CN110753704A - 因子ix和因子x的双特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

一种双特异性抗原结合分子(例如，抗体)，其结合凝血因子，因子IXa(FIXa)和因子X(FX)；并且增强FX对Fxa的FIXa催化活化。所述双特异性抗原结合分子用于通过替代在A型血友病患者中缺乏的天然辅助因子FVIIIa来控制出血。

Description

因子IX和因子X的双特异性抗体
技术领域
本发明涉及在凝血级联中结合因子IXa和因子X凝血因子的双特异性抗原结合分子(例如抗体)。这类双特异性通过活化因子X在功能上取代因子VIII，从而恢复缺乏FVIII的患者(即具有A型血友病的患者)的凝血能力。
背景技术
血友病是一种遗传性病症，其中由于多种凝血因子之一的功能缺失(部分或完全)，血液的凝血能力降低。A型血友病是凝血因子VIII(FVIII)的缺乏。疾病具有轻度、中度和重度形式，取决于患者保留任何残余FVIII功能的程度和凝血级联中其它组分的平衡。如果不治疗，那么A型血友病导致不受控的出血，这可导致严重的功能障碍，尤其因为关节积血事件对关节的损害。所述疾病通常会限制寿命且可危及生命。据信，全球A型血友病的发病率约为1:10,000。B型血友病(不同凝血因子(因子IX)缺乏症)不太常见，其中发病率约为1:50,000。两种疾病是X连锁的，因此通常在男性中发现，因此男性婴儿中A型血友病的发病率约为5,000分之1。
预防出血发作对于改善患者的生命质量和减少致命性失血的风险至关重要。对于A型血友病，可以通过给予FVIII来替代缺失的辅因子。给予患者的FVIII可以重组方式表达或其可从血浆纯化。通常，接受这种治疗的患者每48小时或每周3次自我注射FVIII。
用FVIII治疗不是完美的解决方案。严重的缺点是其可触发体内同种抗体的产生。这使得用FVIII治疗无效，因为同种抗体结合FVIII且妨碍其活性，如果发生出血，那么会使患者处于危险境地。这类抑制性抗体在约30％用FVIII治疗重度血友病的患者中产生。
已报告，用血浆衍生的FVIII而非重组形式进行治疗在患者中具有触发抑制性抗体的较低风险。这可能是由于血浆衍生的形式保留血管性血友病因子(Von Willebrandfactor；VWF)，发现所述因子在性质上与FVIII相关联且可掩盖免疫原性表位。然而，尚未产生完全避免抑制性抗体风险的FVIII形式。
尽管重组FVIII可能具有更高的免疫原性，但其相对于血浆衍生形式提供一些优势，由于其更稳定而更容易和更便宜地存储和运输。通过捐赠的血浆产品传输感染的风险与1980年代相比现在降低许多，在所述年代，例如C型肝炎和HIV的病毒被无意地扩散到受感染血液产品的接受者，但当然仍需要严格的安全控制。
已经研发新的FVIII重组形式，例如B结构域截短多肽turoctocogα
Figure BDA0002322205310000021
然而，这类产品对产生针对FVIII的中和抗体的患者无效。一些患者成功地进行免疫耐受性诱导以防止抗FVIII抗体产生。然而，对于具有抑制性抗体或处于产生抑制性抗体风险下的患者，仍存在对用于所述患者中的FVIII替代品的大量需求。
一个这类替代方案是重组因子VIIa，其称为活化的eptacogα
Figure BDA0002322205310000022
然而，其具有短半衰期且必须每几个小时注射一次。在具有抑制性抗体的血友病患者中，其用途很大程度上局限于急救疗法或在手术期间提供止血覆盖物，而不是长期保护性治疗的可行选项。
另一个可用的产品是FEIBA(第八因子旁路活性抑制剂)，一种活化的凝血酶原复合浓缩物(aPCC)，在具有因子VIII抑制剂的血友病患者中，所述浓缩物同样可用于控制出血发作且预防在外科手术期间出血。
当前正在寻求多种其它替代疗法，例如基因疗法，使用siRNA抑止抗凝血酶和TFPI(组织因子途径抑制剂)的抗体，concizumab。
一种新的方法是靶向因子IXa(FIXa)和因子X(FX)的人源化双特异性IgG抗体。双特异性抗体利用一个臂与FIXa结合，且利用另一个臂与FX结合，使这两个辅因子结合在一起且由此以与FVIII相同的方式促进FX的FIXa催化活化。因此，抗体在功能上替代凝血级联中的FVIII(图1)。由于其结构与FVIII完全不同，因此抗体无法由抗FVIII抗体中和且因此适用于已产生或处于产生所给予FVIII的同种抗体风险的患者。
Kitazawa等人在2012年报道了从大约40,000种抗FIXa/X双特异性抗体的筛选中分离能够活化FX的FIXa/X双特异性抗体，所述双特异性抗体通过用人类FIXa或FX使92只实验动物免疫且将抗FIXa和抗FX抗体基因共转染到宿主细胞中以用于表达而产生[1]。精制所选择的抗体以产生命名为hBS23的人源化抗体，所述抗体在FVIII缺乏型血浆中展示凝血活性且在灵长类动物中展示活体内止血活性[1]。这种抗体的更强力版命名为hBS910[2]，以研究性药物名称ACE910，INN艾美赛珠单抗(emicizumab)进入临床试验。ACE910的研发发生在全球领先的抗体组之一中。然而，花费超过7年的时间来设计一种具有适当活体内功效且具有适用于临床规模制造的生物化学和生物物理学特性的分子。
在48名健康男性个体皮下接受剂量高达1mg/kg的ACE910的I期研究中，2名个体对抗ACE910抗体测试呈阳性[3]。据报告，抗体具有线性药代动力学特征和约4至5周的半衰期[3]。随后，依米珠单抗(Emicizumab)以高达3mg/kg的每周皮下剂量给予18名日本重度A型血友病患者，且报告所述药物减少间歇性使用凝血因子来控制这些患者的出血[4]。在2016年12月，据报告依米珠单抗在减少A型血友病患者出血的III期临床试验中满足其主要终点(“HAVEN1”研究)。据报告，与未接受防治性治疗的那些患者相比，用艾米珠单抗预防治疗的患者的出血量在统计学上显著减少。据报告，研究也已满足所有次要终点，包括在接受先前旁路试剂预防治疗的患者中进行的患者内比较中，艾米珠单抗预防治疗的出血量随时间推移在统计学上显著减少。因此，关于艾米珠单抗的功效数据令人鼓舞，但在HAVEN 1研究中患者的死亡增加了安全问题。审批通过的药物带有加框警告，其关于接受aPCC与艾米珠单抗组合的患者发生血栓性毛细血管病和血栓栓塞的风险。如上文所述，aPCC用于控制具有FVIII的抑制性抗体的患者(用双特异性抗体治疗的关键患者组)的出血。
重要的是应注意，血友病的管理需要在患者的一生中持续治疗，从诊断时刻(通常是在婴儿期)开始，且需要在无副作用的情况下为耐受的并且将在数十年或甚至一个世纪内保持有效的疗法。因此，与打算在较短持续时间(例如数周、数月或甚至数年)内给予的抗体相比，包含低免疫原性的长期安全性对抗血友病抗体具有更大的意义。
最近，WO2018/098363描述从人抗体酵母文库(Adimab)分离的与FIX和FX结合的双特异性抗体。WO2018/098363公开增加双特异性抗体的抗FIXa臂的亲和力导致FVIIIa活性增加(由测定中的凝血时间减少表示)。通过最初选择的“亲本”抗体的亲和力成熟产生双特异性抗体“BS-027125”，这增加了其FIXa结合臂的亲和力。据报告，BS-027125在一级凝血测定中达到约90％的FVIIIa样活性。当与艾米珠单抗相比时，报告BS-027125表现出与因子FIX酶原、FIXa酶原以及FX酶原结合的亲和力更高，和与FXa结合的亲和力更低(未检测到结合)。据报告，FIX结合臂“BIIB-9-1336”展示对FIXa(活化的FIX)的选择性结合优先于FIX酶原(蛋白水解活化之前的成熟FIX)，且发现其结合与由FVIIIa结合的FIXa表位重叠的表位。据报告，FX结合臂“BIIB-12-917”展示与FX酶原的选择性结合、与(活化)FXa缺乏可检测的结合，且结合位于活化肽(其存在于FX酶原而非FXa中)内的FX表位。随后，将进一步的突变引入到所选择的FIX结合抗体(包含BIIB-9-1336)中，以产生文库，从所述文库中选择对FIXa具有甚至进一步增加的特异性及/或亲和力的抗体。
发明内容
本发明涉及结合凝血因子FIXa和FX的改善的双特异性抗原结合分子。本发明的双特异性抗原结合分子增强FX对FXa的FIXa催化活化，且可有效地替代A型血友病患者中缺少的天然辅因子FVIIIa，以恢复患者血液的凝结能力。参见图2b。
如本文所报告，本发明人成功地产生大量具有研发作为治疗性产品的适合品质(包含增强FX活化的非常高的效能)的双特异性抗原结合分子。描述具有针对抗FIXa和抗FX的新颖结合位点的双特异性抗原结合分子，其可用于有效地替代凝血级联中的FVIIIa。具体地说，描述一种抗FIXa结合位点，其与大量不同的抗FX结合位点组合而具有高活性，且因此可并入到多种不同的FIXa-FX双特异性中，从而提供选择具有其它期望特性(例如易于制造)的双特异性抗体的灵活性。
在第一方面，本发明涉及双特异性抗原结合分子，其包括(i)包括FIXa结合位点的FIXa结合多肽臂，和(ii)包括FX结合位点的FX结合多肽臂。FIXa和/或FX结合多肽臂可能包括分别包括FIXa或FX结合位点的抗体Fv区。抗体Fv区为抗体VH-VL结构域对。VH结构域在VH结构域构架中包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，且VL结构域在VL结构域构架中包括LCDR1、LCDR2和LCDR3。多肽臂可包括抗体重链(任选地包括IgG恒定区的一个抗体重链)和/或抗体轻链。
因此，本发明的抗原结合分子可包括
第一和第二抗体Fv区，所述第一和第二抗体Fv区分别包括FIXa和FX的结合位点，以及
半衰期延伸区，用于延长活体内分子的半衰期。
半衰期延伸区可以是异源二聚区，其包括与第一抗体Fv区共价连接(例如作为融合蛋白质)的第一多肽和与第二抗体Fv区共价连接(例如作为融合蛋白质)的第二多肽，其中两个多肽与彼此共价地和/或非共价地配对。异源二聚区的第一和第二多肽可具有相同或不同的氨基酸序列。异源二聚区可包括一个或多个抗体恒定域，例如其可以是抗体Fc区。
本发明的双特异性抗原结合分子能够通过FIXa结合多肽臂的FIXa结合位点结合FIXa，且通过FX结合多肽臂的FX结合位点结合FX，且由此增强FX对FXa的FIXa催化活化。这可在如本文所描述的活体外FX活化测定中确定。
FIXa结合位点可由FIXa结合多肽臂中的互补决定区(CDR)集合提供，所述CDR集合包括HCDR1、HCDR2、HCDR3和/或LCDR1、LCDR2以及LCDR3，其中
HCDR1为SEQ ID NO:1
HCDR2为SEQ ID NO:2
HCDR3为SEQ ID NO:400
LCDR1为SEQ ID NO:6
LCDR2为SEQ ID NO:7，以及
LCDR3为SEQ ID NO:8。
FIXa结合多肽臂中的CDR集合可以是以下CDR集合，其中
HCDR1为SEQ ID NO:1
HCDR2为SEQ ID NO:2
HCDR3为SEQ ID NO:401、SEQ ID NO:402或SEQ ID NO:403。
LCDR1为SEQ ID NO:6
LCDR2为SEQ ID NO:7，以及
LCDR3为SEQ ID NO:8。
FIXa结合多肽臂中的CDR集合可以是以下CDR集合，其中HCDR1为SEQ ID NO:1
HCDR2为SEQ ID NO:2
HCDR3为SEQ ID NO:171
LCDR1为SEQ ID NO:6
LCDR2为SEQ ID NO:7，以及
LCDR3为SEQ ID NO:8。
FIXa结合位点可由FIXa结合多肽臂中的互补决定区(CDR)集合提供，所述CDR集合包括HCDR1、HCDR2、HCDR3和/或LCDR1、LCDR2以及LCDR3，其中
HCDR1为SEQ ID NO:140
HCDR2为SEQ ID NO:141
HCDR3为SEQ ID NO:142
LCDR1为SEQ ID NO:6
LCDR2为SEQ ID NO:7，以及
LCDR3为SEQ ID NO:8。
任选地，可将CDR集合中的一个或多个氨基酸突变成不同于这些序列。举例来说，CDR集合可包括1、2、3、4或5个氨基酸改变，一个或多个改变的残基在重链或轻链CDR中的任何一个或多个中。举例来说，CDR集合可包括一个或两个保守取代。突变选项(例如取代)可以通过本文中实例14中的分析(例如针对HCDR3)和/或通过实验测试来告知，以确认所得变体的生物特性。VH结构域、HCDR集合或HCDR3中的突变可包括用疏水性或带正电荷残基取代HCDR3 SEQ ID NO:171中的IMGT位置111.1处的Ile或HCDR3 SEQ ID NO:171中的IMGT位置111.1处的Ser，或由所述取代组成。优选地，HCDR3在这个位置包括疏水性残基，例如Ile、Leu、Val或Trp。Ile是特别优选的。
FIXa结合多肽臂可包括抗体VH结构域，所述结构域包括HCDR集合(HCDR1，HCDR2和HCDR3)。HCDR1的序列可以为SEQ ID NO:140，任选地具有一个或两个氨基酸改变(例如，取代)。HCDR2的序列可以为SEQ ID NO:141，任选地具有一个或两个氨基酸改变(例如，取代)。HCDR3的序列可以为SEQ ID NO:142，任选地具有一个或两个氨基酸改变(例如，取代)。HCDR1的序列可以是SEQ ID NO:1，任选地具有一个或两个氨基酸改变(例如，取代)。HCDR2的序列可以为SEQ ID NO:2，任选地具有一个或两个氨基酸改变(例如，取代)。HCDR3的序列可以为SEQ ID NO:3，任选地具有一个或两个氨基酸改变(例如，取代)。任选地，HCDR1序列为SEQ ID NO:140或SEQ ID NO:1。任选地，HCDR2序列为SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:2。任选地，HCDR3序列为SEQ ID NO:400、SEQ ID NO:401、SEQ ID NO:402、SEQ ID NO:403或SEQID NO:171。HCDR1的序列可以为SEQ ID NO:1。HCDR2的序列可以为SEQ ID NO:2。HCDR3的序列可以为SEQ ID NO:171。在一优选的实施例中，VH结构域包括HCDR1 SEQ ID NO:1、HCDR2SEQ ID NO:2和HCDR3SEQ ID NO:171。
FIXa结合多肽臂可包括抗体VL结构域，所述结构域包括LCDR集合(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。LCDR1的序列可以为SEQ ID NO:6，任选地具有一个或两个氨基酸改变(例如，取代)。LCDR2的序列可以为SEQ ID NO:7，任选地具有一个或两个氨基酸改变(例如，取代)。LCDR3的序列可以为SEQ ID NO:8，任选地具有一个或两个氨基酸改变(例如，取代)。
FIXa结合多肽臂的抗体Fv区可包括通过免疫球蛋白重链v，d和j基因片段的重组所产生的VH结构域，其中v基因片段为VH3-7(例如，VH3-7*01)，d基因片段为DH1-26(例如DH1-26*01)和/或其中j基因片段为JH6(例如JH6*02)，和/或其可包括通过免疫球蛋白轻链v和j基因片段重组所产生的VL结构域，其中v基因片段为VL3-21(例如VL3-21*d01)且j基因片段为JL3(例如JL3*02)。FIXa结合多肽臂的抗体Fv区可包括通过免疫球蛋白轻链v和j基因片段重组所产生的VL结构域，其中v基因片段为VL3-21(例如VL3-21d*01)且j基因片段为JL2(例如JL2*01)。
本发明中的FIXa结合多肽臂的VH结构域可在构架包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述构架包括一组构架区FR1、FR2、FR3以及FR4，其中：
FR1为SEQ ID NO:132
FR2为SEQ ID NO:133
FR3为SEQ ID NO:134，以及
FR4为SEQ ID NO:135，
或包括具有高达10个氨基酸改变的所述组构架区，例如在任何一个或多个构架区中可存在一个或两个保守取代。
FR1可具有氨基酸序列SEQ ID NO:132，其中在AVS基元中任选地用L取代F，用取代A和/或用A取代V。
FR2可具有氨基酸序列SEQ ID NO:133。
FR3可具有氨基酸序列SEQ ID NO:134，其中任选地在所述序列的第一残基位置用Y取代F，在第四残基位置用D取代A，在第十二残基位置用I取代M，在第十九残基位置用N取代K，在第二十一残基位置用L取代V和/或在所述序列的第二十三残基位置用L取代V。
FR4可具有氨基酸序列SEQ ID NO:135，其中任选地在第八残基位置用S取代T。
FIXa多肽结合臂的VH结构域的氨基酸序列可与SEQ ID NO:324共享至少90％序列一致性。序列一致性可以为至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。优选的是，VH结构域在HCDR3中的IMGT位置111.1处具有疏水性或带正电荷残基。HCDR3的长度可以是15个氨基酸。优选地，HCDR3在这个位置包括疏水性残基，例如Ile、Leu、Val或Trp。Ile是特别优选的。HCDR3可在IMGT位置110、位置111和/或位置112.1处包括Ser，例如其可在位置110、111和112.1中的两个或三个处包括Ser。本发明中的VH结构域的HCDR3的氨基酸序列任选地为SEQID NO:400、SEQ ID NO:401、SEQ ID NO:402、SEQ ID NO:403或SEQ ID NO:171。
VH结构域的氨基酸序列可与SEQ ID NO:5共享至少90％序列一致性。序列一致性可以是至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。
任选地，VH结构域氨基酸序列为SEQ ID NO:324。任选地，VH结构域氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
本发明中的FIXa结合多肽臂的VL结构域可在架构中包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，架构包括一组架构区FR1、FR2、FR3以及FR4，其中：
FR1为SEQ ID NO:136
FR2为SEQ ID NO:137
FR3为SEQ ID NO:138，以及
FR4为SEQ ID NO:139，
或包括具有高达10个氨基酸改变的所述组架构区，例如在任何一个或多个架构区中可存在一个或两个保守替代。
VL结构域的氨基酸序列可与SEQ ID NO:10共享至少90％的序列一致性。序列一致性可以是至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。任选地，VL结构域氨基酸序列为SEQID NO:10。
即使当在双特异性分子的上下文之外以单特异性形式提供时，本发明的双特异性抗原结合分子的FIXa结合多肽臂可能够增强FX对FXa的FIXa催化活化。这可在如本文所描述的活体外FX活化测定中确定。
表面等离子共振可用于确定与FIXa和FX结合，且量化多肽臂对抗原结合的亲和力。
FX结合位点可以由FX结合多肽臂中的一组CDR提供。FX结合多肽臂可以包括抗体VH-VL结构域对(即，抗体Fv区)，VH结构域在框架中包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，和VL结构域在框架中包括LCDR1、LCDR2和LCDR3。
FX结合位点可由抗体T02的CDR提供，即，包括HCDR1、HCDR2、HCDR3和/或LCDR1、LCDR2以及LCDR3的一组CDR，其中
HCDR1为SEQ ID NO:57
HCDR2为SEQ ID NO:58
HCDR3为SEQ ID NO:59
LCDR1为SEQ ID NO:62
LCDR2为SEQ ID NO:63，以及
LCDR3为SEQ ID NO:64。
FX结合多肽臂可以包括与T02 VH结构域SEQ ID NO:61具有至少90％氨基酸序列一致性的VH结构域，和/或可包括与T02 VL结构域SEQ ID NO:66具有至少90％氨基酸序列一致性的VL结构域。序列一致性可以是至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。任选地，VH结构域氨基酸序列为SEQ ID NO:61。任选地，VL结构域氨基酸序列为SEQ ID NO:66。
FX结合位点可由抗体T05的CDR提供，即，包括HCDR1、HCDR2、HCDR3和/或LCDR1、LCDR2以及LCDR3的一组CDR，其中
HCDR1为SEQ ID NO:67
HCDR2为SEQ ID NO:68
HCDR3为SEQ ID NO:69
LCDR1为SEQ ID NO:72
LCDR2为SEQ ID NO:73，以及
LCDR3为SEQ ID NO:74。
FX结合多肽臂可以包括与T05 VH结构域SEQ ID NO:71具有至少90％氨基酸序列一致性的VH结构域，和/或可以包括与T05 VL结构域SEQ ID NO:76具有至少90％氨基酸序列一致性。序列一致性可以是至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。任选地，VH结构域氨基酸序列为SEQ ID NO:61。任选地，VL结构域氨基酸序列为SEQ ID NO:76。
FX结合位点可由抗体T14的CDR提供，即，包括HCDR1、HCDR2、HCDR3和/或LCDR1、LCDR2以及LCDR3的一组CDR，其中
HCDR1为SEQ ID NO:96
HCDR2为SEQ ID NO:97
HCDR3为SEQ ID NO:98
LCDR1为SEQ ID NO:101
LCDR2为SEQ ID NO:92，以及
LCDR3为SEQ ID NO:102。
FX结合多肽臂可以包括与T14 VH结构域SEQ ID NO:100具有至少90％氨基酸序列一致性的VH结构域，和/或可以包括与T14 VL结构域SEQ ID NO:104具有至少90％氨基酸序列一致性的VL结构域。序列一致性可以是至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。任选地，VH结构域氨基酸序列为SEQ ID NO:100。任选地，VL结构域氨基酸序列为SEQ ID NO:104。
FX结合多肽臂可以包括抗体Fv区，其包括：
(a)VH结构域，其通过免疫球蛋白重链v、d和j基因片段的重组而产生，其中v和J基因片段为VH1-3(例如VH1-3*01)和JH6(例如JH6*02)，以及
VL结构域，其通过免疫球蛋白轻链v和j基因片段的重组而产生，其中v和j基因片段为VL1-47(例如VL1-47*01)和JL1(例如JL1*01)；或
(b)VH结构域，其通过免疫球蛋白重链v、d和J基因片段的重组而产生，其中v和J基因片段为VH3-30(例如VH3-30*18)和JH6(例如JH6*02)，以及
VL结构域，其通过免疫球蛋白轻链v和j基因片段的重组而产生，其中v和j基因片段为VL2-8(例如VL2-8*01)和JL2(例如JL2*01)；或
(c)VH结构域，其通过免疫球蛋白重链v、d和J基因片段的重组而产生，其中v和j基因片段为VH4-61(例如VH4-61*01)和JH1(例如JH1*01)，以及
VL结构域，其通过免疫球蛋白轻链v和j基因片段的重组而产生，其中v和j基因片段为VK3-11(例如VK3-11*01)和JK5(例如JK5*01)。
