CN103930129A

CN103930129A - 用于促进凝血的化合物

Info

Publication number: CN103930129A
Application number: CN201280052327.2A
Authority: CN
Inventors: C·E·哈克; C·伊尔迪兹
Original assignee: UMC Utrecht Holding BV
Current assignee: UMC Utrecht Holding BV
Priority date: 2011-08-25
Filing date: 2012-08-24
Publication date: 2014-07-16
Also published as: EP2747776A2; JP6198277B2; WO2013028070A2; CA2846494A1; EP2747776B1; DK2747776T3; HUE039590T2; JP2014529606A; CA2846494C; ES2689776T3; BR112014004297A2; BR112014004297B1; PL2747776T3; AU2012299524A1; CY1120688T1; PT2747776T; US20140356377A1; WO2013028070A3; JP2017186340A; AU2012299524B2

Abstract

本发明涉及抗凝血酶III的抑制剂及其用于治疗或预防出血中的医学用途。所述抑制剂优选地用于患有获得性或遗传性出血障碍例如血友病的受试者，或具有特征为过量出血的临床病症例如外科手术、创伤和内出血的受试者。所述抗凝血酶III的抑制剂可为例如特异性结合并抑制抗凝血酶III的肽、适体或者抗体或抗体片段。

Description

用于促进凝血的化合物

技术领域

本发明涉及医药领域，具体地，本发明涉及凝血因子、其抑制剂以及它们用于止血的用途。更具体地，本发明公开了促进凝血酶活性以刺激血液凝固的方法。本发明可用于治疗或预防过量出血，例如由于出血障碍如血友病，或由于外科手术、创伤，或由于使用抗凝血药，或由于停止内出血而引起的过量出血。

背景技术

血凝固(凝血)是一个精密的过程，其应在血管损伤的情况下立即开启，而当血管完整时关闭。当该过程被错误地调控时就会导致病状：当凝血开启太晚或太弱时就会出现出血障碍或广泛性出血，当凝血开启太早或太强时接着就会发生血栓性疾病。本发明公开了一种新的刺激凝血的方法，因此可用于特征为(过量)出血的疾病或临床病症。这些病症包括A或B型血友病、外科手术或创伤引起的出血，以及内出血例如出血性中风和胃肠道出血，或使用抗凝血药(例如华法林或肝素)引起的出血。

血凝固包括体液应答和细胞应答。前者(体液应答)导致可溶性纤维蛋白原转化成不溶性纤维蛋白，后者(细胞应答)导致形成血小板栓子。两种应答相互掺杂。例如，在体液应答过程中形成的凝血酶是有力的血小板活化剂，而活化的血小板的膜用于组装凝血因子复合体，其是有效凝血过程的关键。活化的血小板栓子、纤维蛋白丝(thread)以及内含的红细胞和白细胞共同组成血凝块。本专利涉及新的促进凝血的体液应答的方法。因此首先论述体液凝血应答。

体液凝血应答是由一系列的蛋白质——所述凝血因子介导，所述凝血因子作为无活性的辅因子和酶原循环。这些因子共同组成凝血系统。凝血作用的活化包括由以下组成的过程，即以级联样的方式相继活化无活性的酶原和辅因子。在每个步骤中，新形成的凝血蛋白酶会催化下一个因子的活化。一旦血液与膜蛋白组织因子(TF)接触就起始活化，所述膜蛋白组织因子通常情况下不由内皮细胞表达，但其在内皮下细胞(sub-endothelial cell)例如平滑肌细胞中大量存在。因此，破坏内皮细胞层会使血液与该组成型表达的TF接触，从而触发凝血。在凝血系统的活化过程中，形成了若干酶-辅因子复合体，其在细胞(具体是内皮细胞和活化的血小板)膜上组装。TF和活化的因子VII的复合体(TF-FVIIa)即在这些酶-辅因子复合体中，其中FVIIa具有蛋白水解活性，能够使因子Ⅹ和IX(FX和FIX)活化。活化的FX(FXa)与活化的因子V(FVa)组装以形成凝血酶原酶复合体，所述凝血酶原酶复合体又使凝血酶原活化成为有活性的蛋白酶凝血酶。TF-FVIIa还可将因子IX转化为FIXa，FIXa与活化的因子VIII(FVIIIa)组装以生成FVIIIa-FXIa复合体。该复合体中有活性的蛋白酶是FIXa，FIXa正如FVIIa一样能够活化FX。

一旦与恰当的刺激物例如TF接触，就通过TF-FVIIa复合体起始凝血系统的活化，并且通过FVIIIa-FIXa复合体的作用加以传播，并且通过FXI的活化加以放大(参见图1)。

在生理条件下，大多数止血反应需要这种FIX-和FVIII-依赖的放大，以确保充足的FX活化(并因此生成凝血酶)。这种对于FVIII和IX的需求是通过以下蛋白的遗传缺陷的临床表现来明显地证明：A或B型血友病，其是严重的出血障碍，并分别由FVIII或FIX的缺乏导致。

血友病是伴X染色体的先天性出血障碍，通常由凝血FVIII(A型血友病)或FIX(B型血友病)的缺乏引起(Mannucci et al.,N Engl J Med2001；344:1773-1779)。该疾病的频率是约1/10,000男性新生儿。A型血友病的患病率是B型血友病的约5-6倍，其也是伴X染色体遗传缺陷。根据出血现象的严重程度，临床上将血友病分为轻、中和重度血友病。患有重度血友病的人常常有以下病史：幼童时期容易擦伤、自发出血(特别是流入关节和软组织中)以及创伤或外科手术后过量出血。患有轻度血友病的患者几乎不发生自发出血发作，主要有由创伤或外科手术引起的过量出血。适当的凝血试验会确认诊断并揭示患者是否患有A或B型血友病。重度A型血友病的特征为非常低的功能性FVIII水平或不存在功能性FVIII(<正常的1％)，而轻度血友病的情形中功能性FVIII的水平是正常的5-15％。

用于血友病患者的按需疗法和预防性疗法通常包括补充疗法(replacement therapy)，补充疗法是基于用所缺乏的凝血因子来补充患者的缺陷性凝血系统。因此，分别将FVIII和FIX浓缩物输注到A和B型血友病患者体内，以治疗或预防出血发作。然而，使用所述缺乏因子的制剂治疗的血友病患者具有产生针对所述缺失因子的中和抗体(抑制剂)的风险。所述缺失的凝血因子对于这些患者来说不是内源性的，因此他们的免疫系统没有对其产生耐受。在15-30％的重度A型血友病患者(Goudemond et al.,Blood2006；107:46-51；Gouw et al.,Blood.2007；109:4693-4697)和1-3％的B型血友病患者中形成了中和抗体。具体地，具有可导致FVIII血浆水平低于正常的1％的严重基因缺陷(例如基因缺失或倒位、无义突变和移码突变)的患者，可能产生抑制剂，因为他们的免疫系统没有对FVIII产生耐受。当抑制剂的循环水平高时，患者需要非常高的量的所述缺乏因子以克服所述抑制剂的中和效应。这种高剂量的FVIII疗法是非常昂贵的。作为一种替代方案，开发了FVIII旁路疗法。这些治疗的基础原理是通过使用活化形式的FVII、IX和Ⅹ来绕过(bypass)FVIII/FIX复合体的缺陷。这种FVIII旁路疗法的实例是活化的凝血酶原复合体的浓缩物和重组FVIIa(J Astermark et al.,Blood.2007；109:546-551；HR Roberts et al.,Blood2004；104:3858-3864；WK Hoots,Blood2007；109:395-396)。这些FVIII旁路疗法的缺点是其只适用于按需疗法。

唯一得到批准的重组FVIII旁路疗法是重组FVIIa(rFVIIa；NovoNordisk,Copenhagen,Denmark)。rFVIIa通过直接地结合或在与组织因子的复合体中结合在活化的血小板表面上暴露的荷负电磷脂来刺激止血，从而将FX的活化靶向到损伤位点。或者，其效应可归因于FVIIa与FVII比率的增加。rFVIIa在70-75％的具有抑制剂的患者中终止出血。使用rFVIIa或活化的凝血酶原复合体的FVIII旁路疗法的局限在于其是昂贵的，并且由于其2-3小时的短半衰期而不适于作为预防性疗法。然而，血友病的预防性治疗可以预防血友病性关节病以及改善生活质量(Manco-Johnson et al.,N Engl J Med2007；；357:535-44)。因此，针对使用FVIII抑制剂对血友病患者的预防性FVIII旁路治疗的医疗需求未得到满足。本发明的目的就是提供这样的疗法。

一些其他临床病症伴有过量或不必要的出血，例如外科手术引起的出血、由战争或交通事故引起的出血、内出血例如出血性中风和胃肠道出血，以及与使用抗凝血剂(例如华法林)相关的出血。可使用局部施用的止血剂(例如纤维蛋白密封剂)或使用全身性给予的rFVIIa来治疗这些病症。然而，使用rFVIIa治疗这些病症具有触发血栓栓塞过程(导致严重的副作用)的风险(O’Connel et al.,JAMA.2006；295:293-298；Levi et al.,N Engl J Med2010；363:1791-1800)。这种血栓栓塞风险可能与rFVIIa是有活性的凝血蛋白酶相关。因此，向循环系统中输注rFVIIa导致有活性的凝血蛋白酶存在于循环系统中的各处。另外，由于缺乏监测rFVIIa的药效的简单测定法，因此难以滴定rFVIIa。

本发明的目标是提供新的用于治疗和预防由外科手术、事故和其他病症引起的过量出血的化合物和方法。与使用rFVIIa的疗法相比，本发明的新的化合物和方法可用作预防性疗法以及按需疗法，并且可使用简单且方便的临床测定法(bedside assay)来滴定和监测其治疗所需剂量。

发明内容

本发明提供了治疗和预防过量出血的方法，包括将抗凝血酶III(AT)的抑制剂给予出血患者或具有出血风险的患者，以降低功能性AT的水平。这是令人吃惊的新方法，因为尚未提出将AT抑制剂作为治疗或预防患者中的出血的治疗方法。本发明可用于其中发生过量出血的血友病、外科手术、创伤或其他病症，例如使用抗凝血剂，也可用于内出血(例如出血性中风或胃肠道出血，例如由血管曲张引起的食道出血)的情形中。本发明公开的方法还可用于预防具有出血风险的患者中的出血，例如在血友病患者中用于预防血友病患者中关节、肌肉和/或软组织出血。可通过使用AT抑制剂的治疗来在这类患者中预防出血。

