ES2391902T3 - Anticuerpos humanizados específicos para NOGO-A y sus usos farmacéuticos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal que se une a NOGO humana y la neutraliza, comprendiendo el anticuerpo una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos SEC ID: NO: 86, SEC ID: NO: 88, SEC ID: NO: 89 o SEC ID: NO: 90 y una región de cadena ligera, que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID: NO: 23 o SEC ID: NO: 25, o una variante correspondiente que comprende un análogo de una región de determinación de complementariedad (CDR) de dicho anticuerpo, en el cual dicha variante mantiene la especificidad de unión y la capacidad de neutralización del anticuerpo del que se deriva,

Description

Anticuerpos humanizados especificos para NOGO-A y sus usos farmaceuticos

Campo de la Invenci6n

La presente invencion se refiere a las inmunoglobulinas, particularmente a los anticuerpos que se unen a NOGO y que neutralizan su actividad, a polinucleotidos que codifican tales anticuerpos, a formulaciones farmaceuticas que contienen los anticuerpos y al uso de tales anticuerpos en el tratamiento y/o profilaxis de las enfermedades neurologicas.

Antecedentes de la Invenci6n

El infarto cerebral es una causa importante de muerte y discapacidad en el mundo occidental. No existe una terapia aprobada para el tratamiento del infarto cerebral distinto del tejido plasminogeno (t-PA) que se tiene que administrar en las primeras 3 horas del inicio despues de una exploracion tomografica por computadora (CT, por sus siglas en ingles) para excluir la existencia de hemorragia. Hasta la fecha la mayoria de los agentes terapeuticos dirigidos hacia el tratamiento del infarto cerebral agudo (es decir neuroproteccion), han implicado predominantemente la deteccion de los receptores de glutamato y sus trayectorias de senalizacion descendentes conocidas por estar implicadas en la muerte celular aguda. No obstante hasta la fecha estas estrategias han probado no tener exito en los ensayos clinicos y se asocian frecuentemente a efectos secundarios limitados por la dosis (Hill & Hachinski, The Lancet, 352: (suppl III) 10-14 (1998)). Por lo tanto hay una necesidad de nuevos procedimientos dirigidos hacia el mejoramiento de la muerte celular despues del detenimiento de flujo sanguineo. La neuroproteccion es la capacidad de un tratamiento para prevenir o mejorar la perdida de celulas neuronales en respuesta a un proceso danino o de enfermedad. Esta se puede lograr detectando las neuronas directa o indirectamente al prevenir la perdida de celulas gliales (incluyendo oligodendrocitos).

Despues del inicio del infarto cerebral, un cierto grado de recuperacion funcional espontanea se observa en muchos pacientes, sugiriendo que el cerebro tiene la capacidad (aunque limitada) de repararse y/o restaurarse despues de la lesion. Los agentes que tienen el potencial de mejorar esta recuperacion por lo tanto pueden permitir que la intervencion sea hecha mucho mas adelante (potencialmente dias) despues del inicio de la isquemia cerebral. Los agentes que pueden ofrecer la neuroproteccion aguda y mejorar la recuperacion funcional pueden proporcionar ventajas importantes sobre las estrategias de neuroproteccion potenciales actuales.

Actualmente son bien conocidos los mecanismos que causan la recuperacion funcional. El brote de axones danados

o no danados se ha propuesto como un mecanismo posible. Sin embargo, aunque los estudios in vivo han mostrado que el tratamiento de la lesion a la medula espinal o infarto cerebral con factores neurotroficos da lugar a la recuperacion funcional mejorada y a un grado de brote axonal, estos no prueban un enlace directo entre el grado de brote axonal y el grado de recuperacion funcional (Jakeman, y col. 1998, Exp. Neurol. 154: 170-184, Kawamata y col. 1997, Proc Acad Natl. Sci. E.E.U.U., 94:8179-8184, Ribotta, y col. 2000, J Neurosci. 20: 5144-5152). Ademas, el brote axonal requiere una neurona viable. En enfermedades tal como infarto cerebral que se asocia a la muerte celular extensa, el mejoramiento de la recuperacion funcional ofrecido por un agente post-infarto dado puede por lo tanto ser a traves de mecanismos distintos del brote axonal tal como la diferenciacion de las celulas madre endogenas, la activacion de las trayectorias redundantes, los cambios de la distribucion del receptor o la excitabilidad de la neuronas o glias (Fawcett & Asher, 1999, Brain Res. Bulletin, 49: 377-391, Homer & Galga, 2000, Nature 407 963-970).

La capacidad limitada del sistema nervioso central (CNS) de repararse despues de la lesion se puede deber a las moleculas dentro del ambiente del CNS que tienen un efecto inhibidor sobre el brote axonal (excrecencia del exson) tal como la proteina NOGO de mielina (Sato S. y col. (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm.163,1473-1480; McKerracher L y col. (1994) Neuron 13, 805-811; Mukhopadhyay G y col. (1994) Neuron 13, 757-767; Torigoe K y Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262; Schafer y col. (1996) Neuron 16, 1107-1113; WO9522344; WO9701352; Prinjha R y col. (2000) Nature 403, 383-384; Chen MS y col. (2000) Nature 403, 434-439; GrandPre T y col. (2000) Nature 403, 439-444; US005250414A; WO200005364A1; WO0031235).

Se han identificado tres formas de NOGO humana: residuos 1192 de aminoacido que tienen NOGO-A (Acceso GenBank No. AJ251383); NOGO-B, una variante de union que carece de los residuos 186 a 1004 en el dominio extracelular putativo (Acceso GenBank No. AJ251384) y una variante mas corta de union, NOGO-C, que tambien carece de los residuos 186 a 1004 y tambien tiene un dominio terminal amino alternativo mas pequeno (Acceso GenBank No. AJ251385) (Prinjha y col. (2000) supra).

La inhibicion de las proteinas inhibidoras del CNS tal como NOGO puede proporcionar medios terapeuticos para mejorar el dano neuronal y promover la reparacion y crecimiento neuronal, de tal modo ayudan potencialmente a la recuperacion de la lesion neuronal tal como la mantenida en el infarto cerebral. Los ejemplos de tales inhibidores de NOGO pueden incluir moleculas pequenas, peptidos y anticuerpos.

Los anticuerpos comprenden comunmente dos cadenas pesadas ligadas juntas por los enlaces disulfuro y dos cadenas ligeras. Cada de cadena ligero es ligada a una cadena pesada respectiva por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable seguido por un numero de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo y un dominio constante en su otro extremo. El dominio variable de cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. El dominio constante de cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada. Los dominios constantes en las cadenas ligeras y pesadas no estan implicados directamente en la union del anticuerpo al antigeno.

Los dominios variables de cada par de cadenas ligeras y pesadas forman el sitio de union de antigeno. Los dominios variables en las cadenas ligeras y pesadas tienen la misma estructura general y cada dominio comprende cuatro regiones de la estructura, cuyas secuencias se conservan relativamente, conectadas por tres regiones de determinacion de complementariedad (CDRs) designadas frecuentemente como regiones hipervariables. Las cuatro regiones de la estructura adoptan en gran parte un orden de lamina beta y las CDRs forman bucles conectados, y en algunos casos forman parte de la estructura de lamina beta. Las CDRs son mantenidas en proximidad cercana por las regiones de la estructura y, con las CDRs del otro dominio, contribuyen a la formacion del sitio de union de antigeno. Las CDRs y las regiones de estructura de los anticuerpos se pueden determinar por referencia a Kabat y col. ("Sequences of proteins of immunological interest" US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office, 1987).

Se ha informado que un anticuerpo monoclonal de murino, IN-1, que fue producido contra NI-220/250, una proteina de mielina que es un inhibidor potente del crecimiento de exson (y mostrada posteriormente como un fragmento de NOGO-A), promueve la regeneracion axonal (Caroni, P y Schwab, ME (1988) Neuron 1 85-96; Schnell, L y Schwab, ME (1990) Nature 343 269-272; Bregman, BS y col. (1995) Nature 378 498-501 y Thallmair, M y col. (1998) Nature Neuroscience 1 124-131 ). Tambien se ha informado que NOGO-A es el objetivo de IN-1 (Chen y col. (2000) Nature 403 434-439). La administracion del fragmento IN-1 Fab o IN-1 humanizado a las ratas que han experimentado el corte transversal de la medula espinal, mejoro la recuperacion (Fiedler, M y col. (2002) Protein Eng 15 931-941; Brosamle, C y col. (2000) J. Neuroscience 20 8061-8068).

Los anticuerpos monoclonales que se unen a NOGO se describen en los documentos WO 04/052932 y WO2005028508. El documento WO 04/052932 divulga un anticuerpo de murino 11 C7 que se une a ciertas formas de NOGO humana con alta afinidad.

Es deseable aislar y desarrollar los anticuerpos monoclonales terapeuticamente utiles adicionales que se unen a, e inhiben la actividad de, NOGO humana. El proceso de la neurodegeneracion es la base de muchas enfermedades/trastornos neurologicos incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedades agudas tal como infarto cerebral (isquemico o hemorragico), lesion cerebral traumatica y lesion de la medula espinal asi como enfermedades cronicas que incluyen la enfermedad de Alzheimer, demencias frontotemporales (tauopatias), neuropatia periferica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), esquizofrenia, esclerosis lateral amiotrofica (ALS), esclerosis multiple, enfermedad de Huntington, esclerosis multiple y miosotis de inclusion corporal. Por lo tanto un anticuerpo monoclonal anti-NOGO puede ser util en el tratamiento de estas enfermedades/trastornos. Tales anticuerpos para el tratamiento de la enfermedad/trastorno anterior son proporcionados por la presente invencion y se describen con mas detalle posteriormente.

El documento WO 2005/061544 divulga los anticuerpos monoclonales de alta afinidad, incluyendo un anticuerpo monoclonal de murino 2A10, y una variante humanizada del mismo H1 L11.

Breve Descripci6n de la Invenci6n

La presente invencion proporciona un numero de anticuerpos monoclonales que se unen a una NOGO humana. La presente solicitud hace referencia a muchas SEC ID NOS, que se presentan brevemente en la tabla 12, con las secuencias despues de la tabla al final de este documento.

El anticuerpo de murino 2A10 se une a NOGO humana con alta afinidad, y se une a la forma de NOGO que es expresada por las lineas celulares humanas con alta afinidad. 2A10 se ha humanizado con exito en el pasado (H1 L11 que comprende la region variable de cadena pesada H1 (SEC ID NO. 77) y la region variable de cadena ligera L11 (SEC ID NO. 78)). La presente invencion proporciona los anticuerpos monoclonales humanizados adicionales que conservan una porcion grande de la afinidad de, o tienen afinidad equivalente a, el anticuerpo de donador (2A10) a NOGO humana. En particular los anticuerpos de la presente invencion tienen un alto grado de union a NOGO humana en forma recombinante segun lo expresado en las celulas bacterianas (tal como E. CoIi), y tambien en la forma que es expresada por una linea celular humana del neuroblastoma (por ejemplo la linea celular humana del neuroblastoma IMR32).

