ES2296839T3 - Variantes de inmunoglobulinas para receptores fc-epsilon especificos. - Google Patents

Abstract

Anticuerpo que es capaz de unirse a la IgE unida a Fc¿RII pero es sustancialmente incapaz de unirse a la IgE unida a FcepsilonRI, que comprende al menos una región Fab de un anticuerpo receptor humano, en el que se han sustituido en una o más de las posiciones 30, 30b, 30d, 33, 53, 91, 92, 93 y 94 en la cadena ligera, y de las posiciones 27, 28, 29, 29a, 31, 33, 34, 50, 52, 53, 54, 55, 58, 95, 97, 98, 99, 100 y 101 en la cadena pesada, residuos procedentes de posiciones análogas en un anticuerpo donante MAE11, MAE13 o MAE15, que tiene las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada tal como se detallan en las SEC. Nº ID. Nº 2 a 7, o un anticuerpo donante que tiene las características poseídas por el anticuerpo MAE11, en particular, la unión de la IgE soluble, la unión de células B portadoras de IgE, el bloqueo de la unión de la IgE a FcepsilonRI y FcepsilonRII, la inhibición in vitro de la producción de IgE, y la incapacidad de unirse a basófilos recubiertos con IgE, para su uso en terapias.

Description

Variantes de inmunoglobulinas para receptores Fc\epsilon específicos.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere a variantes de la secuencia de aminoácidos de anticuerpos anti-IgE, y especialmente al uso médico de anticuerpos humanizados capaces de unirse diferencialmente a Fc\epsilonRI y Fc\epsilonRII.

La IgE es un miembro de la familia inmunoglobulina que media las respuestas alérgicas tales como el asma, las alergias a alimentos, la hipersensibilidad del tipo 1, y la familiar inflamación de los senos nasales padecida de forma amplia. La IgE también se une a las células B (y a los monocitos, eosinófilos y plaquetas), a través de su región Fc, a un receptor de la IgE de baja afinidad (Fc\epsilonRII, denominado a partir de ahora "FCEL"). A partir de la exposición de un mamífero a un alérgeno, las células B se amplifican clonalmente, las cuales sintetizan IgE que se une al alérgeno. Esta IgE, a su vez, es liberada en la circulación por las células B, en donde es unida por las células B (a través del FCEL), y por los mastocitos y los basófilos a través del denominado receptor de alta afinidad (Fc\epsilonRII, denominado a partir de ahora "FCEH") que se halla sobre la superficie de los mastocitos y basófilos. Por tanto, tales mastocitos y basófilos están sensibilizados para el alérgeno. La siguiente exposición al alérgeno entrecruza el Fc\epsilonRI en estas células y activa por tanto
su liberación de histamina y otros factores, los cuales son responsables de la hipersensibilidad y anafilaxis clínica.

La técnica ha informado de anticuerpos capaces de unirse a IgE unida a PCEL pero no a IgE ubicada en el FCEH (ver, por ejemplo, WO-89/06.138 y la patente estadounidense 4.940.782). Se descubre que estos anticuerpos son clínicamente ventajosos puesto que se unen a IgE que se halla sobre células B o circulando libremente en el cuerpo, pero no se unen al FCEH y, por tanto, no activarán los mastocitos o basófilos. Además, se conocen varias variantes de las secuencia de aminoácidos de las inmunoglobulinas, por ejemplo, los anticuerpos "quiméricos" y "humanizados" (ver, por ejemplo, la patente estadounidense nº 4.816.567; WO-91/09.968; EP-452.508; y WO-91/16.927). Los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas, cadenas de inmunoglobulinas, o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de anticuerpos unidoras de antígenos), las cuales contienen la secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en los que se remplazan residuos de las región determinante de complementariedad (CDR) del receptor por residuos procedentes de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata o conejo, que tengan la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, los residuos estructurales del Fv de la inmunoglobulina humana son remplazados por los residuos no humanos correspondientes. Más aún, el anticuerpo humanizado podría comprender residuos que no se hallan ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada o secuencias estructurales. Estas modificaciones se hacen para refinar aún más y optimizar las prestaciones del anticuerpo, como se describirá con más detalle más abajo. Son también conocidos per se los anticuerpos monovalentes y biespecíficos.

Se entiende generalmente que el FCEH, al igual que el FCEL, se une al (a los) sitio(s) de reconocimiento en el dominio constante (Fc) de la IgE. El (los) sitio(s) de reconocimiento para los dos receptores están pobremente definidos, a pesar del considerable esfuerzo realizado en el pasado dirigido al problema.

A lo largo de la década pasada se han realizado diversos estudios para determinar qué porción de la molécula de IgE está implicada en la unión al Fc\epsilonRI y Fc\epsilonRII. Esencialmente, se han intentado tres estrategias. Primero, se han usado péptidos correspondientes a porciones específicas de la secuencia de IgE o como inhibidores competitivos de la unión IgE-receptor (Burt et al., Eur. J. Immunol. 17:437-440 (1987); Helm et al., Nature 331:180-183 (1988); Helm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86:9465-9469 (1989); Vercelli et al., Nature 338:649-651 (1989); Nio et al. Peptide Chemistry 203-208 (1990)), o para generar anticuerpos anti-IgE que bloquearían la interacción IgE-receptor (Burt et al., Molec. Immunol. 24:379-389 (1987); Robertson et al., Molec. Immun. 25:103-113 (1988); Baniyash et al., Molec. Immun. 25:705-711 (1988)). El péptido más efectivo como inhibidor competitivo era una secuencia que era 1000 veces menos activa que la IgE (Burt et al., Eur. J. Immunol. 17:437-440 (1987)).

Helm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86:9465-9469 (1989) halló que un péptido correspondiente a los residuos 329-340 de IgE bloqueaba la sensibilización in vivo de granulocitos basófilos humanos con anticuerpos IgE humanos. Estudios ulteriores indicaron que los residuos 3959-409 no eran esenciales para la unión del péptido 329-409 al Fc\epsilonRI (Helm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86:9465-9469 (1989)). Hay que destacar que las variantes de la secuencia de IgE descritas más abajo tenían la secuencia de Padlan et al., Mol. Immun. 23:1063 (1986), pero que los números de los residuos de inmunoglobulina usada en la presente invención son aquéllos de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interes (National Institutes of Health, Bethesda, Md, 1987).

Vercelli et al., Nature 338:649-651 (1989) usó péptidos de IgE recombinantes, así como anticuerpos monoclonales anti-Fc\epsilon, para investigar el sitio de unión de la IgE humana de las células B (Fc\epsilonRII). Ellos concluyeron que el sitio de unión Fc\epsilonRII está en Fc\epsilon3 cerca de K339-V402.

Burt et al., Eur. J. Immun. 17:437-440 (1987) investigaron siete péptidos por su competición frente a la IgE de rata en la unión a mastocitos de ratas. Su péptido más activo, el p129, era 1000 veces menos activo que la IgE. El p129 corresponde a la secuencia humana 439-453, la cual incluye el bucle EF. Otro de sus péptidos, el p130, correspondiente a los residuos 396-419 en el dominio Fc\epsilon3, no tenía actividad.

Robertson et al., Molec. Immun. 25:103-113 (1988) verificó la unión de la IgE mediante anticuerpos dirigidos contra secuencias inducidos por varios péptidos sintéticos. Ellos concluyeron que la secuencia definida por su \epsilon-péptido-4 (correspondiente a los residuos 446-460) no estaba significativamente implicada en la unión al receptor, mientras que la secuencia definida por su \epsilon-péptido-3 (correspondiente a los residuos 387-401) era probable que estuviera cercana al sitio de reconocimiento del receptor de la IgE.

Nio et al., Peptide Chemistry 203-208 (1990) evaluaron numerosos péptidos con respecto a su capacidad para inhibir la liberación de histamina por parte de basófilos humanos in vivo. Sólo un péptido (péptido 2, Tabla 1) mostró una inhibición específica; este péptido abarcaba los residuos 376-388. No obstante, un péptido mayor que incorporaba esta secuencia (péptido 3, Tabla 1) no tenía actividad inhibidora.

En segundo lugar se han explorado parcialmente las mutaciones de la IgE. Schwarzbaum et al., Eur. J. Immun. 19:1015-1023 (1989) (ver más arriba) encontraron que un mutante puntual P404H (P442H según el sistema de numeración usado en la presente invención) había reducido 2 veces la afinidad por el Fc\epsilonRI sobre células de leucemia basofílica de rata (RBL), pero la interpretación de este hallazgo es controvertida (Weetall et al., J. Immunol. 145:3849-3854 (1990)).

En tercer lugar han construido moléculas quiméricas. La IgE humana no se une al receptor de ratón (Kulczycki Jr. et al., J. Exp. Med. 139:600-616 (1974)), mientras que la IgE de roedor se une al receptor humano con una afinidad reducida (Conrad et al., J. Immun. 130:327-333 (1983)); la IgG1 humana no se une a los receptores de la IgE (Weetall et al., J. Immun. 145:3849-3854 (1990)). En base a estas observaciones, varios grupos han construido quimeras humanas-de ratón o quimeras IgE-IgG humanas. Weetall et al., J. Immun. 145:3849-3854 (1990), construyó una serie de quimeras IgG1 humana-IgE de ratón, y concluyó que los dominios Fc\epsilon2 y Fc\epsilon3 están implicados en la unión al Fc\epsilonRI de ratón, mientras que es improbable que el dominio Fc\epsilon4 esté implicado en la unión al Fc\epsilonRI de ratón (pero posiblemente podría estar implicado en la unión al Fc\epsilonRII). No obstante, estas conclusiones son inciertas puesto que se basan principalmente en la ausencia de unión por parte de quimeras, y tres de las cinco quimeras carecían de ciertos puentes disulfuro entre cadenas.

Nissim et al., EMBO J. 10:101-107 (1991) construyeron una serie de quimeras de IgE humana-de ratón y midieron la unión a células RBL, y concluyeron que la porción de IgE que se une con elevada afinidad al receptor Fc\epsilon especializado sobre células RBL podría ser asignado al Fc\epsilon3.

Los resultados informados por estos autores (por ejemplo, Helm et al. y Burt et al.) son inconsistentes. Más aún, en el caso de anticuerpos anti-IgE es difícil eliminar la posibilidad de bloqueo no específico debido a impedimento estérico (Schwarzbaum et al., Eur. J. Immun. 19:1015-1023 (1989)). Es evidente que existe una confusión considerable en la técnica respecto a los dominios del Fc de IgE que están implicados en la unión de la IgE al FCEH o en el mantenimiento de la conformación de la IgE responsable de la unión de la IgE al FCEH.