FX结合多肽臂可以包括抗体Fv区，所述抗体Fv区包括通过免疫球蛋白重链v、d和j基因片段重组所产生的VH结构域，其中v和j基因片段为：
VH1-3(例如VH1-3*01)和JH6(例如JH6*02)，
VH3-30(例如VH3-30*18)和JH6(例如JH6*02)，
VH3-33(例如VH3-33*01)和JH6(例如JH6*02)，
VH4-31(例如VH4-31*03)和JH4(例如JH4*02)，或
VH4-59(例如VH4-59*01)和JH4(例如JH4*02)，以及
VL结构域。
FX结合多肽臂可以包括抗体Fv区，所述抗体Fv区包括通过免疫球蛋白轻链v和j基因片段重组所产生的VL结构域，其中v基因片段为VL3-21(例如VL3-21*d01)且j基因片段为JL3(例如JL3*02)。
FIXa结合多肽臂和FX结合多肽臂可以各自包括抗体Fv，其中每个Fv的VL结构域具有相同的氨基酸序列，即双特异性抗原结合分子具有共同的VL结构域。分子可具有共同轻链，所述轻链包括可变区和恒定区，任选地包括人类λ恒定区。
双特异性抗原结合分子可以是四聚免疫球蛋白，其包括
第一对抗体重链和轻链(重-轻链对)，其包括FIXa结合Fv区，
第二重-轻链对，其包括FX结合Fv区，
其中每个重链包括VH结构域和恒定区，且每个轻链包括VL结构域和恒定区，且其中第一和第二重-轻链对通过其重链恒定区的异源二聚缔合，从而形成免疫球蛋白四聚体。如所指出，轻链可以是共同轻链，即，第一和第二重-轻链对的轻链具有相同的氨基酸序列。示例性免疫球蛋白同种型包含人类IgG，例如IgG4，任选地具有例如IgG4 PE的工程化恒定结构域。
此处示例的双特异性抗体的有利特征是其已经使用Kymouse平台从人类免疫球蛋白基因片段产生。与从正常实验动物免疫产生的抗体不同，所述抗体可需要“人源化”步骤，例如将小鼠CDR移植到人类抗体可变结构域中，且对工程化可变结构域重复优化以减轻由这些变化引起的功能缺失，本发明的抗体是从具有全人类抗体可变结构域的开始中产生且选择的。如上所述，在血友病治疗的背景下，全人类抗体的用途具有特定相关性，其中低免疫原性是至关重要的。本发明的双特异性抗体的低免疫原性使其适用于治疗A型血友病患者，所述患者包含那些对其它治疗(例如FVIII)具有或不具有抑制性抗体的患者。接受本发明的抗原结合分子的患者应该处于对疗法产生免疫原性反应的最小风险中。
双特异性分子的作用方式也与良好的安全分布相关，具有例如深层静脉栓塞和肺栓塞的并发症的低风险。双特异性分子的活性可与天然FVIII的活性类似，且整合到现有的凝血途径中的作用机制仅在天然凝血级联的上游触发的情况下活化。
其它期望特征包含长半衰期(减少所需的给药频率)和分子在高浓度下对调配物的可控制性(便于在家中皮下注射)。
本发明的其它方面涉及医药组合物，其包括双特异性抗原结合分子、其编码核酸、各别多肽结合臂、用于产生分子的系统和方法以及其在医学中的用途(包含用于治疗A型血友病)，如所附权利要求书中陈述和在本公开中所描述的。
附图说明
图1 凝血级联[5]。
图2 A.FVIIIa与FIXa和FX相互作用的辅因子作用。
B.双特异性抗体与FIXa和FX相互作用的辅因子作用。
图3 因子IX的氨基酸序列，具有成熟蛋白的残基编号。分泌后，信号肽(带直线下划线)被裂解。前肽(带波纹下划线)在成熟时被裂解。成熟因子IX含有轻链(残基1-145)和重链(残基146-415)。在活化时裂解活化肽(加框)，产生活化的因子IXa，其含有通过Cys132与Cys289之间的二硫键连接的轻链(残基1-145)和重链(残基181-415，粗体)。
图4 因子X的氨基酸序列，具有残基编号。残基1-31为信号肽(带直线下划线)。残基32-40为前肽(带波纹下划线)。FX轻链为残基41-179。FX重链为残基183-488。FXa重链为残基235-488(粗体)。
图5A、B 双特异性IgG。(A)具有共同轻链的双特异性IgG。(B)具有不同轻链的双特异性IgG。
图5C、D 双特异性IgG片段。(C)F(ab')2。(D)串联的scFv。
图6 双特异性抗体的FIT-Ig形式。(i)组装的FIT-Ig抗体(ii)FIT-Ig抗体中包含的多肽链。构建体#1是在N到C方向上含有抗体“A”的轻链可变(VL)和轻链恒定(CL)区的多肽，其与抗体“B”的重链可变(VH)和重链恒定区(CH1、CH2、CH3)稠合。优选地，CL与VHB结构域之间不包含连接基团。构建体#2是抗体“A”的重链可变(VH)区和CH1的多肽融合体。构建体#3是抗体“B”的轻链可变(VL)和轻链恒定(CL)区的多肽融合体。可以抗体“A”作为抗FIXa和抗体“B”作为抗FX，或以抗体“A”作为FX和抗体“B”作为抗FIXa来构建FIT-Ig。
图7 A.如实例9中所描述的活体外测定双特异性分子的FVIII模拟物活性的原理。
B.来自实例9中所描述的测定的实例数据展示与阴性对照物相比FIXa-FX双特异性分子的阳性结果。
图8 在酶(tenase)测定中对双特异性抗体进行初步高通量功能筛选的结果。
图9 N128H突变体表。
图10 N128H CDR3突变体的FXase活性。
图11 aPTT测定中的N128H CDR3突变体的FVIII模拟物活性。
图12 因子IX特异性臂N436的活体外酶(FXase)测定活性。
图13 包括N436H VH结构域和N128L VL结构域(提供FIX结合位点)的与FX结合位点异源二聚的双特异性抗体的aPTT测定活性，所述FX结合位点由(i)T02H VH结构域和T02LVL结构域、(ii)T05H VH结构域和T05L VL结构域或(iii)T14H VH结构域和T14L VL结构域提供。
具体实施方式
血液凝结
凝血级联在图1中用图表示。凝血(coagulation/clotting)是最重要的生物过程之一，其阻止受损血管失血，从而使血管修复。凝血机制涉及血小板的活化、粘附和聚集以及纤维蛋白的沉积和成熟。凝血失调可导致过多出血(血友病)或阻塞性凝血(血栓)。凝血在所有哺乳动物中高度保守。其由复杂的凝血因子网络控制。当内衬血管的内皮受损时，开始凝血。内皮下组织因子(TF)暴露于血浆因子VII(FVII)导致原发性止血(外部途径)：在受伤部位形成松动的栓塞。其它凝血因子(尤其是因子IX(FIX)和因子VIII(FVIII))的活化导致继发性止血(内部途径)：形成纤维蛋白链以增强栓塞。外部和内部途径最终汇聚到共同点：因子Xa/Va复合物的形成，所述复合物与钙一起且结合在磷脂表面上，从凝血酶原(因子II)产生凝血酶(因子IIa)。
FVIII由凝血酶或因子Xa(FXa)裂解，且所得因子VIIIa(FVIIIa)呈现由A1亚基、A2亚基以及轻链组成的异源三聚体结构。在活化和存在钙离子和磷脂表面(在血小板上)时，FVIIIa通过其轻链和A2亚基与FIXa结合且同时通过其A1亚基与FX结合，形成活性的内在“酶”或“Xase”复合物，其中FVIIIa辅因子使FIXa和FX接近且还变构地提高FIXa的催化速率常数。参见图2a。因子X由FIXa的丝氨酸蛋白酶活性活化，且凝血级联持续进行，最终导致纤维蛋白沉积、血液凝块的结构性聚合物。
由于缺乏FVIII辅因子活性(血友病A)或缺乏FIX酶活性(血友病B)，Xase复合物缺乏会导致血友病。
因子IX(FIX)
因子IX为需要因子VIII作为辅因子的丝氨酸蛋白酶。如上文所论述，其在血液中作为无活性前体循环，所述前体在止血挑战时通过内在或外在途径活化。
除非上下文另有要求，在本文中所指出的因子IX为人类因子IX，且因子IXa为人类因子IXa。
人类因子IX的氨基酸序列展示于图3中。因子IX基因的长度约为34kb，且含有8个外显子。转录物包括短的5'非翻译区，开放阅读框架加上终止密码子和3'非翻译区。ORF编码461个氨基酸的前原蛋白，其中前序列(信号肽)引导因子IX分泌，前肽序列提供维生素K依赖性羧化酶的结合域，所述酶将相邻GLA结构域中的某些谷氨酸残基羧化，且其余部分代表因子IX酶原，所述酶原在除去前序列和原序列后进入循环。成熟的415残基FIX蛋白质从N端到C端含有：GLA结构域，其中12个谷氨酸残基翻译后经γ-羧基化；两个表皮生长因子(EGF)-样结构域；活化肽序列和催化丝氨酸蛋白酶结构域。FIX由通过内在途径产生的活化因子XI或由外在途径的TF/FVIIa复合物活化。无论如何，活化涉及R145之后的肽键裂解(α裂解)和R180之后的肽键裂解(β裂解)，释放与插入序列对应的活化肽，且由此产生活化的FIXa分子，所述分子具有由轻链的C132与重链的C289之间的二硫桥键连接的N端轻链(GLA-EGF-EGF)和C端重链(催化结构域)。残基编号是指成熟的FIX多肽序列中的氨基酸。在Xase复合物形成的磷脂表面上，其是与磷脂缔合的FIXa的GLA结构域，而催化结构域高于磷脂表面上方
Figure BDA0002322205310000171
且受FVIIIa的A2结构域调节[6，7]。
B型血友病的分子基础-FIXa活性的缺乏-是多种多样的，其包含多种点突变、无义突变、mRNA剪接位点突变、缺失、插入或活化裂解位点处的错意突变[8]。
活化的FIX(FIXa)的催化(蛋白酶)结构域涉及与FVIIIa的结合。这个结构域中的残基E245与钙离子结合，且这个位置的突变可减少与FVIII的结合并且导致B型血友病，例如取代E245V。由残基330-338形成的FIX螺旋内的突变也与FVIII的结合减少有关，因此也与B型血友病有关。
因子IX中的非病原性突变也已报告，包含单核苷酸多态性(SNP)和长度多态性-评论于在[8]中。这些包含外显子6中的MnII SNP，导致残基148发生T/A取代(
Figure BDA0002322205310000181
多态性)，这在美国白人和黑人中相对普遍[8]。
因子X(FX)
除非上下文另外要求，否则本文中提及的因子X为人类因子X，且因子Xa为人类因子Xa。人类FX的氨基酸序列展示在图4中。
FX也称为Stuart-Prower因子。所述因子是一种丝氨酸内肽酶。FX可以通过水解由因子IX(与其辅因子、因子FVIII一起，如上文所述)或因子VII(与其辅因子、组织因子一起)活化成因子Xa。FX通过在两个位置-在Arg-Thr键且随后在Arg-Ile键裂解凝血酶原来发挥作用，以产生活性凝血酶。
抗原结合
双特异性抗原结合分子的期望特征是其以允许结合的FIXa活化结合的FX的方式来结合FIXa和FX。
为了使FIXa和FX结合在一起，且由此促进FIXa对FX的活化，双特异性抗原结合分子可以同时结合这两个辅因子。结合可以连续发生，例如，在第一结合臂与其同源抗原之间可以形成初始二元复合物，随后第二结合臂与其同源抗原结合。原则上，这两个结合事件可以按任一顺序发生，即FIXa后接着FX，或FX后接着FIXa。分子编排受两个结合位点对其相应抗原的相对亲和力的影响。在双特异性抗原结合分子FIXa和FX群体中，许多不同的复合物期望并行存在。因此，库将包括游离抗原结合分子、游离FIXa、游离FX、与抗原结合分子复合的FIXa、与抗原结合分子复合的FX以及FIX、FX和抗原结合分子的三元复合物，其中这些物质中的每一个根据个体相互作用的相对结合速率和解离速率以不同比例存在。
可能优选的是双特异性抗原结合分子对FIXa的亲和力比对FX的亲和力高。将设想这种双特异性分子与FIXa形成初始复合物，其继而结合且活化FX。对FX的相对较低亲和力降低在不完整抗体-抗原复合物(即不含FIXa)中结合的FX的比例。这样的潜在优势在于，其使更大比例的FX保持游离，以与患者血液中可能存在的任何FVIII结合。A型血友病涵盖FVIII的一系列缺陷，范围是从轻度缺乏到完全不存在功能性FVIII。对于那些保留某些功能性FVIII的患者，可能希望尽可能保留这种天然活性。因此，可能需要提供双特异性抗原结合分子，其中FX结合臂不与FVIII竞争结合FX。
优选地，FX结合臂对FX的亲和力高于对FXa的亲和力。对FXa的低亲和力促进活化产物的释放，从而完成FVIII模拟分子在凝血级联中的作用，且释放FX结合位点以供再次使用。
-FIXa结合
双特异性抗原结合分子的FIXa结合臂可以结合FIXa的轻链和/或重链。初步研究表明，实例中所描述的N128谱系的FIXa结合臂不会单独(在不存在重链的情况下)结合FIXa轻链。
因此，本发明的双特异性抗原结合分子(或其FIXa结合多肽臂)可以是结合包括重链和轻链的FIXa分子并且在不存在重链的情况下不结合FIX轻链的一个分子。任选地，FIXa结合臂识别由FIXa重链和轻链的组合形成或由其稳定的表位。其可以例如仅与FIXa分子中的轻链进行接触，结合仅当轻链与FIXa分子中的重链组合存在时才暴露或稳定的表位。或者，其可以接触包括一个或多个来自轻链和重链的残基或仅包括重链的残基的表位。
根据本发明的抗原结合分子或其FIXa结合多肽臂可以下列亲和力(测量为KD)结合人类FIXa的EC结构域：10mM或更小、优选地5mM或更小、更优选地1mM或更小。举例来说，KD可以在1nM与3μM之间。
结合人类FIXa的KD可以在0.1μM与1μM之间，例如在0.15与0.3μM之间。KD可以是0.6μM或更小、0.5μM或更小、0.4μM或更小、0.3μm或更小、0.25μM或更小或2μM或更小。KD可以是至少0.1μM，例如至少0.2μM。
KD可以是50nM或更小、10nM或更小、5nM或更小、2nM或更小或1nM或更小。KD可以是0.9nM或更小、0.8nM或更小、0.7nM或更小、0.6nM或更小、0.5nm或更小、0.4nM或更小、0.3nM或更小、0.2nM或更小，或0.1nM或更小。KD可以是至少0.001nM，例如至少0.01nM或至少0.1nM。KD可以在0.1到10nM之间。
根据本发明的抗原结合分子或其FIXa结合多肽臂可以下列亲和力(测量为KD)结合人类FIX：在0.1μM与1μM之间，例如在0.15与0.3μM之间。KD可以是0.6μM或更小、0.5μM或更小、0.4μM或更小、0.3μm或更小、0.25μM或更小或2μM或更小。KD可以是至少0.1μM，例如至少0.2μM。
与FIX相互作用的KD可类似于与FIXa相互作用的KD，例如，与对FIXa的亲和力相比，在FIXa-结合臂对FIX的亲和力中可存在小于25％、任选地小于10％的差异。与FIXa相比，与FIX相互作用的KD可不存在统计学上显著的差异。
如本文其它地方所描述，可以使用表面等离子共振(SPR)来确定亲和力，例如，将结合臂耦结到固体表面，任选地作为二聚体(例如，作为单特异性IgG)，并且在25℃下将溶液中的抗原作为分析物。
-FX结合
根据本发明的抗原结合分子或其FX结合多肽臂可以下列KD结合人类FX的EC结构域：10mM或更小、优选地为5mM或更小、更优选地为1mM或更小。举例来说，KD可以在5μm与1nM之间，例如在5μM与10nM之间。
KD可以在0.1μM与1μM之间，例如在0.15与0.3μM之间。KD可以是0.6μM或更小、0.5μM或更小、0.4μM或更小、0.3μm或更小或0.25μM或更小。KD可以是至少0.1μM。
KD可以是50nM或更小、10nM或更小、5nM或更小、2nM或更小或1nM或更小。KD可以是0.9nM或更小、0.8nM或更小、0.7nM或更小、0.6nM或更小、0.5nM或更小、0.4nM或更小、0.3nM或更小、0.2nM或更小或0.1nM的或更小。KD可以是至少0.001nM，例如至少0.01nM或至少0.1nM。举例来说，KD可以在1到100nM之间。KD可以在1到10nM之间。
如本文其它地方所描述，可以使用表面等离子共振(SPR)来确定亲和力，例如，将结合臂耦结到固体表面，任选地作为二聚体(例如，作为单特异性IgG)，并且在25℃下将溶液中的抗原作为分析物。
-抗原结合亲和力的测量
抗原结合分子结合FIX、FIXa、FX和FXa的亲和力可以根据平衡解离常数KD，结合相互作用的缔合或缔合速率(Ka)与解离或解离速率(kd)的比率Ka/Kd而量化。抗原结合的KD、Ka和Kd可以使用表面等离子共振(SPR)测量。
可以使用SPR用呈单价形式的抗原结合多肽臂(例如，包括抗原结合位点的抗体Fab或Fv)或具有所讨论抗原的单个抗原结合臂的异二聚体免疫球蛋白(例如IgG)进行亲和力的量化。或者，如实例3和实例6中或实例15到16中所展示，可以方便地确定对二价形式的抗原结合多肽臂的亲和力，例如包括同源二聚体抗原结合臂的IgG。SPR可以包括将抗原结合多肽臂的二聚体涂布到生物传感器芯片上(直接地或间接地)，将抗原结合多肽臂在一定浓度范围的缓冲溶液中暴露于抗原，检测结合，并计算结合相互作用的平衡解离常数KD。可以在25℃下进行SPR。合适的缓冲溶液是150mM NaCl、0.05％清洁剂(例如P20)和3mM EDTA，pH 7.6。具有2.5mM CaCl2的HBS-P 1X(10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％聚山梨醇酯20pH 7.6)是实例缓冲液。可以使用标准算法将结合数据拟合为1:1模型，这可能是所用仪器固有的。多种SPR仪器是已知的，例如BiacoreTM、ProteOn XPR36TM
Figure BDA0002322205310000211
和(Sapidyne Instruments,Inc)。
-交叉反应
监管机构可能需要候选治疗性分子，以在其进行人类临床试验之前在实验动物中表明治疗功效。后天性A型血友病动物模型的实例是食蟹猕猴，其通过给予FVIII中和抗体或针对FVIII的小分子抑制剂而在凝血方面呈现缺陷，从而复制人类A型血友病患者的表型。为了能够在动物模型中测试双特异性抗原结合分子，需要每个臂的结合位点与来自一个或多个非人类哺乳动物的相应抗原发生交叉反应。因此，抗原结合分子的FIXa结合位点可以结合鼠类(例如小鼠或大鼠)、兔或非人类灵长类动物(例如食蟹猕猴)FIXa以及人类FIXa，且FX结合位点可以结合鼠类(例如小鼠或大鼠)、兔或非人类灵长类动物(例如食蟹猕猴)FXa以及人类FXa。
量化抗原结合分子(或更确切地说，其抗原结合位点)的物种交叉反应程度的一种方法是与另一物种的抗原相比，其对抗原或一个物种的亲和力倍数差异，例如对人类抗原与食蟹猕猴抗原的亲和力的倍数差异。亲和力可量化为KD，指代抗原与抗原结合分子的结合的平衡解离常数。KD可以通过如本文别处所描述的SPR来确定。
物种交叉反应性结合分子对结合人类和非人类抗原的亲和力可具有30倍或更小、25倍或更小以下、20倍或更小以下、15倍或更小以下、10倍或更小或5倍或更小的倍数差异。换句话说，结合人类抗原的胞外结构域的KD可以是结合非人类抗原的胞外结构域的KD的30倍、25倍、20倍、15倍、10倍或5倍内。
优选地，人类和非人类抗原的结合亲和力在10倍或更小的范围内、更优选地在5倍内或在2倍内。结合非人类FIXa的KD(例如，通过表面等离子共振确定)可比结合人FIXa的Kd高达10倍(优选地高达5倍或高达2倍)或低达10倍(优选地低达5倍或低达2倍)。类似地，结合非人类FX的KD(例如，如通过SPR确定)可比结合人类FX的Kd高达10倍(优选地高达5倍或高达2倍)或低达10倍(优选地低达5倍或低达2倍)。确定亲和力的方法在本文其它地方描述。
结合分子也可以视为物种交叉反应，如果用于结合这两个物种抗原的KD满足阈值，例如，如果结合人类抗原的KD和结合非人类抗原的KD都为10mM或更小、优选地5mM或更小、更优选地1mM或更小。KD可以是10nm或更小、5nM或更小、2nM或更小或1nM或更小。KD可以是0.9nM或更小、0.8nM或更小、0.7nM或更小、0.6nM或更小、0.5nm或更小、0.4nM或更小、0.3nM或更小、0.2nM或更小或0.1nM或更小。
尽管针对不同物种的结合抗原的物种交叉反应可以是有利的，但是仍希望FIXa结合臂和FX结合臂对其相应抗原具有选择性，以避免不必要的副作用。因此，在体内，FIX/FIXa和FX/FXa优选地是由抗原结合分子结合的唯一抗原。
FIXa介导的FX活化的增强
双特异性抗原结合分子增强FIXa介导的FX对FXa的活化的能力可以在活体外或活体内测定中确定。
合适的活体外测定是在实例9中举例说明且在图7中所说明的FX活化测定。测定包括
(i)在适合于形成FXa的条件下(例如，在存在磷脂的情况下，在37℃的缓冲溶液中)使双特异性抗原结合分子与FIXa和FX接触
(ii)添加可由FXa裂解的底物以产生可检测的产物，以及
(iii)检测并任选地量化可检测产物的存在。
可以将产物水平与对照测定比较，在所述对照测定中反应混合物中不存在FIXa-FX双特异性抗原结合分子。与对照相比，双特异性测定的产物水平中的显著差异表明双特异性能够增强FIXa介导的FX活化。FVIII可以包含为阳性对照。
产物水平可以与在其中FIXa-FX双特异性抗原结合分子为艾米珠单抗的测定进行比较。根据本发明的双特异性可以将FIXa介导的FX对FXa的活化增强到与艾米珠单抗相同或相似的程度(例如，在10％以内的差异或5％以内的差异)或到更大程度(例如，如由可检测产物的水平所测量，FX对FXa的活化比通过艾米珠单抗实现的活化超过10％)。
另一种合适的测定是在FVIII缺乏的血浆中测量活化部分凝血活酶时间(aPTT)，其可以在存在或不存在抑制剂的情况下进行，且可用于比较双特异性分子与重组人类FVIII的活性。在实例10和实例18中举例说明这个测定。aPTT为终点测定，其提供血凝块形成的整体概况且提供作为测定读数的凝血时间。在aPTT测定中，缺乏FVIII的血浆的凝结时间通常约为80到90秒。本发明的双特异性抗原结合分子可有效减少aPTT测定中的凝结时间(与阴性对照相比)。在用本发明的双特异性抗原结合分子的aPTT测定中缺乏人类FVIII的凝血时间可例如与使用重组人类FVIIIa的凝血时间相同或更少。正常(FVIII+)人类血浆的生理凝结时间通常是<40秒，例如在37到34s的范围内。在提供活化的FVIIIa后，使用缺乏FVIII的血浆可获得相似值，这提供通过根据参考值对装置/测量进行校准来标准化测定的方便方式。或者，正常(FVIII+)人类血浆的凝结时间可用于参考，aPTT测定是通过添加钙诱导凝结而开始。
本发明的双特异性抗原结合分子在aPTT测定中的凝结时间可以是FVIIIa的凝结时间的10秒以内(即，比用FVIIIa的aPTT测定的凝结时间多至多10秒或比其少至多10秒)。优选地，在用本发明的双特异性抗原结合分子的aPTT测定中的凝结时间少于用FVIIIa的凝结时间。双特异性抗原结合分子可以将凝结时间减少到小于40秒、小于35秒或小于30秒。凝结时间可以在20与40秒之间，例如在20与30秒之间。
双特异性抗原结合分子
双特异性抗原结合分子包括FIXa结合多肽臂和FX结合多肽臂。其可以是多链或单链多肽分子。尽管FIXa结合多肽臂和FX结合多肽臂表示双特异性分子的不同部分，但一个多肽可任选地形成FIXa结合臂和FX结合臂的全部或部分。
多肽结合臂是双特异性分子的区域，其包括用于抗原(FIXa或FX)之一的结合位点。双特异性分子的一个或两个抗原结合位点可以由多肽臂中的一组互补决定区(或肽环)提供，其中多肽臂是任何合适的支架多肽，无论是抗体(例如抗体Fv区)或非抗体分子。结合臂可以包括一个或超过一个(例如，两个)多肽或其部分(例如，结构域)。
在本文中参考双特异性抗体详细描述本发明，其中抗原结合多肽臂中的至少一个是由在抗体VH和/或VL结构域(任选地Fv区)中的一组CDR提供。
抗体是免疫球蛋白或包括免疫球蛋白结构域的分子。抗体可以是IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子或包含其抗原特异性抗体片段的分子。术语“抗体”涵盖任何包括抗体抗原结合位点的多肽或蛋白质。抗体抗原结合位点(互补位)是抗体与其靶抗原的表位结合且互补的部分。术语“表位”是指由抗体结合的抗原区域。表位可以定义为结构性或功能性的。功能性表位通常是结构性表位的子集，且具有直接有助于相互作用的亲和力的那些残基。表位还可以是构形性的，即由非直链氨基酸构成。在某些实施例中，表位可以包含作为分子的化学活性表面基团的决定子，所述基团例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施例中，可具有特异性三维结构特征和/或特异性电荷特征。
