JP7378298B2 - 第ix因子および第x因子に対する二重特異性抗体 - Google Patents
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Description
FIX結合アーム「BIIB-9-1336」は報告によると、FIXチモーゲン(タンパク質分解活性化の前の成熟FIX)よりもFIXa(活性化FIX)に対する選択的結合を示し、FVIIIaによって結合したFIXaエピトープと重複するエピトープに結合することがわかった。FX結合アーム「BIIB-12-917」は報告によると、FXチモーゲンに選択的に結合し、(活性化)FXaへの検出可能な結合を欠き、(FXaではなくFXチモーゲン中に存在する)活性化ペプチド内にあるFXのエピトープに結合したことを示した。次いで、BIIB-9-1336を含む選択されたFIX結合抗体にさらなる変異を導入し、FIXaに対する特異性および/または親和性がさらに増加した抗体を選択するためのライブラリを生成した。
HCDR1は、配列番号1であり、
HCDR2は、配列番号2であり、
HCDR3は、配列番号400であり、
LCDR1は、配列番号6であり、
LCDR2は、配列番号7であり、
LCDR3は、配列番号8である。
FIXa結合ポリペプチドアームのCDRのセットは、次のCDRのセットであってもよく、
HCDR1は、配列番号1であり、
HCDR2は、配列番号2であり、
HCDR3は、配列番号401、配列番号402、または配列番号403であり、
LCDR1は、配列番号6であり、
LCDR2は、配列番号7であり、
LCDR3は、配列番号8である。
FIXa結合ポリペプチドアームのCDRのセットは、次のCDRのセットであってもよく、
HCDR1は、配列番号1であり、
HCDR2は、配列番号2であり、
HCDR3は、配列番号171であり、
LCDR1は、配列番号6であり、
LCDR2は、配列番号7であり、
LCDR3は、配列番号8である。
FIXa結合部位は、FIXa結合ポリペプチドアームの相補性決定領域(CDR)のセットによって提供されてもよく、そのCDRのセットは、HCDR1、HCDR2、HCDR3、ならびに/またはLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含み、
HCDR1は、配列番号140であり、
HCDR2は、配列番号141であり、
HCDR3は、配列番号142であり、
LCDR1は、配列番号6であり、
LCDR2は、配列番号7であり、
LCDR3は、配列番号8である。
FR1は、配列番号132であり、
FR2は、配列番号133であり、
FR3は、配列番号134であり、
FR4は、配列番号135であるか、
または、最大10個のアミノ酸改変を有するフレームワーク領域のそのセットを含む、例えば、任意の1つ以上のフレームワーク領域内に1つまたは2つの保存的置換があってもよい。
FR1は、アミノ酸配列の配列番号132を有してもよく、任意に、FのL置換、AVSモチーフにおけるAのV置換および/またはVのA置換を有する。
FR2は、アミノ酸配列の配列番号133を有してもよい。
FR3は、アミノ酸配列の配列番号134を有してもよく、任意に、その配列の1番目の残基位置におけるFのY置換、4番目の残基位置におけるAのD置換、12番目の残基位置におけるMのI置換、19番目の残基位置におけるKのN置換、21番目の残基位置におけるVのL置換、および/またはその配列の23番目の残基位置におけるVのL置換を有する。
FR4は、アミノ酸配列の配列番号135を有してもよく、任意に、8番目の残基位置でTのS置換を有する。
FR1は、配列番号136であり、
FR2は、配列番号137であり、
FR3は、配列番号138であり、
FR4は、配列番号139であるか、
または、最大10個のアミノ酸改変を有するフレームワーク領域のそのセットを含む、例えば、任意の1つ以上のフレームワーク領域内に1つまたは2つの保存的置換があってもよい。
HCDR1は、配列番号57であり、
HCDR2は、配列番号58であり、
HCDR3は、配列番号59であり、
LCDR1は、配列番号62であり、
LCDR2は、配列番号63であり、
LCDR3は、配列番号64である。
HCDR1は、配列番号67であり、
HCDR2は、配列番号68であり、
HCDR3は、配列番号69であり、
LCDR1は、配列番号72であり、
LCDR2は、配列番号73であり、
LCDR3は、配列番号74である。
HCDR1は、配列番号96であり、
HCDR2は、配列番号97であり、
HCDR3は、配列番号98であり、
LCDR1は、配列番号101であり、
LCDR2は、配列番号92であり、
LCDR3は、配列番号102である。
(a)免疫グロブリン重鎖v、d、およびj遺伝子セグメントの組換えにより生成されたVHドメインであって、前記vおよびj遺伝子セグメントが、VH1-3(例えば、VH1-3*01)およびJH6(例えば、JH6*02)である、VHドメインと、
免疫グロブリン軽鎖vおよびj遺伝子セグメントの組換えにより生成されたVLドメインであって、前記vおよびj遺伝子セグメントが、VL1-47(例えば、VL1-47*01)およびJL1(例えば、JL1*01)である、VLドメインとを含むか、または、
(b)免疫グロブリン重鎖v、d、およびj遺伝子セグメントの組換えにより生成されたVHドメインであって、前記vおよびj遺伝子セグメントが、VH3-30(例えば、VH3-30*18)およびJH6(例えば、JH6*02)である、VHドメインと、
免疫グロブリン軽鎖vおよびj遺伝子セグメントの組換えにより生成されたVLドメインであって、前記vおよびj遺伝子セグメントが、VL2-8(例えば、VL2-8*01)およびJL2(例えば、JL2*01)である、VLドメインとを含むか、または、
(c)免疫グロブリン重鎖v、d、およびj遺伝子セグメントの組換えにより生成されたVHドメインであって、前記vおよびj遺伝子セグメントが、VH4-61(例えば、VH4-61*01)およびJH1(例えば、JH1*01)である、VHドメインと、
免疫グロブリン軽鎖vおよびj遺伝子セグメントの組換えにより生成されたVLドメインであって、前記vおよびj遺伝子セグメントが、VK3-11(例えば、VK3-11*01)およびJK5(例えば、JK5*01)である、VLドメインとを含む、
抗体Fv領域を含んでもよい。
VH1-3(例えば、VH1-3*01)およびJH6(例えば、JH6*02)、
VH3-30(例えば、VH3-30*18)およびJH6(例えば、JH6*02)、
VH3-33(例えば、VH3-33*01)およびJH6(例えば、JH6*02)、
VH4-31(例えば、VH4-31*03)およびJH4(例えば、JH4*02)、または
VH4-59(例えば、VH4-59*01)およびJH4(例えば、JH4*02)である、VHドメインと、
VLドメインとを含む、抗体Fv領域を含んでもよい。
各重鎖は、VHドメインおよび定常領域を含み、各軽鎖は、VLドメインおよび定常領域を含み、第1および第2の重鎖-軽鎖対は、それらの重鎖定常領域のヘテロ二量体化により会合して、免疫グロブリン四量体を形成する。上記のように、軽鎖は、共通の軽鎖であってもよく、すなわち、第1および第2の重鎖-軽鎖対の軽鎖は、同一のアミノ酸配列を有する。例示的な免疫グロブリンアイソタイプは、ヒトIgG、例えばIgG4、任意にIgG4 PEなどの定常ドメインが操作されたヒトIgGを含む。