在某些实施方案中，所述AT抑制剂为在人或动物中与AT结合并抑制AT的功能或增加AT清除率的分子。在本发明的其他实施方案中，该结合性分子是肽、蛋白质或者抗体或抗体片段。并且其他与AT结合并抑制其功能的分子例如化学化合物，也在本发明的范围内。

在本发明的某些实施方案中，所述AT抑制剂是与AT结合并抑制AT活性的人的、人源化的或来自动物种的单克隆抗体或其片段。

在本发明的其他实施方案中，所述AT抑制剂是与AT结合并降低人或动物中AT水平的人的、人源化的或来自动物种的单克隆抗体或其片段。

在本发明的其他实施方案中，所述抑制剂是抑制AT活性的多克隆抗体或其片段。

在本发明的其他实施方案中，所述AT抑制剂是与AT结合并降低人或动物中AT水平的人的、人源化的或来自动物种的多克隆抗体或其片段。

在本发明的其他实施方案中，所述AT抑制剂是与AT结合并抑制AT活性的非抗体分子例如适体、蛋白质、肽或化学化合物。

在本发明的其他实施方案中，所述AT抑制剂是与AT结合并降低人或动物中AT水平的非抗体分子例如适体、蛋白质、肽或化学化合物。

在本发明的一些实施方案中，所述AT抑制剂结合并阻断AT上的位点，所述位点参与AT与其靶蛋白酶相互作用。在本发明的其他实施方案中，所述AT抑制剂结合AT上的位点从而防止由肝素或其他糖胺聚糖引起的AT功能性活性增加。

在本发明的一个优选实施方案中，所述AT抑制剂防止AT的反应位点环插入AT的中央β-折叠中，这导致AT的靶蛋白酶使AT发生蛋白水解性失活。

在本发明的另一实施方案中，给予所述AT抑制剂以治疗或预防具有FVIII缺陷的血友病患者中的出血，所述患者可能具有或不具有抗FVIII的中和抗体。在其他实施方案中，所述血友病患者缺乏FIX活性，并可能具有或不具有抗FIX的中和抗体。

在本发明的另一实施方案中，给予所述AT抑制剂以治疗或预防具有FXI缺陷的血友病患者中的出血。在其他实施方案中，给予AT抑制剂以治疗或预防具有凝血因子缺陷而非FVIII、FIX或FXI缺陷的患者中的出血。

本发明还提供了用于降低或防止在A型血友病患者中生成针对FVIII的抑制剂的可能性的方法，包括给予AT抑制剂，从而降低对FVIII的需求。本发明还提供了用于降低或防止在B型血友病患者中生成针对FIX的抑制剂的可能性的方法，包括将AT抑制剂给予所述患者。

本发明还提供了治疗或预防非血友病患者中的出血的方法，包括将AT抑制剂给予患有(过量)出血的患者。因此，在一个实施方案中，本发明涉及AT的抑制剂，其用于预防或治疗特征为过量出血的临床病症例如外科手术、创伤和内出血。

根据上文所述的本发明的实施方案，将止血量的AT抑制剂给予所述患者。所述量优选地为有效止血量。

在某些实施方案中，待给予至血友病患者的AT抑制剂的剂量是一体外测定法计算，所述体外测定法可用于确定可补偿所述血浆中缺乏的凝血因子的所述AT抑制剂的浓度，包括：a)将一定浓度的组织因子与Ca2+的稀释液加入到血友病患者的血浆中，其中凝血时间取决于所述血浆中缺乏的凝血因子(例如FVIII或FIX)的加入；b)在不存在所述凝血因子的情况下，测量血友病患者血浆中的纤维蛋白生成或凝血酶生成；c)在存在所缺乏的凝血因子的情况下(加入所述缺乏的凝血因子以达到0.01-1U/ml浓度，其中1U/ml是混合的正常人血浆中存在的因子的量)，测量血友病患者血浆中的纤维蛋白生成或凝血酶生成；和d)在不存在所述凝血因子但存在不同浓度的AT抑制剂的情况下，测量血友病患者血浆中的纤维蛋白生成或凝血酶生成(以及AT水平)。通过将不同AT抑制剂水平下的凝血酶生成和纤维蛋白形成与在所述缺陷的因子的不同水平下观察到的那些进行比较，可以评估通过给予AT抑制剂达到的所需的功能性AT的水平。

在另一实施方案中，待给予至血友病患者(该患者具有抑制剂)的AT抑制剂的剂量是以体外测定法计算，所述体外测定法可用于确定可补偿所述血浆中缺乏的凝血因子的所述AT抑制剂的浓度，包括：a)将一定浓度的组织因子与Ca²⁺的稀释液加入到血友病患者(该患者具有FVIII或IX的抑制剂)的血浆中，其中凝血时间取决于血友病患者血浆(其中具有抑制剂)中凝血因子(例如FVIII或FIX)的加入；b)测量血友病患者血浆(其中具有抑制剂)中的纤维蛋白生成或凝血酶生成；和c)测量混合的正常血浆中的纤维蛋白生成或凝血酶生成。可选择使凝血酶生成和纤维蛋白形成正常化的AT抑制剂的剂量作为体内给药的目标水平。然后通过将AT抑制剂给予所述患者同时测量循环系统中的功能性AT水平，来监测待在体内使用的AT抑制剂的剂量。

在另一实施方案中，本发明提供了一种方法，所述方法用于评估AT抑制剂刺激血浆中的纤维蛋白形成和凝血酶生成以及活性的能力，所述血浆来自非血友病患者，该患者的出血是由于外科手术、创伤、使用抗凝血药或由于另外的原因，所述方法包括：a)向所述患者的血浆提供组织因子的稀释液；b)测量所述血浆中的纤维蛋白生成或凝血酶生成；c)在导致AT活性降低至0-1U/ml(分别为正常的0-100％)的AT抑制剂剂量的存在下，测量纤维蛋白生成或凝血酶生成；和d)在不存在或存在AT抑制剂的情况下，测量所述血浆中的纤维蛋白生成或凝血酶生成，以确定AT抑制剂增加所述血浆中的纤维蛋白形成或凝血酶生成的能力。

在另一实施方案中，通过将AT抑制剂给予所述患者同时测量循环系统中的功能性AT水平，来监测待在体内使用的AT抑制剂的剂量。

在一个方面，本发明提供了治疗出血患者或具有出血风险的患者的方法，包括给予所述患者AT抑制剂，以获得低于正常的80％的功能性AT的血浆浓度，优选为20-80％，优选为正常的20-60％，更优选为正常的40-60％，更优选为正常的约50％。因此，优选地，以一定量给予所述抑制剂，所述量能够使AT的功能活性降低至正常AT水平的至少90、80、50、20、10、5、1、0.5、0.2、0.1％，其中所述正常AT在本文中优选地应理解为健康志愿者的混合血浆中的水平。

在某些实施方案中，本发明提供了通过给予发生出血的非血友病患者AT抑制剂，以使功能性AT的血浆浓度低于正常的80％，优选为20-80％，优选为正常的20-60％，更优选为正常的40-60％，更优选为正常的约50％，来治疗所述患者的方法。在某些实施方案中，使用针对功能性AT的血浆水平的测定法来监测所给予的AT抑制剂的剂量。

在另一方面，本发明提供了治疗具有FVIII缺陷的患者的方法，该方法包括将亚最佳止血水平的FVIII和AT抑制剂一起给予所述患者，以获得所述混合物的有效止血量。在某些实施方案中，将FVIII与AT抑制剂一起以低至足以不会在所述患者中引起对FVIII的免疫应答的水平给药。

附图说明

图1：凝血的简化方案。活化作用从血液暴露于组织因子(TF)开始，组织因子与血浆FVII(a)形成复合体。TF/FVIIa复合体使FX活化为FXa，随后FXa与FV形成复合体。FXa/FVa复合体将酶原凝血酶原转化成凝血酶，凝血酶是凝血作用的核心酶。可认为该途径是凝血作用的基础途径。该基础途径是通过两种途径进行放大，一种由FIX和FVIII组成，另一种由FXI组成。TF/FVIIa复合体激活FIX/FVIII途径，其将FIX活化为FIXa。FIXa/FVIIIa复合体中的FIXa具有蛋白水解活性，可将FX活化为FXa。另一放大环路是由FXI组成，FXI在被凝血酶激活后，还可激活FIX。图中未描述各种凝血抑制剂，包括AT和磷脂辅因子。

图2：丝氨酸蛋白酶抑制剂A1的结构(蛋白质数据库(PDB)编码1QLP；PR Elliott et al.,Nat.Struct Biol1996；3:676-681)。反应中心环(RCL)在所述分子上方。虚线箭头指示中央β-折叠中的“沟(groove)”，所述反应中心环插入所述沟中。

图3：丝氨酸蛋白酶抑制剂对蛋白酶的抑制作用的结构机制。示出的结构为SERPINA1蛋白质数据库(PDB)编码1QLP的结构。途径b—>c：蛋白酶与丝氨酸蛋白酶抑制剂的相互作用产生稳定的共价复合体，该复合体中所述蛋白酶的活性位点丝氨酸与丝氨酸蛋白酶抑制剂的反应位点环(＝反应中心环，RCL)的P1-残基连接。结果所述蛋白酶在分子的底部扭曲变形并失活。途径b—>d：丝氨酸蛋白酶抑制剂-蛋白酶复合体解离，然后完成RSL插入到中央β-折叠，并诱导丝氨酸蛋白酶的活性位点发生构象变化。结果释放所述活性蛋白酶，并留下具有稳定构象的无活性的丝氨酸蛋白酶抑制剂。在这种情形中，丝氨酸蛋白酶抑制剂表现为逃脱了构象陷阱(conformational trap)的所述蛋白酶的底物。参考文献：PR Elliott et al.,Nat.Struct Biol1996；3:676-681；ADementiev et al.,J Biol Chem2003；278:37881-37887；JA Huntington etal.,Nature2000；407:923-926；H Loebermann et al.,J.Mol.Biol.1984；177:531-557。