抗体抗原结合位点由抗体VH和/或VL结构域中的一组互补决定区(CDR)提供，且能够结合抗原。在一实例中，抗体结合位点由单个可变域，例如重链可变结构域(VH结构域)或轻链可变结构域(VL结构域)提供。在另一个实例中，结合位点由VH/VL对(Fv)或两个或更多个这种对提供。
抗体可变结构域是抗体轻链和重链的部分，其包含互补决定区(CDR；即CDR1、CDR2和CDR3)和构架区(FR)的氨基酸序列。因此，在VH和VL结构域中的每一个内的是CDR和FR。VH结构域包括一组HCDR，且VL结构域包括一组LCDR。VH是指重链的可变结构域。VL是指轻链的可变结构域。每个VH和VL通常由三个CDR和四个FR组成，其按以下顺序从氨基端排列到羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。可以根据IMGT命名法界定分配给CDR和FR的氨基酸位置。抗体可包括抗体VH结构域(包括VH CDR1、CDR2和CDR3)和架构。所述抗体可替代地或还可包括抗体VL结构域(包括VL CDR1、CDR2和CDR3)及构架。抗体VH和VL结构域以及CDR的实例序列形成本公开的一部分。根据IMGT系统界定CDR[9]。本文中所公开的所有VH和VL序列、CDR序列、CDR组和HCDR组和LCDR组代表本发明的方面和实施例。如本文所描述，“CDR组”包括CDR1、CDR2和CDR3。因此，一组HCDR是指HCDR1、HCDR2和HCDR3，且一组LCDR是指LCDR1、LCDR2和LCDR3。除非另有说明，否则“CDR组”包含HCDR和LCDR。
抗体可在抗体架构内包括一个或多个CDR，例如一组CDR。构架区可具有人类生殖系基因片段序列。因此，抗体可以是具有VH结构域的人类抗体，所述VH结构域包含人类生殖系构架中的HCDR组。通常，抗体还具有包括例如在人类生殖系构架中的一组LCDR的VL结构域。抗体“基因片段”(例如VH基因片段，D基因片段或JH基因片段)是指具有作为抗体的部分来源的核酸序列的寡核苷酸，例如，VH基因片段是包括从FR1到CDR3的部分对应于多肽VH结构域的核酸序列的寡核苷酸。人类v、d和j基因片段重组以产生VH结构域，且人类v和j片段重组以产生VL结构域。D结构域或区域是指抗体链的多样性结构域或区域。J结构域或区域是指抗体链的接合结构域或区域。体细胞超突变可产生具有构架区的抗体VH或VL结构域，所述构架区不与对应的基因片段精确匹配或比对，但序列比对可用于识别最接近的基因片段，且因此识别从哪个特定的基因片段组合中衍生出特定的VH或VL结构域。当使抗体序列与基因片段比对时，抗体氨基酸序列可以与由基因片段编码的氨基酸序列比对，或抗体核苷酸序列可以与基因片段的核苷酸序列直接比对。表12中指出与本文所描述的实例抗体的构架区相对应的生殖系基因片段。
抗体可以是包含恒定区的整个免疫球蛋白，或可以是抗体片段。抗体片段是完整抗体的一部分，例如包括完整抗体的抗原结合和/或可变区。抗体片段可包含一个或多个恒定区结构域。
本发明的抗体可以是包括人类可变区和非人类(例如小鼠)恒定区的人类抗体或嵌合抗体。本发明的抗体例如具有人类可变区，且任选地还具有人类恒定区。
因此，抗体任选地包含恒定区或其部分，例如人类抗体恒定区或其部分，例如人类IgG4恒定区。举例来说，VL结构域可在其C端末端附接到抗体轻链κ或λ恒定结构域。类似地，抗体VH结构域可在其C端末端附接到所有或部分免疫球蛋白重链恒定区(例如CH1结构域或Fc区)，所述免疫球蛋白重链恒定区来源于任何抗体同种型(例如IgG、IgA、IgE和IgM)和同种型亚类中的任一个(例如IgG1或IgG4)。
可产生具有非人类恒定区的抗体。举例来说，当在转基因动物中产生抗体(其实例在本文其它地方描述)时，可以产生包括人类可变区和非人类恒定区的嵌合抗体。恒定区可以是对宿主动物(例如小鼠)为内源性的那些区域。一些转基因动物产生完全人类抗体。已设计出其它抗体来产生包括嵌合重链和完全人类轻链的抗体。当抗体包括一个或多个非人类恒定区时，这些非人类恒定区可以由人类恒定区替代以提供更适用于作为治疗性组合物向人类给予的抗体，这是由于其免疫原性由此降低。
用木瓜蛋白酶分解整个(二价)免疫球蛋白产生两个相同的(单价)抗原结合片段，称为“Fab”片段和“Fc”片段。Fc不具有抗原结合活性，但具有结晶能力。当在本文中使用时，“Fab”是指包含重链和轻链中的每一个的一个恒定结构域和一个可变结构域的抗体片段。本文中的术语“Fc区”用于限定免疫球蛋白重链的C端区域，其包含天然序列Fc区和变体Fc区。“Fc片段”是指通过二硫键连接在一起的两条H链的羧基端部分。
用胃蛋白酶分解抗体产生二价F(ab')2片段，其中抗体分子的两个臂保持连接。F(ab′)2片段为包含在铰链区通过二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段。单链抗体(例如scFv)为另一个片段。两个不同的单价单特异性抗体片段(例如scFv)可连接在一起以形成二价双特异性抗体。
当在本文中使用时，“Fv”是指保留抗原识别和抗原结合位点的抗体最小片段。这个区域由紧密的非共价或共价缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在这种构型中，每个可变结构域的三个CDR相互作用以限定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。六个CDR共同赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包括三个对抗原具有特异性的CDR的Fv的一半)具有识别且结合抗原的能力，但通常亲和力低于整个结合位点。
双特异性抗体可具有许多可能的形式。有关评论，参见Spiess，Zhai和Carter，≤分子免疫学(Mol.Immunol.)≥67:95-106 2015，其说明5种类别的双特异性抗体：
-双特异性IgG(约150kDa)，由以下示例说明：CrossMab、DAF(2合1)、DAF(4合1)、DutaMab、DT-IgG、具有共同轻链的杵臼结构(Knobs in holes)(KIH)、KIH组装、电荷对、Fab臂交换、SEEDbody、Triomab、LUZ-Y、mAb2(在本评论中称为“Fcab”)、κλ基体、正交Fab；
-附加的IgG(>150kDa)，由以下示例说明：DVD-IgG、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIHIgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、zybody、DVI-IgG(4合1)；
-双特异性抗体片段，由以下示例说明：纳米抗体、纳米抗体-HAS、串联连接的scFv(在此评论中示例为“BiTE”)、双功能抗体、DART、TandAb、scDiabody、scDiabody-CH3、双功能抗体-CH3、三功能抗体、微型抗体、微抗体、TriBi微抗体、scFv-CH3 KIH、Fab-scFv、cFv-CH-CL-scFv、F(ab')2、F(ab')2-scFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCAb、scDiabody-Fc、双抗体-Fc、串联scFv-Fc；胞内抗体；
-双特异性融合蛋白，由以下示例说明：锁钥结构(Dock and Lock)、ImmTAC、HSAbody、scDiabody-HAS、串联scFv毒素；
-双特异性抗体结合物，由以下示例说明：IgG-IgG、Cov-X-Body、scFv1-PEG-scFv2。
尽管本发明的双特异性抗原结合分子不限于任何一种或多种特定形式，但一些双特异性抗体形式在此处更详细地描述为特别合适的分子的实例。
优选地，双特异性抗体是双结合抗体，即其中两个抗原结合结构域均由VH/VL对形成的双特异性抗体。双结合抗体包含FIT-Ig(参见WO2015/103072，以引用方式并入本文)、mAb-dAb、锁钥结构、Fab臂交换、SEEDbody、Triomab、LUZ-Y、Fcab、κλ功能抗体、正交Fab、scDiabody-Fc、双功能抗体-Fc、串联scFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、胞内抗体、BiTE、双功能抗体、DART、TandAb、scDiabody、scDiabody-CH3、双功能抗体-CH3、三功能抗体、微型抗体、微型功能抗体、scFv-CH3 KIH、scFv-CH-CL-scFv、F(ab')2-scFv、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCab、ImmTAC、杵臼结构、具有共同轻链的杵臼结构、具有共同轻链和电荷对的杵臼结构、电荷对、具有常共同轻链的电荷对、DT-IgG、DutaMab、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv和scFv4-Ig。
在一个实施例中，双特异性抗体是包括FIXa结合多肽臂和FX结合多肽臂的双特异性IgG，每个多肽臂包括重链和轻链。IgG是四聚免疫球蛋白，其包括
第一对抗体重链和轻链(重-轻链对)，其包括FIXa结合Fv区，
第二重-轻链对，其包括FX结合Fv区，
其中每个重链包含VH结构域和恒定区，且每个轻链包括VL结构域和恒定区，且其中第一和第二重-轻链对通过其重链恒定区的异源二聚缔合，从而形成免疫球蛋白四聚体。
任选地，两个多肽臂包括共同轻链，因此第一和第二重-轻链对的轻链具有相同的氨基酸序列(图5(A))。或者，两个多肽臂可以包括不同的轻链(图5(B))。
在另一实施例中，双特异性抗体是Fab(双特异性F(ab')2)的连接对，其包括FIXa结合Fab和FX结合Fab，其中Fab重链共价连接(图5(C))。Fab可以通过二硫键连接在其CH1结构域。一个多肽结合臂(例如，FIXa结合臂)包括重-轻链对VH1-CH1和VL1-CL，且另一个多肽结合臂(例如，FX结合臂)包括重-轻链对VH2-CH1和VL2-CL。任选地，两条轻链(VL-CL)在序列上是相同的，即存在共同轻链。
在另一实施例中，双特异性抗体是串联连接的scFv对，其包括任选地通过连接基团连接到第二scFv的第一scFv。可以产生具有呈定向的抗原结合臂的分子，即结合FIXa的第一scFv VL1-VH1和结合FX的第二scFv VL2-VH2，或结合FX的第一scFv VL1-VH1和结合FIXa的第二scFv VL2-VH2。参见图5(D)。
如以上实施例中所说明，双特异性抗体可以是单价的以用于结合FIXa和用于结合FX。在替代性实施例中，双特异性抗体对于一个或两个靶抗原可以是二价的。举例来说，抗体可以是包括两个FIXa结合Fab结构域和两个FX结合Fab结构域的FIT-Ig(图6)。因此，这种形式包括两个FIXa结合多肽臂和两个FX结合多肽臂。FIXa结合Fab可以是“内部”Fab对，且FX结合Fab可以是“外部”Fab对，或反过来也如此。FIT-Ig形式描述在WO2015/103072中-FIT-Ig支架的描述通过引用并入本文中。
或者，双特异性抗体可以DVD-Ig形式存在。DVD-Ig由DiGiammarino等人，≤用于双特异性靶向的DVD-IgTM分子的设计和生成(Design and generation of DVD-IgTMmolecules for dual-specific targeting)≥，《分子生物学方法(Meth.Mo.Biol.)》，889:145-156 2012来描述。
双特异性抗体的另一种双价形式是mAb2，其包括两个Fab结构域和一个Fc区，其中两个CH3结构域各自具有形成抗原结合位点的三个结合环，工程化CH3结构域称为Fcab区。Fcab/mAb2形式隐含的技术更详细地描述于WO2008/003103中，且mAb2形式的描述以引用的方式并入本文中。
抗体恒定区
如上文所描述，可以提供各种同种型且具有不同恒定区的抗体。抗体的Fc区可由Fc受体识别且确定抗体介导细胞效应子功能的能力，所述能力包含抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性、互补序列依赖性细胞毒性(CDC)活性和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)活性。这些细胞效应子功能涉及将携带Fc受体的细胞募集到靶细胞的位点，导致杀死抗体结合细胞。
在本发明的上下文中，期望避免细胞效应子功能，例如ADCC、ADCP和/或CDC。因此，根据本发明的双特异性抗原结合分子可以缺少Fc效应子功能，例如其可以含有不介导ADCC、ADCP和/或CDC的Fc区，或其可以完全缺少Fc区或缺少抗体恒定区。抗体可以具有效应子无效的恒定区。
抗体可具有重链恒定区，所述重链恒定区结合一种或多种类型的Fc受体，但不诱导细胞效应子功能，即不介导ADCC、CDC或ADCP活性。这类恒定区可能无法结合负责触发ADCC、CDC或ADCP活性的特定Fc受体。
抗体可以具有不结合Fcγ受体的重链恒定区，例如恒定区可以包括Leu235Glu突变(即，其中野生型白氨酸残基突变为谷氨酸残基)，其可以称为“E”突变，例如IgG4-E。重链恒定区的另一个可选突变是Ser228Pro(“P”突变)，其通过减少Fab臂交换来增加稳定性。重链恒定区可以是包括Leu235Glu突变和Ser228Pro突变的IgG4。这个“IgG4-PE”重链恒定区是效应子无效的。替代性效应子无效的人类恒定区为失能IgG1。
如下文所论述，在双特异性IgG形式或其它抗体形式中，其中不同抗原结合臂通过恒定区进行异源二聚体化，可对恒定区进行工程改造，以相对于同源二聚体形成促进异源二聚体形成和/或以便于从不同物种的混合物中纯化异源二聚体。
促进异源二聚体形成和/或纯化的双特异性抗体的工程改造
从历史上看，在临床中使用双特异性抗体的困难之一是难以以药用级纯度大量生产所述双特异性抗体。“传统”双特异性IgG形式包括两种不同的重链和轻链对，因此包括4种不同的多肽链，如果一起表达，其可以组装到10种不同的潜在抗体分子中。物种的混合物将包含同源二聚体(同源二聚合抗FIXa结合臂和同源二聚合抗FX结合臂)、其中一个或两个轻链在H-L对之间交换的分子以及“正确的”双特异性异源二聚体结构。
已经研发出避免这种潜在的错误配对的替代分子形式，且在此提供几个实例。这些实例包含例如通过化学偶合或白氨酸拉链(fos:jun)组装、双功能抗体和scFv异源二聚体制备的F(ab')2。然而，仍然希望能够使用双特异性IgG，以反映血流中抗体的天然结构且使所给予治疗性分子的免疫原性最小化。另外，全长双特异性抗体可具有更长的血清半衰期。
用于产生双特异性抗体的“杵臼结构”技术在[12]和在US5,731,168中描述，两者以引用的方式并入本文中。原理是工程化异源二聚体重链的成对CH3结构域，使得一个CH3结构域包含“杵结构”，而另一个CH3结构域在空间相对的位置包含“臼结构”。通过在CH3结构域之间的界面处替代小的氨基酸侧链来创建杵结构，而通过用较小的侧链替代大侧链来创建臼结构。杵结构被设计插入臼结构中，以促进不同CH3结构域的异源二聚化，同时使同源二聚体形成不稳定。在组装形成双特异性抗体的抗体重链和轻链的混合物中，具有成对的异源二聚体重链的IgG分子的比例因此增加，从而提高活性分子的产量和回收率。
可以包含突变Y349C和/或T366W以在IgG CH3结构域中形成“杵结构”。可以包含突变E356C、T366S、L368A和/或Y407V以在IgG CH3结构域中形成“臼结构”。可以将杵结构和臼结构引入到任何人类IgG CH3结构域中，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3结构域。一个优选的实例是IgG4。如所指出的，IgG4可以包含其它修改，例如“P”和/或“E”突变。表11中显示一个实例IgG4-PE序列和包含杵臼结构突变的其它实例恒定区。IgG4 a型(“ra”)序列含有取代Y349C和T366W(“杵结构”)，且IgG4 b型(“γb”)序列含有取代E356C、T366S、L368A和Y407V(“臼结构”)。ra和γb还含有在铰链(S228P)中的位置228处的“P”取代，以稳定重链的铰链区。ra和γb还含有在CH2区中的位置235(L235S)处的“E”取代，以消除与FcγR结合。因此，IgG4-PE重链的相关序列是ppcpPcpapefEggps(SEQ ID NO:401)。本发明的双特异性抗原结合分子可含有IgG4 PE人类重链恒定区(例如SEQ ID NO:143)，任选地两个这样的成对恒定区，任选其中一个具有“杵结构”突变且一个具有“臼结构”突变，例如其中一个重链恒定区具有序列SEQ ID NO:144(杵结构)，且一个重链恒定区具有序列SEQ ID NO:145(臼结构)。
如WO98/50431中所描述，双特异性IgG工程化的进一步进展是使用共同轻链的构思。描述了包括两个重-轻链对的双特异性抗体，其中两个重-轻链对的可变轻链具有共同的序列。WO98/50431描述将共同的轻链方法与重链异源二聚化界面(例如杵臼结构)中的特定互补相互作用结合以促进异源二聚体形成且阻碍同源二聚体形成。相结合地，这些方法相对于不期望的异源二聚体和同源二聚体增强所需异源二聚体的形成。
虽然杵臼结构技术涉及在双特异性异源二聚体中对氨基酸侧链进行工程改造以在成对的CH3结构域的界面处形成互补的分子形状，但另一种促进异源二聚体形成和阻碍同源二聚体形成的方式是对氨基酸侧链进行工程改造以具有相反电荷。带有相反电荷的残基的配对有利于重链异源二聚体中CH3结构域的缔合，而成对的正电荷或成对的负电荷会使同源二聚体形成在能量上不利。WO2006/106905描述了一种生产由多于一种类型的多肽组成的异源多聚体(例如两种不同抗体重链的异源二聚体)的方法，所述异源多聚体在形成所述多肽之间的界面的氨基酸残基中包括取代，从而调节异源多聚体缔合，所述方法包括：
(a)从原始核酸修改编码在多肽之间形成界面的氨基酸残基的核酸，从而在可能形成两种或更多种类型的多聚体的异源多聚体中将抑制形成一个或多个多聚体的多肽之间的缔合；
(b)培养宿主细胞使得表达由步骤(a)修改的核酸序列；以及
(c)从宿主细胞培养物中回收所述异源多聚体，
其中步骤(a)的修改是修改原始核酸，使得一个或多个氨基酸残基在界面处被取代，从而形成界面的两个或多个氨基酸残基(包含突变残基)将携带相同类型的正电荷或负电荷。
这样的一个实例是通过在重链同源二聚体的界面处引入静电排斥来抑制重链之间的缔合，例如通过修改在CH3结构域的界面处彼此接触的氨基酸残基，所述位置包含：
位置356和439
位置357和370
位置399和409，
残基编号是根据EU编号系统进行的。
通过修改这些残基对中的一个或多个以具有在第一重链的CH3结构域中的类似电荷(都是正电或都是负电)，重链同源二聚体的配对通过静电排斥来抑制。通过将第二(不同)重链的CH3结构域中相同对或残基对工程改造成与第一重链中的相应残基相比具有相反电荷，可以通过静电吸引促进第一和第二重链的异源二聚合成对。
在一个实例中，抗体VH和VL结构域中引入电荷对用于抑制“不正确的”VH-VL对的形成(一个抗体的VH与另一抗体的VL配对)。在一个实例中，将VH和VL中的Q残基改变成K或R(正电)，或改变成E或D(负电)，以抑制Q侧链之间的氢键结且引入静电排斥。在另一实例中，修改重链恒定区CH3界面上的氨基酸以引入电荷对，突变在WO2006/106905的表1中列出。据报告，修改重链位置356、357、370、399、409和439处的氨基酸以在CH3界面处引入电荷诱导的分子排斥具有提高期望双特异性抗体形成效率的作用。WO2006/106905还举例说明结合FX和FIXa的双特异性IgG抗体，其中IgG4的CH3结构域被工程改造成杵臼结构突变。a型(IgG4γa)是在Y349C和T366W处取代的IgG4，且b型(IgG4γb)是在E356C、T366S、L368A和Y407V处取代的IgG4。
电荷对的其它实例在WO2013/157954中公开，其描述了一种用于从单个细胞产生包括异源二聚体CH3结构域的分子的方法，所述分子包括能够形成界面的两个CH3结构域。所述方法包括在细胞中提供
(a)第一核酸分子，其编码包括第一CH3结构域的多肽链，根据EU编号系统，这个链包括位置366处的K残基；以及
(b)第二核酸分子，其编码包括第二CH3结构域的多肽链，根据EU编号系统，这个链包括位置351处的D残基，
所述方法还包括以下步骤：培养宿主细胞、允许两个核酸分子表达、以及从培养物中收集包括异源二聚体CH3结构域的分子。
WO2011/143545中描述工程改造多肽链中的静电相互作用以相对于同源二聚体形成促进异源二聚体形成的其它方法。
在CH3-CH3界面进行工程改造的另一实例是链交换工程改造的结构域(SEED)CH3异源二聚体。CH3结构域由交替的人类IgA和IgG CH3序列的片段组成，其形成称为“SEED功能抗体”的互补SEED异源二聚体对[10；WO2007/110205]。
还用异源二聚化的重链产生双特异性，所述异源二聚化的重链在CH3结构域中差异地修改以改变其与纯化试剂(例如蛋白A)结合的亲和力。WO2010/151792描述一种异源二聚体双特异性抗原结合蛋白，其包括
第一多肽，其从N端到C端包括选择性结合第一表位的第一表位结合区；免疫球蛋白恒定区，所述免疫球蛋白恒定区包括选自IgG1、IgG2和IgG4的人类IgG的第一CH3区；以及
第二多肽，其从N端至C端包括选择性结合第二表位的第二表位结合区；免疫球蛋白恒定区，所述免疫球蛋白恒定区包括选自IgG1、IgG2和IgG4的人类IgG的第二CH3区，其中第二CH3区包括减少或消除第二CH3结构域与蛋白A结合的修改。
本发明的双特异性可以根据需要采用任何这些技术和分子形式。
产生和修改抗体
用于识别且制备抗体的方法是众所周知的。可以使用转基因小鼠(例如，KymouseTM、)、大鼠(例如，
Figure BDA0002322205310000362
)、骆驼科动物、鲨鱼、兔、鸡或用抗原免疫的其它非人类动物来产生结合所关注抗原的抗体，随后任选地将恒定区和/或可变区人源化以产生人类或人源化抗体。在一实例中，可以使用例如酵母、噬菌体或核糖体呈现的呈现技术，这对于技术人员将是显而易见的。例如使用呈现技术，可以在从转基因动物、噬菌体呈现库或其它库中分离出抗体前导物之后的另一步骤中进行标准亲和力成熟。合适技术的代表性实例描述于US20120093818(安进公司(Amgen,Inc))中，其全文引用的方式并入本文中，例如在段落[0309]到[0346]中陈述的方法。
产生抗体后，无论是通过免疫还是活体外文库筛选，都可以分离编码所选抗体的抗体重链可变结构域和/或抗体轻链可变结构域的核酸。这种核酸可编码完整抗体重链和/或轻链，或不具有缔合恒定区的可变结合域。编码核苷酸序列可直接从小鼠的产生抗体细胞中获得，或可以使B细胞永生化或稠合以产生表达抗体的杂交瘤，且从这类细胞获得的编码核酸。任选地，编码可变域的核酸接着共轭到编码人类重链恒定区和/或人类轻链恒定区的核苷酸序列，以提供编码人类抗体重链和/或人类抗体轻链的核酸，例如编码包括重链和轻链的抗体。当免疫的哺乳动物产生具有非人类恒定区的嵌合抗体时，这个步骤特别适用，所述非人类恒定区优选地替代为人类恒定区以产生在作为药物给予人类时免疫原性较低的抗体。提供特定人类同种型恒定区对于确定抗体的效应子功能也是重要的，且本文中论述多个合适的重链恒定区。