血液凝固カスケードが、図1に示される。凝固(Coagulation)または凝固(clotting)は、損傷した血管からの失血を止めて、血管が修復されることを可能にする、最も重要な生物学的プロセスのうちの1つである。凝固の機構には、フィブリンの沈着および成熟(maturation)とともに、血小板の活性化、接着、および凝集を伴う。凝固の誤調節は、過度の出血(血友病)または閉塞性凝固(血栓症)を引き起こす可能性がある。凝固は、全ての哺乳動物において高度に保存されている。それは、凝固因子の複雑なネットワークによって制御される。血管の内側を覆う内皮が損傷すると、凝固が開始する。内皮下組織因子(TF)の血漿第VII因子(FVII)への曝露は、一次止血(外因性経路)をもたらし、損傷部位に緩い栓が形成される。追加の凝固因子、特に第IX因子(FIX)および第VIII因子(FVIII)の活性化は、二次止血(内因性経路)をもたらし、フィブリン鎖が形成されて栓を強化する。外因性および内因性経路は、最終的に共通点に集中し、カルシウムと一緒に、かつリン脂質表面上に結合した第Xa/Va因子複合体の形成が、プロトロンビン(第II因子)からトロンビン(第IIa因子)を生成する。
第IX因子は、補因子として第VIII因子を必要とするセリンプロテアーゼである。それは、不活性な前駆体として血液中を循環し、上述のように、止血しようとする時に内因性または外因性経路により活性化される。
文脈が他の意味を必要としない限り、本明細書で言及される第X因子は、ヒト第X因子であり、第Xa因子は、ヒト第Xa因子である。ヒト第FXのアミノ酸配列が、図4に示される。
二重特異性抗原結合分子の望ましい特徴は、結合したFIXaが結合したFXを活性化することを可能にする方法で、FIXaおよびFXを結合することである。
二重特異性抗原結合分子のFIXa結合アームは、FIXaの軽鎖および/または重鎖に結合し得る。初期の研究は、実施例に記載のN128系統のFIXa結合アームが、単独で(重鎖の非存在下で)FIXa軽鎖に結合しないことを示した。
本発明による抗原結合分子、またはそのFX結合ポリペプチドアームは、10mM以下、好ましくは5mM以下、より好ましくは1mM以下のKdでヒトFXのECドメインに結合し得る。例えば、Kdは、5μM~1nM、例えば、5μM~10nMであってもよい。
FIX、FIXa、FX、およびFXaに結合するための抗原結合分子の親和性は、平衡解離定数Kd、会合のKa/Kd比または解離、または結合相互作用の結合速度定数(Ka)および解離速度定数(kd)の観点から定量化され得る。抗原結合のためのKd、KaおよびKdは、表面プラズモン共鳴(SPR)を使用して測定され得る。
規制機関は、候補治療分子がヒトの臨床試験に進む前に、実験動物における治療効果を実証していることを要求し得る。後天性血友病A動物モデルの一例は、FVIII中和抗体またはFVIIIに対する小分子阻害剤の投与により血液凝固が欠乏した状態にされ、それによりヒト血友病A患者の表現型を再現した、カニクイザルである。動物モデルにおける二重特異性抗原結合分子の試験を可能にするために、各アームの結合部位は、1つ以上の非ヒト哺乳動物からの対応する抗原と交差反応することが望ましい。したがって、抗原結合分子のFIXa結合部位は、ネズミ科(例えば、マウスもしくはラット)、ウサギ、または非ヒト霊長類(例えば、カニクイザル)FIXaならびにヒトFIXaに結合し得、FX結合部位は、ネズミ科(例えば、マウスもしくはラット)、ウサギ、または非ヒト霊長類(例えば、カニクイザル)FXaおよびヒトFXaに結合し得る。
FXのFXaへのFIXa介在活性化を強化する二重特異性抗原結合分子の能力は、インビトロまたはインビボアッセイで決定され得る。
(i)FXaの形成に適した条件下(例えば、リン脂質の存在下、37℃の緩衝液中)で、二重特異性抗原結合分子をFIXaおよびFXと接触させることと、
(ii)FXaによって開裂可能である基質を添加して、検出可能な生成物を生成することと、
(iii)検出可能な生成物の存在を検出し、任意に定量化すること、
とを含む。
生成物のレベルは、FIXa-FX二重特異性抗原結合分子が反応混合物に存在しない対照アッセイと比較され得る。対照と比較した二重特異性分子を用いたアッセイにおける生成物レベルの有意差は、二重特異性分子がFXのFIXa介在活性化を強化することが可能であることを示す。FVIIIは、陽性対照として含まれる場合がある。
二重特異性抗原結合分子は、FIXa結合ポリペプチドアームとFX結合ポリペプチドアームとを含む。それは、多鎖または単鎖ポリペプチド分子であってもよい。FIXa結合ポリペプチドアームおよびFX結合ポリペプチドアームは、二重特異性分子の異なる部分を表すが、1つのポリペプチドが任意に、FIXa結合アームおよびFX結合アームの両方の全部または一部を形成することができる。
-CrossMab、DAF(2-in-1)、DAF(4-in-1)、DutaMab、DT-IgG、共通の軽鎖を有するノブ・イン・ホール(KIH)、KIH集合体、電荷対、Fabアーム交換、SEEDボディ、トリオマブ、LUZ-Y、mAb2(この概要では「Fcab」と称される)、κλボディ、直交Fabによって例示される、二重特異性IgG(約150kDa);
-DVD-IgG、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、zybody、DVI-IgG(4-in-1)によって例示される、付加されたIgG(150kDa超);
-ナノボディ、ナノボディ-HSA、タンデム連結scFv(この概要では「BiTE」として例示される)、ダイアボディ(Diabody)、DART、TandAb、scダイアボディ、scダイアボディ-CH3、ダイアボディ-CH3、トリプルボディ、ミニ抗体、ミニボディ、TriBiミニボディ、scFv-CH3 KIH、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab’)2、F(ab’)2-scFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四価HCAb、scダイアボディ-Fc、ダイアボディ-Fc、タンデムscFv-Fc;イントラボディ(intrabody)によって例示される、二重特異性抗体断片;
-ドック・アンド・ロック(Dock and Lock)、ImmTAC、HSAボディ、scダイアボディ-HSA、タンデムscFv-毒素によって例示される、二重特異性融合タンパク質;
-IgG-IgG、Cov-X-ボディ、scFv1-PEG-scFv2によって例示される、二重特異性抗体接合体(conjugate)。
上述のように、抗体は、様々なアイソタイプで、かつ異なる定常領域とともに提供され得る。抗体のFc領域は、Fc受容体によって認識され、抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)活性、補体依存性細胞傷害(CDC)活性、および抗体依存性細胞食作用(ADCP)活性を含む、細胞性エフェクター機能を仲介する抗体の能力を決定する。これらの細胞性エフェクター機能は、Fc受容体を有する細胞の標的細胞の部位への動員を伴い、抗体結合細胞の死滅をもたらす。