图4：描绘一些AT抑制剂的机制的插图。示出了插入AT的中央β-折叠中的肽或者防止RSL插入中央β-折叠的单克隆抗体(mAb)的效应。插图的左侧部分示出了正常的情形：靶蛋白酶将RSL切割后，切割的RSL(残基P1-P14)插入中央β-折叠中从而使所述蛋白酶的活性位点的3D结构变形，使其失活。在右侧，模拟RSL的P1-P14序列的肽插入中央β-折叠中，从而防止AT的RSL插入。作为替代的AT抑制剂，与RSL的P4-P14序列结合的mAb，防止RSL插入中央β-折叠中，使AT成为其靶蛋白酶的底物。

图5：当使用凝血酶进行测量时，亲和纯化的抗AT的山羊多克隆抗体(抗-AT)完全抑制了新鲜的人血浆中的AT的活性。将亲和纯化的山羊抗-AT的抗体(20μg溶于25μl中)加入到25μl的1-10稀释的新鲜人血浆中，并在室温下孵育15分钟。然后将50μl所述混合物与凝血酶(50μl)进行孵育，并通过加入50μl显色底物乙基-丙二酰基-S-脯氨酸-精氨酸-pNA.乙酸(Ethyl-Malonyl-S-Pro-Arg-pNA.AcOH)的溶液(2mg/ml)来测量残留的凝血酶活性。然后每分钟在405nm下对所述混合物进行测量。在Y轴上给出OD值，在X轴上给出以分钟计的时间。测试不同浓度的血浆以生成剂量-反应曲线。值得注意的是，100％血浆有力地抑制了添加的凝血酶的活性，并且加入针对AT的抗体(100％血浆+抗-AT)完全抑制了血浆的这种效应。

图6：当使用牛FXa进行测量时，亲和纯化的抗AT的山羊多克隆抗体(抗-AT)完全抑制了新鲜人血浆中的AT的活性。将亲和纯化的山羊抗-AT抗体(6μg溶于7.5μl中)加入到7.5μl的1-5稀释的新鲜人血浆中，室温下孵育15分钟。然后加入含有肝素(2.5U/ml)的15μl溶液，并将所述混合物在37℃下孵育30min。然后加入75μl的显色底物MAPA-甘氨酸-精氨酸-pNA(MAPA-Gly-Arg-pNA)(8.4μmol/ml)，将所述混合物再次孵育30分钟。最后，加入牛FXa(75μl)，每分钟在405nm下对残留的FXa活性进行测量。在Y轴上给出OD值，在X轴上给出以分钟计的时间。测试不同浓度的血浆以生成剂量-反应曲线。值得注意的是，100％血浆有力地抑制了加入的FXa的活性，并且加入针对AT的抗体(100％血浆+抗-AT)以剂量依赖的方式抑制了血浆的这种效应。

图7：亲和纯化的抗AT的山羊多克隆抗体促进新鲜人血浆中的凝血酶生成。将纯化的山羊抗-凝血酶III的抗体(抗-AT)加入到新鲜的人血浆中。然后将所述混合物与组织因子一起孵育，以诱导凝血系统的激活。使用显色底物实时测量所述混合物中的凝血酶生成，并参考标准表示为nM。值得注意的是，在加入所述相同量的TF之后，生成的凝血酶的量有2倍以上的增加。

图8：亲和纯化的抗AT的山羊多克隆抗体促进FVIII缺陷的血浆中的凝血酶生成。将纯化的山羊抗-凝血酶III的抗体(抗-AT)加入到所述血浆样品中。然后将所述混合物与因子组织因子进行孵育，以诱导凝血系统的激活。使用显色底物测量所述混合物中的凝血酶。值得注意的是，当AT被完全抑制时(250μg/ml)，所述样品中生成的凝血酶的量有2倍以上的增加。

具体实施方式

体内凝血的过度活化是由若干抑制剂调节的。主要的抑制剂是抗凝血酶III(AT)，其属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine proteinase inhibitor或serpin)蛋白质家族。直到现在也无人证明或提出对AT进行抑制可作为用于促进凝血的治疗方法。本发明公开了以下预料不到的发现：对AT进行抑制可作为用于患有血友病或其他出血障碍的患者的治疗选择。通过将AT的抑制剂(例如抑制性抗体)给予患有出血或具有出血风险的患者，使AT水平降低，使得能够产生更多的凝血酶并延长凝血酶的活性，这导致产生更多的纤维蛋白并更有效地形成血凝固。

本发明的原理

AT抑制几种凝血蛋白酶，特别是凝血酶和FXa，以及FVIIa、FIXa和FXIa。据估计，体内产生的凝血酶量的约80％被AT中和。功能性AT水平的降低(例如由基因杂合缺陷引起)，导致对凝血酶、FXa、FIXa、FXIa和FVIIa的抑制作用减弱，从而导致产生更多的纤维蛋白。值得注意的是，在AT水平降低的情况下，不仅凝血酶活性的半衰期延长了，而且有更多的凝血酶分子产生，这是因为FXa的半衰期也延长了，FXa是能够从凝血酶原产生凝血酶的凝血蛋白酶。延长的FXA活性使得每个FXa分子能够使更大数量的凝血酶原分子转化为凝血酶。因此，降低AT水平的促凝血效应，是由于凝血酶的半衰期延长并且产生的凝血酶的量增加。这与所有其他形式的FVIII旁路疗法(例如使用rFVIIa的疗法)不同，所述其他形式的FVIII旁路疗法仅增加凝血酶的产生，而对凝血素的半衰期没有影响。在患有出血或具有出血风险的患者中对AT进行抑制，构成了新的尚未在文献中记载的治疗原理。

血友病的主要缺陷是不存在经由FVIII/FIX环路的凝血酶生成的放大(参见图1)。然而，在不存在FVIII/FIX环路的情况下也产生一些凝血酶，因为由FVIIa/TF复合体直接激活FX的途径是完整的。血浆中，凝血酶被AT抑制了60-90％。此外，FXa和FIXa的活性也受到AT的抑制。本发明的一个实施方案是给予治疗有效剂量的AT抑制剂，以减少AT对FXa和凝血酶的抑制。结果，这两种蛋白酶的半衰期都有所延长，导致每分子FXa使更大数量的凝血酶原分子转化为凝血酶，并且每个凝血酶分子使更大数量的纤维蛋白原分子转化为纤维蛋白。因此，通过降低AT的功能性水平，产生了更多的凝血酶，并且延长了凝血酶活性的半衰期。这补偿了在血友病中由于FVIII/FIX环路的功能缺陷而发生的凝血酶产生减少的状况。值得注意的是，AT抑制产生的这种双重效应——增加了产生的凝血酶分子的数量并且延长了凝血酶的活性，是所述AT抑制的理念所独有的，并且是任何其他FVIII旁路过程所不具有的。在原理上，这使得AT抑制成为最有效的FVIII旁路方法。

对AT进行抑制本身不是激活凝血的诱因，因为活化需要有活性的蛋白酶。TF与FVII(a)的相互作用以及后续的FIX和FX的活化使得在TF表达的位点产生了有活性的蛋白酶(参见图1)。因此，虽然在AT抑制剂的存在下，由于功能性AT的水平更低而更容易发生凝血，但是该血块形成主要(如果不是全部)局限在身体中TF暴露于血液的位置，例如在损伤的血管壁中。这与使用重组FVIIa的治疗不同，所述重组FVIIa作为有活性的蛋白酶被给予，并且在整个循环系统中都可获得。

本发明的方面

因此，在第一个方面，本发明涉及AT的抑制剂，用作药剂。所述抑制剂优选地为如下文所定义的AT的抑制剂。

在第二个方面，本发明涉及AT的抑制剂，用于治疗和预防受试者中的出血，所述受试者患有获得性或遗传性出血障碍(凝血功能降低)或具有特征为过量出血的临床症状。或者在这个方面，本发明涉及AT的抑制剂用于制造治疗和预防受试者中的出血的药剂的用途，所述受试者患有获得性或遗传性出血障碍(凝血功能降低)或具有特征为过量出血的临床症状。在这个方面，所述AT的抑制剂优选地为如下文所定义的抑制剂。同样地，所述对患有获得性或遗传性出血障碍(凝血功能降低)的受试者或具有特征为过量出血的临床症状的受试者中出血的治疗和预防优选地如下文所定义。

在又一方面，本发明涉及治疗或减少受试者中的出血风险的方法，所述受试者患有获得性或遗传性出血障碍(凝血功能降低)或具有特征为过量出血的临床症状，所述方法包括给予所述受试者有效量的AT的抑制剂的步骤。所述AT的抑制剂优选地为如下文所定义的抑制剂。同样地，所述获得性或遗传性出血障碍(凝血功能降低)和所述特征为过量出血的临床症状优选地为如下文所定义。

在另一方面，本发明涉及用于鉴定作为如下文所定义的AT抑制剂的化合物的方法。

抗凝血酶III(AT)的抑制剂

抗凝血酶III(AT)是58kDa的糖蛋白，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)的蛋白质家族。其成熟蛋白质由432个氨基酸组成，具有4个糖基化位点。AT是在肝脏中的实质细胞中产生的。其血浆浓度为约0.1–0.15mg/ml或3.5μM。AT从循环系统消失的表观半衰期为2-3天。抗原水平和活性水平表示为正常水平的百分比或表示为U/ml，1U为混合的人血浆中的量。AT是以α形式和β形式表达的。α-AT代表了90％的AT，并且在全部四个位置上都发生糖基化。β-AT仅占AT的10％，对肝素具有更高的亲和性，在一个位置(N135)未发生糖基化，并且整体上发挥比α-AT更大的抗凝效应。

AT是凝血途径的最重要的生理抑制剂。如其名字所暗示，AT抑制凝血酶。此外，AT能够抑制所有其他的蛋白水解性凝血因子(例如FIXa、FXa和FXIa)。然而，其主要的抗凝血活性归因于对FXa、FIXa和凝血酶的调节。据估计，在体内AT提供了针对凝血酶的抑制效应的50-80％或最高达80％。

糖胺聚糖例如肝素和硫酸乙酰肝素能加强AT的作用，其能够使AT的功能性活性增加2-3个log。肝素包括带有很多硫酸化二糖的蛋白质骨架。粗制品含有分子量范围为3-40kDa的肝素分子。肝素中唯一的戊多糖序列负责与AT的高亲和性结合。在体内，内皮上的硫酸乙酰肝素(heparan sulphate)以及从内皮相关的肥大细胞颗粒中释放的肝素可能是AT的辅因子的主要来源。