如本文所论述，可以对编码抗体重链和/或轻链可变结构域的核酸进行其它改变，例如残基的突变和变体的产生。
可将分离的(任选突变的)核酸引入到宿主细胞，例如所论述的CHO细胞中。接着在表达呈任何所需抗体形式的抗体或抗体重链和/或轻链可变结构域的条件下培养宿主细胞。本文中描述一些可能的抗体形式，例如完整免疫球蛋白、抗原结合片段和其它设计。
如所论述，可根据本发明采用VH和VL结构域或CDR中的任一个的可变结构域氨基酸序列变体，在本文中特地公开其序列。
可能需要形成变体的原因有很多，其包括优化抗体序列以用于大规模制造、促进纯化、增强稳定性或提高适用性以用于包含在期望医药调配物中。可以在抗体序列中的一个或多个靶残基上进行蛋白质工程化操作，例如用替代氨基酸取代一个氨基酸(任选地，除了可能的Cys和Met以外，在这个位置处产生含有所有天然存在的氨基酸的变体，且监测对功能和表达的影响以确定最佳取代。在一些情况下，不希望用Cys或Met取代残基或将这些残基引入到序列中，因为这样做可能会在制造中产生困难，例如通过形成新的分子内或分子间半胱氨酸-半胱氨酸键。在已选择主要候选且将其优化以用于制造和临床研发时，通常期望尽可能少地改变其抗原结合特性或至少保持亲本分子的亲和力和效能。然而，还可以产生变体以便调节例如亲和力、交叉反应性或中和效能的关键抗体特征。
可以任选地在本文中所公开的抗体VH或VL结构域的构架区中进行一个或多个氨基酸突变。举例来说，可以将一个或多个不同于相应的人类生殖系片段序列的残基恢复成生殖系。表12中指示对应于本文中实例抗体的VH和VL结构域的人类生殖系基因片段序列。
在双特异性抗原结合分子中，抗原结合位点可以包括所公开的抗FIX或抗FX抗体中的任一个的一组H和/或L CDR，其中在所公开的H和/或L CDR组内具有一个或多个氨基酸突变。突变可以是氨基酸取代、缺失或插入。因此，举例来说，在所公开的H和/或L CDR组内可能存在一个或多个氨基酸取代。举例来说，在H和/或L CDR组内可能存在多达12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个突变，例如取代。举例来说，在HCDR3中可能存在多达6、5、4、3或2个突变，例如取代，且/或在LCDR3中可能存在多达6、5、4、3或2个突变，例如取代。
抗体可包括VH结构域，其与表中所展示的VH结构域具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％氨基酸序列一致性，且/或包括VL结构域，其与那些抗体中任何一个的VL结构域具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％氨基酸序列一致性。可用于计算两个氨基酸序列的一致性％的算法包含例如BLAST、FASTA或史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)算法，例如采用默认参数。特定变体可以包含一个或多个氨基酸序列改变(氨基酸残基的添加、缺失、取代和/或插入)。
可以在一个或多个构架区和/或一个或多个CDR中进行改变。变体任选地由CDR诱变提供。改变通常不会导致功能丧失，因此包括如此改变的氨基酸序列的抗体可以保留结合其抗原的能力。其可保留与其中不进行改变的抗体相同的定量结合能力，例如，如本文所描述的测定中所测量。包括如此改变的氨基酸序列的抗体可以具有提高的结合其抗原的能力。
改变可包括用非天然存在或非标准的氨基酸替代一个或多个氨基酸残基，将一个或多个氨基酸残基修改成非天然或非标准形式，或将一个或多个非天然存在或非标准氨基酸插入到序列中。本发明序列中改变的编号和位置的实例描述于本文中的其它地方。天然存在的氨基酸包含由其标准单个字母代码识别为以下的20个“标准”L-氨基酸：G、A、V、L、I、M、P、F、W、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、E。非标准氨基酸包含可并入多肽主链中或由修改现有氨基酸残基产生的任何其它残基。非标准氨基酸可以是天然存在的或非天然存在的。
如本文中所用的术语“变体”是指一种肽或核酸，其由于一个或多个氨基酸或核酸的缺失、取代或添加而不同于亲本多肽或核酸，但保留亲本分子的一个或多个特定功能或生物活性。氨基酸取代包含改变，其中氨基酸由不同天然存在的氨基酸残基替代。这类取代可以归类为“保守”取代，在这种情况下，多肽中所含的氨基酸残基由具有关于极性、侧链功能或大小的相似特性的另一天然存在的氨基酸替代。这类保守取代在所属领域中是众所周知。本发明所涵盖的取代还可以是“非保守”取代，其中存在于肽中的氨基酸残基由具有不同特性的氨基酸，例如来自不同基团的天然存在的氨基酸取代(例如，用丙氨酸取代带电荷或疏水性的氨基酸)；或替代地，其中用非常规氨基酸取代天然氨基酸。在一些实施例中，氨基酸取代是保守的。当参考多核苷酸或多肽使用时，同样涵盖在术语变体内的是指分别与参考多核苷酸或多肽相比(例如，与野生型多核苷酸或多肽相比)，可在一级、二级或三级结构方面不同的多核苷酸或多肽。
在一些方面中，我们可使用利用所属领域中熟知的方法分离或产生的“合成变体”、“重组变体”或“化学改性的”多核苷酸变体或多肽变体。如下文所描述，“修改的变体”可以包含保守或非保守的氨基酸变化。多核苷酸变化可在由参考序列编码的多肽中引起氨基酸取代、添加、缺失、融合和截断。使用的一些方面包含插入变体、缺失变体或具有氨基酸取代的取代变体，所述取代包含氨基酸和其它分子的插入和取代，所述取代通常在作为变体基础的肽序列中不会出现，例如(但不限于)通常在人类蛋白质中不会出现的鸟氨酸插入。当描述多肽时，术语“保守取代”是指基本上不改变多肽活性的多肽的氨基酸组成的改变。举例来说，保守取代是指将氨基酸残基取代为具有相似化学特性(例如，酸性、碱性、带正电或带负电、极性或非极性等)的不同氨基酸残基。保守氨基酸取代包含用异白氨酸或缬氨酸替代白氨酸、用谷氨酸替代天冬氨酸或用丝氨酸替代苏氨酸。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表在所属领域众所周知。举例来说，以下六组各自含有彼此保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异白氨酸(I)、白氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。(也参见Creighton，≤蛋白质(Proteins)≥，W.H.Freeman and Company(1984)，其以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施例中，如果改变不降低肽的活性，那么改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比氨基酸的单个取代、缺失或添加也可以视为“保守取代”。插入或缺失通常在约1到5个氨基酸的范围内。保守氨基酸的选择可基于肽中待取代的氨基酸的位置而选择，例如，在氨基酸处于肽的外部上且暴露于溶剂，或在内部上且不暴露于溶剂的情况下。
我们可以基于现有氨基酸的位置来选择将取代现有氨基酸的氨基酸，包含其暴露于溶剂中(即，与未暴露于溶剂的内部定位的氨基酸相比，在氨基酸暴露于溶剂中或存在于肽或多肽的外表面上的情况)。这类保守氨基酸取代的选择在所属领域是众所周知的，例如在Dordo等人，《分子生物学杂志(J.Mol Biol)》，1999，217，721-739和Taylor等人，《理论生物学杂志(J.Theor.Biol.)》119(1986)；205-218和S.French和B.Robson，《分子进化杂志(J.Mol.Evol.)》19(1983)171中所公开的。因此，我们可以选择适合于蛋白质或肽外部上的氨基酸(即暴露于溶剂的氨基酸)的保守氨基酸取代，例如(但不限于)此，可以使用以下取代：用F取代Y、用S或K取代T、用A取代P、用D或Q取代E、用D或G取代N、用K取代R、用N或A取代G、用S或K取代T、用N或E取代D、用L或V取代I、用Y取代F、用T或A取代S、用K取代R、用N或A取代G、用R取代K、用S、K或P取代A。
在替代实施例中，我们还可以选择所涵盖的适用于蛋白质或肽内部上的氨基酸的保守氨基酸取代，例如我们可以使用适用于蛋白质或肽的内部上的氨基酸的保守取代(即，氨基酸不暴露在溶剂中)，例如(但不限于)此，我们可以使用以下保守取代：其中用F取代Y，用A或S取代T，用L或V取代I，用Y取代W，用L取代M，用D取代N，用A取代G，用A或S取代T，用N取代D，用L或V取代I，用Y或L取代F，用A或T取代S，且用S、G、T或V取代A。在一些实施例中，非保守氨基酸取代也涵盖在变体的术语内。
本发明包含产生含有本文表中所展示的抗体VH和/或VL结构域的VH和/或VL结构域变体的多肽结合臂的方法。包括变体VH结构域的FIXa结合多肽臂可以通过以下方法产生，所述方法包括：
(i)借助于在亲本抗体VH结构域的氨基酸序列中添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸来提供作为亲本抗体VH结构域的氨基酸序列变体的抗体VH结构域，
其中亲本抗体VH结构域是VH结构域N192H、N212H、N205H、N211H、N203H、N128H、N215H、N216H、N217H、N218H、N219H、N220H、N221H、N222H、N223H、N224H、N225H、N226H、N227H、N228H或N229H，或是包括那些VH结构域中任一个的重链互补决定区的VH结构域，
(ii)任选地将由此提供的VH结构域与VL结构域组合，以提供VH/VL组合，以及
(iii)测试VH结构域或由此提供的VH/VL结构域组合，以识别具有一个或多个期望特征的抗体。
VH结构域可以是其序列展示在表9A中的任何VH结构域，或包括在表9A中展示的VH结构域的一组HCDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)的任何VH结构域。VH结构域可以是N436 VH结构域(SEQ ID NO:324)。VH结构域可以是N128 VH结构域(SEQ ID NO:5)。
FIXa结合多肽臂和包含其的双特异性抗FIXa/FX结合分子的期望特征在本文其它地方详述。举例来说，方法可以包括确认VH结构域或VH/VL结构域组合结合如本文所述的FIXa。
当VL结构域包含在方法中时，VL结构域可以是N128L VL结构域，或可以是借助于在N128L VL结构域的氨基酸序列中添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸来提供的变体，或可以是包括N128L VL结构域的轻链互补决定区的VL结构域。
产生变体抗体的方法可任选地包括产生抗体或VH/VL结构域组合的复本。方法可以进一步包括例如通过表达编码核酸来产生包括FIXa结合多肽臂的双特异性抗体。本文详细阐述合适的表达方法，所述方法包含在宿主细胞中的重组表达。
编码核酸和表达方法
可以提供分离的核酸，其根据本发明编码双特异性抗原结合分子，例如双特异性抗体。核酸可以是DNA和/或RNA。合成来源的基因组DNA、cDNA、mRNA或其它RNA或其任何组合可编码抗体。
本发明提供呈质粒、载体、转录或表达盒形式的构筑体，其包括至少一个如上的多核苷酸。示例性的核苷酸序列包含在表中。除非上下文另外要求，否则对本文中所陈述的核苷酸序列的参考涵盖具有指定序列的DNA分子，且涵盖具有指定序列的RNA分子，其中U取代T。
本发明还提供包括编码抗原结合分子的一个或多个核酸的重组宿主细胞。产生编码分子的方法可以包括例如通过培养含有核酸的重组宿主细胞来表达核酸。双特异性分子可由此获得，且可使用任何合适的技术分离和/或纯化，接着在适当时使用。生产方法可包括将产物调配成包含至少一种额外组分的组合物，例如医药学上可接受的赋形剂。
用于在各种不同宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是众所周知的。合适的宿主细胞包含细菌、哺乳动物细胞、植物细胞、丝状真菌、酵母和杆状病毒系统以及转基因植物和动物。
抗体和抗体片段在原核细胞中的表达在所属领域中沿用已久。常见的细菌宿主是大肠杆菌(E.coli)。作为生产的选项，所属领域的技术人员还可以获得培养物中真核细胞中的表达。在所属领域中可获得的用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包含中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NSO小鼠黑素瘤细胞、YB2/0大鼠骨髓瘤细胞、人类胚胎肾细胞、人类胚胎视网膜细胞和许多其它细胞。
载体可含有适当的调节序列，按需要包含启动子序列、终止子序列、多腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其它序列。可以将编码抗体的核酸引入到宿主细胞中。可以通过各种方法将核酸引入到真核细胞中，包含磷酸钙转染、DEAE-右旋糖苷、电穿孔、脂质体介导的转染和使用逆转录病毒或其它病毒(例如牛痘，或对于昆虫细胞、杆状病毒)进行的转导。将核酸引入到宿主细胞(尤其真核细胞)中可以使用基于病毒或质粒的系统。质粒系统可以保持游离状态，或可以并入宿主细胞或人造染色体中。可以通过在单个或多个基因座处随机或靶向整合一个或多个复本来进行并入。对于细菌细胞，合适的技术包含氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体进行的转染。引入之后可以例如通过在表达基因的条件下培养宿主细胞，然后任选地分离或纯化抗体来表达核酸。
本发明的核酸可以整合到宿主细胞的基因组(例如染色体)中。可以根据标准技术通过包含促进与基因组重组的序列来促进整合。
本发明还提供包括在表达系统中使用本文中所描述的核酸以便表达双特异性抗原结合分子的方法。理想地，在初始发酵后，抗原结合分子在细胞上清液中以至少0.5g/L的产量表达，优选地以>2g/L的产量表达。溶解度应该是>10mg/ml、优选地>50mg/ml，而无明显的分子聚集或分解。
调配和给药
通常将以分离形式提供根据本发明的双特异性抗原结合分子(“双特异性”)及其编码核酸分子。可以提供从其天然环境或其生产环境中纯化的双特异性VH和/或VL结构域以及核酸。分离的抗原结合分子和分离的核酸将不含或基本上不含其天然缔合的材料，例如在活体内发现的其它多肽或核酸，或当这种制备是通过在体外重组DNA技术时制备其的环境(例如细胞培养)。任选地，分离的抗原结合分子或核酸(1)不含通常会发现的至少一些其它蛋白质，(2)基本上不含来自相同来源(例如来自相同物种)的其它蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，(4)已与至少约50％的多核苷酸、脂质、碳水化合物或其本质相关的其它物质分离，(5)可操作地与(通过共价或非共价相互作用)与在本质上不相关的多肽缔合，或(6)在本质上不存在。
可以用稀释剂或佐剂调配双特异性抗体或其编码核酸，且仍出于实用目的进行分离-例如，如果使用所述抗体涂布用于免疫测定的微量滴定板，则可以将其与载体混合，且在用于疗法中时可以与医药学上可接受的载体或稀释剂混合。如本文其它地方所描述，其它活性成分还可以包含在治疗性制剂中。抗原结合分子可以在体内天然地或通过异源真核细胞(例如CHO细胞)的系统糖基化，或者其可以(例如，如果通过在原核细胞中表达所产生)未糖基化。本发明涵盖具有修改的糖基化模式的抗体。
通常，分离的产物占给定样品的至少约5％、至少约10％、至少约25％或至少约50％。双特异性抗体可以基本上不含蛋白质或多肽或在其天然或生产环境中发现的其它污染物，所述环境会干扰其治疗、诊断、预防、研究或其它用途。
本发明提供包括本文所描述的双特异性的治疗组合物。还提供了包括编码此类双特异性的核酸的治疗组合物。编码核酸更详细地描述在本文中的其它地方，且包含DNA和RNA，例如mRNA。在本文所描述的治疗方法中，编码双特异性的核酸和/或含有这种核酸的细胞的用途可以用作包括双特异性分子本身的组合物的替代物(或添加物)。含有编码双特异性的核酸的细胞(任选地，其中核酸稳定地整合到基因组中)因此代表用于患者的治疗用途的药剂。可以将编码双特异性的核酸引入自预期患者衍生且活体外修改的人类细胞中。向患者给予含有编码核酸的细胞提供了能够表达双特异性的细胞储库，与给予分离核酸或分离双特异性分子相比，其可以在更长的时间内提供治疗益处。可以提供编码双特异性的核酸以用于基因治疗，所述治疗包括将编码核酸引入活体患者的细胞中，从而使核酸在患者的细胞中表达且提供治疗效果，例如对遗传因子VIII缺乏症的补偿。
组合物可以含有合适的载体、赋形剂和并入调配物中以提供改进的转移、递送、耐受性等的其它试剂。众多的适当调配物可发现于所有医药化学家已知的处方集中：《雷氏药学大全(Remington's Pharmaceutical Sciences)》，麦克出版公司(Mack PublishingCompany)，宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton,PA)这些调配物包括例如粉剂、糊剂、软膏、胶状物、蜡、油、脂质、含有脂质的囊泡(阳离子或阴离子)(例如LIPOFECTINTTM)、DNA共轭物、无水吸收糊剂、水包油和油包水型乳剂、卡波蜡(具有各种分子量的聚乙二醇)乳液、半固体凝胶和含有卡波蜡的半固体混合物。还参见Powell等人，《用于肠胃外制剂的赋形剂的汇编(Compendium of excipients for parenteral formulations)》，PDA(1998)，《药物科学与技术杂志(J Pharm Sci Technol)》，52:238-311。组合物可以包括抗体或核酸以及医学注射缓冲液和/或佐剂。
可以调配双特异性抗体或其编码核酸，以用于患者的所需给药途径，例如呈注射用液体(任选地水溶液)形式。
各种递送系统是已知的，且可用于给予本发明的医药组合物。引入方法包含(但不限于)皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。可以通过任何方便的途径给予组合物，例如通过输注或快速注射，通过经由上皮或皮肤粘膜内层(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，且可以与其它生物活性剂一起给予。可全身性或局部给药。抗原结合分子优选地通过皮下注射给予。
医药物组合物还可以递送在囊泡(尤其脂质体)中(参见Langer(1990)《科学(Science)》249:1527-1533；Treat等人(1989)在《脂质体在传染病和癌症中的治疗(Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer)》中，LopezBerestein和Fidler(编)，纽约利斯(Liss,New York)，第353-365页；Lopez-Berestein，同上文献，第317-327页；参见同上文献)。
在某些情况下，可以在控释系统中递送医药组合物。在一个实施例中，可以使用泵(参见Langer；同上文献；Sefton(1987)CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一实施例中，可以使用聚合物材料；参见《控制释放医学应用(Medical Applications ofControlled Release)》，Langer和Wise(编)，CRC出版社，佛罗里达州博卡拉顿(BocaRaton,Fla.)(1974)。在又另一实施例中，可将控制释放系统放置在组合物的靶标附近，因此仅需要全身剂量的一小部分(参见例如Goodson，《控制释放医学应用》，同上，第2卷，第115-138页，1984)。
可注射制剂可以包含用于静脉内、皮下、皮内和肌内注射、滴液注射等的剂型。这些可注射制剂可以通过众所周知的方法制备。举例来说，可例如通过将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化于常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中来制备可注射制剂。作为用于注射的水性介质，存在例如生理盐水、含有葡萄糖的等渗溶液和其它助剂等，其可以与例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)的适当增溶剂、非离子表面活性剂[例如，聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等组合使用。作为油性介质，此处使用例如可以与增溶剂(例如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等)组合使用的芝麻油、大豆油等。由此制备的注射剂可以填充到适当安瓿中。可用标准针头和注射器皮下或静脉内递送本发明的医药组合物。可以设想，治疗将不限于临床用途。因此，使用无针装置的皮下注射也是有利的。相对于皮下递送，笔式递送装置易于应用于递送本发明的医药组合物。这种笔式递送装置可以是可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔式递送装置通常利用含有医药组合物的可更换药筒。一旦已经给予药筒内的所有医药组合物且药筒是空的，那么就可以容易地丢弃空药筒且用含有医药组合物的新药筒替代。然后可以重复使用笔式递送装置。在一次性笔式递送装置中，没有可更换的药筒。相反，一次性笔式递送装置预先填充有保持在装置内的储存器中的医药组合物。一旦储存器中的医药组合物清空，就丢弃整个装置。许多可重复使用的笔式递送装置和自动注射器递送装置应用于皮下递送本发明的医药组合物。实例包含)(但不限于)AUTOPENTM(英国伍德斯托克(Woodstock,UK)的欧文芒福德公司(Owen Mumford,Inc.))、DISETRONICTM笔(瑞士布格多夫(Bergdorf,Switzerland)的Disetronic Medical Systems)、HUMALOG MIX 75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(印第安纳州印第安纳波利斯(Indianapolis,Ind)的Eli Lilly and Co.)、NOVOPENTMI、II和III(丹麦哥本哈根(Copenhagen,Denmark)的Novo Nordisk)、NOVOPEN JUNIORTM(丹麦哥本哈根的Novo Nordisk)、BDTM笔(新泽西州富兰克林湖(Franklin Lakes,N.J.)的BectonDickinson)、OPTIPENTTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTTM(德国法兰克福(Frankfurt,Germany)的sanofi-aventis)，在此仅举几例。用于皮下递送本发明的医药组合物的一次性笔式递送装置的实例包含(但不限于)SOLOSTAR TM笔(Sanofi-Aventis)、FLEXPEN TM(Novo Nordisk)和KWIKPEN TM(Eli Lilly)。
