulantes de abaixamento de níveis de AT são devidos a uma semivida mais longa da trombina, bem como a um aumento da quantidade de trombina gerada. Isso está em contraste com todas as outras formas de contorno de FVIII, tal como terapia com rFVIIa, que apenas aumenta a geração de trombina mas não tem efeito na semivida da trombina. A inibição de AT em pacientes com ou em risco de sangramento constitui um novo princípio terapêutico que nunca tinha sido descrito na literatura.

[35] O defeito principal na hemofilia é a ausência de amplificação de geração de trombina através da volta FVIII/FIX (ver Figura 1). No entanto, alguma geração de trombina ocorre na ausência da volta FVIII/FIX uma vez que a via de ativação direta de FX pelo complexo FVIIa/TF está intacta. No plasma, a trombina é inibida em 60-90% pela AT. Além disso, também as atividades de FXa e FIXa são inibidas pela AT. Uma forma de realização da presente invenção é a administração de uma dose terapeuticamente eficaz de um inibidor de AT para reduzir a inibição de FXa e trombina pela AT. Como consequência, a semivida de ambas as proteases é prolongada, resultando em um maior número de moléculas de protrombina convertidas em trombina por molécula de FXa, e um maior número de moléculas de fibrinogênio convertidas em fibrina por molécula de trombina. Assim, através da diminuição dos níveis de AT funcional, é gerada mais trombina e a semivida da atividade de trombina é prolongada. Isso compensa a diminuição da geração de trombina que ocorre em hemofilia, como consequência de uma função deficiente da volta FVIII/FIX. Notavelmente, esse efeito duplo de inibição da AT, que é o aumento do número de moléculas de trombina geradas, bem como o prolongamento da atividade da trombina, é único para o conceito de inibição da AT e não é compartilhado com qualquer um dos outros procedimentos de contorno de FVIII. Isso torna a inibição de AT, em princípio, a abordagem de contorno de FVIII mais potente.

[36] A inibição da AT em si não é um gatilho para a ativação da coagulação, uma vez que a ativação requer proteases ativas. A interação de TF com FVII(a) e a subsequente ativação de FIX e FX gera proteases ativas no local de expressão de TF (ver Figura 1). Assim, apesar de devido ao nível mais baixo de AT funcional a coagulação ocorrer mais facilmente na presença de inibidores de AT, essa formação de coágulos será principalmente, se não exclusivamente, limitada aos locais do corpo em que TF é exposto ao sangue, por exemplo em paredes de vasos lesionadas. Isso está em contraste com o tratamento com FVIIa recombinante, que é administrado como uma protease ativa e se tornará disponível em todo o sistema circulatório.

Aspectos da invenção

[37] Assim, em um primeiro aspeto a invenção se refere a um inibidor de AT para uso como medicamento. O inibidor é de preferência um inibidor de AT tal como aqui definido abaixo.

[38] Num segundo aspecto, a invenção se refere a um inibidor de AT para uso no tratamento e na prevenção de sangramento em um indivíduo sofrendo de um distúrbio de sangramento adquirido ou genético (hipocoagulabilidade) ou em um indivíduo com uma condição clínica caracterizada por sangramento excessivo. Alternativamente, nesse aspecto, a invenção se refere à utilização de um inibidor de AT para a manufatura de um medicamento para o tratamento e a prevenção de sangramento em um indivíduo sofrendo de um distúrbio de sangramento adquirido ou genético (hipocoagulabilidade) ou em um indivíduo possuindo uma condição clínica caracterizada por sangramento excessivo. Nesse aspecto, o inibidor de AT é de preferência um inibidor tal como aqui definido abaixo. De igual modo, o tratamento e a prevenção de sangramento em um indivíduo sofrendo de um distúrbio de sangramento adquirido ou genético (hipocoagulabilidade) ou em um indivíduo com uma condição clínica caracterizada por sangramento excessivo são de preferência tal como aqui definidos abaixo.

[39] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para tratamento ou redução do risco de sangramento em um indivíduo sofrendo de um distúrbio de sangramento adquirido ou genético (hipocoagulabilidade) ou em um indivíduo possuindo uma condição clínica caracterizada por sangramento excessivo, o método compreendendo a etapa de administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um inibidor de AT. O inibidor de AT é de preferência um inibidor tal como aqui definido abaixo. De igual modo, o distúrbio de sangramento adquirido ou genético (hipocoagulabilidade) e a condição clínica caracterizada por sangramento excessivo são de preferência tal como aqui descrito abaixo.

[40] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para identificação de um composto como inibidor de AT tal como aqui definido abaixo.

Inibidores de antitrombina III (AT)

[41] A antitrombina III (AT) é uma glicoproteína de 58 kDa pertencendo à família de proteínas das serpinas (inibidores de serina-proteases). A proteína madura consiste em 432 aminoácidos, e tem 4 locais de glicosilação. A AT é produzida no fígado, em células parenquimais. A sua concentração plasmática é de cerca de 0,1-0,15 mg/ml ou 3,5 μM. A AT desaparece da circulação com uma semivida aparente de 2-3 dias. Os níveis antigênicos e de atividade são expressos como uma percentagem do nível normal ou como U/ml, sendo 1 U a quantidade em plasma humano reunido. A AT é expressa tanto como uma forma α como uma forma β. α-AT representa 90% da AT e é glicosilada em todas as quatro posições. Embora compreendendo apenas 10% da AT, a β-AT tem uma maior afinidade para a heparina, não é glicosilada numa posição (N135), e exerce um maior efeito anticoagulante global do que a α-AT.

[42] AT é o inibidor fisiológico mais importante da via de coagulação. Como o próprio nome indica, a AT inibe a trombina. Além disso, a AT é capaz de inibir todos os outros fatores de coagulação proteolíticos (p. ex., FIXa, FXa e FXIa). Sua principal atividade anticoagulante é, no entanto, devida à regulação de FXa, FIXa e trombina. Estima-se que a AT proporcione 50-80% ou até 80% do efeito inibidor contra a trombina in vivo.

[43] A ação da AT é potenciada por glicosaminoglicanos tais como heparina e sulfato de heparano, que podem aumentar a atividade funcional da AT em 2-3 logs. A heparina consiste em uma estrutura protéica possuindo vários dissacarídeos sulfatados. As preparações brutas contêm moléculas de heparina com um peso molecular variando de 3 a 40 kDa. Uma sequência de pentassacarídeo única em heparina é responsável pela elevada afinidade de ligação a AT. In vivo, o sulfato de heparano no endotélio e a heparina liberada a partir de grânulos de mastócitos associados ao endotélio são provavelmente as fontes principais de cofatores de AT.

[44] A heparina usa dois mecanismos distintos para acelerar a inibição das proteases através da AT. Um mecanismo é que torna a volta do local reativo (RSL; na Figura 2 essa volta é chamada volta do centro reativo (RCL), ver Figura 2) mais acessível para direcionar proteases, mecanismo esse que contribui para a maior atividade inibidora para FIXa e FXa. Outro mecanismo é que a heparina proporciona um molde para AT e suas proteases alvo, particularmente trombina. Para além da sua atividade anticoagulante, se tem mostrado que a AT tem também funções antiinflamatórias e antiangiogênicas. Essas não serão aqui discutidas.

[45] Foi mostrada a importância fisiológica da AT em camundongos knockout com total deficiência de AT. Esses camundongos morrem in utero de trombose e hemorragia (Ishiguro et al., J. Clin. Invest. 2000; 106: 873-878). Também em humanos a total deficiência de AT tem presumivelmente efeitos letais uma vez que uma total deficiência de AT não tem sido documentada em humanos enquanto a deficiência heterozigótica ocorre em 1 a 20005000 pessoas. Pessoas heterozigóticas deficientes em AT têm um risco aumentado de doenças tromboembólicas (PS McLean et al., Drugs 2007; 67: 1429-1440).

[46] Os efeitos da inibição de proteases de coagulação por AT foram investigados em um sistema com proteínas purificadas à concentração de plasma normal (van't Veer et al., J. Biol. Chem. 1997, 272: 4367-4377). A presença de AT a níveis normais não afetou a fase de iniciação da geração de trombina quando a reação foi iniciada com FVIIa/TF, nem afetou a ativação de FV. A taxa de formação de trombina na presença de AT foi reduzida a 30% da reação não inibida e a quantidade de trombina formada foi rapidamente extinta após a sua geração. A presente invenção revela que o abaixamento dos níveis de AT pode ser usado como um princípio terapêutico em pacientes com sangramento grave ou em risco de sangramento grave.

