KR20080030960A

KR20080030960A - Ｎｏｇｏ―ａ에 특이적인 인간화된 항체 및 이의 약제학적용도

Info

Publication number: KR20080030960A
Application number: KR1020077031031A
Authority: KR
Inventors: 조나단 헨리 엘리스; 폴 앤드류 함블린; 파하나 허싸인; 알랜 피터 루이스; 루쓰 맥카담; 라빈더 프린자; 폴 윌슨
Original assignee: 글락소 그룹 리미티드
Priority date: 2005-07-05
Filing date: 2006-07-03
Publication date: 2008-04-07
Also published as: EA200702634A1; EA014291B1; EP1899377B1; AU2006265276A1; HK1115598A1; PT1899377E; CY1113310T1; PL1899377T3; SG162829A1; SI1899377T1; IL188282A0; WO2007003421A2; HRP20120851T1; CA2614076A1; NZ564567A; ES2391902T3; JP2009500363A; MA29625B1; AU2006265276B2; WO2007003421A3

Abstract

본 발명은 NOGO로의 항체, 이를 함유하는 약제 제형, 및 신경학적 질환/질병의 치료 및/또는 예방에서 이러한 항체의 용도에 관한 것이다.

Description

ＮＯＧＯ―Ａ에 특이적인 인간화된 항체 및 이의 약제학적 용도 {HUMANISED ANTIBODIES SPECIFIC FOR NOGO-A AND PHARMACEUTICAL USES THEREOF}

본 발명은 면역글로불린 특히, NOGO에 결합하여 이의 활성을 중화시키는 항체, 이러한 항체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드, 이러한 항체를 함유하는 약제 제형 및 신경학적 질환의 치료 및/또는 예방에서 이러한 항체의 용도에 관한 것이다.

발작은 서방 세계에서 사망과 불구의 주요한 원인이다. 그러나, 출혈을 배제하기 위해 컴퓨터 단층촬영 (CT) 스캔 후 발병 3시간 내에 투여되어야 하는 조직 플라스미노겐(t-PA) 이외에 발작 치료를 위한 치료법이 입증되지 않았다. 오늘날까지 급성 발작의 치료에 대해 유도된 가장 치료학적인 제제 (즉, 뉴로단백질)은 우세하게 글루타메이트 수용체 및 급성 세포 괴사에 관련된 것으로 공지된 경로를 시그널링하는 이의 다운 스트림을 표적화시키는 것과 관련있다. 그러나, 오늘날까지 이러한 요법은 임상 실험에서 비성공적인 것으로 입증되었으며, 종종 용량 제한 부작용과 관련이 있다 (Hill & Hachinski, The Lancet, 352: (suppl III) 10-14 (1998)). 따라서, 혈류 중단 후 세포 괴사를 완화시키는 신규한 접근법이 요구된다. 신경보호는 상해 또는 질환 과정에 대한 신경 세포 손실을 예방하거나 완화시키기 위한 치료 능력을 뜻한다. 이는 뉴런을 직접적 표적화시키거나 간접적으로 신경교 (희소돌기아교세포를 포함) 세포 손상을 예방함으로써 달성될 수 있다.

발작의 발병 후, 일정 정도의 자발적인 기능 회복이 많은 환자에서 관찰되었으며, 이는 뇌가 상해 후 회복 및/또는 리모델 능력 (물론 제한적이지만)을 갖고 있다는 것을 암시한다. 따라서, 이러한 회복 능력을 증강시킬 수 있는 잠재력을 갖는 제제는 대뇌 허혈이 발생하고 훨씬 후에 중재를 가능하게 할 수 있다. 급성의 신경 보호를 제공하고, 기능 회복성을 증강시킬수 있는 제제는 통상의 잠재적 신경보호 요법에 비해 현저한 이점을 제공할 수 있다.

기능 회복에 기초가 되는 메카니즘은 현재 공지되어 있지 않다. 손상되거나 비손상된 축색 돌기의 발아는 하나의 가능한 메카니즘으로서 제안되었다. 그러나, 생체내 연구에서 신경영양인자로의 척수 손상 또는 발작 치료가 개선된 기능 회복 및 축색 돌기 발아를 유도하는 것으로 인증되었지만, 축색돌기 발아의 정도와 기능 회복 정도 간의 직접적인 관계가 입증되지 않았다 (Jakeman, et al. 1998, Exp.Neurol. 154:170-184, Kawamata et al. 1997, Proc Natl Acad. Sci. USA., 94:8179-8184, Ribotta, et al. 2000, J Neurosci. 20:5144-5152). 또한, 축색돌기 발아에는 생육가능한 뉴론이 요구된다. 따라서, 과도한 세포 괴사와 관련된 발작과 같은 질환에서, 발작 후 제공된 제제에 의해 부여된 기능 회복 증진은 내인성 줄기 세포의 분화, 과다 경로의 활성화, 뉴론 또는 신경교의 수용체 분포 또는 자극성 변화와 같은 축색돌기 발아 이외의 메카니즘을 통해서 유발될 수 있다 (Fawcett & Asher, 1999, Brain Res. Bulletin, 49:377-391, Horner & Gage, 2000, Nature 407 963-970).

손상 후 회복에 대한 중추신경계(CNS)의 제한된 능력은 미엘린 단백질 NOGO와 같은 축색돌기 발아 (신경돌기 성장)에 대한 억제 효과를 갖는 CNS 환경내의 분자로 인한 것일 수 있다 (Sato S. et al (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 163, 1473-1480; McKerracher L et al (1994) Neuron 13, 805-811; Mukhopadhyay G et al (1994) Neuron 13, 757-767; Torigoe K and Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262; Schafer et al (1996) Neuron 16, 1107-1113; WO9522344; WO9701352; Prinjha R et al (2000) Nature 403, 383-384; Chen MS et al (2000) Nature 403, 434-439; GrandPre T et al (2000) Nature 403, 439-444; US005250414A; WO200005364A1; WO0031235).

세가지 형태의 인간 NOGO가 확인되었다: 1192 아미노산 잔기를 갖는 NOGO-A (유전자뱅크 수탁 번호 AJ251383); NOGO-B, 추정되는 세포외 도메인에서 186번에서 1004번의 잔기가 결여된 스플라이스 변이체 (유전자뱅크 수탁 번호 AJ251384) 및 186번에서 1004번의 잔기가 결여되고, 더 작은 대안적 아미노 말단 도메인을 갖는 더 짧은 스플라이스 변이체, NOGO-C (유전자뱅크 수탁 번호. AJ251385) (Prinjha et al (2000) supra).

CNS 억제 단백질 예컨대, NOGO의 억제는 뉴론 손상을 완화시키고, 뉴론 복구 및 성장을 촉진하는 치료학적 수단을 제공하여, 발작에서 입증된 바와 같은 뉴론 손상으로부터의 회복을 잠재적으로 보조할 수 있다. 이러한 NOGO 억제제의 예로는 소분자, 펩티드 및 항체를 포함할 수 있다.

항체는 전형적으로 디설피드 결합에 의해 서로 연결된 두개의 중쇄 및 두개의 경쇄를 포함한다. 각각의 경쇄는 디설피드 결합에 의해 각각의 중쇄에 연결된다. 각각의 중쇄는 한 말단에 가변 도메인 및 이어서 많은 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 한 말단에 가변 도메인 및 이의 다른 말단에서 불변 도메인을 갖는다. 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 경쇄 불변 도메인은 중쇄의 제 1 불변 도메인과 정렬된다. 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인은 항체 항원 결합에 직접적으로 관여하지 않는다.

각 쌍의 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인은 항원 결합 부위를 형성한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인은 동일한 일반적 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4개 프레임워크 영역을 포함하며, 이의 서열은 상대적으로 보존적이며, 초가변 영역으로서 종종 불리우는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 연결된다. 4개의 프레임워크 영역은 크게 베타-시이트 형태를 채택하고 있으며, 상기 CDR은 베타-시이트를 연결하는 루프를 형성하며, 일부 경우에는 베타-시이트 구조의 일부를 형성한다. CDR은 프레임워크 영역에 근접하게 위치하며, 기타 도메인으로부터의 CDR과 함께 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. 항체의 CDR 및 프레임워크 영역은 문헌 [Kabat et al ("Sequences of proteins of immunological interest" US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office, 1987)]에 의해 결정될 수 있다.

또한, NI-220/250 즉, 신경돌기 성장의 잠재적 억제제인 미엘린 단백질 (후에 NOGO-A의 단편으로서 확인됨)에 대해 발생하는 뮤린 모노클로날 항체 IN-1은 축색돌기 재생을 증진시킨다 (Caroni, P and Schwab, ME (1988) Neuron 1 85-96; Schnell, L and Schwab, ME (1990) Nature 343 269-272; Bregman, BS et al (1995) Nature378 498-510 and Thallmair, M et al (1998) Nature Neuroscience 1 124-131). NOGO-A는 또한 IN-1에 대한 표적인 것으로 보고되었다 (Chen et al (2000) Nature 403 434-439). 척수 절개 처리된 래트로의 IN-1 Fab 단편 또는 인간화된 IN-1의 투여는 회복을 증진시킨다 (Fiedler, M et al (2002) Protein Eng 15 931-941; Brosamle, C et al (2000) J. Neuroscience 20 8061-8068).

NOGO에 결합하는 모노클로날 항체는 WO 04/052932 및 WO 2005028508에 기술되어 있다. WO 04/052932에는 높은 친화도로 특정 형태의 인간 NOGO에 결합하는 뮤린 항체 11C7이 기재되어 있다.

인간 NOGO에 결합하여 이의 활성을 억제하는 치료학적으로 유용한 모노클로날 항체를 분리하고 개발하는 것은 여전히 바람직하다. 신경퇴행 과정은 급성 질환 예컨대, 발작 (허혈 또는 출혈), 외상성 뇌손상 및 척수 손상, 및 알츠하이머병, 전두측두엽치매 (타우패시(taupathies)), 말초신경염, 파킨슨병, 크로이츠펠트-야콥 병(CJD), 정신분열증, 근위축성 측발 경화증(ALS), 다발성 경화증, 헌팅턴병, 다발성 경화증 및 봉입체근염을 포함하는 만성 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는 많은 신경학적 질환/질병의 기초가 된다. 결론적으로, 항-NOGO 모노클로날 항체는 이러한 질환/질병의 치료에 유용할 수 있다. 상기 언급된 질환/질병을 치료하기 위한 이러한 항체는 본 발명에 의해 제공되며, 하기 상세히 기술되어 있다.

WO 2005/061544에는 뮤린 모노클로날 항체 2A10 및 이의 인간화된 변이체 H1L11을 포함하는 고친화도 모노클로날 항체가 기재되어 있다.

발명의 요약

본 발명은 인간 NOGO에 결합하는 많은 모노클로날 항체를 제공한다. 본 발명은 많은 SEQ ID 넘버에 대한 기준을 제공하며, 이는 본 문서의 말미의 표 다음의 실제적 서열로 표 12에 요약되어 있다.

뮤린 항체 2A10은 높은 친화도로 인간 NOGO에 결합하며, 높은 친화도로 인간 세포주에 의해 발현되는 형태의 NOGO에 결합한다. 2A10은 과거 성공적으로 인간화되었다 (중쇄 가변 영역 H1 (SEQ ID NO. 77) 및 경쇄 가변 영역 L11 (SEQ ID NO.78)을 포함하는 H1L11). 본 발명은 인간 NOGO에 대한 도너 항체 (2A10)의 높은 친화도 부분을 보유하거나, 상기 도너 항체와 동등한 친화도를 갖는 추가적인 인간화된 모노클로날 항체를 제공한다. 특히, 본 발명의 항체는 박테리아 세포 (예컨대, 이. 콜라이)에서 발현되는 재조합 형태 및 인간에 의해 발현되는 형태의 인간 NOGO에 높은 정도로 결합한다.

2A10의 인간화된 변이체를 제공하기 위해, 본 발명자들은 인간 NOGO에 최적의 결합 친화도를 보유하는데 있어서 중요한 것으로 여겨지는 2A10 가변 영역의 프레임워크 서열내의 많은 주요 아미노산 잔기를 확인하였다. 2A10 중쇄 가변 영역 (VH)은 SEQ ID NO.7로 제공되며; 2A10 경쇄 가변 영역 (VL)은 SEQ ID NO.8로 제공된다. 뮤린 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메라 중쇄 및 경쇄는 각각 SEQ ID NO 9 및 10으로 제공된다 (두 키메라 사슬의 조합은 HcLc로 칭해진다). 당업자는 SEQ ID NO 9 및 10이 시그널 서열을 제거하기 위한 프로세싱 (예를 들어, 숙주 세포 매개된 프로세싱) 전의 중쇄 또는 경쇄를 나타낸다는 것을 이해할 것이다. 전형적으로, 프로세싱된 형태의 항체 사슬은 SEQ ID NO.9의 20번 위치 (시그널 서열의 제거 후)에서 시작될 것이며; SEQ ID NO.10의 21번 위치에서 시작될 것이다. 본 발명내에는, 시그널 서열이 포함된 모든 전장 중쇄 및 경쇄 사슬이 제공될 것이다 (모든 기타 전장 서열에 있어서, 이는 SEQ ID NO 9 및 10이 아니며, SEQ ID NO.75에 상응한다). 이러한 전장 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 유전자에 의해 트랜스펙션된 세포주에 의해 생성되는 항체는 시그널 서열을 포함하지 않아야 한다는 것이 당업자에게는 자명할 것이다.

표 1. 2A10 중쇄의 CDR

표 2. 2A10 경쇄의 CDR

CDR은 문헌[Kabat (Kabat et al. (1991) "Sequences of proetins of immunological interest" ; Fifth Edition; US Department of Health and Human Services; NIH publication No 91-3242)]에 따라 확인되었다. CDR은 바람직하게는, 카배트에 의해 규정된 것과 같으나, 코시아 및 레스크(Chothia and Lesk)에 의해 규정된 바와 같은 단백질 구조 및 폴딩의 원칙에 따라 (Chothia et al., (1989) "Conformations of immunoglobulin hypervariable regions"; Nature 342, p877-883), 추가적인 잔기가 또한 항원 결합 영역의 일부인 것으로 간주될 수 있으며, 따라서 이들도 본 발명에 포함되는 것이 자명할 것이다.

VH 및 VL 도메인 H1 및 L11은 종래 WO2005/061544에 기술되어 있으며, 표 1 및 2에 언급된 CDR이 2A10 도너 항체와 높은 상동성을 띠는 인간 가변 영역으로 이식된 결과물이며, 각각의 이식된 작제물은 추가로 카배트 위치 93번 및 94번 (H1 VH에 있어서), 또는 4번, 45번 및 46번 (L11 VL에 있어서)에서 가역갑작변이를 추가로 포함한다.

