ES2533464T3

ES2533464T3 - Anticuerpos anti-miostatina

Info

Publication number: ES2533464T3
Application number: ES06816226.2T
Authority: ES
Inventors: Bomie Han; Andrew Korytko; Pamela Jean Mitchell; Rosamund Carol Smith; O'bryan (Nee Tobias), Linda; Rong Wang
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2005-10-06
Filing date: 2006-10-05
Publication date: 2015-04-10
Anticipated expiration: 2026-10-05
Also published as: US20100087631A1; CN101277976B; KR20080045733A; AU2006302494B2; EA200801027A1; EA015589B1; WO2007044411A3; US7745583B2; IL189579A0; AU2006302494A1; US20080299126A1; KR101135220B1; CA2624976A1; NO20082073L; EP1951756B1; WO2007044411A2; JP5052517B2; CN101277976A; US7635760B2; EP1951756A2

Abstract

Un anticuerpo anti-miostatina humanizado que comprende un polipéptido de la región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº: 10 y un polipéptido de la región variable de cadena pesada de la SEC ID Nº: 26.

Description

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miostatina. En otra realización el sujeto, preferentemente un mamífero, preferentemente un ser humano, se caracteriza adicionalmente por que está en riesgo de desarrollar un trastorno, enfermedad o afección que se beneficiaría de una disminución del nivel de miostatina o una disminución de la bioactividad de la miostatina.

El término "vector" incluye una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido que incluye, pero no se limita a, plásmidos y vectores virales. Determinados vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que éstos se introducen mientras que otros vectores se pueden integrar en el genoma de una célula huésped después de la introducción en la célula pues que, y de este modo, se replican junto con el genoma huésped. Además, determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que se unen de forma operativa. Tales vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión recombinante" (o simplemente "vectores de expresión") y los vectores a modo de ejemplo se conocen bien en la técnica.

Tal como se usa en el presente documento, las expresiones "célula", "célula huésped", "línea celular", y "cultivo celular" se usan indistintamente e incluyen una célula individual o cultivo celular que es un receptor de cualquier polinucleótido aislado de la invención o cualquier vector o vectores recombinantes que comprenden una secuencia que codifica una HCVR, LCVR o anticuerpo monoclonal de la invención. Las células huésped incluyen la progenie de una sola célula huésped, y puede que no sea necesario que la progenie sea completamente idéntica (en morfología o en el complemento de ADN total) a la célula precursora original debido a mutación y/o cambio natural, accidental, o deliberado. Una célula huésped incluye células transformadas, transducidas o infectadas in vivo o in vitro con uno o más vectores su recombinante es o un polinucleótido que expresa un anticuerpo monoclonal de la invención o una cadena ligera o cadena pesada del mismo. Una célula huésped que comprende un vector recombinante de la invención (incorporado de forma estable en el cromosoma huésped o no) también se puede denominar una "célula huésped a recombinante". Las células huésped preferentes para uso en la invención son células CHO (por ejemplo, CRL-9096 de la ATCC), células NS0, células SP2/0 y células COS (de la ATCC por ejemplo, CRL-1650, CRL-1651), HeLa (CCL-2 de la ATCC). Las células huésped adicionales para uso en la invención incluyen células vegetales, células de levadura, otras células de mamífero y células procariotas.

Caracterización de Anticuerpos

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales, aislados que se unen específicamente a la miostatina con afinidad elevada. Los anticuerpos de la invención son anticuerpos humanizados o porciones de unión a antígeno de los mismos y se unen preferentemente a la miostatina dentro de la región de la forma madura de miostatina que abarca los aminoácidos 40-64 o más preferentemente dentro de la región de la forma madura de miostatina que abarca los aminoácidos 43-57 y/o 45-59. Además, los anticuerpos de la invención neutralizan una actividad biológica de la miostatina in vivo o in vitro. La unión específica de anticuerpos monoclonales anti-miostatina de la invención a la miostatina permite que los anticuerpos de la invención se usen como agentes terapéuticos o profilácticos para afecciones, enfermedades o trastornos asociados con la miostatina, es decir, afecciones, enfermedades o trastornos que se benefician de la reducción de los niveles de miostatina o que antagonizan o inhiben una actividad biológica de la miostatina. Además, los anticuerpos de la invención se pueden usar para diagnosticar o controlar afecciones, enfermedades o trastornos que se benefician de un nivel alterado o bioactividad de miostatina o para determinar el nivel de miostatina en una muestra.