Resumen de la invención

De forma amplia, la presente invención de refiere a anticuerpos que son capaces de unirse al Fc\epsilonRII unido a IgE, pero que son sustancialmente incapaces de unirse al Fc\epsilonRI unido a IgE, y a su uso en terapias, y a su uso para la preparación de medicamentos para el tratamiento o profilaxis de alergias.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo, que es capaz de unirse a Fc\epsilonRII-IgE unida pero es sustancialmente incapaz de unirse a Fc\epsilonRI-IgE unida, que comprende un anticuerpo contra un receptor humano en el que se han sustituido, en una o más de las posiciones 30, 30b, 30d, 33, 53, 91, 92, 93 y 94 en la cadena ligera y en las posiciones 27, 28, 29, 29a, 31, 33, 34, 50, 52, 53, 54, 55, 58, 95, 97, 98, 99, 100 y 101 en la cadena pesada, residuos procedentes de posiciones análogas en el anticuerpo donante MAE11, MAE13 o MAE15, que tienen las secuencias de aminoácidos de la s cadenas ligera y pesada detalladas en la SEC. ID. Nº 2 a 7, o un anticuerpo donante que tiene las características poseídas por el anticuerpo MAE11, en particular la unión a IgE soluble, la unión a células B portadores de IgE, el bloqueo de la unión de IgE al Fc\epsilonRI y Fc\epsilonRII, la inhibición de la producción de IgE in vitro, y la incapacidad de unirse a basófilos recubiertos con IgE, para su uso en terapias.

Una realización preferida es un anticuerpo que comprende las secuencias de la cadena pesada y ligera del humae11ver.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7a, 8, 8a, 8b o 9, en donde humae11ver.1 tiene las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera tal como se detalla en SEC. ID. Nº: 8 y 9, y humae11ver.2-9 tienen las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera del humae11ver.1, incorporando además las modificaciones mostradas en la
Tabla 5.

Otra realización preferida es un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera del humae11ver.1 tal como se detallan en las SEC. ID. Nº: 8 y 9, estando sustituida dicha secuencia de cadena pesada en la posición 60 con asparagina, en la posición 61 con prolina, y en la posición 67 con isoleucina.

Los polipéptidos que se unen diferencialmente de esta invención son útiles en procedimientos de diagnóstico para los receptores de la IgE, o en la terapia de desórdenes mediados por la IgE tales como las alergias. Son útiles también para preparar anticuerpos capaces de unirse a regiones de la IgE que participan en la unión al receptor.

En una realización de esta invención, se proporcionan variantes de anticuerpos anti-IgE para su uso en la diagnosis o para la terapia o profilaxis de alergias u otros desórdenes mediados por la IgE. En realizaciones concretas de esta invención se proporcionan variantes de anticuerpos anti-IgE en las que uno o más residuos de la cadena ligera (receptora) humana 4, 13, 19, 24, 29, 30, 33, 55, 57, 58, 78, 93, 94, ó 104, o los residuos de la cadena pesada 24, 37, 48, 49, 54, 57, 60, 61, 63, 65, 67, 69, 78, 82, 97 ó 100, han sido modificados, preferiblemente mediante sustitución con el residuo hallado en la posición correspondiente en el anticuerpo donante (generalmente de ratón). En las realizaciones preferidas, los residuos seleccionados son el 13, 19, 58, 78 ó 104 de la cadena ligera, o los residuos 48, 49, 60, 61, 63, 67, 69, 82 u 82c en la cadena pesada, y más preferiblemente los residuos 60, 61 de la cadena pesada o el residuo 78 de la cadena ligera.

En otras realizaciones proporcionamos anticuerpos que son capaces de unirse al FCEL unido a IgE, pero que son sustancialmente incapaces de unirse al FCEH unido a IgE o de inducir la liberación de histamina a partir de mastocitos o basófilos, que comprenden el dominio CDR de Kabat en el que se ha sustituido un residuo en posición análoga procedente de un dominio CDR de Kabat de los anticuerpos de ratón anti-huIgE MAE11, MAE13, MAE15 o MAE17. También se proporcionan en la presente invención anticuerpos biespecíficos y anticuerpos monovalentes de IgE; y anticuerpos humanizados que presentan una afinidad por la IgE que en el rango desde aproximadamente 0,1 hasta 100 veces la del MAE11.

Breve descripción de la figura

La Figura 1 ilustra la secuencia del Fc\epsilon2 y Fc\epsilon3 de la IgE humana (SEC. ID. Nº 1). Esta secuencia concreta procede de Padlan et al., Molec. Immun. 23:1063-1075 (1986). Los residuos se numeran de acuerdo con Kabat (ver más arriba). Los residuos "X" se incluyen para alinear la secuencia de IgE de Padlan con el esquema de numeración de Kabat. Las secuencias que se alteraron al preparar varios mutantes de la IgE están subrayadas; los números en negrita debajo de las líneas denotas el número del mutante. Los residuos de la hoja-\beta están rayados por encima; los residuos del bucle están definidos por todos los residuos que intervienen entre la dos hojas-\beta.

La Figura 2 ilustra las secuencias de la cadena ligera y pesada del MAE11 (SEC. ID. Nº 2 y 3), MAE13 (SEC. ID. Nº 4 y 5) y MAE15 (SEC. ID. Nº 6 y 7).

La Figura 3 ilustra las secuencias de la cadena ligera y pesada del HuMae11V1 (SEC. ID. Nº 8 y 9).

Las Figuras 4a y 4b ilustran respectivamente el porcentaje de inhibición de la unión de la IgE a los receptores FCEL y FCEH por parte del anticuerpo monoclonal de ratón MAE11 así como por 3 variantes humanizadas (v1, v8 y v9).

Las Figuras 5a-5d comparan la unión de los anticuerpos MAE11, MAE15 y MAE17 a diversas variantes de la huIgE. MAE1 se proporciona como un control que se une a ambas, las células B y los mastocitos unidos a IgE. Los mutantes programados en los recuadros de cada figura se identifican en la Tabla 11.

Descripción detallada de la invención

Los polipéptidos análogos de la IgE de esta invención contienen una secuencia de aminoácidos que es homóloga a la de la IgE que ocurre de forma natural, y tienen la capacidad de unirse específica o diferencialmente al FCEL o FCEH, pero, en diversos grados, no a ambos. El grado de homología de tales polipéptidos con la IgE del tipo salvaje no es crítico, puesto que tan sólo es preciso retener suficiente secuencia de IgE para permitir que la IgE se una diferencial y específicamente a uno de los dos receptores. En general, los polipéptidos de esta invención serán análogos Fc de IgE, y serán desde aproximadamente el 80% al 99% homólogos con una secuencia polipeptídica de una región Fc de cadena pesada de una IgE que ocurra de forma natural. La homología se determina mediante procedimientos convencionales en los que todas las sustituciones se consideran que no son homólogas (tanto si son conservadoras o no conservadoras), y en los que las secuencias se alinean para conseguir la máxima homología.

Se entenderá que los números de los residuos de Fc de IgE referidos en la presente invención son aquéllos de Kabat. Al aplicar las enseñanzas de los residuos de esta invención a otros dominios Fc de la IgE, será necesario comparar la secuencia candidata completa con la secuencia de la Figura 1 con objeto de alinear los residuos y correlacionar los números de los residuos. Además, la identidad de ciertos residuos individuales en cualquier sitio con número de Kabat podría variar de IgE a IgE debido a divergencias entre especies o alélicas. Cuando, por ejemplo, se afirma que las sustituciones se introducen en el residuo R383 (IgE humana), se entenderá que esto significa introducir una sustitución en el mismo sitio en la IgE, incluso si este mismo sito (en el bucle AB) pudiera estar ubicado en un residuo con número diferente, o pudiera estar representado en la IgE progenitora o inicial por un residuo que es diferente al descrito por Kabat. No obstante, en consideración a la claridad y simplicidad, en la presente invención se usarán los números de los residuos y las identidades de las secuencias de las cadenas pesadas de IgE de Kabat. Hay que destacar que algunos residuos de Kabat se suprimieron en la secuencia de Padlan, en cuyo caso se mantiene el sistema de numeración de Kabat mediante la inserción de un residuo espaciador denominado "X" (Ver Figura 1).

De forma similar, el sistema Kabat se usa para designar residuos de inmunoglobulina usados en la preparación de variantes de inmunoglobulinas, por ejemplo humanizadas, anti-IgE, tales como IgG, IgE, IgA o IgD. En las realizaciones preferidas, el sitio de la inmunoglobulina humana receptora se numera de acuerdo con las secuencias de los subgrupos III (V_{H}) consenso de Kabat y subgrupos I (V_{L}) consenso de \kappa. Con objeto de determinar que residuos donantes corresponden a aquéllos residuos consenso de Kabat, las secuencias se alinean al máximo, introduciendo huecos según sea necesario, usando los residuos de cisteína del dominio variable como postes de guía principales. Hay que destacar que los CDR varían considerablemente de anticuerpo a anticuerpo (y, por definición, no presentarán homología con las secuencias consenso de Kabat). El alineamiento máximo de los residuos estructurales (particularmente las cisteínas) frecuentemente requerirá la inserción de residuos "espaciadores" en el sistema de numeración a ser usado para la región F_{v} del anticuerpo donante. Por ejemplo, el residuo "29a" al que se refiere más adelante. Éste representa un residuo extra hallado en la CDR V_{H1} del anticuerpo donante de ratón, para el cual no existe una contrapartida en la secuencia consenso, pero cuya inserción es necesaria para obtener el alineamiento máximo de las secuencias consenso y donante. En la práctica, por tanto, cuando se prepare un anticuerpo humanizado (versión 1) a partir de este donante, contendrá la V_{H1} con el residuo 29a.

Los polipéptidos con unión diferencial de esta invención típicamente contienen aproximadamente desde 5 a 250 residuos, los cuales son homólogos con una región Fc de la cadena pesada de una IgE, pero ordinariamente contendrán aproximadamente desde 10 hasta 100 de tales residuos. Usualmente, las regiones Fc3 y Fc4 de IgE estarán presentes, proporcionando el dominio Fc3 los residuos directamente implicados en la unión al receptor, y estando presente la Fc4 para garantizar la integridad conformacional.

Generalmente, la IgE es IgE humana, aunque también se incluyen las IgE de animales, como la IgE de rata, de ratón, equina, bovina, felina o porcina. Tal como se ha mencionado más arriba, habrá una variación en las identidades y los números de los residuos para estas IgE en comparación con la secuencia de la Figura 1.

El FCEH y el FCEL se definen respectivamente como el receptor de alta afinidad de la IgE (FC\epsilonRI, Ishizaka et al., Immunochemistry 7:687-702 (1983)) hallados en mastocitos o en basófilos, y el receptor de baja afinidad (FC\epsilonRII o CD23) hallados sobre células implicadas en la inflamación, tales como monocitos, eosinófilos y plaquetas, así como sobre células B (Capron et al., Immun. Today 7:15-18 (1986)). El FCEH y el FCEL incluyen alelos y variantes de la secuencia predeterminada de los mismos que unen la IgE. Mientras que el FCEH contiene varias cadenas polipeptídicas, la unión de polipéptidos candidatos a sus cadenas alfa es todo lo que se tiene que ensayar, puesto que la cadena alfa es la porción del FCEH que une la IgE.

Unión diferencial significa que el polipéptido se unirá a uno del FCEL o FCEH hasta el alcance de al menos aproximadamente el 75% del grado con el que la IgE nativa homóloga se une a ese receptor, pero no se unirá al otro receptor a más de aproximadamente el 20% del grado con el que la IgE homóloga se une al otro receptor. La unión se determinante mediante los ensayos del Ejemplo 3. En esta invención se incluyen polipéptidos que son capaces de unirse a uno de los dos receptores con un grado mayor al de la IgE nativa.