有利地，将上述用于口服或肠胃外用途的医药组合物制成适合于符合活性成分的一定剂量的单位剂量的剂型。这类呈单位剂量的剂型包含例如片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。所含有的前述抗体的量通常为约5mg到约500mg剂型每单位剂量；尤其以注射剂形式，针对其它剂型可含有约5mg到约100mg和约10mg到约250mg的前述抗体。
双特异性抗体、核酸或包括其的组合物可含于医用容器中，例如小瓶、注射器、IV容器或注射装置。在一实例中，双特异性抗体、核酸或组合物处于活体外，且可以在无菌容器中。在一实例中，提供包括用于本文所描述的治疗方法中的双特异性抗体、包装和使用说明书的试剂盒。
本发明的一个方面为包括双特异性抗体或本发明的核酸和一种或多种医药学上可接受的赋形剂的组合物，其实例在上文列出。“医药学上可接受的”是指由美国联邦或州政府的监管机构审批通过或批准，或在《美国药典(U.S.Pharmacopeia)》或其它公认药典中列出用于动物(包含人类)。可以将医药学上可接受的载剂、赋形剂或佐剂与双特异性试剂(例如本文所描述的任何抗体或多肽分子)一起给予患者，且在以足以递送治疗量的药剂的剂量给予时不会破坏其药理活性且为无毒的。
在一些实施例中，双特异性抗体将是根据本发明的组合物中的唯一活性成分。因此，组合物可以由抗体组成，或其可以由双特异性抗体与一种或多种医药学上可接受的赋形剂组成。然而，根据本发明的组合物任选地包含一种或多种其它活性成分。可能需要与根据本发明的双特异性抗体或核酸一起给药的其它治疗剂(包含止痛剂)。任何这类药剂或药剂组合可以与根据本发明的抗体或核酸组合给予，或以具有抗体或核酸的组合物形式提供，无论是作为组合制剂还是单独制剂。根据本发明的双特异性抗体或核酸可以与另一种或多种治疗剂(例如所提及的那些治疗剂)单独且依序或同时且任选地以组合制剂的形式给予。
可以单独或同时给予多种组合物。单独给予是指两种组合物在不同时间给予，例如相隔至少10分钟、20分钟、30分钟或10分钟到60分钟，或相隔1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时。我们也可以相隔24小时或甚至相隔更长时间来给予组合物。或者，可以同时给予两种或多种组合物，例如相隔少于10分钟或少于5分钟。在一些方面，同时给予的组合物可以混合物形式给予，针对每种组分具有或不具有相似或不同的时间释放机制。
双特异性抗体及其编码核酸可用作治疗剂。本文中的患者通常是哺乳动物，通常是人类。可以例如通过本文中所提及的任何给药途径将双特异性抗体或核酸给予哺乳动物。
通常以“治疗有效量”给药，这是产生期望效果，给予其足以向患者展示出益处的量。确切量将取决于治疗目的，且可由所属领域的技术人员使用已知技术来确定(参见例如Lloyd(1999)《医药复合的艺术、科学和技术(The Art,Science and Technology ofPharmaceutical Compounding)》)。治疗处方(例如剂量的决定等)在全科医生和其它医生的职责范围内，且可能取决于所治疗疾病的症状的严重程度和/或进展。可以通过在动物模型中比较其活体外活性和活体内活性来确定双特异性抗体或核酸的治疗有效量或合适剂量。将小鼠和其它试验动物中的有效剂量外推到人类的方法是已知的。
双特异性抗体的给药量可以是以下剂量范围中的一种：
约10μg/kg体重到约100mg/kg体重、
约50μg/kg体重至约5mg/kg体重、
约100μg/kg体重到约10mg/kg体重、
约100μg/kg体重到约20mg/kg体重、
约0.5mg/kg体重至约20mg/kg体重，或
约5mg/kg体重或更小，例如小于4m/kg、小于3m/kg、小于2m/kg或小于1m/kg的抗体。
给予的抗原结合分子的剂量可以高达1mg/kg。对于儿童人群，其可以调配为较低强度，例如30-150mg/mL。双特异性分子可以较小的数量包装用于儿童人群，例如可以25-75mg(例如30或60mg)的小瓶形式提供。
在本文中所描述的治疗方法中，可以给予一次或多次剂量。在某些情况下，单次剂量可能有效地达到长期益处。因此，方法可以包括给予单次剂量的双特异性抗体、其编码核酸或组合物。替代地，通常可以依序地且相隔数天、数周或数月的时间给予多次剂量。任选地，双特异性抗体可以每月一次或更小频率(例如每两个月或每三个月)向患者给予。
如本文所使用，术语“治疗(treat/treatment/treating)”是指治疗性治疗，其中目的是逆转、减轻、改善、抑制、减缓或停止与疾病或病症相关的病状发展或严重程度。术语“治疗”包含减轻或缓解病状、疾病或病症的至少一种不良作用或症状。在一种或多种症状或临床标记减轻的情况下，治疗通常是“有效的”。替代地，如果疾病的进展减小或停止，那么治疗是“有效的”。也就是说，与没有治疗时所期望的情况相比，“治疗”不仅包含改善症状或标记，而且还包含终止或至少减缓症状的进展或恶化。有益或期望的临床结果包含(但不限于)一种或多种症状的缓解、疾病程度的减轻、疾病的稳定(即不恶化)状态、疾病进展的延缓或减缓、疾病状态的改善或缓和、缓解(无论是部分或总体)和/或死亡率减小(无论可检测或不可检测)。疾病的术语“治疗”还包含缓解疾病的症状或副作用(包含缓解性治疗)。为了使治疗有效，不考虑完全治愈。在某些方面，方法也可以包含治愈。在本发明的上下文中，治疗可以是预防性治疗。
较长的半衰期是本发明双特异性抗体的期望特征。延长的半衰期意味着给药频率降低，其中需要维持血液中分子的治疗有效浓度的注射减少。本发明的抗原结合分子在人体内的活体内半衰期可以是7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天或更长。在非人类灵长类动物(例如食蟹猕猴)中，抗原结合分子的活体内半衰期可以是7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天或更长。
可以提供抗原结合分子，用于定期间隔一周、两周、三周、四周或一个月来给予。
治疗用途
本发明的双特异性抗原结合分子可用于通过疗法治疗人体或动物体的方法中。分子的治疗适应症包含：
用于治疗A型血友病，
用于治疗遗传性因子VIII缺乏症，
用于显著降低A型血友病患者的出血发病率，
用于取代因子VIII功能，
和/或
用于促进血液凝结。
患者通常是人类患者。患者可以是诊断患有A型血友病或遗传性因子VIII缺乏症的人类，或是与野生型相比具有较低(或缺乏)因子VIII表达或活性的人类。患者可以是儿科患者(例如，从2岁到小于18岁)或可以是成人。病人可能具有或可能不具有因子VIII抑制剂。
可将本发明的双特异性分子或包括这种双特异性分子或其编码核酸的组合物用于或提供用于任何此类方法。还设想双特异性分子或包括其或其编码核酸的组合物在制造用于任何此类方法中的药剂中的用途。方法通常包含向哺乳动物(例如人类患者)给予抗体或组合物。合适的调配物和给药方法在本文其它地方描述。
目前对A型血友病患者治疗存在尚未满足的需求，所述患者产生针对FVIII的抑制性同种抗体。本发明的抗原结合分子适用于这类患者。因此，在一些方面，由于血流中存在抑制性抗体，用根据本发明的双特异性抗原结合分子治疗的患者可能对用FVIII治疗具有抗性。对治疗的抗性可以用治疗功效的降低来体现。可以用来自患者的血浆样品在体外测定(例如aPTT测定法)中检测到这种抗性，其中治疗分子不会将凝血时间减少到与对照FVIII缺乏血浆(后者缺乏针对治疗性分子的抑制性抗体)的测定中相同的水平。
接受其它血友病治疗(例如针对FIXa和FX的双特异性抗体)的患者，也可能产生针对这些治疗性抗体的抑制性抗体。如上文所述，使用人类抗体(例如本发明的那些抗体)应将其风险降到最低，但在接受针对FIXa和FX的本发明的抗原结合分子或其它双特异性抗原结合分子的某些患者中仍可能产生抑制性抗体。由于血液中存在抑制性抗体，用根据本发明的双特异性抗原结合分子治疗的患者可能对针对FIXa和FX的不同双特异性抗原结合分子的治疗具有抗性。患者可能对用艾米珠单抗治疗有抗性。
由于可以通过药品的长期治疗性给予来产生抑制性抗体，因此可能有利于患者在多种不同的治疗方法之间交替或循环，以降低其产生抑制性抗体的风险。因此，本发明的双特异性抗原结合分子可以给予先前已接受不同FVIIIa活性替代多肽药物治疗的患者，例如针对FIXa和FX的双特异性抗原结合分子，任选地是艾米珠单抗，即使其中患者尚未(尚)产生抑制性抗体。类似地，通常可将艾米珠单抗或其它用于FIXa和FX的双特异性抗原结合分子，以及其它FVIIIa活性替代多肽药物给予先前已用本发明的双特异性抗原结合分子治疗的患者。治疗方案可包括在第一阶段(例如，在一个月与六个月之间，或在六个月与一年之间)给予第一种FVIII活性替代多肽药物，然后在第二阶段(例如，在一个月与六个月之间，或在六个月与一年之间)切换成不同的FVIII活性替代多肽药物，随后切换回第一种药物或切换成另一种FVIII活性替代多肽药物。不同药物治疗的不同氨基酸序列应确保在切换成不同药物(例如本发明的分子)后，处于产生针对一种药物的抑制性抗体的风险下的患者不再处于产生针对第一种药物(例如，艾米珠单抗)的抑制性抗体的风险下。根据患者和医生的便利性和偏好，可以改变或缩短循环周期。
将会认识到，给予编码核酸代表替代性疗法，且可以替代直接给予多肽药物来进行。
如上文所述，认为本发明的双特异性抗原结合分子具有很强的安全性特征，与超敏反应的发病率、同种抗体的产生、器官毒性或其它导致治疗中止的不良事件无关联(或关联最小)。
以下编号的条款和陈述代表本发明的实施例，且是说明书的部分。
条款
条款1.一种双特异性抗原结合分子，其包括
FIXa结合多肽臂，其包括FIXa结合位点，以及
FX结合多肽臂，其包括FX结合位点，
其特征在于
(i)FIXa结合位点由FIXa结合多肽臂中的互补决定区(CDR)集合提供，所述CDR集合包括HCDR1、HCDR2、HCDR3和/或LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
HCDR1为SEQ ID NO:140
HCDR2为SEQ ID NO:141
HCDR3为SEQ ID NO:142
LCDR1为SEQ ID NO:6
LCDR2为SEQ ID NO:7，以及
LCDR3为SEQ ID NO:8
或包括具有1、2、3、4或5个氨基酸改变的CDR集合；
(ii)FIXa结合多肽臂包括抗体Fv区，所述抗体Fv区包括VH结构域，其通过重组免疫球蛋白重链v、d和j基因片段而产生，其中v基因片段为VH3-7，且/或其中j基因片段为JH6，和/或
VL结构域，其通过重组免疫球蛋白轻链v和j基因片段而产生，其中v基因片段为VL3-21且j基因片段为JL3；和/或
(iii)当以单特异性形式提供时，FIXa结合多肽臂能够增强FX对FXa的FIXa催化活化。
条款2.根据条款1所述的双特异性抗原结合分子，其中FIXa结合多肽臂包括VH结构域，其通过重组免疫球蛋白重链v、d和j基因片段而产生，其中v基因片段为VH3-7，d基因片段为DH1-26，且j基因片段为JH6。
条款3.根据条款1或条款2所述的双特异性抗原结合分子，其中FIXa结合多肽臂包括VH结构域，其通过重组免疫球蛋白重链v、d和j基因片段而产生，其中v基因片段为VH3-7*01，且j基因片段为JH6*02。
条款4.根据前述任一条款所述的双特异性抗原结合分子，其中FIXa结合多肽臂包括抗体Fv区，所述抗体Fv区包括由CDR集合提供的FIXa结合位点，所述CDR集合包括：HCDR1、HCDR2、HCDR3和/或LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
HCDR1为SEQ ID NO:140
HCDR2为SEQ ID NO:141
HCDR3为SEQ ID NO:142
LCDR1为SEQ ID NO:6
LCDR2为SEQ ID NO:7，以及
LCDR3为SEQ ID NO:8
或包括具有1、2、3、4或5个氨基酸改变的CDR集合。
条款5.根据前述任一条款所述的双特异性抗原结合分子，其中FIXa结合多肽臂包括抗体VH结构域，其包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中
HCDR1为SEQ ID NO:140
HCDR2为SEQ ID NO:141，以及
HCDR3为SEQ ID NO:142。
条款6.根据前述任一条款所述的双特异性抗原结合分子，其中HCDR1为SEQ IDNO:1，HCDR2为SEQ ID NO:2且HCDR3为SEQ ID NO:3。
条款7.根据前述任一条款所述的双特异性抗原结合分子，
其中FIXa结合多肽臂包括VL结构域，其通过重组VL3-21*d01基因片段和JL3*02基因片段而产生。
条款8.根据前述任一条款所述的双特异性抗原结合分子，其中FIXa结合多肽臂包括抗体VL结构域，所述结构域包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
LCDR1为SEQ ID NO:6
LCDR2为SEQ ID NO:7，以及
LCDR3为SEQ ID NO:8。
条款9.根据前述任一条款所述的双特异性抗原结合分子，其中FIXa结合多肽臂包含VH结构域，其包括构架中的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述构架包括构架区集合FR1、FR2、FR3和FR4，其中：
FR1为SEQ ID NO:132
FR2为SEQ ID NO:133
FR3为SEQ ID NO:134，以及
FR4为SEQ ID NO:135，
或其中构架包括具有最多10个氨基酸改变的构架区集合。
条款10.根据条款9所述的双特异性抗原结合分子，其中
FR1为SEQ ID NO:132，任选地在残基11处用L取代F，在残基24处用V取代A，和/或在残基24处用A取代V
FR2为SEQ ID NO:133
FR3为SEQ ID NO:134，任选地在残基59处用Y取代F，在残基62处用D取代A，在残基70处用I取代M，在残基77处用N取代K，在残基79处用L取代V和/或在残基81处用L取代V，以及
FR4为SEQ ID NO:135，任选地在残基119处用S取代T，
其中残基编号是根据IMGT系统进行的。
条款11.根据条款10所述的双特异性抗原结合分子，其中：
FR1为SEQ ID NO:132
FR2为SEQ ID NO:133
FR3为SEQ ID NO:134，以及
FR4为SEQ ID NO:135。
条款12.根据前述任一条款所述的双特异性抗原结合分子，其中FIXa结合多肽臂包括VL结构域，其在构架中包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述构架包括框架区集合FR1、FR2、FR3和FR4，其中：
FR1为SEQ ID NO:136
FR2为SEQ ID NO:137
FR3为SEQ ID NO:138，以及
FR4为SEQ ID NO:139，
或其中构架包括具有最多10个氨基酸改变的构架区集合。
条款13.根据条款12所述的双特异性抗原结合分子，其中：
FR1为SEQ ID NO:136
FR2为SEQ ID NO:137
FR3为SEQ ID NO:138，以及
FR4为SEQ ID NO:139。
条款14.根据前述任一条款所述的双特异性抗原结合分子，其中FIXa结合多肽臂包括VH结构域，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:5。
条款15.根据前述任一条款所述的双特异性抗原结合分子，其中FIXa结合多肽臂VL结构域包括氨基酸序列SEQ ID NO:10。
条款16.根据前述任一条款所述的双特异性抗原结合分子，其中FIXa结合多肽臂包括抗体重链，所述抗体重链从N端到C端包括VH结构域、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域。
条款17.根据条款16所述的双特异性抗原结合分子，其中抗体重链包括IgG恒定区。
条款18.根据前述任一条款所述的双特异性抗原结合分子，其中FIXa结合多肽臂包括抗体轻链，所述抗体轻链从N端到C端包括VL结构域和CL结构域。
条款19.根据前述任一条款所述的双特异性抗原结合分子，其中FX结合多肽臂包括抗体Fv区，所述抗体Fv区包括由CDR集合提供的FIXa结合位点。
条款20.根据条款19所述的双特异性抗原结合分子，其中抗体Fv区包括VH结构域，其通过重组免疫球蛋白重链v、d和j基因片段而产生，其中v和j基因片段为：
VH1-3(例如VH1-3*01)和JH6(例如JH6*02)，
VH3-30(例如VH3-30*18)和JH6(例如JH6*02)，
VH3-33(例如VH3-33*01)和JH6(例如JH6*02)，
VH4-31(例如VH4-31*03)和JH4(例如JH4*02)，或
VH4-59(例如，VH4-59*01)和JH4(例如，JH4*02)。
条款21.根据条款19或条款20所述的双特异性抗原结合分子，其中抗体Fv区包括VL结构域，其通过重组免疫球蛋白轻链v和j基因片段而产生，其中v基因片段为VL3-21(例如VL3-21*d01)，且j基因片段为JL3(例如JL3)*02)。
条款22.根据前述任一条款所述的双特异性抗原结合分子，其中FIXa结合多肽臂和FX结合多肽臂包括共同的抗体轻链。
条款23.根据条款22所述的双特异性抗原结合分子，其中轻链包括λ恒定区。
条款24.根据前述任一条款所述的双特异性抗原结合分子，其中，抗原结合分子为四聚合免疫球蛋白，其包括
第一重-轻链对，其包括FIXa结合Fv区，
第二重-轻链对，其包括FX结合Fv区，
其中每个重链包括VH结构域和恒定区，且每个轻链包括VL结构域和恒定区，且其中第一和第二重-轻链对通过其重链恒定区的异源二聚化缔合，从而形成四聚合免疫球蛋白。
条款25.根据条款24所述的双特异性抗原结合分子，其中免疫球蛋白为IgG，例如IgG4。
条款26.一种分离的FIXa结合多肽，其包括FIXa结合位点，其中FIXa结合多肽如前述条款中任一项所定义。
条款27.一种用于产生条款1到25中任一项的双特异性抗原结合分子的试剂盒，其包括
包括FIXa结合位点的FIXa结合多肽，或编码所述多肽的核酸，其中FIXa结合多肽为条款1到25中任一项所定义的FIXa结合多肽臂，以及
包括FX结合位点的FX结合多肽，或编码所述多肽的核酸，其中FX结合多肽为条款1到25任一项中所定义的FX结合多肽臂。
条款28.一种组合物，其包括与医药学上可接受的赋形剂组合的根据条款1到25中任一项的抗原结合分子。
条款29.根据条款28所述的组合物，其中抗原结合分子处于无菌水溶液中。
条款30.一种分离的核酸，其编码根据条款1到25中任一项所述的双特异性抗原结合分子。
条款31.一种分离的核酸，其编码根据条款1到25中任一项所述的双特异性抗原结合分子的FIXa结合多肽臂。
条款32.一种宿主细胞，其包括重组核酸，所述重组核酸编码根据条款1到25中任一项所述的双特异性抗原结合分子，或编码所述双特异性抗原结合分子的FIXa结合多肽臂或FX结合多肽臂，其中编码核酸可操作地连接到启动子以用于表达。
条款33.一种产生根据条款1到25中任一项所述的抗原结合分子，或产生所述双特异性抗原结合分子的FIXa结合多肽臂或FX结合多肽臂的方法，所述方法包括在表达抗原结合分子的条件下培养根据条款32所述的宿主细胞，和从宿主细胞培养物中回收抗原结合分子或结合臂。
条款34.一种控制患者出血的方法，其包括向患者给予根据条款29或条款30所述的组合物。
条款35.根据条款1到25中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其用于通过疗法治疗人体或动物体的方法中。
条款36.根据条款1到25中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其用于控制患者出血。
条款37.根据条款34所述的方法，或根据条款35或条款36所述的供使用的双特异性抗原结合分子，其中患者为A型血友病患者。
条款38.根据条款37所述的方法或供使用的双特异性抗原结合分子，其中由于血液中存在抑制性抗体，患者对用FVIII治疗具有抗性。
条款39.一种根据条款1到25中任一项所述的双特异性抗原结合分子的用途，其用于活体外结合FIXa和FX。
条款40.一种根据条款1到25中任一项所述的双特异性抗原结合分子的用途，其用于在A型血友病患者中取代FVIII功能。
陈述
1.一种双特异性抗原结合分子，其包括
FIXa结合多肽臂，其包括FIXa结合位点，以及
FX结合多肽臂，其包括FX结合位点，
其特征在于，FIXa结合多肽臂包括与SEQ ID NO:324具有至少90％氨基酸序列一致性的VH结构域和与SEQ ID NO:10具有至少90％氨基酸序列一致性的VL结构域，任选地其中VH结构域包括在IMGT位置111.1处具有疏水性或带正电荷残基的HCDR3，任选地其中HCDR3氨基酸序列为SEQ ID NO:400、SEQ ID NO:401、SEQ ID NO:402、SEQ ID NO:403或SEQID NO:171；和/或
其特征在于，FIXa结合位点由FIXa结合多肽臂中的互补决定区(CDR)集合提供，所述CDR集合包括HCDR1、HCDR2、HCDR3和/或LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
HCDR1为SEQ ID NO:1
HCDR2为SEQ ID NO:2
HCDR3为SEQ ID NO:400
LCDR1为SEQ ID NO:6
LCDR2为SEQ ID NO:7，以及
LCDR3为SEQ ID NO:8。
2.根据陈述1所述的双特异性抗原结合分子，其中FIXa结合位点由FIXa结合多肽臂中的互补决定区(CDR)集合提供，所述CDR集合包括HCDR1、HCDR2、HCDR3和/或LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
HCDR1为SEQ ID NO:1
HCDR2为SEQ ID NO:2
HCDR3为SEQ ID NO:401、SEQ ID NO:402、SEQ ID NO:403或SEQ ID NO:171
LCDR1为SEQ ID NO:6
LCDR2为SEQ ID NO:7，以及
LCDR3为SEQ ID NO:8。
3.一种双特异性抗原结合分子，其包括
(i)FIXa结合多肽臂，其包括FIXa结合位点，其中FIXa结合多肽臂包括抗体Fv区，所述抗体Fv区包括
VH结构域，其通过重组免疫球蛋白重链v、d和j基因片段而产生，其中v基因片段为VH3-7(例如，VH3-7*01)，且/或其中j基因片段为JH6(例如，JH6*02)，及
VL结构域，其通过重组免疫球蛋白轻链v和j基因片段而产生，其中v基因片段为VL3-21(例如，VL3-21*D01)且j基因片段为JL2(例如，JL2*01)或JL3，以及
(ii)FX结合多肽臂，其包括FX结合位点，其中FX结合多肽臂包括抗体Fv区，所述抗体Fv区包括
(a)VH结构域，其通过重组免疫球蛋白重链v、d和j基因片段而产生，其中v和j基因片段为VH1-3(例如，VH1-3*01)和JH6(例如，JH6*02)，及
VL结构域，其通过重组免疫球蛋白轻链v和j基因片段而产生，其中v和j基因片段为VL1-47(例如VL1-47*01)和JL1(例如JL1*01)；或
(b)VH结构域，其通过重组免疫球蛋白重链v、d和j基因片段而产生，其中v和j基因片段为VH3-30(例如，VH3-30*18)和JH6(例如，JH6*02)，及