[47] A AT pertence à superfamília de proteínas serpinas (inibidores de serina-proteases) que são amplamente encontradas na natureza ocorrendo p. ex. em animais, plantas, bactérias e vírus (ver para revisão: Rubi HP Law et al., Genome Biology 2006; 7: 216.1-216.11). A maioria das serpinas tem nomes bem conhecidos que se referem principalmente à função que levou à sua descoberta. Embora para algumas serpinas como AT o nome tradicional cubra mais ou menos suas principais funções biológicas, para algumas outras serpinas seu nome tradicional é enganoso a esse respeito. Por exemplo, a α1-antitripsina e a α1-antiquimotripsina foram descobertas devido à sua potência para inibir as enzimas digestivas tripsina e quimotripsina, respectivamente, mas sua principal função in vivo é inibir as proteases neutrofílicas elastase e protease 3 e catepsina G, respectivamente. As serpinas são classificadas em 16 clados (A-P). O nome sistemático de cada serpina é SERPINXy, onde X é o clado e y é o número dentro do clado. De acordo com essa classificação, a AT é serpinaC1. Os humanos têm genes codificando para 36 serpinas. A maioria das serpinas serve como inibidor de proteases, embora algumas tenham adotado diferentes funções.

[48] A estrutura básica das serpinas é composta por cerca de 400 aminoácidos, alguns têm grandes voltas de inserção N-terminais, C-terminais ou internas. A maioria das serpinas têm modificações pós-tradução tais como glicosilação, sulfatação, fosforilação e oxidação para alterar sua função. As serpinas partilham uma estrutura 3D altamente conservada composta por um feixe de 9 hélices α (A-I) e uma sanduíche β composta por três folhas β (A-C) (ver Figura 2). Outra característica típica das serpinas é a volta do local reativo (RSL), que se projeta a partir do corpo da proteína e é apresentada às proteases como um tipo de isca. A RSL é tipicamente composta por 20 aminoácidos indo de P17 no terminal N a P3' na extremidade C-terminal (de acordo com esta nomenclatura P1-P1' constitui a ligação clivável, a qual pode ser clivada por proteases). No estado nativo normal de uma serpina, a folha β A, ou a folha β central, é composta por cinco cadeias e a RSL (fazendo a ponte entre o terminal C da cadeia 5A e o terminal N da cadeia 1C) está exposta. Surpreendentemente, a estabilidade termodinâmica dessa conformação não é ótima, a incorporação da RSL na folha β central produz uma conformação mais estável. Essa conformação estável é conseguida por clivagem proteolítica da RSL por uma protease (não alvo), caso em que a protease é liberada da serpina antes da inserção da RSL na folha β central estar concluída, ou durante a formação do complexo com uma protease alvo, caso em que a protease está ainda ligada covalentemente ao resíduo de aminoácido na posição P1, quando a inserção é completada. Como consequência dessa inserção, o sítio ativo da serina é ligeiramente puxado para fora da sua posição no sítio ativo da protease impedindo assim que a protease possa ser liberada a partir do resíduo de P1. Nesse último caso, os complexos ligados de forma covalente entre uma serpina conformacionalmente alterada e sua protease alvo são deixados.

[49] A interação de uma serpina com uma protease alvo é estequiométrica. A reação pode ser descrita como:

P = protease; S = serpina; S* = serpina com conformação estável alterada

[50] Após reconhecimento da sequência da RSL (RCL na Figura 3) como substrato pela protease, um complexo reversível (também conhecido como complexo de Michaelis) é formado, no qual a conformação da serpina ainda é nativa (S). Na próxima fase, a protease começa a clivar a ligação peptidil entre os resíduos de aminoácidos na posição P1 e P1' (no caso de proteases não alvo, outras ligações peptidil na RSL podem também ser clivadas), e a porção N- terminal das inserções de RSL na folha β central da serpina uma vez que isso produz sua conformação de menor energia. Quando a inserção é completada antes de a protease ter sido liberada de P1, o sítio ativo da protease é distorcido interrompendo imediatamente a reação proteolítica da protease (conformação c na Figura 3).

[51] Isso resulta num complexo estável em que o sítio ativo da protease é aprisionado covalentemente pela RSL da serpina, e em que a serpina se adaptou à conformação estável (S*). Quando a inserção não está ainda completada quando a protease já completou a sua reação hidrolítica, a protease é liberada como uma enzima ativa e uma serpina inativada em que a RSL clivada é inserida na folha β central (conformação d na Figura 3). Embora os contatos obrigatórios do sítio ativo de RSL contribuam significativamente para a formação dos complexos de Michaelis, outros locais da molécula estão também envolvidos.

[52] No caso da AT, podem ser formados complexos covalentes entre a serpina e as proteases trombina, FXa e FIXa, e até certo ponto também FXIa e FXIIa. A eficiência de inibição dessas proteases pode também ser descrita em constantes cinéticas, particularmente constantes de velocidade de segunda ordem. Essas constantes são dadas na Tabela 1.Tabela 1: Constantes de inibição da AT com várias proteases alvo e a influência de glicosaminoglicanos sobre elas (segundo: Rau et al., J. Thromb. Haemost. 2007; 5 (Supl. 1): 102-115.

UFH: heparina não fracionada; LMWH: heparina de baixo peso molecular

[53] Tal como é evidente a partir da Tabela 1, a atividade inibitória da AT é aumentada na presença de glicosaminoglicanos tais como heparina, ou pentassacarídeos sintéticos. A inibição aumentada de proteases pela AT na presença de heparina resulta de dois mecanismos distintos. Ela expele o terminal N da RSL da folha β central A. Essa “liberação” da RSL explica a inibição aumentada de FIXa e FXa, mas não a da trombina. A inibição aumentada da trombina resulta de um chamado mecanismo de molde que implica que a heparina serve como molde para se ligar tanto a trombina como a AT em uma posição ótima para permitir a inibição máxima da trombina pela AT.

[54] Em princípio, qualquer inibidor farmaceuticamente aceitável de AT pode ser utilizado na presente invenção. Um inibidor adequado da AT para utilização na presente invenção é preferencialmente um inibidor que, quando adicionado ao plasma (de preferência plasma humano, de maior preferência plasma reunido de voluntários saudáveis), provoca uma diminuição da atividade de AT como medido de preferência com fator Xa, trombina, ou qualquer outra protease interagindo com AT, tal como p. ex. fator IXa. De preferência, o inibidor diminui a atividade de AT até pelo menos 90, 80, 50, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,2, 0,1% do nível normal de AT. A AT normal é aqui entendida como o nível em plasma reunido de voluntários saudáveis. Alternativamente, o inibidor diminui a atividade da AT até pelo menos, 90, 80, 50, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,2, 0,1% do nível de AT antes da adição do inibidor.

[55] A inibição da AT é de preferência medida através da comparação do efeito de AT no plasma com e sem o inibidor quando adicionado a uma enzima proteolítica que é normalmente inibida por AT, tal como p. ex. trombina, fator Xa ou fator IXa, de origem humana ou bovina. Assim, de preferência, o inibidor, quando adicionado ao plasma (de preferência plasma humano, de maior preferência plasma reunido de voluntários saudáveis), impede uma redução na atividade de pelo menos um de trombina, fator Xa e fator IIa em mais de 10, 20, 50, 80, 90, 95, 99, 99,5, 99,8, 99,9% pelo plasma quando adicionado a pelo menos um de trombina (isolada), fator Xa (isolado), e fator IIa (isolado), em comparação com a redução na atividade de pelo menos um de trombina e fator Xa pelo mesmo plasma sem o inibidor. De preferência, a atividade de trombina e/ou fator Xa é determinada em um ensaio usando um substrato cromogênico como p. ex. descrito em http://www.practical- haemostasis.com/Thrombophilia%20Tests/at_assays.html ou em Beeck et al., Blood Coagulation Fibrinolysis 2000; 11: 127-35. Um substrato cromogênico adequado para o fator Xa é p. ex. S-2765, Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA.2HCl tendo a fórmula:

[56] Ensaios para a atividade de AT são ainda aqui descritos em “Determinação de níveis de AT funcional para avaliar a inibição de AT”.

[57] Um inibidor preferido de AT para utilização na presente invenção é um inibidor selecionado a partir do grupo consistindo em: (a) um composto que pode ser inserido na folha β central de antitrombina III; (b) um aptâmero que se liga especificamente a antitrombina III e impede ou atrasa a inserção da volta RSL na folha β central da antitrombina III; e, (c) um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga especificamente a AT. Tais inibidores são mais descritos aqui abaixo.

Inibidores peptídicos de AT

[58] Em uma forma de realização, uma classe de inibidores de AT que pode ser usada na presente invenção, p. ex. para aumentar a formação de trombina e a atividade da trombina em pacientes sofrendo de sangramento, se baseia na observação de que peptídeos que imitam a sequência dos resíduos de RSL P1-P14 se podem inserir na folha β central de AT. A inserção do peptídeo na folha β central impede a inserção da RSL da própria molécula. Como a inserção da RSL na folha β central é essencial para a função inibidora da serpina (ver Figuras 2 e 3), a AT incubada com o peptídeo de RSL é convertida num substrato para as suas proteases alvo tais como trombina. Por outras palavras, após incubação de AT o peptídeo imitando a sequência de aminoácidos de RSL de AT se ligará e se inserirá na folha β central de AT e tornará AT num substrato para suas proteases alvo (ver Figura 4). Os efeitos de peptídeos imitando a sequência de P1-P14 da RSL de AT foi descrita por I. Bjork et al., J. Biol. Chem. 1992; 267: 1976-1982. Assim, um inibidor preferido de AT de acordo com esta forma de realização é um peptídeo ou peptidomimético que imita a sequência de aminoácidos dos resíduos P1-P14 de RSL.