En una realización preferente, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti-miostatina que se une a la miostatina o una porción de la misma con una afinidad de unión (KD) para la miostatina inferior o igual a aproximadamente 1 x 10-9 M, preferentemente inferior a aproximadamente 9 x 10-10 M o 8,7 x 10-10 M o 8 x 10-11 M. Preferentemente los anticuerpos de la invención se caracterizan por una KD para la miostatina no superior a aproximadamente 1 x 10-9 M o 9 x 10-10 M y lo más preferentemente por una KD para la miostatina no superior a aproximadamente 8,7 x 10-10 M o 8 x 10-11 M. Las afinidades de los anticuerpos se pueden determinar tal como se describe en los ejemplos a continuación en el presente documento o mediante el uso de cualquier procedimiento adecuado disponible en la técnica.

En otra realización preferente, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti-miostatina que tiene una CI50 inferior o igual a aproximadamente 25 nM, 20 nM, 16 nM, 14 nM, 10 nM, 9 nM, 6 nM, 5,2 nM o inferior en un ensayo de indicador de miostatina/SBE in vitro tal como se describe en los ejemplos a continuación en el presente documento. tales anticuerpos se pueden caracterizar adicionalmente por una KD para la miostatina no superior a aproximadamente 1 x 10-9 M o 9 x 10-10 M y lo más preferentemente por una KD para la miostatina no superior a aproximadamente 8,7 x 10-10 M o 8 x 10-11 M. Tales anticuerpos se pueden caracterizar adicionalmente por la unión de forma preferente a la miostatina cuando se comparan con su capacidad para unirse a GDF-11 usando cualquier procedimiento disponible en la técnica, por ejemplo, ensayo de ELISA o ensayo de ELISA competitivo o un valor de KD medido por ejemplo, con un ensayo de BIACORE o KINEXA.

En una realización, un anticuerpo monoclonal de la invención tiene una reactividad cruzada inferior a aproximadamente un 35, 33, 30, 28, 25, 23, o un 20 % (más preferentemente, inferior a aproximadamente 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 o 6, incluso más preferentemente, una reactividad cruzada inferior a aproximadamente un 5 o un 4 por ciento) con una proteína que no es miostatina (tal como, por ejemplo, GDF-11) o con un péptido que no es miostatina que consiste en al menos 15, 14, 13, 12, 11, 10 o 9 aminoácidos contiguos, tal

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como se mide con una técnica convencional en la técnica tal como un ensayo de ELISA, un ensayo de ELISA competitivo o valores de KD tal como se miren, por ejemplo, con un ensayo de BIACORE o KINEXA. Preferentemente un anticuerpo de la invención se une a la miostatina con un índice superior a 2, 3, 5, 10, 20, 22, 24

o 25 veces mayor que cuando se une con GDF-11, tal como se determina por ejemplo, mediante ensayo de ELISA de competición o BIACORE o KINEXA. Más preferentemente, los anticuerpos de la invención no se unen a GDF-11 a niveles mayores que los niveles de fondo cuando se usa cualquier ensayo de unión disponible para un experto habitual en la materia. Un anticuerpo monoclonal de la invención se une a una forma monomérica o dimérica de la miostatina o una porción de la misma que comprende aminoácidos que abarcan los restos 40-64, 43-57 y/o 45-59 o miostatina madura.

Preferentemente los polipéptidos de miostatina y GDF-11 sometidos a ensayo para la unión preferente de un anticuerpo de la invención son ambos formas homodiméricas de la proteína madura, preferentemente de origen mamífero o aviar, incluso más preferentemente de origen humano. Sin embargo, los polipéptidos de miostatina y GDF-11 sometidos a ensayo para la unión preferente de un anticuerpo de la invención pueden ser la forma monomérica de la proteína madura o forma de proproteína o un polipéptido que comprende una porción de la proteína madura que abarca los aminoácidos 40-64, 43-57 y/o 45-59 de la forma madura de la proteína.