肝素使用两种不同的机制来加速AT的蛋白酶抑制作用。一种机制是其使得所述反应位点环(RSL；在图2中该环被称为反应中心环(RCL)，参见图2)更容易接近靶蛋白酶，该机制有助于对FIXa和FXa的抑制活性增强。另一种机制是肝素为AT和其靶蛋白酶(特别是凝血酶)提供了模板。已经证明，除了其抗凝血活性之外，AT还具有抗炎和抗血管生成功能。本文中不论述这些。

已经在具有完全AT缺陷的敲除小鼠中证明了AT的生理重要性。这些小鼠在子宫中死于血栓症(thrombosis)和出血(Ishiguro et al.,JClin Invest.2000；106:873–878)。在人中AT的完全缺陷也被推测具有致死效应，因为在人中尚未记载完全的AT缺陷，然而杂合缺陷的发生频率为1:2,000-1:5,000。有杂合AT缺陷的人患血栓栓塞疾病的风险增加(PS McLean et al.,Drugs2007；67:1429-1440)。

已经在具有纯化蛋白质(正常的血浆浓度)的系统中研究了AT对凝血蛋白酶的抑制效应(van‘t Veer et al.,J Biol Chem.1997；272:4367–4377)。当反应以FVIIa/TF起始时，正常水平的AT的存在不会影响凝血酶生成的起始阶段，AT也不会影响FV活化。在AT的存在下凝血酶形成的速率下降至不受抑制的反应时的30％，而在其生成之后所形成的凝血酶的量也迅速随之减少(quence)。本发明公开了降低AT水平可用作治疗患有严重出血或有严重出血风险的患者的治疗原则。

AT属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)的蛋白质超家族，其广泛见于自然中，例如在动物、植物、细菌和病毒中(参见综述：Ruby HP Lawet al.,Genome Biology2006；7:216.1-216.11)。大多数丝氨酸蛋白酶抑制剂具有熟知的的名称，所述名称主要涉及使得它们被发现的功能。虽然对于一些丝氨酸蛋白酶抑制剂例如AT来说，惯例的名称或多或少涵盖了它们的主要生物学功能，但是对于一些其他丝氨酸蛋白酶抑制剂来说，它们的惯例名称在这方面会令人产生误解。例如，α1-抗胰蛋白酶和α1-抗胰凝乳蛋白酶是由于它们能够分别抑制消化酶胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶而被发现，但是它们在体内的主要功能是分别抑制嗜中性蛋白酶、弹性蛋白酶和蛋白酶3，以及组织蛋白酶G。丝氨酸蛋白酶抑制剂被分类到16个进化枝(A-P)中。每种丝氨酸蛋白酶抑制剂的系统名称为SERPINXy，其中X是进化枝，y是所述进化枝中的编号。根据该分类法，AT为serpinC1。人具有编码36种丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因。大多数丝氨酸蛋白酶抑制剂用作蛋白酶抑制剂，但是一些具有不同功能。

丝氨酸蛋白酶抑制剂的基本结构由约400个氨基酸组成，一些具有大的N末端、C末端或内部插入环。大多数丝氨酸蛋白酶抑制剂具有翻译后修饰(例如糖基化、硫酸化、磷酸化和氧化)以改变其功能。丝氨酸蛋白酶抑制剂共享高度保守的3-D结构，该结构包括由9个α-螺旋(A-I)的束和由3个β-折叠(A-C)组成的β-三明治(参见图2)。丝氨酸蛋白酶抑制剂的另一种典型特征是反应位点环(RSL)，RSL从所述蛋白质的本体凸出，然后作为一种诱饵被呈递给蛋白酶。RSL通常由从N末端的P17至C末端的P3’的20个氨基酸组成(根据该命名法P1-P1’构成可被蛋白酶切割的易断裂的键)。在丝氨酸蛋白酶抑制剂的正常天然状态中，β-折叠A或中央β-折叠由5条链组成，并暴露出RSL(将链5A的C末端桥连到链1C的N末端)。值得注意的是，该构象的热动力学稳定性不是最佳的，将RSL纳入中央β-折叠可产生更稳定的构象。在(非靶)蛋白酶对RSL进行蛋白水解性切割(在这种情形中，从丝氨酸蛋白酶抑制剂释放所述蛋白酶，然后完成RSL插入所述中央β-折叠的过程)时，或者在与靶蛋白酶形成复合体的过程中(在这种情形中，在插入完成时所述蛋白酶仍与P1位置的氨基酸残基共价结合)，达到所述稳定构象。该插入过程的结果是活性位点丝氨酸被从其在所述蛋白酶的活性位点中的位置轻微地拉出，从而防止所述蛋白酶被从P1残基释放。在后一种情形中，留下了构象变化的丝氨酸蛋白酶抑制剂和其靶蛋白酶之间的共价连接的复合体。

丝氨酸蛋白酶抑制剂与靶蛋白酶的相互作用是化学计量的。反应可描述为：

P+S←→PS→PS*→P+S*

P＝蛋白酶；S＝丝氨酸蛋白酶抑制剂；S*＝具有变化且稳定的构象的丝氨酸蛋白酶抑制剂

一旦蛋白酶将RSL(图3中的RCL)的序列识别为底物，就形成可逆的复合体(也被称为Michaelis复合体)，丝氨酸蛋白酶抑制剂在该复合体中仍为天然(S)构象。下一个阶段中，所述蛋白酶开始切割P1-位置和P1’-位置上的氨基酸残基之间的肽键(在非靶蛋白酶的情形中，RSL中的其他肽键也可被切割)，并且RSL的N末端部分插入丝氨酸蛋白酶抑制剂的中央β-折叠中，因为这产生其最低能量的构象。完成插入时，在所述蛋白酶被从P1释放之前，所述蛋白酶的活性位点立即变形，中断了所述蛋白酶的蛋白水解反应(图3中的构象c)。

这产生稳定的复合体，其中蛋白酶的活性位点被丝氨酸蛋白酶抑制剂的RSL共价捕获，并且其中丝氨酸蛋白酶抑制剂已经采用稳定构象(S*)。当所述插入尚未完成且蛋白酶已经完成其水解反应时，所述蛋白酶作为活性的酶和失活的丝氨酸蛋白酶抑制剂(其中切割的RSL被插入中央β-折叠中)(图3中的构象d)被释放。当专性(obligae)的RSL-活性位点接触明显有助于形成Michaelis复合体时，也涉及所述分子的其他位点。

在AT的情形中，丝氨酸蛋白酶抑制剂与蛋白酶凝血酶、FXa和FIXa(在某种程度上也有FXIa和FXIIa)之间可形成共价复合体。对这些蛋白酶的抑制效率可用动力学常数特别是二级速率常数描述。表1中给出了这些常数。

表1：AT对若干靶蛋白酶的抑制常数和糖胺聚糖对这些的影响(后：Rau et al.,J.Thromb.Haemost2007；5(Suppl.1):102-115)

靶蛋白酶	辅因子	二级速率k₂(M^-1s^-1)
			凝血酶	--	7.5x10³,1x10⁴
	UFH	2x10⁷，4.7x10⁷
				LMWH	5.3x10⁶

戊多糖	2x10⁴
		因子Xa	--	2.5x10³,6x10³
UFH	5x10⁶，6.6x10⁶
			LMWH	1.3x10⁶
戊多糖	7.5x10⁵
		因子1Xa	--	1.3x10²,5x10²
UFH	8x10⁶,1.75x10⁶
			LMWH	3.7x10⁵

UFH：未分级的肝素；LMWH：低分子量肝素

从表1可清楚地看出，在糖胺聚糖例如肝素或合成戊多糖的存在下AT的抑制活性增强。在肝素的存在下，AT对蛋白酶的抑制的增强是由两种不同的机制引起的。其将RSL的N末端从中央β-折叠A中逐出。这种对RSL的“释放(liberation)”解释了对FIXa和FXa的抑制的增强，而没有解释对凝血酶的抑制的增强。对凝血酶的抑制的增强是由所谓的模板机制引起的，该机制暗示肝素作为模板在最佳位置结合凝血酶和AT，以使得AT对凝血酶产生最大的抑制作用。

在原理上，任何可药用的AT抑制剂可在本发明中使用。用于本发明的合适AT抑制剂优选地为这样的抑制剂，即优选用因子Xa、凝血酶或任何其他与AT相互作用的蛋白酶例如因子IXa测量时，当其被加至血浆(优选人血浆，更优选取自健康志愿者的混合血浆)中时，引起AT的活性下降。优选地，所述抑制剂使AT的活性降低至正常AT水平的至少90、80、50、20、10、5、1、0.5、0.2、0.1％。所述正常AT在本文中应理解为取自健康志愿者的混合血浆中的水平。或者，所述抑制剂使AT的活性降低至加入所述抑制剂之前的AT水平的至少90、80、50、20、10、5、1、0.5、0.2、0.1％。

优选地，通过比较当所述抑制剂被加至通常被AT抑制的源自人或牛的蛋白质水解酶(例如凝血酶、因子Xa或因子IXa)中时具有和不具有所述抑制剂的血浆中AT的效应来测量对AT的抑制作用。因此，优选地，与没有所述抑制剂的相同血浆使凝血酶和因子Xa中至少一种的活性降低的程度相比，当将所述抑制剂加至血浆(优选人血浆，更优选来自健康志愿者的混合血浆)中时，所述抑制剂防止所述血浆(当将所述血浆加至(分离的)凝血酶、(分离的)因子Xa和(分离的)因子IIa中的至少一种中时)使凝血酶、因子Xa和因子IIa中的至少一种的活性降低达10、20、50、80、90、95、99、99.5、99.8、99.9％以上。优选地，凝血酶和/或因子Xa的活性是在使用显色底物的测定法中确定，如例如记载在http://www.practical-haemostasis.com/Thrombophilia％20Tests/at_assa ys.html或Beeck et al.,Blood Coagulation Fibrinolysis2000；11:127-35中。适用于因子Xa的显色底物为例如S-2765,Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA.2HCl，其化学式为