2A10 항체는 인간 NOGO에 결합할 수 있으며, 또한 마머젯(Marmoset) 및 래트 NOGO에 결합하며, 본 발명의 신규한 인간화된 항체는 이들 특성을 보유할 것으로 여겨진다. 예를 들어, H20 및 L16 가변 영역 (더욱 상세한 사항은 하기 참조)을 포함하는 모노클로날 항체는 래트, 키노몰구스(Cynomolgus) 및 스쿼럴 멍키 (Squirrel monkey) NOGO 뿐만 아니라 마머젯 NOGO에 결합한다. 마머젯 NOGO-A 단편의 서열은 SEQ ID NO. 113으로 제공된다.

표 1 및 2에서 CDR을 포함하는 항체가 본 발명에 의해 제공된다. 또한, 이러한 CDR 유사체를 포함하는 항체가 본 발명에 포함된다.

중쇄 가변 영역 (VH)

본 발명의 일 양태에서, 항체는 12, 20, 38, 40, 48, 67, 68, 70, 72, 74, 76, 79 및 91번 위치중 하나 이상에서 추가로 다수 치환된 SEQ ID NO.77의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (H1 가변 영역)을 포함하며; 여기서 각각의 치환된 아미노산 잔기는 SEQ ID NO 7(도너 항체 2A10의 중쇄 가변 영역)의 동일한 위치에서의 아미노산 잔기에 의해 대체되며, 치환 갯수는 1 내지 13개이다. 또 다른 구체예에서, 치환 갯수는 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10, 또는 11, 또는 12, 또는 13이다. 또 다른 구체예에서, 치환기 갯수는 2 내지 13, 또는 3 내지 13, 또는 4 내지 13, 또는 5 내지 13, 또는 6 내지 13, 또는 7 내지 13, 또는 8 내지 13, 또는 9 내지 13, 또는 10 내지 13 또는 11 내지 13, 또는 12 및 13이다. 또 다른 구체예에서, 치환 갯수는 1 또는 2, 또는 1 내지 3, 1 내지 4, 또는 1 내지 5, 또는 1 내지 6, 또는 1 내지 7, 또는 1 내지 8, 또는 1 내지 9, 또는 1 내지 10, 또는 1 내지 11, 또는 1 내지 12개 치환 범위에 있다.

본 문맥상, 기술된 치환기는 "가역갑작변이" 개념에 있어서 등가이며, 여기서, H1 서열내의 특이적 위치에서의 인간 프레임워크 아미노산 잔기는 2A10 도너 항체 서열내의 동일한 위치에서 아미노산 잔기로 가역갑작변이된다.

다르게 언급되지 않는 한, 특이적 서열내에 발견된 아미노산 잔기의 위치 번호 예를 들어, "위치 12번"이 본 문헌에 언급되는 경우, 당업자는 서열중의 첫번째 아미노산을 위치 "1번"으로 간주하고, 위치 1로부터 계수하여 목적하는 위치의 아미노산, 본 예에서는 서열상의 12번째 아미노산 잔기를 확인할 수 있을 것이다. 당업자는 이러한 넘버링 시스템이 항체 서열내의 아미노산 위치를 나타내는데 종종 사용되는 카배트 (Kabat) 넘버링 시스템에 상응하지 않음을 인지할 것이다. 하기 표 (표 3)는 본 발명의 치환/가역갑작변이를 나타내며, 이들의 위치 번호 및 이러한 위치 번호에 상응하는 카배트 번호를 제공한다:

표 3

H1의 인간 프레임워크 잔기 (SEQ ID NO 77)	위치 번호	위치 번호의 카배트 번호	뮤린 2A10에서 상응하는 잔기 (SEQ ID NO 7)
K	12	12	V
V	20	20	L
R	38	38	K
A	40	40	R
M	48	48	I
R	67	66	K
V	68	67	A
M	70	69	L
R	72	71	V
T	74	73	K
T	76	75	S
V	79	78	A
T	91	87	S

표 3을 참조로 하여, 일 구체예에서, 본 발명의 모노클로날 항체는 위치 79번에서 치환/가역갑작변이되어 "클래스 A"의 항체를 형성한다.

최적의 결합 친화도에 있어서, 위치 48번 및 68번의 한쌍의 아미노산 잔기는 각각 I 및 A (이들이 2A10에 존재하는 경우), 또는 각각 M 및 V (이들이 H1에 존재하는 경우)일 수 있다. 따라서, 표 3을 참조로 하여, 또 다른 구체예에서, "클래스 B" 모노클로날 항체는 위치 79번, 48번 및 68번에서 치환된 것이다.

또 다른 구체예에서 ("클래스 C"), "클래스 A" 또는 "클래스 B"의 모노클로날 항체는 추가로 위치 40번 및/또는 67번에서 치환된다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 "클래스 C" 모노클로날 항체는 위치 38번, 72번 또는 70번에서 추가로 치환되어 "클래스 D" 항체를 형성한다.

또 다른 구체예에서, "클래스 D" 모노클로날 항체는 추가로 위치 12, 20, 74, 76 또는 91번중 하나 이상의 위치에서 치환된다 ("클래스 E").

하기 표는 본 발명의 항체의 일부를 형성할 수 있는 20개의 상이한 중쇄 가변 (VH) 영역을 상세히 나타낸 것이다. 각각의 기재된 VH는 H1 VH (SEQ ID NO.77)에 기초하며, 표 (표 4)에서 언급된 바와 같이 추가로 치환되며, 여기서 관련 위치에서의 H1 잔기는 이러한 위치에서의 2A10 잔기로 치환된다 (표에서, "-"는 이 위치에서는 치환되지 않으며, 따라서, 이러한 잔기는 H1의 잔기를 그대로 보유한다는 것을 뜻한다).

표 4

따라서, SEQ ID NO: 11-18 또는 85-91중 어느 하나에 제공된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 또는 CDR의 유사체를 포함하는 이의 변이체를 포함하는 모노클로날 항체가 제공된다. 또 다른 구체예에서, SEQ ID NO: 26-33 또는 92-98중 어느 하나에 제공된 서열을 갖는 중쇄; 또는 CDR의 유사체를 포함하는 이의 변이체를 포함하는 모노클로날 항체가 제공된다.

특정 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO. 11, 12, 16, 18, 85, 86, 87 또는 91 로 제공된 VH 영역 또는 CDR의 유사체를 포함하는 이의 변이체; 또는 SEQ ID NO 26, 27, 31, 33, 92, 93, 94 또는 98로 제공된 중쇄 또는 CDR의 유사체를 포함하는 이의 변이체를 포함한다.

경쇄 가변 영역

본 발명의 한 양태에서, 항체는 위치 4, 7, 11, 19, 42, 64 및 70번중 하나 이상에서 추가로 다수 치환된 SEQ ID NO. 20 (L13 가변 영역)의 아미노산을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 각각의 치환된 아미노산 잔기는 SEQ ID NO. 8 (도너 항체 2A10의 경쇄 가변 영역)에서 동일한 위치에서의 아미노산 잔기로 대체되며, 치환 갯수는 0 내지 7개이다. 또 다른 구체예에서, 치환 갯수는 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7이다. 또 다른 구체예에서, 치환기의 수는 2 내지 7개, 또는 3 내지 7개, 또는 4 내지 7개, 또는 5 내지 7개, 또는 6 내지 7개이다. 또 다른 구체예에서, 치환 갯수는 1 또는 2이거나, 1 내지 3, 또는 1 내지 4, 또는 1 내지 5, 또는 1 내지 6의 범위내에 있다.

하기 표 (표 5)는 본 발명의 치환기/가역갑작변이를 나타내며, 이의 위치 번호 및 이러한 위치 번호에 대한 카배트 번호를 제공한다:

표 5

L13의 인간 프레임워크 잔기 (SEQ ID NO 20)	위치 숫자	카배트 번호	뮤린 2A10에서 상응하는 잔기 (SEQ ID NO 8)
M	4	4	I
S	7	7	D
L	11	11	N
A	19	19	V
Q	42	37	L
P	64	59	S
G	70	65	S

표 5를 참조하여, 또 다른 구체예에서, "클래스 X"의 본 발명의 모노클로날 항체는 위치 11번 및 19번에서 치환/갑작변이된 VL 영역을 포함한다. 또 다른 구체예에서, "클래스 X"의 모노클로날인 "클래스 Y"는 추가로 위치 42번에서 치환된 것이다. 추가의 구체예에서, "클래스 X" 또는 "클래스 Y"의 모노클로날 항체는 추가로 위치 7, 64 또는 70번에서 가역갑작변이되어 "클래스 Z"를 형성한다.

표 5를 참조로 하여, 또 다른 구체예에서, 본 발명의 모노클로날 항체는 위치 4번 (L11 (SEQ ID NO.78)에 상응)에서 치환된 VL 영역을 포함한다.

하기 표 (표 6)는 본 발명의 항체의 일부를 형성할 수 있는 7개의 상이한 경쇄 가변 (VL) 영역 또는 CDR의 유사체를 포함하는 이의 변이체를 상세히 나타내고 있다. 각각의 기재된 VL은 상기 표에서 언급된 바와 같이 선택적으로 추가로 치환된 L13 VL (SEQ ID NO. 20)이거나 이에 기초하며, 여기서, 관련 위치에서 L13 잔기는 이러한 위치에서 2A10 잔기로 치환된다 (표에서, "-"는 이 위치에서는 치환되지 않으며, 따라서, 잔기가 L13의 서열에서와 같이 그대로 보유된다는 것을 뜻한다).

표 6

따라서, SEQ ID NO: 20-25중 하나로 제공된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 또는 CDR의 유사체를 포함하는 이의 변이체를 포함하는 모노클로날 항체가 제공된다. 또 다른 구체예에서, SEQ ID NO: 35-40중 하나로 제공된 서열을 갖는 경쇄; 또는 CDR의 유사체를 포함하는 이의 변이체를 포함하는 모노클로날 항체가 제공된다.

대안적으로, SEQ ID NO. 19에 제공된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 또는 SEQ ID NO. 34에 제공된 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체가 제공된다.

특정 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO. 20, 23 및 25로 제공된 VL 영역 또는 CDR의 유사체를 포함하는 이의 변이체; 또는 SEQ ID NO. 35, 38 및 40으로 제공된 경쇄 또는 CDR의 유사체를 포함하는 이의 변이체를 포함한다.

중쇄 및 경쇄 가변 영역의 특이적 조합

본 발명은 상기 기술된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 모든 가능한 조합을 포함하는 항체 등을 제공한다. 또한, 이러한 조합 또는 하기 기술된 조합에는 관련된 특이적 서열 또는 천연 발생 CDR의 유사체를 포함하는 이의 변이체가 구상된다.

본 발명의 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일 구체예에서, 항체는

(a) 위치 12, 20, 38, 40, 48, 67, 68, 70, 72, 74, 76, 79 및 91번중 하나 이상에서 추가로 다수개 치환된 SEQ ID NO. 77 (H1 가변 영역)의 아미노산을 갖는 중쇄 가변 영역으로서, 각 치환된 아미노산 잔기는 SEQ ID NO 7 (도너 항체 2A10의 중쇄 가변 영역)의 동일한 위치에서의 아미노산 잔기로 대체되며, 치환 갯수는 1 내지 13개인 중쇄 가변 영역 (또 다른 구체예에서, 치환 갯수는 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10, 또는 11 , 또는 12, 또는 13개임); 및

(b) SEQ ID NO 20-25 또는 78로부터 선택된 경쇄 가변 영역을 포함한다.

특정 구체예는 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 하기 조합을 포함하는 항체이다: H1L13 (SEQ ID 77 + SEQ ID 20), H5L13 (SEQ ID 11 + SEQ ID 20), H6L13 (SEQ ID 12 + SEQ ID 20), H14L13 (SEQ ID 14 + SEQ ID 20), H15L13 (SEQ ID 15 + SEQ ID 20), H16L13 (SEQ ID 16 + SEQ ID 20), H17L13 (SEQ ID 17 + SEQ ID 20), H18L13 (SEQ ID 18 + SEQ ID 20), H19L13 (SEQ ID 85 + SEQ ID 20), H20L13 (SEQ ID 86 + SEQ ID 20), H21L13 (SEQ ID 87 + SEQ ID 20), H22L13 (SEQ ID 88 + SEQ ID 20), H23L13 (SEQ ID 89 + SEQ ID 20), H24L13 (SEQ ID 90 + SEQ ID 20), H25L13 (SEQ ID 91 + SEQ ID 20), H700L13 (SEQ ID 13 + SEQ ID 20), H1L16 (SEQ ID 77 + SEQ ID 23), H5L16 (SEQ ID 11 + SEQ ID 23), H6L16 (SEQ ID 12 + SEQ ID 23), H14L16 (SEQ ID 14 + SEQ ID 23), H15L16 (SEQ ID 15 + SEQ ID 23), H16L16 (SEQ ID 16 + SEQ ID 23), H17L16 (SEQ ID 17 + SEQ ID 23), H18L16 (SEQ ID 18 + SEQ ID 23), H19L16 (SEQ ID 85 + SEQ ID 23), H20L16 (SEQ ID 86 + SEQ ID 23), H21L16 (SEQ ID 87 + SEQ ID 23), H22L16 (SEQ ID 88 + SEQ ID 23), H23L16 (SEQ ID 89 + SEQ ID 23), H24L16 (SEQ ID 90 + SEQ ID 23), H25L16 (SEQ ID 91 + SEQ ID 23), H700L16 (SEQ ID 13 + SEQ ID 23), H1L18 (SEQ ID 77 + SEQ ID 25), H5L18 (SEQ ID 11 + SEQ ID 25), H6L18 (SEQ ID 12 + SEQ ID 25), H14L18 (SEQ ID 14 + SEQ ID 25), H15L18 (SEQ ID 15 + SEQ ID 25), H16L18 (SEQ ID 16 + SEQ ID 25), H17L18 (SEQ ID 17 + SEQ ID 25), H18L18 (SEQ ID 18 + SEQ ID 25), H19L18 (SEQ ID 85 + SEQ ID 25), H20L18 (SEQ ID 86 + SEQ ID 25), H21L18 (SEQ ID 87 + SEQ ID 25), H22L18 (SEQ ID 88 + SEQ ID 25), H23L18 (SEQ ID 89 + SEQ ID 25), H24L18 (SEQ ID 90 + SEQ ID 25), H25L18 (SEQ ID 91 + SEQ ID 25), H700L18 (SEQ ID 13 + SEQ ID 25).