Los anticuerpos monoclonales anti-miostatina de la invención se unen a un epítopo antigénico que se localizaba dentro de los aminoácidos 40-64 (SEC ID Nº: 53 para ser humano) de la miostatina madura preferentemente dentro de los aminoácidos 43-57 y/o 45-59 de la miostatina madura. Además, un epítopo inmunogénico de miostatina de la invención se localiza dentro de los aminoácidos 40-64 de la miostatina madura (SEC ID Nº: 53 para ser humano), preferentemente dentro de los aminoácidos 43-57 y/o 45-59 de la miostatina madura de cualquier especie de mamífero o aviar. También se contempla que un epítopo inmunogénico de la invención es un epítopo antigénico. El epítopo antigénico puede poseer restos adicionales de miostatina fuera de los aminoácidos 40-64 de la miostatina madura, pero los anticuerpos monoclonales de la invención no necesitan estos restos adicionales para unirse de forma especificada miostatina. Además, los restos de miostatina fuera de los aminoácidos 40-64 pueden afectar a la estructura conformacional del dominio antigénica y alterar de ese modo la unión de un anticuerpo de la invención al epítopo antigénico. Preferentemente los anticuerpos monoclonales de la invención no reaccionan de forma significativa (es decir, unión) con GDF-11 en comparación con el nivel con el que se unen a GDF-8. Más preferentemente, los anticuerpos monoclonales de la invención se unen a la miostatina al menos 2, 3, 5, 10, 20, 22, 24 o 25 veces más (por ejemplo, afinidad mayor o especificidad mayor) que con la que se unen a GDF-11 tal como se determina por ejemplo, mediante ensayo de ELISA, ensayo de ELISA de competición o valores de KD en un ensayo de BIACORE o KINEXA.

Un péptido que consiste en aminoácidos 40-64 (inclusive), 43-57 o 45-59 de la miostatina madura o cualquier péptido que consiste en un epítopo inmunogénico tal como se describe en el presente documento se puede usar como un péptido inmunogénico, preferentemente conjugado a una proteína vehículo por ejemplo, KLH, para generar anticuerpos monoclonales de la invención usando procedimientos disponibles para un experto en la materia. Se contempla que los restos de cisteína dentro de estos péptidos se pueden cambiar por restos de serina y aún funcionan como un epítopo inmunogénico. El péptido inmunogénico se puede usar para inmunizar un animal no humano, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ratón. Para un anticuerpo totalmente humano, el péptido inmunogénico se puede usar para inmunizar una cepa transgénica de ratón en la que la expresión genética de anticuerpo de ratón se suprime y se reemplaza de forma eficaz con expresión genética de anticuerpo humano. A continuación, los anticuerpos de anti-miostatina se aíslan a partir del animal inmunizado y se identifican sistemáticamente con procedimientos bien conocidos en la técnica para aislar esos anticuerpos que se unen de forma específica dentro del dominio que abarca los aminoácidos 40-64 de la miostatina madura, preferentemente dentro del dominio que abarca los aminoácidos 43-57 y/o 45-59 preferentemente identificado sistemáticamente para una afinidad de unión inferior a aproximadamente 3 x 10-8 M, 1 x 10-8 M o 1 x 10-9 M, preferentemente inferior a aproximadamente 9 x 10-10 M, 8,7 x 10-10 M o 8 x 10-11 M y/o identificado sistemáticamente para una CI50 inferior o igual a aproximadamente 25 nM, 20 nM, 16 nM, 14 nM, 10 nM, 9 nM, 6 nM, 5,2 nM o inferior en un ensayo de miostatina/SBE in vitro (véase el ensayo que se describe en el Ejemplo 6 en el presente documento).

Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando el procedimiento de hibridoma conocido ampliamente en la técnica (véase por ejemplo, Kohler y col., Nature, 256: 495, 1975) o se pueden preparar mediante procedimientos de ADN recombinante (por ejemplo, tal como en la Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567) u otros procedimientos disponibles en la técnica. Generalmente, un hibridoma se puede producir por fusión de una línea celular inmortal adecuada (por ejemplo, una línea celular de mieloma tal como SP2/0) con células que producen anticuerpos del animal inmunizado. La célula que produce anticuerpos, preferentemente las del bazo o nódulos linfáticos, se obtienen a partir de animales inmunizados en el antígeno de interés. Las células fusionadas (hibridomas) se pueden aislar usando condiciones selectivas de cultivo, y clonar mediante dilución limitante. El medio de cultivo en el que las células de hibridoma crecen se somete a ensayo para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos frente al antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de los mabs producidos mediante células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ELISA. Las células que producen anticuerpos con las propiedades de unión deseadas se pueden seleccionar mediante un ensayo adecuado de identificación sistemática. Los procedimientos para tal aislamiento e identificación sistemática se conocen bien en la técnica.