Variantes de anticuerpos anti-huIgE

Se produjeron variantes de anticuerpos anti-huIgE obteniendo primero un grupo de anticuerpos monoclonales de ratón que eran capaces de unirse al FCEL pero no al FCEH. 8 de tales anticuerpos monoclonales de ratón, denominados MAE10, MAE11, MAE12, MAE13, MAE14, MAE15, MAE16, y MAE17, se obtuvieron mediante procedimientos convencionales que implicaban inmunizar ratones con IgE humana o un polipéptido consistente en los residuos 315-547 de la huIgE, y examinándolos en busca de actividad anti-IgE.

MAE11/15 y MAE13 reconocen epítopos diferentes. Parece ser que el epítopo para MAE13 está ubicado tridimensionalmente adyacente a un componente clave del sitio de unión para el FCEH de la IgE (pero que no ocupa directamente ese sitio) puesto que ocurrirá una ligera cantidad de liberación de histamina a concentraciones elevadas de MAE13, sugiriendo que con MAE13 ocurre cierto entrecruzamiento del FCEH mediado por anticuerpo. MAE17 fue el más efectivo para suprimir la síntesis de IgE por parte de las células B, a pesar del hecho que MAE11 y MAE13 presentaban una mayor afinidad por la IgE. Esto podría atribuirse a su capacidad para mediar la fijación del complemento (posee un isótopo de IgG2a, conteniendo, por tanto, un Fc capaz de provocar la función efectora).

Se cree que MAE11 y MAE15 reconocen el mismo epítopo de la IgE. Cada anticuerpo compartía ciertas características inusuales en su secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, los CDR1 de la cadena ligera contenían cada uno 3 residuos de ácido aspártico. Los CDR3 de las cadenas pesadas de MAE11 y MAE15 contenían 3 residuos de histidina (y contenían respectivamente dos residuos de arginina).

Los anticuerpos como los anteriores poseedores de la características de unión de IgE deseadas podrían modificarse aún más. Tales modificaciones caen dentro de dos clases generales. En la primera clase, los anticuerpos son modificados de forma que son monovalentes para la IgE. Esto quiere decir que sólo un "brazo" del anticuerpo, es decir, una horquilla de cadena ligera-pesada, debería ser capaz de unir la IgE. El "brazo" Fv restante del anticuerpo (o brazos en el caso de la IgM) es específico para un segundo antígeno (que no es IgE), no es capaz de unir antígeno alguno, o se suprime totalmente. Por tanto, el término monovalente para la IgE incluye los anticuerpos polivalentes que son monovalentes para la IgE. Los mejores resultados podrían obtenerse con la segunda alternativa, puesto que esto preservaría más fielmente la estructura del anticuerpo, y conferiría posiblemente la vida media circulante más larga del anticuerpo. Los anticuerpos monovalentes para la IgE específicos para IgE unida a FCEL óptimamente comprenderán suficientes dominios Fc de las cadenas pesadas para ser capaces de la funciones de unión del complemento y efectora de Ig.

El segundo antígeno reconocido por una realización del anticuerpo monovalente para la IgE es uno que, cuando se entrecruce indirectamente con el FCEL, mediante el anticuerpo en la presente invención, no producirá ninguna respuesta tóxica o perjudicial, es decir, el segundo antígeno no es el FCEH, y generalmente es uno que no se halla en el animal a ser tratado (con objeto de evitar la absorción no deseada del anticuerpo sobre tejidos o proteínas dentro del cuerpo). Por tanto, el segundo antígeno ordinariamente no será (pero podría serlo) el FCEL. No obstante, en ciertas circunstancias, el segundo antígeno será una proteína presente en el paciente a ser tratado, por ejemplo, cuando tales proteínas han de servir como portadores o liberadora de depósitos para los anticuerpos terapéuticos en la presente invención.

Tales anticuerpos monovalentes para la IgE se preparan mediante procedimientos conocidos per se. Por ejemplo, el ADN que codifica las cadenas ligera y pesada del Fv de IgE se liga con ADN que codifica la Fc de un anticuerpo receptor humano. Además, se proporciona el ADN que codifica las cadenas ligera y pesada para un anticuerpo capaz de unir un segundo antígeno o un antígeno no identificado, o que codifica cadena ligera o pesada que tiene suficientes residuos suprimidos de los CDR como para que ya no pueda darse la unión de antígeno que no es IgE. Se transforma un huésped recombinante convencional con la totalidad de los cuatro ADN y se recuperan los productos. Asumiendo un surtido aleatorio de cadenas, una subpoblación de productos del anticuerpo contendrá un brazo con la cadena pesada y ligera de IgE y, al menos otro brazo que tendrá especificidad por el segundo antígeno o por ningún antígeno. La subpoblación deseada se purifica a continuación mediante procedimientos convencionales, por ejemplo, absorción por inmunoafinidad o mediante cribado molecular. Estos anticuerpos también pueden prepararse mediante reducción de los anticuerpos de partida, seguida por recombinación oxidativa de la cadena, tal como se ha empleado hasta la fecha en la preparación de anticuerpos monovalentes (ver, por ejemplo, Glennie et al., Nature 295:712 (1982)).

Además de la monovalencia por la IgE, en otras realizaciones se modifican los anticuerpos de forma que contengan una proporción máxima de secuencia humana (medida con retención de la actividad requerida o deseada), es decir, son convertidos en quimeras o son humanizados. En ambos casos, el efecto funcional es colocar la capacidad unidora anti-IgE del anticuerpo de ratón u otro anticuerpo donante en un entorno humano para hacerlo tan no inmunogénico como sea posible. Los procedimientos generales para preparar quimeras y anticuerpos humanizados son bien conocidos (tal como se ha destacado más arriba). Se sustituye una cantidad mínima de secuencia de anticuerpo que no es humano en el anticuerpo humano receptor. Típicamente, los residuos que no son humanos se sustituyen en V_{H}, V_{L}, la interfaz V_{H}-V_{L}, o la estructura del anticuerpo humano receptor. Generalmente, los CDR de Kabat de los anticuerpos humanizados son aproximadamente un 80%, y más típicamente aproximadamente un 90% homólogos con los CDR donantes que no son humanos. Por otra parte, los residuos de la interfaz V_{H}-V_{L} y de la estructura del anticuerpo humano son aproximadamente un 80%, ordinariamente un 90%, y preferiblemente aproximadamente un 95%, homólogos con el anticuerpo receptor. La homología se determina mediante el alineamiento máximo de los residuos idénticos. El anticuerpo resultante es (a) menos inmunogénico en humanos que el anticuerpo de ratón, y (b) es capaz de unirse a huIgE unida a FCEL, pero es sustancialmente incapaz de unirse a huIgE unida a FCEH. Tales anticuerpos típicamente comprenden un anticuerpo humano que está sustituido por un residuo aminoácido procedente de una región determinante de la complementariedad (CDR), la interfaz V_{L}-V_{H}, o una región estructural de un anticuerpo anti-IgE que no es humano, el cual es capaz de unir. Uno o más, y preferiblemente todos, de los CDR L1, L2, L3, H1, H2 o H3 que no son humanos son sustituidos en el anticuerpo humano receptor.

Para un uso terapéutico se prefirieron las características poseídas por el anticuerpo MAE11. Puesto que el MAE11 se unión a IgE soluble, se unión a células B portadoras de IgE, bloqueó la unión de la IgE al receptor de baja y alta afinidad de la IgE, inhibió in vitro la producción de IgE, y no consiguió unirse a basófilos recubiertos de IgE, se escogió como el anticuerpo donante para su humanización. El anticuerpo receptor fue la cadena kappa (ligera) humana del subgrupo I y la cadena pesada del subgrupo III de Kabat, aunque se comprenderá que puede emplearse convenientemente cualquier otro anticuerpo humano. De forma sorprendente, los resultados óptimos no se obtuvieron mediante sustituyendo simplemente los CDR de ratón en lugar de los CDR en un anticuerpo humano receptor (Figura 3; Tabla 4, ver más abajo). En cambio, fue necesario restablecer los residuos hidrofóbicos estructurales del donante, tales como los 78, 48, 49, 63, 67; 82 u 82c de V_{H}, o los 13, 19, 58, 78 ó 104 de la V_{L}, con objeto de conseguir un grado de inhibición de la unión de la IgE similar al del anticuerpo donante. Mientras que estos residuos funcionan para establecer la conformación de los CDR, ellos no están generalmente expuestos al exterior del anticuerpo, de forma que el uso de residuos de ratón no debiera causar un impacto significativamente sobre la inmunogenicidad. Otros residuos que no son de CDR que ejercen un efecto sobre la unión incluyeron los V_{H} 60, 61, 37, 24, y los V_{H} 50, 52, 58 y 95 (que no son del CDR según Clothia), y los V_{L} 4, V_{L} 33 (que no son del CDR según Clothia) y el V_{L} 53 (que no es del CDR según Clothia). Los residuos hidrofóbicos estructurales humanos generalmente son sustituidos por otros residuos hidrofóbicos (especialmente aquéllos procedentes del anticuerpo donante) tales como la valina, isoleucina, leucina, fenilalanina o metionina. Los residuos restantes que no son del CDR son sustituidos con cualquier otro residuo aminoácido, pero, una vez más, preferiblemente por el residuo de ratón que se halla en el sitio análogo.

En general, el carácter del anticuerpo anti-IgE se mejora sustituyendo, suprimiendo o insertando un residuo en, o adyacente a, los sitios de la V_{L} 30, 30b, 30d, 33, 55, 57, 58, 78, 93 ó 104 (los residuos 30, 30a, 30b, 30c, 30d se identifican con referencia a la secuencia DYDGD en la secuencia de cadena ligera ilustrada en la Figura 3) y/o los residuos de la V_{H} 24, 37, 48, 49, 54, 57, 60, 61, 63, 65, 67, 69, 78, 82, 82c, 97, 100a ó 100c.

La posición V_{H}-78 se sustituye más preferiblemente con fenilalanina. No obstante, también se sustituye con leucina, valina, isoleucina, metionina, alanina o cualquier otro residuo que resulte en una mejora de las características del anticuerpo (ver más abajo).

La posición V_{H}-60 se sustituye más preferiblemente con asparagina, aunque la sustitución con glutamina, histidina, lisina, arginina o cualquier otro residuo que mejore las características del anticuerpo cae dentro del ámbito de esta invención.

La posición V_{H}-61 se sustituye más preferiblemente con prolina, aunque la sustitución con glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina o cualquier otro residuo que resulte en una mejora de las características del anticuerpo también es apropiado.

Los residuos del CDR se importaron a partir del MAE11 donante. Estos incluyeron cuatro insertos en V_{L1} 30a-30d, así como 91-94 (V_{L3}), V_{H1} 27-29, 29a, 33 y 34, V_{H2} 53-55 y V_{H3} 97-101. V_{L} 30, 30b o 30d, así como V_{H} 97, 100a o 100c, son importantes para conferir al CDR la capacidad de unir la IgE.

La posiciones 97, 100a y 100c de la V_{H} en humae11 (MAE11 humanizado) son todas ellas histidinas, y 2 son arginina en MAE15. Estos residuos son importantes en la unión de la IgE. Uno, dos o tres de estos se modifican mediante sustitución con residuos básicos, particularmente lisina o arginina, pero también con alanina, glicina, valina, isoleucina, serina, treonina, ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina, metionina, fenilalanina, tirosina, triptófano, o prolina.