또 다른 구체예는, 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 하기 조합을 포함하는 항체이다: H1L14 (SEQ ID 77 + SEQ ID 21), H5L14 (SEQ ID 11 + SEQ ID 21), H6L14 (SEQ ID 12 + SEQ ID 21), H14L14 (SEQ ID 14 + SEQ ID 21), H15L14 (SEQ ID 15 + SEQ ID 21), H16L14 (SEQ ID 16 + SEQ ID 21), H17L14 (SEQ ID 17 + SEQ ID 21), H18L14 (SEQ ID 18 + SEQ ID 21), H19L14 (SEQ ID 85 + SEQ ID 21), H20L14 (SEQ ID 86 + SEQ ID 21), H21L14 (SEQ ID 87 + SEQ ID 21), H22L14 (SEQ ID 88 + SEQ ID 21), H23L14 (SEQ ID 89 + SEQ ID 21), H24L14 (SEQ ID 90 + SEQ ID 21), H25L14 (SEQ ID 91 + SEQ ID 21), H700L14 (SEQ ID 13 + SEQ ID 21), H1L15 (SEQ ID 77 + SEQ ID 22), H5L15 (SEQ ID 11 + SEQ ID 22), H6L15 (SEQ ID 12 + SEQ ID 22), H14L15 (SEQ ID 14 + SEQ ID 22), H15L15 (SEQ ID 15 + SEQ ID 22), H16L15 (SEQ ID 16 + SEQ ID 22), H17L15 (SEQ ID 17 + SEQ ID 22), H18L15 (SEQ ID 18 + SEQ ID 22), H19L15 (SEQ ID 85 + SEQ ID 22), H20L15 (SEQ ID 86 + SEQ ID 22), H21L15 (SEQ ID 87 + SEQ ID 22), H22L15 (SEQ ID 88 + SEQ ID 22), H23L15 (SEQ ID 89 + SEQ ID 22), H24L15 (SEQ ID 90 + SEQ ID 22), H25L15 (SEQ ID 91 + SEQ ID 22), H700L15 (SEQ ID 13 + SEQ ID 22), H1L17 (SEQ ID 77 + SEQ ID 24), H5L17 (SEQ ID 11 + SEQ ID 24), H6L17 (SEQ ID 12 + SEQ ID 24), H14L17 (SEQ ID 14 + SEQ ID 24), H15L17 (SEQ ID 15 + SEQ ID 24), H16L17 (SEQ ID 16 + SEQ ID 24), H17L17 (SEQ ID 17 + SEQ ID 24), H18L17 (SEQ ID 18 + SEQ ID 24), H19L17 (SEQ ID 85 + SEQ ID 24), H20L17 (SEQ ID 86 + SEQ ID 24), H21L17 (SEQ ID 87 + SEQ ID 24), H22L17 (SEQ ID 88 + SEQ ID 24), H23L17 (SEQ ID 89 + SEQ ID 24), H24L17 (SEQ ID 90 + SEQ ID 24), H25L17 (SEQ ID 91 + SEQ ID 24), H700L17 (SEQ ID 13 + SEQ ID 24).

추가의 구체예는 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 하기 조합을 포함하는 항체이다: H1L6 (SEQ ID 77 + SEQ ID 19), H5L6 (SEQ ID 11 + SEQ ID 19), H6L6 (SEQ ID 12 + SEQ ID 19), H14L6 (SEQ ID 14 + SEQ ID 19), H15L6 (SEQ ID 15 + SEQ ID 19), H16L6 (SEQ ID 16 + SEQ ID 19), H17L6 (SEQ ID 17 + SEQ ID 19), H18L6 (SEQ ID 18 + SEQ ID 19), H19L6 (SEQ ID 85 + SEQ ID 19), H20L6 (SEQ ID 86 + SEQ ID 19), H21L6 (SEQ ID 87 + SEQ ID 19), H22L6 (SEQ ID 88 + SEQ ID 19), H23L6 (SEQ ID 89 + SEQ ID 19), H24L6 (SEQ ID 90 + SEQ ID 19), H25L6 (SEQ ID 91 + SEQ ID 19), H700L6 (SEQ ID 13 + SEQ ID 19), H5L11 (SEQ ID 11 + SEQ ID 78), H6L11 (SEQ ID 12 + SEQ ID 78), H14L11 (SEQ ID 14 + SEQ ID 78), H15L11 (SEQ ID 15 + SEQ ID 78), H16L11 (SEQ ID 16 + SEQ ID 78), H17L11 (SEQ ID 17 + SEQ ID 78), H18L11 (SEQ ID 18 + SEQ ID 78), H19L11 (SEQ ID 85 + SEQ ID 78), H20L11 (SEQ ID 86 + SEQ ID 78), H21L11 (SEQ ID 87 + SEQ ID 78), H22L11 (SEQ ID 88 + SEQ ID 78), H23L11 (SEQ ID 89 + SEQ ID 78), H24L11 (SEQ ID 90 + SEQ ID 78), H25L11 (SEQ ID 91 + SEQ ID 78), H700L11 (SEQ ID 13 + SEQ ID 78).

일 구체예에서, 항체는 하기 중쇄 및 경쇄 가변 영역 H6L13, H16L16, H20L13 또는 H20L16 또는 자연 발생 CDR의 유사체를 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일 구체예에서, 항체는 H20L16 또는 자연 발생 CDR의 유사체를 포함하는 이의 변이체를 포함한다.

전체 항체

또한, 본 발명은 NOGO 바람직하게는, 인간 NOGO, 더욱 바람직하게는, 인간 NOGO-A에 결합하여 이를 중화시키는 인간화된 항체를 제공한다. 더욱 특히, 본원에 기술된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 본원에 기술된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화된 항체를 제공한다.

본 발명의 인간화된 항체는 뮤린 도너 항체 2A10 또는 이의 키메라 형태(HcLc)의 친화도에 필적하는 친화도로 인간 NOGO에 결합한다. 일 구체예에서, NOGO로의 본 발명의 항체의 결합은 2A10보다 10배 이내의 친화도 상수 (KD, BioCore 기법에 의해 측정됨)를 가지며, 또 다른 구체예에서, 친화도 상수는 2A10의 3배 또는 2배 이내이며, 또 다른 구체예에서, 친화도 상수는 2A10 (또는 2A10 HcLc)와 상이하지 않다. 또 다른 구체예에서, 친화도 상수는 2A10의 친화도의 3배 또는 2배 이내이며, 오프-레이트 (off-rate)(kd)는 2A10의 10배, 또는 3배, 또는 2배 이내이며, 또 다른 구체예에서, 오프-레이트는 2A10 (또는 2A10 HcLc)와 상이하지 않다. 항체의 친화도 상수 및 오프-레이트를 측정하는 방법은 당업자에게 자명할 것이나, 본 문헌의 실시예 5에 제공된 동력 분석법 바이아코어 방법 (BiaCore method)이 본원과 관련하여 예시되어 있다. 예를 들어, 바이아코어 동력 분석법에 의해 측정되는 2A10의 친화도 상수 및 오프-레이트는 일반적으로 각각 1nM 및 1.84 x 10^-3 (kd 1/s)의 범위에 있으며; 동일한 분석에서, 본 발명의 일 구체예의 항체는 8-10nM 미만의 친화도 상수 및 1.84 x 10^-2을 가질 것이다. 유사한 방식으로, 키메라 2A10 항체 즉, HcLc의 분석시 각각 약 1 내지 2nM의 친화도 항체 및 2 x 10^-3 내지 4 x 10^-3 (kd 1/s)를 가질 것이다.

전형적 구체예에서, 본 발명의 항체는 κ 타입 인간 경쇄를 갖는 IgG 클래스, 더욱 특히, 인간 IgG1 또는 IgG4이다.

본 발명의 추가적 양태는 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 본 발명의 항-NOGO 항체 또는 이의 작용 단편을 포함하는 약제 조성물을 제공한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항-NOGO 항체 또는 이의 작용 단편을 이를 필요로하는 인간에게 투여하는 것을 포함하여, 인간에서 발작 (특히, 허혈성 발작) 및 기타 신경학적 질환 특히, 알츠하이머병 또는 다별성 경화증을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 발작 (특히, 허혈성 발작) 및 기타 신경학적 질환 특히, 알츠하이머병 또는 다발성 경화증의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조시 본 발명의 항-NOGO 항체 또는 이의 작용 단편의 용도를 제공한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항-NOGO 항체 또는 이의 작용 단편을 이를 필요로 하는 인간에게 투여하는 것을 포함하여, 발작 (특히, 허혈성 발작) 또는 기타 신경학적 질환 특히, 할츠하이머병 또는 다발성 경화증으로 고통을 받거나, 이러한 질환에 걸릴 위험성이 있는 인간의 신경퇴행을 억제하고/거나 기능 회복을 촉진시키는 방법을 제공한다.

추가의 양태에서, 본 방법은 발작 (특히, 허혈성 발작) 또는 기타 신경학적 질환 특히, 할츠하이머병 또는 다발성 경화증으로 고통을 받거나, 이러한 질환에 걸릴 위험성이 있는 인간의 신경퇴행을 억제하고/거나 기능 회복을 촉진시키기 위한 약물의 제조시 본 발명의 항-NOGO 항체 또는 이의 작용 단편의 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 외상성 신경 손상 예컨대, 척수 손상 또는 기타 신경계에 대한 외상성 손상의 치료를 위한 약물의 제조시 또는 이러한 치료의 방법에서 본 발명의 NOGO 항체의 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태 및 이점은 상세한 설명 및 이의 바람직한 구체예에서 추가로 설명되어 있다.

일 구체예에서, 전장 항체는 SEQ ID NO 34-40의 경쇄 및 SEQ ID NO 92-98의 중쇄; 특히 SEQ ID NO 35, 38 또는 40의 경쇄 및 SEQ ID NO 92, 93, 94 또는 98의 중쇄를 포함하는 항체이다. 표 7 및 12 (및 첨부된 서열)에서 전장 항체 사슬에 대해 제공된 서열 모두는 시그널 서열 제거를 위한 프로세싱 (예를 들어, 숙주 세포 매개된 프로세싱) 전의 중쇄 또는 경쇄를 나타낸다는 것이 당업자에게는 자명할 것이다. 전형적으로, 프로세싱된 형태의 항체 사슬은 위치 20번에서 시작될 것이다 (SEQ ID NO.75에 상응하는 시그널 서열 (잔기 1-19)의 제거 후). 본 발명은 기술된 폴리펩티드 서열을 갖는 항체 (처음 19개 아미노산의 시그널 서열의 제거 후)를 제공하며, 또한, 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 발현하는 숙주로부터 생성되고 정제된 형태의 항체를 제공한다.

표 7. 특이적 전장 항체는 하기를 포함한다:

일 구체예에서, 항체는 H6L13FL, H16L16 FL, H20L13 FL 또는 H20L16 FL이다. 일 구체예에서, 항체는 H20L16 FL, 또는 CDR 유사체를 포함하는 이의 변이체이다.

대안적으로, 도너 2A10 뮤린 서열내의 동일한 위치에서 발견된 정확한 아미노산 잔기에 대해 가역갑작 변이되는 상기 언급된 치환은 도너 2A10 뮤린 서열내의 동일한 위치에서 발견된 정확한 잔기의 보존적 치환인 아미노산에 대한 임의의 치환일 수 있다. 용어 "보존적 치환"은 당업자에게 자명하며, 예를 들어, 아미노산을 유사한 물리적, 화학적 또는 구조적 특성 예컨대, pH, 전하, 소수성, 방향성 등을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환하는 것을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, 불변 영역이 상보체에 결합할 수 없거나, ADCC (항체 의존성 세포 세포독성)을 조정할 수 없다는 점에 있어서 항체는 불용해성이다. 따라서, 전장 항체의 불변 영역은, 인간 IgG4와 같이 천연적으로 비세포용해성인 불변 도메인에 기초하거나, 인간 IgG1 불변 영역내에 위치 235번 및 237번에서의 치환을 불활성화시키는 것을 포함한다 (더욱 상세한 내용은 EP 0307434 참조).

도면의 간단한 설명

도 1A 및 B는 재조합 인간 NOGO에 결합하는 모노클로날 항체 상청액에 대한 ELISA 데이타이다.

도 2A 및 B는 재조합 인간 NOGO에 결합하는 정제된 모노클로날 항체에 대한 ELISA 데이타이다.

도 3A 및 B는 재조합 인간 NOGO에 결합하는 모노클로날 항체 상청액에 대한 ELISA 데이타이다.

도 4A 및 B는 재조합 인간 NOGO에 결합하는 모노클로날 항체 상청액에 대한 ELISA 데이타이다.

도 5A 및 B는 재조합 인간 NOGO에 결합하는 모노클로날 항체 상청액에 대한 ELISA 데이타이다.

도 6A 및 B는 인간 신경모세포종에 의해 발현된 인간 NOGO에 결합하는 정제된 항체에 대한 FACS 데이타이다.

도 7은 경쟁적 ELISA 결과이다.

도 8은 재조합 인간 NOGO에 결합하는 모노클로날 항체에 대한 ELISA 데이타이다.

도 9는 재조합 인간 NOGO에 결합하는 모노클로날 항체에 대한 ELISA 데이타이다.

도 10은 재조합 인간 NOGO에 결합하는 모노클로날 항체에 대한 ELISA 데이타이다.

도 11은 재조합 인간 NOGO에 결합하는 모노클로날 항체에 대한 ELISA 데이타이다.

도 12A 및 B는 재조합 인간 NOGO에 결합하는 모노클로날 항체에 대한 ELISA 데이타이다.

도 13은 인간 신경모세포종에 의해 발현된 인간 NOGO에 결합하는 정제된 항체에 대한 FACS 데이타이다.

도 14A 내지 C는 인간 신경모세포종에 의해 발현된 인간 NOGO에 결합하는 정제된 항체에 대한 FACS 데이타이다.