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Además además de las secuencias de CDR, la LCVR y la HCVR comprenden adicionalmente secuencia de marco conservado. En un anticuerpo humanizado para uso terapéutico en seres humanos, la secuencia de marco conservado es preferentemente total o básicamente de origen humano (es decir, al menos de un 85 %, un 87 %, un 90 %, un 92 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de origen humano). Preferentemente la región de marco conservado de cadena ligera de un anticuerpo humanizado, humano o quimérico de la invención es O2 tal como se muestra en la Fig. 7, formada por FR1 con la SEC ID Nº: 65, FR2 con la SEC ID Nº: 66, FR3 con la SEC ID Nº: 67 y FR4 con la SEC ID Nº: 68. Preferentemente la región de marco conservado de cadena pesada de un anticuerpo humanizado, humano o quimérico de la invención es VH2-70 o VH4-39 tal como se muestra en las Figs. 5 y 6 respectivamente. El marco conservado de VH2-70 está formado por FR1 con la SEC ID Nº: 69, FR2 con la SEC ID Nº: 70, FR3 con la SEC ID Nº: 71, y FR4 con la SEC ID Nº: 72. VH4-39 está formado por FR1 con la SEC ID Nº: 73, FR2 con la SEC ID Nº: 74, FR3 con la SEC ID Nº: 75 y FR4 con la SEC ID Nº: 76. En un anticuerpo para uso en un animal no humano, la secuencia de la región de marco conservado se puede originar básicamente a partir del genoma humano (preferentemente usada en un animal no humano cuando es un embrión o recién nacido) o a partir del genoma del animal en el que se va a usar de forma terapéutica.

En una realización, un anticuerpo anti-miostatina de la invención en el que toda o una porción de la región variable se limita mediante una secuencia en particular tal como se muestra mediante una SEC ID Nº en el presente documento se caracteriza adicionalmente por que es un anticuerpo quimérico, humanizado, o totalmente humano o porción de unión a antígeno del mismo que antagoniza o neutraliza al menos una actividad de miostatina in vivo o in vitro. Un anticuerpo anti-miostatina de la invención en el que toda o una porción de la región variable se limita mediante una secuencia en particular tal como se muestra mediante una SEC ID Nº en el presente documento preferentemente se caracteriza adicionalmente por la unión preferentemente a GDF-8 con respecto a GDF-11. Más preferentemente tales anticuerpos se unen a la miostatina con una frecuencia de al menos aproximadamente 2, 3, 5, 10, 20, 22, 24, o 25 veces superior que la de la unión de GDF-11. Más preferentemente tales anticuerpos, cuando se expresan como Fabs, no se unen a GDF-11 por encima de niveles de fondo.

Un anticuerpo anti-miostatina de la invención en el que toda o una porción de la región variable se limita mediante una secuencia en particular tal como se muestra mediante una SEC ID Nº en el presente documento se caracteriza preferentemente adicionalmente por (i) unión a un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la SEC ID Nº: 53, preferentemente un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la SEC ID Nº: 62; y/o (ii) que tiene una CI50 inferior o igual a aproximadamente 25 nM, 20 nM, 16 nM, 10 nM, 9 nM, 6 nM, 5,7 nM en un ensayo de indicador de miostatina/SBE in vitro y/o (iii) que tiene una afinidad de unión (KD) hacia la miostatina inferior a aproximadamente 1 x 10-8 M o 1 x 10-9 M, preferentemente inferior a aproximadamente 9 x 10-10 M o 8,7 x 10-10 M o 8 x 10-11 M; como alternativa se caracteriza por una KD para miostatina no superior a aproximadamente 1 x 10-9 M o 9 x 10-10 M; más preferentemente una KD no superior a aproximadamente 8,7 x 10-10 M y lo más preferentemente una KD no superior a aproximadamente 8 x 10-11 M.

Expresión de Anticuerpos

La presente invención también se refiere a líneas celulares que expresan un anticuerpo monoclonal anti-miostatina de la invención o porción del mismo. La creación y el aislamiento de líneas celulares que producen un anticuerpo monoclonal de la invención se puede realizar usando técnicas convencionales conocidas en la técnica. Las líneas celulares preferentes incluyen COS, CHO, SP2/0, NS0 y levadura (disponibles en depósitos públicos tales como la ATCC, Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA).