VL结构域，其通过重组免疫球蛋白轻链v和j基因片段而产生，其中v和j基因片段为VL2-8(例如VL2-8*01)和JL2(例如JL2*01)；或
(c)VH结构域，其通过重组免疫球蛋白重链v、d和j基因片段而产生，其中v和j基因片段为VH4-61(例如，VH4-61*01)和JH1(例如，JH1*01)，以及
VL结构域，其通过重组免疫球蛋白轻链v和j基因片段而产生，其中v和j基因片段为VK3-11(例如，VK3-11*01)和JK5(例如，JK5*01)。
4.根据前述任一陈述所述的双特异性抗原结合分子，其中FIXa结合多肽臂包括与SEQ ID NO:324具有至少95％氨基酸序列一致性的VH结构域。
5.根据前述任一陈述所述的双特异性抗原结合分子，其中FIXa结合多肽臂包括与SEQ ID NO:10具有至少95％氨基酸序列一致性的VL结构域。
6.根据前述任一陈述所述的双特异性抗原结合分子，其中
FIXa结合位点由FIXa结合多肽臂中的互补决定区(CDR)集合提供，所述CDR集合包括HCDR1、HCDR2、HCDR3和/或LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
HCDR1为SEQ ID NO:1
HCDR2为SEQ ID NO:2
HCDR3为SEQ ID NO:171
LCDR1为SEQ ID NO:6
LCDR2为SEQ ID NO:7，以及
LCDR3为SEQ ID NO:8。
7.根据前述任一陈述所述的双特异性抗原结合分子，其中FIXa结合多肽臂包括VH结构域氨基酸序列SEQ ID NO:324和VL结构域氨基酸序列SEQ ID NO:10。
8.根据前述任一陈述所述的双特异性抗原结合分子，其在aPTT测定中将FVIII缺乏型人类血浆的凝结时间降低到少于40秒。
9.根据前述任一陈述所述的双特异性抗原结合分子，其中FIXa结合多肽臂能够在以单特异性形式提供时增强FX对FIXa的FXa催化活化。
10.根据前述任一陈述所述的双特异性抗原结合分子，其中
FX结合多肽臂包括与SEQ ID NO:61具有至少90％氨基酸序列一致性的VH结构域和与SEQ ID NO:66具有至少90％氨基酸序列一致性的VL结构域；且/或其中
FX结合位点由FX结合多肽臂中的互补决定区(CDR)集合提供，所述CDR集合包括HCDR1、HCDR2、HCDR3和/或LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
HCDR1为SEQ ID NO:57
HCDR2为SEQ ID NO:58
HCDR3为SEQ ID NO:59
LCDR1为SEQ ID NO:62
LCDR2为SEQ ID NO:63，以及
LCDR3为SEQ ID NO:64。
11.根据陈述10所述的双特异性抗原结合分子，其中FX结合多肽臂包括VH结构域氨基酸序列SEQ ID NO:61和VL结构域氨基酸序列SEQ ID NO:66。
12.根据陈述1到9中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中
FX结合多肽臂包括与SEQ ID NO:71具有至少90％氨基酸序列一致性的VH结构域和与SEQ ID NO:76具有至少90％氨基酸序列一致性的VL结构域；且/或其中
FX结合位点由FX结合多肽臂中的互补决定区(CDR)集合提供，所述CDR集合包括HCDR1、HCDR2、HCDR3和/或LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
HCDR1为SEQ ID NO:67
HCDR2为SEQ ID NO:68
HCDR3为SEQ ID NO:69
LCDR1为SEQ ID NO:72
LCDR2为SEQ ID NO:73，以及
LCDR3为SEQ ID NO:74。
13.根据陈述12所述的双特异性抗原结合分子，其中FX结合多肽臂包括VH结构域氨基酸序列SEQ ID NO:71和VL结构域氨基酸序列SEQ ID NO:76。
14.根据陈述1到9中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中
FX结合多肽臂包括与SEQ ID NO:100具有至少90％氨基酸序列一致性的VH结构域和与SEQ ID NO:104具有至少90％氨基酸序列一致性的VL结构域；且/或
其中FX结合位点由FX结合多肽臂中的互补决定区(CDR)集合提供，所述CDR集合包含HCDR1、HCDR2、HCDR3和/或LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
HCDR1为SEQ ID NO:96
HCDR2为SEQ ID NO:97
HCDR3为SEQ ID NO:98
LCDR1为SEQ ID NO:101
LCDR2为SEQ ID NO:92，以及
LCDR3为SEQ ID NO:102。
15.根据陈述14所述的双特异性抗原结合分子，其中FX结合多肽臂包括VH结构域氨基酸序列SEQ ID NO:100和VL结构域氨基酸序列SEQ ID NO:104。
16.根据前述任一陈述所述的双特异性抗原结合分子，其中FIXa结合多肽臂和/或FX结合多肽臂包括
抗体重链，其从N端到C端包括VH结构域、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域，以及
抗体轻链，其从N端到C端包括VL结构域和CL结构域。
17.根据陈述16所述的双特异性抗原结合分子，其中抗体重链包括IgG恒定区。
18.根据前述任一陈述所述的双特异性抗原结合分子，其中抗原结合分子为四聚合免疫球蛋白，其包括
第一重-轻链对，其包括FIXa结合Fv区，
第二重-轻链对，其包括FX结合Fv区，
其中每个重链包含VH结构域和恒定区，且每个轻链包含VL结构域和恒定区，且其中第一和第二重-轻链对通过其重链恒定区的异源二聚化而缔合，从而形成四聚合免疫球蛋白区。
19.根据陈述18所述的双特异性抗原结合分子，其中免疫球蛋白为IgG，例如IgG4。
20.根据陈述19所述的双特异性抗原结合分子，其中IgG包括IgG4-PE人类重链恒定区SEQ ID NO:143，其任选地用一个或多个氨基酸取代进行工程改造以促进异源二聚化。
21.一种分离的FIXa结合多肽，其包括FIXa结合位点，其中FIXa结合多肽如前述陈述中任一项所定义。
22.一种分离的核酸，其编码根据陈述1到20中任一项所述的双特异性抗原结合分子的FIXa结合多肽臂或FX结合多肽臂。
23.一种分离的核酸，其编码根据陈述1到20中任一项所述的双特异性抗原结合分子。
24.一种用于产生陈述1到20中任一项所述的双特异性抗原结合分子的试剂盒，其包括
包括FIXa结合位点的FIXa结合多肽，或编码所述多肽的核酸，其中FIXa结合多肽为陈述1到20中任一项所定义的FIXa结合多肽臂，以及
包含FX结合位点的FX结合多肽，或编码所述多肽的核酸，其中FX结合多肽为如陈述1到20中任一项所定义的FX结合多肽臂。
25.一种组合物，其包括根据陈述1到20中任一项所述的抗原结合分子，或根据陈述23所述的分离核酸，以及医药学上可接受的赋形剂。
26.根据陈述25所述的组合物，其中抗原结合分子或核酸处于无菌水溶液中。
27.一种宿主细胞，其包括重组核酸，所述重组核酸编码根据陈述1到20中任一项所述的双特异性抗原结合分子，或编码所述双特异性抗原结合分子的FIXa结合多肽臂和/或FX结合多肽臂，其中编码核酸可操作地连接到启动子以用于表达。
28.一种产生根据陈述1到20中任一项所述的抗原结合分子，或产生所述双特异性抗原结合分子的FIXa结合多肽臂或FX结合多肽臂的方法，所述方法包括在表达抗原结合分子的条件下培养根据陈述27所述的宿主细胞，和从宿主细胞培养物中回收抗原结合分子或结合臂。
29.一种控制患者出血的方法，其包括向患者给予根据陈述25或陈述26所述的组合物。
30.根据陈述1到20中任一项所述的双特异性抗原结合分子，或根据陈述25或陈述26所述的组合物，其用于通过疗法治疗人体或动物体的方法中。
31.根据陈述25或陈述26中的组合物的根据陈述1到20中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其用于控制患者出血。
33.根据陈述29所述的方法，或根据陈述30或陈述31所述的供使用的双特异性抗原结合分子，其中患者为A型血友病患者。
34.根据陈述33所述的方法或供使用的双特异性抗原结合分子，其中由于血液中存在抑制性抗体，患者对用FVIII治疗具有抗性。
35.根据陈述33或陈述34所述的方法或供使用的双特异性抗原结合分子，其中由于血液中存在抑制性抗体，患者对用FIXa和FX的另一种双特异性抗原结合分子进行治疗具有抗性。
36.根据陈述35所述的方法或供使用电双特异性抗原结合分子，其中患者对用艾米珠单抗治疗具有抗性。
37.一种减少在A型血友病患者体内产生抑制性抗药物抗体的方法，所述患者用替代FVIIIa活性的多肽进行治疗，所述方法包括
向患者给予第一种FVIIIa活性替代多肽药物，持续1-12个月时间段，
将患者切换到第二种不同FVIIIa活性替代多肽药物，持续1-12个月时间段，以及
将患者切换到第一种抗原结合分子或第三种不同FVIIIa活性替代多肽药物，持续1-12个月时间段，
其中，在每种情况下，以治疗有效量给予FVIIIa活性替代多肽药物或其编码核酸以在功能上替代患者中的FVIIIa，且其中与继续接受FVIIIa活性替代多肽药物治疗的患者相比，患者产生针对FVIIIa活性替代多肽药物中的任一种的抑制性抗药物抗体的风险降低。
38.一种组合物，其包括FVIIIa活性替代多肽药物或其编码核酸，其用于治疗A型血友病患者同时减少抑制性抗药物抗体产生的方法中，所述方法包括向患者给予第一种FVIIIa活性替代多肽药物，持续1-12个月时间段，
将患者切换到第二种不同FVIIIa活性替代多肽药物，持续1-12个月时间段，以及
将患者切换到第一种抗原结合分子或第三种不同FVIIIa活性替代多肽药物，持续1-12个月时间段，
其中，在每种情况下，以治疗有效量给予FVIIIa活性替代多肽药物或其编码核酸以在功能上替代患者中的FVIIIa，且其中与继续接受FVIIIa活性替代多肽药物治疗的患者相比，患者产生针对FVIIIa活性替代多肽药物中的任一种的抑制性抗药物抗体的风险降低。
39.根据陈述37所述的方法或根据陈述38所述的供使用的组合物，其中第一、第二和/或第三FVIIIa活性替代多肽药物为FIXa和FX的双特异性抗原结合分子。
40.根据陈述37到39中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中第一、第二和/或第三FVIIIa活性替代多肽药物为艾米珠单抗。
41.根据陈述37到40中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中第一、第二和/或第三FVIIIa活性替代多肽药物为根据陈述1到20中任一项所述的双特异性抗原结合分子。
42.根据陈述37到41中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中第一、第二或第三FVIIIa活性替代多肽药物为重组FVIII或血浆衍生的FVIII。
43.一种根据陈述1到20中任一项所述的双特异性抗原结合分子的用途，其用于活体外结合FIXa和FX。
44.一种根据陈述1到20中任一项所述的双特异性抗原结合分子的用途，其用于在A型血友病患者中替代FVIII功能。
鉴于本公开，本发明的各种其它方面和实施例对于所属领域上的技术人员将是显而易见的。本说明书中所提及的所有文献，包括所提及的任何专利或专利申请的已公开的美国对应文件，均以全文引用的方式并入本文中。
实例
以下实例描述了分别从抗FIXa和抗FX抗体的FIXa结合多肽臂和FX结合多肽臂组合产生的抗FIXa抗体、抗-FX抗体和双特异性抗体的产生、表征和性能。使用KymouseTM(一种能够产生具有人类可变结构域的抗体的转基因小鼠平台)产生抗体。来自Kymouse的抗体具有由人类v(d)和j片段产生的人类可变结构域和小鼠恒定结构域。内源性小鼠可变基因已沉默，且仅占抗体库的很小一部分(小于0.5％的全部重链可变区属于小鼠来源)。Kymouse系统在Lee等人2014年[11]，WO2011/004192、WO2011/158009和WO2013/061098中进行了描述。这个项目采用了其中使重链基因座和轻链κ基因座人源化的Kymouse HK菌株，和其中使重链基因座和轻链λ基因座人源化的Kymouse HL菌株。小鼠具有人类v、d和j重链基因片段的完整库，和人类v和jκ或λ轻链基因片段的完整库。
实例1.产生针对因子IXa(FIXa)的抗体
使四只Kymouse HK小鼠(雄性，在免疫开始时4个月大)和四只Kymouse HL小鼠(雄性，在免疫开始时3个月大)针对人类因子IXa(酶研究实验公司(Enzyme ResearchLaboratories,Inc.))免疫。
从免疫的小鼠中收集脾组织，且将脾细胞悬浮并且通过FACS分选以分离抗原特异性B细胞。从8只免疫的动物中分选出总共2,460个因子IXa特异性B细胞。通过RNA的逆转录和可变区的PCR扩增，从B细胞中回收偶合的抗体重链和轻链可变结构域序列。
将编码抗体的核酸转染到人类细胞系Expi293F中用于表达，且收集上清液。
实例2.因子IXa抗体的
Figure BDA0002322205310000691
(均相时间分辨荧光)筛选
HTRF测定用于筛选与FIXa结合的抗FIXa抗体。用两种不同的荧光团(供体和受体)标记FIXa和抗体。当两个实体彼此足够接近时，能量源对供体的激发会触发朝向受体的能量转移，进而在给定波长下发射特定的荧光。因此，可以通过在受体的发射波长处进行检测来检测FIXa与其特异性抗体的结合。
使用Expi293表达培养基(英杰公司(Invitrogen))制备抗人类因子IX参考抗体AbN和CM7同型对照抗体的连续稀释液。将来自实例1中产生的2,460个分泌抗体的人类细胞中每个的5μL上清液转移到测定盘。将5μL AbN和CM7同型对照抗体分别转移到每个测定盘上作为阳性和阴性对照。将5μL(80nM)Alexa 647标记的人类因子IX、因子IXa或因子IX轻链添加到测定盘的每个孔中，且在室温(RT)下培育1小时。将10μL 2X M24-K溶液(由储备溶液以1:2000稀释)添加到测定盘的每个孔中，且在室温下黑暗中培育2小时。使用Envision的HTRF 100闪光方案(激发波长：340nm；发射波长1：620nm；发射波长2：665nm)读取测定盘。分析数据且将其标准化为AbN阳性对照。
在这个测定中，在来源于抗FIXa特异性B细胞的2,460个抗体中，732个识别为因子IX、因子IXa和/或因子IX轻链的结合物。
实例3.因子IX抗体的SPR分析
根据制造商的说明书制备抗小鼠IgG芯片。将实例1的上清液用HBS-EP操作缓冲液(由20X HBS-EP+缓冲液，pH 7.6(Bioquote)稀释)以1:5稀释。在抗小鼠IgG表面上捕获抗体。将不同浓度(256nM和1024nM)的人类因子IX、人类因子IXa或人来因子IX轻链用作分析物。用10mM甘氨酸(pH 1.7)使表面再生。用缓冲液注射(0nM)双重参考结合传感图。将数据拟合到ProteOn分析软件固有的1:1模型。在25℃下进行测定，且将HBS-EP缓冲液用作操作缓冲液。
实例4.因子X(FX)抗体的产生
使四只Kymouse HK版本2的小鼠(雄性，在开始免疫时为3个月大)和四只KymouseHL版本2的小鼠(雄性，在免疫开始时为3个月大)对人类因子X(酶研究实验公司(EnzymeResearch Laboratories，Inc.))免疫。从免疫的小鼠中收集脾组织，且将脾细胞悬浮并且通过FACS分选以分离抗原特异性B细胞。从8只免疫的动物中分选出总共1,722个因子X特异性B细胞。通过RNA的逆转录和可变区的PCR扩增，从B细胞中回收偶合的抗体重链和轻链可变结构域序列。
将编码抗体的核酸转染到人类细胞系Expi293F中用于表达，且收集上清液。
实例5.因子X抗体的HTRF筛选
使用Expi293表达培养基(英杰公司)制备参考抗人类因子X抗体、AbT和CM7同型对照抗体的连续稀释液。将来自实例4中产生的1,722个分泌抗体人类细胞中的每个的5μL上清液转移到测定盘。将5μL AbT和CM7同型对照抗体分别转移到每个测定盘上作为阳性和阴性对照。将5μL(80nM)Alexa 647标记的人类因子X、因子Xa或因子X轻链添加到测定盘的每个孔中，且在室温下培育1小时。向每个孔中添加10μL 2X M24-K溶液(由储备溶液以1:2000稀释)，且在室温下黑暗中培育2小时。使用Envision的HTRF 100闪光方案(激发波长：340nm；发射波长1：620nm；发射波长2：665nm)读取测定盘。分析数据并将其标准化为AbT阳性对照。
在这个测定中，在来源于抗FX特异性B细胞的1,722个抗体中，497个识别为因子X、因子Xa和/或因子X轻链的结合物。
实例6.因子X抗体的SPR分析
根据制造商的说明书制备抗小鼠IgG芯片。将实例4的上清液用HBS-EP操作缓冲液(由20X HBS-EP+缓冲液，pH 7.6(Bioquote)稀释)以1∶5稀释。在抗小鼠IgG表面捕获抗体。将不同浓度(256nM和1024nM)的人类因子X、人类因子Xa或人类因子X轻链用作分析物。用10mM甘氨酸(pH 1.7)使表面再生。用缓冲液注射(0nM)双重参考结合传感图。将数据拟合到ProteOn分析软件固有的1:1模型。在25℃下进行测定，且将HBS-EP缓冲液用作操作缓冲液。
实例7.双特异性抗体表达载体的构建
表达双特异性人类IgG抗体的质粒如下构建。由如实例1和实例4中所产生的PCR产物制备编码抗体可变区的DNA片段。为了制备用于克隆的抗体可变区DNA片段，在进行PCR之后，使反应溶液进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)通过随附说明书手册中所描述的方法纯化所需大小(约400bp)的扩增片段，且使用30mL洗脱缓冲液(EB)洗脱。
参考IgG1的杵臼技术[12]制备IgG4的CH3区中的氨基酸取代产物，以形成每个H链的异质分子。a型(IgG4ra)是Y349C和T366W的取代产物，且b型(IgG4yb)是E356C、T366S、L368A和Y407V的取代产物。此外，在两种类型的取代产物的铰链区中引入取代(-ppcpScp-和-ppcpPcp-)。根据本发明技术，几乎所有的H链可形成异源二聚体。
为了表达双特异性抗体的FIXa臂，将VH结构域克隆到质粒载体pTT5_Cam_ccdB_hIgG4ra中以在全长人类IgG4ra抗体重链中提供编码VH结构域的DNA，将VLκ结构域克隆到pTT5_Cam_ccdB_hIgK中以在全长人类κ抗体轻链中提供编码VL结构域的DNA，且将VLλ结构域克隆到pTT5_Cam_ccdB中以在全长人类λ抗体轻链中提供编码VL结构域的DNA。
用AarI(英杰公司)分解H和L链可变区(VH和VL)DNA片段，且根据制造商的说明书使用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)进行纯化。用限制性AarI分解pTT5_Cam_ccdB_hIgG4ra(对于VH)、pTT5_Cam_ccdB_hIgK(对于来自κ克隆的VL)或pTT5_Cam_ccdB(对于来自λ克隆的VL)，所述限制性AarI的裂解位点处于多克隆位点。在分解后，根据制造商的说明书，使用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化载体。
根据制造商的说明书，使用T4连接酶(新英格兰生物实验室(New EnglandBiolabs))将AarI分解的VH或VL片段与已经用AarI分解的pTT5_Cam_ccdB_hIgG4ra(对于VH)、pTT5_Cam_ccdB_hIgK(对于来自κ克隆的VL)或pTT5_Cam_ccdB(对于来自λ克隆的VL)连接。用连接溶液转化大肠杆菌DH10B菌株(ElectroMax DH10B(英杰公司))。使用QIAprepSpin Miniprep试剂盒(QIAGEN)从获得的氨苄青霉素抗性克隆中分离出相应的质粒DNA。通过Sanger定序证实所得的相应氨苄青霉素抗性转化体具有所需VH和VL的插入。
根据制造商的说明书，使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN)从所需克隆中分离出用于抗FIX结合臂和抗FX结合臂的质粒DNA，且将其最初溶解于100mL洗脱缓冲液(EB)中。通过Nano-drop(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))定量质粒DNA溶液，且标准化为50ng/mL。抗FIXa抗体H链表达载体、抗FIXa抗体L链表达载体、抗FX抗体H链表达载体和抗FX抗体L链表达载体称为Nn-IgG4ra、Nn-IgL(或IgK)、Tn-IgG4rb和Tn-IgL(或IgK)。通过Sanger定序确认DNA小量制备物已具有所需VH或VL的插入。将相应质粒溶液保存在4℃下直至使用。
实例8.双特异性抗体的表达
8-1.DNA溶液的制备
制备含有四种质粒DNA的混合溶液以用于转染HEK细胞。对于1mL细胞培养物，分别使用250ng Nn-IgG4ra、Nn-IgL(或IgK)、Tn-IgG4rb和Tn-IgL(或IgK)。
8-2.宿主细胞转染
在转染前一天，对培养的Expi293F细胞(HEK细胞系)进行计数以进行细胞接种量计算。Expi293F细胞以300rpm沉淀10分钟。将细胞再悬浮于预热的新鲜Expi293表达培养基中，以使最终稀释度为2.4×106个细胞/毫升。将200ml细胞悬浮液在Kuhner Shaking培育箱(37℃，140rpm，8％CO2)中培育过夜。
在转染当天，对培养的Expi293F细胞进行计数，且使用新制度Expi293表达培养基将其稀释到4×106个细胞/毫升。使用Multidrop Combi将500μl细胞悬浮液等分到96孔深孔盘的每个孔中。在分配后，将各盘用Duetz夹层盖覆盖，且在Kuhner Shaking培育箱(37℃、300rpm、50mm轨道投掷、湿度80％)中培育2到2.5小时。
对于每次转染，制备两种混合物。
混合物1：每孔25μl B细胞桥结产物(4种质粒混合物)+55μl RSM+100ngHyperPBase
混合物2：1μl ExpiFectamineTM 293+79μl RSM
将混合物2添加到混合物1中，且在室温下培育15分钟。然后将培育的混合物添加到500μl细胞培养溶液中，且在Kuhner Shaking培育箱(37℃、300rpm、50mm轨道投掷)中培育一周。
实例9.活化凝血因子VIII(FVIIIa)样活性测定
通过酶促测定活体外评定双特异性抗体的FVIIIa模拟物活性，即其增强FX的FIXa介导活化的能力。在这次测定中，在适合于形成FXa的条件下，在磷脂存在下使测试双特异性分子与FIXa和FX接触。添加针对FXa的底物，当其由FXa裂解时，产生可检测的产物。将这个产物在测试双特异性抗体存在下的检测与不存在测试抗体的阴性对照(可能包含对照抗体)进行比较。通过记录反应溶液在405nm处的吸光度来量化检测到的信号。在测定中在一定抗体浓度范围内测量吸光度，且在这个测定中将EC50值计算作为双特异性抗体效价的量度。测试抗体与对照之间的EC50显著差异表明，测试抗体能够增强FX的FIXa介导活化。参见图7.