본 발명의 항체는 전형적으로 본래의 항체의 구조 또는 이의 작용 단편을 갖는다. 따라서, 본 항체는 전장의 항체, (Fab')₂ 단편, Fab 단편, 경쇄 다이머 또는 중쇄 다이머를 포함한다. 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4; 또는 IgM; IgA, IgE 또는 IgD 또는 이의 변형된 변이체일 수 있다. 항체 중쇄의 불변 도메인은 이렇게 선택될 수 있다. 경쇄 불변 도메인은 카파 또는 람파 불변 도메인일 수 있다. 또한, 항체는 모든 부류의 변형물 예를 들어, IgG 다이머, Fc 수용체에 더이상 결합하지 않거나 Clq 결합을 매개하지 않는 Fc 변이체를 포함할 수 있다. 항체는 또한, 항원 결합 영역 및 비면역글로불린 영역을 포함하는 WO 86/01533에 기술된 유형의 키메라 항체일 수 있다. 항원 결합 영역은 항체 경쇄 가변 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이다. 전형적으로, 항체 결합 영역은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두를 포함한다. 비면역글로불린 영역은 이의 C 말단에서 항원 결합 영역으로 융합된다. 비면역글로불린 영역은 전형적으로 비면역글로불린 단백질이며, 공지된 결합 특이성을 갖는 효소, 독소 또는 단백질일 수 있다. 이러한 유형의 키메라 항체의 두 영역은 절단가능한 링커 서열을 통해 연결될 수 있다. 이전에 기술된 바와 같은 CDR을 갖는 면역접합체가 또한 본 발명에서 고려된다.

불변 영역은 요구되는 작용성에 따라 선택될 수 있다. 일반적으로, IgG1은 상보체로의 결합을 통해 세포용해력을 입증하고/거나 ADCC (항체 의존성 세포 세포독성)을 매개할 것이다. IgG4는 비세포독성 차단 항체가 요구되는 경우 바람직할 것이다. 그러나, IgG4 항체는 생성시 불안정성을 나타낼 수 있으며, 따라서 일반적으로 더욱 안정한 IgG1을 변형시키는 것이 더욱 바람직할 수 있다. 제안된 변형은 EP0307434에 기술되어 있으며, 바람직한 변형은 위치 235번 내지 237번에서의 변형을 포함한다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 세포용해 또는 비세포용해 형태의 항체를 제공한다.

일 구체예에서, 본 발명의 항체는 상기 기술된 VH 또는 VL 서열을 갖는 전장 (즉, 두개의 중쇄 및 두개의 경쇄를 포함하는 테트라머) 비세포용해성 IgG1 항체이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명자들은 SEQ ID NO 11, 12, 16, 18 또는 85, 86, 87 또는 91의 VH; 및 SEQ ID NO 20, 23 또는 25의 VL을 갖는 전장의 비세포용해성 IgG1 항체를 제공한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 기술된 중쇄 또는 경쇄 또는 가변 영역을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 SEQ ID NO. 45-52, 99-105에 함유된 서열을 갖는 VH 및 SEQ ID NO. 53-59에 함유된 서열을 갖는 VL 영역을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 제공한다.

"NOGO"는 변이체 형태를 포함하는 NOGO 폴리펩티드를 의미한다. 이는 1192개 아미노산 잔기를 갖는 NOGO-A (유전자뱅크 수탁 번호. AJ251383); 추정의 세포외 도메인에서 잔기 186번 내지 1004번이 결손된 스플라이스 변이체인 NOGO-B (유전자뱅크 수탁 번호. AJ251384) 및 잔기 186번 내지 1004번이 결손되고, 더 작은 대안적 아미노 말단 도메인을 갖는 더 짧은 스플라이스 변이체인 NOGO-C(유전자뱅크 수탁 번호. AJ251385)를 포함하나 이에 제한되지 않는다 (Prinjha et al (2000) supra). "NOGO"에 대해 본원에 사용된 모든 용어는 특정한 형태가 지시되어 있지 않는 한, 모든 변이체 형태의 NOGO 예컨대, 기술된 NOGO-A 및 스플라이스 변이체를 포함하는 것으로 이해해야 한다.

"중화" 및 이의 다양한 품사 형태는 뉴론으로의 결합 및 신경돌기 성장의 억제를 포함하는 NOGO 작용의 전체적 또는 부분적 억제를 의미한다.

용어 Fv, Fc, Fd, Fab 또는 F(ab)₂는 이의 표준 의미대로 사용되었다 (Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)).

"키메라 항체"는 어셉터 항체로부터 유래된 경쇄 및 중쇄 불변 영역과 결합된 도너 항체로부터 유래된 자연적으로 발생하는 가변 영역 (경쇄 및 중쇄)을 함유하는 유형의 유전자 조작된 항체를 의미한다.

"인간화된 항체"는 비인간 도너 면역글로불린으로부터 유래된 CDR을 가지며, 분자의 나머지 면역글로불린-유래된 부분은 하나 (또는 그 이상)의 인간 면역글로불린(들)로부터 유래된 유형의 유전자조작된 항체를 의미한다. 또한, 프레임워크 지지 잔기는 결합 친화도를 보존하도록 변형될 수 있다 (Queens et al., Proc. natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)). 적합한 인간 어셉터 항체는 통상적인 데이타 베이스 예를 들어, KABAT® 데이타베이스, 로스 알라모스(Los Alamos) 데이타베이스 및 스위스 단백질 데이타베이스로부터 도너 항체의 누클레오타이드 및 아미노산 서열에 대한 상동성에 의해 선택될 수 있다. 도너 항체의 프레임워크 영역에 대한 상동성 (아미노산을 기초)을 특징으로 하는 인간 항체는 도너 CDR 삽입을 위한 중쇄 불변 영역 및/또는 중쇄 가변 프레임워크 영역을 제공하기에 적합할 수 있다. 경쇄 불변 또는 가변 프레임워크 영역을 부여할 수 있는 적합한 어셉터 항체가 유사한 방식으로 선택될 수 있다. 어셉터 항체 중쇄 및 경쇄가 동일한 어셉터 항체로부터 유래되어야 할 필요는 없다. 종래는 이러한 인간화된 항체를 생성시키는 여러 방법을 기술하고 있다 - 예를 들어, EP-A-0239400 및 EP-A-054951 참조.

용어 "도너 항체"는 제 1 면역글로불린 파트너에 항체의 가변 영역, CDR 또는 이의 작용 단편 또는 이의 유사체의 아미노산 서열을 부여하는 항체 (모노클로날 및/또는 재조합체)로서, 변형된 면역글로불린 코딩 영역 및 생성된 발현된 변형 항체에 도너 항체의 항원 특이성 및 중화 활성 특징을 부여하는 항체를 의미한다.

용어 "어셉터 항체"는 도너 항체에 이종성인 항체 (모노클로날 및/또는 재조합체)로서, 이의 중쇄 및/또는 경쇄 프레임워크 영역 및 이의 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 엔코딩하는 아미노산 서열 모두 (또는 임의의 부분, 바람직하게는 모든 부분)를 제 1 면역글로불린 파트너에 부여하는 항체를 의미한다. 바람직하게는, 인간 항체는 어셉터 항체이다.

"CDR"은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 고도가변성 영역인 항체의 상보성 결정 영역 아미노산 서열로서 정의내려 진다. 예를 들어, 문헌[Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest, 4h Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)] 참조. 면역글로불린 가변부에는 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR (또는 CDR 영역)이 있다. 이와 같이, 본원에 사용된 "CDR"은 모든 3개의 중쇄 CDR 또는 모든 3개의 경쇄 CDR (또는 적합하게는, 모든 중쇄 및 모든 경쇄 CDR)을 나타낸다. 항체의 구조 및 단백질 폴딩은 기타 잔기가 항원 결합 영역의 일부로서 간주된다는 것을 의미할 수 있으며, 당업자에게 이렇게 이해될 것이다. 예를 들어, 문헌[Chothia et al., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p877-883] 참조.

CDR은 항체를 항원 또는 에피토프로 결합시키기 주요 접촉 잔기를 제공한다. 본 발명의 대상 CDR은 도너 항체 가변 중쇄 및 경쇄 서열로부터 유래되며, 자연적으로 발생하는 CDR의 유사체를 포함하며, 이러한 유사체는 또한 이들이 유래되는 도너 항체와 동일한 항원 결합 특이성 및/또는 중화 능력을 공유하거나 보유한다.

"작용 단편"은 단편이 유래되는 항체와 동일하거나 유사한 중화 능력 및 동일한 항원 결합 특이성을 보유하는 부분적인 중쇄 또는 경쇄 가변 서열 (예를 들어, 면역글로불린 가변 영역의 아미노 또는 카르복시 말단에서 소수 결실)이다.

"유사체"는 하나 이상의 아미노산이 변형된 아미노산 서열이며, 여기서 상기 변형이 화학적이거나, 몇몇 아미노산 (즉, 10개 이하)의 치환 또는 재배열일 수 있으며, 이러한 변형은 아미노산 서열이 비변형된 서열의 생물학적 특성 예를 들어, 항원 특이성 및 고친화도를 보유하게 한다.

본 발명은 또한, NOGO에 대해 유도된 본 발명의 mAb로부터 유래된 Fab 단편 또는 F(ab')₂ 단편의 사용을 포함한다. Fab 단편은 전체 경쇄 및 중쇄의 아미노 말단부를 함유하며; F(ab')₂ 단편은 디설피드 결합에 의해 결합된 두개의 Fab 단편에 의해 형성된 단편이다. Fab 단편 및 F(ab')₂ 단편은 통상적인 수단 예를 들어, mAb의 적합한 단백질분해 효소, 파파인 및/또는 펩신으로의 절단, 또는 재조합 방법에 의해 수득될 수 있다. Fab 및 F(ab')₂ 단편은 이들 자체가 치료제 또는 예방제로서 유용하며, 본원에 기술된 바와 같은 재조합 또는 인간화된 항체의 형성에 유용한 CDR 서열 및 가변 영역을 포함하는 서열의 도너로서 유용하다.

본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명자들은 NOGO에 결합하여 이의 작용을 중화시키는 상기 기술된 바와 같은 하나 이상의 CDR을 갖는 디아바디(diabody)(이가 또는 이중특이성), 트리아바디, 테트라바디 및 기타 다가 scFV 단백질 종을 제공한다.

추가의 구체예에서, 본 발명의 항체는 첨가제에 부착될 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기법의 공정은 본 발명의 유전자조작 항체를 생성시키는데 사용될 수 있으며, 여기서 전장 항체 분자의 Fc 단편 또는 CH2-CH3 도메인은 효소 또는 기타 검출가능한 분자 (즉, 폴리펩티드 이펙터 또는 리포터 분자)에 의해 대체되었다.

본 발명의 항체는, 숙주 세포에서의 복제 및 발현, 및/또는 숙주 세포로부터의 분비를 조절할 수 있는 통상적인 조절 조정 서열과 작동적으로 결합되도록 항체에 대한 이들 코딩 서열을 배치시킴으로써 통상적인 발현 벡터 또는 재조합 플라스미드를 제조함으로써 생성될 수 있다. 조절 서열은 프로모터 서열 예를 들어, CMV 프로모터 및 시그널 서열을 포함하며, 이는 기타 공지된 항체로부터 유래될 수 있다. 유사하게는, 상보적 항체 경쇄 또는 중쇄를 엔코딩하는 DNA 서열을 갖는 제 2 발현 벡터가 생성될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 제 2 발현 벡터는 코딩 서열 및 선택가능한 마커가 고려되는 한은 제외하고 제 1 발현 벡터와 동일하여, 각각의 폴리펩티드 사슬이 작용적으로 발현되는 것을 가능한 보장한다. 대안적으로, 변형된 항체에 있어서 중쇄 및 경쇄 코딩 서열은 단일 벡터상에 존재할 수 있다.

선택된 숙주 세포는 제 1 및 제 2 벡터 둘 모두로 통상적인 기법에 의해 코-트랜스펙션되어 (또는 단일 벡터에 의해 단순히 트랜스펙션되어) 재조합체 또는 합성 경쇄 및 중쇄를 포함하는 본 발명의 트랜스펙션된 숙주 세포를 생성시킨다. 그 후, 트랜스펙션된 세포는 통상적인 기법에 의해 배양되어 본 발명의 유전자조작된 항체를 생성시킨다. 재조합 중쇄 및/또는 경쇄 둘 모두의 조합물을 포함하는 항체는 적합한 검정법 예컨대, ELISA 또는 RIA에 의해 배양물로부터 스크리닝된다. 유사한 통상적인 기법이 사용되어 기타 변형된 항체 및 분자를 작제할 수 있다.

본 발명의 조성물의 제조 방법 및 작제에 사용되는 클로닝 및 서브클로닝 단계에 적합한 벡터는 당업자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 통상적인 pUC 시리즈 클로닝 벡터가 사용될 수 있다. 한 벡터 pUC19는 공급체 예컨대, 아머샴(Amersham: Buckinghamshire, United Kingdom) 또는 파마시아(Pharmacia: Uppsala, Sweden)로부터 시중에서 구입가능하다. 또한, 용이하게 복제될 수 있으며, 풍부한 클로닝 부위 및 선택가능한 유전자 (예를 들어, 항생물질 내성)를 가지며, 조작이 용이한 벡터가 클로닝에 사용될 수 있다.

유사하게는, 항체의 발현에 사용된 벡터는 임의의 통상적인 벡터로부터 당업자에 의해 선택될 수 있다. 또한, 벡터는 선택된 숙주 세포에서 이종성 DNA 서열의 복제 및 발현을 유도하는 선택된 조절 서열 (예컨대, CMV 또는 RSV 프로모터)을 함유한다. 이러한 벡터는 항체 또는 변형된 면역글로불린 코딩 영역을 코딩하는 상기 기술된 DNA 서열을 함유한다. 또한, 벡터는 용이한 조작을 위해 바람직한 제한 부위를 삽입함으로써 변형된 선택된 면역글로불린 서열과 혼입될 수 있다.

발현 벡터는 또한, 이종성 DNA 서열 예를 들어, 포유동물 디히드로폴레이트 환원효소 유전자 (DHFR)의 발현을 증폭시키는데 적합한 유전자를 특징으로 할 수 있다. 기타 바람직한 벡터 서열은 예컨대, 소태 성장 호르몬(BGH) 및 베타글로빈 프로모터 서열(베타글로프로)로부터의 폴리 A 시그널 서열을 포함한다. 본원에 유용한 발현 벡터는 당업자에게 널리 공지된 기법에 의해 합성될 수 있다.

이러한 벡터의 성분 예를 들어, 리플리콘, 선택 유전자, 인핸서, 프로모터, 시그널 서열 등은 시중의 또는 천연 공급원으로부터 수득될 수 있거나, 선택된 숙주에서 재조합 DNA 생성물의 발현 및/또는 분비를 유도하는데 이용되는 공지된 공정에 의해 합성될 수 있다. 포유동물, 박테리아, 곤충, 효모 및 진균류 발현을 위해 당해분야에 공지된 다양한 유형의 기타 적합한 발현 벡터가 또한 본 목적을 위해 선택될 수 있다.