AT活性的测定法在本文的“确定功能性AT水平以评价对AT的抑制”中进一步论述。

优选的用于本发明的AT抑制剂为选自以下的抑制剂：(a)可插入抗凝血酶III的中央β-折叠中的化合物；(b)特异性结合抗凝血酶III并防止或减慢RSL-环插入抗凝血酶III的中央β-折叠中的适体；和(c)特异性结合AT的抗体或抗体片段。下文将进一步论述这类抑制剂。

AT的肽-抑制剂

在一个实施方案中，可用于本发明例如用以增强患有出血的患者中凝血酶形成和凝血酶活性的一类AT抑制剂基于以下观察结果：模拟RSL残基P1-P14序列的肽可插入AT的中央β-折叠中。所述肽插入中央β-折叠中可以防止所述分子自身插入RSL。由于对于丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制功能来说，RSL插入中央β-折叠中是必需的(参见图2和3)，因此与RSL-肽孵育的AT被转化为其靶蛋白酶例如凝血酶的底物。换言之，当与AT孵育后，所述模拟AT的RSL氨基酸序列的肽会结合并插入AT的中央β-折叠中，并将AT转变为其靶蛋白酶的底物(参见图4)。I Bjork et al.,J.Biol.Chem.1992；267:1976-1982已经描述了模拟AT的RSL的P1-P14序列的肽的效应。因此，依照该实施方案优选的AT抑制剂为模拟RSL残基P1-P14的氨基酸序列的肽或拟肽。

这种肽的优选序列为

NH₂-Ser-Glu-Ala-Ala-Ala-Ser-Thr-Ala-Val-Val-Ile-Ala-Gly-Arg-COOH

值得注意的是，迄今为止尚无人声称或提出模拟AT RSL的序列的肽用作用于患有过量出血的患者的疗法的治疗用途。这类肽可为具有所示序列的肽，或具有所述相同序列但与另外的蛋白质序列或一个或若干聚乙二醇(PEG)分子或其他分子连接以改善药物代谢动力学特性的肽。能够与AT结合的所示序列的变体也被认为落入本发明的范围内。

此外，化学品或其他化合物(例如能够与AT结合，并通过防止或减慢RSL-环的插入从而降低对凝血酶和其他凝血蛋白酶的抑制活性，而使AT失活的适体)，也被认为落入本专利的范围内。

AT的抗体-抑制剂

在另一实施方案中，用于本发明的AT抑制剂包含抗AT的多克隆抗体和单克隆抗体(人、鼠、人源化鼠、其他动物种例如骆驼)，或其片段。本文的具体实例证明，抗人AT的多克隆抗体在加入血浆中后完全阻断血浆中的AT活性。

关于可中和并失活C1抑制剂(也是丝氨酸蛋白酶抑制剂，与AT具有结构同源性)并引起获得性C1抑制剂缺陷的单克隆自身抗体的研究已经揭示，这些抗体识别位于P10’周围的RSL序列附近的表位(S Heet al.,J.Immunol.1996；154:2009-2013)。这些抗体可能通过妨碍C1抑制剂的RSL插入到所述中央β-折叠中(也参见图4的右侧)，而使得C1抑制剂成为其靶蛋白酶的底物(S He et al.,Molecular Medicine4:119-128,1998)。使用针对AT的同源序列的抗体或其片段来使得在与靶蛋白酶相互作用时失活AT。针对位于P10附近的AT RSL序列的抗体或其片段也削弱RSL到所述中央β-折叠中的插入，并使得丝氨酸蛋白酶抑制剂在与靶蛋白酶相互作用时成为底物。事实上，已经表明，一种识别——包括位于AT RSL的位置P3-P8处的氨基酸的表位——的抗体使AT在与凝血酶孵育时成为底物(S Asakura et al.,J Biol Chem1990；265:5135-6)。此外，文献中已经描述了其他抑制AT的单克隆抗体，而没有进一步详述该抑制作用的基础机制(P Herion et al.,Blood1985；65:1201-7；S Knoller et al.,Eur J Bioch1989；180:319-27)。然而，从未考虑过这类抗体用于治疗或预防出血的治疗潜力。本发明公开了这类抗体可用于终止和预防血友病患者或患有其他原因引起的出血发作的患者中的出血。所有通过干扰AT的RSL插入所述中央β-折叠而抑制AT的抗体(全人抗体、人源化抗体或来自动物种的抗体、去免疫化抗体或未去免疫化抗体)或其片段都落入本发明范围内。

因此，本发明优选的抑制剂是特异性结合AT的RSL序列中的表位并且优选地削弱RSL到AT的中央β-折叠中的插入的抗体或抗体片段。因此，更优选地，AT的RSL序列中的表位包含RSL残基P1-P14中的一个或多个，优选地所述表位包含P10附近的RSL残基、RSL残基P5-P10或RSL残基P3-P8。

上述针对RSL-肽的序列的抗体是通过用涵盖这些序列的肽(连接或不连接载体蛋白)进行免疫而制成。常规地使用与钥孔血蓝蛋白质(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)缀合的肽作为抗原以产生针对肽序列的抗体。然而，也可使用其他载体蛋白例如牛血清白蛋白质(BSA)。此外，所示肽序列的突变体也可用于免疫，只要获得的抗体能够与AT结合。

一种优选的制造抑制AT的抗体的策略是使用KLH来免疫合适的宿主，所述KLH已连接具有AT的RSL的氨基酸序列的肽。所述肽可购自商业或非商业供应商，或根据本领域熟知的方法制造。可商购的肽合成仪机器也可用于该目的。经由已建立的方法(例如通过在序列中引入C末端半胱氨酸)将肽连接至KLH。另一方法使用戊二醛作为缀合试剂。一些商业公司为顾客提供生产KLH-肽缀合物的服务。然后，这类KLH-肽缀合物可用于免疫合适的宿主。

在一个优选的实施方案中，KLH被用作载体蛋白，通过在C末端引入额外的半胱氨酸残基，将涵盖所述RSL序列的肽(见上文)或涵盖AT的RSL的序列P5’-P10的肽缀合至KLH。

可采用多种免疫方案，可包括静脉注射、皮下注射或腹膜内注射，然后进行一次或多次追加注射(boost)。合适的佐剂是弗氏佐剂。合适的免疫方法是使用与弗氏完全佐剂混合的KLH-肽进行超免疫，所述KLH-肽的浓度取决于宿主动物，可在10-500微克的范围内。皮下注射所述混合物。使用与弗氏不完全佐剂混合的相同KLH-肽制剂重复注射2-5次。在第3次、第4次、第5次注射后一周从动物中采集血样，并就针对AT的抗体的存在情况进行筛选。

在本发明的一个优选的实施方案中，针对AT的单克隆鼠抗体是通过使用杂交瘤技术制备。单克隆抗体可以以多种其他方式使用本领域普通技术人员熟知的技术产生。这些技术的细节记载于(Antibodies:ALaboratory Manual,Harlow et al.,Cold Spring Harbor Publications,p.726,1988)或(Campbell,A.M."Monoclonal Antibody TechnologyTechniques in Biochemistry and Molecular Biology,"Elsevier SciencePublishers,Amsterdam,The Netherlands,1984)或(St.Groth et al.,J.Immunol.Methods35:1-21,1980)中。

可通过测定培养物上清液等以就抗体的存在情况来鉴定分泌针对人AT的抗体的杂交瘤。优选的筛选方法包括两个相继的步骤，第一个是鉴定分泌针对AT的mAb的杂交瘤，第二个是确定所述mAb抑制AT的功能性活性的能力。

使用ELISA以就抗AT单克隆抗体的存在情况筛选杂交瘤上清液。可如下进行该ELISA方法。使用纯化的人血浆AT(或重组人AT)用于包被(2μg/ml，溶于pH7.4的磷酸盐缓冲盐水[PBS]中；100μl/孔)。然后通过与含有0.2％(w/v)明胶的PBS/0.1％(w/v)Tween20(PBS-T)(PBS-TG)室温下孵育30分钟，来封闭剩余的非特异性结合位点。然后，洗涤程序(用PBS-T洗涤5次)后，将所述板用20μl的杂交瘤上清液和80μl的PBS-TG在37℃下孵育60分钟。最后，通过与过氧化物酶缀合的多克隆山羊抗小鼠免疫球蛋白抗体在37℃下孵育120分钟，来检测结合的鼠抗体。最后，用蒸馏水洗涤所述板(5次)，再用3,5,3’,5’-四甲基联苯胺显影。

或者，用放射性免疫测定方法(例如使用与(Hack et al.,J Immunol.1988；141:1602-9)描述的检测抗C3抗体的方法类似的方法)来测量抗-AT的抗体。

为了评价针对AT的抗体对AT的功能性活性的效应，经由有限稀释对阳性杂交瘤进行亚克隆并培养。然后，通过蛋白G-亲和色谱法从杂交瘤培养物上清液中纯化抗体。然后将纯化的抗体与纯化的AT或与人血浆孵育，此后如下文所述在显色测定法中测量AT的功能性活性。

任何通过不同于干扰所述RSL插入的机制来抑制AT的抗体或其片段也被认为落入本发明的范围内。这些抗体可为人、人源化、鼠、去免疫化单克隆抗体、来自其他动物种例如骆驼的抗体，或合成的抗体，或其片段。在本发明范围内的抗体或抗体片段的关键特征是它们与AT结合并抑制AT的功能性活性。这些抗体封闭AT上的一个或多个功能上重要的位点，导致AT的功能性活性降低。

一般而言，抑制AT的抗体可通过用功能性的AT免疫动物来获得。然后用使用AT作为抗原的测定法来对筛选抗体(通过收集血浆并纯化AT-抗体而获得的多克隆抗体，或用天然AT作为抗原通过杂交瘤技术制备的单克隆抗体)。然后通过将纯化的AT与所有阳性抗体孵育，随后如下文所述使用显色测定法来测试AT的功能性活性，来就对AT的抑制活性来测试所有阳性抗体。或者，可通过将所述抗体加入到血浆中并在凝血测定法(例如凝血酶原时间(PT)和活化的凝血酶激酶原时间(activated prothromboplastin time)(aPTT)或其他测定法)中测试所述血浆来筛选所述抗体。此外，可将所述抗体加入到正常人血浆中，然后如下文所述使用显色测定法来测量AT的功能性活性。在这些测定法中，抑制性抗体将使得AT的功能性活性降低。