Las posiciones 30, 30b y 30 de la V_{L} del humae11 son también importantes para unir la IgE. En el humae11 cada una de estas posiciones está ocupada por el residuo ácido, ácido aspártico. Ellas son sustituidas en otras realizaciones por ácido glutámico, pero podrían sustituirse también por alanina, glicina, valina, isoleucina, serina, treonina, asparagina, glutamina, metionina, fenilalanina, tirosina, triptófano o prolina. Se encuentra dentro del ámbito de esta invención invertir las cargas de las posiciones V_{L} 30, 30b y 30d con aquéllas de las V_{H} 97, 100a y 100c, por ejemplo, empleando residuos de ácido aspártico en los tres sitios V_{H} (2 en el caso del MAE15 humanizado) e histidina en los tres
sitios V_{L}.

Los residuos también podrían insertarse adyacentes a las posiciones V_{H} 97, 100, 100c, 61 o 61, o los residuos de V_{L} en las posiciones 30, 30b, 30d o 78. Los residuos insertados generalmente serán del mismo tipo, por ejemplo, se insertaría un residuo ácido adyacente a V_{L}-30, 30b o 30d, mientras que un residuo básico se inserta adyacente a V_{H}-97, 100 ó 100c. También podrían suprimirse los residuos en los tres sitios.

Los anticuerpos monovalentes para la IgE humanizados también se incluyen dentro del ámbito de esta invención. En este caso, la humanización se extiende al brazo anti-IgE así como, si es necesario, al (a los) brazo(s) restante(s). Por supuesto, los brazos que no son unidores de la IgE pueden originarse a partir de anticuerpos humanos y en tal caso no requerirán humanización.

Las variaciones anteriores se construyen introduciendo mutaciones en el ADN que codifica la forma precursora del anticuerpo, y expresando el ADN en cultivos de células recombinantes o similares. Esto se consigue mediante procedimientos convencionales de mutagénesis dirigida contra un sitio. A continuación se examinan las variantes en busca del carácter deseado en ensayos convencionales per se. En el caso de anti-huIgE, el carácter deseado incluye incrementar la afinidad del anticuerpo por la huIgE, incrementar su capacidad y especificidad por la IgE unida a FCEL, incrementar la concentración de anticuerpo requerida para estimular la liberación de histamina a partir de mastocitos o basófilos, reducir la inmunogenicidad en humanos, y otras mejoras evidentes al técnico común. La optimización de estos caracteres frecuentemente requerirá equilibrar una mejora respecto otra, y, por tanto, es un asunto a juzgar y depende de los parámetros de prestaciones dictados por el uso pretendido del anticuerpo.

Es preferible usar una IgG1 humana (u otro anticuerpo fijador de complemento) como la inmunoglobulina receptora para la humanización, aunque también pueden usarse como receptoras las hu IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM, IgD o IgA. Preferiblemente el receptor es un anticuerpo IgG que fija el complemento o un anticuerpo IgG capaz de participar en la ADCC.

Usos terapéuticos, diagnósticos y preparatorios

Los anticuerpos en la presente invención son útiles para identificar variantes de la secuencia de aminoácidos de la IgE en las que los dominios unidores de FCEL o FCEH han sido modificados. Los polipéptidos candidatos específicos para el FCEL o FCEH se incuban con estos anticuerpos, y análogos a los que estos anticuerpos no consiguen unirse se seleccionan para su ulterior evaluación, por ejemplo, determinación, respectivamente, de sus características de unión al receptor FCEH y FCEL. Cualquier anticuerpo, tanto si es de ratón, humano, o originario de otra especie animal, o una variante de los mismos como las inmunoglobulinas humanizadas descritas más arriba, que tenga la especificidad epitópica de cualquiera de los anticuerpos MAE10-MAE17 (especialmente MAE11/15, MAE13 o MAE17) será igualmente aceptable. Tales anticuerpos se identifican fácilmente inmunizando un animal apropiado o usando un sistema de selección de Fv in vitro, por ejemplo, un fagémido, con la IgE con origen animal apropiado, y examinando los animales o productos en busca de anticuerpos que tengan la capacidad de competir por la IgE con el MAE11/15, 13, 17, u otros anticuerpos que contengan sustancialmente el(los) mismo(s) sitio(s) epitópico(s) que aquéllos descritos en la presente invención. Tal como se ha destacado, los anticuerpos son deseablemente monovalentes para la IgE unida a FCEL cuando se emplean terapéuticamente. Ellos podrían se bivalentes y/o biespecíficos cuando se usan para purifica IgE a partir de plasma, suero, o cultivos celulares recombinantes.

Los anticuerpos anti-IgE (especialmente aquéllos con inmunogenicidad reducida) son útiles en terapias para el tratamiento o profilaxis de las alergias.

Los anticuerpos típicamente se administran a pacientes que se sabe están sensibilizados a un alérgeno, preferiblemente antes de una respuesta alérgica aguda. Las dosis y la vía de administración dependerán de los funcionalidades accesorias que acompañen al anticuerpo (por ejemplo, agentes citotóxicos, funciones efectoras de inmunoglobulinas, etc.), la condición del paciente (incluyendo la población de células B o mastocitos y basófilos), la vida media del anticuerpo, la afinidad del anticuerpo por su receptor, y otros parámetros conocidos por el clínico. Como guía general, se determinará a partir de ensayos sanguíneos la cantidad de células diana circulando en el paciente, y se determinará la cantidad de anticuerpo para desplazar o competir efectivamente con la IgE endógena, tomando en consideración la población de receptores FCEH así como la vida media y afinidad del anticuerpo por la IgE.

Los polipéptidos terapéuticos se administran mediante vía intravenosa, intrapulmonar, intraperitoneal, subcutánea y otras vías apropiadas. Preferiblemente, los polipéptidos se administran s.c. o i.v. a lo largo de un período de aproximadamente 1 a 14 días, según se precise. En el caso de suprimir la síntesis de IgE, se determinará la cantidad de anticuerpo anti-IgE necesario para inhibir, suprimir o destruir una porción sustancial de la población de células B que secretan IgE. La inhibición o supresión de la población de células B incluye una de, o ambas de las reducciones en la secreción de IgE y la atenuación del número total de células B que secretan IgE. Las dosis candidatas se determinan fácilmente mediante el uso de cultivos de células in vitro o animales modelo.

La terapia de los desórdenes alérgicos con anti-IgE unida a FCEL opcionalmente se consigue con otras terapias conocidas para alergias. Estas incluyen la administración de interferón gamma, la desensibilización al alérgeno, la reducción en la exposición al alérgeno, el tratamiento con antihistamínicos, y similares.

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Ejemplo 1

Preparación de anticuerpos monoclonales contra la IgE

Se usaron ocho anticuerpos monoclonales con la capacidad de bloquear la unión de la IgE al FCEH. Estos anticuerpos monoclonales, denominados como MAE10-MAE17, se prepararon de la siguiente manera. Se preparó IgE humana purificada a partir de sobrenadantes de células U266B1 (ATCC TIB 196) usando cromatografía de afinidad sobre un anticuerpo anti-IgE previamente aislado (Genentech MAE1, aunque otros anticuerpos anti-IgE son igualmente útiles). Para MAE12, se inmunizaron cinco ratones hembras BALB/c, de seis semanas de edad, en su plantas de los pies con 10 \mug de IgE purificada en adyuvante de Ribi. La inyecciones subsiguientes se realizaron de la misma forma una y tres semanas después de las inmunizaciones iniciales. Tres días después de la inyección final, se retiraron los nodos linfáticos inguinal y popliteal y se juntaron, y se preparó una única suspensión de células pasando el tejido a través de una tela metálica de acero. Para MAE14, MAE15 y MAE13, las inmunizaciones se realizaron de una forma similar, excepto que para el MAE13 se usaron 30 \mug de IgE por inyección, y que se usó la IgE 315-547 como un estimulante de pre-fusión; para MAE14 y MAE15 se usaron cinco inyecciones de 50 \mug cada una; y el inmunogén de IgE para MAE17 fue la IgE 315-547. Para MAE10 y MAE11, la inyecciones se administraron subcutáneamente en dos dosis de 100 \mug y un estímulo final de 50 \mug, y se usaron células del bazo para las fusiones. Las células se fusionaron en una proporción de 4:1 con mieloma de ratón P3X63-Ag8.653 (ATCC CRK 1580) en medio DMEM con glucosa elevada conteniendo 50% p/v de polietilenglicol 4000.

Las células fusionadas se sembraron a una densidad de 2\times10^{5} por pocillo en placas de cultivo de 96 pocillos. Transcurridas 24 horas se añadió medio selectivo HAT (hipoxantina/aminopteridina/timidina, Sigma Chemical Company, #H0262). De 1440 pocillos sembrados, 365 contenían células creciendo después de la selección con HAT.

Quince días después de la fusión, se ensayaron los sobrenadantes, en busca de la presencia de anticuerpos específicos para la IgE humana, usando un ensayo de inmunosorción unido a enzima (ELISA). El ELISA se realizó como sigue, realizándose todas las incubaciones a temperatura ambiente. Las placas de ensayo (Nunc Immunoplate) se recubrieron durante 2 horas con IgG anti-ratón de rata (Boehringer Mannheim, #600-500) a 1 \mug/ml en tampón carbonato sódico 50 mM, pH 9,6; a continuación se bloquearon con albúmina de suero bovino al 0,5% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 30 minutos; entonces se lavaron cuatro veces con PBS que contenía Tween 20 al 0,05% (PBST). Se añadieron los sobrenadantes de ensayo y se incubaron dos horas con agitación, a continuación se lavaron cuatro veces con PBST. La IgE humana (purificada a partir de células U266, tal como se ha descrito más arriba) se añadió a 0,5 \mug/ml, y se incubó durante una hora con agitación, a continuación se lavó cuatro veces con PBTS. Se añadió anticuerpo de cabra anti-IgE conjugado con peroxidasa de rábano silvestre (Kirkegaard & Perry Labs, #14-10-04, 0,5 mg/ml) a una dilución 1:2500, y se incubó durante una hora, a continuación se lavó cuatro veces con PBTS. Se revelaron las placas mediante la adición de 100 \mul/pocillo de una solución que contenía 10 mg de dihidrocloruro de o-fenilendiamina (Sigma Chemical Company, #P8287) y 10 \mul de una solución de peróxido de hidrógeno al 30% en 25 ml de tampón de citrato-fosfato, pH 5,0, e incubando durante 15 minutos. Se detuvo la reacción añadiendo 100 \mul/pocillo de ácido sulfúrico 2,5 M. Los datos se obtuvieron leyendo las placas en un lector automático de placas de ELISA a una absorbancia de 490 nm. Para MAE12, se ensayaron 365 sobrenadantes y 100 fueron específicos para la IgE humana. Se obtuvieron frecuencias de especificidad similares cuando se examinaron los otros anticuerpos. Todos los anticuerpos monoclonales descritos en la presente invención fueron del isotipo IgG1, excepto el MAE17, el cual era una IgG2, y MAE14, el cual era una IgG2a.

Cada uno de los anticuerpos específicos para la IgE fue ensayado además en ensayos basados en células y en ensayos en placa para seleccionar anticuerpos que unieran la IgE de tal forma que inhibieran la unión de la IgE al FCEH, y que no fueran capaces de unir la IgE unida a FCEH. Los resultados de estos ensayos se detallan más abajo en la Tabla 1a y Tabla 1b.

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1

2

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1. Ensayos basados en FACS para el análisis de monoclonales anti-IgE humana. Examen de la unión de monoclonales de ratón anti-IgE humana a IgE sobre CHO 3D10 (FcERI alpha +).

a.