[59] Uma sequência preferida desse peptídeo é: NH2-Ser-Glu-Ala-Ala-Ala-Ser-Thr-Ala-Val-Val-Ile-Ala- Gly-Arg-COOH

[60] Notavelmente, ninguém até agora reivindicou ou sugeriu o uso terapêutico de peptídeos imitando a sequência de RSL de AT como terapia para pacientes com sangramento excessivo. Tais peptídeos podem ser um peptídeo com a sequência indicada, ou um peptídeo com a mesma sequência, mas ligado a outra sequência protéica, ou a uma ou várias moléculas de polietilenoglicol (PEG) ou outras moléculas para melhorar as propriedades farmacocinéticas. Também variantes da sequência indicada capazes de se ligar a AT são consideradas como estando dentro do escopo da presente invenção.

[61] Além disso, também compostos químicos ou outros, tais como aptâmeros capazes de se ligar a AT e inativar AT prevenindo ou retardando a inserção da volta RSL e diminuindo assim a atividade inibitória em relação a trombina e outras proteases da coagulação, são considerados como caindo dentro do escopo da presente patente.

Inibidores de anticorpo de AT

[62] Em outra forma de realização, o inibidor de AT para utilização na presente invenção compreende anticorpos policlonais e monoclonais (humanos, de murídeo, de murídeo humanizados, de outras espécies animais tais como camelídeos) contra AT, ou seus fragmentos. Os exemplos específicos aqui demonstram que anticorpos policlonais contra AT humana após adição ao plasma bloqueiam totalmente a atividade de AT no plasma.

[63] Estudos sobre auto-anticorpos monoclonais que neutralizam e inativam o inibidor C1, que é também uma serpina e partilha homologia estrutural com AT, e que causa deficiência adquirida do inibidor C1, revelaram que esses anticorpos reconhecem epítopos localizados próximo ou na sequência de RSL em torno de P10’ (S. He et al., J. Immunol. 1996; 154: 2009-2013). Esses anticorpos tornam o inibidor C1 um substrato para suas proteases alvo (S. He et al., Molecular Medicine 4: 119-128, 1998), provavelmente dificultando a inserção da RSL do inibidor C1 na folha beta central (ver também o painel da direita da Figura 4). Anticorpos ou seus fragmentos contra as sequências homólogas de AT são usados para inativar AT após interação com proteases alvo. Anticorpos ou seus fragmentos contra a sequência de RSL de AT em torno de P10 impedem também a inserção de RSL na folha β central e tornam a serpina num substrato quando interage com uma protease alvo. De fato, se mostrou que um anticorpo reconhecendo um epítopo envolvendo os aminoácidos na posição P3-P8 da RSL de AT, torna AT num substrato quando incubado com trombina (S. Asakura et al., J. Biol. Chem. 1990; 265: 5135-6). Além disso, outros anticorpos monoclonais que inibem AT sem mais especificação dos mecanismos de inibição subjacentes, foram descritos na literatura (P. Herion et al., Blood 1985; 65: 1201-7; S. Knoller et al., Eur. J. Bioch. 1989; 180: 31927). No entanto, o potencial terapêutico de tais anticorpos para o tratamento ou a prevenção de sangramento nunca foi considerado. A presente invenção revela que tais anticorpos podem ser usados para parar e prevenir sangramento em hemofílicos ou pacientes com episódios de sangramento devido a outras razões. Todos os anticorpos, completamente humanos, humanizados ou de espécies animais, desimunizados ou não, ou seus fragmentos, que inibam a AT através de interferência com a inserção da RSL de AT na folha beta central, caem dentro do escopo da presente invenção.

[64] Assim, um inibidor preferido de acordo com a invenção é um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga especificamente a um epítopo na sequência de RSL de AT, e, de preferência, impede a inserção da RSL na folha β central de AT. De maior preferência, deste modo o epítopo na sequência de RSL de AT compreende um ou mais dos resíduos de RSL P1-P14, de preferência o epítopo compreende resíduos de RSL em torno de P10, os resíduos de RSL P5-P10 ou os resíduos de RSL P3-P8.

[65] Os anticorpos contra as sequências dos peptídeos de RSL mencionados acima são produzidos através de imunização com peptídeos cobrindo essas sequências ligadas ou não a uma proteína transportadora. Peptídeos conjugados com hemocianina da lapa californiana (KLH) são rotineiramente utilizados como antígenos para gerar anticorpos contra sequências peptídicas. Outras proteínas transportadoras, no entanto, tais como albumina de soro bovino (BSA), podem também ser usadas. Além disso, mutantes da sequência peptídica indicada podem também ser utilizados para imunização, desde que os anticorpos resultantes se liguem a AT.

[66] Uma estratégia preferida para produzir anticorpos inibidores de AT é imunizar um hospedeiro adequado com KLH à qual foram acoplados peptídeos possuindo a sequência de aminoácidos da RSL de AT. Os peptídeos podem ser adquiridos a fornecedores comerciais ou não comerciais, ou podem ser produzidos de acordo com procedimentos bem conhecidos na técnica. Também podem ser utilizadas máquinas sintetizadoras de peptídeos disponíveis comercialmente para esta finalidade. Os peptídeos são acoplados a KLH através de métodos bem estabelecidos, por exemplo através da introdução de uma cisteína C-terminal na sequência. Outro método usa glutaraldeído como reagente de conjugação. Várias empresas comerciais oferecem produção de conjugados KLH-peptídeos como serviço a clientes. Tais conjugados KLH- peptídeos podem então ser usados para imunização de um hospedeiro adequado.

[67] Em uma forma de realização preferida, KLH é usada como proteína transportadora, os peptídeos cobrindo a sequência de RSL (ver acima) ou os peptídeos cobrindo as sequências P5’-P10 da RSL de AT, são conjugados com KLH através da introdução de um resíduo de cisteína adicional no terminal C.

[68] Uma variedade de protocolos de imunização pode ser empregue, e pode incluir injeção intravenosa, subcutânea, ou intraperitoneal, seguida de um ou mais reforços. Um adjuvante adequado é adjuvante de Freund. Um procedimento de imunização adequado é a hiperimunização com KLH-peptídeo a uma concentração que, dependendo do animal hospedeiro, pode estar no intervalo de 10 a 500 microgramas, misturado com adjuvante completo de Freund. A mistura é injetada por via subcutânea. As injeções são repetidas 2 a 5 vezes usando a mesma preparação de KLH- peptídeo misturada com adjuvante incompleto de Freund. Amostras de sangue são tomadas do animal 1 semana após a 3a, 4a, 5a injeção, e pesquisadas quanto à presença de anticorpos contra AT.

[69] Em uma forma de realização preferida da presente invenção, anticorpos monoclonais de murídeo contra AT são produzidos usando tecnologia de hibridoma. Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos de vários outros modos com técnicas bem compreendidas por aqueles de vulgar perícia na técnica. Detalhes dessas técnicas estão descritos em ("Antibodies: A Laboratory Manual", Harlow et al., Cold Spring Harbor Publications, pág. 726, 1988), ou são descritos por (Campbell, A.M. "Monoclonal Antibody Technology Techniques in Biochemistry e Molecular Biology", Elsevier Science Publishers, Amsterdã, Holanda, 1984) ou por (St. Groth et al., J. Immunol. Methods 35: 1-21, 1980).

[70] Os hibridomas que segregam anticorpo contra AT humana podem ser identificados ensaiando sobrenadantes de cultura, etecetera, quanto à presença de anticorpo. O procedimento de pesquisa preferido compreende dois passos sequenciais, sendo o primeiro a identificação de que hibridomas segregam mAb contra AT, o segundo sendo a determinação da capacidade do mAb para inibir a atividade funcional de AT.

[71] Um ELISA é usado para pesquisar sobrenadantes de hibridoma quanto à presença de anticorpos monoclonais anti- AT. Esse ELISA pode ser realizado como se segue. A AT de plasma humano purificado (ou AT humana recombinante) é usada para revestimento (2 μg/ml em solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4 [PBS]; 100 pl/poço). Os locais de ligação não específica residuais são então bloqueados por 30 minutos de incubação à temperatura ambiente com PBS/Tween 20 a 0,1% (p/v) (PBS-T) contendogelatina a 0,2% (p/v) (PBS-TG). Em seguida, após um procedimento de lavagem (5 vezes com PBS-T), as placas são incubadas durante 60 minutos a 37°C com 20 μl de sobrenadantes de hibridoma juntamente com 80 μl de PBS-TG. Finalmente, anticorpos de murídeo ligados são detectados através de incubação com anticorpos policlonais de cabra anti-imunoglobulina de camundongo conjugados com peroxidase durante 120 minutos a 37°C. Finalmente, as placas são lavadas com água destilada (5 vezes), e reveladas com 3,5,3’,5’-tetrametil-benzidina.