본 발명은 또한, 항체의 코딩 서열 또는 이의 변형된 면역글로불린 분자를 함유하는 재조합 플라스미드로 트랜스펙션된다. 이들 클로닝 벡터의 클로닝 및 기타 조직에 유용한 숙주 세포 또한 통상적인 것이다. 그러나, 가장 바람직하게는, E.coli의 다양한 균주로부터의 세포가 클로닝 벡터의 복제 및 본 발명의 변형된 항체의 작제에서 기타 단계에 사용된다.

본 발명의 항체의 발현에 적합한 숙주 세포 또는 세포주는 바람직하게는, 포유동물 세포 예컨대, NSO, Sp2/0, CHO (예를 들어, DG44), COS, 섬유아세포 (예를 들어, 3T3), 및 골수종 세포, 더욱 바람직하게는, CHO 또는 골수종 세포이다. 인간 세포가 사용될 수 있으며, 따라서 분자를 인간 글리코실화 패턴으로 변형시킬 수 있다. 대안적으로, 기타 진핵 세포주가 사용될 수 있다. 적합한 숙주 세포의 선택, 및 형질전환, 배양, 증폭, 스크리닝 및 생성물 생성 및 정제의 방법은 당해분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., cited above] 참조.

박테리아 세포는 본 발명의 재조합 Fab의 발현에 적합한 숙주 세포로서 유용한 것으로 입증될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Plueckthun, A., Immunol. Rev., 130:151-188(1992)] 참조). 그러나, 단백질이 박테리아 세포에서 비폴딩되거나 부적합하게 폴딩된 형태 또는 비글리코실화된 형태로 발현되는 경향이 있기 때문에, 박테리아 세포에서 생성된 재조합 Fab는 항원 결합력의 보유에 대해 스크리닝되어야 할 것이다. 박테리아 세포에 의해 발현된 분자가 적합하게 폴딩된 형태로 생성되는 경우, 이러한 박테리아 세포는 바람직한 숙수 세포일 것이다. 예를 들어, 발현에 사용된 E.coli의 다양한 균주는 생물학 분야에서 숙주 세포로서 널리 공지되어 있다. B.수브틸리스(subtilis), 스트렙토마이시스(Sterptomyces), 기타 바실리(bacilli) 등의 다양한 균주가 또한 본 발명에 사용될 수 있다.

요망에 따라, 당업자에게 공지된 효모 세포 균주가 또한 이용가능하며, 숙주 세포 및 곤충 세포 예를 들어, 드로소필라(Drosophila) 및 레피돕테라(Lepidoptera) 및 바이러스 발현 시스템 또한 이용가능하다. 예를 들어, 문헌[Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press (1986) and reference cited therein] 참조.

벡터를 작제시킬 수 있는 일반적 방법, 본 발명의 숙주 세포를 생성시키는데 요구되는 트랜스펙션 방법, 및 이러한 숙주 세포로부터 본 발명의 항체를 생성시키는데 필요한 배양 방법은 모두 통상적인 기법에 해당한다. 전형적으로, 본 발명의 배양 방법은 일반적으로, 세포를 혈청 비함유 현탁액중에 배양하는 혈청 비함유 배양법이다. 마찬가지로, 일단 생성되면, 본 발명의 항체는 암모늄 설포이트 침전, 친화도 칼럼, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하는 당업계의 표준 공정에 따라 세포 배양물로부터 정제될 수 있다. 이러한 기법은 본 기술 분야에 해당되며, 본 발명을 제한하지 못한다. 예를 들어, 변형된 항체의 제법은 WO 99/58679 및 WO 96/16990에 기술되어 있다.

항체 발현의 또 다른 방법은 U.S 특허 제 4,873,316호에 기술된 바와 같이 유전자이식 동물에서의 발현을 이용할 수 있다. 이는 동물 카세인 프로모터를 사용하는 발현 시스템에 관한 것이데, 상기 프로모터는 포유동물에 유전자이식 혼입되는 경우, 암컷이 이의 젖에서 목적하는 재조합 단백질을 생성할 수 있게 한다.

본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 엔코딩하는 벡터로 형질전환되거나 트랜스펙션된 숙주 세포를 배양하고, 이렇게 생성된 항체를 회수하는 단계를 포함하여, 본 발명의 항체를 생성시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서,

(a) 항체의 중쇄를 엔코딩하는 제 1 벡터를 제공하는 단계;

(b) 항체의 경쇄를 엔코딩하는 제 2 벡터를 제공하는 단계;

(c) 제 1 및 제 2 벡터로 포유동물 숙주 세포 (예를 들어, CHO)를 형질전환시키는 단계;

(d) 숙주 세포로부터의 항체가 상기 배양 배지에 분비되게 하는 조건하에 단계 (c)의 숙주 세포를 배양하는 단계;

(e) 단계 (d)의 분비된 항체를 회수하는 단계를 포함하여, 인간 NOGO-A에 특이적으로 결합하여 이의 활성을 중화시키는 본 발명의 항-NOGO 항체를 생성시키는 방법을 제공한다.

바람직한 방법에 의해 일단 발현되면, 항체를 적합한 검정법을 사용하여 시험관내 활성에 대해 시험한다. 현재, 통상적인 ELISA 검정 형식이 항체의 NOGO로의 정성적 및 정량적 결합을 평가하는데 사용된다. 또한, 기타 시험관내 검정법이 일반적인 제거 메카니즘에도 불구하고 몸체에서 항체의 내구성을 평가하기 위해 수행된 후속 인간 임상 연구 전에 중화 효력을 입증하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 치료제는 예방제로서 또는 발작/발병 개시 임상 증상 후에, 또는 기타 필요에 따라 투여될 수 있다. 치료 용량 및 기간은 인간 순환계에서 본 발명의 분자의 상대적 존속 기간과 관련이 있으며, 치료할 질병 및 환자의 건강 상태에 따라 당업자에 의해 조절될 수 있다. 연장된 기간 (예를 들어, 4 내지 6 개월)에 걸친 반복된 투여 (예를 들어, 주 1회 또는 매 2주 1회)는 최대 치료 효율을 달성하는데 요구될 수 있다.

본 발명의 치료제의 투여 모드는 치료제가 숙주로 전달되는 적합한 경로일 수 있다. 본 발명의 안타고니스트 및 항체, 및 약제 조성물은 특히, 비경구 투여 즉, 피하내, 경막내, 복강내, 근내, 정맥내 또는 비내 투여에 적합할 수 있으며, 이중 정맥내 투여가 특히 바람직하다.

본 발명의 치료제는 약제학적으로 허용되는 담체중에 활성성분으로서 유효량의 본 발명의 안타고니스트 또는 항체를 함유하는 약제 조성물로서 제조될 수 있다. 본 발명의 예방제에서, 주입에 용이한 형태로 바람직하게는 생리학적 pH에서 완충된 유전자 조작된 항체를 함유하는 수성 현탁액 또는 용액이 바람직하다. 비경구 투여용 조성물은 통상적으로 약제학적으로 허용되는 담체, 바람직하게는 수성 담체중에 용해된 본 발명의 안타고니스트 또는 항체의 용액 또는 이의 칵테일을 포함할 것이다. 다양한 수성 담체 예를 들어, 0.9% 살린, 0.3% 글리신 등이 사용될 수 있다. 이러한 용액은 멸균되고, 일반적으로 미립자 물질을 함유하지 않는다. 이러한 용액은 통상적으로 널리 공지된 멸균 기법 (예를 들어, 여과)에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 예컨대, pH 조절제 및 완충제 등과 같은 대략적인 생리학적 조건에 요구되는 바와 같은 약제학적으로 허용되는 보조 물질을 함유할 수 있다. 이러한 약제 제형중의 본 발명의 안타고니스 또는 항체의 농도는 매우 다양할 수 있는데, 즉 약 0.5 중량% 미만, 일반적으로 약 1 중량% 이상 내지 15 또는 20중량%이며, 선택된 특정 투여 모드에 따라 유체 부피, 점도 등에 기초하여 우선적으로 선택될 것이다.

따라서, 근내 주입용의 본 발명의 약제 조성물은 1mL의 멸균 완충수, 약 1ng 내지 약 100mg, 예를 들어, 약 50ng 내지 약 30mg, 더욱 바람직하게는 약 5mg 내지 약 25mg의 본 발명의 안타고니스트 또는 항체를 함유하도록 제조될 수 있다. 유사하게는, 정맥내 주입용 약제 조성물은 약 250ml의 멸균 링거액, 및 약 1mg 내지 30mg, 바람직하게는 5mg 내지 25mgd의 본 발명의 유전자 조작된 항체를 함유하도록 제조될 수 있다. 비경구 투여가능한 조성물을 제조하기 위한 실제적인 방법은 널리 공지되어 있거나, 당업자에게 자명할 것이며, 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania]에 더욱 상세히 기술되어 있다. 본 발명의 정맥내 투여용 항체 제형을 제조하기 위해서는, 본원에 참고문헌으로 인용되고, 당업자가 특히 참조할 수 있는 문헌[Lasmar U and Parkins D"The formulation ofBiopharmaceutical products", Pharma. Sci. Tech. today, page 129-137, Vol. 3(3^rd April 2000), Wang,W"Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceutical",Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188, Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B edAhern T. J., Manning M. C. , New York, NY: Plenum Press (1992), Akers, M. J. "Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations", J. Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300, Imamura, K etal "Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state", J Pharm Sci 92 (2003) 266-274,zutsu, Kkojima, S."Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying", J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039, Johnson, R, "Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization", J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914- 922. Ha, E Wang W, Wang Y.j. "Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability", J.Pharm Sci, 91, 2252-2264 (2002)]을 참조하라.

약제 제조물중의 본 발명의 치료제는 단위 용량 형태로 존재하는 것이 바람직하다. 치료학적으로 효과적인 적합한 용량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 인간의 발작 및 기타 신경학적 질환을 효과적으로 치료하기 위해, 700mg/체중 70kg의 본 발명의 안타고니스트 또는 항체의 용량으로 비경구적으로 바람직하게는, 정맥내 또는 근내로 투여되어야 한다. 이러한 투여는 필요에 따라, 의사에 의해 적당한 시간 간격을 두고 적당하게 반복될 수 있다. 본 실시예에 기술된 바와 같이, 본 발명자들은 본 발명의 항체가 정맥내 투여될 경우, 래트 모델에서 작용 회복의 긍정적인 효과를 입증할 수 있었다.

본원에 기술된 항체는 저장을 위해 동결건조되고, 사용전 적합한 담체중에 재구성될 수 있다. 이러한 기법은 통상적인 면역글로불린에 효과적이며, 공지된 동결건조 및 재구성 기법이 이용될 수 있다.

본 발명의 항체는 신경 성장 인자 (NGF) 예를 들어, 뇌 유래된 신경영양인자 (BDNF), 항염증제 예컨대, 코르티코스테로이드, 및/또는 tPA와 (즉, 동시에, 후속적으로 또는 별도로) 혼합될 수 있다. 본 발명의 NOGO 항체와 예를 들어, tPA의 조합은 하기 실시예의 MCAO 모델에서 평가될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 발작 및 기타 신경학적 질환의 치료 또는 예방을 위해 본 발명의 항-NOGO 항체 또는 이의 작용 단편과 약제학적을 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물을 제공한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 발작 또는 기타 신경학적 질환으로 고통받거나, 이러한 질환에 걸릴 위험성이 있는 인간에서 신경퇴행을 억제하고/거나 기능 회복을 촉진시키기 위한 본 발명의 항-NOGO 항체 또는 이의 작용 단편과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물을 제공한다.

본 발명은 추가로, 유효량의 항-NOGO 항체 또는 이의 작용 단편을 이를 필요로하는 인간에게 투여하는 것을 포함하여, 인간에서 발작 (특히, 허혈성 발작) 및 기타 신경학적 질환/질병 특히, 알츠하이머병을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명의 항체는 인간 환자에서 확인된 질환을 치료하는 것 이외에 (또는 이의 대안으로서) 알츠하이머병의 진행 및/또는 발병을 늦추거나 정지시켜 치료하는 방법에 이용될 수 있다.

추가로, 본 발명은 발작 및 기타 신경학적 질환/질병 특히, 알츠하이머병의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조시 항-NOGO 항체 또는 이의 작용 단편의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한, 유효량의 항-NOGO 항체 또는 이의 작용 단편을 이를 필요로 하는 인간에게 투여하는 것을 포함하여, 발작 또는 기타 신경학적 질환/질병 특히, 알츠하이머병으로 고통을 받거나, 이러한 질환에 걸릴 위험성이 있는 인간의 신경퇴행을 억제하고/거나 기능 회복을 촉진시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 발작 및 기타 신경학적 질환/질병 특히, 알츠하이머병으로 고통을 받거나, 이러한 질환에 걸릴 위험성이 있는 인간의 신경퇴행을 억제하고/거나 기능 회복을 촉진시키기 위한 약물의 제조에서 항-NOGO 항체 또는 이의 작용 단편의 용도를 제공한다.

본 발명은 치료학적 유효량의 항-NOGO 항체를 비경구 투여하는 단계를 포함하여, 인간에서 발작 또는 신경학적 질환/질병 특히, 알츠하이머병을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 항-NOGO 항체가 정맥내 투여된다.

본원에 이용된 바와 같이 신경학적 질환 또는 질병은 외상성 뇌손상, 척수 손상, 전두측두엽 치매(티오패시:tauopathies), 말초신경염, 파킨슨병, 헌팅턴병, 다발성 경화증 특히, 알츠하이머병을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 인간 축색돌기를 항-NOGO 항체와 접촉시키는 단계를 포함하여, 축색돌기 발아를 촉진하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 수행될 수 있으며, 바람직하게는, 생체내 수행된다.

추가의 양태에서, 환자에서 발작(특히, 허혈성 발작), 뇌손상, 척수손상, 전두측두엽 치매 (티오패시), 말초신경염, 파킨슨병, 헌틴텅병, 다발성 경화증 특히 알츠하이머병을 치료하기 위한 약물의 제조시 정맥내 투여가능한 형태의 본 발명의 항-NOGO 항체의 용도를 제공한다.