A objeto de proporcionar las variantes humanizadas 2A10, los presentes inventores han identificado un numero de residuos de aminoacidos esenciales en la secuencia de la estructura de las regiones variables 2A10 que se creen que son importantes en la retencion optima de la afinidad de union a la NOGO humana. La region variable de cadena pesada 2A10 (VH) se proporciona en la SEC ID NO. 7; la region variable de cadena ligera 2A10 (VL) se proporciona en la SEC ID NO. 8. Las cadenas pesadas y ligeras quimericas que comprenden las regiones variables de murino y las regiones constantes humanas se proporcionan en las SEC ID NOS 9 y 10 respectivamente (la combinacion de las dos cadenas quimericas es llamada HcLc). El lector experto entendera que las SEC ID NOS 9 y

10 representan las cadenas pesadas o las cadenas ligeras antes de cualquier procesamiento (por ejemplo el procesamiento mediado por la celula huesped) para la eliminacion de una secuencia senal. Comunmente las formas procesadas de las cadenas de anticuerpo comenzaran en la posicion 20 (despues de la eliminacion de la secuencia senal) para la SEC ID NO. 9; y comenzara en la posicion 21 para la SEC ID NO. 10. Dentro del contexto de la presente invencion todas las secuencias de cadena pesada y ligera integrales seran proporcionadas con la secuencia senal incluida (que para el resto de las secuencias integrales, que no son SEC ID NOS 9 y 10, corresponde a la SEC ID NO.75). Sera evidente al experto que el anticuerpo producido por una linea celular transfectada con un gene que codificaba cualquiera de estas cadenas pesadas y ligeras integrales, no debe comprender esta secuencia senal.

Tabla 1, las CDRs de la cadena pesada 2A10 son:

CDR

De acuerdo con Kabat

H1

SYWMH (SEC ID NO: 1)

H2

NINPSNGGTNYNEKFKS (SEC ID NO: 2)

H3

GQGY (SEC ID NO: 3)

Tabla 2, las CDRs de la cadena ligera 2A10

CDR

De acuerdo con Kabat

L1

RSSKSLLYKDGKTY (SEC ID NO: 4)

L2

LMSTRAS (SEC ID NO: 5)

L3

QQLVEYPLT (SEC ID NO: 6)

Las CDRs fueron identificadas de acuerdo a Kabat (Kabat y col. (1991) "Sequences of preteins of immunological interest"; Fifth Edition; US Departament of Health and Human Services; Publicacion NIH No. 91-3242). Las CDRs preferiblemente son segun lo definido por Kabat pero siguiendo los principios de la estructura y el pliegue de la proteina segun lo definido por Chothia y Lesk, (Chothia y col., (1989) "Conformations of immunoglobulin hypervariable regions"; Nature 342, p877-883) sera apreciado que los residuos adicionales tambien se puedan considerar como parte de la region de union de antigeno y que asi sean comprendidos por la presente invencion.

H1 y L11 de los dominios de VH y VL se han descrito previamente en el documentos WO 2005/061544 y son un resultado de las CDRs mencionada en las tablas 1 y 2 que son injertadas en las regiones variables humanas con alta homologia al anticuerpo de donador 2A10, cada constructo injertado que comprende adicionalmente las mutaciones anteriores en las posiciones de Kabat 93 y 94 (para H1 VH) o 4, 45 y 46 (para L11 VL).

El anticuerpo 2A10 es capaz de unirse a NOGO humana, y tambien de unirse a NOGO de mono titi y rata, y se cree que los nuevos anticuerpos humanizados de la presente invencion conservaran tal caracteristica. Por ejemplo un anticuerpo monoclonal que comprende las regiones variables H20 y L16 (ver abajo para detalles) a NOGO de mono titi asi como a NOGO de rata, NOGO de Cynomolgus y de mono ardilla. La secuencia del fragmento de NOGO-A de mono titi se da en la SEC ID NO. 113.

Los anticuerpos que comprenden las CDRs en la tabla 1 y 2 son proporcionados por la presente invencion. Los anticuerpos que comprenden los analogos de estas CDRs tambien estan comprendidos dentro de la presente invencion.

En un primer aspecto, la invencion proporciona un anticuerpo humanizado como se reivindica en la reivindicacion 1.

A menos que se indique especificamente lo contrario, cuando una posicion numerica de un residuo de aminoacido encontrado dentro de una secuencia especifica se menciona en este documento, por ejemplo "posicion 12", se desea que el experto asigne al primer aminoacido en la secuencia la posicion "1" y cuente a partir de la posicion uno e identifique el aminoacido que esta en la posicion deseada, en este ejemplo el duodecimo residuo de aminoacido en la secuencia. El experto notara que este sistema de numeracion no corresponde al sistema de numeracion de Kabat que se utiliza frecuentemente para las posiciones de aminoacido dentro de las secuencias del anticuerpo. La siguiente tabla (la tabla 3) ilustra las sustituciones/mutaciones inversas de la presente invencion y proporciona sus posiciones numericas y el numero de Kabat para tal posicion numerica:

5 Tabla 3

Residuo de Posicion numerica Numero de Kabat de Residuo estructura estructura la posicion numerica correspondiente en humana de H1 (SEC murino 2A10 (SEC ID ID NO: 77) NO: 7)

K 1212 V V 2020 L R 3838 K A 4040 R M 4848 I R 6766 K V 6867 A M 7069 L R 7271 V T 7473 K T 7675 S V 7978 A T 9187 S

La siguiente tabla incluye los detalles de 20 diferentes regiones variables de cadena pesadas (VH) que pueden formar parte de los anticuerpos de la presente invencion. Cada una de VH descrita se basa en H1 VH (SEC ID NO. 77) que comprende adicionalmente las sustituciones mencionadas en la tabla (tabla 4) donde el residuo H1 en la

10 posicion relevante es sustituido con el residuo 2A10 en tal posicion (en la tabla, "-" significa medios que no existe sustitucion en tal posicion, y asi el residuo permanece como en la secuencia de H1):

Tabla 4

Nueva VH (SEC ID NO: X)

Residuo numerico No. 12 20 38 40 48 67 68 70 72 74 76 79 91

Kabat No.

12 20 38 40 48 66 67 69 71 73 75 78 87

2A10

V L K R I K A L V K S A S

H1

K K R A M R M M R T T V T

H5 (11)

- - - - - - - - - - - A -

H6 (12)

- - - - I - A - - - - A -

H7 (13)

- - - - I - A L V K - A -

H8

- - - - I - A L V - - A -

H9

- L - - I - A L V K - A -

H10

- L K - I - A L V K - A -

H12

- - - - I - A L - K - - -

H13

- - - - I - A - V - - A -

H14 (14)

V L K - I - A L - - - A -

H15 (15)

V L K R I K A L V - S A S

H16 (16)

- - K R I K A L V K - A -

H17 (17)

V L K R I K A L V K - A -

H18 (18)

V L K R I K A L V K S A S

H19 (85)

- - - R I - A - - - - A -

H20 (86)

- - - - I K A - - - - A -

H21 (87)

- - - R I K A - - - - A -

H22 (88)

- - K R I K A - - - - A -

H23 (89)

- - K R I K A - V - - A -

H24 (90)

- - K R I K A L V - - A -

H25 (91)

- - - R - - - - - - - A -

La siguiente tabla (Tabla 5) ilustra las sustituciones/mutaciones inversas de la presente invencion y proporciona sus posiciones numericas y el numero de Kabat para tal posicion numerica:

Tabla 5

Residuo de estructura

Posicion numerica Numero de Kabat de Residuo

humana de L3 (SEC

la posicion numerica correspondiente en

ID NO: 20)

murino 2A10 (SEC ID

NO: 8)

M

4 4 I

S

7 7 D

L

11 11 N

A

19 19 V

Q

42 37 L

P

64 59 S

G

70 65 S

La siguiente tabla (tabla 6) incluye los detalles de siete diferentes regiones variables de cadena ligera (VL) que puedan formar parte de los anticuerpos de la presente invencion o son variantes de los mismos que comprenden los analogos de las CDRs. Cada una de VL descritas es, o se basa en, los L13 VL (SEC ID NO. 20) ademas opcionalmente comprenden las sustituciones mencionadas en la tabla donde el residuo L13 en la posicion relevante se sustituye con el residuo 2A10 en tal posicion (en la tabla, "-" significa medios que no existe una sustitucion en tal posicion, y asi el residuo permanece como en la secuencia de L13):

Tabla 6

Nueva VH (SEC ID NO: X)

Residuo numerico No. 4 7 11 19 42 64 70

Kabat No.

4 7 11 19 37 59 65

2A10

I 0 N V L S S

L131

M S L A Q P G

L11 (78)

I - - - - - -

L13 (20)

- - - - - - -

L14 (21)

- - - - L - -

L15 (22)

- - - - L S -

L16 (23)

- - N V L - -

L17 (24)

- D - - - S S

L18 (25)

- D N -V L S S

Las realizaciones particulares son anticuerpos que comprenden las siguientes combinaciones de regiones variables de cadena pesadas y ligeras: H20L16 (SEC ID NO: 86 + SEC ID NO: 23), H22L16 (SEC ID NO: 86 + SEC ID NO: 23), H23 L16 (SEC ID NO: 89 + SEC ID NO: 23), H24L16 (SEC ID NO: 90 + SEC ID NO: 23), H23L18 (SEC ID NO: 86 + SEC ID NO: 25), H22L18 (SEC ID NO: 88 + SEC ID NO: 25), H23L18 (SEC ID NO: 89 + SEC ID NO: 25), H24L18 (SEC ID NO: 90 + SEC ID NO: 25). En una realizacion el anticuerpo comprende H20L16 o una variante de la misma que comprende un analogo de las CDRs natural.

Los anticuerpos humanizados de la presente invencion se unen a NOGO humana con una afinidad comparable a la del anticuerpo de donador murino de 2A10 o version quimerica del mismo (HcLc). En una realizacion la union del anticuerpo de la presente invencion a NOGO tiene una afinidad constante (KD, segun lo medido por las tecnicas BiaCore) dentro de 10 veces la de 2A10, y en otra realizacion la constante de afinidad esta dentro de tres o dos veces la de 2A10, en otra realizacion la constante de la afinidad no es diferente a la de 2A10 (o 2A10 HcLc). En otra realizacion la constante de afinidad esta dentro de tres o dos veces la de 2A10 y la constante de disociacion (kd) esta dentro de 10 veces, o tres veces, o dos veces la de 2A10, en otra realizacion la constante de disociacion no es diferente de la de 2A10 (o 2A10 HcLc). El procedimiento de medir la constante de afinidad y la constante de disociacion del anticuerpo debe estar claro para el experto, no obstante el procedimiento BiaCore de analisis cinetico dado en el ejemplo 5 de este documento es ilustrativo a este respecto. Por ejemplo, la constante de afinidad y la constante de disociacion de 2A10 segun lo medido por el analisis cinetico BiaCore esta comunmente en la region de 1 nM y 1.84 x10-3 (kd 1/s) respectivamente; en el mismo analisis los anticuerpos de una realizacion de la presente invencion tendran una constante de afinidad de menos de 8-10 nM y 1.84x10-2. De una manera similar el analisis del anticuerpo quimerico2A10, HcLc, tendra una constante de afinidad de aproximadamente 1 a 2 nM y 2 x 10-3 a 4 x10-3 (kd 1/s) respectivamente.