診療所で二重特異性抗体を使用することの難しさの1つは、歴史的に、大量かつ医薬品グレードの純度でそれらを製造することの難しさであった。「従来の」二重特異性IgG形式は、重鎖および軽鎖の2つの異なる対、したがって4つの異なるポリペプチド鎖を含み、これは、一緒に発現すると、集合して10の異なる潜在的な抗体分子になり得る。種の混合物は、ホモ二量体(ホモ二量体抗FIXa結合アームおよびホモ二量体抗FX結合アーム)、一方または両方の軽鎖がH-L対間で交換される分子、ならびに「正しい」二重特異性ヘテロ二量体構造を含む。
(a)1つ以上の多量体を形成するポリペプチド間の会合が、2つ以上のタイプの多量体を形成し得るヘテロ多量体において阻止されるように、元の核酸からのポリペプチド間の界面を形成するアミノ酸残基をコードする核酸を改変することと、
(b)ステップ(a)によって改変された核酸配列が発現されるように、宿主細胞を培養することと、
(c)宿主細胞培養物から前記ヘテロ多量体を回収することであって、
ステップ(a)の改変が、1つ以上のアミノ酸残基が界面において置換され、これにより界面を形成する変異残基を含む2つ以上のアミノ酸残基が、同じタイプの正に荷電または負に荷電するように、元の核酸を改変している、回収、
とを含む。
356位および439位
357位および370位
399位および409位、
EU番号付けシステムに従っている残基番号付け、を含む。
(a)第1のCH3ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする第1の核酸分子(この鎖は、EU番号付けシステムに従って366位にK残基を含む)と、
(b)第2のCH3ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする第2の核酸分子(この鎖は、EU番号付けシステムに従って351位にD残基を含む)
とを提供することを含み、
この方法はさらに、宿主細胞を培養するステップと、2つの核酸分子の発現を可能にするステップと、培養物からヘテロ二量体CH3ドメイン含有分子を収集するステップとを含む。
N末端からC末端へ、第1のエピトープに選択的に結合する第1のエピトープ結合領域、IgG1、IgG2、およびIgG4から選択されるヒトIgGの第1のCH3領域を含む免疫グロブリン定常領域を含む、第1のポリペプチドと、
N末端からC末端へ、第2のエピトープに選択的に結合する第2のエピトープ結合領域、IgG1、IgG2、およびIgG4から選択されるヒトIgGの第2のCH3領域を含む免疫グロブリン定常領域を含む、第2のポリペプチド
とを含む、ヘテロ二量体二重特異性抗原結合タンパク質を記載し、第2のCH3領域は、第2のCH3ドメインのプロテインAへの結合を低減または排除する改変を含む。
抗体を同定および調製するための方法は、よく知られている。目的の抗原に結合する抗体は、当該抗原で免疫化された遺伝子導入マウス(例えば、Kymouse(商標)、Velocimouse(登録商標)、Omnimouse(登録商標)、Xenomouse(登録商標)、HuMab Mouse(登録商標)、またはMeMo Mouse(登録商標))、ラット(例えば、Omnirat(登録商標))、ラクダ科動物、サメ、ウサギ、ニワトリ、または他の非ヒト動物を使用して生成されてもよく、続いて任意に、定常領域および/または可変領域をヒト化して、ヒトまたはヒト化抗体を製造する。一例では、当業者には明らかになるように、酵母、ファージ、またはリボソームディスプレイなどのディスプレイ技術が使用され得る。例えば、ディスプレイ技術を使用した標準的な親和性成熟は、遺伝子導入動物、ファージディスプレイライブラリ、または他のライブラリからの抗体リードの単離後のさらなるステップで実施され得る。好適な技術の代表例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるUS2012/0093818(Amgen,Inc)に記載され、例えば、方法は、段落[0309]~[0346]に記載されている。
(i)親抗体VHドメインのアミノ酸配列中の1つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、または挿入によって、親抗体VHドメインのアミノ酸配列変異体である抗体VHドメインを提供することであって、
前記親抗体VHドメインが、VHドメインN192H、N212H、N205H、N211H、N203H、N128H、N215H、N216H、N217H、N218H、N219H、N220H、N221H、N222H、N223H、N224H、N225H、N226H、N227H、N228H、もしくはN229Hであるか、またはそれらのVHドメインのうちのいずれかの重鎖相補性決定領域を含むVHドメインである抗体VHドメインを提供することと、
(ii)VH/VLの組み合わせを提供するために、そのように提供されたVHドメインをVLドメインと組み合わせることと、
(iii)1つ以上の所望の特性を有する抗体を同定するために、そのように提供されたVHドメインまたはVH/VLドメインの組み合わせを試験すること、
とを含む方法によって製造され得る。
本発明に従って、二重特異性抗原結合分子、例えば、二重特異性抗体をコードする単離された核酸が提供され得る。核酸は、DNAおよび/またはRNAであってもよい。合成起源のゲノムDNA、cDNA、mRNA、もしくは他のRNA、またはそれらの任意の組み合わせは、抗体をコードすることができる。
本発明による二重特異性抗原結合分子(「二重特異性分子」(bispecifics))、およびそれらをコードする核酸分子は、通常、単離された形態で提供される。二重特異性分子VHおよび/またはVLドメイン、ならびに核酸は、それらの自然環境または製造環境から精製されて提供されてもよい。単離された抗原結合分子および単離された核酸は、それらがインビボで見られる他のポリペプチドまたは核酸、またはそれらが調製され(例えば、細胞培養)、そのような調製がインビトロでの組換えDNA技術によるものである環境など、それらが自然に結合される材料を含まないか、または実質的に含まない。任意に、単離された抗原結合分子または核酸は、(1)それが通常見られる少なくともいくつかの他のタンパク質を含まないか、(2)同じ源からの、例えば、同じ種からの他のタンパク質を本質的に含まないか、(3)異なる種の細胞によって発現されるか、(4)ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または自然界でそれが結合される他の材料の少なくとも約50%から単離されているか、(5)それが自然界で結合されていないポリペプチドと作動可能に結合されているか(共有結合もしくは非共有結合相互作用によって)、または(6)自然界で生じない。
約10μg/kg体重~約100mg/kg体重、
約50μg/kg体重~約5mg/kg体重、
約100μg/kg体重~約10mg/kg体重、
約100μg/kg体重~約20mg/kg体重、
約0.5mg/kg体重~約20mg/kg体重、または
約5mg/kg体重以下、例えば、4未満、3未満、2未満、または1mg/kg未満の抗体
で投与され得る。
本発明の二重特異性抗原結合分子は、療法によるヒトまたは動物の身体の治療方法で使用され得る。分子の治療指標は、
血友病Aの治療のための使用、
遺伝性第VIII因子欠乏症の治療のための使用、
血友病A患者における出血インシデントの数の大幅な減少のための使用、
第VIII因子機能の代わりになるための使用、
および/または
血液凝固の促進のための使用
を含む。
節1.