Se puede usar una amplia diversidad de sistemas de expresión de huésped para expresar un anticuerpo de la presente invención que incluye sistemas de expresión procariota (bacteriano) y eucariota (tales como levadura, baculovirus, vegetal, mamífero y otras células animales, animales transgénicos, y células de hibridoma), así como sistemas de expresión de presentación de fagos. Un ejemplo de un vector de expresión bacteriano adecuado es pUC119 y un vector de expresión eucariota adecuado es un vector pcADN3.1 con un sistema de selección de DHFR debilitado. En la técnica también se conocen otros sistemas de expresión de anticuerpos y se contemplan en el presente documento.

Un anticuerpo de la invención se puede preparar mediante expresión recombinante de genes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina en una célula huésped. Para expresar un anticuerpo de forma recombinante, una célula huésped se transforma, transduce, infecta o similar con uno o más vectores de expresión recombinante que portan fragmentos de ADN que codifican las cadenas ligera y/o pesada de inmunoglobulina del anticuerpo de modo que las cadenas ligera y/o pesada se expresan en la célula huésped. La cadena pesada y la cadena ligera se pueden expresar independientemente a partir de promotores diferentes a los que se unen de forma operativa en un vector o, como alternativa, la cadena pesada y la cadena ligera se pueden expresar independientemente a partir de diferentes promotores a los que se unen de forma operativa en dos vectores – uno que expresa la cadena pesada y uno que expresa la cadena ligera. Opcionalmente la cadena pesada y la cadena ligera se pueden expresar en diferentes células huésped. Preferentemente, los anticuerpos recombinante se secretan en el medio en el que se cultivan las células huésped, a partir del que los anticuerpos se pueden recuperar o purificar. Se usan metodologías convencionales de ADN recombinante para obtener genes de cadena pesada y ligera de anticuerpo, incorporar estos genes en vectores de expresión recombinante, e introducir los vectores en células huésped. Tales tecnologías convencionales de ADN recombinante se describen, por ejemplo, en Sambrook, Fritsch, y Maniatis (Eds.), Molecular

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Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Ausubel, y col (Eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1989.

Un ADN aislado que codifica una región de HCVR se puede convertir en un gen de cadena pesada de longitud completa mediante unión de forma operativa del ADN que codifica la HCVR a otra molécula de ADN que codifican regiones constantes de cadena pesada (CH1, CH2, y CH3). Las secuencias de genes humanos de región constante de cadena pesada se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Kabat, y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos, Publicación del NIH Nº 91-3242 (1991). Se pueden obtener fragmentos de ADN que incluyen estas regiones por ejemplo, mediante amplificación de PCR convencional. La región constante de cadena pesada puede ser cualquier tipo, (por ejemplo, IgG, IgA, IgE, IgM o IgD), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) o subclase de región constante y cualquier variante alotípica de la misma tal como se describe en Kabat (mencionado anteriormente). Como alternativa, la porción de unión a antígeno puede ser un fragmento de Fab, fragmento de Fab’, fragmento de F(ab’)2, Fd, o un fragmento de Fv de una sola cadena (scFv). Para un fragmento de Fab de cadena pesada, el ADN que codifica la HCVR se puede unir de forma operativa a otra molécula de ADN que codifican solamente una región constante CH1 de cadena pesada.

Un ADN aislado que codifica una región de LCVR se puede convertir en un gen de cadena ligera de longitud total (así como en un gen de cadena ligera de Fab) mediante unión de forma operativa del ADN que codifica la LCVR a otra molécula de ADN que codifican una región constante de cadena ligera, CL. Las secuencias de genes humanos de región constante de cadena ligera se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Kabat, mencionado anteriormente. Se pueden obtener fragmentos de ADN que incluyen estas regiones mediante amplificación de PCR convencional. La región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda.

Para crear un gen de scFv, los fragmentos de ADN que codifican HCVR y LCVR –se unen de forma operativa a otro fragmento que codifica un conector flexible, por ejemplo, que codifican la secuencia de aminoácidos (Gly4-Ser)3, de modo que las secuencias de HCVR y LCVR se pueden expresar como una proteína contigua de una sola cadena, con las regiones de LCVR y HCVR unidas al conector flexible. Véase, por ejemplo, Bird, y col., Science 242: 423-6, 1988; Huston, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83, 1988; McCafferty, y col., Nature 348: 552-4, 1990.