[72] Alternativamente, anticorpos anti-AT são medidos com um procedimento de radioimunoensaio, por exemplo usando um procedimento similar como descrito para detecção de anticorpos anti-C3 por (Hack et al., J. Immunol. 1988; 141: 1602-9).

[73] Para avaliar o efeito do anticorpo contra AT na atividade funcional da AT, os hibridomas positivos são subclonados através de diluição limitante e cultivados. Em seguida, os anticorpos são purificados a partir do sobrenadante da cultura de hibridoma através de cromatografia de afinidade de proteína G. O anticorpo purificado é então incubado com AT purificada ou com plasma humano, após o que a atividade funcional de AT é medida num ensaio cromogênico tal como aqui descrito abaixo.

[74] Quaisquer anticorpos ou seus fragmentos que inibam AT através de um mecanismo diferente da interferência com a inserção de RSL são também considerados como caindo dentro do escopo da presente invenção. Esses anticorpos podem ser humanos, humanizados, de murídeo, anticorpos monoclonais desimunizados, anticorpos de outras espécies animais tais como camelos, ou sintéticos, ou seus fragmentos. As principais características dos anticorpos ou fragmentos de anticorpo que estão dentro do escopo da presente invenção, é que eles se ligam a AT e inibem a atividade funcional da AT. Esses anticorpos bloqueiam um ou mais locais funcionalmente importantes na AT, resultando em uma diminuição da atividade funcional da AT.

[75] Os anticorpos que inibem AT podem em geral ser obtidos por imunização de animais com AT funcional. Os anticorpos (policlonais ou através de colheita de plasma e purificação de anticorpos de AT, ou anticorpos monoclonais produzidos através da tecnologia de hibridoma com AT nativa como antígeno) são então pesquisados com ensaios utilizando AT como antígeno. Todos os anticorpos positivos são então testados quanto a atividades inibidoras para AT através da incubação de AT purificada com os anticorpos após o que a atividade funcional de AT é testada usando um ensaio cromogênico tal como aqui descrito a seguir. Alternativamente, os anticorpos podem ser pesquisados, através da sua adição a plasma e testando o plasma em ensaios de coagulação, tais como o tempo de protrombina (TP) e o tempo protromboplastina ativada (TTPa) ou outro. Além disso, o anticorpo pode ser adicionado a plasma humano normal, após o que a atividade funcional da AT é medida usando um ensaio cromogênico tal como descrito abaixo. Os anticorpos de inibição diminuirão a atividade funcional de AT nesses ensaios.

[76] Além disso, anticorpos de seus fragmentos, que se ligam a AT e causam uma diminuição de AT in vivo através do aumento da eliminação de AT, ou diminuição da atividade in vivo de AT através de outros mecanismos, são considerados como caindo dentro do escopo da presente invenção.

Outros inibidores de AT

[77] Peptídeos, anticorpos e outras moléculas que se liguem a AT e inibam AT através de diferentes mecanismos de interferência com a inserção da RSL na folha beta central, estão também dentro do escopo da presente invenção. Por exemplo, esses peptídeos ou compostos tais como aptâmeros podem se ligar a outros locais funcionais na AT, tais como locais envolvidos na interação com proteases alvo. Qualquer molécula capaz de inibir a atividade funcional de AT, de preferência in vivo, é considerada como caindo dentro do escopo da invenção. Da mesma forma, qualquer molécula capaz de diminuir a atividade funcional da AT, de preferência in vivo, é considerada como caindo dentro do escopo da invenção.

Determinação de níveis de AT funcional para avaliar a inibição de AT

[78] O efeito dos inibidores de AT no plasma pode ser avaliado com um ensaio que mede a atividade funcional de AT no plasma ou em outros fluidos (biológicos). A atividade funcional de AT pode ser avaliada com base na sua atividade inibidora em relação à trombina. Tais ensaios estão comercialmente disponíveis (p. ex. Actichrome ATIII, American Diagnostica, Greenwich, CT, EUA; STA Stachrome, Diagnostica Stago Inc, Parsippany, NJ, EUA). A base desses ensaios é que a trombina pode converter substratos cromogênicos adequados (p. ex. S-2238, Haemochrom Diagnostica, Molndal, Suécia). Os substratos cromogênicos são peptídeos que reagem com enzimas proteolíticas com formação de cor. Eles são produzidos sinteticamente por várias empresas e são concebidos para possuir uma seletividade semelhante à do substrato natural da enzima. Ligado à parte peptídica do substrato cromogênico está um grupo químico, p-nitroanilida, o qual após liberação depois da clivagem enzimática dá origem a uma cor amarela. A alteração de cor pode ser seguida espectrofotometricamente, e é proporcional à atividade proteolítica. No caso das medições de AT, uma determinada quantidade de trombina é incubada com plasma na etapa 1, etapa durante o qual a AT funcional se liga a, e inativa, parte da trombina. A atividade residual da trombina é então medida com um substrato cromogênico na etapa 2 do ensaio. Essa atividade residual da trombina é inversamente proporcional à concentração de AT. Para assegurar a quantificação ótima, a incubação da trombina com plasma ocorre na presença de heparina que otimiza a atividade de AT. Além disso, é muitas vezes utilizada trombina bovina para aumentar ainda mais a especificidade do ensaio, uma vez que a trombina bovina, em contraste com a trombina humana, dificilmente interage com um outro inibidor do plasma, cofator II da heparina. Também o FXa humano ou bovino, em combinação com um substrato cromogênico, pode ser utilizado para medir níveis de atividade de AT.

[79] Utilizando esse ensaio cromogênico, o nível de inibição de AT através de inibidores de AT pode ser facilmente medido in vitro bem como in vivo. In vitro isto é alcançado através da incubação de certo volume de plasma, por exemplo X ml, com uma certa quantidade de inibidor de AT dissolvido em, por exemplo, 0,1X ml de solução salina ou tampão. A mistura é então incubada a 37°C, após o que a atividade de AT na mistura é medida com um ensaio cromogênico para AT tal como descrito acima. O valor obtido é então comparado com o valor obtido com uma amostra contendo trombina e solução salina, em vez de plasma, o que é igual a 100% de inibição de AT funcional, e ao obtido com plasma ao qual não foi adicionado qualquer inibidor de AT, o que é igual a 0% inibição. A quantidade de inibição de AT na amostra de plasma incubada com inibidor de AT é então comparada com os controlos de 0% e 100% de inibição e expressa como % de inibição de AT. A amostra de plasma incubada com inibidor de AT pode ser um plasma normal ou plasma de um paciente de sangramento ou de um paciente em risco de sangramento, por exemplo um hemofílico. A inibição in vivo de AT através de inibidores de AT administrados a um paciente pode ser avaliada através da medição dos níveis de AT em circulação após administração de inibidores de AT utilizando os ensaios cromogênicos descritos neste parágrafo.

Aplicação clínica da invenção

[80] Os inibidores de AT podem ser aplicados para tratamento profilático ou tratamento a pedido de distúrbios de sangramento. Assim, em uma forma de realização, a invenção se refere a um inibidor de AT para uso no tratamento e na prevenção de sangramento num indivíduo sofrendo de distúrbio de sangramento (hipocoagulabilidade). O distúrbio de sangramento pode ser um distúrbio de sangramento adquirido ou genético. Em uma forma de realização preferida, o distúrbio de sangramento é hemofilia, p. ex. hemofilia A ou B. De maior preferência, o inibidor de AT é usado em tratamento de um indivíduo hemofílico com anticorpos neutralizantes para fator VIII ou fator IX. Em tais casos o inibidor é de preferência usado como terapia de bypass de fator VIII ou fator IX profilática.