FIXa結合部位を含むFIXa結合ポリペプチドアームと、
FX結合部位を含むFX結合ポリペプチドアームとを含み、
(i)前記FIXa結合部位が、FIXa結合ポリペプチドアームの相補性決定領域(CDR)のセットによって提供され、前記CDRのセットが、HCDR1、HCDR2、HCDR3、および/またはLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含み、
HCDR1が、配列番号140であり、
HCDR2が、配列番号141であり、
HCDR3が、配列番号142であり、
LCDR1が、配列番号6であり、
LCDR2が、配列番号7であり、
LCDR3が、配列番号8であるか、
または、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸改変を有するCDRのそのセットを含み、
(ii)前記FIXa結合ポリペプチドアームが、
免疫グロブリン重鎖v、d、およびj遺伝子セグメントの組換えにより生成されたVHドメインであって、前記v遺伝子セグメントが、VH3-7であり、および/または前記j遺伝子セグメントが、JH6である、VHドメイン、および/または
免疫グロブリン軽鎖vおよびj遺伝子セグメントの組換えにより生成されたVLドメインであって、前記v遺伝子セグメントが、VL3-21であり、前記j遺伝子セグメントが、JL3である、VLドメインとを含む抗体Fv領域を含み、および/または
(iii)前記FIXa結合ポリペプチドアームが、単一特異性形態で提供される場合、FXからFXaへのFIXa触媒活性化を強化することが可能である
ことを特徴とする二重特異性抗原結合分子。
HCDR1が、配列番号140であり、
HCDR2が、配列番号141であり、
HCDR3が、配列番号142であり、
LCDR1が、配列番号6であり、
LCDR2が、配列番号7であり、
LCDR3が、配列番号8であるか、
または、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸改変を有するCDRのそのセットを含む、節1~3のいずれか1節に記載の二重特異性抗原結合分子。
HCDR1が、配列番号140であり、
HCDR2が、配列番号141であり、
HCDR3が、配列番号142である、
節1~4のいずれか1節に記載の二重特異性抗原結合分子。
前記FIXa結合ポリペプチドアームが、VL3-21*d01遺伝子セグメントおよびJL3*02遺伝子セグメントの組換えにより生成されたVLドメインを含む、節1~6のいずれか1節に記載の二重特異性抗原結合分子。
LCDR1が、配列番号6であり、
LCDR2が、配列番号7であり、
LCDR3は、配列番号8である、
節1~7のいずれか1節に記載の二重特異性抗原結合分子。
FR1が、配列番号132であり、
FR2が、配列番号133であり、
FR3が、配列番号134であり、
FR4が、配列番号135であるか、
または前記フレームワークが、最大10個のアミノ酸改変を有するフレームワーク領域のそのセットを含む、節1~8のいずれか1節に記載の二重特異性抗原結合分子。
FR1が、配列番号132であり、任意に残基11におけるFのLの置換、残基24におけるAのVの置換、および/または残基24におけるVのAの置換を有し、
FR2が、配列番号133であり、
FR3が、配列番号134であり、任意に残基59におけるFのYの置換、残基62におけるAのDの置換、残基70におけるMのIの置換、残基77におけるKのNの置換、残基79におけるVのLの置換、および/または残基81におけるVのLの置換を有し、
FR4が、配列番号135であり、任意に残基119におけるTのS置換を有し、残基番号付けが、IMGTシステムに従っている、節9に記載の二重特異性抗原結合分子。
FR1が、配列番号132であり、
FR2が、配列番号133であり、
FR3が、配列番号134であり、
FR4は、配列番号135である、節10に記載の二重特異性抗原結合分子。
FR1が、配列番号136であり、
FR2が、配列番号137であり、
FR3が、配列番号138であり、
FR4が、配列番号139であるか、
または前記フレームワークが、最大10個のアミノ酸改変を有するフレームワーク領域のそのセットを含む、節1~11のいずれか1節に記載の二重特異性抗原結合分子。
FR1が、配列番号136であり、
FR2が、配列番号137であり、
FR3が、配列番号138であり、
FR4が、配列番号139である、節12に記載の二重特異性抗原結合分子。
VH1-3(例えば、VH1-3*01)およびJH6(例えば、JH6*02)、
VH3-30(例えば、VH3-30*18)およびJH6(例えば、JH6*02)、
VH3-33(例えば、VH3-33*01)およびJH6(例えば、JH6*02)、
VH4-31(例えば、VH4-31*03)およびJH4(例えば、JH4*02)、または
VH4-59(例えば、VH4-59*01)およびJH4(例えば、JH4*02)である、節19に記載の二重特異性抗原結合分子。
FIXa結合Fv領域を含む第1の重鎖-軽鎖対、
FX結合Fv領域を含む第2の重鎖-軽鎖対を含む、四量体免疫グロブリンであり、各重鎖が、VHドメインおよび定常領域を含み、各軽鎖が、VLドメインおよび定常領域を含み、前記第1および第2の重軽-軽鎖対が会合して、それらの重鎖定常領域のヘテロ二量体化により四量体免疫グロブリンを形成している、節1~23のいずれか1節に記載の二重特異性抗原結合分子。
FX結合部位を含むFX結合ポリペプチドであって、節1~25のいずれか1節で定義されるFX結合ポリペプチドアームであるFX結合ポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードする核酸とを含む、
節1~25のいずれか1節に記載の二重特異性抗原結合分子の製造のためのキット。
1.FIXa結合部位を含むFIXa結合ポリペプチドアームと、
FX結合部位を含むFX結合ポリペプチドアームとを含み、
前記FIXa結合ポリペプチドアームが、配列番号324と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するVHドメインと、配列番号10と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するVLドメインとを含み、任意に、前記VHドメインが、IMGT位置111.1に疎水性残基または正に荷電した残基を有するHCDR3を含み、任意に、前記HCDR3アミノ酸配列が、配列番号400、配列番号401、配列番号402、配列番号403、もしくは配列番号171であることを特徴とし、および/または
前記FIXa結合部位が、FIXa結合ポリペプチドアームの相補性決定領域(CDR)のセットによって提供され、前記CDRのセットが、HCDR1、HCDR2、HCDR3、および/またはLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含み、
HCDR1が、配列番号1であり、
HCDR2が、配列番号2であり、
HCDR3が、配列番号400であり、
LCDR1が、配列番号6であり、