En las realizaciones comunes, los anticuerpos de la invencion son de la clase IgG, mas comunmente IgG1 o lgG4 humana, con una cadena ligera humano de tipo K.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un procedimiento para inhibir la neurodegeneracion y/o para promover la recuperacion funcional en un paciente humano que padece, o esta en riesgo de desarrollar, un infarto cerebral (particularmente infarto cerebral isquemico) u otra enfermedad neurologica, en particular la enfermedad de Alzheimer o esclerosis multiple, el cual comprende administrar al humano en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-NOGO de la invencion o un fragmento funcional del mismo.

Los anticuerpos de la presente invencion pueden usarse en un procedimiento para inhibir la neurodegeneracion y/o para promover la recuperacion funcional en un paciente humano que padece, o esta en riesgo de desarrollar, un infarto cerebral u otra enfermedad neurologica, en particular la enfermedad de Alzheimer o esclerosis multiple, que comprende administrar a dicho humano en necesidad una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-NOGO de la invencion o un fragmento funcional del mismo

Los anticuerpos de la presente invencion pueden usarse en un procedimiento de tratamiento, o en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de, una lesion traumatica nerviosa, tal como lesion de la medula espinal u otra lesion traumatica del sistema nervioso.

Otros aspectos y ventajas de la presente invencion se describen adicionalmente en la descripcion detallada de la invencion y en las realizaciones preferidas de la misma.

Los anticuerpos integrales descritos en la presente memoria son los que comprenden las cadenas ligeras de las SEC ID NOS 34-40 y las cadenas pesadas de las SEC ID NOS 92-98; y en particular las cadenas ligeras de las SEC ID NOS 35, 38 o 40 y las cadenas pesadas de las SEC ID NOS 92, 93, 94 o 98. Sera evidente a los expertos en la tecnica que todas las secuencias dadas para las cadenas del anticuerpo integral en la tabla 7 y 12 (y secuencias anexas) representan las cadenas pesadas o cadenas ligeras antes de cualquier procesamiento (por ejemplo procesamiento mediado por la celula huesped) para la eliminacion de una secuencia senal. Comunmente las formas procesadas de las cadenas del anticuerpo comenzaran en la posicion 20 (despues de la eliminacion de la secuencia senal (residuos 1-19) que corresponde a la SEC ID NO. 75). La presente invencion proporciona los anticuerpos que tienen las secuencias de polipeptido listadas (despues de la eliminacion de los primeros 19 aminoacidos de la secuencia senal), y tambien proporciona los anticuerpos en la forma en la cual se producen y purifican a partir de las celulas huesped que expresan los polinucleotidos que codifican la cadena pesada y ligera.

Tabla 7, Los anticuerpos integrales especificos incluyen:

Anticuerpo

Cadena ligera Cadena pesada

H20L 16 FL

SEQ ID NO. 38 SEQ ID NO. 93

H20L 18 FL

SEQ ID NO. 40 SEQ ID NO. 93

En una realizacion el anticuerpo es H20L16 FL, o una variante del mismo que comprende un analogo de CDR.

En una realizacion de la presente invencion los anticuerpos no son liticos, en que la region constante no son capaces de unirse a un ADCC (anticuerpo dependiente de la toxicidad celular) complementario y/o de mediacion. Las regiones constantes de los anticuerpos integrales estan por lo tanto basados en los dominios constantes que son naturalmente no liticos, tal como lgG4 humano, o comprenden inactivar las sustituciones en las posiciones 235 y 237 dentro de una region constante de IgG1 humano (vease el documento EP0307434 para mas detalles).

Descripci6n de las Figuras

Figura 1A y B, datos de ELISA para los supernadantes del anticuerpo monoclonal que se unen a NOGO humana recombinante. Figura 2A y B, datos de ELISA para el anticuerpo monoclonal purificado que se une a NOGO humana recombinante. Figura 3A y B, datos de ELISA para los supernadantes del anticuerpo monoclonal que se une a NOGO humana recombinante. Figura 4A y B, datos de ELISA para los supernadantes del anticuerpo monoclonal que se une a NOGO humana recombinante. Figura 5A y B, datos de ELISA para los supernadantes del anticuerpo monoclonal que se une a NOGO humana recombinante. Figura 6, A a F, datos de FACS para el anticuerpo purificado que se une a NOGO humana expresada por las celulas del neuroblastoma humano. Figura 7, resultados de ELISAde competencia. Figura 8, datos de ELISA para los anticuerpos monoclonales que se unen a NOGO humana recombinante. Figura 9, datos de ELISA para los anticuerpos monoclonales que se unen a NOGO humana recombinante. Figura 10, datos de ELISA para los anticuerpos monoclonales que se unen a NOGO humana recombinante. Figura 11, datos de ELISA para los anticuerpos monoclonales que se unen a NOGO humana recombinante. Figura 12A y B, datos de ELISA para los anticuerpos monoclonales que se unen a NOGO humana recombinante. Figura 13, datos de FACS para el anticuerpo purificado que se une a NOGO humana expresada por las celulas de neuroblastoma humano. Figura 14 A a C, datos de FACS para el anticuerpo purificado que se une a NOGO humana expresada por las celulas del neuroblastoma humano.

Descripci6n Detallada de la Invenci6n

Los anticuerpos de la invencion tienen de comunmente la estructura de un anticuerpo natural o fragmento funcional del mismo. El anticuerpo por lo tanto puede comprender un anticuerpo integral, un fragmento (Fab')2, fragmento Fab, un dimero de cadena ligera o dimero de cadena pesado. El anticuerpo puede ser un IgG1, lgG2, lgG3, o lgG4; o IgM; IgA, IgE o IgD o una variante modificada de los mismos. Por consiguiente se puede seleccionar el dominio constante de la cadena pesada del anticuerpo. El dominio constante de cadena ligera puede ser un dominio constante kappa o lambda. Ademas, el anticuerpo puede comprender las modificaciones de todas las clases por ejemplo dimeros de IgG, mutantes de Fc que dejan de unirse a los receptores Fc o median la union de CIq. El anticuerpo tambien puede ser un anticuerpo quimerico del tipo descrito en el documento WO86/01533, que comprende una region de union de antigeno y una region sin inmunoglobulina. La region de union de antigeno es un dominio variable de cadena ligera o dominio variable de cadena pesada del anticuerpo. Comunmente la region de union de antigeno comprende los dominios variables de cadena ligera y pesada. La region sin inmunoglobulina esta fusionada en su terminal C a la region de union de antigeno. La region sin inmunoglobulina es comunmente una proteina sin inmunoglobulina y puede ser una enzima, toxina o proteina que tiene la especificidad de union conocida. Las dos regiones de este tipo de anticuerpo quimerico se pueden conectar via una secuencia de enlace dividida. Tambien se contemplan en la presente invencion las inmunoadhesinas que tienen las CDRs segun lo descrino anteriormente.

La region constante se selecciona de acuerdo a la funcionalidad requerida. Un IgG1 mostrara una capacidad litica a traves de la union a un ADCC (anticuerpo dependiente de la citotoxicidad celular) complemento ario y/o de mediacion. Un lgG4 sera preferido si se requiere un anticuerpo de bloqueo no citotoxico. Sin embargo, los anticuerpos lgG4 pueden demostrar inestabilidad en la produccion y por lo tanto puede ser mas preferible modificar el IgG1 generalmente mas estable. Se describen las modificaciones sugeridas en el documento EP0307434, las modificaciones preferidas se incluyen en las posiciones 235 y 237. La invencion por lo tanto proporciona una forma litica o no litica de un anticuerpo de acuerdo a la invencion.

En una realizacion el anticuerpo de la invencion es un anticuerpo IgG1 no litico integral (es decir un tetramero que comprende dos cadenas pesadas y dos ligeras) que tiene las secuencias de VH o VL descritas anteriormente.

"NOGO" se refiere a cualquier polipeptido de NOGO, incluyendo las formas variables. Esto incluye, pero no se limita a, NOGO-A que tiene 1192 residuos de aminoacido (Acceso GenBank No. AJ251383); NOGO-B, una variante de union que carece de los residuos 186 a 1004 en el dominio extracelular putativo (Acceso GenBank No. AJ251384) y una variante de union mas corta, NOGO-C1 que tambien carece de los residuos 186 a 1004 y tambien tiene el dominio terminal amino mas pequeno alternativo (Acceso GenBank No. AJ251385) (Prinjha y col. (2000) supra). Se entiende que todas las referencias a "NOGO" en la presente incluyen cualquiera y todas las formas variables de NOGO tal como NOGO-A y las variantes de union descritas, a menos que se indique una forma especifica.

"Neutralizar" y variaciones gramaticales de la misma palabra, se refieren a la inhibicion, total o parcial, de la funcion de NOGO incluyendo su union a las neuronas y la inhibicion del crecimiento del exson.

Los terminos Fv, Fc, Fd, Fab, o F(ab)2 se utilizan con sus significados estandares (ver, por ejemplo, Harlow y col., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)).

Un "anticuerpo quimerico" se refiere a un tipo de anticuerpo disenado que contiene una region variable natural (cadena pesada y cadena ligera) derivada de un anticuerpo de donador en la asociacion con las regiones constantes de cadena ligera y pesada derivadas de un anticuerpo de aceptor.

Un "anticuerpo humanizado" se refiere a un tipo de anticuerpo disenado que tiene sus CDRs derivadas de una inmunoglobulina de donador no humana, las partes derivadas de inmunoglobulina restantes de la molecula se derivan de una o mas inmunoglobulinas humano. Ademas, los residuos soportados por la estructura se pueden alterar para conservar la afinidad de union (ver, por ejemplo, Queen y col., Proc. Natl Acad Sci E.E.U.U., 86:1002910032 (1989), Hodgson y col., Bio/Technology, 9:421 (1991)). Un anticuerpo de aceptor humano conveniente puede ser uno seleccionado de una base de datos convencional, por ejemplo, la base de datos KABAT®, base de datos Los Alamos, y la base de datos Swiss Protein, por homologia a las secuencias de nucleotido y aminoacido del anticuerpo de donador. Un anticuerpo humano caracterizado por una homologia a las regiones de la estructura del anticuerpo de donador (sobre una base de aminoacido) puede ser adecuado para proporcionar una region constante de cadena pesada y/o una region variable de la estructura de cadena pesada para la insercion de las CDRs de donador. Un anticuerpo de aceptor conveniente capaz de donar las regiones de estructura constantes o variables de cadena ligera, se puede seleccionar de una manera similar. Se debe observar que las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo de aceptor no son requeridas para originar el mismo anticuerpo de aceptor. La tecnica anterior describe varias maneras de producir tales anticuerpos humanizados -ver por ejemplo los documentos EP-A-0239400 y EP-A054951.