[81] Uma aplicação da presente invenção é o tratamento agudo e profilático de hemofílicos com inibidores (anticorpos neutralizantes para FVIII de IX). A gravidade das manifestações de sangramento em hemofilia se correlaciona geralmente com o nível de fator de coagulação. Os hemofílicos graves têm quantidades negligenciáveis de FVIII (<1% do normal) e podem sangrar espontaneamente a partir de muitos locais. Os locais mais freqüentes, no entanto, são as articulações (70%-80%) especialmente joelhos e cotovelos, e tecido muscular/mole (10%-20%). Outros sangramentos importantes (5%-10%) e, por vezes, sangramento do sistema nervoso central (<5%) também ocorrem. Além disso, os hemofílicos podem sangrar excessivamente após trauma cirúrgico ou outro. A substituição profilática de fator de coagulação em hemofilia, que visa manter os níveis em circulação do fator deficiente sempre acima de 1% para prevenir sangramentos espontâneos nas articulações e tecidos moles, em contraste com a terapia a pedido, impede em grande parte a artropatia hemofílica (M.J. Manco-Johnson et al., N. Engl. J. Med. 2007; 357: 535-44). Em particular, pacientes com FVIII muito baixo ou sem ele estão em risco de desenvolver anticorpos neutralizantes quando tratados com FVIII exógeno, uma vez que o seu sistema imunológico considera o FVIII administrado um antígeno estranho e não é tolerante a ele. Com efeito, 20-30% dos hemofílicos graves desenvolvem tais anticorpos neutralizantes (J. Goudemond et al., Blood 2006; 107: 46-51; S.C. Gouw et al., Blood 2007; 109: 46934697), que inibem a eficácia do FVIII administrado e, por conseguinte, são freqüentemente referidos como inibidores de FVIII. No momento, a única terapia profilática disponível para hemofílicos é a terapia de reposição com o fator deficiente. No entanto, no caso de um paciente com inibidores contra FVIII, a terapia profilática é praticamente impossível uma vez que o FVIII administrado é neutralizado pelos inibidores ou rapidamente eliminado da circulação através da ligação de anticorpos a FVIII. De acordo com a presente invenção, o defeito da formação de fibrina durante a coagulação nesses pacientes pode ser restabelecido através da administração de uma quantidade de inibidor de AT, que diminui a atividade funcional de AT em circulação, o que aumenta a formação de fibrina devido à inibição da diminuição do fator Xa e à atividade de trombina prolongada. O grau de inibição de AT exigido pode ser monitorado medindo o nível in vivo de AT funcional após a administração do inibidor de AT a um paciente hemofílico, enquanto o grau de inibição necessário para uma hemostasia eficaz pode ser estimado com base em experiências in vitro em que a geração de trombina é induzida por uma baixa concentração de TF no plasma do paciente hemofílico na presença de várias quantidades de inibidor de AT.

[82] Em outra forma de realização, a invenção se refere a um inibidor de AT para utilização na prevenção ou no tratamento de uma condição clínica caracterizada por sangramento excessivo. Uma condição clínica caracterizada por sangramento excessivo pode p. ex. ser uma ou mais de cirurgia, trauma e hemorragia interna. Assim, a invenção proporciona ainda um método para redução ou prevenção de perda de sangue em um paciente de trauma ou uma vítima de guerra, compreendendo a administração de um inibidor de AT ao paciente. A invenção proporciona também um método para redução ou prevenção de perda de sangue em um paciente submetido à cirurgia, por exemplo bypass coronário ou outra cirurgia vascular, compreendendo a administração de um inibidor de AT ao paciente. A invenção proporciona ainda um método para redução ou prevenção de danos cerebrais em um paciente sofrendo de uma hemorragia intracerebral, compreendendo a administração de um inibidor de AT ao paciente. A invenção proporciona também um método para redução ou prevenção de perda de sangue em um paciente com uma hemorragia interna, por exemplo de varizes esofágicas ou devido ao uso de medicamentos antiinflamatórios não esteróides, compreendendo a administração de um inibidor de AT ao paciente. A invenção proporciona também um método para redução ou prevenção de perda de sangue em um paciente com sangramento devido à utilização de anticoagulantes. A invenção pode ser aplicada em cirurgia, trauma ou outras condições em que ocorra sangramento excessivo, tais como o uso de anticoagulantes, e também no caso de hemorragia interna tal como acidente vascular cerebral hemorrágico ou sangramento gastrointestinal tal como sangramento esofágico devido a varizes. O método revelado pela presente invenção pode também ser usado para prevenir sangramento em pacientes em risco de sangramento, por exemplo em pacientes de hemofilia para prevenir sangramento nas articulações, músculo e/ou tecidos moles num paciente de hemofilia.

[83] O inibidor da antitrombina III, quando utilizado de acordo com a invenção no tratamento e na prevenção de sangramento num indivíduo sofrendo de um distúrbio de sangramento adquirido ou genético (hipocoagulabilidade) ou num indivíduo possuindo uma condição clínica caracterizada por sangramento excessivo, é de preferência utilizado a uma dose que diminui a atividade de AT para pelo menos 90, 80, 50, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,2, 0,1% do nível normal de AT, em que o nível normal de AT é tal como aqui definido acima.

Avaliação dos níveis de AT funcional para guiar a dose de inibidor de AT a utilizar in vivo

[84] O efeito de inibidores de AT no plasma pode ser avaliado utilizando um ensaio que mede a atividade funcional de AT no plasma, tal como aqui descrito acima. O nível de inibição de AT a alcançar in vivo pode ser estimado in vitro com amostras de plasma de pacientes com distúrbios de sangramento. No caso de um plasma de hemofílico, o plasma suplementado com várias concentrações de inibidores de AT pode ser plasma imune sem FVIII (Dade Behring, Marburg, Alemanha) ou plasma de um paciente hemofílico. A formação de trombina nessas amostras de plasma é então desencadeada pela adição de TF (por exemplo Innovin, Dade Behring, B4212-50). As concentrações de TF são primeiro selecionadas para dar uma geração de trombina ou formação de fibrina dependente de FVIII nesse plasma sem FVIII ou de hemofílico, que é conseguida através da incubação das amostras de plasma com 1 a 1000 até 1 a 80000 diluições de Innovin, na presença de diferentes concentrações de FVIII variando de 0,1% (0,001 U/ml) a 25% (0,25 U/ml) do nível normal imitando condições hemofílicas graves a ligeiras, respetivamente. A geração de fibrina pode ser medida no tempo através da utilização do leitor de placas de microtitulação SpectraMax e software Softmax pro. Alternativamente, a geração de trombina é avaliada com substratos cromogênicos ou fluorogênicos, p. ex. o sistema Technothrombin TGA proporcionado por DiaPharma. É então selecionada uma concentração de TF que induz a geração de trombina ou fibrina dependente da dose de FVIII nesse sistema.

[85] Para avaliar o efeito do inibidor de AT sobre a formação de fibrina ou a geração de trombina, amostras de plasma de hemofílicos ou sem FVIII são incubadas com várias quantidades de inibidor de AT para diminuir os níveis de AT funcional em 20, 40, 60, 80 ou 100% tal como avaliado de acordo com os procedimentos descritos acima. Como controlos, as amostras de plasma são suplementadas com várias concentrações de FVIII (p. ex. FVIII recombinante de Baxter (Recombinate®) ou Bayer (Kogenate®)). Após mistura, as amostras são testadas quanto à geração de fibrina ou geração de trombina após adição de TF a uma concentração selecionada tal como explicado no parágrafo anterior para obter geração de trombina e formação de fibrina dependentes de FVIII. Essa geração de trombina e/ou formação de fibrina é então medida tal como descrito acima. A geração de fibrina e/ou geração de trombina aumentada (reforçada) observada na amostra de plasma com níveis decrescentes de AT funcional (aumentando a inibição da AT), pode ser comparada com os resultados obtidos com FVIII. O nível desejado de inibição da AT para compensar a falta de FVIII pode ser assim selecionado para mimetizar condições de hemofilia moderada, ligeira ou nenhuma. O nível correspondente de inibidor de AT a alcançar no plasma pode então ser calculado.

[86] A co-administração de inibidor de AT com FVIII pode também ser considerada. Tal co-administração pode diminuir a necessidade de FVIII e portanto diminuir o risco de imunogenicidade e a possibilidade de desenvolvimento de inibidores. Em pacientes, a administração de Fator VIII pode ser diminuída para níveis muito menores, por exemplo para níveis suficientemente baixos que não provoquem uma resposta imunológica no paciente a FVIII. Por exemplo, é possível administrar a pacientes de hemofilia uma quantidade de FVIII para alcançar uma concentração de 0,001-0,05, p. ex. 0,01 U/ml no plasma, e ao mesmo tempo também tratar o paciente com inibidor de AT de acordo com a presente invenção.

[87] Além da hemofilia, o sangramento de rotina que falha a terapia convencional pode ocorrer num grande número de outros distúrbios médicos. Atualmente, rFVIIa, usado off-label, é o único tratamento dessas condições. Essas condições incluem hemorragia intracraniana, doença hepática, sangramento após cirurgia tal como cirurgia de bypass cardiopulmonar, cirurgia da coluna vertebral, cirurgia da próstata e transplante de fígado ortotópico, sangramento associado a trauma, sangramento associado ao uso de anticoagulantes tais como varfarina, e outros.