LCDR2が、配列番号7であり、
LCDR3が、配列番号8である、
ことを特徴とする二重特異性抗原結合分子。
HCDR1が、配列番号1であり、
HCDR2が、配列番号2であり、
HCDR3が、配列番号401、配列番号402、配列番号403、または配列番号171であり、
LCDR1が、配列番号6であり、
LCDR2が、配列番号7であり、
LCDR3が、配列番号8である、
陳述1に記載の二重特異性抗原結合分子。
(i)免疫グロブリン重鎖v、d、およびj遺伝子セグメントの組換えにより生成されたVHドメインであって、前記v遺伝子セグメントが、VH3-7(例えば、VH3-7*01)であり、および/または前記j遺伝子セグメントが、JH6(例えば、JH6*02)である、VHドメインと、
免疫グロブリン軽鎖vおよびj遺伝子セグメントの組換えにより生成されたVLドメインであって、前記v遺伝子セグメントが、VL3-21(例えば、VL3-21*d01)であり、前記j遺伝子セグメントが、JL2(例えば、JL2*01)またはJL3である、VLドメインとを含む抗体Fv領域を含むFIXa結合ポリペプチドアームと、
(ii)FX結合部位を含むFX結合ポリペプチドアームであって、
(a)免疫グロブリン重鎖v、d、およびj遺伝子セグメントの組換えにより生成されたVHドメインであって、前記vおよびj遺伝子セグメントが、VH1-3(例えば、VH1-3*01)およびJH6(例えば、JH6*02)である、VHドメインと、
免疫グロブリン軽鎖vおよびj遺伝子セグメントの組換えにより生成されたVLドメインであって、前記vおよびj遺伝子セグメントが、VL1-47(例えば、VL1-47*01)およびJL1(例えば、JL1*01)である、VLドメインとを含む、または、
(b)免疫グロブリン重鎖v、d、およびj遺伝子セグメントの組換えにより生成されたVHドメインであって、前記vおよびj遺伝子セグメントが、VH3-30(例えば、VH3-30*18)およびJH6(例えば、JH6*02)である、VHドメインと、
免疫グロブリン軽鎖vおよびj遺伝子セグメントの組換えにより生成されたVLドメインであって、前記vおよびj遺伝子セグメントが、VL2-8(例えば、VL2-8*01)およびJL2(例えば、JL2*01)である、VLドメインとを含む、または、
(c)免疫グロブリン重鎖v、d、およびj遺伝子セグメントの組換えにより生成されたVHドメインであって、前記vおよびj遺伝子セグメントが、VH4-61(例えば、VH4-61*01)およびJH1(例えば、JH1*01)である、VHドメインと、
免疫グロブリン軽鎖vおよびj遺伝子セグメントの組換えにより生成されたVLドメインであって、前記vおよびj遺伝子セグメントが、VK3-11(例えば、VK3-11*01)およびJK5(例えば、JK5*01)である、VLドメインとを含む
抗体Fv領域を含むFX結合ポリペプチドアーム、
とを含む、二重特異性抗原結合分子。
HCDR1が、配列番号1であり、
HCDR2が、配列番号2であり、
HCDR3が、配列番号171であり、
LCDR1が、配列番号6であり、
LCDR2が、配列番号7であり、
LCDR3が、配列番号8である、
陳述1~5のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
前記FX結合部位が、FX結合ポリペプチドアームの相補性決定領域(CDR)のセットによって提供され、前記CDRのセットが、HCDR1、HCDR2、HCDR3、および/またはLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含み、
HCDR1が、配列番号57であり、
HCDR2が、配列番号58であり、
HCDR3が、配列番号59であり、
LCDR1が、配列番号62であり、
LCDR2が、配列番号63であり、
LCDR3が、配列番号64である、
陳述1~9のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
前記FX結合部位が、FX結合ポリペプチドアームの相補性決定領域(CDR)のセットによって提供され、前記CDRのセットが、HCDR1、HCDR2、HCDR3、および/またはLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含み、
HCDR1が、配列番号67であり、
HCDR2が、配列番号68であり、
HCDR3が、配列番号69であり、
LCDR1が、配列番号72であり、
LCDR2が、配列番号73であり、
LCDR3が、配列番号74である、
陳述1~9のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
前記FX結合部位が、FX結合ポリペプチドアームの相補性決定領域(CDR)のセットによって提供され、前記CDRのセットが、HCDR1、HCDR2、HCDR3、および/またはLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含み、
HCDR1が、配列番号96であり、
HCDR2が、配列番号97であり、
HCDR3が、配列番号98であり、
LCDR1が、配列番号101であり、
LCDR2が、配列番号92であり、
LCDR3が、配列番号102である、
陳述1~9のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
N末端からC末端へ、VHドメイン、CH1ドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む抗体重鎖と、
N末端からC末端へ、VLドメインおよびCLドメインを含む抗体軽鎖とを含む、
陳述1~15のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
FX結合Fv領域を含む第2の重鎖-軽鎖対とを含む、四量体免疫グロブリンであり、
各重鎖が、VHドメインおよび定常領域を含み、各軽鎖が、VLドメインおよび定常領域を含み、前記第1および第2の重鎖-軽鎖対は会合して、それらの重鎖定常領域のヘテロ二量体化により四量体免疫グロブリンを形成している、陳述1~17のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
FX結合部位を含むFX結合ポリペプチドであって、陳述1~20のいずれか1つで定義されるFX結合ポリペプチドアームであるFX結合ポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードする核酸とを含む、
陳述1~20のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子の製造のためのキット。
第1のFVIIIa活性補充ポリペプチド薬物を、1~12か月間、前記患者に投与することと、
前記患者を、1~12か月間、第2の異なるFVIIIa活性補充ポリペプチド薬物に切り替えることと、
前記患者を、1~12か月間、前記第1の抗原結合分子、または第3の異なるFVIIIa活性補充ポリペプチド薬物のいずれかに切り替えることと、を含み、