El termino "anticuerpo de donador" se refiere a un anticuerpo (monoclonal, y/o recombinante) que contribuye con las secuencias de aminoacido de sus regiones variables, CDRs, u otros fragmentos o analogos funcionales de las mismas a un primer asociado de inmunoglobulina, para proporcionar la region de codificacion de inmunoglobulina alterada y el anticuerpo alterado expresado resultante con la especificidad antigenica y para neutralizar la actividad caracteristica del anticuerpo de donador.

El termino "anticuerpo de aceptor" se refiere a un anticuerpo (monoclonal y/o recombinante) heterologo al anticuerpo de donador, que contribuye todas (o cualquier porcion, pero preferiblemente todas) las secuencias de aminoacido que codifican sus regiones de cadena pesada y/o ligera de la estructura y/o sus regiones constantes de cadena pesada y/o ligera al primer asociado de inmunoglobulina. Preferiblemente un anticuerpo humano es el anticuerpo de aceptor.

Las "CDRs" se definen como las secuencias de aminoacido de la region de determinacion de complementariedad de un anticuerpo, las cuales son las regiones hipervariables de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina. Ver, por ejemplo, Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). Hay CDRs de tres cadenas pesadas y de tres cadenas ligeras (o regiones CDR) en la porcion variable de una inmunoglobulina. Asi, "CDRs" segun lo utilizado en la presente se refiere las CDRs de tres cadenas pesadas, o CDRs de tres cadenas ligeras (o CDRs de todas las cadenas pesadas y de todas las cadenas ligeras, si es apropiado).

El plegamiento de la estructura y de la proteina del anticuerpo puede significar que otros residuos son considerados parte de la region de union de antigeno y seria entendido asi por un experto. Ver por ejemplo Chothia y col., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p877-883.

Las CDRs proporcionan la mayoria de los residuos de contacto para la union del anticuerpo al antigeno o epitope. Las CDRs de interes en esta invencion se derivan de las secuencias de cadena pesada y ligera variable del anticuerpo de donador, e incluyen los analogos de las CDRs naturales, cuyos analogos tambien comparten o conservan la misma especificidad de union de antigeno y/o la capacidad de neutralizacion que el anticuerpo de donador de el cual se derivan.

Un "fragmento funcional" es una secuencia variable de cadena pesada o ligera parcial (por ejemplo, eliminaciones menores en la terminal amino o carboxi de la region variable de inmunoglobulina) que conserva la misma especificidad de union de antigeno y la misma o similar capacidad de neutralizacion que el anticuerpo de el cual el fragmento se deriva.

Un "analogo" es una secuencia de aminoacido modificada por al menos un aminoacido, en donde la modificacion puede ser quimica o una sustitucion o un reacomodo de algunos aminoacidos (es decir, no mas de 10), cuya modificacion permite que la secuencia de aminoacido conserve las caracteristicas biologicas, por ejemplo, especificidad de antigeno y afinidad alta, de la secuencia sin modificar.

La presente invencion tambien incluye el uso los fragmentos Fab o fragmentos F(ab')2 derivados de mAbs de la presente invencion dirigidos contra NOGO. Un fragmento Fab contiene la porcion terminal entera de cadena ligera y amino de la cadena pesada; y un fragmento F(ab')2 es el fragmento formado por dos fragmentos Fab unidos por los enlaces disulfuro. Los fragmentos Fab y los fragmentos F(ab')2 se pueden obtener por medios convencionales, por ejemplo, division de mAb con las enzimas proteoliticas, papaina y/o pepsina apropiadas, o por procedimientos recombinantes. Los fragmentos Fab y F(ab')2 son utiles por si mismos como terapeuticos o profilacticos, y como donadores de las secuencias que incluyen las regiones variables y las secuencias de CDR utiles en la formacion de anticuerpos recombinantes o humanizados segun lo descrito en la presente.

En aun otra realizacion, el anticuerpo de la invencion pudo haberse unido a un agente adicional. Por ejemplo, el procedimiento de la tecnologia de ADN recombinante se puede utilizar para producir un anticuerpo disenado de la invencion en el cual el fragmento Fc o dominio CH2-CH3 de una molecula de anticuerpo integral se ha sustituido por una la enzima u otra molecula detectable (es decir, una molecula efectora o reportera de polipeptido).

Los anticuerpos de la presente invencion se pueden producir elaborando un vector de expresion convencional o plasmido recombinante colocando estas secuencias de codificacion para el anticuerpo en asociacion operativa con las secuencias de control reguladoras convencionales capaces de controlar la multiplicacion y expresion en, y/o la secrecion de, una celula huesped. Las secuencias reguladoras incluyen las secuencias de promotor, por ejemplo, promotor CMV, y las secuencias senal, que se pueden derivar de otros anticuerpos conocidos. Similarmente, un segundo vector de expresion se puede producir teniendo una secuencia de ADN que codifique una cadena ligera o pesada del anticuerpo complementario. Preferiblemente este segundo vector de expresion es identico al primero excepto por que son afectados las secuencias de codificacion y los marcadores seleccionables, a modo de asegurar lo mas posible que cada cadena de polipeptido sea expresada funcionalmente. Alternativamente, las secuencias de codificacion de cadena pesada y ligera para el anticuerpo alterado pueden residir en un solo vector.

Una celula huesped seleccionada es co-transfectada por tecnicas convencionales con el primer y segundo vectores (o se transfecta simplemente por un solo vector) para crear la celula huesped transfectada de la invencion que comprende las cadenas ligeras y pesadas sinteticas o recombinantes. La celula transfectada entonces se cultiva por tecnicas convencionales para producir el anticuerpo disenado de la invencion. El anticuerpo que incluye la asociacion de la cadena pesada y/o cadena ligera recombinante es analizado a partir del cultivo mediante el analisis apropiado, tal como ELISA o RIA. Las tecnicas convencionales similares se pueden utilizar para construir otros anticuerpos y moleculas alterados.

Los vectores convenientes para las etapas de clonacion y subclonacion utilizados en los procedimientos y construccion de las composiciones de esta invencion, se pueden seleccionar por un experto en la tecnica. Por ejemplo, se puede utilizar la serie pUC convencional de vectores de clonacion. Un vector, pUC19, esta disponible comercialmente de proveedores, tal como Amersham (Buckinghamshire, Reino Unido) o Pharmacia (Uppsala, Suecia). Ademas, cualquier vector que es capaz de replegarse facilmente, tiene una abundancia de sitios de clonacion y de genes seleccionables (por ejemplo, resistencia antibiotica), y que se manipula facilmente se puede utilizar para la clonacion.

Similarmente, los vectores utilizados para la expresion de los anticuerpos pueden ser seleccionados de cualquier vector convencional por experto en la tecnica. Los vectores tambien contienen las secuencias reguladoras seleccionadas (tal como promotores CMV o RSV) que dirigen la multiplicacion y expresion de las secuencias de ADN heterologas en celulas huesped seleccionadas. Estos vectores contienen las secuencias de ADN descritas anteriormente que codifican el anticuerpo o la region de codificacion de inmunoglobulina alterada. Ademas, los vectores pueden incorporar las secuencias de inmunoglobulina seleccionadas que son modificadas por la insercion de los sitios de restriccion deseables para la manipulacion preparada.

Los vectores de expresion tambien se pueden caracterizar por los genes convenientes para la expresion de amplificacion de las secuencias de ADN heterologas, por ejemplo, el gene de dihidrofolato reductasa (DHFR, por sus siglas en ingles) mamifero. Otras secuencias del vector preferibles incluyen una secuencia poli A senal, tal como de la hormona de crecimiento bovina (BGH, por sus siglas en ingles) y la secuencia de promotor de betaglobulina (betaglopro). Los vectores de expresion utiles en la presente se pueden sintetizar por tecnicas bien conocidas por los expertos en esta tecnica.

Los componentes de tales vectores, por ejemplo replicones, genes de seleccion, mejoradores, promotores, secuencias senal y similares, se pueden obtener de fuentes comerciales o naturales o sintetizarse por procedimientos conocidos para el uso en la direccion de la expresion y/o secrecion del producto del ADN recombinante en un hospedador seleccionado. Los otros vectores de expresion apropiados de los cuales numerosos tipos se conocen en la tecnica para la expresion mamifera, bacteriana, en insectos, en levaduras, y hongos tambien se pueden seleccionar para este proposito.

Tambien se describen en la presente memoria una linea celular transfectada con un plasmido recombinante que contiene las secuencias de codificacion de los anticuerpos o moleculas de inmunoglobulina alteradas de los mismos. Tambien son convencionales las celulas huesped utiles para la clonacion y otras manipulaciones de estos vectores de clonacion. Sin embargo, lo mas deseable es que, las celulas de varias cepas de E. coli se utilicen para la multiplicacion de los vectores de clonacion y para otras etapas en la construccion de los anticuerpos alterados de esta invencion.

Las celulas huesped o lineas celulares convenientes para la expresion del anticuerpo de la invencion son celulas preferiblemente mamiferas tal como NSO, Sp2/0, CHO (por ejemplo DG44), COS, una celula del fibroblasto (por ejemplo, 3T3), y celulas de mieloma, y mas preferiblemente una CHO o una celula de mieloma. Las celulas humanas se pueden utilizar, asi se permite que la molecula sea modificada con los patrones de glicosilacion humana. Alternativamente, se pueden utilizar otras lineas de celulas eucarioticas. Se conoce en la tecnica la seleccion de las celulas huesped mamiferas convenientes y de los procedimientos para la transformacion, cultivo, amplificacion, analisis y produccion y purificacion del producto. Ver, por ejemplo, Sambrook y col., citado anteriormente.

Las celulas bacterianas pueden probar ser utiles como celulas huesped convenientes para la expresion de Fabs recombinantes de la presente invencion (ver, por ejemplo, Pluckthun, A., Immunol. Rev., 130:151-188 (1992)). Sin embargo, debido a la tendencia de las proteinas expresadas en celulas bacterianas a estar en una forma sin plegar

o plegada incorrectamente o en una forma no glicosilada, cualquier Fab recombinante producido en una celula bacteriana tendria que ser analizado para determinar la retencion de la capacidad de union de antigeno. Si la molecula expresada por la celula bacteriana fuera producida de una forma plagada correctamente, la celula bacteriana seria una huesped deseable. Por ejemplo, varias cepas de E. coli usadas para la expresion, son bien conocidas como celulas huesped en el campo de la biotecnologia. Varias cepas de B. subtilis, Streptomyces, otros bacilos y similares tambien se pueden utilizar en este procedimiento.