Para expresar un anticuerpo de la invención, se inserta un ADN que codifica una cadena ligera y/o pesada de longitud parcial o completa, obtenido tal como se ha descrito anteriormente, en un vector de expresión de modo que el gen se une de forma operativa a secuencias de control de la transcripción y de la traducción. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se eligen para que sean compatibles con la célula huésped de expresión usada. El gen de cadena ligera de anticuerpo y el gen de cadena pesada de anticuerpo se pueden insertar en vectores separados o, más habitualmente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresión mediante procedimientos convencionales. Además, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido de señal que facilita la secreción de la cadena ligera y/o pesada del anticuerpo monoclonal anti-miostatina a partir de una célula huésped. El gen de cadena ligera y/o pesada del anticuerpo monoclonal anti-miostatina se puede clonar en el vector de modo que el péptido de señal se une de forma operativa en marco con el extremo camino del gen de la cadena del anticuerpo. El péptido de señal puede ser un péptido de señal de inmunoglobulina o un péptido de señal heterólogo.

Además del gen o genes de cadena pesada y/o ligera del anticuerpo, un vector de expresión recombinante de la invención lleva secuencias reguladoras que controlan la expresión del gen o genes de la cadena del anticuerpo en una célula huésped. La expresión "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación), cuando sea necesario, que controlan la transcripción o la traducción del gen o genes de cadena del anticuerpo. El diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada. Las secuencias reguladoras preferentes para la expresión de célula huésped de mamífero incluyen elementos virales que dirigen niveles elevados de expresión de proteína en células de mamífero, tales como promotores y/o potenciales derivados de citomegalovirus (CMV), Virus de Simio 40 (SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)) y virus de polioma.

Además de los genes de cadena pesada y/o ligera del anticuerpo y secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinante de la invención pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células huésped (por ejemplo, orígenes de replicación) y uno o más genes marcadores que se pueden seleccionar. El gen marcador que se puede seleccionar facilita la selección de células huésped en las que se ha introducido el vector. Por ejemplo, por lo general, el gen marcador que se puede seleccionar confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina, o metotrexato, en una célula huésped en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores que se pueden seleccionar preferentes incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para uso en células huésped sin DHFR con selección/amplificación de metotrexato), el gen neo (para selección de G418), y glutamina sintetasa (GS) en una línea celular negativa para GS (tal como NS0) para selección/amplificación.

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la amplificación de las secuencias que codifican inmunoglobulina a clonar usando cebadores apropiados mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR). Los celadores adecuados para amplificar secuencias de ácidos nucleicos de inmunoglobulina, y específicamente secuencias de HCVR y LCVR de murino se han informado en la bibliografía. Después de haber clonado tales secuencias que codifican inmunoglobulina, se secuencian mediante procedimientos bien conocidos en la técnica.

Después de injertar las secuencias que codifican CDR en las secuencias que codifican marco conservado humano seleccionado, las secuencias de ADN resultantes que codifican las secuencias variables pesadas y variable ligera "humanizadas" se expresan a continuación para producir un Fv humanizado o anticuerpo humanizado que se une a la miostatina. Las HCVR y LCVR humanizadas se pueden expresar como parte de una molécula entera de anticuerpo anti-miostatina, es decir, como una proteína de fusión con secuencias de dominio constante humanas cuyas secuencias de codificación de ADN se han obtenido a partir de una biblioteca disponible en el mercado o que se han obtenido usando, por ejemplo, uno de los procedimientos que se han descrito anteriormente para obtener secuencias de ADN, o se encuentran en la técnica. Sin embargo, las secuencias de las HCVR y LCVR también se pueden expresar en ausencia de secuencias constantes para producir un anti-miostatina Fv humanizado. Sin embargo, la fusión de secuencias constantes humanas en la región variable se desea potencialmente porque el anticuerpo anti-miostatina humanizado resultante puede poseer funciones efectoras humanas.

Los procedimientos para sintetizar ADN que codifica una proteína de secuencia conocidas son bien conocidos en la técnica. Usando tales procedimientos, se sintetizan secuencias de ADN que codifican las secuencias de HCVR y LCVR humanizadas objeto (con o sin regiones constantes), y a continuación se expresan en un sistema de vector adecuado para la expresión de anticuerpos recombinantes. Esto se puede realizar en cualquier sistema de vector que proporcione las secuencias de HCVR y LCVR humanizadas sujeto a expresar como una proteína de fusión consecuencias de dominio constante humano y que se asocie para producir anticuerpos (unión a antígeno) o fragmentos de anticuerpos funcionales.