各場合において、前記FVIIIa活性補充ポリペプチド薬物またはそのコード核酸が、前記患者においてFVIIIaを機能的に補充する治療有効量で投与され、前記患者が、前記FVIIIa活性補充ポリペプチド薬物のうちのいずれかに対して阻害性抗薬物抗体を生成するリスクが、そのFVIIIa活性補充ポリペプチド薬物での治療を受け続けている患者と比較して低減される、方法。
第1のFVIIIa活性補充ポリペプチド薬物を、1~12か月間、前記患者に投与することと、
前記患者を、1~12か月間、第2の異なるFVIIIa活性補充ポリペプチド薬物に切り替えることと、
前記患者を、1~12か月間、前記第1の抗原結合分子、または第3の異なるFVIIIa活性補充ポリペプチド薬物のいずれかに切り替えることと、を含み、
各場合において、前記FVIIIa活性補充ポリペプチド薬物またはそのコード核酸が、前記患者においてFVIIIaを機能的に補充する治療有効量で投与され、前記患者が、前記FVIIIa活性補充ポリペプチド薬物のうちのいずれかに対して阻害性抗薬物抗体を生成するリスクが、当該FVIIIa活性補充ポリペプチド薬物での治療を受け続けている患者と比較して低減される、組成物。
4匹のKymouse HKマウス(オス、免疫化の開始時に4か月齢)および4匹のKymouse HLマウス(オス、免疫化の開始時に3か月齢)を、ヒト第IXa因子(Enzyme Research Laboratories,Inc.)に対して免疫化した。
HTRFアッセイを使用して、FIXaへの結合について抗FIXa抗体をスクリーニングした。FIXaおよび抗体を、ドナーおよびアクセプターの2つの異なるフルオロフォアで標識した。2つの実体が互いに十分に近づくと、エネルギー源によるドナーの励起がアクセプターに向かうエネルギー移動を誘発し、これは、所与の波長で特定の蛍光を発する。したがって、その特異的抗体によるFIXaの結合は、アクセプターの発光波長での検出によって検出され得る。
製造業者の説明書に従って、抗マウスIgGチップを調製した。実施例1からの上清を、HBS-EP泳動用緩衝液(20X HBS-EP+緩衝液から希釈、pH7.6(Bioquote))で1:5に希釈した。抗マウスIgG表面上で抗体を捕捉した。様々な濃度(256nMおよび1024nM)のヒト第IX因子、ヒト第IXa因子、またはヒト第IX因子軽鎖を検体として使用した。10mMグリシン(pH1.7)で表面を再生した。結合センサグラムを、緩衝液注入(0nM)で二重参照した。データを、ProteOn分析ソフトウェアに固有の1:1モデルに適合した。アッセイを25℃で実施し、HBS-EP緩衝液を泳動用緩衝液として使用した。
4匹のKymouse HKバージョン2マウス(オス、免疫化の開始時に3か月齢)および4匹のKymouse HLバージョン2マウス(オス、免疫化の開始時に3か月齢)を、ヒト第X因子(Enzyme Research Laboratories,Inc.)に対して免疫化した。免疫化したマウスから脾臓組織を収集し、脾臓細胞を懸濁し、FACSによって選別して、抗原特異的B細胞を単離した。合計1,722個の第X因子特異的B細胞を、8匹の免疫化した動物から選別した。結合した抗体重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を、RNAの逆転写および可変領域のPCR増幅によってB細胞から回収した。
Expi293発現培地(Invitrogen)を使用して、参照抗ヒト第X因子抗体、AbTおよびCM7アイソタイプ対照抗体の連続希釈液を調製した。実施例4で生成された1,722個の抗体分泌ヒト細胞の各々からの上清5μLをアッセイプレートに移した。5μLのAbTおよびCM7アイソタイプ対照抗体を、それぞれ陽性対照および陰性対照として各アッセイプレートに移した。5μL(80nM)のAlexa 647標識ヒト第X因子、第Xa因子、または第X因子軽鎖をアッセイプレートの各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。10μLの2X M24-K溶液(原液から1:2000希釈)を各ウェルに添加し、暗所で室温において2時間インキュベートした。EnvisionのHTRF 100フラッシュプロトコルを使用して、アッセイプレートを読み取った(励起波長:340nm、発光波長1:620nm、発光波長2:665nm)。データを分析し、AbT陽性対照に対して正規化した。
製造業者の指示に従って、抗マウスIgGチップを調製した。実施例4からの上清を、HBS-EP泳動用緩衝液(20X HBS-EP+緩衝液から希釈、pH7.6(Bioquote))で1:5に希釈した。抗マウスIgG表面上で抗体を捕捉した。様々な濃度(256nMおよび1024nM)のヒト第X因子、ヒト第Xa因子、またはヒト第X因子軽鎖を検体として使用した。10mMグリシン(pH1.7)で表面を再生した。結合センサグラムを、緩衝液注入(0nM)で二重参照した。データを、ProteOn分析ソフトウェアに固有の1:1モデルに適合した。アッセイを25℃で実施し、HBS-EP緩衝液を泳動用緩衝液として使用した。
二重特異性ヒトIgG抗体の発現のためのプラスミドを、以下のように構築した。抗体可変領域をコードしているDNA断片を、実施例1および実施例4に記載されるように生成されたPCR生成物から調製した。クローニングのための抗体可変領域DNA断片を調製するために、PCRを実施した後、反応溶液を0.8%アガロースゲル電気泳動に供した。添付の説明書に記載される方法によって、QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)を使用して、所望のサイズ(約400bp)の増幅断片を精製し、30mLの溶出緩衝液(EB)を使用して溶出した。
8-1.DNA溶液の調製
HEK細胞の遺伝子導入のために、4種類のプラスミドDNAを含む混合溶液を調製した。1mLの細胞培養に対して、250ngのNn-IgG4ra、Nn-IgL(またはIgK)、Tn-IgG4rb、およびTn-IgL(またはIgK)の各々を使用した。
遺伝子導入の1日前に、細胞播種計算のために、培養したExpi293F細胞(HEK細胞株)を集計した。Expi293F細胞を300rpmで10分間ペレット化した。細胞を予め加温した新鮮なExpi293発現培地に再懸濁して、2.4×106細胞/mLの最終希釈液を得た。200mLの細胞懸濁液をKuhner Shaking Incubator(37°C、140rpm、8%CO2)で一晩インキュベートした。
混合物1:1ウェル当たり25μLのB細胞架橋生成物(4プラスミド混合物)+55μLのRSM+100ngのHyperPBase
混合物2:1μLのExpiFectamine(商標)293+79μLのRSM
混合物2を混合物1に添加し、室温で15分間インキュベートした。次いで、インキュベートした混合物を500μLの細胞培養液に添加し、Kuhner Shaking Incubator(37℃、300rpm、50mmオービタルスロー)で1週間インキュベートした。