Se incubaron células CHO 3D10 (transfectante estable de la cadena alfa del FcERI; Hakimi et al., J. Biol. Chem. 265:22079), a 5\times10^{5} células por muestra, con IgE de U266 estándar (lote nº 13068-46) a 10 \mug/ml en 100 \mul de tampón FACS (0,1% BSA, azida sódica 10 mN, en PBS, pH 7,4), durante 30 minutos a 4ºC, seguida por un lavado con tampón FACS. La cantidad de unión de IgE se determina incubando una alícuota de células cargadas con IgE con una IgG policlonal anti-humana de conejo conjugada con FITC (Accurate Chem. Co. AXL-475F, lote nº 16), a 50 \mug/ml, durante 30 minutos a 4ºC, seguida por tres lavados con tampón FACS.

b.

Se incubaron células cargadas con IgE con 100 \mul de sobrenadante de hibridoma de IgE anti-humana de ratón (concentración de IgG de ratón oscilando desde 1 hasta 20 \mug/ml), durante 30 minutos a 4ºC, seguida por un lavado con tampón FACS. Se usó un anticuerpo monoclonal anti-IgE humana (MAE1) a 10 \mug/ml como control positivo de la unión. El anticuerpos monoclonal de Genentech (MAD 6P) que no reconoce la IgE se usó a 10 \mug/ml como control negativo.

c.

La unión del monoclonal a la IgE humana sobre células CHO se detectó incubando las células con 20 \mug/ml de F(ab)2 de cabra anti-IgG de ratón purificado por afinidad (Organon Teknica, nº de catálogo 10711-0081), durante 30 minutos a 4ºC, seguido por tres lavados con tampón FACS. Se añaden las células a 400 \mul de tampón conteniendo 2 \mug/ml de yoduro de propidio (Simga, nº de catálogo P4170) para teñir células muertas.

d.

Se analizaron las células en un citómetro de flujo Becton Dickinson FACSCAN. Las puertas para la dispersión hacia adelante de la luz y la dispersión a 90 grados se ajustan para analizar una población de células homogénea. Las células muertas, que se tiñen con yoduro de propidio se excluyeron de los análisis. Los sobrenadantes de hibridomas que no unían la IgE sobre células CHO 3D10 se consideraron candidatos para su ulterior examen.

2. Liberación de histamina a partir de basófilos de sangre periférica:

La sangre heparinizada se obtuvo a partir de donantes normales y se diluyó 1:4 en un tampón Tyrodes modificado (Tris 25 mM, NaCl 150 mM, CaCl_{2} y MgCl_{2} 10 mM, 0,3 mg/ml de HSA, pH 7,35), se incubaron a continuación con IgE humana 1 nM (ND) a 4ºC durante 60 minutos. A continuación se añadieron las células al tampón Tyrodes que contenía o el Ab monoclonal anti-IgE de ratón (10 mg/ml) o un antisuero policlonal anti-humano como control positivo, y se incubaron a 37ºC durante 30 minutos. Se precipitaron las células, se acetiló la histamina en el sobrenadante, y se determinó el contenido en histamina usando un equipo RIA (AMAC, Inc., Wesbrook, Main). La histamina total se determinó a partir de células sometidas a varias rondas de congelación y descongelación. El porcentaje de liberación de histamina se calculó como contenido nM de histamina en el sobrenadante - nM histamina liberada espontáneamente, dividido por la histamina nM total en la muestra.

3. Bloqueo de IgE conjugada con Fitc que se une a la cadena alfa del FcERI.

El efecto de los anticuerpos sobre la unión a la IgE se estudió preincubando IgE marcada con FITC con los diversos anticuerpos MAE, a 37ºC durante 30 minutos, en PBS que contenía el 0,1% de BSA y azida sódica 10 mM, pH 7,4; incubando a continuación el complejo con 5\times10^{5} células 3D10 a 4ºC durante 30 minutos. A continuación se lavaron las células tres veces y se midió la fluorescencia promedio del canal a 475 nM. Como control se usó un anticuerpo anti-IgE humana de ratón (MAE1) que no bloquea la unión de la IgE a la cadena alfa del FcERI.

4. Análisis de la unión de [...] de ratón anti-IgE humana a la membrana de células B U266 positivas para la IgE.

a.

Se cultivan células B U266 (+ para IgE en membrana) en medio base suplementado con 15% de suero fetal bovino desactivado mediante calor (Hyclone nº de catálogo A-1111-L), penicilina, estreptomicina (100 unidades/ml) y L-glutamina (2 mM).

b.

Se incuban las células (5\times10^{5}/alícuota) en 100 \mul de tampón FACS conteniendo monoclonales de ratón anti-IgE humana a 10, 55, 1, 0,5 y 0,1 \mug/ml, durante 30 minutos sobre hielo, en placas de microvaloración de 96 pocillos de fondo redondeado, seguido por dos lavados con tampón FACS. El monoclonal MAE1 de Genentech se usó como control positivo.

c.

Se incubaron las células en 100 \mul de tampón FACS que contenía 50 \mug/ml (1:20 de reserva) de IgG F(ab')2 anti-ratón de cabra, purificada por afinidad, conjugada con FITC (Organon Teknica, nº de catálogo 1711-0084), durante 30 minutos sobre hielo, seguida por tres lavados con tampón FACS. Las células se añadieron a 400 \mul de tampón FACS conteniendo yoduro de propidio a 2 \mug/ml para teñir las células muertas.

5. Ensayos de unión, basados en FACS, a células B IM9 FcERII(CD23+).

a.

Análisis FACS de la unión de la IgE a la línea celular B IM0 FcERII(CD23)(+). Las células B IM9 de mieloma (ATCC CCL 159 (Ann. N.Y. Acad. Sci. 190:221-234 (1972)) se mantuvieron en medio base GIF con un 10% de suero fetal bovino, desactivado mediante calor, penicilina, estreptomicina (100 unidades/ml), y L-glutamina (2 mM).

b.

Las células (5\times10^{5}) se incubaron en 100 \mul de tampón FACS que contenía IgE U266 estándar a 2 \mug/ml, durante 30 minutos a 4ºC, en placas de microvaloración de 96 pocillos, seguida por dos lavados con tampón FACS. Como control, las células se cultivaron en tampón solo o tampón que contenía 2 \mug/ml de Ig1 humana (Behring Diagnostics, nº de catálogo 400112, lote nº 801024).

c.

A continuación se incubaron las células con monoclonales de ratón anti-IgE humana, a 0,1 hasta 10 \mug/ml, durante 30 minutos sobre hielo. El monoclonal MAE1 de Genentech se usó como control positivo.

d.

Se incubaron las células en 100 \mul de tampón FACS que contenía IgG F(ab')2 anti-ratón de cabra a 50 \mug/ml (Organon Teknica, nº de catálogo 1711-0084), durante 30 minutos a 4ºC, seguida por tres lavados con tampón FACS.

e.

Las células se añadieron a 400 \mul de tampón FACS conteniendo yoduro de propidio a 2 \mug/ml para teñir las células muertas.

f.

Las células se analizaron en un citómetro de flujo FACSCAN de Becton Dickinson. Las puertas para la dispersión hacia adelante de la luz y la dispersión a 90 grados se ajustan para analizar una población de células homogénea, y las células muertas, que se tiñen con yoduro de propidio, se excluyeron de los análisis. Las células positivas para el FITC (unidoras de la IgE) se analizaron en relaciona a las células teñidas con FITC-anticuerpo de conejo anti-IgE humana solo.

g.

Como control positivo para determinar el nivel de CD23 sobre la superficie de las células IM9 en cada experimento, se tiñó una alícuota de células con el monoclonal Leu 20 de ratón (anti-CD23) de Becton Dickinson a 10 \mug/ml, durante 30 minutos a 4ºC, seguida por 2 lavados. A continuación se incubaron las células con f(ab')2 de cabra anti-IgG de ratón, purificados por afinidad, conjugados con FITC.

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6. Bloqueo con anticuerpos de la unión de IgE conjugada con FITC al receptor de baja afinidad de la IgE.

La unión de IgE 40 nM marcada con FITC al receptor de baja afinidad de la IgE (CD23) expresado sobre células linfoblastos B IM-9 se analizó mediante citometría de flujo en un citómetro de flujo FACSCAN. El efecto de los anticuerpos sobre la unión de la FITC-IgE se estudió preincubando FITC-IgE de ratón con anticuerpos quimera anti-humanos a 0,1 hasta 10 \mug/ml, a 37ºC durante 30 minutos, en PBS que contenía 0,1% de BSA y azida sódica 10 mM, pH 7,4, incubando a continuación el complejo con 5\times10^{5} células a 4ºC durante 30 minutos. Las células se lavaron entonces tres veces y se midió la fluorescencia promedio del canal a 475 nm.

7. Protocolo de ensayo in vitro de la IgE.

a.

Se separaron células mononucleares de la sangre de donantes normales.

b.

Se lavaron extensivamente las células con solución salina tamponada con fosfato para suprimir tantas plaquetas como fuera posible.

c.

Las células mononucleares se contaron y resuspendieron en medio a 1\times10^{6} células/ml (Medio=DMEM + pen/strep + 15% suero de caballo + IL-2 (25 U/ml) + IL-4 (20 ng/ml)).

d.

Se añadieron anticuerpos a las concentraciones apropiados en los días 0, 5 y 8.

e.

Los cultivos se incubaron en placas de cultivo Falcon de 24 pocillos durante 14 días.

f.

El día 14 se recogieron los sobrenadantes y se ensayó su concentración de IgE mediante un protocolo ELISA específico para la IgE.

8. La constante de afinidad (kd) de los mAb de ratón por la IgE humana se determinó mediante unión en equilibrio (análisis de Scatchard) como sigue:

a.

Los alotipos ND y PS de la IgE se yodaron mediante el procedimiento de la cloramina T, y se separaron del ^{125}I Na libre con una columna Sephadex G25 PD10 (Pharmacia, nº de catálogo 17-0851-01) en tampón RIA:PBA, 0,5% de albúmina de suero bovino (Sigma, nº de catálogo A-7888), 0,05% de Tween-20 (Sigma, nº de catálogo P-1379), 0,01% de Thimerosal (Sigma, nº de catálogo T-5125), pH 7,4. Se precipitaron aproximadamente el 78-95% de las cuentas posteriores a la columna con ácido tricloroacético al 50% y la actividad específica de las preparaciones de IgE yodada oscilaron entre 1,6 y 13 \muCi/\mug, asumiendo una eficiencia de recuento del 70%.

b.

Se añadió una concentración fija de ^{125}I IgE (aproximadamente 5\times10^{4} c.p.m.) a diferentes concentraciones de IgE sin marcar (1 a 200 mM) en un volumen final de 0,1 ml de tampón RIA, en tubos de polipropileno de 12\times75 mm. Entonces se añadieron los mAB anti-IgE humana (concentración final: 20 nM) en 0,1 ml de tampón RIA para un volumen de ensayo final de 0,2 ml.

c.

Las muestras se incubaron durante 16-18 horas a 25ºC con agitación continua.

d.