-材料和方法
除非另有说明，否则所有反应都在37℃下进行。
将7.5μL FIX(3.75μg/mL)和来自产生重组抗体的Expi293细胞(实例8)的5μL上清液添加到测定盘的每个孔中，且在室温下培育1小时。将2.5μL FXIa(10ng/mL)、5μL FX(50ng/mL)、0.05μL磷脂(10mg/mL)和5μL TBSB-S缓冲液的混合物添加到每个孔中以引发酶反应(FIXa裂解FX以产生FXa)，且在37℃下培育1小时。60分钟后，通过添加5μL的0.5M EDTA终止反应。向每个孔中添加10μL S2765底物溶液后，测量405nm(参考波长655nm)处的吸光度30分钟(每10分钟读取一个读数)。
TBSB：
含有0.1％牛血清白蛋白的Tris缓冲盐水
制备7.5mL TBSB：
0.1mL 7.5％BSA溶液(西格玛(Sigma))
7.4mL 1×TBS溶液(由20×TBS溶液稀释，赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher))
TBSB-S：
含有5mM CaCl2和1mM MgCl2的TBSB
制备100mL TBSB-S：
99.4mL TBSB
0.5mL 1M CaCl2(西格玛(Sigma))
0.1mL 1M MgCl2(西格玛(Sigma))
FXIa储备溶液(10μg/mL)：
将10mL TBSB-S添加到0.1mg FXIa(酶研究实验公司(Enzyme ResearchLaboratories))中，制成10μg/mL储备溶液。
使用前稀释成10ng/mL(1:1,000)的工作溶液。
FIX储备溶液(37.5μg/mL)：
将13.3mL TBSB-S添加到0.5mg FIX(酶研究实验公司(Enzyme ResearchLaboratories))中以制成37.5μg/mL储备溶液。
使用前稀释成3.75μg/mL(1:10)的工作溶液。
FX工作溶液(50μg/mL)：
向0.8mg FX(酶研究实验公司(Enzyme Research Laboratories))中添加16mLTBSB-S，以制成50μg/mL的工作溶液。
使用前无需进一步稀释。
S2765储备溶液：
25mg S2765(Chromogenix)显色底物(0.035mmol)
制备2mM储备溶液：
向小瓶中添加17.493mL水，且摇动溶解。
Pefafluor FXa储备溶液：
10μmol Pefafluor FXa荧光底物(0.010mmol)
制备1.5mM储备溶液：
向小瓶中添加6.667mL水，且摇动溶解。
凝聚胺溶液：
制备0.6g/L的海美溴铵(hexadimethrine bromide)储备溶液
将0.15g海美溴铵(西格玛(Sigma))添加到250mL水中。
使用前稀释成0.6mg/L(1:1,000)工作溶液。
S2765底物工作溶液
2mM S-2765储备溶液和0.6mg/L凝聚胺溶液的1:1混合物。
实例10.血浆凝结测定
为了确定本发明的双特异性抗体纠正A型血友病患者血液的凝血能力的能力，使用FVIII缺乏型血浆检查这些抗体对活化部分凝血活酶时间(aPTT)的影响。
将具有各种浓度的50mL双特异性抗体溶液、50mL FVIII缺乏型血浆(Biomerieux)和50mL aPTT试剂(Dade Behring)的混合物在37℃下加热3分钟。通过向混合物中添加50mL的20mM CaCl2(Dade Behring)来引发凝结反应。测量直到凝结的时间。用于此测定的设备是连接到CR-A(Amelung)的KC10A(Amelung)。
随后确定表现出最高凝结时间减少作用的双特异性抗体的浓度依赖性。
实例11：初步筛选的总结
含有N128H FIX结合臂的双特异性抗体在FXase测定中的活性比大多数其它双特异性抗体显著高得多，且N128H FIX结合臂展示形成具有一系列FX结合臂的活性双特异性抗体的能力。图8.
实例12：N128H突变体的产生
选择具有分别命名为N128H和N128L的重链和轻链可变域的抗FIX抗体“N128”进行进一步评估和优化。N128H CDR3(SEQ ID NO:3)分别在IMGT残基位置110、111、111.1和112.1含有一系列的四个丝氨酸残基。每个Ser都分别突变为所有其它天然存在的氨基酸，从而在如图9所概述的N128H HCDR3中产生突变。
这项工作产生大量含有N128 FIXa结合臂变体的双特异性抗体，其为研究FIXa结合臂在以下方面的其它潜力提供了基础：
1)使因子Ixa达到因子X的理想接近度；
2)以最大化因子IXa的催化活性的方式定向因子IXa。
如下所报告，双特异性抗体在哺乳动物细胞中表达，通过蛋白A纯化(实例13)并在功能上进行表征(实例14)，每个双特异性抗体含有与N128相比在HCDR3中具有单点突变的FIXa结合臂。随后进一步分析呈现比具有N128H臂的双特异性抗体活性更好的所选择的双特异性抗体，以确认其结合特性和生物活性(实例15到18)。
实例13：用于功能测定的抗体的表达和纯化
以下步骤用于制备抗体(单特异性和双特异性)，以用于后续实例中所描述的实验。
表达：
抗体在人类(Expi293)细胞中暂时表达，随后从细胞培养物上清液中纯化。
在转染前一天，Expi293细胞通过自动细胞计数器(Eve cell counter)进行计数，所述细胞以约1.7×106个细胞/毫升的密度接种在预热的表达培养基中，且在定轨振荡器培育箱中培育过夜(37℃、8％CO2、140rpm)。
在转染当天，对细胞计数且将细胞数调整到2.5×106个细胞/毫升。将2000μl细胞悬浮液分配到24个深孔盘中，且放置到Kuhner振荡培育箱(37℃、8％CO2、225rpm)中。
制备DNA溶液。在超纯水中稀释的2μg DNA质粒混合物用于Expi293细胞的每次转染。
就双特异性抗体而言，制备含有四种质粒DNA的混合溶液。对于2mL细胞培养物，分别使用500ng Nn-IgG4ra、Nn-IgL(或IgK)、Tn-IgG4γb和Tn-IgL(或IgK)。就单特异性抗体而言，对于2mL细胞培养液，分别使用1μg Nn-IgG4PE和Nn-IgL(或IgK)或Tn-IgG4PE和Tn-IgL(或IgK)。
通过相同程序转染编码单特异性或双特异性抗体的DNA。制备两种混合物以用于转染：
混合物1：将2μg质粒DNA稀释在40μl
Figure BDA0002322205310000781
I培养基中。
混合物2：80μl ExpiFectamineTM 293转染试剂+40μl OptiMEM I培养基。
将混合物2与混合物1合并，且在室温下培育20到30分钟。培育完成后，将165μlDNA-ExpiFectamineTM 293试剂复合物分配到24个深孔盘的每个孔中。将细胞在Kuhner振荡培育箱(37℃、8％CO2、225rpm)中培育6天。转染后6天获得细胞培养上清液。
纯化：
使用96孔盘以纯化来自Expi293F细胞培养物上清液的抗体(双特异性或单特异性)。此方法允许在抗体筛选实验中快速地对多个样本进行小规模亲和抗体纯化。为了获得高百分比回收率，使用MabSelect Sure LX，其为具有极其动态的结合活性(60mg人类IgG/ml培养基)、延长的滞留时间、耐碱和低配体泄漏的蛋白A亲和力。
步骤
1.使MabSelect Sure LX树脂(GE Healthcare)在1×PBS(吉毕科公司(Gibco))中平衡，以去除储存缓冲液，使最终浓度为10％浆液。
2.将600μl 10％浆液添加到96孔盘AcroPrepTM Advance(颇尔公司(Pall))的每个孔中
3.将树脂在4℃下以70×rcf离心1分钟。
4.用300μl 1×PBS洗涤树脂，旋转70×rcf 1分钟。将此步骤重复两次。
5.将2ml细胞培养物上清液(pH 7-8)装载到96孔纯化盘中的MabSelect Sure LX树脂上，且以70-100×rcf离心1分钟。
6.使用600μl 1×PBS洗涤盘，且在70-100×rcf下离心1分钟。此步骤总共进行四次。
7.向每个孔中添加70μl洗脱缓冲液(IgG Elute Pierce)且培育1分钟。
8.将盘在70-100×rcf下离心1分钟以收集洗脱液。此步骤总共进行两次。
实例14：N128H CDR3突变体的功能分析
使用活体外显色因子X活化(FXase)测定和血浆凝结测定(如先前所描述)确定根据实例12新产生的双特异性抗体的功能活性。为了标准化变体的比较，将所有FIXa结合臂(与N128 VL配对的变异VH)与相同FX结合臂异源二聚化。
根据CDRH3的诱变分析，应注意在N128H CDR3中的4个丝氨酸系列的第3个丝氨酸残基似乎实质上有助于FVIII模拟物活性。令人惊讶的是，与原始N128 FIX结合臂相比，此位置上的几个序列变异极大地改善了双特异性抗体的FVIII模拟物活性(图10)。具体地说，其中N128H CDR3的第3个丝氨酸分别由异白氨酸、白氨酸和缬氨酸替代(图9)的变体N436H、N438H和N445H展示FXase活性显著增加(约2-3倍)。N435H、N437H、N442H、N443H和N446H变体也观察到FXase活性的显著增加，其中第3个丝氨酸分别突变为组氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、精氨酸和色氨酸。诱变分析还揭露，与原始抗FIX臂N128H相比，HCDR3中的特定氨基酸在此位置的取代降低了双特异性抗体的FXase活性。变体N430H(Cys)、N441H(Pro)、N447H(Tyr)的酶活性再次表明了此位置上的残基的重要性。
与原始的抗FIX臂相比，在(Ser)4基元中的其它位置处取代丝氨酸的某些其它氨基酸也降低了活性，最显著的是在以下变体中：N459H(第4个Ser变成Pro)、N461H(第4个Ser变成Arg)、N465H(第4个Ser变成Tyr)、N470H(第1个Ser变成Phe)、N478H(第1个Ser变成Pro)、N480H(第1个Ser变成Arg)、N495H(第2个Ser变成Asn)。
在图11中，将N128H变体的酶活性(如405nm处的吸光度)相对于凝血时间(aPTT以秒为单位)绘制成图。将N128H变体的FVIII模拟物活性与双特异性抗体AbE和ISTC进行比较。如高aPTT值所指示，同型对照(阴性对照，ISTC)显示无酶活性且形成凝块的能力较弱。N436H、N438H和N445H变体表现出强大的产生FXa(高OD405值)并快速地导致FVIII免疫贫血血浆凝结(低aPTT值-大约30秒)的能力。
考虑到这些功能数据，可以为HCDR3中的连续IMGT位置110、111、111.1和112.1处的残基生成共有序列(见表9A)。考虑IMGT位置111.1(对应于N128H中的第三个Ser)、疏水性残基(例如，Ile、Leu、Val、Trp)或带正电荷的残基(例如，Arg、Gln、Lys)与强大的功能活性相关。可以在此位置取代而不丧失活性(且可能改善活性)的其它残基包含His、Glu、Asn和Met。
如以下实例所报告，选择在上述筛选中显示最高活性的双特异性抗体的FIXa结合臂进行进一步表征。
实例15.纯化抗FIX抗体的SPR分析
SPR用于确定FIXa结合臂对FIX的结合亲和力(KD)，动力学常数结合速率(kon)和解离速率(koff)。使用Biacore 8K(GE Healthcare)系统进行分析。
根据制造商的说明书将抗人类IgG Fc抗体固定在CM4芯片(GE Healthcare目录号BR100534)上。胺偶合试剂盒(BioRad)用于活化芯片表面。随后用1M乙醇胺封闭表面。使用HBS-EP(10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％聚山梨醇酯20pH 7.6)作为固定操作缓冲液，在25℃下进行固定操作。
来自实例13的纯化单特异性抗体(称为配体)以约2μg/ml捕获在抗人类IgG FcCM4表面上。在所有8个流动通道的所有活动通道中，以10μl/min注入配体60秒。使用中性pH(pH 7.4)HBS-P 1×(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.05％聚山梨醇酯20pH 7.6)+CaCl2 2.5mM作为操作缓冲液，在25℃下进行操作。人类因子IX(FIX)(酶研究实验公司目录号HFIX 47064)在操作缓冲液中以1mg/ml(MW～55KDa)重组，且用作分析物。将因子IX以多循环动力学(MCK)模式以3种浓度(1.5μM、500μM和166.7nM)注射，在活性通道和参考通道中均以流速30μl/sec进行120秒缔合阶段和200秒解离阶段。10mM甘氨酸pH 1.5以10μl/min进行三次注射持续60秒，用于再生阶段。
同型对照(ISTC)抗体hIgG4PE在1μg/ml下以10μl/min在参考通道中捕获持续60秒。还在活动通道中捕获了hIgG4PE ISTC和hIgG1 ISTC作为阴性对照。包含用于比较的抗FIX单特异性抗体AbN。
将数据作为参考且减去缓冲液，然后将其拟合为Langmuir 1:1模型。在模型中评估解离的前30秒。
结果：
所分析的抗FIX抗体展示以表1中所展示的亲和力与FIX结合，以及与FIX的快速缔合(kon)和解离(koff)速率。用ISTC未观察到与FIX的结合。与AbN相比，所分析的抗FIX抗体展示了对于FIX的高约10倍的亲和力。
Figure BDA0002322205310000811
Figure BDA0002322205310000821
表格1.抗FIX抗体的结合亲和力和动力学常数结合速率(kon)和解离速率(koff)。使用生物分子反应模型(1:1Langmuir模型)拟合相互作用的缔合和解离数据。通过BIAevaluation软件从结合数据中计算出缔合速率常数(kon)、解离速率常数(koff)和解离常数(KD)的值。“NB”＝未观察到结合。
由于此测定使用FIX而不是FIXa，因此这里的动力学数据是指结合臂与FIX相互作用的亲和力。考虑到FIX与FIXa之间的紧密结构相似性，抗体结合FIXa的亲和力可以类似于其结合FIX的亲和力。
实例16.纯化抗FX抗体的SPR分析
SPR用于确定FIXa结合臂对FIX的结合亲和力(KD)，动力学常数结合速率(kon)和解离速率(koff)使用Biacore 8K(GE Healthcare)系统进行分析。
根据制造商的说明书，将抗人类IgG Fc抗体固定在CM5芯片(GE Healthcare目录号29104988)上。胺偶合试剂盒(BioRad)用于活化芯片表面。随后用1M乙醇胺封闭表面。使用HBS-EP(10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％聚山梨醇酯20pH 7.6)作为固定操作缓冲液，在25℃下进行固定操作。
将来自实例13的纯化单特异性抗体(称为配体)以约1μg/ml捕获在抗人类IgG FcCM5表面上。在所有8个流动池的所有8个活性通道中，将配体以10μl/min注入60秒。使用中性pH(pH 7.4)HBS-P 1×(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.05％聚山梨醇酯20pH 7.6)+CaCl2 2.5mM作为操作缓冲液，在25℃下进行操作。
人类因子X(FX)(酶研究实验公司目录号HFX1010)以1mg/ml(MW～58KDa)重组，且用作分析物。将因子X以多循环动力学(MCK)模式以3种浓度(1.5μM、375nM、93.75nM)注射，在活动通道和参考通道中均分别以流速30μl/sec进行120秒缔合阶段和300秒解离阶段。10mM甘氨酸pH 1.5以10ul/min进行三次注射持续60秒，用于再生阶段。
在活动通道中捕获hIgG4PE ISTC作为阴性对照。包含用于比较的抗FX单特异性抗体AbT。
将数据作为参考且减去缓冲液，并且拟合为Langmuir 1:1模型。在模型中评估解离的前30秒。
结果：
所分析的抗FX抗体展示以表2中所展示的亲和力与FX结合，以及FX的快速缔合(kon)和解离(koff)速率。用ISTC未观察到与FX的结合。
与AbT相比，所分析的抗FX抗体展示与FX的结合亲和力高约10倍到1000倍之间。抗体T14(VH结构域T14H、VL结构域T14L)对FX具有约0.18μM的亲和力。从具有类似于T14的序列的免疫小鼠中识别出的其它两个抗FX抗体VH结构域(T19H和T20H)与T14VL结构域配对以进行比较。这些结合的FX的KD分别约为0.2和0.05μM。其它测试的抗FX抗体(T15、T23和T25)的KD在纳摩尔范围内。
捕获的抗FX抗体 k<sub>on</sub>(1/Ms) k<sub>off</sub>(1/s) K<sub>D</sub>(M)
AbT 1.40×10<sup>4</sup> 3.26×10<sup>-2</sup> 2.33×10<sup>-6</sup>
T14H_IgG4PE+T14_VL_IgK 5.62×10<sup>4</sup> 1.01×10<sup>-2</sup> 1.79×10<sup>-7</sup>
T19H_IgG4PE+T14_VL_IgK 6.29×10<sup>4</sup> 1.21×10<sup>-2</sup> 1.93×10<sup>-7</sup>
T20H_IgG4PE+T14_VL_IgK 9.00×10<sup>4</sup> 4.19×10<sup>-3</sup> 4.66×10<sup>-8</sup>
T15H_IgG4PE+T15L_IgK 9.94×10<sup>4</sup> 2.94×10<sup>-4</sup> 2.96×10<sup>-9</sup>
T23H_IgG4PE+T23L_IgK 1.06×10<sup>4</sup> 6.03×10<sup>-4</sup> 5.70×10<sup>-9</sup>
T25H_IgG4PE+T25L_IgK 7.03×10<sup>4</sup> 2.51×10<sup>-3</sup> 3.57×10<sup>-9</sup>
hIgG4PE ISTC NB
表2.抗FX抗体的结合亲和力和动力学常数结合速率(kon)和解离速率(koff)。使用生物分子反应模型(1:1Langmuir模型)拟合相互作用的缔合和解离数据。通过BIAevaluation软件从结合数据中计算出缔合速率常数(kon)、解离速率常数(koff)和解离常数(KD)的值。“NB”＝未观察到结合。
实例17：对与一系列FX结合臂配对的FIX结合臂N436进行酶(FXase)测定
使用活体外酶(FXase)测定法(其使用从人类血浆中纯化的凝血因子)来确定与不同的因子X臂异源二聚化的N436H_IgG4_ra因子IX抗体臂催化因子X的因子IXa活化的能力。
为本实验改进了用于初步筛选的Fxase测定方案(参见实例9)，所述实验使用由蛋白A(而非细胞上清液)纯化的双特异性抗体。在此更新的测定方案中添加预活化的因子IXa，而非因子IX和因子XIa，且在添加测定混合物之前，FIX未与抗体溶液一起预培育。在37℃下的培育从1小时减少到10分钟。
简单来说，方法如下，其中除非另有说明，否则所有反应均在37℃下进行：
如实例13中所描述使用蛋白A从来自重组Expi293细胞的上清液中纯化以重组方式表达的抗体。
将5μL纯化的重组抗体添加到测定盘的每个孔中。将1.5μL FIXa(1μg/ml)、5μL FX(50μg/mL)、0.05μL磷脂(10mg/mL)和13.45μL TBSB-S缓冲液的混合物添加到每个孔中以引发酶促反应(FIXa裂解FX以产生FXa)，且在37℃下培育10分钟。在10分钟后，通过添加5μL0.5M EDTA终止反应。在向每个孔中添加10μL S2765底物溶液之后，测量405nm(参考波长655nm)处的吸光度25分钟(每5分钟读取一个读数)。
Chromogenix S-2765是用于确定活化因子X的产生的显色底物。因子Xa裂解S2765，释放显色基团对硝基苯胺(pNA)，从而导致可在405nm处进行光度监测的颜色变化。405nm处的吸光度读数与生成的因子Xa的量成比例。
图7说明测定的原理。
在此测定中测试的双特异性抗体具有FIX结合臂，所述结合臂包括N436H的VH结构域和N128L的VL结构域。这些分别表达为重链和轻链构建体N436H_IgG4_ra和N128L_IgL，并与以下提供FX结合臂的重链和轻链构建体异源二聚化：
T02H_IgG4rb+T02L_IgL；
T05H_IgG4rb+T05L_IgL；或
T14H_IgG4rb+T14L_IgK。
还包含供参考的阳性对照FIX-FX双特异性抗体(Ab_E)和同型对照(ISTC)。
结果如图12中所说明。
作为双特异性抗体的N436H_IgG4ra、N128L_IgL表现出FXase活性的剂量依赖性增加，所述双特异性抗体与T02H_IgG4rb+T02L_IgL、T05H_IgG4rb+T05L_IgL或T14H_IgG4rb+T14L_IgK异源二聚化。观察到的FX活化与双特异性抗体Ab_E类似。在不存在抗因子X臂的情况下单独表达的N436H_IgG4ra、N128L_IgL仍然能够活化因子X，尽管处于降低水平。同型对照表明无FXase活性。
实例18：对与一系列FX结合臂配对的FIX结合臂N436进行血浆凝结(aPTT)测定