此外，与AT结合并通过增强AT的清除率而引起体内AT减少，或通过其他机制引起体内AT活性降低的抗体或其片段被认为落入本发明的范围内。

其他AT的抑制剂

与AT结合并通过不同于干扰所述RSL插入中央β-折叠的机制来抑制AT的肽、抗体和其他分子也在本发明的范围内。例如，这些肽或化合物例如适体可与AT上的其他功能性位点(例如参与与靶蛋白酶相互作用的位点)结合。任何能够(优选在体内)抑制AT的功能性活性的分子被认为落入本发明的范围内。同样地，任何能够(优选在体内)降低AT的功能性活性的分子被认为落入本发明的范围内。

确定功能性AT水平以评价对AT的抑制

可使用测量血浆或其他(生物学)流体中AT的功能性活性的测定法来评价血浆中AT抑制剂的效应。可基于AT对凝血酶的抑制性活性来评价AT的功能活性。这类测定法是可商购的(例如Actichrome ATIII,American Diagnostica,Greenwich,CT,USA；STA Stachrome,Diagnostica Stago Inc,Parsippany,NJ,USA)。这些测定法的基础是凝血酶可以转化合适的显色底物(例如S-2238,Haemochrom Diagnostica,Molndal,Sweden)。显色底物是与蛋白水解酶反应并形成颜色的肽。它们可以由一些公司通过合成的方法制得，并被设计成具有与天然底物对所述酶的选择性类似的选择性。与显色底物的肽部分连接的是化学基团、对硝基苯胺(p-nitroanilide)，其在酶切割后释放，产生黄色。可用分光光度计法跟踪颜色变化，并且颜色变化与蛋白水解活性成比例。在AT测量的情形中，步骤1中将一定量的凝血酶与血浆孵育，在该步骤中功能性AT与所述凝血酶的一部分结合并使其失活。然后在该测定法的步骤2中，用显色底物测量剩余的凝血酶活性。该剩余的凝血酶活性与AT浓度成反比。为了确保最佳定量，在存在肝素的情况下进行凝血酶与血浆的孵育，所述肝素使AT的活性最佳化。此外，常使用牛凝血酶来进一步增加所述测定法的特异性，因为牛凝血酶与人凝血酶不同，其几乎不与另外的血浆抑制剂——肝素辅因子II相互作用。与显色底物相结合的人或牛FXa也可用于测量AT活性水平。

使用该显色测定法时，可在体内和体外容易地测量AT抑制剂达到的AT抑制水平。在体外，这通过将一定体积的血浆(例如X ml)与一定量的溶于例如0.1X ml盐水或缓冲液中的AT抑制剂孵育来实现。然后在37℃下孵育所述混合物，然后如上文所述使用用于AT的显色测定法来测量混合物中的AT活性。然后将所得的值与使用含凝血酶和生理盐水但不含血浆的样品获得的值进行比较，其等于对功能性AT有100％的抑制作用，并且与使用其中未加入AT抑制剂的血浆获得的值比较，其等于0％的抑制作用。然后将与AT抑制剂孵育的血浆样品中的AT抑制的量与0％和100％抑制的对照进行比较，并表示为对AT的％抑制。与AT抑制剂孵育的血浆样品可为正常血浆或来自出血患者或具有出血风险的患者(例如血友病患者)的血浆。可通过在给予AT抑制剂后使用本段落中描述的显色测定法来测量循环的AT水平，来评价给予患者的AT抑制剂对AT的体内抑制。

本发明的临床应用

AT抑制剂可用于出血障碍的预防性或按需治疗。因此在一个实施方案中，本发明涉及AT的抑制剂，其用于治疗和预防患有出血障碍(凝血功能降低)的受试者中的出血。所述出血障碍可为获得性或遗传性出血障碍。在一个优选的实施方案中，所述出血障碍为血友病例如A或B型血友病。更优选地，所述AT的抑制剂用于治疗具有针对因子VIII或因子IX的中和抗体的血友病受试者。在这类实例中，所述抑制剂优选地被用作预防性的因子VIII或因子IX旁路疗法。

本发明的一个应用是使用抑制剂(针对FVIII或IX的中和抗体)对血友病患者进行的急性和预防性治疗。血友病中的出血现象的严重程度通常与凝血因子水平相关。严重的血友病患者具有可忽略量的FVIII(<正常的1％)，可从许多部位自发出血。然而最频繁的部位是关节(70％-80％)，特别是膝和肘，以及肌肉/软组织(10％-20％)。也发生其他大出血(5％-10％)，有时发生中枢神经系统出血(<5％)。此外，血友病患者可在外科手术或其他创伤后过量出血。对血友病中凝血因子的预防性替换的目的在于使缺陷因子的循环水平一直保持在1％以上，以预防关节和软组织中的自发出血，其与主要预防血友病性关节病的按需疗法不同(MJ Manco-Johnson et al.,N Engl J Med2007；357:535-44)。具体地，具有非常低的FVIII或不具有FVIII的患者在用外源性FVIII治疗时，有产生中和抗体的风险，因为他们的免疫系统认为所给予的FVIII是外来抗原并对其不耐受。事实上，20-30％的严重血友病患者产生这类中和抗体(J Goudemond et al.,Blood2006；107:46-51；SC Gouwet al.,Blood.2007；109:4693-4697)，该中和抗体抑制所给予的FVIII的效力并因此常被称为FVIII抑制剂。目前，唯一的可用于血友病患者的预防性疗法是使用所述缺陷因子的补充疗法。然而，在具有针对FVIII的抑制剂的患者中，预防性疗法实际上是不可能的，因为所给予的FVIII被所述抑制剂中和或通过抗体与FVIII的结合而被快速地从循环中清除。根据本发明，这些患者的凝血过程中纤维蛋白形成的缺陷，可通过给予一定量的AT抑制剂来恢复，所述AT抑制剂使循环AT的功能活性降低，这使得由于对因子Xa的抑制作用降低以及凝血酶活性延长，而增加了纤维蛋白形成。所需要的对AT的抑制程度可通过以下方式监测：在将所述AT抑制剂给予血友病患者后测量功能性AT的体内水平，而有效止血所需的抑制程度可基于体外实验来评估，在所述体外实验中，在存在不同量的AT抑制剂的情况下，通过来自血友病患者的血浆中的低浓度TF来诱导生成凝血酶。

在另一实施方案中，本发明涉及AT的抑制剂，其用于预防或治疗特征为过量出血的临床病症。特征为过量出血的临床病症可为例如外科手术出血、创伤出血和内出血中的一种或多种。因此，本发明还提供了用于减少或防止创伤患者或战争受害者的失血的方法，所述方法包括将AT抑制剂给予所述患者。本发明还提供了用于减少或防止处于外科手术(例如冠状动脉分流术或其他血管外科手术)过程中的患者中的失血的方法，所述方法包括将AT抑制剂给予所述患者。本发明还提供了用于减少或防止患有脑内出血的患者中的脑损伤的方法，所述方法包括将AT抑制剂给予所述患者。本发明还提供了用于减少或防止具有内出血(例如由食管静脉曲张引起的或由使用非类固醇消炎药引起的)的患者中的失血的方法，所述方法包括将AT抑制剂给予所述患者。本发明还提供了用于减少或防止具有由使用抗凝血药引起的出血的患者中的失血的方法。本发明可用于其中发生过量出血的外科手术、创伤或其他病症(例如使用抗凝血药)，也用于内出血的情形(例如出血性中风或胃肠道出血，例如由血管曲张引起的食道出血)。本发明公开的方法还可用于预防具有出血风险的患者(例如血友病患者)中的出血，以防止血友病患者的关节、肌肉和/或软组织出血。

当依据本发明使用抗凝血酶III的抑制剂来治疗和预防受试者(所述受试者患有获得性或遗传性出血障碍(凝血功能降低)或具有特征为过量出血的临床症状)中的出血时，使用的剂量优选地为使AT的活性降低至正常AT水平的至少90、80、50、20、10、5、1、0.5、0.2、0.1％的剂量，其中所述正常AT水平如为上文所定义的。

评价功能性AT水平以指导用于体内的AT抑制剂的剂量

如上文所述，可使用测量血浆中AT的功能活性的测定法来评价血浆中AT抑制剂的效应。待在体内达到的AT抑制的水平可在体外用来自患有出血障碍的患者的血浆样品来评估。在血友病患者血浆的情况中，补充有不同浓度的AT抑制剂的血浆可为FVIII-免疫耗尽的血浆(DadeBehring,Marburg,Germany)或来自血友病患者的血浆。然后通过加入TF(例如Innovin,Dade Behring,B4212-50)而在这些血浆样品中触发凝血酶的形成。首先选择TF浓度以在该FVIII-耗尽血浆或血友病血浆中产生FVIII-依赖的凝血酶生成或纤维蛋白形成，这是通过在不同浓度FVIII(范围为正常水平的0.1％(0.001U/ml)-25％(0.25U/ml)，分别模拟严重至轻度血友病病症)的存在下，将所述血浆样品与1:1000-1:80.000稀释的Innovin孵育而实现的。可通过使用SpectraMax微量滴定板读数仪和Softmax pro软件及时测量纤维蛋白的生成。或者，凝血酶的生成可使用显色底物或荧光底物(例如DiaPharma供应的Technothrombin TGA系统)来评价。然后选择能够在该系统中诱导FVIII-剂量-依赖的凝血酶或纤维蛋白生成的TF浓度。

为了评价AT抑制剂对纤维蛋白形成或凝血酶生成的效应，将血友病的或FVIII-耗尽的血浆样品与不同量的AT抑制剂一起孵育，以使功能性AT水平降低20、40、60、80或100％，如根据上文所述的方法所评价的。作为对照，向所述血浆样品中补充不同浓度的FVIII(例如来自Baxter()或Bayer()的重组FVIII)。混合后，在以如前面段落所述选择的浓度加入TF以实现FVIII-依赖的凝血酶生成和纤维蛋白形成后，就纤维蛋白生成或凝血酶生成测试所述样品。然后如上所述测量该凝血酶生成和/或纤维蛋白形成。可将在所述具有降低的功能性AT水平(对AT的抑制作用增强)的血浆样品中观察到的增强的(提高的)纤维蛋白生成和/或凝血酶生成与使用FVIII获得的结果相比较。因此可选择补偿FVIII的缺失所需的AT抑制水平来模拟中度、轻度或无血友病的状态。然后可计算要在血浆中达到的AT抑制剂的相应水平。