Las secuencias de dominio constante humano son bien conocidas en la técnica, y se han informado en la bibliografía. Las secuencias de cadena ligera constante humana preferentes incluyen las secuencias de cadena ligera constante kappa y lambda. Las secuencias de cadena esa constante humana preferentes incluyen IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana, IgG4 humana, y versiones mutadas de las mismas que proporcionan función efecto de la alterada, por ejemplo, aumento de vida media in vivo, reducción de unión al receptor de Fc o alteración del perfil de desamidación.

Si estuvieran presentes, las regiones de marco conservado humano tiene su origen preferentemente en una de anticuerpo humano que tiene similitud de secuencia con la región análoga o equivalente del dador de la región de unión a antígeno (es decir, el anticuerpo precursor). Otras fuentes de regiones de marco conservado para porciones de origen humano de anticuerpo humanizado incluyen secuencias consenso variables humanas (véase por ejemplo, Kettleborough, C.A. y col. Protein Engineering 4: 773-783 (1991); Carter y col., documento de patente WO 94/04679. Por ejemplo, la secuencia del anticuerpo o región variable usada para obtener la porción no humana se puede comparar con las secuencias humanas tal como se describe en Kabat y col. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, NIH, U.S. Government Printing Office (1991). En una realización particularmente preferente, las regiones de marco conservado de una cadena de anticuerpo humanizado tienen su origen en una región variable humana que tiene una identidad de secuencia global de al menos aproximadamente un 60 %, preferentemente una identidad de secuencia global de al menos aproximadamente un 70 % y más preferentemente una identidad de secuencia global de al menos aproximadamente un 85 %, con la región variable del donante no humano. Una porción humana también puede tener su origen en un anticuerpo humano que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 65 %, y preferentemente una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 70 %, dentro de la porción en particular (por ejemplo, FR) que se está usando, cuando se compara con la porción equivalente (por ejemplo, FR) del donante no humano.

Las referencias que describen adicionalmente procedimientos implicados en la humanización de un anticuerpo de ratón que se pueden usar se encuentran por ejemplo, en Queen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2869, 1991; Patente de Estados Unidos Nº 5.693.761; Patente de Estados Unidos Nº 4.816.397; Patente de Estados Unidos Nº 5.225.539; los programas informáticos ABMOD y ENCAD tal como se describe en Levitt, M., J. Mol. Biol. 168: 595620, 1983; la humanización se puede realizar básicamente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores [Jones y col., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen y col., Science, 239: 1534-1536 (1988)].

Usos

Los anticuerpos de la presente invención son útiles en aplicaciones terapéuticas, profilácticas, de diagnóstico y de investigación tal como se describe en el presente documento. Un anticuerpo de la invención se puede usar para diagnosticar un trastorno o enfermedad asociado con la expresión de la miostatina humana. De una forma similar, el anticuerpo de la invención se puede usar en un ensayo para controlar los niveles de miostatina en un sujeto que se está tratando para una afección asociada con la miostatina. Los ensayos de diagnóstico incluyen procedimientos que usan el anticuerpo de la invención y una marca para detectar miostatina en una muestra, por ejemplo, en un fluido corporal humano o en un extracto celular o tisular. Los anticuerpos de la invención se pueden usar con o sin

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cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo, se sopesa con los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profiláctico deseado. Por lo general, dado que una dosis profiláctica se usa en sujetos antes de o en un estadio temprano de enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.