在此血浆凝结测定中，使用光学凝结系统得出aPTT测量值。随着血块形成，能够通过样本的光量减少。随着时间推移绘制这种降低，生成波形。一旦已形成纤维蛋白凝块，凝结反应的终点完成，且自动计算凝结时间。当前aPTT测定中使用的血浆缺乏FVIII，因此添加FIX-FX双特异性抗体的效果可以通过其在凝血级联中取代FVIII的能力来测量。可以将双特异性抗体存在下的凝结时间与阴性对照和FVIII存在下的凝结时间进行比较。
将具有各种浓度的5μL双特异性抗体溶液、20μL FVIII缺乏型人类血浆(海伦娜生物科学(Helena Biosciences))和25μL Si L Minus aPTT试剂(海伦娜生物科学)的混合物在37℃下加热2分钟。通过向混合物中添加25μL 20mM CaCl2(海伦娜生物科学)来引发凝结反应。测量直到凝结的时间。用于此测定的设备是半自动凝血仪，特别是C系列光学凝结系统(海伦娜生物科学)。aPTT试剂含有磷脂和接触活化剂(近似胶体颗粒活化剂，即镁铝硅酸盐)，所述试剂可提供内在凝血级联的“表面接触”活化作用(参见图1)。随后确定表现出最高凝结时间-减少作用的双特异性抗体的浓度依赖性。
结果展示在图13中。在这种使用FVIII缺乏的人类血浆进行的一阶段aPTT凝血测定中，作为双特异性抗体的N436H_IgG4ra、N128L_IgL表明aPTT时间的剂量依赖性降低，所述双特异性抗体与T02H_IgG4rb+T02L_IgL、T05H_IgG4rb+T05L_IgL或T14H_IgG4+T14L_IgK异源二聚化。aPTT时间的剂量依赖性减少与Ab_E类似。对于同型对照，未观察到aPTT的降低。
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12 Ridgway等人，《蛋白质工程化(Protein Eng.)》9:617-621 1996
FIXa结合臂多肽序列
表9A：抗FIXa VH结构域序列和CDR
Figure BDA0002322205310000891
Figure BDA0002322205310000901
Figure BDA0002322205310000911
Figure BDA0002322205310000921
Figure BDA0002322205310000931
Figure BDA0002322205310000941
Figure BDA0002322205310000961
Figure BDA0002322205310000971
Figure BDA0002322205310000981
Figure BDA0002322205310000991
Figure BDA0002322205310001001
Figure BDA0002322205310001021
Figure BDA0002322205310001031
Figure BDA0002322205310001041
Figure BDA0002322205310001051
Figure BDA0002322205310001061
Figure BDA0002322205310001071
Figure BDA0002322205310001081
Figure BDA0002322205310001091
Figure BDA0002322205310001101
Figure BDA0002322205310001111
Figure BDA0002322205310001121
Figure BDA0002322205310001131
Figure BDA0002322205310001141
Figure BDA0002322205310001151
Figure BDA0002322205310001161
Figure BDA0002322205310001181
Figure BDA0002322205310001191
Figure BDA0002322205310001201
Figure BDA0002322205310001211
表9B：抗FIXa VH结构域构架序列
Figure BDA0002322205310001212
Figure BDA0002322205310001221
表9C：抗FIXa VL结构域序列和CDR
Figure BDA0002322205310001231
表9D：抗FIXa VL结构域构架序列
Figure BDA0002322205310001232
FX结合臂多肽序列
表10A：抗FX VH结构域序列和CDR
Figure BDA0002322205310001233
Figure BDA0002322205310001241
Figure BDA0002322205310001261
表10B：抗FX VL结构域序列和CDR
Figure BDA0002322205310001271
Figure BDA0002322205310001281
表11：抗体恒定区序列
Figure BDA0002322205310001282
Figure BDA0002322205310001291
表12：抗体VH和VL结构域的对应生殖系v和j基因片段
Figure BDA0002322205310001292

Claims (43)

1.一种双特异性抗原结合分子，其包括
FIXa结合多肽臂，其包括FIXa结合位点，以及
FX结合多肽臂，其包括FX结合位点，
其特征在于，所述FIXa结合多肽臂包括与SEQ ID NO:324具有至少90％氨基酸序列一致性的VH结构域和与SEQ ID NO:10具有至少90％氨基酸序列一致性的VL结构域，任选地，其中所述VH结构域包括在IMGT位置111.1处具有疏水性或带正电荷残基的HCDR3，任选地其中所述HCDR3氨基酸序列是SEQ ID NO:400、SEQ ID NO:401、SEQ ID NO:402、SEQ ID NO:403或SEQ ID NO:171；和/或
其特征在于，所述FIXa结合位点由所述FIXa结合多肽臂中的互补决定区(CDR)集合提供，所述CDR集合包括HCDR1、HCDR2、HCDR3和/或LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
HCDR1为SEQ ID NO:1
HCDR2为SEQ ID NO:2
HCDR3为SEQ ID NO:400
LCDR1为SEQ ID NO:6
LCDR2为SEQ ID NO:7，以及
LCDR3为SEQ ID NO:8。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗原结合分子，其中所述FIXa结合位点由所述FIXa结合多肽臂中的互补决定区(CDR)集合提供，所述CDR集合包括HCDR1、HCDR2、HCDR3和/或LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
HCDR1为SEQ ID NO:1
HCDR2为SEQ ID NO:2
HCDR3为SEQ ID NO:401、SEQ ID NO:402、SEQ ID NO:403或SEQ ID NO:171
LCDR1为SEQ ID NO:6
LCDR2为SEQ ID NO:7，以及
LCDR3为SEQ ID NO:8。
3.一种双特异性抗原结合分子，其包括
(i)FIXa结合多肽臂，其包括FIXa结合位点，其中所述FIXa结合多肽臂包括抗体Fv区，所述抗体Fv区包括
VH结构域，其通过重组免疫球蛋白重链v、d和j基因片段而产生，其中所述v基因片段为VH3-7(例如，VH3-7*01)，且/或其中所述j基因片段为JH6(例如，JH6*02)，以及
VL结构域，其通过重组免疫球蛋白轻链v和j基因片段而产生，其中所述v基因片段为VL3-21(例如，VL3-21*D01)且j基因片段为JL2(例如，JL2*01)或JL3，以及
(ii)FX结合多肽臂，其包括FX结合位点，其中所述FX结合多肽臂包括抗体Fv区，所述抗体Fv区包括
(a)VH结构域，其通过重组免疫球蛋白重链v、d和j基因片段而产生，其中所述v和j基因片段为VH1-3(例如，VH1-3*01)和JH6(例如，JH6*02)，以及
VL结构域，其通过重组免疫球蛋白轻链v和j基因片段而产生，其中所述v和j基因片段为VL1-47(例如，VL1-47*01)和JL1(例如，JL1*01)；或
(b)VH结构域，其通过重组免疫球蛋白重链v、d和j基因片段而产生，其中所述v和j基因片段为VH3-30(例如，VH3-30*18)和JH6(例如，JH6*02)，以及
VL结构域，其通过重组免疫球蛋白轻链v和j基因片段而产生，其中所述v和j基因片段为VL2-8(例如，VL2-8*01)和JL2(例如，JL2*01)；或
(c)VH结构域，其通过重组免疫球蛋白重链v、d和j基因片段而产生，其中所述v和j基因片段为VH4-61(例如，VH4-61*01)和JH1(例如，JH1*01)，以及
VL结构域，其通过重组免疫球蛋白轻链v和j基因片段而产生，其中所述v和j基因片段为VK3-11(例如，VK3-11*01)和JK5(例如，JK5*01)。
4.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述FIXa结合多肽臂包括与SEQ ID NO:324具有至少95％氨基酸序列一致性的VH结构域。
5.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述FIXa结合多肽臂包括与SEQ ID NO:10具有至少95％氨基酸序列一致性的VL结构域。
6.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述
FIXa结合位点由所述FIXa结合多肽臂中的互补决定区(CDR)集合提供，所述CDR集合包括HCDR1、HCDR2、HCDR3和/或LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
HCDR1为SEQ ID NO:1
HCDR2为SEQ ID NO:2
HCDR3为SEQ ID NO:171
LCDR1为SEQ ID NO:6
LCDR2为SEQ ID NO:7，以及
LCDR3为SEQ ID NO:8。
7.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述FIXa结合多肽臂包括VH结构域氨基酸序列SEQ ID NO:324和VL结构域氨基酸序列SEQ ID NO:10。
8.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其在aPTT测定中将FVIII缺乏型人类血浆的凝结时间降低到少于40秒。
9.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中当以单特异性形式提供时，所述FIXa结合多肽臂能够增强FX对FXa的FIXa催化活化。
10.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中
所述FX结合多肽臂包括与SEQ ID NO:61具有至少90％氨基酸序列一致性的VH结构域和与SEQ ID NO:66具有至少90％氨基酸序列一致性的VL结构域；和/或其中
所述FX结合位点由所述FX结合多肽臂中的互补决定区(CDR)集合提供，所述CDR集合包括HCDR1、HCDR2、HCDR3和/或LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
HCDR1为SEQ ID NO:57
HCDR2为SEQ ID NO:58
HCDR3为SEQ ID NO:59
LCDR1为SEQ ID NO:62
LCDR2为SEQ ID NO:63，以及
LCDR3为SEQ ID NO:64。
11.根据权利要求10所述的双特异性抗原结合分子，其中所述FX结合多肽臂包括VH结构域氨基酸序列SEQ ID NO:61和VL结构域氨基酸序列SEQ ID NO:66。
12.根据权利要求1到9中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中
所述FX结合多肽臂包括与SEQ ID NO:71具有至少90％氨基酸序列一致性的VH结构域和与SEQ ID NO:76具有至少90％氨基酸序列一致性的VL结构域；和/或其中
所述FX结合位点由所述FX结合多肽臂中的互补决定区(CDR)集合提供，所述CDR集合包括HCDR1、HCDR2、HCDR3和/或LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
HCDR1为SEQ ID NO:67
HCDR2为SEQ ID NO:68
HCDR3为SEQ ID NO:69
LCDR1为SEQ ID NO:72
LCDR2为SEQ ID NO:73，以及
LCDR3为SEQ ID NO:74。
13.根据权利要求12所述的双特异性抗原结合分子，其中所述FX结合多肽臂包括VH结构域氨基酸序列SEQ ID NO:71和VL结构域氨基酸序列SEQ ID NO:76。
14.根据权利要求1到9中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中
所述FX结合多肽臂包括与SEQ ID NO:100具有至少90％氨基酸序列一致性的VH结构域和与SEQ ID NO:104具有至少90％氨基酸序列一致性的VL结构域；和/或
其中所述FX结合位点由所述FX结合多肽臂中的互补决定区(CDR)集合提供，所述CDR集合包含HCDR1、HCDR2、HCDR3和/或LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
HCDR1为SEQ ID NO:96
HCDR2为SEQ ID NO:97
HCDR3为SEQ ID NO:98
LCDR1为SEQ ID NO:101
LCDR2为SEQ ID NO:92，以及
LCDR3为SEQ ID NO:102。
15.根据权利要求14所述的双特异性抗原结合分子，其中所述FX结合多肽臂包括VH结构域氨基酸序列SEQ ID NO:100和VL结构域氨基酸序列SEQ ID NO:104。
16.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述FIXa结合多肽臂和/或所述FX结合多肽臂包括
抗体重链，其从N端到C端包括VH结构域、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域，以及
抗体轻链，其从N端到C端包括VL结构域和CL结构域。
17.根据权利要求16所述的双特异性抗原结合分子，其中所述抗体重链包括IgG恒定区。
18.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述抗原结合分子为四聚免疫球蛋白，其包括
第一重-轻链对，其包括FIXa结合Fv区，
第二重-轻链对，其包括FX结合Fv区，
其中每个重链包括VH结构域和恒定区，且每个轻链包括VL结构域和恒定区，且其中所述第一重-轻链对和所述第二重-轻链对通过其重链恒定区的异源二聚化而缔合，从而形成所述四聚免疫球蛋白。
19.根据权利要求18所述的双特异性抗原结合分子，其中所述免疫球蛋白为IgG，例如IgG4。
20.根据权利要求19所述的双特异性抗原结合分子，其中所述IgG包括IgG4-PE人类重链恒定区SEQ ID NO:143，其任选地用一个或多个氨基酸取代进行工程改造以促进异源二聚化。
21.一种分离的FIXa结合多肽，其包括FIXa结合位点，其中所述FIXa结合多肽如前述权利要求中任一项所定义。
22.一种分离核酸，其编码根据权利要求1到20中任一项所述的双特异性抗原结合分子的FIXa结合多肽臂或FX结合多肽臂。
23.一种分离核酸，其编码根据权利要求1到20中任一项所述的双特异性抗原结合分子。
24.一种用于生产根据权利要求1到20中任一项所述的双特异性抗原结合分子的试剂盒，其包括
包括FIXa结合位点的FIXa结合多肽，或编码所述多肽的核酸，其中所述FIXa结合多肽为如权利要求1到20中任一项所定义的FIXa结合多肽臂，以及
包括FX结合位点的FX结合多肽，或编码所述多肽的核酸，其中所述FX结合多肽为如权利要求1到20中所定义的FX结合多肽臂。
25.一种组合物，其包括根据权利要求1到20中任一项所述的抗原结合分子，或根据权利要求23所述的分离核酸，以及医药学上可接受的赋形剂。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述抗原结合分子或核酸处于无菌水溶液中。
27.一种包括重组核酸的宿主细胞，所述重组核酸编码根据权利要求1到20中任一项所述的双特异性抗原结合分子，或编码所述双特异性抗原结合分子的所述FIXa结合多肽臂和/或所述FX结合多肽臂，其中所述编码核酸可操作地连接到启动子以用于表达。
28.一种产生根据权利要求1到20中任一项所述的抗原结合分子，或产生所述双特异性抗原结合分子的所述FIXa结合多肽臂或所述FX结合多肽臂的方法，其包括在表达所述抗原结合分子的条件下培养根据权利要求27所述的宿主细胞，和从所述宿主细胞培养物中回收所述抗原结合分子或结合臂。
29.一种控制患者体内出血的方法，其包括向所述患者给予根据权利要求25或权利要求26所述的组合物。
30.根据权利要求1到20中的任一项所述的双特异性抗原结合分子，或根据权利要求25或权利要求26所述的组合物，其用于通过疗法治疗所述人类或动物身体的方法中。
31.根据权利要求25或权利要求26所述的组合物的根据权利要求1到20中的任一项所述的双特异性抗原结合分子，其用于控制患者体内的出血。
32.根据权利要求29所述的方法，或根据权利要求30或权利要求31所述的供使用的双特异性抗原结合分子，其中所述患者为A型血友病患者。
33.根据权利要求33所述的方法或供使用的双特异性抗原结合分子，其中由于血液中存在抑制性抗体，所述患者对用FVIII治疗具有抗性。
34.根据权利要求33或权利要求34所述的方法或供使用的双特异性抗原结合分子，其中由于血液中存在抑制性抗体，所述患者对用FIXa和FX的另一双特异性抗原结合分子治疗具有抗性。
35.根据权利要求35所述的方法或供使用的双特异性抗原结合分子，其中所述患者对用艾米珠单抗(emicizumab)治疗具有抗性。
36.一种减少在A型血友病患者体内产生抑制性抗药物抗体的方法，所述患者用替代FVIIIa活性的多肽进行治疗，所述方法包括
向所述患者给予第一种FVIIIa活性替代多肽药物，持续1-12个月时间段，
将所述患者切换到第二种不同FVIIIa活性替代多肽药物，持续1-12个月时间段，以及
将所述患者切换到第一种抗原结合分子或第三种不同FVIIIa活性替代多肽药物，持续1-12个月时间段，
其中在每种情况下，以治疗有效量给予所述FVIIIa活性替代多肽药物或其编码核酸，以在功能上替代患者中的FVIIIa，且其中与继续接受用所述FVIIIa活性替代多肽药物治疗的患者相比，所述患者产生针对所述FVIIIa活性替代多肽药物中的任一种的抑制性抗药物抗体的风险降低。
37.一种包括FVIIIa活性替代多肽药物或其编码核酸的组合物，其用于治疗A型血友病患者同时减少抑制性抗药物抗体产生的方法中，所述方法包括
向所述患者给予第一种FVIIIa活性替代多肽药物，持续1-12个月时间段，
将所述患者切换到第二种不同FVIIIa活性替代多肽药物，持续1-12个月时间段，以及
将所述患者切换到第一种抗原结合分子或第三种不同FVIIIa活性替代多肽药物，持续1-12个月时间段，
其中在每种情况下，以治疗有效量给予所述FVIIIa活性替代多肽药物或其编码核酸，以在功能上替代所述患者中的FVIIIa，且其中与继续接受用所述FVIIIa活性替代多肽药物治疗的患者相比，所述患者产生针对所述FVIIIa活性替代多肽药物中的任一种的抑制性抗药物抗体的风险降低。
38.根据权利要求37所述的方法或根据权利要求38中所述的供使用的组合物，其中所述第一种、第二种和/或第三种FVIIIa活性替代多肽药物为针对FIXa和FX的双特异性抗原结合分子。
39.根据权利要求37到39中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述第一种、第二种和/或第三种FVIIIa活性替代多肽药物为艾米珠单抗。
40.根据权利要求37到40中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述第一种、第二种和/或第三种FVIIIa活性替代多肽药物为根据权利要求1到20中任一项所述的双特异性抗原结合分子。
41.根据权利要求37到41中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述第一种、第二种或第三种FVIIIa活性替代多肽药物为重组FVIII或血浆衍生的FVIII。
42.一种根据权利要求1到20中任一项所述的双特异性抗原结合分子的用途，其用于活体外结合FIXa和FX。
43.一种根据权利要求1到20中任一项所述的双特异性抗原结合分子的用途，其用于取代A型血友病患者中的FVIII功能。
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