La ^{125}I IgE unida y libre se separaron mediante la adición de 0,3 ml de una mezcla de IgG anti-ratón de cabra purificada por afinidad (Boehringer Mannheim, nº de catálogo 605 208) acoplada Sepharose 4B activada con CNBr (nº de catálogo 17-0430-01) y Sepharose Proteína A portadora (Repligen, nº de catálogo IPA 300), en tampón RIA, y se incubaron de 1 a 2 horas a 25ºC con agitación continua. Entonces se añadió tampón RIA (1 ml), y se centrifugaron los tubos 5 minutos a 400 \timesg. Las muestras se contaron para determinar las cuentas totales. Los sobrenadantes se aspiraron con una pipeta Pasteur delicadamente estirada, las muestras se contaron de nuevo, y se calcularon las cuentas unidas respecto las cuentas libres.

e.

El análisis de Scatchard se realizó usando un programa en Fortran (scanplot) basado en el programa Ligand escrito por P. Munson en el NIH. Scatplot usa un ajuste unido de acción de masas como una función del total usando el análisis de regresión del tipo Rodbard.

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Ejemplo 2

Preparación de variantes de la IgE

En base al modelo de Fc IgE de Padlan y Davies (Mol. Immunol. 23:1063 (1986)), el cual se basa en la estructura cristalina del Fc IgG1 humano (Deisenhofer, Biochem 20:2361-2370 (1981)), se diseñaron una serie de mutantes que podían usarse para ensayar la unión de la IgE humana a sus receptores. Estos mutantes se denominaron Emut 1-13, y se listan en la Tabla 2 siguiente. El dominio Fc\epsilon3 está formado por siete hebras-\beta, las cuales forman una estructura de hoja-\beta representativa de todos los dominios de inmunoglobulinas; hay seis bucles que conectan estas siete hebras-\beta. Nos referimos a estos bucles por las hebras-\beta que los conectan, por ejemplo, el bucle AB conecta las hebras-\beta A y B. Hemos construido mutantes de la IgE humana en los que hemos sustituido cinco de los bucles del dominio Fc\epsilon3 por sus contrapartidas procedentes de la IgG1 humana (Tabla 2, 1-5). El sexto bucle contiene el sitio de glicosilación tanto en IgE como en IgG y, por tanto, no se alteró. Un mutante (Tabla 2, 6) se construyó intercambiando la hebra-\beta D del Fc\epsilon3 humano por su contrapartida Fcgamma2 de la IgG1 humana. Siete mutantes adicionales (Tabla 2, 7-13) consistieron en la sustitución de residuos Ala en las hebras-\beta del Fc\epsilon3 y de un bucle en el Fc\epsilon2.

Se clonó un gen de la IgE humana procedente de U266, una línea celular disponible públicamente. El gen se clonó en un vector fagémido previamente descrito que contenía el potenciador y promotor del citomegalovirus humano, un intrón 5', y la señal de poliadenilación del sv40 (Gorman et al., DNA and Prot. Eng. Techn. 2:3-10 (1990)). La mutagénesis se realizó mediante el procedimiento de Kunkel (T. A. Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)) usando tampones y enzimas proporcionados con el equipo de mutagénesis in vitro de fagémido Muta-gene de BioRad, junto con los oligonucleótidos que codificaban las secuencias de la IgG1 humana mostradas en la Tabla 2 siguiente. Las secuencias de los ADN de IgE mutante se comprobaron sólo en el sitio de mutación usando la secuenciación con ^{35}S dideoxi.

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3

Las IgE mutantes se expresaron transitoriamente en células 293 de riñón embrionario humano (Gorman et al., ver más arriba), se purificaron sobre una columna de afinidad de anticuerpo de ratón anti-IgE humana, y se analizaron las muestras usando SDS-PAGE para verificar que las proteínas mutantes tenían el peso molecular apropiado.

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Ejemplo 3

Ensayo de unión de la IgE soluble

Este ensayo se un ELISA de inhibición secuencial que mide sólo la unión al FCEH. En este ensayo, se recubren placas de ELISA con un anticuerpo monoclonal contra el FCEH, a una concentración de 1 \mug/ml en carbonato sódico 50 mM, pH 9,6, durante dos horas a temperatura ambiente, y se bloquean durante dos horas con PBS conteniendo un 0,5% de albúmina de suero bovino (PBSA), a continuación se lavan tres veces con tampón de lavado de ELISA (0,05% Tween 20 en PBS). Se añade FCEH soluble producido de forma recombinante a una concentración de 50 unidades/ml y se incuba durante una hora, entonces se lava cinco veces con tampón de lavado de ELISA. A continuación se añaden las muestras de IgE mutante a los pocillos a 50 ng/ml durante 15 minutos, seguidas por cinco lavados con tampón de lavado de ELISA. Se añade estreptoavidina conjugada con peroxidasa de rábano silvestre (Sigma Chemical Company, #S5512) a una dilución 1:5000 durante 15 minutos, a continuación se lava tres veces con tampón de lavado de ELISA. El color se reveló con un sistema de sustrato de peroxidasa de tetrametilbencidina (Kirkegaard & Perry Labs, #50-76-00, nº de lote NA 18) durante siete minutos a 25ºC. Se detuvo la reacción mediante la adición de HCl 1 M. La capacidad del mutante de la IgE para unirse al FCEH se evalúa por el grado con el que se impide la unión de la IgE biotinilada. Este ensayo está diseñado para ensayar cualquier tipo de unión al FCEH por parte de la IgE mutante, y no se pretende que determine la afinidad del mutante por el FCEH respecto la IgE nativa.

Ensayos basados en FACS para mutantes de la IgE de U266

Los sobrenadantes de cultivos de tejidos de células 293 transfectadas con el cADN de la IgE de U266 se recolectaron a la 48 o a las 96 horas posteriores a la transfección. Los sobrenadantes del cultivo de tejidos se concentraron 5 veces con concentradores centrífugos Amicon Centriprep 30® (PM de corte de 30.000). Los sobrenadantes concentrados se pasaron a través de una columna de afinidad de monoclonal de ratón anti-IgE de U266 (Genentech MAE1 acoplado a CNBr-Sepharose). La IgE de U266 se eluyó de la columna con cianato potásico 3,0 M en tampón Tris 50 mM, pH 7,8. Las fracciones eluidas que contenían proteína, según se determinó mediante OD a 280 nm, se juntaron y colocaron en concentradores Amicon Centricon 30®. El tampón de elución se cambio por PBS haciendo pasar varios volúmenes de PBS a través del concentrador. El volumen final de sobrenadante purificado mediante afinidad osciló entre 0,5-1 ml. La integridad estructural de los mutantes de IgE recombinantes se analizó sobre geles de SDS-PAGE al 1-12%, y se comparó con IgE de U266 estándar obtenida a partir de la línea celular U266. Los mutantes también se analizaron por su capacidad para unirse a una serie de anticuerpos monoclonales y anticuerpos para IgE para verificar aún más el correcto plegamiento e identidad estructural con la IgE nativa. La concentración de IgE inmunoreactiva para cada mutante de la IgE se determinó tal como sigue mediante un ELISA de captura de IgE humana. Se recubrieron placas Immunoplate Maxisorp® de Nunc (Nunc, #4-39451) a lo largo de la noche a 4ºC con una IgG1 de ratón anti-IgE de U266 de Genentech (MAE1) a 1 \mug/ml en tampón de recubrimiento (tampón carbonato sódico 50 mM, pH 9,6). El anticuerpo de recubrimiento se suprimió mediante tres lavados con tampón de lavado de ELISA (0,05% Tween-20 (US Biochemical Corporation, #20605) en PBS). Los sitios no específicos fueron bloqueados con tampón diluyente de ELISA (solución salina tamponada con Tris 50 mM, conteniendo un 0,5% de BSA (Sigmal Chemical Company, #A-7888), 0,05% de Tween-20, y EDTA 2 mM), durante dos horas a 25ºC, en un agitador orbital. Se retiró el tampón de dilución con 3 lavados con tampón de lavado de ELISA. Se añadieron a la placa diluciones en serie a la mitad de mutantes de la IgE en tampón de dilución de ELISA. Se añadió IgE de U266 estándar (lote 13068-46) a 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,3 y 15,6 ng/ml por duplicado como estándar. Las muestras y el estándar se incubaron dos horas a 25ºC, seguida por tres lavados con tampón de lavado de ELISA. La IgE se detectó con anticuerpo de oveja anti- IgE humana conjugado con HRP (ICN, #N060-050-1), a 1:8000 en tampón de dilución de ELISA, durante 90 minutos a 25ºC, seguida por tres lavados con tampón de lavado de ELISA. El conjugado con HRP se reveló con un sistema de sustrato de peroxidasa de tetrametilbencidina (Kirkegaard & Perry Labs, #5076-00, nº de lote NA 18) durante 7 minutos a 25ºC. Se detuvo la reacción mediante la adición de HCl 1 M. El producto de la reacción se analizó con un espectrofotómetro de doble longitud de onda a 450 nm menos la absorción a 570 nm. Los estándares de IgE de U266 se usaron para generar una curva estándar y las concentraciones de IgE de la muestra se extrapolaron mediante análisis de regresión lineal no paramétrico.

Se usaron líneas celulares B, FcERI alpha (+) CHO 3D10 (expresando el FCEH) y FcERII (CD23) (+) IM9 (expresando el FCEL), para los ensayos de unión. El clon celular 3D10 de CHO (duk-) establemente transfectado (JBC 265:22079-22081 (1990)) se mantuvo en medio de Dulbecco modificado por Iscove, suplementado con un 10% de suero fetal bovino desactivado, 80 \mug/ml de sulfato de gentamicina, y metotrexato 5\times10^{-7} M. Las células B IM9 de mieloma humano (ATCC CCL 159) (Ann. N.Y. Acad. Sci. 190:221-234 (1972)) se mantuvieron en medio base GIF con un 10% de suero fetal bovino desactivado, penicilina, estreptomicina (100 unidades/ml), y L-glutamina (2 mM). Como control positivo para determinar el nivel de CD23 sobre la superficie de células IM9 en cada experimento, se tiñó una alícuota de células con el monoclonal de ratón Leu 20 (anti-CD23) de Becton Dickinson, a 10 \mug/ml, durante 30 minutos a 4ºC, seguida por dos lavados con tampón de FACS. A continuación se incubaron las células con F(ab')2 de cabra, anti-IgG de ratón, purificado por afinidad, conjugado con FITC, a 5 \mug/ml. Las células CHO 3D10 adherentes se retiraron de las placas de cultivo de tejidos mediante incubación con EDTA 10 mM en PBS, durante 2 minutos a 37ºC. Se contaron las células, se resuspendieron a continuación en tampón FACS (0,1% BSA, azida sódica 10 mM, en PBS, pH 7,4), a una concentración de 5\times10^{6}/ml. Se incubaron células CHO 3D10 e Im9 (5\times10^{5}/alícuota) en 100 \mul de tampón FACS que contenía IgE de U266 estándar o mutantes de IgE, a 2 \mug/ml, durante 30 minutos a 4ºC, en placas de microvaloración de 96 pocillos, seguida por dos lavados con tampón FACS. Como control, se incubaron las células en tampón solo o tampón conteniendo 2 \mug/ml de IgG1 humana (Behring Diagnostics, #400112, lote nº 801024). A continuación se incubaron las células en 100 \mul de tampón FACS que contenía anticuerpo de conejo anti-IgE humana, conjugado con FITC, a 20 \mug/ml (Accurate Chem. Co., #AXL 475F, lote nº 040A), durante 30 minutos a 4ºC, seguida por 3 lavados con tampón FACS. Se añadieron 400 \mul de tampón conteniendo yoduro de propidio a 2 \mug/ml a la suspensión de células para teñir las células muertas. Las células se analizaron en un citómetro de flujo FACSCAN de Becton Dickinson. Las puertas para la dispersión hacia adelante de la luz y la dispersión a 90 grados se ajustaron para analizar una población de células homogénea, y las células muertas que se tiñeron con yoduro de propidio se excluyeron de los análisis. Las células positivas para el FITC (unidoras de la IgE) se analizaron respecto a las células teñidas con FITC-anticuerpo de conejo anti-H IgE solo.