还可以考虑同时给予AT抑制剂和FVIII。这种同时给药可降低对FVIII的需求，从而降低免疫原性的风险并降低产生抑制剂的几率。在患者中，可将因子VIII的给予量缩减至更低水平，例如缩减至低至足以不在所述患者体内引起对FVIII的免疫应答的水平。例如，可给予血友病患者一定量的FVIII，以达到浓度为0.001-0.05，例如0.01U/ml血浆，同时还使用本发明的AT抑制剂来治疗所述患者。

除了血友病之外，常规疗法失效的常规出血可发生在大量其他医学病症中。目前，rFVIIa(标签外使用)是这些病症唯一的疗法。这些病症包括颅内出血、肝病、外科手术(例如心肺旁路手术、脊柱手术、前列腺手术和原位肝移植)后出血、与创伤相关的出血、与使用抗凝血药(例如华法林相关)的出血，以及其他出血。

脑内出血是最能致残疾的中风形式之一。多于三分之一的患有该疾病的患者在症状开始后的一个月内去世，大多数变得严重衰弱，只有20％恢复功能性自立。虽然通过给予重组FVIIa来刺激血液凝固已经显示出有希望的结果(SA Mayer et al.,N.Engl.J.Med.2005；352:777-85)，但是目前对脑内出血没有有效疗法。血肿的体积是脑内出血后的死亡率和功能性结果的关键性决定因素，并且早期血肿生长是神经功能衰退的重要原因。已经证明，rFVIIa能够降低这种体积的增长。在3期研究中，再次发现了rFVIIa对梗塞面积的有利效应，虽然临床结果是rFVIIa减缓了血肿的生长，但并没有改善脑内出血后的存活率或功能性结果(SA Mayer et al.,N.Engl.J.Med.2008；358:2127-37)。

患有由酒精性肝硬化或肝炎后肝硬化或其他疾病引起的肝病的患者具有严重出血的风险，这是因为肝脏减少了凝血因子的合成，导致凝血因子的循环水平较低，以及在食道和胃中存在血管曲张。目前用凝血因子浓缩物或输注rFVIIa来治疗这些患者。重度出血还可发生在非肝硬化患者的肝移植过程中和肝部分切除术过程中，这是由各种凝血因子的循环水平降低而引起的。失血过多还发生在处于心脏外科手术中的患者中。这种增加的出血风险是由凝血因子的血浆水平低引起的，凝血因子的血浆水平低是因为使用预充液(用于体外充氧器)导致的血液稀释、使用抗凝血药以及人造血管(vascular graft)的机械性问题所引起的。

抗凝血药用于许多血栓栓塞性疾病，包括心房颤动、深部静脉血栓形成、心肌梗死和其他疾病。用口服抗凝血药治疗的患者具有降低的功能性维生素K依赖的凝血蛋白质水平，因此具有出血并发症的风险。出血的发生率为约0.6-0.7％/月(以治疗性国际标准化比率(INR)表示)，并且大出血事件的发生率是较大的。因此，重要的是反转所述抗维生素K的效应的能力。紧急情况下，使用血浆或凝血酶原复合体浓缩物以及重组FVIIa。可以使用本发明作为替代。本发明的优势是，可通过测量接受AT抑制剂的患者中的功能性AT水平，来用滴定促凝血效应。

在以上段落中描述的临床病症中，以及出血风险增加或正在发生出血的其他疾病中，医学上需要预防或终止出血。为了止血，只有重组FVIIa或血浆来源的活化的凝血酶原复合体(例如FEIBA)是可用的(JAstermark et al.,Blood2007；109:546-551；HR Roberts et al.,Blood2004；104:3858-3864)。这些都不能被用于预防出血。此外，在用于预测这些试剂的效力或副作用的体外测定法中没有益处。本发明提供了这些促凝血剂的替代品，其中可滴定和监测治疗效果，并且其可用作预防疗法也可用作按需疗法。本发明包括将AT抑制剂给予具有出血风险或患有出血的患者。通过测量功能性AT的血浆水平，可实现对待给予的AT抑制剂的量进行药理学控制。

评价促进凝血酶形成的AT抑制剂的有效浓度

如上文所阐述，可在体外使用患有出血障碍的患者的血浆样品来评估体内AT抑制的目标水平。加入TF诱导凝血后，可通过使用SpectraMax微量滴定板读数仪和Softmax pro软件来及时测量纤维蛋白的生成，而可使用显色底物或荧光底物(例如DiaPharma供应的Technothrombin TGA系统)来评价凝血酶的生成。

将来自患者的含有不同量的AT抑制剂的血浆样品中的凝血酶生成和纤维蛋白形成的结果与使用来自正常对照的血浆样品所获得的结果进行比较。然后基于能够使凝血酶生成和纤维蛋白形成恢复至使用正常对照的血浆样品时所观察到的范围内的AT抑制剂量，以及基于生物利用度和药物代谢动力学性质，来计算待给予的AT抑制剂的剂量。将AT抑制剂给予所述患者后，通过使用上文所述的测定法来测量循环的AT活性水平，来确定待给予的剂量。

AT抑制剂的药物组合物

对于人的给药，本发明可采用包含所述AT抑制剂和可药用载体或赋形剂的药物组合物。在本文的上下文中，术语“可药用”意指所述载体或赋形剂在所采用的剂量和浓度下不会在被给予所述载体或赋形剂的患者中引起任何不想要或有害的效应。这种可药用载体和赋形剂是本领域所熟知的(参见Remington's Pharmaceutical Sciences,18th edition,A.R.Gennaro,Ed.,Mack Publishing Company[1990]；PharmaceuticalFormulation Development of Peptides and Proteins,S.Frokjaer and L.Hovgaard,Eds.,Taylor&Francis[2000]；和Handbook ofPharmaceutical Excipients,3rd edition,A.Kibbe,Ed.,PharmaceuticalPress[2000])。虽然利用冻干的制剂也在本发明的范围内，但是优选地将本发明的AT抑制剂作为无菌溶液来配制和给药。通过无菌过滤或通过其他本领域本来已知的方法来制备无菌溶液。然后将所述溶液冻干或充入药物剂量容器中。所述溶液的pH通常在pH3.0-9.5的范围内，例如pH5.0-7.5。所述蛋白质或肽通常在具有合适的可药用缓冲液的溶液中，并且所述蛋白质溶液还可含有盐。在某一实施方案中，加入了洗涤剂。对于本发明中的用途，可将AT抑制剂配制成可注射的制剂。肠胃外制剂适合用于本发明，优选用于静脉给药。这些制剂含有治疗有效量的AT抑制剂，为无菌液体溶液、液体悬液或冻干形式，并任选地含有稳定剂或赋形剂。通常，用合适的稀释剂例如无菌注射用水、无菌盐水等来复原冻干的组合物。

用AT抑制剂治疗患有出血障碍的患者

可通过血管内注射或通过其他给药途径和/或部位给予AT抑制剂。所需的剂量取决于临床病症等。

上文中，本发明人已经描述了评价与FVIII的剂量范围的效应相比较，不同程度的AT抑制对血友病患者血浆中的凝血酶和纤维蛋白生成的效应的方法。在用AT抑制剂进行预防性治疗的情况中，需要相似的AT抑制程度，这与补充约0.3U FVIII所对应的抑制程度等价，如在上文的“评价功能性AT水平以指导待在体内使用的AT抑制剂的剂量”中所述。考虑到所述AT抑制剂的药物代谢动力学特性，可以估计在体内产生与体外实验中相似的AT抑制程度的待给药量。通过在给予AT抑制剂后监测患者中功能性AT的水平，检查所述患者中实际需要的AT抑制水平。

在急性出血发作的情形中，可以以稍微不断增加的剂量并在AT的功能性水平的指示下给予AT抑制剂，直至出血停止。可以使用类似策略来对具有由非血友病的其他原因引起的出血发作的患者进行治疗。给予AT抑制剂以缓慢降低AT的功能性水平，直至出血停止。给予AT抑制剂后对功能性AT的水平进行的监测是使用如上文所述的测定法来完成。

鉴定作为AT抑制剂的化合物的方法

在另一方面，本发明涉及鉴定作为AT抑制剂的化合物的方法。所述方法优选地包括以下步骤：(a)将所述化合物加入到健康志愿者的混合血浆中；(b)将a)中所获得的具有所述化合物的混合血浆与分离的凝血酶和分离的因子Xa中的至少一种混合；(c)确定b)中所获得的混合物中凝血酶和因子Xa中至少一种的活性，并比较具有所述化合物的混合物中的活性以及与相同血浆混合但无所述化合物的凝血酶和因子Xa中至少一种的活性，其中优选地，所述凝血酶和因子Xa中至少一种的活性是以使用显色底物的测定法确定；和(d)与无所述化合物的相同血浆相比，将可防止所述血浆中凝血酶和因子Xa中至少一种的活性降低的化合物鉴定为AT的抑制剂，其中优选地，所述化合物防止凝血酶和因子Xa中至少一种的活性降低达50％以上。在所述方法的优选实施方案中，在步骤(a)之前，所述化合物已被选择为与AT特异性结合的化合物。优选地，在所述方法中，所述化合物为已被选择为与AT特异性结合的肽、适体、抗体或抗体片段；更优选地，所述肽、适体、抗体或抗体片段已被选择为与AT的RSL序列中的表位特异性结合。

在本说明书和其权利要求书中，动词“包含”和其词形变化使用其非限制性意义，意指包括该词语后面的项目，但不排除未具体指出的项目。此外，通过不定冠词“一”或“一个”提及一个元素时，不排除存在多于一个的所述元素的可能性，除非上下文清楚地要求有且只有一个所述元素。因此不定冠词“一”或“一个”常指“至少一个”。

本说明书中引用的所有专利和参考文献以引用的方式全文纳入本文。

提供以下实施例仅用于说明性目的，并不意欲以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1：用针对AT的多克隆抗体抑制血浆中的AT活性