Donde sea deseado, las cepas de celulas de levadura conocidas por los expertos en la tecnica tambien estan disponibles como celulas huesped, asi como las celulas de insectos, por ejemplo Drosophila y Lepidoptera y sistemas de expresion viral. Ver, por ejemplo Miller y col., Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press (1986) y las referencias citadas en los mismos documentos.

Los procedimientos generales por los cuales los vectores se pueden construir, los procedimientos de transfeccion requeridos para producir las celulas huesped de la invencion, y los procedimientos de cultivo necesarios para producir el anticuerpo de la invencion a partir de tal celula huesped, son todos tecnicas convencionales. Comunmente, el procedimiento de cultivo de la presente invencion es un procedimiento de cultivo libre de suero, generalmente por celulas de cultivo libres de suero en suspension. Asimismo, una vez que se produzcan, los anticuerpos de la invencion se pueden purificar de los contenidos de cultivo celular de acuerdo a los procedimientos estandares de la tecnica, incluyendo la precipitacion de sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografia en columna, electroforesis en gel y similares. Tales tecnicas estan dentro de la habilidad de la tecnica y no limitan esta invencion. Por ejemplo, la preparacion de los anticuerpos alterados se describe en los documentos WO 99/58679 y WO 96/16990.

Aun otro procedimiento de expresion de los anticuerpos puede utilizar la expresion en un animal transgenico, tal como el descrito en la Patente Norteamericana No. 4,873,316. Esto se relaciona a un sistema de expresion usando al promotor de caseina del animal que cuando se incorpora de manera transgenica en un mamifero, permite que la hembra produzca la proteina recombinante deseada en su leche.

Una vez que se expreso por el procedimiento deseado, el anticuerpo entonces se examina para determinar la actividad in vitro por medio del uso de un analisis apropiado. Los formatos de analisis de ELISA actualmente convencionales se utilizan para determinar la union cualitativa y cuantitativa del anticuerpo a NOGO. Ademas, otros analisis in vitro tambien se pueden utilizar para verificar la eficacia de neutralizacion antes de los estudios clinicos humanos subsecuentes realizados para evaluar la persistencia del anticuerpo en el cuerpo a pesar de los mecanismos de eliminacion comunes.

Los agentes terapeuticos de esta invencion se pueden administrar como un profilactico o despues de ocurrir el infarto cerebral/inicio de los sintomas clinicos, o segun lo necesitado de otra manera. La dosis y duracion del tratamiento se relaciona a la duracion relativa de las moleculas de la presente invencion en la circulacion humana, y puede ajustarse por un experto en la tecnica dependiendo de la condicion que es tratada y de la salud general del paciente. Se considera que la dosificacion repetida (por ejemplo una vez por semana o una vez cada dos semanas) durante un periodo prolongado (por ejemplo cuatro a seis meses) pudo requerir alcanzar una eficacia terapeutica maxima.

El modo de administracion del agente terapeutico de la invencion puede ser cualquier ruta conveniente que suministre el agente al hospedador. Los antagonistas y anticuerpos, y las composiciones farmaceuticas de la invencion son particularmente utiles para la administracion parenteral, es decir, de manera subcutanea, intratecal, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, o intranasal, de las cuales la intravenosa es la particularmente preferida.

Los agentes terapeuticos de la invencion se pueden preparar como composiciones farmaceuticas que contienen una cantidad efectiva del antagonista o anticuerpo de la invencion como un ingrediente activo en un portador farmaceuticamente aceptable. En el agente profilactico de la invencion, se prefiere una suspension o una solucion acuosa que contiene el anticuerpo disenado, amortiguado preferiblemente en pH fisiologico, en una forma lista para la inyeccion. La composicion para la administracion parenteral comprendera comunmente una solucion de antagonista o anticuerpo de la invencion o una combinacion de los mismos disueltos en un portador farmaceuticamente aceptable, preferiblemente un portador acuoso. Una variedad de portadores acuosos se puede utilizar, por ejemplo, 0.9% solucion salina, 0.3% glicina, y similares. Estas soluciones son esteriles y generalmente libres de materia en particulas. Estas soluciones se pueden esterilizar por tecnicas de esterilizacion convencionales bien conocidas (por ejemplo, filtracion). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmaceuticamente aceptables segun lo requerido para aproximarse a las condiciones fisiologicas tal como el ajuste del pH y la amortiguacion de los agentes, etc. La concentracion del antagonista o anticuerpo de la invencion en tal formulacion farmaceutica puede variar ampliamente, es decir, menos de aproximadamente 0.5%, generalmente a o por lo menos aproximadamente 1% a maximo 15 o 20% en peso y se seleccionara principalmente en base a volumenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo al modo particular de administracion seleccionada.

Asi, una composicion farmaceutica de la invencion para la inyeccion intramuscular se podria preparar para que contenga 1 ml de agua amortiguada de manera esteril, y entre aproximadamente 1 ng a aproximadamente 100 mg, por ejemplo aproximadamente 50 ng a aproximadamente 30 mg o mas preferiblemente, aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg, de un antagonista o anticuerpo de la invencion. Similarmente, una composicion farmaceutica de la invencion para la infusion intravenosa se podria elaborar para que contenga aproximadamente 250 ml de la solucion de Ringer esteril, y aproximadamente 1 mg a aproximadamente 30 mg y preferiblemente 5 mg a aproximadamente 25 mg de un anticuerpo disenado de la invencion. Los procedimientos acetales para preparar las composiciones administrables de manera parenteral son bien conocidos o seran evidentes para los expertos en la tecnica y se describen mas detalladamente en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania. Para la preparacion de las formulaciones de anticuerpo administrables de manera intravenosa de la invencion, ver Lasmar U y Parkins D "The formulation of Biopharmaceutical products", Pharma. Sci. Tech. today, paginas 129-137, Vol. 3 (3 de abril de 2000), Wang, W "Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals", Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188, Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B ed Ahem T. J., Manning M. C1 New York, NY: Plenum Press (1992), Akers.M.J. "Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations", J. Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300, Imamura, K y col. "Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state", J Pharm Sci 92 (2003) 266-274,lzutsu, Kkojima, S. "Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying", J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 10331039, Johnson, R, "Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization", J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922. Ha, E Wang W, Wang Y.j. "Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability", J. Pharm Sci, 91, 2252-2264, (2002).

Se prefiere que el agente terapeutico de la invencion, cuando esta en una preparacion farmaceutica, este presente en formas de dosis unitaria. La dosis apropiada terapeuticamente efectiva se puede determinar facilmente por los expertos en la tecnica. Para trata con efectividad el infarto cerebral y otras enfermedades neurologicas en un humano, una dosis de hasta 700 mg por 70 kg de peso corporal de un antagonista o anticuerpo de esta invencion, se debe administrar de manera parenteral, preferiblemente i.v. o i.m. (intramuscular). Tal dosis se puede, en caso de ser necesario, repetir en intervalos de tiempo apropiados seleccionados como apropiados por un medico. Segun lo descrito en los ejemplos, los presentes inventores han podido demostrar un efecto positivo sobre la recuperacion funcional en el modelo rata, cuando los anticuerpos de la invencion fueron administrados de manera intravenosa.

Los anticuerpos descritos en la presente memoria se pueden liofilizar para el almacenamiento y reconstitucion en un portador conveniente antes del uso. Se ha mostrado que esta tecnica es efectiva con las inmunoglobulinas convencionales y se pueden utilizar las tecnicas de liofilizacion y reconstitucion conocidas en la tecnica.

Los anticuerpos de la invencion tambien se pueden utilizar en combinacion (es decir simultanea, secuencialmente o por separado) con un factor neurotrofico tal como factor de crecimiento de nervio (NGF, por sus siglas en ingles), por ejemplo factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF, por sus siglas en ingles), agentes anti-inflamatorios tal como corticoesteroides, y/o tPA. Las combinaciones de un anticuerpo de NOGO de la invencion y por ejemplo tPA se pueden determinar en el modelo MCAO establecido en los ejemplos posteriores.

En otro aspecto, la invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo anti-NOGO de la presente invencion o un fragmento funcional del mismo y un portador farmaceuticamente aceptable para el tratamiento o profilaxis del infarto cerebral y otras enfermedades neurologicas.

En aun un aspecto adicional, la invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo anti-NOGO de la presente invencion o un fragmento funcional del mismo y un portador farmaceuticamente aceptable para inhibir la neurodegeneracion y/o para promover la recuperacion funcional en un paciente humano que padece,

o esta en riesgo de desarrollar, infarto cerebral u otra enfermedad neurologica.

Los anticuerpos de la invencion se pueden usar en procedimientos de tratamiento para ralentizar o detener la progresion y/o el inicio de la enfermedad de Alzheimer ademas del (o como alternativa al) tratamiento de la enfermedad establecida en un paciente humano.

Las enfermedades o trastornos neurologicos segun lo utilizado anteriormente incluyen, pero no se limitan a lesion traumatica del cerebro, lesion de la medula espinal, demencias frontotemporales (tauopatias), neuropatia periferica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis multiple y en particular la enfermedad de Alzheimer.

Los anticuerpos de la invencion se pueden usar tambien en un procedimiento para promover el brote axonal, el cual comprende la etapa de poner en contacto un axon humano con un anticuerpo anti-NOGO. Este procedimiento se puede realizar in vitro o in vivo, preferiblemente el procedimiento se realiza in vivo.

Segun lo utilizado en la presente memoria, el termino "recuperacion funcional" se refiere un mejoramiento motriz y/o sensorial y/o del comportamiento en un sujeto despues de por ejemplo un suceso acontecimiento o una lesion isquemica o un inicio de los sintomas clinicos. La recuperacion funcional en humanos se puede evaluar por los instrumentos disenados para medir las funciones neurologicas elementales tal como fuerza motriz, sensacion y coordinacion, las funciones cognoscitivas tal como memoria, habla y la capacidad de seguir indicaciones, y las capacidades funcionales tal como actividades basicas de la vida diaria o actividades utiles. La recuperacion de la funcion neurologica elemental se puede medir con los instrumentos tal como NIH Stroke Scale (NIHSS), la recuperacion de la funcion cognoscitiva se puede medir con las pruebas neuropsicologicas tal como Boston Name Test, Trail-making Tests, y California Verbal Learning Test, y las actividades de la vida diaria se pueden medir con los instrumentos tal como la escala ADCS/ADL (Alzheimer's Desease Clinical Studies/Acitivities of Daily Living) o la Bristol Activities of Daily Living Scale, todas las pruebas y escalas conocidas en la tecnica.

Ejemplo 1. Construccion y Expresion de los Anticuerpos Anti-NOGO Humanizados

Los constructos de VH y de VL de murino y humanizados fueron preparados nuevamente por elaboracion de oligonucleotidos traslapados que incluyen los sitios de restriccion para clonarse en los vectores mamiferos de expresion de RId y RIn asi como una secuencia senal humana. Los sitios de restriccion Hind III y Spe I fueron introducidos para estructurar el dominio de VH que contiene la secuencia senal de CAMPATH-1H para clonarse en RId que contenia la region constante mutada humana y1. Los sitios de restriccion Hind III y BsiWI fueron introducidos para estructurar el dominio VL que contiene la secuencia senal de CAMPATH-1H para clonarse en RIn que contiene la region constante humana kappa.