[88] A hemorragia intracerebral é uma das formas mais incapacitantes de acidente vascular cerebral. Mais de um terço dos pacientes com esse distúrbio morre no prazo de um mês após o início dos sintomas, a maioria fica gravemente debilitada, e apenas 20 por cento recupera a independência funcional. Não há atualmente nenhum tratamento eficaz para a hemorragia intracerebral, embora a estimulação da coagulação sanguínea através da administração de FVIIa recombinante tenha mostrado resultados promissores (SA Mayer et al., 2005; 352: 777-85). O volume do hematoma é um determinante crítico da mortalidade e do resultado funcional após hemorragia intracerebral, e o crescimento inicial do hematoma é uma importante causa de deterioração neurológica. Se mostrou que rFVIIa reduz esse aumento de volume. Num estudo de fase 3, foi novamente verificado um efeito favorável de rFVIIa no tamanho do infarto, embora as consequências clínicas de rFVIIa tenham reduzido o crescimento do hematoma mas não tenham melhorado a sobrevivência ou o resultado funcional após a hemorragia intracerebral (S.A. Mayer et al., N. Engl. J. Med. 2008; 358: 2127-37).

[89] Os pacientes com doença hepática devido a cirrose alcoólica ou pós-hepatite ou outras doenças estão em risco de sangramento grave devido à síntese diminuída de fatores de coagulação pelo fígado, resultando em baixos níveis de fatores de coagulação em circulação, e na presença de varizes no esôfago e no estômago. Esses pacientes são tratados atualmente com concentrados de fator de coagulação ou infusão de rFVIIa. Sangramento grave pode também ocorrer durante transplante hepático e durante hepatectomia parcial em pacientes não cirróticos, devido a níveis diminuídos de vários fatores de coagulação em circulação. Hemorragia excessiva pode também surgir em pacientes submetidos a cirurgia cardíaca. Esse aumento de risco de sangramento é devido a baixos níveis plasmáticos de fatores de coagulação, devido à hemodiluição como consequência do uso de fluido de preparação para o oxigenador extracorpóreo, do uso de anticoagulantes e problemas mecânicos de enxertos vasculares.

[90] Os anticoagulantes são usados para várias doenças tromboembólicas, incluindo fibrilação atrial, trombose venosa profunda, enfarto do miocárdio e outros. Os pacientes tratados com anticoagulante oral têm níveis diminuídos de proteínas de coagulação dependentes de vitamina K funcional e estão assim em risco de complicações hemorrágicas. A incidência do sangramento é de cerca de 0,6-0,7% por mês a uma Razão Terapêutica Normalizada Internacional (INR) e a incidência de eventos hemorrágicos importantes é substancial. Portanto, a capacidade para inverter o efeito anti-vitamina K é importante. No caso de emergência, são usados concentrados de plasma ou complexos de protrombina, bem como FVIIa recombinante. Como alternativa, pode ser utilizada a presente invenção. A vantagem da presente invenção é que o efeito pró-coagulante pode ser titulado através da medição de níveis de AT funcional num paciente recebendo inibidor de AT.

[91] Nas condições clínicas descritas no parágrafo anterior, bem como em outras doenças com risco aumentado de sangramento ou com sangramento em curso, existe a necessidade médica de prevenir ou parar o sangramento. Para parar o sangramento apenas está disponível FVIIa recombinante ou o complexo de protrombina ativada derivado de plasma tal como FEIBA (J. Astermark et al., Blood 2007; 109: 546-551; H.R. Roberts et al., Blood 2004; 104: 3858-3864). Nenhum desses pode ser usado para evitar o sangramento. Além disso, não há bons ensaios in vitro que prevejam a eficácia ou os efeitos colaterais desses agentes. A presente invenção proporciona uma alternativa a esses pró-coagulantes, por o efeito de o tratamento poder ser titulado, poder ser monitorado, e poder ser usado tanto como profilático como também em terapia a pedido. Esta invenção consiste na administração de inibidor de AT a um paciente em risco de sangramento ou sofrendo de sangramento. O controle farmacológico da quantidade de inibidor de AT a administrar pode ser conseguido através da medição dos níveis plasmáticos de AT funcional.

Avaliação da concentração eficaz de inibidor de AT para reforçar a formação de trombina

[92] O nível alvo da inibição de AT in vivo pode ser estimado in vitro com amostras de plasma de pacientes com distúrbios de sangramento tal como é aqui explicado acima. Após a adição de TF para induzir coagulação, a geração de fibrina pode ser medida no tempo através da utilização do leitor de placas de microtitulação SpectraMax e do software Softmax Pro, enquanto a geração de trombina pode ser avaliada com substratos cromogênicos ou fluorogênicos, p. ex. o sistema Technothrombin TGA fornecido por Diapharma.

[93] Os resultados da geração de trombina e da formação de fibrina nas amostras de plasma de pacientes contendo quantidades variáveis de inibidor de AT são comparados com os obtidos com amostras de plasma de controlos normais. Com base na quantidade de inibidor de AT que é capaz de restaurar a geração de trombina e formação de fibrina no intervalo observado com as amostras de plasma de controlos normais, bem como na biodisponibilidade e nas propriedades farmacocinéticas, a dose de inibidor de AT a administrar é então calculada. A dose a administrar é confirmada medindo os níveis de atividade de AT em circulação após a administração de inibidores de AT aos pacientes utilizando o ensaio aqui descrito anteriormente.

Composições farmacêuticas de inibidores de AT

[94] Para administração a humanos, a invenção pode empregar composições farmacêuticas compreendendo o inibidor da AT e um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. No presente contexto, o termo "farmaceuticamente aceitável" significa que o transportador ou excipiente, nas dosagens e concentrações empregadas, não causará quaisquer efeitos indesejados ou nocivos nos pacientes a que é administrado. Esses veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica (ver "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18a edição, AR Gennaro, ed. Mack Publishing Company [1990]; "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", S. Frokjaer e L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; e "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3a edição, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]). O inibidor de AT da presente invenção é de preferência formulado e administrado como uma solução estéril, embora esteja dentro do escopo da presente invenção a utilização de preparações liofilizadas. As soluções estéreis são preparadas através de filtração estéril ou através de outros métodos conhecidos per se na técnica. As soluções são então liofilizadas ou enchidas em recipientes farmacêuticos de dosagem. O pH da solução está em geral no intervalo de pH 3,0 a 9,5, p. ex. pH 5,0 a 7,5. A proteína ou o peptídeo está tipicamente numa solução possuindo um tampão farmaceuticamente aceitável, e a solução de proteína pode também conter um sal. Em certas formas de realização é adicionado detergente. Para uso na presente invenção, o inibidor de AT pode ser formulado numa preparação injetável. Formulações parentéricas são adequadas para uso na invenção, de preferência para administração intravenosa. Essas formulações contêm quantidades terapeuticamente eficazes de inibidor de AT, e ou são soluções líquidas, suspensões líquidas ou versões liofilizadas estéreis e contêm opcionalmente estabilizantes ou excipientes. Tipicamente, as composições liofilizadas são reconstituídas com diluentes adequados, p. ex. água estéril para injeção, solução salina estéril e semelhantes.

Tratamento de pacientes com um distúrbio de sangramento com inibidores de AT

[95] O inibidor de AT pode ser administrado através de injeção por via intravascular, ou através de outras vias e/ou locais de administração. A dose necessária depende, entre outros, da condição clínica.

[96] Acima descrevemos a metodologia para avaliar o efeito de um grau variável de inibição de AT na geração de trombina e de fibrina em plasma de hemofílicos em comparação com os efeitos de um intervalo de doses de FVIII. No caso de tratamento profilático com inibidores de AT, é desejado um grau semelhante de inibição de AT uma vez que é equivalente ao grau de inibição que corresponde à suplementação com cerca de 0,3 U de FVIII tal como descrito sob "Avaliação dos níveis de AT funcional para guiar a dose de inibidor de AT a utilizar in vivo" acima. Considerando as propriedades farmacocinéticas do inibidor de AT, pode ser estimada a quantidade a administrar para produzir um grau semelhante de inibição de AT in vivo ao das experiências in vitro. Ao monitorar os níveis de AT funcional no paciente após a administração de inibidor de AT, se verifica que o nível desejado de inibição de AT ocorre realmente no paciente.

[97] No caso de um episódio de sangramento agudo, o inibidor de AT pode ser administrado em doses ligeiramente crescentes e sob a orientação de níveis funcionais de AT até parar o sangramento. O tratamento de pacientes com episódios de sangramento devido a outras causas além de hemofilia pode ser feito utilizando uma estratégia similar. O inibidor de AT é administrado para diminuir lentamente os níveis funcionais de AT até que o sangramento tenha cessado. O monitoramento dos níveis de AT funcional após administração de inibidor de AT é feito com um ensaio como aqui descrito acima.