二重特異性抗体のFVIIIa模倣活性、すなわち、FXのFIXa媒介活性化を強化するその能力を、酵素アッセイによってインビトロで評価した。このアッセイでは、FXaの形成に適した条件下で、リン脂質の存在下において、試験二重特異性分子をFIXaおよびFXと接触させる。FXaの基質を添加し、これは、FXaによって開裂されると、検出可能な生成物を生成する。試験二重特異性抗体の存在下でのこの生成物の検出を、試験抗体が存在しない(対照抗体が含まれる場合がある)陰性対照と比較する。検出されたシグナルを、405nmでの反応溶液の吸光度を記録することによって定量化する。吸光度を、アッセイにおける広範囲の抗体濃度にわたって測定し、EC50値を、このアッセイにおける二重特異性抗体の効力の尺度として計算する。試験抗体と対照との間のEC50の有意差は、試験抗体がFXのFIXa媒介活性化を強化することが可能であることを示す。図7を参照されたい。
特に明記しない限り、全ての反応を37℃で実施した。7.5μLのFIX(3.75μg/mL)、および組換え抗体を製造するExpi293細胞(実施例8)からの5μLの上清をアッセイプレートの各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。2.5μLのFXIa(10ng/mL)、5μLのFX(50ng/mL)、0.05μLのリン脂質(10mg/mL)、および5μLのTBSB-S緩衝液の混合物を各ウェルに添加して、酵素反応(FIXaを生成するためのFXのFXa開裂)を開始し、37°Cで1時間インキュベートした。60分後、5μLの0.5M EDTAを添加することによって反応を終了した。10μLのS2765基質溶液を各ウェルに添加した後、405nm(参照波長655nm)での吸光度を30分間測定した(10分毎に1回読み取り)。
0.1%ウシ血清アルブミンを含むトリス緩衝生理食塩水
7.5mLのTBSBを作製するには:
0.1mLの7.5% BSA溶液(Sigma)
7.4mLの1X TBS溶液(20X TBS溶液ThermoFisherから希釈)
5mMのCaCl2および1mMのMgCl2を含むTBSB
100mLのTBSB-Sを作製するには:
99.4mLのTBSB
0.5mLの1M CaCl2(Sigma)
0.1mLの1M MgCl2(Sigma)
10mLのTBSB-Sを0.1mgのFXIa(Enzyme Research Laboratories)に添加して、10μg/mLの原液を作製する。
使用前に10ng/mL(1:1,000)の希釈標準溶液に希釈する。
13.3mLのTBSB-Sを0.5mgのFIX(Enzyme Research Laboratories)に添加して、37.5μg/mLの原液を作製する。
使用前に3.75μg/mL(1:10)の希釈標準溶液に希釈する。
16mLのTBSB-Sを0.8mgのFX(Enzyme Research Laboratories)に添加して、50μg/mLの希釈標準溶液を作製する。
使用前にさらなる希釈は必要ない。
25mgのS2765(Chromogenix)発色基質(0.035mmol)
2mMの原液を作製するには:
17.493mLの水をバイアルに添加し、振盪しながら溶解する。
10μmolのPefafluor FXa蛍光基質(0.010mmol)
1.5mMの原液を作製するには:
6.667mLの水をバイアルに添加し、振盪によって溶解する。
0.6g/Lの臭化ヘキサジメトリン原液を作製するには:
0.15gの臭化ヘキサジメトリン(Sigma)を250mLの水に添加する。
使用前に0.6mg/L(1:1,000)の希釈標準溶液に希釈する。
2mMのS-2765原液および0.6mg/Lのポリブレン溶液の1:1混合物。
血友病A患者の血液の凝固能力を修正する本発明の二重特異性抗体の能力を決定するために、FVIII欠乏血漿を使用した活性化部分トロンボプラスチン時間(aPTT)に対するこれらの抗体の効果を検査した。
N128H FIX結合アームを含む二重特異性抗体は、他の大半の二重特異性分子よりもFXaseアッセイにおいて劇的に活性が高く、N128H FIX結合アームは、幅広いFX結合アームと活性な二重特異性分子を形成する能力を示した。図8。
それぞれN128HおよびN128Lと指定される重鎖および軽鎖可変ドメインを有する抗FIX抗体「N128」を、さらなる評価および最適化のために選択した。N128H CDR3(配列番号3)は、IMGT残基位置110、111、111.1、および112.1のそれぞれにおいて、一連の4つのセリン残基を含む。各Serを、他の全ての天然型アミノ酸に個々に変異させ、図9に要約されるように、N128H HCDR3において変異を生成した。
1)第IXa因子を第X因子に理想的に近接させること。
2)第IXa因子の触媒活性を最大化するように第IXa因子を方向付けること。
後続の実施例に記載される実験に使用するための抗体(単一特異性および二重特異性)の調製に、以下の手順を使用した。
抗体を、ヒト(Expi293)細胞において一過性に発現させ、次いで、細胞培養上清から精製した。
混合物1:40μLのOpti-MEM(登録商標)I培地で希釈した2μgのプラスミドDNA。
混合物2:80μLのExpiFectamine(商標)293遺伝子導入試薬+40μLのOptiMEM I培地。
混合物2を混合物1と組み合わせ、室温で20~30分間インキュベートした。インキュベーションが完了した後、165μLのDNA-ExpiFectamine(商標)293試薬複合体を24ディープウェルプレートの各ウェルに分注した。細胞をKuhner振盪インキュベーター(37℃、8% CO2、225rpm)で6日間インキュベートした。遺伝子導入の6日後に細胞培養上清を収集した。
96ウェルプレート精製を用いて、Expi293F細胞培養上清から抗体(二重特異性または単一特異性)を精製した。この方法により、抗体スクリーニング実験における複数の試料の迅速な小規模親和性抗体精製が可能になる。高い回収率を達成するために、非常に動的な結合活性(60mgのヒトIgG/mL培地)、滞留時間の延長、アルカリ耐性、および低リガンド漏出を伴うプロテインA親和性であるMabSelect Sure LXを使用した。
1.MabSelect Sure LX樹脂(GE Healthcare)を1×PBS(Gibco)で平衡化して、保存緩衝液を除去し、10%スラリーの最終濃度にした。
2.600μLの10%スラリーを96ウェルプレートAcroPrep(商標)Advance(Pall)の各ウェルに添加する。
3.樹脂を4℃で1分間、70×rcfで遠心分離した。
4.樹脂を1分間70×rcfのスピンで、300μLの1×PBSで洗浄した。このステップを2回繰り返した。
5.2mLの細胞培養上清(pH7~8)を96ウェル精製プレート内のMabSelect Sure Lx樹脂上に装填し、70~100×rcfで1分間遠心分離した。
6.600μLの1×PBSを使用してプレートを洗浄し、70~100×rcfで1分間遠心分離した。このステップを合計4回実施する。
7.70μLの溶出緩衝液(IgG Elute Pierce)を各ウェルに添加し、1分間インキュベートした。
8.溶出液を収集するために、プレートを70~100×rcfで1分間遠心分離した。このステップを合計2回実施する。