La secuencia senal de CAMPATH-1H: MGWSCIILFLVATATGVHS (SEC ID NO: 82). Similarmente una version quimerica de 11C7 fue generada (ver el documento WO04/052932). La secuencia de dominio variable de cadena pesada (derivado de SEC ID NO: 43 del documento WO04/052932) y la secuencia de dominio variable de cadena ligera (derivada de SEC ID NO: 44 del documento WO04/052932) fueron preparados nuevamente por la elaboracion de los oligonucleotidos traslapados. Los sition de restriccion Hind III y Spel fueron introducidos para estructurar el dominio VH para clonarse en RId que contiene la region constante mutada humana y1. Los sitios de restriccion Hind lll y BsiWI fueron introducidos para estructurar el dominio VL para clonarse en RIn que contiene la region constante humana kappa.

Ejemplo 2. Expresion del Anticuerpo en Celulas CHO

Los plasmidos RId y RIn que codifican las cadenas pesadas y ligeras respectivamente fueron co-transfectados temporalmente en las celulas CHO y expresados a escala pequena o escala grande para producir el anticuerpo. Los mismos plasmidos fueron alternativamente co-transfectados en las celulas CHO por electroporacion y una poblacion policlonal estable de celulas que expreso el anticuerpo apropiado, fue seleccionada usando un medio libre de nucleosido. En algunos casos el anticuerpo contenido en el supernadante fue probado, en otros casos el anticuerpo recombinante fue recuperado y purificado por cromatografia de afinidad en sefarosa de proteina A.

Ejemplo 3, Anticuerpo Anti-NOGO Humanizado Unido a NOGO

GST-NOGO-A56 humana (SEC ID NO: 76) a 1 1g/ml en PBS se recubrio sobre placas Nunc lmmunosorp (100 1l por pozo) a 4°C durante la noche. Los pozos fueron enjuagados una vez con TBS + 0.05% Tween (TBST) despues se incubaron con 2% BSA en TBST para bloquear los sitios de union no especificos a temperatura ambiente durante 1 hora. Los anticuerpos fueron diluidos en TBST + 2% BSA 10 a 10 g/ml y 1/2 diluciones se hicieron a partir de esto. Los anticuerpos fueron agregados a los pozos pro duplicado e incubados a temperatura ambiente durante 1 hora. Los pozos fueron lavados tres veces con TBST despues fueron incubados con el conjugado de peroxidasa kappa anti-humano (1:2000) durante 1 hora. Los pozos fueron lavados tres veces con TBST y despues incubados con 100 1l sustrato de peroxidasa de OPD (Sigma) por pozo durante 10 minutos. La reaccion de color fue detenida por la adicion de 25 1l H2SO4 concentrado. La densidad optica a 490 nm fue medida usando un lector de placa. Los valores anteriores leidos en los pozos sin anticuerpo fueron restados.

Las figuras 1-5 ilustran la union dependiente de la dosis de los anticuerpos humanizados en comparacion a la quimera (llamada HcLc que es la quimera de 2A10 (que comprende el 2A10 VH de murino (SEC ID NO: 7) y VL (SEC ID NO: 8) y las regiones constantes de IgG humano)) a NOGO-A56 humana (ver el ejemplo 6 para los detalles) en un analisis de ELISA. El eje Y muestra la densidad optica medida (OD, por sus siglas en ingles) a 490 nm, una medicion cuantitativa del anticuerpo capturado en los pozos. El eje X muestra la concentracion del anticuerpo usado (mcg/ml) por pozo en cada punto de datos.

El material del anticuerpo usado en las figuras 1, 3, 4 y 5 fue generado de transfecciones temporales a escala pequena. Los niveles de IgG humano en el supernadante son cuantificados por ELISA (ejemplo 4). Para la figura 2, el material usado fue el anticuerpo purificado (ver el ejemplo 2) generado por el sistema de expresion policlonal o por las transfecciones temporales a gran escala. En estos casos, los niveles de IgG fueron cuantificados por ELISA y densidad optica.

En otro experimento, el material del anticuerpo (en forma de supernadante de cultivo de celulas CHO) fue generado a partir de las transfecciones temporales a escala pequena (por triplicado) para los siguientes anticuerpos humanizados: H16L16, H17L16, H18L16, H16L18 y el anticuerpo quimerico HcLc. Los resultados de este experimento son de acuerdo a los datos presentados en las figuras 1-5 a excepcion de H17L16 que se realizo menos adecuadamente que lo mostrado en las figuras 1A y la figura 2. Mientras que esta observacion no se pueda explicar, se debe observar que las conclusiones son contrarias a otro experimento con el material flotante (ver la figura 1A) y a un experimento que usa el material purificado H17L16 (la figura 2), ambos experimentos indicaron que H17L16 muestra la union comparable a las otras variantes optimizadas.

Ejemplo 4. Protocolo de Cuantificacion del Anticuerpo

Las placas Nunc lmmunosorp se recubrieron con el anticuerpo capturado H19 (cadena anti-IgG humano de cabra, Sigma # 13382) a 2 1g/ml en amortiguador de bicarbonato (Sigma # C3041) y se incubaron durante la noche a 4°C. Las placas fueron lavadas dos veces con TBS que contiene 0.05% Tween20 (TBST) y bloqueadas con 200 1l TBST que contiene 2% BSA (amortiguador de bloqueo) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas dos veces con TBST. Los supernadantes del cultivo tisular que contienen el anticuerpo fueron titulados a traves de la placa en etapas de dilucion de 2 veces en amortiguador de bloqueo y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas fueron lavadas tres veces con TBST. El anticuerpo H23 conjugado con HRP (cadena kappa antihumano de cabra, sigma # A7164) fue diluido 1:2000 en TBST y 100 1l se agregaron a cada pozo. Las placas fueron incubadas a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas fueron lavadas tres veces con TBST y desarrolladas con 100 1l de sustrato Fast-OPD (Sigma # P9187). Se dejo desarrollar el color durante 5-10 mins momento despues de tal tiempo se detuvo el ELISA con 25 1l 3M H2SO4. La absorbencia a 490 nM fue leida de la placa y la concentracion del anticuerpo fue determinada por referencia a una curva estandar.

Ejemplo 5. Protocolo de ELISA de Competencia del Anticuerpo

GST-NOGO-A56 humano (SEC ID NO: 76) a 0.1-1.0 1g/ml en PBS se recubrio sobre las placas Nunc lmmunosorp (100 1l por pozo) a 4°C durante la noche o a 37°C durante 1 hora. Los pozos fueron enjuagados tres veces con PBS despues se incubaron con 1% de BSA en PBS (amortiguador de bloqueo) para bloquear los sitios de union no especificos a temperatura ambiente durante 2 horas. Al mismo tiempo, fue hecha una mezcla 50:50 de anticuerpos. El anticuerpo 2A10 de murino fue agregado a una concentracion final de 0.5 o 1.0 mcg/ml en amortiguador de bloqueo. Los anticuerpos quimericos (regiones variables de raton clonadas sobre una region constante mutada de IgG1 Fc humano) fueron agregados a una concentracion final de 0-25 mcg/ml en amortiguador de bloqueo. El amortiguador de bloqueo fue eliminado de las placas y 100 1l de la mezcla 50:50 de anticuerpos fueron agregados durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pozos fueron lavados tres veces con PBS despues incubados con 100 1l de conjugado de peroxidasa de inmunoglobulinas de anti-raton policlonales de conejo (diluidos a 1:2000 en amortiguador de bloqueo, DakoCytomation #P0260) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pozos fueron lavados tres veces con PBS y despues incubados con 100 1l sustrato de peroxidasa de OPD (Sigma # P9187) o sustrato de TMB (Sigma # T8665) por pozo durante 10-30 minutos. La reaccion de color de detuvo por la adicion de 25 1l H2SO4 concentrado. La densidad optica a 490 nm (OPD) o 450 nm (TMB) fue medida usando un lector de placa.

En el primer experimento (figura 7A), las placas fueron recubiertas con GST-NOGO-A56 humana a 0.5 1g/ml en PBS durante la noche a 4°C y las placas fueron desarrolladas con sustrato de TMB. En este experimento, el anticuerpo 2A10 de murino fue determinado en combinacion con HcLc (la forma quimerica de 2A10), 11C7, un anticuerpo quimerico de control de isotipo y un testigo. En el segundo experimento (figura 7B), las placas fueron recubiertas con GST-NOGO-A56 humana a 0.5 ug/ml en PBS a 37°C durante 1 hora y las placas fueron desarrolladas con sustrato de OPD. En este experimento, el anticuerpo 2A10 de murino fue determinado en combinacion con HcLc, 11C7, un control de isotipo y el anticuerpo H16L18 purificado.

Ejemplo 6. Produccion del Fragmento NOGO-A (NOGO-A56. SEC ID NO: 76)

Una secuencia de ADNc que codifica los aminoacidos 586-785 (MQESLYPAAQLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAP LNSAVPSAGASVIQPSSSPLEASSVNYESIKHEPENPPPYEEAMSVSLKKVSGIKEEIKEPENINAALQETEAPYISIACD LIKETKLSAEPAPDFSDYSEMAKVEQPVPDHSELVEDSSPDSEPVDLFSDDSIPDVPQKQDETVMLVKESLTETSFES MIEYENKE - SEC ID NO: 76) de NOGO-A humana fue clonada en los sitios de BamHI-Xhol de pGEX-6P1 para generar una proteina de fusion etiquetada con GST designada como NOGO-A56. El plasmido fue expresado en las celulas BL21 en el medio 2XTY con 100 1g/ml de ampicilina despues de la induccion con IPTG a 0.5 mM a 37°C durante 3 horas. Los granulos celulares fueron lisados por tratamiento sonico y la proteina de fusion se purifico usando glutationa-sefarosa (Amersham Pharmacia) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. La proteina purificada fue eluida usando glutationa reducida y se dializo ampliamente contra PBS, se cuantifico con estandares de BSA y un manchado con BioRad coomassie se baso en el analisis de proteina y despues se almaceno en alicuotas a -8°C.

Ejemplo 7. Analisis BiaCore de los Anticuerpos Monoclonales Anti-NOGO Humanizados

La cinetica de union de los anticuerpos monoclonales purificados anti-NOGO (mAb) a NOGO-A humana expresada de manera recombinante (GST-NOGO-A56 humana) fue analizada usando el biosensor Biacore3000. El chip de hNOGO-A fue preparado como sigue:

Procedimiento

hNOGO (GST-NOGO-A56 humana) fue inmovilizada en un chip de CM5 por el acoplamiento de amina primaria usando el programa Biacore Wizard disenado para los niveles de inmovilizacion detectados. La superficie del sensor CM5 fue activada haciendo pasar una solucion de 50 mM N-hidroxi-succinimida (NHS) y 200 mM carbonida de N

5 etil-N'-dimetilaminopropilo (EDC). Entonces hNOGO en amortiguador de acetato de sodio, pH 5.0 o pH 4.5, se hizo pasar sobre el chip y se inmovilizo. Despues de que la inmovilizacion fuera completada cualquier ester aun activado fue bloqueado por una inyeccion de 1 M clorhidrato de etanolamina, pH 8.5.