Método para identificação de um composto tal como um inibidor de AT

[98] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para identificação de um composto como inibidor de AT. O método compreende de preferência as etapas de: (a) adição do composto a plasma reunido de voluntários saudáveis; (b) mistura do plasma reunido com o composto tal como obtido em a) com pelo menos um de trombina isolada e fator Xa isolado; (c) determinação da atividade de pelo menos um de trombina e fator Xa na mistura obtida em b) e comparação da atividade na mistura com o composto com a atividade de pelo menos um de trombina e fator Xa misturado com o mesmo plasma sem o composto, em que, de preferência, a atividade de pelo menos um de trombina e fator Xa é determinada em um ensaio usando um substrato cromogênico; e, (d) identificação de um composto que impede uma redução na atividade de pelo menos um de trombina e fator Xa no plasma em comparação com o mesmo plasma sem o composto, como inibidor de AT, em que de preferência o composto impede uma redução na atividade de pelo menos um de trombina e fator Xa em mais de 50%. Na forma de realização preferida do método, antes da etapa (a), o composto foi selecionado como um composto que se liga especificamente a AT. De preferência, no método o composto é um peptídeo, aptâmero, anticorpo ou fragmento de anticorpo que foi selecionado para se ligar especificamente a AT; de maior preferência, o peptídeo, aptâmero, anticorpo ou fragmento de anticorpo foi selecionado para se ligar especificamente a um epítopo na sequência de RSL de AT.

[99] Neste documento e em suas reivindicações, o verbo "compreender" e suas conjugações são usados em seu sentido não limitante para significar que os itens a seguir à palavra estão incluídos, mas os itens não especificamente mencionados não são excluídos. Além disso, a referência a um elemento pelo artigo indefinido "um" ou "uma" não exclui a possibilidade de que mais do que um dos elementos esteja presente, a menos que o contexto claramente exija que haja um e apenas um dos elementos. O artigo indefinido "um" ou "uma" significa, portanto, geralmente "pelo menos um".

[100] Todas as referências de patentes e literatura citadas na presente descrição são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

[101] Os exemplos seguintes são oferecidos apenas para fins ilustrativos, e não se destinam a limitar o escopo da presente invenção de forma alguma.

Descrição das Figuras

[102] Figura 1: Esquema simplificado de coagulação. A ativação começa com a exposição de sangue a fator tecidular (TF) que forma um complexo com FVII(a) do plasma. O complexo TF/FVIIa ativa FX em FXa, que por sua vez forma um complexo com FV. O complexo FXa/FVa converte a pró-enzima protrombina em trombina, a enzima central da coagulação. Essa via pode ser considerada como uma via de coagulação basal. Essa via basal é amplificada através de duas vias, uma consistindo em FIX e FVIII, e a outra consistindo em FXI. A via FIX/FVIII é ativada pelo complexo TF/FVIIa, que ativa FIX em FIXa. FIXa no complexo FIXa/FVIIIa tem atividade proteolítica e pode ativar FX em FXa. Outra volta de amplificação consiste em FXI que após ativação pela trombina pode também ativar FIX. Não representado na figura estão vários inibidores da coagulação incluindo a AT e o cofator fosfolipídico.

[103] Figura 2: Estrutura da serpina A1 (Protein Data Bank (PDB), código 1QLP; P.R. Elliott et al., Nat. Struct. Biol. 1996; 3: 676-681). A volta do centro reativo (RCL) está no topo da molécula. A seta tracejada indica o "sulco" na folha β central no qual a volta do centro reativo se insere.

[104] Figura 3: Mecanismo estrutural da ação inibitória de uma serpina com uma protease. A estrutura mostrada é a da SERPINA1 Protein Data Bank (PDB), código 1QLP. Via b ^ c: A interação protease-serpina resulta num complexo covalente estável, em que o sítio ativo da serina da protease está ligada ao resíduo P1 da volta do local reativo (= volta do centro reativo, RCL) da serpina. Como resultado, a protease fica pendente distorcida e inativa na base da molécula. Via b ^ d: o complexo serpina-protease se dissocia antes da inserção de RSL na folha β central estar completada e é induzida a alteração conformacional no sítio ativo da serina-protease. Como resultado, a protease ativa é liberada e é deixada uma serpina inativa com conformação estável. Nessa situação, a serpina se comporta como um substrato para a protease, que escapa à armadilha conformacional. Referências: P.R. Elliott et al., Nat. Struct. Biol. 1996; 3: 676-681; A. Dementiev et al., J. Biol. Chem. 2003; 278: 37881-37887; J.A. Huntington et al., Nature 2000; 407: 923-926; H. Loebermann et al., J. Mol. Biol. 1984; 177: 531-557.

[105] Figura 4: Desenho descrevendo o mecanismo de alguns inibidores de AT. É mostrado o efeito de um peptídeo se inserindo na folha β central da AT ou um anticorpo monoclonal (mAb) que impede a inserção da RSL na folha β central. A parte esquerda do desenho mostra a situação normal: após clivagem da RSL por uma protease alvo, a RSL clivada (resíduos P1-P14) se insere na folha β central distorcendo assim a estrutura 3D do sítio ativo da protease tornando-a inativa. À direita, um peptídeo imitando a sequência de P1-P14 da RSL se insere na folha β central prevenindo assim a inserção de RSL de AT. Um inibidor alternativo de AT, um mAb se ligando à sequência de P4-P14 de RSL impede a inserção de RSL na folha β central tornando AT um substrato para as suas proteases alvo.

[106] Figura 5: Anticorpos policlonais de cabra purificados por afinidade contra AT (anti-AT) inibem completamente a atividade de AT em plasma humano fresco tal como medido com trombina. Os anticorpos de cabra purificados por afinidade anti-AT (20 μg em 25 μl) foram adicionados a 25 μl de plasma humano diluído 1 para 10, e incubados durante 15 minutos à temperatura ambiente. 50 μl da mistura foram então incubados com trombina (50 μl) e a atividade residual da trombina foi medida adicionando 50 μl de uma solução do substrato cromogênico Etil-Malonil-S-Pro- Arg-pNA.AcOH (2 mg/ml). As misturas foram então medidas a 405 nm a cada minuto. Os valores de DO são dados no eixo dos YY, o tempo em minutos no eixo dos XX. Várias concentrações de plasma foram testadas para gerar uma curva de dose-resposta. Note-se que 100% do plasma inibe potentemente a atividade da trombina adicionada, e que a adição de anticorpos contra AT (100% de plasma + anti-AT) inibe completamente o efeito do plasma.

[107] Figura 6: Anticorpos policlonais de cabra purificados por afinidade contra AT (anti-AT) inibem completamente a atividade de AT em plasma humano fresco tal como medido com FXa bovino. Os anticorpos de cabra purificados por afinidade anti-AT (6 μg em 7,5 μl) foram adicionados a 7,5 μl de plasma humano fresco diluído 1 para 5, e incubados durante 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, 15 μl com heparina (2,5 U/mL) foram adicionados e as misturas foram incubadas durante 30 min a 37°C. Depois, 75 μl do substrato cromogênico MAPA-Gly-Arg-pNA (8,4 μmol/ml) foram adicionados e a mistura foi incubada durante mais 30 minutos. Finalmente, foi adicionado FXa bovino (75 μl) e a atividade residual de FXa foi medida a 405 nm a cada minuto. Os valores de DO são dados no eixo dos YY, o tempo em minutos no eixo dos XX. Várias concentrações de plasma foram testadas para gerar uma curva de dose-resposta. Note-se que 100% de plasma inibe potentemente a atividade do FXa adicionado, e que a adição de anticorpos contra AT (100% de plasma + anti-AT) inibe de modo dependente da dose o efeito do plasma.

[108] Figura 7: Anticorpos policlonais de cabra purificados por afinidade contra AT reforçam a geração de trombina em plasma humano fresco. Anticorpos de cabra purificados anti-antitrombina III (a-AT) foram adicionados a plasma humano fresco. A mistura foi então incubada com fator tecidular para induzir a ativação do sistema de coagulação. A geração de trombina na mistura foi medida em tempo real com um substrato cromogênico, e expressa como nM por referência com um padrão. Note-se o aumento de mais de 2 vezes na quantidade de trombina gerada após adição da mesma quantidade de TF.

[109] Figura 8: Anticorpos policlonais de cabra purificados por afinidade contra AT reforçam a geração de trombina em plasma deficiente para FVIII. Anticorpos de cabra purificados anti-antitrombina III (anti-AT) foram adicionados à amostra de plasma. A mistura foi então incubada com fator tecidular para induzir a ativação do sistema de coagulação. A trombina na mistura foi medida com um substrato cromogênico. Note-se o aumento de mais de 2 vezes na quantidade de trombina gerada na amostra quando a AT foi completamente inibida (250 μg/ml).