따라서, 추가의 양태에서, 치료학적 유효량의 본 발명의 항-NOGO 항체를 정맥내 투여하는 것을 포함하여, 환자에서 발작(특히, 허혈성 발작), 뇌손상, 척수손상, 전두측두엽 치매 (티오패시), 말초신경염, 파킨슨병, 헌틴텅병, 다발성 경화증 특히 알츠하이머병을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 양태에서, 치료학적 유효량의 항-NOGO 항체 (예를 들어, 본원에 기재된 CDR을 포함하는 항-NOGO 항체)를 (예를 들어, 정맥내 투여) 투여하는 것을 포함하여, 인간 피검체 (예를 들어, 환자)의 중추신경계내의 뉴런의 축색돌기 발아를 촉진시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 양태에서, 환자에서 발작(특히, 허혈성 발작), 뇌손상, 척수손상, 전두측두엽 치매 (티오패시), 말초신경염, 파킨슨병, 헌틴텅병, 다발성 경화증 및 특히, 알츠하이머병을 치료하기 위한 정맥내 투여가능한 약물의 제조시 본 발명의 항-NOGO 항체의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가의 양태에서, 치료학적 유효량의 본 발명의 항-NOGO 항체를 (예를 들어, 정맥내) 투여하는 단계를 포함하여, 발작(특히, 허혈성 발작), 뇌손상, 척수손상, 전두측두엽 치매 (티오패시), 말초신경염, 파킨슨병, 헌틴텅병, 다발성 경화증, 및 특히, 알츠하이머병에 걸린 환자 (또는 이들 질환에 민감한 환자)에서 중추신경계의 뉴런의 축색돌기 프로세스(process)를 재생시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 양태에서, 발작(특히, 허혈성 발작), 뇌손상, 척수손상, 전두측두엽 치매 (티오패시), 말초신경염, 파킨슨병, 헌틴텅병, 다발성 경화증 및 특히, 알츠하이머병에 걸린 환자 (또는 이들 질환에 민감한 환자)에서 중추신경계의 뉴런의 축색돌기 프로세스를 재생시키기 위한 정맥내 투여가능한 약제 조성물의 제조에서 본 발명의 항-NOGO 항체의 용도를 제공한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기능 회복"은 예를 들어, 허혈 또는 손상 또는 임상 증후의 발병 후에 피검체에서 운동 및/또는 지각 및/또는 행동의 개선을 의미한다. 인간에서 기능 회복은 기본적인 신경학적 기능 예를 들어, 운동 강도, 지각 및 조정, 인지 기능 예컨대, 기억, 언어 및 지시에 따라하는 능력, 및 기능력 예컨대, 일상 생활 또는 기기 조작의 기본적 활동을 측정하기 위해 고안된 장치에 의해 평가될 수 있다. 본질적인 신경학적 기능의 회복은 NIH 발작 스케일(NIHSS)과 같은 장치로 측정될 수 있으며, 인지 작용의 회복은 신경심리 평가 예컨대, 보스턴 나밍 테스트(Boston Naming Test), 트레일-메이킹 테스트(Trail-making Tests), 및 캘리포니아 버벌 러닝 테스트(California Verbal Learning Test)에 의해 측정될 수 있으며, 일상 생활의 활동은 ADCS/ADL (알츠하이머 질환 클리닉 연구/일상 생활 활동: Alzheimer's Disease Clinical Studies/Activities of Daily Living) 스케일 또는 브리스톨 액티버티 오브 데일리 리빙 스케일(Bristol Activities of Daily Living Scale)에 의해 측정될 수 있으며, 모든 시험 및 장치는 당해분야에 공지되어 있다.

실시예 1. 인간화된 항-NOGO 항체의 작제 및 발현

뮤린 및 인간화된 V_H 및 V_L 작제물을 Rld 및 Rln 포유동물 발현 벡터로의 클로닝을 위한 제한 부위 및 인간 시그널 서열을 포함하는 올리고누클레오티드의 오버랩 축적에 의해 새로이 제조하였다. Hind III 및 Spe I 제한 부위를 인간 γ1 변이된 불변 영역을 함유하는 Rld로의 클로닝을 위해 CAMPATH-1H 시그널 서열을 함유하는 V_H 도메인을 프레임하도록 유입시켰다. Hind III 및 BsiW I 제한 부위를 인간 카파 불변 영역을 함유하는 Rln으로 클로닝하기 위해 CAMPATH-1H 시그널 서열을 함유하는 V_L 도메인을 프레임하도록 유입시켰다.

CAMPATH-1H 시그널 서열: MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO:82)

동시에, 키메라 형태의 11C7을 생성시켰다 (WO04/052932 참조). 가변 중쇄 도메인 서열 (WO04/052932 Seq ID 43으로부터 유래됨) 및 가변 경쇄 도메인 서열 (WO04/052932 Seq ID 43으로부터 유래됨)을 올리고누클레오티드의 오버랩 축적에 의해 새로이 제조하였다. Hind III 및 Spel 제한 부위를 유입시켜 인간 κ1 변이된 불변 영역을 함유하는 Rld로 클로닝하기 위한 V_H 도메인을 프레이밍하였다. HindIII 및 BsiWI 제한 부위를 유입시켜 인간 카파 불변 영역을 함유하는 Rln으로 클로닝하기 위한 V_L 도메인을 프레이밍하였다.

실시예 2 . CHO 세포에서의 항체 발현

중쇄 및 경쇄를 각각 엔코딩하는 Rld 및 Rln 플라스미드를 CHO 세포에 일시적으로 공동-트랜스펙션시키고, 소규모 또는 대규모로 발현시켜 항체를 생성시켰다. 대안적으로, 동일한 플라스미드를 일렉트로포레이션에 의해 CHO 세포로 공동-트랜스펙션시키고, 적당한 항체를 발현하는 안정한 폴리클로날 세포 군집을 누클레오시드 비함유 배지를 이용하여 선택하였다. 일부 예에서, 상청액에 함유된 항체는 분석하고, 또 다른 경우에서, 재조합 항체를 회수하고, 단백질 A 세파로오스상에서의 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

실시예 3. 인간화된 항-NOGO 항체는 인간 NOGO에 결합한다

PBS중의 1㎍/ml의 GST-인간 NOGO-A56 (SEQ ID: 76)을 Nunc 면역소프 플레이트(Nunc Immunosorp plates)(웰 당 100㎕)상에 4℃에서 밤새 코팅시켰다. 웰을 TBS+0.05% 트윈 (TBST)으로 린스하고, TBST중의 2% BSA와 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켜 비특이적 결합 부위를 차단하였다. 항체를 TBST + 2% BSA로 10㎍/ml로 희석시키고, 1/2 희석물을 이로부터 제조하였다. 항체를 이중으로 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 웰을 TBST로 3회 세척한 후, 1시간 동안 항-인간 카파 퍼옥시다아제 컨쥬게이트(1:2000)로 인큐베이션시켰다. TBST로 3회 세척한 후, 웰 당 100㎕ OPD 퍼옥시다아제 기질(Sigma)과 10분 동안 인큐베이션시켰다. 25㎕의 진한 H₂SO₄를 첨가하여 발색 반응을 중단시켰다. 490nm에서의 광학 밀도를 플레이트 리더를 사용하여 측정하였다. 배경값은 항체가 처리되지 않은 웰로부터 측정하였다.

도 1-5는 ELISA 분석에서 키메라 (HcLc로서, 이는 2A10 (2A10 뮤린 VH (SEQ ID NO.7) 및 VL (SEQ ID NO.8) 및 인간 IgG 불변 영역을 포함)를 인간 NOGO-A56과 비교한 인간화된 항체의 용량-의존적 결합을 나타낸다 (더욱 상세한 내역은 실시예 6 참조). Y-축은 490nm에서 측정된 광밀도 (OD)로서, 웰중에 포획된 항체의 정량적 측정치를 나타낸다. X-축은 각 데이타 시점에서 웰당 사용된 항체의 농도 (mcg/ml)를 나타낸다.

도 1, 3, 4 및 5에 사용된 항체 물질은 소규모의 일시적 트랜스펙션으로부터 생성되었다. 상청액중의 인간 IgG 수준은 ELISA에 의해 정량화된다 (실시예 4). 도 2에 있어서, 사용될 물질은 폴리클로날 발현 시스템 또는 대규모 일시적 트랜스펙션에 의해 생성된 정제된 항체 (실시예 2 참조)이다. 이러한 경우, IgG 수준을 ELISA 및 광학 밀도에 의해 정량하였다.

또 다른 구체예에서, 하기 인간화된 항체를 위해 항체 물질 (CHO 세포 배양 상청액 형태)을 소규모의 일시적 트랜스펙션 (삼중으로)으로부터 생성시켰다: H16L16, H17L16, H18L16, H16L18 및 키메라 항체 HcLc. 이러한 실험으로부터 결과는 도 1A 및 도 2에 나타난 것보다 수행능이 훨씬 떨어지는 H17L16을 제외하고는 도 1-5에 나타낸 데이타와 일치한다. 이러한 관찰이 설명될 수는 없지만, 이는 H17l16이 다른 최적화된 변이체에 필적하는 결합을 나타낸다는 것을 시사하는 상청액 물질로의 또 다른 실험 (도 1A 참조) 및 정제된 H17L16 물질을 사용한 실험 (도 2)에 상반되는 것임에 주의해야 한다.

실시예 4. 항체 정량화 프로토콜

눈크 이뮤노소프 플레이트 (Nunc Immunosorp plate)를 비카르보네이트 완충액 (Bicarbonate buffer: Sigma #C3041)중의 2㎍/ml로 포획 항체 H19 (염소 항-인간 IgG 사슬, Sigma #13382)로 코팅하였다. 플레이트를 0.05% 트윈20 (TBST)을 함유하는 TBS로 2회 세척하고, 실온에서 1시간 동안 2% BSA을 함유하는 200㎕ TBST (블록 완충액)로 차단하였다. 플레이트를 TBST로 2회 세척하였다. 항체를 함유하는 조직 배양 상청액을 블록 완충액으로 2배 희석 단계로 플레이트에 걸쳐 적정하였으며, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 TBST로 3회 세척하였다. HRP 컨쥬게이팅된 항체 H23 (염소 항-인간 카파 사슬, Sigma #A7164)를 TBST중에 1:2000으로 희석하고, 100㎕를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 TBST로 3회 세척하고, 100㎕의 Fast-OPD 기질 (Sigma #P9187)로 발색시켰다. 5-10분 동안 발색시킨 후, 25㎕ 3M H₂SO₄로 ELISA를 중단하였다. 플레이트를 490nM의 흡광도에서 해독하고, 표준 곡선을 기준으로 하여 항체 농도를 측정하였다.

실시예 5. 항체 경쟁 ELISA 프로토콜

PBS중의 0.1-1.0㎍/ml의 GST-인간 NOGO-A56 (SEQ ID: 76)를 4℃에서 밤새 또는 37℃에서 1시간 동안 눈크 이뮤노소프 플레이트상으로 코팅시켰다 (웰당 100㎕). 웰을 PBS로 3회 린스하고, PBS중의 1% BSA (블록 완충액)과 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켜 비특이적 결합 부위를 차단하였다. 동시에, 50:50 혼합 항체를 제조하였다. 뮤린 항체 2A10을 블록 완충액중의 최종 농도 0.5 또는 1.0mcg/ml로 첨가하였다. 키메라 항체 (인간 IgG1 Fc 변이된 불변 영역상으로 클로닝된 마우스 가변 영역)를 블록 완충액중의 최종 농도 0-25mcg/ml로 첨가하였다. 블록 완충액을 플레이트로부터 제거하고, 100㎕의 50:50 혼합 항체를 1시간 동안 실온에서 첨가하였다. 웰을 PBS로 3회 세척한 후, 1시간 동안 실온에서 100㎕의 래빗 폴리클로날 항-마우스 면역글로불린 퍼옥시다아제 컨쥬게이트 (블록 완충액중에 1:2000으로 희석된, DakoCytomation #P0260)와 인큐베이션시켰다. 웰을 PBS로 3회 세척하고, 10-30분 동안 웰당 100㎕의 OPD 퍼옥시다아제 기질 (Sigma #P9187) 또는 TMB 기질 (Sigma #T8665)과 인큐베이션시켰다. 색 반응을 25㎕의 진한 H₂SO₄를 첨가함으로써 중단하였다. 490nm(OPD) 또는 450nm(TMB)에서의 광학 밀도를 플레이트 리더를 사용하여 측정하였다.

제 1 실험 (도 7A)에서, 플레이트를 PBS중의 0.5㎍/ml의 GST-인간 NOGO-A56으로 밤새 4℃에서 코팅시키고, 플레이트를 TBM 기질로 발색시켰다. 본 실험에서, 뮤린 항체 2A10을 HcLc (2A10의 키메라 형태), 11C7, 아이소타입 대조군 키메라 항체 및 블랭크 대조군과 함께 평가하였다. 두번째 실험 (도 7B)에서, 플레이트를 1시간 동안 PBS중의 0.5㎍/ml의 GST-인간 NOGO-A56으로 코팅하고, 플레이트를 OPD 기질로 발색시켰다. 본 실험에서, 뮤린 항체 2A10을 HcLc, 11C7, 아이소타입 대조군 및 정제된 H16L18 항체와 함께 평가하였다.

실시예 6. NOTO-A 단편의 생성 (NOGO-A56, SEQ ID NO:76)

인간 NOGO-A의 아미노산 586-785 (MQESLYPAAQLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAPLNSAVPSAGASVIQPSSSPLEASSVNYESIKHEPENPPPYEEAMSVSLKKVSGIKEEIKEPENINAALQETEAPYISIACDLIKETKLSAEPAPDFSDYSEMAKVEQPVPDHSELVEDSSPDSEPVDLFSDDSIPDVPQKQDETVMLVKESLTETSFESMIEYENKE - SEQ.I.D.NO:76)을 엔코딩하는 cDNA 서열을 pGEX-6P1의 BamHI-Xhol 부위로 클로닝하여 GST-태깅된 융합 단백질 NOGO-A56을 생성하였다. 플라스미드에 IPTG를 0.5mM으로 37℃에서 3시간 동안 유입시킨 후, 100㎍/ml의 암피실린을 갖는 2XTY 배지중에 BL21 세포에서 발현시켰다. 세포 펠렛을 고주파 분해에 의해 용해시키고, 제조업자의 지시에 따라 글루타티온-세파로오스 (Amersham Pharmacia)를 사용하여 융합 단백질을 정제하였다. 정제된 단백질을 환원된 글루타티온으로 용출시키고, PBS에 대해 광범위하게 투석시키고, BSA 표준 및 BioRad 코마시에를 기초로 하는 단백질 분석법을 이용하여 정량화시킨 후, -80℃에서 분취물을 저장하였다.