Los ensayos anteriores se usaron para determinar la capacidad de los análogos de la IgE del Ejemplo 2 para unirse al FCEL y FCEH. Los resultados se detallan en la Tabla 3.

5

Tres mutantes de la IgE presentaron la pérdida completa de la unión al receptor FCEH: los mutantes 1, 4 y 6. El mutante 6 alteró la hebra-\beta D en el extremo del Fc\epsilon3, cerca del dominio Fc\epsilon2. Los mutantes 1 y 4 implicaron la alteración de dos bucles Fc\epsilon3, los cuales son adyacentes y cercano al dominio Fc\epsilon4. Hay que destacar que el mutante 7 es un subconjunto del mutante 1 en el que los tres residuos C-terminales del bucle AB han sido cambiados a alaninas (Tabla 2, 1 respecto 7). No obstante, el mutante 7 no afecta la unión al FCEH. Nosotros interpretamos que esto indica que o (1) el Fc\epsilonRI se une al menos a los residuos 377-381 de la Ige o (2) el residuo extra en el bucle AB de la IgG1 (9 residuos) sustituido por el bucle AB de la IgE (8 residuos) deformó algunos determinantes de unión adyacentes, posiblemente el bucle EF. Que los mutantes 8 y 10 no tuvieran efecto alguno sobre la unión al Fc\epsilonRI indica que lo más probable es que el receptor FCEH no sobresalga hacia dentro de la cavidad limitada por el bucle AB y la
hebra-\beta D.

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Aunque el mutante 4 tenía una Leu remplazando la Gly444 (Tabla 2), esto no debería afectar la conformación del bucle EF. El residuo 444 es anterior al extremo N-terminal de esta hélice-\alpha- Además, la IgE de ratón tiene una Val en la posición 444 y la IgE de rata tiene un Asp. Los dos residuos hidrofóbicos enterrados en el medio de la hélice-\alpha, W448 y I449, son retenidos en el bucle IgG1 sustituido (W448 y L449), así como el G451 que termina la hélice-\alpha. Por consiguiente, la conformación del bucle EF debería ser similar en la IgE y en la IgG1.

Los mutantes 2 y 3 exhibieron una unión disminuida al FCEH. Puesto que el bucle BC está cerca de la hebra-\beta D y el bucle CD está en la proximidad del bucle EF, es concebible que uno o dos residuos en los bucles BC y CD entren en contacto con el FCEH.

Cinco mutantes de la IgE presentaron una pérdida de unión al receptor FCEL: los mutantes 1, 3, 4, 7 y 8. Los mutantes 1 y 4 se han discutido más arriba. El mutante 3 implicó la alteración del bucle CD; en contraste con el FCEH, el bucle CD evidentemente juega un papel principal en la unión al FCEL. El mutante 7, un subconjunto del mutante 1 tal como se ha discutido más arriba, comprende la porción C-terminal del bucle AB y está próximo al bucle EF. Adicionalmente, el bucle 8 consiste en el remplazo de dos residuos Thr (387, 389) con Ala; estos dos residuos son parte de la hebra-\beta B, la cual está en el fondo de la cavidad antes mencionada, limitada por el bucle AB y la hebra-\beta D. El mutante 10 incluyó dos residuos diferentes en esta cavidad (438, 440) sobre la hebra-\beta E, la cual es adyacente a la hebra-\beta B. Puesto que el mutante 10 no afectó la unión al FCEL, nosotros concluimos que el receptor FCEL debería tener sólo una incursión mínima en la cavidad, mientras que el receptor de alta afinidad no penetra en la
cavidad.

Además de un sitio de glicosilación Asn430, que corresponde al sitio de glicosilación en la IgG Fc, la IgE humana contiene otro sitio de glicosilación en Asn403. El mutante 9 convirtió el Asn403 y la Thr405 en alaninas (Tabla 2). La pérdida de carbohidratos no afectó la unión al receptor.

En base a las informaciones de los mutantes 1-13, proponemos que el FCEH y el FCEL tienen sitios de unión sobre la Fc de IgE que son distintos pero que se solapan. El receptor de baja afinidad parece interaccionar con una porción relativamente menor del dominio Fc\epsilon3 de la IgE, implicando tres bucles adyacentes: AB, CD y EF. Por contra, el receptor de alta afinidad interacciona con una porción mayor del Fc\epsilon3 de la IgE, la cual abarca el bucle EF, la hebra-\beta D y, posiblemente, la porción N-terminal del bucle AB. Las porciones de bucles DC y CD en la proximidad del bucle EP y la hebra-\beta D también podrían interaccionar con el FCEH. Además, el FCEL podría proyectarse hacia dentro de la cavidad limitada por el bucle AB y la hebra-\beta D. El FCEH no hace tal cosa. Puesto que no hemos evaluado ningún mutante en el Fc\epsilon4 y sólo uno en el Fc\epsilon2 (mutante 13), es posible que porciones de estos dos dominios jueguen un papel en la unión al receptor de la IgE.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Ejemplo 4

Preparación de MAE11 humanizado

Se seleccionaron residuos del MAE11 y se insertaron o sustituyeron en la estructura de un anticuerpo Fab humano (región de la V_{H} Kabat del subgrupo III y región de la V_{L} kappa del subgrupo I). Una primera versión, el humae11v1 o versión 1, se describe en la Tabla 4.

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Se ensayó la afinidad de la versión 1, y se encontró que era aproximadamente 100 veces inferior a la del anticuerpo donante MAE11 (Ver Figuras 4a y 4b). Por tanto, tal como se muestra en la Tabla 5, se hicieron modificaciones ulteriores en la secuencia de la versión 1. Se realizó la determinación de la capacidad de estas modificaciones ulteriores para inhibir la unión de huIgE marcada al FCEH.

Los ensayos de inhibición al 50% que se muestran en la Tabla 5 se realizaron como sigue:

Se recubrió una placa de ensayo de 96 pocillos (fabricante Nunc) con 0,05 ml del receptor quimérico cadena alfa del Fc\epsilonRI-IgG1 en 1 \mug/ml de tampón de recubrimiento (50 nmoles de carbonato/bicarbonato, pH 9,6). El ensayo se realizó durante 12 horas a 4-8ºC. Se aspiraron los pocillos y se añadieron 250 \mul de tampón bloqueador (PBS - - 1% BSA, pH 7.2), y se incubaron durante una hora a 4ºC. En una placa de ensayo distinta se valoraron las muestras y el anticuerpo MAE11 de ratón de referencia desde 200 \mug/ml mediante dilución de 1 a 10 veces en tampón de ensayo (0,5% BSA, 0,05% Tween-20, PBS, pH 7,2), y se añadió un volumen igual de IgE biotinilada a 10 ng/ml, y se incubó la placa durante 2-3 horas a 25ºC. Los pocillos recubiertos con Fc\epsilonRI se lavaron tres veces con PBS-0,05% Tween-20, y a continuación se transfirieron 50 \mul de los pocillos de muestras, y se incubaron con agitación, durante 30 minutos a 25ºC. Se incubaron 50 \mul/pocillo de estreptoavidina-HRP, diluida 1:5000 en tampón de ensayo, durante 15 minutos con agitación, y a continuación se lavó la placa como antes. Se añadieron 50 \mul/pocillo de sustrato de peroxidasa Microwell (Kirkgaard & Parry Laboratories), y se desarrolló el color durante 30 minutos. Se detuvo la reacción añadiendo un volumen igual de HCl 1 normal, y se midió la absorbancia a 450 nm. La concentración para un 50% de inhibición se calculó representado el porcentaje de inhibición frente a la concentración de anticuerpo bloqueador para cada anticuerpo, con un ajuste a una curva de cuatro parámetros usando INPLOT.

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Tal como puede observarse a partir de la Tabla 5 y Figuras 4a y 4b, la versión 8 (en la que los residuos humanos de la versión 1 en los sitios 60 y 61 en la cadena ligera han sido remplazados por sus contrapartidas del MAE11) demostró una afinidad sustancialmente incrementada. Se observan mayores incrementos en la afinidad en las versiones 8a y 8b, en donde uno o dos residuos de ratón remplazaron residuos humanos. Otros incrementos, al menos virtualmente hasta el nivel del MAE11 se consiguieron remplazando residuos humanos hidrofóbicos hallados en el interior de la V_{H} y de la V_{H1} por sus contrapartidas en el MAE11, resultando en la variante denominada versión 9 (ver Tabla 5 y Figuras 4a y 4b). En consecuencia, los anticuerpos humanizados de esta invención poseerán afinidades que oscilarán desde aproximadamente 0,1 hasta 100 veces la del MAE11.

La Tabla 6 explora los efectos sobre la afinidad por el FCEH de varias combinaciones de variantes de la IgG1 MAE11 humanizada.

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Ejemplo 5

Creación de mutantes IgE

Se prepararon mutantes IgE (Tabla 7) para evaluar su efecto sobre la unión a anti-IgE, especialmente MAE11, y a Fc\epsilonRI y Fc\epsilonRII. Algunos de los mutantes se diseñaron para sustituir un residuo aminoácido específico con otro residuo con carga o tamaño similar o muy diferente. El impacto de estos cambios en la unión al receptor se refleja en la tabla siguiente.

Los ensayos del receptor se realizaron sustancialmente como sigue:

Se recubrió una placa de ensayo de 96 pocillos (fabricante Nunc) con 0,05 ml del receptor quimérico IgG1 Fc\epsilonRI o RII en 1 \mug/ml de tampón de recubrimiento (50 nmoles de carbonato/bicarbonato, pH 9,6). El ensayo se realizó durante 12 horas a 4-8ºC. Se aspiraron los pocillos y se añadieron 250 \mul de tampón bloqueador (PBS - - 1% BSA, pH 7.2), y se incubaron durante una hora a 4ºC. En una placa de ensayo distinta se valoraron las muestras y el anticuerpo MAE11 de ratón de referencia desde 200 \mug/ml mediante dilución de 1 a 10 veces en tampón de ensayo (0,5% BSA, 0,05% Tween-20, PBS, pH 7,2), y se añadió un volumen igual de IgE biotinilada a 10 ng/ml, y se incubó la placa durante 2-3 horas a 25ºC. Los pocillos recubiertos con Fc\epsilonRI se lavaron tres veces con PBS-0,05% Tween-20, y a continuación se transfirieron 50 \mul de los pocillos de muestras, y se incubaron con agitación, durante 30 minutos a 25ºC. Se incubaron 50 \mul/pocillo de estreptoavidina-HRP, diluida 1:5000 en tampón de ensayo, durante 15 minutos con agitación, y a continuación se lavó la placa como antes. Se añadieron 50 \mul/pocillo de sustrato de peroxidasa Microwell (Kirkgaard & Parry Laboratories), y se desarrolló el color durante 30 minutos. Se detuvo la reacción añadiendo un volumen igual de HCl 1 normal, y se midió la absorbancia a 450 nm. Se representó la absorbancia frente a la concentración de anticuerpo MAE11 bloqueador y se generó una curva estándar de inhibición usando
INPLOT.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante sólo es para provecho del lector. No forma parte del documento de la Patente Europea. Aunque se ha tenido sumo cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones, y la EPO rechaza cualquier responsabilidad en este aspecto.