Una cantidad terapéuticamente eficaz o profilácticamente eficaz es al menos la dosis mínima, pero inferior a la dosis tóxica, de un agente activo que es necesario para transmitir beneficio terapéutico a un sujeto. indicado de otro modo, una cantidad terapéutica mente eficaz de un anticuerpo de la invención es una cantidad en la que, en mamíferos, preferentemente seres humanos, aumenta la masa muscular, aumenta la densidad ósea, o tratar afecciones en las que la presencia de miostatina causa o contribuye a efectos patológicos indeseables o la disminución de los niveles de miostatina da como resultado un efecto terapéutico beneficioso en un mamífero, preferentemente un ser humano, que incluyen, pero no se limitan, atrofia muscular, lesión muscular, cirugía debilidad, sarcopenia relacionada con la edad, atrofia por desuso, osteoporosis, osteoartritis, crecimiento y reparación de ligamento, obesidad, supresión de acumulación de grasa corporal, distrofia muscular de cualquier tipo, miopatía de cuidado crítico, caquexia (por ejemplo, relacionada con cáncer o inducida por el VIH, o que resulta de EPOC, insuficiencia renal, insuficiencia hepática, insuficiencia o enfermedad cardiaca), síndrome metabólico y diabetes de Tipo II. La atrofia por desuso puede dar como resultado numerosas causas o incidentes que incluyen cualquier trastorno o enfermedad o patología que conduce a inmovilidad prolongada o desuso o descanso en cama que incluyen, pero no se limitan a, trasplante de órganos sólidos, sustitución de articulaciones, apoplejía, lesión de la médula espinal, recuperación de quemaduras graves, hemodiálisis crónica sedentaria, recuperación después de sepsis y exposición a microgravedad.

La vía de administración de un anticuerpo de la presente invención puede ser oral, parenteral, por inhalación, o tópica. Preferentemente, los anticuerpos de la invención se pueden incorporar en una composición farmacéutica adecuada para administración parenteral. El término parenteral tal como se usa en el presente documento incluye administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, vaginal, o intraperitoneal. Es preferente la administración sistémica periférica mediante inyección intravenosa o intraperitoneal o subcutánea. Los vehículos adecuados para tales inyecciones son evidentes en la técnica.

La composición farmacéutica por lo general debe ser estéril y estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento en el envase proporcionado, que incluye por ejemplo, un vial cerrado herméticamente o jeringa. Por lo tanto, las composiciones farmacéuticas se pueden filtrar de forma estéril después de fabricar la formulación, o de otro modo se pueden fabricar de forma microbiológicamente aceptable. Una composición habitual para infusión intravenosa podría tener un volumen de tanto como 250-1000 ml de fluido, tal como solución de Ringer estéril, solución salina fisiológica, solución de dextrosa y solución de Hank y una dosis terapéutica mente eficaz, (por ejemplo, de 1 a 100 mg/ml, o superior) de concentración de anticuerpo. La dosis puede variar dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad. Tal como se conoce bien en las técnicas médicas, las dosificaciones para un sujeto cualquiera dependen de muchos factores, que incluyen la talla del paciente, área de superficie corporal, edad, el compuesto en particular a administrar, sexo, tiempo y vía de administración, salud general, y otros fármacos que se están administrando de forma simultánea. Una dosis habitual puede estar, por ejemplo, en el intervalo de 0,001 a 1000 µg; sin embargo, se conciben dosis inferiores o superiores a este intervalo a modo de ejemplo, especialmente teniendo en cuenta los factores que se han mencionado anteriormente. El régimen diario de dosificación parenteral puede ser de aproximadamente 0,1 µg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal total, preferentemente de aproximadamente 0,3 µg/kg a aproximadamente 10 mg/kg y más preferentemente de aproximadamente 1 µg/kg a 1 mg/kg, incluso más preferentemente de aproximadamente 0,5 a 10 mg/kg de peso corporal al día. El progreso se puede controlar mediante evaluación periódica. Para administraciones repetidas durante varios días o períodos más largos, dependiendo de la afección, el tratamiento se repite hasta que se produce una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles y no se excluyen de los mismos. La dosificación deseada se puede administrar mediante una administración de un solo bolo, mediante administraciones de múltiples bolos, o mediante administración de infusión continua de anticuerpo, dependiendo del patrón del deterioro farmacocinético que el profesional desea conseguir.

Estas cantidades de anticuerpos sugeridas están sometidas en gran medida al criterio terapéutico. El factor fundamental para la selección de una dosis apropiada y programación es el resultado obtenido. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno en particular que se está tratando, el mamífero en particular que se está tratando, la afección clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del anticuerpo, el tipo en particular de anticuerpo, el procedimiento de administración, la programación de administración, y otros factores conocidos por los profesionales médicos.

Los agentes terapéuticos de la invención se pueden congelar o liofilizar para almacenamiento y reconstitución en un vehículo estéril adecuado antes de su uso. La liofilización y la reconstitución pueden conducir a grados variables de pérdida de actividad del anticuerpo. Puede ser necesario el ajuste de las dosificaciones para compensar lo anterior. Generalmente, el pH preferente está entre 6 y 8.

Artículos de Fabricación.

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Claims

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