Los mAbs anti-NOGO fueron diluidos en HBS-EP (10 mM HEPES1 pH 7.4, 150 mM NaCI, 3 mM EDTA, y 0.005% tensioactivo P-20) y los estudios de union fueron realizados a un intervalo de las concentraciones definidas del

10 anticuerpo. Todas la ejecuciones fueron referidos contra una superficie de sensor vacia (una que habia sido activada y bloqueada segun lo descrito anteriormente pero no tenia ninguna adicion de ligando). El analisis de union fue realizado usando la version 4.1 del programa de analisis cinetico BIAevaluation. El analisis Biacore de otros anticuerpos de la invencion esencialmente siguio el mismo protocolo segun lo descrito en la presente.

Resultados - Tabla 8

15 Promedio (+/-desviacion estandar) de los cuatro experimentos separados

Anticuerpo

ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM)

HcLc

2,70e6 (2,7e5) 3,78e-3 (7,0e-4) 1,41 (0,3)

H6L13

1,82e6 (3,5e5) 1,37e-2 (2,0e-3) 7,68 (1,2)

H16L16

4,37e6 (4,5e5) 5,54e-3 (1,4e-3) 1,26 (0,2)

H16L18

4,18e6 (4,1e5) 5,52e-3 (9,0e-4) 1,33 (0,2)

H17L16

3,38e6 (1,3e5) 6,10e-3 (1,3e-3) 1,82 (0,4)

H18L16

3,64e6 (3,5e5) 5,86e-3 (9,0e-4) 1,62 (0,3)

H1 L11

1,73e6 (1,7e5) 3,14 e-2 (4,2e-3) 18,6 (3,7)

Resultados - Tabla 9

Los resultados mostrados son de un solo experimento a excepcion de HcLc y H6Lc donde los valores son el promedio (+/- desviacion estandar) de dos experimentos separados

Anticuerpo (numero de ejecuciones independientes)

ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM)

HcLc (2)

3,52e6 (2,8e5) 3,46e-3 (7,9e-4) 0,995 (0,3)

HcL11

3,78e6 1,34e-2 3,55

H6Lc (2)

2,17e6 (3,8e5) 2,84e-3 (1,5e-3) 2,21 (0,3)

Anticuerpo (numero de ejecuciones independientes)

ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM)

HcL13

4,8e6 9,38e-3 1,98

H6L13

2,95e6 2,33e-2 7,9

H6L6

1,2e6 2,54e-2 21,4

H10L13

1,64e6 2,12e-2 12,95

H700L11

1,19e6 2,33e-2 19,45

H5L6

1,5e6 4,7e-2 30,3

11C7

1,44e6 8,25e-5 0,057

Resultados -Tabla 10 Los resultado mostrados son de un solo experimento.

Anticuerpo

ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM)

H6L13

1,77e6 1,3e-2 7,3

H16L16

5,47e6 5,69e-3 1,0

H14L16

2,05e6 7,39e-3 3,6

H14L18

2,41e6 8,69e-3 3,6

H1 L11

1,33e6 2,84e-2 21,3

HcLc

2,62e6 4,12e-3 1,6

Ejemplo 8. Analisis BiaCore de los Anticuerpos Monoclonales de NOGO Humanizados Usando la Clasificacion de la Constante de Asociacion

El chip de hNOGO fue preparado para el analisis cinetico. Los supernadantes celulares estan donde se tomaron directamente de las transfecciones temporales de las celulas CHO-K1. Estos se hicieron pasar directamente sobre la

10 superficie de sensor y fue medida la interaccion. Un supernadante celular trasnfectado simulado fue utilizad para referirse doblemente a la eliminacion de cualquier objeto debido al medio de cultivo tisular. Todos las ejecuciones fueron referidas contra una superficie de sensor vacia (una que habia sido activada y bloqueada segun lo descrito anteriormente pero que no tuvo ninguna adicion de ligando). El analisis de union fue realizado usando la version 4.1 del programa de analisis cinetico BIAevaluation.

15 Resultados - Tabla 11

Los resultados mostrados son de un solo experimento a excepcion de H6L13, H16L16, H16L18, H1L11, HcLc y H18L16 en donde los valores mostrados son el promedio (+/- desviacion estandar) de dos o tres experimentos separados.

Anticuerpos (numero de ejecuciones independientes) Kd (1/s)

20 H14L13 1,38e-2 H15L13 9,65e-3 H16L13 9,07e-3 H17L13 9,31e-3 H18L13 9,07e-3

25 H6L13 (x3) 1,73e-2 (4,8e-3)

H16L16 (x3) 6,64e-3 (9,2e-4) H16L18 (x3) 6,09e-3 (7,4e-4) H1L11 (x3) 4,03e-2 (1,8e-2) HcLc (x2) 3,76e-3 (7,1e-4) H15L16 6,042-3 H14L16 8,9e-3 H18L16 (x2) 6,87e-3 (7,5e-4) H14L18 8,35e-3 H15L18 5,94e-3 H18L18 5,8e-3 H6L17 1,58e-2 H6L18 1,06e-2 H6L14 4,57e-2 H6L15 2,11e-2 H6L16 1,14e-2

Ejemplo �. analisis FACS de Anticuerpos Monoclonales Anti-NOGO humanizados

Las celulas IMR32 del neuroblastoma humanas fueron suspendidas nuevamente en amortiguador de manchado de FACS (PBS + 4% FCS inactivado por calor) a una densidad de 106 celulas por ml. 100 1l de esta suspension fue transferida a los pozos de una microplaca de fondo redondo de 96 pozos. 100 1l de medio A �Fix & Perm" (Caltag Laboratories, GAS001S-100) fue agregado a cada pozo y la placa fue incubada a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las celulas fueron granuladas, lavadas dos veces en amortiguador de manchado de FACS. Despues del lavado, las celulas fueron suspendidas nuevamente en 50 1l de una solucion de anticuerpos purificados anti-NOGO

o un isotipo que igualo el anticuerpo de control a una concentracion de 2X la concentracion final (0-200 1g/ml en amortiguador de manchado de FACS). 50 1l de medio B �Fix & Perm" (Caltag Laboratories GAS002S-100) fue agregado y la placa fue incubada en hielo durante 1 hora. Las celulas fueron lavadas dos veces en amortiguador de manchado de FACS antes suspenderse nuevamente en 100 1l de una solucion de un F(ab')2 de cabra especifico y1 anti-humano conjugado de PE (Sigma P-8047) en una dilusion de 1/50 o 1/100. Las celulas se incubaron durante 1 hora en hielo. Las celulas fueron granuladas y lavadas 3 veces en amortiguador de manchado de FACS y las celulas se suspendieron nuevamente en n 100 1l del el mismo amortiguador. 100 1l de medio B �Fix & Perm" fue agregado para fijar las celulas para los experimentos mostrados en las figuras 6 y 13. 100 1l de BD CeIIFIX fue agregado para fijar las celulas para los experimentos mostrados en la figura 14. El grado de manchado fue determinado por la cartometria de flujo usando un citometro de flujo Becton Dickinson FACScan. Los controles de igualacion de isotipo fueron utilizados como referencia.

Los resultados se muestran en la figura 6A a F. La totalidad de los datos mostrados ilustran que el anticuerpo HcLc (de 2A10) proporciona una senal fuerte en este analisis de FACS, lo cual indica la union fuerte a NOGO expresado de celulas humanas. Los datos tambien muestran que las versiones humanizadas de esta quimera pueden conservar esta propiedad. El anticuerpo H20L16 supera constantemente a 11C7 en este analisis, mientras que el anticuerpo quimerico 2A10, y otras versiones humanizadas del mismo, superan constantemente 11C7 en este analisis o son comparables al mismo.

Ejemplo 1�. Anticuerpos Monoclonales Humanizados Anti-NOGO Adicionales

Siguiendo las tecnicas descritas en los ejemplos 1 y 2, fue producido un numero de anticuerpos monoclonales adicionales. La actividad de union de estos anticuerpos fue probada por BIAcore, ELISA y FACS.

10.1 BIAcore

De acuerdo a las metodologias descritas en el ejemplo 7, se muestran los datos de los anticuerpos anti-NOGO adicionales en las siguientes tablas 13, 14, 15 y 17 (material de anticuerpo purificado) y tabla 16 (material flotante).

Resultados - Tabla 13

Los resultados mostrados son de un solo experimento. En este experimento, el valor obtenido para H16L16 no fue el comun de los valores obtenidos en otros experimentos (que exhiben comunmente KD(nM) de aproximadamente 1 (ver las tablas 8 y 10)).

Anticuerpo

ka(1IMs) kd (1/s) KD (nM)

HcLc

2,6e6 4,4e-3 1,7

H20L 16

4,4e6 7,3e-3 1,7

H22L16

4,ge6 6,ge-3 1,47

H23L16

1,ge6 6,4e-3 3,8

H24L 16

1,ge6 6,ge-3 3,7

H6L13

2,2e6 1,4e-2 6,4

H1L11

1,4e6 3,1e-2 22,3

H16L16

1,2e6 4,0e-3 3,4

Resultados - Tabla 14 Los resultados mostrados son de un solo experimento.

Anticuerpo

ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM)

H1L11

1,34e6 2,82e-2 21,0

H6L13

2,02 e6 1,57e-2 7,76

HcLc

2,46 e6 3,5e-3 1,42

H20L16

5,24 e6 8,47 e-3 1,61

H22L16

5,83 e6 7,67 e-3 1,32

H23L16

2,95 e6 5,87 e-3 1,99

H24L16

2,3 e6 5,72 e-3 2,493

Resultados - Tabla 15 Los resultados mostrados son de un solo experimento.