실시예 7. 인간화된 항 NOGO 모노클로날 항체의 바이아코어 검정

재조합 발현된 인간 NOGO-A (GST-인간 NOGO-A56)으로의 정제된 항-NOGO 모노클로날 항체 (mAb)의 결합 동력을 바이아코어3000 바이오센서 (Biacore300 biosensor)를 사용하여 검정하였다. hNOGO-A 칩을 하기와 같이 제조하였다:

방법

hNOGO (GST-인간 NOGO-A56)를 표적화된 부동화 수준에 대해 설계된 바이아코어 위자드 프로그램 (Biacore Wizard program)을 사용하여 일차 아민 결합에 의해 CM5 칩에 고정시켰다. 50mM N-히드록시-숙신이미드 (NHS) 및 200mM N-에틸-N'-디메틸아미노프로필 카르보나이드 (EDC)의 용액을 통과시켜 CM5 센서 표면을 활성화시켰다. 나트륨 아세테이트 완충액 (pH5.0 또는 pH4.5)중의 hNOGO를 칩 위로 통과시켜 부동화시켰다. 부동화 완료 후, 임의의 여전히 활성화된 에스테르를 pH 8.5의 1M 에탄올아민 히드로클로라이드를 주입하여 차단하였다.

항-NOGO mAb를 HBS-EP (10mM HEPES, pH7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA 및 0.005% P-20 계면활성제)중에 희석시켜, 결합 연구를 규정된 항체 농도 범위에서 수행하였다. 블랭크 센서 표면 (활성화되고, 상기 기술된 바와 같이 차단되었으나, 리간드를 첨가하지 않은 표면)을 기준으로 하여 수행하였다. 결합 검정은 BlA평가 카이네틱 검정 소프트웨어 버젼 4.1 (BlAevaluation kinetic analysis software version 4.1)을 사용하여 수행하였다. 본 발명의 기타 항체의 바이아코어 검정은 본질적으로 본원에 기술된 것과 동일한 프로토콜을 따른다.

결과 - 표 8

4개의 각 실험의 평균 (+/- 표준 편차)

결과 - 표 9

기재된 결과는 HcLc 및 H6Lc를 제외한 단일 실험으로부터의 결과이며, 여기서 기재된 값은 두개의 각 실험의 평균 (+/- 표준 편차)이다.

결과 - 표 10

기재된 결과는 단일 실험부터의 결과이다.

실시예 8. 오프-레이트 랭킹을 사용한 인간화된 항 NOGO 모노클로날 항체의 바이아코어 검정

동력 검정을 위한 것으로서 hNOGO 칩을 제조하였다. 세포 상청액을 CHO-K1 세포의 일시적 트랜스펙션으로부터 직접 취하였다. 이들을 센서 표면 위로 직접 통과시키고, 상호작용을 평가하였다. 모의 트랜스펙션된 세포 상청액을 이중 참조(double referencing)를 위해 사용하여 조직 배양 배지로 인한 임의의 가공물을 제거하였다. 블랭크 센서 표면 (활성화되고, 상기 기술된 바와 같이 차단되었으나, 리간드를 첨가하지 않은 표면)을 기준으로 하여 수행하였다. 결합 검정은 BlA평가 카이네틱 검정 소프트웨어 버젼 4.1을 사용하여 수행하였다.

결과 - 표 11

기재된 결과는 H6L13, H16L16, H16L18, H1L11, HcLc 및 H18L16를 제외한 단일 실험으로부터의 결과이며, 여기서 기재된 값은 두개 또는 세개의 각 실험의 평균 (+/- 표준 편차)이다.

실시예 9. 인간화된 항 NOGO 모노클로날 항체의 FACS 검정

IMR32 인간 신경모세포종 세포를 ml당 10⁶ 세포 밀도로 FACS 염색 완충액 (PBS + 4% 열 불활성화된 FCS)중에 재현탁시켰다. 100㎕의 본 현탁액을 96 웰 둥근 바닥 마이크로플레이트의 웰로 이동시켰다. 100㎕의 "픽스 앤 펌 (Fix & Perm)" 배지 A (Caltag Laboatories, GAS001S-100)을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 15분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 세포를 펠렛화시키고, FACS 염색 완충액으로 2회 세척하였다. 세척 후, 세포를 50㎕의 정제된 항-NOGO 항체 용액 또는 아이소타입 매칭된 대조군 항체 용액중에 2X 최종 농도 (FACS 염색 완충액중의 0-200㎍/ml)로 재현탁시켰다. 50㎕의 "픽스 앤 펌" 배지 B (Caltag Laboatories, GAS002S-100)을 첨가하고, 플레이트를 1시간 동안 얼음상에서 인큐베이션시켰다. 세포를 FACS 염색 완충액으로 2회 세척한 후, 1/50 또는 1/100 희석으로 100㎕의 PE 컨쥬게이팅된 항 인간 γ1 특이적 염소 F(ab')2 (Sigma P-8047) 용액에 재현탁시켰다. 세포를 얼음상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 펠렛화시키고, FAC 염색 완충액으로 3회 세척하고, 세포를 100㎕의 동일한 완충액중에 재현탁시켰다. 도 6 및 13에 도시된 실험을 위해 100㎕의 "픽스 앤 펌" 배지 B를 첨가하여 세포를 고정시켰다. 100㎕의 BD CellFIX를 첨가하여 도 14에 도시된 실험을 위해 세포를 고정시켰다. 염색 정도를 벡턴 디킨슨 FACS캔 흐름세포 분석기 (FACScan flow cytometer)를 사용하여 흐름세포분석기에 의해 측정하였다. 아이소타입 매칭된 대조군을 기준으로 사용하였다.

결과는 도 6A 내지 F에 도시되어 있다. 전체 데이타는, (2A10의) HcLc 항체가 이러한 FACS 분석에서 강한 시그널을 제공하며, 이는 인간 세포 발현된 NOGO에 대한 강한 결합을 시사한다. 또한, 데이타는 이러한 인간화된 버젼의 키메라가 이러한 특성을 보유할 수 있음을 보여준다. H20L16 항체는 본 분석에서 11C7 보다 시종일관 성능이 우세하였으며, 2A10 키메라 항체 및 이의 인간화된 버젼은 본 분석에서 11C7 보다 시종일관 성능이 우세하였거나, 이에 필적한 성능을 나타내었다.

실시예 10. 추가적인 인간화된 항-NOGO 모노클로날 항체

실시예 1 및 2에 기술된 기법에 따라, 많은 추가적인 모노클로날 항체를 생성하였다. 이러한 항체의 결합 활성은 BIAcore, ELISA 및 FACS에 의해 분석하였다.

10.1 BIAcore

실시예 7에 기술된 방법론에 기초하여, 추가적인 항-NOGO 항체에 대한 데이타는 하기 표 13, 14, 15 및 17 (정제된 항체 물질) 및 표 16 (상청액 물질)에 기재하였다.

결과 - 표 13

결과는 단일 실험으로부터의 결과이다. 본 실험에서, H16L16에 대해 획득된 값은 다른 실험에서 획득된 전형적인 값이 아니다 (전형적으로, 약 1의 KD (nM)을 나타냄 (표 8 및 10 참조)).

결과 - 표 14

결과는 단일 실험으로부터의 결과이다.

결과 - 표 15

결과는 단일 실험으로부터의 결과이다.

결과 - 표 16

결과는 단일 실험으로부터의 결과이다. 데이타는 소규모의 일시적 트랜스펙션으로부터의 상청액 물질에 기초한 오프-레이트 랭킹이다.

표 17

결과는 12회 독립적으로 수행한 결과이다. 도시된 데이타는 12회 수행한 결과의 평균 및 표준 편차이다.

10.2. ELISA

실시예 3에 기술된 방법론에 기초하여, NOGO 항체에 대한 추가적인 데이타를 도 8-11에 기술하였다. 이들 실험중 일부에서, 상이한 농도의 코팅 항원을 사용하였다 (0.1-1.0 mcg/ml).

결과 - 도 8. 1.0mcg/ml로 코팅된 NOGO 항원

결과 - 도 9. 0.1mcg/ml로 코팅된 NOGO 5+6 항원

결과 - 도 10. 0.5mcg/ml로 코팅된 NOGO 항원

결과 - 도 11. 1.0mcg/ml로 코팅된 NOGO 항원

결과 - 도 12A 및 B. 1.0mcg/ml로 코팅된 GST-인간 NOGO A56 항원. 소규모 일시적 트랜스펙션으로부터의 상청액 물질의 ELISA 결합.

10.3. 세포내 FACS

실시예 9에 기술된 방법론에 기초하여, 추가적인 FACS 데이타를 도 13에 도시하였다. 추가적인 데이타는 도 14A 내지 C에 도시되어 있다. 도 14A는 각 샘플에 대한 단일 시점을 나타낸다. 도 14A 및 14B는 이중 샘플의 평균이다.

실시예 11 . 인간화된 항 NOGO 모노클로날 항체의 역 포맷 바이아코어 검정

재조합 발현된 인간 NOGO-A (GST-인간 NOGO-A56)에 대한 정제된 항-NOGO 모노클로날 항체 (mAb)의 결합 동력을 바이아코어T100을 사용하여 분석하였다. 칩을 하기와 같이 제조하였다:

방법

인간화된 NOGO 항체의 바이아코어^TM 동력 검정 (Biacore^TM kinetic analysis)을 후보 항체의 단백질 A 포획물을 사용하여 수행하였다. 간단하게는, 단백질 A를 표준 결합 공정을 이용하여 일차 아민 결합에 의해 CM5 칩상에 고정시켜, 머신 소프트웨어의 고유의 부동화 위자드를 사용하여 측정시 밀도 약 3000-4000 공명 단위 (RU)가 되게하였다. 그 후, 인간화된 항체를 단백질 A 표면위로 통과시키고 약 200-400 RU의 수준으로 포획시키고, 안정화 기간 후 인간 NOGO 5+6 GST를 소정의 농도로 포획된 항체 표면위로 통과시키고, 결합 센서그램을 수득하였다. 산성 재생 (100mM H₃PO₄ 또는 10mM 글리신 pH 1.5)에 의해 단백질 A 표면으로부터 포획된 항체 전부를 제거하였으며, 이는 표면 결합력을 현저하게 감소시키지 않았다. 모든 곡선은 인간 NOGO 5+6 GST 대신에 완충액 주입물을 이중 참조한 것이며, 데이타는 바이아코어 평가 소프트웨어 T100 v1.1 (Biacore evaluation software T100v1.1)의 글로벌 핏 파라미터를 사용하여 1:1 결합 모델로 핏팅시켰다. 모든 실험은 T100 장치에서 수행하였다.

표 18 - 도시된 결과는 5개 또는 6개의 독립적 수행 결과의 평균 및 표준 편차이다.

NOGO 항체 서열 요약 (표 12)

설명	서열 (SEQ ID NO)
설명	아미노산 서열	폴리누클레오티드 서열
2A10, CDR-H1	1	-
2A10, CDR-H2	2	-
2A10, CDR-H3	3	-
2A10, CDR-L1	4	-
2A10, CDR-L2	5	-
2A10, CDR-L3	6	-
2A10, VH (뮤린)	7	41
2A10, VL (뮤린)	8	42
키메라 중쇄 Hc	9	43
키메라 경쇄 Lc	10	44
2A10 VH 인간화된 작제물 H5	11	45
2A10 VH 인간화된 작제물 H6	12	46
2A10 VH 인간화된 작제물 H700	13	47
2A10 VH 인간화된 작제물 H14	14	48
2A10 VH 인간화된 작제물 H15	15	49
2A10 VH 인간화된 작제물 H16	16	50

2A10 VH 인간화된 작제물 H17	17	51
2A10 VH 인간화된 작제물 H18	18	52
2A10 VL 인간화된 작제물 L6	19	53
2A10 VL 인간화된 작제물 L13	20	54
2A10 VL 인간화된 작제물 L14	21	55
2A10 VL 인간화된 작제물 L15	22	56
2A10 VL 인간화된 작제물 L16	23	57
2A10 VL 인간화된 작제물 L17	24	58
2A10 VL 인간화된 작제물 L18	25	59
2A10 중쇄 인간화된 작제물 H5	26	60
2A10 중쇄 인간화된 작제물 H6	27	61
2A10 중쇄 인간화된 작제물 H700	28	62
2A10 중쇄 인간화된 작제물 H14	29	63
2A10 중쇄 인간화된 작제물 H15	30	64
2A10 중쇄 인간화된 작제물 H16	31	65
2A10 중쇄 인간화된 작제물 H17	32	66
2A10 중쇄 인간화된 작제물 H18	33	67
2A10 경쇄 인간화된 작제물 L6	34	68
2A10 경쇄 인간화된 작제물 L13	35	69
2A10 경쇄 인간화된 작제물 L14	36	70
2A10 경쇄 인간화된 작제물 L15	37	71
2A10 경쇄 인간화된 작제물 L16	38	72
2A10 경쇄 인간화된 작제물 L17	39	73
2A10 경쇄 인간화된 작제물 L18	40	74
캠파스 리더 서열	75	-
인간 NOGO A (NOGO-A56)의 아미노산 586-785	76	-
2A10 VH 인간화된 작제물 H1	77	81
2A10 VL 인간화된 작제물 L11	78	82
2A10 중쇄 인간화된 작제물 H1	79	83
2A10 경쇄 인간화된 작제물 L11	80	84
2A10 VH 인간화된 작제물 H19	85	99
2A10 VH 인간화된 작제물 H20	86	100
2A10 VH 인간화된 작제물 H21	87	101
2A10 VH 인간화된 작제물 H22	88	102
2A10 VH 인간화된 작제물 H23	89	103
2A10 VH 인간화된 작제물 H24	90	104
2A10 VH 인간화된 작제물 H25	91	105
2A10 중쇄 인간화된 작제물 H19	92	106
2A10 중쇄 인간화된 작제물 H20	93	107
2A10 중쇄 인간화된 작제물 H21	94	108
2A10 중쇄 인간화된 작제물 H22	95	109
2A10 중쇄 인간화된 작제물 H23	96	110
2A10 중쇄 인간화된 작제물 H24	97	111
2A10 중쇄 인간화된 작제물 H25	98	112

서열 목록

SEQ ID 1: 2A10 CDR-H1

SEQ ID 2: 2A10 CDR-H2

SEQ ID 3: 2A10 CDR-H3

SEQ ID 4: 2A10 CDR-L1

SEQ ID 5: 2A10 CDR-L2

SEQ ID 6: 2A10 CDR-L3

SEQ ID 7: 2A10, VH (뮤린)