作为用于证明抗体确实可以抑制人血浆中的AT活性的实施例，从以人AT(Bioconnect,Huissen,the Netherlands；Catalog nr:AHP1750)免疫的山羊的血清中纯化了多克隆抗体。根据制造商的用法说明，将纯化的AT(Kybernin P,CSL-Behringwerke,Marburg,Germany；Catalognr:83167111A)与CNBr活化的琼脂糖4B(GE Healthcare LifeSciences,Diegem,Belgium)连接(约25mg的AT加入1克CNBr活化的琼脂糖凝胶中)。洗涤微珠，然后将其与2.5ml的针对人AT的山羊抗血清(在pH7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中1-2稀释)在室温下孵育2小时。再次洗涤微珠，然后用pH2.5的0.1M甘氨酸0.15NaCl洗脱。1300g离心1分钟将微珠旋下，移出上清液，立即用pH8.5的1M Tris中和，用PBS透析。将所得的制剂在SDS-PAGE上进行纯度分析，发现其在非还原条件下由Mr为～160.000的一条条带组成，在还原条件下由Mr为～50.000和～25.000的2条条带组成。

两种用于功能性AT活性的测定法可用于评估抗体对血浆中的功能性AT的效应。第一种测定法(STA ATIII kit,Catalog nr:12145103140；Roche Diagnostics,Almere,the Netherlands)是显色测定法，其使用凝血酶作为靶蛋白酶。该测定法的原理是在肝素的存在下将标准量的凝血酶加入到血浆中，然后使用显色底物乙基-丙二酰基-S-脯氨酸-精氨酸-pNA.乙酸(2mg/ml)检查所述血浆中的残留凝血酶活性。在该测定法中，对50μL的1-20稀释(在所述测定法所提供的稀释剂中)的血浆样品进行测试。为了评价它们对血浆中的AT功能的效应，将25μL中的20μg所述纯化抗-AT的抗体加入到25μL的1-10稀释的正常血浆中。然后在该测定法中对所述混合物进行测试。所得结果清楚地表明，加入纯化的抗-AT的抗体后，血浆对凝血酶活性的抑制作用被中和(比较图5中的“100％血浆”与“100％血浆+抗-AT”与“0％血浆”)。

虽然AT是血浆中凝血酶的主要抑制剂，但是血浆中的其他抑制剂例如肝素辅因子II也可有助于抑制凝血酶。与此相比，血浆中FXa只受AT的抑制。因此，在另一测定法(STA Rotachrom Heparin,Catalognr:11556959140；Roche Diagnostics)中确认了使用所述抗-AT的抗体的结果，该测定法除了使用牛FXa作为蛋白酶，乙基-丙二酰基-S-脯氨酸-精氨酸-pNA.乙酸作为显色底物(2mg/ml)之外，与上文描述的使用凝血酶的测定法类似。此外，对15μL的1-10稀释(在该测定法提供的稀释剂中)的血浆样品进行了测试。制备了7.5μL中的6μg亲和纯化的抗-AT的抗体与7.5μL的1-5稀释的正常血浆的混合物，并在该测定法中对其进行测试。将所述亲和纯化的抗体加入到新鲜的人血浆中，以剂量依赖的方式终止了血浆对FXa的抑制效应(比较图6中的“100％血浆”与“100％血浆+抗-AT”与“0％血浆”)。

图5和6中示出的结果表明，使用针对AT的多克隆抗体可达到对血浆中AT活性的完全抑制。所述亲和纯化的AT抗体的这种效应在一些其他血浆样品中也得到确认：在所有测试的血浆样品中，在加入亲和纯化的针对AT的多克隆抗体后，观察到对AT活性的完全抑制。

实施例2：AT抑制剂对正常血浆中和FVIII-缺陷的血浆中的凝血酶生成的效应

然后，本发明人在下一组实验中明确了通过加入所述亲和纯化的抗-AT的抗体而对AT的抑制是否能够在正常血浆和血友病患者血浆中影响由TF诱导的凝血酶生成。

凝血酶是凝血系统的关键酶，在将TF加入血浆中后在体外及时生成凝血酶被认为是极好的凝血的离体模型。在低TF浓度下的血友病患者血浆中凝血酶生成严重受损，并且已经被证明可有效终止血友病患者中出血的治疗性干预，即FVIII制剂、rFVIIa和活化的凝血酶原复合体例如FEIBA(J Astermark et al.,Blood2007；109:546-551；HRRoberts et al.,Blood2004；104:3858-3864)，均已被证明能够使凝血酶生成恢复到某种程度(K Varadi et al.,J Thromb Haemost2003；1:2374-80；NM Aljamali et al.,Haemophilia2009；15:1318-26)。因此，本发明人选择该离体模型来评估AT抑制剂的效应。

所述模型，经校准的自动化凝血酶生成图(thrombogram)测定法基本上是按照Hemker et al(Pathophysiol Haemost Thromb2002；32:249-2)所描述的以及由Thrombinoscope(Maastricht,theNetherlands)提供的指南进行。在1或5pM重组人组织因子、4μM促凝血磷脂和417μM荧光底物Z-甘氨酸-甘氨酸-精氨酸-AMC的存在下，通过复钙作用触发凝血。用荧光计(Fluoroscan Ascent,ThermoLabsystems,Helsinki,Finland)监测荧光，使用软件(Thrombinoscope)计算内源性凝血酶潜能(ETP)。在缺乏血小板的血浆或富含血小板的血浆中得到的“凝血酶生成图”用来测量凝血功能降低(例如血友病或使用抗凝血剂)以及凝血功能过高例如AT缺陷等等。如图7所示，加入纯化的抗-AT的抗体诱导正常血浆中的凝血酶生成增加，这与凝血功能过高状态的存在一致，所述凝血功能过高状态与血浆中对AT的抑制一致。

除了使用FVIII缺陷血浆而非混合正常血浆之外，进行了相同实验。患有血友病的患者缺乏因子VIII(或因子IX)，并且显示出在低TF浓度下比健康人低得多的凝血酶生成。如图8中所见，与期望的相同，事实上在血友病患者血浆中凝血酶生成有所降低，峰水平约为20nM，这与所述血浆的凝血功能降低一致。加入亲和纯化的针对AT的山羊多克隆抗体，以剂量依赖方式促进FVIII缺陷血浆中的凝血酶生成。在加入最高浓度(250μg/ml)的情况下，观察到凝血酶生成有接近2倍的增加。由于血浆中的凝血酶生成被认为是极好的体内生成凝血酶的潜能的指示方法，因此这些数据强烈地支持：对AT的抑制构成了治疗血友病的方法，以通过绕过FVIII来恢复所述凝血酶生成缺陷。

Claims

1.一种抗凝血酶III的抑制剂，用作药剂。

2.一种抗凝血酶III的抑制剂，用于治疗和预防患有获得性或遗传性出血障碍(凝血功能降低)或具有特征为过量出血的临床病症的受试者中的出血。

3.权利要求2的抑制剂，其中与由不含所述抑制剂的相同血浆所引起的凝血酶和因子Xa中至少一种的活性降低相比，所述抑制剂在被加入到来自健康志愿者的混合血浆中并将所述血浆加入到凝血酶、因子Xa和因子IXa中的至少一种中时，所述抑制剂防止由所述血浆所引起的凝血酶和因子Xa中至少一种的活性降低达20％以上，并且其中优选地，所述凝血酶和因子Xa中至少一种的活性是以使用显色底物的测定法确定。

4.权利要求2或3的抑制剂，其中所述出血障碍是血友病，并且其中优选地，所述受试者是具有针对因子VIII或因子IX的中和抗体的血友病患者。

5.权利要求4的抑制剂，其中所述抑制剂被用作预防性因子VIII或因子IX旁路疗法。

6.权利要求2或3的抑制剂，其中所述特征为过量出血的临床病症是外科手术、创伤和内出血中的一种或多种。

7.权利要求1-6任一项的抑制剂，其中所述抑制剂选自：

a)可插入抗凝血酶III的中央β-折叠的化合物；

b)与抗凝血酶III特异性结合并防止或减慢RSL-环插入抗凝血酶III的中央β-折叠的适体；和

c)与AT特异性结合的抗体或抗体片段。

8.权利要求7的抑制剂，其中所述a)中的化合物是肽或模拟RSL残基P1-P14的氨基酸序列的拟肽。

9.权利要求7的抑制剂，其中所述抗体或抗体片段特异性结合抗凝血酶III的RSL序列中的表位，并且优选地削弱所述RSL插入抗凝血酶III的中央β-折叠。

10.权利要求9的抑制剂，其中所述抗凝血酶III的RSL序列中的表位包含RSL残基P1-P14的一个或多个，优选地所述表位包含P10附近的RSL残基、RSL残基P5-P10或RSL残基P3-P8。

11.一种治疗或降低受试者中出血风险的方法，所述受试者患有出血障碍或具有特征为过量出血的临床病症，所述方法包括给予所述受试者有效量的抗凝血酶III的抑制剂的步骤。

12.权利要求11的方法，其中所述抑制剂是如权利要求3-7任一项所定义的抑制剂，和/或其中所述治疗是权利要求8-10任一项所定义的治疗。

13.一种鉴定作为抗凝血酶III的抑制剂的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将所述化合物加入到健康志愿者的混合血浆中；

b)将a)中所获得的具有所述化合物的混合血浆与分离的凝血酶和分离的因子Xa中的至少一种混合；

c)确定在b)中所获得的混合物中凝血酶和因子Xa中的至少一种的活性，并比较具有所述化合物的混合物中的活性以及与相同血浆混合但无所述化合物的凝血酶和因子Xa中的至少一种的活性，其中优选地，所述凝血酶和因子Xa中至少一种的活性是以使用显色底物的测定法确定；和

d)将与无所述化合物的相同血浆相比，防止所述血浆中凝血酶和因子Xa中至少一种的活性降低的化合物鉴定为抗凝血酶III的抑制剂，其中优选地，所述化合物防止凝血酶和因子Xa中至少一种的活性降低达20％以上。

14.权利要求13的方法，其中在步骤a)之前，所述化合物已被选择作为与抗凝血酶III特异性结合的化合物。

15.权利要求14的方法，其中所述化合物是已被选择为与抗凝血酶III特异性结合的肽、适体、抗体或抗体片段，优选地所述肽、适体、抗体或抗体片段已经被选择为与抗凝血酶III的RSL序列中的表位特异性结合。