Exemplos Exemplo 1: Inibição da atividade de AT no plasma com anticorpos policlonais contra AT

[110] Como exemplo para mostrar que os anticorpos podem de fato inibir a atividade de AT no plasma humano, anticorpos policlonais foram purificados a partir de soro de uma cabra imunizada com AT humana (Bioconnect, Huissen, Holanda; No. de Catálogo: AHP1750). AT purificada (Kybernin P, CSL-Behringwerke, Marburg, Alemanha; No. de Catálogo: 83167111A) foi acoplada a Sepharose 4B ativada com CNBr (GE Healthcare Life Sciences, Diegem, Bélgica), de acordo com as instruções do fabricante (aproximadamente 25 mg de AT para 1 grama de Sepharose ativada com CNBr). As contas foram lavadas e posteriormente incubadas com 2,5 ml de antissoro de cabra contra AT humana diluída 1 para 2 em solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4 (PBS), durante 2 horas à temperatura ambiente. As contas foram lavadas novamente e em seguida eluídas com glicina 0,1 M, NaCl 0,15, pH 2,5. As contas foram centrifugadas através de centrifugação durante 1 minuto a 1300 g, o sobrenadante foi removido, imediatamente neutralizado com Tris 1 M, pH 8,5, e dialisado contra PBS. A preparação resultante foi analisada em SDS-PAGE quanto à pureza e se verificou consistir em uma banda com Mr de «160000 sob condições não redutoras, e em duas bandas com Mr «50000 e «25000 sob condições redutoras.

[111] Dois ensaios para a atividade de AT funcional foram utilizados para avaliar os efeitos dos anticorpos na AT funcional no plasma. O primeiro ensaio (kit STA ATIII, No. de Catálogo: 12145103140; Roche Diagnostics, Almere, Holanda) é um ensaio cromogênico usando trombina como protease alvo. O princípio desse ensaio é que uma quantidade padrão de trombina é adicionada ao plasma na presença de heparina, o plasma é então verificado quanto à atividade residual de trombina usando o substrato cromogênico Etil-Malonil-S-Pro-Arg-pNA.AcOH (2 mg/ml). Nesse ensaio, são testados 50 μl de amostras de plasma diluídas 1 para 20 (em diluente proporcionado com o ensaio). Para avaliar seus efeitos na função de AT no plasma, 20 μg dos anticorpos anti-AT purificados em 25 μL foram adicionados a 25 μL de plasma normal diluído 1 para 10. A mistura foi então testada no ensaio. Os resultados mostraram claramente que o efeito inibidor do plasma na atividade de trombina foi neutralizado após adição de anticorpos anti-AT purificados (comparar “100% plasma” com “100% plasma + anti-AT” e com “0% plasma” na Figura 5).

[112] Embora a AT seja o principal inibidor da trombina no plasma, outros inibidores no plasma tais como o cofator II de heparina podem também contribuir para a inibição da trombina. Em contraste, FXa é exclusivamente inibido no plasma por AT. Portanto, os resultados com os anticorpos anti-AT foram confirmados em outro ensaio (STA Rotachrom Heparin, No. de Catálogo: 11556959140; Roche Diagnostics), que é similar ao ensaio com trombina descrito acima exceto que o FXa bovino é usado como protease e Etil- Malonil-S-Pro-Arg-pNA.AcOH como substrato cromogênico (a 2 mg/ml). Além disso, são testados 15 μl de amostras de plasma diluído 1 para 10 (em diluente proporcionado com o ensaio). Misturas de 6 μg de anticorpos anti-AT purificados por afinidade em 7,5 μl e 7,5 μl de plasma normal diluído 1 para 5 foram feitas e testada no ensaio. A adição dos anticorpos purificados por afinidade a plasma humano fresco abandonou de forma dependente da dose o efeito inibitório de plasma em FXa (comparar “100% plasma” com “100% plasma + anti-AT” e com “0% plasma” na Figura 6).

[113] Os resultados mostrados nas Figuras 5 e 6 mostram que a inibição completa da atividade de AT no plasma pode ser conseguida com anticorpos policlonais contra AT. Esse efeito dos anticorpos de AT purificados por afinidade foi confirmado em várias outras amostras de plasma: em todas as amostras de plasma testadas foi observada inibição completa da atividade de AT após a adição de anticorpos policlonais purificados por afinidade contra AT.

Exemplo 2: Efeitos de inibidores de AT na geração de trombina em plasma normal e deficiente para FVIII

[114] Num conjunto seguinte de experiências estabelecemos então se a inibição da AT através da adição de anticorpos anti-AT purificados por afinidade poderia afetar a geração de trombina induzida por TF em plasma normal e em plasma de hemofílicos.

[115] A trombina é a enzima chave do sistema de coagulação e a geração de trombina no tempo in vitro após adição de TF ao plasma é considerada um excelente modelo ex vivo para coagulação. A geração de trombina no plasma de hemofílicos a baixas concentrações de TF é gravemente prejudicada e se mostrou que intervenções terapêuticas que se mostrou serem eficazes para parar o sangramento em pacientes hemofílicos, i.e. preparações de FVIII, rFVIIa e do complexo de protrombina ativado tal como FEIBA (J. Astermark et al., Blood 2007; 109: 546-551; H.R. Roberts et al., Blood 2004; 104: 3858-3864), foram todas capazes de restaurar a geração de trombina até certo ponto (K. Varadi et al., J. Thromb. Haemost. 2003; 1: 2374-80; N.M. Aljamali et al., Hemofilia 2009; 15: 1318-26). Por isso, selecionamos esse modelo ex vivo para avaliar os efeitos de inibidores da AT.

[116] O modelo, o ensaio automatizado de trombograma calibrado, foi realizado essencialmente tal como descrito por Hemker et al. (Pathophysiol. Thromb. Haemost. 2002; 32: 249-2) e o manual proporcionado por Thrombinoscope (Maastricht, Holanda). A coagulação foi desencadeada por recalcificação na presença de 1 ou 5 pM de fator tecidular humano recombinante, fosfolípidos procoagulantes 4 μM, e substrato fluorogênico Z-Gly-Gly- Arg-AMC 417 μM. A fluorescência foi monitorada com um fluorímetro (Fluoroscan Ascent, ThermoLabsystems, Helsinque, Finlândia), e o potencial de trombina endógena (ETP) foi calculado usando o software Thrombinoscope® (Thrombinoscope). O “Trombograma” resultante em plasma pobre em plaquetas ou rico em plaquetas mede hipocoagulabilidade tal como hemofilias ou a utilização de anticoagulantes, mas também hipercoagulabilidades tais como deficiência de AT, e assim por diante. Tal como é mostrado na Figura 7, a adição de anticorpos anti-AT purificados induziu uma geração de trombina aumentada no plasma normal consistente com a existência de um estado de hipercoagulabilidade, o que é consistente com a inibição de AT no plasma.

[117] O mesmo experimento foi executado, exceto que foi utilizado plasma deficiente em FVIII em vez de plasma normal reunido. Os pacientes com hemofilia não têm fator VIII (ou fator IX) e mostram muito menos geração de trombina a baixa concentração de TF do que as pessoas saudáveis. Tal como pode ser observado na Figura 8, a geração de trombina, tal como esperado, foi de fato reduzida no plasma de hemofílicos com níveis de pico de aproximadamente 20 nM, e consistente com uma hipocoagulabilidade do plasma. A adição de anticorpos policlonais de cabra purificados por afinidade contra AT reforçou de forma dependente da dose a geração de trombina no plasma deficiente em FVIII. Na maior concentração adicionada (250 μg/ml), foi observado um aumento de quase 2 vezes na geração de trombina. Uma vez que a geração de trombina no plasma é considerada um excelente indicador do potencial de geração de trombina in vivo, esses dados apoiam fortemente que a inibição de AT constitui uma abordagem terapêutica para hemofilia para restaurar o defeito de geração de trombina contornando FVIII.

Claims (9)

1. Uso de um inibidor de antitrombina III caracterizado pelo fato de ser para preparação de um medicamento para tratar e prevenir sangramento: (i) em um indivíduo sofrendo de um distúrbio de sangramento adquirido ou genético (hipocoagulabilidade); ou (ii) em um indivíduo tendo uma condição clínica com a característica de sangramento excessivo, em que o sangramento não é devido ao uso de anticoagulantes; em que o inibidor é um anticorpo que se liga especificamente à antitrombina III; e em que o inibidor, quando adicionado ao plasma reunido de voluntários saudáveis, causa uma redução dos níveis de antitrombina III funcional em pelo menos 20% como medido com um ensaio cromogênico para antitrombina III funcional utilizando o fator Xa ou trombina.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o distúrbio de sangramento é hemofilia.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um hemofílico com anticorpos neutralizantes para o fator VIII ou fator IX.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o inibidor é usado como terapia de bypass profilática de fator VIII ou fator IX.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a condição clínica com a característica de sangramento excessivo é uma ou mais de cirurgia, trauma e sangramento interno.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de anticorpo se liga especificamente a um epítopo na sequência de RSL de antitrombina III.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de anticorpo prejudica a inserção da RSL na folha β central da antibrombina III.

8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o epítopo na seqüência de RSL da antitrombina III compreende um ou mais resíduos de RSL P1-P14.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o epítopo compreende resíduos de RSL em torno de P10, resíduos de RSL P5-P10 ou resíduos de RSL P3-P8.

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