SEQ ID 8: 2A10, VL (뮤린)

SEQ ID 9: 키메라 중쇄 Hc

SEQ ID 10: 키메라 경쇄 Lc

SEQ ID 11: 2A10 VH 인간화된 작제물 H5

SEQ ID 12: 2A10 VH 인간화된 작제물 H6

SEQ ID 13: 2A10 VH 인간화된 작제물 H700

SEQ ID 14: 2A10 VH 인간화된 작제물 H14

SEQ ID 15: 2A10 VH 인간화된 작제물 H15

SEQ ID 16: 2A10 VH 인간화된 작제물 H16

SEQ ID 17: 2A10 VH 인간화된 작제물 H17

SEQ ID 18: 2A10 VH 인간화된 작제물 H18

SEQ ID 19: 2A10 VL 인간화된 작제물 L6

SEQ ID 20: 2A10 VL 인간화된 작제물 L13

SEQ ID 21: 2A10 VL 인간화된 작제물 L14

SEQ ID 22: 2A10 VL 인간화된 작제물 L15

SEQ ID 23: 2A10 VL 인간화된 작제물 L16

SEQ ID 24: 2A10 VL 인간화된 작제물 L17

SEQ ID 25: 2A10 VL 인간화된 작제물 L18

SEQ ID 26: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H5

SEQ ID 27: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H6

SEQ ID 28: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H700

SEQ ID 29: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H14

SEQ ID 30: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H15

SEQ ID 31: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H16

SEQ ID 32: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H17

SEQ ID 33: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H18

SEQ ID 34: 2A10 경쇄 인간화된 작제물 L6

SEQ ID 35: 2A10 경쇄 인간화된 작제물 L13

SEQ ID 36: 2A10 경쇄 인간화된 작제물 L14

SEQ ID 37: 2A10 경쇄 인간화된 작제물 L15

SEQ ID 38: 2A10 경쇄 인간화된 작제물 L16

SEQ ID 39: 2A10 경쇄 인간화된 작제물 L17

SEQ ID 40: 2A10 경쇄 인간화된 작제물 L18

SEQ ID 41: 2A10, VH (뮤린) SEQ ID: 7을 엔코딩하는 PN

SEQ ID 42: 2A10, VL (뮤린) SEQ ID: 8을 엔코딩하는 PN

SEQ ID 43: 키메라 중쇄 Hc SE ID:9를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 44: 키메라 경쇄 Lc SEQ ID:10을 엔코딩하는 PN

SEQ ID 45: 2A10 VH 인간화된 작제물 H5 SEQ ID:11를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 46: 2A10 VH 인간화된 작제물 H6 SEQ ID:12를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 47: 2A10 VH 인간화된 작제물 H700 SEQ ID:13를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 48: 2A10 VH 인간화된 작제물 H14 SEQ ID:14를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 49: 2A10 VH 인간화된 작제물 H15 SEQ ID:15를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 50: 2A10 VH 인간화된 작제물 H16 SEQ ID:16를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 51: 2A10 VH 인간화된 작제물 H17 SEQ ID:17를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 52: 2A10 VH 인간화된 작제물 H18 SEQ ID:18를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 53: 2A10 VL 인간화된 작제물 L6 SEQ ID:19를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 54: 2A10 VL 인간화된 작제물 L13 SEQ ID:20를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 55: 2A10 VL 인간화된 작제물 L14 SEQ ID:21를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 56: 2A10 VL 인간화된 작제물 L15 SEQ ID:22를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 57: 2A10 VL 인간화된 작제물 L16 SEQ ID:23를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 58: 2A10 VL 인간화된 작제물 L17 SEQ ID:24를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 59: 2A10 VL 인간화된 작제물 L18 SEQ ID:25를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 60: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H5 SEQ ID:26을 엔코딩하는 PN

SEQ ID 61: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H6 SEQ ID:27을 엔코딩하는 PN

SEQ ID 62: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H700 SEQ ID:28을 엔코딩하는 PN

SEQ ID 63: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H14 SEQ ID:29을 엔코딩하는 PN

SEQ ID 64: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H15 SEQ ID:30을 엔코딩하는 PN

SEQ ID 65: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H16 SEQ ID:31을 엔코딩하는 PN

SEQ ID 66: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H17 SEQ ID:32을 엔코딩하는 PN

SEQ ID 67: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H18 SEQ ID:33을 엔코딩하는 PN

SEQ ID 68: 2A10 경쇄 인간화된 작제물 L6 SEQ ID:34을 엔코딩하는 PN

SEQ ID 69: 2A10 경쇄 인간화된 작제물 L13 SEQ ID:35을 엔코딩하는 PN

SEQ ID 70: 2A10 경쇄 인간화된 작제물 L14 SEQ ID:36을 엔코딩하는 PN

SEQ ID 71: 2A10 경쇄 인간화된 작제물 L15 SEQ ID:37을 엔코딩하는 PN

SEQ ID 72: 2A10 경쇄 인간화된 작제물 L16 SEQ ID:38을 엔코딩하는 PN

SEQ ID 73: 2A10 경쇄 인간화된 작제물 L17 SEQ ID:39을 엔코딩하는 PN

SEQ ID 74: 2A10 경쇄 인간화된 작제물 L18 SEQ ID:40을 엔코딩하는 PN

SEQ ID 75: 캠파스 리더 서열

SEQ ID 76: 인간 NOGO A (NOGO-A56)의 아미노산 586-785

SEQ ID 77: 2A10 VH 인간화된 작제물 H1

SEQ ID 78: 2A10 VL 인간화된 작제물 L11

SEQ ID 79: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H1

SEQ ID 80: 2A10 경쇄 인간화된 작제물 L11

SEQ ID 81: 2A10 VH 인간화된 작제물 H1 SEQ ID:77을 엔코딩하는 PN

SEQ ID 82: 2A10 VL 인간화된 작제물 L11 SEQ ID:78을 엔코딩하는 PN

SEQ ID 83: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H1 SEQ ID:79를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 84: 2A10 경쇄 인간화된 작제물 L11 SEQ ID:80을 엔코딩하는 PN

SEQ ID 85: 2A10 VH 인간화된 작제물 H19

SEQ ID 86: 2A10 VH 인간화된 작제물 H20

SEQ ID 87: 2A10 VH 인간화된 작제물 H21

SEQ ID 88: 2A10 VH 인간화된 작제물 H22

SEQ ID 89: 2A10 VH 인간화된 작제물 H23

SEQ ID 90: 2A10 VH 인간화된 작제물 H24

SEQ ID 91: 2A10 VH 인간화된 작제물 H25

SEQ ID 92: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H19

SEQ ID 93: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H20

SEQ ID 94: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H21

SEQ ID 95: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H22

SEQ ID 96: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H23

SEQ ID 97: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H24

SEQ ID 98: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H25

SEQ ID 99: 2A10 VH 인간화된 작제물 H19 SEQ ID:85를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 100: 2A10 VH 인간화된 작제물 H20 SEQ ID:86를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 101: 2A10 VH 인간화된 작제물 H21 SEQ ID:87를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 102: 2A10 VH 인간화된 작제물 H22 SEQ ID:88를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 103: 2A10 VH 인간화된 작제물 H23 SEQ ID:89를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 104: 2A10 VH 인간화된 작제물 H24 SEQ ID:90를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 105: 2A10 VH 인간화된 작제물 H25 SEQ ID:91를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 106: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H19 SEQ ID:92를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 107: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H20 SEQ ID:93를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 108: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H21 SEQ ID:94를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 109: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H22 SEQ ID:95를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 110: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H23 SEQ ID:96를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 111: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H24 SEQ ID:97를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 112: 2A10 중쇄 인간화된 작제물 H25 SEQ ID:98를 엔코딩하는 PN

SEQ ID 113: 마머젯 NOGO-A 단편의 아미노산 서열

Claims

인간 NOGO에 결합하는 모노클로날 항체로서, 12, 20, 38, 40, 48, 67, 68, 70, 72, 74, 76, 79 및 91번 위치중 하나 이상의 위치에서 추가로 n개 치환된 SEQ ID NO.77의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 각각의 치환된 아미노산 잔기는 SEQ ID 7의 동일한 위치에서의 아미노산 잔기로 대체되며, n은 1 내지 13인 모노클로날 항체.
제 1항에 있어서, 79번 위치에서 치환된 모노클로날 항체.
제 2항에 있어서, 항체 서열중 48번 및 68번 위치에서 치환된 모노클로날 항체.
제 2항 또는 제 3항에 있어서, 40번 및/또는 67번 위치에서 추가로 치환된 모노클로날 항체.
제 4항에 있어서, 38번 및/또는 72번 및/또는 70번 위치에서 추가로 치환된 모노클로날 항체.
제 5항에 있어서, 21, 20, 74, 76 또는 91번 위치중 하나 이상의 위치에서 추가로 치환된 모노클로날 항체.
제 1항 내지 제 6항중의 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 11-18, 29-33 및 85-91의 서열을 갖는 모노클로날 항체.
제 7항에 있어서, SEQ ID NO. 11, 12, 16, 18, 85, 86, 87 또는 91의 VH 영역을 포함하는 모노클로날 항체.
선택적으로 4, 7, 11, 19, 42, 64 및 70번 위치중 하나 이상의 위치에서 추가로 다수개 치환된 SEQ ID NO.20의 아미노산을 갖는 경쇄 가변 영역과 함께 제 1항 내지 제 8항중의 어느 한 항에 따른 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체로서, 각각의 치환된 아미노산 잔기는 SEQ ID NO.8의 동일한 위치에서의 아미노산 잔기로 대체되며, 치환 수는 0 내지 7인 모노클로날 항체.
제 9항에 있어서, 경쇄 가변 영역의 11번 및 19번 위치에서 치환된 모노클로날 항체.
제 9항에 있어서, 경쇄 가변 영역의 4번 위치에서 치환된 모노클로날 항체.
제 10항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 42번 위치에서 치환된 모노클로날 항체.
제 10항 또는 제 12항에 있어서, 경쇄 가변 영역의 7, 64 또는 70번 위치에서 치환된 모노클로날 항체.
제 9항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.20인 모노클로날 항체.
제 9항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO. 23 및 25으로 제공된 VL 영역을 포함하는 모노클로날 항체.
하기로부터 선택된 VH 및 VL 영역을 포함하는 모노클로날 항체:
제 16항에 있어서, 포유동물 세포에서 하기 전장 항체 사슬중 하나의 발현에 의해 수득된 모노클로날 항체:
제 1항 내지 제 17항중의 어느 한 항에 따른 항-NOGO 항체 또는 이의 작용 단편과 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 담체를 포함하는 약제 조성물.
변형된 항체를 포함하는 유효량의 제 1항 내지 제 17항중의 어느 한 항에 따른 항-NOGO 항체 또는 이의 작용 단편을 인간에게 투여하는 것을 포함하여, 인간의 발작 및 기타 신경학적 질환/질병을 치료하거나 예방하는 방법.
발작 및 기타 신경학적 질환/질병의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조시 변형된 항체를 포함하는 제 1항 내지 제 17항중의 어느 한 항에 따른 항-NOGO 항체 또는 이의 작용 단편의 용도.
변형된 항체를 포함하는 유효량의 제 1항 내지 제 17항중의 어느 한 항에 따른 항-NOGO 항체 또는 이의 작용 단편을 인간에게 투여하는 것을 포함하여, 발작 또는 기타 신경학적 질환/질병으로 고통을 받거나, 이러한 질환/질병에 걸릴 위험성이 있는 인간의 신경퇴행을 억제하고/거나 기능 회복을 촉진시키는 방법.
발작 및 기타 신경학적 질환/질병으로 고통을 받거나, 이러한 질환/질병에 걸릴 위험성이 있는 인간의 신경퇴행을 억제하고/거나 기능 회복을 촉진시키기 위한 약물의 제조시 변형된 항체를 포함하는 제 1항 내지 제 17항중의 어느 한 항에 따른 항-NOGO 항체 또는 이의 작용 단편의 용도.
유효량의 제 1항 내지 제 17항중의 어느 한 항에 따른 항-NOGO 항체를 인간에서 비경구 투여하는 단계를 포함하여, 인간의 발작 또는 기타 신경학적 질환/질병을 치료하는 방법.
제 23항에 있어서, 항-NOGO 항체가 정맥내 투여되는 방법.
제 19항 내지 제 23항중의 어느 한 항에 있어서, 기타 신경학적 질환/질병이 외상성 뇌손상, 척수 손상, 알츠하이머병, 전두측두엽치매 (타우패시(taupathies)), 말초신경염, 파킨슨병, 헌팅턴병 및 다발성 경화증으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제 1항 내지 제 17항중의 어느 한 항에 따른 항-NOGO 항체와 인간 축색 돌기를 접촉시키는 단계를 포함하여, 축색돌기 발아(axonal sprouting)를 촉진시키는 방법.
제 26항에 있어서, 실험관내 수행되는 방법.
인간 NOGO-A에 특이적으로 결합하여 이의 활성을 중화시키는 제 1항 내지 제 17항중의 어느 한 항에 따른 항-NOGO 항체를 생성시키는 방법으로서,

(a) 항체의 중쇄를 엔코딩하는 제 1 벡터를 제공하는 단계;

(b) 항체의 경쇄를 엔코딩하는 제 2 벡터를 제공하는 단계;

(c) 제 1 및 제 2 벡터로 포유동물 숙주 세포를 공동-트랜스펙션시키는 단계;

(d) 숙주 세포로부터의 항체가 상기 배양 배지 (바람직하게는, 혈청 비함유)로 분비되게 하는 조건하에 단계 (c)의 숙주 세포를 배양하는 단계;

(e) 단계 (d)의 분비된 항체를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
제 1항 내지 제 17항중의 어느 한 항에 따른 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항-NOGO 항체를 생성시키는 방법으로서,

(a) 항체의 중쇄를 엔코딩하는 제 1 벡터를 제공하는 단계;

(b) 항체의 경쇄를 엔코딩하는 제 2 벡터를 제공하는 단계;

(c) 제 1 및 제 2 벡터로 포유동물 숙주 세포를 공동-트랜스펙션시키는 단계;

(d) 숙주 세포로부터의 항체가 상기 배양 배지 (바람직하게는, 혈청 비함유)로 분비되게 하는 조건하에 단계 (c)의 숙주 세포를 배양하는 단계;

(e) 단계 (d)의 분비된 항체를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
제 28항 또는 제 29항에 있어서, 숙주 세포가 NS0 Sp2/o, CHO, COS, 섬유아세포 예컨대, 3T3 특히, CHO로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.