Anticuerpo

ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM)

H1L11

1.19E6 2.19E-2 18.4

H6L13

1.91E6 1.55E-2 8.1

HcLc

2.32E6 3.69E-3 1.59

H22L 16

5.69E6 7.59E-3 1.33

H16L13

4.76E6 1.21 E-2 2.53

H20L13

5.25E6 1.6E-2 3.06

Resultados - Tabla 16 Los resultados mostrados son de un solo experimento. Los datos son la clasificacion de la constante de disociacion basada en el material de supernadante a partir de la transfeccion temporal a escala pequena. 19

Anticuerpo

Constante de disociacion: kd (1/s)

H23Lc

3,42E-03

H24Lc

3,83E-03 5

HcLc

3,92E-03

H22Lc

4,67E-03

H20Lc

5,07E-03

H16L18

5,66E-03

H21Lc

5,69E-03 10

H16L16

5,77E-03

H24L16

5,85E-03

H19Lc

5,95E-03

H23L16

6,06E-03

H20L16

7,18E-03 15

H22L16

7,78E-03

H19L16

8,73E-03

H23L13

9,56E-03

H24L 13

9,96E-03

H20L13

1,20E-02 20

H21L13

1,20E-02

H19L13

1,30E-02

H16L13

1,38E-02

H1L11

1,96E-02

Ta��a 1�

Los resultados son de 12 ejecuciones independientes, Los datos mostrados son la desviacion promedia y estandar de las 12 ejecuciones,

Anticuerpo

Ka kd KD(nM)

H20L16

5,43e6 (1,77e5) 1,02e-2 (1,56e-3) 1,86(0,16)

HcLc

3,92e6( 4,7 4e5) 7,54e-3(1,90e-3) 1,90(0,18)

10,2 ELISA

30 Basado en las metodologias descritas en el ejemplo 3, los datos adicionales sobre los anticuerpos de NOGO se muestran en las figuras 8-11, En algunos de estos experimentos, fueron utilizadas diferentes concentraciones de antigeno de recubrimiento (0,1-1,0 mcg/ml)

Resultados -figura 8, Antigeno de NOGO recubierto a 1,0 mcg/ml Resultados -figura 9, Antigeno de NOGO 5+6 recubierto a 0,1 mcg/ml Resultados -figura 10, Antigeno de NOGO recubierto a 0,5 mcg/ml Resultados -figura 11, Antigeno de NOGO recubierto a 1,0 mcg/ml

5 Resultados - figura 12A y B, antigeno de GST-human NOGO A56 recubierto a 1,0 mcg/ml, ELISA de union del material supernadante de la transfeccion temporal a escala pequena 10,3 FACS Intracelulares

Basado en las metodologias descritas en el ejemplo 9, los datos de FACS adicionales se muestran en la figura 13, Los datos adicionales se muestran en la figura 14 A a C, La figura 14A representa un solo punto de datos para cada

10 muestra, Las figuras 14A y 14B representan el promedio de muestras duplicadas,

Ejemplo 11. Analisis BiaCore de Formato Inverso de los Anticuerpos Monoclonales Anti-NOGO Humanizados

La cinetica de union de los anticuerpos monoclonales anti-NOGO purificados (mAb) a NOGO-A humana expresada de manera recombinante (GST-NOGO-A56 humana) fue analizada usando el BiacoreT100, El chip fue preparado como sigue:

15 Procedimiento

El analisis cinetico Biacore� de los anticuerpos de NOGO humanizados fue realizado usando la captura de la proteina A de los anticuerpos candidatos, Brevemente, la proteina A fue inmovilizada en un chip CM5 por el acoplamiento de amina primaria, usando los procedimientos de acoplamiento estandares, a densidades de aproximadamente 3000-4000 unidades de resonancia (RUs) usando el asistente de inmovilizacion inherente en el

20 software de las maquinas, El anticuerpo humanizado entonces se hizo pasar sobre la superficie de proteina A y se capturo a niveles de aproximadamente 200-400 RUs, despues de un periodo de estabilizacion, NOGO humana 5+6 GST se hizo pasar sobre la superficie del anticuerpo capturado a concentraciones definidas y fueron obtenidos los sensogramas de union, La regeneracion acida (100 mM H3PO4 o 10 mM glicina pH 1,5) dio lugar a eliminacion total del anticuerpo capturado de la superficie de proteina A, y no redujo significativamente la capacidad de union de las

25 superficies, Todas las curvas fueron referidas doblemente contra una inyeccion de amortiguador en lugar de NOGO humana 5+6 GST y los datos fueron ajustados al modelo de union 1:1 usando los parametros de ajuste global en el software de evaluacion Biacore T100 v1,1, Todos los experimentos se llevaron acabo en un instrumento T100,

Tabla 18 - Los Resultados mostrados son la desviacion promedio y estandar de 5 o 6 ejecuciones independientes Sumario de las Secuencias del Anticuerpo NOGO (Tabla 12)

Anticuerpo

Ka kd KD (nM)

H20L16

1,01e6(1,35e5) 3,13e-4(2,7ge-5) 0,31 (0,036)

HcLc

1,38e6(3,70e5) 5,6ge-4(1,54e-4) 0,41 (0,062)

11C7

2,85e5(4,06e4) 1,17e-4(1,22e-5) 0,42(0,065)

Descripcion

Identificador de secuencia (SEC ID NO)

Secuencia de aminoacido

Secuencia de Polinucleotido

2A10, CDR-H1

1 -

2A10, CDR-H2

2 -

2A10, CDR-H3

3 -

2A10, CDR-L 1

4 -

2A 10, CDR-L2

-

2A 10, CDR-L3

6 -

2A10, VH (murino)

7 41

2A10, VL (murino)

8 42

cadena pesada quimerica Hc

9 43

cadena ligera quimerica Lc

44

constructo humanizado de 2A10 de VH H5

11 45

constructo humanizado de 2A10 de VH H6

12 46

constructo humanizado de 2A10 de VH H700

13 47

constructo humanizado de 2A10 de VH H14

14 48

constructo humanizado de 2A10 de VH H15

49

constructo humanizado de 2A10 de VH H16

16 50

constructo humanizado de 2A10 de VH H17

17 51

constructo humanizado de 2A10 de VH H18

18 52

constructo humanizado de 2A10 de VL L6

19 53

constructo humanizado de 2A10 de VL L13

54

constructo humanizado de 2A10 de VL L14

21 55

constructo humanizado de 2A10 de VL L15

22 56

constructo humanizado de 2A10 de VL L16

23 57

constructo humanizado de 2A10 de VL L17

24 58

constructo humanizado de 2A10 de VL L18

59

constructo humanizado de cadena pesada de 2A10 H5

26 60

constructo humanizado de cadena pesada de 2A10 H6

27 61

Descripcion

Identificador de secuencia (SEC ID NO)

Secuencia de aminoacido

Secuencia de Polinucleotido

constructo humanizado de cadena pesada de 2A10 H700

28 62

constructo humanizado de cadena pesada de 2A10 H14

29 63

constructo humanizado de cadena pesada de 2A10 H15

30 64

constructo humanizado de cadena pesada de 2A10 H16

31 65

constructo humanizado de cadena pesada de 2A10 H17

32 66

constructo humanizado de cadena pesada de 2A10 H18

33 67

constructo humanizado de cadena ligera de 2A10 L6

34 68

constructo humanizado de cadena ligera de 2A10 L13

35 69

constructo humanizado de cadena ligera de 2A10 L14

36 70

constructo humanizado de cadena ligera de 2A10 L15

37 71

constructo humanizado de cadena ligera de 2A10 L16

38 72

constructo humanizado de cadena ligera de 2A10 L17

39 73

constructo humanizado de cadena ligera de 2A10 L18

40 74

Secuencia principal de Campath

75 -

Aminoacidos 586-785 de NOGO A humana (NOGO-A56)

76 -

constructo humanizado de 2A10 de VH H1

77 81

(cont.)

constructo humanizado de 2A10 de VL L11

78 82

constructo humanizado de cadena pesada de 2A10 H1

79 83

constructo humanizado de cadena ligera de 2A10 L11

80 84

constructo humanizado de 2A10 de VH H19

85 99

constructo humanizado de 2A10 de VH H20

86 100

constructo humanizado de 2A10 de VH H21

87 101

constructo humanizado de 2A10 de VH H22

88 102

constructo humanizado de 2A10 de VH H23

89 103

constructo humanizado de 2A10 de VH H24

90 104

constructo humanizado de 2A10 de VH H25

91 105

constructo humanizado de cadena pesada de 2A10 H19

92 106

Descripcion

Identificador de secuencia (SEC ID NO)

Secuencia de aminoacido

Secuencia de Polinucleotido

constructo humanizado de cadena pesada de 2A10 H20

93 107

constructo humanizado de cadena pesada de 2A10 H21

94 108

constructo humanizado de cadena pesada de 2A10 H22

95 109

constructo humanizado de cadena pesada de 2A10 H23

96 110

constructo humanizado de cadena pesada de 2A10 H24

97 111

constructo humanizado de cadena pesada de 2A10 H25

98 112

Secuencias

SEQ ID 1: 2A10 CDR-H1 SYWMH

5 SEQ ID 2: 2A10 CDR-H2 NINPSNGGTNYNEKFKS SEQ ID 3: 2A10 CDR-H3 GQGY SEQ ID 4: 2A10 CDR-L1 RSSKSLLYKDGKTYLN SEQ ID 5: 2A10 CDR-L2 LMSTRAS SEQ ID 6: 2A10 CDR-L3 QQLVEYPLT

Claims (1)

1. REIvINDICACIoNES

   1,- Un anticuerpo monoclonal que se une a NOGO humana y la neutraliza, comprendiendo el anticuerpo una region variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoacidos SEC ID: NO: 86, SEC ID: NO: 88, SEC ID: NO: 89 o SEC ID: NO: 90 y una region de cadena ligera, que tiene una secuencia de aminoacidos de SEC ID: NO: 23 o

   5 SEC ID: NO: 25, o una variante correspondiente que comprende un analogo de una region de determinacion de complementariedad (CDR) de dicho anticuerpo, en el cual dicha variante mantiene la especificidad de union y la capacidad de neutralizacion del anticuerpo del que se deriva,

   2,- Un anticuerpo monoclonal segun la reivindicacion 1, que comprende regiones VH y VL seleccionadas en la siguiente lista H20L16 (SEQ ID 86 + SEQ ID 23), H22L16 (SEQ ID 88 + SEQ ID 23), H23L16 (SEQ ID 89 + SEQ ID

   10 23), H24L16 (SEQ ID 90 + SEQ ID 23), H20L18 (SEQ ID 86 + SEQ ID 25), H22L18 (SEQ ID 88 + SEQ ID 25), H23L18 (SEQ ID 89 + SEQ ID 25), y H24L18 (SEQ ID 90 + SEQ ID 25).

   3,- Una celula huesped co-transfectada con un primer y un segundo vectores que codifican las cadenas pesada y ligera, respectivamente, de un anticuerpo segun la reivindicacion 1 o 2,

   15 4,- Una celula huesped transfectada con un vector que codifica las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo segun la reivindicacion 1 o 2,

   5,- Un procedimiento de produccion de un anticuerpo segun la reivindicacion 1 o 2, que comprende la etapa de cultivar una celula huesped segun la reivindicacion 3 o 4, y en recuperar el anticuerpo asi producido,

   6,- Un anticuerpo segun la reivindicacion 1 o 2 producido por el procedimiento de la reivindicacion 5,

   20 7,-Composiciones farmaceuticas que comprenden un anticuerpo anti-NOGO o un fragmento funcional correspondiente, segun las reivindicaciones 1, 2 o 6 junto con un diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable,

   8,- Un anticuerpo segun la reivindicacion 1, 2 o 6 para su uso en el tratamiento o la profilaxis de un paciente humano,

   Figura 2