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\bulletCAPRON et al. Immun. Today, 1986, vol. 7, 15-18 [0028]

\bulletGLENNIE et al. Nature, 1982, vol. 295, 712 [0035]

\bulletHAKIMI et al. J. Biol. Chem., vol. 265, 22079 [0057] Ann, N,Y, Acad, Sci., 1972, vol. 190, 221-234 [0057]

\bulletPADLAN; DAVIES. Mol. Immunol., 1986, vol. 23, 1063 [0058]

\bulletDEISENHOFER. Biochem., 1981, vol. 20, 2361-2370 [0058]

\bulletGORMAN et al. DNA and Prot. Eng, Techn., 1990, vol. 2, 3-10 [0059]

\bullet T.A. KUNKEL. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, vol. 82, 48B-492 [0059]

\bulletJBC, 1990, vol. 265, 22079-22081 [0063]

\bulletAnn. N.Y. Acad. Sci., 1972, vol. 190, 221-234 [0063]

\global\parskip0.000000\baselineskip

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Jardieu, Paula M.

\hskip3.9cm

Presta, Leonard G.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Variantes de inmunoglobulina.

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 64

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Genentech, Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 460 Point San Bruno Blvd

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: South San Francisco

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: California

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

NACIÓN: USA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 94080

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete de 360 kB, de 5,25 pulgadas

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: Compatible con IBM PC

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: patin (Genentech)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE REGISTRO: 14-AGOSTO-1992

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 07/879495

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE REGISTRO: 07-MAYO-1992

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 07/744768

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE REGISTRO: 14-AUG-1991

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL AGENTE/ABOGADO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Adler, Carolyn R.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 32.324

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 718P2

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 415/225-2614

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 415/952-9881

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TELEX: 910/371-7168

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 118 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:1:

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 111 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:2:

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 134 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:3:

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 124 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:4:

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 130 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:5:

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 106 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:6:

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 137 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:7:

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 453 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:8:

27

28

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 218 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:9:

\vskip1.000000\baselineskip

30

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:10:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

100

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:11:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

101

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:12:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

102

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:13:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

103

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:14:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

104

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:15:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

105

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:16:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

106

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:17:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

107

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:18:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

108

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:19:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

109

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:20:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

110

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:21:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

111

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:22:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

112

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:23:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

113

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:24:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

114

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:25:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

115

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:26:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

116

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:27:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

117

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:28:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

118

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:29:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

119

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:30:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

120

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:31:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

121

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:32:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

122

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:33:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

123

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:34:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

124

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:35:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

125

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:36:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

126

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:37:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

127

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:38:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

128

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:39:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

129

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:40:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

130

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:41:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

131

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:42:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

132

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:43:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

133

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:44:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

134

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:45:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

135

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:46:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

136

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:47:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

137

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:48:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

138

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:49:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

139

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:50:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

140

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:51:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

141

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:52:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

143

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:53:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

144

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:54:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

145

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:55:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

146

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:56:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

147

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:57:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:57:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

148

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:58:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:58:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

149

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:59:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:59:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

150

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:60:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:60:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

151

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:61:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:61:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

152

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:62:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:62:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

153

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:63:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:63:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

154

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:64:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.:64:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

155

Claims (37)

1. Anticuerpo que es capaz de unirse a la IgE unida a Fc\epsilonRII pero es sustancialmente incapaz de unirse a la IgE unida a Fc\epsilonRI, que comprende al menos una región Fab de un anticuerpo receptor humano, en el que se han sustituido en una o más de las posiciones 30, 30b, 30d, 33, 53, 91, 92, 93 y 94 en la cadena ligera, y de las posiciones 27, 28, 29, 29a, 31, 33, 34, 50, 52, 53, 54, 55, 58, 95, 97, 98, 99, 100 y 101 en la cadena pesada, residuos procedentes de posiciones análogas en un anticuerpo donante MAE11, MAE13 o MAE15, que tiene las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada tal como se detallan en las SEC. Nº ID. Nº 2 a 7, o un anticuerpo donante que tiene las características poseídas por el anticuerpo MAE11, en particular, la unión de la IgE soluble, la unión de células B portadoras de IgE, el bloqueo de la unión de la IgE a Fc\epsilonRI y Fc\epsilonRII, la inhibición in vitro de la producción de IgE, y la incapacidad de unirse a basófilos recubiertos con IgE, para su uso en terapias.

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo donante es el MAE11.

3. Anticuerpo según la reivindicación 1 ó reivindicación 2, en donde el anticuerpo humano receptor tiene una cadena kappa (ligera) humana del subgrupo I de Kabat, y una cadena pesada humana del subgrupo III.

4. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones precedentes el cual es un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

5. Anticuerpo según la reivindicación 4 el cual es un anticuerpo IgG unidor de complemento, o un anticuerpo IgG capaz de participar en la ADCC.

6. Anticuerpo que comprende las secuencias de cadena pesada y ligera del Fab del humae11ver.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7a, 8, 8a, 8b o 9, en donde el humae11ver.1 tiene las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera tal como se detallan en las SEC. Nº ID.: 8 y 9, y los humae11ver.2-9 tienen las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera del humae11ver.1, que incorporan además las modificaciones mostradas en la Tabla 5.

7. Anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera del Fab del humae11ver.1 tal como se detallan en la SEC. Nº ID.: 8 y 9, estando sustituida dicha cadena pesada en la posición 60 con asparagina, en la posición 61 con prolina, y en la posición 67 con isoleucina.

8. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que tiene adicionalmente la sustitución de uno o más residuos estructurales del anticuerpo donante en posiciones seleccionadas de entre la 4, 13, 19, 33, 53, 58, 78 y 104 de la cadena ligera, y la 24, 37, 50, 52, 58, 60, 61, 95, 78, 48, 49, 63, 67, 69, 82 y 82c de la cadena pesada.

9. Anticuerpo según la reivindicación 8, que tiene residuos hidrofóbicos estructurales de donante en las posiciones 13, 19, 58, 78 y 104 de la cadena ligera, y 48, 49, 63, 67, 69, 78, 82 y 82c en la cadena pesada.

10. Anticuerpo según la reivindicación 8, que tiene residuos donantes en 4, 33 y 53 de la cadena ligera, y 24, 37, 50, 52, 58, 60, 61 y 95 de la cadena pesada.

11. Anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y 8 a 10, que tiene la sustitución, supresión o inserción de un residuo de un anticuerpo donante en, o adyacente a los sitios 30, 30b, 30d, 33, 55, 57, 58, 78, 93, 94 o 104 de la cadena ligera, y/o los sitios 24, 37, 48, 49, 54, 57, 60, 61, 63, 65, 67, 69, 78, 82, 82c, 97, 100a o 100c de la cadena pesada.

12. Anticuerpo según la reivindicación 11, en donde el V_{H} 78 se sustituye por fenilalanina.

13. Anticuerpo según la reivindicación 11, en donde el V_{H} 78 se sustituye por leucina, valina, isoleucina, metionina o alanina.

14. Anticuerpo según la reivindicación 11, en donde el V_{H} 60 se sustituye por asparagina.

15. Anticuerpo según la reivindicación 11, en donde el V_{H} 60 se sustituye por glutamina, histidina, lisina o arginina.

16. Anticuerpo según la reivindicación 11, en donde el V_{H} 61 se sustituye por prolina.

17. Anticuerpo según la reivindicación 11, en donde el V_{H} 61 se sustituye por glicina, alanina, valina, leucina o isoleucina.

18. Anticuerpo según la reivindicación 8, en donde los residuos se importan del MAE11 donante, incluyendo cuatro insertos en V_{L1} 30a-30d, así como V_{L3} 91-94, V_{H1} 27-29, 29a, 31, 33 y 34, V_{H2} 53-55 y V_{H3} 97-101.

19. Anticuerpo según la reivindicación 11, en donde cualquiera de las posiciones V_{H} 97, 100a y 100c tiene un residuo básico distinto de la histidina, preferiblemente lisina o arginina.

20. Anticuerpo según la reivindicación 11, en donde cualquiera de las posiciones V_{H} 97, 100a y 100c tiene un residuo seleccionado de entre alanina, glicina, valina, isoleucina, serina, treonina, ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina, metionina, fenilalanina, tirosina, triptófano o prolina.

21. Anticuerpo según la reivindicación 11, en donde cualquiera de las posiciones V_{L} 30, 30b y 30d es ácido glutámico.

22. Anticuerpo según la reivindicación 11, en donde cualquiera de las posiciones V_{L} 30, 30b y 30d tiene un residuo seleccionado de entre alanina, glicina, valina, isoleucina, serina, treonina, asparagina, glutamina, metionina, fenilalanina, tirosina, triptófano o prolina.

23. Anticuerpo según la reivindicación 11, en donde cualquiera de los residuos de V_{L} en las posiciones 30, 30b y 30d es histidina, y cualquiera de los residuos de V_{H} en las posiciones 97, 100a o 100c es ácido aspártico.

24. Anticuerpo según la reivindicación 11, en donde los residuos se insertan adyacentes a cualquiera de los residuos de V_{H} en las posiciones 97, 100a, 100c, 60 ó 61, o de los residuos de V_{L} en las posiciones 30, 30b, 30d ó 78.

25. Anticuerpo según la reivindicación 24, en donde los residuos insertados son del mismo tipo, esto es, residuos ácidos insertados adyacentes a V_{L} 30, 30b ó 30d, o residuos básicos adyacentes a V_{H} 97, 100a ó 100c.

26. Anticuerpo según la reivindicación 11, en donde los residuos en cualquiera de V_{L} 30, 30b ó 30d ó 78, o de V_{H} 97, 100a, 100c, 60 ó 61 se suprimen.

27. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que es un anticuerpo biespecífico.

28. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que es monovalente para la IgE unida a Fc\epsilonRII, y es capaz de una función efectora de imunoglobulina, y comprende un dominio Fc que contiene al menos dos cadenas pesadas.

29. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende una cadena pesada consenso humana y una secuencia de cadena ligera.

30. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que tiene una afinidad por la IgE que es sustancialmente la misma que, o superior que la del MAE11 por la IgE.

31. Uso de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones precedentes para la preparación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de las alergias.

32. El uso según la reivindicación 32, en donde el medicamento es para su administración a un paciente que está sensibilizado a un alérgeno.

33. El uso según la reivindicación 33, en donde el medicamento es para su administración antes de una respuesta alérgica aguda.

34. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, en donde el medicamento es para su administración mediante la ruta intravenosa, intaperitoneal o subcutánea.

35. El uso según la reivindicación 34, en donde el medicamento es para su administración subcutánea.

36. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35, en donde el medicamento es para su uso conjuntamente con una terapia adicional para el tratamiento de alergias.

37. El uso según la reivindicación 36, en donde la terapia adicional es la administración de interferón gamma, la desensibilización al alérgeno, la reducción en la exposición al alérgeno, o la administración de antihistamínicos.