実施例12に従って新たに生成された二重特異性抗体の機能的活性を、インビトロ発色第X因子活性化(FXase)アッセイおよび血漿凝固アッセイ(前述)を使用して決定した。変異体の比較を標準化するために、全てのFIXa結合アーム(N128 VLと対になった変異体VH)を同じFX結合アームでヘテロ二量体化した。
SPRを使用して、FIXに対するFIXa結合アームの結合親和性(Kd)、反応速度定数オンレート(kon)およびオフレート(koff)を決定した。Biacore 8K(GE Healthcare)システムを使用して分析を実施した。
分析した抗FIX抗体は、表1に示される親和性でのFIXへの結合、ならびにFIXの高速結合(kon)および解離(koff)速度を示した。ISTCではFIXへの結合は観察されなかった。分析した抗FIX抗体は、AbNと比較してFIXに対して約10倍高い親和性を示した。
SPRを使用して、FXに対するFX結合アームの結合親和性(Kd)、反応速度定数結合速度定数(kon)および解離速度定数(koff)を決定した。Biacore 8K(GE Healthcare)システムを使用して分析を実施した。
分析した抗FX抗体は、表2に示される親和性でのFXへの結合、ならびにFXの高速結合(kon)および解離(koff)速度を示した。ISTCではFXへの結合は観察されなかった。
第X因子の第IXa因子活性化を触媒する、異なる第X因子アームでヘテロ二量体化されたN436H_IgG4_ra第IX因子抗体アームの能力を、ヒト血漿から精製された凝固因子を使用するインビトロテナーゼ(FXase)アッセイを使用して決定した。
T02H_IgG4rb+T02L_IgL;
T05H_IgG4rb+T05L_IgL;または
T14H_IgG4rb+T14L_IgK。
この血漿凝固アッセイでは、写真-光学凝固システムを使用してaPTT測定値を得る。血餅が形成されると、試料を通過することが可能な光の量が減少する。この減少を時間の関数としてプロットし、波形が生成される。いったんフィブリン血餅が形成されると、凝固反応が終点まで完了し、凝固時間が自動的に計算される。本aPTTアッセイで使用される血漿は、FVIIIを欠乏しているため、FIX-FX二重特異性抗体の添加効果は、凝固カスケードにおいてFVIIIの代わりになるその能力によって測定可能である。二重特異性抗体の存在下での凝固時間は、陰性対照およびFVIIIの存在下での凝固時間と比較され得る。
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Claims (10)
- FIXa結合性Fv領域を含む第1の重鎖-軽鎖対と、
FX結合性Fv領域を含む第2の重鎖-軽鎖対と
を含む、四量体免疫グロブリンである二重特異性抗原結合性分子であって、
各重鎖が、VHドメインおよび定常領域を含み、各軽鎖が、VLドメインおよび定常領域を含み、前記第1および第2の重鎖-軽鎖対は会合して、それらの重鎖定常領域のヘテロ二量体化により四量体免疫グロブリンを形成しており、
前記二重特異性抗原結合性分子が、共通の軽鎖を含み、そのため、前記第1および第2の重鎖-軽鎖対の軽鎖は、同一のアミノ酸配列を有し、
FIXa結合性Fv領域が配列番号324と少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有し、前記VHドメインが相補性決定領域(CDR)HCDR1、HCDR2、およびHCDR3のセットを含み、
HCDR1が、配列番号1であり、
HCDR2が、配列番号2であり、
HCDR3が、配列番号171であるか、または配列番号171においてIMGT位置111.1にIle、Leu、Val、およびTrpから選択される疎水性残基を有する配列である、
VHドメインと、
配列番号10と少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有し、相補性決定領域(CDR)LCDR1、LCDR2、およびLCDR3のセットを含み、
LCDR1が、配列番号6であり、
LCDR2が、配列番号7であり、
LCDR3が、配列番号8である、
VLドメインとを
含み、
FX結合性部位がFXaに関してよりFXに関して高い親和性を有する
ことを特徴とする二重特異性抗原結合性分子。 - FIXa結合性Fv領域が、
免疫グロブリン重鎖v、dおよびj遺伝子セグメントの組換えにより生成されたVHド
メインであって、前記v遺伝子セグメントが、VH3-7(例えば、VH3-7*01)であり、および/または前記j遺伝子セグメントが、JH6(例えば、JH6*02)である、VHドメインと、
免疫グロブリン軽鎖vおよびj遺伝子セグメントの組換えにより生成されたVLドメインであって、前記v遺伝子セグメントが、VL3-21(例えば、VL3-21*d01)であり、前記j遺伝子セグメントが、JL2(例えば、JL2*01)である、VLドメインと
を含む抗体Fv領域を含む、
請求項1に記載の二重特異性抗原結合性分子。 - N末端からC末端へ、VHドメイン、CH1ドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む抗体重鎖を含む、
請求項1または2に記載の二重特異性抗原結合性分子。 - 前記抗体重鎖が、IgG定常領域を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
- 前記免疫グロブリンが、IgG4である、請求項4に記載の二重特異性抗原結合性分子。
- aPTTアッセイにおいて、FVIII欠乏ヒト血漿の凝固時間を40秒未満に短縮する、請求項1~5のいずれか1項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
- 請求項1~6のいずれか1項に記載の二重特異性抗原結合性分子をコードする単離された核酸。
- FIXa結合部位を含むFIXa結合性ポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードする核酸、ここで、FIXa結合性ポリペプチドは第1の重鎖-軽鎖対である、と、
FX結合部位を含むFX結合性ポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードする核酸、ここで、FX結合性ポリペプチドは第2の重鎖-軽鎖対である、とを含む、
請求項1~6のいずれか1項に記載の二重特異性抗原結合性分子の製造のためのキット。 - 請求項1~6のいずれか1項に記載の二重特異性抗原結合性分子をコードする組換え核酸を含む宿主細胞であって、前記コード核酸が、発現のためのプロモーターに作動可能に連結されている、宿主細胞。
- 請求項1~6のいずれか1項に記載の抗原結合性分子を製造する方法であって、前記抗原結合性分子の発現のための条件下で請求項9に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞培養物から前記抗原結合性分子または前記ポリペプチドを回収することとを含む方法。
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